JP2004073013A

JP2004073013A - Large scale expression system of measles virus hemagglutinin protein

Info

Publication number: JP2004073013A
Application number: JP2002234202A
Authority: JP
Inventors: Hisatoshi Shida; 志田　壽利; Minoru Kidokoro; 木所　稔
Original assignee: Chiba Prefectural Government; Japan Science and Technology Corp
Current assignee: Chiba Prefectural Government; Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2002-08-09
Filing date: 2002-08-09
Publication date: 2004-03-11

Abstract

【課題】麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質（ＭＶＨ）としての抗原性を保持し、抗麻疹ウイルス抗体との反応性が高い麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質を大量に発現し、かつ発現したタンパク質を迅速に精製する方法を提供すること。
【解決手段】プロモーターとしてポックスウイルスのＡ型封入体（ＡＴＩ）プロモーター及び／又は複数反復するワクシニアウイルス７．５Ｋ前期発現プロモーターを用い、そのプロモーターの下流に、麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質の遺伝子を連結し、３´末端にヒスチジン標識配列（Ｈｉｓ標識）を挿入し、これを弱毒ワクシニアウイルスＬＣ１６ｍＯ（ｍＯ）株に導入することにより、天然の麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質の抗原性を保持する血球凝集素タンパク質を、高発現で発現するとともに、その生産物から該血球凝集素タンパク質を効率的かつ迅速に精製することを可能とした。[PROBLEMS] To express a large amount of a measles virus hemagglutinin protein which retains antigenicity as a measles virus hemagglutinin protein (MVH) and has high reactivity with an anti-measles virus antibody, and rapidly purifies the expressed protein. To provide a way to
A poxvirus type A inclusion body (ATI) promoter and / or a vaccinia virus 7.5K early expression promoter that repeats multiple times are used as a promoter, and a measles virus hemagglutinin protein gene is linked downstream of the promoter. And inserting a histidine-tagged sequence (His-tag) at the 3 'end and introducing it into the attenuated vaccinia virus LC16mO (mO) strain, thereby retaining the antigenicity of the natural measles virus hemagglutinin protein. The protein was expressed with high expression, and the hemagglutinin protein was efficiently and rapidly purified from the product.

