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JP2003535066A - 薬学的活性化合物の制御された送達のための共役付加反応 - Google Patents

薬学的活性化合物の制御された送達のための共役付加反応

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JP2003535066A
JP2003535066A JP2002500775A JP2002500775A JP2003535066A JP 2003535066 A JP2003535066 A JP 2003535066A JP 2002500775 A JP2002500775 A JP 2002500775A JP 2002500775 A JP2002500775 A JP 2002500775A JP 2003535066 A JP2003535066 A JP 2003535066A
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JP
Japan
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biomaterial
pharmaceutically active
moiety
binding
peptide
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JP2002500775A
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English (en)
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ジェフリー エイ． ハベル
ドナルド エルベルト
ロナルド ショエンメーカーズ
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Universitaet Zuerich
Original Assignee
Universitaet Zuerich
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、共役不飽和基への求核付加反応によって形成される、重合体生体材料を特徴とする。これらの生体材料は、医学的治療のために用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の背景 本発明は、バルク材料およびコロイド材料を含む生体材料からの薬学的活性化
合物の放出に関する。薬学的活性化合物の重合体への結合のために求核付加反応
を用いて、本発明の組成物によって特徴付けられる所望の放出速度を達成する。
【０００２】 重合体ヒドロゲルおよび水溶性共重合体を含む合成生体材料を、薬学的および
外科的適用を含む、様々な適用において用いることができる。これらは、例えば
、治療分子を被検者に、接着剤または密封剤として、組織工学および創傷治癒の
骨格として、ならびに細胞移植デバイスとして送達するために用いることができ
る。
【０００３】 薬学的活性化合物の放出のための材料の使用は、いくつかのグループによって
研究されている。ピット(Pitt)およびシンドラー(Scindler)は様々な型の制御薬
物送達スキームを分類した(ピットら、「制御された薬物送達(Controlled Drug
Delivery)」、CRC Press、フロリダ州ボカラトン、p.53〜80、1983)。彼らは、
薬物が材料に共有結合されている二種類の系を定義した。薬物が重合体の側鎖と
して結合されている系はIV型系と呼ばれ、薬物が重合体主鎖中に組み込まれてい
る系はV型系と呼ばれた。このV型重合体の定義は、ベイカー(Baker)(「生物学的
活性物質の制御放出(Controlled Release of Biologically Active Agents)」、
p.84〜13 John Wiley and Sons、ニューヨーク、1987)によってさらに拡大され
、フリーラジカルの重合可能な基を薬物に付加し、続いて薬物単独または他の共
重合用単量体とのフリーラジカル重合により材料を生成する系が含まれた(例え
ば、ダンカン(Duncan)ら、Adv. In Polym. Sci. 57:51〜101、1984参照)。IVb型
系は、薬物を重合体上の活性基に連結するためにリンカー分子を用いる点でV型
系と異なっている。
【０００４】 重合体生体材料の分野では多くの進歩があったが、そのような生体材料を体内
で最適に用いるために、さらなる開発がなされねばならない。臨床上妥当な時間
枠内で生体材料から治療化合物が放出されるために、生体材料からの治療化合物
放出の半減期は、生体材料を生理的条件下に置いた場合に、時間または年の次元
ではなく、週または月の次元であるべきである。事実、生体材料からの薬学的活
性化合物送達の臨床的有用性は、生体材料からの薬学的活性化合物放出速度が制
御できず、これらの化合物の重合体への結合には大きな困難が伴い、低収率であ
るために制限されている。
【０００５】発明の概要 以下の発明は、薬学的活性化合物の重合体への結合において有用な新規化合物
および方法であって、生体材料を生成するために共役付加反応および重合または
重合体の架橋を用い、いくつかの態様においては複数の共役付加反応を用いる方
法を含む。前述に加えて、重合または架橋は、フリーラジカル重合などの他のメ
カニズムによって達成することもできる。薬学的活性化合物に結合された重合体
をもう一つの重合体に架橋して、直鎖重合体生体材料、コロイド生体材料、また
はゲル生体材料などの共重合体を生成することもできる。本発明の化合物、前駆
成分、および生体材料は、疾患、障害、または感染症の治療または予防において
用いることができる。
【０００６】 第1の局面において、本発明は以下の式を有する化合物を提供する：
【化２】 式中、Dは薬学的活性部分または結合部分であり；nは1、2、または3であり；か
つYはO、NH、またはNである。
【０００７】 第2の局面において、本発明は以下の式の化合物を特徴とする：
【化３】 式中、Dは薬学的活性部分または結合部分であり；nは1、2、または3であり；Xは
NまたはOであり；Pは一つまたは複数の共役不飽和基を有する水溶性重合体また
は水膨潤性重合体であり；YはO、NH、またはNであり；かつUは重合体に結合され
ている求電子基への求核剤の付加産物である。化合物が一つまたは複数のメチレ
ン(CH2)基における一つまたは複数の水素の代わりに炭化水素部分を有しうるこ
とも企図される。薬学的活性部分または結合部分上のエステルまたはアミド結合
の半減期は、pH7.4、37℃の水溶液中で1時間から1年の間である。望ましくは、
半減期は1日から9ヶ月の間、より好ましくは2日から6ヶ月の間、最も好ましくは
4日から3週間の間である。
【０００８】 第3の局面において、本発明は以下の式を有する化合物を特徴とする：
【化４】 式中、Dは薬学的活性部分または結合部分であり；かつYはO、NH、またはNである
。化合物がアルケン(-CH＝CH2)基における一つまたは複数の水素の代わりに炭化
水素部分を有しうることも企図される。様々な態様において、nは1である。
【０００９】 第4の局面において、本発明は以下の式を有する化合物を含む：
【化５】 式中、Dは薬学的活性部分または結合部分であり；YはO、NH、またはNであり；か
つLは直鎖または分枝リンカーである。様々な態様において、nは1、2、または3
である。
【００１０】 第5の局面において、本発明は以下の式を有する化合物を特徴とする：
【化６】 式中、Dは薬学的活性部分または結合部分であり；Lは直鎖または分枝リンカーで
あり；XはOまたはNであり；YはO、NH、またはNであり；Pは一つまたは複数の共
役不飽和基を有する水溶性重合体または水膨潤性重合体であり；かつUは重合体
に結合されている求電子基への求核剤の付加産物である。薬学的活性部分または
結合部分上のエステルまたはアミド結合の半減期は、pH7.4、37℃の水溶液中で1
時間から1年の間である。様々な態様において、nは1、2、または3である。
【００１１】 本発明の第6の局面は、以下の式を有する複数の前駆成分の架橋により生成さ
れる生体材料を特徴とする：
【化７】 式中、Dは薬学的活性部分または結合部分であり；YはO、NH、またはNであり；L
は直鎖または分枝リンカーであり；XはOまたはNであり；Pは一つまたは複数の共
役不飽和基を有する水溶性重合体または水膨潤性重合体であり；かつUは重合体
に結合されている求電子基への求核剤の付加産物である。薬学的活性部分または
結合部分上のエステルまたはアミド結合の半減期は、pH7.4、37℃の水溶液中で1
年から1年の間である。一つの望ましい態様において、架橋は、場合によっては
促進剤存在下、フリーラジカル重合または共役付加により起こる。もう一つの望
ましい態様において、架橋はコロイド材料、ミクロスフェア、またはナノスフェ
アを生成する。架橋は、感受性生物学的分子存在下、またはヒトなどの哺乳類の
体内の部位の近辺もしくはその部位においても起こりうる。望ましくは、薬学的
活性化合物が放出されて、その部位に送達される。様々な態様において、nは1、
2、または3である。
【００１２】 本発明の第1から第6の局面の望ましい態様において、薬学的活性部分は、合成
有機分子、天然に存在する有機分子、核酸分子、生合成タンパク質またはペプチ
ド、天然に存在するペプチドまたはタンパク質、および修飾された天然に存在す
るペプチドまたはタンパク質からなる群の一つより誘導される。望ましい有機分
子には、パクリタキセル、ドキソルビシン、5-フルオロデオキシウリジン、エス
トラジオール、2-メトキシエストラジオール、およびそれらの誘導体が含まれる
。
【００１３】 第2、第4、第5、および第6の局面の望ましい態様において、水溶性または水膨
潤性重合体は、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(エチレンオキシド)、ポリ(ビ
ニルアルコール)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(エチレン-co-ビニルアルコール)、
ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(ヒドロキシプロピルメタクリルアミド)、ポリ(N
-イソプロピルアクリルアミド)、ポリ(ジメチルアクリルアミド)、ポリ(アクリ
ル酸)、ポリ(エチルオキサゾリン)、ポリ(エチレンオキシド)-ポリ(プロピレン
オキシド)ブロック共重合体、またはこれらの重合体を含む水溶性もしくは水膨
潤性共重合体、および共役不飽和基を有するそれらの誘導体からなる群より選択
される。不飽和基は同じでも、異なっていてもよい。様々な態様において、一つ
または複数の不飽和基は薬学的活性部分に結合されていなくてもよい。望ましく
は、不飽和基は求核置換反応を受けるように活性されていない。好ましい不飽和
基には、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、
アクリロニトリル、キノン、およびそれらの誘導体が含まれる。もう一つの望ま
しい態様において、化合物の加水分解によって、式D-OH、D-NH2、またはD-NHを
有する薬学的活性化合物が放出される。
【００１４】 第4から第6の局面の一つの望ましい態様において、リンカーは一つまたは複数
のアミノ酸を含む。望ましくは、リンカーは付着部位、増殖因子結合部位、また
はプロテアーゼ結合部位を含む。望ましいリンカーは、酵素により分解可能なリ
ンカーも含む。
【００１５】 第4から第6の局面のリンカーが親水性である場合、これは薬学的活性部分の水
溶性を増大させる、および／または誘導される薬学的活性化合物の放出速度を増
大させることがある。リンカーが疎水性である場合、これは薬学的活性部分の水
溶性を低下させる、および／またはDから誘導される薬学的活性化合物の放出速
度を低下させることがある。他の望ましい態様において、リンカーは、D上のエ
ステルまたはアミド結合と反応することにより、式D-OH、D-NH2、またはD-NHを
有する薬学的活性化合物の放出速度を増大させる求核基を含む。望ましいリンカ
ーは1から4個(両端を含む)の原子を含む炭化水素部分も含む。
【００１６】 第4から第6の局面のリンカーが親水性である場合、これは結合部分の水溶性を
増大させる、および／または結合部分から誘導される化合物の放出速度を増大さ
せることもある。リンカーが疎水性である場合、これは結合部分の水溶性を低下
させる、および／または結合部分から誘導される化合物の放出速度を低下させる
こともある。他の望ましい態様において、リンカーは、結合部分を含むD上のエ
ステルまたはアミド結合と反応することにより、式D-OH、D-NH2、またはD-NHを
有する薬学的活性化合物の放出速度を増大させる求核基を含む。望ましいリンカ
ーは1個から4個(両端を含む)の原子を含む炭化水素部分も含む。
【００１７】 第7の局面において、本発明は生体材料の前駆成分を生成する方法を特徴とす
る。この方法は、(a)薬学的活性化合物または結合化合物をリンカー分子に結合
させて、以下の式を有する化合物を産生する段階：
【化８】 式中、Dは薬学的活性部分または結合部分であり；YはO、NH、またはNであり；か
つnは1、2、または3である；および(b)段階(a)の生成物を複数の共役不飽和基を
有する水溶性重合体または水膨潤性重合体に、共役付加反応によって結合する段
階を含む。
【００１８】 生体材料の前駆成分を生成する方法は、本発明の第8の局面によっても提供さ
れる。この方法は、(a)薬学的活性化合物または結合化合物をリンカー分子に結
合させて、以下の式を有する化合物を産生する段階：
【化９】 式中、Dは薬学的活性部分または結合部分であり、かつYはO、NH、またはNである
；および(b)段階(a)の生成物を複数の共役不飽和基を有する水溶性重合体または
水膨潤性重合体に、共役付加反応によって結合する段階を含む。好ましくは、段
階(a)はアクリル酸を薬学的活性化合物または結合部分上のアルコールまたはア
ミンと縮合させてエステルまたはアミド結合を生成し、修飾された薬学的活性化
合物または修飾された結合化合物を産生することにより実施する。
【００１９】 本発明の第9の局面は、生体材料の前駆成分を生成する方法であって、(a)薬学
的活性化合物または結合化合物をリンカー分子に結合させて、以下の式を有する
化合物を産生する段階：
【化１０】 式中、Dは薬学的活性部分または結合部分であり；YはO、NH、またはNであり；か
つLは直鎖または分枝リンカーである；および(b)段階(a)の生成物を複数の共役
不飽和基を有する水溶性重合体または水膨潤性重合体に、共役付加反応によって
結合する段階を含む方法を特徴とする。好ましくは、段階(a)はアクリル酸を薬
学的活性化合物または結合化合物上のアルコールまたはアミンと縮合させてエス
テルまたはアミド結合を生成し、生成物を一つの保護アミンまたはチオールおよ
び一つの遊離アミンまたはチオールを有する化合物と反応させ、かつチオール-
またはアミン-保護基を除去することにより実施する。様々な態様において、nは
1、2、または3である。
【００２０】 第10の局面において、本発明は生体材料の前駆成分を生成する方法であって、
(a)チオール保護メルカプトプロピオン酸、チオール保護メルカプト酢酸、アミ
ン保護アミノプロピオン酸、またはアミン保護グリシンの一つを含むリンカーを
、薬学的活性化合物または結合化合物上のアルコールまたはアミンと縮合させて
エステルまたはアミド結合を生成し、修飾された薬学的活性化合物または修飾さ
れた結合化合物を産生する段階；(b)チオール-またはアミン-保護基を除去する
段階；および(c)段階(b)の生成物を複数の共役不飽和基を有する水溶性重合体ま
たは水膨潤性重合体に、共役付加反応によって結合する段階を含む方法を特徴と
する。
【００２１】 第11の局面において、本発明は生体材料の前駆成分を生成する方法を提供する
。この方法は、(a)アクリル酸を薬学的活性化合物または結合化合物上のアルコ
ールまたはアミンと縮合させてエステルまたはアミド結合を生成し、修飾された
薬学的活性化合物または修飾された結合化合物を産生する段階；(b)修飾された
薬学的活性化合物または修飾された結合化合物を一つの遊離チオールまたはアミ
ンおよび一つの保護チオールまたはアミンを含むリンカーと、共役付加により反
応させる段階；(c)チオール-またはアミン-保護基を除去する段階；および(d)段
階(c)の生成物を複数の共役不飽和基を有する水溶性重合体または水膨潤性重合
体に、共役付加反応によって結合する段階を含む。
【００２２】 第12の局面において、本発明は生体材料の前駆成分を生成する方法を特徴とす
る。この方法は、(a)求核アミンまたはチオールを薬学的活性化合物または結合
化合物に組み込む段階、および(b)段階(a)の生成物を複数の共役不飽和基を有す
る水溶性重合体または水膨潤性重合体に、共役付加反応によって結合する段階を
含む。好ましくは、薬学的活性化合物はDNA、RNA、ペプチド、またはタンパク質
である。一つの望ましい態様において、DNAまたはRNAはチオールを含むように修
飾された塩基を有する。
【００２３】 第七から第12の局面の望ましい態様において、薬学的活性化合物は、合成有機
分子、天然に存在する有機分子、核酸分子、生合成タンパク質またはペプチド、
天然に存在するペプチドまたはタンパク質、および修飾された天然に存在するペ
プチドまたはタンパク質からなる群より選択される。望ましい有機分子には、パ
クリタキセル、ドキソルビシン、カンプトテシン、5-フルオロデオキシウリジン
、エストラジオール、2-メトキシエストラジオール、およびそれらの誘導体が含
まれる。一つの望ましい態様において、生合成ペプチドまたはタンパク質のアミ
ノ酸配列は、天然ペプチドまたはタンパク質の対応する位置に見られる別のアミ
ノ酸の代わりにシステインを有する。段階(a)における薬学的活性化合物または
結合部分のリンカーまたはアクリル酸への結合は、縮合剤の存在下で実施するこ
とができる。これらの局面の他の望ましい態様において、水溶性または水膨潤性
重合体は、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(エチレンオキシド)、ポリ(ビニル
アルコール)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(エチレン-co-ビニルアルコール)、ポリ(
ビニルピロリドン)、ポリ(ヒドロキシプロピルメタクリルアミド)、ポリ(N-イソ
プロピルアクリルアミド)、ポリ(ジメチルアクリルアミド)、ポリ(アクリル酸)
、ポリ(エチルオキサゾリン)、ポリ(エチレンオキシド)-ポリ(プロピレンオキシ
ド)ブロック共重合体、またはこれらの重合体を含む水溶性もしくは水膨潤性共
重合体、および共役不飽和基を有するそれらの誘導体からなる群より選択される
。もう一つの望ましい態様において、共役不飽和基は同じである。望ましい共役
不飽和基には、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルア
ミド、アクリロニトリル、およびキノンが含まれた。これらの局面の望ましい態
様において、一つまたは複数の不飽和基は薬学的活性部分に結合されていない。
これらの局面の他の望ましい態様において、一つまたは複数の不飽和基は結合部
分に結合されていない。これらの局面のさらに他の望ましい態様において、一つ
または複数の不飽和基は結合部分にも、薬学的活性部分にも結合されていない。
望ましくは、不飽和基は求核置換反応を受けるように活性化されていない。本発
明のこれらの局面の方法は、最終段階の前に実施される精製段階を含んでいても
よい。望ましくは、薬学的活性化合物は前駆成分から元の修飾されていない薬学
的活性化合物として放出される。一つの望ましい態様において、重合体における
共役不飽和基の数は、リンカーにおけるアミンまたはチオール基の数よりも多い
。
【００２４】 本発明の第七から第12の局面のリンカー分子は、第4から第6の局面のリンカー
について挙げられたものと同じ態様を有しうる。
【００２５】 第13の局面において、本発明は生体材料を生成する方法を特徴とする。この方
法は、(a)薬学的活性化合物もしくは結合化合物をリンカー分子に結合する、ま
たは求核アミンもしくはチオールを薬学的活性化合物もしくは結合化合物に組み
込む段階、(b)リンカーにおけるいかなるチオール-またはアミン-保護基も除去
する段階、(c)リンカーにおける、または薬学的活性化合物もしくは結合化合物
に組み込まれたチオール、アミン、またはアルケン基を、複数の共役不飽和基を
有する水溶性重合体または水膨潤性重合体に、共役付加反応によって結合して、
前駆成分を生成する段階、および(d)一つまたは複数の前駆成分における結合し
ていない共役不飽和基を架橋する段階を含む。一つの望ましい態様において、一
つまたは複数の共役不飽和基を有し、かつ薬学的活性部分に結合していない重合
体を、この重合体存在下で架橋を行うことにより、生体材料に組み込む。もう一
つの望ましい態様において、一つまたは複数の共役不飽和基を有し、かつ結合部
分に結合していない重合体を、この重合体存在下で架橋を行うことにより、生体
材料に組み込む。さらにもう一つの望ましい態様において、一つまたは複数の共
役不飽和基を有し、かつ結合部分または薬学的活性化合物のいずれにも結合して
いない重合体を、この重合体存在下で架橋を行うことにより、生体材料に組み込
む。もう一つの望ましい態様において、架橋を複数の求核基を有する標的化合物
存在下で行い、それにより標的化合物を生体材料に組み込む。望ましい標的化合
物には、配列 に80％、好ましくは90％、またはより好ましくは100％同一であるアミノ酸配列
を有するペプチドが含まれる。他の望ましい標的化合物には、哺乳類の細胞、組
織、器官、器官系、または部位への標的指向性を提供するアミノ酸配列または部
分を有するものが含まれる。一つの望ましい態様において、架橋段階および／ま
たは生体材料の前駆成分の生成は、ヒトなどの哺乳類の体内で起こる。もう一つ
の望ましい態様において、架橋は哺乳類の体内の部位、またはその近辺での、フ
リーラジカル重合または共役付加反応により起こる。望ましくは、架橋はチオー
ルまたはアミンと共役不飽和基との間の自己選択的反応によって起こる。もう一
つの望ましい態様において、架橋により、ヒトなどの哺乳類に送達することがで
きるヒドロゲル、コロイド材料、ミクロスフェア、またはナノスフェアが生成さ
れる。さらにもう一つの望ましい態様において、薬学的活性化合物またはその誘
導体が生体材料から放出され、体内の部位に送達される。好ましくは、薬学的活
性部分または結合部分上のエステルまたはアミド結合の半減期は、体内の部位で
1時間から1年の間である。望ましくは、半減期はpH7.4、37℃の水溶液中で1時間
から1年の間である。この局面の共役不飽和基は、前述の局面のいずれかの共役
不飽和基について挙げられたものと同じ態様を有しうる。
【００２６】 第14の局面において、本発明は、薬学的活性部分を有する生体材料を特徴とす
る。生体材料は薬学的活性部分上にエステルまたはアミド結合を含み、この結合
はpH7.4、37℃の水溶液中で1時間から1年の間の半減期を有する。望ましくは、
この生体材料、本発明の第6の局面の生体材料、および本発明の方法を用いて生
成される生体材料について、薬学的活性部分上のエステルまたはアミド結合の半
減期は、1日から9ヶ月の間、より好ましくは2日から6ヶ月の間、最も好ましくは
4日から3週間の間である。関連する局面において、本発明は、結合部分を有する
生体材料を特徴とする。生体材料は結合部分上にエステルまたはアミド結合を含
み、この結合はpH7.4、37℃の水溶液中で1時間から1年の間の半減期を有する。
望ましくは、この生体材料について、結合部分上のエステルまたはアミド結合の
半減期は、1日から9ヶ月の間、より好ましくは2日から6ヶ月の間、最も好ましく
は4日から3週間の間である。他の態様において、結合部分はヘパリン、ヘパリン
結合部分、金属イオン結合部分、炭水化物部分、炭水化物結合部分、または疎水
性基を結合する部分である。金属イオン結合部分の例には、Cu2＋結合部分、Co2 ＋ 結合部分、およびZn2＋結合部分が含まれる。望ましい炭水化物結合部分は、
フェニルボロン酸である。もう一つの態様において、フェニルボロン酸はフェニ
ルボロン酸のフェニル環上の二級アミンにより生体材料に連結される。疎水性基
を結合する部分の例は、シクロデキストリンである。望ましい態様において、薬
学的活性部分または化合物は、生体材料における結合部分に結合される。結合部
分に直接または間接的に結合されうる薬学的活性部分または化合物には、合成有
機分子、天然に存在する有機分子、核酸分子、生合成タンパク質またはペプチド
、天然に存在するペプチドまたはタンパク質、および修飾された天然に存在する
ペプチドまたはタンパク質が含まれる。そのような有機分子の例には、パクリタ
キセル、ドキソルビシン、カンプトテシン、5-フルオロデオキシウリジン、エス
トラジオール、2-メトキシエストラジオール、およびその誘導体が含まれる。
【００２７】 第13および第14の局面の望ましい態様において、薬学的活性部分は前述の局面
の薬学的活性部分の望ましい態様のいずれかを有する。
【００２８】 第15の局面において、本発明は、疾患、障害、または感染症を治療または予防
する方法であって、ヒトなどの哺乳類に、以下の式を有する化合物を投与するこ
とによる方法を提供する：
【化１１】 式中、Dは薬学的活性部分または結合部分であり；YはO、NH、またはNであり；L
は直鎖または分枝リンカーであり；XはOまたはNであり；Zは求核アミンまたはチ
オールが組み込まれている薬学的活性部分または結合部分であり；Pは一つまた
は複数の共役不飽和基を有する水溶性重合体または水膨潤性重合体であり；かつ
Uは重合体に結合されている求電子基への求核剤の付加産物である。薬学的活性
部分または結合部分上のエステルまたはアミド結合の半減期は、pH7.4、37℃の
水溶液中で1時間から1年の間である。様々な態様において、nは1、2、または3で
ある。
【００２９】 第16の局面において、本発明は、哺乳類における疾患、障害、または感染症を
治療または予防する方法を特徴とする。この方法は、哺乳類に薬学的活性部分を
有する生体材料を投与する段階を含む。薬学的活性部分は、アミドもしくはエス
テル結合を介して生体材料に直接結合されていてもよく、またはアミドもしくは
エステル結合を介して生体材料に結合されている結合部分との共有結合もしくは
非共有結合相互作用により生体材料に間接的に結合されていてもよい。この生体
材料は、以下の前駆成分の一つまたは複数の架橋により生成される：
【化１２】 式中、Dは薬学的活性部分または結合部分であり；YはO、NH、またはNであり；L
は直鎖または分枝リンカーであり；XはOまたはNであり；Zは求核アミンまたはチ
オールが組み込まれている薬学的活性部分または結合部分であり；Pは一つまた
は複数の共役不飽和基を有する水溶性重合体または水膨潤性重合体であり；かつ
Uは重合体に結合されている求電子基への求核剤の付加産物である。薬学的また
は結合部分上のエステルまたはアミド結合の半減期は、pH7.4、37℃の水溶液中
で1時間から1年の間である。様々な態様において、nは1、2、または3である。
【００３０】 第17の局面において、本発明は、哺乳類における疾患、障害、または感染症を
治療または予防する方法を提供する。この方法は、 (a)薬学的活性化合物または結合化合物をリンカー分子に結合する段階、(b)リン
カーにおけるいかなるチオール-またはアミン-保護基も除去する段階、(c)リン
カーにおけるチオール、アミン、またはアルケン基を、複数の共役不飽和基を有
する水溶性重合体または水膨潤性重合体に、共役付加反応によって結合する段階
、および(d)哺乳類内の部位で重合体における結合していない不飽和基を架橋す
る段階を含む。この局面の一つの態様において、段階(a)から(c)の一つまたは複
数も、哺乳類内の部位で実施される。
【００３１】 第18の局面において、本発明は、哺乳類における疾患、障害、または感染症を
治療または予防する方法であって、哺乳類に薬学的活性部分を有する生体材料を
投与することによる方法を特徴とする。生体材料は、薬学的活性部分上にエステ
ルまたはアミド結合を含んでいてもよい。この結合は、pH7.4、37℃の水溶液中
で1時間から1年の間の半減期を有する。または、生体材料は、結合部分上にエス
テルまたはアミド結合を含んでいてもよく、これは薬学的活性化合物または部分
と共有結合または非共有結合により相互作用する。この結合部分上のエステルま
たはアミド結合は、pH7.4、37℃の水溶液中で1時間から1年の間の半減期を有す
る。
【００３２】 第19の局面において、本発明は、薬学的活性化合物を哺乳類の細胞、組織、器
官、器官系、または体に送達する方法を特徴とする。この方法は、細胞、組織、
器官、器官系、または体を、薬学的活性部分上にエステルまたはアミド結合を有
する生体材料に接触させる段階を含む。この結合は、pH7.4、37℃の水溶液中で1
時間から1年の間の半減期を有し、結合の切断により、薬学的活性部分を有する
薬学的活性化合物が放出される。関連する局面は、細胞、組織、器官、器官系、
または体を、薬学的活性化合物または部分と共有結合または非共有結合により相
互作用する結合部分上にエステルまたはアミド結合を有する生体材料に接触させ
る段階を含む方法を含む。この結合は、pH7.4、37℃の水溶液中で1時間から1年
の間の半減期を有し、結合の切断により、結合部分が放出される。結合部分の放
出により、結合部分に結合されている薬学的活性化合物または部分も生体材料か
ら放出されることになる。
【００３３】 第20の局面において、本発明は、薬学的活性化合物を哺乳類の細胞、組織、器
官、器官系、または体に送達する方法を特徴とする。この方法は、哺乳類に薬学
的活性部分を有する生体材料を投与する段階を含む。生体材料は、複数の求核基
を有する標的化合物存在下、前駆成分の架橋により生成される。前駆成分は、複
数の共役不飽和基を有する重合体に結合された薬学的活性部分を含み、標的化合
物は、哺乳類内の細胞、組織、器官、器官系、または部位への標的指向性を提供
する。薬学的活性部分を有する薬学的活性化合物は、哺乳類の細胞、組織、器官
、器官系、もしくは体、またはその近辺で生体材料から放出される。この局面の
一つの望ましい態様において、生体材料は薬学的活性部分上にエステルまたはア
ミド結合を有し、この結合は、pH7.4、37℃の水溶液中で1時間から1年の間の半
減期を有する。関連する局面において、本発明は、哺乳類に結合部分を有する生
体材料を投与する段階を含む方法を特徴とする。生体材料は、複数の求核基を有
する標的化合物存在下、前駆成分の架橋により生成される。前駆成分は、複数の
共役不飽和基を有する重合体に結合された結合部分を含み、標的化合物は、哺乳
類内の細胞、組織、器官、器官系、または部位への標的指向性を提供する。結合
部分は、共有結合または非共有結合により薬学的活性化合物または部分を結合す
る。結合部分および結合部分に結合された薬学的活性化合物または部分は、哺乳
類の細胞、組織、器官、器官系、もしくは体、またはその近辺で生体材料から放
出される。この局面の一つの望ましい態様において、生体材料は結合部分上にエ
ステルまたはアミド結合を有し、この結合は、pH7.4、37℃の水溶液中で1時間か
ら1年の間の半減期を有する。
【００３４】 第21の局面において、本発明は、哺乳類における癒着、血栓症、または再狭窄
を予防する方法を提供する。この方法は、哺乳類の部位を前駆成分に接触させる
段階、および前駆成分をその部位に架橋する段階を含む。前駆成分は以下の式を
有する：
【化１３】 式中、Dは薬学的活性部分または結合部分であり；YはO、NH、またはNであり；L
は直鎖または分枝リンカーであり；XはOまたはNであり；Zは求核アミンまたはチ
オールが組み込まれている薬学的活性部分または結合部分であり；Pは一つまた
は複数の共役不飽和基を有する水溶性重合体または水膨潤性重合体であり；かつ
Uは重合体に結合されている求電子基への求核剤の付加産物である。薬学的活性
部分または結合部分上のエステルまたはアミド結合の半減期は、pH7.4、37℃の
水溶液中で1時間から1年の間である。様々な態様において、nは1、2、または3で
ある。
【００３５】 第22の局面において、本発明は、哺乳類における癒着、血栓症、または再狭窄
を予防する方法を提供する。この方法は、哺乳類内の部位を薬学的活性部分上に
エステルまたはアミド結合を有する生体材料に接触させる段階を含む。この結合
は、pH7.4、37℃の水溶液中で1時間から1年の間の半減期を有し、結合の切断に
より、薬学的活性部分を有する薬学的活性化合物が放出される。関連する局面に
おいて、本発明は、哺乳類内の部位を、結合部分上にエステルまたはアミド結合
を有する生体材料に接触させる段階を含む方法を提供する。この結合は、pH7.4
、37℃の水溶液中で1時間から1年の間の半減期を有し、結合の切断により、結合
部分(または結合部分から誘導される化合物)が放出される。結合部分は共有結合
または非共有結合により薬学的活性化合物または部分を結合することができる。
したがって、生体材料からの結合部分の放出により、薬学的活性化合物または部
分も放出されることになる。
【００３６】 第15から第22の局面の一つの望ましい態様において、化合物、前駆成分、また
は生体材料は、経口、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、または疾患、障害、もし
くは感染症の予防もしくは治療に適した用量を提供するのに十分な他のいかなる
経路によっても投与される。これらの局面のもう一つの望ましい態様において、
薬学的活性部分または結合部分上のエステルまたはアミド結合は、pH7.4、37℃
の水溶液中で1日から9ヶ月の間の半減期を有する。より好ましくは、半減期はpH
7.4、37℃の水溶液中で2日から6ヶ月の間、最も好ましくは、4日から3週間の間
である。これらの局面の方法を用いて治療または予防することができる一つの疾
患は癌である。好ましくは、哺乳類はヒトである。これらの局面のリンカーは、
第4から第6の局面のリンカーについて挙げられたものと同じ態様を有しうる。こ
れらの局面の薬学的活性部分または共役不飽和基は、前述の局面のいずれかにつ
いて挙げられた、対応する望ましい態様を有しうる。
【００３７】 本発明者らが米国特許出願第09/496,231号において記載しているとおり、本発
明の前述の新しい局面は、前駆成分が架橋して生体材料を生成するために、強い
求核剤と共役不飽和基との間の自己選択的共役付加反応を含んでいてもよく、該
特許出願は参照として本明細書に組み込まれる。例えば、自己選択的共役付加反
応を含む方法において、共有結合された薬学的活性部分または結合部分を有する
本発明の新規前駆成分は、複数の求核基を有する重合体存在下で架橋して共重合
体を生成することができる。加えて、本発明の方法は、新規化合物の産生のため
に、薬学的活性化合物または結合部分に結合されているか、または組み込まれて
いるチオールまたはアミン基を重合体上の共役不飽和基に結合させるために、自
己選択的共役付加反応を利用することができる。
【００３８】 本発明者らはここで、本発明者が以前に開発した重合体生体材料(2000年2月1
日出願の、米国特許出願第09/496,231号)について記載するが、これらは感受性
生物学的材料存在下で達成しうる様式で、複数の成分を重合または架橋するため
に、強い求核剤と共役不飽和との間の付加反応を利用する点で独特である。この
方法の適用例には、タンパク質およびDNAを含む薬物存在下での生体材料生成、
細胞および細胞凝集物存在下での生体材料生成、および体内または体の表面上い
ずれかにおけるインビボでの生体材料生成が含まれる。用いる強い求核剤と共役
不飽和との間の自己選択性が高いため、これらの生体材料を感受性生物学的材料
存在下で生成することが可能である。本明細書に記載の方法において、特に興味
が持たれる強い求核剤はチオールである。
【００３９】 感受性生体物質の存在下での生体材料の作製において、二つまたはそれ以上の
液体組成物を混合して反応させ、弾性固体、粘弾性固体（一般的な固体ゲルなど
、例えば、ゼラチンなどのゲル）、粘弾性液体（流動化させうる一般的なゲルな
ど、例えば、ワセリンなどのゲル）、ゲル状微粒子から構成される粘弾性液体（
Carbopol（登録商標）ゲルなど）、またはさらには、混合する二つの前駆成分の
いずれかよりも粘性がかなり高い粘性液体のいずれかを作製することができる。
前駆物質の最終物質への化学的変換は選択性が高いため、生体物質が生体それそ
のものである場合を含め、感受性生体物質の存在下で行なわれうる。
【００４０】 高い生体模倣性を有する可能性のある合成ポリマーの新規ファミリーを開発し
た。これらのポリマーは、（i）実験室またはインサイチュー移植部位のどちら
かにおいて液体前駆物質から重合性の直線状または架橋性生体材料へと変換され
ることができる；（ii）ヒドロゲルまたはより実質的に非膨潤性の材料であるこ
とができる；（iii）細胞侵入に対する牽引摩擦力をもたらす接着部位としての
役割を果たす生物活性分子を提供することができる；（iv）細胞移動時に細胞に
よって産生されるコラゲナーゼまたはプラスミンなどの酵素に反応し、材料を分
解させるためのプロテアーゼ基質部位としての役割を果たす生物活性分子を提供
することができる；（v）材料を増殖因子と結合させ、その後細胞の要求に応じ
て増殖因子を遊離させることにより、生体模倣的な方法でそれらを相互作用させ
るための増殖因子結合部位を提供することができる；および（vi）ゲルを構成す
るポリマーの骨格内部に含まれる基の加水分解または酵素的分解によってタンパ
ク質医薬を送達することができる。
【００４１】 したがって第23の局面において、本発明は生体材料の二つまたはそれ以上の前
駆成分を二つの組成物の重合が可能となる条件下で化合させることを含み、重合
が強い求核試薬と共役不飽和結合または共役不飽和基との間の求核付加による自
己選択的反応によって生じるような、生体材料を作製するための方法を特徴とす
る。各組成物の官能価は少なくとも2であり、生体材料は処理されていないアル
ブミンを含まない。さらに、共役不飽和結合または共役不飽和基は、マレイミド
またはビニルスルホンではない。
【００４２】 本発明の第23の局面の一つの態様において、組成物はオリゴマー、ポリマー、
生合成タンパク質またはペプチド、天然のペプチドまたはタンパク質、処理され
た天然のペプチドまたはタンパク質、および多糖類からなる群より選択される。
ポリマーは、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(エチレンオキシド)、ポリ(ビニ
ルアルコール)、ポリ(エチレン-co-ビニルアルコール)、ポリ(アクリル酸)、ポ
リ(エチレン-co-アクリル酸)、ポリ(エチルオキサゾリン)、ポリ(ビニルピロリ
ドン)、ポリ(ヒドロキシプロピルメタクリルアミド)、ポリ(N-イソプロピルアク
リルアミド)、ポリ(ジメチルアクリルアミド)、ポリ(エチレン-co-ビニルピロリ
ドン)、ポリ(マレイン酸)、ポリ(エチレン-co-マレイン酸)、ポリ(アクリルアミ
ド)、またはポリ(エチレンオキシド)-co-ポリ(プロピレンオキシド)ブロック共
