JP2003524394A

JP2003524394A - ハイスループット質量分析法

Info

Publication number: JP2003524394A
Application number: JP2000598862A
Authority: JP
Inventors: サンアイレイラード，; ヨンホンチェン，; クラウスクレバー，; ウィレムピー．シー．ステマー，; ジェレミーミンシュル，
Original assignee: マキシジェン，インコーポレイテッド
Priority date: 1999-02-11
Filing date: 2000-02-11
Publication date: 2003-08-19
Also published as: KR20010102069A; CA2361384A1; US7384387B1; IL144657A0

Abstract

(57)【要約】ハイスループット質量分析法についての装置および方法が、提供される。この方法は、オフライン並行精製システムにおけるサンプルの調製を含む。このような方法としては、サンプルを産生する際の適切な緩衝液の使用またはタグ化成分のための固体支持体の使用を含むがこれらに限定されない。次いで、このようにして調製されたサンプルは、カラムで分離される必要がない。提供された装置は、細胞を増殖させかつ産物および／または反応物を産生するための細胞増殖プレート、オフライン並行精製システム、質量分析計ならびにサンプルを輸送しかつそれらを質量分析計の装置に注入する自動サンプラーを含む。記載された方法および装置を使用して、例えば、酵素反応経路をスクリーニングする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（著作権表示）３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．７１（ｅ）に従って、出願人は、この開示の一部が著作
権保護を受ける資料を含むことを記述する。著作権保有者は、特許文書または特
許開示について誰でも複製に反対しない。なぜならそれは、特許商標庁において
特許ファイルまたは登録であるようであるからであり、そうでなければ、全ての
著作権の権利をいずれも留保する。

【０００２】（関連出願の相互参照）本出願は、ＲａｉｌｌａｒｄによるＵＳＳＮ６０／１１９，７６６、「Ｈｉｇ
ｈＴｈｒｏｕｇｈｐｕｔＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」；１９９９
年８月１２日に提出されたＬｉｕらによる「ＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｎｄＵｓ
ｅｏｆＥｎｚｙｍｅｓｆｏｒＣｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌａｎｄＭ
ｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ」と題されたＵＳＳＮ６０／１４８，８
４８；およびＡｔｔｏｒｎｅｙＤｏｃｋｅｔＮｏ．２−０２９５１０ＵＳ、
２０００年２月１１日に提出された、Ｒａｉｌｌａｒｄらによる同時提出された
米国出願「ＨｉｇｈＴｈｒｏｕｇｈｐｕｔＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔ
ｒｙ」に対する利益および優先権を主張する。

【０００３】（発明の分野）本発明は、例えば、遺伝配列のライブラリーから産生された、例えば酵素産物
のような複数のサンプルを例えばモニターするための質量分析法のためのハイス
ループット方法に関する。

【０００４】（発明の背景）例えば、酵素活性のハイスループット化学スクリーニングは、代表的には、１
つ以上の基質および／または産物の定量的な検出を包含する。現在最も普遍的な
検出方法は、質量分析法（ＭＳ）であり、これは、電荷に対する質量の比に基づ
いて、特定の有機分子の同定を可能にする。

【０００５】伝統的には、質量分析法は、目的の化合物を精製し、そして分離するための液
体クロマトグラフィーを用いてタンデムで実行される。この精製は、オンライン
の逐次的な精製であると考えられ得る。精製のこの逐次的な性質は、短時間での
多数の反応産物をスクリーニングするための質量分析法の能力を限定する。なぜ
なら、精製は、質量分析法とインラインで、質量分析法の前に行わなければなら
ないからである。

【０００６】ＤＮＡシャッフリング技術は、例えば、反応を触媒する１つ以上の酵素をコー
ドする関連遺伝子配列のライブラリーを作製するために使用される。このような
ライブラリーは、例えば、ＤＮＡシャッフリングの間の、ＤＮＡフラグメントの
相同交換（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｅｘｃｈａｎｇｅ）によって構築される。

【０００７】１つの代表的なセットの実施形態において、関連遺伝子配列のライブラリーは
、細菌に形質転換されたプラスミド上にある。従って、単一の細菌クローンは、
特定の酵素または酵素経路の独特の改変体を表す独特の遺伝子配列を保有し得る
。

【０００８】検出された進化について、ライブラリーは、望ましい特徴を有する改変体につ
いてスクリーニングされる。酵素および経路の進化は、化学スクリーニング方法
によって検出され得る１つ以上の酵素の生化学的反応を含む。化学スクリーニン
グ方法は、酵素反応の基質および／または産物を検出する。

【０００９】現在、これらの酵素反応を分析するための質量分析法の使用は、非常に時間を
消費する。時間の制限は、質量分析形に注入する前に、酵素経路の産物および反
応物を分離および精製するための必要性に起因する。これは、分析され得るサン
プルの数を１日当たり約１００に制限する（代表的には、精製の実行（例えば、
液体クロマトグラフィー）は、約１０分／サンプルを必要とする。１時間当たり
６個のサンプルで、１４４サンプルが２４時間で実行され得る）。新たなハイス
ループットシステムは、所望の性質を提供する何千のうちの数個の変異体に対す
るライブラリーを分析する方法を提供するのに有用である。

【００１０】１つの現在開発されたシステムは、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ
１９９７、第４巻、第９号、６５３〜６５７頁のＷｕらによる、「Ｑｕａｎｔ
ｉｔａｔｉｖｅＥｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙＭａｓｓ−Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔ
ｒｙｆｏｒｔｈｅＲａｐｉｄＡｓｓｓａｙｏｆＥｎｚｙｍｅＩｎ
ｈｉｂｉｔｏｒｓ」に記載されるようなエレクトロスプレー法である。エレクト
ロスプレーイオン化法は、荷電極性有機分子を質量分析法分析のための気相に移
すためのマイルドな方法であり、大部分の生物学関連有機分子に適用可能である
。エレクトロスプレー法は、ＧＣ／ＭＳにおけるような、質量分析計に注入する
前のサンプルの先の誘導体化の必要性を除外し、従って、質量分析計の分析時間
を短くする。しかし、カラム分離は、依然としてこの技術において利用され、上
に示したようにスループットを制限する。

【００１１】別の最近の開発は、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎａｌｙｔｉｃａｌＴｏｘｉ
ｃｏｌｏｇｙ、第２２巻、１９９８、３１９〜３２８頁の、Ｗｅｉｎｍａｎおよ
びＳｖｏｂｏｄａｉｎによる「ＦａｓｔＳｃｒｅｅｎｉｎｇｆｏｒＤｒｕ
ｇｓｏｆＡｂｕｓｅｂｙＳｏｌｉｄ−ＰｈａｓｅＥｘｔｒａｃｔｉｏ
ｎＣｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈＦｌｏｗ−ＩｎｊｅｃｔｉｏｎＩｏｎｓｐ
ｒａｙ−ＴａｎｄｅｍＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」に記載される。
この技術は、血清または尿における異なる薬物を同時に検出するための、タンデ
ム質量分析法およびエレクトロスプレー法の組み合わせを記載する。タンデム質
量分析法が複数の化合物の検出を可能にするので、カラム分離は使用されないが
、サンプル調製において固相抽出法が必要である。サンプル調製工程が依然とし
てあまりに長過ぎるので、質量分析法によるハイスループットスクリーニングを
提供し得ない。

【００１２】従って、例えば、シャッフルされた分子のライブラリーをスクリーニングする
ために、質量分析法を実行するハイスループット法が有用である。本発明は、こ
れらおよび本開示の完全なレビューによって明かになる他の多くの必要性を満た
す。

【００１３】（発明の要旨）本発明は、例えば、１時間当たり約１００個以上のサンプル速度で、より好ま
しくは１時間当たり約２００個のサンプルの速度で、例えば、酵素反応をモニタ
ーするために使用されるハイスループット質量分析法のための方法を提供する。
この方法を使用して、多くのサンプルが、同時にスクリーニングされ、その結果
、全体のライブラリーが、１種間以下でスクリーニングされ得る。これは、以前
に存在していたよりも速い質量分析法スクリーニングの方法を提供する。スルー
プットの増加は、新規なオフライン並行精製システムに起因する。オフライン並
行精製は、サンプルを質量分析計に注入する前の、液体クロマトグラフィーまた
は分離精製工程についての必要性を除く。

【００１４】１つの実施形態において、ハイスループット質量分析法スクリーニングを実施
する方法が提供される。この方法において、１つ以上の細胞が増殖する。目的の
カラムで分離されない成分が、細胞コロニーまたは培養物から精製される。１つ
の局面において、精製は、細胞増殖条件のオフライン並行調製またはカラムで分
離されない成分の固体支持体への付着を提供する。この方法において、フローイ
ンジェクション分析は、例えば、エレクトロスプレータンデム質量分析法を使用
し、これによって、質量電荷比を得、そして目的のカラムで分離されない成分の
ハイスループット質量分析法スクリーニングを提供して実施される。

【００１５】増殖工程および精製工程は、増殖条件または反応物または目的の産物を産生す
るために使用される条件を調整することによって、基本的に同時に達成される。
例えば、目的の成分は、全細胞、細胞上清、細胞溶解物または添加された基質を
有する精製された酵素から産生され得る。この産生は、揮発性緩衝液（イオン種
濃度を減少する緩衝液）で行われ、続いてイオン交換樹脂のような精製／洗浄方
法を行うか、または、精製は、さらなる精製なしで質量分析計に直接注入され得
る成分を提供するための、例えば有機溶媒を用いる抽出と適合性であるように改
変される。これらの工程が並行であるので、少なくとも１００個の細胞コロニー
が、１時間未満で、１つ以上のカラムで分離されない成分の存在または活性につ
いてスクリーニングされる。

【００１６】あるいは、精製工程は、細胞を溶解し、１つ以上の成分（例えば、タグ化酵素
、タンパク質、または核酸のようなタグ化成分）を、例えばタグ結合部分を含む
固体支持体に付着することによって達成される。細胞溶解物は、必要に応じて、
固体支持体から洗浄され、酵素は、１つ以上の基質と接触され、１つ以上の産物
を産生し、これは、さらなる精製なしで必要に応じて分析される。

【００１７】１つ以上のカラムで分離されない成分は、タンパク質、タンパク質結合分子、
炭水化物、炭水化物結合分子、酵素、酵素基質、酵素触媒反応の産物、核酸、核
酸触媒反応の産物、１つ以上の疎水性部分を有する基質、無機イオン、オリゴ糖
、疎水性分子、ブリアチン（ｂｒｉａｔｉｎｅ）誘導体、アトラジン、ポリケチ
ドまたは目的の他の分子である。

【００１８】別の実施形態において、本発明は、関連酵素遺伝子配列のような例えば関連遺
伝子配列の１以上のメンバーのライブラリーを含むプラスミドを用いて形質転換
された細胞または細菌を提供することによる、ハイスループット質量分析法によ
って、酵素反応のような産物または反応物モニタリングするための方法を提供す
る。１つ以上の細胞または細胞コロニーまたは培養物をこの細胞から増殖する；
生物学的マトリクスにおいて、１つ以上の産物または反応物を細胞コロニーまた
は培養物から産生し、これによってカラムで分離されないサンプルを産生する；
生物学的マトリクスのオフライン並行調整を使用して生物学的サンプルからカラ
ムで分離されないサンプルを精製し、そしてエレクトロスプレータンデム質量分
析法を使用してフローインジェクション分析によってカラムで分離されないサン
プルをモニターし、これによって１つ以上の産物または反応物をモニタリングす
る。このようにして、酵素反応およびそれらの産物をハイスループットレベルで
研究し得る。あるいは、ライブラリーもまた、である。

【００１９】産物および／または反応物は、産生と同時に精製され得、このようにしてオフ
ライン並行精製システムを提供する。産物および／または反応物は、例えば、全
細胞、細胞上清、細胞溶解物を使用して産生されるか、または少なくとも１つの
精製された細胞酵素と少なくとも１つの基質との間の反応から産生される。サン
プルの成分は、必要に応じて１つ以上の疎水性部分を有する基質、無機イオン、
小分子、オリゴ糖、疎水性分子、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、
ポリヌクレオチド、親水性分子、トリアジン誘導体、ポリケチドのような二次代
謝物、タンパク質、タンパク質結合分子、炭水化物、炭水化物結合分子、酵素、
酵素基質、酵素触媒反応の産物、核酸、核酸触媒反応の産物などである。この成
分は、必要に応じて、公知であるかまたは公知でない成分である。公知でない成
分は、必要に応じて、質量分析法分析を使用して同定および／または定量化され
る。