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質（ＭＶＨ）としての生物学的活性及び抗原性を保持し、抗麻疹ウイルス抗体との反応性が高い麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質を、大量発現し、分離・精製して取得する方法、そのための遺伝子発現用組換えベクター及び該タンパク質を高発現で発現する遺伝子組換えウイルス、更には該タンパク質を抗原として用いて、抗麻疹ウイルスの抗体価を診断する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
麻疹の病原体である麻疹ウイルス（ＭＶ）は、世界中に広く分布しており、このウイルスは極めて伝染力が強いことで知られている。ヒトに飛沫感染すると、主として呼吸器系と細網内皮組織を侵し、急性伝染性疾患を発症する。罹病すると、麻疹ウイルスによる赤い発疹を生じ、高熱、カタルなど全身にわたる症状を呈し、重症例では、高熱、痙攣、循環不全、意識障害から昏睡へと移行する。
この疾患の予防には、麻疹生ワクチンによる能動免疫、ヒト免疫グロブリンによる受動免疫などがある。
【０００３】
麻疹ウイルス（ＭＶ）は、モノネガウイルス目パラミクソウイルス科モルビリウイルス属に属する。ビリオンは、直径約１５０ｎｍの略球形を呈し、脂質二重膜からなるエンベロープを有する。そのエンベロープの全面には、Ｈ（ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；血球凝集素）タンパク質とＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質とがスパイク状に突起し、その基底はエンベロープ下面のマトリクス膜タンパク質で支持されている。エンベロープ内側に存在するヌクレオキャプシドは、麻疹ウイルスゲノムである全長約１６ｋｂの線状単鎖（−）センスの遺伝子ＲＮＡとタンパク質からなる。
従来、麻疹の予防には弱毒麻疹生ワクチン株ウイルスが用いられているが、該弱毒麻疹生ワクチン株ウイルスとしては、ＣＡＭ−７０、Ｓｃｈｗａｒｚ　ＦＦ８、ＡＩＫ−Ｃ、ＡＩＫ−ＨＤＣ、ＴＤ−９７、Ｍｏｒａｔｅｎ、Ｃｏｎｎａｕｇｈｔなどの株が知られている（Ｖａｃｃｉｎｅｓ　２，　２３８−２３９，　１９９４）。
【０００４】
麻疹ウイルス（ＭＶ）のＨタンパク質すなわち麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質は、麻疹ウイルス抗原として有用である。このウイルス抗原を用いて、麻疹ウイルスの診断が可能となる。この麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質（ＭＶＨ）については、近年、いくつかの報告がある。
ＭＶＨは、その免疫原性並びに正確な細胞内輸送、ホールディング及びオリゴマー形成などの生物活性を発揮するため、糖鎖修飾（グリコシル化）を含む正しい翻訳後修飾を受けなくてはならないことが報告されている（Ａｒｃｈ．　Ｖｉｒｏｌ．　１３６，　２３９−２５３，　１９９４、Ｊ．　Ｇｅｎ．　Ｖｉｒｏｌ．　７５，　１０４３−１０５２，　１９９４）。
【０００５】
また、ＭＶＨは、宿主細胞表面の受容体分子（例えばＣＤ４６、モエシン及びＳＬＡＭ）に結合するＭＶエンベロープ糖タンパク質であり（Ｃｅｌｌ　７５，　２９５−３０５，　１９９３、Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ．　６７，　６０２５−６０３２，　１９９３、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１９８，　２６５−２７４，　１９９４、Ｎａｔｕｒｅ　４０６，　８９３−８９７，　２０００）、ＭＶＨが、ＲＢＣ上のＣＤ４６分子に結合することから、アフリカミドリザル（ＡＧＭ）の赤血球（ＲＢＣ）を凝集させるＭＶの能力は、そうした結合によるものと考えられている（Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ．　７１，　６１４４−６１５４，　１９９７）。
【０００６】
更に、ＭＶＨは、他のＭＶエンベロープ糖タンパク質である融合（Ｆ）タンパク質と協同して、ウイルスのエンベロープと宿主細胞膜との融合を促進する（Ｊ．Ｇｅｎ．　Ｖｉｒｏｌ．　７２，　４３９−４４２，　１９９１、Ｊ．　Ｇｅｎ．　Ｖｉｒｏｌ．　７４，　２３６５−２３７２，　１９９３、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２００，　１１−２０，　１９９４）。また、ＭＶＨは、麻疹ウイルス（ＭＶ）感染において、体液性及び細胞性免疫を引き起こす主な標的抗原のひとつであり（Ｐｒｏｇ．　Ｍｅｄ．　Ｖｉｒｏｌ．　３６，　１−３３，　１９８９、Ｊ．　Ｇｅｎ．　Ｖｉｒｏｌ．　７２，　２４９１−２５００，　１９９１、Ｃｕｒｒ．　Ｔｏｐ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１８９，　１０９−１２１，　１９９４、Ｃｕｒｒ．　Ｔｏｐ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１８９，　１５１−１６７，　１９９４、Ｊ．　Ｉｎｆｅｃｔ．　Ｄｉｓ．　１７７，　１２８２−１２８９，　１９９８、Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．１０２，　１９６９−１９７７，　１９９８）、ＭＶＨに対する抗体は、麻疹ウイルス（ＭＶ）の中和を促し、ＭＶ感染防止に関わっている（Ｊ．　Ｇｅｎ．　Ｖｉｒｏｌ．　７２，　２４９１−２５００，　１９９１、Ｊ．　Ｉｎｆｅｃｔ．　Ｄｉｓ．　１６２，　１０３６−１０４２，　１９９０、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１４４，　４６−５８，　１９８５、Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　３６，　７２１−７２６，　１９９８）。
【０００７】
従来、ＭＶＨを取得するには、精製麻疹ウイルス（ＭＶ）ビリオン（ビリオン：ウイルス粒子）の可溶化と数行程のカラムクロマトグラフィーを組み合わせることにより（Ｊ．　Ｇｅｎ．　Ｖｉｒｏｌ．　５６，　１８５−１９３，　１９８１、Ｊ．　Ｇｅｎ．　Ｖｉｒｏｌ．　６９，　２０６１−２０６９，　１９８８、Ａｒｃｈ．　Ｖｉｒｏｌ．　６９，　５１３−５１６，　１９９５）、あるいはＭＶＨのモノクローナル抗体を併用したアフィニティークロマトグラフィーカラムにより（Ｉｎｆｅｃｔ．　Ｉｍｍｕｎ．　３２，　１０５１−１０５７，　１９８１、Ｊ．　Ｇｅｎ．　Ｖｉｒｏｌ．　７５，　３５５−３６６，　１９８４）、精製されてきた。
【０００８】
しかし、これらの方法にはいくつかの制限があった。例えば、充分な量の精製ウイルス粒子を入手するのは、集約的で費用のかさむ仕事であり、また、ＭＶＨ以外のウイルス成分を最終調製物から完全に除去するのは不可能であつた。更に、後者のアプローチでは、溶出段階におけるタンパク質の変性が避けられない場合があり、こうした制限のため、今まで、ＭＶＨとしての生物活性と抗原性を保持しつつ、尚且つ、高い回収率と精製度でＭＶＨを取得する方法が開発できずにきた。したがって、ＭＶＨを診断薬等として実用化するためには、抗原性の優れたＭＶＨを大量に生産できる方法の開発が強く望まれていた。
【０００９】
一方で、ＭＶＨのような糖鎖を含有するタンパク質を製造するためには、従来より、タンパク質をコードする遺伝子を用いて、遺伝子工学技術により製造する方法が行われてきた。
今日までに、真核生物の膜糖タンパク質を効率的に発現させるための、数多くのウイルス発現系が開発されてきた（Ｊ．　Ｇｅｎ．　Ｖｉｒｏｌ．　６４，　２５５−２６６，　１９８３、Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ．　３５，　１７７−１９２，　１９８８）。そのなかでも、ワクシニアウイルス（ＶＶ）発現ベクター（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　７９，　４９２７−４９３１，　１９８２、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　７９，　７４１５−７４１９，　１９８２）は、発現効率が高く、宿主が広範囲にわたること、及び外来遺伝子に対する収容性が非常に大きなこと（少なくとも３５ｋｂ）から、特に有用な手段として知られている（Ｊ．　Ｇｅｎ．　Ｖｉｒｏｌ．　６７，　２０６７−２０８２，　１９８６、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５２，　１６６２−１６６７，　１９９１）。そのうえ、それらが適切な宿主細胞に感染すると、タンパク質産物に対する正しい翻訳後修飾が確実に行われるようになる。
【００１０】
しかし、ワクシニアウイルス（ＶＶ）系でひとつ不利な点は、場合によってはワクシニアウイルス（ＶＶ）がヒトに対して病原性をもつことである。この問題を克服するため、数種の弱毒ワクシニアウイルス（ＶＶ）株が開発された。そのなかには、リスター株由来のＬＣ１６ｍＯ（ｍＯ）株とＬＣ１６ｍ８株も含まれる。これらは高度弱毒ワクチン株で、その神経毒性及び動物の皮膚中での増殖程度は、元のウイルスよりもかなり低いものである。ワクチン接種を受けていないヒトに対してこれらの株が安全に使用できることは、幼児を対象とした臨床試験により証明されている（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，８７−１００，　１９８５）。
【００１１】
ワクシニアウイルス（ＶＶ）ベクター系は、自らのプロモーターの制御下で外来遺伝子を発現する。牛痘ウイルスＡ型封入体（ＡＴＩ）後期プロモーターと、修飾ｐ７．５−ｋＤａプロモーターの縦列型反復配列からなる、２つの高効率合成プロモーター、ＰＳＦＪ１−１０及びＰＳＦＪ２−１６が開発されている（Ａｒｃｈ．　Ｖｉｒｏｌ．　１３８，　３１５−３３０，　１９９４）。これらのプロモーターの効率は、ＰＳＦＪ２−１６プロモーターの制御下でクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼが発現したとき、その産物が全細胞タンパク質に占める割合が１８％だったという観察結果によって明らかになっている。そうした発現レベルの高さは、ＶＶ−Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼハイブリッド系よりも高く、バキュロウイルスベクターについて報告されているものに近い（Ａｒｃｈ．　Ｖｉｒｏｌ．　１３８，　３１５−３３０，　１９９４、Ｃｕｒｒ．　Ｏｐｉｎ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　８，　５７３−５７７，　１９９７、Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．７　２５３８−２５４４，１９８７）。
【００１２】
真核生物の膜糖タンパク質を効率的に発現させるための、ウイルス発現系として、バキュロウイルスを用いたタンパク質発現系が知られている。この発現系はバキュロウイルスの一種である核多角体病ウイルス（ＮＰＶ）のゲノムＤＮＡの一部を外来遺伝子と組換え、ＮＰＶのもつ強力プロモーターを利用して外来遺伝子産物を大量発現する系である。バキュロウイルスで発現したタンパク質は、糖鎖、脂肪酸の付加、リン酸化などの翻訳後修飾が本来のものと同じように行われ、その結果、高次構造や生物学的活性においては、ほぼ本来のものと同様であることが多いと報告されている。しかし、グリコシル化は不完全な場合が多い。
【００１３】
以前の報告に、バキュロウイルス発現系によるＭＶＨの発現が記載されている（Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ．　６４，　３７−５０，　１９９０、Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ．　２６，　１６７−１７５，　１９９２）が、その産物には大量（全産生量のおよそ半分）の非グリコシル化血球凝集素タンパク質分子が含まれていることが報告されている（Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ．　６４，　３７−５０，　１９９０）。血球凝集素タンパク質の機能的完全性及び抗原性には正しい翻訳後グリコシル化が不可欠であるため（Ａｒｃｈ．　Ｖｉｒｏｌ．　１３６，　２３９−２５３，　１９９４、Ｊ．　Ｇｅｎ．　Ｖｉｒｏｌ．　７５，　１０４３−１０５２，　１９９４）、変性した非グリコシル化分子によってそのように広範囲に汚染されるのは、重大な問題となる場合がある。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、麻疹ウイルス（ＭＶ）血球凝集素タンパク質としての抗原性を保持し、抗麻疹ウイルス抗体との反応性が高い麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質を提供すること、及び該タンパク質を高発現で発現する遺伝子組換えウイルス、該ウイルスを用いた麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質の大量発現及び発現したタンパク質を迅速に精製する方法を提供すること、更には該タンパク質を抗原として用いて、抗麻疹ウイルスの抗体価を診断する方法を提供することにある。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究の結果、プロモーターとしてＰＳＦＪ１−１０とＰＳＦＪ２−１６（ポックスウイルスのＡ型封入体（ＡＴＩ）プロモーターより成る合成プロモーターと複数反復するワクシニアウイルス７．５Ｋ前期発現プロモーターより成る合成プロモーター）を用い、そのプロモーターの下流に麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質の遺伝子を連結し、更に、３´末端にＮｉ^２＋・イミノ−アセト酢酸（Ｎｉ^２＋ＩＤＡ）カラムによる精製が可能なヒスチジン標識配列（Ｈｉｓ標識）を挿入し、これを弱毒ワクシニアウイルスＬＣ１６ｍＯ株に導入した。この方法により、麻疹ウイルス（ＭＶ）血球凝集素タンパク質としての抗原性を保持し、抗麻疹ウイルス抗体との反応性が高い麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質を高発現する遺伝子組換えウイルスを構築することができた。しかもその生産物から一行程のアフィニティークロマトグラフィーで、血球凝集素タンパク質を精製することが可能な麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質の大量取得方法を見い出し本発明を完成するに至った。
【００１６】
本発明は、該方法における遺伝子発現用ベクタープラスミド、該プラスミドを弱毒ワクシニアウイルスに導入した組換えワクシニアウイルスを含み、更に、該方法により取得した麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質を、抗麻疹ウイルスの抗体価の診断への利用を含むものである。
【００１７】
すなわち本発明は、ポックスウイルスのＡ型封入体（ＡＴＩ）プロモーター及び／又は複数反復するワクシニアウイルス７．５Ｋ前期発現プロモーターの下流に、麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質の遺伝子を連結したことを特徴とする麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質の遺伝子発現用ベクタープラスミド（請求項１）や、麻疹Ｈ遺伝子の３´末端に、ヒスチジン標識配列を挿入したことを特徴とする請求項１記載の麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質の遺伝子発現用ベクタープラスミド（請求項２）や、請求項１又は２記載の麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質の遺伝子発現用ベクタープラスミドを、弱毒ワクシニアウイルス株に導入したことを特徴とする麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質の大量発現用組換えワクシニアウイルス（請求項３）や、ワクシニアウイルス株が、弱毒ワクシニアウイルスＬＣ１６ｍＯ株であることを特徴とする請求項３記載の麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質の大量発現用組換えワクシニアウイルス（請求項４）や、請求項３又は４のいずれか記載の組換えワクシニアウイルスを動物細胞に感染させ、培養することを特徴とする麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質の大量発現方法（請求項５）や、動物細胞が、ウサギ腎臓細胞ＲＫ１３又はシリアンハムスター腎臓細胞ＢＨＫ−２１であることを特徴とする請求項５記載の麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質の大量発現方法（請求項６）や、請求項５又は６記載の方法で発現した麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質を採取し、アフィニティークロマトグラフィーで精製することを特徴とする麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質の大量取得方法（請求項７）からなる。
【００１８】
