JP2004532625A - 多種多様な病原体に対する樹状細胞の応答 - Google Patents
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Abstract
樹状細胞において種々の病原体に応答して活性化される別個の遺伝子発現プログラムが開示される。診断方法および処置方法もまた開示される。
Description
【０００１】
関連出願
本願は、２０００年１０月２４日出願の米国予備出願第６０／２４２，８００号（この全教示は本明細書中に参考として援用される）の利益を主張する。
【０００２】
発明の背景
ヒト免疫系は、多種多様な病原体により絶えず攻撃されている。この免疫系は、好中球、ナチュラルキラー細胞および他の細胞型を調節するサイトカインおよびケモカインを介する生得免疫応答で病原体にまず反応し、その後、適応免疫応答により反応する。生得免疫系は多くの侵入感染性因子を認識し得るレセプターを備えており、免疫応答を最適化するように反応し得るという仮説が立てられている。
【０００３】
免疫応答および適応応答の開始は、「樹状細胞」と呼ばれる抗原提示細胞のサブセットの活性化に決定的に依存する。樹状細胞は、ほとんどの組織、主に未熟段階に存在し、病原体または抗原の入来を調べている。一旦、これらの細胞が抗原を捕獲および保有すると、成熟および活性化を受け、劇的にＴ細胞を活性化する能力を増加する。活性化すると、樹状細胞は、抗原をリンパ器官に輸送し、特異的Ｔ細胞適応免疫応答を誘発し得る。樹状細胞が侵入病原体を認識し活性化される能力（例えば、ナイーブＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞が活性化し、次いで感染細胞または腫瘍細胞を殺傷し得る）は、免疫応答の開始において第一の重大な事象である。対照的に、樹状細胞はまた、自己反応性リンパ球を欠失することによる抗原に対する寛容の維持、それによる自己免疫応答の減少に関与する。樹状細胞は免疫に必須であるが、樹状細胞がこのような多種多様な病原体に対して生得および適応免疫応答を制御する方法についてはほとんど知られていない。
【０００４】
発明の要旨
本発明は、病原体に応じて樹状細胞により誘導された遺伝子発現パターンによって病原体を同定する方法を提供する。本明細書で記載されるように、別個の遺伝子発現プログラムが、種々の病原体に応じて活性化される。本発明は、疾患の診断、予後および処置に有用である。
【０００５】
１つの態様において、本発明は、１つ以上の樹状細胞からｍＲＮＡを単離する工程；および刺激特異的遺伝子が特異的である病原体の感染を示す少なくとも１つの刺激特異的遺伝子の遺伝子発現を決定する工程を含む病原体による感染を同定する方法に関する。代替の態様において、本発明は、１つ以上の未熟樹状細胞を病原体またはその１つ以上の免疫原性成分と接触させる工程；この樹状細胞からｍＲＮＡを単離し、標識する工程；遺伝子発現プロフィールが生じるように、この樹状細胞から標識ｍＲＮＡを検出する工程；ならびに少なくとも１つの刺激特異的遺伝子が同定されるように、１つ以上の参考遺伝子発現プロフィールと比較してこの遺伝子発現プロフィールを解析し、それによりこの刺激が特異的である病原体を同定する工程を含む、病原体を同定する方法に関する。
【０００６】
別の態様において、本発明は、哺乳動物由来の１つ以上の樹状細胞からｍＲＮＡを単離する工程；このｍＲＮＡを少なくとも１つの刺激応答性遺伝子プローブと接触させる工程、ここで刺激応答性遺伝子プローブのｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションがこの哺乳動物における感染を示す、を含む、哺乳動物における感染を診断する方法に関する。特定の態様において、刺激応答性遺伝子は刺激特異的である。別の特定の態様において、刺激応答性遺伝子は、共通の刺激応答性遺伝子である。
【０００７】
別の態様において、本発明は、哺乳動物由来の１つ以上の樹状細胞からタンパク質を単離する工程；このタンパク質を刺激特異的遺伝子によりコードされるタンパク質に対する少なくとも１つの抗体と接触させる工程、ここで、このタンパク質に対する抗体の結合はこの動物における感染を示す、を含む、哺乳動物における感染を診断する方法に関する。
【０００８】
別の態様において、本発明は、哺乳動物における１つ以上の樹状細胞からｍＲＮＡを単離する工程；および少なくとも１つの刺激特異的遺伝子の遺伝子発現を決定する工程、ここで、刺激特異的遺伝子が特異的である病原体による感染を示すを含む、哺乳動物における病原体による感染を診断する方法に関する。
【０００９】
特定の態様において、刺激応答性遺伝子発現は減少する。別の特定に態様において、刺激応答性遺伝子発現は増大する。
【００１０】
別の態様において、本発明は、臨床的結果で補正される刺激応答性遺伝子の遺伝子プロフィールを解析することにより感染した個体に対する予後を予測する方法に関する。
【００１１】
別の態様において、本発明は、病原体を同定し、その結果治療養生法（ｒｅｇｉｍｅｎ）を処方する（ｆｏｒｍｕｌａｔｅ）工程を含む、治療養生法を処方する方法に関する。さらに、病原体に対する患者の度重なる評価は、次いでその結果変更され得る治療養生法の有効性を決定し得る。
【００１２】
別の態様において、本発明は、１つ以上の未熟樹状細胞を試験ワクチンと接触させる工程；この樹状細胞からｍＲＮＡを単離する工程；この樹状細胞における遺伝子プロフィールを決定する工程；および最適なワクチンを示す遺伝子発現プロフィールを顕在化させる試験ワクチンを選択する工程を含む、ワクチンを最適化する方法に関する。
【００１３】
別の態様において、本発明は、樹状細胞が活性化されるように患者の樹状細胞を病原体またはその成分と接触させる工程；および活性化された樹状細胞がこの病原体に対して免疫応答を誘発するようにこの活性化された樹状細胞を患者に戻す工程を含む、病原体に対するエキソビボ治療的処置に関する。
【００１４】
別の態様において、本発明は、樹状細胞が活性化されるように患者の樹状細胞を腫瘍細胞またはその成分と接触させる工程；および活性化された樹状細胞がこの腫瘍細胞またはその成分に対して免疫応答を誘発するようにこの活性化された樹状細胞を患者に戻す工程を含む、腫瘍に対するエキソビボ治療的処置に関する。
【００１５】
別の態様において、本発明は、樹状細胞が活性化されるように患者の樹状細胞を自身の抗原またはその成分と接触させる工程；活性化された樹状細胞がこの自身の抗原またはその成分に対して免疫応答を誘発しないようにこの活性化された樹状細胞を患者に戻す工程を含む、自己免疫に対するエキソビボ治療的処置に関する。
【００１６】
別の態様において、本発明は、樹状細胞が活性化されるように患者の樹状細胞を移植片組織またはその成分と接触させる工程；活性化された樹状細胞がこの移植片組織またはその成分に対して免疫応答を誘発しないようにこの活性化された樹状細胞を患者に戻す工程を含む、移植片拒絶反応に対するエキソビボ治療的処置に関する。
【００１７】
別の態様において、本発明は、１つ以上の樹状細胞を刺激と接触させる工程；免疫応答を示す少なくとも１つの刺激応答性遺伝子が同定されるように、この樹状細胞からｍＲＮＡを単離して遺伝子プロフィールを決定する工程を含む、刺激に対する免疫応答を測定する方法に関する。
【００１８】
別の態様において、本発明は、１つ以上の樹状細胞を刺激と接触させる工程；この樹状細胞からｍＲＮＡを単離し標識する工程；ＤＮＡマイクロアレイをこの樹状細胞由来の標識ｍＲＮＡと接触させる工程；および免疫応答を示す少なくとも１つの刺激応答性遺伝子が同定されるように対照刺激と比較して遺伝子プロフィールを解析する工程を含む、刺激に対する免疫応答を測定する方法に関する。特定の態様において、樹状細胞は末梢血から得られる。別の特定の態様において、刺激は、細菌、真菌、ウイルス、またはその成分からなる群より選択される。別の特定の態様において、刺激は、エスケリチア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｎｓ）、インフルエンザウイルス、カンジダ・アルビカン（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）、リポ多糖類（ＬＰＳ）、ポリＩ：Ｃ、および酵母マンナンからなる群より選択される。特定の態様において、刺激は、物理的、化学的、または電気的刺激からなる群より選択される。別の態様において、刺激は、無機化学物質および有機化学物質からなる群より選択させる組み合わせを含む。特定の態様において、ＤＮＡマイクロアレイは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ＨＵ ６８００である。別の特定の態様において、ＤＮＡマイクロアレイは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ ＧｅｎｏｍｅＵ９５セットである。
【００１９】
別の態様において、刺激応答性遺伝子の発現は、刺激に応じて増加する。別の態様において、刺激応答性遺伝子の発現は、刺激に応じて減少する。別の態様において、刺激応答性遺伝子は、刺激特異的である。
【００２０】
別の態様において、本発明は、未熟樹状細胞を刺激と接触させる工程、この樹状細胞からｍＲＮＡを単離し標識する工程、ならびに少なくとも１つの刺激応答性遺伝子が同定されるように対照刺激と比較して遺伝子プロフィールを測定し解析する工程を含む、刺激に応じて樹状細胞における遺伝子プロフィールを測定する方法に関する。
【００２１】
別の態様において、本発明は、樹状細胞を刺激と接触させる工程；この樹状細胞からｍＲＮＡを単離し標識する工程；ＤＮＡマイクロアレイをこの樹状細胞由来の標識ｍＲＮＡと接触させる工程；および少なくとも１つの刺激応答性遺伝子を含むデータベースが作製されるように、対照刺激と比較して遺伝子プロフィールを測定し解析する工程を含む、刺激応答性遺伝子を含むデータベースの生成に関する。別の態様において、本発明は、樹状細胞を刺激と接触させる工程；この樹状細胞からｍＲＮＡを単離し標識する工程；ＤＮＡマイクロアレイをこの樹状細胞由来の標識ｍＲＮＡと接触させる工程；および少なくとも１つの刺激特異的遺伝子を含むデータベースが作製されるように、対照刺激と比較して遺伝子プロフィールを測定し解析する工程を含む、刺激特異的遺伝子を含むデータベースの形成に関する。別の態様において、本発明は、樹状細胞を刺激と接触させる工程；この樹状細胞からｍＲＮＡを単離し標識する工程；ＤＮＡマイクロアレイをこの樹状細胞由来の標識ｍＲＮＡと接触させる工程；および少なくとも１つの共通の刺激応答性遺伝子を含むデータベースが作製されるように、対照刺激と比較して遺伝子プロフィールを測定し解析する工程を含む、共通免疫応答遺伝子を含むデータベースの形成に関する。別の態様において、本発明は、刺激応答性遺伝子のデータベース、刺激特異的遺伝子のデータベースおよび共通の免疫応答遺伝子のデータベースに関する。
【００２２】
別の態様において、本発明は、１つ以上の未熟樹状細胞を刺激と接触させる工程；この樹状細胞からｍＲＮＡを単離する工程；および少なくとも１つの刺激特異的遺伝子が同定されるように、遺伝子プロフィールを決定し、それによりこの刺激特異的遺伝子が特異的である病原体を同定する工程を含む、病原体を同定する方法に関する。別の態様において、本発明は、１つ以上の未熟樹状細胞を刺激と接触させる工程；この樹状細胞からｍＲＮＡを単離し標識する工程；ＤＮＡマイクロアレイをこの樹状細胞由来の標識ｍＲＮＡと接触させる工程；および少なくとも１つの刺激特異的遺伝子が同定されるように、対照刺激と比較して遺伝子プロフィールを測定し解析し、それによりこの刺激特異的遺伝子が特異的である病原体を同定する工程を含む、病原体を同定する方法に関する。
【００２３】
別の態様において、本発明は、樹状細胞からｍＲＮＡを単離する工程；および少なくとも１つの刺激特異的遺伝子が同定されるように、遺伝子プロフィールを決定し、それにより刺激特異的遺伝子が特異的である（これが感染を示す）病原体を同定する工程を含む、病原体による感染を診断する方法に関する。別の態様において、本発明は、樹状細胞からｍＲＮＡを単離し標識する工程；ＤＮＡマイクロアレイをこの樹状細胞由来の標識ｍＲＮＡと接触させる工程；および少なくとも１つの刺激特異的遺伝子が同定されるように、対照刺激と比較して遺伝子プロフィールを測定し解析し、それにより刺激特異的遺伝子が特異的である（これが感染を示す）病原体を同定する工程を含む、病原体による感染を診断する方法に関する。
【００２４】
樹状細胞における刺激特異的、刺激応答性および共通の刺激応答性遺伝子の同定は、医薬および探索において重要な新規な治療的、診断的および予後的ツールを提供する。
【００２５】
発明の詳細な説明
樹状細胞は、病原体の広いアレイに対する免疫応答において重大な役割をはたすが、この応答の分子成分についてはほとんど知られていない。本発明は、少なくとも部分的に、病原体への樹状細胞の曝露が遺伝子発現の病原体特異的パターンを生じるという発見に基づく。したがって、本発明は、本明細書に記載の遺伝子発現プロファイルに基づく感染性因子の同定に使用されうる。本発明はまた、さらなる病原体またはその成分に対する遺伝子発現の病原体特異的パターンを決定するための方法を提供する。本明細書に記載の知見により、免疫応答を誘発する各病原体における重要な成分が決定され、したがって免疫療法のための確固とした標的が提供される。したがって、本発明は、宿主−病原体相互作用のより良好な理解を提供し、公知および新規の病原体の同定を助け、感染性疾患の診断および治療を改善する。
【００２６】
疾患を生じる病原体の同定は、治療が病原体に依存して広く変化するので、有効な治療の提供において最も重要である。１つの態様において、本発明は、脊椎動物（例えば、哺乳動物）由来の１つ以上の樹状細胞からｍＲＮＡを単離する工程；および少なくとも１つの刺激−特異的遺伝子の遺伝子発現プロファイルを決定する工程を含み、ここで該遺伝子発現プロファイルは、刺激−特異的遺伝子が特異的である病原体による感染を示す、脊椎動物に感染している病原体を同定する方法である。ＲＮＡを単離する方法は、本明細書に記載されており、当業者に周知である。本明細書で使用される「遺伝子プロファイル」または「遺伝子発現プロファイル」は、本明細書に記載される方法または当該分野で公知の他の方法により評価した場合の特定の遺伝子の遺伝子発現のレベルまたは量として定義される。遺伝子発現プロファイルは、１つ以上の遺伝子のデータを含有し得、単一時点または一定時間にわたり測定されうる（図７Ｂ参照）。病原体は、感染した脊椎動物から得られる樹状細胞から得られる遺伝子発現プロファイルを、図７Ｅに示されるものなどの１つ以上の刺激−特異的遺伝子発現プロファイル（例えば、データベース中）と比較することにより、同定されうる。病原体は、特定の遺伝子プロファイルにより同定される病原体のファミリーまたはクラスでありうる。例えば、病原体は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａファミリーのメンバー（例えば、大腸菌）、Ｃａｎｄｉｄａ ファミリーのメンバー（例えば、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）またはインフルエンザウイルスのファミリーのメンバーでありうる。それゆえ、本発明は、疾患または病気を生じる病原体のクラスを同定し、したがって、治療養生法（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｒｅｇｉｍｅｎ）の選択を助けうる。本明細書で使用される「治療養生法」は、患者が疾患または疾病を除去する、緩和するまたは弱めるために受ける臨床治療のことを言う。
【００２７】
さらに、本発明は、刺激−応答性（図１Ａ〜１ＧＧ 、２Ａ〜２Ｚ、３Ａ〜３Ｎ、１１Ａ〜１１ＡＡＡＡＡＡＡ 、１３Ａ 〜１３ＺＺＺＺＺＺ、および１５Ａ 〜１５ＫＫＫＫ）遺伝子、刺激−特異的（図４Ａ〜４Ｆ、５Ａ〜５Ｃ、１２Ａ 〜１２ＡＡ、１４Ａ 〜１４ＢＢ、１６Ａ〜１６Ｆ ）遺伝子および共通刺激−応答性（図６Ａ〜６Ｅおよび１７Ａ 〜１７ＩＩ）遺伝子を提供する。したがって、本発明は、特異的な病原体に対する選択的な免疫応答および全ての感染生物により惹起される共通免疫応答に重要である遺伝子に関する情報を提供し（図７Ａ）、それにより診断および治療のためのさらなる標的を提供する。
【００２８】
本明細書で使用される「刺激−応答性」遺伝子は、免疫応答を惹起する病原体または病原体の成分に応答して調節される遺伝子のことを言う。「刺激−応答性」および「病原体−調節」は、交換可能に使用されうる。本明細書で使用される「刺激−特異的」遺伝子は、病原体、病原体−クラスまたはそれらの成分により特異的に調節される遺伝子のことを言う。「刺激−特異的」および「病原体−特異的」は、交換可能に使用されうる。本明細書で使用される「共通刺激−応答性遺伝子」は、２つ以上の病原体、病原体クラスまたはそれらの成分に応答して調節される遺伝子のことを言う。「共通刺激−応答性」遺伝子および「共通調節」遺伝子は、交換可能に使用されうる。
【００２９】
本明細書で使用される場合、刺激−応答性遺伝子は、以下の基準を満足することにより、同定される（すなわち、選択される）：刺激に応答した遺伝子発現スコアの比が、アップレギュレートされた遺伝子に対して２つの連続した時点で対照媒体と比較して１．２ 倍より多く異なるか、または１つの時点で４倍より多く異なる；またはダウンレギュレートされた遺伝子に対して４つの連続した時点で−１．４倍未満である。共通調節遺伝子は、全ての病原体にわたる上記病原体アップレギュレート遺伝子の交差（ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｏｎ）に基づいて選択される。共通ダウンレギュレート遺伝子は、全ての病原体にわたり３つの連続した点で−１．２倍未満の比に基づいて選択された。
【００３０】
刺激−特異的遺伝子は、以下の基準を満足することにより、同定される（すなわち、選択される）：病原体に応答した遺伝子発現スコアの比が、全３ドナーに対して対照媒体と比較して２．５ 倍より多く異なるか、または全３ドナーに対して２つの連続した時点で１．４ 倍より多く異なる。本発明を使用して、刺激−応答性遺伝子、刺激−特異的遺伝子、および／または共通刺激−応答性遺伝子を含有するデータベース（図１Ａ〜１ＧＧ、２Ａ〜２Ｚ、３Ａ〜３Ｎ、４Ａ〜４Ｆ、５Ａ〜５Ｃ、６Ａ〜６Ｉ、１１Ａ 〜１１ＡＡＡＡＡＡＡ 、１２Ａ 〜１２ＡＡ、１３Ａ 〜１３ＺＺＺＺＺＺ、１４Ａ 〜１４ＢＢ、１５Ａ〜１５ＫＫＫＫ、１６Ａ 〜１６Ｆ および１７Ａ 〜１７ＩＩを参照のこと）を作製しうることが明らかである。これらのデータベースは、医学、研究および産業において、多くの適用を有するであろう。特に、本明細書に記載され、本発明の方法により同定される遺伝子プロファイルは、樹状細胞が曝露されている病原体または病原体クラスを同定するために使用されうる。
【００３１】
代替的な態様において、本発明は、１つ以上の未熟樹状細胞を病原体または１つ以上のその免疫原性成分と接触させる工程；該樹状細胞からｍＲＮＡを単離および標識する工程；遺伝子発現プロファイルが作製されるように、該樹状細胞から標識ｍＲＮＡを検出する工程；ならびに、少なくとも１つの刺激−特異的遺伝子が同定されるように、１つ以上の参照遺伝子発現プロファイルと比較して遺伝子発現プロファイルを解析し、それにより刺激−特異的遺伝子が特異的である病原体を同定する工程を含む、病原体を同定する方法に関する。本発明は、病原体に対して環境的、産業的および居住的単離物を試験することを含むがこれらに限定されない多くの臨床的および非臨床的方法に有用である。
【００３２】
感染の診断は、患者の治療における最初の重大な工程である。別の態様において、本発明は、哺乳動物における１つ以上の樹状細胞からｍＲＮＡを単離する工程；該ｍＲＮＡを少なくとも１つの刺激−応答性遺伝子プローブと接触させる工程を含み、ここで該ｍＲＮＡへの刺激−応答性遺伝子プローブのハイブリダイゼーションは、該哺乳動物における感染を示す、哺乳動物における感染を診断する方法に関する。本明細書に記載されるように、対照との比較における刺激−特異的遺伝子の遺伝子発現の比は、感染の原因である病原体（存在する場合）を同定する。さらに、当業者の十分能力内にある本発明のバリエーションがある。例えば、脊椎動物における感染を同定するために、遺伝子プローブは、刺激−特異的または共通刺激−応答性遺伝子プローブでありうる。各プローブタイプの使用に対する基準が、本明細書に記載される。その標的に対するプローブのハイブリダイゼーションを測定する方法、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、核酸ブロッティング、およびミクロアレイは、当該分野で十分特徴づけられる。刺激−応答性プローブのハイブリダイゼーションの量またはレベルは、陽性または陰性、あるいは時間経過において測定される場合、両方の組み合わせでありうる。さらに、遺伝子の不在は、感染を示しうる。
【００３３】
別の態様において、本発明は、哺乳動物に由来する１つ以上の樹状細胞からタンパク質を単離する工程；該タンパク質を少なくとも１つの刺激−特異的抗体と接触させる工程を含み、ここで該タンパク質への刺激得的抗体の結合は、該哺乳動物における感染を示す、哺乳動物における感染を診断する方法に関する。タンパク質を細胞から抽出する方法および抗体を調製する方法は、当該分野で周知である。抗体は、ポリクローナルおよび／またはモノクローナルでありうる。刺激−特異的抗体の混合物はまた、刺激−特異的タンパク質を検出するために使用されうる。抽出タンパク質への刺激−特異的抗体の結合の欠如は、１つもしくは複数の病原体または１つもしくは複数の病原体の型による感染の診断でありうる。
【００３４】
別の態様において、本発明は、哺乳動物において１つ以上の樹状細胞からｍＲＮＡを単離する工程；少なくとも１つの刺激−特異的遺伝子の遺伝子プロファイルを決定する工程を含み、ここで刺激−特異的遺伝子の発現は、刺激−特異的遺伝子が特異的である病原体による感染を示す、哺乳動物における特異的な病原体による感染を診断する方法に関する。刺激−特異的遺伝子のプロファイルは、陽性または陰性でありうる。本明細書で規定される「陽性」は、対照遺伝子プロファイルと比較した遺伝子発現プロファイルにおける増加を意味する。本明細書で規定される「陰性」は、対照プロファイルと比較した遺伝子発現プロファイルにおける減少を意味する。
【００３５】