【００２０】精製システム（代表的には、環境細胞条件を模倣する反応条件で起こる）は、
緩衝液を、カラムで分離されないサンプルが産生される生物学的マトリクスに代
えるか、または緩衝液をこのマトリクスに加え、これによってサンプルの分析の
ための質量分析計へ直接注入され得るサンプルを産生することを包含する。使用
される緩衝液は、必要に応じて、揮発性緩衝液（イオン種の濃度を減少する緩衝
液、イオン交換樹脂のような容易な並行オンライン精製、または有機溶媒抽出を
可能にする緩衝液）である。あるいは、精製システムは、酵素または他の成分（
例えば、核酸、タンパク質、ペプチド、炭水化物など）を固体支持体に、例えば
、特異的なタグ部分を介して結合することを包含する。次いで、反応は、固体支
持体上で行われ、これは、必要に応じて不純物または結合しない成分を除去する
ために洗浄され、これによって、質量分析計に注入するのに十分精製されている
サンプルを産生する。これらの精製技術のうちの１つを使用して、少なくとも約
１００のライブラリーメンバーまたはそれ以上が、１時間未満で産物または反応
物の存在または不在についてスクリーニングされる。代表的には、少なくとも約
２００以上のライブラリーのメンバーが、約１時間でスクリーニングされる。好
ましくは、少なくとも約５００以上のサンプルが約１時間でスクリーニングされ
る。

【００２１】他の実施形態において、スループットは、例えば、サンプルまたは成分をプー
ルし、同時分析のためにプールされたサンプルを質量分析計に注入することによ
って、必要に応じて増加される。得られたデータは、代表的には、異なるサンプ
ルを同定するために、例えば、フラグメントパターンまたはスペクトルを使用し
て解析される。

【００２２】別の実施形態において、本発明は、ハイスループットな質量分析法スクリーニ
ングのための装置を提供する。この装置は、細胞サンプルを増殖し、そして酵素
、酵素基質、および酵素産物を反応させるための細胞増殖プレート；サンプルを
精製するための、細胞増殖プレートにまたは細胞増殖プレート内に結合されたオ
フライン並行精製システム；オフライン並行精製システムに結合された自動サン
プラー；および自動サンプラーに結合された、エレクトロスプレー三連（ｔｒｉ
ｐｌｅ）四重極タンデム質量分析計のような質量分析計を備える。自動サンプラ
ーは、サンプルをオフライン並行精製システムから質量分析計に、注入および分
析のために運ぶサンプルハンドラーである。これは、例えば、約１時間で少なく
とも１００個またはそれ以上のサンプルを運び得る。

【００２３】本発明の装置および一体化システムを使用して、スクリーニングの速度が、オ
フライン精製システムと質量分析計との間で自動化サンプラーがサンプルを運ぶ
最大速度によって決定される。これは、例えば、酵素または他の成分を結合する
ための、必要に応じて揮発性緩衝液、イオン種の濃度を減少する緩衝液、イオン
交換樹脂、有機溶媒または固体支持体である、オフライン並行システムの注入の
ためにサンプルを精製するための装置の能力に起因する。

【００２４】別の局面において、本発明の装置は、質量分析計のデータを記録および分析す
るため、ならびに自動化サンプラーを制御するための装置に操作可能に連結され
たコンピューターおよびソフトウェアを含む。

【００２５】（定義）用語「カラムで分離されない成分」は、（例えば、クロマトグラフィーカラム
）事前のインライン連続分離を伴わない、目的の成分または物質（例えば、それ
らは質量分析計に注入される）をいう。連続したインライン分離を伴わずに、そ
の成分は、必要に応じてハイスループットシステムで分析される。成分を産生し
ながらその成分が精製されるかまたは分離されることを可能にする、並行システ
ムは、ハイスループット分析を可能にする。

【００２６】本発明において、用語「細胞増殖条件のオフライン並行調整」または「オフラ
イン並行精製システム」または「生物学的マトリックスのオフライン並行調整」
は、サンプル調製の新規な方法をいうように用いられる。この方法は、時間のか
かる連続した精製および／または分離工程を伴ずに、質量分析計に注入するため
の複合体サンプルを調製するために使用される。この方法において、サンプルお
よびそれらの反応条件は、例えば、目的の産物および反応物の産生と並行して、
細胞増殖プレートにおいて調整されるかまたは調節される。細胞増殖条件および
反応条件は、例えば（例えば質量分析計に対して）十分な純度で産物を得るため
に、反応パラメーターおよび条件の慣用的な変更および最適化によって、最適化
される。この反応は、質量分析計とインラインでかつ連続して機能するカラム分
離システムに結合されない。１つの実施形態において、カラムで分離されない成
分は、分離なしで精製される。あるいは、オフライン精製システムは、反応器（
例えば、酵素反応器（例えば、成分のライブラリーへの結合または付着のための
固体支持体（例えば、タグ化された酵素は、必要に応じてタグ結合分子を含む固
体支持体に結合される）））を含む。例えば、特異的タグ（例えば、ビオチン）
を有する酵素配列をコードする遺伝子で形質転換された細胞は、代表的に酵素の
発現後に溶解される。酵素は、支持体または酵素反応器（例えば、ストレプトア
ビジンを含む固体支持体）に結合され、そして細胞溶解物は、必要に応じて、例
えば、固体支持体を細胞溶解物から除去することまたは細胞溶解物を固体支持体
から濾過することによって除去される。支持体上で酵素反応を実施するために基
質が提供され、それによって質量分析計への注入に十分な純度の産物が産生され
る。固体支持体は、必要に応じて磁性、アガロースまたはポリスチレンのビーズ
、ピン、膜などのセットを含む。例えば、ビーズは、必要に応じて（例えば、細
胞増殖プレート上の）サンプルウェル中に配置される。細胞が溶解された場合、
タグ化された成分は、例えば、ビーズ上のタグ結合部分を介してビーズに結合さ
れる。次いで、このビーズは必要に応じてさらなる反応または同定のためにサン
プルウェルから除去される。あるいは、細胞溶解物は、ビーズから除去されるか
または洗浄される。ピンは、必要に応じてサンプルウェル中そしてサンプルウェ
ル外に持ち上げられ、タグ化された成分に結合し、そして／またはサンプルから
タグ化された成分を除去する。同様に、膜は、必要に応じて成分に結合させるた
めに使用される。他のタグ化されていない成分は、必要に応じて膜から洗浄され
るか、または、膜が、例えばサンプルウェルから除去され、精製された成分を提
供する。

【００２７】「産物または反応物」とは、本明細書中で、例えば、酵素触媒反応の産物また
は反応物をいうために使用される。この産物または反応物は、必要に応じてタン
パク質、ペプチド、タンパク質結合分子もしくはペプチド結合分子、炭水化物、
炭水化物結合分子、核酸分子、ポリヌクレオチド、核酸結合分子もしくはポリヌ
クレオチド結合分子、または核酸触媒反応の産物である。さらに、産物および／
または反応物は、必要に応じて、酵素または酵素基質である。産物または反応物
は、本発明の方法によって分析される任意の目的の分子である。

【００２８】「細胞増殖プレート」とは、本明細書中で、細胞が適切な培地中で増殖し得る
プレートをいうために使用される。代表的なプレートとしては、１５３６、３８
４または９６ウェルマイクロタイタープレートが挙げられる。このプレートを使
用して、細胞コロニーを増殖させる。例えば、遺伝子ライブラリーを含む細胞コ
ロニーは、形質転換プレートから、適切な増殖培地を有する１５３６、３８４ま
たは９６ウェルマイクロタイタープレートに、例えば、ＧｅｎｅｔｉｘからのＱ
−ｂｏｔを用いて直接拾い上げられる。さらに、オフライン並行精製および／ま
たは反応条件の調整は、目的の産物または反応物が産生された場合に、細胞増殖
プレートで行なわれる。全ての産物産生および精製工程は、必要に応じて細胞増
殖プレートのウェルで行なわれる。いくつかの実施形態において、細胞増殖プレ
ートは、例えば細胞が溶解された後の、１つ以上の成分（例えば、酵素）の結合
のために、固体支持体（例えば、粒子、ビーズ、膜、ピンのセットなど）を含む
。例えば、マイクロタイタープレートの各ウェルは、必要に応じて１つ以上のア
ガロースビーズ（例えば、ビオチンタグを含む酵素が結合するアビジンまたはス
トレプトアビジンを含むビーズ）を含む。あるいは、ピンのセットは、必要に応
じて、細胞増殖プレートのウェルに導入され、タグ化された酵素に結合されるか
または細胞溶解物からタグ化された酵素を除去する。

【００２９】「質量分析計」は、タンパク質および核酸などの種々の物質の分子量を測定す
るために使用され得る分析装置である。これはまた、いくつかの適用に、例えば
、タンパク質分子の配列および実質的に任意の物質の化学組成を測定するために
使用され得る。代表的には、質量分析計は、４つの部分を含む：サンプル口、イ
オン化供給源、質量分析器および検出器。サンプルは、必要に応じて種々の型の
入口（例えば、気相、液相または固相の中の固体プローブ、ＧＣもしくはＬＣ）
を介して導入される。次いでサンプルは、代表的に、イオン化供給源中でイオン
化され、１つ以上のイオンを形成する。生じたイオンは、質量分析器に導入され
、そして操作される。残存しているイオンは、電荷に対する質量比に基づいて検
出される。１つの実施形態において、質量分析計は、検査している物質に電子ビ
ームを衝突させ、そして陽イオンフラグメントおよび陰イオンフラグメントのス
ペクトルとして結果を定量的に記録する。イオンフラグメントの分離は、イオン
の電荷に対する質量の比に基づく。全てのイオンが単一に荷電されている場合、
この分離は、本質的に質量に基づく。四重極質量分析計は、質量分析器に４つの
電極を使用する。これらの技術は、一般的に多くの基本書に記載されている（例
えば、ＰｅｔｅｒＤａｗｓｏｎ，ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇによる、Ｑ
ｕａｄｒｕｐｏｌｅＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙａｎｄｉｔｓ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９５）；およびＳｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ，Ｂａ
ｓｓｌｅｒおよびＭｏｒｒｉｌｌによる、ＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃＩｄｅ
ｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＯｒｇａｎｉｃＣｏｍｐｏｕｎｄｓ第４版
（１９８１））。エレクトロスプレー質量分析法システムにおいて、イオン化は
、荷電した小滴（ｄｒｏｐｌｅｔ）およびＴＩＳ分析のためのイオン蒸発（ｉｏ
ｎｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）による引き続く検体イオンの産生のために使用さ
れる電界によって生じる。ＲｉｃｈａｒｄＢ．Ｃｏｌｅ（１９９７）「Ｅｌｅ
ｃｔｒｏｓｐｒａｙＩｏｎｉｚａｔｉｏｎＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔ
ｒｙ」ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照のこと。

【００３０】「ハイスループット質量分析法」は、本明細書中で、１日当たり約１００また
は２００個のサンプルから１日当たり約１５，０００個のサンプルの速度でサン
プルをスクリーニングし得る質量分析法システムをいうために使用される。本発
明において、１時間未満で約２００個のサンプルをスクリーニングするシステム
（例えば、２００個のサンプルが質量分析計に注入され、そして１時間未満に分
析される）が提供される。さらに、ハイスループット質量分析法は、例えば、単
一の注入へのサンプルのプール（ｐｏｏｌｉｎｇ）をいう。例えば、複数のサン
プルが、単一の注入へプールされる。これは、質量分析計のスクリーニングの速
度を増加する。なぜなら、複数のサンプルが同時に注入されるからである。約２
〜約１０００個のサンプルが、必要に応じてプールされる。代表的に、約５〜約
５００個のサンプル、または約５〜約１００個のサンプルがプールされる。他の
実施形態において、約５〜約２０個のサンプルがプールされる。例えば、１００
個のサンプルが、必要に応じて単一の注入にプールされ、そして２００個の注入
が必要に応じて約１時間でなされ、それによって全部で２０，０００個のサンプ
ルをＭＳによって約１時間でスクリーニングする。他の用語において、サンプル
（例えば、クローンまたはライブラリーメンバー）は、１日当たり約４８０，０
００個のサンプルの速度でスクリーニングされる。これは、１日当たり約１００
〜約２００個のサンプルの代表的なＭＳスクリーニング速度を優に越える。「ハ
イスループットシステム」は、代表的に上記のようなスループット速度を有する
。本場合における目的のシステムとしては、質量分析法システム、磁気共鳴シス
テム、ＩＲおよびＵＶ分光法システムなどが挙げられるがこれらに限定されない
。

