JP2003528309A - 蛍光を用いた検体の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 基質が組み込まれたポリジアセチレン骨格の２次元又は３次元配列は、配列の蛍光性を測定することにより、検体と基質の相互作用を検出する化学的検出方法において使用される。配列の中に組み込まれた基質を有するポリジアセチレン骨格の２次元又は３次元配列に試験試料を接触させ、且つ、蛍光の変化を検出することで検体の存在を示すことを特徴とする試料中の検体の検出方法である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 技術分野 本発明は、試料中の検体の存在を検出する方法であって、より具体的には、蛍光
の変化の測定を含む方法に関する。本発明によれば、配列中に基質を組み込んだ
ポリジアセチレンが組み込まれた配列が用いられている。

【０００２】 背景技術 ポリジアセチレンは１，３−ジアセチレンが１，４−付加重合することにより形
成される二重結合と三重結合とが交互に並んだ骨格を持つ共役ポリマーである（
図１）。一般にポリジアセチレンはスペクトルの可視領域で良好に吸光するため
、青色から黄色の範囲で強く着色している。ポリジアセチレンの非線型光学特性
に対する関心は強く、溶解したポリジアセチレンの溶媒−色相関特性、並びに、
ポリジアセチレンフィルム及び単結晶ポリジアセチレンの温度−色相関特性は共
に広く研究されてきた。ポリジアセチレンを形成するには、重合が進むようにジ
アセチレンモノマーが規則的に充填されていなければならないことはよく知られ
ている。発明者らはこれに縛られることはないが、側鎖の充填が乱されると、骨
格における共役の長さや、従って色の特性にも影響を与えうることは一般に容認
されているようである。

【０００３】 その後重合されてポリマーを形成するジアセチレンモノマーは、結晶、液晶、リ
ポソーム、及び、フィルムといった種々の規則的な系を形成するために用いられ
てきた。リポソームは、２本のジアセチレン鎖及び極性のある先端部（ホスホチ
ジルコリン及びその類似体等）を持つモノマーと、１本のジアセチレン鎖を持つ
モノマーとから作られてきた。リポソームは紫外光又はγ線によって重合できる
。モノマーフィルムの形成は、ラングミュア・ブロジェット（Ｌａｎｇｍｕｉｒ
Ｂｌｏｄｇｅｔｔ）法か、又は、溶液をキャストし、次にさらに紫外光又はγ
線によって重合することで行われてきた。モノマーの構造、リポソーム又はフィ
ルムの形成条件、及び、重合条件はすべてポリジアセチレン骨格の共役の長さに
影響し、従って色の特性にも影響する。加熱により長い形態（青色及び紫色）か
ら短い形態（赤色及び黄色）へとこれらの重合系における有効共役の長さは変化
し得る。この変化は、加熱による側鎖の移動と再充填のためであるとされてきた
。可溶性のポリジアセチレンは溶媒−色相関習性を示し、ポリジアセチレンフィ
ルムは溶媒蒸気に曝露されるとしばしば変色する。ジアセチレン界面活性剤によ
って形成されたポリジアセチレンフィルム及びリポソームもｐＨの変化によりし
ばしば変色する。フィルム及びリポソームを形成する充填ポリマー配列の場合、
共役系骨格から外れた側鎖の配置と充填に影響する環境の変化は、共役の長さや
、従ってポリマーの色特性及び電子的特性に影響し得ることは一般に認められて
いる。

【０００４】 色の変化を利用した発色体分析にこれらのポリジアセチレンフィルム及びリポソ
ームを使用することが提案されてきた（Ｃｈａｒｙｃｈら、米国特許ＵＳ６００
１５５６号公報；Ｃｈａｒｙｃｈら、米国特許ＵＳ６１８０１３５号公報；Ｃｈ
ａｒｙｃｈら、米国特許ＵＳ６０８０４２３号公報；Ｃｈａｒｙｃｈ、米国特許
ＵＳ６１８３７７２号公報；Ｃｈａｒｙｃｈら、米国特許ＵＳ６０２２７４８号
公報）。Ｃｈａｒｙｃｈの仮説（Ｏｋａｄａ Ｓ．ら、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅ
ｓ．，１９９８，３１，２２９−２３９）では、青色ポリジアセチレンフィルム
又はリポソームに合体したリガンドへの結合は、ポリジアセチレンの側鎖や、従
って、ポリジアセチレンの共役の長さを乱し、フィルム又はリポソームの色を赤
に変える。色の変化は、目視か、又は、ＵＶ／ＶＩＳ分光測光器により６００ｎ
ｍにより測定して長い波長及び６００ｎｍより短い波長での吸収を比較すること
が提案されている。

【０００５】 蛍光現象は、系に色をつける吸光特性とは性質が異なる。系がある波長の光を吸
収し、異なる波長の光を発しなければ蛍光にはならない。光を吸収した際、系は
より高いエネルギー状態に励起される。その後系は様々な機構により基底状態に
戻るが、ほとんどの場合蛍光は発光されない。基底状態に戻るためのこれらの様
々な非発光性の機構により強い吸光種の多くが非蛍光になるため、どの種が蛍光
性になるかという予測が困難になり、従って当業者にも分かりにくい。

【０００６】 例えば、拡張した共役を持つ有機系には蛍光を発するものもあるが、もっと多く
の系が発しない。

【０００７】 これらに習えば、一般に種は紫外及び可視領域の光を吸収する。紫外波長の領域
はおよそ１９０ｎｍから３８０ｎｍ、可視光の領域はおよそ３８０ｎｍから８０
０ｎｍである。光を吸収すると、種は高エネルギー電子励起状態に移動する。そ
の後の経過で種が蛍光性かどうか決まる。種がある波長の光を吸収し、より高い
エネルギー状態に励起され、異なる波長の光を発して基底状態に戻れば蛍光性（
又はりん光性）である。蛍光を発するには、励起種が発光可能でなければならな
い。一般に、発光が励起光とは異なる波長のものでなければ、蛍光は測定可能に
はならない。ストークスシフトは励起波長と発光波長との差である。吸光する種
のほとんどは発光できず、種々の非発光性機構により基底状態に戻る。更に、蛍
光種は蛍光を起こす波長の光に加えて蛍光を起こさない波長の光もしばしば吸収
する。要するに、吸光は蛍光に不可欠だが蛍光発光に至るとは限らない。

【０００８】 一方、色は吸光特性である。私たちが見る色は、種が吸収している光の波長と関
係している。例えば、もし種が主に６５０ｎｍの光を吸収すれば、その種は青く
見え、もし主に５５０ｎｍの光を吸収すれば、それは赤く見える。色は可視領域
の光を吸収することにより生まれる。色を持つ種のほとんどは非蛍光性である。
もし色を持つ種が蛍光性ならば、普通は一つの色を示すが、適切な波長の光で励
起されると、発せられる光の色に輝く。例えば、発蛍光団は橙色の粉に見えるが
、ＵＶランプの下では緑色に光る。

【０００９】 ポリジアセチレンも蛍光を示すことができる。しかし、溶液、フィルム、又は、
リポソーム若しくはその他の３次元構造に形成された場合のいずれであっても、
蛍光を発する能力はポリマーの構造と組織（特に共役の長さ及び凝集状態）に左
右される。

【００１０】 赤色又は黄色に製造されたポリジアセチレンフィルムは固有の蛍光性を持ち、青
いフィルムには（従来の測定による場合）蛍光性はない（Ｙａｓｕｄａ Ａ．ら
、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．，１９９３，２０９（３），２８１−２８６
）ことが知られている。このようなフィルムの蛍光特性は、フィルムの領域や欠
陥を微視的に描写するのに利用されてきた。

【００１１】 Ｒｉｂｉらは、ポリジアセチレンフィルムの蛍光を用いた２つのセンサーを提案
した。第一のセンサー（Ｓａｕｌら、米国特許ＵＳ５４１５９９９号公報及び米
国特許ＵＳ５６１８７３５号公報）は、蛍光性赤色ポリジアセチレンフィルムを
用いたもので、検体の存在下で測定されるフィルムの発光を（例えば発光の吸収
等により）調整する蛍光調整剤が、フィルムに非共有結合で積層されている。フ
ィルムの蛍光状態は分析の間変化しない。それよりも、蛍光調整剤の働きにより
発光が不明確になったり明確になったりする。提案された第二のセンサー（Ｒｉ
ｂｉ，米国特許ＵＳ５６２２８７２号公報）は、検体の検出に対して特異的な組
成のフィルムを用い、この組成のフィルムの蛍光の変化により検出する。検出方
法の請求項中のフィルムは式（Ａ）_ａ（Ｄ）_ａＣ_ｘ（Ｃ Ｃ）_２Ｃ_ｙＬＢで定義
されるジアセチレンモノマーを重合したポリマー化フィルムからなる〔Ａは下に
横たわる基質とフィルムとを結合させるのに用いられる官能基、ａは０又は１、
Ｃは炭素、ｘ及びｙは１以上で（ｘ＋ｙ）は４から３２まで、Ｄ及びＬは結合又
は結合性基、並びに、Ｂは特定の検体に結合する特異的結合部位、各モノマーの
一方の末端は横たわる基質に最も近く、且つ、もう一方の末端はＢを有する（す
なわち、フィルムは単層で、ポリジアセチレンの全ての側鎖末端は、横たわる基
質に最も近いか又は結合部位である）〕。ポリジアセチレンの３次元配列（リポ
ソーム又は細管等）を用い、検体とポリジアセチレン３次元配列との相互作用に
よって起きる蛍光の変化を測定することで検体を検出する方法は、知る限りでは
Ｒｉｂｉも、また、他の誰も提案していない。

【００１２】 発明の要約 本発明は、非蛍光形（一般に青色又は紫色）から蛍光形（一般に赤色から黄色）
に変わることによるポリジアセチレンフィルムの蛍光の変化を測定することを特
徴とする検知方法を提供する。本発明は、より具体的には、基質（リガンド又は
反応性基質等）が共有又は非共有結合で組み込まれているポリジアセチレン骨格
の２次元又は３次元配列に試験試料を接触させることで試料中の検体を検出する
方法を提供する。本発明の２次元配列、すなわちフィルムは、検体に特異的に結
合する基（すなわち特定結合部位）を末端に持つジアセチレンが９０％以下であ
る２次元重合化ジアセチレン配列からなる。リガンド又は反応性基質は検体に対
して直接的な親和力を持つか、又は、検体に対する結合剤として機能し得るか、
若しくは、検体と化学的若しくは生物的な反応又は作用をし得る。蛍光の変化を
測定又は検出することで検体の存在を示す。

【００１３】 本発明の２次元及び３次元ポリジアセチレン配列は、検体との相互作用の際にそ
の蛍光状態を変化させるか、又は、検体との相互作用の際にその蛍光の偏光を変
化させる。配列のポリジアセチレンが非蛍光形から蛍光形へ変わるのは、目的の
ある検体と配列に組み込まれた基質との相互作用によるものである。配列が非蛍
光形から蛍光形へ変わるにつれて蛍光が増加するのを測定すれば、新規の検出方
法としてこのような相互作用を観察でき、これは色の変化を観察するよりも感度
がよい。この感度の向上は、多くの応用例に対してセンサーとして実用性をもた
せるために検出システムにとって必要である。部分的に蛍光形である配列を初め
に用いて検体との相互作用により蛍光が増加するのを測定することも可能である
。配列は補助的な蛍光種（発蛍光団）を含有していてもよく、これらの発蛍光団
の蛍光は、ポリジアセチレン配列によって調整され、ポリジアセチレンが蛍光性
を変えるにつれて変化し得る。