別の態様において、本発明は、刺激−応答性遺伝子の遺伝子発現プロファイルを解析することによって、ここで特異的発現プロファイルが臨床結果に対応する、感染個体に対する予後を予測する方法に関する。例えば、本発明により決定される遺伝子プロファイルの患者の予後は、乏しい予後に対応する。本発明の利点は、患者に対するより積極的な治療に利用されることである。本明細書に記載の刺激−特異的または共通刺激−応答性遺伝子の遺伝子プロファイルについて試験されている個体の集団に対して、対比が行われる。かかる解析を行なうために、少なくとも１つの刺激−特異的または共通刺激−応答性遺伝子に対する遺伝子プロファイルが、１セットの個体に対して決定され、そのいくつかは特定の特徴を示し、そのいくつかは該特徴の欠如を示す。カイ二乗検定などの標準統計方法により対比が行われ得、１つまたは複数の遺伝子プロファイルと表現型特徴との間の統計的に有意な相関が記載される。例えば、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ） 特異的遺伝子プロファイルの存在は、湿疹に相関することが見出されるであろう。
【００３６】
かかる相関は、いくつかの方法において活かされうる。治療に利用できる遺伝子プロファイルと疾患との間の強い相関の場合、ヒトまたは動物患者における刺激−応答性遺伝子プロファイルの検出は、治療の即時適用、または少なくとも患者の規則的なモニタリングの開始を正当化しうる。刺激−特異的遺伝子プロファイルとヒト疾患との間のより弱いがまだ統計的に有意である相関の場合、即時治療介入またはモニタリングは、正当化されないであろう。にもかかわらず、患者は、患者に対して少ないコストで達成されうるが、患者が増加した感受性を有しうる状態の危険を低減するのに潜在的利益を与えうる簡単な生活様式変化（例えば、規定食、運動）を始めるように刺激−応答性遺伝子プロファイルによって動機づけられうる。増加した感受性と疾患に対するいくつかの治療養生法の１つの相関を示す患者における刺激−応答性遺伝子プロファイルの同定は、この治療養生法が続けられるべきであることを示す。
【００３７】
代替的には、本発明は、治療養生法を処方するために使用されうる。本明細書で使用される場合、「治療養生法」は、薬理剤を用いた患者の治療として規定される。１つの態様において、本発明は、病原体を同定する工程、およびそれに応じて治療養生法を処方する工程を含む、治療養生法を処方する方法に関する。さらに、病原体に対する患者の繰り返し評価は、次いでそれに応じて変更されうる治療養生法の効力を決定しうる。治療養生法の効力を決定する方法は、当該分野で公知である。
【００３８】
ワクチン開発は、医学における最も重要な見込みのある健康保護の１つである。本発明は、ワクチン最適化に理論的に適切である。１つの態様において、本発明は、樹状細胞を試験ワクチンと接触させる工程、該樹状細胞からｍＲＮＡを単離する工程；該樹状細胞における遺伝子発現プロファイルを決定する工程；ならびに最適化ワクチンを示す遺伝子発現プロファイルを惹起する試験ワクチンを選択する工程を含む、ワクチン最適化方法に関する。ワクチンの構築およびバリアント試験ワクチンの作製は、当業者に公知である。本明細書で使用される場合、「バリアント試験ワクチン」は、最初の試験ワクチンの異なる組成物である。最適化免疫応答とは、最も高いレベルの病原体免疫性または死滅を促進する免疫応答のことを言う。病原体の免疫性および死滅を測定する方法は、当該分野において十分特徴づけられている。最適化ワクチンは、本明細書に記載のように決定され、最も強い免疫応答を惹起する試験ワクチンとして規定される。例えば、最適化ワクチンは、利用される場合、病原体に対する標準ワクチンにより生じる応答を少なくとも有するであろう。最適化ワクチンの遺伝子発現プロファイルは、他の非関連ワクチンと異なりうる。
【００３９】
樹状細胞は、生得および適応できる免疫応答を開始するので、それらは本発明によって特異的抗原に対する免疫応答を誘発するのに十分適切である。１つの態様において、本発明は、患者の樹状細胞を病原体またはその免疫原性成分と、該樹状細胞が活性化されるように接触させる工程；活性化樹状細胞が該病原体に対する免疫応答を誘発するように、患者に活性化樹状細胞を戻す工程を含む、病原体に対するエクスビボ治療処置に関する。活性化樹状細胞は、ＣＤ８６、ＣＤ８３、およびＨＬＡ−ＤＲを含む特異的細胞表面マーカーを発現する。マーカーをスクリーニングする方法は、当業者に公知である。
【００４０】
別の態様において、本発明は、患者の樹状細胞を腫瘍細胞またはその免疫原性成分と、該樹状細胞が活性化されるようにエクスビボで接触させる工程；ならびに、活性化樹状細胞が該腫瘍細胞またはその成分に対する免疫応答を誘発するように、患者に活性化樹状細胞を戻す工程を含む、腫瘍のエクスビボ治療処置に関する。任意の腫瘍細胞の型が使用されうる。
【００４１】
樹状細胞はまた、自己免疫疾患（たとえば、関節炎など）や器官移植に重要な抗原耐性に関与する。別の態様において、本発明により、患者の樹状細胞をその樹状細胞が活性化されるように自己抗原またはその免疫原成分とエクス・ビボで接触させる工程、活性化された樹状細胞が該自己抗原またはその成分に対して免疫応答を引き起こさないように、この活性化された樹状細胞を患者に戻す工程を含む、自己免疫のエクス・ビボ治療法が導入される。
【００４２】
器官移植に関連する大部分の共通の問題は、移植片拒絶反応である。移植片拒絶反応は、移植された組織が非自己として認識されるプロセスであり、移植された組織の破壊を導く免疫応答を引き起こす。別の態様において、本発明により、患者の樹状細胞をこの樹状細胞が活性化されるように移植片組織またはその成分と接触させる工程、活性化された樹状細胞が移植片組織またはその成分に対して免疫応答を引き起こさないように、この活性化された樹状細胞を患者に戻す工程を含む、移植片拒絶反応のエクス・ビボ治療法が導入される。
【００４３】
別の態様において、本発明により、樹状細胞を刺激物質と接触させる工程、該樹状細胞からｍＲＮＡを単離して、免疫応答を示す少なくとも１つの刺激物質応答遺伝子（ｓｔｉｍｕｌｕｓ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｇｅｎｅ） が同定されるように、遺伝子プロフィールを決定する工程を含む、刺激物質に対する免疫応答を測定する方法が導入される。１以上の遺伝子の遺伝子プロフィールは、本明細書に記載されるように、および当業者に公知の方法で測定することができ、その例としては、アフィニティークロマトグラフィー、核酸ブロッティングおよびミクロアレイが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４４】
別の態様において、本発明により、樹状細胞を刺激物質と接触させる工程、該樹状細胞からｍＲＮＡを単離し標識する工程、該樹状細胞由来の標識したｍＲＮＡとＤＮＡミクロアレイとを接触させる工程、および少なくとも一つの刺激物質応答遺伝子が同定されるように、対照刺激物質に関連する遺伝子プロフィールを測定する工程を含む、刺激物質に対する免疫応答の測定方法が導入される。別の態様において、本発明は、樹状細胞を刺激物質と接触させる工程、該樹状細胞からＲＮＡを単離し標識する工程、該樹状細胞由来の標識したｍＲＮＡとＤＮＡミクロアレイとを接触させる工程、および少なくとも一つの刺激物質応答遺伝子が同定されるように、対照刺激物質に関連する遺伝子プロフィールを測定する工程を含む、刺激物質に応答する際に樹状細胞の遺伝子プロフィールを測定することを指向する。樹状細胞の好ましい供給源は、末梢血であるが、他の体液、組織、器官を含む任意の供給源から単離されまたは市販の供給源から得られ得る。樹状細胞の単離培養方法は、当業者に周知であり、本明細書に記載されている。本明細書で用いられるように、「未熟」樹状細胞は、抗原に曝露されていない樹状細胞として定義される。未熟樹状細胞の作製方法は、本明細書に記載されている。
【００４５】
本発明での使用に適当な刺激物質（たとえば、病原体）は、細菌、酵母、真菌、およびウイルスであり、大腸菌、スタフィロコッカス・アウレンス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｎｓ）、インフルエンザウイルス、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ポリＩ：Ｃ、酵母マンナンおよびｄｓ ＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）またはそれらの成分が挙げられる。細菌は、グラム陽性またはグラム陰性であり得る。ウイルスは、ＲＮＡ（一本鎖または二本鎖）ウイルスまたはＤＮＡウイルスであり得る。細菌、酵母、およびウイルスは、大多数の樹状細胞が各細胞が応答するように微生物と接触されることを確実にするのに十分な（しかし、微生物が組織培養プレート中で異常増殖しないおよび／または樹状細胞を殺さないだけの十分低い）濃度で使用されるべきである。細菌および真菌は、約１〜１０，０００の感染多重度（ＭＯＩ）で使用され得る。詳細な態様において、細菌または真菌は、約１．５〜約１０００、約２〜約５０、約３〜約２０ＭＯＩ、または約５〜約１０ＭＯＩで使用され得る。さらに、刺激物質は、物理的、化学的、または電気的であり得る。さらに、刺激物質は無機化学薬品、有機化学薬品またはそれらの組み合わせたものを含み得る。刺激物質は、樹状細胞に曝露された場合、好ましくは免疫応答を引き出す。免疫応答を測定する方法は、当該分野においてよくキャラクタライズされている。
【００４６】
本発明の一つの態様において、樹状細胞は、刺激物質と共に培養される。次に、ｍＲＮＡが、曝露後種々の時点で樹状細胞から単離される。培養物中の細胞からのｍＲＮＡの単離は、技術標準である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．およびＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ １９８７，＆ Ｓｕｐｐ．４９，２０００ を参照のこと、この教示は参照により本明細書に取り込まれる）。ｍＲＮＡは、ついで、標準的な方法（上記参照文献を参照のこと）により標識される。ｍＲＮＡは、任意の適当な分子、たとえば、発蛍光団、ビオチン、放射性ヌクレオチド、および染料で標識されてもよい。好ましい態様において、ｍＲＮＡは蛍光的に標識される。ひとつの態様において、標識されたｍＲＮＡは、次いで、ＤＮＡミクロアレイにハイブリダイズされ得る。ＤＮＡミクロアレイは、任意の高密度オリゴヌクレオチドミクロアレイ、たとえば、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ＨＵ６８００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， ＣＡ）であり得る。標識されたｍＲＮＡのＤＮＡミクロアレイへのハイブリダイゼーションは、当業者に公知である（Ｔａｍａｙｏら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９９）９６：２９０７−２９１２； Ｅｉｓｅｎ ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９９９） ３０３：１７９−２０５）。
【００４７】
標識されたｍＲＮＡ／ＤＮＡミクロアレイのハイブリダイゼーションからの遺伝子プロフィールの定量を、ミクロアレイをスキャンしてアフィメトリックススキャナー（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， ＣＡ）を用いてミクロアレイ上の各位置でのハイブリダイゼーションの量を測定することで行う。各刺激物質について、時系列のｍＲＮＡレベル（Ｃ＝｛Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３，．．．Ｃｎ｝）および刺激物質と同じ実験での対照培地中の対応する時系列のｍＲＮＡレベル（Ｍ＝｛Ｍ１，Ｍ２，Ｍ３，．．．Ｍｎ｝）が得られる。定量データを次いで分析する。ＣｉおよびＭｉ（ｉはｉ番目の時点を示し、ｎは全時間コースの時点の総数を示す）を相関定常状態ｍＲＮＡレベルとして規定する。μＭおよびσＭは、それぞれ対照時間コースの平均および標準偏差として規定される。
【００４８】
あるいは、標識されたＲＮＡは、本明細書に記載される病原体特異的または一般的な調節された遺伝子を含む標的核酸を含有するフィルターまたは他の固体支持体にハイブリダイズされ得る。ハイブリダイゼーション条件は、標識されたＲＮＡと標的遺伝子との間の特異的な結合を確実にするのに十分なくらいストリンジェントであるべきである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当業者に公知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．およびＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ １９８７，＆ Ｓｕｐｐ．４９，２０００ を参照のこと）。特異的ハイブリダイゼーションの定量は、シンチレーションと濃度計を含む任意の適当な方法により行うことができる。
【００４９】
本発明による刺激物質特異的データベースの生成は、患者中の病原体を同定する方法を提供するだろう。樹状細胞は末梢血で見られるため、それらは静脈穿刺により容易に得られる。一つの態様において、本発明により、患者の樹状細胞を単離する工程、該樹状細胞からｍＲＮＡを単離し標識する工程、ＤＮＡミクロアレイを樹状細胞由来の標識されたｍＲＮＡと接触させる工程、および少なくとも一つの刺激物質特異的遺伝子が同定されるように、遺伝子プロフィールを測定し分析する工程を含む、病原体の同定方法が導入される。刺激物質特異的遺伝子は、次いで、病原体が同定されるように刺激物質特異的データベースをサーチするのに使用される。刺激物質特異的遺伝子は複数の病原体に対して特異的であってもよい。また、病原体は、病原体のファミリーに属し得る。
【００５０】
本発明は、全ての記載された態様についてのキットを包含する。本発明は、大腸菌、カンジダ・アルビカンス、インフルエンザウイルスおよびそれらの成分に応答して調節される遺伝子のリストを提供する。本発明の方法は、病原体を同定し、感染を診断するのに使用され得る。さらに、本発明は、ワクチンを最適化する方法や、関節炎および移植片拒絶反応などの自己免疫疾患を治療する方法を提供する。
【００５１】
本発明は、その好ましい態様に関して特に示され、記載されているが、当業者であれば、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲から逸脱することなく、形態や詳細において種々の変更がここでなされ得ることは理解されるであろう。本明細書で引用された全ての参照文献の教示は、参照により本明細書中に取り込まれる。
【００５２】
実施例１．
樹状細胞の調製
傾瀉されたヒト単球（ＡｄｖａｎｃｅｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｃｏｌｕｍｂｉａ ＭＤ） は、１０００Ｕ／ｍｌ ＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ）および１０００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−４（Ｒ＆Ｄシステムズ）を補足した１０％ウシ胎仔血清（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ） とＲＰＭＩ中で７日間、２４ウェルプレート（１ｍｌ培地／ウエル中１０６細胞）で培養し、培養（１）後、２日ごとに培地を供給した。
【００５３】
樹状細胞の刺激
７日目に、樹状細胞（ＤＣ）（上記）を採取し、１×１０７ 細胞／プレートで１００ｍｍプレートに等分し、３７℃で６０分間インキュベートした。病原体またはそれらの成分をついで以下に示す量でＤＣ培養物に添加した。成熟したＤＣ樹状形成を示す刺激された細胞は、２４時間で付着力を失い、典型的なＤＣマーカー（ｃｄ８３、ｃｄ８６）を発現し、ＤＣ：Ｔの比率が１：１０００〜１：１０で異質遺伝型Ｔ細胞増殖を刺激した。以下の微生物を示される力価で使用した：大腸菌ＳＤ５４（ＡＴＣＣ）（５：１ＭＯＩ）（Ｊ．Ｎａｕ から好意的に提供された） 、インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４（７５０ＨＡＵ／ｍｌ（血球凝集素単位／ｍｌ）、５０％の細胞に感染するのに必要なウイルスの量は約５〜１０ＨＡＵ／ｍｌであった、Ｊ．Ｈｅｒｍａｎｎの贈与） 、カンジダ・アルビカンスＨＬＣ５４（５：１ＭＯＩ）（Ｇ．Ｆｉｎｋ の贈与） 、および以下の示された濃度の成分：大腸菌０５５：Ｂ５由来のＬＰＳ（リポ多糖）（１ｍｇ／ｍｌ，ＳｉｇｍａＬ−２８８０） 、ポリＩ：Ｃ（２５ｍｇ／ｍｌ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ； エンドトキシンレベルは０．２ＥＵ／ｍｌ未満であった、それはＤＣ中でＴＮＦα発現を誘導するのに十分ではない）、Ｓ．セレビジエ由来のマンナン（１ｍｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ，Ｍ７５０４） 。観察された病原体特異的な応答は、病原体認識における本質的な差よりも、各病原体の異なる力価のためであることが重要である。これは、共通の応答内の遺伝子の多くが、全ての刺激物質により等しいレベルに誘導されるためでありそうもなく、いくつかの経路がすべての病原体により等しく保証され得ることが提案され、使用された力価は、公知の成熟マーカーの発現を飽和することが示され、全ての病原体は、ＤＣにより食作用され、そしていくつかのケースでは、低力価および低濃度のミクロアレイ測定を繰り返し、類似の遺伝子発現プロフィールを見出した（データ示さず）。
【００５４】
病原体および成分を有するドナーの概要
以下の表は、各ドナー由来のＤＣに添加された刺激物質の概要である。
ドナー 刺激物質
ドナーＤ ポリＩ：Ｃ
ドナーＦ 大腸菌、インフルエンザ、ＬＰＳ、ポリＩ：Ｃ
ドナーＨ 大腸菌、インフルエンザ、ＬＰＳ
ドナーＩ Ｃ．アルビカンス
ドナーＭ Ｃ．アルビカンス、マンナン
ドナーＯ マンナン
ドナーＴ 大腸菌、インフルエンザ、Ｃ．アルビカンス
【００５５】
ＲＮＡ調製およびミクロアレイハイブリダイゼーション
各時点（０、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間）で、１×１０７ 細胞を採取し、トリゾール（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）を用いて溶解させた。全ＲＮＡを単離し、標識し、標準的な方法（Ｇｏｌｕｂ ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６：５３１−５３７（１９９９））を用いてＨｕＧｅｎｅＦＬオリゴヌクレオチドアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， ＣＡ）に対するハイブリダイゼーションのために調製した。
ハイブリダイゼーションは、１５ｍｇの標識されたＲＮＡ産物を用いて一晩行い、アレイをアフィメトリックススキャナーでスキャンした。可変な動力学を有する６人の非関連ヒトドナーの間で応答レベルの比較を可能にし、ＤＣ活性化における異なる相を規定するため、ＤＣ刺激後、複数の時点で測定を行った。インフルエンザ応答および大腸菌応答は、常に同じドナーで測定された。
【００５６】
遺伝子発現測定
遺伝子発現測定を保存し、本明細書で記載する分析法を用いて分析した。ｍＲＮＡ発現動力学レベルおよび誘導レベルを、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α、ＩＬ１２／ｐ４０、ＩＬ−１０およびＭＣＰ−１タンパク質レベルの酵素結合免疫ソルベントアッセイ（ＥＬＩＺＡ）測定で確認した。
【００５７】
統計的分析
データの集積と確認
１．７×１０６ 個体遺伝子測定物を保存し、分析し、一連のデータベースと研究室で開発された分析装置を用いて確認した。アレイ測定物を、同じドナー由来のサンプルとハイブリダイズした参照アレイで、Ｐ細胞（アフィメトリックスソフトウエアのＰ細胞）を用いる全ての遺伝子のハイブリダイゼーションシグナルのメジアンをスケーリングファクターとして用いて、正規化した。いくつかの喪失した時点でのデータを、フランキング時点を用いて組み込んだ。各刺激物質に応答する際の動力学および相対誘導レベルの両方を確認する標準ＥＬＩＳＡ測定を用いて、４つの分泌因子（ＴＮＦα、ＩＬ１２ｐ４０、ＩＬ１０、ＭＣＰ−１）のタンパク質レベルを測定することで遺伝子発現プロフィールを確認した。
【００５８】
得点システム
各病原体または化合物に曝露した樹状細胞（ＤＣ）における時系列のｍＲＮＡ蛍光レベル、Ｒ＝｛Ｒ１ 、Ｒ２ 、Ｒ３ 、．．．Ｒｎ ｝を集め、同じドナー由来の未処理ＤＣにおける対照系列のｍＲＮＡレベル、Ｃ＝｛Ｃ１ 、Ｃ２、Ｃ３ 、．．． Ｃｎ ｝を集めた。ＲｉおよびＣｉ は、ｉ番目の時点での定常状態のｍＲＮＡハイブリダイゼーション測定（アフィメトリックス用語で「平均差」）であり、ｎは時点の総数である。得点、Ｓｉ ＝（Ｒｉ −μｃ）／σｃ、は、対照時間コースの平均μｃから、ある時点、Ｒｉ 、での刺激された発現レベルの有意な偏差を測定するために考案された。対照時間コースの標準偏差であるσｃを用いることにより、得点は、培地対照中の高いノイズを有する遺伝子にペナルティをつけ、このようにして、殆どの強固なデータの抽出を可能にする。
【００５９】
病原体調節遺伝子
アップレギュレートされた遺伝子は、同じ時点で３人すべてのドナーに適用された以下の評価基準にしたがって選択された：（ｉ）２つ以上の連続した時点についてＳｉ ＞１．２、または（ｉｉ）１つ以上の時点についてＳｉ ＞４。４つ以上の連続した時点についてＳｉ＜−１．４である場合、ダウンレギュレートされた遺伝子を選択した。しかしながら、信号対雑音はアップレギュレートされた遺伝子よりも低いため、フィルターをさらに軽減して、３人のうちの２人のドナーについてフィルターを通過し、３人目のドナーで同じ傾向を有する、最も強固なダウンレギュレートされた遺伝子を選択した。
【００６０】
共通の調節遺伝子
共通のアップレギュレートされた遺伝子を、前記に規定された（ｉおよびｉｉ）病原体アップレギュレート遺伝子の交差に基づいて選択した。共通のダウンレギュレートされた遺伝子は、すべての病原体をわたる３つ以上の連続した時点についてＳｉ ＜−１．２に基づいて選択された。
【００６１】
刺激物質特異的遺伝子
