JP2005140981A - 顕微鏡装置 - Google Patents

Abstract

【課題】 より簡単な構成で照明光の光量を検出できる顕微鏡装置を提供すること。
【解決手段】 励起光と標本２７からの蛍光とを分離する光学分離手段２１と、前記光学分離手段２１を透過した前記入射励起光の光量を検出する検出手段２２を有する顕微鏡装置。
【選択図】 図１

Description

本発明は、顕微鏡装置に関し、特に安定した光量の照明光を照射できる顕微鏡装置に関する。

従来、レーザ光を照明光として用いる顕微鏡では、照明光の光量を検出するために、レーザ光源を含む照明装置の光路途中にレーザ光を主光束と参照光束とに分離する平面ガラス等を配置し、参照光束をフォトダイオード（ＰＤ）で受光することで出射光量を検出していた。さらに、ＰＤの受光信号を用いてレーザ照明装置からの出射強度を照明装置に設けられた調光部で制御し所定の光量のレーザ光を標本に照射していた（例えば、特許文献１参照。）。
特開平１０−２８２４２６号公報

しかし、照明光の光路中に光量検出のみのために平面ガラス等の光学部材を配置しなければならず、光学系の構成が複雑になったり、光学系の調整が難しくなったりする虞があった。

本発明は、上記課題に鑑みて行われたものであり、より簡単な構成で照明光の光量を検出、調整できる顕微鏡装置を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は、励起光と標本からの蛍光とを分離する光学分離手段と、前記光学分離手段を透過した前記励起光の光量を検出する検出手段を有することを特徴とする顕微鏡装置を提供する。

また、本発明にかかる顕微鏡装置では、少なくとも１つの照明光源と、前記照明光源の光量を調整する調光手段と、前記検出手段の検出結果に基づき、前記励起光の光量を所定の光量に調整する制御手段を有することが好ましい。

また、本発明は、少なくとも１つの照明光源と、前記照明光源の光量を調整する調光手段を有する照明ユニットと、前記照明ユニットからの励起光と標本からの蛍光を分離する光学分離手段と、前記光学分離手段の近傍に配置され、前記光学分離手段を透過した前記励起光の光量を検出する検出手段を有する顕微鏡ユニットと、前記検出手段からの信号を用いて前記調光手段を制御する制御手段と前記顕微鏡ユニットからの蛍光像を処理して画像表示する画像処理手段とを含む制御ユニットとを具備してなることを特徴とする顕微鏡装置を提供する。

また、本発明にかかる顕微鏡装置は、前記光学分離手段と前記標本との間に前記励起光を遮断する遮断手段を有し、前記励起光の光量を調整する際に、前記励起光を遮断することが好ましい。

また、本発明にかかる顕微鏡装置では、前記遮断手段は、前記光学分離手段の近傍に配置され前記励起光を走査する走査手段であることが好ましい。

また、本発明にかかる顕微鏡装置は、前記励起光の出射光量に応じて、前記検出手段からの信号の増幅率を切換える切換手段を有することが好ましい。

また、本発明にかかる顕微鏡装置では、前記制御手段は、前記検出手段の検出結果を用いて、前記調光手段により前記励起光の光量を所定の光量に自動的に調整するフィードバック機能を有することが好ましい。

また、本発明にかかる顕微鏡装置は、時間間隔毎に前記励起光の光量を前記検出手段により検出して検出結果を記憶する記憶手段と、前記時間間隔毎に蛍光画像を取得する画像取得手段とを有し、前記検出結果のいずれか1つの検出結果を基準として、前記励起光の光量比率を演算し、前記蛍光画像の強度を前記光量比率に基づき規格化する演算処理部を有することが好ましい。