また本発明は、請求項７の方法により、分離精製した麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質（請求項８）や、請求項８記載の麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質からなる抗麻疹ウイルス抗体検出用抗原（請求項９）や、請求項９記載の抗麻疹ウイルス抗体検出用抗原を用いることを特徴とする抗麻疹ウイルス抗体価の診断方法（請求項１０）からなる。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明は、麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質の遺伝子高発現用ベクタープラスミドを構築するために、ＰＳＦＪ１−１０とＰＳＦＪ２−１６（ポックスウイルスのＡ型封入体（ＡＴＩ）プロモーターより成る合成プロモーターと複数反復するワクシニアウイルス７．５Ｋ前期発現プロモーターより成る合成プロモーター）の下流に、麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質の遺伝子を連結することよりなる。該プロモーターは、ワクシニアウイルス（ＶＶ）ベクター系用のプロモーターとして開発されたもので、ポックスウイルス（牛痘ウイルス）Ａ型封入体（ＡＴＩ）後期プロモーター、及び複数反復するワクシニアウイルス７．５Ｋ前期発現プロモーターとを連結した高効率合成プロモーター（ＰＳＦＪ２−１６）として開発されている（Ａｒｃｈ．　Ｖｉｒｏｌ．　１３８，　３１５−３３０，　１９９４；特開平６−２３７７７３号公報）。
【００２０】
本発明において、麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質の遺伝子を調製するには、公知の弱毒麻疹ワクチン株ウイルス（Ｖａｃｃｉｎｅｓ　２，　２３８−２３９，　１９９４）を、適宜、動物細胞中で増殖させた後、該細胞中から全ＲＮＡを単離し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成することによって調製することができる。例えば、公知の弱毒麻疹ワクチン株ウイルスＴＤ９７株を、Ｖｅｒｏ細胞中で増殖させた後、該細胞から全ＲＮＡを抽出単離し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを取得することができる。
【００２１】
本発明においては、本発明のベクターを用いて生産した、麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質を容易にカラムクロマトグラフィーにより精製するために、麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質遺伝子の３´末端にヒスチジン標識配列（Ｈｉｓ−ｔａｇ）をインフレームで挿入した、麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質の遺伝子高発現用ベクタープラスミドを構築する。ヒスチジン標識配列の挿入は、六量体のヒスチジン配列を含むプライマーによるＰＣＲにより行うことができる。この標識により、ワクシニアウイルスに感染させた細胞の溶解液から、アフィニティクロマトグラフィーの一回の精製行程で、高い精製度を有する麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質を得ることができ、該タンパク質の効率的で、迅速な精製が可能となる。
【００２２】
本発明で構築した麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質の遺伝子高発現用ベクタープラスミドを、弱毒ワクシニアウイルス株に導入することによって、麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質の大量発現用組換えワクシニアウイルスを構築することができる。該ワクシニアウイルス株としては、特に弱毒ワクシニアウイルスＬＣ１６ｍＯ株が好ましい（千葉県血清研究所が以前より保有；臨床とウイルス　３，　２２９−２３５，　１９７５）。組換えワクシニアウイルスの作製には、構築した高発現用ベクタープラスミドを常用のトランスフェクション法により弱毒ワクシニアウイルス株に導入して行うことができる。該トランスフェクションは、常用のエレクトロポーレーションにより実施することができる。
【００２３】
本発明において、麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質の大量発現用組換えワクシニアウイルスを用いて、麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質を高発現するには、該発現用組換えワクシニアウイルスを適宜の動物細胞に感染させ、培養することによって、行うことができる。動物細胞としては、ＢＨＫ−２１細胞、ＲＫ１３細胞、ＣＶ−１細胞、Ｖｅｒｏ細胞及びＨｅＬａ細胞等公知のものを挙げることができるが、特に好ましい動物細胞として、ＢＨＫ−２１細胞及びＲＫ１３細胞を挙げることができる。
【００２４】
本発明において、麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質を取得するには、麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質の発現用組換えワクシニアウイルスを感染させて培養した動物細胞を溶解し、該溶解液をアフィニティクロマトグラフィーにかけて精製することにより行うことができる。本発明においては、麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質の遺伝子発現ベクターにヒスチジン標識配列を挿入して、生成タンパク質にＨｉｓ標識を付与したことによって、該タンパク質をアフィニティクロマトグラフィーを用いて精製するに際して、効率的で迅速な精製を可能とした。
【００２５】
本発明の方法で取得した麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質は、麻疹ウイルス（ＭＶ）血球凝集素タンパク質としての抗原性を保持し、抗麻疹ウイルス抗体との反応性が高いという優れた特性を有することから、麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質の抗原として、抗麻疹ウイルスの抗体価の診断に用いることができる。本発明により、麻疹ウイルスの抗原タンパク質の大量取得が可能となったことと相俟って、本発明の麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質抗原は、麻疹ウイルスの実用的な診断薬としての利用を可能とするものである。本発明の麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質抗原を用いて、麻疹ウイルスの診断を実施するには、この分野の常法により実施することができる。また、かかる麻疹ウイルスの診断に際しては、本発明の麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質抗原をセットした麻疹ウイルス診断用のキットとして、製品化しておくことも可能である。
【００２６】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［発現ベクタープラスミドの構築及び発現用組換えワクシニアウイルスの作製］（細胞及びウイルス）
５〜１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したＭｉｎｉｍａｌ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ　（ＭＥＭ）中で、ＢＨＫ−２１細胞、ＣＶ−１細胞、ＲＫ１３細胞、Ｖｅｒｏ細胞及びＨｅＬａ細胞を培養した。麻疹ウイルス（ＭＶ）ワクチン株ＴＤ９７（Ｊ．　Ｍｅｄ．　Ｖｉｒｏｌ．　３２，　１９４−２０１，　１９９０）を、Ｖｅｒｏ細胞に接種し、３２℃で培養した。弱毒ワクシニアウイルスＬＣ１６ｍＯ（ｍｅｄｉｕｍ　ｐｏｃｋ　ｓｉｚｅ　ｃｌｏｎｅ　ｏｒｉｇｉｎａｌ；ｍＯ）株及びその組換え体を常法で増殖させ、３４又は３５℃で培養を行った。ＴＤ９７株を文献（Ｊ．　Ｍｅｄ．　Ｖｉｒｏｌ．　３２，　１９４−２０１，　１９９０）記載のとおり精製した。
【００２７】
（麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質（ＭＶＨ）遺伝子及びＦ遺伝子ｃＤＮＡの調製）
酸性フェノール−グアニジンチオシアネート−クロロホルム抽出（ａｃｉｄ　ｐｈｅｎｏｌｇｕａｎｉｄｉｕｍ　ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ＡＰＴＣ法）（ＮＩＰＰＯＮ　ＧＥＮＥ社製）により、ＴＤ９７株を感染させたＶｅｒｏ細胞から全ＲＮＡを単離した。ランダム六量体プライマーとＭＭＴＶ逆転写酵素（Ａｍｅｒｃｉａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を用いて、ウイルスｃＤＮＡを合成した。ＭＶＨ遺伝子及びＦ遺伝子のｃＤＮＡ（ヌクレオチド領域はそれぞれ７１５４ｎｔ〜９７３８ｎｔ（図１Ｃ１）及び５４２４ｎｔ〜７１８６ｎｔ（図１Ｃ２）であり、各遺伝子のオープンリーディングフレームをすべて含んでいる）をＰＣＲで増幅した。その際に、７１５４ｎｔ〜９７３８ｎｔ領域のセンスプライマーとして５’−ＴＴＣＧＴＣＡＴＣＡＡＧＣＡＡＣＣＡＣＣ−３’（配列番号１）、アンチセンスプライマーとして５’−ＡＡＡＣＡＧＡＡＡＧＧＧＣＴＣＡＡＡＣＣＡ−３’（配列番号２）、並びに５４２４ｎｔ〜７１８６ｎｔ領域のセンスプライマーとして５’−ＧＡＡＴＣＣＣＡＧＡＡＴＣＡＡＧＡＣＴＣＡＴＣＣ−３’（配列番号３）、アンチセンスプライマーとして５’−ＴＧＡＴＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＧＴＧＧＴＴＧＣＴＴ−３’（配列番号４）のプライマー対を使用した。
【００２８】
（トランスファーベクタープラスミドのｐＳＦＴＤＨ／ＨｉｓＸ１、ｐＳＦＴＤＨ／ＨｉｓＣ２、及びｐＳＦＴＤＦ１の作製）
増幅した麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質（ＭＶＨ）遺伝子ｃＤＮＡをまずＰａｃ　Ｉで切断し、平滑化し、その後ＥｃｏＲ　Ｉで切断し、トランスファーベクターｐＳＦＪ１−１０（図１Ａ）のＳｍａ　Ｉ部位とＥｃｏＲ　Ｉ部位との間に挿入し、プラスミドをｐＳＦＴＤＨ１とした。ｐＳＦＴＤＨ１の３’末端（ＭＶＨ遺伝子の終止コドンより９コドン上流）に位置するＸｍａ　Ｉ部位に、六量体のヒスチジン（Ｈｉｓ６）をコードする合成ＤＮＡを、インフレームで挿入することで、ｐＳＦＴＤＨ／ＨｉｓＸ１を作製した（図１Ｄ２）。鋳型ＤＮＡとしてｐＳＦＴＤＨ１を使用し、センスプライマーとして５’−ＡＣＡＡＴＧＴＣＡＣＣＡＣＡＡＣＧＡＧＡＣＣＧＧＡＴＡＡＡＴＧＣＣＴＴＣ−３’（配列番号５）、アンチセンスプライマーとして５’−ＣＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＴＣＴＧＣＧＡＴＴＧＧＴＴＣＣＡＴＣＴ−３’（配列番号６）を用いたＰＣＲにより、ＭＶＨ遺伝子の３’末端にＨｉｓ標識配列をインフレームで追加した（図１Ｄ３）。
【００２９】
増幅したＤＮＡをｐＣＲＩＩプラスミド（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）に直接クローニングした。Ｈｉｓ標識ＭＶＨ遺伝子の配列をＤＮＡシークエンスで確認した後、キメラｐＣＲＩＩプラスミドを分断し、ｐＳＦＪ２−１６のマルチクローニング部位におけるＥｃｏＲ　Ｉ部位に、ＭＶＨ遺伝子を挿入し（図１Ｂ）、ｐＳＦＴＤＨ／ＨｉｓＣ２を作製した。Ｆ遺伝子ｃＤＮＡをｐＣＲＩＩプラスミドに直接クローニングし、Ｔｆｉ　Ｉで消化後、平滑化した。その後、ＥｃｏＲ　Ｉで切断し、トランスファーベクターであるｐＳＦＪ１−１０のＳｍａ　Ｉ部位とＥｃｏＲ　Ｉ部位との間に挿入し、ｐＳＦＴＤＦ１を作製した。
【００３０】
（エレクトロポレーション法によるプラスミドＤＮＡのトランスフェクション）トリプシン処理を行った後、無血清ＭＥＭで１度洗浄し、１×ＨｅＢＳ溶液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１３７ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、０．７ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、６ｍＭのスクロース、ｐＨ７．０５）で２度洗浄したワクシニアウイルスＬＣ１６ｍＯ株感染細胞へ、１０μｇのプラスミドＤＮＡをエレクトロポレーター（ＢＴＸ社製）を用いてエレクトロポレーションを行った。細胞を１０分間室温で放置した後、１０％のＦＣＳを添加し、事前に温めておいたＭＥＭに穏やかに再懸濁させ、５％のＣＯ_２下において３５℃で培養した。
【００３１】
（間接免疫蛍光分析法）
カバーガラス上で単層化したウイルス感染細胞を、５％のパラホルムアルデヒドで固定し、ウサギ抗ＭＶＨポリクローナル抗体（ＮＩＨのＴ．　Ｋｏｈａｍａ博士より供与されたもの）又は抗Ｈｉｓ６モノクローナル抗体（Ｒ　＆　Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）と反応させた。その後、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（ＭＢＬ社製）又は抗マウスＩｇＧ抗体（ＭＢＬ社製）を、二次抗体として使用した。
【００３２】
（組換えワクシニアウイルス（ＶＶ）の作製）
１細胞あたり０．０２ｐｆｕのｍＯ株に感染させたＲＫ１３細胞に、前記トランスファーベクタープラスミドをトランスフェクションした。４８時間培養した後、ウイルスを回収し、ＡＧＭのＲＢＣを血球吸着するプラーク（ＨＡＤ^＋）から、麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質（ＭＶＨ）を発現している組換えワクシニアウイルス（ＶＶ）を回収した。ＡＧＭのＲＢＣには、ＭＶＨにより特異的な血球凝集が生じる。Ｆタンパク質を発現している組換えウイルスを、ニワトリＲＢＣを使用したときにＨＡＤ⁻だったプラークから回収した。外来遺伝子をワクシニアウイルス（ＶＶ）血球凝集素遺伝子に挿入すると、血球凝集しなくなる。ＨＡＤ表現型の検査をして、ＭＶＨを発現する組換えウイルス及びＦを発現する組換えウイルスをさらに３回プラーク精製した。ｐＳＦＴＤＨ／ＨｉｓＸ１、ｐＳＦＴＤＨ／ＨｉｓＣ２又はｐＳＦＴＤＦ１を使用して作製した組換えウイルスを、それぞれｍＯＴＤＨ／ＨｉｓＸ１、ｍＯＴＤＨ／ＨｉｓＣ２又はｍＯＴＤＦ１と表示した。
【００３３】
［麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質（ＭＶＨ）の精製］
（Ｈｉｓ標識ＭＶＨの精製）
ローラーボトル（ｒｏｌｌｅｒ　ｂｏｔｔｌｅ）（８５ｃｍ^２、Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ社製）で培養したＲＫ１３又はＢＨＫ−２１の単層細胞を、１細胞あたり０．１ｐｆｕの前記組換えウイルスを感染させた。培養開始から４８〜７２時間後、ボトルを振盪して細胞を遊離させ、３５００×ｇで３０分間の遠心分離を行って、細胞を回収した。１ボトルあたり１０ｍＬの溶解緩衝液（５０ｍＭのリン酸緩衝液、５００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのイミダゾール、１％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、ｐＨ７．４）を添加して、細胞溶解液を調製した。超音波処理を軽く施し、１００００×ｇで３０分間遠心分離を行い上澄液を得た。１０ｍＬの洗浄緩衝液（５０ｍＭのリン酸緩衝液、５００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのイミダゾール、０．１％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、ｐＨ７．４）で平衡させておいたＮｉ^２＋ＩＤＡアガロース樹脂カラム（カラム容量＝１ｍＬ、Ａｍｅｒｃｉａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）に、上澄液を加えた。
【００３４】
１０ｍＬの洗浄緩衝液で洗浄した後、Ｈｉｓ標識ＭＶＨを５０−５００ｍＭのイミダゾール濃度勾配で溶出させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、各画分（ｆｒａｃｔｉｏｎ）を還元条件下（ｒｅｄｕｃｅｄ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）で分析した。温度を６℃に維持したクロマトグラフィーチャンバーに備え付けたオートマティッククロマトグラフィーシステム（Ａｍｅｒｃｉａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）で、精製におけるすべての段階を制御した。ピーク画分を０．１％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）；ｐＨ７．４中で透析して、限外濾過膜（カットオフ＝５０ｋＤａ、Ｐａｌｌ　Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）で濃縮した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準タンパク質として使用したビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質分析（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ社製）により、タンパク質濃度を定量した。