刺激物質、Ａ、に応答し、かつ対照に相関するフォールド（Ｆｏｌｄ）発現レベルは、ＦＡ ＝ｍａｘ｛Ｌ１ ，Ｌ２ ，．．．，Ｌｎ−１｝（ここで、Ｌｉ ＝幾何平均｛Ｒｉ，ＲＩ＋１ ｝／幾何平均｛Ｃｉ ，Ｃｉ＋１｝）として規定される。刺激物質ＡおよびＢの間の遺伝子についてのフォールド発現レベルの比率はＲＦＡＢ＝ＦＡ ／ＦＢとして規定される。ある刺激物質（Ａ）で別の刺激物質（Ｂ）よりも強く調節される遺伝子は２つの方法のうちの一方で同定された：（ｉ）３人のドナー中、平均ＲＦＡＢ＝２．５；または（ｉｉ）３人のドナー中、刺激物質Ａに対する２つ以上の連続した時点についてＳｉ ＞１．４（対照時間コースと有意に異なる遺伝子プロフィールについて選択する）および刺激物質Ｂに対する全ての時点でＳｉ ＝１．２（遺伝子プロフィールは対照時間コースに密接に一致する）。刺激物質特異的遺伝子の最終セット（たとえば、図７Ａ、点線の丸）を用いて、ＤＣ応答がどのように生物学的に各刺激物質と異なるかを記載した。刺激物質Ａにおいて調節されるが、刺激物質Ｂにおいては調節されず、上記刺激物質特異的フィルターを通過しない残りの遺伝子は、共通の刺激物質特異的遺伝子のグループ間の境界上にあるため、比較分析に使用されなかった。
【００６２】
全てのフィルターは、以下の点を除く以外は、前記のように用いた：
（１）ＡおよびＢに対する応答が全ての複製について同じドナーで測定されない場合の二方向比較（刺激物質Ａに対するＤＣ応答対刺激物質Ｂに対するＤＣ応答の間）：
（ｉ）成分−病原体比較．全ての成分応答を２人のドナーで測定し、一方で全ての病原体応答を３人のドナーで測定した。成分と病原体との間の比較のストリンジェンシーを増大するため、平均ＲＦＡＢ＝２．５（全ての他の比較に関して）かつ成分と病原体がＤＣの同じ群で測定される一つの実験に関してＦＡ ／ＦＢ ＝２であることが必要であった。
（ｉｉ）Ｃ．アルビカンス−病原体比較．ＤＣの同じ群を一つの実験（ドナーＴ）でのみ全ての病原体（Ｃ．アルビカンス、大腸菌およびインフルエンザ）に曝したので、平均ＲＦＡＢ＝２．５および全ての病原体応答が測定された（ドナーＴ）実験についてＦＡ／ＦＢ ＝２を必要とすることにより、Ｃ．アルビカンスに対する任意の病原体の比較のストリンジェンシーを増大させた。
【００６３】
（２） ２名のドナーにおいて測定された、成分応答に関する制御された遺伝子は、よりストリンジェントなフィルターを必要とする。上方調節された遺伝子は、１つの実験について以下の基準：（ｉ）２つ以上の連続的な時間点についてＳｉ＞２または（ｉｉ）３つ以上の連続的な時間点についてＳｉ＞１．２または（ｉｉｉ）１つ以上の時間点についてＳｉ＞５にしたがって選択し、第２のドナーでの独立した実験には、ドナー間の発現レベルにおける変動を考慮するために、（ｉ）より低ストリンジェントなフィルターに置き換え、２つ以上の連続的な時間点についてＳｉ＞１．４としたこと以外は同じ基準を適用した。下方調節された遺伝子は、２つ以上の連続的な時間点についてＳｉ＜−１．４の場合に選択した。
【００６４】
一過性クラスタリング
自動マップ組織化アルゴリズム（ｓｅｌｆ−ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ ｍａｐ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）（Ｔａｍａｙｏら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：２９０７−１２（１９９９））を用い、遺伝子を、その一過性発現プロフィールの類似性に基づいて互いにクラスターさせた。この手順は、遺伝子を６つの基本的な群：時間経過の初期、中期または後期に発現された遺伝子からなる主な３つの群、およびこれらの群のそれぞれについて、遺伝子を、一過的に発現されるもの、または持続的に発現されるものにさらに分けて分類するのを補助するために使用した（図８Ａ）。
【００６５】
機能的カテゴリー
また、調節された遺伝子のそれぞれを、公のデータベースにしたがって、機能的カテゴリー（例えば、ケモカイン、解糖など）に割り当てた。機能的群の割り当ては、遺伝子のＰｒｏｔｅｏｍｅ注釈データベース、Ｈｕｍａｎ ＰＳＤ（登録商標）（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ，Ｉｎｃとの共同研究により提供いただいた）との比較により確認し、詳細化した。
【００６６】
好中球の移動
好中球の単離および移動のアッセイを、標準的技術（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｄｓ，１９９９））を用いて行った。指向された好中球移動を、フィルター付の９６−ウェルチャンバ（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて測定した。２００００個の好中球をＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で蛍光標識し、フィルター上面に配置した。ＤＣ上清みを下方に配置した（１：１０希釈）。３０分間３７℃および１０分間４℃でインキュベートした後、各ウェルの底面の好中球を計測した。
【００６７】
実施例２：Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ＨｕＧｅｎＦ１ Ｃｈｉｐ（６８００遺伝子）（３ドナー）を用いた病原体調節遺伝子の同定
オリゴヌクレオチドマイクロアレイを用い、ＤＣが、系統発生的に多様な病原体をどの程度識別するか、およびこれらの病原体の一般的に研究されている成分が生きた病原体の応答を説明するのに充分であるか否かを試験した。ヒト単球由来樹状細胞（ＤＣ）を、多様な組の微生物および化合物：グラム陰性細菌種、大腸菌およびその細胞壁成分、リポ多糖（ＬＰＳ）；真菌、Ｃ．アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）および酵母細胞壁由来マンナン；ならびにＲＮＡウイルス、インフルエンザＡおよび二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）に曝露した。ＤＣを、病原体またはその成分ととともに１〜３６時間培養し、ＲＮＡを単離し、標識し、（本明細書に記載のような）マイクロアレイとハイブリダイズさせた。各病原体刺激を３名の別個のドナーで繰り返し、各成分刺激を２名のドナーで繰り返した。発現レベルが刺激に応答して変化した遺伝子（調節された遺伝子とよぶ）を、多数の時間点にわたる、処理試料および未処理試料の発現レベルの有意差および反復される差に基づいて選択した。オリゴヌクレオチドアレイ上に提示されたおよそ６８００個の遺伝子のうち、全部で１３３０個の遺伝子が、病原体または成分の１つに接するとその発現が有意に変化した。遺伝子発現のかかる大きな変化は、ＤＣが、その細胞表現型において顕著な形質転換を受けうることを示した。
【００６８】
病原体に対する個々の応答の解析は、各病原体により特徴的な数の遺伝子が調節されることを示した。インフルエンザおよび大腸菌は、排他的サブセットの遺伝子の発現をモジュレートしうるが（７Ａおよび７Ｃ）、Ｃ．アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）は大腸菌調節性遺伝子のサブセットの発現のみモジュレートした（図７Ｂ）。また、遺伝子発現は、大腸菌により最も迅速に、Ｃ．アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）によりやや迅速に、インフルエンザにより最も遅く誘導された。
【００６９】
３つの異なる病原体応答の共通点により、共通の１６５個の高度に調節された遺伝子の組が明らかになった（図７Ａおよび７Ｄ）。３つの病原体のいずれかに曝露した後のＤＣ応答の力学を説明するため、これらの遺伝子を、その発現の運動論および公知の生物学的機能にしたがって分類した（図８Ａおよび８Ｂ）。３つの病原体のいずれかと接触させた直後、遺伝子の転写物レベルにおいて、食作用および病原体認識に関連する急速な低下が観察された（図８Ｂ）。同時に、免疫サイトカイン、ケモカイン、ならびに単球、ＤＣおよびマクロファージの感染部位への漸増に寄与するレセプターの発現において一過性の増加があった。また、活性化ＤＣの形態変化および移動挙動を潜在的に媒介しうる１組の細胞骨格遺伝子が強く誘導された。中期におけるシグナル伝達遺伝子および転写因子の誘導は、リンパ管およびリンパ節における調節性シグナルに受容されるＤＣの調製に関与しうる。また、いくつかの抗原プロセッシング遺伝子および抗原提示遺伝子が、高レベルで持続的に誘導された。反応性酸素種（ＲＯＳ）の生成に関与する遺伝子は、経時的に誘導され、これは、感染性微生物が、ＤＣの成熟および移動により死滅されることを示す。最後に、後期において、リンパ節ケモカインに対する応答を媒介し、それによりＤＣ移動を媒介することが知られているケモカインレセプターが上方調節された。本明細書に記載する１６５個の遺伝子の組は、したがって、中心的ＤＣ応答の一部を構成する。この応答は、独立して病原体に特徴的に独立して誘発され、先天性免疫応答および適応免疫応答の両方をモジュレートする時間順のカスケードとして展開される（図８Ｃ）。
【００７０】
対照的に、大腸菌特異的遺伝子の解析（図７Ｅおよび１０Ａ〜１０Ｃ）は、ＤＣがまた、炎症サイトカイン、好中球誘引性ケモカイン、単球誘因性ケモカインおよびプロスタグランジン経路成分を含む、アレイ上の先天性免疫遺伝子のほとんどを強力に迅速に上方調節することを示した。この強力な炎症応答は、おそらく、中期に誘導されるインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）により部分的に中和される。その後、Ｔ細胞刺激遺伝子、分泌されるサイトカイン、およびナイーブＴＨ２Ｔヘルパー細胞（ｖｏｎ ＡｎｄｒｉａｎおよびＭａｃｋａｙ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３：１０２０−１０３４（２０００））を誘引すると考えられているケモカインのサブセットを含む、適応免疫応答を調節する遺伝子が誘導された。共通のΥ鎖を共有する予期しないクラスのサイトカインレセプター（ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−７Ｒ、ＩＬ−１５ＲおよびＩＬ−４Ｒ）もまた誘導された。これらのレセプターの発現は、リンパ節内でＤＣがリンパ球誘導性インターロイキンに応答するのを許容しうる。
【００７１】
これらの免疫刺激応答はすべて、さらなる誘導された遺伝子ファミリー（図１０Ａ〜１０Ｃ）、例えば、抗菌性ＲＯＳのレベルをモジュレートする細胞ストレス遺伝子、感染ＤＣの寿命を延長しうる抗アポトーシス遺伝子（Ｏ’ＲｅｉｌｌｙおよびＳｔｒａｓｓｅｒ，Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｒｅｓ．４８：５−２１（１９９９））、およびサイトカインのプロセッシングおよびリンパ節へのＤＣの移動を可能にしうる後期発現性マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭｕｒｐｈｙおよびＧａｖｒｉｌｏｖｉｃ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１：６１４−６２１（１９９９））の誘導により増強されうる。ＤＣ機能における役割が不明確な遺伝子もまた大腸菌により調節され、シグナル伝達分子、転写因子、接着分子および解糖遺伝子の多くが含まれた。解糖遺伝子の公知の転写因子の１つであるＨＩＦ１αもまた、上方調節された（Ｗｅｎｇｅｒ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．２０３：１２５３−１２６３（２０００））。まとめると、大腸菌およびＬＰＳに対する応答における遺伝子発現のこれらの多様な変化は、ＤＣの有意な細胞性および免疫学的再プログラミングを反映する。
【００７２】
大腸菌に対するＤＣの応答に比べ、そのＣ．アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）に対する応答は、多くの機能的カテゴリーにおいて大幅に減衰され、大腸菌応答のサブセットを構成し、免疫遺伝子の数はずっと少なく、強力なＣ．アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）特異的遺伝子はなかった（図７Ａ、７Ｂおよび１０Ａ〜１０Ｃ）。免疫遺伝子の多くは、転写因子ＮＦ−κＢにより調節されることが知られているため（Ｇｈｏｓｈら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：２２５−２６０（１９９８））、この差は、比較的弱いＮＦ−κＢ上方調節により一部説明されうる（図１０Ａ〜１０Ｃ）。
【００７３】
ＤＣは、インフルエンザに応答して、大腸菌に応答して調節された数に匹敵する多数の遺伝子を調節した。しかしながら、先天性免疫応答は、好中球化学走性アッセイにより確認されるように比較的弱く、好中球を刺激しうる遺伝子を完全に欠いていた。また、インフルエンザに対する適応応答は、大腸菌に対する応答とは異なっていた。インターフェロン（ＩＦＮ）αおよびβをコードする抗ウイルス性遺伝子が強力に誘導され、これらはインターフェロン誘導性ケモカイン遺伝子であった（図１０Ａ〜１０Ｃ）。これは、ナイーブＴＨ１細胞（ｖｏｎ ＡｎｄｒｉａｎおよびＭａｃｋａｙ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３：１０２０−１０３４（２０００））の誘導および移動に対する可能な効果を示す。インフルエンザにより誘導された重要なサブセットの遺伝子は、ある段階での免疫応答の阻害と関連している。これらには、感染細胞の初期の死滅を導きうるプロアポトーシス遺伝子（Ｏ’ＲｅｉｌｌｙおよびＳｔｒａｓｓｅｒ，Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｒｅｓ．４８：５−２１（１９９９））ならびにマクロファージにおけるＩＬ−１２産生をブロックしうる、ｍｃｐ−１をコードする遺伝子（Ｂｒａｕｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：３００９−３００１７（２０００））；ナチュラルキラー細胞を阻害しうるＨＬＡ−Ｅ（Ｔｏｍａｓｅｃら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：１０３１（２０００））；ＮＯ合成を阻害するタンパク質の近縁ホモログであるＧｆｒｐ（Ｍｉｌｓｔｉｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１９７４３−１９７５１ １９９６））およびＴ細胞活性化を阻害しうるＩＤＯ（Ｈｗｕら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：３５９６−３５９９（２０００））が含まれる。また、インフルエンザは、多様な細胞機能に関与し、かつ病原体−宿主相互作用に対する寄与がこれまでに研究されていないようである多数遺伝子の組の発現をモジュレートした。
【００７４】
ＤＣが病原体を識別する能力をさらに詳細に調べるため、これらの示差的な病原体応答を誘発するのに充分な個々の病原体成分の量を調査した。細菌に存在することが知られているさらなる活性分子にもかかわらず、ＬＰＳは、ほぼ完全な細菌性応答を擬態し、説明しえた（図９Ａ）。意外にも、真菌成分マンナンは、真菌性またはウイルス性応答プロフィールよりも近似的に細菌性応答の大きさおよび生物学的特徴を擬態した（図９Ａおよび９Ｂ）。ｄｓＲＮＡは、細菌応答のあまり強力でない刺激因子であったが、細菌により誘導されるものに匹敵する強力な先天性応答を誘発し、同時に、ウイルス性応答において見られる局面を誘発することができた（図９Ａおよび９Ｂ）。したがって、３つのすべての成分は、多くの先天性免疫遺伝子および一般的病原体応答におけるほとんどの遺伝子の発現を誘発することができた。この所見は、中心的ＤＣプログラムが多様な分子構造をもつ多重刺激物質により引き起こされうることを示す。
【００７５】
ＤＣ転写応答のゲノムレベルの研究により、一般的だが示差的な病原体の認識経路の存在がわかった。ＬＰＳに応答したＤＣにおける遺伝子発現の変化が報告されているが、病原体に対する応答は充分には調査されていない（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、Ｂｌｏｏｄ ９６：２２０６−２２１４（２０００）；Ｄｉｅｔｚら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７５：７３１−７３８（２０００））。病原体に対する示差的免疫応答は、臨床試験及び動物試験において記載されている（ＡｓｈｍａｎおよびＰａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９：６４６−６７２（１９９５）；Ｌｕｄｗｉｇら、Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１７５−１９６（１９９６）；Ｒｅｉｓ ｅ Ｓｏｕｓａら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：３９２−３９９（１９９９））、本明細書に記載する結果は、これらの応答がＤＣ遺伝子発現の変化を反映したものであることを示す。
【００７６】
グラム陽性スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）を含む病原体に対する一般的応答における遺伝子発現の時間的カスケード（データ開示せず）は、中心的ＤＣ機能を説明し、病原体の先天性認識と抗原提示および適応Ｔ細胞応答との関連づけにおけるＤＣの本質的な役割を表す（Ｃｅｌｌａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：８２１−８２９（１９９９）；Ｂｈａｒｄｗａｊら、Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：７９７−８０７（１９９４）；Ｒｅｓｃｉｇｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：５２２９−５２３４（１９９８）；Ｈｅｍｍｉら、Ｎａｔｕｒｅ ４０８：７４０−７４５（２０００））。この一般的な応答の存在は、これらの成分および病原体のいくつかを識別することが知られているレセプター由来の経路の収斂を反映する。対照的に、ほとんどの機能的カテゴリー（転写因子およびサイトカインを含む）における病原体特異的遺伝子発現の存在は、異なる経路が異なる病原体により活性化されることを示す。これらの示差的応答は、ヒト単球由来ＤＣがその応答において柔軟性であり、異なるＤＣサブタイプのものと類似する多様な応答を発揮することさえありうることを示す（Ｒｉｓｓｏａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３：１１８３−１１８６（１９９９）；Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：７６７−８１１（２０００））。
【００７７】
本発明での実験において観察されたＤＣの広範な適応性は、ＤＣ成熟の概念がマーカーの標準的な組のモジュレーションでは簡単に説明されえないことを示す（ＢａｎｃｈｅｒｅａｕおよびＳｔｅｉｎｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２４５−２５２（１９９８））。その代わり、本明細書に記載の研究は、ＤＣが任意の病原体に対して中心的な応答を生じうるだけでなく、刺激特異的成熟および活性化を発揮することを示す。各刺激について、遺伝子の特定のサブセットがモジュレートされ、重要な生理学的結果を導く。ＤＣサブタイプ、細胞相互作用および組織の位置に依存して、よりいっそう示差的なインビボ調節が存在するようである。これらの特有の応答が病原体に対して、または宿主に対して有利であるか否かは、宿主−病原体相互作用を理解するのに必須である（ｄ’Ｏｓｔｉａｎｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１：１６６１−１６７４（２０００））。したがって、これらの病原体−調節遺伝子のさらなる研究は、ＤＣ成熟の理解を深め、免疫療法のさらなる標的を提供する。
【００７８】
ＨＵ６８００結果の概要
刺激応答性遺伝子
結果は以下の通りである（ｐ＜．００００５）：
大腸菌：６８５遺伝子（図１Ａ〜１ＧＧ）
インフルエンザ：５３１遺伝子（図２Ａ〜２Ｚ）
カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）：２８９遺伝子（図３Ａ〜３Ｎ）
【００７９】
刺激特異的遺伝子
大腸菌（インフルエンザにもカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）にも特異的でない）： １１８遺伝子（図４Ａ〜４Ｆ）
インフルエンザ（大腸菌にもカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）にも特異的でない）： ５８遺伝子（図５Ａ〜５Ｃ）
カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）（大腸菌にもインフルエンザにも特異的でない）： ０遺伝子
【００８０】
一般的刺激応答性遺伝子
図６Ａ〜６Ｅ、１６５個の一般的刺激応答性遺伝子を同定した。一般的刺激応答性遺伝子の概略図を図７Ａに示す。
【００８１】
刺激に応答する異なるタイプまたはクラスの遺伝子のリストを図１０Ａ〜１０Ｃに示す。
【００８２】
実施例３：Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ヒトゲノムＵ９５セット（６００００遺伝子）（１ドナー）を用いた病原体調節遺伝子の同定
種々の病原体に応答して調節されるさらなる樹状細胞遺伝子が同定されうるか否かを調べるため、６００００個の遺伝子を含有するＤＮＡチップ（マイクロアレイ）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ヒトゲノムＵ９５セット（５アレイセット））を利用して上述の方法を繰り返した。本明細書に記載する結果には１名のドナーを用いた。図１１Ａ〜１１ＡＡＡＡＡＡＡは、大腸菌での刺激で誘導された樹状細胞遺伝子を列挙する。図１２Ａ〜１２ＡＡは、大腸菌での刺激により特異的に誘導された樹状細胞遺伝子を列挙する。図１３Ａ〜１３ＺＺＺＺＺＺは、インフルエンザウイルスでの刺激で誘導された樹状細胞遺伝子を列挙する。図１４Ａ〜１４ＢＢは、インフルエンザウイルスでの刺激により特異的に誘導された樹状（細胞）遺伝子を列挙する。図１５Ａ〜１５ＫＫＫＫは、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）での刺激で誘導された樹状細胞遺伝子を列挙する。図１６Ａ〜１６Ｆは、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）での刺激により特異的に誘導された樹状細胞遺伝子を列挙する。図１７Ａ〜１７ＩＩは、大腸菌、インフルエンザウイルスおよびカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）により誘導された樹状（細胞）遺伝子を列挙する。