【００１４】 本発明の分析方法では、検体の結合を連続して測定することが可能である。検体
を配列に添加し、蛍光を長時間に渡って測定できる。洗浄工程が不要なので、本
発明の方法は簡単に、しかも安価に実行できる。

【００１５】 発明を実施するための最良及び様々の形態 本発明の理解を容易にするため、ここで用いられている定義を以下に示す。 基質：化学的物質又は生物学的物質 反応性基質：化学的若しくは生物学的な反応又は作用をし得る基質 リガンド：共有又は非共有結合性の相互作用により選択的に検体と相互作用する
物質又は基質 検体：検出されるべきあらゆる物体（物理的、化学的又は生物学的） 非蛍光形：ポリジアセチレンの５００ｎｍより高波長の蛍光で、蛍光形に比べて
低いもの全般

【００１６】 本発明で用いられる２次元及び３次元配列は、ポリジアセチレン骨格を持つ。検
体に対して直接的な親和力を持つか、検体に対して競合的結合剤として機能し得
るか、又は、検体と反応し得るリガンド若しくは反応性基質がポリジアセチレン
配列に組み込まれている。リガンド又は反応性基質は親油性であるか、親油性部
分を持つか、又は、共役して全体を共役親油性にしている非極性若しくは極性種
である。親油性又は非極性部分は、ジアセチレン又は他の重合可能な基を含んで
いてもよいが、必ずしも必要ではない。配列は、前駆体であるジアセチレン配列
を重合して調製する。ジアセチレン前駆体である２次元及び３次元配列は、さら
にジアセチレンではない非基質を含んでいてもよい。２次元配列は、検体に特異
的に結合する官能基（すなわち検体と形成する特異的結合対の一部）を末端に持
つジアセチレンが９０％以下である２次元ジアセチレン配列を重合して作られる
。さらに典型的な例では、２次元前駆体であるジアセチレン配列において、検体
に特異的に結合する官能基を末端に持つジアセチレンの含有率が６０％以下であ
る。

【００１７】 本発明で用いられるポリジアセチレン骨格は公知であり、ここに詳細を述べる必
要はない。また、この骨格は（３つ以上のモノマーの反応で作られる）低重合体
（オリゴマー）から高重合体にまで及ぶ。例えば、参照として本発明に組み込ま
れるＣｈａｒｙｃｈらによる米国特許ＵＳ６００１５５６号公報を参照のこと。
特定の用途に好適なポリジアセチレンは、当業者で本出願中の開示を理解した者
であれば、余分な実験をせずに選択することができる。

【００１８】 本発明のある実施形態において、リガンド又は反応性基質はポリジアセチレン骨
格に結合しており、好ましくは線形構造をしたリンカーによって結合している。
線形構造をしたリンカーは一般的に２つの末端を持っている。一方の末端はリガ
ンド又は反応性基質に接合し、中央部の一部はポリジアセチレン骨格に組み込ま
れており、もう一方の末端を含む残りの部分はポリジアセチレンの側鎖となって
いる。この実施形態において、ポリジアセチレンは、ジアセチレン、及び、重合
性ジアセチレン群にリガンド又は反応性基質が共有結合したジアセチレンを含む
３次元又は２次元配列のジアセチレンを重合して得られる。この配列は非ジアセ
チレン種を含んでいてもよい。

【００１９】 本発明の他の実施例においては、リガンド又は反応性基質は、ポリジアセチレン
骨格と共有結合しないでポリジアセチレン配列に組み込まれている。この配列は
他の非ジアセチレン種を含んでいてもよい。

【００２０】 更に、整列した先端部を持つ側鎖は一般的にポリジアセチレン骨格に結合してい
る。先端部は一般的に極性を持つ。

【００２１】 ポリジアセチレン骨格は好ましくは非蛍光形である。

【００２２】 配列はジアセチレンモノマー配列を重合して得られる。典型的なモノマーは単数
又は複数の末端を持ち、極性先端部を持つジアセチレン界面活性剤である。本発
明では特定のジアセチレン界面活性剤や末端構造、極性先端部の使用を必要とす
るものではないが、重合して非蛍光形ポリジアセチレンが得られるもの、又は、
異なる発光、好ましくは検体との相互作用においてより高い発光をする蛍光形に
変化する蛍光形ポリジアセチレンが得られるものであればどのようなジアセチレ
ンでも使用できる。

【００２３】 本発明において一般に用いられる先端部は、例えば、カルボン酸、カルボン酸塩
、アミド、エタノールアミド、アミン、アンモニウム、イミン、イミド、アルコ
ール、カルバメート、カーボネート、チオカルバメート、ヒドラジド、ヒドラゾ
ン、ホスフェート、ホスホネート、ホスホニウム、チオール、硫酸塩、スルホン
酸塩、スルホン酸、スルホンアミン、スルホンアミド、アミノ酸、ペプチド、ニ
トロ基のついた残基、炭水化物、コリン、エチレングリコール、エチレングリコ
ールオリゴマー、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、プロピレン
グリコールオリゴマー、ポリプロピレングリコール、及び、これらを組み合わせ
たもの等であるが、これらに限定されるものではない。

【００２４】 本発明において用いられるリガンド又は反応性基質には様々なものがあり、ここ
ではポリジアセチレン配列に組み込まれており検体と相互作用する種と定義する
。主な判断基準は、リガンド又は反応性基質が選ばれた検体に対し親和性を持つ
ことである。物質の分類が分析される場合等に、リガンド又は反応性基質は様々
な種類となり得る。リガンドとして好適なものは、ペプチド、タンパク質、抗体
、抗体フラグメント、抗原及びそのエピトープ、酵素、炭水化物、核酸、アミノ
酸、クラウンエーテル、かご形化合物、小分子、有機金属化合物、塩、又は、検
体と結合する生物又は有機化合物若しくは種等であるが、これらに限定されるも
のではない。反応性基質として適当なものは、リン脂質、ペプチド、タンパク質
、プロテアーゼの基質、キナーゼの基質、炭水化物、核酸、アミノ酸、又は、化
学的又は生物学的反応若しくは作用を起こせる生物、有機、又は、有機金属化合
物若しくは種等である。検体は、膜、受容体、細胞、細菌、ウイルス、毒素、タ
ンパク質、酵素、プロテアーゼ、キナーゼ、抗原、抗体、核酸、小分子、及び、
リガンド又は反応性基質と相互作用しうる生物、有機、又は、有機金属化合物若
しくは種等であるが、これらに限定されるものではない。

【００２５】 リガンドは特に、ＧＭ１ガングリオシド、シアリン酸、セロトニン、ジオクタデ
シルグリセリルエーテル−β−グルコシド、抗サルモネラ抗体、抗リステリア抗
体、抗カンピロバクター抗体、抗クラミジア抗体、抗クリプトスポリジウム抗体
、抗大腸菌抗体、ＨＩＶプロテアーゼ基質、ＭＡＰキナーゼ基質、ＭＥＫキナー
ゼ基質、及び、ヘキソキナーゼ等である。反応性基質は特に、ジミリストイルホ
スホチジルコリン、ジパルミトリルホスホチジルコリン、ミエリン塩基蛋白残基
配列を持つペプチド、チロシンヒドロキシラーゼ残基配列を持つペプチド、ＭＡ
Ｐキナーゼ残基配列を持つペプチド、及び、ホスホイノシチド３−キナーゼのホ
スファチジルイノシトール−４，５−ビホスホネート基質等である。検体は特に
、インフルエンザウイルス、コレラ毒素、ホスホリパーゼＡ_２等のホスホリパー
ゼ、ＨＩＶプロテアーゼ、ＭＡＰキナーゼ、ＭＥＫキナーゼ、ホスホイノシチド
３−キナーゼ、サルモネラ、リステリア、大腸菌、クラミジア、クリプトスポリ
ジウム、及び、カンピロバクター等である。

【００２６】 本発明の配列を担体表面に保持又は固定しなければならない場合、この機能を果
たすため脂質末端を選ぶこともできる。

【００２７】 本発明の２次元又は３次元配列は、数多くの形態に作ることができる。作り得る
３次元配列の好適な形の1つとしてとして、リポソームがある。リポソームは、
数々の異なる大きさ及び型に形づくることができる。例えば、単純二層構造のリ
ポソームを形成することも可能である。更に、タマネギ型の多層構造にすること
もできる。さらに、そのサイズも変更可能である。作製できる２次元配列形態で
好適なのはフィルムである。フィルムは一層、二層又は多層でもよい。

【００２８】 他の多くの形態も作製可能である。ラメラ（Ｒｈｏｄｅｓら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ
，１９９４，１０，２６７−２７５）、中空細管及び組みひも状（Ｆｒａｎｋｅ
ｌら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ，Ｓｏｃ．，１９９４，１１６，１００５７−１００
６９）、結晶、リオトロピック及びサーモトロピック液晶相、ゲル及びアモルフ
ァス構造等が形成可能である。これらを集めて固定化すると、さらに大きな集合
体とすることもできる。

【００２９】 制御された冷却、濃度の変化、又は、エタノールの添加によって重合する前に、
ジアセチレンリポソームを細管に転化することができる。細管は光重合でポリジ
アセチレンの非蛍光形にすることができ、それらは蛍光モニタリングを伴う分析
に使用できる。ポリジアセチレンはまた、凝集した繊維の網状構造を持つ青色又
は赤色のゲルを形成することもできる。ポリジアセチレンは、無機粘土との積層
といった複合材料の形成に用いられてきた。

【００３０】 ジアセチレン長鎖モノマーの２次元又は３次元配列は、化学反応に用いるため組
み込まれているリガンド又は基質と共に調製される。これらリガンド又は基質は
、官能基がついたジアセチレン、又は、単にジアセチレンモノマーと混合するの
に十分な親油性を持つものである。配列は、単層、複層、又は、溶液中のリポソ
ームである。ジアセチレン又はポリジアセチレンのフィルム配列は、そのままの
形、又は、ガラス、セラミック、ポリマー、紙、金属、若しくは、その他の表面
に担持して用いることができる。担体は多孔性であってもよく、限定されるわけ
ではないが例えばナノポア及びミクロポア膜等である。また、ガラス、セラミッ
クポリマー、紙、金属、その他の表面にジアセチレンコーティングを施して光重
合し、上記のポリジアセチレン配列を得ることもできる。

【００３１】 ジアセチレン又はポリジアセチレンリポソームは固体に付着、担持、又は、吸着
させることができる。固体には例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ
エチレン、ポリプロピレン、及び、Ｔｅｆｌｏｎ（テフロン（Ｒ））等のポリフ
ルオロカーボン等の高分子、シリコンチップ、ビーズ、フィルター及び膜、ガラ
ス、金、シリカ、セファデックス、セファロース、ポリアクリレート、及び、ポ
リアセトニトリル等の多孔性又は膨張性固体、並びに、ゾル−ゲル等があるが、
これらに限定される訳ではない。ジアセチレンリポソーム及びフィルム配列の場
合、これらは固体担体に組み込み、又は、付着された後に重合される。

【００３２】 固体に担持されたポリジアセチレンは、ナノポア膜上の配列の形をとるのが好ま
しい。さらに好ましいのは、ポリカーボネートナノポア膜上にある配列である。

【００３３】 発明者らは、ジアセチレンリポソームを１００ｎｍ膜、２００ｎｍ膜及び４００
ｎｍ膜等の膜中又は膜上に導入し、光重合すると非蛍光性ポリジアセチレンが作
られることを発見した。これらの膜は、室温、空気中、及び、光にあてた状態で
１２カ月以上安定である。ポリジアセチレン配列は磨耗にもある程度の耐性を示
す。ジアセチレンリポソームの一部分が膜表面の大きな孔を通過し、内部の小さ
な孔に捕捉されることも可能のようであるが、発明者らはこれに拘束される訳で
はない。ポリジアセチレン配列は、適切な試薬を作用させれば非蛍光形から蛍光
形に転化できる。