重合体であってよい。ペプチドは接着部位、増殖因子結合部位またはプロテアー
ゼ結合部位を含みうる。
【００４３】 もう一つの態様において、組成物は強い求核試薬または共役不飽和基もしくは
共役不飽和結合を含むように官能性を付与される。好ましくは、強い求核試薬は
チオール、またはチオールを含む基である。好ましくは、共役不飽和基はアクリ
ル酸エステル、アクリルアミド、キノン、または、例えば2-ビニルピリジニウム
もしくは4-ビニルピリジニウムなどのビニルピリジニウムである。もう一つの態
様において、一つの組成物の官能価は少なくとも3である。
【００４４】 本発明の第23の局面のさらに他の態様において、本方法はさらに、前駆成分を
、接着部位、増殖因子結合部位、ヘパリン結合部位、金属イオン結合部位、また
は炭水化物結合部位（例えば、ボロン酸基）を含み、かつ強い求核試薬または共
役不飽和結合もしくは共役不飽和基のいずれかをも含む分子と化合させる段階を
含む。好ましくは、強い求核試薬はチオールである、または共役不飽和結合もし
くは共役不飽和基はアクリル酸エステル、アクリルアミド、キノンもしくはビニ
ルピリジニウムである。
【００４５】 本発明の第23の局面のさらに他の態様において、生体材料はヒドロゲルである
。生体材料は分解性であってもよい。生体材料を感受性生体分子の存在下または
細胞もしくは組織の存在下で作製してもよい。また、生体材料を動物の体の内部
または表面で作製してもよい。
【００４６】 本発明の第23の局面のさらに別の態様において、本方法はさらに、前駆成分を
重合の前に促進剤と化合させる段階を含む。また、本方法はさらに、前駆成分を
、少なくとも一つの共役不飽和結合または共役不飽和基および少なくとも一つの
アミン反応性基を含む組成物と混合することを含んでもよい。細胞または組織表
面の重合部位に対して、少なくとも一つの共役不飽和結合または共役不飽和基お
よび少なくとも一つのアミン反応性基を含む付加的な組成物を適用してもよい。
【００４７】 第24の局面において、本発明は、生体材料の二つまたはそれ以上の前駆成分を
二つの組成物の重合が可能となる条件下で化合させることによって作製される生
体材料であって、重合が強い求核試薬と共役不飽和結合または共役不飽和基との
間の求核付加による自己選択的反応によって生じるような生体材料を特徴とする
。各組成物の官能価は少なくとも2であり、生体材料は処理されていないアルブ
ミンを含まず、共役不飽和結合または共役不飽和基はマレイミドまたはビニルス
ルホンではない。
【００４８】 本発明の第24の局面の一つの態様において、組成物は、オリゴマー、ポリマー
、生合成タンパク質またはペプチド、天然のペプチドまたはタンパク質、処理さ
れた天然のペプチドまたはタンパク質、および多糖類からなる群より選択される
。ポリマーは、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(エチレンオキシド)、ポリ(ビ
ニルアルコール)、ポリ(エチレン-co-ビニルアルコール)、ポリ(アクリル酸)、
ポリ(エチレン-co-アクリル酸)、ポリ(エチルオキサゾリン)、ポリ(ヒドロキシ
プロピルメタクリルアミド)、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)、ポリ(ジメ
チルアクリルアミド)、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(エチレン-co-ビニルピロ
リドン)、ポリ(マレイン酸)、ポリ(エチレン-co-マレイン酸)、ポリ(アクリルア
ミド)またはポリ(エチレンオキシド)-co-ポリ(プロピレンオキシド)ブロック共
重合体であってよい。ペプチドは接着部位、増殖因子結合部位またはプロテアー
ゼ結合部位を含みうる。
【００４９】 本発明の第24の局面のもう一つの態様において、組成物は強い求核試薬または
共役不飽和基もしくは共役不飽和結合を含むように官能性を付与される。好まし
くは、強い求核試薬はチオール、またはチオールを含む基である。好ましくは、
共役不飽和基はアクリル酸エステル、アクリルアミド、キノン、または例えば2-
ビニルピリジニウムもしくは4-ビニルピリジニウムなどのビニルピリジニウムで
ある。もう一つの態様において、一つの組成物の官能価は少なくとも3である。
【００５０】 本発明の第24の局面のさらに他の態様において、本方法はさらに、前駆成分を
、接着部位、増殖因子結合部位、ヘパリン結合部位、金属イオン結合部位、また
は炭水化物結合部位（例えば、ボロン酸基）を含み、強い求核試薬または共役不
飽和結合もしくは共役不飽和基のいずれかをも含む分子と化合させる段階を含む
。好ましくは、強い求核試薬はチオールであるか、または共役不飽和結合もしく
は共役不飽和基はアクリル酸エステル、アクリルアミド、キノンもしくはビニル
ピリジニウムである。
【００５１】 本発明の第24の局面のさらに他の態様において、生体材料はヒドロゲルである
。生体材料は分解性であってもよい。生体材料を感受性生体分子の存在下または
細胞もしくは組織の存在下で作製してもよい。また、生体材料を動物の体の内部
または表面で作製してもよい。
【００５２】 本発明の第24の局面のさらに別の態様において、本方法はさらに、前駆成分を
重合の前に促進剤と化合させる段階を含む。また、本方法はさらに、前駆成分を
、少なくとも一つの共役不飽和結合または共役不飽和基および少なくとも一つの
アミン反応性基を含む組成物と混合することを含んでもよい。細胞または組織表
面の重合部位に対して、少なくとも一つの共役不飽和結合または共役不飽和基お
よび少なくとも一つのアミン反応性基を含む付加的な組成物を適用してもよい。
【００５３】 第25の局面において、本発明は、治療用物質を動物の細胞、組織、器官、器官
系または身体に送達する方法であって、細胞、組織、器官、器官系または身体を
本発明の第24の局面の生体材料と接触させることを含み、生体材料が治療用物質
を含んでいて、治療用物質がそれによって動物の細胞、組織、器官、器官系また
は身体へと送達されるような方法を特徴とする。
【００５４】 一つの態様において、治療用物質は、タンパク質、天然または合成性の有機分
子、DNAまたはRNAなどの核酸分子、およびウイルス粒子からなる群より選択され
る。もう一つの態様において、治療用物質はプロドラッグである。さらにもう一
つの態様において、核酸分子はアンチセンス核酸分子である。
【００５５】 第26の局面において、本発明は、細胞内殖を許容する条件下である部位に足場
を導入する段階を含む、組織を再生させる方法を特徴とする。この足場は本発明
の第24の局面の生体材料を含みうる。
【００５６】 本発明の第26の局面の態様において、足場は細胞によってあらかじめ播種され
る。組織は骨、皮膚、神経、血管および軟骨からなる群より選択されうる。
【００５７】 第27の局面において、本発明は、何らかの部位を本発明の第24の局面の生体材
料前駆成分と接触させること、およびその部位で組成物を重合させる段階を含む
、癒着、血栓症または再狭窄を防止する方法を特徴とする。
【００５８】 第28の局面において、本発明は、液体または気体の流れを封止する方法であっ
て、動物の体内のある部位を、少なくとも一つの共役不飽和結合または共役不飽
和基および少なくとも一つのアミン反応性基を含む組成物をさらに含みうる本発
明の第2の局面の生体材料前駆成分と接触させる段階、ならびにその部位で組成
物を重合させる段階を含む方法を特徴とする。
【００５９】 本発明の第28の局面の望ましい態様において、部位は肺、血管、皮膚、硬膜障
壁または腸である。
【００６０】 第29の局面において、本発明は、生体材料の前駆成分を細胞または組織と化合
させること、および組成物を重合させる段階を含む、細胞または組織を封入する
方法であって、重合が強い求核試薬と共役不飽和結合または共役不飽和基との間
の自己選択的反応によって生じ、細胞または組織が重合生体材料によって封入さ
れるような方法を特徴とする。
【００６１】 第30の局面において、本発明は、生体材料の二つまたはそれ以上の前駆成分を
二つの組成物の重合が可能となる条件下で化合させる段階を含む、生体材料を作
製するための方法であって、重合がアミンと共役不飽和結合または共役不飽和基
との間の求核付加による自己選択的反応によって生じ、各組成物の官能価が少な
くとも2であり、生体材料が処理されていないアルブミンを含まず、不飽和結合
または不飽和基がマレイミドまたはビニルスルホンでないような方法を特徴とす
る。
【００６２】 第31の局面において、本発明は、生体材料の二つまたはそれ以上の前駆成分を
二つの組成物の重合が可能となる条件下で化合させることによって作製される生
体材料であって、重合がアミンと共役不飽和結合または共役不飽和基との間の求
核付加による自己選択的反応によって生じ、各組成物の官能価が少なくとも2で
あり、生体材料が処理されていないアルブミンを含まず、不飽和結合または不飽
和基がマレイミドまたはビニルスルホンでないような生体材料を特徴とする。
【００６３】 本発明の様々な局面の態様において、重合体はPEG-オクタアクリレート、PEG-
テトラアクリレート、PEG-トリアクリレート、PEG-ジアクリレート、またはPEG-
モノアクリレートである。他の局面において、重合体はPEG-オクタアクリルアミ
ド、PEG-テトラアクリルアミド、PEG-トリアクリルアミド、またはPEG-モノアク
リルアミドである。さらに他の態様において、重合体は混合アクリレート部位お
よび混合アクリルアミド部位を含む。さらに他の態様において、nは4、5、6、7
、8、9、または10である。
【００６４】 前述の局面のいずれかの様々な他の態様において、生体材料は、薬学的活性化
合物を結合する抗体、タンパク質、核酸、または有機部分などの共有結合または
非共有結合された結合部位を含む。さらに他の態様において、生体材料は、疎水
性の薬学的活性化合物を結合するシクロデキストリンを含む。他の態様において
、結合部位はヘパリン、ヘパリン結合部分、金属イオン結合部分、炭水化物部分
、炭水化物結合部分、または疎水性基を結合する部分である。金属イオン結合部
分の例には、Cu2＋結合部分、Co2＋結合部分、およびZn2＋結合部分が含まれる
。望ましい炭水化物結合部分は、フェニルボロン酸である。もう一つの態様にお
いて、フェニルボロン酸はフェニルボロン酸のフェニル環上の二級アミンにより
生体材料に連結される。望ましい態様において、薬学的活性部分または化合物は
、生体材料における結合部分に直接または間接的に結合される。結合部分に直接
または間接的に結合されうる薬学的活性部分または化合物には、合成有機分子、
天然に存在する有機分子、核酸分子、生合成タンパク質またはペプチド、天然に
存在するペプチドまたはタンパク質、および修飾された天然に存在するペプチド
またはタンパク質が含まれる。そのような有機分子の例には、パクリタキセル、
ドキソルビシン、カンプトテシン、5-フルオロデオキシウリジン、エストラジオ
ール、2-メトキシエストラジオール、およびその誘導体が含まれる。他の態様に
おいて、金属結合部位は、タンパク質などの薬学的活性化合物に組み込まれて、
生体材料中の結合部分により結合されている金属との薬学的活性化合物の相互作
用を促進する。例えば、一つまたは複数のヒスチジン残基を薬学的活性タンパク
質に加えて、金属に対する親和性を高め、それにより生体材料への親和性を増大
させることもできる。
【００６５】 前述の局面のいずれかの様々な態様において、薬学的活性部分は、アミドもし
くはエステル結合を介して生体材料に直接結合されていてもよく、またはアミド
もしくはエステル結合を介して生体材料に結合されている結合部分との共有結合
もしくは非共有結合相互作用により生体材料に間接的に結合されていてもよい。
薬学的活性部分または化合物は、結合部分を直接結合してもよく、または結合部
分に直接結合されている分子(金属イオンまたはヘパリンなど)と相互作用するこ
とにより、結合部分を間接的に結合してもよい。
【００６６】 前述の局面のいずれかの他の態様において、生体材料は薬学的活性化合物を封
入する。薬学的活性化合物存在下で生体材料を生成することにより、薬学的活性
化合物を生体材料内に捕捉することができる。架橋材料において、重合体の網目
は、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、RNA、およびDNAなどの高分子
薬物の拡散に対する物理的バリアを形成する。網目サイズは網目の成分の設計に
よって調節することができる。例えば、PEG-トリアクリレートの大量濃縮(mass
concentrations)により生成された架橋材料は、同等の条件下でPEG-オクタアク
リレートの同等の大量濃縮により生成されたものよりも、透過性の高い網目を作
ると考えられる。したがって、高分子薬物の透過性を生体材料網目の設計によっ
て調節し、薬物の制御放出を行うことができる。
【００６７】 「生体材料」とは、身体と、その表面でまたはその内部への移植によって接触
させるための材料を意味する。好ましくは、生体材料は強い求核試薬と共役不飽
和物との間の共役付加反応によって作製される。
【００６８】 本明細書で用いる「重合」および「架橋」という用語は、多数の前駆成分分子
を連結させて分子量を実質的に増加させることを意味するように用いられる。「
架橋」はさらに、ポリマー網目構造が一般的に得られる分枝形成を示す。
【００６９】 「自己選択的」とは、反応の第1の前駆成分が反応の第2の前駆成分と反応部位
において混合物中に存在する他の組成物よりもはるかに速く反応し、かつ、反応
の第2の前駆成分が反応の第1の前駆成分と反応部位において混合物中に存在する
他の組成物よりもはるかに速く反応することを意味する。好ましくは、第1と第2
の前駆成分との反応は、第1または第2の前駆成分と、混合物中の別の組成物との
、次に最も速い反応よりも、少なくとも2倍、より好ましくは少なくとも10倍、
および最も好ましくは少なくとも50倍速い。混合物は他の生体物質、例えば、薬
物、ペプチド、タンパク質、DNA、細胞、細胞集塊および組織などを含んでもよ
い。本明細書で用いる強い求核試薬は他の生体化合物よりも共役不飽和物と選択
的に結合し、共役不飽和基は他の生体化合物よりも強い求核試薬と選択的に結合
する。
【００７０】 本発明の方法において最も高度の自己選択性が求められる場合には、チオール
が求核試薬として選択される。本発明の方法において最も高いレベルの自己選択
性が必要ではない場合には、アミンを強い求核試薬として用いてもよい。本発明
の自己選択的反応を終了させるために用いる条件は、本明細書に提示するように
、自己選択性の程度が高まるように変更することができる。例えば、低pKのアミ
ンの選択による生体材料の作製における強い求核試薬として用いる、重合させる
最終前駆物質溶液をpHがpK付近となるように処方する場合には、不飽和物と提供
されたアミンとの反応が優先的となり、これによって自己選択性が得られる。
【００７１】 「強い求核試薬」とは、極性結合作製反応において求電子試薬に電子対を供与
しうる分子を意味する。好ましくは、強い求核試薬の求核性は生理的pHでH２Oよ
りも強い。強い求核試薬の例にはチオールおよびアミンがある。
【００７２】 チオールは、高い自己選択性を示すことから、本発明に用いるのに好ましい強
い求核試薬である。細胞外において見い出されるタンパク質には立体的に接近し
うるチオールはほとんど存在しない。アミンを有しない感受性生体分子、例えば
多くの薬剤の存在下で生体材料作製反応が行われる場合には、特にアミンも有用
かつ自己選択的である。
【００７３】 「共役不飽和結合」とは、炭素-炭素、炭素-ヘテロ原子もしくはヘテロ原子-
ヘテロ原子多重結合と単結合が交互に存在すること、または官能基の合成ポリマ
ーもしくはタンパク質などの高分子との結合を意味する。このような結合は付加
反応を生じうる。
【００７４】 「共役不飽和基」とは、付加反応しうる多重結合を有する、炭素-炭素、炭素-
ヘテロ原子またはヘテロ原子-ヘテロ原子多重結合と単結合が交互に存在するこ
とを含む、分子または分子の領域を意味する。共役不飽和基の例には、アクリル
酸エステル、アクリルアミド、キノン、および例えば2-または4-ビニルピリジニ
ウムなどのビニルピリジニウムが非制限的に含まれる。
【００７５】 「実質的に純粋なペプチド」、「実質的に純粋なポリペプチド」または「実質
的に純粋なタンパク質」とは、天然の状態で付随している組成物から分離された
ポリペプチドを意味する。本明細書で用いる場合、ペプチド、ポリペプチドおよ
びタンパク質という用語は互換的に用いられる。典型的には、ポリペプチドは、
天然の状態で伴っているタンパク質および天然の有機分子を除いた割合が重量に
して少なくとも60％である場合、実質的に純粋である。好ましくは、ポリペプチ
ドは、重量にして少なくとも75％、より好ましくは少なくとも90％、そして最も
好ましくは少なくとも99％純粋である。実質的に純粋な関心対象のポリペプチド
は、例えば、天然の提供源（例えば、細胞、細胞集塊または組織）からの抽出、
所望のポリペプチドをコードする組換え核酸の発現、またはタンパク質の化学合
成によって得ることができる。純度は、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動、アガロースゲル電気泳動、光学密度またはHPLC分
析などの任意の適した方法を用いてアッセイしうる。
【００７６】 タンパク質は、天然の状態で付随している混入物から分離されている場合は、
天然の状態で伴う組成物を実質的に含まない。このため、化学的に合成されたタ
ンパク質、または天然で生じた細胞と異なる無細胞系によって産生されたタンパ
ク質は、天然の状態で伴う組成物を実質的に含まないと考えられる。したがって
、実質的に純粋なポリペプチドには、真核生物に由来するが大腸菌(E. coli)ま
たはその他の原核生物において合成されたものが含まれる。
【００７７】 「精製された核酸」とは、本発明の核酸が由来する生物体の天然のゲノムにお
いて、遺伝子の近傍に位置する遺伝子を含まない核酸を意味する。このため、こ
の用語には、例えば、ベクター、自律複製性プラスミドもしくはウイルス、また
は原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれる組換えDNA、またはその
他の配列から独立した分離分子（例えば、PCRまたは制限酵素消化によって生じ
るcDNAまたはゲノムDNAもしくはcDNAの断片）として存在する組換えDNAが含まれ
る。また、付加的なポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部で
ある組換えDNAもこれに含まれる。
【００７８】 「官能性を付与する」とは、官能基または官能部分の付加が生じるような方法
で改変することを意味する。例えば、分子を強い求核試薬または共役不飽和物に
させる分子の導入により、分子に官能性を付与することができる。好ましくは、
PEGなどの分子は官能性を付与されて、チオール、アミン、アクリル酸エステル
またはキノンとなる。
【００７９】 タンパク質には特に、ジスルフィド結合の部分的に還元または完全に還元する
ことによって遊離チオールを作り出すことにより、効果的に官能性を付与するこ
ともできる。
【００８０】 「官能価」とは、分子にある反応部位の数を意味する。本明細書で用いる場合
、強い求核試薬および共役不飽和物の官能価はそれぞれ少なくとも2であると考
えられる。官能価がそれぞれ2である二つの組成物、例えば強い求核試薬および
共役不飽和物を混合すると直線状の重合性生体材料が生じると考えられ、官能価
がそれぞれ少なくとも2であって一方の組成物の官能価が2を上回る二つの組成物
を混合すると架橋性生体材料が生じると考えられる。
【００８１】 「接着部位」とは、ある分子、例えば細胞表面の接着促進受容体が結合するペ
プチド配列を意味する。接着部位の例には、フィブロネクチン由来のRGD配列お
よびラミニン由来のYIGSR配列が非制限的に含まれる。好ましくは、接着部位は
本発明の生体材料に組み込まれる。
【００８２】 「増殖因子結合部位」とは、増殖因子または増殖因子と結合する分子が結合す
るペプチド配列を意味する。例えば、増殖因子結合部位にはヘパリン結合部位が
含まれる。この部位はヘパリンと結合し、続いてヘパリンはヘパリン結合性の増
殖因子、例えば、bFGF、VEGF、BMPまたはTGFβと結合すると考えられる。
【００８３】 「プロテアーゼ結合部位」とは、ある酵素の基質であるペプチド配列を意味す
る。
【００８４】 「アンチセンス核酸」とは、その長さとは無関係に、関心対象のタンパク質の
コード遺伝子のコード鎖に対して相補的な核酸配列を意味する。好ましくは、ア
ンチセンス核酸は細胞内に存在する場合に、関心対象のタンパク質の生物活性を
低下させることができる。好ましくは、対照と比べて少なくとも10％、より好ま
しくは25％、最も好ましくは100％低下している。
【００８５】 「生物活性」とは、タンパク質、核酸（例えば、DNAもしくはRNA）、または有
機分子のような、関心対象の分子によって媒介される機能的現象を意味する。い
くつかの態様において、これにはあるポリペプチドと別のポリペプチドとの相互
作用を測定することによってアッセイされる現象が含まれる。これには、関心対
象のタンパク質が細胞の増殖、分化、死、移動、接着、他のタンパク質との相互
作用、酵素活性、タンパク質のリン酸化もしくは脱リン酸化、転写または翻訳に
対する影響をアッセイすることも含まれる。
【００８６】 「感受性生体分子」とは、細胞内もしくは生体内において見い出される分子、
または細胞もしくは生体に対する治療薬として用いうる分子であって、他の分子
の存在下で他の分子と反応しうると考えられる分子を意味する。感受性生体分子
の例には、ペプチド、タンパク質、核酸および薬剤が非制限的に含まれる。本発
明では、生体材料を感受性生体物質の存在下で、感受性生体物質に有害な影響を
及ぼさずに作製することができる。
【００８７】 本明細書で用いる場合、「再生する」とは、組織の一部または全体が増殖して
元の状態に戻ることを意味する。例えば、本発明は、外傷、腫瘍摘出もしくは脊
椎固定術の後に骨を再生させる方法、または糖尿病性足部潰瘍、褥瘡および静脈
不全の治癒を補助する目的で皮膚を再生させるための方法を特徴とする。再生可
能と考えられるその他の組織には、神経、血管および軟骨組織が非制限的に含ま
れる。
【００８８】 「細胞移植」とは、細胞、細胞集塊または組織を対象に移植することを意味す
る。本発明の生体材料を用いることにより、対象における移植された細胞、細胞
集塊または組織を対象の防御系から分離しながら、正常な細胞機能に必要な分子
の選択的送達を行わせることが可能である。
【００８９】 「薬学的活性部分」とは、化合物に存在するアルコールまたはアミン基などの
反応性の基を含まないという点で、治療的活性化合物とは異なる種を意味する。
薬学的活性部分はDで表すことができ、治療的活性化合物はD-OH、D-NH2、または
D-NHであらわされる。
【００９０】 記号「D」は、アミドまたはエステル結合を介して生体材料に結合されている
薬学的活性部分を表すのに加えて、アミドまたはエステル結合を介して生体材料
に結合されている結合部分を表すために用いることもできる。「結合部分」とは
、薬学的活性部分または化合物を直接または間接的に結合する化合物を意味する
。例えば、結合部分は共有結合または非共有結合相互作用により薬学的活性部分
または化合物を直接結合することができる。結合部分はまた、薬学的活性部分ま
たは化合物を結合する、金属イオンまたはヘパリンなどの分子に結合することに
より、薬学的活性部分または化合物を間接的に結合することもできる。結合部分
に結合されている薬学的活性部分または化合物は、結合部分との相互作用によっ
て生体材料に結合されるため、-OH、-NH2、または-NH基を含む必要がない。この
場合、薬学的活性部分または化合物における-OH、-NH2、または-NH基は、生体材
料へのエステルまたはアミド結合に関与していなくてもよい。「結合化合物」と
は、結合部分を含む化合物を意味する。
【００９１】 「可溶性重合体」とは、複数の単量体の架橋により生成された化合物であり、
水に溶解可能な化合物を意味する。
【００９２】 「水膨潤性重合体」とは、複数の単量体の架橋により生成された化合物であり
、水に溶解しない化合物を意味する。水と重合体との相互作用により、重合体の
体積が増大する。
【００９３】 「共重合体」とは、複数の単量体から生成された重合体であり、少なくとも二
つの単量体が異なる化学式または構造を有する重合体を意味する。
【００９４】 「リンカー」とは、一連の共有結合により薬学的活性部分を重合体に結合可能
な化合物または化合物内の部分を意味する。リンカーは、薬学的活性部分に存在
する原子を結合することができるか、または一連の共有結合により薬学的活性部
分に結合されている原子を結合することができる。リンカー上の別の原子は、重
合体に結合されている共役不飽和基と反応することができるか、または共役不飽
和基と反応可能な基に結合することができる。
【００９５】 「放出速度」とは、生体材料または生体材料の成分における結合の加水分解に
よる生成速度を意味する。Dで表される、薬学的活性部分上のエステルまたはア
ミド結合が加水分解されると、化合物または生体材料の生成において用いられた
元の薬学的活性化合物が放出される。リンカー内の結合または重合体上のエステ
ル結合などの別の結合が加水分解されると、元の薬学的活性化合物の修飾型が放
出される。修飾化合物は、D-O2C-Z、D-NH-C(O)-Z、またはD-N-C(O)-Zで表すこと
ができ、ただしZは加水分解された結合とD-O2C、D-NH-C(O)、またはD-N-C(O)基
との間の成分または生体材料の一部を含む。
【００９６】 「Dから誘導される薬学的活性化合物」とは、薬学的活性部分Dを含む治療的活
性化合物を意味する。化合物は元の薬学的活性化合物と同じでもよく；D-OH、D-
NH2、またはD-NHで表され；成分または生体材料の生成に用いられる。または、
化合物は、前述のD-O2C-Z、D-NH-C(O)-Z、またはD-N-C(O)-Zで表すこともでき、
この場合、化合物は、ヒドロキシル基の代わりに-O2C-Z基、またはアミン基(NH2 またはNH)の代わりに-NH-C(O)-Zもしくは-N-C(O)-Z基を有し、これは成分または
生体材料の生成中に修飾されたものである。
【００９７】 「薬学的活性化合物またはその誘導体」とは、D-OH、D-NH2、もしくはD-NHで
表される治療的活性化合物、またはアルコールもしくはアミン基が、誘導体が前
述のD-O2C-Z、D-NH-C(O)-Z、またはD-N-C(O)-Zで表されるように修飾されている
、この化合物の誘導体を意味する。
【００９８】 「結合されている(coupled to)」とは、おそらくは一連の共有結合により、反
応する、または結合されている(attached to)ことを意味する。例えば、「重合
体に結合されている薬学的活性部分」とは、重合体と同じ分子内に存在し、かつ
重合体に直接結合されているか、または重合体に結合されているリンカーなどの
別の基に結合されている部分を意味する。薬学的活性部分は、重合体上のただ一
つの共役不飽和基に結合されると考えられる。したがって、薬学的活性部分また
は薬学的活性部分に結合されている基が重合体上の共役不飽和基と反応する場合
、この部分はその共役不飽和基と結合されると言う。薬学的活性部分を有する化
合物と反応しなかった、重合体に結合されている残りの一つまたは複数の共役不
飽和基は、「薬学的活性部分に結合されていない」と言う。
【００９９】 有機分子の「誘導体」とは、有機分子の一部を有し、かつ元の分子と同じ治療
活性を有する化合物を意味する。誘導体は、薬学的活性有機分子には存在しない
一つまたは複数の官能基を有していてもよい。加えて、誘導体は薬学的活性有機
分子に存在する一つまたは複数の官能基を有していなくてもよい。
【０１００】 「薬学的活性部分が誘導される」とは、別の化合物に結合することができる、
薬学的活性化合物中の部分を意味する。例えば、薬学的活性化合物上の、アルコ
ール、一級アミン、または二級アミンなどの反応性基は、カルボン酸を有する化
合物と反応することができ、薬学的活性部分を含む生成物を生じる。この場合、
部分は薬学的活性化合物中に存在する水素を含まず、生成物は薬学的活性部分上
のエステルまたはアミド結合を含む。
【０１０１】 「求核置換反応」とは、求核剤と求電子剤との間の反応であって、求核剤と求
電子剤との間で共有結合が形成され、求電子剤と脱離基との間で結合が切断され
る反応を意味する。したがって、求電子剤に結合されている脱離基が求核剤と置
き換わる。
【０１０２】 「フリーラジカル重合」とは、ラジカルによって開始される単量体の架橋を意
味する。ラジカルは単量体と反応し、別の単量体と反応しうるラジカルを生成す
る。
【０１０３】 「共役付加反応」とは、求核剤と共役不飽和基または共役不飽和結合との間の
反応を意味する。例えば、求核剤はα,β不飽和アルデヒドまたはケトンと反応
することができ、求核剤とβ炭素との間の共有結合および水素原子とα炭素との
間の結合が形成される。この反応では、αおよびβ炭素の間の結合も、二重結合
から一重結合に変換される。この他の例が「詳細な説明」の項に挙げられている
。
【０１０４】 「体内の部位またはその近辺」とは、放出された薬学的活性化合物が所望の領
域に局在するような、体内の部位の近くに位置することを意味する。
【０１０５】 「コロイド材料」とは、5nmよりも大きく、1μmよりも小さい寸法の共重合体
を意味する。
【０１０６】 「ミクロスフェア」とは、直径が1μmから1000μmの球形を有する生体材料を
意味する。
【０１０７】 「ナノスフェア」とは、直径が1nmから1000nmの球形を有する生体材料を意味
する。
【０１０８】 「チオールを有するように修飾された塩基」とは、チオールまたは硫黄を含む
基を有する塩基を意味する。例えば、6-クロロプリン誘導体はH2Sと反応して、
アミン基の代わりに硫黄を有するアデノシンを生成する。
【０１０９】 「修飾された天然に存在するペプチドまたはタンパク質」とは、生成物が共役
不飽和基または結合と共役付加反応により反応可能なように、チオールまたはア
ミンを有する基と反応した天然ペプチドまたはタンパク質を意味する。
【０１１０】 「精製段階」とは、生成物の純度を増大させる段階を意味する。生成物は、出
発材料、促進因子、副産物、および溶媒などの、混合物の他の成分のいくつかか
ら分離することができる。生成物は、標準的技術を用いて、サイズ、形状、電荷
、疎水性、溶解性、または沸点などの特徴に基づいて精製されうる。
【０１１１】 「縮合剤」とは、アルコールまたはアミンとカルボン酸との間の反応を促進す
る化合物を意味する。縮合剤は、カルボン酸のヒドロキシル基が、この活性化カ
ルボン酸とアルコールまたはアミンとの間の求核置換反応のためのよりよい脱離
基に変換されるように、カルボン酸と反応する。縮合剤は有機合成の分野では公
知である。
【０１１２】 「疾患、障害、または感染症を治療または予防する」とは、哺乳類に、共有結
合された薬学的活性部分を有する生体材料、生体材料の前駆成分、または化合物
を投与することを意味する。望ましい態様において、投与された前駆成分は体内
で架橋して生体材料を生成する。治療的活性化合物は、薬学的活性部分上のエス
テルまたはアミド結合などの、薬学的活性部分と重合体との間の結合の加水分解
によって、生体材料から放出される。この化合物は、症状の発症を軽減もしくは
遅延させる、または疾患、障害、もしくは感染症の原因を除去もしくは予防する
ことができる。
【０１１３】 本発明の生体材料、生体材料の前駆成分、または化合物が特定の投与様式、用
量、または投与頻度に限定されることは意図されておらず、本発明の様式は経口
、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、または疾患、障害、もしくは感染症の予防も
しくは治療に適した用量を提供するのに十分な他のいかなる経路も含む、すべて
の投与様式を企図する。一つまたは複数の生体材料、前駆成分、または化合物を
哺乳類に、単回用量または反復用量で、場合によっては薬学的安定化化合物存在
下で投与することができる。反復用量を投与する場合、用量は互いに、例えば、
1週間から1ヶ月隔てることもできる。いかなる特定の被検者についても、個人の
必要性、および組成物の投与を行う、または投与を管理する者の専門家としての
判断に従い、具体的な投与法を経時的に調節しなければならないことが理解され
るべきである。
【０１１４】詳細な説明 I．生体材料のインビボ合成または適用 生体材料の作製のために用いた化学反応系 生体材料の二つまたはそれ以上の前駆成分をインサイチューまたは感受性生体
物質の存在下で自己選択性の高い方法で重合または架橋（この二つの用語を本明
細書では同義語として用いる）させるための新規化学反応スキームを開発した。
一般には二つの前駆成分を混合する。これらの二つの前駆成分は反応速度におい
て自己選択的である（すなわち、第1の前駆成分は感受性生体物質における他の
組成物よりも第2の前駆成分とはるかに速く反応し、しかも、第2の前駆成分は感
受性生体物質における他の組成物よりも第1の前駆成分とはるかに速く反応する
）。これらの前駆成分の官能価がいずれも少なくとも2であってその一方の官能
価が2を上回る場合には、その系は自己選択的に反応して架橋性生体材料を作製
すると考えられる。「官能価」という用語は本明細書では、ポリマー科学で用い
られる意味（すなわち、反応部位の数）で用いられる。したがって、官能価がそ
れぞれ2である二つの組成物を混合すると直線状の重合性生体材料が生じると考
えられ、官能価がそれぞれ少なくとも2であって組成物の一方の官能価が2を上回
る二つの組成物を混合すると架橋性生体材料が生じると考えられる。両種類の生
体材料とも、有用でありうる。
【０１１５】 架橋性生体材料の場合には、組成物が極めて親水性であっても全材料は完全な
固体として存続し、体内全体には分散しないことが可能である。このような非分
散系が直線状の重合性生体材料に望まれる場合には、結果として得られる生体材
料も水または体液に不溶性であるように、少なくとも一つの前駆成分が疎水性で
あると有用である。例えば、二つの前駆成分が別の方法で相互作用して不溶性と
なる場合、または前駆物質の一方もしくは両方がpH、温度もしくは他の刺激に反
応して溶解性が上昇もしくは低下する場合、または一方の前駆成分がポリカチオ
ンで他方の前駆成分がポリアニオンである場合、または一方の前駆成分が他方と
強い水素結合を生じる場合に、他のアプローチも可能である。
【０１１６】 本発明の化学反応系では、一方の組成物が強い求核試薬を有し、他方の組成物
が共役不飽和物または共役不飽和物を有する付加反応を利用する。本発明におい
て強い求核試薬として特に関心対象であるのはチオールである。好ましくは、こ
の系ではチオールと共役不飽和物（例えば、アクリル酸エステルまたはキノン）
との間の共役付加反応を利用する。この反応系は自己選択的なものにすることが
でき、すなわち、関心対象の大半の感受性生体化合物（大半の薬剤、ペプチド、
タンパク質、DNA、細胞、細胞集塊および組織）において見い出される他の化学
基とは実質的に反応しない。これは、これらの組成物の一方または両方がポリマ
ーまたはオリゴマーである場合に特に有用であるが、他の可能性も本明細書に示
している。
【０１１７】 大部分のタンパク質は、側鎖の末端にチオールが存在するアミノ酸であるシス
テインを含んでいる。これにもかかわらず、ほとんどのタンパク質には遊離チオ
ールが存在せず；ほとんどのタンパク質は偶数のシステイン残基を含み、これら
は後に対になってタンパク質の種々の領域との間にジスルフィド架橋を形成する
。タンパク質の中には奇数のシステイン残基を含むものもあるが、これらの大部
分はジスルフィド結合性二量体として存在し、そのうえ天然のタンパク質には遊
離チオール残基は存在しない。このため、タンパク質に存在する遊離チオールの
数は極めて少ない。グルタチオンなどのいくつかの重要な電子伝達分子は遊離チ
オールを含むが、これらの分子の細胞内での空間的配置は一般に限られている。
したがって、細胞外に存在する共役不飽和構造は生理的条件に近い条件ではほと
んどのタンパク質と実質的に反応しないと考えられる。アミンも求核試薬である
が、求核試薬としてはチオールほど優れてはいない。反応環境のpHはこれを考慮
すると重要である。特に、非プロトン化アミンは一般にプロトン化アミンよりも
優れた求核試薬である。生理的pHでは、リジン側鎖上のアミンはほぼ完全にプロ
トン化されており、このため反応性はそれほど高くない。ペプチドおよびタンパ
ク質のN末端のαアミンは側鎖εアミンよりもpKがはるかに低く、このため、生
理的pHでは、これはリジン側鎖のεアミンよりも共役付加に対する反応性が高い
。
【０１１８】 しかしながら、チオールは実質的にプロトン化アミンよりも反応性が高い。上
記のようにpHはこれを考慮すると重要であり、脱プロトン化チオールは実質的に
プロトン化チオールよりもかなり反応性が高い。以上から、アクリル酸エステル
またはキノンなどの共役不飽和物とチオールとの反応によって二つの前駆成分を
生体材料へと変換させる付加反応は、関心対象のチオールのほとんどが脱プロト
ン化され（このため反応性がより高くなり）、しかも関心対象のアミンのほとん
どはプロトン化された状態に保たれる（このため反応性が低い）、ほぼpH 8で（
すなわち最も速く、最も自己選択的に）行われることがしばしばであると考えら
れる。チオールを第1の組成物として用いる場合には、アミンと比べてチオール
との反応性に対して選択的である共役構造が非常に望ましい。
【０１１９】 共役構造が細胞外で保たれる場合には、反応し、その結果毒性を誘発する反応
性求核試薬の数は極めて少ない。この空間的制限は一般に、共役組成物を高分子
量にすること、親水性にすること、またはその両方によって実現可能である。
【０１２０】 ポリエチレングリコール（PEG）は極めて好都合な構成単位を提供する。直線
状（末端が二つあることを意味する）または分枝状（末端が二つを上回ることを
意味する）のPEGは容易に購入または合成でき、続いてPEG末端基に官能性を付与
してチオールなどの強い求核試薬またはアクリル酸エステルもしくはキノンなど
の共役構造を導入することができる。これらの組成物を互いに混合すると、また
は対応する組成物と混合すると、ヒドロゲル材料が作製されると考えられる。PE
G組成物を非PEG組成物と反応させて、結果として得られる生体材料の物理的特性
、透過性および含水量を操作するために、いずれかの組成物の分子量または親水
性を調節することもできる。これらの材料は一般に、以下にさらに詳細に述べる
医療用インプラントに有用である。
【０１２１】 生体材料、特にインビボでの分解が望ましい生体材料の形成においては、ペプ
チドが非常に好都合な構成単位を提供する。二つまたはそれ以上のシステイン残
基を含むペプチドを合成することは簡単であり、続いてこの組成物を生体材料、
特にヒドロゲル生体材料の求核性前駆成分として容易に利用することができる。
例えば、二つの遊離システイン残基を有するペプチドは、生理的pHまたはそれよ
りもわずかに高いpH（例えば8〜9；ゲル化はさらに高いpHでも進行すると考えら
れるが、自己選択性が損失するおそれがある）の下でPEGトリアクリル酸エステ
ルと混合すると、容易にヒドロゲルを作製すると考えられる。二つの液体前駆成
分を混合すると、それらは数分間にわたって反応し、網目構造の結節点を有する