【００８３】
ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ヒトゲノムＵ９５セットにより、さらなる遺伝子の同定が可能となった。本明細書に記載される種々の病原体に対する拡充された遺伝子プロフィールは、感染性因子および治療標的の同定に関して本発明の方法を向上させる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａ〜１ＧＧは、Ｅ．ｃｏｌｉを用いる刺激で誘導される樹状細胞遺伝子を列挙する。第１列は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ同定番号（本明細書に記載されるように使用されるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）由来）を引用する。第２列は、ＧｅｎＢａｎｋまたはＴＩＧＲ受託番号を引用する。第３列は、遺伝子略語を引用する。第４列は、遺伝子名を引用する。第５〜７列は、Ｅ．ｃｏｌｉを用いる刺激についての遺伝子スコア（１列あたり１ドナー）を引用する。第８〜１０列は、インフルエンザを用いる刺激についての遺伝子スコア（１列あたり１ドナー）を引用する。第１１〜１３列は、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓを用いる刺激についての遺伝子スコア（１列あたり１ドナー）を引用する。
【図２】
図２Ａ〜２Ｚは、インフルエンザウイルスを用いる刺激で誘導される樹状細胞遺伝子を列挙する。第１列は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ同定番号（本明細書に記載されるように使用されるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）由来）を引用する。第２列は、ＧｅｎＢａｎｋまたはＴＩＧＲ受託番号を引用する。第３列は、遺伝子略語を引用する。第４列は、遺伝子名を引用する。第５〜７列は、Ｅ．ｃｏｌｉを用いる刺激についての遺伝子スコア（１列あたり１ドナー）を引用する。第８〜１０列は、インフルエンザを用いる刺激についての遺伝子スコア（１列あたり１ドナー）を引用する。第１１〜１３列は、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓを用いる刺激についての遺伝子スコア（１列あたり１ドナー）を引用する。
【図３】
図３Ａ〜３Ｎは、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓを用いる刺激で誘導される樹状細胞遺伝子を列挙する。第１列は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ同定番号（本明細書に記載されるように使用されるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）由来）を引用する。第２列は、ＧｅｎＢａｎｋまたはＴＩＧＲ受託番号を引用する。第３列は、遺伝子略語を引用する。第４列は、遺伝子名を引用する。第５〜７列は、Ｅ．ｃｏｌｉを用いる刺激についての遺伝子スコア（１列あたり１ドナー）を引用する。第８〜１０列は、インフルエンザを用いる刺激についての遺伝子スコア（１列あたり１ドナー）を引用する。第１１〜１３列は、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓを用いる刺激についての遺伝子スコア（１列あたり１ドナー）を引用する。
【図４】
図４Ａ〜４Ｆは、Ｅ．ｃｏｌｉを用いる刺激で特異的に誘導される樹状細胞遺伝子を列挙する。第１列は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ同定番号（本明細書に記載されるように使用されるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）由来）を引用する。第２列は、ＧｅｎＢａｎｋまたはＴＩＧＲ受託番号を引用する。第３列は、遺伝子略語を引用する。第４列は、遺伝子名を引用する。第５〜７列は、Ｅ．ｃｏｌｉを用いる刺激についての遺伝子スコア（１列あたり１ドナー）を引用する。第８〜１０列は、インフルエンザを用いる刺激についての遺伝子スコア（１列あたり１ドナー）を引用する。第１１〜１３列は、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓを用いる刺激についての遺伝子スコア（１列あたり１ドナー）を引用する。
【図５】
図５Ａ〜５Ｃは、インフルエンザウイルスを用いる刺激で特異的に誘導される樹状細胞遺伝子を列挙する。第１列は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ同定番号（本明細書に記載されるように使用されるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）由来）を引用する。第２列は、ＧｅｎＢａｎｋまたはＴＩＧＲ受託番号を引用する。第３列は、遺伝子略語を引用する。第４列は、遺伝子名を引用する。第５〜７列は、Ｅ．ｃｏｌｉを用いる刺激についての遺伝子スコア（１列あたり１ドナー）を引用する。第８〜１０列は、インフルエンザを用いる刺激についての遺伝子スコア（１列あたり１ドナー）を引用する。第１１〜１３列は、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓを用いる刺激についての遺伝子スコア（１列あたり１ドナー）を引用する。
【図６】
図６Ａ〜６Ｉは、Ｅ．ｃｏｌｉ、インフルエンザウイルス、およびＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓによって誘導される樹状細胞遺伝子を列挙する。第１列は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ同定番号（本明細書に記載されるように使用されるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）由来）を引用する。第２列は、ＧｅｎＢａｎｋまたはＴＩＧＲ受託番号を引用する。第３列は、遺伝子略語を引用する。第４列は、遺伝子名を引用する。第５〜７列は、Ｅ．ｃｏｌｉを用いる刺激についての遺伝子スコア（１列あたり１ドナー）を引用する。第８〜１０列は、インフルエンザを用いる刺激についての遺伝子スコア（１列あたり１ドナー）を引用する。第１１〜１３列は、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓを用いる刺激についての遺伝子スコア（１列あたり１ドナー）を引用する。
【図７】
図７Ａは、各刺激に対して調節される樹状細胞遺伝子の数および種々の刺激に応じて重複する遺伝子の数を示す図である。図７Ｂは、遺伝子プロフィールの図ならびに経時的にＥ．ｃｏｌｉおよびＣ． ａｌｂｉｃａｎｓに応じて調節された樹状細胞遺伝子を表す図である。図７Ｃは、遺伝子プロフィールの図ならびに経時的にＥ．ｃｏｌｉおよびインフルエンザに応じて調節された樹状細胞遺伝子を表す図である。図７Ｄは、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓおよびインフルエンザによって刺激された共通の応答樹状細胞遺伝子の遺伝子プロフィールの図である。図７Ｅは、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓおよびインフルエンザによって刺激された異なる応答樹状細胞遺伝子の遺伝子プロフィールの図である。
【図８】
図８Ａは、樹状細胞における共通応答遺伝子の発現速度論の経時的な概略図である。遺伝子が、その発現の時間的性質およびその発現の持続により分類された（すなわち、早期一過性、ＥＴ；早期持続、ＥＳ；中期一過性、ＭＴ；中期持続、ＭＳ；後期一過性、ＬＴ；後期持続、ＬＳ）。
図８Ｂは、その時間的発現速度論および遺伝子型により分類された樹状細胞遺伝子のリストである。
図８Ｃは、樹状細胞生活環期の図である。病原体の食作用、生得免疫応答の活性化、リンパ節への移動、適応できる免疫細胞の抗原提示および刺激、ならびにアポトーシスを含む樹状細胞成熟の相対的タイミングが示される。
【図９】
図９Ａは、大腸菌、Ｃ． ａｌｂｉｃａｎｓ、またはインフルエンザまたはその成分分子ＬＰＳ 、マンナンもしくはｄｓＲＮＡ それぞれに応答して調節された樹状細胞遺伝子の数の図である。
図９Ｂは、大腸菌またはマンナンまたはｄｓＲＮＡに応答して調節された樹状細胞遺伝子の数の図である。
【図１０】
図１０Ａ 〜Ｃ は、大腸菌、Ｃ． ａｌｂｉｃａｎｓ 、およびインフルエンザに応答して特異に調節された樹状細胞遺伝子の機能的カテゴリーのリストである。
【図１１】
図１１Ａ 〜１１ＡＡＡＡＡＡＡ は、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ヒトゲノムＵ９５ セットを用いた大腸菌との刺激により誘発された樹状細胞遺伝子を列挙する。１列に、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ同定番号（本明細書に記載のように使用されるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧｅｎｅＣｈｉｐ （登録商標）由来） を挙げる。２列に、遺伝子名を挙げる。３列に、遺伝子略語を挙げる。４列に、Ｇｅｎｂａｎｋ またはＴＩＧＲアクセッション番号を挙げる。５列に、大腸菌との刺激に対する遺伝子スコアを挙げる。６列に、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓとの刺激に対する遺伝子スコアを挙げる。７列に、インフルエンザとの刺激に対する遺伝子スコアを挙げる。
【図１２】
図１２Ａ 〜１２ＡＡは、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ヒトゲノムＵ９５セットを用いた大腸菌との刺激により特異的に誘発された樹状細胞遺伝子を列挙する。１列に、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ同定番号（本明細書に記載のように使用されるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ （登録商標）由来） を挙げる。２列に、遺伝子名を挙げる。３列に、遺伝子略語を挙げる。４列に、Ｇｅｎｂａｎｋ またはＴＩＧＲアクセッション番号を挙げる。５列に、大腸菌との刺激に対する遺伝子スコアを挙げる。６列に、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓとの刺激に対する遺伝子スコアを挙げる。７列に、インフルエンザとの刺激に対する遺伝子スコアを挙げる。
【図１３】
図１３Ａ 〜１３ＺＺＺＺＺＺは、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ヒトゲノムＵ９５ セットを用いたインフルエンザウイルスとの刺激により誘発された樹状細胞遺伝子を列挙する。１列に、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ同定番号（本明細書に記載のように使用されるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧｅｎｅＣｈｉｐ （登録商標）由来） を挙げる。２列に、遺伝子名を挙げる。３列に、遺伝子略語を挙げる。４列に、Ｇｅｎｂａｎｋ またはＴＩＧＲアクセッション番号を挙げる。５列に、大腸菌との刺激に対する遺伝子スコアを挙げる。６列に、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓとの刺激に対する遺伝子スコアを挙げる。７列に、インフルエンザとの刺激に対する遺伝子スコアを挙げる。
【図１４】
図１４Ａ 〜１４ＢＢは、インフルエンザウイルスとの刺激により特異的に誘発された樹状遺伝子を列挙する。１列に、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ同定番号（本明細書に記載のように使用されるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧｅｎｅＣｈｉｐ （登録商標）由来） を挙げる。２列に、遺伝子名を挙げる。３列に、遺伝子略語を挙げる。４列に、Ｇｅｎｂａｎｋ またはＴＩＧＲアクセッション番号を挙げる。５列に、大腸菌との刺激に対する遺伝子スコアを挙げる。６列に、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓとの刺激に対する遺伝子スコアを挙げる。７列に、インフルエンザとの刺激に対する遺伝子スコアを挙げる。
【図１５】
図１５Ａ 〜１５ＫＫＫＫは、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ヒトゲノムＵ９５ セットを用いたＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓとの刺激により誘発された樹状細胞遺伝子を列挙する。１列に、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ同定番号（本明細書に記載のように使用されるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧｅｎｅＣｈｉｐ （登録商標）由来） を挙げる。２列に、遺伝子名を挙げる。３列に、遺伝子略語を挙げる。４列に、Ｇｅｎｂａｎｋ またはＴＩＧＲアクセッション番号を挙げる。５列に、大腸菌との刺激に対する遺伝子スコアを挙げる。６列に、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓとの刺激に対する遺伝子スコアを挙げる。７列に、インフルエンザとの刺激に対する遺伝子スコアを挙げる。
【図１６】
図１６Ａ 〜１６Ｆ は、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ヒトゲノムＵ９５セットを用いたＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓとの刺激により特異的に誘発された樹状遺伝子を列挙する。１列に、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ同定番号（本明細書に記載のように使用されるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧｅｎｅＣｈｉｐ （登録商標）由来） を挙げる。２列に、遺伝子名を挙げる。３列に、遺伝子略語を挙げる。４列に、Ｇｅｎｂａｎｋ またはＴＩＧＲアクセッション番号を挙げる。５列に、大腸菌との刺激に対する遺伝子スコアを挙げる。６列に、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓとの刺激に対する遺伝子スコアを挙げる。７列に、インフルエンザとの刺激に対する遺伝子スコアを挙げる。
【図１７】
図１７Ａ 〜１７ＩＩは、大腸菌、インフルエンザウイルス、およびＣａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓにより誘発された樹状遺伝子を列挙する。１列に、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ同定番号（本明細書に記載のように使用されるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ （登録商標）由来） を挙げる。２列に、遺伝子名を挙げる。３列に、遺伝子略語を挙げる。４列に、Ｇｅｎｂａｎｋ またはＴＩＧＲアクセッション番号を挙げる。５列に、大腸菌との刺激に対する遺伝子スコアを挙げる。６列に、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓとの刺激に対する遺伝子スコアを挙げる。７列に、インフルエンザとの刺激に対する遺伝子スコアを挙げる。
関連出願
本願は、２０００年１０月２４日出願の米国予備出願第６０／２４２，８００号（この全教示は本明細書中に参考として援用される）の利益を主張する。
【０００２】
発明の背景
ヒト免疫系は、多種多様な病原体により絶えず攻撃されている。この免疫系は、好中球、ナチュラルキラー細胞および他の細胞型を調節するサイトカインおよびケモカインを介する生得免疫応答で病原体にまず反応し、その後、適応免疫応答により反応する。生得免疫系は多くの侵入感染性因子を認識し得るレセプターを備えており、免疫応答を最適化するように反応し得るという仮説が立てられている。
【０００３】
免疫応答および適応応答の開始は、「樹状細胞」と呼ばれる抗原提示細胞のサブセットの活性化に決定的に依存する。樹状細胞は、ほとんどの組織、主に未熟段階に存在し、病原体または抗原の入来を調べている。一旦、これらの細胞が抗原を捕獲および保有すると、成熟および活性化を受け、劇的にＴ細胞を活性化する能力を増加する。活性化すると、樹状細胞は、抗原をリンパ器官に輸送し、特異的Ｔ細胞適応免疫応答を誘発し得る。樹状細胞が侵入病原体を認識し活性化される能力（例えば、ナイーブＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞が活性化し、次いで感染細胞または腫瘍細胞を殺傷し得る）は、免疫応答の開始において第一の重大な事象である。対照的に、樹状細胞はまた、自己反応性リンパ球を欠失することによる抗原に対する寛容の維持、それによる自己免疫応答の減少に関与する。樹状細胞は免疫に必須であるが、樹状細胞がこのような多種多様な病原体に対して生得および適応免疫応答を制御する方法についてはほとんど知られていない。
【０００４】
発明の要旨
本発明は、病原体に応じて樹状細胞により誘導された遺伝子発現パターンによって病原体を同定する方法を提供する。本明細書で記載されるように、別個の遺伝子発現プログラムが、種々の病原体に応じて活性化される。本発明は、疾患の診断、予後および処置に有用である。
【０００５】
１つの態様において、本発明は、１つ以上の樹状細胞からｍＲＮＡを単離する工程；および刺激特異的遺伝子が特異的である病原体の感染を示す少なくとも１つの刺激特異的遺伝子の遺伝子発現を決定する工程を含む病原体による感染を同定する方法に関する。代替の態様において、本発明は、１つ以上の未熟樹状細胞を病原体またはその１つ以上の免疫原性成分と接触させる工程；この樹状細胞からｍＲＮＡを単離し、標識する工程；遺伝子発現プロフィールが生じるように、この樹状細胞から標識ｍＲＮＡを検出する工程；ならびに少なくとも１つの刺激特異的遺伝子が同定されるように、１つ以上の参考遺伝子発現プロフィールと比較してこの遺伝子発現プロフィールを解析し、それによりこの刺激が特異的である病原体を同定する工程を含む、病原体を同定する方法に関する。
【０００６】
別の態様において、本発明は、哺乳動物由来の１つ以上の樹状細胞からｍＲＮＡを単離する工程；このｍＲＮＡを少なくとも１つの刺激応答性遺伝子プローブと接触させる工程、ここで刺激応答性遺伝子プローブのｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションがこの哺乳動物における感染を示す、を含む、哺乳動物における感染を診断する方法に関する。特定の態様において、刺激応答性遺伝子は刺激特異的である。別の特定の態様において、刺激応答性遺伝子は、共通の刺激応答性遺伝子である。
【０００７】
別の態様において、本発明は、哺乳動物由来の１つ以上の樹状細胞からタンパク質を単離する工程；このタンパク質を刺激特異的遺伝子によりコードされるタンパク質に対する少なくとも１つの抗体と接触させる工程、ここで、このタンパク質に対する抗体の結合はこの動物における感染を示す、を含む、哺乳動物における感染を診断する方法に関する。
【０００８】
別の態様において、本発明は、哺乳動物における１つ以上の樹状細胞からｍＲＮＡを単離する工程；および少なくとも１つの刺激特異的遺伝子の遺伝子発現を決定する工程、ここで、刺激特異的遺伝子が特異的である病原体による感染を示すを含む、哺乳動物における病原体による感染を診断する方法に関する。
【０００９】
特定の態様において、刺激応答性遺伝子発現は減少する。別の特定に態様において、刺激応答性遺伝子発現は増大する。
【００１０】
別の態様において、本発明は、臨床的結果で補正される刺激応答性遺伝子の遺伝子プロフィールを解析することにより感染した個体に対する予後を予測する方法に関する。
【００１１】
別の態様において、本発明は、病原体を同定し、その結果治療養生法（ｒｅｇｉｍｅｎ）を処方する（ｆｏｒｍｕｌａｔｅ）工程を含む、治療養生法を処方する方法に関する。さらに、病原体に対する患者の度重なる評価は、次いでその結果変更され得る治療養生法の有効性を決定し得る。
【００１２】
別の態様において、本発明は、１つ以上の未熟樹状細胞を試験ワクチンと接触させる工程；この樹状細胞からｍＲＮＡを単離する工程；この樹状細胞における遺伝子プロフィールを決定する工程；および最適なワクチンを示す遺伝子発現プロフィールを顕在化させる試験ワクチンを選択する工程を含む、ワクチンを最適化する方法に関する。
【００１３】
別の態様において、本発明は、樹状細胞が活性化されるように患者の樹状細胞を病原体またはその成分と接触させる工程；および活性化された樹状細胞がこの病原体に対して免疫応答を誘発するようにこの活性化された樹状細胞を患者に戻す工程を含む、病原体に対するエキソビボ治療的処置に関する。
【００１４】
別の態様において、本発明は、樹状細胞が活性化されるように患者の樹状細胞を腫瘍細胞またはその成分と接触させる工程；および活性化された樹状細胞がこの腫瘍細胞またはその成分に対して免疫応答を誘発するようにこの活性化された樹状細胞を患者に戻す工程を含む、腫瘍に対するエキソビボ治療的処置に関する。