本発明によれば、より簡単な構成で照明光の光量を検出、調整できる顕微鏡装置を提供することが出来る。

以下、本発明の実施の形態にかかる顕微鏡装置に関し図面を参照しつつ説明する。

図１は本発明の第１実施の形態にかかる顕微鏡装置の概略構成図である。図２は第１実施の形態に用いられている光学分離手段の分光特性を示す図である。図３は第１実施の形態の顕微鏡装置を用いて蛍光測定を行った例を示す図である。図４は本発明の第２実施の形態にかかる顕微鏡装置の概略構成図である。図５は第２実施の形態の顕微鏡装置を用いて蛍光測定を行った例を示す図である。図６は本発明の第３実施の形態にかかる顕微鏡装置の概略構成図である。

（第１実施の形態）
図１において、照明ユニット１１にはＡｒレーザ光源１２ａ（波長４８８ｎｍ）とＧｒｅｅｎ−ＨｅＮｅレーザ光源１２ｂ（波長５４３ｎｍ）の２種類のレーザ光源を有し、それぞれのレーザ光源の出射光路上にレーザ光の光量を調整する調光手段として音響光学素子（以後、ＡＯＭと記す）１４ａ、１４ｂがそれぞれ配置されている。Ａｒレーザ光源１２ａとＡＯＭ１４ａとの間にはシャッタ１３ａが、Ｇｒｅｅｎ−ＨｅＮｅレーザ光源１２ｂ（以後、ＧＨｅＮｅと記す）とＡＯＭ１４ｂとの間にはシャッタ１３ｂが、それぞれ配置されている。

ＧＨｅＮｅレーザ光源１２ｂからのレーザ光は、ＡＯＭ１４ｂで光量が調整された後、全反射ミラー１５で反射されダイクロイックミラー１６に入射する。Ａｒレーザ光源１２ａからのレーザ光は、ＡＯＭ１４ａで光量が調整された後、ダイクロイックミラー１６に入射し、ＧＨｅＮｅレーザ光源１２ｂからのレーザ光と同じ光路になるように結合される。結合されたレーザ光は、照明ユニット１１に結合されている光ファイバー１８の端面に集光レンズ１７で集光され、光ファイバー１８によってレーザ光がレーザスキャニング顕微鏡１９に伝達される。

光ファイバー１８の出射端はレーザスキャニング顕微鏡ユニット１９に結合されている。光ファイバー１８の出射端から出射したレーザ光（以後、入射励起光と記す）はコリメータレンズ２０で略平行光束にされダイクロイックミラー２１に入射する。ダイクロイックミラー２１は図２に示す分光特性を有し、これで反射された入射励起光は、ガルバノスキャナ２３に入射し２次元的に走査される。ガルバノスキャナ２３を出射した入射励起光は、第１集光レンズ２４と第２集光レンズ２５を介して対物レンズ２６に入射し、出射して標本２７上を２次元的に照明する。

標本２７を照明した入射励起光の反射光（以後、反射励起光と記す）と標本２７から発生する蛍光は、対物レンズ２６で集光され、第２集光レンズ２５、第１集光レンズ２４、およびガルバノスキャナ２３を介してダイクロイックミラー２１に入射する。ダイクロイックミラー２１に入射した光束の内、反射励起光は主にダイクロイックミラー２１で入射励起光側に反射され、標本２７からの蛍光はダイクロイックミラー２１を透過して、ダイクロイックミラー２１を透過してしまう一部の反射励起光のもれ光を阻止するバリアフィルタ２８を透過し、結像レンズ２９で高感度検出器（以後、ＰＭＴと記す）３０に結像される。ＰＭＴ３０からの信号はコントローラ３１内の画像処理部３２にて処理され、コンピュータ３３に結合されているモニタ３４上で標本２７からの蛍光像として観察される。コントローラ３１、コンピュータ３３およびモニタ３４で制御ユニットが構成されている。

また、ダイクロイックミラー２１を透過した入射励起光（透過光）の光路上に透過光量を検出するフォトダイオード（以後、ＰＤと記す）２２が配置されている。ＰＤ２２からの信号はＩ／Ｖ変換部３５により電圧に変換、増幅されてコンピュータ３３に入力され入射励起光の光量が測定されモニタ３４上に数値表示される。