PEG鎖の網目構造からなり、ペプチドが結合部として存在する弾性ゲルを作製す
る。タンパク質をベースとする網目構造の場合と同じように網目構造が細胞によ
る浸潤および分解を受けるように、ペプチドをプロテアーゼ基質として選択する
ことができる。このゲル化は自己選択的であり、すなわちペプチドはほとんど他
の組成物ではなくPEG組成物と反応し、PEG組成物はほとんど他の組成物ではなく
ペプチドと反応する。必要に応じて、他種のもの（例えば、組織表面）との化学
結合を提供するように生体機能性物質を設計して組み込むことも可能である。こ
れらのゲルは操作的には作製が容易であり、一方がペプチドを含み、他方が官能
性を付与されたPEGを含む、二つの液体前駆物質を混合する。この例では、生理
食塩水を溶媒として利用することができ、反応によって生じる熱が極めてわずか
である上、PEGトリアクリル酸エステルもペプチドも容易に細胞内には拡散しな
いため、ゲル化は組織と直接接触した状態で有害な毒性を引き起こすことなく、
インビボまたはインビトロで行うことができる。テレケリック的に修飾された、
または側基が修飾された、PEG以外のポリマーも用いうることは明らかである。
【０１２２】 プロテアーゼ部位 本発明の化学架橋スキームの一つの特別な特徴は、それが自己選択的であるこ
と、すなわちそれがペプチドまたはタンパク質上の他の特徴となるものとは反応
しないことである。したがって、上記の通りに、ペプチド上のシステイン残基以
外の側基とは化学的に反応しないペプチドを一つの組成物として用いることがで
きる。このことは、結果として得られる生体材料構造に種々の生体活性ペプチド
を組み込むことができることを意味する。例えば、架橋用のジチオールとして用
いるペプチドを、組織移動時および組織再編成時に細胞が用いる酵素の基質であ
るように設計することができる（例えば、プラスミン、エラスターゼ、またはコ
ラゲナーゼなどのマトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）の基質のような）
。ゲルの分解特性は、架橋結節点として利用するペプチドの細部を変更すること
によって操作可能である。コラゲナーゼによって分解されるがプラスミンによっ
ては分解されないゲル、またはプラスミンによって分解されるがコラゲナーゼに
よっては分解されないゲルを作製することができる。さらに、酵素反応のKｍも
しくはkcatまたはその両方が変化するようにアミノ酸配列を単に変更することの
みによって、このような酵素との反応によるゲルの分解を速くまたは遅くするこ
ともできる。このため、細胞の通常の再編成特性による再編成されうるという点
で生体模倣的な生体材料を作製することが可能である。
【０１２３】 接着部位 細胞接着のためのペプチド部位、すなわち細胞表面の接着促進受容体と結合す
るペプチドを本発明の生体材料に組み込むことができる。フィブロネクチン由来
のRGD配列またはラミニン由来のYIGSR配列などの、このような種々の接着促進ペ
プチドを組み込むことは容易である。上記の通り、これは例えば、残りのチオー
ル含有前駆成分と混合する数分前に、システイン含有ペプチドをPEGジアクリル
酸エステルもしくはトリアクリル酸エステル、PEGジアクリルアミドもしくはト
リアクリルアミドまたはPEGジキノンもしくはトリキノンと単に混合することに
よって行える。この最初の段階の間に、接着促進ペプチドは共役不飽和物による
多数の官能性を付与されたPEGの一端に組み込まれると考えられ、残りの多価チ
オールを系に加えると架橋網目構造が作製されると考えられる。このため、例え
ば、システイン一つを含む接着性ペプチドをPEGトリアクリル酸エステルと混合
し（例えば、アクリル酸エステル末端基1モル当たり0.1モルのペプチドの割合で
）、続いてシステイン残基二つを含むプロテアーゼ基質ペプチドを添加して三次
元網目構造を作製させると（例えば、アクリル酸エステル末端基1モル当たり等
モルより0.1モル少ないペプチドの割合で）、結果として得られる材料は高い生
体模倣性を有すると考えられる。すなわち、組み込まれた接着部位およびプロテ
アーゼ部位が共存することにより、細胞がインビボで細胞外基質において通常行
っているのと全く同じように、細胞が移動用の経路を分解しながら作成する際に
材料において牽引摩擦力を成立させることが可能となる。この場合には、接着部
位は側基として材料に組み込まれる。また、接着部位を材料の骨格に直接組み込
むことも可能である。これを行える方法は一つにとどまらない。一つの方法は、
接着性ペプチドまたはタンパク質に二つまたはそれ以上のチオール（例えば、シ
ステイン）を含めることである。または、PEGなどのポリマー上に接着性ペプチ
ドを直接合成し（例えば、液相化学を用いて）、一つの鎖末端当たり少なくとも
一つのチオール（例えば、システイン）または共役不飽和物を含めることも可能
と考えられる。
【０１２４】 増殖因子結合部位 本発明の生体材料の生体模倣性は、特にそれらをヒドロゲルとなるように水溶
性組成物から作製する場合には、増殖因子結合ドメインを組み込むことによって
さらに増大させることが可能である。例えば、ヘパリンを結合させるためにヘパ
リン結合性ペプチドを用いることができ、続いてこのヘパリンを用いて、bFGF、
VEGF、BMPまたはTGFβなどのヘパリン結合性増殖因子を結合させることができる
。このため、ヘパリン結合性増殖因子、ヘパリンおよび活性化ヘパリン結合性ペ
プチドを活性化PEG（前の項に述べたものと同様のもの）を混合する場合には、
その結果得られるゲルは、浸潤細胞がゲルの分解によって増殖因子を放出させる
までその大半を保持しながら、増殖因子を徐々に放出すると考えられる。増殖因
子の貯蔵所としての役割を果たし、損傷時に局所的細胞活動によってそれを放出
することは、細胞外基質のインビボでの通常の機能の一つである。ヘパリン結合
性増殖因子を隔離するためのもう一つの類似した方法は、より直接的に、増殖因
子と直接結合する共有結合的に組み込まれたヘパリン模倣物、例えば負に荷電し
た側鎖を有するペプチドなどを用いることによるものであると考えられる。さら
に、生体材料はそれ自体が網目構造であるため、それを用いて、単に物理的に組
み込まれた、分解もしくは拡散、またはその組み合わせによってによって徐々に
放出される、増殖因子を放出させることもできる。ゲル化化学作用は自己選択的
であるため、増殖因子それ自体および他の生体活性ペプチドはその生物活性が消
失するような化学的修飾を受けないことを理解する必要がある（実施例29）。自
己選択性のこの重要な様相により、例えば、増殖因子をポリマー粒子内に封入す
る必要性（ゲル化化学作用が、タンパク質中のリジン側鎖上に存在するεアミン
のように増殖因子上に遊離した形で存在する側基と反応させるものである場合に
、それをゲル化化学作用から保護するために）はなくなる。
【０１２５】 共役付加反応によって作製されるヒドロゲルからの薬物送達 ヒドロゲルはタンパク質医薬の送達には特に有用である。ヒドロゲルは生体適
合性があり、タンパク質の変性を最小限に抑えるタンパク質に対して穏和な環境
を提供する。チオールとの共役付加反応はタンパク質の存在下でゲルを作製する
ために用いられるが、これはこれらの反応の自己選択性が求核性置換反応、フリ
ーラジカル反応または反応性を得るためにアミンを含む反応に比べて高いためで
ある。このため、タンパク質はゲル中に物理的に埋め込まれる。さらに、ヒドロ
ゲルを構成するポリマーの内部に分解性部分を組み込むこともでき、この際には
ゲル内部の部分の分解により、ゲルの分解に伴ってタンパク質が放出されると考
えられる。本発明の一つの特に有用な態様は、共役付加反応それ自体によって特
に加水分解を受けやすい構造が得られる場合に生じる。
【０１２６】 大半の場合には、タンパク質医薬、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドも
しくは遺伝子などの高分子医薬は、ポリ乳酸などの分解性疎水性材料から送達さ
れる。しかし、本発明者らは、チオール、共役不飽和物またはその両方による官
能性が付与された架橋性ポリエチレングリコールなどの、より親水性の高い材料
を記載する。光架橋性ポリエチレングリコール（Pathakら、Journal of the Ame
rican Chemical Society 114：8311〜8312、1992）、および求核性置換反応によ
って架橋されたポリエチレングリコール（Zhaoら、Polymer Preprints 38：526
〜527、1997；国際公開公報第99/2270；国際公開公報第99/34833号および国際公
開公報第99/14259号）を含む他の例も存在する。チオールとの共役付加反応を介
した架橋は、タンパク質中の共役基とアミンなどの他の基との間の反応が極めて
遅いという点で優れた自己選択性を示す。組み込もうとするタンパク質が遊離チ
オールを含む場合には、別の方法で保護または反応させない限り、これは生体材
料系と反応すると考えられる。
【０１２７】 タンパク質の封入および放出を目的としてチオールとの共役付加によって作製
される生体材料を用いるほかの利点には、共役付加架橋によって生じる基の化学
的性質によるものがある。共役基がアクリル酸エステルである場合には、比較的
不安定なエステルが系に存在する。アクリル酸エステルにフリーラジカル架橋を
行うと、この種のゲルはpH 7.4および37℃では分解が極めて遅く、ゲルが分解す
るのに約1年間かかることが明らかになっている。しかし、アクリル酸エステル
基をチオールと反応させると、アクリル酸エステル基エステル加水分解による半
減期は約3週間であり、約3週間で分解するゲルが生じる（以下に述べる）。フリ
ーラジカル架橋の場合には、ゲルの分解を促進させるためにポリエチレングリコ
ールとアクリル酸エステルとの間に特別な基を含める必要があるが（ポリ乳酸オ
リゴマーなど；Pathak、前記）、一方、共役付加架橋の場合にはアクリル酸エス
テルとポリエチレングリコールとの間に特別な基は必要でない。共役不飽和物と
ポリマーとの間により安定なリンカーを用い、続いてグリコール酸、乳酸、εカ
プロラクトンまたはトリメチレン炭酸エステルのオリゴマーなどの加水分解によ
って分解されるドメインをポリマーと共役不飽和物との間に組み込むことにより
、これらのドメインの分解による生体材料の分解を得ることができる。
【０１２８】 ヒドロゲルの生物医学的応用 ヒドロゲルは水によって大きく膨潤する重合性材料である。ヒドロゲルは多く
の用途に対して特に有用である。ヒドロゲルは極めて多くの生物医学的応用に対
して関心がもたれている。これらには、障壁用途（癒着予防薬、密封剤）、薬物
送達装置、組織工学用および創傷治癒用の足場、細胞封入および移植用の材料、
組織の外科的補強用の材料、および密封剤および接着剤としての材料が非制限的
に含まれる。生物医学におけるヒドロゲルの応用に関して不完全ながらも例示的
なリストを以下に示す。
【０１２９】 1．接着予防用のヒドロゲルは、術後またはその他の外傷後の望ましくない接
着を最小限に抑えるために望まれる。このような接着はタンパク質性もしくは細
胞性またはその両方でありうる。例えば、術後腹骨盤癒着は慢性痛、腸閉塞およ
び不妊につながるおそれがある。第2の例として、血管系におけるバルーン血管
形成術後の血小板と血管壁表面との望ましくない接着は血栓症および再狭窄につ
ながるおそれがある。外科手術部位でインサイチューで治癒した材料は術後癒着
の予防に、特にこれらの材料が数日から数週間かけて分解する場合に有用と考え
られる。損傷動脈の表面でインサイチューで治癒した材料は、カテーテル介在、
ステント配置または外科手術に伴う血管外傷部位での血栓症の予防に有用と考え
られる。
【０１３０】 2．接着剤または密封剤としてのヒドロゲルは、（気相または液相）液体含有
腔を分離している組織における漏出を封止するために望ましい。いくつかの例に
血管、皮膚、肺、硬膜障壁および腸がある。この材料は内用として例えば肺の空
気漏出の封止にも有用であり、外用として例えば皮膚の切開部の閉鎖にも有用と
考えられる。
【０１３１】 3．ヒドロゲルは局所的な薬物送達装置としても有用と考えられる。薬物は任
意の生物活性分子、例えば、天然物、合成薬、タンパク質（増殖因子または酵素
など）、または遺伝物質であってよい。このような薬物の機能特性はその担体に
よって保持される必要がある。薬物の放出は、拡散機構、種々の機構によるゲル
担体の分解（加水分解または酵素的分解など）または他の感知機構（例えば、pH
誘導性の膨潤）によるものでよい。多くの薬物は反応基を含むことから、担体と
しての役割を果たす材料は本材料と望ましくない様式では反応しないことが重要
である。このため、共役不飽和物とチオールとの間の反応の自己選択性の高さは
薬物封入において極めて有用である。実施例29は、タンパク質（例えば、ウシ血
清アルブミン）が、捕捉によって共有結合的に修飾されることなく、ヒドロゲル
の形成時に封入されうることを例示する。さらに、タンパク質は非修飾型でヒド
ロゲルから放出されうる。
【０１３２】 放出速度は特定の臨床的適応に関して最適化されうる。例えば、加水分解可能
なリンカーまたはプロテアーゼ切断部位は、ハイドロゲルに組み込まれて放出速
度を増大させうる。さらに、ポリマーの分子量、ポリマーの濃度、またはハイド
ロゲル形成に使用されるポリマーの機能性を変化させることによって、放出速度
を改変することができる。
【０１３３】 4．足場としてのヒドロゲルは、組織工学および創傷治癒の用途、すなわち神
経再生、血管新生ならびに皮膚、骨および軟骨の修復および再生のために望まし
い。このような足場は細胞をあらかじめ播種した体内に導入してもよく、材料の
外側から移植した生体材料の付近の組織中への細胞侵入に依存してもよい。この
ような足場は、接着性ペプチドおよび増殖因子などの細胞相互作用性分子を（共
有結合または非共有結合によって）含んでもよい。
【０１３４】 5．ヒドロゲルには細胞移植装置としての生物医学的用途もある。このような
装置は、細胞（例えば、同種移植片または異種移植片）を宿主の防御系から分離
しつつ（免疫防御）、酸素、二酸化炭素、グルコース、ホルモンおよびインスリ
ンならびに他の増殖因子などの分子の選択的送達を可能にし、これによって封入
された細胞が正常な機能を保持し、免疫防御性ヒドロゲル膜を介したレシピエン
トへの拡散可能な治療用タンパク質を放出するといった望ましい利点が得られる
という役割を果たす。
【０１３５】 6．ヒドロゲルをその環境に対して反応性にすることができる。最初に注入さ
れた際に組成物は水を含む上に水溶性であるため、ゲルと組織との間の網目構造
の形成が増加し、それによって付着性が高まるようにそれらを設計することがで
きる。活性刺激（例えば、温度またはpH）が遷移すると、前駆物質の一方または
両方が水不溶性となって平均含水量が減少し、結果として得られるゲルの剛性の
増加および力学特性の改善がもたらされる。
【０１３６】 上記で引用されたこれらの例の一部においては、治療用ヒドロゲルを体内の最
終的目標部位で作製させることが望ましい。このため、液相として標的部位に注
入し、そこで固体材料に変換することができる移植可能な材料には関心がもたれ
る。このようなインプラントの形状は組織の形態に適合させることができ、侵襲
性が非常に低い方法によって比較的大きなインプラントを送達することが可能で
ある。しばしば、基盤となる組織基質との良好な接着は、例えば、組織表面の構
造への液体前駆物質の直接浸透により、または生体材料ポリマー網目構造と同じ
くポリマー網目構造である天然組織細胞外材料との間に相互浸透ポリマー網目構
造を作製させる相相互浸透によって得ることができる。また、接着性を増大させ
るためのカップリング剤としての役割を果たす付加的な材料を設計することも可
能である。例えば、活性化エステル（N-スクシンイミジル活性化エステル誘導体
のような）またはエポキシド基を一方の端に有し、アミンと緩徐に反応する共役
構造をもう一方の端に有するヘテロ二官能カップリング剤を設計することができ
る。このような薬剤は組織表面に適用すると組織表面上のタンパク質と反応し、
続いて重合または架橋の際に化学的組み込み用の共役基を生体材料の網目構造に
固定すると考えられる。この前処理段階によって、最終的な前駆物質溶液の二つ
の組成物間の自己選択的架橋に関与しうると考えられる化学基が組織表面に導入
されると考えられる。
【０１３７】 ヒドロゲルを含む生体材料を作製させる方法は数多くある。しかし、細胞また
は組織を含む感受性生体物質と接触した状態で作製される材料、または移植もし
くは身体との他の接触を意図している材料には特別な制約が課せられる。以下の
本文では、生体材料ヒドロゲルの特殊な有用性のために、生体材料ヒドロゲルの
作製状況を考察する。非ヒドロゲル材料についてもアプローチは一般に同じであ
り、以下に述べるアプローチは一般化が可能であると理解される必要がある。網
目構造の形成過程は、溶媒系、温度および発熱性ならびにpHに関して比較的穏和
な条件で進行する必要がある。前駆物質および（ゲル化化学作用およびゲル分解
の）作製物は実質的に無毒性である必要があり、ここで毒性は医学的に関連のあ
る文脈で医学的に関連のある組織反応を誘発することと定義される。
【０１３８】 生体材料の作製のためにチオールとの共役付加反応を用いる本明細書に述べる
アプローチによって、ゲル形成の方法は容易になり（光および温度の変更が必要
ない）、自己選択的であることによって有用性が大きく高まる（バイオ医薬品と
して組み込まれたタンパク質、または細胞および組織表面に存在するタンパク質
とは一般に反応しない）。さらに、自己選択性があるために、例えば、プロテア
ーゼ切断部位（分解のため）、細胞接着部位またはヘパリンもしくは増殖因子の
結合部位として、生体材料それ自体にペプチドをはるかに柔軟な形で組み込むこ
とが可能である。
【０１３９】 インサイチュー架橋が望ましいがヒドロゲルは望ましくない医療分野において
、数多くの用途が存在する。これらには、強度の高い材料が望ましい用途が含ま
れうる。強度の高いヒドロゲルは作製可能であるが、一般に非ヒドロゲル材料の
方が強度は高い。これらの材料は、酢酸エチル、低分子量PEGなどの低毒性非水
性溶媒の存在下で本発明のスキームを用いる架橋によって、または溶媒を用いず
に液体前駆物質からの適切な架橋によって入手可能である。例えば、加水分解に
よって分解される強度の高い材料は、疎水性組成物として低分子量ポリ(ε-カプ
ロラクトン)ジアクリル酸エステル（これは液体である）から作製しうると考え
られる。このような材料は直線状の重合性生体材料でもよく架橋性の重合性生体
材料でもよい。また、これをpH、温度または他の操作可能な刺激に対する感受性
を示す前駆物質を用いて成し遂げてもよい。これにより、前駆物質は適用の後/
間に可溶性形態から不溶性形態への変換を生じると考えられる。これによって取
り扱いが容易となり、非ヒドロゲル（含水量が少ない）材料を用いることによっ
て力学特性の改善が可能となる。
【０１４０】 チオールとの共役付加を用いて、インサイチューでかなりの力学強度を有する
構造材料を調製することが可能である。高い架橋密度および/または少ない含水
量を用いた場合には、高い力学強度を有するゲルまたは材料を得ることができる
。水溶性が低いまたは非水溶性の多官能性低分子量前駆物質を化合させることに
より、強度の高い架橋材料を作製させることが可能である。これらの不溶性また
はわずかに可溶性の前駆物質は、それらが液体である場合には、乳化剤の存在下
または非存在下で水相において分散させることによって化合させることができる
。この乳化剤はソルビタンモノオレイン酸エステルなどの無毒性または毒性が極
めて低い界面活性剤でもよく、アルブミンなどのタンパク質でもよい。無機粒子
もこのような前駆物質の水中分散を補助しうる。この方法によって得られる構造
ゲルの力学特性は、無機粒子、親水性または疎水性添加剤の添加によって、また
は多様な分子量の前駆物質（多数の分子量が小さい前駆物質）の使用によって改
変可能である。無機粒子の添加によって架橋材料の剛性が高まり、材料の極限強
さおよび耐疲労性を増大させることができる。親水性添加剤の添加によって含水
量を高め、材料を軟化させることができる。化学的組成によっては、疎水性添加
剤の添加によってゲルの含水量を減らし、材料の硬度および/または強度を増大
させることができる。これを弾性を増大させるために用いることもできる。架橋
密度は最初の前駆物質の分子量によって影響を受けさせることができる。分子量
が増すと架橋密度を低下することができ、これを利用して最終的な生体材料の力
学特性を調節することができる。
【０１４１】II．架橋化学作用 本明細書で用いる場合、記号Pは二つの反応部位の間に位置する（テレケリッ
クの意味で）、または反応部位が接合した（グラフトの意味で）分子の部分を示
すために用いられる。テレケリックポリマーの場合、Pは二つのチオールなどの
二つの強い求核試薬の間、または二つの共役不飽和物の間に位置すると考えられ
る（例えば、PEGジアクリル酸エステルまたはPEGジチオールの場合には、PはPEG
鎖である）。PEGトリキノンまたはトリチオールの場合には、Pは3つの分枝を有
する分枝状PEGである。ブロック共重合体性のアクリル酸エステル-(乳酸オリゴ
マー)PEG-(乳酸オリゴマー)-アクリル酸エステルまたはキノン-(乳酸オリゴマー
)-PEG-(乳酸オリゴマー)-キノンの場合、Pは(乳酸オリゴマー)-PEG-(乳酸オリゴ
マー)ブロック共重合体である。共役不飽和物または強い求核試薬のいずれかが
、剛毛が先端にある瓶洗いブラシのような構造をポリマーが有するグラフト共重
合体の場合には（例えば、ポリリジン-グラフト-(PEGアクリル酸エステル)また
はポリリジン-グラフト-(PEGキノン)またはポリリジン-グラフト-(PEGチオール)
）、Pはポリリジン-グラフト-(PEG)である。Pは側鎖内に反応性基を提示するこ
ともできる：側鎖内にアルコールまたはアミンを有するすべてのポリマーは、例
えば、共役付加反応のための多数の共役不飽和基を提示させるために、容易にア
クリル酸エステル化することができる。カルボン酸を含むポリマーは誘導体化し
て、例えばキニン基を露出させることができる。Pは用語の通常の意味で重合性
である必要はない。例えば、エチレングリコールジアクリル酸エステルまたはジ
キノンの場合、Pはエチレン単位である。例えば （配列中、Cはアミノ酸システインであり、XおよびYは、XXXXXX（配列番号：3）
がコラゲナーゼなどのプロテアーゼの基質として作用する配列となるような他の
アミノ酸である）などのペプチドの場合、PはXXXXXXである。XXXXXXの長さまた
はXの数（例えば、Xｎ）は任意の長さまたは数（n＝0）でありうる。1,2エチレ
ンジチオールの場合、Pはエチレンである。このように、Pは前駆成分にある二つ
またはそれ以上の反応性基の間に介在する前駆成分の分子部分である。これがポ
リマー性またはオリゴマー性である場合にはしばしば好都合であるが、いずれの
場合も必ずしも必要ではなく、低分子も関心がもたれる上に有用である。用いう
る低分子の例には、完全または部分的にアクリル酸エステル化しうる、またはβ
-メルカプトプロピオン酸と反応してチオールを生じうる、マンニトール、エリ
スリトール、ペンタエリスリトール、トリメチロールプロパンおよびグリセロー
ルなどの還元糖または類似の化合物が非制限的に含まれる。EDTA、クエン酸、コ
ハク酸およびセバシン酸などの多カルボン酸はキノンに変換可能である。
【０１４２】 マイケル型反応の定義 共役不飽和系に対する求核試薬の1,4付加反応はマイケル型反応と呼ばれる。
付加機序は純粋に極性的であってもよく、ラジカル様中間状態を介して進行して
もよく、ルイス酸または適切に設計された水素結合種は触媒として作用しうる。
共役という用語は炭素-炭素、炭素-ヘテロ原子もしくはヘテロ原子-ヘテロ原子
多重結合と単結合が交互に存在するもの、または官能基の合成ポリマーもしくは
タンパク質などの高分子との結合のいずれをも意味する。CHまたはCH2単位によ
って隔てられた二重結合はホモ共役二重結合と呼ばれる。
【０１４３】 共役不飽和基に対するマイケル型付加は、種々の求核試薬により、室温または
体温において穏和な条件下で定量的収量が得られる程度に良好に起こる（Pathak
、前記；Mathurら、Journal of Macromolecular Science-Reviews In Macromole
cular Chemistry and Physics、C36：405〜430、1996；Moghaddamら、Journal o
f Polymer Science：Part A：Polymer Chemistry 31：1589〜1597、1993；およ
びZhoa、前記）。アミノ-またはメルカプト-基によるマイケル型反応によってPE
Gまたは多糖類をタンパク質と結合させるために、ビニルスルホン（Pathak、前
記）またはアクリルアミド（Mathur、前記）などの共役不飽和基が用いられてい
る。
【０１４４】 本発明の革新性は、生体材料前駆物質の生体適合性のあるゲル化による生体材
料の作製が、自己選択的な様式でチオールと反応する種々の共役不飽和化合物の
使用によって迅速に得られることにある。ゲル作製反応速度ならびに作製物の力
学特性および送達特性は用途の必要性に応じて調整される。主としてタンパク質
分解的に分解される材料を得るために、またはその内部での特異的認識過程のた
めに、タンパク質性もしくはペプチド性材料を組み込む可能性も想定されるが、
これは主として意図的に組み込まれたシステイン残基との反応によるものである
。純粋なタンパク質のPEG化は本発明の範囲に含まれないが、これはそれによっ
て生体材料を生じないためである。マレイミドおよびビニルスルホンなどの基は
これらの架橋反応に有用であるが、これらは他の求核試薬と比べて、例えば以下
に述べる共役系のいくつかと比べてアミンとの反応速度が相対的に高いため、他
のものよりは有用性が低い傾向がある。このため、キノンおよびアクリル酸エス
テルを含む、全体的反応性が低い共役不飽和物の使用。
【０１４５】 共役不飽和構造 種々の共役不飽和化合物に対してマイケル型付加反応を行うことができる。以
下に示す構造では、オリゴマー性またはポリマー性の構造をPとして示している
。Pの具体的実体に関する種々の可能性については本明細書でさらに考察する。P
は1〜20の番号を付したものなどの構造における反応共役不飽和基とのカップリ
ングが可能である。
【０１４６】 図面中、Pの末端にはCH2、CHまたはC基があるものとする。
【０１４７】 反応性二重結合は、直線状ケトン、エステルまたはアミド構造中の一つもしく
は複数のカルボニル基（1、2）、またはマレイン酸もしくはパラキノイド誘導体
におけるように環状系と共役させることができる（3、4、5、6、7、8、9、10）
。後者の場合には環を融合させてナフトキノン（6、7、10）または4,7-ベンズイ
ミダゾールジオン（8）を生じさせることができ（Pathak、前記）、カルボニル
基をオキシムに変換することが可能である（9、10）。二重結合をスルホン（11
）、スルホキシド（12）、スルホネートまたはスルホンアミド（13）、ホスホン
酸エステルまたはホスホンアミド（14）などのヘテロ原子-ヘテロ原子二重結合
と共役させることもできる。最終的には、二重結合を4-ビニルピリジニウムイオ
ン（15）などの電子欠乏性芳香族系と共役させることもできる。カルボニルまた
はヘテロ原子に基づく多重結合と共役した三重結合も用いられうる（16、17、18
、19、20）。
【０１４８】 化学構造：
【化１４】
【化１５】
【化１６】
【化１７】
【０１４９】 1および2などの構造は、炭素-炭素二重結合の一電子または二電子求引基との
共役に基づく。それらの一つは常にカルボニルであり、アミドからエステルへ、
さらにフェノン構造への反応性を増大させる。求核付加は立体障害を軽減するこ
と、またはα位における電子求引力を増大させることによって容易になる。すな
わちCH3＜H＜COOH＜CNの順である。
【０１５０】 後者の二つの構造を用いることによって得られる比較的高い反応性は、求核攻
撃が起こるβ位での置換基の嵩高性を変化させることによって調節しうる。この
際、反応性はP＜W＜Ph＜Hの順となる。このため、Pの位置によって求核試薬に対
する反応性を調整することも可能である。このファミリーには、毒性に関する詳
細が知られており、医療に用いられているいくつかの化合物も含まれる。例えば
、末端にアクリル酸エステルおよびメタクリル酸エステルがある水溶性ポリマー
は、それぞれヒドロゲル密封剤および骨の役目をするセメントにおいてインビボ
で重合を生じる（フリーラジカル機序による）。このため、アクリル酸エステル
およびメタクリル酸エステルを含むポリマーはすでに臨床用製品において体内に
認められているが、用いる化学反応スキームは大きく異なる。
【０１５１】 構造3〜構造10は、二重結合がシス配置であって二電子求引基が存在するとい
う双方の理由により、求核試薬に対する反応性が極めて高い。
【０１５２】 不飽和ケトンはこれらのカルボニル基の電気陰性度が大きいためにアミドまた
はイミドよりも反応速度が高い。このため、共役範囲が長いためにシクロペンタ
ジオン誘導体はマレイミド誘導体（3）よりも速く反応し、パラキノンはマレイ
ンヒドラジド（4）よりも同じくシクロヘキサノンよりも速く反応する。最も高
い反応性が認められるのはナフトキノン（7）である。
【０１５３】 Pは、環の対側部分（3、5）、別の環（7、8）またはパラキノンモノオキシム
を介してO結合した（9、10）、不飽和基の反応性を低下させない位置に配置する
ことができる。また、求核付加速度を低下させたい場合にはPを反応性二重結合
と結合させてもよい（6、8）。
【０１５４】 二重結合の求核付加に対する活性化を、ヘテロ原子に基づく電子求引基を用い
て得ることもできる。実際、ヘテロ原子を含むケトン（11、12）、エステルおよ
びアミド（13、14）の類似体は類似した電子挙動を示している。構造13および14
を、迅速なゲル分解を促進しうる易加水分解性基として用いることもできる。求
核付加に対する反応性は基の電気陰性度が大きいほど高く、すなわち11＞12＞13
＞14の順となり、芳香環との結合によって高くなる。芳香環に基づく電子求引基
を用いて二重結合の強い活性化を得ることもできる。ピリジニウム様カチオンを
含む任意の芳香族構造（例えば、キノリン、イミダゾール、ピラジン、ピリミジ
ン、ピリダジンおよび類似のsp2窒素含有化合物の誘導体）は二重結合に強い極
性を与え、迅速なマイケル型付加を可能にする。
【０１５５】 炭素またはヘテロ原子に基づく電子求引基と共役した炭素-炭素三重結合は含
硫求核試薬と容易に反応し、単付加および二重付加による作製物を生じる。二重
結合を含む類似化合物に関しては、反応性は置換基によって影響される。
【０１５６】 水分環境における規則的凝集体（リポソーム、ミセル）の形成または単相分離
により、不飽和基の局所濃度は高くなり、このために反応速度も上昇する。この
場合、後者は求核試薬の分配係数にも依存し、これは親油的特性が増大された分
子ほど高くなる。
【０１５７】 求核試薬 有用な求核試薬は、付加反応による共役不飽和基との反応性を有するものであ
る。求核試薬の反応性は不飽和基の実体に依存し、これについては本明細書の別
項でより詳細に考察するが、不飽和基の実体はまず生理的pHでの水との反応によ
って制限される。このため、有用な求核試薬は一般に生理的pHではH２Oよりも求
核性が高いと考えられる。好ましい求核試薬は、毒性の理由から生体系に一般に
おいて見い出されるものの、細胞外の生体系では一般に遊離した状態では見い出
されるないものと考えられる。このため、アミンを有効な求核試薬として用いう
る例もあるが、最も望ましい求核試薬はチオールである。
【０１５８】 チオールは細胞外の生体系ではジスルフィド結合による対形態として存在する
。最も高い程度の自己選択性が求められる場合（例えば、治療用タンパク質を組
み込む場合、ゲル化化学作用が組織の存在下で行われ、その組織の化学修飾が望
ましくない場合など）には、チオールがえり抜きの強い求核試薬であると考えら
れる。
【０１５９】 しかし、最も高いレベルの自己選択性は必要ではないと考えられる他の状況も
ある。これには、治療用タンパク質を組み込まない場合、およびゲル化化学作用
はインサイチューで行われるが組織との化学結合は望ましいか有害ではない場合
といった状況が含まれると考えられる。これらの場合には、アミンは適切な求核
試薬として役立つと考えられる。ここで、脱プロトン化アミンはプロトン化アミ
ンよりもはるかに強い求核試薬であるという点で、pHには特に注意を払う必要が
ある。このため、例えば、典型的なアミノ酸にあるαアミン（pKはアスパラギン
の場合は8.8と低く、プロリンを除く20種の一般的アミノ酸すべての平均は9.0で
ある）のpKはリジンの側鎖εアミンよりもはるかに低い（pK 10.80）。このため
、強い求核試薬として用いるアミンのpKに特に注意を払う場合には、かなりの自
己選択性を得ることができる。タンパク質にはαアミンは一つしかない（N末端
にある）。低pKのアミンを選択し、pHがそのpK付近となるように最終的な前駆物
質溶液を処方することにより、提供された不飽和物と提供されたアミンとの反応
を、系に存在する他のアミンよりも優先的に行わせることができる。自己選択性
が全く要求されない場合には、求核試薬として用いるアミンのpKにそれほど注意
を払う必要はないが、許容される程度に高い反応速度を得るためには、適切な数
のこれらのアミンが脱プロトン化されるように最終的な前駆物質溶液のpHを調整
する必要がある。
【０１６０】 概略すると、前駆物質溶液のpHおよび最も高い自己選択性という理由から、チ
オールは望ましい本発明の強い求核試薬であるが、アミンが有用な強い求核試薬
として有用であると考えられる状況もある。特定の求核試薬の有用性は、想定さ
れる状況および求められる自己選択性の程度に依存する。
【０１６１】 求核基の概念は本明細書において、この用語が時に官能基それ自体（例えば、
チオールまたはアミン）だけでなく、官能基を含む分子（例えば、システインも
しくはシスチル残基、またはリジンもしくはリジル残基）も含むものとして用い
られるように拡張される。
【０１６２】 求核基は全体的構造が極めて柔軟な分子に含まれてもよい。例えば、二官能性
求核試薬がNuc-P-Nuc（式中、Pは本明細書に述べた意味で用いられ、Nucは求核
試薬を指す）の形態として存在することが可能である。同様に、分枝状ポリマー
Pを多数の求核試薬によって誘導体化してP-(Nuc)ｉを作製することもでき、この
場合にはi＝2が有用と考えられる。NucはPの鎖端に提示される必要はなく、例え
ば、反復構造を想定することもできる：（PNuc）ｉ、この場合にはi＝2が有用と
考えられる。明らかに、このような構造内部のPまたはNucのすべてが同一である
必要はない。必要とされるのは、一つの求核性前駆物質がこのようなNuc基を二
つまたはそれ以上含むことのみである。
【０１６３】 同様に、Pおよび上記に詳細に述べた共役不飽和基の類似の構造を作製させて
もよい。必要とされるのは、一つの共役不飽和前駆物質がこのような共役不飽和
基を二つまたはそれ以上含むことのみである。
【０１６４】 二つの前駆成分の両方、例えば、求核性前駆成分および共役不飽和前駆成分の
両方が、実際に用語の通常の意味で重合性である必要はないことに注意が必要で
あり、理解される必要がある。これはその官能価のみに関することである。実際
には、少なくとも一つの組成物が用語の通常の意味で重合性である場合には、好
都合であるが、これは絶対的に必要ではない。例えば、有用な材料はPEGトリア
クリル酸エステルとジシステインとの反応によって生じ、同様に有用な材料はPE
Gトリチオールと低分子量ジアクリル酸エステルとの反応によっても生じる。最
終的には、一部の用途のための有用な材料はジシステインと低分子ジアクリル酸
エステルとの反応によっても得られる。
【０１６５】 実際には、一つまたは複数の前駆成分が用語の通常の意味で重合性である場合
は、好都合かつ有用である。これらの場合には、Pは合成親水性ポリマー、合成
疎水性重合液体、想定される用途に対して許容される毒性もしくは生物的影響を
有する溶媒に溶解しうる合成疎水性ポリマー、生合成タンパク質もしくはペプチ
ド、天然のタンパク質もしくは処理された天然のタンパク質、または多糖類であ
りうる。
【０１６６】 親水性ポリマー 好ましい態様において、合成ポリマーPはポリ(エチレングリコール)、ポリ(エ
チレンオキシド)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(エチレン-co-ビニルアルコー
ル)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(エチレン-co-アクリル酸)、ポリ(エチルオキサゾ
リン)、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(エチレン-co- ビニルピロリドン)、ポリ
(マレイン酸)、ポリ(エチレン-co-マレイン酸)、ポリ(アクリルアミド)またはポ
リ(エチレンオキシド)-co-ポリ(プロピレンオキシド)ブロック共重合体でありう
る。これは網羅的なリストではなく、他の親水性ポリマーを用いることもできる
。
【０１６７】 Pは共重合体、ブロック共重合体、グラフト共重合体またはランダム共重合体
であってもよい。親水性ポリマーの両端で重合したブロックは、例えば、加水分
解または酵素的手段による分解性を付与するために、例えば、乳酸、グリコール
酸、ε-カプロラクトン、乳酸-co-グリコール酸オリゴマー、トリメチチレン炭
酸エステル、無水物およびアミノ酸などで構成することができる。このリストは
網羅的ではなく、他のオリゴマーもブロック共重合体に用いうる。
【０１６８】 ランダム共重合体は、ポリ(N-ビニルピロリドン-co-ビニルアルコール)または
ポリ(エチレン-co-ビニルアルコール）などのさまざまな組成のビニルアルコー
ルに基づくことが可能であり、アクリル酸エステル、ベンゾキノン、ナフトキノ
ンなどの共役不飽和基による誘導体化を行える。ビニルアルコール共重合体には
、ω-ブロモ-カルボン酸との反応によって(CH２)ｎCOOH基による官能性を付与す
ることができる。その結果得られるポリマーまたはアクリル酸もしくはメタクリ
ル酸共重合体はキノン基の付加に用いることができる。コモノマー組成および官
能性付与の程度は、それらが溶解性または相転移を決定している場合を除き、反
応速度に劇的な影響を及ぼすことはない。一方、それらは最終的な力学特性を決
定する。
【０１６９】 一つの組成物Pは、求核試薬または共役不飽和物の部位が存在するコロイド粒
子などの固体でもよいことに注意しなければならない。
【０１７０】 タンパク質および生合成タンパク質 Pはタンパク質でもよい。タンパク質は天然タンパク質または組換えタンパク
質でありうる。一般的な用語として、組換えタンパク質とは組換えDNA技術によ
って作製される任意の長さのアミノ酸材料のことである。これらの組成物の例に
は、プロテアーゼによる分解部位をコードするペプチド配列、他の生物シグナル
に関するペプチド配列および非生体相互作用性配列が含まれる。
【０１７１】 任意の天然のタンパク質がPであってもよい。より詳細には、天然のタンパク
質は求核試薬によって隔てられた複数のPsを含む。例えば、584アミノ酸からな
るタンパク質である血清アルブミンは、5.7％システイン、9.9％リジンおよび3.