【００３５】
［生成した麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質（組換えＭＶＨ）の同定］
（組換えＭＶＨを使用したＥＬＩＳＡ）
９６ウェルプレート（Ｎａｌｇｅ　Ｎｕｎｃ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）の各ウェルに対して、１００μＬの精製組換えＭＶＨ（ＴＤＨ／ＨｉｓＸ１については１１μｇ／ｍＬ、ＴＤＨ／ＨｉｓＣ２については６μｇ／ｍＬ）、又はＴＤ９７株由来の精製ウイルス粒子（５μｇ／ｍＬ）でのコーティングをＰＢＳ中で行い、プレートを４℃に一晩放置した。洗浄とブロッキングの後、０．０５％のＴｗｅｅｎ　２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で２倍段階希釈した血清サンプルを、１００μＬ／ウェルでウェルに添加し、３７℃で１時間保温した。その後の行程を、市販のＥＬＩＳＡキットの指示（Ｄａｄｅ　Ｂｅｈｒｉｎｇ　Ｍａｒｂｕｒｇ　ＧｍｂＨ社製）にしたがって行った。４５０ｎｍにおける各ウェルの吸光度を、ＥＬＩＳＡリーダー（Ｎａｌｇｅ　Ｎｕｎｃ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）で測定した。標準血清（中和試験力価＝２^７／２５μＬ）について、抗ＭＶ　ＥＬＩＳＡ価を平行線定量法（ｐａｒａｌｌｅｌ　ｌｉｎｅ　ａｓｓａｙ　ｍｅｔｈｏｄ）で計算した。
【００３６】
（中和試験（ＮＴ））
およそ６０〜８０ｐｆｕを含むＭＶ溶液（５０μＬ）を、４倍段階希釈した５０μＬの血清サンプルと混合した。３７℃で２時間保温した後、かかる混合物５０μＬ／ウェルを２４ウェルマルチプレート中のＶｅｒｏ細胞の単層上に接種し、５％のＣＯ_２下において、３５℃で１時間吸収させた。その後、５％のＦＣＳ及び０．８％の寒天を含む１ｍＬ／ウェルのＭＥＭ（寒天培地）を添加し、細胞を３４℃で７日間培養した。ニュートラルレッド染色後、各ウェルのプラークを計数した。プラークの数をウイルスコントロールの５０％に削減した血清希釈倍数をＮＴ抗体価とした。
【００３７】
［生成した麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質（組換えＭＶＨ）の同定の結果］（Ｈｉｓ標識ＭＶＨの一時的発現）
ＰＳＦＪ１−１０又はＰＳＦＪ２−１６プロモーターのいずれかのもとで合成されたＨｉｓ標識ＭＶＨの抗原性及び細胞内局在を調べるため、弱毒ワクシニアウイルスＬＣ１６ｍＯを感染させたＣＶ−１細胞にｐＳＦＴＤＨ／ＨｉｓＸ１及びｐＳＦＴＤＨ／ＨｉｓＣ２をトランスフェクションし、間接免疫蛍光染色によりＭＶＨの細胞内局在を解析した。免疫蛍光染色において異なる２つの抗体、すなわち、組換えＭＶＨの抗原性を調べるためにウサギ抗ＭＶＨ血清と、抗Ｈｉｓ６モノクローナル抗体を使用した。後者の抗体を使用して、Ｃ末端が外部環境にさらされているＩＩ型膜タンパク質である、ＭＶＨの外部領域にＨｉｓタグ配列が存在するかどうかを確認した。抗ＭＶＨ抗体を用いると、ｐＳＦＴＤＨ／ＨｉｓＸ１及びｐＳＦＴＤＨ／ＨｉｓＣ２プラスミドをトランスフェクションした細胞の表面全体に、強い特異的な蛍光が観察された。野生型ＭＶＨ遺伝子（ｐＳＦＴＤＨ１）をトランスフェクションした細胞についても、同様のパターンが現れた。
【００３８】
抗Ｈｉｓ６抗体を使用すると、Ｈｉｓタグ特異的蛍光は、ｐＳＦＴＤＨ／ＨｉｓＸ１及びｐＳＦＴＤＨ／ＨｉｓＣ２をトランスフェクションした細胞にのみ認められ、ｐＳＦＴＤＨ１をトランスフェクションした細胞には認められなかった（データは図示せず）。これらの結果から、組換えＭＶＨが正しく配置されていることが確認された。
一時的に発現したＨｉｓ標識ＭＶＨの生物活性を調べるため、ｍＯ株に感染させたＶｅｒｏ細胞にトランスファーベクタープラスミドをトランスフェクションした。その後、ＡＧＭのＲＢＣを用いた血球吸着（ＨＡＤ）分析で、これらの細胞の試験を行った。宿主細胞に導入した野生型ＭＶＨ遺伝子（ｐＳＦＴＤＨ１）により、宿主細胞はＡＧＭのＲＢＣを血球吸着する能力を得た（データは図示せず）。ＴＤＨ／ＨｉｓＸ１又はＴＤＨ／ＨｉｓＣ２を発現する細胞はすべて、野生型ＭＶＨを発現する細胞と同じように、細胞表面上でＡＧＭのＲＢＣを吸着した（データは図示せず）。
【００３９】
（組換えワクシニアウイルス（ＶＶ）により発現するＭＶＨ及びＦタンパク質の性質）
組換えＶＶが産生した麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質（ＭＶＨ）が、Ｆタンパク質と協同して細胞融合を仲介する能力を保有しているかどうかを調べるため、Ｆ組換え体及び／又はＭＶＨ組換え体をＨｅＬａ細胞に共感染させた（図２）。多核細胞の形成程度を観察し、膜融合活性を観察した。ｍＯＴＤＨ／ＨｉｓＸ１（図２Ｄ）又はｍＯＴＤＨ／ＨｉｓＣ２のみ（図２Ｅ）を感染させた細胞では、低いレベルの合胞体形成が認められたが、これは、細胞にｍＯＴＤＦ１（図２Ｆ及び２Ｇ）と共感染させた場合に比べてかなり低いものであった。非感染細胞（図２Ａ）、ｍＯ株感染細胞（図２Ｂ）、又はｍＯＴＤＦ１のみ感染させた細胞（図２Ｃ）では細胞融合はまったく認められなかった。このように、ｍＯＴＤＨ／ＨｉｓＸ１及びｍＯＴＤＨ／ＨｉｓＣ２により発現したＭＶＨは、細胞表面への輸送が可能であり、Ｆタンパク質とともに生物活性ヘテロオリゴマーを形成することができる。
【００４０】
（組換えＭＶＨの精製度）
各組換えＭＶＨウイルスを感染させたＲＫ１３細胞の細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析すると、組換えＭＶＨは、細胞の全タンパク質のうち、もっとも顕著なバンドで構成されていた（図３Ａパネル１）。それらの同一性を、抗ＭＶＨウサギ血清を用いたウェスタンブロットで確認した（図３Ａパネル２）。予想したとおり、それらの分子量は互いに等しく（およそ７６ｋＤａ）、野生型ＭＶＨの分子量（７４．５ｋＤａ）よりもやや大きいものであった。
【００４１】
各組換えＭＶＨのワクシニアウイルス（ＶＶ）を感染させた細胞の溶解液を、Ｎｉ^２＋ＩＤＡアガロース樹脂カラムに入れ、５０−５００ｍＭのイミダゾール濃度勾配で組換えＭＶＨを溶出した。ＴＤＨ／ＨｉｓＸ１及びＴＤＨ／ＨｉｓＣ２の溶出ピークは、イミダゾールがそれぞれおよそ１３０ｍＭのときと２１０ｍＭのときに生じた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、還元条件下にもかかわらず、精製組換えＭＶＨが二量体及びさらに大型のオリゴマーとして存在することが多かったが、その範囲は一定していなかった（図３Ｂパネル１、Ｃパネル１）。それらの相同性をウェスタンブロットで分析した（図３Ｂパネル２、Ｃパネル２）。蛍光色素で染色したゲルの蛍光イメージ分析で定量したところ、ＴＤＨ／ＨｉｓＸ１又はＴＤＨ／ＨｉｓＣ２のピーク画分の精製度は、それぞれ９４％（図３Ｂパネル１）又は９８％（図３Ｃパネル１）を越えていた。精製ＴＤＨ／ＨｉｓＸ１タンパク質及びＴＤＨ／ＨｉｓＣ２タンパク質の回収率は、ＢＣＡ分析で測定したところ、それぞれ０．５ｍｇ／１０^８細胞（７．５ｍｇ／Ｌ）と２．８ｍｇ／１０^８細胞（４２ｍｇ／Ｌ）だった。
【００４２】
（精製したＨｉｓ標識ＭＶＨの生物学的特徴）
精製した組換え麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質（組換えＭＶＨ）の生物活性が、野生型タンパク質のものと類似しているかどうかを評価するため、Ｈｉｓ標識ＭＶＨの血球凝集（ＨＡ）活性を、濃度４０μｇ／ｍＬで、市販ＨＡのものと比較した（図４）。ＴＤＨ／ＨｉｓＸ１と、とりわけＴＤＨ／ＨｉｓＣ２のＨＡ活性は、市販のＨＡ抗原（それぞれ３２、２０４８、１６ＨＡＵ／μｇのＭＶＨ）のものよりも高かった。クロマトグラフィーのピーク画分中のＴＤＨ／ＨｉｓＣ２も、リン脂質リポソームへの組み込みなどの処理をまったく行わずに、非常に高いＨＡ活性（４０６２ＨＡＵ／μｇ）を示していることに注目すべきである。ＴＤＨ／ＨｉｓＣ２のＨＡ活性は、これまでに報告されたものよりも高い（Ｊ．　Ｇｅｎ．　Ｖｉｒｏｌ．　６９，　２０６１−２０６９、Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ．　６９，　５１３−５１６，　１９９５、Ｉｎｆｅｃｔ．　Ｉｍｍｕｎ．　３２，　１０５１−１０５７，　１９８１）。
【００４３】
精製麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質（精製ＭＶＨ）が野生型タンパク質と同様の抗原性を持つかどうかを調べるため、麻疹患者及びワクチン被接種者の血清を用いてＥＬＩＳＡで調べた。同一血清サンプルの中和抗体価は、それらのプラーク減少法（ＮＴ法）に基づいて、平行して調べた。コントロールとして、精製ＭＶウイルス粒子抗原をＥＬＩＳＡに用いた。ＴＤＨ／ＨｉｓＣ２を抗原として用いた場合、ＥＬＩＳＡに基づく抗体価（ＥＬＩＳＡ／Ｃ２）は、ＮＴ法のものと相関性が最も高かった（Ｒ^２＝０．８４、Ｐ＜０．０５）（図５Ｃ）。この相関係数は、ウイルス粒子使用時（Ｒ^２＝０．６９、Ｐ＜０．０５）（図５Ａ）よりも高い。しかし、ＴＤＨ／ＨｉｓＸ１を用いた分析での相関係数（図５Ｂ）は、３つの抗原のうちでもっとも低かった（Ｒ^２＝０．４９、Ｐ＜０．０５）。これらの結果は、組換えＭＶＨ、特にＴＤＨ／ＨｉｓＣ２が、ＭＶＨとしての抗原性を保持していることを示唆している。
【００４４】
［本発明の方法及び生成物の評価］
本発明により、精製度の高いＭＶＨを大量に精製する簡単な方法を提供した。この方法は、Ｈｉｓ標識ＭＶＨを発現し、高度弱毒ワクシニアウイルスＬＣ１６ｍＯ株に由来する組換えワクシニアウイルス（ＶＶ）の作製に関するものである。本発明においては、ＨｉｓタグとＶＶプロモーターが異なる、２つの別個の組換え体を作製した。どちらの組換え体についても、ＴＤＨ／ＨｉｓＸ１及びＴＤＨ／ＨｉｓＣ２と名づけた精製度の高いＨｉｓ標識ＭＶＨを感染細胞の溶解液から大量に調製するために、Ｎｉ^２＋ＩＤＡカラムを用いたアフニティークロマトグラフィーを１回だけ行えば充分であるというすぐれた効果が確認された。しかも、上記２つの組換え体に由来するＨｉｓ標識ＭＶＨはともに、野生型タンパク質の生物活性をすべて保有しているという、該タンパク質を抗原として利用する場合の優れた特性を備えており、また、そのなかには血球凝集（ＨＡ）活性及びＦタンパク質と呼応して膜融合を促進する能力も含まれていた。更に、ＥＬＩＳＡで測定した抗ＭＶ抗血清の抗体価と、ＮＴ法で測定した同抗血清の抗体価との間の相関関係に示されたとおり、本発明の手順によって、抗原性が損なわれることはなかった。
【００４５】
過去に、ＧｅｒｌｉｅｒらがＭＶＨの高速精製法（Ｊ．　Ｇｅｎ．　Ｖｉｒｏｌ．　６９，　２０６１−２０６９，　１９８８）について報告しているが、該従来の方法は、精製ビリオンをＭＶＨの原材料として利用しているものであった（Ｊ．　Ｇｅｎ．　Ｖｉｒｏｌ．　６９，　２０６１−２０６９，　１９８８、Ｊ．Ｇｅｎ．　Ｖｉｒｏｌ．　５６，　１８５−１９３，　１９８１、Ａｒｃｈ．　Ｖｉｒｏｌ．　６９，　２０６１−２０６９，　１９８８、Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ．　６９，　５１６−５１３，　１９９５）。本発明者の推定によると、同量のＭＶＨを得るには、精製ＴＤＨ／ＨｉｓＣ２を作製する本発明者らのシステムに対し、少なくとも４００倍のウイルス培養物が必要となる。従来の手順に伴うもうひとつの制限は、他のウイルス成分の汚染を完全には回避できないことである（Ａｒｃｈ．　Ｖｉｒｏｌ．　６９，
２０６１−２０６９，　１９８８、Ｊ．　Ｇｅｎ．　Ｖｉｒｏｌ．　６９，　２０６１−２０６９，　１９８８）。本発明の方法は、いかなる前処理も必要とせず、標的とするタンパク質を、たった１行程の操作で、高精製度（＞９８％）と高効率（２．８ｍｇ／１０^８個又は４２ｍｇ／Ｌ）にて精製できる。
【００４６】
また、以前の報告に、バキュロウイルス系によるＭＶＨの発現が記載されていた（Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ．　６４，　３７−５０，　１９９０、Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ．　２６，　１６７−１７５，　１９９２）が、その産物には大量（全産生量のおよそ半分）の非グリコシル化ＭＶＨ分子が含まれている（Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ．　６４，　３７−５０，　１９９０）。ＭＶＨの機能的完全性及び抗原性には正しい翻訳後グリコシル化が不可欠であるため（Ａｒｃｈ．　Ｖｉｒｏｌ．　１３６，　２３９−２５３，　１９９４、Ｊ．　Ｇｅｎ．　Ｖｉｒｏｌ．　７５，　１０４３−１０５２，　１９９４）、変性した非グリコシル化分子によってそのように広範囲に汚染されるのは、重大な問題となる場合がある。ＳＤＳ−ＰＡＧＥやウェスタンブロット実験を行うと、本発明により精製取得した組換えＭＶＨにはそのような非グリコシル化分子が含まれていないことがわかる（図３）。
【００４７】
ＭＶＨ調製物が抗原性を保持していることは、精製組換えＭＶＨを用いたＥＬＩＳＡで測定した抗血清の価と同抗血清の中和価が相関することにより、示すことができる。ＴＤＨ／ＨｉｓＣ２の相関係数Ｒ^２は、麻疹ウイルス（ＭＶ）ウイルス粒子のもの（図５Ａ）と比べてかなり高く（図５Ｃ）、これまで報告されたもののうちで、最高であった（Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　３６，　７２１−７２６，　１９９８）。ＭＶＨ特異的抗体は麻疹ウイルス（ＭＶ）を中和し、ヒトを麻疹ウイルス（ＭＶ）感染から防御する免疫に有意に寄与しているため、ＭＶＨ特異的ＩｇＧ抗体の測定は、麻疹に対する機能免疫を推定する一助となる（Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　３６，　７２１−７２６，　１９９８）。全麻疹ウイルス粒子（ＭＶ）抗原に基づくＥＬＩＳＡは、この目的のために日常的に使用されているが、広範囲にわたる抗体を、その機能的活性に関係なく検出してしまう（Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　１９，　３７６−３７９，　１９８４、Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　３０，　５６４−５６９，　１９９２）。結果として、ＮＴのような機能分析法が、麻疹に対する免疫の評価にはより適切だとされている。しかし、ＮＴは、時間を要する診断法である。短期間で多くのサンプルを診断するにはＥＬＩＳＡのほうがＮＴよりも便利なため、精製ＴＤＨ／ＨｉｓＣ２のすぐれた抗原性は、抗ＭＶ抗体価の定量を目的とする診断的なＥＬＩＳＡにおいて、非常に有用であることが示唆される。
【００４８】
本発明においては、２種類のＨｉｓ標識ＭＶＨ、ＴＤＨ／ＨｉｓＸ１及びＴＤＨ／ＨｉｓＣ２を作製した。これら組換え分子は、別個の性質を示した。ＴＤＨ／ＨｉｓＸ１はＴＤＨ／ＨｉｓＣ２よりも血球凝集活性及び抗ＭＶ抗体との反応性が低かった。ＭＶＨのカルボキシル末端にある１８個のアミノ酸が、血球吸着には不可欠と言われているため（Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　２１４，　１２３２−１２３８，　１９９５）、ＴＤＨ／ＨｉｓＸ１のＸｍａ　Ｉ部位に導入されたＨｉｓタグ配列が、その生物学的機能に影響を及ぼすこともありうる。なぜＴＤＨ／ＨｉｓＸ１に対するＭＶ特異的抗体の反応性が低いのかは、明らかではないが、こうした観察結果は、標的遺伝子に導入されたＨｉｓタグの位置が、移植したタンパク質の生物学的機能に影響を及ぼせることを示唆している。
【００４９】
ベクターウイルスの安全性、とりわけそれが物質の大量生産に使用されるときの安全性は重要である。Ｓｕｔｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ．は、以前、非複製（ｎｏｎｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ）ワクシニアウイルス（ＶＶ）株ＭＶＡに基づく、安全性が高くかつ効率的な発現ベクターを報告している（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．　８９，　１０８４７−１０８５１，　１９９２）。もうひとつの高度弱毒株は、ワクシニアウイルスＬＣ１６ｍＯ株で、本発明における発現系で使用したベクターウイルスである。このウイルスは、大半の哺乳類細胞中でもその複製能力を維持している一方、動物モデルを使用した実験や実地調査で、その安全性が証明されている（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，８７−１００，　１９８５）。更に、動物の皮膚その他の組織中におけるその複製能力は、外来遺伝子をゲノムに導入すると低下する（Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ．　６２，　４４７４−４４８０，　１９８８）。
【００５０】
この株の毒性の低下にもかかわらず、ワクシニアウイルスＬＣ１６ｍＯ株を起源とする組換え体は、細胞株の親ウイルスと同じ効率で増殖することができる。このように、低い感染多重度（例えば、０．１ｐｆｕ／細胞）で組換えウイルスを感染させた細胞から、充分な量のタンパク質産物を入手することができる。非複製ベクターと比較して、ワクシニアウイルスＬＣ１６ｍＯ株の使用により、必要とされる接種ウイルス量が１００分の１程度に減少すると思われ、これは、タンパク質の大量生産における優位点である。本発明におけるワクシニアウイルス（ＶＶ）系の優位点を表１にまとめて示す。
【００５１】
【表１】