【００１５】
別の態様において、本発明は、樹状細胞が活性化されるように患者の樹状細胞を自身の抗原またはその成分と接触させる工程；活性化された樹状細胞がこの自身の抗原またはその成分に対して免疫応答を誘発しないようにこの活性化された樹状細胞を患者に戻す工程を含む、自己免疫に対するエキソビボ治療的処置に関する。
【００１６】
別の態様において、本発明は、樹状細胞が活性化されるように患者の樹状細胞を移植片組織またはその成分と接触させる工程；活性化された樹状細胞がこの移植片組織またはその成分に対して免疫応答を誘発しないようにこの活性化された樹状細胞を患者に戻す工程を含む、移植片拒絶反応に対するエキソビボ治療的処置に関する。
【００１７】
別の態様において、本発明は、１つ以上の樹状細胞を刺激と接触させる工程；免疫応答を示す少なくとも１つの刺激応答性遺伝子が同定されるように、この樹状細胞からｍＲＮＡを単離して遺伝子プロフィールを決定する工程を含む、刺激に対する免疫応答を測定する方法に関する。
【００１８】
別の態様において、本発明は、１つ以上の樹状細胞を刺激と接触させる工程；この樹状細胞からｍＲＮＡを単離し標識する工程；ＤＮＡマイクロアレイをこの樹状細胞由来の標識ｍＲＮＡと接触させる工程；および免疫応答を示す少なくとも１つの刺激応答性遺伝子が同定されるように対照刺激と比較して遺伝子プロフィールを解析する工程を含む、刺激に対する免疫応答を測定する方法に関する。特定の態様において、樹状細胞は末梢血から得られる。別の特定の態様において、刺激は、細菌、真菌、ウイルス、またはその成分からなる群より選択される。別の特定の態様において、刺激は、エスケリチア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｎｓ）、インフルエンザウイルス、カンジダ・アルビカン（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）、リポ多糖類（ＬＰＳ）、ポリＩ：Ｃ、および酵母マンナンからなる群より選択される。特定の態様において、刺激は、物理的、化学的、または電気的刺激からなる群より選択される。別の態様において、刺激は、無機化学物質および有機化学物質からなる群より選択させる組み合わせを含む。特定の態様において、ＤＮＡマイクロアレイは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ＨＵ ６８００である。別の特定の態様において、ＤＮＡマイクロアレイは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ ＧｅｎｏｍｅＵ９５セットである。
【００１９】
別の態様において、刺激応答性遺伝子の発現は、刺激に応じて増加する。別の態様において、刺激応答性遺伝子の発現は、刺激に応じて減少する。別の態様において、刺激応答性遺伝子は、刺激特異的である。
【００２０】
別の態様において、本発明は、未熟樹状細胞を刺激と接触させる工程、この樹状細胞からｍＲＮＡを単離し標識する工程、ならびに少なくとも１つの刺激応答性遺伝子が同定されるように対照刺激と比較して遺伝子プロフィールを測定し解析する工程を含む、刺激に応じて樹状細胞における遺伝子プロフィールを測定する方法に関する。
【００２１】
別の態様において、本発明は、樹状細胞を刺激と接触させる工程；この樹状細胞からｍＲＮＡを単離し標識する工程；ＤＮＡマイクロアレイをこの樹状細胞由来の標識ｍＲＮＡと接触させる工程；および少なくとも１つの刺激応答性遺伝子を含むデータベースが作製されるように、対照刺激と比較して遺伝子プロフィールを測定し解析する工程を含む、刺激応答性遺伝子を含むデータベースの生成に関する。別の態様において、本発明は、樹状細胞を刺激と接触させる工程；この樹状細胞からｍＲＮＡを単離し標識する工程；ＤＮＡマイクロアレイをこの樹状細胞由来の標識ｍＲＮＡと接触させる工程；および少なくとも１つの刺激特異的遺伝子を含むデータベースが作製されるように、対照刺激と比較して遺伝子プロフィールを測定し解析する工程を含む、刺激特異的遺伝子を含むデータベースの形成に関する。別の態様において、本発明は、樹状細胞を刺激と接触させる工程；この樹状細胞からｍＲＮＡを単離し標識する工程；ＤＮＡマイクロアレイをこの樹状細胞由来の標識ｍＲＮＡと接触させる工程；および少なくとも１つの共通の刺激応答性遺伝子を含むデータベースが作製されるように、対照刺激と比較して遺伝子プロフィールを測定し解析する工程を含む、共通免疫応答遺伝子を含むデータベースの形成に関する。別の態様において、本発明は、刺激応答性遺伝子のデータベース、刺激特異的遺伝子のデータベースおよび共通の免疫応答遺伝子のデータベースに関する。
【００２２】
別の態様において、本発明は、１つ以上の未熟樹状細胞を刺激と接触させる工程；この樹状細胞からｍＲＮＡを単離する工程；および少なくとも１つの刺激特異的遺伝子が同定されるように、遺伝子プロフィールを決定し、それによりこの刺激特異的遺伝子が特異的である病原体を同定する工程を含む、病原体を同定する方法に関する。別の態様において、本発明は、１つ以上の未熟樹状細胞を刺激と接触させる工程；この樹状細胞からｍＲＮＡを単離し標識する工程；ＤＮＡマイクロアレイをこの樹状細胞由来の標識ｍＲＮＡと接触させる工程；および少なくとも１つの刺激特異的遺伝子が同定されるように、対照刺激と比較して遺伝子プロフィールを測定し解析し、それによりこの刺激特異的遺伝子が特異的である病原体を同定する工程を含む、病原体を同定する方法に関する。
【００２３】
別の態様において、本発明は、樹状細胞からｍＲＮＡを単離する工程；および少なくとも１つの刺激特異的遺伝子が同定されるように、遺伝子プロフィールを決定し、それにより刺激特異的遺伝子が特異的である（これが感染を示す）病原体を同定する工程を含む、病原体による感染を診断する方法に関する。別の態様において、本発明は、樹状細胞からｍＲＮＡを単離し標識する工程；ＤＮＡマイクロアレイをこの樹状細胞由来の標識ｍＲＮＡと接触させる工程；および少なくとも１つの刺激特異的遺伝子が同定されるように、対照刺激と比較して遺伝子プロフィールを測定し解析し、それにより刺激特異的遺伝子が特異的である（これが感染を示す）病原体を同定する工程を含む、病原体による感染を診断する方法に関する。
【００２４】
樹状細胞における刺激特異的、刺激応答性および共通の刺激応答性遺伝子の同定は、医薬および探索において重要な新規な治療的、診断的および予後的ツールを提供する。
【００２５】
発明の詳細な説明
樹状細胞は、病原体の広いアレイに対する免疫応答において重大な役割をはたすが、この応答の分子成分についてはほとんど知られていない。本発明は、少なくとも部分的に、病原体への樹状細胞の曝露が遺伝子発現の病原体特異的パターンを生じるという発見に基づく。したがって、本発明は、本明細書に記載の遺伝子発現プロファイルに基づく感染性因子の同定に使用されうる。本発明はまた、さらなる病原体またはその成分に対する遺伝子発現の病原体特異的パターンを決定するための方法を提供する。本明細書に記載の知見により、免疫応答を誘発する各病原体における重要な成分が決定され、したがって免疫療法のための確固とした標的が提供される。したがって、本発明は、宿主−病原体相互作用のより良好な理解を提供し、公知および新規の病原体の同定を助け、感染性疾患の診断および治療を改善する。
【００２６】
疾患を生じる病原体の同定は、治療が病原体に依存して広く変化するので、有効な治療の提供において最も重要である。１つの態様において、本発明は、脊椎動物（例えば、哺乳動物）由来の１つ以上の樹状細胞からｍＲＮＡを単離する工程；および少なくとも１つの刺激−特異的遺伝子の遺伝子発現プロファイルを決定する工程を含み、ここで該遺伝子発現プロファイルは、刺激−特異的遺伝子が特異的である病原体による感染を示す、脊椎動物に感染している病原体を同定する方法である。ＲＮＡを単離する方法は、本明細書に記載されており、当業者に周知である。本明細書で使用される「遺伝子プロファイル」または「遺伝子発現プロファイル」は、本明細書に記載される方法または当該分野で公知の他の方法により評価した場合の特定の遺伝子の遺伝子発現のレベルまたは量として定義される。遺伝子発現プロファイルは、１つ以上の遺伝子のデータを含有し得、単一時点または一定時間にわたり測定されうる（図７Ｂ参照）。病原体は、感染した脊椎動物から得られる樹状細胞から得られる遺伝子発現プロファイルを、図７Ｅに示されるものなどの１つ以上の刺激−特異的遺伝子発現プロファイル（例えば、データベース中）と比較することにより、同定されうる。病原体は、特定の遺伝子プロファイルにより同定される病原体のファミリーまたはクラスでありうる。例えば、病原体は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａファミリーのメンバー（例えば、大腸菌）、Ｃａｎｄｉｄａ ファミリーのメンバー（例えば、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）またはインフルエンザウイルスのファミリーのメンバーでありうる。それゆえ、本発明は、疾患または病気を生じる病原体のクラスを同定し、したがって、治療養生法（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｒｅｇｉｍｅｎ）の選択を助けうる。本明細書で使用される「治療養生法」は、患者が疾患または疾病を除去する、緩和するまたは弱めるために受ける臨床治療のことを言う。
【００２７】
さらに、本発明は、刺激−応答性（図１Ａ〜１ＧＧ 、２Ａ〜２Ｚ、３Ａ〜３Ｎ、１１Ａ〜１１ＡＡＡＡＡＡＡ 、１３Ａ 〜１３ＺＺＺＺＺＺ、および１５Ａ 〜１５ＫＫＫＫ）遺伝子、刺激−特異的（図４Ａ〜４Ｆ、５Ａ〜５Ｃ、１２Ａ 〜１２ＡＡ、１４Ａ 〜１４ＢＢ、１６Ａ〜１６Ｆ ）遺伝子および共通刺激−応答性（図６Ａ〜６Ｅおよび１７Ａ 〜１７ＩＩ）遺伝子を提供する。したがって、本発明は、特異的な病原体に対する選択的な免疫応答および全ての感染生物により惹起される共通免疫応答に重要である遺伝子に関する情報を提供し（図７Ａ）、それにより診断および治療のためのさらなる標的を提供する。
【００２８】
本明細書で使用される「刺激−応答性」遺伝子は、免疫応答を惹起する病原体または病原体の成分に応答して調節される遺伝子のことを言う。「刺激−応答性」および「病原体−調節」は、交換可能に使用されうる。本明細書で使用される「刺激−特異的」遺伝子は、病原体、病原体−クラスまたはそれらの成分により特異的に調節される遺伝子のことを言う。「刺激−特異的」および「病原体−特異的」は、交換可能に使用されうる。本明細書で使用される「共通刺激−応答性遺伝子」は、２つ以上の病原体、病原体クラスまたはそれらの成分に応答して調節される遺伝子のことを言う。「共通刺激−応答性」遺伝子および「共通調節」遺伝子は、交換可能に使用されうる。
【００２９】
本明細書で使用される場合、刺激−応答性遺伝子は、以下の基準を満足することにより、同定される（すなわち、選択される）：刺激に応答した遺伝子発現スコアの比が、アップレギュレートされた遺伝子に対して２つの連続した時点で対照媒体と比較して１．２ 倍より多く異なるか、または１つの時点で４倍より多く異なる；またはダウンレギュレートされた遺伝子に対して４つの連続した時点で−１．４倍未満である。共通調節遺伝子は、全ての病原体にわたる上記病原体アップレギュレート遺伝子の交差（ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｏｎ）に基づいて選択される。共通ダウンレギュレート遺伝子は、全ての病原体にわたり３つの連続した点で−１．２倍未満の比に基づいて選択された。
【００３０】
刺激−特異的遺伝子は、以下の基準を満足することにより、同定される（すなわち、選択される）：病原体に応答した遺伝子発現スコアの比が、全３ドナーに対して対照媒体と比較して２．５ 倍より多く異なるか、または全３ドナーに対して２つの連続した時点で１．４ 倍より多く異なる。本発明を使用して、刺激−応答性遺伝子、刺激−特異的遺伝子、および／または共通刺激−応答性遺伝子を含有するデータベース（図１Ａ〜１ＧＧ、２Ａ〜２Ｚ、３Ａ〜３Ｎ、４Ａ〜４Ｆ、５Ａ〜５Ｃ、６Ａ〜６Ｉ、１１Ａ 〜１１ＡＡＡＡＡＡＡ 、１２Ａ 〜１２ＡＡ、１３Ａ 〜１３ＺＺＺＺＺＺ、１４Ａ 〜１４ＢＢ、１５Ａ〜１５ＫＫＫＫ、１６Ａ 〜１６Ｆ および１７Ａ 〜１７ＩＩを参照のこと）を作製しうることが明らかである。これらのデータベースは、医学、研究および産業において、多くの適用を有するであろう。特に、本明細書に記載され、本発明の方法により同定される遺伝子プロファイルは、樹状細胞が曝露されている病原体または病原体クラスを同定するために使用されうる。
【００３１】
代替的な態様において、本発明は、１つ以上の未熟樹状細胞を病原体または１つ以上のその免疫原性成分と接触させる工程；該樹状細胞からｍＲＮＡを単離および標識する工程；遺伝子発現プロファイルが作製されるように、該樹状細胞から標識ｍＲＮＡを検出する工程；ならびに、少なくとも１つの刺激−特異的遺伝子が同定されるように、１つ以上の参照遺伝子発現プロファイルと比較して遺伝子発現プロファイルを解析し、それにより刺激−特異的遺伝子が特異的である病原体を同定する工程を含む、病原体を同定する方法に関する。本発明は、病原体に対して環境的、産業的および居住的単離物を試験することを含むがこれらに限定されない多くの臨床的および非臨床的方法に有用である。
【００３２】
感染の診断は、患者の治療における最初の重大な工程である。別の態様において、本発明は、哺乳動物における１つ以上の樹状細胞からｍＲＮＡを単離する工程；該ｍＲＮＡを少なくとも１つの刺激−応答性遺伝子プローブと接触させる工程を含み、ここで該ｍＲＮＡへの刺激−応答性遺伝子プローブのハイブリダイゼーションは、該哺乳動物における感染を示す、哺乳動物における感染を診断する方法に関する。本明細書に記載されるように、対照との比較における刺激−特異的遺伝子の遺伝子発現の比は、感染の原因である病原体（存在する場合）を同定する。さらに、当業者の十分能力内にある本発明のバリエーションがある。例えば、脊椎動物における感染を同定するために、遺伝子プローブは、刺激−特異的または共通刺激−応答性遺伝子プローブでありうる。各プローブタイプの使用に対する基準が、本明細書に記載される。その標的に対するプローブのハイブリダイゼーションを測定する方法、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、核酸ブロッティング、およびミクロアレイは、当該分野で十分特徴づけられる。刺激−応答性プローブのハイブリダイゼーションの量またはレベルは、陽性または陰性、あるいは時間経過において測定される場合、両方の組み合わせでありうる。さらに、遺伝子の不在は、感染を示しうる。
【００３３】
別の態様において、本発明は、哺乳動物に由来する１つ以上の樹状細胞からタンパク質を単離する工程；該タンパク質を少なくとも１つの刺激−特異的抗体と接触させる工程を含み、ここで該タンパク質への刺激得的抗体の結合は、該哺乳動物における感染を示す、哺乳動物における感染を診断する方法に関する。タンパク質を細胞から抽出する方法および抗体を調製する方法は、当該分野で周知である。抗体は、ポリクローナルおよび／またはモノクローナルでありうる。刺激−特異的抗体の混合物はまた、刺激−特異的タンパク質を検出するために使用されうる。抽出タンパク質への刺激−特異的抗体の結合の欠如は、１つもしくは複数の病原体または１つもしくは複数の病原体の型による感染の診断でありうる。
【００３４】
別の態様において、本発明は、哺乳動物において１つ以上の樹状細胞からｍＲＮＡを単離する工程；少なくとも１つの刺激−特異的遺伝子の遺伝子プロファイルを決定する工程を含み、ここで刺激−特異的遺伝子の発現は、刺激−特異的遺伝子が特異的である病原体による感染を示す、哺乳動物における特異的な病原体による感染を診断する方法に関する。刺激−特異的遺伝子のプロファイルは、陽性または陰性でありうる。本明細書で規定される「陽性」は、対照遺伝子プロファイルと比較した遺伝子発現プロファイルにおける増加を意味する。本明細書で規定される「陰性」は、対照プロファイルと比較した遺伝子発現プロファイルにおける減少を意味する。
【００３５】
別の態様において、本発明は、刺激−応答性遺伝子の遺伝子発現プロファイルを解析することによって、ここで特異的発現プロファイルが臨床結果に対応する、感染個体に対する予後を予測する方法に関する。例えば、本発明により決定される遺伝子プロファイルの患者の予後は、乏しい予後に対応する。本発明の利点は、患者に対するより積極的な治療に利用されることである。本明細書に記載の刺激−特異的または共通刺激−応答性遺伝子の遺伝子プロファイルについて試験されている個体の集団に対して、対比が行われる。かかる解析を行なうために、少なくとも１つの刺激−特異的または共通刺激−応答性遺伝子に対する遺伝子プロファイルが、１セットの個体に対して決定され、そのいくつかは特定の特徴を示し、そのいくつかは該特徴の欠如を示す。カイ二乗検定などの標準統計方法により対比が行われ得、１つまたは複数の遺伝子プロファイルと表現型特徴との間の統計的に有意な相関が記載される。例えば、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ） 特異的遺伝子プロファイルの存在は、湿疹に相関することが見出されるであろう。
【００３６】
かかる相関は、いくつかの方法において活かされうる。治療に利用できる遺伝子プロファイルと疾患との間の強い相関の場合、ヒトまたは動物患者における刺激−応答性遺伝子プロファイルの検出は、治療の即時適用、または少なくとも患者の規則的なモニタリングの開始を正当化しうる。刺激−特異的遺伝子プロファイルとヒト疾患との間のより弱いがまだ統計的に有意である相関の場合、即時治療介入またはモニタリングは、正当化されないであろう。にもかかわらず、患者は、患者に対して少ないコストで達成されうるが、患者が増加した感受性を有しうる状態の危険を低減するのに潜在的利益を与えうる簡単な生活様式変化（例えば、規定食、運動）を始めるように刺激−応答性遺伝子プロファイルによって動機づけられうる。増加した感受性と疾患に対するいくつかの治療養生法の１つの相関を示す患者における刺激−応答性遺伝子プロファイルの同定は、この治療養生法が続けられるべきであることを示す。
【００３７】
代替的には、本発明は、治療養生法を処方するために使用されうる。本明細書で使用される場合、「治療養生法」は、薬理剤を用いた患者の治療として規定される。１つの態様において、本発明は、病原体を同定する工程、およびそれに応じて治療養生法を処方する工程を含む、治療養生法を処方する方法に関する。さらに、病原体に対する患者の繰り返し評価は、次いでそれに応じて変更されうる治療養生法の効力を決定しうる。治療養生法の効力を決定する方法は、当該分野で公知である。
【００３８】
ワクチン開発は、医学における最も重要な見込みのある健康保護の１つである。本発明は、ワクチン最適化に理論的に適切である。１つの態様において、本発明は、樹状細胞を試験ワクチンと接触させる工程、該樹状細胞からｍＲＮＡを単離する工程；該樹状細胞における遺伝子発現プロファイルを決定する工程；ならびに最適化ワクチンを示す遺伝子発現プロファイルを惹起する試験ワクチンを選択する工程を含む、ワクチン最適化方法に関する。ワクチンの構築およびバリアント試験ワクチンの作製は、当業者に公知である。本明細書で使用される場合、「バリアント試験ワクチン」は、最初の試験ワクチンの異なる組成物である。最適化免疫応答とは、最も高いレベルの病原体免疫性または死滅を促進する免疫応答のことを言う。病原体の免疫性および死滅を測定する方法は、当該分野において十分特徴づけられている。最適化ワクチンは、本明細書に記載のように決定され、最も強い免疫応答を惹起する試験ワクチンとして規定される。例えば、最適化ワクチンは、利用される場合、病原体に対する標準ワクチンにより生じる応答を少なくとも有するであろう。最適化ワクチンの遺伝子発現プロファイルは、他の非関連ワクチンと異なりうる。
【００３９】
樹状細胞は、生得および適応できる免疫応答を開始するので、それらは本発明によって特異的抗原に対する免疫応答を誘発するのに十分適切である。１つの態様において、本発明は、患者の樹状細胞を病原体またはその免疫原性成分と、該樹状細胞が活性化されるように接触させる工程；活性化樹状細胞が該病原体に対する免疫応答を誘発するように、患者に活性化樹状細胞を戻す工程を含む、病原体に対するエクスビボ治療処置に関する。活性化樹状細胞は、ＣＤ８６、ＣＤ８３、およびＨＬＡ−ＤＲを含む特異的細胞表面マーカーを発現する。マーカーをスクリーニングする方法は、当業者に公知である。
【００４０】
別の態様において、本発明は、患者の樹状細胞を腫瘍細胞またはその免疫原性成分と、該樹状細胞が活性化されるようにエクスビボで接触させる工程；ならびに、活性化樹状細胞が該腫瘍細胞またはその成分に対する免疫応答を誘発するように、患者に活性化樹状細胞を戻す工程を含む、腫瘍のエクスビボ治療処置に関する。任意の腫瘍細胞の型が使用されうる。
【００４１】
樹状細胞はまた、自己免疫疾患（たとえば、関節炎など）や器官移植に重要な抗原耐性に関与する。別の態様において、本発明により、患者の樹状細胞をその樹状細胞が活性化されるように自己抗原またはその免疫原成分とエクス・ビボで接触させる工程、活性化された樹状細胞が該自己抗原またはその成分に対して免疫応答を引き起こさないように、この活性化された樹状細胞を患者に戻す工程を含む、自己免疫のエクス・ビボ治療法が導入される。
【００４２】
器官移植に関連する大部分の共通の問題は、移植片拒絶反応である。移植片拒絶反応は、移植された組織が非自己として認識されるプロセスであり、移植された組織の破壊を導く免疫応答を引き起こす。別の態様において、本発明により、患者の樹状細胞をこの樹状細胞が活性化されるように移植片組織またはその成分と接触させる工程、活性化された樹状細胞が移植片組織またはその成分に対して免疫応答を引き起こさないように、この活性化された樹状細胞を患者に戻す工程を含む、移植片拒絶反応のエクス・ビボ治療法が導入される。
【００４３】
別の態様において、本発明により、樹状細胞を刺激物質と接触させる工程、該樹状細胞からｍＲＮＡを単離して、免疫応答を示す少なくとも１つの刺激物質応答遺伝子（ｓｔｉｍｕｌｕｓ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｇｅｎｅ） が同定されるように、遺伝子プロフィールを決定する工程を含む、刺激物質に対する免疫応答を測定する方法が導入される。１以上の遺伝子の遺伝子プロフィールは、本明細書に記載されるように、および当業者に公知の方法で測定することができ、その例としては、アフィニティークロマトグラフィー、核酸ブロッティングおよびミクロアレイが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４４】