1％チロシンを含む。例えば、システイン、チロシンおよびリジンの間にあるア
ミノ酸配列は異なるPsを構成する。アルブミンは天然の状態では共役不飽和物と
タンパク質上のチオールとの間の共役付加反応による架橋の目的にはそれほど有
用ではないが、アルブミンはシステイン残基の一部またはすべてが遊離状態にあ
るポリ(アミノ酸)を作製するために還元によって容易に処理することができ、ま
たは多数のチオール基を導入するために化学的に誘導体化することができる。
【０１７２】 ペプチド 場合によっては、Pは、求核試薬がアミノ酸のシステインであって、一つの態
様においては （配列中、Cはシステインの一文字表記であり、Xはシステイン以外の任意のアミ
ノ酸を表す）に、もう一つの態様においては （配列中、Yはチロシンの一文字表記であり、Xはシステインおよびチロシン以外
の任意のアミノ酸を表す）に類似した構造のペプチドを生じる、ペプチドまたは
ポリペプチドであってもよい。XXXXX（配列番号：7）の長さまたはXの数（例え
ば、Xｎ）は任意の長さまたは数（n＝0）でありうる。上記にXXXXXとして示した
ドメイン内部の配列が細胞移動に関与する酵素の基質（例えば、コラゲナーゼ、
プラスミンまたはエラスターゼなどの酵素の基質）である場合には特に有用であ
るが、ドメインがこれらに限定される必要はない。酵素プラスミンの基質として
特に有用なこのような配列の一つが実施例の項に記載されている。これらの酵素
に関する文献を調査することによって種々のこのようなペプチドを学ぶことがで
きる。例えば、このような調査により、重要なプロテアーゼであるプラスミンの
基質部位（表1；配列番号：8〜配列番号：24）が示される。
【０１７３】
【表１】 フィブリン(フィブリノーゲン)(Fg)において見い出されたプラスミン
基質部位** 参照1：Takagi T.およびR.F. Doolittle、Biochemistry 14：5149〜5156、1975
；参照2：Hantgan R.R.ら、うっ血および血栓症：基本原理および臨床実践（Hem
ostasis and Thrombosis：Basic Principles and Clinical Practice）、第3版
、R.W. Colmanら編、LB. Lippincott Company：Philadelphia. 1994；参照3：Ta
kagi T.およびR.F. Doolittle、前記；参照4：Nomura S.ら. Electrophoresis 1
4：1318〜1321、1993.；参照5：Standker L.ら、Biochemical and Biophysical
Research Communications 215：896〜902（1995）。* 疎水性アミノ酸を示す；+/- 陽イオン性（+）または陰イオン性（-）の荷電側
鎖を示す。** 一文字アミノ酸記号；A、アラニン；C、システイン；D、アスパラギン酸；E、
グルタミン酸；F、フェニルアラニン；G、グリシン；H、ヒスチジン；I、イソロ
イシン；K、リジン；M、メチオニン；N、アスパラギン；P、プロリン；Q、グル
タミン；R、アルギニン；S、セリン；T、トレオニン；V、バリン；W、トリプト
ファン；Y、チロシン。
【０１７４】 プラスミンは細胞移動および組織/凝血塊再編成に重要な酵素であると仮定す
ると、これらの基質またはこれらの基質の部分は、PにおけるXXXXXとして上記に
示した部位の内部の有用な配列である。
【０１７５】 同様に、コラゲナーゼは細胞移動および組織再編成に重要な酵素である。同じ
くコラゲナーゼに関する文献調査により、PにおけるXXXXXの有用な実体である種
々の基質部位が示されている（表2；配列番号：25〜配列番号：31）。
【０１７６】
【表２】 コラーゲンにおいて見い出されるコラゲナーゼ基質部位 参照6：Netzel-Arnett S.ら. The Journal of Biological Chemistry 266：6747
〜6755、1991：参照7：Upadhye S.およびVS. Ananthanarayanan. Biochemical a
nd Biophysical Research Communications 215：474〜482、1995；参照8：Liko
Z.ら、Biochem Biophys Res Commun 227：351〜35、1996。
【０１７７】 求核試薬前駆成分（求核試薬としてのチオールを提供するために配列中のシス
テインを用いうるため最も容易である）または共役不飽和前駆成分のいずれかと
してP内部の酵素的分解部位を用いることは、生体材料の吸収または再編成の速
度が例えば細胞侵入によって示される治癒の速度と相関する可能性があるという
ことである。
【０１７８】 基質部位のKｍおよびkｃａｔが変化するようにオリゴペプチド配列を調整する
ことによって生体材料の吸収速度を調節しうることを指摘することは特に有意義
である。例えば、コラゲナーゼ基質部位の酵素学に関する文献の検討により、基
質上の配列の設計によって基質の分解速度を調整しうることが示されている（表
3：配列番号：32〜配列番号：38）。
【０１７９】
【表３】 コラゲナーゼ（マトリックスメタロプロテイナーゼ1）感受性ペプチ
ド配列の設計 Netzel-Arnett S.ら、The Journal of Biological Chemistry 266：6747〜6755
、1991。
【０１８０】 促進剤 反応性に乏しい求核試薬とは、pH5よりも高く9よりも低いpHと一般に定義され
るpHおよび25℃よりも高く40℃よりも低い温度の下での擬一次半減期が約15分を
上回るものをいう（過剰量の共役不飽和基が存在する場合；一部の医療環境では
比較的遅い反応が有用と考えられる）。ラジカル開始剤とは、自発的、熱的また
は光化学的に誘発される炭素-ヘテロ原子またはヘテロ原子-ヘテロ原子結合の均
一切断によって炭素またはヘテロ原子に基づくラジカルを生じる有機分子または
水溶性分子のことをいう。このようなラジカル開始剤を促進剤として用いること
は、望ましくはないが、用いるフリーラジカルの濃度をはるかに低くできるとい
う点で重合よりも優れていることを理解する必要がある。共役不飽和基に対する
反応性に乏しい求核試薬の付加速度は加速物質の存在によって増大させることが
できる。これらはラジカル開始剤、光増感剤（単独またはラジカル開始剤との併
用による；Pathak、前記）、低分子量ルイス酸（Pathak、前記）、ルイス酸性も
しくは第4アンモニウムイオンの存在を特徴とするアンバーリスト（Amberlyst）
樹脂（Pathak、前記）もしくはモンモリロナイト粘土（Pathak、前記）などの固
体触媒、またはN,N-二置換尿素もしくはペプチド構造に基づく水素結合性受容体
（Pathak、前記）であってよい。最後の場合には、加速機序は、共役オレフィン
上の求核試薬の攻撃に続いてのエノラート様遷移状態の水素結合による安定化に
基づく。適合させた抗体をこの目的に用いることができる（Pathak、前記）。
【０１８１】 一つの典型的な実験では、P残基一つ当たり一つを上回る数の共役不飽和基を
含むP誘導体の高濃度の（一般的には10％ w/w以上であるが、簡便には望ましい
挙動を得るのに十分に高い濃度の）溶液を、求核性化学種の数が2を上回るチオ
ール含有性または適したアミノ含有性化合物（最も高度の自己選択性が必要でな
いと考えられる用途では、特にチオール）の高濃度の（>10％であるが、簡便に
は望ましい挙動を得るのに十分に高い濃度の）溶液と直ちに混合する。触媒量（
<1〜2％ w/w）の促進性化学種を混合段階で導入することができる。混合後には
架橋反応を活性化するために比較的高い温度（最大60℃）を短期間用いることが
できる。材料を体内に注入した後にインサイチューで反応させて最終的な生体材
料を作製させようとする状況では、最大約50℃までの注入温度が許容されると考
えられる。
【０１８２】III．ポリマー網目構造の形成 官能価 ポリマー科学の専門用語を用いると、ポリマーは官能価が2のモノマーの反応
によって作製可能である。ポリマーの架橋網目構造はモノマーの一部またはすべ
ての官能価が2を上回る場合に生じうる。本明細書では、互いに反応して架橋網
目構造を形成できる場合に分子の官能価は2またはそれ以上であると記載し（モ
ノマーまたはマクロマー）、官能価は付加反応の局面から定義される。本明細書
で用いる場合、重合とは官能価が2であるモノマーまたはマクロマーの反応を意
味し、架橋とはその一部またはすべての官能価が2を上回るモノマーまたはマク
ロマーの反応を意味する。モノマーという用語は本明細書において低分子には限
定されず、ポリマーおよび生体高分子も指すものとする。
【０１８３】 記載されるモノマーは二つのクラスからなり、互いに反応すると直線状または
架橋性の生体材料を作製する。架橋が起こるためには両方のクラスのモノマーを
混合することが必要である（混合のための異なるアプローチをすぐ後に述べる）
。一方のクラスのモノマーは二つまたはそれ以上の共役不飽和基を含み（このた
め、官能価は2またはそれ以上である）、好ましくは共役性である。他方のクラ
スのモノマーは二つまたはそれ以上の求核試薬を含み（このため、官能価は2ま
たはそれ以上である）、これは好ましくは系の他の組成物として存在する他のも
のよりも強い求核試薬、例えば、望ましくは系の非反応性組成物として存在する
と考えられるアミンと比較した際にはチオールである。
【０１８４】 水溶性前駆物質モノマーを混合すると（最終的な前駆物質溶液と呼ぶ）、直線
状または架橋性のゲルまたは網目構造が作製されるが、このような反応は生理的
または生理的に近い塩濃度およびpHの水中で進行しうる。モノマーが完全に水溶
性である必要はなく、実際には水溶性でないことが有益である場合もある。この
ような場合にはゲルが最終材料として得られず、むしろより疎水性が高く水膨潤
性の低い材料が得られると考えられる。これらは疎水性薬剤の送達および構造強
度の高い材料の作製に特に有用な可能性がある。必要とされるのは、おそらくは
乳化剤の存在下で、二つの組成物が互いに溶解性であること、または少なくとも
互いに微細に分散しうることである。これにより、二つの組成物は、反応して直
線状または架橋性の材料を作製する程度に互いに十分に接近することができる。
【０１８５】 また、水以外の溶液中で形成されるモノマーの溶液を用いて作用させることも
可能である。例えば、注射可能な生体材料系における溶媒としてのN-メチルピロ
リドン（NMP）の使用が知られており、このため、溶液中にある前駆成分を用い
て作用させたいが、その前駆成分が水に溶けにくい場合には、検討対象の感受性
生体物質との使用が許容される特定の有機溶媒を用いることができる。
【０１８６】 薬剤を実験室または作製ラインで組み込む場合には、インプラントを対象に提
供する前に少なくともその大部分は除去されると考えられるため、この有機溶媒
の選択には大きな自由度がある。材料を皮膚表面で作製させる場合にも、NMP、
アセトン、エタノール、イソプロパノールおよび酢酸エチルを含む多くの溶媒の
皮膚毒性は低いため、大きな自由度がある。材料を体内で作製させる場合には、
許容される溶媒の範囲はかなり狭くなり、これは毒性面での懸念によって決まる
。このような場合にはNMPが特に好ましい有機溶媒である。有機溶媒および水を
含む混合溶媒系を用いて、有機溶媒の全体的濃度を下げながら混合溶媒系におけ
る優れた溶解性または分散性を維持することによって溶媒系の毒性を調節するこ
とも可能である。
【０１８７】 最終的な前駆物質溶液を作製させるための混合はいくつかの手段によって行う
ことができる。最も簡便な場合には、一方の溶液が求核性前駆成分を含み、もう
一方の溶液が共役不飽和前駆成分を含む。混合後に得られるpHおよび濃度が化学
反応の進行に適切となるように、これらの二つの組成物を溶媒および緩衝系中に
処方する。このような混合は、例えば、二つのシリンジの作用で静止型混合器に
おいて行うことができる。
【０１８８】 その他の混合方法も想起されうる。例えば、エアスプレーにおいて二つの前駆
物質溶液のそれぞれの微粒子の間で混合が起こりうる。例えば、反応が進行しな
い、または緩徐にしか進行しないpHで、一つの溶液を両方の前駆成分から調製す
ることもできる。あらかじめ混合しておいた前駆物質溶液を配置した後に、pHを
調製し（例えば、温度の変化、または酸もしくは塩基との混合、または酸もしく
は塩基が生じる化学反応、または酸もしくは塩基の拡散による）、最終的な前駆
物質溶液において化学反応の進行に適した最終条件を得ることができると考えら
れる。もう一つの方法は、反応の活性化エネルギーもしくは温度感受性のある緩
衝液またはその両方に関係して、反応が進行しない、または緩徐にしか進行しな
いような温度で最終的な前駆物質溶液を調製することである。最終的な適用温度
へと（例えば、注射後に体温へと）加温または冷却を行うと（加温が最も有用で
ある）、最終的な前駆物質溶液における条件は化学反応の進行に適切なものにな
ると考えられる。
【０１８９】 医学的応用 本生体材料はヒトにおける医用インプラントまたは装置として、または薬物送
達のために有用であるため、前駆物質溶液に用いる分子系はある種の基準を満た
す必要がある。これらには以下が含まれる。
【０１９０】 1．マイケル型反応の速度は臨床的に意味のある期間にわたって臨床的に意味
のある温度およびpHでみられる必要がある。一般的には、一般に7よりも高く9よ
りも低いpHおよび25℃よりも高く40℃よりも低い温度での約15分未満のゲル化が
望ましい。
【０１９１】 2．反応は十分に自己選択的である必要があり、自己選択性の検討事項には以
下が含まれる。アミンを含む薬剤の存在下でのゲルの作製の場合、または細胞お
よび組織組成物との反応が望ましくない場合には、最終的な前駆物質溶液の適用
pHでの共役不飽和物のアミンとの反応は極めて緩徐である必要がある。好ましく
は、反応性を意図した求核試薬に対する共役不飽和物の反応性とアミン、この場
合には反応性が意図されないまたは望ましくない求核試薬に対するものとの比は
、10またはそれを上回ること、好ましくははるかに上回ることが望ましい。一般
に、共役不飽和物とチオールとの間のマイケル型付加によるアプローチは、それ
自体が共役不飽和物またはチオールを含む薬剤には有用でないと考えられる。そ
の例外には、薬剤にある基の反応性が生体材料前駆物質における対応する基の反
応性よりもかなり低い場合、およびこの種の反応が有害でない場合、例えば、生
体材料網目構造に対するグラフト形成が有害でない場合が含まれる。
【０１９２】 3．前駆物質溶液を水相中に調製する場合には、反応物は水中で安定である必
要がある。安定であるとは緩徐に反応することと定義され、緩徐であるとは二つ
の組成物の間の反応が進行する程度に十分に緩徐であり、それでもなお望ましい
生体材料の作製が得られることと定義される。
【０１９３】 4．最終的な前駆物質溶液における付加反応は、組織損傷、薬剤分解または検
討対象の生体物質に他の有害な結果を引き起こす程度に発熱性であってはならな
い。ゲル化溶液の温度は一般にゲル化の間は60℃を超えない必要があり、好まし
くは最高反応温度はさらに低いことが望ましい。
【０１９４】 5．前駆物質溶液の組成物は、最終的な前駆物質溶液が適用された際に拡散す
る濃度で有毒であってはならず、ここで毒性という用語は医学的に関連する文脈
で医学的に許容されない組織反応を誘発することと定義される。
【０１９５】 この項で上記に定義した基準は、架橋に用いられる化学基の実体を限定するこ
とにより、前駆物質溶液において有用と考えられる分子の実体を限定する。
【０１９６】 更なる生体機能性 本明細書に述べる付加反応の使用による一つの大きな利点は、例えば、細胞表
面の接着促進受容体の結合のための部位、または増殖因子の結合のための部位を
提供するために、生体活性のある他の生体機能性基を生体材料に組み込むことが
できることにある。
【０１９７】 接着性ペプチド 種々の接着促進ペプチドが、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、
コラーゲン、フォンビルブランド因子、オステオネクチンなどの接着促進タンパ
ク質の活性ドメインとして同定されている。これらのペプチドは、ペプチド鎖に
おいてシステインなどの強い求核試薬とともに設計すれば、生体材料に容易に組
み込むことができる。このような一例が実施例に示されている。関心がもたれる
と考えられるペプチドの一部のリストを以下に示す（表4；配列番号：39〜配列
番号：49）。
【０１９８】
【表４】 細胞外基質タンパク質の細胞結合ドメイン配列 Yamada, Y.およびKleinman, H.K.、Curr. Opin. Cell Biol. 4：819、1992によ
る。
【０１９９】 これらのペプチドは、材料表面での細胞の接着、移動および異常増殖（特に材
料が分解性でない場合、または緩徐に分解される場合）、材料を経た細胞移動（
特に二つの前駆成分の一方にプロテアーゼ基質を組み込むことによって材料がよ
り容易に分解される場合）および特定の細胞表現型の誘導（例えば、異物巨細胞
を形成せずに有益な増殖因子を放出するようにマクロファージを刺激すること）
などの種々の細胞反応の制御に有用な可能性がある。表5に示したペプチド（配
列番号：50〜配列番号：57）は、糖タンパク質である細胞表面受容体と結合する
。ヘパリン結合性ペプチドファミリーと呼ばれる、細胞表面ヘパラン硫酸および
コンドロイチン硫酸を含むプロテオグリカンと結合する他のこのようなペプチド
配列もある。このような細胞表面組成物との結合を介した細胞接着性を付与する
ためにこれらを組み込むこともできる。
【０２００】
【表５】 細胞外基質タンパク質のプロテオグリカン結合ドメイン配列 最初の5つに関する参照はMassia, S.P.、およびHubbell, J.A. J. Biol. Chem.
267：10133〜10141、1992である；抗トロンビンIIIの配列はTyler-Cross, R.ら
、Protein Sci. 3：620〜627、1994による；神経細胞接着分子の配列はKallapur
, S.G.およびAkeson, R.A.、J. Neurosci. Res. 33：538〜548．1992による；血
小板第4因子の配列はZucker, MB.、およびKatz, I.R.、Proc. Soc. Exp. Biol.
Med. 198、693〜702．1991による。* xは疎水性アミノ酸を示す。塩基性アミノ酸は下線を付して示している。
【０２０１】 本発明の方法による接着性ペプチドの組み込みのための実践的方法は、現時点
の最高技術水準よりもはるかに容易であることに留意されるべきである（Pathak
、前記）。先行技術に用いられるこのような方法では（ペプチド-PEG-アクリル
酸エステルの作製を一例に挙げると）、一方の端に活性化エステルがあって他方
の端にアクリル酸エステルがあるヘテロ二官能性PEGを合成しなければならない
。これはペプチドに対してグラフト処理を行って精製する必要がある。この作用
物質は、本発明の方法またはアクリル酸エステル末端基の重合による、例えばハ
ッベル（Hubbell）らによって開示されたPEGジアクリル酸エステルへの組み込み
のために有用である。これに対して、本方法によるペプチド組み込みははるかに
容易である。ペプチドを含む求核試薬（例えば、遊離チオールを有するシステイ
ン）をPEGジアクリル酸エステル（または多官能性PEG共役不飽和構造）と単に混
合して短期間反応させ、残りの異なる多価求核試薬を添加するか、系を光重合さ
せる。ヘテロ二官能性物質を合成する必要はなく、カップリング後の精製も必要
ない。これが可能なのは系の自己選択性のためである。
【０２０２】 増殖因子結合ペプチド 生体材料において有用な第2の種類の生体機能性は、増殖因子と結合する構造
である。これらは増殖因子の調節的送達および放出に用いることができる。その
優れた一例は、aFGF、bFGF、VEGF. TGFβおよびBMPを含むヘパリン結合性増殖因
子に関して見い出される。ヘパリンと結合するペプチドを組み込むことは容易で
ある（上記の通り、以下でも述べる）。この混合物に増殖因子とともにヘパリン
を添加することができる。系が自己選択的であるため、ヘパリンおよび増殖因子
との化学反応は起こらないと考えられる。このため、システイン残基の箇所に単
一の遊離チオールを含むヘパリン結合性ペプチドをヘパリンおよびヘパリン結合
性増殖因子と混合し、これらの組成物を例えば、PEG-トリアクリル酸エステルと
混合して、これを二つのシステイン残基（それぞれ基質ドメインの両端に位置す
る）の組み込みによって二つのチオールを有するプロテアーゼ基質ペプチドと混
合する場合に、以下の生体模倣性生体材料が生じると考えられる。すなわち、こ
の生体材料は細胞に伴うプロテアーゼによって分解されると考えられ、増殖因子
はヘパリンとの非共有結合によって生体材料の内部に結合し、このヘパリンはヘ
パリン結合性ペプチドと非共有的に結合し、さらにこれがヒドロゲル生体材料と
共有結合すると考えられる。または、ヘパリンに直接、それが単一の強い求核試
薬を含み、ポリマー網目構造と直接化学的に結合するように官能性を付与するこ
とも可能と考えられる。ヘパリン結合性増殖因子を隔離するための関連したもう
一つの方法は、より直接的に、増殖因子と直接結合する共有結合的に組み込んだ
ヘパリン模倣物（例えば、負に荷電した側鎖を有するペプチド）を用いることで
あると考えられる。
【０２０３】 金属イオン結合部位 実施例28に記載のとおり、二価金属カチオンなどの金属イオンに対する親和性
部位も、生体材料に組み込むことができる。例示的金属結合部位には、イミノ二
酢酸および一つまたは複数の隣接またはクラスター状ヒスチジン残基を含むペプ
チドが含まれる。これらの金属イオン結合部位は金属を結合することができ、こ
の金属は次いで所望の金属結合タンパク質と相互作用する。この金属結合タンパ
ク質と生体材料の親和性部位との結合により、金属結合タンパク質(例えば、ヒ
ト成長ホルモン)の本発明の生体材料内への封入または保持を助けることができ
る。結合した金属イオン結合部位は、その金属イオン親和性を有する結合タンパ
ク質薬物に対する結合部分として役立つ。
【０２０４】 炭水化物結合部位 同様に、炭水化物を結合する基は、生体材料の糖タンパク質に対する親和性を
増大させることができる。炭水化物を結合する基の例には、フェニルボロン酸な
どのボロン酸部分が含まれる(実施例28)。特に興味が持たれるのは、実施例28に
示されるものなどの、生理的pHで炭水化物残基を結合するフェニルボロン酸部分
である。
【０２０５】 共有結合された薬学的活性化合物の制御放出 薬学的活性化合物の生体材料への共有結合と、続くそれらの放出については、
複数の方法および化合物が開発されている。生体材料への結合を助け、好ましく
は元の、修飾されていない薬学的活性化合物の最終的放出を促進する特性を有す
るリンカーが記載されている。薬学的活性化合物が結合しうる生体材料または生
体材料の前駆成分は、動物の体内の多くの部位への配置に適している。
【０２０６】 本明細書に記載の系は、フリーラジカル重合可能な基が薬物に付加され、続い
て薬物単独または他の共重合用単量体とフリーラジカル重合して材料を生成する
IVb型系(ベイカー、上記およびダンカンら、上記)に類似している。しかし、本
発明の基は、共役付加反応またはフリーラジカル重合のいずれかにより重合する
ことができる。他のIVb型系と同じく、リンカー分子を用いて薬物を活性基また
は重合体に連結することができる。
【０２０７】 薬物を重合体に結合するために、他の研究者らが用いている求核置換反応とは
対照的に、本発明の方法は薬学的活性化合物または修飾薬学的活性化合物と重合
体上の共役不飽和基との間の共役付加反応を含む。前述の共役付加反応は、求核
付加反応のサブセットであり、したがって他の研究者らが用いている求核置換反
応とは化学的に異なっている。共役付加反応において、求核置換反応に必要な脱
離基はなく、求核剤が二重または三重結合に付加する。求核置換反応に比べて共
役付加反応の高い自己選択性は、この方法を感受性生物学的分子存在下で生体材
料のインサイチュー生成に適用するために有利である。
【０２０８】 この方法は、リンカー分子の薬学的活性化合物上のアルコールまたはアミンへ
の、エステルまたはアミド結合を介しての結合を含み、リンカー分子は次いで共
役付加反応において有用な化学基を提供する。薬学的活性化合物の重合体への、
共役付加反応による結合の後、チオエーテルまたは二級アミンはリンカー分子上
の、リンカーを薬学的活性化合物に結合するカルボニルエステルまたはアミドの
近くに存在する。生理的温度およびpHでの、このエステルまたはアミドの半減期
は、材料からの薬物送達のために過去に記載されている結合の多くの半減期より
もはるかに長い。しかし、この結合の半減期は、チオエーテルのために、完全に
脂肪族のエステルまたはアミドの半減期よりは短いと考えられる。過去に記載さ
れているプロドラッグのほとんどは生理的条件で時間のレベルの半減期を示すが
、本発明の化合物の多くは薬学的活性部分上、または薬学的活性部分と重合体と
の間に、週または月のレベルで加水分解する結合を有するため、これらの治療的
に適切な放出速度は、本発明の重要な局面である。そのような改良により、より
大量の薬学的活性化合物を生体材料内に組み込むことが可能となり、生体材料が
薬学的活性化合物を放出する時間を延長することができる。
【０２０９】 薬学的活性化合物は様々な化学基を含むことができ、そのうちのいくつかは求
核性であり、いくつかは求電子性である。薬物の安定性に関しては、高反応性基
は典型的に望ましくなく、したがって高反応性基は薬学的活性化合物においては
非常にまれである。薬学的活性化合物の多くの例は、アルコール以外の求核基を
含まないことがわかる。これらのアルコール基の反応性は一般に非常に低いため
、薬学的活性化合物の材料への結合は難しい。長い反応時間が必要になると考え
られ、薬学的活性化合物-重合体複合体の精製は非常に困難であるため、いかな
る競合反応も問題であると思われる。化学において一般に用いられる分離技術は
、比較的小さい分子のために開発されたもので、重合体では、その高分子量ゆえ
に、あまり有効ではない。残存する不純物は哺乳類において望ましくない副作用
を引き起こしうるため、リンカーに結合されている重合体に比べて、リンカーに
結合されている薬学的活性部分で、より高い純度が得られることは、前駆成分ま
たはこれらの化合物から調製される生体材料の臨床での使用にとって重要である
。したがって、薬学的活性化合物上の単一のアルコールをリンカーを用いてチオ
ールまたはアミンに変換することにより、いくつかの利点を得ることができる。
オリゴヌクレオチドまたはペプチドの場合、チオール含有基を分子の合成中に容
易に付加することができるため、これは全く単純であると考えられる。有機分子
の場合、これはより努力を必要とするが、実行可能であることが多い。特定の薬
学的活性化合物、特に国の規制認可をすでに通過している化合物の合成への改変
は、非常に望ましくない。好ましくは、薬学的活性化合物を生体材料に結合する
ために行ういかなる改変も、薬学的活性部分上のエステルまたはアミド結合を加
水分解することにより、元の薬学的活性化合物が最終的に再生されるような方法
で行う。いくつかの薬学的活性化合物は、アルコールまたはアミンなどの反応性
基の修飾後にもその治療的活性を保持するため、そのような修飾を施された化合
物を放出する生体材料も治療的に有用でありうる。
【０２１０】 本発明は、薬学的活性化合物上のアルコールまたはアミンを、より反応性のチ
オールまたはアミン基に変換する。アミン基に比べてチオール基の求核性が優れ
ているため、またアミン基は薬学的活性化合物において高頻度に見られるため、
チオール基を含むリンカーはアミン基を含むものよりも望ましい。しかし、いく
つかの場合に、リンカーにおいてチオールの代わりにアミンが存在することで、
薬学的活性化合物のより望ましい放出速度が得られることもある。本明細書に記
載の方法は、生体材料または重合体ではなく、薬学的活性化合物にリンカー分子
を付加することを含む。このリンカー分子の化学的性質は非常に多様でありうる
が、薬学的活性化合物との反応前は一般構造R1-COOHからなり、ただしR1は実質
的に求核性または求電子性基を含まない有機部分である。次いで、このカルボン
酸含有分子を薬学的活性化合物からのアルコールまたはアミンと縮合する。一つ
の場合に、反応性の低い硫黄または窒素原子がR1基内に含まれ、適当な脱保護化
学を用いることにより、遊離チオールまたはアミンを生成することができる。別
の場合に、R1はCH2＝CH-であり、これは構造R2-SHまたはR2-NH2の第二のリンカ
ー分子と反応することができる。反応性の低い硫黄または窒素原子がR2に含まれ
、適当な脱保護化学を用いることにより、遊離チオールまたはアミンを生成する
ことができる。リンカー分子の結合に続いて、高度の精製を行うが、これは薬学
的活性化合物が生体材料または重合体に直接結合されている場合には不可能とな
ることもある。加えて、そのようなリンカーの結合は、薬学的活性化合物の完全
な合成後に行うのではなく、化合物の全合成に組み込むことができる。加えて、
既存の薬学的活性化合物の構造に基づき、本明細書に記載の方法を用いて、より
容易に重合体に結合されるが、元の化合物と類似の薬物動態を有する、新しい薬
学的活性化合物を設計することもできる。
【０２１１】 薬学的活性化合物のチオールまたはアミン含有リンカーへの結合 本発明の一つの方法において、求核性がアミン、アルコール、またはより弱い
求核剤の存在からなる薬学的活性化合物を、標準的技術を用いて、アミン基がそ
れ以上の反応から保護されるように反応させる。保護された薬学的活性化合物ま
たは反応性基はアルコールしか含まない薬学的活性化合物上のアルコール基は、
メルカプト基が保護されているメルカプトプロピオン酸もしくはメルカプト酢酸
、またはアミン基が保護されているアミノプロピオン酸もしくはグリシンの誘導
体とのさらなる反応を標的としている。保護チオールまたはアミン含有化合物酸
のカルボン酸を薬学的活性化合物上のアルコールと縮合することによりエステル
結合を生成する。アミンまたはメルカプト基の保護基、および薬学的活性部分に
保護基がある場合にはこれを、標準的技術を用いて除去する。次いでこの生成物
を、下記に詳細に記載するとおり、共役不飽和基を含む水溶性重合体と反応させ
る。関連する方法において、遊離の一級または二級アミンを含む薬学的活性化合
物を、前述のとおり反応させて、重合体に結合することができるアミド含有化合
物を生成することもできる。
【０２１２】 薬学的活性化合物のアクリロイル誘導体への結合 別の方法において、アクリル酸などのアクリロイル誘導体を、薬学的活性化合
物(保護アミノ基を含んでいてもよい)上のアルコールと反応させ、エステルを生
成する。または、アクリロイル誘導体を薬学的活性化合物上のアミンと反応させ
て、アミドを生成することもできる。得られた薬学的活性化合物上のアクリレー
トを次いで、一つの遊離チオールまたはアミンと、一つの保護チオールまたはア
ミンを含むリンカー分子と反応させる。リンカー分子のチオールまたはアミン上
の保護基は除去することができ、このチオールまたはアミンを次いで、複数の共
役不飽和基を含む水溶性重合体と反応させることができる。
【０２１３】 リンカーが果たす役割 本発明の重要な局面は、リンカーにおけるチオールまたはアミン基が二重の機
能を提供することである。第一に、これらの基は共役付加反応を介して重合体と
の迅速かつ定量的反応を可能にするため、薬学的活性化合物は重合体と結合する
ことができる。第二に、薬学的活性化合物をリンカーに結合しているエステルま
たはアミド結合の近くにチオエーテルが存在することで、単純な脂肪族エステル
またはアミドに比べて、結合の加水分解の速度が増強される。典型的には、完全
な脂肪族エステルはその脂肪鎖の疎水性のために、pH7.4、37℃の緩衝液中で、
加水分解による半減期は年のレベルとなることが予想される。エステルを介して
ポリエチレングリコールにアクリレート基を結合した場合、アクリレートエステ
ル結合への水の接近が増大することにより、pH7.4、37℃の緩衝液中での半減期
は約3ヶ月に短縮される。同様に、ポリエチレングリコールに結合されたアクリ
レート基をチオール含有化合物と反応させる場合、エステル近辺にチオエーテル
が生じることにより、加水分解による半減期は約3週間まで短縮される。式D-O2C
-(CH2)n-SHを有する本発明の化合物は、nが1の場合には半減期は約4日で、nが2
の場合には18日となる。対応するアミド含有化合物の半減期は長く、エステルの
約4倍の長さであるが、これでもまだ臨床的に適切である。加えて、エステル結
合に対してα位の炭素に結合されているチオールのpH7.4、37℃で半減期は、約4
日である(ニコラオウ(Nicolaou)ら、米国特許第5,817,80号)。式D-O2C-(CH2)-NH
を有する化合物は約4ヶ月の半減期を有する。薬学的活性化合物の送達に関して
、哺乳類への生体材料の前駆成分または生体材料投与のための望ましい投与計画
は、1日1回以下で、好ましくはおよそ1週間に1回から1ヶ月に1回である。したが
って、臨床適用のためには、1時間から1年、好ましくは1日から9ヶ月、より好ま
しくは2日から6ヶ月、最も好ましくは4日から3週間の間の加水分解による半減期
が望ましい。
【０２１４】 加えて、水溶性の高いリンカーは修飾された化合物の溶解性を増大させること
により、修飾された薬学的活性化合物の重合体との反応を促進することができる
。リンカーが親水性である場合、リンカーは加水分解可能な結合を水に曝露する
ことにより、薬学的活性化合物の放出速度を増大させることもできる。リンカー
が疎水性の場合は、結合が水環境から追い出されて、加水分解は遅くなると考え
られる。リンカーがアミンなどの求核基を含む場合、求核剤は薬学的活性化合物
を重合体に結合するエステルまたはアミド結合と反応することができ、したがっ
て元の、修飾されていない薬学的活性化合物の放出速度を上げることができる。
加えて、リンカーは一つまたは複数のアミノ酸、酵素により分解可能なペプチド
、接着部位、成長因子結合部位、プロテアーゼ部位、炭化水素部分、または所望
の部位を標的とするためのペプチド配列を含むこともできる。
【０２１５】 遊離チオールまたはアミンを含む修飾された薬学的活性化合物 天然または合成有機分子に加えて、前述のとおり、治療的DNA、RNA、ペプチド
、またはタンパク質を生体材料内に共有結合することもできる。加えて、DNA、R
NA、ペプチド、またはタンパク質は、単一の遊離チオールを持つように修飾する
こともでき、これを次いで複数の共役不飽和基を含む水溶性重合体に直接結合さ
せ、生成物を架橋する。この場合、元の薬学的活性化合物は再生されないが、DN
A、RNA、ペプチド、またはタンパク質治療薬の修飾は、従来の医薬品の修飾に比
べて、はるかに一般的であり、かつ許容される。DNA、RNA、ペプチド、またはタ
ンパク質への修飾は通常、修飾が分子上の活性部位から遠い部位で行われるなら
ば、分子の活性に影響をおよぼすことはない。
【０２１６】 ペプチドまたはオリゴヌクレオチドの場合、アミノ酸システインを含むことに
より、または誘導体化オリゴヌクレオチドを用いることにより、チオールまたは
アミンを分子の活性部位から遠い部位に付加することができる。これらの場合、
チオールまたはアミン含有分子を重合体上のアクリレート基と直接反応させるこ
とができる。加水分解によって放出される分子は元の分子ではないが、プロピオ
ン酸で修飾されたチオールまたはアミンを含む。治療的ペプチドまたはオリゴヌ
クレオチドの活性部位から遠い部分は、活性を損失せずに、大きく変更すること
ができるため、これらの化合物は通常はその治療活性を保持する。
【０２１７】 薬学的活性化合物の重合体への結合およびそれに続く架橋 薬学的活性化合物に付加されるか、または元から存在する遊離チオールもしく
はアミンを用いて、薬学的活性化合物を重合体に結合する。生体材料は疎水性重
合体から作られることが多いが、共有結合された薬学的活性化合物の放出は、薬
学的活性化合物周囲の水の存在に依存しているため、ここではそれらは望ましく
ない。したがって、薬学的活性化合物は水溶性重合体または水膨潤性重合体に結
合させることができる。水溶性重合体は、共有結合または物理的架橋を介して、
様々な方法で材料に調製することができる。共有結合架橋は、重合体にフリーラ
ジカル重合(フッベル(Hubbell)ら、米国特許第5,410,016号)、求核置換(ザオ(Zh
ao)ら、Polymer Preprints 38(1)：526〜527 1997)、および共役付加反応を含む
他の化学的方法が可能な基を付加することによって確立することができる。
【０２１８】 薬学的活性化合物の水溶性または水膨潤性重合体への結合は、続く生体材料生
成のための水溶性重合体の架橋と補足的な様式で実施しなければならない。この
薬学的活性化合物の重合体への結合と、続く重合体の架橋を達成するために、他
の研究者らは、薬学的活性化合物の結合のために一つのクラスの化学基と、架橋
反応のためにもう一つのクラスの化学基を含む、二官能性水溶性重合体を用いて
いた。予想されるとおり、二官能性重合体は一官能性重合体よりも高価で、生成
が困難である。ここで、一官能性とは、重合体上に一種類の官能基だけが存在す
ることを指しており、各重合体分子が一つだけの官能基を含むということではな
い。本発明では、二つの異なる種類の反応のために、一種類の官能基を有する一
官能性重合体を用いる。一方の反応は薬学的活性化合物の結合のために用い、他
方の反応は架橋のために用いる。このような状況で有用な官能基の種類は、共役
付加反応において受容体となる基である。これらの基には、アクリレート、メタ
クリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、アクリロニトリル誘導体、キ
ノン、その誘導体、および共役二重結合を有する他の基が含まれる。チオールと
アクリレートとの間のそのような反応は、緩衝液中、中性pH付近で迅速に進行す
る(半減期は分のレベル)。したがって、薬学的活性化合物を重合体に結合する反
応は、薬学的活性化合物に害を与えない、非常に緩和な条件下で起こりうる。反
応はまた、有機溶媒または水と極性有機溶媒との混合物中でも行うことができる
。
【０２１９】 中性pH付近の緩衝液中で、チオールとアクリレートとの間の反応は、二つのチ
オール間の反応(ジスルフィド結合を形成する)または二つのアクリレート間の反
応(フリーラジカル開始剤がないことを仮定して、重合体を生成する)よりもはる
かに速く起こる。好ましくは、チオールとアクリレートとの間の反応は、チオー
ル二つの間の反応よりも10倍、より好ましくは100倍、最も好ましくは1000倍速
く起こる。チオールとアクリレートとの間の反応はまた、フリーラジカル開始剤
非存在下で、アクリレート二つの間の反応よりも好ましくは100倍、より好まし
くは1000倍、最も好ましくは10,000倍速く起こる。アミンとアクリレートとの間
の対応する反応においては、反応速度はフリーラジカル開始剤非存在下で、アク
リレート二つの間の反応よりも好ましくは10倍、より好ましくは100倍、最も好
ましくは1000倍速い。
【０２２０】 その後の架橋反応は一般に、二つの主な経路により、すなわちフリーラジカル
重合(ラウ(Lau)ら、Bioorg. Med. Chem. 3：1305〜1312、1995)または共役付加
反応のいずれかを用いて行うことができる。共役付加反応を介して優れた求核剤
と反応する、本発明の共役不飽和基は一般に、フリーラジカルのメカニズムによ
っても重合することができる。したがって、薬学的活性化合物の結合後に、少な
くとも一つの共役不飽和基が重合体上に残っている限り、その重合体はフリーラ
ジカルのメカニズムにより生体材料に組み込むことができる。不飽和基の数を、
薬学的活性化合物に存在するか、または結合されているチオールまたはアミン基
に比べて過剰に維持することにより、重合体上に少なくとも一つの未反応不飽和
基が確保される。これらの材料を架橋するための第二の経路は、薬学的活性化合
物に結合された重合体上に残っている共役不飽和基を、基底膜への細胞接着を増
大させるペプチド (配列番号73)などの、複数の求核剤を含む架橋分子と反応させることを含む。次
いで、別の共役付加反応を介して、材料を生成するための架橋を行う。
【０２２１】 そのような前述の架橋反応は、生存細胞および組織存在下で行うこともできる
(ラウら、上記)。したがって、薬物含有材料を実質的に体内のいかなる部位でも
配置または架橋することができる。この材料は、活性が望まれる部位での治療薬
のデポーとして機能する。有用な例は、悪性増殖を含む組織中に配置または重合
した生体材料からの治療薬の送達からなる。または、悪性増殖を組織から外科的
に除去してもよく、共有結合された薬学的活性部分を含む生体材料を悪性増殖を
除去した部位の近くに配置または重合することもできる。この生体材料からの元
の、または修飾された薬学的活性化合物の放出により、除去中に腫瘍から排出さ
れた腫瘍細胞の播種を防ぐことができ、または手術中に除去できなかった悪性細
胞のさらなる増殖を防ぐことができる。
【０２２２】 本発明の望ましい態様は、重合体を、薬学的活性化合物に結合されたチオール
またはアミン基に結合するための共役付加反応の利用であるが、チオールまたは
アミン基を重合体と反応させるために、求核置換反応を用いることもできる。こ
の態様は、薬学的活性化合物の重合体との反応を促進するためにリンカーを用い
、リンカーの加水分解により、一定期間、元の薬学的活性化合物を放出させる。
【０２２３】 間接的に結合された薬学的活性化合物の制御放出 薬学的活性化合物を直接共有結合することに加えて、それ自体が共有結合され
ている結合部分を介して、薬学的活性化合物を間接的に結合することにより、薬
学的活性化合物を放出することも可能である。薬学的活性物質を重合体に直接結
合することは魅力的かつ有利であるが、間接的に結合することも有利でありうる
。そのような手段を用いれば、有機合成を物質に対して直接行う必要がなく、物
質に結合親和性を示す結合部分に対して行う。本明細書において用いられる記号
Dで同様に表すことができる結合部分を、介在する加水分解可能なリンカーを有
する重合体に結合すると、結合部分が存在することで薬学的活性物質が結合され
、結合部分がなくなれば物質に対する結合部位もなくなり、したがって重合体か
ら薬学的活性物質が放出されることになる。コロイド生体材料またはゲル材料の
場合、結合部分が材料中に結合されると、薬学的活性部分と結合部分との間の解
離速度が比較的高い場合でも、結合部分が材料全体にわたって三次元的に存在す
ることにより結合が維持される。一つの解離事象が起こると、薬学的活性物質は
ほんの短い距離だけ拡散する機会を得るが、その後別の結合部分と結合する。こ
の再結合の速度は、材料内の結合部分の密度に依存する。結合部分が介在する加
水分解部位の水解によって材料から放出されるのに合わせて、その濃度は低下し
、生物学的活性物質の放出が比例的に速くなる。したがって、次の二つのアプロ
ーチを採用することができる：(1)Dが薬学的活性物質自体を表す、直接結合、お
よび(2)Dが薬学的活性物質に結合親和性を有する結合部分を表す、間接的結合。
【０２２４】 いくつかのクラスの結合部分が存在する。多くの生物学的活性タンパク質は固
定化金属イオン、特にCu2＋、Co2＋、およびZn2＋などのイオンに対する結合親
和性を有する。これらのタンパク質は典型的に、αヘリックス中に表面ヒスチジ
ン残基または二つのアミノ酸で隔てられたヒスチジン残基対を有する。そのよう
な固定化金属イオンに対する親和性を有する薬学的活性タンパク質の一例は、ヒ
ト成長ホルモンである。したがって、イミノ二酢酸基、ヒスチジンまたはhis-X-
X-hisペプチドなどの金属イオン結合部位を、結合部位Dとして組み込むことがで
きる。多くのタンパク質生物学的活性物質は、糖タンパク質、すなわち結合され
た糖質構造を有するタンパク質として生成される。ボロン酸残基などの、そのよ
うな構造に対する結合部分が存在する。ウィンブレード(Winblade)ら(Biomacrom
olecules 1：523〜533、2000)によって開示されているものなどの、生理的に適
切な範囲のpKaを有する、特に好ましいボロン酸残基が記載されている。したが
って、フェニルボロン酸部分を結合部分Dとして組み込むことができる。多くの
タンパク質薬学的活性物質は、ヘパリンなどの多糖構造に結合し、したがってヘ
パリンをDとして結合するか、またはDプラス可溶性ヘパリンとしてヘパリン結合
ペプチドを結合することができた。結合部分は、ファージディスプレイ系上のペ
プチドまたはミックスおよびスプリット固相合成におけるビーズ上のペプチドな
どの、様々な技術を用いてコンビナトリアル法により同定することもできる。し
たがって、コンビナトリアル法によって決定されたペプチドまたは他の分子を結
合部分Dとして組み込むこともできる。多くの小さい、疎水性有機分子は、シク
ロデキストリンなどのホスト内の封入複合体としてのゲストとして結合する。し
たがって、シクロデキストリン部分を結合部分Dとして組み込むこともできる。
【０２２５】 捕捉された薬学的活性化合物の制御放出 薬学的活性化合物の直接の共有結合、および結合部分の共有結合を介しての薬
学的活性化合物の間接的結合に加えて、これらを生体材料の網目内に捕捉するこ
とによって薬学的活性化合物を放出することが可能である。架橋材料において、
重合体の網目は、特にペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、RNA、およ
びDNAなどの高分子薬物の拡散に対する物理的バリアを形成する。網目サイズは
網目の成分の設計によって調節することができる。例えば、PEG-トリアクリレー
トの大量濃縮により生成された架橋材料は、同等の条件下でPEG-オクタアクリレ
ートの同等の大量濃縮により生成されたものよりも、透過性の高い網目を作ると
考えられる。したがって、高分子薬物の透過性を生体材料網目の設計によって調
節し、薬物の制御放出を行うことができる。
【０２２６】 以下に、本発明の組成物の調製、および本発明の方法について記載する特定の
実施例を示す。これらの実施例は、発明を例示する目的で提供しており、限定的
なものと解釈されるべきではない。
【０２２７】実施例1：基本試薬の調製 ポリ（エチレングリコール）ジオールのアクリル化 ポリエチレングリコール、分子量8000（50 g、6.25 mmol、12.5 mmol水酸基、
Aldrich、Milwaukee、WI、USA）をトルエン（500 ml）に加え、共沸蒸留によっ
て乾燥させた。混合物を0℃まで冷却し、100 mlの無水ジクロロメタン（Aldrich
）を加えた。トリエチルアミン（2.61 ml、18.75 mmol、水酸基に対して1.5当量
、Aldrich）を加え、次いで、塩化アクリロイル（acryloyl chloride）（2.03 m
l、18.75 mmol、1.5当量、Aldrich）を一滴づつ加えた。反応をアルゴン雰囲気
下で一晩、暗黒下で行った。作製物をろ過した後、ヘキサン中で撹拌することに
より沈殿として回収した。作製物を75 ｍlのジクロロメタンに再溶解させ、再度
、ヘキサン中で撹拌することにより沈殿させた。作製物を25 gのNaClを含む水50
0 mlに溶解させ、pHをpH 6に調節した。溶液はジクロロメタン（Aldrich）で3回
抽出した（エマルジョンの形成を避けるため、最初のジクロロメタンの抽出では
、激しく振るべきでない）。ジクロロメタン画分を全て回収し、撹拌しながらヘ
キサンを加えた。作製物をろ過により回収し、真空下で一晩乾燥した。1H-NMRに
よって、ポリエチレングリコールの80％のアルコールがアクリル化された（作製
物を、ポリエチレングリコールジアクリレートと呼ぶ）。
【０２２８】 ポリ（エチレングリコール）トリオールのアクリル化 PEGトリアクリレート（PEG-3A）はグリセロール核を持つ、3本の枝のPEGであ
る。分子量の記号（PEG-2500-3A、PEG-3500-3A）は総平均分子量を指し、単一の
枝の分子量を指したものではない。アクリル化は、PEGジオールに関して記載さ
れた反応物のモル分率と全く同じ比率を用いることで行われた。
【０２２９】 ポリ（エチレングリコール）ジオールのクロトニル化とジメチルアクリル化 クロトニルPEG-8000（PEG-8000-2C）（クロトニル、-OOC-CH=CHCH3）とジメチ
ルアクリロイルPEG-8000（PEG-8000-2DMA）（ジメチルアクリロイル、-OOC-CH=C
(CH3)2）を、並行した反応で同時に合成した。27 gのPEG-8000（3.375 mmol、6.