【００５２】
このように、高効率プロモーターのＰＳＦＪ２−１６、高度に弱毒化されているものの複製を行うワクシニアウイルスのＬＣ１６ｍＯ株、及びＨｉｓタグとアフィニティークロマトグラフィーを用いた高速精製手順を組み合わせた本発明のシステムは、適切な翻訳後修飾が機能に必要とされる真核生物の膜糖タンパク質などの大量調製という点で有力である。
【００５３】
［図の説明］
図１．ｐＳＦＴＤＨ１、ｐＳＦＴＤＨ／ＨｉｓＸ１、ｐＳＦＴＤＨ／ＨｉｓＣ２及びｐＳＦＴＤＦ１の作製。ハイブリッドプロモーターＰＳＦＪ１−１０及びＰＳＦＪ２−１６をそれぞれ有するトランスファーベクタープラスミドｐＳＦＪ１−１０（Ａ）及びｐＳＦＪ２−１６（Ｂ）の構造。ＰＳＦＪ１−１０及びＰＳＦＪ２−１６は、ＡＴＩプロモーター（牛痘ウイルスＡＴＩ遺伝子の後期プロモーター）、及びＰ７．５Ｅ×１０及びＰ７．５×１６（つまり１０個又は１６個のＶＶ　Ｐ７．５−ｋＤａ遺伝子の縦列型反復修飾初期プロモーター配列；ｔａｎｄｅｍｌｙ　ｒｅｐｅａｔｅｄ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｅａｒｌｙ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｅｌｅｍｅｎｔｓ）で、それぞれ構成されている（Ａｒｃｈ．　Ｖｉｒｏｌ．　１３８，　３１５−３３０，　１９９４）。Ｏｒｉは細菌性複製起点（ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｏｒｉｇｉｎ　ｏｆ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、ＡＰｒはアンピシリン耐性遺伝子、ｖｖＨＡ（Ｌ）及びｖｖＨＡ（Ｒ）は、ＶＶ血球凝集素遺伝子の左側又は右側部分を示す。各ベクタープラスミドのプロモーター領域とＶＶ血球凝集素遺伝子の方向に注目のこと。（Ｃ）ＭＶＨ遺伝子ｃＤＮＡ（Ｃ１）及びＦ遺伝子ｃＤＮＡ（Ｃ２）の概略図。ＰＣＲで増幅し、ＭＶゲノム上のヌクレオチド番号、オープンリーディングフレーム（黒色部）、膜貫通領域（斜線部）及び制限酵素部位を示している。（Ｄ）野生型（Ｄ１、ｐＳＦＴＤＨ１）及びＨｉｓ標識ＭＶＨ（Ｄ２、ｐＳＦＴＤＨ／ＨｉｓＸ１；Ｄ３、ｐＳＦＴＤＨ／ＨｉｓＣ２）のカルボキシル末端のＤＮＡ及び推定アミノ酸配列。太字は導入したＨｉｓタグ配列を示す。
【００５４】
図２．ＨｅＬａ細胞中でＦタンパク質と共発現したＨｉｓ標識ＭＶＨの膜融合活性。ウイルス非感染ＨｅＬａ細胞（Ａ）、及び単独感染の場合は感染の多重度（ＭＯＩ）２０ｐｆｕで、共感染の場合は個々のウイルスの感染多重度（ＭＯＩ）は１０ｐｆｕで、ｍＯ（Ｂ）、ｍＯＴＤＦ１（Ｃ）、ｍＯＴＤＨ／ＨｉｓＸ１（Ｄ）、ｍＯＴＤＨ／ＨｉｓＣ２（Ｅ）、ｍＯＴＤＦ１とｍＯＴＤＨ／ＨｉｓＸ１（Ｆ）、ｍＯＴＤＦ１とｍＯＴＤＨ／ＨｉｓＣ２（Ｇ）をそれぞれ感染させたＨｅＬａ細胞を作製した。３５℃で２０時間培養した後、細胞の形態を対物双眼顕微鏡で観察した。
【００５５】
図３．組換えウイルスにより発現したＨｉｓ標識ＭＶＨの検出及び精製。（Ａ）組換えウイルスにより発現する組換えＭＶＨを同定するため、１細胞あたり１０ｐｆｕで同ウイルスを感染させて２０時間培養したＲＫ１３細胞を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（パネル１）及びウェスタンブロット（パネル２）で分析した。１０％のゲル上でタンパク質を分離させ、蛍光染色で可視化した。ウサギ抗ＭＶＨ血清を使用して、ウェスタンブロットでＭＶＨを同定した。レーン：１、未感染（ｍｏｃｋ）；２、ｍＯ感染；３、ｍＯＴＤＨ／ＨｉｓＸ１感染；４、ｍＯＴＤＨ／ＨｉｓＣ２感染；５、精製全ＭＶ（ＴＤ９７株）ウイルス粒子。（Ｂ及びＣ）Ｈｉｓ標識ＭＶＨを精製するため、ｍＯＴＤＨ／Ｘ１（Ｂ）又はｍＯＴＤＨ／ＨｉｓＣ２（Ｃ）を感染させたＲＫ１３細胞の溶解液について、Ｎｉ^２＋ＩＤＡカラム上でアフィニティークロマトグラフィーを実施した。それらの画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（パネル１）及びウェスタンブロット（パネル２）により分析した。（Ｂ）レーン：１、分画前試料；２、非吸着画分；３、分画３；４、分画５；５、分画７；６、分画９；７、分画１１；Ｍ１、分子量マーカー。（Ｃ）レーン：１、分画前試料；２、非吸着画分；３、分画４；４、分画６；５、分画８；６、分画１０；Ｍ２、分子量マーカー。
【００５６】
図４．精製組換えＭＶＨの血球凝集（ＨＡ）能力。０．２％のＢＳＡ及び０．０１％のゼラチンを含むＰＢＳに０．５％のＲＢＣを懸濁した液５０μＬを、連続希釈された５０μＬの市販のＭＶ　ＨＡ抗原（Ｄｅｎｋａ　Ｓｅｉｋｅｎ社製）又は精製組換えＭＶＨとともに、丸底９６ウェルプレートで３７℃で３０分間保温し、その後４℃で１時間保温した。血球凝集を誘導した最終希釈倍数をＨＡ価として算出した。各サンプル中のＭＶＨ濃度を４０μｇ／ｍＬに調節した。２^３から２^１４の範囲内で、サンプルの２倍段階希釈を行った。Ａ、ＴＤＨ／ＨｉｓＸ１；Ｂ、ＴＤＨ／ＨｉｓＣ２；Ｃ、市販のＨＡ抗原。
【００５７】
図５．抗ＭＶ血清の中和抗体価と、組換えＭＶＨを用いたＥＬＩＳＡ価との相関。捕獲抗原として、精製ＭＶウイルス粒子（ＥＬＩＳＡ／ＷＶ）（Ａ）、精製ＴＤＨ／ＨｉｓＸ１（ＥＬＩＳＡ／Ｘ１）（Ｂ）、又は精製ＴＤＨ／ＨｉｓＣ２（ＥＬＩＳＡ／Ｃ２）（Ｃ）を用いてＥＬＩＳＡを行った。プラークの数をウイルスのコントロールの５０％に減少させた血清最終希釈倍数をＮＴ法の抗体価とした。
【００５８】
【発明の効果】
本発明の方法により、高度弱毒ワクシニアウイルス株であるＬＣ１６ｍＯの強力なプロモーター（ＰＳＦＪ１−１０及びＰＳＦＪ２−１６）の制御下で、麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質（ＭＶＨ）の大量発現を可能とした。更に、本発明においては、麻疹ウイルス血球凝集素タンパク質にＨｉｓ−ｔａｇを付与することにより、組換えワクシニアウイルスに感染させた細胞の溶解液から、一行程のアフィニティークロマトグラフィーで、組換え血球凝集素タンパク質を精製することができ、該タンパク質の効率的で迅速な精製を可能とした。また、本発明の方法は、回収率及び精製率が非常に高い（収率は１０^８個の細胞につき２．８ｍｇ、精製率は９８％）。これは、本発明の方法が、従来使用されている血球凝集素の調製法よりもおよそ４００倍も効率的であることを示している。
【００５９】
本発明により取得された血球凝集素は、細胞膜へ輸送され、血球吸着活性をもち、また、組換え血球凝集素タンパク質は麻疹ウイルス融合タンパク質と協同して細胞融合活性を引き出す。更に、麻疹ウイルスに対する抗体価は、精製した血球凝集素を抗原として用いた酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）で測定したように、中和抗体価（Ｒ^２＝０．８４、Ｐ＜０．０５）と高い相関を示している。このことは、抗原性が保持されていることを示唆している。そうした組換え血球凝集素調製物は、機能的な抗麻疹免疫性を測定する診断のために実用化しうるものであり、更に、血球凝集素の生物学的機能と構造の研究においても有用なものである。
【００６０】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例におけるＭＶＨ遺伝子ｃＤＮＡ、Ｆ遺伝子ｃＤＮＡ、トランスファーベクタープラスミドｐＳＦＪ１−１０、ｐＳＦＪ２−１６、野性型及びＨｉｓ標識ＭＶＨの構造を示す図である。
【図２】ＨｅＬａ細胞中でＦタンパク質と共発現したＨｉｓ標識ＭＶＨの膜融合活性を示す図である。
【図３】組換えウイルスにより発現したＨｉｓ標識ＭＶＨの検出及び精製結果を示す図である。
【図４】精製組換えＭＶＨの血球凝集（ＨＡ）能を解析した結果を示す図である。
【図５】抗ＭＶ血清の中和能力と、組換えＭＶＨを用いたＥＬＩＳＡ価との相関関係を示す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention expresses a large amount of measles virus hemagglutinin protein that retains biological activity and antigenicity as measles virus hemagglutinin protein (MVH) and has high reactivity with anti-measles virus antibody, The present invention relates to a method for obtaining by purification, a recombinant vector for gene expression therefor, a recombinant virus expressing the protein with high expression, and a method for diagnosing the antibody titer of anti-measles virus using the protein as an antigen. .
[0002]
[Prior art]
The measles virus (MV), a measles pathogen, is widely distributed throughout the world, and this virus is known to be extremely infectious. Droplet infection in humans mainly affects the respiratory system and reticuloendothelial tissue, causing acute infectious diseases. When ill, a red rash caused by the measles virus occurs, presenting with systemic symptoms such as high fever and catarrh. In severe cases, the fever shifts from high fever, convulsions, circulatory failure, and impaired consciousness to coma.
Prevention of this disease includes active immunization with live measles vaccine and passive immunization with human immunoglobulin.
[0003]
Measles virus (MV) belongs to the genus Morbillivirus of the order Paramyxoviridae, Mononegaviridae. The virion has a substantially spherical shape with a diameter of about 150 nm, and has an envelope composed of a lipid bilayer. On the entire surface of the envelope, H (haemagglutinin) protein and F (fusion) protein protrude in a spike shape, and the base is supported by a matrix membrane protein on the lower surface of the envelope. The nucleocapsid present inside the envelope consists of a measles virus genome of about 16 kb in length, a linear single-stranded (-) sense gene RNA and a protein.
Conventionally, live attenuated measles vaccine strain viruses have been used for the prevention of measles. Examples of the live attenuated measles vaccine strain viruses include CAM-70, Schwarz FF8, AIK-C, AIK-HDC, TD-97 and Moraten. And strains such as Connaught are known (Vaccines 2, 238-239, 1994).
[0004]
The H protein of measles virus (MV), a measles virus hemagglutinin protein, is useful as a measles virus antigen. The measles virus can be diagnosed using this virus antigen. In recent years, there have been several reports on the measles virus hemagglutinin protein (MVH).
It has been reported that MVH must undergo correct post-translational modifications, including glycosylation (glycosylation), in order to exert its immunogenicity and biological activities such as accurate intracellular transport, folding and oligomerization. (Arch. Virol. 136, 239-253, 1994, J. Gen. Virol. 75, 1043-1052, 1994).
[0005]
MVH is also an MV envelope glycoprotein that binds to receptor molecules on the host cell surface (eg, CD46, moesin and SLAM) (Cell 75, 295-305, 1993, J. Virol. 67, 6025-6032, 1993). , Virology 198, 265-274, 1994, Nature 406, 893-897, 2000), the ability of MV to agglutinate African green monkey (AGM) red blood cells (RBC) because MVH binds to the CD46 molecule on RBC. Is believed to be due to such binding (J. Virol. 71, 6144-6154, 1997).
[0006]
In addition, MVH promotes fusion of the viral envelope with the host cell membrane in cooperation with the fusion (F) protein, another MV envelope glycoprotein (J. Gen. Virol. 72, 439-442, 1991; J. Gen. Virol. 74, 2365-2372, 1993, Virology 200, 11-20, 1994). MVH is one of the main target antigens that cause humoral and cellular immunity in measles virus (MV) infection (Prog. Med. Virol. 36, 1-33, 1989, J. Gen. Virol. 72, 2491-2500, 1991, Curr. Top Microbiol. Immunol. 189, 109-121, 1994, Curr. Top Microbiol. Immunol. 189, 151-167, 1994, J. Infect. 1998, J. Clin. Invest. 102, 1969-1977, 1998), antibodies against MVH promote neutralization of measles virus (MV) and are involved in preventing MV infection (J. Gen. Virol. 72, 2491-2500, 1991, J. Infect. Dis. 162, 1036-1042, 1990, Virology 144, 46-58, 1985, J. Clin. Microbiol. 36, 721-726, 1998).
[0007]
Conventionally, MVH has been obtained by combining solubilization of purified measles virus (MV) virions (virions: virus particles) and column chromatography in several steps (J. Gen. Virol. 56, 185-193, 1981). 69, 2061-2069, 1988, Arch. Virol. 69, 513-516, 1995), or an affinity chromatography column using a monoclonal antibody of MVH (Infect. Immun. 32, 1051- 1057, 1981, J. Gen. Virol. 75, 355-366, 1984).
[0008]
However, these methods have some limitations. For example, obtaining a sufficient quantity of purified virus particles was an intensive and costly task, and it was not possible to completely remove viral components other than MVH from the final preparation. Furthermore, in the latter approach, protein denaturation in the elution step may be unavoidable, and due to such limitations, it has been possible to maintain the biological activity and antigenicity of MVH while still achieving high recovery and purification. It has been impossible to develop a method for obtaining MVH at a time. Therefore, in order to put MVH into practical use as a diagnostic agent or the like, it has been strongly desired to develop a method capable of mass-producing MVH having excellent antigenicity.
[0009]
On the other hand, in order to produce a protein containing a sugar chain such as MVH, a method of producing the protein by a genetic engineering technique using a gene encoding the protein has been conventionally performed.
To date, a number of viral expression systems have been developed to efficiently express eukaryotic membrane glycoproteins (J. Gen. Virol. 64, 255-266, 1983, Adv. Virus Res. 35, 177-192, 1988). Among them, the vaccinia virus (VV) expression vector (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 4927-4931, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 7415-7419, 1982) has an expression efficiency. Is known as a particularly useful means because of its high host range, wide host range, and very high capacity for foreign genes (at least 35 kb) (J. Gen. Virol. 67, 2067-2082, 1986, Science 252, 1662-1667, 1991). Moreover, when they infect suitable host cells, they ensure that the correct post-translational modifications to the protein product are made.
[0010]
However, one disadvantage of the vaccinia virus (VV) system is that, in some cases, vaccinia virus (VV) is pathogenic to humans. To overcome this problem, several attenuated vaccinia virus (VV) strains have been developed. Among them, LC16mO (mO) strain and LC16m8 strain derived from Lister strain are also included. These are highly attenuated vaccine strains, whose neurotoxicity and growth in animal skin are significantly lower than the original virus. The safe use of these strains in unvaccinated humans has been demonstrated by clinical trials in infants (Elsevier, Amsterdam, 87-100, 1985).
[0011]
The vaccinia virus (VV) vector system expresses foreign genes under the control of its own promoter. Two highly efficient synthetic promoters, PSFJ1-10 and PSFJ2-16, consisting of tandem repeats of the cowpox virus type A inclusion body (ATI) late promoter and a modified p7.5-kDa promoter have been developed (Arch. Virol. 138, 315-330, 1994). The efficiency of these promoters is evidenced by the observation that when chloramphenicol acetyltransferase was expressed under the control of the PSFJ2-16 promoter, the product accounted for 18% of total cellular proteins. Such expression levels are higher than the VV-T7 RNA polymerase hybrid system and are close to those reported for baculovirus vectors (Arch. Virol. 138, 315-330, 1994, Curr. Opin. Biotechnol. 8). , 573-577, 1997, Mol. Cell. Biol. 7 2538-2544, 1987).
[0012]
As a virus expression system for efficiently expressing a eukaryotic membrane glycoprotein, a protein expression system using a baculovirus is known. This expression system is a system that recombines a part of the genomic DNA of nuclear polyhedrosis virus (NPV), which is a kind of baculovirus, with a foreign gene, and expresses a large amount of a foreign gene product using the strong promoter of NPV. . Baculovirus-expressed proteins undergo post-translational modifications, such as addition of sugar chains, fatty acids, and phosphorylation, in the same manner as the original, and as a result, in their higher-order structure and biological activity, almost It is reported that they are often similar to the ones. However, glycosylation is often incomplete.
[0013]
Previous reports have described the expression of MVH by the baculovirus expression system (J. Virol. 64, 37-50, 1990; Virus Res. 26, 167-175, 1992), but the product contains large amounts ( (Approximately half the total production) of non-glycosylated hemagglutinin protein molecules (J. Virol. 64, 37-50, 1990). Correct post-translational glycosylation is essential for the functional integrity and antigenicity of the hemagglutinin protein (Arch. Virol. 136, 239-253, 1994; J. Gen. Virol. 75, 1043-1052, 1994). ), Such extensive contamination by denatured non-glycosylated molecules can be a significant problem.
[0014]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a measles virus hemagglutinin protein which retains antigenicity as a measles virus (MV) hemagglutinin protein and has high reactivity with an anti-measles virus antibody, and highly expresses the protein The present invention provides a recombinant virus expressed in, a large-scale expression of a measles virus hemagglutinin protein using the virus, and a method for rapidly purifying the expressed protein, and further using the protein as an antigen, an anti-measles virus It is to provide a method for diagnosing the antibody titer.
[0015]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, as a promoter, a synthetic promoter composed of PSFJ1-10 and PSFJ2-16 (a poxvirus type A inclusion body (ATI) promoter and a vaccinia virus 7.5K that repeats a plurality of times are used. A measles virus hemagglutinin protein gene is ligated downstream of the promoter, and Ni is added at the 3 'end. ²⁺ ・ Imino-acetoacetic acid (Ni ²⁺ A histidine-tagged sequence (His tag) that can be purified by an IDA) column was inserted and introduced into the attenuated vaccinia virus LC16mO strain. By this method, it is possible to construct a recombinant virus that retains antigenicity as a measles virus (MV) hemagglutinin protein and highly expresses a measles virus hemagglutinin protein having high reactivity with an anti-measles virus antibody. did it. In addition, the present inventors have found a method for obtaining a large amount of measles virus hemagglutinin protein from which the hemagglutinin protein can be purified by one-step affinity chromatography, and have completed the present invention.
[0016]
The present invention includes a vector plasmid for gene expression in the method, a recombinant vaccinia virus obtained by introducing the plasmid into an attenuated vaccinia virus, and further comprising the measles virus hemagglutinin protein obtained by the method, the antibody titer of anti-measles virus. This includes the use for diagnosis.
[0017]
That is, the present invention is characterized in that a measles virus hemagglutinin protein gene is linked downstream of a poxvirus type A inclusion body (ATI) promoter and / or a vaccinia virus 7.5K early expression promoter that repeats multiple times. 2. The measles virus hemagglutinin protein according to claim 1, wherein a histidine-labeled sequence is inserted at the 3 'end of the measles H gene. A measles virus hemagglutinin, wherein the vector plasmid for gene expression according to claim 2 or the vector plasmid for gene expression of the measles virus hemagglutinin protein according to