別の態様において、本発明により、樹状細胞を刺激物質と接触させる工程、該樹状細胞からｍＲＮＡを単離し標識する工程、該樹状細胞由来の標識したｍＲＮＡとＤＮＡミクロアレイとを接触させる工程、および少なくとも一つの刺激物質応答遺伝子が同定されるように、対照刺激物質に関連する遺伝子プロフィールを測定する工程を含む、刺激物質に対する免疫応答の測定方法が導入される。別の態様において、本発明は、樹状細胞を刺激物質と接触させる工程、該樹状細胞からＲＮＡを単離し標識する工程、該樹状細胞由来の標識したｍＲＮＡとＤＮＡミクロアレイとを接触させる工程、および少なくとも一つの刺激物質応答遺伝子が同定されるように、対照刺激物質に関連する遺伝子プロフィールを測定する工程を含む、刺激物質に応答する際に樹状細胞の遺伝子プロフィールを測定することを指向する。樹状細胞の好ましい供給源は、末梢血であるが、他の体液、組織、器官を含む任意の供給源から単離されまたは市販の供給源から得られ得る。樹状細胞の単離培養方法は、当業者に周知であり、本明細書に記載されている。本明細書で用いられるように、「未熟」樹状細胞は、抗原に曝露されていない樹状細胞として定義される。未熟樹状細胞の作製方法は、本明細書に記載されている。
【００４５】
本発明での使用に適当な刺激物質（たとえば、病原体）は、細菌、酵母、真菌、およびウイルスであり、大腸菌、スタフィロコッカス・アウレンス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｎｓ）、インフルエンザウイルス、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ポリＩ：Ｃ、酵母マンナンおよびｄｓ ＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）またはそれらの成分が挙げられる。細菌は、グラム陽性またはグラム陰性であり得る。ウイルスは、ＲＮＡ（一本鎖または二本鎖）ウイルスまたはＤＮＡウイルスであり得る。細菌、酵母、およびウイルスは、大多数の樹状細胞が各細胞が応答するように微生物と接触されることを確実にするのに十分な（しかし、微生物が組織培養プレート中で異常増殖しないおよび／または樹状細胞を殺さないだけの十分低い）濃度で使用されるべきである。細菌および真菌は、約１〜１０，０００の感染多重度（ＭＯＩ）で使用され得る。詳細な態様において、細菌または真菌は、約１．５〜約１０００、約２〜約５０、約３〜約２０ＭＯＩ、または約５〜約１０ＭＯＩで使用され得る。さらに、刺激物質は、物理的、化学的、または電気的であり得る。さらに、刺激物質は無機化学薬品、有機化学薬品またはそれらの組み合わせたものを含み得る。刺激物質は、樹状細胞に曝露された場合、好ましくは免疫応答を引き出す。免疫応答を測定する方法は、当該分野においてよくキャラクタライズされている。
【００４６】
本発明の一つの態様において、樹状細胞は、刺激物質と共に培養される。次に、ｍＲＮＡが、曝露後種々の時点で樹状細胞から単離される。培養物中の細胞からのｍＲＮＡの単離は、技術標準である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．およびＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ １９８７，＆ Ｓｕｐｐ．４９，２０００ を参照のこと、この教示は参照により本明細書に取り込まれる）。ｍＲＮＡは、ついで、標準的な方法（上記参照文献を参照のこと）により標識される。ｍＲＮＡは、任意の適当な分子、たとえば、発蛍光団、ビオチン、放射性ヌクレオチド、および染料で標識されてもよい。好ましい態様において、ｍＲＮＡは蛍光的に標識される。ひとつの態様において、標識されたｍＲＮＡは、次いで、ＤＮＡミクロアレイにハイブリダイズされ得る。ＤＮＡミクロアレイは、任意の高密度オリゴヌクレオチドミクロアレイ、たとえば、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ＨＵ６８００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， ＣＡ）であり得る。標識されたｍＲＮＡのＤＮＡミクロアレイへのハイブリダイゼーションは、当業者に公知である（Ｔａｍａｙｏら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９９）９６：２９０７−２９１２； Ｅｉｓｅｎ ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９９９） ３０３：１７９−２０５）。
【００４７】
標識されたｍＲＮＡ／ＤＮＡミクロアレイのハイブリダイゼーションからの遺伝子プロフィールの定量を、ミクロアレイをスキャンしてアフィメトリックススキャナー（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， ＣＡ）を用いてミクロアレイ上の各位置でのハイブリダイゼーションの量を測定することで行う。各刺激物質について、時系列のｍＲＮＡレベル（Ｃ＝｛Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３，．．．Ｃｎ｝）および刺激物質と同じ実験での対照培地中の対応する時系列のｍＲＮＡレベル（Ｍ＝｛Ｍ１，Ｍ２，Ｍ３，．．．Ｍｎ｝）が得られる。定量データを次いで分析する。ＣｉおよびＭｉ（ｉはｉ番目の時点を示し、ｎは全時間コースの時点の総数を示す）を相関定常状態ｍＲＮＡレベルとして規定する。μＭおよびσＭは、それぞれ対照時間コースの平均および標準偏差として規定される。
【００４８】
あるいは、標識されたＲＮＡは、本明細書に記載される病原体特異的または一般的な調節された遺伝子を含む標的核酸を含有するフィルターまたは他の固体支持体にハイブリダイズされ得る。ハイブリダイゼーション条件は、標識されたＲＮＡと標的遺伝子との間の特異的な結合を確実にするのに十分なくらいストリンジェントであるべきである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当業者に公知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．およびＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ １９８７，＆ Ｓｕｐｐ．４９，２０００ を参照のこと）。特異的ハイブリダイゼーションの定量は、シンチレーションと濃度計を含む任意の適当な方法により行うことができる。
【００４９】
本発明による刺激物質特異的データベースの生成は、患者中の病原体を同定する方法を提供するだろう。樹状細胞は末梢血で見られるため、それらは静脈穿刺により容易に得られる。一つの態様において、本発明により、患者の樹状細胞を単離する工程、該樹状細胞からｍＲＮＡを単離し標識する工程、ＤＮＡミクロアレイを樹状細胞由来の標識されたｍＲＮＡと接触させる工程、および少なくとも一つの刺激物質特異的遺伝子が同定されるように、遺伝子プロフィールを測定し分析する工程を含む、病原体の同定方法が導入される。刺激物質特異的遺伝子は、次いで、病原体が同定されるように刺激物質特異的データベースをサーチするのに使用される。刺激物質特異的遺伝子は複数の病原体に対して特異的であってもよい。また、病原体は、病原体のファミリーに属し得る。
【００５０】
本発明は、全ての記載された態様についてのキットを包含する。本発明は、大腸菌、カンジダ・アルビカンス、インフルエンザウイルスおよびそれらの成分に応答して調節される遺伝子のリストを提供する。本発明の方法は、病原体を同定し、感染を診断するのに使用され得る。さらに、本発明は、ワクチンを最適化する方法や、関節炎および移植片拒絶反応などの自己免疫疾患を治療する方法を提供する。
【００５１】
本発明は、その好ましい態様に関して特に示され、記載されているが、当業者であれば、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲から逸脱することなく、形態や詳細において種々の変更がここでなされ得ることは理解されるであろう。本明細書で引用された全ての参照文献の教示は、参照により本明細書中に取り込まれる。
【００５２】
実施例１．
樹状細胞の調製
傾瀉されたヒト単球（ＡｄｖａｎｃｅｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｃｏｌｕｍｂｉａ ＭＤ） は、１０００Ｕ／ｍｌ ＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ）および１０００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−４（Ｒ＆Ｄシステムズ）を補足した１０％ウシ胎仔血清（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ） とＲＰＭＩ中で７日間、２４ウェルプレート（１ｍｌ培地／ウエル中１０６細胞）で培養し、培養（１）後、２日ごとに培地を供給した。
【００５３】
樹状細胞の刺激
７日目に、樹状細胞（ＤＣ）（上記）を採取し、１×１０７ 細胞／プレートで１００ｍｍプレートに等分し、３７℃で６０分間インキュベートした。病原体またはそれらの成分をついで以下に示す量でＤＣ培養物に添加した。成熟したＤＣ樹状形成を示す刺激された細胞は、２４時間で付着力を失い、典型的なＤＣマーカー（ｃｄ８３、ｃｄ８６）を発現し、ＤＣ：Ｔの比率が１：１０００〜１：１０で異質遺伝型Ｔ細胞増殖を刺激した。以下の微生物を示される力価で使用した：大腸菌ＳＤ５４（ＡＴＣＣ）（５：１ＭＯＩ）（Ｊ．Ｎａｕ から好意的に提供された） 、インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４（７５０ＨＡＵ／ｍｌ（血球凝集素単位／ｍｌ）、５０％の細胞に感染するのに必要なウイルスの量は約５〜１０ＨＡＵ／ｍｌであった、Ｊ．Ｈｅｒｍａｎｎの贈与） 、カンジダ・アルビカンスＨＬＣ５４（５：１ＭＯＩ）（Ｇ．Ｆｉｎｋ の贈与） 、および以下の示された濃度の成分：大腸菌０５５：Ｂ５由来のＬＰＳ（リポ多糖）（１ｍｇ／ｍｌ，ＳｉｇｍａＬ−２８８０） 、ポリＩ：Ｃ（２５ｍｇ／ｍｌ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ； エンドトキシンレベルは０．２ＥＵ／ｍｌ未満であった、それはＤＣ中でＴＮＦα発現を誘導するのに十分ではない）、Ｓ．セレビジエ由来のマンナン（１ｍｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ，Ｍ７５０４） 。観察された病原体特異的な応答は、病原体認識における本質的な差よりも、各病原体の異なる力価のためであることが重要である。これは、共通の応答内の遺伝子の多くが、全ての刺激物質により等しいレベルに誘導されるためでありそうもなく、いくつかの経路がすべての病原体により等しく保証され得ることが提案され、使用された力価は、公知の成熟マーカーの発現を飽和することが示され、全ての病原体は、ＤＣにより食作用され、そしていくつかのケースでは、低力価および低濃度のミクロアレイ測定を繰り返し、類似の遺伝子発現プロフィールを見出した（データ示さず）。
【００５４】
病原体および成分を有するドナーの概要
以下の表は、各ドナー由来のＤＣに添加された刺激物質の概要である。
ドナー 刺激物質
ドナーＤ ポリＩ：Ｃ
ドナーＦ 大腸菌、インフルエンザ、ＬＰＳ、ポリＩ：Ｃ
ドナーＨ 大腸菌、インフルエンザ、ＬＰＳ
ドナーＩ Ｃ．アルビカンス
ドナーＭ Ｃ．アルビカンス、マンナン
ドナーＯ マンナン
ドナーＴ 大腸菌、インフルエンザ、Ｃ．アルビカンス
【００５５】
ＲＮＡ調製およびミクロアレイハイブリダイゼーション
各時点（０、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間）で、１×１０７ 細胞を採取し、トリゾール（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）を用いて溶解させた。全ＲＮＡを単離し、標識し、標準的な方法（Ｇｏｌｕｂ ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６：５３１−５３７（１９９９））を用いてＨｕＧｅｎｅＦＬオリゴヌクレオチドアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， ＣＡ）に対するハイブリダイゼーションのために調製した。
ハイブリダイゼーションは、１５ｍｇの標識されたＲＮＡ産物を用いて一晩行い、アレイをアフィメトリックススキャナーでスキャンした。可変な動力学を有する６人の非関連ヒトドナーの間で応答レベルの比較を可能にし、ＤＣ活性化における異なる相を規定するため、ＤＣ刺激後、複数の時点で測定を行った。インフルエンザ応答および大腸菌応答は、常に同じドナーで測定された。
【００５６】
遺伝子発現測定
遺伝子発現測定を保存し、本明細書で記載する分析法を用いて分析した。ｍＲＮＡ発現動力学レベルおよび誘導レベルを、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α、ＩＬ１２／ｐ４０、ＩＬ−１０およびＭＣＰ−１タンパク質レベルの酵素結合免疫ソルベントアッセイ（ＥＬＩＺＡ）測定で確認した。
【００５７】
統計的分析
データの集積と確認
１．７×１０６ 個体遺伝子測定物を保存し、分析し、一連のデータベースと研究室で開発された分析装置を用いて確認した。アレイ測定物を、同じドナー由来のサンプルとハイブリダイズした参照アレイで、Ｐ細胞（アフィメトリックスソフトウエアのＰ細胞）を用いる全ての遺伝子のハイブリダイゼーションシグナルのメジアンをスケーリングファクターとして用いて、正規化した。いくつかの喪失した時点でのデータを、フランキング時点を用いて組み込んだ。各刺激物質に応答する際の動力学および相対誘導レベルの両方を確認する標準ＥＬＩＳＡ測定を用いて、４つの分泌因子（ＴＮＦα、ＩＬ１２ｐ４０、ＩＬ１０、ＭＣＰ−１）のタンパク質レベルを測定することで遺伝子発現プロフィールを確認した。
【００５８】
得点システム
各病原体または化合物に曝露した樹状細胞（ＤＣ）における時系列のｍＲＮＡ蛍光レベル、Ｒ＝｛Ｒ１ 、Ｒ２ 、Ｒ３ 、．．．Ｒｎ ｝を集め、同じドナー由来の未処理ＤＣにおける対照系列のｍＲＮＡレベル、Ｃ＝｛Ｃ１ 、Ｃ２、Ｃ３ 、．．． Ｃｎ ｝を集めた。ＲｉおよびＣｉ は、ｉ番目の時点での定常状態のｍＲＮＡハイブリダイゼーション測定（アフィメトリックス用語で「平均差」）であり、ｎは時点の総数である。得点、Ｓｉ ＝（Ｒｉ −μｃ）／σｃ、は、対照時間コースの平均μｃから、ある時点、Ｒｉ 、での刺激された発現レベルの有意な偏差を測定するために考案された。対照時間コースの標準偏差であるσｃを用いることにより、得点は、培地対照中の高いノイズを有する遺伝子にペナルティをつけ、このようにして、殆どの強固なデータの抽出を可能にする。
【００５９】
病原体調節遺伝子
アップレギュレートされた遺伝子は、同じ時点で３人すべてのドナーに適用された以下の評価基準にしたがって選択された：（ｉ）２つ以上の連続した時点についてＳｉ ＞１．２、または（ｉｉ）１つ以上の時点についてＳｉ ＞４。４つ以上の連続した時点についてＳｉ＜−１．４である場合、ダウンレギュレートされた遺伝子を選択した。しかしながら、信号対雑音はアップレギュレートされた遺伝子よりも低いため、フィルターをさらに軽減して、３人のうちの２人のドナーについてフィルターを通過し、３人目のドナーで同じ傾向を有する、最も強固なダウンレギュレートされた遺伝子を選択した。
【００６０】
共通の調節遺伝子
共通のアップレギュレートされた遺伝子を、前記に規定された（ｉおよびｉｉ）病原体アップレギュレート遺伝子の交差に基づいて選択した。共通のダウンレギュレートされた遺伝子は、すべての病原体をわたる３つ以上の連続した時点についてＳｉ ＜−１．２に基づいて選択された。
【００６１】
刺激物質特異的遺伝子
刺激物質、Ａ、に応答し、かつ対照に相関するフォールド（Ｆｏｌｄ）発現レベルは、ＦＡ ＝ｍａｘ｛Ｌ１ ，Ｌ２ ，．．．，Ｌｎ−１｝（ここで、Ｌｉ ＝幾何平均｛Ｒｉ，ＲＩ＋１ ｝／幾何平均｛Ｃｉ ，Ｃｉ＋１｝）として規定される。刺激物質ＡおよびＢの間の遺伝子についてのフォールド発現レベルの比率はＲＦＡＢ＝ＦＡ ／ＦＢとして規定される。ある刺激物質（Ａ）で別の刺激物質（Ｂ）よりも強く調節される遺伝子は２つの方法のうちの一方で同定された：（ｉ）３人のドナー中、平均ＲＦＡＢ＝２．５；または（ｉｉ）３人のドナー中、刺激物質Ａに対する２つ以上の連続した時点についてＳｉ ＞１．４（対照時間コースと有意に異なる遺伝子プロフィールについて選択する）および刺激物質Ｂに対する全ての時点でＳｉ ＝１．２（遺伝子プロフィールは対照時間コースに密接に一致する）。刺激物質特異的遺伝子の最終セット（たとえば、図７Ａ、点線の丸）を用いて、ＤＣ応答がどのように生物学的に各刺激物質と異なるかを記載した。刺激物質Ａにおいて調節されるが、刺激物質Ｂにおいては調節されず、上記刺激物質特異的フィルターを通過しない残りの遺伝子は、共通の刺激物質特異的遺伝子のグループ間の境界上にあるため、比較分析に使用されなかった。
【００６２】
全てのフィルターは、以下の点を除く以外は、前記のように用いた：
（１）ＡおよびＢに対する応答が全ての複製について同じドナーで測定されない場合の二方向比較（刺激物質Ａに対するＤＣ応答対刺激物質Ｂに対するＤＣ応答の間）：
（ｉ）成分−病原体比較．全ての成分応答を２人のドナーで測定し、一方で全ての病原体応答を３人のドナーで測定した。成分と病原体との間の比較のストリンジェンシーを増大するため、平均ＲＦＡＢ＝２．５（全ての他の比較に関して）かつ成分と病原体がＤＣの同じ群で測定される一つの実験に関してＦＡ ／ＦＢ ＝２であることが必要であった。
（ｉｉ）Ｃ．アルビカンス−病原体比較．ＤＣの同じ群を一つの実験（ドナーＴ）でのみ全ての病原体（Ｃ．アルビカンス、大腸菌およびインフルエンザ）に曝したので、平均ＲＦＡＢ＝２．５および全ての病原体応答が測定された（ドナーＴ）実験についてＦＡ／ＦＢ ＝２を必要とすることにより、Ｃ．アルビカンスに対する任意の病原体の比較のストリンジェンシーを増大させた。
【００６３】
（２） ２名のドナーにおいて測定された、成分応答に関する制御された遺伝子は、よりストリンジェントなフィルターを必要とする。上方調節された遺伝子は、１つの実験について以下の基準：（ｉ）２つ以上の連続的な時間点についてＳｉ＞２または（ｉｉ）３つ以上の連続的な時間点についてＳｉ＞１．２または（ｉｉｉ）１つ以上の時間点についてＳｉ＞５にしたがって選択し、第２のドナーでの独立した実験には、ドナー間の発現レベルにおける変動を考慮するために、（ｉ）より低ストリンジェントなフィルターに置き換え、２つ以上の連続的な時間点についてＳｉ＞１．４としたこと以外は同じ基準を適用した。下方調節された遺伝子は、２つ以上の連続的な時間点についてＳｉ＜−１．４の場合に選択した。
【００６４】
一過性クラスタリング
自動マップ組織化アルゴリズム（ｓｅｌｆ−ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ ｍａｐ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）（Ｔａｍａｙｏら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：２９０７−１２（１９９９））を用い、遺伝子を、その一過性発現プロフィールの類似性に基づいて互いにクラスターさせた。この手順は、遺伝子を６つの基本的な群：時間経過の初期、中期または後期に発現された遺伝子からなる主な３つの群、およびこれらの群のそれぞれについて、遺伝子を、一過的に発現されるもの、または持続的に発現されるものにさらに分けて分類するのを補助するために使用した（図８Ａ）。
【００６５】
機能的カテゴリー
また、調節された遺伝子のそれぞれを、公のデータベースにしたがって、機能的カテゴリー（例えば、ケモカイン、解糖など）に割り当てた。機能的群の割り当ては、遺伝子のＰｒｏｔｅｏｍｅ注釈データベース、Ｈｕｍａｎ ＰＳＤ（登録商標）（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ，Ｉｎｃとの共同研究により提供いただいた）との比較により確認し、詳細化した。
【００６６】
好中球の移動
好中球の単離および移動のアッセイを、標準的技術（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｄｓ，１９９９））を用いて行った。指向された好中球移動を、フィルター付の９６−ウェルチャンバ（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて測定した。２００００個の好中球をＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で蛍光標識し、フィルター上面に配置した。ＤＣ上清みを下方に配置した（１：１０希釈）。３０分間３７℃および１０分間４℃でインキュベートした後、各ウェルの底面の好中球を計測した。
【００６７】
実施例２：Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ＨｕＧｅｎＦ１ Ｃｈｉｐ（６８００遺伝子）（３ドナー）を用いた病原体調節遺伝子の同定
オリゴヌクレオチドマイクロアレイを用い、ＤＣが、系統発生的に多様な病原体をどの程度識別するか、およびこれらの病原体の一般的に研究されている成分が生きた病原体の応答を説明するのに充分であるか否かを試験した。ヒト単球由来樹状細胞（ＤＣ）を、多様な組の微生物および化合物：グラム陰性細菌種、大腸菌およびその細胞壁成分、リポ多糖（ＬＰＳ）；真菌、Ｃ．アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）および酵母細胞壁由来マンナン；ならびにＲＮＡウイルス、インフルエンザＡおよび二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）に曝露した。ＤＣを、病原体またはその成分ととともに１〜３６時間培養し、ＲＮＡを単離し、標識し、（本明細書に記載のような）マイクロアレイとハイブリダイズさせた。各病原体刺激を３名の別個のドナーで繰り返し、各成分刺激を２名のドナーで繰り返した。発現レベルが刺激に応答して変化した遺伝子（調節された遺伝子とよぶ）を、多数の時間点にわたる、処理試料および未処理試料の発現レベルの有意差および反復される差に基づいて選択した。オリゴヌクレオチドアレイ上に提示されたおよそ６８００個の遺伝子のうち、全部で１３３０個の遺伝子が、病原体または成分の１つに接するとその発現が有意に変化した。遺伝子発現のかかる大きな変化は、ＤＣが、その細胞表現型において顕著な形質転換を受けうることを示した。