【００３１】「細胞コロニー」は、本明細書中で、生組織から単離された細胞のインビトロ
の増殖物をいうために使用される。本明細書中に使用される場合、細胞コロニー
は、代表的に固体培地上または液体培養物中の細胞増殖物であり、代表的には、
拡大せずに肉眼で見える細胞増殖物である。細胞コロニー由来の１つ以上の細胞
またはクローン（同じ遺伝的構成を有する細胞）は、細胞全体としてまたは完全
細胞溶解物の形態もしくは細胞上清の形態で分析され得る。精製された細胞溶解
物は、細胞溶解物の産物または細胞壁の完全もしくは部分的な崩壊物もしくは破
壊物である。この細胞は、本発明における使用の前に溶解され得、そして生じた
細胞溶解物は目的の産物または反応物を産生するために使用され得る。あるいは
、細胞上清は、目的の成分を産生するために使用される。目的のために、分泌タ
ンパク質が、細胞上清から必要に応じて得られるかまたは精製され、そして本発
明の方法に使用される。

【００３２】本明細書中に使用される場合、「添加さた基質を伴う精製された細胞酵素」と
は、細胞または他の供給源から予め精製された酵素をいう。次いで基質が、精製
された酵素に添加され、目的の反応産物を産生する。これは、細胞全体または細
胞溶解物由来の反応産物の産生と対照的である。精製された酵素が固体支持体（
例えば、酵素反応器）に付着された場合、この反応産物は、必要に応じて、固体
支持体を洗浄することによってか、または例えば固体支持体の除去による反応混
合物からの酵素の除去によって精製される。例えば、タグ結合部分を含むピンを
用いて細胞溶解物から酵素を精製する場合、ピンは、必要に応じて酵素反応ため
に反応混合物中に配置され、次いで反応の終わりに除去され、精製された産物が
残る。

【００３３】「核酸」は、一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかの、デオキシリボヌクレ
オチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーをいう。この用語は、公
知のヌクレオチドアナログまたは改変された骨格残基もしくは連結を含む核酸を
含み、これは、合成的であり、天然に存在するものであり、そして天然に存在し
ないものである。この核酸は、参照核酸と類似した結合特性を有し、そしてこれ
は、参照ヌクレオチドに類似した様式で代謝される。そのようなアナログの例と
しては、限定されないが、ホスホロチオエート、ホスホルアミダイト（ｐｈｏｓ
ｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート
、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。

【００３４】用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書中で
交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーをいう。この用語は、１つ以上の
アミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸のアナログまたは模倣物であ
るアミノ酸ポリマーに、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用される
。

【００３５】用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに
天然に存在するアミノ酸に類似した様式で機能するアミノ酸アナログおよびアミ
ノ酸模倣物をいう。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされる
アミノ酸であり、ならびに後で修飾されるアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリ
ン、γ−カルボキシグルタメートおよびＯ−ホスホセリン）である。アミノ酸ア
ナログは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本の化学構造（すなわち、水素、カ
ルボキシル基、アミノ基およびＲ基に結合するα炭素を有する化合物（例えば、
ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホ
ニウム））をいう。そのようなアナログは、改変されたＲ基（例えば、ノルロイ
シン）または改変されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同
じ基本の化学構造を保持する。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般的な化学構造
とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸に類似した様式で機能する
化学化合物をいう。

【００３６】本明細書中で使用される場合、「酵素触媒反応の産物」とは、酵素によって触
媒された反応によって産生された任意の産物をいう。酵素は、基質分子と反応し
、本発明において目的である反応産物を産生する。例えば、新規の機能的酵素を
進化させるために、基質を用いた新規な酵素反応の産物の同定および検出は、新
規な酵素の機能に関して重要な情報を提供する。この産物は、必要に応じて公知
の化合物または未知の化合物である。

【００３７】本明細書中で使用される場合、「核酸触媒反応の産物」とは、酵素として機能
する核酸によって触媒された反応によって産生された任意の産物をいう（例えば
、ハンマーヘッド型（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）リボザイムまたはヘアピンリボザ
イム（ｈａｉｒｐｉｎｒｉｂｏｚｙｍｅ）の切断産物）。

【００３８】用語「タンパク質結合分子」とは、本明細書中で、タンパク質と結合または相
互作用する任意の分子をいうために使用される。これは、他のタンパク質、炭水
化物、脂質、核酸などを含むが、これらに限定されない。

【００３９】用語「炭水化物」は、炭素−水素−酸素化合物の任意の大きなクラスを含む。
これは、糖およびそれらのポリマー（例えば、デンプン、グリコーゲン、グルコ
ースおよびセルロース）およびポリヒドロキシアルデヒド、ポリヒドロキシケト
ンまたはそれらの誘導体を含むが、これらに限定されない。全てではないが大部
分の炭水化物は、式Ｃ_x（Ｈ₂Ｏ）_n（ここで「ｎ」は、３以上である）によって
化学的に示される。

【００４０】「炭水化物結合分子」とは、本明細書中で、特異的または非特異的のいずれか
で炭水化物と結合または相互作用する任意の分子または化合物をいうために使用
される。これは、他の炭水化物、タンパク質、脂質、核酸などを含むが、これら
に限定されない。

【００４１】用語「酵素」は、本明細書中に使用される場合、一般的に、触媒として作用し
て、他の化合物または「基質」の化学反応の活性化エネルギーを減少させるタン
パク質をいう。

【００４２】用語「１つ以上の疎水性部分を有する基質」とは、本明細書中で、少なくとも
１つ（そしておそらくはより多くの）疎水性基または部分を有する分子を含む基
質をいうために使用される。

【００４３】「無機イオン」は、有機成分を含まないイオンである。

【００４４】「オリゴ糖」とは、約１０〜約１００個の単純糖（ｓｉｍｐｌｅｓｕｇａｒ
）または単糖単位から成り立つ、相対的に短い分子鎖をいう。

【００４５】用語「疎水性分子」とは、油−水界面において油に親和性を有する、任意の分
子または分子部分をいう。「親水性分子」は、油−水界面において水に親和性を
有する分子または任意の分子部分をいう。

【００４６】用語「ライブラリー」とは、本明細書中で、例えば、変異誘発、組換え、指向
された進化（ｄｉｒｅｃｔｅｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）、シャッフリングまたは
他の多様性産生技術によって産生された遺伝子ライブラリー；酵素ライブラリー
；コンビナトリアルライブラリーまたは化学ライブラリー；天然に存在するライ
ブラリー；例えば、微生物のライブラリー；非生物学的化合物のライブラリーな
どをいうために使用される。「関連する遺伝子配列のライブラリー」とは、本明
細書中で、例えば、新規な基質に作用する能力を有する酵素または古い基質との
増強された触媒特性のための酵素をコードする、新規および／または関連する遺
伝子を作製するために、単独で、または他の遺伝子との組合せで、進化またはシ
ャッフルされた酵素または酵素サブユニットをコードする遺伝子配列などの類似
した遺伝子配列の群をいうために使用される。いくつかの実施形態において、ラ
イブラリーは、特異的タグ（例えば、ビオチンタグ）をコードする配列に融合し
た遺伝子の群を含む。次いで、例えば、そのようなライブラリーの発現産物を、
必要に応じてその特異的タグに結合するタグ結合部分（例えば、アビジンまたは
ストレプトアビジン）を含む固体支持体に結合させる。

【００４７】本明細書中で使用される場合、「生物学的マトリックス」とは、その中で細胞
が増殖する、流体、基質、または反応混合物、または増殖培地をいう。本発明に
おける目的の産物および反応物は、生物学的マトリックス中で必要に応じて産生
され、そして／または精製される。生物学的マトリックスは、代表的に、目的の
酵素または基質の、天然の周囲の状況に類似している。いくつかの実施形態にお
いて、酵素（例えば、標識酵素）は、固体支持体（例えば、細胞増殖プレート中
のポリエチレンビーズもしくは磁性ビーズ、または細胞が増殖しそして溶解され
るウェル中に浸漬されたピン）に結合することによって生物学的マトリックスか
ら除去される。

【００４８】「形質転換（された）」とは、本明細書中で使用される場合、核酸で形質転換
されたか、または形質導入された細胞をいう。細胞は、このような外来核酸が細
胞膜内に導入された場合に、外来核酸によって「形質転換」された。外来ＤＮＡ
は、細胞のゲノムを作製する染色体のＤＮＡ中に（共有結合して）結合されてい
るかもしれないし、結合されていないかもしれない。外来ＤＮＡは、プラスミド
のようなエピソーム性因子上に保持され得る。形質転換とは、核酸に細胞膜を通
過させる任意の方法をいい、この方法としては、エレクトロポレーション、弾道
学、注射、脂質−核酸複合体の使用などが挙げられる。

【００４９】「宿主細胞」によって、発現ベクターを含有し、そして発現ベクターの複製ま
たは発現を支持する細胞が意味される。宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉのような原核
細胞、または酵母、昆虫、両生類、もしくは哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ、Ｈ
ｅＬａなど）のような真核細胞（例えば、培養された細胞、外植片、およびイン
ビボでの細胞）であり得る。

【００５０】「プラスミド」は、複製点を有するＤＮＡ分子である。プラスミドは、１つ以
上の宿主細胞型において複製され得る。プラスミドは、通常、小さくそして比較
的単純であるから、組換えＤＮＡ実験において、外来ＤＮＡのアクセプターとし
てよく使用される。

【００５１】用語「同時に」とは、本質的に同時に生じる２つの事象をいう。例えば、本発
明における目的の産物または反応物の産生は、オフライン並行精製システムにお
ける精製と同時に生じる。２つの事象は、同時に、同じ場所（例えば、細胞増殖
プレート）で共になされて、分析における時間を節約し、従って、ハイスループ
ット質量分析スクリーニングが生じることを可能にする。

【００５２】「自動サンプラー」は、サンプルを１つの場所から別の場所へ輸送するロボッ
トハンドラーである。自動サンプラーは、例えば、サンプルを細胞増殖プレート
から輸送し、そしてそれらを分析のために質量分析計に注入するために使用され
る。自動サンプラーの例としては、Ｇｉｌｓｏｎ８−プローブマイクロタイタ
ー自動サンプラーおよびＣＴＣａｎａｌｙｔｉｃｓからのマイクロタイター自
動サンプラーが挙げられる。自動サンプラーは、必要に応じて、コロニー（例え
ば、Ｑ−ｂｏｔ）を採取するため、および／または細胞増殖プレートに試薬を添
加するか、細胞増殖プレートから試薬を除去するために使用されるロボットハン
ドラーを含む。

【００５３】（詳細な考察）質量分析は、生物学的流体における代謝を検出するため、および酵素反応をモ
ニターするために使用されてきた。例えば、「ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＥｌ
ｅｃｔｒｏｓｐｒａｙＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｆｏｒｔｈｅ
ＲａｐｉｄＡｓｓａｙｏｆＥｎｚｙｍｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」Ｗｕ
ら、ＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｌｏｇｙ、９／１９／９７、４、６５
３頁を参照のこと。１つの実施形態において、本発明は、エレクトロスプレーＭ
Ｓの固有の能力を使用し、ハイスループットフローインジェクション分析を採用
することによって、酵素反応およびそれらの反応産物をモニターする。本発明の
方法を使用して、サンプルを、いかなるカラム分離も伴わずに質量分析計に直接
注入し、そして即座に分析する。分析の速さは、サンプルを注入するために使用
された自動サンプラーの運動の動向によってのみ制限される。従って、サンプル
の全９６−ウェルマイクロタイタープレートは、代表的に１時間未満で実施され
る。自動サンプラー会社（例えば、ＧｉｌｓｏｎおよびＣＴＣＡｎａｌｙｔｉ
ｃｓ）は、現在、１０分間の１つのプレートへのスループットを増加するよう努
めており、次いでこのことは、１時間当たり約５７０または１日に約１３，００
０の質量分析計への注入を可能にする。サンプルがプールされる場合、例えば約
２〜約１０００のサンプルが組合わされ、そして同時に注入され、次いでスクリ
ーニング速度は、１時間当たり約１０００のサンプル〜１時間当たり約５７５，
０００のサンプル、または１日当たり約２５，０００のサンプル〜１日当たり約
１３，０００，０００以上のサンプルまで増加する。