claim

1 or 2 is introduced into an attenuated vaccinia virus strain. Recombinant vaccinia virus for large-scale expression of Item 3) The recombinant vaccinia virus for large-scale expression of measles virus hemagglutinin protein according to Item 3, wherein the vaccinia virus strain is an attenuated vaccinia virus LC16mO strain (Claim 4). 5. A method for expressing a large amount of measles virus hemagglutinin protein, which comprises infecting and culturing an animal cell with the recombinant vaccinia virus according to any of 3 or 4, wherein the animal cell is a rabbit kidney cell The measles virus hemagglutinin protein mass expression method according to claim 5, which is RK13 or Syrian hamster kidney cell BHK-21, or the measles expressed by the method according to

claim

5 or 6. Measles virus, which is characterized in that a virus hemagglutinin protein is collected and purified by affinity chromatography. A method for obtaining a large amount of ils hemagglutinin protein (claim 7).
[0018]
The present invention also provides a measles virus hemagglutinin protein separated and purified by the method of claim 7 (claim 8), and an antigen for detecting an anti-measles virus antibody comprising the measles virus hemagglutinin protein of claim 8 (claim Item 9) and a method for diagnosing an anti-measles virus antibody titer using the antigen for detecting an anti-measles virus antibody according to claim 9 (claim 10).
[0019]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
In order to construct a vector plasmid for high expression of measles virus hemagglutinin protein gene, the present invention provides multiple repeats with a synthetic promoter comprising PSFJ1-10 and PSFJ2-16 (poxvirus type A inclusion body (ATI) promoter). Downstream of a vaccinia virus 7.5K pre-expression promoter (synthetic promoter), which is linked to the measles virus hemagglutinin protein gene. The promoter was developed as a promoter for the vaccinia virus (VV) vector system, and includes a poxvirus (coxpox virus) A-type inclusion body (ATI) late promoter and a vaccinia virus 7.5K early expression promoter that repeats multiple times. (PSFJ2-16) (Arch. Virol. 138, 315-330, 1994; JP-A-6-237773).
[0020]
In the present invention, in order to prepare the gene for the measles virus hemagglutinin protein, a known attenuated measles vaccine strain virus (Vaccines 2, 238-239, 1994) is appropriately grown in animal cells, and It can be prepared by isolating total RNA from them and synthesizing cDNA using reverse transcriptase. For example, after a known attenuated measles vaccine strain TD97 strain is grown in Vero cells, total RNA is extracted and isolated from the cells, and cDNA can be obtained using reverse transcriptase.
[0021]
In the present invention, in order to easily purify the measles virus hemagglutinin protein produced using the vector of the present invention by column chromatography, a histidine-labeled sequence (His) is added to the 3 'end of the measles virus hemagglutinin protein gene. -Tag) is inserted in-frame to construct a vector plasmid for high expression of the measles virus hemagglutinin protein gene. The insertion of the histidine-labeled sequence can be performed by PCR using a primer containing a hexameric histidine sequence. By this labeling, a measles virus hemagglutinin protein having a high degree of purification can be obtained from a lysate of cells infected with vaccinia virus in a single purification step of affinity chromatography. , Rapid purification becomes possible.
[0022]
By introducing the vector plasmid for high expression of the measles virus hemagglutinin protein gene constructed in the present invention into an attenuated vaccinia virus strain, a recombinant vaccinia virus for large-scale expression of the measles virus hemagglutinin protein can be constructed. . As the vaccinia virus strain, an attenuated vaccinia virus LC16mO strain is particularly preferable (previously held by the Chiba Prefectural Serum Institute; clinical and virus 3, 229-235, 1975). The recombinant vaccinia virus can be prepared by introducing the constructed high expression vector plasmid into an attenuated vaccinia virus strain by a conventional transfection method. The transfection can be performed by conventional electroporation.
[0023]
In the present invention, in order to highly express the measles virus hemagglutinin protein using a recombinant vaccinia virus for large-scale expression of the measles virus hemagglutinin protein, the recombinant vaccinia virus for expression is infected into appropriate animal cells. , By culturing. Examples of animal cells include known cells such as BHK-21 cells, RK13 cells, CV-1 cells, Vero cells, and HeLa cells. Particularly preferred animal cells include BHK-21 cells and RK13 cells. Can be.
[0024]
In the present invention, in order to obtain the measles virus hemagglutinin protein, animal cells cultured and infected with the recombinant vaccinia virus for expressing the measles virus hemagglutinin protein are lysed, and the lysate is purified by affinity chromatography. Can be performed. In the present invention, by inserting a histidine-tagged sequence into a gene expression vector for a measles virus hemagglutinin protein and imparting a His tag to the produced protein, efficient purification of the protein using affinity chromatography is achieved. And enabled rapid purification.
[0025]
The measles virus hemagglutinin protein obtained by the method of the present invention retains antigenicity as a measles virus (MV) hemagglutinin protein and has excellent properties of high reactivity with an anti-measles virus antibody. As an antigen of the measles virus hemagglutinin protein, it can be used for diagnosis of an anti-measles virus antibody titer. According to the present invention, the measles virus hemagglutinin protein antigen of the present invention can be used as a practical diagnostic agent for measles virus in combination with the fact that a large amount of measles virus antigen protein can be obtained. Is what you do. Diagnosis of measles virus using the measles virus hemagglutinin protein antigen of the present invention can be performed by a conventional method in this field. In diagnosing such measles virus, it is also possible to commercialize it as a measles virus diagnosis kit in which the measles virus hemagglutinin protein antigen of the present invention is set.
[0026]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
[Construction of expression vector plasmid and preparation of recombinant vaccinia virus for expression] (cells and viruses)
BHK-21 cells, CV-1 cells, RK13 cells, Vero cells, and HeLa cells were cultured in Minimal Eagle's Medium (MEM) supplemented with 5 to 10% fetal calf serum (FCS). Measles virus (MV) vaccine strain TD97 (J. Med. Virol. 32, 194-201, 1990) was inoculated into Vero cells and cultured at 32 ° C. The attenuated vaccinia virus LC16mO (medium pack size clone original; mO) strain and its recombinant were grown by a conventional method and cultured at 34 or 35 ° C. The TD97 strain was purified as described in the literature (J. Med. Virol. 32, 194-201, 1990).
[0027]
(Preparation of measles virus hemagglutinin protein (MVH) gene and F gene cDNA)
Total RNA was isolated from Vero cells infected with the TD97 strain by acidic phenol-guanidine thiocyanate-chloroform extraction (APTC method) (acid phenol-guanidine thiocyanate-chloroform extraction; APTC method). Virus cDNA was synthesized using a random hexamer primer and MMTV reverse transcriptase (Amerciam Pharmacia Biosystem). The cDNAs of the MVH gene and the F gene (the nucleotide regions were 7154 nt to 9938 nt (FIG. 1C1) and 5424 nt to 7186 nt (FIG. 1C2), respectively, and all of the open reading frames of each gene) were amplified by PCR. At that time, 5'-TTCGTTCATCAAGCAACCACC-3 '(SEQ ID NO: 1) as a sense primer in the 7154 nt to 9738 nt region, 5'-AAACAGAAAGGGCTCAAACCA-3' (SEQ ID NO: 2) as the antisense primer, and a sense primer in the 5424 nt to 7186 nt region 5′-GAATCCCAGAATCAAGACTCATCC-3 ′ (SEQ ID NO: 3), and a primer pair 5′-TGATGCTGGGTGCGGTGGTTTGCTT-3 ′ (SEQ ID NO: 4) as an antisense primer.
[0028]
(Preparation of transfer vector plasmids pSFTDH / HisX1, pSFTDH / HisC2, and pSFTDF1)
The amplified measles virus hemagglutinin protein (MVH) gene cDNA was first cut with PacI, blunted, then cut with EcoRI, and the SmaI and EcoRI sites of the transfer vector pSFJ1-10 (FIG. 1A). The plasmid was called pSFTDH1. Synthetic DNA encoding hexameric histidine (His6) was inserted in-frame at the XmaI site located at the 3 'end of pSFTDH1 (9 codons upstream of the stop codon of the MVH gene) to obtain pSFTDH / HisX1. Was prepared (FIG. 1D2). PCR using pSFTDDH1 as a template DNA, 5′-ACAATGTCACCACAACGAGACCGGATAAATGCCCTTC-3 ′ (SEQ ID NO: 5) as a sense primer, and 5′-CTAATGATGATGATGATGATGTCTGCGATTGGTTCCATCT-3 ′ (SEQ ID NO: 6) as an antisense primer, and a gene using a VH gene with a PCR using a gene of VH. A 'His-tagged sequence was added in-frame to the terminus (FIG. 1D3).
[0029]
The amplified DNA was directly cloned into a pCRII plasmid (Invitrogen). After confirming the sequence of the His-tagged MVH gene by DNA sequencing, the chimeric pCRII plasmid was disrupted, and the MVH gene was inserted into the EcoRI site in the multiple cloning site of pSFJ2-16 (FIG. 1B) to produce pSFTDH / HisC2. . The F gene cDNA was cloned directly into the pCRII plasmid, digested with TfiI, and blunted. Then, it was cut with EcoRI and inserted between the SmaI site and EcoRI site of pSFJ1-10, which is a transfer vector, to prepare pSFTDF1.
[0030]
(Transfection of Plasmid DNA by Electroporation) After trypsinization, it was washed once with serum-free MEM, and washed with 1 × HeBS solution (20 mM Hepes, 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.7 mM NaCl). ₂ HPO ₄ Vaccinia virus LC16mO strain-infected cells washed twice with 6 mM sucrose, pH 7.05), and 10 μg of plasmid DNA was electroporated using an electroporator (manufactured by BTX). After leaving the cells at room temperature for 10 minutes, 10% FCS was added and gently resuspended in pre-warmed MEM, 5% CO 2 ₂ The cells were cultured at 35 ° C. below.
[0031]
(Indirect immunofluorescence analysis)
The virus-infected cells monolayered on a cover glass were fixed with 5% paraformaldehyde, and a rabbit anti-MVH polyclonal antibody (provided by Dr. T. Kohama of NIH) or an anti-His6 monoclonal antibody (R & D Systems) (Made by the company). Thereafter, a FITC-labeled goat anti-rabbit IgG antibody (manufactured by MBL) or an anti-mouse IgG antibody (manufactured by MBL) was used as a secondary antibody.
[0032]
(Preparation of recombinant vaccinia virus (VV))
The transfer vector plasmid was transfected into RK13 cells infected with the mO strain at 0.02 pfu per cell. After culturing for 48 hours, the virus was recovered, and a plaque (HAD) that adsorbed RBC of AGM to blood cells was used. ⁺ ), A recombinant vaccinia virus (VV) expressing the measles virus hemagglutinin protein (MVH) was recovered. MVH causes specific hemagglutination in AGM RBCs. The recombinant virus expressing the F protein was isolated from HAD using chicken RBC. ⁻ Was recovered from the plaque. When a foreign gene is inserted into the vaccinia virus (VV) hemagglutinin gene, hemagglutination stops. The HAD phenotype was examined and the recombinant virus expressing MVH and the recombinant virus expressing F were plaque purified three more times. Recombinant viruses produced using pSFTDH / HisX1, pSFTDH / HisC2 or pSFTDF1 were designated as mOTDH / HisX1, mOTDH / HisC2 or mOTDF1, respectively.
[0033]
[Purification of measles virus hemagglutinin protein (MVH)]
(Purification of His-labeled MVH)
Roller bottle (85cm) ² RK13 or BHK-21 monolayer cells cultured in Corning Incorporated) were infected with 0.1 pfu of the recombinant virus per cell. 48 to 72 hours after the start of the culture, the bottle was shaken to release the cells, and the cells were collected by centrifugation at 3500 × g for 30 minutes. A cell lysate was prepared by adding 10 mL of lysis buffer (50 mM phosphate buffer, 500 mM NaCl, 50 mM imidazole, 1% Triton X-100, pH 7.4) per bottle. Ultrasonic treatment was performed lightly, and centrifuged at 10,000 × g for 30 minutes to obtain a supernatant. Ni equilibrated with 10 mL of wash buffer (50 mM phosphate buffer, 500 mM NaCl, 50 mM imidazole, 0.1% Triton X-100, pH 7.4). ²⁺ The supernatant was added to an IDA agarose resin column (column capacity = 1 mL, manufactured by Amerciam Pharmacia Biosystem).
[0034]
After washing with 10 mL of wash buffer, His-labeled MVH was eluted with a 50-500 mM imidazole gradient. Each fraction was analyzed by SDS-PAGE under reduced conditions. All steps in the purification were controlled with an automatic chromatography system (Amerciam Pharmacia Biosystem) fitted to a chromatography chamber maintained at a temperature of 6 ° C. The peak fraction was dialyzed in phosphate buffered saline (PBS) containing 0.1% Triton X-100; pH 7.4, and an ultrafiltration membrane (cut off = 50 kDa, manufactured by Pall Filtration Corporation) was used. And concentrated. Protein concentration was quantified by bicinchoninic acid (BCA) protein analysis (Pierce Chemical Company) using bovine serum albumin (BSA) as a standard protein.
[0035]
[Identification of generated measles virus hemagglutinin protein (recombinant MVH)]
(ELISA using recombinant MVH)
For each well of a 96-well plate (Nalge Nunc International), 100 μL of purified recombinant MVH (11 μg / mL for TDH / HisX1, 6 μg / mL for TDH / HisC2) or purified virus derived from TD97 strain Coating with particles (5 μg / mL) was performed in PBS and the plates were left at 4 ° C. overnight. After washing and blocking, a serum sample that had been serially diluted 2-fold with PBS containing 0.05% Tween 20 (PBS-T) was added to the wells at 100 μL / well and incubated at 37 ° C. for 1 hour. Subsequent steps were performed according to the instructions of a commercially available ELISA kit (Dade Behring Marburg GmbH). The absorbance of each well at 450 nm was measured with an ELISA reader (Nalge Nunc International). Standard serum (neutralization test titer = 2 ⁷ / 25 μL), the anti-MV ELISA titer was calculated by the parallel line assay method.