【００６８】
病原体に対する個々の応答の解析は、各病原体により特徴的な数の遺伝子が調節されることを示した。インフルエンザおよび大腸菌は、排他的サブセットの遺伝子の発現をモジュレートしうるが（７Ａおよび７Ｃ）、Ｃ．アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）は大腸菌調節性遺伝子のサブセットの発現のみモジュレートした（図７Ｂ）。また、遺伝子発現は、大腸菌により最も迅速に、Ｃ．アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）によりやや迅速に、インフルエンザにより最も遅く誘導された。
【００６９】
３つの異なる病原体応答の共通点により、共通の１６５個の高度に調節された遺伝子の組が明らかになった（図７Ａおよび７Ｄ）。３つの病原体のいずれかに曝露した後のＤＣ応答の力学を説明するため、これらの遺伝子を、その発現の運動論および公知の生物学的機能にしたがって分類した（図８Ａおよび８Ｂ）。３つの病原体のいずれかと接触させた直後、遺伝子の転写物レベルにおいて、食作用および病原体認識に関連する急速な低下が観察された（図８Ｂ）。同時に、免疫サイトカイン、ケモカイン、ならびに単球、ＤＣおよびマクロファージの感染部位への漸増に寄与するレセプターの発現において一過性の増加があった。また、活性化ＤＣの形態変化および移動挙動を潜在的に媒介しうる１組の細胞骨格遺伝子が強く誘導された。中期におけるシグナル伝達遺伝子および転写因子の誘導は、リンパ管およびリンパ節における調節性シグナルに受容されるＤＣの調製に関与しうる。また、いくつかの抗原プロセッシング遺伝子および抗原提示遺伝子が、高レベルで持続的に誘導された。反応性酸素種（ＲＯＳ）の生成に関与する遺伝子は、経時的に誘導され、これは、感染性微生物が、ＤＣの成熟および移動により死滅されることを示す。最後に、後期において、リンパ節ケモカインに対する応答を媒介し、それによりＤＣ移動を媒介することが知られているケモカインレセプターが上方調節された。本明細書に記載する１６５個の遺伝子の組は、したがって、中心的ＤＣ応答の一部を構成する。この応答は、独立して病原体に特徴的に独立して誘発され、先天性免疫応答および適応免疫応答の両方をモジュレートする時間順のカスケードとして展開される（図８Ｃ）。
【００７０】
対照的に、大腸菌特異的遺伝子の解析（図７Ｅおよび１０Ａ〜１０Ｃ）は、ＤＣがまた、炎症サイトカイン、好中球誘引性ケモカイン、単球誘因性ケモカインおよびプロスタグランジン経路成分を含む、アレイ上の先天性免疫遺伝子のほとんどを強力に迅速に上方調節することを示した。この強力な炎症応答は、おそらく、中期に誘導されるインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）により部分的に中和される。その後、Ｔ細胞刺激遺伝子、分泌されるサイトカイン、およびナイーブＴＨ２Ｔヘルパー細胞（ｖｏｎ ＡｎｄｒｉａｎおよびＭａｃｋａｙ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３：１０２０−１０３４（２０００））を誘引すると考えられているケモカインのサブセットを含む、適応免疫応答を調節する遺伝子が誘導された。共通のΥ鎖を共有する予期しないクラスのサイトカインレセプター（ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−７Ｒ、ＩＬ−１５ＲおよびＩＬ−４Ｒ）もまた誘導された。これらのレセプターの発現は、リンパ節内でＤＣがリンパ球誘導性インターロイキンに応答するのを許容しうる。
【００７１】
これらの免疫刺激応答はすべて、さらなる誘導された遺伝子ファミリー（図１０Ａ〜１０Ｃ）、例えば、抗菌性ＲＯＳのレベルをモジュレートする細胞ストレス遺伝子、感染ＤＣの寿命を延長しうる抗アポトーシス遺伝子（Ｏ’ＲｅｉｌｌｙおよびＳｔｒａｓｓｅｒ，Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｒｅｓ．４８：５−２１（１９９９））、およびサイトカインのプロセッシングおよびリンパ節へのＤＣの移動を可能にしうる後期発現性マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭｕｒｐｈｙおよびＧａｖｒｉｌｏｖｉｃ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１：６１４−６２１（１９９９））の誘導により増強されうる。ＤＣ機能における役割が不明確な遺伝子もまた大腸菌により調節され、シグナル伝達分子、転写因子、接着分子および解糖遺伝子の多くが含まれた。解糖遺伝子の公知の転写因子の１つであるＨＩＦ１αもまた、上方調節された（Ｗｅｎｇｅｒ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．２０３：１２５３−１２６３（２０００））。まとめると、大腸菌およびＬＰＳに対する応答における遺伝子発現のこれらの多様な変化は、ＤＣの有意な細胞性および免疫学的再プログラミングを反映する。
【００７２】
大腸菌に対するＤＣの応答に比べ、そのＣ．アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）に対する応答は、多くの機能的カテゴリーにおいて大幅に減衰され、大腸菌応答のサブセットを構成し、免疫遺伝子の数はずっと少なく、強力なＣ．アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）特異的遺伝子はなかった（図７Ａ、７Ｂおよび１０Ａ〜１０Ｃ）。免疫遺伝子の多くは、転写因子ＮＦ−κＢにより調節されることが知られているため（Ｇｈｏｓｈら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：２２５−２６０（１９９８））、この差は、比較的弱いＮＦ−κＢ上方調節により一部説明されうる（図１０Ａ〜１０Ｃ）。
【００７３】
ＤＣは、インフルエンザに応答して、大腸菌に応答して調節された数に匹敵する多数の遺伝子を調節した。しかしながら、先天性免疫応答は、好中球化学走性アッセイにより確認されるように比較的弱く、好中球を刺激しうる遺伝子を完全に欠いていた。また、インフルエンザに対する適応応答は、大腸菌に対する応答とは異なっていた。インターフェロン（ＩＦＮ）αおよびβをコードする抗ウイルス性遺伝子が強力に誘導され、これらはインターフェロン誘導性ケモカイン遺伝子であった（図１０Ａ〜１０Ｃ）。これは、ナイーブＴＨ１細胞（ｖｏｎ ＡｎｄｒｉａｎおよびＭａｃｋａｙ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３：１０２０−１０３４（２０００））の誘導および移動に対する可能な効果を示す。インフルエンザにより誘導された重要なサブセットの遺伝子は、ある段階での免疫応答の阻害と関連している。これらには、感染細胞の初期の死滅を導きうるプロアポトーシス遺伝子（Ｏ’ＲｅｉｌｌｙおよびＳｔｒａｓｓｅｒ，Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｒｅｓ．４８：５−２１（１９９９））ならびにマクロファージにおけるＩＬ−１２産生をブロックしうる、ｍｃｐ−１をコードする遺伝子（Ｂｒａｕｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：３００９−３００１７（２０００））；ナチュラルキラー細胞を阻害しうるＨＬＡ−Ｅ（Ｔｏｍａｓｅｃら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：１０３１（２０００））；ＮＯ合成を阻害するタンパク質の近縁ホモログであるＧｆｒｐ（Ｍｉｌｓｔｉｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１９７４３−１９７５１ １９９６））およびＴ細胞活性化を阻害しうるＩＤＯ（Ｈｗｕら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：３５９６−３５９９（２０００））が含まれる。また、インフルエンザは、多様な細胞機能に関与し、かつ病原体−宿主相互作用に対する寄与がこれまでに研究されていないようである多数遺伝子の組の発現をモジュレートした。
【００７４】
ＤＣが病原体を識別する能力をさらに詳細に調べるため、これらの示差的な病原体応答を誘発するのに充分な個々の病原体成分の量を調査した。細菌に存在することが知られているさらなる活性分子にもかかわらず、ＬＰＳは、ほぼ完全な細菌性応答を擬態し、説明しえた（図９Ａ）。意外にも、真菌成分マンナンは、真菌性またはウイルス性応答プロフィールよりも近似的に細菌性応答の大きさおよび生物学的特徴を擬態した（図９Ａおよび９Ｂ）。ｄｓＲＮＡは、細菌応答のあまり強力でない刺激因子であったが、細菌により誘導されるものに匹敵する強力な先天性応答を誘発し、同時に、ウイルス性応答において見られる局面を誘発することができた（図９Ａおよび９Ｂ）。したがって、３つのすべての成分は、多くの先天性免疫遺伝子および一般的病原体応答におけるほとんどの遺伝子の発現を誘発することができた。この所見は、中心的ＤＣプログラムが多様な分子構造をもつ多重刺激物質により引き起こされうることを示す。
【００７５】
ＤＣ転写応答のゲノムレベルの研究により、一般的だが示差的な病原体の認識経路の存在がわかった。ＬＰＳに応答したＤＣにおける遺伝子発現の変化が報告されているが、病原体に対する応答は充分には調査されていない（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、Ｂｌｏｏｄ ９６：２２０６−２２１４（２０００）；Ｄｉｅｔｚら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７５：７３１−７３８（２０００））。病原体に対する示差的免疫応答は、臨床試験及び動物試験において記載されている（ＡｓｈｍａｎおよびＰａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９：６４６−６７２（１９９５）；Ｌｕｄｗｉｇら、Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１７５−１９６（１９９６）；Ｒｅｉｓ ｅ Ｓｏｕｓａら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：３９２−３９９（１９９９））、本明細書に記載する結果は、これらの応答がＤＣ遺伝子発現の変化を反映したものであることを示す。
【００７６】
グラム陽性スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）を含む病原体に対する一般的応答における遺伝子発現の時間的カスケード（データ開示せず）は、中心的ＤＣ機能を説明し、病原体の先天性認識と抗原提示および適応Ｔ細胞応答との関連づけにおけるＤＣの本質的な役割を表す（Ｃｅｌｌａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：８２１−８２９（１９９９）；Ｂｈａｒｄｗａｊら、Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：７９７−８０７（１９９４）；Ｒｅｓｃｉｇｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：５２２９−５２３４（１９９８）；Ｈｅｍｍｉら、Ｎａｔｕｒｅ ４０８：７４０−７４５（２０００））。この一般的な応答の存在は、これらの成分および病原体のいくつかを識別することが知られているレセプター由来の経路の収斂を反映する。対照的に、ほとんどの機能的カテゴリー（転写因子およびサイトカインを含む）における病原体特異的遺伝子発現の存在は、異なる経路が異なる病原体により活性化されることを示す。これらの示差的応答は、ヒト単球由来ＤＣがその応答において柔軟性であり、異なるＤＣサブタイプのものと類似する多様な応答を発揮することさえありうることを示す（Ｒｉｓｓｏａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３：１１８３−１１８６（１９９９）；Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：７６７−８１１（２０００））。
【００７７】
本発明での実験において観察されたＤＣの広範な適応性は、ＤＣ成熟の概念がマーカーの標準的な組のモジュレーションでは簡単に説明されえないことを示す（ＢａｎｃｈｅｒｅａｕおよびＳｔｅｉｎｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２４５−２５２（１９９８））。その代わり、本明細書に記載の研究は、ＤＣが任意の病原体に対して中心的な応答を生じうるだけでなく、刺激特異的成熟および活性化を発揮することを示す。各刺激について、遺伝子の特定のサブセットがモジュレートされ、重要な生理学的結果を導く。ＤＣサブタイプ、細胞相互作用および組織の位置に依存して、よりいっそう示差的なインビボ調節が存在するようである。これらの特有の応答が病原体に対して、または宿主に対して有利であるか否かは、宿主−病原体相互作用を理解するのに必須である（ｄ’Ｏｓｔｉａｎｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１：１６６１−１６７４（２０００））。したがって、これらの病原体−調節遺伝子のさらなる研究は、ＤＣ成熟の理解を深め、免疫療法のさらなる標的を提供する。
【００７８】
ＨＵ６８００結果の概要
刺激応答性遺伝子
結果は以下の通りである（ｐ＜．００００５）：
大腸菌：６８５遺伝子（図１Ａ〜１ＧＧ）
インフルエンザ：５３１遺伝子（図２Ａ〜２Ｚ）
カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）：２８９遺伝子（図３Ａ〜３Ｎ）
【００７９】
刺激特異的遺伝子
大腸菌（インフルエンザにもカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）にも特異的でない）： １１８遺伝子（図４Ａ〜４Ｆ）
インフルエンザ（大腸菌にもカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）にも特異的でない）： ５８遺伝子（図５Ａ〜５Ｃ）
カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）（大腸菌にもインフルエンザにも特異的でない）： ０遺伝子
【００８０】
一般的刺激応答性遺伝子
図６Ａ〜６Ｅ、１６５個の一般的刺激応答性遺伝子を同定した。一般的刺激応答性遺伝子の概略図を図７Ａに示す。
【００８１】
刺激に応答する異なるタイプまたはクラスの遺伝子のリストを図１０Ａ〜１０Ｃに示す。
【００８２】
実施例３：Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ヒトゲノムＵ９５セット（６００００遺伝子）（１ドナー）を用いた病原体調節遺伝子の同定
種々の病原体に応答して調節されるさらなる樹状細胞遺伝子が同定されうるか否かを調べるため、６００００個の遺伝子を含有するＤＮＡチップ（マイクロアレイ）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ヒトゲノムＵ９５セット（５アレイセット））を利用して上述の方法を繰り返した。本明細書に記載する結果には１名のドナーを用いた。図１１Ａ〜１１ＡＡＡＡＡＡＡは、大腸菌での刺激で誘導された樹状細胞遺伝子を列挙する。図１２Ａ〜１２ＡＡは、大腸菌での刺激により特異的に誘導された樹状細胞遺伝子を列挙する。図１３Ａ〜１３ＺＺＺＺＺＺは、インフルエンザウイルスでの刺激で誘導された樹状細胞遺伝子を列挙する。図１４Ａ〜１４ＢＢは、インフルエンザウイルスでの刺激により特異的に誘導された樹状（細胞）遺伝子を列挙する。図１５Ａ〜１５ＫＫＫＫは、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）での刺激で誘導された樹状細胞遺伝子を列挙する。図１６Ａ〜１６Ｆは、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）での刺激により特異的に誘導された樹状細胞遺伝子を列挙する。図１７Ａ〜１７ＩＩは、大腸菌、インフルエンザウイルスおよびカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）により誘導された樹状（細胞）遺伝子を列挙する。
【００８３】
ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ヒトゲノムＵ９５セットにより、さらなる遺伝子の同定が可能となった。本明細書に記載される種々の病原体に対する拡充された遺伝子プロフィールは、感染性因子および治療標的の同定に関して本発明の方法を向上させる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａ〜１ＧＧは、Ｅ．ｃｏｌｉを用いる刺激で誘導される樹状細胞遺伝子を列挙する。第１列は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ同定番号（本明細書に記載されるように使用されるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）由来）を引用する。第２列は、ＧｅｎＢａｎｋまたはＴＩＧＲ受託番号を引用する。第３列は、遺伝子略語を引用する。第４列は、遺伝子名を引用する。第５〜７列は、Ｅ．ｃｏｌｉを用いる刺激についての遺伝子スコア（１列あたり１ドナー）を引用する。第８〜１０列は、インフルエンザを用いる刺激についての遺伝子スコア（１列あたり１ドナー）を引用する。第１１〜１３列は、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓを用いる刺激についての遺伝子スコア（１列あたり１ドナー）を引用する。
【図２】
図２Ａ〜２Ｚは、インフルエンザウイルスを用いる刺激で誘導される樹状細胞遺伝子を列挙する。第１列は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ同定番号（本明細書に記載されるように使用されるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）由来）を引用する。第２列は、ＧｅｎＢａｎｋまたはＴＩＧＲ受託番号を引用する。第３列は、遺伝子略語を引用する。第４列は、遺伝子名を引用する。第５〜７列は、Ｅ．ｃｏｌｉを用いる刺激についての遺伝子スコア（１列あたり１ドナー）を引用する。第８〜１０列は、インフルエンザを用いる刺激についての遺伝子スコア（１列あたり１ドナー）を引用する。第１１〜１３列は、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓを用いる刺激についての遺伝子スコア（１列あたり１ドナー）を引用する。
【図３】
図３Ａ〜３Ｎは、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓを用いる刺激で誘導される樹状細胞遺伝子を列挙する。第１列は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ同定番号（本明細書に記載されるように使用されるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）由来）を引用する。第２列は、ＧｅｎＢａｎｋまたはＴＩＧＲ受託番号を引用する。第３列は、遺伝子略語を引用する。第４列は、遺伝子名を引用する。第５〜７列は、Ｅ．ｃｏｌｉを用いる刺激についての遺伝子スコア（１列あたり１ドナー）を引用する。第８〜１０列は、インフルエンザを用いる刺激についての遺伝子スコア（１列あたり１ドナー）を引用する。第１１〜１３列は、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓを用いる刺激についての遺伝子スコア（１列あたり１ドナー）を引用する。
【図４】
図４Ａ〜４Ｆは、Ｅ．ｃｏｌｉを用いる刺激で特異的に誘導される樹状細胞遺伝子を列挙する。第１列は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ同定番号（本明細書に記載されるように使用されるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）由来）を引用する。第２列は、ＧｅｎＢａｎｋまたはＴＩＧＲ受託番号を引用する。第３列は、遺伝子略語を引用する。第４列は、遺伝子名を引用する。第５〜７列は、Ｅ．ｃｏｌｉを用いる刺激についての遺伝子スコア（１列あたり１ドナー）を引用する。第８〜１０列は、インフルエンザを用いる刺激についての遺伝子スコア（１列あたり１ドナー）を引用する。第１１〜１３列は、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓを用いる刺激についての遺伝子スコア（１列あたり１ドナー）を引用する。
【図５】
図５Ａ〜５Ｃは、インフルエンザウイルスを用いる刺激で特異的に誘導される樹状細胞遺伝子を列挙する。第１列は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ同定番号（本明細書に記載されるように使用されるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）由来）を引用する。第２列は、ＧｅｎＢａｎｋまたはＴＩＧＲ受託番号を引用する。第３列は、遺伝子略語を引用する。第４列は、遺伝子名を引用する。第５〜７列は、Ｅ．ｃｏｌｉを用いる刺激についての遺伝子スコア（１列あたり１ドナー）を引用する。第８〜１０列は、インフルエンザを用いる刺激についての遺伝子スコア（１列あたり１ドナー）を引用する。第１１〜１３列は、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓを用いる刺激についての遺伝子スコア（１列あたり１ドナー）を引用する。