75 mmol水酸基、Aldrich）をベンゼンに溶解させ、蒸留液が透明になるまで共沸
させた。PEGベンゼン溶液を室温まで放冷した。そして溶液の100 mlを無水的に
丸底フラスコに移した。トリエチルアミン（100 mlの試料に対し1.1 ml、または
より大量（150 ml）の試料に対しては1.7 ml、水酸基に対して3当量、Aldrich）
をそれぞれのフラスコに加えた。クロトニル-Cl（1.2 ml、水酸基に対して3当量
、Fulka）を一滴づつ150mlの試料へ加えた。ジメチルアクリロイル-Cl（0.9 ml
、水酸基に対して3当量、Fulka）を一滴づつ100 mlの試料へ加えた。反応を暗黒
下で20時間続けた。溶液を紙でろ過し、ヘキサンで沈殿させた。両方の沈殿を真
空中で乾燥させた。修飾の程度は、1H-NMRによって（エステル化の程度により）
PEG-8000-2Cに対しては85％、PEG-8000-2DMAに対しては89％と決定された。
【０２３０】 ビス（ベンゾキノン）PEGの調製 段階A）ビス-カルボニルPEGの調製 17 g（5 mmol）の3400 PEGジオールを500 mlのトルエンに溶解させ、共沸蒸留
で乾燥させる。カリウムtert-ブチルオキサイド（15 mmol）の1 MTHF溶液を加え
、反応混合物を10分間環流した後、室温まで冷却する。次に5.4 ml（50 mmol）
のエチル2-ブロモアセトンを加え、溶液を40℃で24時間撹拌し、臭化カリウムを
除去するためにろ過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、冷ジエチルエ
ーテル内で沈殿させる。その後、固体を250 mlの0.2N NaOH（4N NaOHの滴下によ
ってpH12を維持する）に溶解させ、溶液を12時間撹拌し、濃塩酸の滴下によりpH
を4まで低下させた後、ジクロロメタンで抽出する。有機層を硫酸ナトリウムで
乾燥させ、冷ジエチルエーテル内で沈殿させる。修飾の程度は1H-NMRによって決
定される。
【０２３１】 段階B）ビス（カルボニル2,5-ジメトキシアニリド）PEGの調製 10 g（2.8 mmol、5.2ミリ当量）の3400ビス-カルボニルPEGを、2.0 g（6 mmol
）の2,5-ジメトキシアニリド（ヘキサンからの再結晶を3回行ったもの）を含むT
HF200 mlに溶解させ、次に0.73 g（5.8 mmol）のジイソプロピルカルボジイミド
を加え、溶液を室温で24時間撹拌する。沈殿したジイソプロピル尿素をろ過して
除き、THFはロータリーエバポレーターで蒸発させる。その後、重合物をトルエ
ンに再溶解し、溶液をろ過後、冷ジエチルエーテル内で沈殿させる。この操作を
2回繰り返す。修飾の程度は1H-NMRによって決定される。
【０２３２】 段階C）ビス（カルボニル2,5-ヒドロキシアニリド）PEGの調製 5 g（1.4 mmol、5.7ミリ当量）の3400ビス（カルボニル2,5-ジメトキシアニリ
ド）PEGを乾燥窒素雰囲気下で50 mlの乾燥ジクロロメタンに溶解させる。次に1.
2 g（6 mmol、0.82 ml）のヨウ化トリメチルシランを加え、溶液を24時間室温で
撹拌する。ジクロロエタン溶液を中性になるまで水で洗浄し、硫酸ナトリウムで
乾燥させ、ヘキサンで沈殿させる。反応収率は1H-NMRによって決定される。
【０２３３】 段階D）ビス（カルボキサミド2,5-ベンゾキノン）PEGの調製 5 g（1.4 mmol、5.6ミリ当量）の3400ビス（カルボニル2,5-ヒドロキシアニリ
ド）PEGを50 mlのエタノールに溶解させ、1.2 g（7.4 mmol）の塩化第三鉄を加
える。溶液を24時間室温で撹拌し、その後150 mlのジクロロメタンと150mlの水
を加えて二層に分離させる。ジクロロメタン層を水で3回洗浄し、その後濃縮し
て冷ジエチルエーテルで沈殿させる。反応収率は1H-NMRによって決定される。
【０２３４】 α,ω-ビス（ベンゾキノン）ポリ（乳酸）-PEG-ポリ（乳酸）ブロック共重合体
の調製（PEG末端当たり乳酸の2.5単量体ユニットを用いた例） 段階A）ポリ（乳酸）-PEG-ポリ（乳酸）ブロック共重合体の調製 17 g（5 mmol）の乾燥3400PEGジオール、3.60 g（0.025 mol）のdlラクチドお
よび15 mlのオクチル酸スズを共に乾燥窒素雰囲気下で混合する。反応混合物を2
00℃で2時間撹拌し、160℃で2時間撹拌し、その後室温まで冷却する。得られた
固体をジクロロメタンに溶解させ冷ジエチルエーテル内で沈殿させる。
【０２３５】 段階Bから段階E 段階Bから段階Eはビス（ベンゾキノン）PEGの調製における段階Aから段階Dに
類似している。
【０２３６】 ポリ（エチレン-co-ビニルアルコール-co-2-オキシビニル-（2',5'-ベンゾキノ
ン）アセトアミド）の調製 段階Aから段階D）ポリ（エチレン-co-ビニルアルコール-co-2-オキシビニル-酢
酸）の調製 これらの調製はビス（ベンゾキノン）PEGの調製における段階Aから段階Dに類
似している。
【０２３７】 ビス（4-ビニルピリジル）PEGの調製 30 mlの乾燥したNMPの中で、10 g（2.7 mmol）の新たに調製された3400PEGト
リフレートを24時間0℃で0.75 g（8 mmol）の4-ビニルピリジンと反応させた。
溶液を冷ジエチルエーテル内で沈殿させ、固体をジクロロメタンに再溶解し、再
び冷ジエチルエーテル内で沈殿させた。
【０２３８】 ペプチド合成 ペプチドを、パーセプティブバイオシステムズ（Perseptive Biosystems）（F
ramingham、MA、USA）のパイオニアペプチド合成機により、標準的なFmoc保護法
を用いて合成した。樹脂から樹脂1 g当たり8.8 mlのトリフルオロ酢酸（パーセ
プティブバイオシステムズ）、0.5 mlの水、0.5 mlのフェノール（Aldrich）お
よび0.2 mlのトリイソプロピルシラン（Aldrich）を用いて、室温で2時間ペプチ
ドを切り出した。溶液をエーテル内で沈殿させ、反応物をろ過で回収し、真空中
で乾燥させた。ペプチドをC18クロマトグラフィーで精製し、作製物を含む画分
をMALDI-TOF質量分析計で同定した。ペプチドをアルゴン雰囲気下-20℃で保存し
た。
【０２３９】 使用の前に、できるだけ酸化を防ぐために、システイン含有ペプチドを酸性溶
液および/もしくは脱気した溶液で湿らせて取り扱い、または真空もしくはアル
ゴン下で乾燥させた。
【０２４０】実施例2：共役付加反応によるゲルの形成 低分子量トリチオールとPEG結合不飽和物との共役付加によって形成されたゲル
：トリメチルオールプロパントリス（3-メルカプトプロピオン酸）およびPEGジ
アクリル酸 50 mgのPEG-8000-2Aを、0.1 g/mlで50 mM炭酸水素塩緩衝液（pH 8.4）とアセ
トニトリルを4:1で混合した溶液500μlに溶解させた。1.1μlのトリメチルオー
ルプロパントリス（3-メルカプトプロピオン酸）（アクリレートを基準として1.
25当量）を加え、溶液をボルテックスにより混合させた。トリメチルオールプロ
パントリス（3-メルカプトプロピオン酸）は溶液の中で完全には混和せず、水層
の中で小さな液滴の懸濁物を形成した。試料は2時間ではゲル化せず、一晩静置
された。トリメチルオールプロパントリス（3-メルカプトプロピオン酸）添加後
約12時間で、架橋された材料が形成された。材料に水を加えると、水によって膨
潤するが、溶解しなかった（時間尺度：不純物のために最終的にゲルが捨てられ
るまでの数週間）。
【０２４１】 同様に、より高いPEG濃度でより強い機械的性質を有するゲルが、最初に0.2 g
のPEG-8000-2Aを750μlの緩衝作用のない水および250μlのアセトンに溶解させ
ることにより形成された。4.4μlのトリメチルオールプロパントリス（3-メルカ
プトプロピオン酸）（アクリル酸塩基を基準として1.25当量）が加えられた。ト
リメチルオールプロパントリス（3-メルカプトプロピオン酸）はこれらの濃度（
4.4μlのトリメチルオールプロパントリス（3-メルカプトプロピオン酸）/250μ
lのアセトン）ではアセトンに可溶であるが、ボルテックスによりPEG溶液中で未
だ視覚的に不溶な懸濁液を形成した。2時間〜4時間後、高度に架橋された水に不
溶な材料が形成された。
【０２４２】 ペプチド結合求核剤とPEG結合共役不飽和物との共役付加反応によって形成され
たゲル ペプチド は酵素プラスミンによる加水分解感受性で、共役した不飽和基との付加反応のた
め1個以上のチオール（システイン）を含み、水に非常に溶け易いように設計さ
れた。ペプチドは前述の方法に従って合成された。ペプチドは、少なくとも120
mg/mlまでは非常に水に溶けやすい。
【０２４３】 ゲルは、PEG-2500-3Aおよび から、ならびにPEG-3500-3Aおよび から形成された。ゲルは、スルフヒドリル基に対するアクリレートの3種類の比
（1:1、1.1:1、1.25:1）において形成された。ゲルは、pH試験紙で調べたように
、pH 8.0からpH9.0に調整するためにトリエタノールアミンを含む10 mMリン酸緩
衝生理食塩水中で形成された（ゲル形成反応は50μlか、それ以下のスケールで
実行された）。ゲルは以下のように作製された：ペプチドを予め溶解させておき
、その後、ペプチド溶液にPEG-3Aを加える。または、PEG-3Aを予め溶解させてお
き、その溶液にペプチドを加える。または、両方を予め溶解させておき、その後
、両者を適当な割合で混合する。
【０２４４】 以下の方法は、40μlスケールでのゲル形成のために使われた。エッペンドル
フに量り取られるPEG-2500-3Aの量は、材料の粘性のために変化し、これにより
制御が多少困難になる。しかし、PEG-2500-3Aへ加えられる緩衝液の体積は、質
量/体積を基準とした最終濃度を同一とするために常に調整される。
【０２４５】 2.5 mgの をエッペンドルフチューブに量り取った。7.0 mgのPEG-2500-3Aを別のエッペン
ドルフチューブに量り取った。62μlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）・TEA（1ml
あたり13μlのトリエタノールアミンを含む10 mM PBS）をPEG-2500-3Aに加え、4
.5 mg/40 μlの溶液とした。PEG溶液をPEG-3Aが溶解するまで（5分未満）静置さ
せた。40μlのPEG-3A溶液をペプチドに加え、非常に早く溶解させた。移動に用
いたピペットチップを、約3秒間混合物を撹拌するのに用いた。試験紙（pH範囲1
〜11）によるpHの試験のために、1μlの試料を除いた。およそpH8.0であった。2
0分〜30分後、ゲルが形成された。
【０２４６】 求核剤（たとえばチオール）近傍の電荷の調節によるゲル化速度の制御 2種類のコラゲナーゼ（MMP-1）感受性ペプチド： および が、実施例1で記載された標準的なFmoc技法を用いて合成された。一つのペプチ
ドにおいて、関心対象のpHである中性のpH付近では（システイン、Cにおける）
チオール基は負電荷をもった残基（アスパラギン酸、D）の近傍に位置していた
。もう一方のペプチドにおいては、中性pH付近で、チオール基は正電荷をもつ残
基（アルギニン、R）の近傍に存在した。pH 8で、それぞれのペプチドはPEGのポ
リマーを含むアクリレートと別々に反応した。共役付加の速度は、エルマン試薬
、DTNBによるチオールの消費より遅かった。結果を図1に示す。チオール基に隣
接したDからR（負電荷から正電荷）への交換は反応速度を増加させ、ゲル形成の
チオール消費の半減期を約3分の1に減少させた。これは、チオールが共役付加に
関与するS型で存在する可能性が増大し、よって、反応およびゲル化の速度が増
加するように設計されたことにより、達成された。
【０２４７】 共役付加によって作られたゲルの膨潤（水の含量） ゲルは、20 μlスケールで0.1 g/ml、0.15 g/ml、および0.2 g/ml のPEG-2500
-3Aで作製された。ゲルはペプチド（求核剤）組成物、GCYKNRDCGにおいてスルフ
ヒドリル当たり1.1のアクリレートを含んだ。ゲル形成のために、高濃度のゲル
における余分なペプチドの付加的な酸性度を考慮して、pH 8.0〜pH8.5で反応す
るようにPBS緩衝液が調整された。ゲルが4通り作製された。
【０２４８】
【表６】 膨潤調査のための共役付加ゲル
【０２４９】 ゲルは、最初の湿潤重量測定の前に10 mM PBS, pH 7.3で48時間膨潤された。
ゲルは連続した3日間にわたって4回、湿潤重量を測定され、この期間の間、湿潤
重量において有意な増加はみられなかった。乾燥重量を得るために凍結乾燥され
た後、ゲルは4日間脱イオン水に浸漬されて液相が交換された。（実際の乾燥重
量における可変性による）最大可能乾燥重量を基準とした水含量は、全て湿潤ゲ
ルの質量の95％である。
【０２５０】 2種の粉末組成物の混合によって形成されるゲル 材料の前駆体もまた、乾燥状態で組織に送達されうる。例えば、2種の粉末組
成物が混合され、水、生理食塩水または生理的な液体中に溶解されたとき、たと
えばpH 8など2種の前駆成分の反応がおこるようなpHで溶液が形成されるように
、緩衝組成物を含む一方またはもう一方の組成物、しかし好ましくは両方の組成
物、つまり、PEGジチオールは粉末として調製されることができ、PEGテトラアク
リレートも粉末として調製されうる。これらの粉末組成物は、水流とともに、ま
たはそれなしで組織表面に噴霧されうる。水流とともに、あるいはそれなしで粉
末が噴霧された場合。粉末が水流とともに噴霧された場合、組織表面の生物学的
液体（biomaterial）の層に沿って重合体組成物は水流に溶解し、その後反応し
て最終的な生体材料の移植片を形成する。粉末組成物を組織表面に適用する場合
、重合体の前駆体と緩衝液組成物は生物学的な液体に溶解し、最終的な生体材料
の移植片を形成する反応する能力を持つ前駆体溶液を形成する。生物学的な液体
が重合体の前駆体組成物の溶解のための水分を供給する場所である場合、重合体
の前駆体組成物の濃度は高くてよく、強固な生体材料の移植片および組織への良
好な接着をもたらす。粉末の流れの応用において、粉末は一緒に混合されうり、
その後、単一の粉末混合物として湿潤した組織表面に適用されうるか、または2
種の組成物由来の噴霧中で混合されうる。粉末組成物は、沈殿、磨砕、粉砕、凍
結乾燥、噴霧乾燥などの粉末技術の当業者に既知の方法により形成されうる。小
さい粒子は水流中や組織表面の水分中のいずれかで、より効率的で迅速な溶解を
もたらす。2種の重合体の前駆体組成物は、アクリレート1モル当たりチオール1
モルベースにおいて、チオール組成物とアクリレート組成物がほぼ等当量となる
割合で共に混合されねばならない。さらに、生体材料の移植片の性質は、前記の
水溶液またはガスへ溶解するのが遅い粒子などの他の薬剤を前駆体粉末に混合す
ることによって、制御されうり、どちらも回復後、移植材料中での小孔形成をも
たらす。
【０２５１】実施例3：ペプチドを固定化し、培養物中の細胞で活性を試験するための一般的
プロトコール ペプチドが共役付加により固定化され、ゲルが共役付加によって形成されるよう
なゲルにおけるペプチドの固定化 13.9 mgのPEG-2500-3Aを69.5μl（5.0 mg/25μl）の を3.2 mgの の濃度で含むPBS・TEA（1ml当たり13μlのトリエタノールアミンを含む10 mM PB
S）に溶解させた。7.0 mgの を、65μlのPBS・TEA（2.7 mg/25μl）に溶解させた。 を、0.22ミクロンのフィルターを通してろ過した。9分間の反応時間後、 溶液を別々に0.22ミクロンのフィルターを通してろ過した。ろ過が完了したらす
ぐに、等体積（25μl）の二種の溶液をコーニング（Corning）平底組織培養処理
用ポリスチレン96ウェルプレートのウェルに加えた。二つの前駆体溶液のうち2
番目を加える時、ピペットのチップを、混合物を2秒〜3秒撹拌するために用いた
。その後、ゲルを37℃で静置させた。
【０２５２】 組み込まれた接着ペプチドが欠如した共役付加によって作られたゲルの細胞耐性 共役付加ゲルは、 中の0.1 g/mlのPEG-2500-3Aおよびスルフヒドリル基当たり1.1当量のアクリレー
トで作製された。ゲルを24時間、1％の抗生物質と抗真菌剤を含むダルベッコ改
変イーグル培地（幾つかは血清なしの条件下でまた幾つかは10％ウシ胎仔血清を
含む）で膨潤された。ヒト包皮線維芽細胞（継代後7代目；トリプシン/EDTA継代
）をゲルに播種した。2時間から40時間の時点では、細胞は球状のままで、広が
らなかった。細胞が次第に凝集していった。細胞の挙動は培地中の血清に依存し
なかった。組織培養処理ポリスチレンに播種された対照細胞は通常通り広がった
。
【０２５３】 組み込まれた接着ペプチドを含む共役付加によって作製されたゲルとの、細胞の
相互作用 共役付加ゲルはPEG-2500-3A、 およびペンダント型で挿入されたRGD含有ペプチド で作製された。ゲルは、 中の0.1 gのPEG-2500-3A/mlおよびスルフヒドリル基当たり1.1当量のアクリレー
トで作製された。ゲルは36時間以上、1％の抗生物質と抗真菌剤を含むダルベッ
コ改変イーグル培地（幾つかは血清なしの条件下でまた幾つかは10％ウシ胎仔血
清を含む）で膨潤された。RGDペプチドがPEG-2500-3Aの12個のアクリレート当た
り一つ組み込まれた時、（血清を含まない条件下での膨潤と血清を含む培地中で
の膨潤のいずれの場合も）ヒト包皮線維芽細胞（継代後8代目;トリプシン/EDTA
継代）はゲルに接着した。播種から6時間後、（いずれの培地条件においても）
細胞はゲルの表面に均一に分布し、播種された細胞の約50％が広がった。
【０２５４】 ポリエチレングリコールネットワークとの細胞の相互作用 ポリエチレングリコールネットワークと細胞の相互作用は標準的な組織培養方
法を用いてゲルにヒト細胞を播種することによって試験された。ヒト包皮線維芽
細胞またはヒト臍静脈内皮細胞を、クローンティクス（Clonetics)(San Diego,C
A,USA）から購入した。線維芽細胞を、10％のウシ胎仔血清と1％の抗生物質（全
てGIBCO BRL,Grand Island,NY,USAから購入）を含むダルベッコ改変イーグル培
地で、37℃5％CO2で培養した。内皮細胞を、10％のウシ胎仔血清と1％の抗生物
質（全てGIBCO BRL,Grand Island,NY,USAから購入）を含むM199培地で培養した
。培地50μl当たり100 mg/mlのヘパリン（Sigma、St Louis、MO、USA）と3 mgの
内皮細胞成長補助剤（Becton Dickinson Labware,Bedford,MA,USA）を加えた。
トリプシン/EDTA（GIBCO BRL）を用いて細胞を培地基質から除去し、遠心分離（
線維芽細胞に対して500 gで5分間、内皮細胞に対して250 gで5分間）し、ポリエ
チレングリコールゲルに播種する前に通常の細胞培養培地に再懸濁させた。
【０２５５】実施例4：反応作製物の化学分析 エルマン（Ellman）試薬を用いて測定した反応速度論 溶液のチオール濃度を測定するためにエルマン試薬が使われた。分析には、10 mlの0.1 Mリン酸緩衝液pH 8に40 mgのジニトロビスチオールニトロベンゼン（S
igma）を溶かした溶液（エルマン試薬）が用いられた。3 mlのリン酸緩衝液を加
えることによって、溶液をチオールの存在に関して試験した。エルマン試薬(100
μl)を加え混合した。15分後、溶液の吸光度を412 nmで測定した。モル吸光係数
は14150とした。
【０２５６】 アミノ酸であるシステインを用いて、エルマン試薬がpH 10で室温下30分以内
に検出可能なジスルフィド結合を形成しないことを示した。同じ条件でシステイ
ンを過剰量の分子量8000のPEGジアクリレートに加えたところ、チオールの濃度
は数秒のうちに元の値の0.2％まで低下して以後30分間減少せず、PEGジアクリレ
ートの存在下でのチオールの急速な消失を示した。PEGジアクリレートおよびア
ミノ酸であるシステイン間の共役付加反応を図2に示す。
【０２５７】 アミノ酸配列 （配列番号:62）を持つペプチドも同様に試験された。PEGジアクリレートを、1
ml中25μmolの濃度でpH8 リン酸緩衝液中に溶解させた。ペプチド（1 μmol）は
PEGジアクリレート溶液に加えられ、チオールの消失はエルマン試薬を用いるこ
とによりモニターされた（図3を参照のこと）。反応は異なったpHで行われ、更
にジスルフィド結合の形成は、同じ濃度ではあるがPEGジアクリレートの非存在
下でペプチドを溶かすことによって評価された。室温で、反応の半減期はpH 7.4
で約3分、pH 8でわずか数秒であった。
【０２５８】 チオールとPEGジアクリレートの間の反応をオンラインでモニターできるもう
一つの方法は、反応混合物の223 nmの吸光度をモニターすることである。この波
長では、吸光度は原則として4種の基質、チオール組成物、チオール組成物中の
ジスルフィド不純物、アクリレート、および作製物（β-アルキルチオプロピオ
ン酸エステル）による。実験は、20℃から37℃の間の種々の温度の10-2M PBS緩
衝液において行われた。
【０２５９】 反応基の総モル濃度を一定にしながら、反応物の比を変えて実験を行ない（図
4）、反応前後の吸光度をあわせることで、すべての種の吸光係数が計算されう
る。この方法は、反応物と作製物の濃度の時間変化を別々に追跡することを可能
にした。つまり、PEGDAおよびシステインは同様の反応速度定数をもつ単一の指
数関数的な挙動を示し、これは、全ての反応物に関する反応が1次であることを
証明した。半減期が2分から10分の間で、温度に依存し、反応物の濃度が記録さ
れた。表7においては、速度定数が列挙されている。
【０２６０】
【表７】 異なったPEGDA含量における、2.5×10-3Mの総累積濃度でのPEGDA-シ
ステインの反応の一次反応速度定数
【０２６１】 PEGジアクリレートと1級アミンとの反応もまた評価された。PEGジアクリレー
トは、ペプチドのアミノ末端にわずか一つの1級アミンを含むアミノ酸配列 を持つペプチドと混合された。アミンの存在はフルオレスカミン分析によって測
定された。フルオレスカミン（Sigma）を乾燥アセトンに1.5 mg/ml で溶解させ
た。ペプチド（1 mg）を100μlのpH 8、0.1 Mリン酸緩衝液に加えた。PEGジアク
リレート、分子量8000（100 mg）を900 μlのpH 8、0.1 Mリン酸緩衝液に溶解さ
せ、ペプチド溶液と混合させた。試料を反応物から取り出し、1.5 mgのフルオレ
スカミンを溶かした乾燥アセトン溶液100 μlに加え、pH 9の50 mMホウ酸溶液で
1 mlにした。
【０２６２】 蛍光強度は蛍光分光光度計を用いて測定され、アミノ酸であるグリシンを用い
て作製した検量線との比較により濃度が測定された。アミンとアクリレートとの
反応の半減期は、pH 8、37℃で、約90分である。
【０２６３】 サイズ排除クロマトグラフィーを用いて評価されたPEG-ペプチド付加物の作製 水溶性サイズ排除クロマトグラフィーは、ショーデクスオーパック（Shodex O
Hpak）SB-803カラム（昭和電工、東京、日本）、UV検出、および200 nm〜400 nm
の吸光度測定により行われた。溶出液はリン酸緩衝生理食塩水（10 mMリン酸ナ
トリウム、140 mM NaCl、pH 7.4）であった。PEGジアクリレートは極大吸収を20
5 nmにもち、一方、使用されたペプチド はアミド結合およびチロシンの存在のため、吸収極大を220 nmおよび270 nmにも
つ。PEGジアクリレートを1 ml中に25 μmolの濃度で、pH 8の0.1 Mリン酸緩衝液
に溶解させた。溶液の試料はサイズ排除カラムクロマトグラフィーを用いて分離
され、吸収極大を205 nmにもち、220 nmや270 nmには吸光度をもたないポリエチ
レングリコールは単一のピークとして溶出した。次に、ペプチド（12.5 μmol）
をPEGジアクリレート溶液に加え、室温で5分間反応させた。その後試料をサイズ
排除クロマトグラフィーで分離し、吸収極大を205 nm、220 nm、270 nmにもち、
PEGジアクリレートと同じ保持時間を有する単一のピークを検出した。これによ
りペプチドがPEGジアクリレートと反応することが示された。同様の研究が、C18
クロマトグラフィーを用いて0.1％のトリフルオロ酢酸、5％のアセトニトリルを
含む95％の水から、0.1％のトリフルオロ酢酸、60％のアセトニトリルを含む40
％の水グへの勾配を用いて行なわれた。ペプチド は約20％のアセトニトリルで溶出し、一方、PEGまたはPEG-3400ジアクリレート
は約40％アセトニトリルで溶出した。2 molのPEG-3400ジアクリレート当たり1 m
olのペプチドを、pH8で緩衝された水中でインキュベートすると、20％アセトニ
トリルで溶出するペプチド関連のピークが消失し、40％アセトニトリルでPEGの
ピークと共溶出した、220 nmと270 nmの吸光度バンドが現れた。ピークを回収し
、MALDI-TOF質量分析計で分析することにより、PEG関連のピークは未修飾のPEG-
3400ジアクリレートの混合物ならびにPEG-3400ジアクリレートおよびペプチドの
分子量の合計である分子量をもつ新たな化学種を含むことが示された。
【０２６４】 アクリレート、クロトニレート、およびジメチルアクリレート末端化PEGとシス
テインとの反応速度論の分析 チオールおよび共役不飽和基が最初に等モル濃度（20μmol）になるように、
アミノ酸であるシステインを溶液（0.1 Mリン酸、pH 8）中で、官能基の結合し
たPEG（PEG-8000-2A、PEG-8000-2C、およびPEG-8000-2DMA）と混合させた。ジメ
タクリロイル基の存在下では、その後の時間尺度（10分間）において、チオール
の消費速度は本質的に0であった。より立体障害の小さなクロトニル基（二重結
合においてひとつのメチル基の置換）の存在下では、チオールの消費速度は増加
した。もっと立体障害の小さなアクリレートにおいては、チオールの濃度の減少
はもっと迅速であったが、以下の時間経過内では完了しなかった。図5参照のこ
と。
【０２６５】 共役した不飽和基の濃度がチオール基の10倍である実験においては、アクリレ
ートによるチオールの消費は極端に速かった。反応は、1分後に最初の試料を取
り出したことにより終了した（データは示していない）。
【０２６６】実施例5：システイン含有ペプチドとアクリル化ポリマーとの間に形成された結
合の加水分解の証明 溶液中での加水分解 ペプチド 脱イオン水に溶解させ、PEG-8000ジアクリレートを10 mM HEPESと115 mMトリエ
タノールアミンでpH 8に緩衝された脱イオン水に溶解させた。2 molのPEG-8000
ジアクリレート当たり1 molのペプチドを混合した後、C18クロマトグラフィーで
0.1％のトリフルオロ酢酸および5％のアセトニトリルを含む95％の水から、0.1
％のトリフルオロ酢酸および60％のアセトニトリルを含む40％の水への勾配を用
いて反応を追跡した。ペプチド は約20％アセトニトリルで溶出し、一方PEGまたはPEG-8000ジアクリレートは約4
0％アセトニトリルで溶出した。20％アセトニトリルにおける遊離ペプチドのピ
ークが迅速に消失し、ペプチドはその後、40％アセトニトリルでPEGのピークと
共溶出した。PEGペプチド付加物を含む溶液をその後、37℃でインキュベートし
、ポリマーからのペプチドの加水分解を検出するために、後の時点で、C18クロ
マトグラフィーへの注入を行った。これは、PEGのピークと共溶出した273 nmで
のシグナルにおける減少と、約20％アセトニトリルでの遊離ペプチドのピークの
再出現を観察することによって測定された。約20％アセトニトリルで溶出する新
たなピークのMALDI-TOFF質量分析は、もとのペプチドの分子量＋72質量ユニット
に相当する分子量をもつ作製物を明らかにした。これは、新たなピークはプロピ
オン酸で修飾されたペプチドを含んでおり、このペプチドは、ペプチド上のシス
テイン残基およびアクリレート基との間に期待される以下の共役付加の作製物で
、その後に修飾されたアクリレートのエステルが加水分解される。ペプチドとPE
Gの間のエステルの加水分解の半減期は4.86日であることが見出された。これは
、加水分解の半減期がpH 7.4で3週間であることに対応する。
【０２６７】 チオールを含むペプチドとアクリレートとの反応によって形成されるゲルの分解 PEG-3400トリアクリレートを濃度20％（W/V）で、50 mM HEPES緩衝生理食塩水
pH 8.0に溶解させた。PEG-3400ジチオール（Shearwater Polymers, Huntsville,
AL, USA）を、1 mM MES緩衝生理食塩水pH 5.6に濃度20％（W/V）で溶解させた
。溶液は、アクリレート1：チオール1の割合で混合された。37℃で数分後にゲル
が形成され、その後ゲルを10 mM HEPES緩衝食塩水pH 7.4を含む試験管に移し、3
7℃でインキュベートした。最初の一週間、HEPES緩衝生理食塩水を毎日交換し、
試験管内に残存しているゲルの存在を毎日評価した。架橋後18日から24日の間で
試験管からなくなるゲルを用いて、固体のゲルが約3週間後には試験管内からな
くなることが見出された。これは、遊離基架橋（Pathak、前記）によってPEG-80
00ジアクリレートから形成されるゲルに匹敵し、これはpH 7.4、37℃において4
ヵ月後もまだ存在している。
【０２６８】 チオールを含む分子とアクリレートとの反応によって形成されたゲルの分解 13.9 mgのPEG-2500-3Aを、69.5μl（5.0 mg/25μl）のPBS・TEA（1ml当たり13
μlのトリエタノールアミンを含む10 mM PBS）に溶解させた。7.0 mgのGCYKNRDC
Gは65μlのPBS・TEA（2.7 mg/25μl）に溶解させた。等体積（25μl）の二つの
溶液を、コーニング平底組織培養処理ポリスチレン96ウェルプレートのウェルに
加えた。二つの前駆体溶液を加える時、ピペットのチップを、混合物を2、3秒撹
拌するために使用した。その後、ゲルを37℃で静置した。次にゲルを10 mM HEPE
S緩衝生理食塩水pH 7.4を含む試験管に移した。ゲルを37℃でインキュベートし
、固体のゲルの消失がその後目視された。14日から21日の間ですべての固体ゲル
は消失し、それらがペプチドとPEGとの間のエステル結合の加水分解によって分
解されたことが示された。
【０２６９】 局所的な環境における変化を通じた加水分解速度の制御 13.9 mgのPEG-2500-3Aを、69.5μl（5.0 mg/25μl）のPBS・TEA（1ml当たり13
μlのトリエタノールアミンを含む10 mM PBS）に溶解させた。7.0 mgの を65μlのPBS・TEA（2.7 mg/25μl）に溶解させた。等体積（25μl）の二つの溶
液を、コーニング平底組織培養処理ポリスチレン96ウェルプレートのウェルに加
えた。二つの前駆体溶液を加える時、ピペットのチップを、混合物を2、3秒撹拌
するために使用した。その後、ゲルを37℃で静置した。次にゲルを10 mM HEPES
緩衝生理食塩水pH 7.4を含む試験管に移した。ゲルを37℃でインキュベートし、
固体のゲルの消失がその後目視された。ペプチドにおいて見出された余分なリジ
ン（「GKKKK…」）が、エステル結合の局所的環境への更なる求核試薬を供給す
るために添加された。さらに、この基のカチオン性の性質はまた、局所的なpHの
上昇をもたらす。これらの二つの効果の組み合わせがペプチドおよびポリマーの
間のエステル結合の加水分解速度を増大させると期待される。
【０２７０】実施例6：2個のシステイン残基を含むペプチドと、その間のプラスミン基質配列 との共役付加によって形成されたゲルのプラスミン加水分解および置換ペプチド の加水分解の欠如の証明 共役付加によるゲルの合成 酵素やペプチドはキラル（chiral）であるので、 の立体化学が、共役付加によって作製されたゲルに対する、プラスミンに安定な
求核剤を作製するために変更された。このプラスミンに安定なペプチドは、 であった。 の非常に良好な水溶性の性質を維持するため、他の点では配列は変えられなかっ
た。
【０２７１】 分析的なC18 HPLC（水中のTFA0.1％以上の直線状アセトニトリル勾配）を、 の相対的なプラスミン安定性を確認するために使用した。以下の試料を用いた： （マイクロモルの）プラスミンは、（ミリモルの）ペプチドの1/1000の濃度で存
在しており、それゆえ、クロマトグラムの重なった吸光度に影響を与えなかった
。ペプチドの溶出のトレース（220 nmまたは278 nmの吸光度）に対してペプチド
-プラスミンのトレースを重ねることにより、 ペプチドの大部分が37℃において約一時間で分解されたことが示された。 ペプチドはしかし、24時間後でもプラスミンによって影響を受けず、試料中のプ
ラスミンの寿命を超えて、影響を受けないままであった（試料はC18に二週間注
入された）。
【０２７２】 プラスミン感受性およびプラスミン耐性の証明 上述の40μlプロトコールに従ってゲルが作製された。幾つかはL配置のLysとA
rgをもつ ペプチドを含んだ。もう一方はその代わりに を含んだ。全てが200μl中の0.2ユニットのプラスミンに曝露され、37℃でイン
キュベートされた。ペプチドのL-Lys、L-Arg配置は酵素によって容易に分解され
た。ある場合には、6時間後にはゲルが残っていなかった。DLys、DArg配置のゲ
ルはプラスミン分解による分解が示されなかった。
【０２７３】実施例7：光重合化によって形成されたポリエチレングリコールゲルへのペプチ
ドの組み込み ゲルの合成 分子量8000のポリエチレングリコールジアクリレート（230 mg/ml）を、HEPES
緩衝生理食塩水(10 mmol HEPES、Sigma、8 g/L NaCl、pH 7.4)に一時間溶かした
。トリエタノールアミン（Aldrich、15.3 μl/ml）を加え、溶液のpHを6N HClで
pH 8に調製した。システイン含有ペプチドを116.5μlのHEPES緩衝生理食塩水に
溶かし、870μlのPEG溶液をボルテックスしながら加えた。5分後、3.5 μlのN-
ビニルピロリドンおよび10 mMのエオシン（Eosin）Y 溶液10 μlを加え、続いて
ボルテックスした。ゲルを、75 mW/cm2の光（Cermax Xenon Lightsource、470nm
から520 nmの間の光を透過;ILC Technology、Sunnyvale,CA,USA)に一時間さらす
ことによって形成した。ゲルをpH 7.4のトリス緩衝生理食塩水（1L当たり4.36 g
Tris HCl、0.64 g Trizma base、8 g NaCl、0.2 g KCl、全てSigmaから購入）
の中で36時間膨潤させた。
【０２７４】 光重合化によってゲルが形成される共役付加によって挿入されたペプチドを含む
PEGゲルと細胞の相互作用 PEGゲルはペプチド を用いて、上述のように調製された。大部分の細胞は 配列を認識する受容体をもっており、細胞は、ペプチドを含む固定化されたRGD
を示している表面と相互作用すると考えられる。共役付加によって組み込まれた
ペプチドを含むPEGゲルと細胞との細胞相互作用を試験するためにゲルが形成さ
れ、ヒト臍静脈内皮細胞はゲルに播種された。表面で細胞がペプチドと相互作用
していることを示す、表面上の細胞の形の変化が観察された。形の変化は広がり
と呼ばれ、表面での球状から平面状および多面体状の細胞の形の変化のことを指
す。ペプチドのないPEGゲル上では細胞の広がりが起こらず、また、 ペプチドの特異性は、同じアミノ酸残基を含むが異なった配列であり、生物学的
な活性を持たない ペプチドを含むゲルとの比較によって確認された。細胞がゲル上に1 mm2当たり4
00細胞の割合で播種され、面積当たりの広がった細胞の数を数回にわたって計測
した（図6参照）。実験は、通常の細胞培養培地を用いて行われた。共役付加反
応を用いてゲル中に組み込まれたペプチド を含むゲルの上だけで、細胞は広がることができた。
【０２７５】実施例8：共役付加反応を用いたpH感受性ゲルの形成 ペプチド が、上述のように合成された。ペプチド（10 mg）を、15 μlの10 mMリン酸緩衝
生理食塩水pH 7.4および25 μlのエタノールに溶解させた。溶液のpHを1N NaOH
を用いてpH 5.8に調製し、その後、分子量400のPEGジアクリレート（7.5 μl、A
ldrich）を加えた。混合物は37℃で5分間インキュベートされた。ヒドロゲルが
形成され、pHを7.4から5.8に変えることにより直径が約50％増加することが示さ
れた。
【０２７６】 37℃で10分間ボルテックスさせながら上記のゲル化溶液に94 mgのハイパーマ
ー（Hypermer）B239 （ICI Surfactants, Wilmington, DE, USA）を含む1 mlの
シクロヘキサンに加えることにより、ゲルが球状に重合化された。直径2 μmか
ら20 μmの範囲の球が作製され、pHを7.4から5.8に変えることで直径が約50％増
加することが示された。
【０２７７】実施例9：タンパク質送達への応用のための粒子の形成 PEG-3400トリアクリレートを、2％のアルブミン(Sigma、St.Louis, MO,USA)を
含む50 mM HEPES緩衝生理食塩水pH 8に、20％（w/v）の濃度で溶解させる。PEG-
3400ジチオール（Sharwater Polymers, Huntsville,AL,USA）を、1 mM MES緩衝
生理食塩水pH 5.6に20％(w/v)の濃度で溶解させる。溶液を、アクリレート1：チ
オール1の割合で混合する。液体溶液（50 μl）に、100 mgのハイパーマー B239
(ICI Surfactants,Wilmington, DE,USA) を含む1 mlのシクロヘキサンを急速に
攪拌しながら迅速に加える。混合物を37℃で30分間加熱する。その後、重合化し
たタンパク質を含む球を余分のシクロヘキサンで洗浄して界面活性剤を除き、続
いてシクロヘキサンを除くために真空中で乾燥させる。次に粒子をHEPES緩衝生
理食塩水pH 7.4に再懸濁させる。微粒子からのタンパク質の放出を、毎日再懸濁
培地を変えることにより測定し、再懸濁培地中のタンパク質を、280 nmでのUV検
出と組み合わせたサイズ排除クロマトグラフィーを用いて評価する。再懸濁培地
中のタンパク質濃度は、280 nmにおけるアルブミンの濃度検量線から決定される
。
【０２７８】実施例10：共役付加によって組み込まれたペプチドを用いた細胞および組織に対 する標的化PEGトリアクリレート微粒子 実施例7で示されたように微粒子はPEGトリアクリレートおよびペプチド との共役付加架橋によって形成されるが、 の割合で、付加的にペプチド も反応混合物に含まれる。生物活性なペプチドが、生物活性なペプチドを含まな
い微粒子と比較して、細胞の表面に微粒子を局在化させる能力を試験される。
【０２７９】実施例11：共役付加によって形成されたゲルによる薬剤カプセル化および送達 共役付加によりPEGゲルを形成するための条件は非常に穏和（室温から37℃、p
Hは約8.0、水溶性の溶媒中）であるので、タンパク質薬剤のような薬剤は送達の
ためゲル中に組み込まれる。そのような穏和な条件はほとんどのタンパク質を変
性させない。薬剤はいろいろな様式で挿入される。一つの方法において、タンパ
ク質またはその他の薬剤（PEG感受的および酵素感受的なペプチドの両方のため
に、水、エタノール、アセトニトリルまたは他の溶媒に可溶な薬剤で、水性緩衝
液に交換されうる）はゲル形成の間にゲルの小孔の空間に捕捉される。遊離シス
テインは天然のタンパク質において相対的に稀であるので、ゲルと架橋するタン
パク質が問題となる場合は僅かである。また、共役した不飽和化合物の、タンパ
ク質中の他の求核剤（水酸基およびアミノ基）への添加はスルフヒドリル基に比
べ非常に遅いので、反応の選択性は非常に良い。膨潤状態におけるゲルの小孔空
間よりも薬剤が大きい時は、分子量や前駆体の濃度による制御のため、薬剤は適
当な速度でゲルの外へ拡散するのではなく、むしろゲルの表面の酵素的分解によ
って放出される。
【０２８０】 タンパク質放出の拡散および分解制御：ゲル小孔空間に閉じ込められたミオグロ
ビンの放出 タンパク質であるミオグロビン（17,000 Da）は、チオールおよびアクリレー
トの間の共役付加によって作製されたヒドロゲルから放出された。PBS、pH 7.4
中の0.2 g/mlPEG-3500-3Aは、チオールとアクリレートの濃度が同じでPEG-3500-
3Aの最終濃度が10％（前駆体溶液）になるように、プラスミン感受性ペプチド の溶液と混合された。幾つかの前駆体溶液に対して、ミオグロビンが加えられた
（195 μlの前駆体溶液あたり5.2 μlの9.8 mg/mlのミオグロビン溶液）。ミオ
グロビンは、大きさが同じであることから、BMP-2のような成長因子のためのモ
デルタンパク質として選択された。ミオグロビンを含むまたは含まない200μlア
リコートの前駆体溶液は、止血用コラーゲンスポンジ上に作製された。幾つかの
対照スポンジに、5.2 μlの9.8 mg/mlのミオグロビン溶液がゲル前駆体なしに加
えられた。幾つかのスポンジに、ミオグロビンの代わりにPBSが加えられた。ス
ポンジの中でゲルが固形化した後、各試料はが細菌や真菌の混入を防ぐため、0.