【００３４】 ナノポア膜材料には様々なものがあり、例えば、アルミナ、Ｔｅｆｌｏｎ（テフ
ロン（Ｒ））等のポリフルオロカーボン、ナイロン、ポリカーボネート、ガラス
、及び、ポリビニレンジフルオライド（ＰＶＤＦ）等で、孔の大きさも様々であ
る。発明者らは、孔の大きさは６００ｎｍまでで、これらの膜を用いて、固体に
担持されたポリジアセチレンを調製しようと構想している。ポリジアセチレンで
コートされた膜はフィルター及びフロー・セルに組み込まれ、標本又は試験片と
して用いられるか、又は、固体担体に接着される。

【００３５】 本発明のある形態では、非蛍光形ポリジアセチレン配列を持つフィルター又はフ
ロー・セルで、膜内又は膜上に基質が組み込まれているものを用いる。検体の溶
液をフィルター又はフロー・セルに通すと膜の蛍光が読まれる。光学的又は電子
的にポリジアセチレンと相互作用しない発蛍光団が配列に含まれていてもよい。
これらの発蛍光団の蛍光発光は、内部補正標準として別個に測定してもよい。光
学的、電子的又は共鳴カップリングを通してポリジアセチレンと相互作用する発
蛍光団が配列に含まれていてもよい。

【００３６】 ジアセチレンの２次元及び３次元配列構造は、紫外光又はγ線照射によって光重
合され、吸収の極大波長が５００ｎｍから８００ｎｍ、好ましくは６００ｎｍか
ら７５０ｎｍの範囲で、青色から紫色であることを特徴とする、共役がより長い
ポリジアセチレン構造が得られる。光重合では主に非蛍光形が得られ、バックグ
ラウンドに対して全般に低い蛍光を示す。ここで使われる「非蛍光形」という用
語はまた、全般に低い蛍光を示すポリマーで、バックグラウンドと比べて１から
３倍しかなく、且つ、相当する蛍光形よりは低い、５００ｎｍより高波長の蛍光
シグナルを示すものも指す。「非蛍光形」は一般に５００ｎｍより高波長の蛍光
発光を示すが、これは相当する蛍光形より約１０％以上、更に典型的には約５０
％以上低い。ジアセチレンの２次元及び３次元配列の中には光重合で蛍光形ポリ
ジアセチレンを与えるものもある。これらの配列は、もし検体との相互作用によ
って異なる発光を測定できるような蛍光形に、好ましくは低蛍光形から高蛍光形
に変換されるのであれば、分析に用いることができる。

【００３７】 ポリマー配列の蛍光を測定し、対象となる検体に十分な時間接触させて結合又は
化学的若しくは生物学的反応を起こし、蛍光を再び測定する。結合又は化学的若
しくは生物学的反応は配列を非蛍光形から、吸収の極大波長が５９０ｎｍ未満で
赤色、橙色、緑色又は黄色であることを特徴とする蛍光形に変換する。蛍光形ポ
リジアセチレンの蛍光は、３００ｎｍから６００ｎｍの間の波長の光によって励
起され、１つから２つの極大波長を持ち、５００ｎｍより高波長の幅広い蛍光で
あるが、本発明はこれらに拘束されるものではない。目的の検体又は種に作用さ
せた後、又は、作用させている間のポリジアセチレン蛍光の増加は、結合又は反
応を示している。相互作用の経過を追跡し反応速度を解明するために、作用させ
ている間の蛍光を定期的に測定してもよい。

【００３８】 この検出方法は、活性化合物によるリガンドへの結合の阻害又は基質との反応を
測定するのにも用いられる。阻害の測定では、阻害剤又は試験化合物をポリジア
セチレン配列に添加される。リガンドに結合するか、又は、反応性基質と反応す
る活性種もまた添加される。もし試料が、試験化合物を添加していない対照試料
と同様の蛍光の増加を示した場合、阻害剤は活性種の活性を抑制していないこと
になる。もし試料が、対照試料と比べて低い蛍光を維持するか、又は、蛍光がわ
ずかしか増加しない場合、活性種の活性は試験試料によって阻害されていること
になる。

【００３９】 蛍光形への変換を引き起こす条件は、目には青から赤への変化として映る色の変
化も引き起こす。これはＵＶ／ＶＩＳ吸収スペクトルを測定することで定量化で
きる。蛍光の変化と、特定の波長で起きる吸収の変化とは必ずしも線形の相関関
係を示すとは限らない（図３）。発明者らはこれらに拘束されないが、発せられ
る蛍光の増加は、ポリジアセチレン骨格において短い共役の数が増えたか、ポリ
ジアセチレン骨格において長い共役の消光が減ったか、又は、その両方であると
思われる。蛍光の相対変化は、一桁違うかそれ以上で、この変換において測定さ
れるＵＶ／ＶＩＳ吸収スペクトルでの相対変化よりも大きい。これは直接的な色
の応答よりも蛍光の方が、リポソームにおける変化をより敏感に測定できるとい
うことを意味する。感度が上昇すれば、比色定量分析での検出が全く十分ではな
い多くの領域において、新規蛍光検出方法を可能にする。フィルムの場合、ポリ
ジアセチレンの蛍光／非蛍光特性は新しい化学的検出方法として利用できると共
に、固定化された検出系においては比色定量分析検出方法に比べてより高い感度
を与える。また、比色定量分析検出では透明な（石英ガラス、ＵＶ／ＶＩＳ透明
プラスチック等）支持体の台が必要であるのに対し、蛍光検出方法は不透明な支
持体を使用できる。

【００４０】 蛍光は公知の蛍光測定装置により読み取ることができる。限定されるわけではな
いが、例えば、キュベットとファイバー性光学付属品を備えた蛍光光度計、プレ
ートリーダー、携帯型リーダー、蛍光顕微鏡、ＣＤＣカメラ、及び、目視等であ
る。この検出方法は、多穴プレート形式のハイスループットスクリーニングに容
易に用いることができる。

【００４１】 この新しい検出方法では、ポリジアセチレン配列に組み込まれるリガンドに適切
なものを使用することで、空気中及び溶液中の様々な化学及び生物種を検出する
ことができる。限定される訳ではないが、例えば、小さい有機物（分子量＜１０
００ｇ／ｍｏｌ）、溶液、毒素、ペプチド、タンパク質、ウイルス、バクテリア
、生物化学兵器等である。この新しい検出方法では、ポリジアセチレン配列に含
まれる基質を適切なものにすることで、空気中及び溶液中の様々な化学及び生物
反応性種を検出することができる。限定される訳ではないが、例えば、塩基、酸
、ルイス酸、ルイス塩基、求核物質、求電子物質、酸化剤、還元剤、及び、酵素
等である。この方法はまた、結合や反応性の阻害を測定するのにも利用できる。
この方法は、限定されるわけではないが、薬の発見、医学的診断学、食品の安全
性、病原体検出、環境の監視（生物化学兵器の製造、貯蔵及び使用を含む）、及
び基礎研究等に利用できる。

【００４２】 共役ポリマー鎖の分離を増やすと、蛍光形ポリジアセチレンの蛍光を強められる
と信じられている。ポリマー鎖の分離は、自己消光の量を減らし蛍光形ポリジア
セチレンの蛍光を強める手段として提案された。ポリジアセチレン結晶ではポリ
マー鎖を分離するだけで蛍光に達した（Ｌｅｃｕｉｌｌｅｒ Ｒら、Ｐｈｙｓ．
Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔ．，１９９８，８０（１８），４０６８−４０７１）。リポソ
ーム又はフィルム構造をさらに保ちながら、ポリマー配列を他の非ジアセチレン
界面活性種で希釈することもできる。それに代わって、側鎖をかさ高い官能基で
置換してポリマー骨格を遠ざけたり、又は、ポリジアセチレンと共役型又は非共
役型ポリマーとの共重合体としてポリアセチレンを調製したりすることもできる
。その他の手段として、ポリジアセチレン切片がジアセチレンモノマーの配列中
で分離できるよう重合度を減らすこともできる。

【００４３】 本発明では更に、ポリジアセチレン配列に他の蛍光種が組み込まれていてもよい
。発蛍光団には有機、生物、無機若しくは高分子の化合物、錯体、又は、粒子が
使用できる。発蛍光団は、ポリジアセチレン配列が非蛍光形から蛍光形へと変わ
る際に蛍光の変化の度合いを強めることができる。発蛍光団の蛍光は、もしポリ
ジアセチレン内の変化に影響されなければ内部標準として、また蛍光が変化する
なら変換の追加の尺度として、変換の間に測定できる。さらに発蛍光団の中には
励起状態エネルギー移動過程を経て、配列の蛍光全体を変化させ、量子収率を上
げるものもある。

【００４４】 発蛍光団の多くは親油性で、リポソームのアルキル領域に組み込まれていると予
想され、それ以外は極性を持つか電荷を帯びており、先端部領域−水性界面又は
水溶液中に達すると思われる。リポソームの蛍光と添加された発蛍光団の蛍光は
、熱の作用下、化学反応下、又は検体を検出する間の、非蛍光形から蛍光形へと
変わるリポソームを観察してきた。様々な発蛍光団添加剤には、リポソームが非
蛍光形から蛍光形へと変わる際、蛍光応答のパーセント変化を強める効果があっ
た。添加された発蛍光団の蛍光もまた観察され、蛍光増加を示す発蛍光団及び減
少を示す発蛍光団を持つリポソームの形の変化が示された。

【００４５】 添加された発蛍光団は、光学的及び／又は電子的にポリジアセチレンポリマーと
相互作用する。発蛍光団と配列が光学的又は電子的に相互作用ことができるのに
はいくつかの様式があり、それは、限定されるわけでは無いが、例えば以下の通
りである。 （１）配列の蛍光を吸収する発蛍光団によるか、又は発蛍光団の蛍光を吸収する
、配列によるもの。 （２）発蛍光団が励起光を吸収して励起し、励起状態からポリジアセチレン配列
へエネルギーを移動させ、蛍光を発光させることによるもの。この過程は共鳴エ
ネルギー移動（Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ， ＲＥ
Ｔ）として、また蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓ
ｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ， ＦＲＥＴ）としても知られ
る。このＲＥＴプロセスは、ポリジアセチレンの蛍光に発蛍光団の時間減衰性を
持たせるものである。 （３）蛍光形ポリジアセチレン配列が励起光を吸収してその励起状態から発蛍光
団へエネルギーを移動させ、発蛍光団に蛍光を発光させることによるもの。この
ＲＥＴプロセスは効果的に系のストークスシフトを増加させ、全量子収率を上げ
る。 （４）配列へ電子を移動させる発蛍光団の励起状態によるか、又は、発蛍光団へ
電子を移動させる配列の励起状態によるもの。この過程は光誘起電子移動（Ｐｈ
ｏｔｏｉｎｄｕｃｅｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒ， ＰＥＴ）とし
て知られる。 （５）発蛍光団の蛍光発光に必要な励起光を吸収する配列によるか、又は、配列
の蛍光発光に必要な励起光を吸収する発蛍光団によるもの。 （６）配列の蛍光を消光する発蛍光団によるもの。 （７）蛍光団の蛍光を消光する配列によるもの。

【００４６】 ポリジアセチレン配列に発蛍光団を添加すると、分析中の配列の蛍光変化の程度
を増加でき、分析感度が上がる。また、分析中の発蛍光団の蛍光も観察でき、検
体によるポリジアセチレン配列の変化を見る第二の指標とできる。発蛍光団とポ
リジアセチレン配列のＲＥＴ相互作用について以下で議論する。