【００５４】本発明の質量分析法の１つの局面は、サンプルがオフラインで精製され、その
結果、インラインの引き続くクロマトグラフィー工程が必要ではないことである
。成分を分離するための液体クロマトグラフィ（ＬＣ）工程は、通常、連続する
様式で質量分析計（ＭＳ）と連結され、その結果、質量分析計スループットの律
速因子は、ＬＣが成分を処理し得る速さである。オフライン精製システム（例え
ば、本明細書中におけるシステム）に関して、質量分析法の速さは、引き続く精
製工程によって制限されない。本発明における質量分析のスループットは、代表
的に、自動サンプラーがサンプルを輸送し、そして質量分析計に注入し得る速さ
に依存する速さである。

【００５５】ハイスループット質量分析を使用して酵素反応を分析するために、第一に、単
一コロニーの細胞が採取され、そして増殖されなければならない。第二に、基質
が添加された、全細胞、完全もしくは部分的な細胞溶解物、または精製された酵
素を使用して酵素産物が産生される。第三に、生物学的マトリックスから産生さ
れた産物は、オフライン並行精製システムにおいて精製される。第四に、タンデ
ム質量分析を使用してフローインジェクション分析が行われる。

【００５６】ハイスループットＭＳの用途としては、血漿、尿、または大脳脊髄液などのス
クリーニング、すなわち癌の感受性または存在に相関する代謝物の同定、毒素に
対する暴露の事象特異的試験、薬物試行の効果のモニタリング、処方された薬物
使用の効果のモニタリング、ヒト身体におけるあらゆる型の細胞に関する代謝プ
ロフィールを含む代謝事典の制作が挙げられるがこれらに限定されない。さらに
、試験および分析は、非ヒト動物、植物、ならびに食料品および飲料品（例えば
、穀物またはワイン）に対して実施され得る。別の局面において、ハイスループ
ット（ＨＴＰ）ＭＳは、商業的に有益な植物産物（例えば、薬物および油）の合
成に関与する遺伝子経路の同定のため、ならびに代謝産物の表現型に対する遺伝
子形質転換の効果の同定のため、または所望の天然産物の存在について植物をス
クリーニングするために、植物遺伝学において使用される。ハイスループットＭ
Ｓはまた、細菌系およびウイルス系における同様の分析のために有用である。本
発明の特に有用な局面において、ハイスループット質量分析法（ＨＴＰ−ＭＳ）
は、細胞のライブラリーを、例えば、シャッフリングされた核酸の発現産物につ
いてスクリーニングするために、またはライブラリー（例えば、指向性進化（ｄ
ｉｒｅｃｔｅｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）またはシャッフリングから作製されたラ
イブラリー）を、酵素活性についてスクリーニングするために使用される。

【００５７】（Ｉ．統合されたシステム要素）（ライブラリーの作製）本発明は、代表的に、ＤＮＡシャッフリング技術または指向性進化技術を使用
して、本発明のハイスループット方法によりスクリーニングされるライブラリー
を作製するが、他の型のライブラリーもまた利用可能であり、そして必要に応じ
て、本発明の方法によりスクリーニングされる。本発明における組成物または化
合物の「ライブラリー」は、サンプル（例えば、タンパク質、発現産物、遺伝子
、核酸、細胞、薬学的に活性な組成物（例えば、薬物、小さな有機分子、ペプチ
ド）などで構成される）の大きな収集物である。ライブラリーとしては、生物学
的組成物または化学的組成物のライブラリー（例えば、発現産物または改変体遺
伝子のライブラリー、あるいは変異誘発した細胞のライブラリー）が挙げられる
がこれらに限定されない。このようなライブラリーは、必要に応じて、ＤＮＡシ
ャッフリング、無作為な変異誘発、トランスポゾンの変異誘発、または無作為配
列の遺伝子組合せによって産生される。遺伝子ライブラリーは、必要に応じて発
現され、ＭＳによってスクリーニングされる発現産物のライブラリーを産生する
。本発明の方法は、必要に応じて、化合物または分子の任意の所望の基をスクリ
ーニングするための利用法である。ライブラリーの産生技術は、当業者に周知で
ある。

【００５８】ライブラリーの作製は、代表的に、トランスフェクトされた宿主細胞における
組換え核酸の構築および遺伝子の発現を含む。これらの目的を達成するための分
子クローニング技術は、当該分野において公知である。組換え核酸（例えば、発
現ベクター）の構築に適切な、広範な種々のクローニング方法およびインビトロ
増幅方法は当業者に周知である。本明細書において有用な分子生物学的技術（変
異誘発を含む）を記載する一般的な文章としては、以下が挙げられる：Ｂｅｒｇ
ｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、ＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉ
ｎｇＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
第１５２巻ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、ＳａｎＤｉｅｇｏ、
ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉ
ｎｇ−ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（第２版）、第１〜３巻、Ｃｏ
ｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＣｏｌｄＳｐｒ
ｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮｅｗＹｏｒｋ、１９８９（「Ｓａｍｒｏｏｋ」）な
らびにＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉ
ｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、編、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ、ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．
とＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．との間の共同事業、（１９９
９年まで補足された）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）。インビトロ増幅方法（ライブラ
リー核酸を作製するために有用）を通して、当業者を指導するに十分な技術の例
としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑ
−レプリカーゼ増幅が挙げられ、そして他のＲＮＡポリメラーゼ媒介技術（例え
ば、ＮＡＳＢＡ）が以下において見出される：Ｂｅｒｇｅｒ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ
、およびＡｕｓｂｅｌｌ、同書、ならびにＭｕｌｌｉｓら、（１９８７）米国特
許第４，６８３，２０２号；ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓＡＧｕｉｄｅｔ
ｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら、編）
ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＩｎｃ．ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０
）（Ｉｎｎｉｓ）；ＡｒｎｈｅｉｍおよびＬｅｖｉｎｓｏｎ（１９９０年１０月
１日）Ｃ＆ＥＮ３６−４７；ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌＯｆＮＩＨＲｅｓ
ｅａｒｃｈ（１９９１）３、８１−９４；Ｋｗｏｈら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６、１１７３；Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１
９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７、１８７４；Ｌ
ｏｍｅｌｌら（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ３５、１８２６；Ｌａｎｄ
ｅｇｒｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１、１０７７−１０８０；Ｖａ
ｎＢｒｕｎｔ（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８、２９１−２９４
；ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ、（１９８９）Ｇｅｎｅ４、５６０；Ｂａｒｒｉ
ｎｇｅｒら（１９９０）Ｇｅｎｅ８９、１１７、ならびにＳｏｏｋｎａｎａｎ
およびＭａｌｅｋ（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１３：５６３−５
６４。インビトロで増幅された核酸をクローニングするための改良された方法が
、Ｗａｌｌａｃｅら、米国特許第５，４２６，０３９号に記載される。ＰＣＲに
よって大きな核酸を増幅する改良された方法が、Ｃｈｅｎｇら（１９９４）Ｎａ
ｔｕｒｅ３６９：６８４−６８５、およびその中の参考文献において概説され
、この方法において４０ｋｂまでのＰＣＲ単位複製配列が産生される。当業者は
、基本的に任意のＲＮＡが、逆転写酵素およびポリメラーゼを使用して、制限消
化、ＰＣＲ伸長、および配列決定に適切な二重鎖ＤＮＡに変換され得ることを理
解する。Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、およびＢｅｒｇｅｒ（全て前出）
を参照のこと。

【００５９】ライブラリー構築物中のように核酸を有する細胞（植物細胞および動物細胞を
含む）に形質導入する方法は、このような核酸によってコードされるタンパク質
を発現する方法が利用可能であるように、一般に利用可能である。Ｂｅｒｇｅｒ
、Ａｕｓｕｂｅｌ、およびＳａｍｂｒｏｏｋに加えて、動物細胞の培養に関する
有用な一般的参考文献としては、以下が挙げられる：Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（Ｃｕｌ
ｔｕｒｅｏｆＡｎｉｍａｌＣｅｌｌｓ、ａＭａｎｕａｌｏｆＢａｓ
ｉｃＴｅｃｈｎｉｑｕｅ、第３版Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ
（１９９４）およびそこに引用される参考文献、Ｈｕｍａｓｏｎ（Ａｎｉｍａｌ
ＴｉｓｓｕｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第４版Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎａ
ｎｄＣｏｍｐａｎｙ（１９７９））ならびにＲｉｃｃｉａｒｄｅｌｌｉら、Ｉ
ｎＶｉｔｒｏＣｅｌｌＤｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５：１０１６−１０２４（１
９８９）。植物細胞のクローニング、培養、および再生に関する参考文献として
は、以下が挙げられる：Ｐａｙｎｅら（１９９２）ＰｌａｎｔＣｅｌｌａｎ
ｄＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅｉｎＬｉｑｕｉｄＳｙｓｔｅｍｓＪ
ｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．ＮｅｗＹｏｒｋ、ＮＹ（Ｐａｙ
ｎｅ）；ならびに、ＧａｍｂｏｒｇおよびＰｈｉｌｌｉｐｓ（編）（１９９５）
ＰｌａｎｔＣｅｌｌ、ＴｉｓｓｕｅａｎｄＯｒｇａｎＣｕｌｔｕｒｅ；
ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌＭｅｔｈｏｄｓＳｐｒｉｎｇｅｒＬａｂＭａｎ
ｕａｌ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（ＢｅｒｌｉｎＨｅｉｄｅｌｂｅｒ
ｇＮｅｗＹｏｒｋ）（Ｇａｍｂｏｒｇ）。種々の細胞培地が、以下に記載さ
れている：ＡｔｌａｓおよびＰａｒｋｓ（編）ＴｈｅＨａｎｄｂｏｏｋｏｆ
ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣＰｒｅｓ
ｓ、ＢｏｃａＲａｔｏｎ、ＦＬ（Ａｔｌａｓ）。植物細胞培養に関するさらな
る情報は、市販の文献、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｉｎｃ（Ｓｔ
Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）（Ｓｉｇｍａ−ＬＳＲＣＣＣ）からのＬｉｆｅＳｃｉｅｎ
ｃｅＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅＣａｔａｌｏｇｕｅ（１
９９８）、ならびに、例えば、これもまたＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｉｎｃ
（ＳｔＬｏｕｉｓ、ＭＯ）（Ｓｉｇｍａ−ＰＣＣＲ）からのＰｌａｎｔＣｕ
ｌｔｕｒｅＣａｔａｌｏｇｕｅおよび補遺（１９９７）に見出される。

【００６０】本明細書中で提供される方法によって必要に応じてスクリーニングされるライ
ブラリーを作製するために、種々の多様性生産反応／産生物スクリーニング反応
が必要に応じて使用される。例えば、関連酵素をコードする遺伝子のライブラリ
ーは、必要に応じて発現され、そしてこの酵素反応の産物は、精製され、そして
本明細書中に記載されるように、質量分析法によってハイスループット形式で分
析される。このような多様性生産反応の１つの重要なクラスは、いわゆる「核酸
シャッフリング」または「ＤＮＡシャッフリング」である。これらの方法におい
て、組換えを基にした任意の種々の多様性生産手順は、開始核酸または核酸を含
む生物体を多様化するために、あるいは、核酸の「シリコ内（ｉｎｓｉｌｉｃ
ｏ）」（コンピューター内）表現である文字列を多様化するためにさえ使用され
得る。産生される多様な核酸／文字列／生物体は、代表的に、１つ以上の活性に
ついてスクリーニングされる。次いで、核酸、文字列、または核酸を含む生物体
は、引き続く組換え反応において基質として使用され、その産物は、再び１つ以
上の活性についてスクリーニングされる。このプロセスは、１つ以上の所望の産
物が産生されるまで再帰的に繰り返される。

【００６１】核酸シャッフリングプロトコルを含む種々の多様性産生プロトコルが利用可能
であり、そして当該分野において完全に記載されている。以下の文献は、このよ
うな手順に援用され得る種々の再帰的な組換え手順および／または方法、ならび
に他の多様性生産プロトコルを記載する：