1％のアジ化ナトリウムを含む4 mlの10 mM PBS pH 7.4でインキュベートされた
。6時間、12時間、24時間後および、2日、3日、7日、13日後、それぞれの試料か
ら液層が除去され、0.1％のアジ化ナトリウムを含む新鮮なPBSで置換された。13
日後、溶液が4 ml PBSの0.08ユニットのプラスミンで置換され、図7の垂直線で
示された不連続性が現れた。溶液をBIORAD/Bradfordタンパク質微量分析法を用
いて展開し、既知の濃度のミオグロビン溶液から作製された検量線と比較した。
ヒドロゲル材料中のミオグロビンを含む試料がミオグロビンを遅れて放出（拡散
律速）することが示されるが、酵素であるプラスミンによってヒドロゲルが分解
されると、放出されるタンパク質の総量はスポンジだけ（ヒドロゲルなし）から
放出される総量と変わらない（データは示していない）。
【０２８１】 組み込まれた親和性部位を用いた放出 もう一つの方法において、ヘパリン結合成長因子のような薬剤は、ゲルの中へ
静電的に隔離される。本方法は、特に膨潤状態のゲルで、さもなくば小孔を通っ
てゲルの外へ拡散してしまうような、比較的低分子量の化合物を閉じ込めるのに
効果的である。隔離は、種々の方法で行われる。
【０２８２】 最初の試みにおいて、共役付加によるゲル形成の間、一つまたは複数のシステ
インを含むヘパリン結合ペプチド（つまり、ペプチドが付加物あるいは架橋用と
なりうる）、ヘパリン、およびヘパリン結合成長因子が含まれる。第2番目の試
みにおいて、以前全く存在していなかった（あるいは、ごく親和性の低い部位し
かなかった）ヘパリン結合領域における分子生物学的技術や遺伝子工学によって
、人為的なタンパク質が作製される。第3の試みにおいては、対になっていない
システインを含む、人為的なタンパク質を作製する。その後ゲル形成段階の間に
、このシステインリンカーを通じてタンパク質を共有結合させる。第4の試みに
おいて、対になっていないシステインおよび酵素感受性領域の両方を人為的タン
パク質中に導入する。このタンパク質はまた、ゲル形成において共役付加ゲル内
に共有結合的に組み込まれるが、該タンパク質は適当なプロテアーゼの存在下で
放出され、これは、バルクのゲルまたは特異的な酵素が劣化することと同じであ
りうる。第5の場合において、成長因子を静電的に隔離するために、チオール、
たとえばシステイン残基において、または共役不飽和を含むヘパリン類似物を作
製し、ヘパリン結合成長因子の存在下で、材料の中へ共有的に組み込んだ。
【０２８３】 成長因子の親和性の組み込みおよび持続性放出のための成長因子の隔離 ヘパリン結合成長因子を含むヘパリン結合タンパク質は、材料形成において非
共有結合的に材料に結合される。もし、結合されるタンパク質が天然のヘパリン
結合配列を含んでいないならば、天然のタンパク質配列および合成ヘパリン結合
ドメインを含むように融合タンパク質が構築される（分子生物学的技法を用い、
DNAレベルから開始する）。
【０２８４】 たとえば、神経成長因子（NGF）は、タンパク質がN末端にヘパリン結合ドメイ
ンを、該タンパク質のC末端にNGFの配列を含むような融合タンパク質として大腸
菌内で発現する。これは、所望の融合タンパク質をコードするDNAを含む合成遺
伝子を構築することで達成される。発現されるタンパク質配列は、以下の通りで
ある。 ここで、斜体の領域は発現ベクター由来のヒスチジンタグで、下線の領域はトロ
ンビン切断部位である。太字で示されたアミノ酸は、ヘパリン結合配列を示して
いる。
【０２８５】 遺伝子を組み立てるために使われるクローニングプラスミドはpUC 18である。
遺伝子のDNA配列は以下の5'末端から3'末端である： この遺伝子は、pUC18のポリリンカークローニング部位のEcoRI部位とHindIII部
位の間に挿入されている。組み立て後、この遺伝子は発現ベクターに挿入される
。その後発現と精製が行われる。
【０２８６】 上記実施例1に記載された標準的なFmocペプチド合成を用いて、 （配列番号:71；表5参照）のようなヘパリン結合ペプチドが合成される。材料形
成のため、ペプチドは共役した不飽和前駆体とあらかじめインキュベートされ、
融合タンパク質はヘパリンとあらかじめインキュベートされる。その後ペプチド
が共役した不飽和物と共有結合し、同時に、ヘパリンがペプチドとタンパク質の
間に非共有結合的な架橋を形成するように、融合タンパク質-ヘパリン複合体が
ペプチド-不飽和物に加えられる。そして、架橋する前駆体を含むチオールが加
えられ、ヘパリン結合タンパク質を全体にわたって含む材料が形成される。
【０２８７】 タンパク質の共有結合的な組み込みと酵素的に制御された放出の可能性 融合タンパク質が、関心対象のタンパク質、および、一方の末端にプラスミン
のような酵素によって分解可能な短いペプチド配列、および、タンパク質分解の
ための部位から遠位にシステインを含むように構築される。システインは、材料
形成の際に、材料の中にタンパク質が共有結合的に組み込まれることを可能にす
る。タンパク質分解のための部位は、細胞活性、たとえば、細胞の移動において
用いられるプラスミンまたはコラーゲンのようなプロテアーゼの活性化によって
決定された速度で、その天然型におけるタンパク質の放出を可能にする。タンパ
ク質の放出は、材料それ自身を分解するだけでなく、同じまたは異なった酵素に
よって制御されうる。酵素的な放出なしで、タンパク質と材料との共有結合が望
ましい場合もある。このような場合には、タンパク質は（たとえば、タンパク質
の一方の末端における）対になっていないシステインを含むが新たなタンパク質
分解部位を含まないように、DNAレベルから開始して操作される。
【０２８８】 たとえば、血管内皮成長因子（VEGF）は、タンパク質のN末端近くにシステイ
ンを導入するように部位特異的突然変異導入を行うことで、改変される。分子生
物学的方法が、タンパク質の合成、精製、折り畳みのために使われる。タンパク
質はタンパク質中のチオールに対して過剰量のアクリレートを含むPEG-トリアク
リレートとインキュベートされる。2個のチオールを含むプラスミン感受性ペプ
チド が全体にわたって組み込まれた成長因子を含む材料と架橋するために加えられる
。
【０２８９】実施例12：タンパク質分解によって薬剤として放出されうる共有結合的に結合さ れたプロドラッグによる材料からの薬剤（非タンパク質薬剤を含む）の送達 材料内へのプロドラッグの共有結合的な組み込みのためのもう一つの方法が記
載されている。材料が可溶性である場合、材料からプロドラッグを送達できる。
薬剤の大きな分子量の改変は、循環時間、プロドラッグの標的化、免疫耐性およ
び細胞取り込みの様式を調節するために用いられる。安定な担体-薬剤結合が送
達のために望ましい。しかしながら、望ましい部位に到着すると切断されること
ができる結合が、関心対象である。結合の一つの組成物がタンパク質分解酵素に
認識されるL-アミノ酸であるようなアミド結合が適当である。コペセック（Kope
cek）ら（Pato, J., M Azori, K., K. Ulbrich, J. Kopecek, Makromol. Chem.
誌, 185巻：231〜237, 1984年）はこのような酵素的分解可能な可溶性の高分子
量薬剤担体に関して多くの文献を公開してきた。しかしながら、ヒドロゲルのよ
うな固体材料からの酵素的に制御された薬剤送達についてはほとんど研究されて
いない。固体材料からの送達は、所望の部位、たとえば、材料形成の部位に薬剤
送達を局在化させることに役立つ。薬剤放出がタンパク質分解酵素の発現のよう
な細胞活性によって行われる固体材料からの送達は、細胞活性（たとえば、細胞
の移動）が放出の速度を決定するように、放出の速度を制御する。
【０２９０】 （抗がん剤ドキソルビシンまたはダウノルビシンのような）薬剤の官能基は、
アミノ官能基以外が保護される。薬剤のアミン基は、アミド結合の形成によって
アミノ酸またはペプチドと結合する。それゆえ、アミノ末端をリジンやアルギニ
ンに切断するプラスミンのようなタンパク質分解酵素によって、アミノ酸または
ペプチドと薬剤が結合しているアミド結合において、アミノ酸またはペプチドは
、アミノ末端がアミノ酸（Y）またはペプチド（XXXXY；配列番号:72）に分解可
能なように選択される。チオール（たとえばシステイン）は、結合したペプチド
に含まれるか、または、ペプチド-薬剤共役部分のアミノ酸もしくはペプチド部
分の隣に結合されるかのどちらかである。（SH-XXXXY-薬剤を与えるため）薬剤
およびペプチドの官能基は脱保護されている。材料形成の際には、チオール-ペ
プチド-薬剤の共役は、材料前駆体内の共役不飽和物におけるチオールの共役付
加によって、材料と共有結合する。薬剤は、薬剤を材料へ結合しているアミド結
合（Y-薬剤）を切断するプラスミン分解のような酵素的活性によって、材料から
放出される。
【０２９１】 または、（プロスタグランジンのアンタゴニストであるジクロフェナックのよ
うな）薬剤の官能基は、カルボキシル官能基以外が保護される。カルボキシル基
はペプチドのアミノ末端においてアミド結合を形成することにより活性化され、
ペプチドと結合する。それゆえ、このペプチドはカルボキシル末端を特定のアミ
ノ酸（Y）になるように切断するタンパク質分解酵素によって、ペプチドと薬剤
を結合しているアミド結合においてチオール（たとえばシステイン）を含み、カ
ルボキシル末端がペプチドに分解されうるように設計される。薬剤およびペプチ
ドの官能基は脱保護されている。材料形成の際には、チオール-ペプチド-薬剤の
共役（薬剤-YXXXX-SH）は、材料前駆体内の共役不飽和物においてチオールの共
役付加によって材料と共有結合する。薬剤は、薬剤を材料へ結合しているアミド
結合（薬剤-Y）を切断する酵素的活性によって、材料から放出される。
【０２９２】実施例13：組織の再生 ラットにおける異所性（皮下の）骨形成 本質的に実施例3に従って、しかし滅菌条件下、ならびにPEG-3500-3A、1：1の
アクリレート：チオールのモル比、および1/12の のモル比を用いて材料を作製した。ゲル形成時には、骨形成を誘導する組み換え
ヒト成長因子、BMP-2を、前駆体溶液の濃度250 μl/mlで前駆体溶液に加えた。
前駆体溶液を止血用コラーゲンスポンジ（Helistat、直径8 mm、高さ約3.5 mm）
に加えた。前駆体溶液を、スポンジがそれ以上溶液を吸収できなくなるまで（約
160 μl）加えた。ゲルは、スポンジ中で固体化された。ゲルを簡単にPBSで洗浄
し、その後、ラットの皮下に移植するまで、最低限に湿った状態にしておいた。
移植片を2週間後に除去し、固定し、ヘマトキシリンおよびエオシン染色をした
。材料に非常に少量の残余の材料が残っていて、細胞によりよく浸潤されており
、骨形成（石灰化および髄形成）および血管新生が促進されていた。このことは
、材料が活性な生体分子（たとえば、成長因子）を送達することができ、インビ
ボで細胞によって浸潤されうることを示している。
【０２９３】 骨再生 ヒドロゲル材料は、多様な治療の状況、たとえば、外傷後、腫瘍の除去、また
は脊椎の融合などにおける骨再生において有用である。一つの例において、例え
ば上述のヒドロゲル材料は脊椎融合ケージ中の空間に適用され、材料内にBMP-2
、TGF-β、またはBMP-7などの骨形態形成タンパク質を含む。この生物活性な製
剤は、症例における脊椎融合の成功の確率の増大において有用である。このよう
な材料の使用は、ケージ内の空間を（疾病の感染や高い費用を伴う）アモルファ
ス骨同種移植片で充填することおよび、たとえば、腸骨隆線から得られた（付加
的な罹患率や入院のコストを伴う）骨自家移植片で空間を充填することといった
現在の外科的方法におけるいくつかの困難を回避することができる。
【０２９４】 皮膚再生 ヒドロゲル材料は、皮膚の治療および再生、たとえば、糖尿病性足潰瘍、圧迫
びらん、および静脈機能不全潰瘍の閉塞に有用である。たとえば、前述のヒドロ
ゲルはたとえば、血管内皮細胞成長因子、TGFβ、アクチビン、ケラチノサイト
成長因子、血小板由来成長因子、上皮成長因子、または他の多くの成長因子など
、これらの傷の閉鎖を増強する成長因子を送達することに使われうる。これらの
成長因子は捕捉または生物特異的親和性（たとえば、ヘパリンに対する親和性な
ど）のどちらかによってヒドロゲル内に組み込まれうる。
【０２９５】実施例14：構造的負荷をもつためのヒドロゲルおよび非ヒドロゲル材料 共役付加反応によって形成された構造材料 ペンタエリトリトールテトラキス（3-メルカプトプロピオン酸）（QT）（424
mg）および997 mgのポリエチレングリコールジアクリレート570（PEGDA）を適切
に化合させ、ボルテックスにより、よく混合させた。空気の泡を超音波処理によ
って除去した。PH 9.0で調製されたPBS 0.01 M溶液（1N NaOHでpH 9に調整され
た等体積の10 mM PBSと混合されたトリエタノールアミン（EtOH3N） により、pH
9に調整された10 mM PBS）（473 mg）を、混合された前駆体に加えた。混合物
をよく混合するために再度約2分間ボルテックスし、水性溶液内の前駆体を分散
させた。ボルテックスに続いて、空気の泡を除去するために、混合物を再度超音
波処理した。材料は室温で、約20分〜30分内でゲル化した。得られたゲルは、約
2 MPaの極限強度を示し、圧縮において、約35％の変形に耐えた（図8）。
【０２９６】 疎水性による機械的特性の制御（ペンタエリトリトールトリアクリレート） QTおよびペンタエリトリトールトリアクリレートを489 mg対596 mgの割合で適
切に混合した（混合物1）。QTおよびPEGDA570を、上記で示した比率で混合した
（混合物2）。100 mgの混合物1を650 mgの溶液2と化合させて250 mgのPBS pH 9.
0を加え、混合のため全混合物をボルテックスした。同様なゲルを、200 mg、300
mg、および400 mgの混合物1に対して調製した。これらに対しては、550 mg、45
0 mg、および350 mgの混合物2をそれぞれ加えた。これら全てに対して250 mgの
活性化緩衝液を加えた。得られたゲルは、疎水性共前駆体を添加することで、機
械的特性の変化を示した。疎水的なTA含量の増加は、得られたゲルの硬度を増加
させた（図9）。
【０２９７】 チオールのアクリレートに対する比の変化 QTおよびPEGDA570を、適当量のQTを1000 mgのPEGDA 570に加え、75重量％の固
体ゲルを作製するために大量のPBS 9.0を加え、チオールのアクリレートに対す
る比率が、0.8、0.9、1.0、1.1、1.3であるように適切に化合させた。一つの例
として、チオールのアクリレートに対する比率0.8に関しては、343 mgのQTを100
0 mgのPEGDAに加えた。二つの組成物をボルテックスにより混合し、その後、448
mgのPBS 9.0を加えた。混合物を再度ボルテックスし、その後、ゲル化させた。
1以上のチオールとアクリレートの比において、得られたゲルは極限強度におけ
る有意な減少を示した。1.0から1.3の比において、チオール/アクリレートの比
の変化に対するゲルの感受性が減少した。以下の表（表8）は、それぞれのチオ
ール/アクリレートの比で得られた極限強度を示している。
【０２９８】
【表８】 種々のチオール/アクリレートの比に対するゲルの極限強度
【０２９９】 粒子の添加による機械的特性の制御 前駆体であるQTおよびPEGDA 570を、上記で概述したように化合させた。活性
化緩衝液（PBS、pH 9.0）を加える前に、10重量％のBaSO4粒子であるbalance fi
xe（0.8 μm）を、混合された前駆体に加えた。活性化緩衝液を加えて全混合物
をボルテックスし、その後、ゲル化させた。上記の実施例で記されたものと同量
の前駆体が使われた。BaSO4を加えることによって得られたゲルは、多少の極限
強度の増加およびかなりの硬度の増加を示した（図10および図11）。QTおよびPE
GDA 570ゲルもまた、いぶしたシリカ粒子（14 nm）に添加されることで調整され
る。424 mgのQTを997 mgのPEGDAと化合させた。PBS pH 9.0緩衝液を加える前に
、緩衝液を10％のいぶしたシリカ粒子に添加した。250 mgのPBS-いぶしたシリカ
の混合物をQT/PEGDA混合物に加え、その後、混合するためにボルテックスした。
いぶしたシリカの添加により得られたゲルは、極限強度における有意な増加を示
した。図12は、準破壊圧縮におけるいぶしたシリカゲルの圧縮負荷曲線を示して
いる。4 MPaの圧縮においても、これらのゲルは破壊されなかった。
【０３００】 乳化剤の使用による機械的特性の改善 緩衝液を、混合された前駆体であるQTおよびPEGDA 570に加える前に、ソルビ
タンモノオレイン酸を4重量％でPBS 9.0緩衝液に加えることによる乳化によりゲ
ルが調製された。その後、界面活性剤/pH 9.0緩衝液混合物を、混合された前駆
体に加えた。他の点においては、上記と同じように、同じ量と方法が使用された
。無機的粒子を加えたゲルと比較して、得られたゲルは極限強度において同様の
増加を示したが、それに伴う硬度の増大を示さなかった（図10および図11）。
【０３０１】 有機溶媒を含む溶媒中での材料の調製 QTおよびPEGDAを、前述の比率で化合させた。次に、これらの前駆体を10重量
％のN-メチルピロリジノン（NMP）に溶解させ、その後ゲル化させた。ゲルを24
時間固めた後、溶媒を交換するために、脱イオン化した水の中に置いた。溶媒を
交換する間に、ゲルの体積は60％縮小し、新たな平衡体積に達した。得られた平
衡化ゲルは、低負荷の圧縮に対する柔らかい弾性反応および圧縮における高度な
変形に対する硬度において増加を示した。図13はこの材料の典型的な圧縮負荷曲
線を示している。
【０３０２】 親水性添加物の添加による機械的特性の調節 QTおよびPEGDAを上述の比率で化合させた。ポリ（ビニルピロリドン）（分子
量40,000）（PVP）を、PBS 9.0緩衝液に、1％、7％、および13％の濃度で溶解さ
せた。上記で示したように、同量の前駆体混合物と緩衝液/PVP溶液を混合した。
混合物をボルテックスし、ゲル化させた。これらのゲルにより、親水性添加物の
添加による機械的特性の操作が示された。PVPの添加はゲルの平衡膨潤を増加さ
せ、PVP含量の増加は、さらに膨潤を増加させた。PVPの添加はまた、より弱く柔
らかいゲルをもたらした。
【０３０３】 QTおよびPEGDA 570のゲル化の速度論 QTおよびPEGDAを上述の比率で化合させた。ボルテックスによりQT/PEGDA 570
を混合させた後、緩衝液を加える代わりに、室温で100 μmの隙間を有するCVO 1
20流量計の20 mmのプレートの間に100 μlの混合物を置いた。弾性係数、複素（
complex）係数、および粘度を、歪幅が0.3である1Hzの剪断応力を用いて経時変
化を追跡する間、混合物を室温で維持した。反応の進行にしたがって、化合した
二つの前駆体は、弾性係数が複素係数よりも大きくなった時間で定義されるゲル
化点を約14時間で示した。図14は、化合した前駆体の二つの係数を時間とともに
示している。
【０３０４】 次に、上記のように、2種類以上の前駆体を化合させ、上記のように、PBS 9.0
を加えた。前駆体と緩衝液を混合した後、混合物は37℃で流量計のプレートの間
に置かれた。周波数と振幅は、前述の方法と同様であった。緩衝液を加えること
により、ゲル化の速度は劇的に増加した。37℃において、ゲル化点は約11分に生
じた。図15は、pH 9.0の緩衝液によって活性化された前駆体の係数を示している
。
【０３０５】 組織中でのゲルの生体適合性 前駆体、QTおよびPEGDA 570、緩衝液、ならびにソルビタンモノオレイン酸を
全てフィルターで滅菌した。Blanc Fixe粒子をオートクレーブにより滅菌した。
ゲルのピンは前駆体、Blanc Fixe、およびソルビタンモノオレイン酸を用いて調
製された。他のピンは二つの前駆体のみを用いて調製された。二つの前駆体から
のみ調製されたゲルのピンはゲル化に先立って活性化され、ボルテックスされた
混合物がピンを形成するため鋳型に置かれる点以外、上述された同じ方法で調製
され、無機粒子を含むゲルのピンおよび界面活性剤を上述の方法を組み合わせる
ことにより調製された。ピンは、ウサギの左右の背筋に埋め込まれた。ポリエチ
レンの参照用ピンも使用された。4週間後、移植片と周辺の組織の組織学的切開
が行われた。テストしたどちらのゲルも、参照用の材料に比較して、有意な差は
現れなかった。稀なマクロファージ、線維芽細胞、および新生血管が、移植され
たゲルのピンに結合していた。ネクローシス、変質、または他の局所的拒絶反応
の兆候はこれらのゲル組成によって誘導されなかった。
【０３０６】 低分子量前駆体の毒性と生体適合性は、官能基を残している高分子量の前駆体
をもたらす大量の前駆体をあらかじめ反応させることによって改善される。QTは
、10倍の過剰量のPEG-DA 570で官能基が導入された。この過程の結果は、末端の
アクリレートがフリーのままであるジアクリレートでキャップされたQTのそれぞ
れのチオールからなる4個の官能基を持ったアクリレートである。QTが過剰であ
る同様な反応では、6個の官能基を持つ3個のフリーのチオールでそれぞれの末端
がキャップされたPEGを生じる。チオールとアクリレートの比1：1で化合された
これらの前駆体は、QTおよびPEGD 570をの直接の使用によって得られるゲルと同
様なゲルを生じる（図10および図11を参照のこと、HTおよびQTの値に注目された
い）。
【０３０７】 混合した分子量の前駆体からの材料の調製による機械的特性の制御 末端官能基ポリマー架橋系は、機械的特性が多様な分子量の分布を用いること
で、操作を可能にすることを示してきた。低分子量系のなかで、高分子量の前駆
体の低いモルを含むことは、どちらかの分子量の前駆体だけで達成されるよりは
、より改善された機械的特性を与える協同的な効果を有している。短い鎖だけを
含むネットワークはもろく、そしてより長い組成物だけを含むネットワークは非
常に低い極限強度しか持たない。一方、短い鎖が支配的で、より長い組成物を小
さなモル比率で含む二つの様式を持つ系は、大きな分子量系に比べて高い極限強
度を持ち、短い鎖からなる1組モデル系に比べ、改善された展性を持ったネット
ワークを示す（Pathak, 上記、Llorente, M. A., 他、J. Polym. Sci., Polym.
Phys. Ed., 19: 621, 1981）。
【０３０８】 高分子量の前駆体（たとえば、PEGDA 20,000またはPEVAL 20,000）の低いモル
含量を、二つの様式を持つ系を作製するために、ある割合でPEGDA 570と置き替
えることができる。3つの前駆体系（例えばQT、PEGDA 570、およびPEGDA 20,000
）は、十分な反応速度を与えるpHで水溶液中で化合されることができる。その結
果、より強靭なゲルとなる。第3組成物（高分子量前駆体）の親水性/疎水性バラ
ンスもまた、さらに特性を調節するために活用されうる。
【０３０９】実施例15：環境条件に対応した材料の調製 前駆体の温度感受性 もし、前駆体が温度感受性（たとえば、37℃以下の臨界温度以下で可溶および
その温度以上で不溶）であり、更にチオールや共役不飽和な基を有するならば、
それらは、混合中の取り扱いが容易なゲルに調製することに使うことができるが
、疎水性前駆体で得られたゲルによって示される改善された特性を示す。この目
的のために、テレキレリックもしくはポリ（N-イソプロピルアクリルアミド）、
ポリ（プロピレングリコール-co-エチレングリコール）に接合された官能基、ま
たは他の温度感受性ポリマーを使うことができる。前駆体を臨界温度以下の温度
の水に溶解させることができる。前駆体溶液を化合させ、ゲル化する。もし、ゲ
ルが臨界温度以上の温度にさらされると、ゲルは、より疎水的な状態へと転移を
すると考えられる。転移が温度感受性前駆体の設計や当初の濃度に依存した離液
現象に関連する場合もあるし、そうでない場合もある。
【０３１０】 前駆体のpH感受性 前駆体がpH感受性（たとえば、臨界pHより高いまたは低いときに可溶）であっ
て、さらにチオールや共役不飽和基を有する場合、それらは、それらは、混合中
の取り扱いが容易なゲルに調製することに使うことができるが、疎水性前駆体で
得られたゲルによって示される改善された特性を示す。この目的のために、テレ
キレリックもしくはポリ（N-イソプロピルアクリルアミド-co-アクリル酸）、ポ
リ（イソプロピルアクリルアミド-co-ジメチルアミノエチルメタクリレート）あ
るいはポリ（アクリル酸）に接合された官能基、または他のpH感受性ポリマーを
使うことができる。これらの材料の溶解度は、pHにより変化しうる。前駆体溶液
は化合し、ゲル化する。環境におけるpHの変化は、ゲルのプロトン化または脱プ
ロトン化によって、ゲルの疎水性を変化させる。転移はpH感受性前駆体の設計や
当初の濃度に依存した離液現象を伴う場合もあるし、そうでない場合もある。
【０３１１】実施例16：チオール含有リンカーを介してPEGに結合されたパクリタキセルの側
鎖を含む架橋生体材料の生成 チオール含有リンカー分子をモデル化合物であるパクリタキセルの側鎖に結合
した(図16)。この生成物を続いてPEG-連結共役不飽和に結合し(図16)、残ってい
るPEG-連結共役不飽和基を架橋して生体材料を生成した。結合化学に関して、こ
のモデル化合物はパクリタキセルの安価なモデルを提供し、この誘導体で得られ
る結果は、完全なパクリタキセル分子、ならびにアルコールまたはアミン基を含
む他の有機分子を用いる仕事に適切である。
【０３１２】 パクリタキセル側鎖-2-O-(3-チオ-プロピオネート)のメチルエステルの調製 段階A)3-トリチルチオ-プロピオン酸の調製 3-メルカプトプロピオン酸(0.87ml、10mmol)およびトリフェニルメタノール(2
.86g、11mmol)のN,N-ジメチルホルムアミド(DMF)(40ml)溶液を、60℃で30分間撹
拌した。溶液を室温まで冷却後、三フッ化ホウ素エーテラート(1.43ml、11.4mmo
l)を加え、反応混合物を60℃で4時間撹拌した。溶液を減圧濃縮し、残渣を5％Na
HCO3(500ml)に溶解した。水溶液をジエチルエーテル(250ml)で洗浄し、1M KHSO4 を用いてpH3まで酸性化し、酢酸エチル(500ml)で二回抽出した。合わせた酢酸エ
チル分画を、食塩水(250ml)で洗浄し、Na2SO4で乾燥した。生成物を白色固体、
収率90％で得た。
【０３１３】 段階B)保護、修飾パクリタキセル側鎖(N-ベンゾイル-(2R,3S)-2-O-(3-トリチル
チオ-プロピオネート)-3-フェニル-イソセリンメチルエステル)の調製 N-ベンゾイル-(2R,3S)-3-フェニル-イソセリンメチルエステル(120mg、0.4mmo
l)および3-トリチルチオプロピオン酸(280mg、0.8mmol)のジクロロメタン(4ml)
およびDMF(1ml)溶液を0℃に冷却した。次いで、ジイソプロピルカルボジイミド(
126μl、0.8mmol)および少数のジメチルアミノピリジンの結晶を加え、反応混合
物を0℃で2時間撹拌した。反応混合物のTLC分析に基づいて反応が完了した後、
溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をジクロロメタン(50ml)に溶解した。有機溶液
を1M KHSO4、5％NaHCO3、および食塩水で連続して洗浄し、Na2SO4で乾燥した。
カラムクロマトグラフィー(シリカ、溶出液：酢酸エチル／ヘキサン1：2v/v)で
精製後、白色固体を収率74％で得た。
【０３１４】 段階C)脱保護によるパクリタキセル側鎖-2-3-(チオ-プロピオネート)のメチルエ
ステル(N-ベンゾイル-(2R,3S)-2-O-(3-チオ-プロピオネート)-3-フェニル-イソ
セリンメチルエステル)の生成 トリチル保護化合物のジクロロメタン溶液をTFA、トリイソプロピルシラン、
および水(95：2.5：2.5)の溶液に加え、反応混合物を室温で1時間撹拌した。溶
媒を減圧下で除去し、カラムクロマトグラフィー(シリカ、溶出液：酢酸エチル
／ヘキサン1：2v/v)後に生成物を得た。
【０３１５】 PEG-3400ジアクリルアミドの調製 分子量3400のポリエチレングリコール(100g、0.05882mol-OH)を塩化メシル(13
.65ml、0.1764mol、3当量(eq.))と、トリエチルアミン(24.58ml、3当量)存在下
、トルエン(600ml)／ジクロロメタン(100ml)中、室温で反応させた。生成物をろ
過し、ジエチルエーテル中で沈殿させることにより回収した。生成物を減圧下で
乾燥し、次いで25％水酸化アンモニウム溶液(400ml)に溶解した。この溶液を密
封容器中、室温で3日間撹拌した。次いで、溶液を開放容器中、室温で5日間撹拌
することにより、アンモニアを蒸発させた。1M水酸化ナトリウムをpH13になるま
で加え、ジクロロメタンで3回抽出して、生成物を回収した。ジクロロメタン相
を減圧濃縮し、ジエチルエーテル中に滴加して、生成物を沈殿させた。収量は80
gであった。1H NMR、PEG 3.6ppm、CH2-CH2-NH2 2.85ppm。PEG末端のアミン基の
存在は、NMRで、アミンに対してα位の炭素上の水素に対応する、2.85ppmの三重
線があることから検出された。PEG主鎖ピーク(3.6ppm)との比較により、生成物
は99.3％のPEGジアミンおよび0.7％のPEGα-モノアミン、ω-モノヒドロキシル
を含むと計算された。
【０３１６】 PEG-3400ジアミン(20g、11.765mmol-NH2)をトルエン(400ml)中で共沸蒸留によ
り乾燥し、次いで室温まで冷却した。ジクロロメタン(50mL)を加え、混合物を氷
浴中で冷却した。混合物を塩化アクリロイル(1.43ml、17.647mmol、1.5当量)と
トリエチルアミン(2.46ml、17.647mmol、1.5当量)存在下で終夜反応させた。溶
液をろ過し、ジエチルエーテル中で沈殿させた。PEG-3400ジアクリルアミドの収
量は17gであった。 赤外スペクトルは1539.79および1673.90cm-1にアミドIおよびIIのピークを含ん
でいた。
【０３１７】 パクリタキセル側鎖-2-O-(3-チオ-プロピオネート)のメチルエステルおよびPEG-
連結共役飽和との間の共役付加反応 3-チオ-プロピオネートリンカーを含むパクリタキセル側鎖-2-O-(3-チオ-プロ
ピオネート)のメチルエステル(10mg、25μmol)およびPEG-3400ジアクリルアミド
(361mg、100μmol)の無水メタノール(1ml)溶液に、トリエタノールアミン(3.3μ
l、25μmol)を加えた。溶液を暗所、アルゴン雰囲気下、室温で4時間撹拌した。
溶媒を窒素気流により除去し、次いで残渣を50mM酢酸水溶液(1ml)に溶解し、PD1
0カラム(Pharmacia)を用いて精製した。PEGを含む分画を回収して凍結乾燥した
。生成物を収率91％(PEG-3400ジアクリルアミドに基づき)で得た。
【０３１８】 共有結合されたパクリタキセル側鎖メチルエステルを含む架橋PEG生体材料の生
成 上からのPEG-3400ジアクリルアミドおよびPEG-3400α-モノアクリルアミド、
ω-モノ(パクリタキセル側鎖メチルエステル)の混合物(1ml)にN-ビニルピロリド
ン(3.5μl)およびエオシンY(HEPES緩衝化食塩水(pH7.4)中、10mMの溶液10μL)を
加えた。この溶液を約500nmの可視光(75mW/cm2)に1分間曝露し、架橋網目を生成
した。
【０３１９】 または、チオールとアクリルアミドの比が1対1となるように、PEG-3400ジアク
リルアミドおよびPEG-3400α-モノアクリルアミド、ω-モノ(パクリタキセル側
鎖メチルエステル)の混合物(1ml)に、ペプチド (15.4mg、13.8mol、このペプチドの配列は水溶性を付与するよう設計されている
)を加える。この溶液を37℃で1時間インキュベートし、架橋網目を生成する。前
述のとおり、N-ビニルピロドジン対エオシンYを3.5：10の比で含むゲル化溶液50
μLを、HypermerB239(ICI Surfactants、米国デラウェア州ウィルミントン)(94m
g)を含むシクロヘキサン(1mL)に加え、37℃で1時間ボルテックスにかけることに
より、ゲルを球体に重合することができる。球体は直径2μmから20μmの範囲で
生成すると予想される。
【０３２０】実施例17：ペプチドリンカーを介してPEGに結合されたパクリタキセルの側鎖の
修飾型を含む架橋生体材料の生成 アクリレート基をパクリタキセル側鎖のヒドロキシル基に結合した(図17)。次
いで、水溶性ペプチドリンカーを付加することができる。この方法においてリシ
ン残基を含むリンカーを用いた場合、求核性のリシンは生体材料から薬物を加水
分解する速度を増大させ、または疎水性残基を含むリンカーを用いた場合、エス
テル結合の環境から水を除去することによって、水解速度は低下すると考えられ
る。
【０３２１】 パクリタキセル側鎖アクリレートのメチルエステル(N-ベンゾイル-(2R,3S)-2-O-
アクリレート-3-フェニル-イソセリンメチルエステル)の調製 N-ベンゾイル-(2R,3S)-3-フェニル-イソセリンメチルエステル(120mg、0.8mmo
l)およびアクリル酸(55μl、0.8mmol)のジクロロメタン(4ml)およびDMF(1ml)溶
液を0℃に冷却した。次いで、ジイソプロピルカルボジイミド(126μl、0.8mmol)
および少数のジメチルアミノピリジンの結晶を加え、反応混合物を0℃で2時間撹
拌した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をジクロロメタン(50ml)に溶解した。
有機溶液を1M KHSO4、5％NaHCO3、および食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥した。
カラムクロマトグラフィー(シリカ、溶出液：酢酸エチル／ヘキサン1：2v/v)の
後、純粋な生成物を得た。
【０３２２】 ペプチドリンカーの調製 ペプチドを、配列 で、一個の脱保護システイン残基を含むように、標準のFmocによる固相法を用い
て合成する。Fmoc-Cys(tBuチオ)-OH(Novabiochem)を用いてCys(tBuチオ)基を導
入する。トリフルオロ酢酸：水：フェノール：トリイソプロピルシラン88：5：5
：2により樹脂から切断した後、ペプチドをジエチルエーテル中で沈殿させ、ろ
取する。粗ペプチドを半調製スケールのC18クロマトグラフィーで精製し、分離
ピークの同一性をMALDI-TOF質量分析によって確認する。
【０３２３】 パクリタキセル側鎖アクリレートのメチルエステルとペプチドリンカーとの間の
共役付加反応 パクリタキセル側鎖アクリレートのメチルエステル(1.25mg、3.68μmol)を、1
15mMトリエタノールアミンを含む10mM HEPES緩衝化食塩水(pH8)(1ml)中に分散さ
せ、前述のペプチド(8.4mg、7.36μmol)と37℃で1時間反応させる。パクリタキ
セル誘導体のペプチドへの結合を、C18クロマトグラフィーおよびUV検出により
追跡する。共役付加反応によるペプチドとパクリタキセル側鎖アクリレートのメ
チルエステルとの反応完了後、ジチオスレイトール(2.27mg、14.72μmol)を混合
物に加えて室温で1時間反応させ、ペプチドのシステイン残基上のtButチオ基を
脱保護する。ペプチド連結パクリタキセル側鎖生成物の精製を、半調製スケール
のC18クロマトグラフィーを用いて行う。
【０３２４】 修飾パクリタキセル側鎖上のペプチドリンカーとPEG-連結共役不飽和との間の共
役付加反応 上からのペプチド連結パクリタキセル側鎖生成物(5.45mg、3.68μmol)を、115
mMトリエタノールアミンを含む10mM HEPES緩衝化食塩水(pH8)(1ml)中に分散させ
、実施例16からのPEG-3400ジアクリルアミド(100mg、29.4μmol)と37℃で1時間
反応させる。次いで、生成物を実施例16に記載のとおりに架橋することができる
。
【０３２５】実施例18：アミン含有リンカーを介してPEGに結合されたパクリタキセルの側鎖
を含む架橋生体材料の生成 本実施例は、パクリタキセル側鎖-2-O-(3-アミノ-プロピオネート)のメチルエ
ステルの合成戦略について記載する。この修飾パクリタキセル側鎖のPEG-連結共
役不飽和への結合およびその生成物の架橋による生体材料の生成は、対応するチ
オール含有化合物について実施例16に記載のとおりに実施することができる。
【０３２６】 パクリタキセル側鎖-2-O-(3-アミノ-プロピオネート)のメチルエステルの調製 段階A)保護、修飾パクリタキセル側鎖(N-ベンゾイル-(2R,3S)-2-O-(3-Boc-アミ
ノ-プロピオネート)-3-フェニル-イソセリンメチルエステル)の調製 このジクロロメタン(4ml)中、N-ベンゾイル-(2R,3S)-3-フェニル-イソセリン
メチルエステル(0.4mmol)および3-Boc-アミノ-プロピオン酸(0.8mmol)の反応は
、パクリタキセル側鎖-2-O-(3-チオ-プロピオネート)のメチルエステル調製のた
めに、実施例16に記載されている類似の反応のとおりに実施することができる。
【０３２７】 段階B)脱保護によるパクリタキセル側鎖-2-(3-アミノ-プロピオネート)のメチル
エステル(N-ベンゾイル-(2R,3S)-2-O-(3-アミノ-プロピオネート)-3-フェニル-
イソセリンメチルエステル)の生成 ジエチルエーテル中HClの飽和溶液をBoc-ル保護化合物のジクロロメタン溶液
に加え、反応混合物を室温で1時間撹拌する。溶媒を減圧下で除去し、生成物をH
Cl塩で得る
【０３２８】実施例19：チオール含有リンカーを介してPEGに結合されたパクリタキセルを含
む架橋生体材料の生成 3-メルカプトプロピオネートをパクリタキセルの2'アルコールに結合すること
ができる(図16)。次いで、パクリタキセルの側鎖を有する化合物を用いた類似の
反応について実施例16に記載のとおり、この生成物をPEG-連結共役不飽和に結合
し(図16)、架橋して生体材料を生成することができる。
【０３２９】 パクリタキセル-2'-O-3-チオ-プロピオネートの調製 段階A)保護パクリタキセル-2'-O-3-トリチルチオ-プロピオネートの調製 パクリタキセル(87mg、0.1mmol)および3-トリチルチオプロピオン酸(35mg、0.