ダイクロイックミラー２１は、図２に示すような分光特性を有し、Ａｒレーザ光源１２ａの入射励起光は９９％反射し１％透過し、ＧＨｅＮｅレーザ光源１２ｂの入射励起光も９９％反射し１％透過する特性を有している。このため、それぞれの入射励起光の略１％がダイクロイックミラー２１を透過してＰＤ２２で検出され、それぞれの入射励起光の光量測定に用いられる。なお、ダイクロイックミラー２１の分光特性は図２に限らず、反射及び透過率を適宜選択して用いることが出来る。

コントローラ３１には、Ａｒレーザ光源１２ａとＧＨｅＮｅレーザ光源１２ｂの光路上にそれぞれ配置されているＡＯＭ１４ａ、１４ｂをそれぞれ制御する調光制御手段３６が設けられている。コンピュータ３３からの指示により、所定の光量になるように調光制御手段３６を介してＡＯＭ１４ａ、１４ｂにそれぞれ電圧を与え光量をそれぞれ調整する。調整されたレーザ光の光量はＰＤ２２で検出されモニタ３４に表示され確認することが出来る。

また、コントローラ３１には、照明ユニット１１のシャッタ１３ａ、１３ｂをそれぞれ制御するシャッタ制御手段３８が設けられている。シャッタ制御手段３８は、Ａｒレーザ光源１２ａからのレーザ光と、ＧＨｅＮｅレーザ光源１２ｂからのレーザ光をレーザスキャニング顕微鏡ユニット１９に導入、非導入を切替える制御を行う。それぞれのシャッタ１３ａ、１３ｂの開閉指示はコンピュータ３３の操作によって行う。

そして、それぞれの入射励起光の光量測定では、Ａｒレーザ光源１２ａの光量測定の際は、シャッタ１３ａを開きシャッタ１３ｂを閉じて行い、ＧＨｅＮｅレーザ光源１２ｂの光量測定の際は、シャッタ１３ａを閉じシャッタ１３ｂを開いて行う。所定の光量に設定した後、シャッタ１３ａ、１３ｂを開放して、標本２７へ励起光を照射する。

また、コントローラ３１には、ガルバノスキャナ２３のスキャン状態を制御するスキャン制御手段３７が設けられている。スキャン制御手段３７は、コントローラ３１の画像処理部３２と同期して動作させることによって、標本２７からの蛍光像を画像情報として取得することが出来る。

また、スキャン制御手段３７は、標本２７に照射される入射励起光の光量を測定する際に、シャッタとして動作し、入射励起光が標本２７に照射されないように入射励起光を光路外に偏向する機能を有している。このように、入射励起光の光量を測定する際に標本２７に入射励起光を照射することがないので、蛍光の退色現象を防止することが出来る。なお、ガルバノスキャナ２３にシャッタ機能を持たせる以外に、ダイクロイックミラー２１と対物レンズ２６との間の光路内にシャッタを設けても良い。また、対物レンズ２６と標本２７との間に設けても良い。

このようにして、本発明の第１実施の形態にかかる顕微鏡装置が構成されている。

本第１実施の形態にかかる顕微鏡装置では、入射励起光の光量をレーザスキャニング顕微鏡ユニット１９内に配置されているダイクロイックミラー２１を透過する入射励起光の透過光路に配置したＰＤ２２で検出するので、入射励起光の光量を常時検出、測定することが出来る。また、ＰＤ２２はダイクロイックミラー２１を透過した入射励起光の光路上に配置され、ダイクロイックミラー２１を透過した入射励起光の光量を検出するため、ビームスプリッタ等の光学分離手段を新たに設ける必要もなく、光学系が簡単となり光学系の調整も容易となる。また、レーザスキャニング顕微鏡ユニット１９内は筐体に覆われており、ＰＤ２２をこの筐体内に配置すればＰＤ２２のノイズの原因となる外部照明光の影響を防止することが出来る。