[0036]
(Neutralization test (NT))
An MV solution (50 μL) containing approximately 60-80 pfu was mixed with 50 μL of a 4-fold serially diluted serum sample. After incubation at 37 ° C. for 2 hours, 50 μL / well of this mixture was inoculated on a monolayer of Vero cells in a 24-well multiplate and 5% CO 2 was added. ₂ Absorbed at 35 ° C. for 1 hour below. Thereafter, 1 mL / well of MEM (agar medium) containing 5% FCS and 0.8% agar was added, and the cells were cultured at 34 ° C. for 7 days. After neutral red staining, plaques in each well were counted. The dilution number of the serum in which the number of plaques was reduced to 50% of the virus control was defined as the NT antibody titer.
[0037]
[Results of identification of produced measles virus hemagglutinin protein (recombinant MVH)] (temporary expression of His-tagged MVH)
To examine the antigenicity and subcellular localization of His-tagged MVH synthesized under either the PSFJ1-10 or PSFJ2-16 promoter, pSFTDH / HisX1 and CV-1 cells infected with attenuated vaccinia virus LC16mO were examined. pSFTDH / HisC2 was transfected and the intracellular localization of MVH was analyzed by indirect immunofluorescence staining. Rabbit anti-MVH serum and anti-His6 monoclonal antibody were used to examine the antigenicity of the recombinant MVH in immunofluorescence staining. The latter antibody was used to confirm the presence of a His tag sequence in the external region of MVH, a type II membrane protein whose C-terminus was exposed to the external environment. Using anti-MVH antibodies, strong specific fluorescence was observed over the entire surface of cells transfected with pSFTDH / HisX1 and pSFTDH / HisC2 plasmids. A similar pattern appeared for cells transfected with the wild-type MVH gene (pSFTDH1).
[0038]
Using the anti-His6 antibody, His tag-specific fluorescence was only observed in cells transfected with pSFTDH / HisX1 and pSFTDH / HisC2, but not in cells transfected with pSFTDH1 (data not shown). . From these results, it was confirmed that the recombinant MVH was correctly arranged.
To determine the biological activity of the transiently expressed His-tagged MVH, Vero cells infected with the mO strain were transfected with the transfer vector plasmid. These cells were then tested by blood cell adsorption (HAD) analysis using AGM RBCs. With the wild-type MVH gene (pSFTDH1) introduced into the host cells, the host cells obtained the ability of AGM to adsorb RBCs to the blood cells (data not shown). All cells expressing TDH / HisX1 or TDH / HisC2 adsorbed RBCs of AGM on the cell surface, similar to cells expressing wild-type MVH (data not shown).
[0039]
(Properties of MVH and F proteins expressed by recombinant vaccinia virus (VV))
To determine whether the measles virus hemagglutinin protein (MVH) produced by the recombinant VV possesses the ability to mediate cell fusion in cooperation with the F protein, F recombinants and / or MVH recombinants were used. Was co-infected with HeLa cells (FIG. 2). The degree of polynuclear cell formation was observed, and the membrane fusion activity was observed. Cells infected with only mOTDH / HisX1 (FIG. 2D) or mOTDH / HisC2 (FIG. 2E) showed low levels of syncytium formation, indicating that cells were co-infected with mOTDF1 (FIGS. 2F and 2G). It was much lower than when it was made to run. No cell fusion was observed in uninfected cells (FIG. 2A), cells infected with the mO strain (FIG. 2B), or cells infected with only mOTDF1 (FIG. 2C). As described above, MVH expressed by mOTDH / HisX1 and mOTDH / HisC2 can be transported to the cell surface, and can form a bioactive hetero-oligomer together with the F protein.
[0040]
(Purification degree of recombinant MVH)
When the cell extract of RK13 cells infected with each recombinant MVH virus was analyzed by SDS-PAGE, the recombinant MVH was composed of the most prominent band among all the cell proteins (FIG. 3A panel 1). . Their identity was confirmed by Western blot using anti-MVH rabbit serum (FIG. 3A panel 2). As expected, their molecular weights were equal to each other (approximately 76 kDa) and slightly larger than that of wild-type MVH (74.5 kDa).
[0041]
Lysates of cells infected with the vaccinia virus (VV) of each recombinant MVH were added to Ni ²⁺ The recombinant MVH was eluted with a 50-500 mM imidazole concentration gradient on an IDA agarose resin column. The elution peaks for TDH / HisX1 and TDH / HisC2 occurred at approximately 130 mM and 210 mM imidazole, respectively. In SDS-PAGE, purified recombinant MVH often existed as dimers and larger oligomers, despite reducing conditions, but the range was not constant (FIG. 3B panels 1, C Panel 1). Their homology was analyzed by Western blot (FIG. 3B panel 2, C panel 2). As determined by fluorescence image analysis of the gel stained with a fluorescent dye, the degree of purification of the peak fraction of TDH / HisX1 or TDH / HisC2 was 94% (FIG. 3B panel 1) or 98% (FIG. 3C panel 1), respectively. Was over. The recovery rate of the purified TDH / HisX1 protein and TDH / HisC2 protein was 0.5 mg / 10 ⁸ Cells (7.5 mg / L) and 2.8 mg / 10 ⁸ Cells (42 mg / L).
[0042]
(Biological characteristics of purified His-tagged MVH)
To assess whether the biological activity of the purified recombinant measles virus hemagglutinin protein (recombinant MVH) is similar to that of the wild-type protein, the hemagglutinating (HA) activity of His-tagged MVH was measured at a concentration of 40 μg. / ML compared to that of commercial HA (FIG. 4). HA activity of TDH / HisX1, and especially TDH / HisC2, was higher than that of commercially available HA antigens (32, 2048, 16 HAU / μg MVH, respectively). It should be noted that TDH / HisC2 in the chromatographic peak fraction also showed a very high HA activity (4062 HAU / μg) without any treatment such as incorporation into phospholipid liposomes. The HA activity of TDH / HisC2 is higher than previously reported (J. Gen. Virol. 69, 2061-2069, J. Virol. 69, 513-516, 1995, Infect. Immun. 32, 1051). -1057, 1981).
[0043]
To determine whether purified measles virus hemagglutinin protein (purified MVH) has the same antigenicity as the wild-type protein, ELISA was performed using sera from measles patients and vaccinees. Neutralizing antibody titers of the same serum samples were examined in parallel based on their plaque reduction method (NT method). As a control, purified MV virus particle antigen was used for ELISA. When TDH / HisC2 was used as the antigen, the antibody titer based on ELISA (ELISA / C2) had the highest correlation with that of the NT method (R ² = 0.84, P <0.05) (Figure 5C). This correlation coefficient is obtained when virus particles are used (R ² = 0.69, P <0.05) (Fig. 5A). However, the correlation coefficient in the analysis using TDH / HisX1 (FIG. 5B) was the lowest of the three antigens (R ² = 0.49, P <0.05). These results suggest that recombinant MVH, particularly TDH / HisC2, retains the antigenicity as MVH.
[0044]
[Evaluation of the method and the product of the present invention]
According to the present invention, a simple method for purifying a large amount of highly purified MVH was provided. This method involves the production of a recombinant vaccinia virus (VV) that expresses His-tagged MVH and is derived from the highly attenuated vaccinia virus LC16mO strain. In the present invention, two separate recombinants with different His tags and VV promoters were created. In order to prepare highly purified His-labeled MVHs, named TDH / HisX1 and TDH / HisC2, from infected cell lysates in large amounts for both recombinants, ²⁺ An excellent effect was confirmed in that it was sufficient to perform affinity chromatography using an IDA column only once. Moreover, both of the His-tagged MVHs derived from the above two recombinants have all the biological activities of the wild-type protein, and have excellent properties when using the protein as an antigen. Among them was the ability to promote membrane fusion in response to hemagglutination (HA) activity and F protein. Furthermore, as shown in the correlation between the antibody titer of the anti-MV antiserum measured by ELISA and the antibody titer of the same antiserum measured by the NT method, the antigenicity is impaired by the procedure of the present invention. There was no.
[0045]
In the past, Gerlier et al. Reported a high-speed purification method of MVH (J. Gen. Virol. 69, 2061-2069, 1988), but the conventional method uses purified virions as a raw material of MVH. (J. Gen. Virol. 69, 2061-2069, 1988, J. Gen. Virol. 56, 185-193, 1981, Arch. Virol. 69, 2061-2069, 1988, J. Virol. 69). , 516-513, 1995). We estimate that obtaining the same amount of MVH would require at least 400 times more virus culture than our system for producing purified TDH / HisC2. Another limitation with conventional procedures is that contamination of other viral components cannot be completely avoided (Arch. Virol. 69,
2061-2069, 1988; Gen. Virol. 69, 2061-2069, 1988). The method of the present invention does not require any pre-treatment and requires only one pass operation to achieve high purity (> 98%) and high efficiency (2.8 mg / 10 ⁸ Or 42 mg / L).
[0046]
Also, in previous reports, the expression of MVH by the baculovirus system was described (J. Virol. 64, 37-50, 1990, Virus Res. 26, 167-175, 1992), but the product contained a large amount. (Approximately half of the total production) non-glycosylated MVH molecules (J. Virol. 64, 37-50, 1990). Since correct post-translational glycosylation is essential for the functional integrity and antigenicity of MVH (Arch. Virol. 136, 239-253, 1994, J. Gen. Virol. 75, 1043-1052, 1994), denaturation Such widespread contamination by non-glycosylated molecules can be a serious problem. SDS-PAGE and Western blot experiments show that the recombinant MVH purified and obtained according to the present invention does not contain such non-glycosylated molecules (FIG. 3).
[0047]
The fact that the MVH preparation retains antigenicity can be shown by the correlation between the antiserum value measured by ELISA using purified recombinant MVH and the neutralization value of the antiserum. Correlation coefficient R of TDH / HisC2 ² Was significantly higher (FIG. 5C) than that of the measles virus (MV) virus particles (FIG. 5A) and was the highest reported so far (J. Clin. Microbiol. 36, 721-726). , 1998). Since MVH-specific antibodies neutralize measles virus (MV) and significantly contribute to immunity to protect humans from measles virus (MV) infection, measurement of MVH-specific IgG antibodies implies functional immunity against measles. It helps to estimate (J. Clin. Microbiol. 36, 721-726, 1998). Although ELISA based on whole measles virus particle (MV) antigen is routinely used for this purpose, it detects a wide range of antibodies regardless of their functional activity (J. Clin. Microbiol. 19, 376-379, 1984, J. Clin. Microbiol. 30, 564-569, 1992). As a result, functional assays such as NT are more relevant for assessing immunity to measles. However, NT is a time-consuming diagnostic method. The superior antigenicity of purified TDH / HisC2 is very significant in a diagnostic ELISA aimed at quantifying anti-MV antibody titers, as ELISA is more convenient than NT for diagnosing many samples in a short period of time. It is suggested to be useful.
[0048]
In the present invention, two types of His-labeled MVH, TDH / HisX1, and TDH / HisC2 were produced. These recombinant molecules exhibited distinct properties. TDH / HisX1 had lower hemagglutination activity and reactivity with anti-MV antibodies than TDH / HisC2. Since 18 amino acids at the carboxyl terminus of MVH are said to be indispensable for blood cell adsorption (Biochem. Biophys. Res. Commun. 214, 1232-1238, 1995), they are introduced into the XmaI site of TDH / HisX1. His tag sequence may affect its biological function. It is not clear why the reactivity of the MV-specific antibody against TDH / HisX1 is low, but these observations suggest that the location of the His tag introduced into the target gene may affect the biological function of the implanted protein. Suggests that
[0049]
The safety of a vector virus, especially when it is used for mass production of a substance, is important. Sutter et al. Previously reported a highly safe and efficient expression vector based on the non-replicating vaccinia virus (VV) strain MVA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 10847-10851). , 1992). Another highly attenuated strain is the vaccinia virus LC16mO strain, which is a vector virus used in the expression system of the present invention. This virus retains its replication ability in most mammalian cells, but its safety has been proven in experiments and field studies using animal models (Elsevier, Amsterdam, 87-100, 1985). In addition, its ability to replicate in animal skin and other tissues is reduced when foreign genes are introduced into the genome (J. Virol. 62, 4474-4480, 1988).
[0050]
Despite the reduced virulence of this strain, recombinants originating from the vaccinia virus strain LC16mO can grow with the same efficiency as the parent virus of the cell line. Thus, sufficient amounts of protein product can be obtained from cells infected with the recombinant virus at a low multiplicity of infection (eg, 0.1 pfu / cell). Compared to non-replicating vectors, the use of the vaccinia virus strain LC16mO appears to reduce the required inoculum viral load by as much as a factor of 100, an advantage in mass production of proteins. Table 1 summarizes the advantages of the vaccinia virus (VV) system in the present invention.
[0051]
[Table 1]