1mmol)のジクロロメタン(4ml)溶液を0℃に冷却した。次いで、ジイソプロピルカ
ルボジイミド(16μl、0.1mmol)および少数のジメチルアミノピリジンの結晶を加
え、反応混合物を0℃で1時間と、室温でさらに2時間撹拌した。溶媒を減圧下で
除去し、粗生成物をジクロロメタン(25ml)に溶解した。有機溶液を1M KHSO4、5
％NaHCO3、および食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥した。カラムクロマトグラフィ
ー(シリカ、溶出液：酢酸エチル／ヘキサン1：1)の後、純粋な生成物を得た。
【０３３０】 段階B)脱保護によるパクリタキセル-2'-O-3-チオ-プロピオネートの生成 脱保護段階を、TFA、トリイソプロピルシラン、および水(95：2.5：2.5)の溶
液をトリチル保護化合物のジクロロメタン溶液に加えることにyり実施した。反
応混合物を室温で1時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、カラムクロマトグラ
フィー(シリカ、溶出液：酢酸エチル／ヘキサン1：1)後に生成物を得た。
【０３３１】実施例20：ペプチドリンカーを介してPEGに結合されたパクリタキセルの修飾型
を含む架橋生体材料の生成 アクリレート基をパクリタキセルの2'アルコールに結合することができる(図1
7)。次いで、水溶性ペプチドリンカーを共役付加反応によって付加することがで
き、この生成物を実施例16に記載のとおりPEG-連結共役不飽和に結合し、実施例
16に記載のとおりに架橋することができる。
【０３３２】 パクリタキセル-2'-O-アクリレートの調製 パクリタキセル(85mg、0.1mmol)およびアクリル酸(70mg、0.2mmol)のジクロロ
メタン(4ml)溶液を0℃に冷却する。次いで、ジイソプロピルカルボジイミド(32
μl、0.2mmol)および少数のジメチルアミノピリジンの結晶を加え、反応混合物
を0℃で2時間撹拌する。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をジクロロメタン(50m
l)に溶解する。有機溶液を1M KHSO4、5％NaHCO3、および食塩水で洗浄し、Na2SO4 で乾燥する。カラムクロマトグラフィーの後、純粋な生成物を得る。
【０３３３】実施例21：チオール含有リンカーを介してPEGに結合されたドキソルビシンを含
む架橋生体材料の生成 パクリタキセルについて記載されているとおり、薬物ドキソルビシンをチオー
ル含有リンカーで修飾することができる。この生成物のPEG-連結共役不飽和への
結合、および残っている共役不飽和基の架橋による生体材料の生成の生成は、パ
クリタキセル誘導体について実施例19に記載されているとおりに実施することが
できる。
【０３３４】 ドキソルビシン-O-3-チオ-プロピオネートの調製 段階A)N-Boc-ドキソルビシンの調製 ドキソルビシンHCl(116mg、0.2mmol)の1M NaOH溶液を撹拌し、氷浴中で冷却す
る。ジ-tert-ブチルジカーボネート(48mg、0.22mmol)のジオキサン溶液を加え、
反応混合物を室温で2時間撹拌する。ジオキサンを減圧下で除去し、水溶液を1M
KHSO4でpH2〜3に酸性化する。水溶液を酢酸エチルで抽出する。有機相を食塩水
で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、減圧濃縮する。
【０３３５】 段階B)N-Boc-ドキソルビシン-O-3-トリチルチオ-プロピオネートの調製 ジクロロメタン中、ジイソプロピルカルボジイミド(0.1mmol)およびジメチル
アミノピリジンを用いてのN-Boc-ドキソルビシン(0.2mmol)および3-トリチルチ
オプロピオン酸(0.1mmol)の反応を、N-Boc-ドキソルビシンの代わりにパクリタ
キセルについて実施例19の段階Aに記載されているとおりに実施することができ
る。
【０３３６】 段階C)脱保護によるドキソルビシン-O-3-チオ-プロピオネートの生成 N-Boc保護化合物の脱保護は、トリチル保護パクリタキセル誘導体の脱保護に
ついての、実施例19の段階Bと同様である。
【０３３７】実施例22：チオール含有リンカーを介してPEGに結合されたメトキシエストラジ
オールを含む架橋生体材料の生成 チオール化2-メトキシエストラジオールを以下に記載のとおりに合成すること
ができる。次いでこの化合物を、パクリタキセルおよびドキソルビシンについて
実施例19および21に記載のとおりに生体材料に組み込むことができる。
【０３３８】 チオール化2-メトキシエストラジオールの調製 ジクロロメタン中、ジイソプロピルカルボジイミド(0.25mmol)およびジメチル
アミノピリジンを用いての2-メトキシエストラジオール(0.5mmol)および3-トリ
チルチオプロピオン酸(0.25mmol)の反応を、パクリタキセルについて実施例19の
段階Aに記載されているとおりに実施することができる。このトリチル保護化合
物の脱保護は、トリチル保護パクリタキセル誘導体の脱保護についての、実施例
19の段階Bと同様である。
【０３３９】実施例23：チオール含有ペプチドの生体材料への組み込みと、生体材料からの修 飾ペプチド放出の速度論 基底膜への細胞接着に影響をおよぼすことが知られている治療ペプチドを、PE
G-連結共役不飽和に結合した。結合は、一個のシステイン残基を活性ペプチド配
列に加えることによって行った。システイン残基のチオールがプロピオン酸で修
飾されていたため、架橋生体材料からのペプチドの放出により、元のペプチドは
再生されなかった。しかし、この、および他のペプチド治療薬の性質は、ペプチ
ドの活性がペプチド末端のこの修飾システインの存在によって影響を受けないよ
うなものである。
【０３４０】 ペプチドの調製 一個のシステイン残基を含むペプチドを、配列 で、標準のFmocによる固相法を用いて合成した。トリフルオロ酢酸：水：フェノ
ール：トリイソプロピルシラン88：5：5：2により樹脂から切断した後、ペプチ
ドをジエチルエーテル中で沈殿させ、ろ取した。粗ペプチドを半調製スケールの
C18クロマトグラフィーで精製し、分離ピークの同一性をMALDI-TOF質量分析によ
って確認した。
【０３４１】 ポリエチレングリコールジアクリレートの調製 分子量3400のポリエチレングリコール(PEG-3400、20g、11.765mmol-OH)をトル
エン中で共沸蒸留により乾燥し、室温まで冷却した。0℃でジクロロメタンを加
えて澄明な溶液を得た。混合物を氷浴中で冷却し、塩化アクリロイル(1.43ml、1
7.647mmol、1.5当量)とトリエチルアミン(2.46ml、17.647mmol、1.5当量)存在下
で終夜反応させた。溶液をろ過し、ジエチルエーテル中で沈殿させた。ポリエチ
レングリコール-3400ジアクリレートを収量17gで得た。
【０３４２】 ペプチドとPEG連結共役不飽和との間の共役付加反応 ペプチド(3.92mg、3.68μmol)を1mM MES緩衝化食塩水(pH5.8)(115μl)に溶解
し、115mMトリエタノールアミンを含む10mM HEPES緩衝化食塩水(pH8)に溶解した
PEG-3400ジアクリルアミド(100mg、29.4μmol、実施例16から)870μlと混合し、
37℃で10分間放置した。ペプチドの修飾PEGへの完全な結合を、エルマン試薬を
用いて確認した。
【０３４３】 共有結合されたペプチドを含む架橋PEG生体材料の生成 前述のペプチドおよびPEGジアクリルアミド溶液の光重合／光架橋を促進する
ために、N-ビニルピロリドン(3.5μl)およびエオシンY(HEPES緩衝化食塩水(pH7.
4)中、10mMの溶液10μL)を加えた。この溶液を約500nmの可視光(75mW/cm2)に1分
間曝露し、加水分解可能なペプチドを含む架橋網目を生成した。材料からのペプ
チドの放出をC18クロマトグラフィーを用いて追跡した。pH7.4、37℃で10日後、
ペプチドの約1/3が材料から放出されていた。
【０３４４】 生体材料からの修飾ペプチド放出の速度論 重合体からのペプチドの加水分解による放出を調べるために、ペプチド(15.7m
g、14.71μmol)を1mM MES緩衝化食塩水(pH5.8)(115μl)に溶解し、ペプチド中の
有利チオールの存在をエルマン試薬により確認した。PEG-3400ジアクリレート(1
00mg、29.41μmol)を、115mMトリエタノールアミンを含む10mM HEPES緩衝化食塩
水(pH8)(885μl)に溶解した。ペプチドのPEGへの結合ををC18クロマトグラフィ
ーを用いて追跡した。95％水-0.1％TFA／5％アセトニトリルから40％水-0.1％TF
A／60％アセトニトリルの勾配を用いた。遊離ペプチドは約20％アセトニトリル
で溶出され、PEGアクリレートは約40％アセトニトリルで溶出された。ペプチド
およびPEGジアクリレートを混合して10分以内で、ペプチドのピークはもはや観
察されず、273nmのペプチド関連吸収がPEGジアクリレートと共に溶出されたこと
が明らかとなった。MALDI-TOF質量分析により、ペプチドがPEGに結合されたこと
が確認された。次いで、混合物をpH8、37℃でインキュベートし、PEGからのペプ
チドの放出を、20％アセトニトリルで溶出されるピークの出現によって追跡した
。このピークのMALDI-TOF質量分析により、これが元のペプチドに72質量単位を
加えたものに等しい分子量の化合物を含むことが示され、ペプチドがプロピオン
酸で修飾されたことが示された。この結果は、システイン含有ペプチドにおける
チオールが共役付加反応によってPEG上のアクリレート基と反応し、修飾ペプチ
ドとPEGとの間のエステル結合の加水分解によって修飾ペプチドが放出されたこ
とを示している。修飾ペプチドの放出速度を測定し、37℃、pH8で修飾ペプチド
放出の半減期は4.86日であった。この加水分解の予測されるpH依存性に基づき、
37℃での放出半減期はpH7.4で約3週間である。
【０３４５】 115mMトリエタノールアミンを含む、10mM HEPES緩衝化食塩水(pH8)中でのPEG-
3400ジアクリレートの加水分解速度も測定した。アクリル酸はPEG-3400ジアクリ
レートから37℃、pH8.0で、半減期24日で加水分解されることが判明し、37℃、p
H7.4での放出半減期は約3ヶ月であることが示された。
【０３４６】実施例24：チオール化オリゴヌクレオチドの生体材料への組み込み、および生体 材料からのチオール化オリゴヌクレオチド放出の速度論 本実施例は、チオール化オリゴヌクレオチドの生体材料への組み込み法と、生
体材料の加水分解によるオリゴヌクレオチドの放出速度の測定について記載する
。一個のチオール基を含むオリゴヌクレオチドは注文合成する(Synthegan、LLC
、米国テキサス州ヒューストン)。オリゴヌクレオチド(3.675μmol)を、115mMト
リエタノールアミンを含む10mM HEPES緩衝化食塩水(pH8)(1ml)中の実施例23から
のPEGジアクリレート(100mg、29.4μmol)に加える。15分後、N-ビニルピロリド
ン(3.5μl)およびエオシンY(HEPES緩衝化食塩水(pH7.4)中、10mMの溶液10μL)を
溶液に加える。この溶液を約500nmの可視光(75mW/cm2)に1分間曝露し、オリゴヌ
クレオチドを含む架橋網目を生成する。プロピオン酸で修飾されたチオール化オ
リゴヌクレオチドの材料周囲の緩衝液への放出の加水分解を、260nmのUV吸収に
より追跡することができる。
【０３４７】実施例25：コロイド生体材料の生成 本実施例は、共役付加反応によるコロイド生体材料の生成法について記載する
。コロイド生体材料とは、直径が5nmより大きく、1μmよりも小さい寸法の大き
い共重合体を意味する。コロイド生体材料は、コロイドに細胞を標的とさせる、
ペプチドなどの分子を含むことができる。
【０３４８】 PEG-3400ジアクリルアミドおよびPEG-3400α-モノアクリルアミド、ω-モノ(
パクリタキセル側鎖メチルエステル)の混合物(実施例16)(1ml)を、37℃で1時間
インキュベートする。細胞を標的とするためのRGD配列を含むペプチド (31.0mg、27.6μmol)を、チオールとアクリルアミドとの比1対1でこの混合物に
含めることもできる。この方法は、注入可能な組成物として調合することができ
る、PEG-3400とPEG-3400モノ(パクリタキセル側鎖メチルエステル)により末端キ
ャッピングされたペプチドとの直鎖高分子量共重合体を生成すると予想される。
【０３４９】実施例26：チオール含有リンカーを介してPEGに結合されたパクリタキセルの側
鎖を含む架橋生体材料の生成 実施例16は、重合体に連結されているパクリタキセルの側鎖を含む生体材料の
生成について記載している。この生体材料は次の式を有する前駆成分を用いて生
成される：D-OC(O)(CH2)2-S-(CH2)2C(O)NH-P、式中Dは薬学的活性部分(例えば、
パクリタキセル--本実施例では、本発明者らは経済的理由によりパクリタキセル
の側鎖のメチルエステルを用いている)であり、Pは重合体(例えば、PEG)である
。パクリタキセルの側鎖はパクリタキセル全体よりも安価で、かつパクリタキセ
ル全体はその側鎖を介して結合されるため、側鎖はパクリタキセル全体と類似の
放出速度論を有するはずであることから、パクリタキセルの側鎖をパクリタキセ
ル分子全体のモデルとして用いる。パクリタキセルなどの薬物をよりゆっくり放
出する他の生体材料を得るために、薬物とリンカー中のチオール基との間に追加
のメチレン(CH2)基を含むリンカーを用いることもできる。式D-OC(O)(CH2)3-S-(
CH2)2C(O)NH-Pを有する前駆成分を用いて生成される、一つのそのような生体材
料の合成を以下に記載し、図18に図示している。
【０３５０】 パクリタキセル側鎖-2-O-(4-チオ-ブチレート)のメチルエステルの調製 段階A)4-トリチルチオ-酪酸の調製 4,4-ジチオ二酪酸(0.48mg、2mmol)の新しく蒸留したジオキサン(20ml)溶液を
窒素雰囲気下で撹拌した。次いで、トリブチルホスフィン(0.52ml、2.1mmol)お
よび水(50μl)を加え、反応混合物を室温で4時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去
した後、粗生成物をトリフェニルメタノール(1.15g、4.4mmol)と共にDMF(25ml)
に溶解し、溶液を60℃で30分間撹拌した。溶液を室温まで冷却後、三フッ化ホウ
素エーテラート(580μl、4.6mmol)を加え、反応混合物を80℃で終夜撹拌した。
溶液を減圧濃縮し、生成物をカラムクロマトグラフィー(シリカ、溶出液：酢酸
エチル／ヘキサン1：1v/v)で精製した。酢酸エチル／ヘキサンから再結晶させた
後、生成物を白色針状結晶として収率50％で得た。
【０３５１】 段階B)保護、修飾パクリタキセル側鎖(N-ベンゾイル-(2R,3S)-2-O-(4-トリチル
チオブチレート)-3-フェニル-イソセリンメチルエステル)の調製 このN-ベンゾイル-(2R,3S)-3-フェニル-イソセリンメチルエステル(133mg、0.
44mmol)および4-トリチルチオ-酪酸(177mg、0.49mmol)の76μl(0.49mmol)および
少数のジメチルアミノピリジンの結晶との反応を、実施例16、段階Bに記載のと
おりに実施した。カラムクロマトグラフィー(シリカ、溶出液：酢酸エチル／ヘ
キサン1：3から1：2v/v)の後、生成物を白色固体として収率77％で得た。
【０３５２】 段階C)脱保護によるパクリタキセル側鎖-2-O-(4-チオ-ブチレート)のメチルエス
テル(N-ベンゾイル-(2R,3S)-2-O-(4-チオ-ブチレート)-3-フェニル-イソセリン
メチルエステル)の生成 チオールからのトリチル基の除去を、実施例16、段階Cに記載のとおりに実施
した。カラムクロマトグラフィー(シリカ、溶出液：酢酸エチル／ヘキサン1：3
から1：2v/v)の後、生成物を白色固体として得た。
【０３５３】 パクリタキセル側鎖-2-O-(4-チオ-ブチレート)のメチルエステルとPEG-連結共役
飽和との間の共役付加反応 4-チオ-ブチレートリンカーを含むパクリタキセル側鎖のメチルエステル(11mg
、25μmol)とPEG-3400ジアクリルアミド(361mg、100μmol)との結合を、実施例1
6に記載の結合反応と同様に実施した。
【０３５４】実施例27：PEG-連結結合体から、およびヒドロゲルからの、パクリタキセル側鎖 の放出の速度論 実施例16および26は、合成における経済性のためにパクリタキセル側鎖を用い
て、パクリタキセルの徐放型の精製について記載している。本実施例は、パクリ
タキセル側鎖とパクリタキセル側鎖を重合体に連結しているリンカー中の硫黄と
の間に、3個または4個いずれかの炭素原子がある、これら二つの型で得られる放
出の特徴について記載する。
【０３５５】 溶液中でのPEG-連結結合体からの放出 PEG-連結結合体(実施例16または26から)(50mg)のPBS(pH7.4)(1ml)溶液を37℃
でインキュベートした。定期的に50μlの試料を採取し、pHを4に調節するために
1M HCl(1μl)を加えた。試料は分析まで-30℃で保存した。放出された化合物の
量を、逆相C18カラム(Nova-Pak(登録商標)C18、3.9×150mm、Waters Associates
Inc.)、Waters 2690 Separation Module(Waters Associates Inc.)、およびWat
ers 996 Photodiode Array Detector(Waters Associates Inc.)を用いたHPLCで
測定した。溶出系として、流速1ml/分で、17.5分間に0.1％TFA水溶液／アセトニ
トリル75：25v/vから25：75v/vの直線勾配を用いた。クロマトグラムをWaters M
illennium(登録商標) 32ソフトウェア(バージョン3.05.01)により解析した。結
果を図19Aに示す。
【０３５６】 光重合ヒドロゲルからの結合体の放出 PEG-連結結合体(実施例16に記載のとおりに調製)(10mg)からの10％w/v光重合
ヒドロゲルを、PBS(pH7.4)(1ml)中、37℃でインキュベートした。定期的に50μl
の試料を採取し、代わりに新鮮緩衝液を加えた。放出された化合物の量を、前述
のとおりにHPLCで測定した(図19B)。
【０３５７】 図19Aおよび19Bに示すとおり、PEG-連結結合体またはヒドロゲルにおけるリン
カーの加水分解による薬物放出速度は、薬物とリンカー中の硫黄(または窒素)原
子との間の鎖長を変えることにより調節することができる。薬物(すなわち、パ
クリタキセル側鎖)とリンカー中の硫黄原子との間に3個の炭素原子を含むPEG-連
結結合体およびヒドロゲルは、薬物とリンカー中の硫黄原子との間に追加のメチ
レン基(CH2)を含む、対応するPEG-連結結合体およびヒドロゲルよりも速く薬物
を放出した。望まれる場合には、薬物とリンカー中の硫黄(または窒素)原子との
間に異なる数の基を含むリンカーを有する、複数のPEG-連結結合体を組み合わせ
て、全般的な放出速度が薬学的により好ましいヒドロゲルを生成することもでき
る。
【０３５８】実施例28：結合部分の生体材料への組み込み タンパク質および小分子両方の持続放出を得るために、親和性アプローチを用
いることができる。ヘパリン結合成長因子などの、ヘパリン結合タンパク質の生
体材料への結合を促進するための、結合ヘパリンまたはヘパリン親和性部位の生
体材料への組み込みが前述されている。例えば、ヘパリン親和性部位を含む生体
材料をヘパリン結合タンパク質の存在下で生成して、ヘパリン結合部分への親和
性を介して、またはヘパリン結合ペプチド結合部分へのヘパリンの結合を介して
、生体材料に間接的に結合されるヘパリン結合タンパク質の量を増大させること
もできる。生体材料の分解に伴い、封入されたタンパク質が放出される。
【０３５９】 本実施例は、他の結合部分の生体材料への組み込みについて記載する。多くの
タンパク質はCu2＋、Co2＋、およびZn2＋などの二価の金属イオンに対する結合
部位を含む。この親和性は金属イオン結合タンパク質の持続放出のために利用す
ることができる。イミノ二酢酸、His残基、His-Gly-Gly-Hisペプチド、またはHi
s残基のオリゴマーなどの金属イオン結合合成リガンドを、結合部分として役立
てるためにゲルに組み込むことができ、これは次いで、ヒト成長因子などの金属
イオン結合タンパク質に結合するために利用することができる。これらの結合部
位は、加水分解可能なリンカーを介して組み込み、より制御された保持と放出を
提供することができる。
【０３６０】 イミノ二酢酸金属イオン結合リガンドの調製を以下に記載する(図20)。
【０３６１】 2-チオ-エチルイミンジアセテート金属イオン結合リガンドの調製 段階A)2-トリチルチオ-エチルアミンの調製 塩酸システアミン(塩酸2-チオ-エチルアミン)およびトリフェニルメタノール
のDMF溶液を、60℃で30分間撹拌した。溶液を室温まで冷却後、三フッ化ホウ素
エーテラートを加え、反応混合物を80℃で撹拌した。反応混合物を減圧濃縮し、
残渣を5％NaHCO3水溶液に分散させ、水層に固体がなくなるまで酢酸エチルで抽
出した。有機溶液を食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、減圧下で濃縮して、粗生
成物を87％で得た。生成物を水に溶解し、1M KHSO4でわずかに酸性化して沈殿を
得、これを酢酸エチル／メタノールから再結晶させて、白色針状結晶を収率75％
で得た。
【０３６２】 段階B)2-トリチルチオ-エチルイミンジアセテートジエチルエステルの調製 2-トリチルチオ-エチルアミン(1.78g、5mmol)およびブロモ酢酸エチル(1.67ml
、15mmol)のTHF(100ml)溶液に、トリエチルアミン(2.09ml、15mmol)を加えた。
室温で3日間撹拌後、ブロモ酢酸エチル(15mmol)およびトリエチルアミン(15mmol
)を追加した。合計反応時間6日間の後、反応混合物を減圧濃縮し、生成物をカラ
ムクロマトグラフィー(シリカ、溶出液：酢酸エチル／ヘキサン1：2v/v)で精製
した。生成物をオイルとして収率88％で得た。
【０３６３】 段階C)2-トリチルチオ-エチルイミン二酢酸の調製 2-トリチルチオ-エチルイミンジアセテートジエチルエステルのジオキサン(20
ml)およびメタノール(7.5ml)溶液に、4M NaOH水溶液(7.5ml)を加えた。室温で1
時間撹拌後、反応混合物を減圧濃縮し、残渣を水に懸濁した。水溶液を1M KHSO4 で酸性化し、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル溶液を食塩水で洗浄し、Na2SO4 で乾燥して、減圧下で濃縮した。生成物を白色固体として定量的収率で得た。
【０３６４】 段階D)2-チオ-エチルイミンジアセテートの調製 2-トリチルチオ-エチルイミン二酢酸のジクロロメタン溶液を、TFA、トリイソ
プロピルシラン、および水(95:2.5：2.5v/v/v)の溶液に加えた。室温で1時間撹
拌後、溶媒を減圧下で除去し、残渣を酸素を含まない5％NaHCO3溶液に分散させ
た。水溶液をジエチルエーテルで洗浄し、1M KHSO4で酸性化し、酢酸エチルで抽
出した。有機溶液を食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥して、減圧下で濃縮した。
【０３６５】 多くの糖タンパク質は、タンパク質に結合した糖残基にビシナルのジオールを
含んでいる。これらを持続放出に利用することができる。フェニルボロン酸基な
どのボロン酸部分を生体材料に組み込んで、ビシナルのジオールとの可逆的複合
体形成による親和性相互作用に利用することができる。-NH-(C6H4)-B(OH)2の形
のフェニルボロネート部分は、特に好ましいpKa(すなわち、生理的pHに近い値)
を有することが明らかにされている(ウィンブレードら、Biomacromolecules 1：
523〜533、2000)。
【０３６６】 生体材料に組み込んで、糖タンパク質の生体材料への結合部分として役立てる
ためのフェニルボロン酸リガンドの合成を以下に記載する(図21)。
【０３６７】 フェニルボロン酸リガンドの合成 段階A)4-((N-2-トリチルチオエチル)アミノメチル)ベンゼンボロン酸の調製 4-((N-2-トリチルチオエチル)アミノメチル)ベンゼンボロン酸を、アブデル-
マギド(Abdel-Magid)ら(J. Org. Chem. 61：3849〜3862、1996)の方法に従い、
トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムを用いる4-ホルミルフェニルボロン酸お
よび2-トリチルチオ-エチルアミン(実施例27から)の還元的アミノ化により合成
する。
【０３６８】 段階B)4-((N-2-チオエチル)アミノメチル)ベンゼンボロン酸の調製 チオールの脱保護を実施例27、段階Dに記載のとおりに実施する。
【０３６９】 加水分解可能なリンカーまたはプロテアーゼ切断部位を含むリンカーのいずれ
かを用いての結合部位の組込みが、特に有用である。加えて、そのようなリンカ
ーを用いない、親和性結合部位を含むゲルも有用である。薬物が重合体マトリク
ス担体から放出されるにつれて、徐放性マトリクスと周囲の環境との間の濃度勾
配が低下し、放出速度の低下につながる。これは、本発明の方法をもちいること
によって補正することができる。経時的に、濃度勾配および親和性部位の数の両
方が低下し、これによって放出は、一方では濃度勾配の低下によって遅くなるが
、他方では親和性結合部位の数の減少によって加速されることになる。これら二
つの相互作用は互いに対抗し、放出特性は直線に近いものとなる。さらに、複数
のリンカーを用いることもでき、これによって速やかに放出される部位もあれば
、ゆっくり放出される部位もあり、より望ましい放出特性が得られることになる
。
【０３７０】 いくつかの特徴を持つ親和性結合部位を用いることもできる。これらは、例え
ば、抗体でもよく、または薬物に対する適当な親和性についてコンビナトリアル
法により選択されたペプチド、ヌクレオチド、もしくは有機部分でもよい。疎水
性有機薬物にとって、シクロデキストリンの組み込みは、ホスト(シクロデキス
トリン)-ゲスト(薬物)の対に伴う相互作用を介しての親和性を提供するために、
特に有用である。
【０３７１】実施例29：生体材料への捕捉によって封入された薬学的活性化合物の放出 組み込まれた薬物(特に、DNA、RNA、多糖、またはタンパク質などの高分子薬
物)の周囲に形成される重合体網目によって、持続性放出を得ることができる。
重合体網目は、分解よりも先に起こる(高い初期透過性、低い分解速度)、または
分解によって制御される(低い初期透過性、高い分解速度)放出を達成するのに適
した、透過性および分解速度を有するように設計することができる。本明細書に
おいて開示されるリンカーを用いて、所望の分解速度を得ることができる。
【０３７２】 以下の実施例は、直鎖または多腕(arm)PEGマルチアクリレートと直鎖PEGジチ
オールとを反応させることによって得られる分解可能な重合体ヒドロゲルを用い
て得られる放出速度について記載する。こうして生成されるリンカーはP-OC(O)-
(CH2)2-S-(CH2)2-Pである。
【０３７３】 アクリレート化PEGの合成 PEG-テトラアクリレートを、分子量14,800の4腕PEG(10g、0.676mmol、Shearwa
ter Polymers、米国アラバマ州ハンツビル、屈折率検出によるTHF中のGPCにより
Mn＝11880、Mw＝15460)から調製した。4腕PEGをトルエン(300mL)中、ディーンス
タークトラップを用いて1時間共沸蒸留することにより乾燥した。アルゴン下で5
0℃未満まで冷却後、ジクロロメタン(50mL)およびトリエチルアミン(0.75mL、2.