次に、本第１実施の形態にかかる顕微鏡装置による蛍光測定の一例について説明する。

標本２７からの蛍光を測定する方法の１つにタイムラプスと呼ばれる方法がある。この方法は、所定の時間間隔（例えば、１分から１時間毎）で長時間（例えば、５時間程度）標本２７からの蛍光の変化を観察する方法である。このとき、室温変化等により図３（ａ）に示すように励起光であるレーザ光の強度（光量）が変動し、得られる蛍光の強度も図３（ｂ）に示すように励起光の変動成分を含んだ結果となり、正確な蛍光の変化を捉えることが出来ない虞がある。

本第１実施の形態にかかる顕微鏡装置では、ＰＭＴ３０で蛍光画像を取り込む時に、ＰＤ２２でその時の入射励起光の光量をコンピュータ３３に取り込み記憶し、レーザ光の強度の変動が生じていない観察時の最初に取り込んだ入射励起光の光量を基準として光量比率を算出し、この光量比率を用いて蛍光画像から得られる蛍光強度を規格化することで、図３（ｃ）に示すように、入射励起光の径時変化に影響されない蛍光の強度変化を捉えることが可能となる。

なお、図３（ｃ）の測定時間３０分から６０分間の段差は、細胞に刺激を与えた結果細胞活動が変化したことに起因する蛍光強度の変化によるものである。

本第１実施の形態にかかる顕微鏡装置では、蛍光強度を入射励起光の光量に基づき規格化する演算処理部を有しているため、入射励起光の光量変動があっても入射励起光の光量変動に影響されずに蛍光の強度変化を測定することが出来る。

なお、励起光の光源はレーザ光源に限定されず、ハロゲンランプや水銀ランプを光源等を用いても良い。また、調光手段として可変ＮＤフィルタを用いることで同様の効果を奏することが出来る。

（第２実施の形態）
次に、本発明の第２実施の形態にかかる顕微鏡装置に関し説明する。

図４は、本発明の第２実施の形態にかかる顕微鏡装置の概略構成図である。本第２実施の形態と第１実施の形態との相違点は、入射励起光の光量調整を自動的に行うフィードバック機能を有するところにある。第１実施の形態と同様の構成には同じ符号を付し説明を省略する。

図４において、ダイクロイックミラー２１を透過した入射励起光の光路上に透過光量を検出するＰＤ２２が配置されている。ＰＤ２２からの信号はＩ／Ｖ変換部３５により電圧に変換、増幅されてコントローラ３１の調光制御手段３６に入力され入射励起光の光量が測定されモニタ３４上に数値表示される。調光制御手段３６はコンピュータ３３から指示された光量と入射励起光の光量とを比較演算し、指定された入射励起光の光量となるように調光制御手段３６からＡＯＭ１４ａ、１４ｂに制御電圧を与える。これにより標本２７に励起光が照射されている間、コンピュータ３３から指定された入射励起光の光量を保持するフィードバック制御が行われる。

本第２実施の形態にかかる顕微鏡装置では、図５（ａ）に示すように、タイムラプス測定中において、常に一定の入射励起光の光量を自動的に維持できるため、図５（ｂ）に示すような入射励起光の光量変化の影響を受けない蛍光測定がより容易に可能となる。

また、調光手段に高速のＡＯＭ１４ａ、１４ｂを用いているので、励起光を標本２７に照射して蛍光観察をしている最中に入射励起光の光量変動があっても、光量を指定された値に修正するフィードバック制御が働き、更に容易に一定光量での蛍光観察が可能となる。

その他の作用、効果は第１実施の形態と同様であり説明を省略する。

（第３実施の形態）
次に、本発明の第３実施の形態にかかる顕微鏡装置に関し説明する。

図６は、本発明の第２実施の形態にかかる顕微鏡装置の概略構成図である。本第３実施の形態と第２実施の形態との相違点は、入射励起光の光源であるレーザ光源の切換えに対応してＩ／Ｖ変換部の増幅率を切換えるところにある。第２実施の形態と同様の構成には同じ符号を付し説明を省略する。