【００６２】

【化１】ＤＮＡシャッフリング、および他の多様性産生方法に関するさらなる詳細が、
発明者らおよび彼らの共働者により、米国特許において見受けられ、この米国特
許としては、以下が挙げられる。Ｓｔｅｍｍｅｒによる「ＭＥＴＨＯＤＳＦＯ
ＲＩＮＶＩＴＲＯＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ」と題する、米国特許第５
，６０５，７９３号（１９９７年２月２５日）、Ｓｔｅｍｍｅｒらによる「ＭＥ
ＴＨＯＤＳＦＯＲＧＥＮＥＲＡＴＩＮＧＰＯＬＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ
ＨＡＶＩＮＧＤＥＳＩＲＥＤＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳＢＹＩ
ＴＥＲＡＣＴＩＶＥＳＥＬＥＣＴＩＯＮＡＮＤＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯ
Ｎ」と題する、米国特許第５，８１１，２３８号（１９９８年９月２２日）、Ｓ
ｔｅｍｍｅｒらによる「ＤＮＡＭＵＴＡＧＥＮＥＳＩＳＢＹＲＡＮＤＯＭ
ＦＲＡＧＭＥＮＴＡＴＩＯＮＡＮＤＲＥＡＳＳＥＭＢＬＹ」と題する、米
国特許第５，８３０，７２１号（１９９８年１１月３日）、Ｓｔｅｍｍｅｒらに
よる「ＥＮＤ−ＣＯＭＰＬＥＭＥＮＴＡＲＹＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥＲＥＡＣ
ＴＩＯＮ」と題する、米国特許第５，８３４，２５２号（１９９８年１１月１０
日）、ならびにＭｉｎｓｈｕｌｌらによる「ＭＥＴＨＯＤＳＡＮＤＣＯＭＰ
ＯＳＩＴＩＯＮＳＦＯＲＣＥＬＬＵＬＡＲＡＮＤＭＥＴＡＢＯＬＩＣ
ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ」と題する、米国特許第５，８３７，４５８号（１９９
８年１１月１７日）。

【００６３】さらに、ＤＮＡシャフリング、および他の多様性産生プロトコルについての詳
細および形式が、種々のＰＣＴおよび外国の特許出願公報に見受けられ、これら
の特許出願広報としては、以下が挙げられる。ＳｔｅｍｍｅｒおよびＣｒａｍｅ
ｒｉによる「ＤＮＡＭＵＴＡＧＥＮＥＳＩＳＢＹＲＡＮＤＯＭＦＲＡＧ
ＭＥＮＴＡＴＩＯＮＡＮＤＲＥＡＳＥＭＢＬＹ」と題する、ＷＯ９５／２
２６２５号、ＳｔｅｍｍａｅｒおよびＬｉｐｓｃｈｕｔｚによる「ＥＮＤＣＯ
ＭＰＬＥＭＥＮＴＡＲＹＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥＣＨＡＩＮＲＥＡＣＴＩＯ
Ｎ」と題する、ＷＯ９６／３３２０７号、ＳｔｅｍｍｅｒおよびＣｒａｍｅｒ
ｉによる「ＭＥＴＨＯＤＳＦＯＲＧＥＮＥＲＡＴＩＮＧＰＯＬＹＮＵＣＬ
ＥＯＴＩＤＥＳＨＡＶＩＮＧＤＥＳＩＲＥＤＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩ
ＣＳＢＹＩＴＥＲＡＴＩＶＥＳＥＬＥＣＴＩＯＮＡＮＤＲＥＣＯＭＢ
ＩＮＡＴＩＯＮ」と題する、ＷＯ９７／００７８号、ＭｉｎｓｈｕｌおよびＳ
ｔｅｍｍｅｒによる「ＭＥＴＨＯＤＳＡＮＤＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳＦ
ＯＲＣＥＬＬＵＬＡＲＡＮＤＭＥＴＡＢＯＬＩＣＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮ
Ｇ」と題する、ＷＯ９７／３５９６６号、Ｐｕｎｎｏｎｅｎらによる「ＴＡＲ
ＧＥＴＩＮＧＯＦＧＥＮＥＴＩＣＶＡＣＣＩＮＥＶＥＣＴＯＲＳ」と題
する、ＷＯ９９／４１４０２号、Ｐｕｎｎｏｎｅｎらによる「ＡＮＴＩＧＥＮ
ＬＩＢＲＡＲＹＩＭＭＵＮＩＺＡＴＩＯＮ」と題する、ＷＯ９９／４１
３８３号、Ｐｕｎｎｏｎｅｎらによる「ＧＥＮＥＴＩＣＶＡＣＣＩＮＥＶＥ
ＣＴＯＲＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ」と題する、ＷＯ９９／４１３６９号、Ｐ
ｕｎｎｏｎｅｎらによる「ＯＰＴＩＭＩＺＡＴＩＯＮＯＦＩＭＭＵＮＯＭＯ
ＤＵＬＡＴＯＲＹＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳＯＦＧＥＮＥＴＩＣＶＡＣＣＩ
ＮＥＳ」と題する、ＷＯ９９／４１３６８号、ＳｔｅｍｍｅｒおよびＣｒａｍ
ｅｒｉによる「ＤＮＡＭＵＴＡＧＥＮＥＳＩＳＢＹＲＡＮＤＯＭＦＲＡ
ＧＭＥＮＴＡＴＩＯＮＡＮＤＲＥＡＳＳＥＭＢＬＹ」と題する、ＥＰ０９
３４９９９号、Ｓｔｅｍｍｅｒによる「ＥＶＯＬＶＩＮＧＣＥＬＬＵＬＡＲ
ＤＮＡＵＰＴＡＫＥＢＹＲＥＣＵＲＳＩＶＥＳＥＱＵＥＮＣＥＲＥＣ
ＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ」と題する、ＥＰ０９３２６７０号、Ｓｔｅｍｍｅｒら
による「ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮＯＦＶＩＲＵＳＴＲＯＰＩＳＭＡＮ
ＤＨＯＳＴＲＡＮＧＥＢＹＶＩＲＡＬＧＥＮＯＭＥＳＨＵＦＦＬＩ
ＮＧ」と題する、ＷＯ９９２３１０７号、Ａｐｔらによる「ＨＵＭＡＮＰ
ＡＰＩＬＬＯＭＡＶＩＲＵＳＶＥＣＴＯＲＳ」と題する、ＷＯ９９２１９７
９号、ＤｅｌＣａｒｄａｙｒｅらによる「ＥＶＯＬＵＴＩＯＮＯＦＷＨＯ
ＬＥＣＥＬＬＳＡＮＤＯＲＧＡＮＩＳＭＳＢＹＲＥＣＵＲＳＩＶＥ
ＳＥＱＵＥＮＣＥＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ」と題する、ＷＯ９８３１８
３７号、ＰａｔｔｅｎおよびＳｔｅｍｍｅｒによる「ＭＥＴＨＯＤＳＡＮＤ
ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳＦＯＲＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＥＮＧＩＮＥＥ
ＲＩＮＧ」と題する、ＷＯ９８２７２３０号、ならびに、Ｓｔｅｍｍｅｒらに
よる「ＭＥＴＨＯＤＳＦＯＲＯＰＴＩＭＩＺＡＴＩＯＮＯＦＧＥＮＥ
ＴＨＥＲＡＰＹＢＹＲＥＣＵＲＳＩＶＥＳＥＱＵＥＮＣＥＳＨＵＦＦＬ
ＩＮＧＡＮＤＳＥＬＥＣＴＩＯＮ」と題する、ＷＯ９８１３４８７号。

【００６４】特定の米国出願は、ＤＮＡシャフリングおよび関連技術、ならびに他の多様性
産生方法に関するさらなる詳細を提供し、その米国出願としては以下が挙げられ
る。１９９８年９月２９日（米国特許出願第６０／１０２，３６２号）、１９９
９年１月２９日（米国特許出願第６０／１１７，７２９号）、および１９９９年
９月２８日（米国特許出願第０９／４０７，８００号）（代理人整理番号２０−
２８５２０ＵＳ／ＰＣＴ）に出願された、Ｐａｔｔｅｎらによる「ＳＨＵＦＦＬ
ＩＮＧＯＦＣＯＤＯＮＡＬＴＥＲＥＤＧＥＮＥＳ」、１９９８年７月１
５日（米国特許出願第０９／１６６，１８８号）および１９９９年７月１５日（
米国特許出願第０９／３５４，９２２号）に出願された、ｄｅｌＧａｒｄｙｒ
ｅらによる「ＥＶＯＬＵＴＩＯＮＯＦＷＨＯＬＥＣＥＬＬＳＡＮＤＯ
ＲＧＡＮＩＳＭＳＢＹＲＥＣＵＲＳＩＶＥＳＥＱＵＥＮＣＥＲＥＣＯＭ
ＢＩＮＡＴＩＯＮ」、１９９９年２月５日（米国特許出願第６０／１１８，８１
３号）および１９９９年６月２４日（米国特許出願第６０／１４１，０４９号）
、ならびに１９９９年９月２８日（米国特許出願第０９／４０８，３９２号、代
理人整理番号０２−２９６２０ＵＳ）に出願された、Ｃｒａｍｅｒｉらによる「
ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＭＥＤＩＡＴＥＤＮＵＣＬＥＩＣＡＣＩ
ＤＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ」、ならびに１９９９年９月２８日（米国特許
出願第０９／４０８，３９３号、代理人整理番号０２−０１００７０ＵＳ）に出
願された、Ｗｅｌｃｈらによる「ＵＳＥＯＦＣＯＤＯＮ−ＢＡＳＥＤＯＬ
ＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳＹＮＴＨＥＳＩＳＦＯＲＳＹＮＴＨＥＴＩ
ＣＳＨＵＦＦＬＩＮＧ」、ならびに１９９９年２月５日（米国特許出願第６０
／１１８８５４号）および１９９９年１０月１２日（米国特許出願第０９／４１
６，３７５号）に出願された、ＳｅｌｉｆｏｎｏｖおよびＳｔｅｍｍｅｒによる
「ＭＥＴＨＯＤＳＦＯＲＭＡＫＩＮＧＣＨＡＲＡＣＴＥＲＳＴＲＩＮＧ
ＳＰＯＬＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ＆ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳＨＡＶ
ＩＮＧＤＥＳＩＲＥＤＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ」。

【００６５】前述の公報、特許、公開出願、ならびに米国特許出願を再考して明らかなよう
に、所望の特性を有する新規の核酸を提供するための核酸の反復組換えが、多数
の確立された方法により実行され得、これらの手順は、任意の種々の他の多様性
産生方法と組み合わせられ得て、例えば、本明細書に記載されるように、必要に
応じてスクリーニングされるライブラリーを産生する。

【００６６】簡単に言えば、少なくとも５つの異なる一般的なクラスの組替え方法が、本発
明に適用可能であり、そして上記参照中で述べられている。第１に、核酸は、上
記参照中で議論される任意の種々の技術により、インビトロ中で組換えられ得、
この技術としては、例えば、組換えられる拡散のＤＮＡｓｅ消化、続いてこの核
酸の連結および／またはＰＣＲ再構築が挙げられる。第２に、例えば、細胞内で
核酸の間で組換えが生じることを可能にすることによって、核酸は、インビボで
反復的に組換えられ得る。第３に、細胞または他の生物のゲノム全体が組換えら
れる、ゲノム全体の組換え方法が使用され得、この方法としては、必要に応じて
、所望のライブラリー成分を有するゲノム組換え混合物のスパイキング（ｓｐｉ
ｋｉｎｇ）が挙げられる。第４に、目的の標的に一致するオリゴヌクレオチドが
合成され、そして１よりも多い親核酸に一致するオリゴヌクレオチドを含むＰＣ
Ｒ反応または連結反応の際に再構築される、合成組換え方法が使用され得、それ
により、新規の組換え核酸を産生する。オリゴヌクレオチドは標準のヌクレオチ
ド付加方法によって作成され得るか、または３ヌクレオチド合成アプローチによ
り作成され得る。第５に、遺伝アルゴリズムがコンピュータ中で使用され、核酸
ホモログ（または非ホモログ配列さえも）に一致する配列ストリングを組換える
、組換えのインシリコ方法がもたらされ得る。生じた組換え配列ストリングは、
必要に応じて、例えば、オリゴヌクレオチド合成／遺伝子再構築技術と協調して
組換え配列に対応する核酸の合成によって、核酸に変換される。前述の一般的な
組換え形式の内のいくつかは、反復方法で行われ得、本明細書中で提供される精
製およびＭＳ法を用いて必要に応じてスクリーニングされる、組換え核酸のより
多様なセットを産生する。

【００６７】上記の参照は、これらおよび他の基本的な組換え形式、ならびにこれらの形式
の多数の改変を提供する。使用される形式に関係なく、本発明の核酸は、（互い
にか、または関連してか（または、関連しなくても））組換えられ、多様な組換
え核酸のセット（相同な核酸のセットを含む）を産生し得る。