0当量、Aldrich、米国ウィスコンシン州ミルウォーキー)を加えた。反応を、塩
化アクリロイル(0.33mL、1.5当量、Aldrich)の滴加により開始した。暗所、室温
、アルゴン雰囲気下で終夜撹拌することにより反応が進行した。得られた淡黄色
溶液を、中性アルミナ床を通してろ過した。炭酸ナトリウムをトルエン-ジクロ
ロメタン溶液に加え、2時間撹拌した。炭酸ナトリウムをろ去し、溶液の体積を
ロータリーエバポレーションによって減少させた。氷浴中でジエチルエーテルを
加えることによってトルエンからPEGを沈殿させ、ろ過により回収した。沈殿を
ジエチルエーテルで洗浄し、減圧下で乾燥した。収量：8.7g。
【０３７４】 PEG-オクタアクリレートを分子量20,000の8腕PEG(Shearwater Polymers、レー
ザー光散乱検出によるTHF中のGPCによりMn＝18410、Mw＝19210)から同様に調製
した。
【０３７５】 分子量2800のPEG-トリアクリレートを分子量2800の3腕PEG(Neocrin Company、
米国カリフォルニア州アーヴィンから供与、屈折率検出によるTHF中のGPCにより
Mn＝2768、Mw＝2856)から同様に調製した。
【０３７６】 分子量3400のPEG-ジアクリレートを分子量3400のPEG(Aldrich、製造者によれ
ばMn約3400)から同様に調製した。
【０３７７】 PEG-モノアクリレートを分子量5,000のPEG-モノメチルエーテル(Fluka、スイ
ス、ブックス、製造者によればMn約5000)から同様に調製した。
【０３７８】 多腕ポリエチレングリコールは様々な製造者により、エチレングリコールの重
合を低分子量マルチアルコールのアルコキシドを用いて開始することにより製造
された。したがって、多腕PEGの核への結合はエーテル結合によると考えられた
。
【０３７９】 ゲルの生成 所与のPEG割合％の架橋ゲルを生成するために、二つの溶液、すなわち一つは
所望の最終PEG割合％でPEG-アクリレートを含み、もう一つは所望の最終PEG割合
％でPEG-ジチオールを含む溶液を作製した。40％PEGゲルを生成するために、PEG
-マルチアクリレートを50mM PBS(pH7.4)(10.85g/L Na2HPO4・7H2O、0.88g/L無水
NaH2PO4、および4.8g/L NaCl)中、40％w/vの公称濃度で溶解した。使用直前に、
分子量3400のPEG-ジチオール(Shearwater Polymers)を50mM PBS(pH7.4)中、40％
w/vの公称濃度で別に溶解した。非常に少量を用いたため、PEGの溶解による緩衝
液の体積変化はPEG1gあたり1mLに等しいと仮定した。したがって、60μLのPBSを
40mgのPEGに加えて、公称40％w/vのPEG溶液を調製した。同様に、30％w/vのPEG
溶液を、70μLのPBSを30mgのPEGに加えることによって調製した。30％PEGゲルを
生成するために、PEG-マルチアクリレートを50mM PBS(pH7.4)中、30％w/vの公称
濃度で溶解し、PEG-ジチオールを50mM PBS(pH7.4)中、30％w/vの公称濃度で別に
溶解した。PEGの溶解には3分から10分を要した。PEG-マルチアクリレートおよび
PEG-ジチオール溶液を、チオール基とアクリレート基の比が常に1：1となるよう
に、表9に規定した比で合わせた。
【０３８０】
【表９】 本試験で用いた架橋PEGゲルの調合
【０３８１】 タンパク質放出 タンパク質放出試験のために、ウシ血清アルブミンの固体粒子(Cohn fraction
V、Sigma、米国ミズーリ州セントルイス、受領したままで用い、2.5×の倍率で
の位相差顕微鏡検査により特徴付けた)をPEG-マルチアクリレート溶液に加え、
ピペットチップで混合した。PEG-ジチオール溶液を加え、溶液をピペットチップ
で混合し、次いで疎水性ガラスの顕微鏡スライド(7.5cm×2.5cmのスライド、供
給者の指示に従いSigmaCote、Sigmaでコーティングした)の中心に移した。正方
形のテフロン（登録商標）スペーサー（２ｃｍ×２ｃｍ、厚さ７００μｍ）をガ
ラススライドの端に置き、第二の疎水性スライドを上に載せた。二つのスライド
をバインダークリップで一緒に留めた。PEG溶液の滴は疎水性ガラスにのみ接触
し、拡がって厚さ７００μｍの丸い円盤を形成した。ゲルを加湿インキュベータ
ー中、３７℃で２時間硬化させた。
【０３８２】 ゲルの膨潤および分解 ゲルの膨潤および分解を特徴付けた。ゲルを、前述のとおり、1mLのプラスチ
ックシリンジ中、全量100μlで生成した(シリンジの先端はかみそり刃で除去し
てあった)。ゲルを加湿インキュベーター中、37℃で2時間硬化させた。硬化後、
ゲルをシリンジから出し、初期寸法をディジタルカリパスで測定した。次いで、
ゲルを5mLの50mM PBS(pH7.4)に加え、37℃で保存した。ゲルの寸法をカリパスで
経時的に、ゲルが完全に溶解するまで測定した。加えて、PBS中に放出されたPEG
の量を、24時間後にサイズ排除クロマトグラフィー(Shodex OHpak SB-802.5HQま
たはSB-803HQ、8×300mm、溶出液：10mMリン酸、0.3M NaCl(pH7.4)、0.3ml/min
、屈折率検出による)により測定した。ゲル中の重合体の体積分率をより正確に
測定するために、ゲルの浮力を、Mettker-Toledo AG天秤(Mettler-Toledo、スイ
ス、グライフェンゼー)により、エタノール中、密度測定キットを用いて測定し
た。ゲルの密度を、DI水中24時間膨潤させた後に測定した。次いで、ゲルを凍結
乾燥し、各ゲル中のPEGの重量を求めた。膨潤ゲルの体積を次の式から計算した
：
【数１】 Vs＝(Wa-Wn)/ρn 式中、Vsは膨潤ゲルの体積であり、Waは膨潤ゲルの空気中での重量であり、Wnは
エタノールの重量であり、ρnはエタノールの密度である。乾燥重合体の体積、Vp を、凍結乾燥後の重量および1.1198g/mLとしての乾燥重合体の密度から計算し
た。次いで、膨潤ゲル中の重合体の体積分率を、
【数２】 v2＝Vp/Vs として計算した。
【０３８３】 膨潤および分解試験のために、円柱形のゲルの体積を時間の関数として、ゲル
が完全に溶解するまで測定した。膨潤率Qを次のとおりに計算した：
【数３】 Q＝Vt/V0 式中、Vtはゲルの時間tにおける体積であり、V0は初期体積である。ゲル中のPEG
の体積分率を次式から推定した：
【数４】 vPEG＝mPEG/(ρPEG・Vt) 式中mPEGはゲル中のPEGの初期質量であり、ρPEGは固体PEGの密度、1.1198g/mL
である。膨潤24時間後、ゲル上の緩衝液5mLを交換し、取り出した緩衝液をサイ
ズ排除HPLCを用いて分析し、ゲルから放出されたPEGの量を求めた。放出されたP
EGは、ゲル化過程でゲル中に組み込まれていなかったと考えられ、材料中に実際
に架橋されたPEGの質量をより正確に見積もるために、その後の計算ではPEGの初
期質量の補正値を用いた。表10に、膨潤24時間以内に緩衝液中に放出されたPEG
の量と、ゲル中のPEGの補正初期質量を示す。
【０３８４】
【表１０】 架橋中にゲル相に組み込まれたPEGの量
【０３８５】 ゲルの初期膨潤を図19Aおよび19Bに示しており、ゲルが数時間後に初期平衡体
積に達していたことが明らかである。完全に架橋したゲルについて、膨潤後数時
間で観察されるQの値は、架橋間のPEGの分子量および架橋中のPEGの濃度によっ
て主に求められるべきで、架橋の官能性にわずかに依存する。PEG-オクタアクリ
レート、PEG-テトラアクリレート、またはPEG-トリアクリレートから生成された
ゲルについて、完全なゲルにおける架橋間の分子量はそれぞれ8400、10,800、お
よび5267であると考えられる。PEGの初期濃度40％w/vで生成されたゲルでは、Q
の初期プラトー値と架橋間の分子量との間に相関性は認められず、架橋反応完了
の程度はこの系において非常に重要であることが示されている。
【０３８６】 架橋後、ゲルを大量の緩衝液中に入れた。数時間以内に、ゲルはかなり膨潤し
たが、24時間以内に平衡体積に達した。膨潤率Qは、架橋条件下での体積に対す
るゲルの体積を表す(図22A)。図22Bは、膨潤第1日のゲル中のPEGの体積分率計算
値を示す。
【０３８７】 後半の時点では、ゲル内の結合の加水分解が起こるために、ゲルは膨潤し続け
た。過去に、これらのゲル内で見られたのと類似のエステル結合が、緩衝化食塩
水中、pH7.4、37℃で約11日の一次半減期を有することが明らかにされている。
ゲル内のエステル結合の加水分解による、ゲルの膨潤挙動および最終的分解を、
図23Aおよび23Bに示す。ゲルの分解に要する時間は、架橋の官能性に最も強く依
存するはずである。すなわち、官能性が増加するにつれて、ゲル中の架橋の数が
減少し始める前に、より多くの結合が切断されなければならない。図23Aおよび2
3Bから、PEG-マルチアクリレートの官能性の増加により、ゲルの完全な分解に要
する時間が増大したことが観察できる。
【０３８８】 タンパク質放出 ゲルからのタンパク質放出を試験するために、前述のとおり、固体ウシ血清ア
ルブミンをゲル前駆体溶液に加え、液体前駆体溶液の全量100μLからゲルを生成
した。加湿環境、37℃で2時間の硬化後、ゲルを5mLの50mM PBS(pH7.4)に加えた
。試料を振盪水浴中、37℃で維持した。24時間毎に、5mLの緩衝化溶液を置き換
え、280nmの吸光度を分光光度計で測定した。PBS溶液中のタンパク質濃度を、標
準曲線から求めた。ゲルのアルブミン以外の成分は280nmで光を吸収しなかった
。この技術による検出限界は、1日あたり全タンパク質の約2.3％であった(すな
わち、検出のためには1日に約178μgのアルブミンの放出が必要とされた)。ゲル
から放出されたタンパク質の累積量は100％に正規化されず、それよりも全タン
パク質量は絶対値であり、割合％は各ゲルに加えられたタンパク質の量(アルブ
ミン7.5mg)に基づいている。
【０３８９】 共役付加反応によって生成したヒドロゲルを、タンパク質薬物の送達媒体の可
能性があるものとして調査した。ウシ血清アルブミンのゲルからの放出を、ほぼ
すべてのタンパク質が放出されてしまうまで、24時間毎に測定した。タンパク質
の制御放出が、PEG濃度40％で架橋されたPEG-テトラアクリレートおよびPEG-オ
クタアクリレートで調製されたゲルから観察された(図24)。PEG-テトラアクリレ
ートで調製されたゲルでは、最初の4日間はほぼ直線の放出が観察され、1日に約
20％のタンパク質が放出された。PEG-オクタアクリレートで調製されたゲルでは
、4つの異なる型が観察された。第1日に約10％のタンパク質が初期放出された後
、次の15％のタンパク質の放出には、さらに4日間が必要であった。この後、5日
間かけて、次の65％のタンパク質のゼロ次放出が見られ、毎日10％から15％のタ
ンパク質が放出された。これに対して、PEG-トリアクリレートで調製されたゲル
、およびPEG濃度30％で架橋されたPEG-テトラアクリレートで調製されたゲルか
らは、タンパク質は速やかに放出された。ヒドロゲルへの組み込みの前に、ウシ
血清アルブミンをまず光学顕微鏡で特徴付け、直径118μm±47μmの血小板から
なることが明らかにされた。ウシ血清アルブミンの粒子サイズの影響も、供給者
から受領したままの固体粉末を、液体窒素下で乳鉢と乳棒を用いて粉砕すること
により試験した。次いで、より小さい粒子をPEG-テトラアクリレート40％ゲルに
組み込んだ。タンパク質の放出特性は、小さい粒子の使用によって影響を受けな
かった。
【０３９０】 生後放出が観察されたゲルでは、タンパク質粒子は放出の全期間を通してゲル
内で見ることができた。すべてのゲルで、タンパク質粒子のゲルからの消失は、
ゲル中のタンパク質の90％を超える送達の完了と一致していた。したがって、PE
G-含有溶液におけるウシ血清アルブミンの溶解性は、タンパク質の制御放出実現
における最も重要な要因であると考えられる。溶解したアルブミンを含む溶液を
、溶解したPEGを含む溶液と混合すると、PEGの濃度および分子量に依存して、ア
ルブミンが沈殿した。同様に、ウシ血清アルブミンの粒子をPEG溶液に加えると
、アルブミンの溶解の速度論はPEGの存在によって強い影響を受けた。アルブミ
ン固体は、PEG非存在下では、50mM PBS緩衝液(pH7.4)に3分で完全に溶解した。
分子量8000のPEG10％溶液では、アルブミン粒子の溶解時間は6分に増大した。分
子量8000のPEG30％または40％溶液では、タンパク質は7日後でも溶解しなかった
。分子量8000のPEG20％溶液では、タンパク質粒子は1時間以内に溶解して、第二
の液相を形成した。これはおそらく、一方はタンパク質が多く、重合体が少ない
相で、もう一方は重合体が多く、タンパク質が少ない相の、真のコアセルベート
であった。
【０３９１】 放出タンパク質の品質 ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)を用いて
、アルブミンはヒドロゲル生成中にPEG-チオールおよびPEG-アクリレートによっ
て修飾されずに残ることを示した。ウシ血清アルブミンを50mM HEPES緩衝化食塩
水(pH7.4)に、1.5mg/mLの濃度で溶解した。PEG誘導体と反応させる前に、アルブ
ミン中のジスルフィド結合を還元するために、10μLのトリス(2-カルボキシエチ
ル)ホスフィン塩酸塩(DI水中11.1mg/mL、Pierce Chemicals)を、500μLのアルブ
ミン溶液に加えた。以下のPEG誘導体を、アルブミン溶液の一部に、規定の化学
量比で加えた：分子量3400のPEG-ジチオール、PEG-モノアクリレート、分子量34
00のモノNHSエステル(Shearwater Polymers)、または分子量3400のPEG-ジアクリ
レート。加えて、PEG-ジチオールの遊離チオール基を失活させ、SDS-PAGE試料調
製中のチオールのアルブミンとの交換を防止するために、選択されたアルブミン
溶液にアクリル酸(無水、Aldrich)を加えた。タンパク質を10％アルブミン溶液
クリルアミドゲルを用いたSDS-PAGEによって分析した。特に記載がない限り、試
料調製のために、任意の所与の反応混合物10μLをDI水6μLおよび1Mジチオスレ
イトール(DTT)を含む5×SDS-PAGE泳動緩衝液4μLと合わせた。次いで、試料を約
3分間煮沸した。31kDa、45kDa、66.2kDa、97kDa、116kDa、および200kDaの分子
量マーカー(Bio-Rad、米国カリフォルニア州ハーキュレス)を標準として用いた
。
【０３９２】 SDS-PAGEによる分析から、生理的条件下では、アルブミンと分子量3400のPEG-
ジアクリレートとの間、またはアルブミンと分子量3400のPEG-ジチオールとの間
でほとんど反応は認められないことが判明した(図22Aおよび22B)。特に、図25A
は、PEG-ジアクリレートと共に1時間インキュベートしたアルブミンは、ほぼ完
全に修飾されずに残り、したがってSDS-PAGE中に天然のアルブミンと実質的に同
等に泳動したことを示している(レーン3対レーン2)。還元アルブミンとアクリル
酸との反応も、タンパク質の移動度を変えることはなかった(レーン4)。図25A、
レーン3のアルブミンのバンドの上の小さいスポットは、わずかな割合％のタン
パク質がPEG-ジアクリレートによって修飾されたことを示している可能性がある
。この知見は、生理的条件下でのPEG-NHS-エステルとアルブミンとの間(図25A、
レーン4)、またはアルブミンを事前に還元し、変性条件下で維持した場合のPEG-
ジアクリレートとアルブミンとの間(図25A、レーン5)の、明白かつ多量の反応と
は全く対照的であった。SDS-PAGEのための反応混合物を煮沸した場合に、アルブ
ミンはPEG-ジチオールとチオール交換によって明らかに反応した(図25A、レーン
9；試料中にDTTは含まれていない)が、SDS-PAGE試料の調製前にPEGの遊離チオー
ルをアクリル酸によって失活させた場合には、アルブミンは事実、修飾されなか
った(図25B、レーン7)。これは、アルブミンとPEG-ジチオールとの反応が生理的
条件下では起こらないが、ゲル電気泳動の試料調製に必要な煮沸段階で起こるこ
とを示している。アルブミンとPEG-ジアクリレートまたはPEG-ジチオールとの間
に反応性がないことは、さらに別の知見からも明らかであった。すなわち、PEG-
テトラアクリレート／PEG-ジチオールゲル中に組み込まれ、緩衝液でのインキュ
ベーション第6日にゲルから放出されたアルブミンは、PEG-テトラアクリレート
またはPEG-ジチオールのいずれでも修飾されなかった(図25B、レーン3)。
【０３９３】 他の態様 前述の記載から、種々の使用法や条件に合わせるために、本明細書に記載され
た発明に対して変形や改変が行われうることは明らかであると考えられる。この
ような態様もまた、添付の特許請求の範囲内である。更に、生体材料前駆体組成
物としてのアミンの使用は、添付の特許請求の範囲内の態様である。
【０３９４】 本明細書内の全ての出版物および特許は、それぞれ個々の出版物または特許が
特異的かつ独立して参照として組み入れられることが示されるのと同程度に、本
明細書において参照として組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 システインに隣接するアミノ酸残基の変更が、アクリル酸エステ
ル（PEG-アクリル酸エステル）への共役付加速度に及ぼす影響に関するグラフで
ある。
【図２】 PEGジアクリル酸エステル上のアクリル酸エステルへのチオール
（システイン上の）付加の反応速度を調べるためのモデルとして用いた共役付加
反応の概略図である。
【図３】 チオール（システイン上の）とPEGジアクリル酸エステルとの間
の付加反応に対するpHの影響を示したグラフである。
【図４】 さまざまな量のPEGDAが、試薬1モル当たりの吸光度である平均吸
光係数（すなわち、吸光度をPEGDA濃度とシステイン濃度の合計で割ったもの；
この合計は2.5×10３Mに保たれる）に及ぼす影響に関するグラフである。
【図５】 共役不飽和物の部位の近傍にある基の立体的影響が、チオール（
システイン上の）とアクリル酸エステル、クロトン酸エステルまたはジメチルア
クリル酸エステルとの反応およびそれによって官能性を付与されたPEGに及ぼす
影響を示したグラフである。
【図６】 RGDペプチド配列を本発明のヒドロゲルに組み込むことが、細胞
の接着および伸展に及ぼす影響を示したグラフである。
【図７】 ヒドロゲル包埋コラーゲン(ヘリスタット（Helistat))スポンジ
からのミオグロビンの放出を示したグラフである。第14日に材料にプラスミンを
添加しており、これによってプラスミン感受性ヒドロゲルからのミオグロビンの
放出量が増したことに注目されたい。
【図８】 水系で調製した75％固体ゲルの歪み-応力曲線である。ゲルはペ
ンタエリトリトールテトラキス（3-メルカプトプロピオン酸）およびPEGジアク
リル酸エステル570を用いてリン酸緩衝生理食塩水、pH 9.0中に75％固体として
調製した。圧縮荷重を加えた場合、ゲルは約37％の変形および2MPaの極限強さを
示した。
【図９】 PEGジアクリル酸エステル570と入れ換えに種々の量のペンタエリ
トリトールトリアクリル酸エステルを加えた水系で調製した75％固体ゲルの歪み
-応力曲線である。ゲルはペンタエリトリトールテトラキス（3-メルカプトプロ
ピオン酸）およびPEGジアクリル酸エステル570およびペンタエリトリトールトリ
アクリル酸エステルを用いてリン酸緩衝生理食塩水、pH 9.0中にて75％固体とし
て調製した。このゲルにより、疎水性トリアクリル酸エステルの含有量によって
ゲルの剛性が操作されることが示された。
【図１０】 ゲルへの無機粒子または界面活性剤の添加がゲルの極限強さに
及ぼす影響を示したグラフである。水系で75％固体（75％固体ゲル）として調製
したゲルを、BaSO4 10％を添加した場合、または界面活性剤ソルビタンモノオレ
イン酸エステル(エマルジョン(Emulsion))1％を添加した場合と比べた。あらか
じめ反応させた前駆物質から得られたゲルと、ペンタエリトリトールテトラキス
（3-メルカプトプロピオン酸）およびPEGジアクリル酸エステル570前駆物質（あ
らかじめ反応させた前駆物質）によって得られたゲルとの比較も行った。
【図１１】 ゲルへの無機粒子または界面活性剤の添加がゲルの剛性に及ぼ
す影響を示したグラフである。水系で75％固体（75％固体ゲル）として調製した
ゲルを、BaSO4 10％を添加した場合、または界面活性剤ソルビタンモノオレイン
酸エステル（Emulsion）1％を添加した場合と比べた。あらかじめ反応させた前
駆物質から得られたゲルと、ペンタエリトリトールテトラキス（3-メルカプトプ
ロピオン酸）およびPEGジアクリル酸エステル570前駆物質（あらかじめ反応させ
た前駆物質）によって得られたゲルとの比較も行った。
【図１２】 フュームドシリカ（14nm）を加えた水系で調製したゲルの歪み
-応力曲線である。ゲルはペンタエリトリトールテトラキス（3-メルカプトプロ
ピオン酸）およびPEGジアクリル酸エステル570を用い、フュームドシリカ粒子（
14nm）で補強した上でリン酸緩衝生理食塩水、pH 9.0中にて調製した。
【図１３】 N-メチルピロリドン/PEG 400共溶媒中で調製した10％固体ゲル
の歪み-応力曲線である。ゲルはペンタエリトリトールテトラキス（3-メルカプ
トプロピオン酸）およびPEGジアクリル酸エステル570を用い、10％固体としてN-
メチルピロリドン/PEG 400中にて調製した。
【図１４】 ペンタエリトリトールテトラキス（3-メルカプトプロピオン酸
）およびPEGジアクリル酸エステル570の弾性率および複素弾性率（G'およびG''
）を示している。pH 9.0のリン酸緩衝生理食塩水は加えずに、ペンタエリトリト
ールテトラキス（3-メルカプトプロピオン酸）およびPEGジアクリル酸エステル5
70を1 SHに対して1 C=Cの比で混合した。この混合物をボルテックスした後に、
弾性率および複素弾性率をレオロジーにより時間的に決定した。
【図１５】 pH 9.0のリン酸緩衝生理食塩水で活性したペンタエリトリトー
ルテトラキス（3-メルカプトプロピオン酸）およびPEGジアクリル酸エステル570
の37℃での弾性率および複素弾性率（G'およびG''）を示している。ペンタエリ
トリトールテトラキス（3-メルカプトプロピオン酸）およびPEGジアクリル酸エ
ステル570を1 SHに対して1 C=Cの比で混合し、pH 9.0のリン酸緩衝生理食塩水を
加えた。混合物をボルテックスした後に弾性率（◆）および複素弾性率（■）を
レオロジーにより時間的に決定した。
【図１６】 パクリタキセル(実施例19)またはパクリタキセルの側鎖(実施
例16)のチオール含有リンカーによる修飾のための合成経路を示す図である。こ
のリンカーを次に、共役付加反応によりPEG-連結不飽和に結合し、残っているPE
G-連結共役不飽和基を架橋して生体材料を生成する。
【図１７】 パクリタキセル(実施例20)またはパクリタキセルの側鎖(実施
例17)のアクリレートによる修飾のための合成経路を示す図である。このアクリ
レートを次に、チオール-またはアミン-含有リンカーを介してPEG-連結不飽和に
結合し、残っているPEG-連結共役不飽和基を架橋して生体材料を生成する。
【図１８】 パクリタキセルの側鎖を含む生体材料前駆成分生成のための合
成経路を示す図である。この前駆成分は次の式で表される：D-OC(O)(CH2)3-S-(C
H2)2C(O)NH-P、式中Dは薬学的活性部分(例えば、パクリタキセルの側鎖のメチル
エステル)であり、Pは重合体(例えば、PEG)である(実施例26)。
【図１９】 Aは、PBS中、pH7.4、37℃で、PEG-連結結合体溶液からパクリ
タキセルの側鎖を放出する速度論を示すグラフである(実施例27)。「C3リンカー
」は、式D-OC(O)(CH2)2-S-(CH2)2C(O)NH-Pを有するPEG-連結結合体を示し、式中
Dはパクリタキセルの側鎖のメチルエステルであり、PはPEGである(実施例16)。
この結合体はパクリタキセルの側鎖とリンカーのイオウ原子との間に三つの炭素
原子を含む。「C4リンカー」は、式D-OC(O)(CH2)3-S-(CH2)2C(O)NH-Pを有するPE
G-連結結合体を示し、式中Dはパクリタキセルの側鎖のメチルエステルであり、P
はPEGである(実施例26)。この結合体はパクリタキセルの側鎖とリンカーのイオ
ウ原子との間に4つの炭素原子を含む。Bは、図19Aに挙げたPEG-連結結合体から
の光重合ヒドロゲルからパクリタキセルの側鎖を放出する速度論を示すグラフで
ある。放出の速度論はPBS中、pH7.4、37℃で測定した。
【図２０】 生体材料に組み込むためのイミノ二酢酸金属イオン結合リガン
ド生成のための合成系路を示す図である(実施例28)。
【図２１】 生体材料に組み込むためのフェニルボロン酸リガンド生成のた
めの合成系路を示す図である(実施例28)。
【図２２】 架橋PEGゲルの緩衝液中での膨潤を示すグラフである。架橋後
数時間以内に、ゲルはかなり膨潤したが、24時間以内に平衡体積に達した。膨潤
率Qは、架橋条件下での体積に対するゲルの体積を表す(図22A)。Bは、膨潤第1日
のゲル中のPEGの体積分率計算値を示す。ゲルはPEG-ジチオールおよび次の一つ
から調製した：PEG-オクタアクリレート、40％(▲)；PEG-テトラアクリレート、
40％(■)；PEG-テトラアクリレート、30％(□)；またはPEG-トリアクリレート、
40％()。割合％は架橋中のゲル前駆体におけるPEGのパーセントを表す。デー
タは三つのゲルの平均値である。
【図２３】 分解中のゲルの性質を特徴付けるグラフである。Aは、様々な
日数後の膨潤率Qを示す。Bは、様々な時点でのPEGの体積分率計算値を示す。ゲ
ルはPEG-ジチオールおよび次の一つから調製した：PEG-オクタアクリレート、40
％(▲)；PEG-テトラアクリレート、40％(■)；PEG-テトラアクリレート、30％(
□)；またはPEG-トリアクリレート、40％()。割合％は架橋中のゲル前駆体に
おけるPEGのパーセントを表す。データは三つのゲルの平均値である。
【図２４】 PEGヒドロゲルからタンパク質を放出する速度論を示すグラフ
である。タンパク質の固体粒子をPEG-マルチアクリレートおよびPEG-ジチオール
と混合することにより、タンパク質粒子をPEGヒドロゲル中に組み込んだ。タン
パク質の放出を、毎日交換するゲル上の洗浄溶液の280nmにおける吸光度を測定
することにより追跡した。累積放出を、PEG-テトラアクリレート(分子量14,800
；40％PEG濃度で調製)から調製したゲル(■)、およびPEG-オクタアクリレート(
分子量20,000；40％PEG濃度で調製)から調製したゲル(▲)について示す。誤差バ
ーは標準偏差(n＝3)を示す。
【図２５】 架橋反応の自己選択性を示す、SDS-PAGEゲルの写真である。A
において、レーン1および6は分子量マーカーを含み；レーン2はアルブミンおよ
びDTTを含む泳動緩衝液を含み；レーン3はPEG-ジアクリレート(20mol PEG/molア
ルブミン)と共に37℃で1時間インキュベートし、次いでDTTを含む泳動緩衝液に
溶解したアルブミンを含む。レーン4はPEG-モノアクリレート、モノ-NHSエステ
ル(20mol PEG/molアルブミン)と共に37℃で1時間インキュベートし、次いでDTT
を含む泳動緩衝液に溶解したアルブミンを含む。レーン5は8M尿素に溶解し、TCE
Pで還元したアルブミンを含む。還元アルブミンをPEG-ジアクリレート(350mol P
EG/molアルブミン)と共に37℃で1時間インキュベートし、次いでDTTを含む泳動
緩衝液に溶解した。レーン9はPEG-ジチオール(20mol PEG/molアルブミン)と共に
37℃で1時間インキュベートし、次いでDTTを含まない泳動緩衝液に溶解したアル
ブミンを含む。レーン10はDTTを含まない泳動緩衝液に溶解したアルブミンを含
む。 Bにおいて、レーン1は分子量マーカーを含み、レーン2はDTTを含む泳動緩衝液
に溶解したアルブミンを含む。レーン3はPEG-テトラアクリレートおよびPEG-ジ
チオールから調製したヒドロゲルから放出され、DTTを含む泳動緩衝液に溶解し
たアルブミンを含む。レーン4はアクリル酸(20,000molアクリル酸/molアルブミ
ン)と共に37℃で15分間インキュベートし、次いでDTTを含む泳動緩衝液に溶解し
たアルブミンを含む。レーン5はDTTを含まない泳動緩衝液に溶解したアルブミン
を含む。レーン6はアクリル酸(20,000molアクリル酸/molアルブミン)と共に37℃
で15分間インキュベートし、次いでDTTを含まない泳動緩衝液に溶解したアルブ
ミンを含む。レーン7はPEG-ジチオール(20mol PEG/molアルブミン)と共に37℃で
1時間インキュベートし、次いでアクリル酸(10,000molアクリル酸/molアルブミ
ン)と共に37℃で15分間インキュベートしたアルブミンを含む。アルブミンを次
いでDTTを含まない泳動緩衝液に溶解した。レーン8はPEG-ジチオールと共に37℃
で1時間インキュベートし、次いでDTTを含まない泳動緩衝液に溶解したアルブミ
ンを含む。レーン9は8M尿素およびPEG-ジチオール(20mol PEG/molアルブミン)と
共に37℃で1時間インキュベートし、次いでアクリル酸(10,000molアクリル酸/mo
lアルブミン)と共に37℃で15分間インキュベートしたアルブミンを含む。アルブ
ミンを次いでDTTを含まない泳動緩衝液に溶解した。レーン10は8M尿素およびPEG
-ジチオール(20mol PEG/molアルブミン)と共に37℃で1時間インキュベートし、
次いでDTTを含まない泳動緩衝液に溶解したアルブミンを含む。
【手続補正書】
【提出日】平成１５年６月２３日（２００３．６．２３）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６９】 局所的な環境における変化を通じた加水分解速度の制御 13.9 mgのPEG-2500-3Aを、69.5μl（5.0 mg/25μl）のPBS・TEA（1ml当たり13
μlのトリエタノールアミンを含む10 mM PBS）に溶解させた。7.0 mgの を65μlのPBS・TEA（2.7 mg/25μl）に溶解させた。等体積（25μl）の二つの溶
液を、コーニング平底組織培養処理ポリスチレン96ウェルプレートのウェルに加
えた。二つの前駆体溶液を加える時、ピペットのチップを、混合物を2、3秒撹拌
するために使用した。その後、ゲルを37℃で静置した。次にゲルを10 mM HEPES
緩衝生理食塩水pH 7.4を含む試験管に移した。ゲルを37℃でインキュベートし、
固体のゲルの消失がその後目視された。ペプチドにおいて見出された余分なリジ
ン（「GKKKK…」、配列番号：75）が、エステル結合の局所的環境への更なる求
核試薬を供給するために添加された。さらに、この基のカチオン性の性質はまた
、局所的なpHの上昇をもたらす。これらの2つの効果の組み合わせがペプチドお
よびポリマーの間のエステル結合の加水分解速度を増大させると期待される。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７４】 光重合化によってゲルが形成される共役付加によって挿入されたペプチドを含む
PEGゲルと細胞の相互作用 PEGゲルはペプチド を用いて、上述のように調製された。大部分の細胞は （配列番号：74）配列を認識する受容体をもっており、細胞は、ペプチドを含む
固定化されたRGDを示している表面と相互作用すると考えられる。共役付加によ
って組み込まれたペプチドを含むPEGゲルと細胞との細胞相互作用を試験するた
めにゲルが形成され、ヒト臍静脈内皮細胞はゲルに播種された。表面で細胞がペ
プチドと相互作用していることを示す、表面上の細胞の形の変化が観察された。
形の変化は広がりと呼ばれ、表面での球状から平面状および多面体状の細胞の形
の変化のことを指す。ペプチドのないPEGゲル上では細胞の広がりが起こらず、
また、 ペプチドの特異性は、同じアミノ酸残基を含むが異なった配列であり、生物学的
な活性を持たない （配列番号：68）ペプチドを含むゲルとの比較によって確認された。細胞がゲル
上に1 mm2当たり400細胞の割合で播種され、面積当たりの広がった細胞の数を数
回にわたって計測した（図6参照）。実験は、通常の細胞培養培地を用いて行わ
れた。共役付加反応を用いてゲル中に組み込まれたペプチド を含むゲルの上だけで、細胞は広がることができた。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７８】実施例10：共役付加によって組み込まれたペプチドを用いた細胞および組織に対 する標的化PEGトリアクリレート微粒子 実施例7で示されたように微粒子はPEGトリアクリレートおよびペプチド との共役付加架橋によって形成されるが、 の割合で、付加的にペプチド も反応混合物に含まれる。生物活性なペプチドが、生物活性なペプチドを含まな
い微粒子と比較して、細胞の表面に微粒子を局在化させる能力を試験される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９０】 （抗がん剤ドキソルビシンまたはダウノルビシンのような）薬剤の官能基は、
アミノ官能基以外が保護される。薬剤のアミン基は、アミド結合の形成によって
アミノ酸またはペプチドと結合する。それゆえ、アミノ末端をリジンやアルギニ
ンに切断するプラスミンのようなタンパク質分解酵素によって、アミノ酸または
ペプチドと薬剤が結合しているアミド結合において、アミノ酸またはペプチドは
、アミノ末端がアミノ酸（Y）またはペプチド（XXXXY；配列番号:72）に分解可
能なように選択される。チオール（たとえばシステイン）は、結合したペプチド
に含まれるか、または、ペプチド-薬剤共役部分のアミノ酸もしくはペプチド部
分の隣に結合されるかのどちらかである。（SH-XXXXY-薬剤；配列番号：76を与
えるため）薬剤およびペプチドの官能基は脱保護されている。材料形成の際には
、チオール-ペプチド-薬剤の共役は、材料前駆体内の共役不飽和物におけるチオ
ールの共役付加によって、材料と共有結合する。薬剤は、薬剤を材料へ結合して
いるアミド結合（Y-薬剤）を切断するプラスミン分解のような酵素的活性によっ
て、材料から放出される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２２】 ペプチドリンカーの調製 ペプチドを、配列 （配列番号：77）で、一個の脱保護システイン残基を含むように、標準のFmocに
よる固相法を用いて合成する。Fmoc-Cys(tBuチオ)-OH(Novabiochem)を用いてCys
(tBuチオ)基を導入する。トリフルオロ酢酸：水：フェノール：トリイソプロピ
ルシラン88：5：5：2により樹脂から切断した後、ペプチドをジエチルエーテル
中で沈殿させ、ろ取する。粗ペプチドを半調製スケールのC18クロマトグラフィ
ーで精製し、分離ピークの同一性をMALDI-TOF質量分析によって確認する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 45/00 45/00 47/32 47/32 47/34 47/34 47/36 47/36 47/40 47/40 Ａ６１Ｐ 31/00 Ａ６１Ｐ 31/00 35/00 35/00 Ｃ０７Ｋ 7/06 // Ｃ０７Ｋ 7/06 7/08 7/08 14/48 14/48 19/00 19/00 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＣ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ， ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，Ｉ Ｎ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ， ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 エルベルト ドナルド スイス連邦 チューリッヒ ホッフシュト ラーセ ９ (72)発明者 ショエンメーカーズ ロナルド スイス連邦 チューリッヒ チューリッヒ ベルクシュトラーセ 235 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 CA07 DA06 EA04 GA11 HA03 4C076 AA94 AA95 CC03 CC27 EE09M EE11M EE13M EE23M EE30M EE39M EE45M EE59M FF31 4C084 AA03 AA17 NA10 NA12 ZB26 ZB31 4C086 AA01 AA02 BA05 BC43 CB22 DA09 GA02 GA07 MA02 MA05 MA67 NA10 NA12 ZB26 ZB31 4H045 AA10 AA30 BA10 BA15 BA16 BA41 BA56 BA62 DA21 EA20 EA34 FA33 FA51 FA74

Claims (35)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 薬学的活性部分を含む生体材料であって、該薬学的活性部分
    上にエステルまたはアミド結合を有し、該結合はpH7.4、37℃の水溶液中で1時間
    から1年の間の半減期を有する、生体材料。
  2. 【請求項２】 薬学的活性部分上のエステルまたはアミド結合の半減期が、
    pH7.4、37℃の水溶液中で1日から9ヶ月の間である、請求項1記載の生体材料。
  3. 【請求項３】 薬学的活性部分上のエステルまたはアミド結合の半減期が、
    pH7.4、37℃の水溶液中で2日から2ヶ月の間である、請求項2記載の生体材料。
  4. 【請求項４】 薬学的活性部分が、合成有機分子、天然に存在する有機分子
    、核酸分子、生合成タンパク質またはペプチド、天然に存在するペプチドまたは
    タンパク質、および修飾された天然に存在するペプチドまたはタンパク質からな
    る群の一つから誘導される、請求項1記載の生体材料。
  5. 【請求項５】 有機分子がパクリタキセル、ドキソルビシン、カンプトテシ
    ン、5-フルオロデオキシウリジン、エストラジオール、2-メトキシエストラジオ
    ール、またはその誘導体である、請求項4記載の生体材料。
  6. 【請求項６】 結合部分を含む生体材料であって、該結合部分は薬学的活性
    化合物に対する親和性を有し、かつ該結合部分上にエステルまたはアミド結合を
    有し、該結合はpH7.4、37℃の水溶液中で1時間から1年の間の半減期を有する、
    生体材料。
  7. 【請求項７】 結合部分上のエステルまたはアミド結合の半減期が、pH7.4
    、37℃の水溶液中で1日から9ヶ月の間である、請求項6記載の生体材料。
  8. 【請求項８】 結合部分上のエステルまたはアミド結合の半減期が、pH7.4
    、37℃の水溶液中で2日から2ヶ月の間である、請求項7記載の生体材料。
  9. 【請求項９】 結合部分が、ヘパリン、ヘパリン-結合部分、金属イオン結
    合部分、炭水化物部分、炭水化物結合部分、または疎水性基に結合する部分であ
    る、請求項6記載の生体材料。
  10. 【請求項１０】 金属イオン結合部分がCu2＋結合部分、Co2＋結合部分、ま
    たはZn2＋結合部分である、請求項9記載の生体材料。
  11. 【請求項１１】 炭水化物結合部分がフェニルボロン酸である、請求項9記
    載の生体材料。
  12. 【請求項１２】 フェニルボロン酸が該フェニルボロン酸のフェニル環上の
    二級アミンを介して、生体材料に連結されている、請求項11記載の生体材料。
  13. 【請求項１３】 疎水性基に結合する部分がシクロデキストリンである、請
    求項9記載の生体材料。
  14. 【請求項１４】 薬学的活性部分または化合物が、結合部分に結合されてい
    る、請求項6記載の生体材料。
  15. 【請求項１５】 薬学的活性部分または化合物が、合成有機分子、天然に存
    在する有機分子、核酸分子、生合成タンパク質またはペプチド、天然に存在する
    ペプチドまたはタンパク質、および修飾された天然に存在するペプチドまたはタ
    ンパク質からなる群の一つから誘導される、請求項14記載の生体材料。
  16. 【請求項１６】 有機分子がパクリタキセル、ドキソルビシン、カンプトテ
    シン、5-フルオロデオキシウリジン、エストラジオール、2-メトキシエストラジ
    オール、またはその誘導体である、請求項15記載の生体材料。
  17. 【請求項１７】 二つまたはそれ以上の前駆成分の架橋から生成される生体
    材料であって、前駆成分が以下の式を有する生体材料： 【化１】 式中、Dは薬学的活性部分または結合部分であり；YはO、NH、またはNであり；L
    は直鎖または分枝リンカーであり；XはOまたはNであり；Pは一つまたは複数の共
    役不飽和基を有する、水溶性重合体または水膨潤性（water-swellable）重合体
    であり；かつUは該重合体に結合されている求電子基への求核剤の付加産物であ
    り；ここで該薬学的活性部分または該結合部分上のエステルまたはアミド結合の
    半減期は、pH7.4、37℃の水溶液中で1時間から1年の間である。
  18. 【請求項１８】 架橋が薬学的活性部分を含まない重合体の存在下で起こり
    、該重合体は二つまたはそれ以上の共役不飽和基を含み、該重合体は生体材料に
    組み込まれる、請求項17記載の生体材料。
  19. 【請求項１９】 架橋が結合部分を含まない重合体の存在下で起こり、該重
    合体は二つまたはそれ以上の共役不飽和基を含み、該重合体は生体材料に組み込
    まれる、請求項17記載の生体材料。
  20. 【請求項２０】 架橋が薬学的活性部分または結合部分を含まない重合体の
    存在下で起こり、該重合体は二つまたはそれ以上の共役不飽和基を含み、該重合
    体は生体材料に組み込まれる、請求項17記載の生体材料。
  21. 【請求項２１】 薬学的活性部分上にエステルまたはアミド結合を有し、か
    つ結合部分上にエステルまたはアミド結合を有する、請求項17記載の生体材料。
  22. 【請求項２２】 架橋が二つまたはそれ以上の求核基を含む標的化合物の存
    在下で起こり、該標的化合物が哺乳類内の細胞、組織、器官、器官系、または部
    位への標的指向性を提供する、請求項17記載の生体材料。
  23. 【請求項２３】 水溶性または水膨潤性重合体が、ポリ(エチレングリコー
    ル)、ポリ(エチレンオキシド)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(アクリル酸)、
    ポリ(エチレン-co-ビニルアルコール)、ポリ(ヒドロキシプロピルメタクリルア
    ミド)、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)、ポリ(ジメチルアクリルアミド)
    、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(エチルオキサゾリン)、ポ
    リ(エチレンオキシド)-co-ポリ(プロピレンオキシド)ブロック共重合体、または
    これらの重合体を含む水溶性もしくは水膨潤性共重合体、および共役不飽和基を
    含むそれらの誘導体からなる群より選択される、請求項17記載の生体材料。
  24. 【請求項２４】 不飽和基が求核置換反応を受けるように活性化されていな
    い、請求項17記載の生体材料。
  25. 【請求項２５】 共役不飽和基が、アクリレート、メタクリレート、アクリ
    ルアミド、メタクリルアミド、アクリロニトリル、およびキノンからなる群より
    選択される、請求項17記載の生体材料。
  26. 【請求項２６】 リンカーが接着部位、成長因子結合部位、プロテアーゼ結
    合部位、または酵素により分解可能な部位を含む、請求項17記載の生体材料。
  27. 【請求項２７】 リンカーが、-OH、-NH2、または-NHでD上のエステルまた
    はアミド結合と反応することにより、式D-OH、D-NH2、またはD-NHを有する薬学
    的活性化合物または結合部分の放出速度を増大させる求核基を含む、請求項17記
    載の生体材料。
  28. 【請求項２８】 nが2または3である、請求項17記載の生体材料。
  29. 【請求項２９】 封入された薬学的活性化合物を含む、請求項17記載の生体
    材料。
  30. 【請求項３０】 封入された薬学的活性化合物がタンパク質である、請求項
    29記載の生体材料。
  31. 【請求項３１】 生体材料を生成する方法であって、以下の段階を含む方法
    ： (a)薬学的活性化合物もしくは結合化合物をリンカー分子に結合するか、また
    は求核アミンもしくはチオールを薬学的活性化合物もしくは結合化合物に組み込
    む段階、 (b)該リンカーにおける任意のチオール保護基またはアミン保護基を除去する
    段階、 (c)該リンカーにおける、または該薬学的活性化合物もしくは該結合化合物に
    組み込まれたチオール、アミン、またはアルケン基を、二つまたはそれ以上の共
    役不飽和基を含む水溶性重合体または水膨潤性重合体に、共役付加反応によって
    結合して、前駆成分を生成する段階、および (d)一つまたは複数の前駆成分における、結合していない共役不飽和基を架橋
    する段階。
  32. 【請求項３２】 結合していない不飽和基の架橋が、哺乳類の体内の部位、
    またはその近辺で起こる、請求項31記載の方法。
  33. 【請求項３３】 哺乳類に薬学的活性部分を含む生体材料を投与することに
    より、該哺乳類における疾患、障害、または感染症を治療または予防する方法で
    あって、該生体材料は、該薬学的活性部分上にエステルまたはアミド結合を有し
    、該結合はpH7.4、37℃の水溶液中で1時間から1年の間の半減期を有する方法。
  34. 【請求項３４】 哺乳類に結合部分を含む生体材料を投与することにより、
    該哺乳類における疾患、障害、または感染症を治療または予防する方法であって
    、該生体材料は、該結合部分上にエステルまたはアミド結合を有し、該結合はpH
    7.4、37℃の水溶液中で1時間から1年の間の半減期を有し、かつ薬学的活性部分
    または化合物は、該結合部分に結合されている方法。
  35. 【請求項３５】 哺乳類がヒトである、請求項33または34記載の方法。
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