図６において、ダイクロイックミラー２１を透過した入射励起光の光路上に透過光量を検出するＰＤ２２が配置されている。ＰＤ２２からの信号はＩ／Ｖ変換部４０により電圧に変換、増幅されてコントローラ３１の調光制御手段３６に入力され入射励起光の光量が測定されモニタ３４上に数値表示される。調光制御手段３６はコンピュータ３３から指示された光量と入射励起光量とを比較演算し、指定された入射励起光の光量となるように調光制御手段３６からＡＯＭ１４ａ、１４ｂに制御電圧を与える。これにより標本２７に励起光が照射されている間、コンピュータ３３から指定された入射励起光の光量を保持するフィードバック制御が行われる。

本第３実施の形態にかかる顕微鏡装置では、レーザ光源１２ａ、１２ｂの切換に対応してＩ／Ｖ変換部４０の増幅率を切換えている。例えば、Ａｒレーザ光源１２ａを用いる場合、レーザ光の出力が約１０ｍＷ程度と大きく、ダイクロイックミラー２１の透過率が１％とするとＰＤ２２は約０．１ｍＷの光量を受光する。一方、ＧＨｅＮｅレーザ光源を用いる場合、レーザ光の出力は約１ｍＷ程度と小さく、同じくダイクロイックミラー２１の透過率が１％とするとＰＤ２２は約０．０１ｍＷの光量を受光する。また、ＡＯＭ１４ａ、１４ｂにより入射励起光をそれぞれ０．１％から１００％まで調整出来るとするとＰＤ２２からの信号を変換するＩ／Ｖ変換部４０のダイナミックレンジは４桁必要となり、広帯域の増幅器が必要となる。

本第３実施の形態にかかる顕微鏡装置では、Ｉ／Ｖ変換部４０に、レーザ光源１２ａ、１２ｂに対応した最適な増幅率を有するＩ／Ｖ変換部３５ａ、３５ｂを設け、Ａｒレーザ光源１２ａから励起光を入射する場合には、増幅率の小さいＩ／Ｖ変換部３５ａに、ＧＨｅＮｅレーザ光源１２ｂから励起光を入射する場合には、増幅率の大きいＩ／Ｖ変換部３５ｂに切換えることによって、最適な光量制御を達成することが可能となる。Ｉ／Ｖ変換部３５ａ、３５ｂの切換は、コンピュータ３３からの指示により、入射するレーザ光源が選択され、調光制御手段３６、シャッタ制御手段３８と連動して行われる。

なお、第３実施の形態では、レーザ光源が２個の場合について説明しているが、レーザ光源の数には限定されないことは言うまでもない。また、上記Ｉ／Ｖ変換部３５ａ、３５ｂの切換は、同一のレーザ光源において異なる出力範囲を用いる場合にも使用可能である。例えば、Ａｒレーザ光源１２ａを用い励起光の最大出力を１０ｍＷとする場合と、最大出力を１ｍＷにする場合とで切換えて使用することも出来る。

また、本第３実施の形態は、第１実施の形態を組み合わせた構成とすることも可能である。

その他の作用、効果は第２実施の形態と同様であり説明を省略する。

上述べたように、本発明によれば、レーザスキャニング顕微鏡ユニット内のダイクロイックミラーを透過した入射励起光の光量を検出するため、標本からの蛍光を観察中に常時入射励起光の光量を検出することが出来る。また、調光手段と調光制御手段によりレーザ光源の光量変動を補正可能なフィードバック制御が可能となる。

また、検出器がレーザスキャニング顕微鏡ユニット内に配置される場合、ノイズの原因となる外部照明光の影響を防止することが出来る。

また、顕微鏡ユニット内にシャッタを設けて蛍光測定以外の場合には入射励起光を遮断でき、標本の退色現象を防止することが可能となる。

また、レーザ光源に対応した増幅率を有するＩ／Ｖ変換部を有し、レーザ光源に対応して切換可能であり、レーザ光源の強度や、波長、ダイクロイックミラーの特性等により、最適なＩ／Ｖ変換部を選択することが可能となり、選択されたレーザ光源に最適な光量制御が可能となる。