【図６】
図６Ａ〜６Ｉは、Ｅ．ｃｏｌｉ、インフルエンザウイルス、およびＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓによって誘導される樹状細胞遺伝子を列挙する。第１列は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ同定番号（本明細書に記載されるように使用されるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）由来）を引用する。第２列は、ＧｅｎＢａｎｋまたはＴＩＧＲ受託番号を引用する。第３列は、遺伝子略語を引用する。第４列は、遺伝子名を引用する。第５〜７列は、Ｅ．ｃｏｌｉを用いる刺激についての遺伝子スコア（１列あたり１ドナー）を引用する。第８〜１０列は、インフルエンザを用いる刺激についての遺伝子スコア（１列あたり１ドナー）を引用する。第１１〜１３列は、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓを用いる刺激についての遺伝子スコア（１列あたり１ドナー）を引用する。
【図７】
図７Ａは、各刺激に対して調節される樹状細胞遺伝子の数および種々の刺激に応じて重複する遺伝子の数を示す図である。図７Ｂは、遺伝子プロフィールの図ならびに経時的にＥ．ｃｏｌｉおよびＣ． ａｌｂｉｃａｎｓに応じて調節された樹状細胞遺伝子を表す図である。図７Ｃは、遺伝子プロフィールの図ならびに経時的にＥ．ｃｏｌｉおよびインフルエンザに応じて調節された樹状細胞遺伝子を表す図である。図７Ｄは、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓおよびインフルエンザによって刺激された共通の応答樹状細胞遺伝子の遺伝子プロフィールの図である。図７Ｅは、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓおよびインフルエンザによって刺激された異なる応答樹状細胞遺伝子の遺伝子プロフィールの図である。
【図８】
図８Ａは、樹状細胞における共通応答遺伝子の発現速度論の経時的な概略図である。遺伝子が、その発現の時間的性質およびその発現の持続により分類された（すなわち、早期一過性、ＥＴ；早期持続、ＥＳ；中期一過性、ＭＴ；中期持続、ＭＳ；後期一過性、ＬＴ；後期持続、ＬＳ）。
図８Ｂは、その時間的発現速度論および遺伝子型により分類された樹状細胞遺伝子のリストである。
図８Ｃは、樹状細胞生活環期の図である。病原体の食作用、生得免疫応答の活性化、リンパ節への移動、適応できる免疫細胞の抗原提示および刺激、ならびにアポトーシスを含む樹状細胞成熟の相対的タイミングが示される。
【図９】
図９Ａは、大腸菌、Ｃ． ａｌｂｉｃａｎｓ、またはインフルエンザまたはその成分分子ＬＰＳ 、マンナンもしくはｄｓＲＮＡ それぞれに応答して調節された樹状細胞遺伝子の数の図である。
図９Ｂは、大腸菌またはマンナンまたはｄｓＲＮＡに応答して調節された樹状細胞遺伝子の数の図である。
【図１０】
図１０Ａ 〜Ｃ は、大腸菌、Ｃ． ａｌｂｉｃａｎｓ 、およびインフルエンザに応答して特異に調節された樹状細胞遺伝子の機能的カテゴリーのリストである。
【図１１】
図１１Ａ 〜１１ＡＡＡＡＡＡＡ は、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ヒトゲノムＵ９５ セットを用いた大腸菌との刺激により誘発された樹状細胞遺伝子を列挙する。１列に、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ同定番号（本明細書に記載のように使用されるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧｅｎｅＣｈｉｐ （登録商標）由来） を挙げる。２列に、遺伝子名を挙げる。３列に、遺伝子略語を挙げる。４列に、Ｇｅｎｂａｎｋ またはＴＩＧＲアクセッション番号を挙げる。５列に、大腸菌との刺激に対する遺伝子スコアを挙げる。６列に、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓとの刺激に対する遺伝子スコアを挙げる。７列に、インフルエンザとの刺激に対する遺伝子スコアを挙げる。
【図１２】
図１２Ａ 〜１２ＡＡは、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ヒトゲノムＵ９５セットを用いた大腸菌との刺激により特異的に誘発された樹状細胞遺伝子を列挙する。１列に、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ同定番号（本明細書に記載のように使用されるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ （登録商標）由来） を挙げる。２列に、遺伝子名を挙げる。３列に、遺伝子略語を挙げる。４列に、Ｇｅｎｂａｎｋ またはＴＩＧＲアクセッション番号を挙げる。５列に、大腸菌との刺激に対する遺伝子スコアを挙げる。６列に、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓとの刺激に対する遺伝子スコアを挙げる。７列に、インフルエンザとの刺激に対する遺伝子スコアを挙げる。
【図１３】
図１３Ａ 〜１３ＺＺＺＺＺＺは、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ヒトゲノムＵ９５ セットを用いたインフルエンザウイルスとの刺激により誘発された樹状細胞遺伝子を列挙する。１列に、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ同定番号（本明細書に記載のように使用されるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧｅｎｅＣｈｉｐ （登録商標）由来） を挙げる。２列に、遺伝子名を挙げる。３列に、遺伝子略語を挙げる。４列に、Ｇｅｎｂａｎｋ またはＴＩＧＲアクセッション番号を挙げる。５列に、大腸菌との刺激に対する遺伝子スコアを挙げる。６列に、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓとの刺激に対する遺伝子スコアを挙げる。７列に、インフルエンザとの刺激に対する遺伝子スコアを挙げる。
【図１４】
図１４Ａ 〜１４ＢＢは、インフルエンザウイルスとの刺激により特異的に誘発された樹状遺伝子を列挙する。１列に、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ同定番号（本明細書に記載のように使用されるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧｅｎｅＣｈｉｐ （登録商標）由来） を挙げる。２列に、遺伝子名を挙げる。３列に、遺伝子略語を挙げる。４列に、Ｇｅｎｂａｎｋ またはＴＩＧＲアクセッション番号を挙げる。５列に、大腸菌との刺激に対する遺伝子スコアを挙げる。６列に、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓとの刺激に対する遺伝子スコアを挙げる。７列に、インフルエンザとの刺激に対する遺伝子スコアを挙げる。
【図１５】
図１５Ａ 〜１５ＫＫＫＫは、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ヒトゲノムＵ９５ セットを用いたＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓとの刺激により誘発された樹状細胞遺伝子を列挙する。１列に、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ同定番号（本明細書に記載のように使用されるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧｅｎｅＣｈｉｐ （登録商標）由来） を挙げる。２列に、遺伝子名を挙げる。３列に、遺伝子略語を挙げる。４列に、Ｇｅｎｂａｎｋ またはＴＩＧＲアクセッション番号を挙げる。５列に、大腸菌との刺激に対する遺伝子スコアを挙げる。６列に、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓとの刺激に対する遺伝子スコアを挙げる。７列に、インフルエンザとの刺激に対する遺伝子スコアを挙げる。
【図１６】
図１６Ａ 〜１６Ｆ は、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ヒトゲノムＵ９５セットを用いたＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓとの刺激により特異的に誘発された樹状遺伝子を列挙する。１列に、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ同定番号（本明細書に記載のように使用されるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧｅｎｅＣｈｉｐ （登録商標）由来） を挙げる。２列に、遺伝子名を挙げる。３列に、遺伝子略語を挙げる。４列に、Ｇｅｎｂａｎｋ またはＴＩＧＲアクセッション番号を挙げる。５列に、大腸菌との刺激に対する遺伝子スコアを挙げる。６列に、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓとの刺激に対する遺伝子スコアを挙げる。７列に、インフルエンザとの刺激に対する遺伝子スコアを挙げる。
【図１７】
図１７Ａ 〜１７ＩＩは、大腸菌、インフルエンザウイルス、およびＣａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓにより誘発された樹状遺伝子を列挙する。１列に、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ同定番号（本明細書に記載のように使用されるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ （登録商標）由来） を挙げる。２列に、遺伝子名を挙げる。３列に、遺伝子略語を挙げる。４列に、Ｇｅｎｂａｎｋ またはＴＩＧＲアクセッション番号を挙げる。５列に、大腸菌との刺激に対する遺伝子スコアを挙げる。６列に、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓとの刺激に対する遺伝子スコアを挙げる。７列に、インフルエンザとの刺激に対する遺伝子スコアを挙げる。
Claims (58)
- ａ）１つまたはそれより多くの樹状細胞からｍＲＮＡを単離する工程；および
ｂ）少なくとも１つの刺激特異的遺伝子の遺伝子発現を測定する工程
を含み、ここで、刺激特異的遺伝子の発現は、該刺激特異的遺伝子が特異的である病原体による感染を示す、病原体の同定方法。 - 刺激特異的遺伝子発現が増大する、請求項１記載の方法。
- 刺激特異的遺伝子発現が減少する、請求項１記載の方法。
- 刺激特異的遺伝子が発現されない、請求項１記載の方法。
- ａ）未熟樹状細胞と病原体またはその免疫原性成分とを接触させる工程；
ｂ）該樹状細胞からｍＲＮＡを単離し、標識する工程；
ｃ）遺伝子プロフィールが作製されるように該樹状細胞由来の標識ｍＲＮＡを検出する工程；および
ｄ）遺伝子プロフィールを、少なくとも１つの刺激特異的遺伝子が同定されるように１つまたはそれより多くのリファレンス遺伝子プロフィールと比較して解析し、それにより刺激特異的遺伝子が特異的である病原体を同定する工程
を含む病原体の同定方法。 - ｂ）哺乳動物中の１つまたはそれより多くの樹状細胞からｍＲＮＡを単離する工程；
ｂ）該ｍＲＮＡと少なくとも１つの刺激応答性遺伝子プローブとを接触させる工程、ここで該ｍＲＮＡへの刺激応答性プローブのハイブリダイゼーションは、該哺乳動物における感染症を示す、
を含む哺乳動物における感染症の診断方法。 - 刺激応答性プローブが刺激特異的プローブである、請求項６記載の方法。
- 刺激応答性プローブが共通刺激応答性プローブである、請求項６記載の方法。
- ａ）哺乳動物中の１つまたはそれより多くの樹状細胞からｍＲＮＡを単離する工程；
ｂ）少なくとも１つの刺激特異的遺伝子の遺伝子発現を測定する工程、ここで該刺激特異的遺伝子の発現は、刺激特異的遺伝子が特異的である病原体による感染を示す、
を含む哺乳動物における病原体による感染症の診断方法。 - 刺激特異的遺伝子発現が増大する、請求項９記載の方法。
- 刺激特異的遺伝子発現が減少する、請求項９記載の方法。
- ａ）刺激応答性遺伝子の遺伝子プロフィールを解析する工程、ここで遺伝子プロフィールは臨床予後と相関する、
を含む、感染した個体の予後を予測する方法。 - 刺激応答性遺伝子が刺激特異的である、請求項１２記載の方法。
- 刺激応答性遺伝子が共通刺激応答性遺伝子である、請求項１２記載の方法。
- ａ）病原体を同定する工程；および
ｂ）それにしたがって治療養生法を処方する工程
を含む治療養生法を処方する方法。 - 病原体について患者を繰り返し評価し、治療養生法を処方する工程をさらに含む、請求項１５記載の方法。
- ａ）１つまたはそれより多くの未熟樹状細胞と試験ワクチンとを接触させる工程；
ｂ）該樹状細胞からｍＲＮＡを単離する工程；
ｃ）該樹状細胞中の遺伝子プロフィールを決定する工程；および
ｄ）至適化されたワクチンを示す遺伝子プロフィールを誘発する試験ワクチンを選択する工程、
を含むワクチンを至適化する方法。 - ａ）患者の樹状細胞が活性化されるように、患者の樹状細胞と病原体またはその成分とを接触させる工程；
ｂ）活性化された樹状細胞が該病原体に対して免疫応答を引き起こすように活性化された樹状細胞を患者に戻す工程
を含む病原体のエキソビボ治療処置。 - ａ）患者の樹状細胞が活性化されるように、患者の樹状細胞と腫瘍細胞またはその成分とを接触させる工程；
ｂ）活性化された樹状細胞が該腫瘍細胞またはその成分に対して免疫応答を引き起こすように活性化された樹状細胞を患者に戻す工程
を含む腫瘍のエキソビボ治療処置。 - ａ）患者の樹状細胞が活性化されるように、患者の樹状細胞と自己抗原またはその成分とを接触させる工程；
ｂ）活性化された樹状細胞が該自己抗原に対して免疫応答を引き起こさないように活性化された樹状細胞を患者に戻す工程
を含む自己免疫のエキソビボ治療処置。 - ａ）患者の樹状細胞が活性化されるように、患者の樹状細胞と移植片組織またはその成分とを接触させる工程；
ｂ）活性化された樹状細胞が移植片組織に対して免疫応答を引き起こさないように活性化された樹状細胞を患者に戻す工程
を含む自己免疫のエキソビボ治療処置。 - １つまたはそれより多くの樹状細胞と刺激とを接触させる工程；
ｂ）該樹状細胞からｍＲＮＡを単離する工程；および
ｃ）免疫応答を示す少なくとも１つの刺激応答性遺伝子が同定されるように遺伝子プロフィールを決定する工程
を含む、刺激に対する免疫応答を測定する方法。 - ａ）樹状細胞と刺激とを接触させる工程；
ｂ）該樹状細胞からｍＲＮＡを単離し、標識する工程；
ｃ）ＤＮＡマクロアレイと該樹状細胞由来の標識されたｍＲＮＡとを接触させる工程；および
ｄ）免疫応答を示す少なくとも１つの刺激応答性遺伝子が同定されるように対照刺激と比較して遺伝子プロフィールを測定し、解析する工程
を含む、刺激に対する免疫応答を測定する方法。 - 樹状細胞が末梢血から得られる、請求項２３記載の方法。
- 刺激が、細菌、真菌、ウイルス、またはそれらの成分からなる群より選ばれるものである、請求項２３記載の方法。
- 刺激が、エスケリチア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、スタフィロコッカス・オウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｎｓ）、インフルエンザウイルス、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、多糖（ＬＰＳ）、ポリＩ：Ｃ、および酵母マンナンからなる群より選ばれるものである、請求項２３記載の方法。
- 刺激が、物理的、化学的、または電気的からなる群より選ばれるものである、請求項２３記載の方法。
- 刺激が、無機化学物質および有機化学物質からなる群より選ばれるものである、請求項２３記載の方法。
- 刺激が、無機化学物質および有機化学物質からなる群より選ばれる組み合わせを含む、請求項２３記載の方法。
- ＤＮＡマイクロアレイが、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＨＵ ６８００である、請求項２３記載の方法。
- 刺激応答性遺伝子の発現が刺激に応答して増大する、請求項２３記載の方法。
- 刺激応答性遺伝子の発現が刺激に応答して減少する、請求項２３記載の方法。
- 刺激応答性遺伝子が刺激特異的である、請求項２３記載の方法。
- ａ）未熟樹状細胞と刺激とを接触させる工程；
ｂ）該樹状細胞からｍＲＮＡを単離し、標識する工程；
ｃ）ＤＮＡマイクロアレイと該樹状細胞由来の標識ｍＲＮＡとを接触させる工程；および
ｄ）少なくとも１つの刺激応答性遺伝子が同定されるように対照刺激と比較して遺伝子プロフィールを測定し、解析する工程
を含む、刺激に応答する樹状細胞における遺伝子プロフィールを測定する方法。 - 樹状細胞が末梢血から得られる、請求項３４記載の方法。
- 刺激が、細菌、真菌、ウイルス、またはそれらの成分からなる群より選ばれるものである、請求項３４記載の方法。
- 刺激が、エスケリチア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、スタフィロコッカス・オウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｎｓ）、インフルエンザウイルス、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、多糖（ＬＰＳ）、ポリＩ：Ｃ、および酵母マンナンからなる群より選ばれるものである、請求項３４記載の方法。
- 刺激が、物理的、化学的、または電気的からなる群より選ばれるものである、請求項３４記載の方法。
- 刺激が、無機化学物質および有機化学物質からなる群より選ばれるものである、請求項３４記載の方法。
- 刺激が、無機化学物質および有機化学物質からなる群より選ばれる組み合わせを含む、請求項３４記載の方法。
- ＤＮＡマイクロアレイがＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＨＵ６８００である、請求項３４記載の方法。
- 刺激応答性遺伝子の発現が刺激に応答して増大する、請求項３４記載の方法。
- 刺激応答性遺伝子の発現が刺激に応答して減少する、請求項３４記載の方法。
- 刺激応答性遺伝子が刺激特異的である、請求項３４記載の方法。
- ａ）未熟樹状細胞と刺激とを接触させる工程；
ｂ）該樹状細胞からｍＲＮＡを単離し、標識する工程；
ｃ）ＤＮＡマイクロアレイと該樹状細胞由来の標識ｍＲＮＡとを接触させる工程；および
ｄ）少なくとも１つの刺激応答性遺伝子を含むデータベースが作製されるように対照刺激と比較して遺伝子プロフィールを測定し、解析する工程
を含む刺激応答性遺伝子のデータベースを作製する方法。 - ａ）未熟樹状細胞と刺激とを接触させる工程；
ｂ）該樹状細胞からｍＲＮＡを単離し、標識する工程；
ｃ）ＤＮＡマイクロアレイと該樹状細胞由来の標識ｍＲＮＡとを接触させる工程；および
ｄ）少なくとも１つの刺激特異的遺伝子のデータベースが作製されるように対照刺激と比較して遺伝子プロフィールを測定し、解析する工程
を含む刺激特異的遺伝子のデータベースを作製する方法。 - ａ）樹状細胞と刺激とを接触させる工程；
ｂ）該樹状細胞からｍＲＮＡを単離し、標識する工程；
ｃ）ＤＮＡマイクロアレイと該樹状細胞由来の標識ｍＲＮＡとを接触させる工程；および
ｄ）少なくとも１つの共通刺激応答性遺伝子を含む共通刺激応答性遺伝子のデータベースが作製されるように対照刺激と比較して遺伝子プロフィールを測定し、解析する工程
を含む共通刺激応答性遺伝子のデータベースを作製する方法。 - 刺激応答性遺伝子のデータベース。
- 刺激特異的遺伝子のデータベース。
- 共通刺激応答性遺伝子のデータベース。
- ａ）１つまたはそれより多くの未熟樹状細胞と刺激とを接触させる工程；
ｂ）該樹状細胞からｍＲＮＡを単離する工程；
ｃ）少なくとも１つの刺激特異的遺伝子が同定されるように遺伝子プロフィールを決定し、それにより刺激特異的遺伝子が特異的である病原体を同定する工程
を含む病原体を同定する方法。 - ａ）１つまたはそれより多くの未熟樹状細胞と刺激とを接触させる工程；
ｂ）該樹状細胞からｍＲＮＡを単離し、標識する工程；
ｃ）ＤＮＡマクロアレイと該樹状細胞由来の標識ｍＲＮＡとを接触させる工程
ｄ）少なくとも１つの刺激特異的遺伝子が同定されるように対照刺激と比較して遺伝子プロフィールを測定および解析し、それにより刺激特異的遺伝子が特異的である病原体を同定する工程
を含む病原体を同定する方法。 - ａ）樹状細胞からｍＲＮＡを単離する工程；および
ｂ）少なくとも１つの刺激特異的遺伝子が同定されるように遺伝子プロフィールを決定し、それにより刺激特異的遺伝子が特異的である病原体を同定し、それが感染を示す工程
を含む病原体による感染を診断する方法。 - ａ）樹状細胞からｍＲＮＡを単離し、標識する工程；
ｂ）ＤＮＡマクロアレイと該樹状細胞由来の標識されたｍＲＮＡとを接触させる工程；および
ｃ）少なくとも１つの刺激特異的遺伝子が同定されるように対照刺激と比較して遺伝子プロフィールを測定し、解析し、それにより刺激特異的遺伝子が特異的である病原体を同定し、それが感染を示す工程
を含む病原体による感染を診断する方法。 - ａ）哺乳動物由来の１つまたはそれより多くの樹状細胞樹からタンパク質を単離する工程；
ｂ）該タンパク質と少なくとも１つの刺激特異的遺伝子とを接触させる工程
を含み、ここで、該タンパク質への刺激特異的抗体の結合が該哺乳動物における感染を示す、哺乳動物における感染の診断方法。 - Ｅ．ｃｏｌｉ特異的遺伝子を含む遺伝子プロフィール。
- カンジダ・アルビカン（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎ）特異的遺伝子を含む遺伝子プロフィール。
- インフルエンザウイルス特異的遺伝子を含む遺伝子プロフィール。
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