【００４７】 蛍光共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ） ポリジアセチレンの固有蛍光を利用した蛍光測定は吸光（すなわち比色定量分析
）測定の改良型ではあるが、ポリジアセチレンは比較的弱い発蛍光団である。蛍
光ポリマーがたいてい弱い発蛍光団なのは、共役鎖が励起状態のトラップとして
働き、励起状態の非放射緩和の機構を経て蛍光の消光に至るからである（Ｗａｒ
ｔａ Ｒ．ら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．，１９８８，１，９５−９９）。青色
ポリジアセチレンの長い共役は励起状態のトラップとして非常に有効で、これが
青色のものが非蛍光である理由だという理論がある（Ｍｏｒｇａｎ Ｊ．ら、Ｃ
ｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．，１９９２，１９６，４５５−４６１）。赤色及
び黄色のポリジアセチレン配列は共役長さが異なるポリマー鎖の混合物を含有し
、ポリマー鎖間消光及びポリマー鎖内消光により短めの共役長さの蛍光が減少す
るのは全く起こり得ることである。

【００４８】 ポリジアセチレン配列の全蛍光は、脂質領域、脂質−水界面及びそれ自身の水溶
液に発蛍光団を加えることで強くできる。必ずしもこれに拘束されないが、発明
者らは、発蛍光団は励起した蛍光形ポリジアセチレン鎖から共鳴エネルギー移動
（ＲＥＴ又はＦＲＥＴ）によってエネルギーを受け取り、その後蛍光発光するの
ではないかと仮説を立てた。ＲＥＴプロセスは鎖内部の消光機構を短絡化するよ
うに思われ、系の蛍光強度を２０から３０倍強める。ある発蛍光団に関わるＲＥ
Ｔ過程はさらにストークスシフトを１００ｎｍ未満から２００ｎｍより上に大き
く上昇させる。プレートリーダーでそれらの蛍光を測定する際最適な光学機械を
持っていなかったり、表面から外れた励起光の反射によりバックグラウンドが通
常高い固体の蛍光を読み取ったりする場合、これは重要である。組み込まれた発
蛍光団は、ポリジアセチレンを少量だけ励起させる波長の光によって直接励起さ
れるので、この発蛍光団を含む非蛍光形ポリジアセチレンは蛍光性が大きく変わ
るわけではない。

【００４９】 発蛍光団が、その励起状態から蛍光形ポリジアセチレン配列へエネルギーを移動
させ、蛍光を発光させることも可能である。発蛍光団は、ポリジアセチレンが励
起しない波長で励起させることができ、ポリジアセチレンへエネルギーを移動さ
せてポリジアセチレンが蛍光を発する。これもまたポリジアセチレン全般の配列
のストークスシフトを有効に増加させ得る。もし発蛍光団の寿命が長ければ、例
えばあるテルビウム及びユーロピウム化合物において励起状態減衰時間が長けれ
ば、ポリジアセチレン蛍光の減少も同じような寿命となる。これによりポリジア
セチレン配列と通常のＴＲＦリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ^２Ｖ等）を用いた時間分解
蛍光測定（ＴＲＦ）が可能となる。

【００５０】 もう１つの分析法では、蛍光形ポリジアセチレンリポソームの偏光の変化を測定
して、目的の検体がリポソームに結合又は反応するのを検出する。この場合、蛍
光強度の変化よりもむしろリポソーム蛍光の偏光の変化を測定する。

【００５１】 検出に用いる蛍光偏光 蛍光偏光検出方法は、蛍光形ポリジアセチレンリポソーム又は他の蛍光形３次元
配列に目的の検体が結合又は反応した際の旋回（又は回転）の変化を利用する。

【００５２】 ３次元蛍光形ポリジアセチレン配列は偏光により励起する。旋回する前に配列が
発光すれば、放出光も偏向する。偏光子を放出光の経路に置き、適度な偏向を持
たない放出光（すなわち蛍光）をすべて取り除く。励起後発光までの間に配列が
旋回すれば、放出光は偏向しない。検体が配列と同じ大きさかそれ以上ならば、
検体が配列に結合した後に回転速度は大きく減少するはずである。すると放出光
はさらに偏向する。検体が複数の配列に結合することも可能である。この場合回
転はさらに遅くなり偏向は大きくなる。配列が複数の検体に結合しても偏向は大
きくなる。配列に組み込まれた反応性基質との反応を通して、検体が分解するか
、リポソーム若しくは他の３次元ポリジアセチレン配列の構造を変えるか、又は
、リポソーム若しくは他の３次元ポリジアセチレン配列のクラスターをばらばら
にすると、配列の回転速度が変わり、故に蛍光の偏向が変わりうる。もし配列に
組み込まれた基質との反応又は結合を通して、検体がリポソーム又は他の３次元
ポリジアセチレン配列のクラスターをばらばらにすると、配列の回転速度が変わ
り、故に測定される蛍光の偏向が変わり得る。もし検体が、ミクロビーズ（直径
は一般にナノメートルかミクロン、ミリメートルの範囲まで）の表面又はマクロ
ビーズ（直径は一般にミリメートルの範囲かそれ以上）の表面等の表面か、又は
、コロイド粒子に結合しており、その検体に３次元ポリジアセチレン配列が結合
すると、配列の蛍光の偏向はやはり変わりうる。

【００５３】 この検出方法では好ましくは、３次元配列リガンド及び／又は反応性基質が組み
込まれた蛍光形ポリジアセチレンリポソームを用いる。

【００５４】 偏向の変化は、励起偏向子に対して平行な偏光子を通り抜ける放出光の強度（Ｉ _ｐ ）と垂直な偏光子を通り抜ける放出光の強度（Ｉ_ｓ）とを測定して決定される
。偏光度は、Ｐ＝（Ｉ_ｐ−Ｉ_ｓ）／（Ｉ_ｐ＋Ｉ_ｓ）で算出される。結合が起きる
とＩ_ｐは増えＩ_ｓは減り、偏光度は増える。偏光度に代わる類似の方法は異方性
ｒ＝（Ｉ_ｐ−Ｉ_ｓ）／（Ｉ_ｐ＋２Ｉ_ｓ）の追跡である。

【００５５】 実施例 本発明の理解をさらに深めるために、以下に実施例を述べる。これは、本発明を
限定するものではない。

【００５６】 以下の実施例の中で特に記載がなければ、ジアセチレン脂肪酸は、Ｆａｒｃｈａ
ｎ社若しくはＧＦＳ社から購入したもの、又は、実験室で合成したものを用いた
。アセチレン化合物は、ＧＦＳ社又はＬａｎｃａｓｔｅｒ社から購入した。試薬
は、Ａｌｄｒｉｃｈ社及びＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した
。ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジステアロイル
−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタノール、ハチ毒液ホスホリパーゼＡ_２（
ＰＬＡ_２）、モノシアロガングリオシドＧ_Ｍ１、及び、コレラ毒素Ｂサブユニッ
トはＳｉｇｍａ社から購入した。有機発蛍光団はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂ
ｅｓ社及びＡｌｄｒｉｃｈ社から、テルビウム及びユーロピウム塩はＡｌｆａ
Ａｅｓａｒ社から購入した。クラミジアトラコマティス抗体（ａｎｔｉ−ＭＯＭ
Ｐ）はＶｉｒｏ Ｓｔａｔ社から、クラミジアトラコマティス基本小体（ＥＢｓ
）はＡｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入した。Ｈ_２ ＯはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉ−Ｑ Ｐｌｕｓ装置を用いて、限外ろ過し
た。溶媒は、特に記載がなければＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社からＯ
ｐｔｉｍａグレードのものを、無水溶媒はＡｌｄｒｉｃｈ社から購入した。

【００５７】 プローブ超音波処理は、マイクロチップを備えたＩｍａｇｉｎｇ Ｐｒｏｄｕｃ
ｔｓ Ｓｏｎｉｃ ３００Ｖ／Ｔを用いて、パワーを約２５％に設定して行った
。浴超音波処理は、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＦＳ１４０Ｈ超音波
処理装置に水を満たし、滴切な温度に加熱して行った。光重合は、ＵＶ光のエネ
ルギー量を２５４ｎｍ付近に設定できるＵＶオーブンを用いて行った。蛍光スペ
クトルは、ＭｉｃｒｏＭａｘプレートリーダー付ＳＰＥＸ Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ
−２を用いて、キュベット及び９６ウェルプレート（未処理の黒白ポリスチレン
）中で測定した。ＵＶ／ＶＩＳスペクトルは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃ
ｅｓ Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ−２５０プレートリーダーを用いて、９６ウェルプ
レート中で測定した。分析データは、ＳＰＥＸ Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ−２プレー
ト読取装置とＷａｌｌａｃｈ Ｖｉｃｔｏｒ^２ ａｎｄ Ｖｉｃｔｏｒ^２ Ｖ読
取装置の両方を用いて回収した。^１Ｈ及び^１３Ｃスペクトルは、Ａｃｏｒｎ Ｎ
ＭＲ、Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ ＣＡによって得た。

【００５８】 市販されていないジアセチレン脂肪酸は、文献に記載されている方法で、銅（Ｉ
）を媒介とする、適切な１−ヨード−１−イン炭化水素、及び、ω−インカルボ
ン酸をカップリングさせることにより合成した（Ｔｉｅｋｅ Ｂ．ら、Ａｎｇｅ
ｗ．Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇ．，１９７６，１５（１２），７６４−７
６５）。この１−ヨード−１−イン炭化水素は、対応する１−イン炭化水素を１
当量の無水ヘキサン中のブチルリチウムを用いて、室温で１時間、アルゴン雰囲
気下で脱プロトンすることにより調製した。その後、１．０２当量のヨウ素を加
えた。得られた反応液を、室温で６時間さらに−２０℃で１５時間攪拌した。次
に１Ｍ塩酸を用いて反応を終結させ、得られた生成物をエチルエーテル中に抽出
した。次に、合わせたエーテル抽出物を飽和チオ硫酸ナトリウム溶液で５回、飽
和食塩水で２回洗浄し、硫酸マグネシウムを用いて乾燥させ、ろ過した。その後
、溶媒を分圧下で除去し、９８％の収率で粗１−ヨード−１−アルキンを得た。
さらにこの粗生成物をイソプロピルアルコールで希釈し、２時間以内に次の反応
で使用するか、又は未希釈の状態で約２０時間以内、−２０℃で保存した。

【００５９】 １当量のω−インカルボン酸を、１．３当量のＫＯＨを含む１Ｍ水酸化カリウム
溶液中にアルゴン雰囲気下で溶解した。次に、触媒量（約０．１当量）の水酸化
アンモニウム塩化物をこの溶液に加えた。また、０．２５当量の塩化銅（Ｉ）を
、４．４当量のエチルアミンを含む水中に７０％エチルアミンを溶解させた。こ
の溶液を、脱プロトンした脂肪酸溶液に加え、氷／水槽で冷却した。粗１−ヨー
ド−１−アルキン（１．０５当量）をイソプロピルアルコールに加え（おおよそ
ヨード−アルキン溶液量２に対し、反応混合液量１）、フラスコの中身を光から
保護するためにホイルを被せ、反応液を０℃で１時間攪拌した。その後、室温ま
で温め、さらに約２０時間攪拌した。１Ｍ硫酸を用いて反応を終結させ、得られ
た生成物をエチルエーテル中で抽出した。集めたエーテル抽出物は、水、飽和チ
オ硫酸ナトリウム、及び、飽和食塩水でそれぞれ繰り返し洗浄し、硫酸マグネシ
ウムを用いて乾燥させた。次に、得られた混合液をろ過し、分圧下で溶媒を除去
して、量収率で粗生成物を得た。ジアセチレン脂肪酸をクロロホルム／ヘキサン
及びヘキサンで繰り返し再結晶化させるか、又は、クロロホルム中のイソプロパ
ノールの比率を高くしたものを溶離液としてシリカフラッシュカラムクロマトグ
ラフィー処理することによって精製し、さらにヘキサンから再結晶化させた。シ
リカ（５％メタノールのクロロホルム溶液で溶離）の薄層クロマトグラフィー処
理、並びに、^１Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲ分析によって純度を測定した。