【００６８】ＤＮＡシャフリングは、改善された特性を有するタンパク質、経路、細胞、お
よび生物の操作に有用である、多様性を産生する強力で、広範囲に適用可能な手
段を提供する。上記した基本形式に加えて、シャフリング方法を多様性を産生す
るための他の技術と組み合わせることが、時として所望され得る。シャフリング
方法と共に（またはシャフリング方法とは別に）、種々の多様性産生方法が、行
われ得そして結果物（例えば、核酸の多様な集合）が、本発明のシステムにおい
てスクリーニングされる。個々のヌクレオチドか、または連続ヌクレオチドもし
くは非連続ヌクレオチドの群の変化を生じる方法（すなわち、誘発誘発方法）は
、さらなる多様性を導入し得る。誘発誘発方法としては、例えば、組換え（ＰＣ
Ｔ／ＵＳ９８／０５２２３；公開番号ＷＯ９８／４２７２７）；オリゴヌクレオ
チド指向性変異誘発（総説については、Ｓｍｉｔｈ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅ
ｔ．１９；４２３〜４６２（１９８５）；ＢｏｔｓｔｅｉｎおよびＳｈｏｒｔｌ
ｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９；１１９３〜１２０１（１９８５）；Ｃａｒｔｅｒ
，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３７：１〜７（１９８６）；Ｋｕｎｋｅｌ，「Ｔｈｅ
ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｄｉｒｅｃ
ｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ＆Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＥｃｋｓｔｅｉｎおよびＬｉｌｌｅｙ編，Ｓｐｒ
ｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９８７）を参照のこと）が挙げら
れる。これらの方法には、オリゴヌクレオチド指向性変異誘発（Ｚｏｌｌｅｒ
ａｎｄＳｍｉｔｈ，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１０：６４８７〜６５０
０（１９８２）、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８〜５
００（１９８３）、およびＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．１５４：３
２９〜３５０（１９８７））、ホスホチオエート改変ＤＮＡ変異誘発（Ｔａｙｌ
ｏｒら，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１３：８７４９〜８７６４（１９８５
）；Ｔａｙｌｏｒら，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１３：８７６５〜８７８
７（１９８５）；ＮａｋａｍａｙｅおよびＥｃｋｓｔｅｉｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓＲｅｓ．１４：９６７９〜９６９８（１９８６）；Ｓａｙｅｒｓら，Ｎｕ
ｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１６：７９１〜８０２（１９８８）；Ｓａｙｅｒｓ
ら，ＮｕｃｌＡｃｉｄｓＲｅｓ．１６：８０３〜８１４（１９９８））、ウ
ラシル含有テンプレートを使用する変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：４８８〜４９２（１９８５）およびＫ
ｕｎｋｅｌら，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７〜３８
２））；ギャップのある二重鎖ＤＮＡを使用する変異誘発（Ｋｒａｍｅｒら，Ｎ
ｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１２：９４４１〜９４５６（１９８４）；Ｋｒａ
ｍｅｒおよびＦｒｉｔｚ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．１５４：３
５０〜３６７（１９８７）；Ｋｒａｍｅｒら，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．
１６：７２０７（１９８８）；およびＦｒｉｔｚら，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲ
ｅｓ．１６：６９８７〜６９９９（１９８８））が含まれる。さらなる適切な方
法としては、点ミスマッチ修復（Ｋｒａｍｅｒら，Ｃｅｌｌ３８：８７９〜８
８７（１９８４））、修復欠損宿主株を用いる変異誘発（Ｃａｒｔｅｒら，Ｎｕ
ｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１３：４４３１〜４４４３（１９８５）；Ｃａｒｔ
ｅｒ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．１５４：３８２〜４０３（１９
８７））、欠失変異変異誘発（ＥｇｈｔｅｄａｒｚａｄｅｈおよびＨｅｎｉｋｏ
ｆｆ，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄＲｅｓ．１４：５１１５（１９８６））、制限選択
および制限精製（Ｗｅｌｌら，Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．
Ａ３１７：４１５〜４２３（１９８６））、総遺伝子合成による変異誘発（Ｎ
ａｍｂｉａｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２３：１２９９〜１３０１（１９８４）；
ＳａｋａｍａｒおよびＫｈｏｒａｎａ，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１４：
６３６１〜６３７２（１９９８）；Ｗｅｌｌｓら，Ｇｅｎｅ３４：３１５〜３
２３（１９８５）；およびＧｒｕｎｄｓｔｒｏｍら．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．１３：３３０５〜３３１６（１９８５））が挙げられる。誘発誘発のキ
ットは、市販されている（例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＡｍｅｒｓｈａｍＩｎｔ
ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＡｎｇｌｉａｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。

【００６９】組換え後に、産生される任意の核酸は、必要に応じて所望の活性について選択
される。本発明の脈絡において、これは、従来技術のアッセイのいくつかが自動
化可能な形式において検出され得る任意の活性を試験しかつ同定することを含む
。種々の関連（または無関係さえ）特性が、任意の利用可能なアッセイを使用し
てアッセイされ、そして例えば、ハイスハープットＭＳを使用してスクリーニン
グされ得る。

【００７０】さらに、任意の記載されるシャッフリング技術は、さらなる多様性をゲノムま
たはライブラリーに導入する手順と共に使用され得る。例示的方法が、Ｓｃｈｅ
ｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒによる、キメラ核酸マルチマーを記載している米国特許第
５，７５６，３１６号、および多様性産生の連鎖終結方法を記述している米国特
許第５，９６５，４０８号において記述されている。加えて、相同性ベースでは
ない方法の使用は、多様性をさらに増加させ得る。例えば、Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅ
ｒら（１９９９）「Ａｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌａｐｐｌｏａｃｈｔｏ
ｈｙｂｌｉｄｅｎｚｙｍｅｓｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｏｆＤＮＡｈ
ｏｍｏｌｏｇｙ」ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ１７：１２０５で述べられて
いる、ハイブリッド酵素の作成のための追加の短縮化（ＩＴＣＨＹ）は、１回以
上のインビトロまたはインビボシャフリング方法についての基質として利用され
る、初期組換えライブラリーを産生するために使用され得る。多種発現ライブラ
リーを産生および使用するための方法は、例えば、米国特許第５，７８３，４３
１号、第５，８２４,４８５号に述べられている。

【００７１】これらの多様性産生方法のうちのいくつかが、ユーザによって選択される任意
の組み合わせにおいて、互いにか、またはシャフリング反応と組み合わせられ得
、任意の利用可能なスクリーニング方法を用いてスクリーニングされ得る核酸多
様性を産生し得る。例えば、多様な核酸のライブラリーは、必要に応じて発現さ
れ、そして目的の成分が、精製され、そして本明細書で記述したようなハイスル
ープットＭＳによりスクリーニングされる。

【００７２】（細胞増殖プレート）本発明の細胞増殖プレートは、必要に応じて、１５３６ウェルのマイクロタイ
タープレート、３８４ウェルのマイクロタイタープレート、または９６ウェルの
マイクロタイタープレート等である。形質転換プレートから、例えば、遺伝子ラ
イブラリーを含む細胞のコロニーが、例えば、ＧｅｎｅｔｉｘからのＱ−ｂｏｔ
を使用する適切な増殖媒地を含む１５３６ウェルのマイクロタイタープレート、
３８４ウェルのマイクロタイタープレート、または９６ウェルのマイクロタイタ
ープレートに直接拾われる。Ｑ−ｂｏｔの最大速度は、１時間あたり４０００コ
ロニーである。

【００７３】マイクロタイタープレートは、代表的に、例えば、代表的には、生物に依存し
て１日から約２週間の間で、細胞増殖のためのプレートシェーカー中でインキュ
ーベートされる。媒地および細胞増殖状態は、インキューベートされる特定の細
胞に適する。

【００７４】細胞増殖プレートはまた、例えば、酵素反応が研究されている場合に、産物の
産生のために使用される。酵素と基質との間の反応の産物は、新規の機能的な酵
素を進化させる場合に関心がある。これらの産物または反応物は、多数の酵素の
遺伝子ライブラリーが短期間に解析され得るようハイスループット方法において
解析されるべきである。産物および反応物のハイスループット測定を可能にする
ために、産物は必要に応じて、本発明の自動化されたシステムの一部として産生
される。従って、このアッセイで行われなければならない任意の産物の産生工程
は、必要に応じて細胞増殖プレート上で実行される。産物の産生の後、サンプル
（例えば、産物および／または反応物）は、必要に応じて、解析するため、質量
分析計中への注入のために、精製される。

【００７５】（オフライン精製システム）本発明のオフライン並行精製システムは、ハイスループットの質量分析法分析
を可能にする。なぜなら、これは、サンプルが、システムにおいて精製されるこ
とを可能にし、このシステムは、実質的に質量分析法分析に縛られず、そして異
質量分析法分析を遅くしないからである。このシステムは、時間を消費するカラ
ム分離を使用することなく、産物および／または反応物のオフライン並行精製を
可能にする。

【００７６】本発明のオフライン並行精製は、細胞増殖プレート上での産物発生の一部とし
て実施される。この様式において、システムは、全てのサンプルが、カラム分離
を用いることなく、質量分析法分析のために十分に精製されることを可能にし、
このカラム分離は、引き続いて、質量分析計とインラインで実施される。このこ
とを行うために、このシステムは、分析されるサンプルのタイプ（例えば、反応
物および/または産物）に基づいて選択される、化学的精製工程を提供する。さ
らに、この化学的精製工程は、本発明のオフラインシステム中の細胞増殖プレー
トのウェルにおいて実施され得る。

【００７７】例えば、オフライン化学的精製工程は、目的の反応物および／または産物を産
生する場合に、必要に応じて、異なるまたはさらなる緩衝液の使用を含む。ある
いは、オフライン並行精製システムは、目的の反応物および／または産物を産生
する場合に、イオン交換樹脂の使用を含む。従って、サンプルを、そのサンプル
が産生するときに、調製することによって、本発明のシステムは、分析されるべ
き成分を精製および／または分離するために、さらなる時間を要しない。

【００７８】あるいは、精製システムは、質量分析計への直接注入のための精製された産物
を産生する成分リアクタ（例えば、酵素リアクタ）を備える。本明細書で使用さ
れる場合、成分リアクタは、固体支持体をいい、この固体支持体は、例えば、成
分を固体支持体に付着することによって、目的の成分から細胞溶解物を除去する
ために、または細胞溶解物から目的の成分を除去するために、使用される。目的
の成分には、核酸、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、酵素、炭水
化物、脂質などが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、酵素、ペプチ
ド、またはタンパク質をコードする遺伝子に、特定のタグについての配列を融合
することによって、タグ化されたタンパク質、酵素、ペプチドなどが、必要に応
じて、例えば、特異的かつ安定な様式で固体支持体上で精製および固定化され、
従って、例えば、酵素リアクタを形成する。典型的に、酵素、タンパク質、また
はペプチドは、タグ化された酵素を、固体支持体上に固定化されたタグ結合部分
に結合させることによって、細胞溶解物から除去される。例えば、酵素または他
のタンパク質は、細胞において発現され、そして、細胞が、例えば、ＥＤＴＡ、
リゾチーム、ＤＴＴ、ＰＭＢＳ、熱、超音波処理などを使用して、溶解される。
分泌タンパク質が目的の成分ならば、溶解は必要ではない。他のライブラリー成
分がまた、必要に応じて、固体支持体を結合する分子とタグ化される。例えば、
ビオチンは、必要に応じて、目的の任意のライブラリー成分（例えば、核酸、炭
水化物または小さい有機分子）に化学的にまたは酵素的に添加される。

【００７９】次いで、タグ化された成分は、タグ結合部分を含むタグ結合マトリックスまた
は固体支持体に曝露される。タグ結合分子および対応するタグの例が、以下に提
供される。タグ結合マトリックスまたは固体支持体は、典型的にタグ結合部分（
例えば、酵素上の特定のタグに結合する分子）および固体マトリックス物質を含
む。任意の固体支持体としては、分配可能なビーズまたは粒子（例えば、アガロ
ース、ポリスチレン、または磁気ビーズ、膜、マイクロウェルプレート、または
ピン）が挙げられるが、これらに限定されない。これらのタグ化された酵素また
はタンパク質は、固体支持体上のタグ結合部分に結合する。結合していない物質
は、例えば、ビーズまたは膜の場合において、分配されるか、または遠心分離さ
れるか、または吸引される。磁気ビーズは、必要に応じて、例えば、ビーズおよ
びタグ化酵素を細胞溶解物から除去する磁石によって、非結合フラクションから
分離される。ピンは、典型的に、例えば、細胞増殖プレート中の溶解物ウェルの
内外に持ち上げられる。ピンの使用は、必要に応じて、特にハイスループットを
生じる。なぜなら、精製にほとんど時間がかからないからである。洗浄が、必要
に応じて、類似の様式で、非結合物質の除去の後に実施される。この固体支持体
は、例えば、緩衝液で洗浄され、その後、反応を実施する。