なお、上述の実施の形態は例に過ぎず、上述の構成や形状に限定されるものではなく、本発明の範囲内において適宜修正、変更が可能である。

本発明の第１実施の形態にかかる顕微鏡装置の概略構成図である。 第１実施の形態に用いられている光学分離手段の分光特性を示す図である。 第１実施の形態の顕微鏡装置を用いて蛍光測定を行った例を示す図である。 本発明の第２実施の形態にかかる顕微鏡装置の概略構成図である。 第２実施の形態の顕微鏡装置を用いて蛍光測定を行った例を示す図である。 本発明の第３実施の形態にかかる顕微鏡装置の概略構成図である。

符号の説明

１１ 照明ユニット
１２ レーザ光源
１３ シャッタ
１４ 音響光学素子（ＡＯＭ）
１５ 全反射ミラー
１６ ダイクロイックミラー
１７ 集光レンズ
１８ 光ファイバー
１９ レーザスキャニング顕微鏡ユニット
２０ コリメータレンズ
２１ ダイクロイックミラー
２２ フォトダイオード（ＰＤ）
２３ ガルバノスキャナ
２４ 第１集光レンズ
２５ 第２集光レンズ
２６ 対物レンズ
２７ 標本
２８ バリアフィルタ
２９ 結像レンズ
３０ 高感度検出器（ＰＭＴ）
３１ コントローラ
３２ 画像処理部
３３ コンピュータ
３４ モニタ
３５ Ｉ／Ｖ変換部
３６ 調光制御手段
３７ スキャン制御手段
３８ シャッタ制御手段
４０ Ｉ／Ｖ変換部

Claims (8)

1. 励起光と標本からの蛍光とを分離する光学分離手段と、
   前記光学分離手段を透過した前記励起光の光量を検出する検出手段を有することを特徴とする顕微鏡装置。
2. 少なくとも１つの照明光源と、
   前記照明光源の光量を調整する調光手段と、
   前記検出手段の検出結果に基づき、前記励起光の光量を所定の光量に調整する制御手段を有することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
3. 少なくとも１つの照明光源と、前記照明光源の光量を調整する調光手段を有する照明ユニットと、
   前記照明ユニットからの励起光と標本からの蛍光を分離する光学分離手段と、前記光学分離手段の近傍に配置され、前記光学分離手段を透過した前記励起光の光量を検出する検出手段を有する顕微鏡ユニットと、
   前記検出手段からの信号を用いて前記調光手段を制御する制御手段と前記顕微鏡ユニットからの蛍光像を処理して画像表示する画像処理手段とを含む制御ユニットとを具備してなることを特徴とする顕微鏡装置。
4. 前記光学分離手段と前記標本との間に前記励起光を遮断する遮断手段を有し、
   前記励起光の光量を調整する際に、前記励起光を遮断することを特徴とする請求項１または２または３に記載の顕微鏡装置。
5. 前記遮断手段は、前記光学分離手段の近傍に配置され前記励起光を走査する走査手段であることを特徴とする請求項４に記載の顕微鏡装置。
6. 前記励起光の出射光量に応じて、前記検出手段からの信号の増幅率を切換える切換手段を有することを特徴とする請求項１から５の何れか１項に記載の顕微鏡装置。
7. 前記制御手段は、前記検出手段の検出結果を用い、前記調光手段により前記励起光の光量を所定の光量に自動的に調整するフィードバック機能を有することを特徴とする請求項２または３に記載の顕微鏡装置。
8. 時間間隔毎に前記励起光の光量を前記検出手段により検出して検出結果を記憶する記憶手段と、
   前記時間間隔毎に蛍光画像を取得する画像取得手段とを有し、
   前記検出結果のいずれか1つの検出結果を基準として、前記励起光の光量比率を演算し、前記蛍光画像の強度を前記光量比率に基づき規格化する演算処理部を有することを特徴とする請求項１から６のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。

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