【００６０】 ジアセチレン界面活性剤のクロロホルム溶液は、適量の界面活性剤をクロロホル
ムに溶解し、２．０ｍＭ溶液をつくることによって調製した。その後０．２２ミ
クロン孔のＰＴＦＥフィルターでこの溶液をろ過し、全ての重合体を除去した。
また、ジアセチレンリポソーム溶液は、文献に記載されている一般的な方法で調
製した。（Ｈｕｐｆｅｒ Ｂ．ら、Ｃｈｅｍ，Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ，１９８
３，３３，３５５−３７４；Ｓｐｅｖａｋら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，
１９９３，１１５，１１４６−補足材料；Ｒｅｉｃｈａｒｔ Ａ．ら、Ｊ．Ａｍ
．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９５，１１７，８２９−補足材料）すなわち、ジア
セチレン界面活性剤の有機溶液を、添加剤（例；リガンド又は反応性基質、及び
／又は、発蛍光団）とともに乾燥させ、水又は緩衝溶液を加え、化合物質を全体
で約１ｍＭにした後、プローブ超音波処理により物質を分散させ、さらに０．８
μｍ孔のセルロースアセテートフィルターでろ過して、４℃又は１０℃で一晩冷
却した。

【００６１】 クラミジアトラコマティス抗体（ａｎｔｉ−ＭＯＭＰ）は、２−メルカプトエチ
ルアミン塩酸塩（ＭＥＡ）（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ Ｇ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａ
ｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａ
ｎ Ｄｉｅｇｏ，ｐ８３）を用いて、蝶つがい型ジスルフィド結合を還元するこ
とによって等しく半分に開裂させた。この抗体溶液（０．９５０ｍＬ、４〜５ｍ
ｇ／ｍＬ ｉｎ ２ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４／８ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４／１５５ｍＭ
ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）を、０．０２ｍＬ ２ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．０８
ｍＬ ８ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４及び０．０２ｍＬ ５００ｍＭ ＥＤＴＡと、ｐ
Ｈ７．４で混合した。その後ＭＥＡ（６ｍｇ）を加え、反応チューブにアルゴン
を流し、３７℃で９０分間培養した。反応溶液を取り出し、０．１Ｍ Ｎａ_２Ｈ
ＰＯ_４／０．１５Ｍ ＮａＣｌ緩衝液に対して（約７５０ｍＬで３回取り替えた
）、ｐＨ７．２で、約２０時間透析した（１０，０００ＭＷＣＯ 透析カセット
）。

【００６２】 遊離チオール基を用いて、抗体の半体を１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセ
ロ−３−ホスホリルエタノールアミノカプロイルマレイミド（ＰＥ−Ｍ）に共役
させ、脂質末端を持つ抗体を得た（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ Ｇ．，同章、ｐｐ４６
３−４６５）。その後ＰＥ−Ｍ（０．２１ｍｇ）を透析した開裂抗体の半体に加
え、反応チューブにアルゴンを流し、ＰＥ−Ｍを分散させるために随時攪拌しな
がら、３７℃で２時間かけて浴超音波処理した。このチューブをその後、３７℃
で１時間保温し、続いて溶液を１．５ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４／１ｍＭ Ｎａ_２ＨＰ
Ｏ_４／１３７ｍＭ ＮａＣｌ／２．７ｍＭ ＫＣｌを用いて（約７５０ｍＬで３
回取り替え）、ｐＨ７．１で、約２０時間透析した（１０，０００ＭＷＣＯ透析
カセット）。

【００６３】 ＰＥ−Ｍに共役させた、坑クラミジアトラコマティス抗体の半体を、界面活性剤
透析によって、デオキシコール酸塩を用いて、未重合ジアセチレンリポソームに
挿入した（Ｈｕａｎｇ Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８０，２５５
（１７），８０１５−８０１８）。次に、リポソーム溶液（１．０ｍＬ、脂質中
１ｍＭ）を共役抗体半体溶液６〜７μＬ、デオキシコール酸塩溶液５６μＬ（水
中１２．５％）、及び、１５ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４／１０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４／
１．３７Ｍ ＮａＣｌ／２７ｍＭ ＫＣｌ １００μＬと、ｐＨ７．４で混合さ
せた。その後混合液を、４℃、約２０時間で、１０ｍＭ ＫＣｌ／１．５ｍＭ
ＫＨ_２ＰＯ_４／１ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４を用いて、１０，０００ＭＷＣＯカセッ
トにより、約７５０ｍＬの量で３回取り替えて、ｐＨ７．１で透析した。

【００６４】 実施例１ リポソームを水中の１０，１２−ペンタコサジン酸（ＰＤＡ）から形成し、約２
５４ｎｍで、４００ｍＪ／ｃｍ^２のＵＶエネルギーにより光重合した。次に、こ
の溶液を原脂質０．１ｍＭに希釈し、蛍光スペクトルを測定した。その後１０分
間６３℃に加熱し、再び蛍光スペクトルを測定した。この２回の蛍光性の最大値
は３５０％と４００％であった。このことは、加熱によりポリジアセチレンリポ
ソームが、非蛍光性から蛍光性へと転化したことを示している。

【００６５】 実施例２ 発蛍光団を５％モル濃度でＰＤＡに加えることにより、実施例１と同様に、追加
の重合リポソーム溶液を調製した。その後、重合リポソームと発蛍光団の蛍光ス
ペクトルを測定した。さらに、試料を６３℃〜６５℃に１０〜１５分間加熱し、
再び蛍光スペクトルを測定した。結果を表１に示す。リポソームの蛍光性は１３
倍まで増加し、発蛍光団についても−１６％の減少から＋２０．３倍の増加まで
変化した（２，０３０％）。

【００６６】

【表１】

【００６７】 実施例３ 水中で、ＰＤＡリポソームを調製し、実施例１と同様に光重合した。また、同等
の量の水と２５ｍＭ 重炭酸ナトリウムを用いて、原脂質約０．１ｍＭの希釈溶
液を調製した。その後、水で希釈した試料のリポソーム発蛍光団スペクトルを測
定し、３０分後、塩基で希釈した試料のスペクトルを再び測定した。最大５６０
ｎｍでの蛍光性のパーセント変化は、純粋ポリ（ＰＤＡ）リポソームの５５％増
加から、発蛍光団試料を添加したリポソームの５６５％まで変化した（表２）。

【００６８】

【表２】

【００６９】 実施例４ 水中でＰＤＡからリポソームを調製し、実施例２と同様に光重合した。このポリ
（ＰＤＡ）リポソーム溶液を、２５ｍＭ 重炭酸ナトリウムを用いて１：１に希
釈し、原脂質を約０．１ｍＭにした。次に、少量の試料をＦｌｕｏｒｏｍａｘ
２の石英マイクロセル（２５０μＬ）に入れ、５６０ｎｍでの蛍光発光性を２時
間かけて測定した。また６５０ｎｍ、５６０ｎｍ、４９０ｎｍでの吸光度を、別
の試料を用いて、同時に２時間かけて測定した。初期値からの測定値のパーセン
ト変化は、それぞれのデータポイントについて計算した（パーセント変化＝１０
０×［（Ｖ（ｔ）−Ｖ（０））／Ｖ（０）］：式中、Ｖ（ｔ）はｔ点での測定値
、Ｖ（０）は初期値を表す）。ポリ（ＰＤＡ）リポソームの蛍光性及び吸光度の
パーセント変化結果を図３に示す。蛍光シグナルの変化が吸光度の変化よりも顕
著であることがはっきりと示されている。

【００７０】 実施例５ １μＭ及び５μＭのポリ（ＰＤＡ）リポソーム溶液を、貯蔵重合リポソーム溶液
（実施例１参照）を２５ｍＭ ＮａＨＣＯ_３で適切に希釈することにより調製し
、ポリ（ＰＤＡ）リポソームを蛍光性へと転化させた。次に、試料（各１００μ
Ｌ）のＵＶ／ＶＩＳ吸光度を、９６ウェル Ｃｏｓｔａｒ ＵＶ／ＶＩＳプレー
ト付モレキュラーデバイスプレート読取装置を用いて測定した。水のバックグラ
ウンド上の６５０ｎｍ、６２０ｎｍ、５６０ｎｍ及び４９０ｎｍでは特に、３５
０ｎｍから７５０ｎｍでは概して、どの試料にも吸光性は見られなかった。溶液
の蛍光スペクトルはＳＰＥＸ Ｆｌｕｏｒｏ−Ｍａｘ ２と石英マイクロセルを
用いて、励起４９０ｎｍで測定した。約４回又は５回水をバックグラウンドにし
た時の５６０ｎｍでの蛍光シグナルを、それぞれ１μＭと５μＭの溶液につき測
定した。黒色Ｇｒｉｅｎｅｒ ９６ウェルプレート（各１００μＬ）中の溶液の
蛍光性を、ＶＩＣＴＯＲ^２プレートリーダーを用いて、励起４８５ｎｍで測定し
た場合は、１μＭと５μＭのリポソーム溶液両方が、水のバックグラウンド上で
６４２ｎｍでの顕著なシグナル値、バックグラウンドの３倍値、バックグラウン
ドの５倍値をそれぞれ示した。このことは、ＵＶ／ＶＩＳにおける蛍光性測定の
感光度の増加を明示している。

【００７１】 実施例６ 水中でリポソームを、１０，１２−トリコサジン酸（ＴＲＣＤＡ）とジミリスト
イルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）を７：２のモル比で含む混合物により、
調製した。その後このリポソームを２５４ｎｍで、２００ｍＪ／ｃｍ^２のＵＶエ
ネルギーにより重合した。次に、ホスホリパーゼＡ_２（ＰＬＡ_２）を水中に溶解
して１．０ｍｇ／ｍＬにした。さらに、ＴＲＩＳ（５０ｍＭ）及びＮａＣｌ（１
５０ｍＭ）から混合緩衝液をｐＨ７．７で調製し、緩衝液９部とＰＬＡ_２溶液１
部の割合で、ＰＬＡ_２溶液と混合した。この溶液をリポソーム溶液に加え、リポ
ソーム０．０９１ｍＭに希釈し、（「ＰＬＡ_２試料」）１時間かけて蛍光性を測
定した。また、９部の混合緩衝液と１部のＨ_２Ｏからなる対照溶液も調製した。
この対照溶液を用いて、リポソーム溶液を０．０９１ｍＭに希釈し（「対照溶液
」）、６３５ｎｍでの蛍光発光性を１時間かけて測定した。また、複製のＰＬＡ _２ 及びコントロール試料を調製し、６５０ｎｍと４９０ｎｍでの吸光度を測定し
、６５０ｎｍ／４９０ｎｍ吸光度比を各時点で計算した。６３５ｎｍでの発光の
パ−セント変化及び６５０ｎｍ／４９０ｎｍでの吸光度比は、実施例４に記載さ
れている方法で計算した。５分後、ＰＬＡ_２溶液の発光は４２％増加し、一方対
照溶液の発光は１４％増加した。ＰＬＡ_２溶液の吸光度比は、２９％減少し、対
照溶液の吸光度比は、２３％減少した。１時間後、ＰＬＡ_２試料の発光は１８７
％増加し、コントロール試料の発光は１３０％増加した。一方でＰＬＡ_２溶液の
吸光度比は５６％減少し、対照溶液の吸光度比は４４％減少した。