【００８０】例えば、精製されかつ安定な様式で固体支持体に固定化されたタグ化成分は、
それによって、リアクタ（例えば、酵素リアクタ）を提供する。反応が、必要に
応じて、固体支持体上で実施され、タグ化成分（例えば、タグ化酵素）が、例え
ば、タグ化成分が結合される、ピンのセットを反応ウェルから持ち上げることに
よって、反応後容易に除去される。タグ化成分の除去は、例えば、必要に応じて
、さらなる精製または汚染除去することなく、質量分析計、ＩＲまたはＮＭＲ分
光計などに直接注入される精製された産物を残す。結果の検出の代替の方法は、
色原体または蛍光原体基質および／または産物の測定を含む。

【００８１】上記のようにリアクタを提供するために、必要に応じて、使用される１つの極
度に安定な相互作用は、ビオチンのアビジンへの結合またはビオチンのストレプ
トアビジンへの結合を利用する。アビジンおよびストレプトアビジンは、必要に
応じて、種々のサプライヤーから入手可能な種々の固体支持体（例えば、磁気ビ
ーズ、アガロースビーズ、または膜）上に固定化される。酵素は、一般に特別な
ペプチドタグを、一方でタンパク質を発現する酵素のＮ末端またはＣ末端に融合
することによって、インビボで代表的にビオチン化される。例えば、Ｓｃｈａｔ
ｚ（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１１、１１３８−１１４３を参照
のこと。ビオチン−ホロ酵素リガーゼは、それらのＮ末端またはＣ末端ペプチド
を基質として認識し、そしてそのペプチドのリシン残基をビオチン化する。ビオ
チン−ホロ酵素リガーゼについてのこれらの新しい基質の発現のレベルは、典型
的に高いので、全ての分子がビオチン化されるわけではない。ｂｉｒＡ遺伝子の
過剰発現および発現媒体への少量のビオチンの添加は、この問題を回避する。例
えば、Ｓｍｉｔｈら（１９９８）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２６，
１４１４−１４２０を参照のこと。組換え酵素の過剰発現のために、リアクタに
結合したＢＣＣＰの量は無視されるか、またはＢＣＣＰノックアウトが、酵素ビ
オ−タグ融合の発現のために、必要に応じて構築される。目的の成分（例えば、
酵素、タンパク質、核酸など）の精製および固定化のテーマに対する多くのバリ
エーションは、当業者によってさらに評論される際に、明白である。

【００８２】タグ化のために有用な化合物のさらなる対としては、ビオチンおよびストレプ
トアビジン、ビオチンおよびアビジン、マルトース結合タンパク質およびアミロ
ース；ＮＴＡ、ＩＤＡ、ＴＥＤなどをキレート化剤として用いる固定化金属キレ
ートクロマトグラフィーを使用するＮ末端またはＣ末端でのＨｉｓ−タグオリゴ
−ｈｉｓ；グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼおよび還元されたグルタチオ
ン；ストレプ−タグ短い人工ストレプトアビジン結合タグおよびストレプトアビ
ジン、Ｅ−タグ、ｍｙｃ−タグ、ＨＡＧ−タグ、Ｈｉｓ−タグなどのようなエピ
トープタグとモノクローナル抗体；キチン結合ドメインおよびチキン；Ｓ−タグ
およびＲＮＡｓｅマイナスＳ−ペプチド変異体；セルロース結合タンパク質とセ
ルロースドメイン；チオレドキシンおよびチオボンド（ｔｈｉｏｂｏｎｄ）を有
するＤｓｂＡ；ポリアニオンカラム物質を有するヘキサ−アルギニンポリ−カチ
オン−タグ；ＩＧｇおよび他のＩＧｇ誘導ペプチドとＰｒｏｔｅｉｎＡまたはＰ
ｒｏｔｅｉｎＧ最小化ペプチド；カルモジュリン結合ペプチドとカルモジュリン
；ならびにヒスタクトフィリン（ｈｉｓｔａｃｔｏｐｈｉｌｉｎ）とＩＭＡＣ（
固定化金属キレートクロマトグラフィー）が挙げられるが、これらに限定されな
い。

【００８３】１つの実施形態において、遺伝子のライブラリーが提供され、その遺伝子は、
１つ以上のタグ化酵素をコードする。例えば、ビオチンについての配列は、酵素
配列と融合され、例えば、細胞中でタグ化酵素を発現する。その細胞は、必要に
応じて、溶解され、そして酵素は、典型的に、固体支持体（例えば、リアクタ）
上のタグ結合部分に結合される。次いで、酵素は、必要に応じて、除去され、そ
して基質（例えば、精製された基質）と反応される。このような様式で産生され
た産物は、例えば、質量分析法または別のハイスループットシステムによる分析
のために十分に純粋である。あるいは、酵素は、細胞溶解物中の基質と反応され
、次いで、除去される。別の実施形態において、目的の成分は、分泌タンパク質
である。この場合、タンパク質は、必要に応じて、例えば、本明細書中に記載さ
れるような固体支持体リアクタを使用して、さらなる反応または分析のために細
胞上清から除去される。さらに、細胞上清は、さらなる反応における使用のため
に、必要に応じて、除去される。

【００８４】上記のようなリアクタは、必要に応じて、例えば、同じまたは異なる基質ある
いは反応条件を使用して、複数回使用される。なぜなら、それは、必要に応じて
、完了の際に反応から除去され、例えば、洗浄され、そして再利用されるからで
ある。酵素ライブラリーが、新規な活性についてスクリーニングされ、そして適
合基質が同定される場合に、これは、特に有用である。

【００８５】本発明のリアクタまたは固体支持体は、例えば、活性アッセイにおける精製さ
れた酵素の使用を可能にし、そして異なる時間に複数の異なる基質とともに必要
に応じて使用される、再使用可能なシステムを生じ、それによって、例えば、化
学処理およびエンジニアリングのための酵素リアクタを提供する。あるいは、リ
アクタは、同時に複数の異なる基質とともに使用される。なぜなら、反応サンプ
ルは、質量分析計への注入の前に、精製されるべきではないからである。固体支
持体リアクタに関するさらなる詳細が、ＵＳＳＮ６０／１４８，８４８（１９
９９年８月１２日に提出された、Ｌｉｕらの「ＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｎｄＵ
ｓｅｏｆＥｎｚｙｍｅｓｆｏｒＣｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌａｎｄ
ＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ」）に見出される。

【００８６】（オートサンプラー）オートサンプラーは、本発明の装置に連結され、細胞増殖プレート（ここで、
細胞が増殖し、反応物および／または目的の産物が産生され、そして精製される
）の間のサンプルを、注入および分析のために質量分析計に輸送する。オートサ
ンプラーは、標準的な研究室装置サプライヤー（例えば、ＧｉｌｓｏｎおよびＣ
ＴＣＡｎａｌｙｔｉｃｓ）から購入され得る。このようなサンプラーは、約１
０秒／サンプル〜約１分／サンプルの速度で機能する。

【００８７】さらに、ロボットサンプラーハンドラーを必要に応じて使用して、細胞コロニ
ーを細胞増殖プレートに移し、そして試薬をオフライン並行精製システムに添加
する。マイクロタイタープレートへの、またはそこからの流体移動に関連した共
通配置の産生のために、流体ハンドリングステーションが使用される。このよう
なロボットハンドラーとしては、Ｂｅｃｋｍａｎｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓおよ
びＧｅｎｅｔｉｘによって作製されたもの（例えば、Ｑ−ｂｏｔ）が挙げられる
が、これらに限定されない。さらに、このような移動を実施するためのいくつか
の「棚のない（ｏｆｆｔｈｅｓｈｅｌｆ）」流体ハンドリングステーション
が市販され、例えば、ＺｙｍａｒｋＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｚｙｍａｒｋ
Ｃｅｎｔｅｒ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ；ｈｔｔｐ:／／ｗｗｗ．ｚｙｍａｒ
ｋ．ｃｏｍ／）からのＺｙｍａｔｅｓｙｓｔｅｍおよび他のステーション（こ
れは、例えば、プレート移動のためのロボットとともに、自動ピペッターを利用
する）（例えば、ＯＲＣＡ（登録商標）ロボット、これは、例えば、Ｂｅｃｋｍ
ａｎＣｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）から入手可能な
種々の研究室システムにおいて使用される）が挙げられる。

【００８８】ロボットサンプラーハンドラーはまた、上記のような細胞増殖プレートまたは
酵素リアクタから酵素を除去するために、必要に応じて使用される。例えば、ロ
ボットハンドラーを必要に応じて使用して、ピンのセットを、反応ウェルから持
ち上がるか、または磁気ビーズのセットを、細胞増殖ビーズ（例えば、タグ化酵
素を含むビーズ）から持ち上げるために磁石を位置決めするために、必要に応じ
て使用される。

【００８９】（質量分析計）種々の質量分析計装置が、市販されている。例えば、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ（Ｕ
．Ｋ．）は、種々の適切な装置（例えば、ＱｕａｔｔｒｏＬＣ（例えば、ＡＰ
ＩＬＣ−ＭＳ−ＭＳのために最適化された、コンパクトな三連ステージの四重極
システム）、これは、二連ステージ直交「Ｚ」噴霧サンプリング技術を使用する
）を製造する。他の適切な三連ステージ四重極質量分析計（例えば、「ＴＳＱ」
分析計）は、ＦｉｎｎｉｇａｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって製造される。

【００９０】（ＩＩ．形質転換細胞）本発明の１つの実施形態において、関連した遺伝子配列のライブラリーの１つ
以上のメンバーを含むプラスミドで形質転換される細胞を提供する。関連した遺
伝子配列のライブラリーは、必要に応じて、再帰的な配列組換えのために一般的
な方法によって作り出される。例えば、この方法は、酵素または酵素サブユニッ
トをコードし、そして新しい基質に作用する能力、または古い基質を用いる増加
された触媒特性について進化される遺伝子を用いて、単独または多段階経路にお
ける他の遺伝子との組み合わせにおいてのいずれかで開始される。

【００９１】用語「遺伝子」は、生物学的機能に関連するＤＮＡの任意のセグメントまたは
配列を言う場合に、本明細書中で広く使用される。遺伝子は、必要に応じて、種
々の供給源から得られ、それには、目的の供給源からのクローニングもしくは公
知または予測される配列情報からの合成を含み、そして、所望のパラメータを有
するように設計された配列を含み得る。新しい基質を使用する能力は、ある場合
には、栄養供給源としての基質上で増殖する能力によってアッセイされ得る。別
の状況において、このような能力は、宿主細胞についての基質の減少した毒性に
よってアッセイされ得、従って、宿主がその基質の存在下で増殖し得る。新しい
化合物（例えば、抗生物質）の生合成は、進化した遺伝子を発現する宿主の存在
下で、インディケーター生物の増殖によって同様にアッセイされ得る。例えば、
インディケーター生物が、進化した遺伝子を発現する宿主のオーバーレイにおい
て使用される場合（ここで、インディケーター生物は所望の抗生物質に対して感
受性であるか、または所望の抗生物質に対して感受性であると予測される）、イ
ンディケーター生物の増殖が、進化した遺伝子を発現する宿主細胞またはコロニ
ーの周りの領域で阻害される。

【００９２】ライブラリーは、１０から１０⁵、１０⁹、１０¹²以上のメンバーより多くのサ
イズで広く変化し得る。いくつかの実施形態において、開始セグメントおよび産
生された組換えライブラリーは、増強された発現のための全長のコード配列およ
び任意の本質的な調節配列（例えば、プロモーターまたはポリアデニル化配列）
を含む。別の実施形態において、ライブラリーにおける組換えＤＮＡセグメント
が、発現のために必要な配列を提供する共通ベクターに挿入され得、その後、ス
クリーニングまたは選択を実施する。酵素をコードする関連した遺伝子を含むラ
イブラリーが、例えば、複数の関連した遺伝子の組換えによって、必要に応じて
産生される。このライブラリーは、必要に応じて、分子のインビトロセットであ
るか、またはファージ、細胞などに含まれる。他の実施形態において、ライブラ
リーは、タグ化酵素を提供するために融合された酵素遺伝子のライブラリーを含
む。次いで、そのライブラリーを、例えば、改善された酵素または所望の産物を
検出するために、本発明のハイスループット質量分析法によって、スクリーニン
グされる。