[0052]
Thus, the system of the present invention combining the high efficiency promoter PSFJ2-16, the highly attenuated but vaccinia virus LC16mO strain that replicates, and the His tag and high-speed purification procedures using affinity chromatography are: It is promising in the large-scale preparation of eukaryotic membrane glycoproteins, etc., where proper post-translational modification is required for function.
[0053]
[Explanation of figures]
FIG. Preparation of pSFTDH1, pSFTDH / HisX1, pSFTDH / HisC2 and pSFTDF1. Structure of transfer vector plasmids pSFJ1-10 (A) and pSFJ2-16 (B) having hybrid promoters PSFJ1-10 and PSFJ2-16, respectively. PSFJ1-10 and PSFJ2-16 contain the ATI promoter (late promoter of the cowpox virus ATI gene) and the P7.5E × 10 and P7.5 × 16 (ie, 10 or 16 tandem VV P7.5-kDa genes). Tandemly modified modified early promoter elements (Arch. Virol. 138, 315-330, 1994). Ori indicates the bacterial origin of replication, APr indicates the ampicillin resistance gene, and vvHA (L) and vvHA (R) indicate the left or right portion of the VV hemagglutinin gene. Note the orientation of the promoter region of each vector plasmid and the VV hemagglutinin gene. (C) Schematic diagram of MVH gene cDNA (C1) and F gene cDNA (C2). The nucleotide numbers, open reading frames (black), transmembrane regions (shaded), and restriction enzyme sites on the MV genome, which were amplified by PCR, are shown. (D) DNA and deduced amino acid sequences at the carboxyl terminus of wild-type (D1, pSFTDH1) and His-tagged MVH (D2, pSFTDH / HisX1; D3, pSFTDH / HisC2). Bold letters indicate the introduced His tag sequence.
[0054]
FIG. Membrane fusion activity of His-tagged MVH co-expressed with F protein in HeLa cells. The multiplicity of infection (MOI) of the virus-uninfected HeLa cells (A) and single infection is 20 pfu in the case of single infection, and the multiplicity of infection (MOI) of each virus is 10 pfu in the case of co-infection, mO (B), mOTDF1 (C), HeLa cells infected with mOTDH / HisX1 (D), mOTDH / HisC2 (E), mOTDF1 and mOTDH / HisX1 (F), and mOTDF1 and mOTDH / HisC2 (G) were prepared. After culturing at 35 ° C. for 20 hours, the morphology of the cells was observed with a binocular objective microscope.
[0055]
FIG. Detection and purification of His-tagged MVH expressed by the recombinant virus. (A) To identify the recombinant MVH expressed by the recombinant virus, RK13 cells infected with the virus at 10 pfu per cell and cultured for 20 hours were subjected to SDS-PAGE (panel 1) and Western blot (panel 2) Was analyzed. Proteins were separated on a 10% gel and visualized by fluorescent staining. MVH was identified by Western blot using rabbit anti-MVH serum. Lanes: 1, uninfected (mock); 2, mO infected; 3, mOTDH / HisX1 infected; 4, mOTDH / HisC2 infected; 5, purified whole MV (TD97 strain) virus particles. (B and C) To purify His-tagged MVH, lysate of RK13 cells infected with mOTDH / X1 (B) or mOTDH / HisC2 (C) ²⁺ Affinity chromatography was performed on an IDA column. The fractions were analyzed by SDS-PAGE (panel 1) and Western blot (panel 2). (B) Lane: 1, sample before fractionation; 2, non-adsorbed fraction; 3,

fraction

3, 4, fraction 5; 5, fraction 7; 6, fraction 9; 7, fraction 11; M1 , Molecular weight markers. (C) Lane: 1, sample before fractionation; 2, non-adsorbed fraction; 3,

fraction

4, 4, fraction 6; 5, fraction 8; 6, fraction 10; M2, molecular weight marker.
[0056]
FIG. Hemagglutination (HA) capacity of purified recombinant MVH. 50 μL of a suspension of 0.5% RBC in PBS containing 0.2% BSA and 0.01% gelatin was added to 50 μL of serially diluted 50 μL of commercially available MV HA antigen (Denka Seiken) or purified. The cells were incubated with the recombinant MVH in a round-bottom 96-well plate at 37 ° C. for 30 minutes, and then at 4 ° C. for 1 hour. The final dilution that induced hemagglutination was calculated as the HA value. The MVH concentration in each sample was adjusted to 40 μg / mL. 2 ³ From 2 ¹⁴ A two-fold serial dilution of the sample was performed within the range. A, TDH / HisX1; B, TDH / HisC2; C, commercially available HA antigen.
[0057]
FIG. Correlation between neutralizing antibody titer of anti-MV serum and ELISA titer using recombinant MVH. ELISA was performed using purified MV virus particles (ELISA / WV) (A), purified TDH / HisX1 (ELISA / X1) (B), or purified TDH / HisC2 (ELISA / C2) (C) as capture antigens. . The final dilution of the serum in which the number of plaques was reduced to 50% of the virus control was defined as the antibody titer of the NT method.
[0058]
【The invention's effect】
The method of the present invention enables large-scale expression of measles virus hemagglutinin protein (MVH) under the control of strong promoters (PSFJ1-10 and PSFJ2-16) of LC16mO, a highly attenuated vaccinia virus strain. Furthermore, in the present invention, by adding His-tag to the measles virus hemagglutinin protein, the recombinant hemagglutinin is obtained from the lysate of the cells infected with the recombinant vaccinia virus by one-step affinity chromatography. The protein was able to be purified, which enabled efficient and rapid purification of the protein. Further, the method of the present invention has a very high recovery rate and purification rate (the yield is 10 ⁸ 2.8 mg / cell, purification rate 98%). This indicates that the method of the present invention is approximately 400 times more efficient than conventionally used hemagglutinin preparation methods.
[0059]
The hemagglutinin obtained according to the present invention is transported to the cell membrane and has a hemagglutination activity, and the recombinant hemagglutinin protein elicits a cell fusion activity in cooperation with the measles virus fusion protein. Furthermore, the antibody titer against measles virus was determined by neutralizing antibody titer (R) as measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using purified hemagglutinin as an antigen. ² = 0.84, P <0.05). This suggests that the antigenicity is maintained. Such recombinant hemagglutinin preparations can be used for diagnosis to measure functional anti-measles immunity, and are also useful for studying the biological function and structure of hemagglutinin. It is.
[0060]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the structures of MVH gene cDNA, F gene cDNA, transfer vector plasmids pSFJ1-10, pSFJ2-16, wild-type and His-tagged MVH in Examples of the present invention.
FIG. 2 shows the membrane fusion activity of His-tagged MVH co-expressed with F protein in HeLa cells.
FIG. 3 shows the results of detection and purification of His-tagged MVH expressed by a recombinant virus.
FIG. 4 shows the results of analyzing the hemagglutination (HA) ability of purified recombinant MVH.
FIG. 5 is a diagram showing a correlation between neutralizing ability of anti-MV serum and ELISA titer using recombinant MVH.

Claims

A measles virus hemagglutinin protein, wherein a measles virus hemagglutinin protein gene is linked downstream of a poxvirus type A inclusion body (ATI) promoter and / or a vaccinia virus 7.5K early expression promoter that repeats multiple times. Vector plasmid for gene expression of protein.

2. The vector plasmid for gene expression of a measles virus hemagglutinin protein according to claim 1, wherein a histidine-labeled sequence is inserted into the 3 'end of the measles H gene.

A recombinant vaccinia virus for large-scale expression of a measles virus hemagglutinin protein, wherein the vector plasmid for gene expression of the measles virus hemagglutinin protein according to claim 1 or 2 is introduced into an attenuated vaccinia virus strain.

4. The recombinant vaccinia virus for overexpressing measles virus hemagglutinin protein according to claim 3, wherein the vaccinia virus strain is an attenuated vaccinia virus LC16mO strain.

A method for expressing a large amount of a measles virus hemagglutinin protein, comprising infecting an animal cell with the recombinant vaccinia virus according to claim 3 or 4 and culturing the animal cell.

The method according to claim 5, wherein the animal cells are rabbit kidney cells RK13 or Syrian hamster kidney cells BHK-21.

A method for obtaining a large amount of measles virus hemagglutinin protein, comprising collecting the measles virus hemagglutinin protein expressed by the method according to claim 5 or 6, and purifying the protein by affinity chromatography.

A measles virus hemagglutinin protein separated and purified by the method of claim 7.

An antigen for detecting an anti-measles virus antibody, comprising the measles virus hemagglutinin protein according to claim 8.

A method for diagnosing an anti-measles virus antibody titer, comprising using the antigen for detecting an anti-measles virus antibody according to claim 9.