【００７２】 実施例７ 水中でリポソームを、１０，１２−トリコサジン酸（ＴＲＣＤＡ）とジミリスト
イルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）を７：２のモル比で含み、且つ、発蛍光
団ＢＯＤＩＰＹ^ＴＭＴＲ−カダベリンを発蛍光団１：ＴＲＣＤＡ２００の割合で
混合して調製した。このリポソームを２５４ｎｍで、ＵＶエネルギー２００ｍＪ
／ｃｍ^２によって重合した。また、ホスホリパーゼＡ_２（ＰＬＡ_２）を水中に溶
解して１．０ｍｇ／ｍＬにした。さらに、ＴＲＩＳ（５０ｍＭ）及びＮａＣｌ（
１５０ｍＭ）から混合緩衝液をｐＨ７．７で調製し、緩衝液９部とＰＬＡ_２溶液
１部の割合で、ＰＬＡ_２溶液と混合した。得られた溶液をリポソーム溶液に加え
、リポソーム０．０９１ｍＭに希釈し、（「ＰＬＡ_２試料」）１時間かけて蛍光
度を測定した。また、９部の混合緩衝液と１部のＨ_２Ｏからなる対照溶液も調製
した。この対照溶液を用いて、リポソーム溶液を０．０９１ｍＭに希釈し（「対
照溶液」）、６３５ｎｍでの蛍光発光性を１時間かけて測定した。６３５ｎｍで
の発光のパ−セント変化は、実施例４に記載されている方法で計算した。５分後
、ＰＬＡ_２溶液の発光は４６％増加し、一方対照溶液の発光は１０％増加した。
１時間後、ＰＬＡ_２試料の発光は２５５％増加し、コントロール試料の発光は１
５２％増加した。

【００７３】 実施例８ １０，１２−トリコサジン酸（ＴＲＣＤＡ）とジミリストイルホスファチジルコ
リン（ＤＭＰＣ）を７：２のモル比で含む混合物から、リポソーム溶液を調製し
、さらに発蛍光団を、発蛍光団：ＴＲＣＤＡが約１：２００の割合になるように
加えた。各調製液には異なった発蛍光団を加えた。その後、このリポソームを２
５４ｎｍで４０ｍＪ／ｃｍ^２のＵＶエネルギーにより重合した。次に、ホスホリ
パーゼＡ_２（ＰＬＡ_２）を水中に１．２ｍｇ／ｍＬで溶解した。さらに、ＴＲＩ
Ｓ（８９４ｍＭ）、ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）及びＣａＣｌ_２（４．５ｍＭ）から
混合緩衝液をｐＨ７．１で調製し、緩衝液９部とＰＬＡ_２溶液１部の割合で、Ｐ
ＬＡ_２溶液と混合した。得られた溶液をリポソーム溶液に加え、リポソーム０．
０９１ｍＭに希釈し、６３０ｎｍでのリポソームの蛍光性を１時間かけて測定し
た。また、対照溶液を、９部の混合緩衝液と１部のＨ_２Ｏを混合することによっ
て調製した。この対照溶液を用いてリポソーム溶液を０．０９１ｍＭに希釈し、
リポソームの蛍光性を１時間かけて測定した。第２の対照実験として、Ｈ_２Ｏを
用いてリポソーム溶液を０．０９１ｍＭに希釈し、１時間かけて蛍光性を測定し
た。結果を表３に示す。ＰＬＡ_２にさらされている試料ではリポソームの蛍光性
が増加し、対照緩衝液及び純水にさらされている試料では増加が極めて少ないか
、減少していることが示されている。

【００７４】

【表３】

【００７５】 実施例９ リポソームを５，７−ドコサジン酸から、５モル％モノシアロガングリオシドＧ _Ｍ１ 及び０．５質量％ＤＩＣ−１８（５）を混合することにより調製し、Ｈ_２Ｏ
中全脂質１ｍＭにして、Ｎ_２気体下、２．４Ｊ／ｃｍ^２で光重合した。このリポ
ソーム溶液（２０μＬ）に１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液をｐＨ６．２５（５
５μＬ）で、９６ウェルマイクロタイターのウェルの中で混合した。４０分後、
Ｈ_２Ｏ（２５μＬ）、ｐＨ７．０の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（２５μＬ
）、又は、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）−ｐＨ７．０の１０ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液（２５μＬ）０．７４ｍｇ／ｍＬのいずれかをそれぞれのウェ
ルに加えた。その後、６８０ｎｍでの蛍光性を４時間かけて定期的に測定した。
ＣＴＢを入れたウェルは４時間後、平均で１９３％の蛍光性の増加が見られ、緩
衝液を加えたウェルは平均で１２９％の増加、Ｈ_２Ｏを加えたくぼみは平均で−
２％の変化が見られた。６２０ｎｍ及び４９０ｎｍでの吸光度の二重測定を行っ
たところ、６２０ｎｍ／４９０ｎｍの平均球光度において、ＣＴＢを用いた場合
は−１２％、緩衝液の場合は−９％、Ｈ_２Ｏの場合は−２％の変化が見られた。

【００７６】 実施例１０ ０．５モル％のＤＩＣ−１８（５）を組み込んで、ＰＤＡからリポソームを調製
した。その後、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタ
ノールアミノカプロイルマレイミドに共役させた、抗クラミジアトラコマティス
抗体の半体を、前述と同様に、デオキシコール酸塩を用いて界面活性剤透析によ
って挿入した。次に、リポソームを６００ｍＪ／ｃｍ^２で重合させ、非蛍光性の
ポリジアセチレンリポソームを得た。このリポソーム溶液（１０μＬ）を９６ウ
ェルプレート中でＨ_２Ｏ（８０μＬ）によって希釈し、クラミジアトラコマティ
ス基本小体溶液（ｐＨ７．４の１０^８／ｍＬ １０ｍＭ リン酸ナトリウム／１
５４ｍＭ ＮａＣｌ、１０μＬ）を加えた。また、基本小体を含まない緩衝液を
対照ウェルに加えた。この試料を４７５ｎｍの光で励起させ、６３５ｎｍでの蛍
光強度（ポリジアセチレン発光）及び６８０ｎｍ（発蛍光団発光）を測定した。
１時間後、６３５ｎｍでの蛍光強度は対照用では３１６８で、活性試料では３４
６６、６８０ｎｍでの蛍光強度は対照用では２５１２、活性試料では３７３８で
あった。

【００７７】 実施例１１ 未重合のＴＲＣＤＡリポソームを水中で調製して４℃に冷却し、１００ｎｍ孔ポ
リカーボネート膜を備えた、冷却手持ち押出成形機（Ａｖｅｓｔｉｎ社製、Ｌｉ
ｐｏ−Ｆａｓｔ Ｂａｓｉｃ）でろ過した。次に膜を取り除き、５分間４℃に冷
却して、１００ｍＪ／ｃｍ^２のＵＶエネルギー（２５４ｎｍ）で光重合した。そ
の後、この膜は濃青色に変化し、空気中、光の当たる状態で保存して、２カ月に
わたりその色を保った。２カ月後、その膜の蛍光性を測定し、１分間２５ｍＭ
ＮａＨＣＯ_３に浸した後、再び蛍光性を測定したところ、図４に示してあるよう
に、２１６％の増加が見られた。同様の膜は原色を保ち、非蛍光性を１２カ月保
ったが、それでも蛍光性へと転化させることができた。

【００７８】 実施例１２ ＴＲＣＤＡからリポソームを調製し、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ
−３−ホスホリルエタノールアミノカプロイルマレイミドと共役させた、抗クラ
ミジア抗体を前述のように挿入した。その後このリポソーム溶液を、４℃で約４
０時間冷却した。次に、フィルターホルダーに２００ｎｍ孔濃灰色ポリカーボネ
ート膜（Ｐｏｒｅｔｉｃｓ社製）を付けたシリンジに、この溶液を約１．５ｍＬ
入れ、ろ過させて膜の表面上及び／又は表面内にリポソームを沈積させた。その
後、この膜を一時的に−２０℃に冷却し、２５４ｎｍのＵＶ光０．０５Ｊ／ｃｍ ^２ にさらさせた。これによって膜の表面が暗青色に着色した。

【００７９】 次にこの膜を、石英セル（容積約２ｍＬ）中に対角線上に置かれた、黒色金属片
上に載せ、セルをｐＨ７．４の１０ｍＭ リン酸ナトリウム／１５４ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ １部と９部の水からなる溶液（Ａ）で満たした。その後、セルを蛍光計Ｆ
ｌｕｏｒｏｍａｘ ２の発光側に取り付けられた、５５０ｎｍのロングパスフィ
ルター付ホルダー中に置いた。次に、試料を４５０ｎｍの光で励起し、６１５ｎ
ｍでの発光を１時間、毎分対照実験として測定した。発光の増加は見られなかっ
た。発光は、Ｓ／Ｒ＝（蛍光シグナル）／（励起ランプから直接取った参照シグ
ナル（参照値は１より小さく、ランプ強度の変動を補う））として測定した。対
照溶液をその後取り出し、石英セルや試料を動かすことなく、約１０^７ｍＬの溶
液（Ａ）中のクラミジア基本小体（ＥＢｓ）と入れ替えた。この試料を励起させ
、６１５ｎｍでの発光を前述と同様に１時間かけて測定したところ、増加が見ら
れた。この試料をその後、上記溶液の中に１６時間入れておき、再び発光を測定
したところ、さらに増加が見られた。１時間後の対照溶液における試料の発光（
Ｓ／Ｒ）は、９９，５５６であり、１時間後の緩衝溶液における試料の発光（Ｓ
／Ｒ）は、１１２，４７２であり、１６時間後は、１２３，９２８であった。

【００８０】 実施例１３ ０．５モル％のＤＩＣ−１８（５）を混合して、ＰＤＡからリポソームを調製し
た。さらに、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタノ
ールアミノカプロイルマレイミドと共役させた抗クラミジア抗体を、前述と同様
に界面活性剤透析によって挿入した。次にこのリポソームを、実施例１２と同様
に、１００ｎｍ孔の白色ポリカーボネート膜上に沈積させた。その後膜を−２０
℃に冷却し、２５４ｎｍで、０．０８Ｊ／ｃｍ^２のＵＶエネルギーによってコー
ティング光重合した。実施例１２と同様に、この膜を対照溶液に１時間浸し、次
にＥＢ溶液に浸した。混合した発蛍光団の蛍光発光性（Ｓ／Ｒ）を６７６ｎｍで
測定した（５５０ｎｍロングパスフィルター）。１時間後の対照溶液中で−１％
の変化が見られ、一方、ＥＢ溶液中で１時間後６３％の上昇、４時間後は３３２
％の上昇が見られた。

【００８１】 実施例１４ ５，７−テトラコサジン酸から、０．５モル％のＤＩＣ−１８（５）を組み込ん
で、リポソームを調製した。１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホ
スホリルエタノールアミノカプロイルマレイミドと共役させた、抗クラミジアト
ラコマティス抗体を、前述と同様に界面活性剤透析によって挿入した。その後こ
のリポソームを、２００ｎｍ孔の白色ポリカーボネート膜の上に、実施例１２と
同様に沈積させた。膜１３ｍｍにつき、１ｍＬの未重合リポソーム溶液が見られ
た。その後、この膜を−２０℃に冷却し、２５４ｎｍで、０．２０Ｊ／ｃｍ^２の
ＵＶエネルギーによってコーティングを光重合した。

【００８２】 ｐＨ７．４の１０ｍＭ リン酸Ｎａ／１５４ｍＭ ＮａＣｌ中の約１０^８／ｍＬ
のクラミジア基本小体（ＥＢｓ）を、水で約１０^６ｍＬに希釈した。同じ量の緩
衝液を同様に、対照溶液として希釈した。次に２枚の塗被膜を、それぞれシリン
ジフィルターカートリッジ中の、被覆されていない２００ｎｍ孔ポリカーボネー
ト膜上においた。その後、３ｍＬのプラスチックシリンジを用いて溶液に圧力を
かけて、対照溶液（２ｍＬ）を１枚の膜でろ過し、ＥＢ溶液（２ｍＬ）をもう１
枚でろ過した過には１５〜２０分間かかった。この膜をカートリッジから取り出
して、黒色金属片の上に載せ、実施例１２と同様に石英セル中に置した。その後
、蛍光発光性を両方の試料について測定し（５５０ｎｍロングパスフィルター）
、６８８ｎｍでの蛍光性（コーティングの蛍光）を５６０ｎｍでの蛍光性（大部
分はバックグラウンド反射）と比較した。ＥＢ溶液のろ過に使用した膜の６８８
ｎｍ／５６０ｎｍでの発光比は０．６０、対照溶液のろ過に使用した膜は０．４
９であった。

【００８３】 追加実施例 以下の追加実施例により、本発明のさらなる蛍光性の検出方法の実例を挙げる。

【００８４】 Ｇ_Ｍ１ガングリオシド及びシアル酸先端基を持つジアセチレンが組み込まれ、フ
ィルム中に発蛍光団を含む、又は、含まないポリ（ＰＤＡ）フィルムを用いて行
う、コレラ毒素又はコレラの検出。

【００８５】 シアル酸先端基を持つジアセチレンが組み込まれ、リポソーム中に発蛍光団を含
む、又は、含まないポリ（ＰＤＡ）リポソームを用いて行う、インフルエンザウ
ィルスの検出。

【００８６】 シアル酸先端基を持つジアセチレンが組み込まれ、フィルム中に発蛍光団を含む
、又は、含まないポリ（ＰＤＡ）フィルムを用いて行う、インフルエンザウィル
スの検出。

【００８７】 ＤＭＰＣが組み込まれ、フィルム中に発蛍光団を含む、又は、含まないポリ（Ｔ
ＲＣＤＡ）フィルムを用いて行う、ＰＬＡ_２の検出。

【００８８】 ジアクタデシルグリセリルエーテル−β−グルコシドが組み込まれ、リポソーム
中に発蛍光団を含む、又は、含まないポリ（ＴＲＣＤＡ）リポソームを用いて行
う、大腸菌の検出。

【００８９】 大腸菌の抗体が組み込まれ、リポソーム中に発蛍光団を含む、又は、含まないポ
リジアセチレンリポソームを用いて行う、大腸菌の検出。

【００９０】 ジアクタデシルグリセリルエーテル−β−グルコシドが組み込まれ、フィルム中
に発蛍光団を含む、又は、含まないポリ（ＴＲＣＤＡ）フィルムを用いて行う、
大腸菌の検出。

【００９１】 大腸菌の抗体が組み込まれ、フィルム中に発蛍光団を含む、又は、含まないポリ
ジアセチレンリポソームを用いて行う、大腸菌の検出。

【００９２】 サルモネラ菌の抗体が組み込まれ、リポソーム中に発蛍光団を含む、又は、含ま
ないポリジアセチレンリポソームを用いて行う、サルモネラ菌の検出。

【００９３】 サルモネラ菌の抗体が組み込まれ、フィルム中に発蛍光団を含む、又は、含まな
いポリジアセチレンフィルムを用いて行う、サルモネラ菌の検出。

【００９４】 リステリアの抗体が組み込まれ、リポソーム中に発蛍光団を含む、又は、含まな
いポリジアセチレンリポソームを用いて行う、リステリアの検出。

【００９５】 リステリアの抗体が組み込まれ、フィルム中に発蛍光団を含む、又は、含まない
ポリジアセチレンフィルムを用いて行う、リステリアの検出。

【００９６】 カンピロバクターの抗体が組み込まれ、リポソーム中に発蛍光団を含む、又は、
含まないポリジアセチレンリポソームを用いて行う、カンピロバクターの検出。

【００９７】 カンピロバクターの抗体が組み込まれ、フィルム中に発蛍光団を含む、又は、含
まないポリジアセチレンフィルムを用いて行う、カンピロバクターの検出。

【００９８】 ヘキソキナーゼがその表面に組み込まれ、フィルム中に発蛍光団を含む、又は、
含まないポリ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドＰＤＡ−ＰＤＡ）フィルムを用い
て行う、グルコースの検出。

【００９９】 ヘキソキナーゼがその表面に組み込まれ、リポソーム中に発蛍光団を含む、又は
、含まないポリ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドＰＤＡ−ＰＤＡ）リポソームを
用いて行う、グルコースの検出。

【０１００】 抗体又は抗体フラグメントが組み込まれ、リポソーム中に発蛍光団が加えられた
、又は、加えられていないポリジアセチレンリポソームを用いて行う、抗原の検
出。

【０１０１】 抗体又は抗体フラグメントが組み込まれ、フィルム中に発蛍光団が加えられた、
又は、加えられていないポリジアセチレンフィルムを用いて行う、抗原の検出。

【０１０２】 プロテアーゼ基質が組み込まれ、リポソーム中に発蛍光団が加えられた、又は、
加えられていないポリジアセチレンリポソームを用いて行う、ＨＩＶプロテアー
ゼ等のプロテアーゼの検出。

【０１０３】 プロテアーゼ基質が組み込まれ、フィルム中に発蛍光団が加えられた、又は、加
えられていないポリジアセチレンフィルムを用いて行う、ＨＩＶプロテアーゼ等
のプロテアーゼの検出。

【０１０４】 キナーゼ基質が組み込まれ、リポソーム中に発蛍光団が加えられた、又は、加え
られていないポリジアセチレンリポソームを用いて行う、ＭＡＰキナーゼ等のキ
ナーゼの検出。

【０１０５】 キナーゼ基質が組み込まれ、フィルム中に発蛍光団が加えられた、又は、加えら
れていないポリジアセチレンフィルムを用いて行う、ＭＡＰキナーゼ等のキナー
ゼの検出。

【０１０６】 Ｇ_Ｍ１ガングリオシドが組み込まれ、ナノポア膜上が発蛍光団で覆われた、又は
、覆われていないポリ（５，７−ドコサジン酸）を用いて行う、コレラ毒素の検
出。

【０１０７】 Ｇ_Ｍ１ガングリオシド及びシアル酸先端基を持つジアセチレンが組み込まれ、ナ
ノポア膜上が発蛍光団で覆われた、又は、覆われていないポリ（ＰＤＡ）を用い
て行う、コレラ毒素の検出。

【０１０８】 シアル酸先端基を持つジアセチレンが組み込まれ、ナノポア膜上が発蛍光団で覆
われた、又は、覆われていないポリ（ＰＤＡ）を用いて行う、インフルエンザウ
ィルスの検出。

【０１０９】 ＤＭＰＣが組み込まれ、ナノポア膜上が発蛍光団で覆われた、又は、覆われてい
ないポリ（ＴＲＣＤＡ）を用いて行う、ＰＬＡ_２の検出。

【０１１０】 ジアクタデシルグリセリルエーテル−β−グルコシドが組み込まれ、ナノポア膜
上が発蛍光団で覆われた、又は、覆われていないポリ（ＴＲＣＤＡ）を用いて行
う、大腸菌の検出。

【０１１１】 大腸菌の抗体が組み込まれ、ナノポア膜上が発蛍光団で覆われた、又は、覆われ
ていないポリジアセチレンを用いて行う、大腸菌の検出。

【０１１２】 サルモネラ菌の抗体が組み込まれ、ナノポア膜上が発蛍光団で覆われた、又は、
覆われていないポリジアセチレンを用いて行う、サルモネラ菌の検出。

【０１１３】 リステリアの抗体が組み込まれ、ナノポア膜上が発蛍光団で覆われた、又は、覆
われていないポリジアセチレンを用いて行う、リステリアの検出。

【０１１４】 カンピロバクターの抗体が組み込まれ、ナノポア膜上が発蛍光団で覆われた、又
は、覆われていないポリジアセチレンを用いて行う、カンピロバクターの検出。

【０１１５】 ヘキソキナーゼがその表面に組み込まれ、多孔膜上が発蛍光団で覆われた、又は
、覆われていないポリ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドＰＤＡ−ＰＤＡ）を用い
て行う、グルコースの検出。

【０１１６】 抗体又は抗体フラグメントが組み込まれ、ナノポア膜上が発蛍光団で覆われた、
又は、覆われていないポリジアセチレンを用いて行う、抗原の検出。

【０１１７】 プロテアーゼ基質が組み込まれ、ナノポア膜上が発蛍光団で覆われた、又は、覆
われていないポリジアセチレンを用いて行う、ＨＩＶプロテアーゼ等のプロテア
ーゼの検出。

【０１１８】 キナーゼ基質が組み込まれ、ナノポア膜上が発蛍光団で覆われた、又は、覆われ
ていないポリジアセチレンを用いて行う、ＭＡＰキナーゼ等のキナーゼの検出。

【０１１９】 適切な抗原又はエピトープが組み込まれ、さらに発蛍光団が組み込まれ、又は、
組み込まれていないポリジアセチレン配列を用いて行う、抗原又は抗原片の検出
。

【０１２０】 適切な抗原又はエピトープが組み込まれ、さらに発蛍光団が組み込まれた、又は
、組み込まれていないポリジアセチレンリポソームを用いて行う、抗原又は抗原
フラグメントの検出。

【０１２１】 適切な抗原又はエピトープが組み込まれ、さらに発蛍光団が組み込まれ、又は、
組み込まれていないポリジアセチレンフィルムを用いて行う、抗原又は抗原フラ
グメントの検出。

【０１２２】 適切な抗原又はエピトープが組み込まれ、ナノポア膜上が発蛍光団で覆われた、
又は、覆われていないポリジアセチレン配列を用いて行う、抗原又は抗原フラグ
メントの検出。

【０１２３】 適切な抗原又はエピトープが組み込まれ、ナノポア膜上が発蛍光団で覆われた、
又は、覆われていないポリジアセチレンリポソームを用いて行う、抗原又は抗原
フラグメントの検出。

【０１２４】 適切な抗原又はエピトープが組み込まれ、ナノポア膜上が発蛍光団で覆われた、
又は、覆われていないポリジアセチレンフィルムを用いて行う、抗原又は抗原フ
ラグメントの検出。

【０１２５】 核酸が組み込まれ、さらに発蛍光団が組み込まれた、又は、組み込まれていない
ポリジアセチレン配列を用いて行う、核酸の検出。

【０１２６】 核酸が組み込まれ、さらに発蛍光団が組み込まれた、又は、組み込まれていない
ポリジアセチレンリポソームを用いて行う、核酸の検出。

【０１２７】 核酸が組み込まれ、さらに発蛍光団が組み込まれた、又は、組み込まれていない
ポリジアセチレンフィルムを用いて行う、核酸の検出。

【０１２８】 核酸が組み込まれ、ナノポア膜上が発蛍光団で覆われた、又は、覆われていない
ポリジアセチレンを用いて行う、核酸の検出。

【０１２９】 核酸が組み込まれ、さらに発蛍光団が組み込まれた、又は、組み込まれていない
ポリジアセチレン配列を用いて行う、タンパク質の検出。

【０１３０】 核酸が組み込まれ、さらに発蛍光団が組み込まれた、又は、組み込まれていない
ポリジアセチレンリポソームを用いて行う、タンパク質の検出。

【０１３１】 核酸が組み込まれ、さらに発蛍光団が組み込まれた、又は、組み込まれていない
ポリジアセチレンフィルムを用いて行う、タンパク質の検出。

【０１３２】 核酸が組み込まれ、ナノポア膜上が発蛍光団で覆われた、又は、覆われていない
ポリジアセチレンを用いて行う、タンパク質の検出。

【０１３３】 タンパク質が組み込まれ、さらに発蛍光団が組み込まれた、又は、組み込まれて
いないポリジアセチレン配列を用いて行う、核酸の検出。

【０１３４】 タンパク質が組み込まれ、さらに発蛍光団が組み込まれた、又は、組み込まれて
いないポリジアセチレンリポソームを用いて行う、核酸の検出。

【０１３５】 タンパク質が組み込まれ、さらに発蛍光団が組み込まれた、又は、組み込まれて
いないポリジアセチレンフィルムを用いて行う、核酸の検出。

【０１３６】 タンパク質が組み込まれ、ナノポア膜上が発蛍光団で覆われた、又は、覆われて
いないポリジアセチレンを用いて行う、核酸の検出。

【０１３７】 タンパク質が組み込まれ、さらに発蛍光団が組み込まれた、又は、組み込まれて
いないポリジアセチレン配列を用いて行う、タンパク質の検出。

【０１３８】 タンパク質が組み込まれ、さらに発蛍光団が組み込まれた、又は、組み込まれて
いないポリジアセチレンリポソームを用いて行う、タンパク質の検出。

【０１３９】 タンパク質が組み込まれ、さらに発蛍光団が組み込まれた、又は、組み込まれて
いないポリジアセチレンフィルムを用いて行う、タンパク質の検出。

【０１４０】 タンパク質が組み込まれ、ナノポア膜上が発蛍光団で覆われた、又は、覆われて
いないポリジアセチレンを用いて行う、タンパク質の検出。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ジアセチレンモノマーからのポリジアセチレンの形成を示している。

【図２】 本発明の方法で用いた非蛍光形及び蛍光形ポリジアセチレンリポソー
ムの蛍光スペクトルを示している。

【図３】 ポリジアセチレンリポソームが一方の形からもう一方の形へ変化する
際の吸光及び蛍光の変化を示している。

【図４】 ポリジアセチレンリポソームが発蛍光団を有する場合と有しない場合
での蛍光を示している。

【図５】 発蛍光団と抗クラミジア抗体が組み込まれ、ナノポア膜にコーティン
グされたポリジアセチレン配列の、クラミジア基本小体に曝露される前と後での
蛍光スペクトルを示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 21/64 Ｇ０１Ｎ 21/64 Ｚ 21/78 21/78 Ｃ 33/543 ５７５ 33/543 ５７５ // Ｇ０１Ｎ 21/05 21/05 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 サラ エー スポーン アメリカ合衆国 デラウェア州 19808 ウィルミントン ダブリュー ロングスプ ール ドライブ 204 (72)発明者 チャールズ エフ サラー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92025 エスコニディード エリック ロ ード 3427 Ｆターム(参考） 2G043 AA03 BA16 CA03 DA01 DA02 DA05 EA01 FA02 FA03 HA07 JA01 KA02 LA03 LA05 2G054 AA06 AB03 AB04 CE02 EA03 EA04 GA04 GA06 2G057 AA04 AA14 AB01 AB03 AC01 BA01 BA03 BA05 BB04 4B063 QA18 QA19 QQ32 QS02 QX02

Claims (46)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 試料中の検体の検出方法であって、 前記方法は、ポリジアセチレン骨格の３次元配列に基質を組み込ませたものと、
   試験試料を接触させ、蛍光の変化を検出することで検体の存在を示すことからな
   り、 前記基質は、検体に対して直接的な親和性を持つか、又は、検体への結合剤とし
   て機能し得るか若しくは検体と反応し得るものであることを特徴とする検出方法
   。
2. 【請求項２】 配列がリポソーム又は細管の溶液の形をとっていることを特徴と
   する請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 検体が酵素であって、基質がその酵素の反応性基質であることを
   特徴とする請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 検体が抗原であって、基質がその抗原の抗体であることを特徴と
   する請求項１又は２に記載の方法。
5. 【請求項５】 検体が抗原であって、基質がその抗原の抗体のフラグメントであ
   ることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
6. 【請求項６】 検体が抗体又は抗体のフラグメントであって、基質がその抗体の
   抗原であることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
7. 【請求項７】 検体が抗体又は抗体のフラグメントであって、基質がその抗体の
   エピトープであることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
8. 【請求項８】 検体が酵素であって、基質がその酵素の反応性基質であることを
   特徴とする請求項２に記載の方法。
9. 【請求項９】 配列のポリジアセチレンが非蛍光体であり、バックグラウンドの
   約１から３倍の蛍光シグナルを示し、且つ、対応する蛍光形よりは小さい蛍光シ
   グナルを示すことを特徴とする請求項１に記載の方法。
10. 【請求項１０】 基質にリガンドを含めることを特徴とする請求項１に記載の方
    法。
11. 【請求項１１】 配列がリポソーム又は細管の溶液の形をとることを特徴とする
    請求項１に記載の方法。
12. 【請求項１２】 基質には反応性基質を含める請求項１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 配列がリポソーム又は細管の溶液の形態をとることを特徴とす
    る請求項１２に記載の方法。
14. 【請求項１４】 ３次元配列がさらに発蛍光団も含有し、ポリジアセチレン配列
    の蛍光の変化を測定することを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７、
    ８、９、１０、１１、１２、又は、１３に記載の方法。
15. 【請求項１５】 ３次元配列がさらに発蛍光団も含有し、発蛍光団の蛍光の変化
    を測定することを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０
    、１１、１２、又は、１３記載の方法。
16. 【請求項１６】 配列がさらに発蛍光団を持たないことを特徴とする請求項１に
    記載の方法。
17. 【請求項１７】 ５５０ｎｍ未満の波長の光を照射して発光を測定することによ
    り、蛍光の変化を検出することを特徴とする請求項１に記載の方法。
18. 【請求項１８】 ４５０ｎｍから５００ｎｍの間の波長の光を照射して発光を測
    定することにより、蛍光の変化を検出することを特徴とする請求項１に記載の方
    法。
19. 【請求項１９】 配列のポリジアセチレンが蛍光を発し、検体の存在の指標とし
    て前記蛍光が増加することを特徴とする請求項１に記載の方法。
20. 【請求項２０】 試料中の検体の検出方法であって、 前記方法は、ポリジアセチレン骨格の２次元配列に基質を組み込ませたものと、
    試験試料を接触させ、蛍光の変化を検出することで検体の存在を示すことからな
    り、 前記基質は、検体に対して直接的な親和性を持つか、又は、検体への結合剤とし
    て機能し得るか若しくは検体と反応し得るものであり、 前記２次元配列は重合化ジアセチレン配列からなり、９０％以下の前記ジアセチ
    レンが検体に特異的に結合する官能基を末端に持つことを特徴とする検出方法。
21. 【請求項２１】 ２次元配列が重合化ジアセチレン配列からなり、６０％以下の
    前記ジアセチレンが検体に特異的に結合する官能基を末端に持つことを特徴とす
    る請求項２０に記載の方法。
22. 【請求項２２】 配列が固体担体にコーティングされていることを特徴とする請
    求項２０に記載の方法。
23. 【請求項２３】 固体担体が多孔膜であることを特徴とする請求項２２に記載の
    方法。
24. 【請求項２４】 配列が担持されていないことを特徴とする請求項２０に記載の
    方法。
25. 【請求項２５】 さらに、多孔膜上又は多孔膜中に担持されている配列を含有す
    るフィルター又はフロー・セルを用い、検出前又は検出中に検体の溶液を前記フ
    ィルター又はフロー・セルに通すことを特徴とする請求項２０に記載の方法。
26. 【請求項２６】 基質にはリガンドを含むことを特徴とする請求項２０に記載の
    方法。
27. 【請求項２７】 配列がナノポア膜上にあることを特徴とする請求項２６に記載
    の方法。
28. 【請求項２８】 基質には反応性基質を含むことを特徴とする請求項２０に記載
    の方法。
29. 【請求項２９】 配列がナノポア膜上にあることを特徴とする請求項２８に記載
    の方法。
30. 【請求項３０】 ２次元配列がさらに発蛍光団も含有し、ポリジアセチレン配列
    の蛍光の変化が測定されることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
31. 【請求項３１】 ２次元配列がさらに発蛍光団も含有し、且つ、前記発蛍光団の
    蛍光の変化が測定されることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
32. 【請求項３２】 ３次元配列がさらに発蛍光団も含有し、且つ、ポリジアセチレ
    ン配列の蛍光の変化が測定されることを特徴とする請求項２６又は２８に記載の
    方法。
33. 【請求項３３】 ３次元配列がさらに発蛍光団も含有し、且つ、前記発蛍光団の
    蛍光の変化が測定されることを特徴とする請求項２６又は２８に記載の方法。
34. 【請求項３４】 配列がさらに発蛍光団を持たないことを特徴とする請求項２０
    に記載の方法。
35. 【請求項３５】 ５５０ｎｍ未満の波長の光を照射し、発光を測定することによ
    り蛍光の変化を検出することを特徴とする請求項２０に記載の方法。
36. 【請求項３６】 ４５０ｎｍから５００ｎｍの間の波長の光を照射し、発光を測
    定することにより蛍光の変化を検出することを特徴とする請求項２０に記載の方
    法。
37. 【請求項３７】 配列のポリジアセチレンが蛍光を発し、前記蛍光が検体の存在
    の指標として増加することを特徴とする請求項２０に記載の方法。
38. 【請求項３８】 試料中の検体の検出方法であって、 前記方法は、ポリジアセチレン骨格の３次元配列に基質を組み込ませたものと、
    試験試料を接触させ、偏光により励起した前記ポリジアセチレン配列が発する蛍
    光偏光の変化を検出することで検体の存在を示すことからなり、 前記基質は検体に対して直接的な親和性を持つか、又は、検体への結合剤として
    機能し得るか若しくは検体と反応し得る基質であり、 前記配列が溶液中に懸濁していることを特徴とする検出方法。
39. 【請求項３９】 ３次元配列がリポソームであることを特徴とする請求項３８に
    記載の方法。
40. 【請求項４０】 基質が抗体であって、検体がその抗体の抗原であることを特徴
    とする請求項３８又は３９に記載の方法。
41. 【請求項４１】 基質が抗体のフラグメントであって、検体がその抗体のフラグ
    メントの抗原であることを特徴とする請求項３８又は３９に記載の方法。
42. 【請求項４２】 検体が表面に固定化されていることを特徴とする請求項３８又
    は３９に記載の方法。
43. 【請求項４３】 検体がミクロビーズに付着していることを特徴とする請求項３
    ８又は３９に記載の方法。
44. 【請求項４４】 検体がマクロビーズに付着していることを特徴とする請求項３
    ８又は３９に記載の方法。
45. 【請求項４５】 ３次元配列がさらに発蛍光団も含有し、偏光により励起したポ
    リジアセチレン配列上の前記発蛍光団が発する偏光の変化を検出することで検体
    の存在を示すことを特徴とする試料中の検体の検出方法。
46. 【請求項４６】 ３次元配列がリポソームであることを特徴とする請求項４５に
    記載の方法。