【００９３】次いで、当業者に周知の標準的な技術を使用して、細胞が、上記のライブラリ
ーメンバーの１つ以上とトランスフェクトされるか、または形質転換される。本
発明における使用の一般的な方法を開示する基本的なテキストには、Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋ、ＡｕｓｕｂｅｌおよびＢｅｒｇｅｒ（全て前出）が挙げられる。

【００９４】（ＩＩＩ．細胞の増殖）一般的に、任意の型の細胞が、進化遺伝子のレシピエントとして、必要に応じ
て使用される。特定の目的の細胞には、多くの細菌細胞型（グラム陰性およびグ
ラム陽性の両方（例えば、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｅｎｉｃ
ｉｌｌｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、およびＥｒｗｉｎｉａ））が含まれ
る。目的の細胞としてはまた、真核生物細胞（特に、哺乳動物細胞（例えば、マ
ウス、ハムスター、霊長類、ヒト））、細胞株および初代培養物の両方が含まれ
る。このような細胞としては、幹細胞（胚幹細胞を含む）、接合体、線維芽細胞
、リンパ球、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、マウス線維芽細胞（ＮＩ
Ｈ３Ｔ３）、腎細胞、肝細胞、筋細胞、および皮膚細胞が挙げられる。目的の他
の真核生物細胞としては、以下が挙げられる：植物細胞（例えば、トウモロコシ
、イネ、コムギ、ワタ、ダイズ、サトウキビ、タバコ、およびａｒａｂｉｄｏｐ
ｓｉｓ）；魚類、藻類、真菌類（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、昆虫
、酵母（ＰｉｃｃｈｉａおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）など。

【００９５】宿主の選択は、操作される宿主の意図される用途（病原性、基質範囲、環境耐
久力、重要な中間体の存在、遺伝子操作の容易性、および他の生物体への遺伝情
報の乱交雑移入の可能性、を含む）に依る多数の因子に依存する。特に有利な宿
主は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ、および糸状菌である。

【００９６】本発明では、単一コロニーの細胞を、例えば、ＧｅｎｅｔｉｘからのＱ−ｂｏ
ｔを用いて、直接形質転換プレートから適切な増殖培地（例えば、ＬＢ）を有す
る１５３６、３８４または９６ウェルのマイクロタイタープレートまたは細胞増
殖プレートに採取する。Ｑ−ｂｏｔの最高スピードは、１時間あたり約４０００
コロニーである。マイクロタイタープレートは、代表的に、細胞増殖のために特
定のプレートシェーカー内でインキュベートされる。

【００９７】各々の単一コロニーを、細胞増殖プレートの単一のマイクロタイターウェル内
で均一に増殖させる（これは、必要に応じて、このプロセス（例えば、接種物サ
イズおよび培養条件）を自動化すること、ならびに温度および湿度を制御したイ
ンキュベーターを提供すること、によって達成される）。１つの局面において、
ライブラリーメンバー（例えば、細胞、ウイルスプラーク、胞子など）が固形培
地上で分離されて、個々のコロニーまたはプラークを産生する。自動化コロニー
採取機（例えば、Ｑ−ｂｏｔ、Ｇｅｎｅｔｉｘ、Ｕ．Ｋ．）を用いて、コロニー
を同定し、採取し、そして１０，０００個の異なる変異体を、約２つまたは３つ
のガラスボール／ウェル（例えば、３ｍｍのガラスボール）を必要に応じて含む
９６または３８４ウェルのマイクロタイターディッシュに接種する。Ｑ−ｂｏｔ
は、コロニー全体を採取するのではなく、そのコロニーの中心を通るピンを挿入
し、そして細胞（または、菌糸）および胞子（または、プラーク適用においては
ウイルス）の少量のサンプリングとともに抜け出る。このピンがそのコロニー内
に存在する時間、その培養培地に接種する浸漬物の数、およびそのピンがその培
地に存在する時間は各々、接種サイズに影響し、そして各々は制御および最適化
され得る。Ｑ−ｂｏｔの均一なプロセスは、人間の手による誤差を減少させ、そ
して培養物を確立する速度を上昇させる（およそ１０，０００／４時間）。次い
で、これらの培養物を、温度および湿度が制御されたインキュベータ中で振盪す
る。マイクロタイタープレートにおけるガラスボールは、使用される場合、細胞
の均一な通気を促進するように作用し、そして発酵槽のブレードと同様に菌糸フ
ラグメントが分散することを促進するにように作用する。例えば、Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓは、培養の間に共に凝集化する傾向があるが、混合の間にガラスビ
ーズが添加される場合には、培養物中で比較的均一性を維持する傾向がある。

【００９８】（ＩＶ．目的の細胞成分の産生）本発明の１つの実施形態では、次いで、１つ以上の細胞もしくはクローン、ま
たは細胞コロニーを、例えば、細胞の酵素反応経路からの産物形成を開始させる
ためのいくつかの様式のうちの１つで処理する。酵素またはタンパク質の発現が
細胞増殖の間に故意に抑制された場合、サプレッサーを除去することによってか
またはアクチベーター分子を添加することによって、発現を誘導し得る。

【００９９】活性酵素を含む細胞は、溶解されそして透過剤で処理されて、かさ高くおよび
／または強イオン性の基質が細胞壁を透過するのを可能にし得る。これは、特に
Ｅ．ｃｏｌｉのようなグラム陰性細菌について重要である。いくつかの細胞成分
（例えば、酵素またはタンパク質）が培地中に分泌され（すなわち、適切なシグ
ナル配列を有する、ｂａｃｉｌｌｕｓのようなグラム陰性細菌において発現され
る場合）、この場合、余分な処理は必要とされない。

【０１００】いくつかの場合では、目的の成分（例えば、酵素、タンパク質、または核酸）
が、必要に応じて、精製樹脂で精製される。試薬（例えば、酵素基質）は、目的
の精製成分に添加され、このようにして、精製された成分または産物を提供する
。タンパク質精製工程は、引き続く多くのサンプル精製工程を排除する。いくつ
かの実施形態では、目的の成分を、上記のような成分または酵素リアクターを用
いて精製する。反応は、必要に応じて、このようなリアクター内で実施され、そ
して例えば、遠心分離または磁化によって、酵素または成分が除去されて、例え
ば、ＭＳによる分析のための精製産物を提供する。産物形成の開始は、必要に応
じて、異なる培地内に細菌培養物を接種することによって達成される。すべての
場合において、産物形成の開始は、本発明の細胞増殖プレートにおける並行９６
または３８４ウェル形式で実施される。

【０１０１】（Ｖ．オフライン並行精製によるサンプルの調製）２つの要素が、質量分析計での分析物の定量的検出に影響する。第１に、マト
リックス中の不純物は、シグナルを抑制またはマスクし得る。第２に、質量分析
計は、生サンプルを扱うためには所望されない高度に精巧な装置である。強イオ
ン性の緩衝液およびマトリックス中のＤＮＡまたはタンパク質のような高分子は
、シグナルの減少へと導き、そして最悪の場合には、機械の目詰まりへと導く。
従って、サンプルのクリーンアップが最も重要である。

【０１０２】本発明は、全細胞、または部分的もしくは完全に溶解された細胞を用いるアッ
セイ（例えば、酵素アッセイ）のためのハイスループット方法を提供する。クロ
マトグラフィーの分離工程の代わりに、サンプルは、例えば、固相抽出またはエ
タノール／メタノール沈殿析出によって、タンパク質、核酸、通常の細胞ジャン
ク、および細片を取り除くために、抽出方法でクリーンアップされる。使用され
る方法は、多くの成分（糖、ペプチド、ポリヌクレオチド、無機低分子、ポリケ
チド、β−ラクタム抗生物質、トリアジン誘導体などが挙げられるが、これらに
限定されない）に対して実行可能である。

【０１０３】伝統的には、生サンプルを質量分析計に導入する前に、その生サンプルを液相
クロマトグラフィーカラムで清浄化した。液体クロマトグラフィー質量分析法（
ＬＣ／ＭＳ）はおそらく、生サンプルを清浄化するために最も一般的な方法であ
った。しかし、各カラムの泳動は、時間浪費的であり（１サンプルあたり１０〜
３０分間）、分析速度を制限する。

【０１０４】フローインジェクション分析（ＦＩＡ）は、一般的に、オートサンプラーの速
度によってのみ制限され、これは、１回の注入あたり約３０〜約４０秒間の範囲
であり、そして新型のオートサンプラーが製造されるにつれて、より早くなって
いる。ＦＩＡについてのサンプル調製は、細胞増殖から反応までか、または産物
形成から質量分析計への導入までのすべての工程を考慮に入れる。１つの重要な
要素は、スクリーニングの質を損なうことなく、できるかぎりＭＳ適合性を適応
させるように産物形成の反応条件を調整することである。反応またはアッセイの
条件は、目的の産物および／または反応物が使用される実際の環境条件にできる
かぎり近い。例えば、酵素経路が問題である場合、反応条件は、その酵素が使用
される条件にできる限り近い（例えば、指向される酵素の進化が、所望される変
異改変体へと導くことを保証するため）。例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓに
おけるポリケチドの産生培地は、発酵槽で代表的に使用される安価な成分を含む
。一般的に、選択される条件は、計画依存的である。当業者は、関連する生物学
および分析測定の適切な形態の両方を理解し、従って、反応条件を選択し得る。

【０１０５】一旦、これらの条件が定義付けられると、さらなるサンプルのクリーンアップ
は、しばしば必要とされない。有効なサンプルのクリーンアップは、分析物なら
びにマトリクスの物理化学的性質に依存する。しかし、すべてのサンプルのクリ
ーンアップは、必要に応じて、ＭＳ分析と並行してオフラインシステムにおいて
細胞増殖プレート上で実施される。

【０１０６】いくつかのストラテジーが、必要に応じて、生物学的マトリクスにおける種々
の異なる分析物に適応するために使用される。例えば、アトラジンのような疎水
性部分を有する目的の低分子基質は、細胞の溶解を伴わずにＥ．ｃｏｌｉの細胞
質内に貫入し得る。酢酸アンモニウムのような揮発性緩衝液を使用することは、
非常に単純なクリーンアップを可能にする。１つの局面では、細胞を遠心分離し
、そして緩衝液をその上清に添加する。基質を添加し、そして細胞細片を、並行
様式で濾過して除く。

【０１０７】別の実施形態では、金属イオンを配位することによって、小さな無機イオン分
析物をしばしばマスクする。これらの分析物との酵素反応のための反応緩衝液は
、必要に応じて、イオン種の濃度を最小限に減少させるように選択され、そして
陽イオン交換樹脂によって、残存する陽イオンを取り除く。

【０１０８】別の局面では、オリゴサッカリドが目的の分析物である。オリゴサッカリドは
、混合イオン交換樹脂を用いて、すべてのイオン種を取り除くことによってクリ
ーンアップされる。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞は部分的に溶解され、そしてすべての細胞
細片、ＤＮＡおよびタンパク質の不純物がエタノールで沈殿され、そして濾過に
よって取り除かれる。

【０１０９】別の局面では、目的の産物または反応物は、疎水性分子（例えば、ポリケチド
）である。疎水性分子は、イオン性不純物も取り除く有機溶媒によって、水相か
ら抽出される。

【０１１０】別の局面では、細胞を溶解し、そして目的の酵素または他の成分（例えば、ペ
プチド、核酸など）を、固体支持体（例えば、上記のような酵素リアクター）に
誘引する。酵素は、必要に応じて、固体支持体上の基質によって接触され、次い
で、完了すると反応から取り除かれて、液体クロマトグラフィーのようなさらな
る精製を伴わずに、質量分析法に直接使用されるに十分な純度の産物を生じる。

【０１１１】オフラインサンプル調製の別の例は、９６ウェル並行固相抽出（ＳＰＥ）を含
み、ここでは複数のサンプル（例えば、約９６または約３８４個のサンプル）が
、固相抽出プレート（例えば、９６ウェルプレート（例えば、ＷａｔｅｒｓＣ
ｏｒｐ．ＭｉｌｆｏｒｄＭＡから））上に同時にロードする。例えば、１以上
の緩衝液または溶媒を使用して、所望されない成分をプレートから洗浄する。目
的の成分は、ＳＰＥプレートのカラム内部に保持され、そして必要に応じて、比
較的高い強度の溶媒によって、対応するマイクロウェルプレート（例えば、９６
ウェルプレート）中に溶出される。この様式で調製されたサンプルは、質量分析
計内に注入するに十分に純粋である。

【０１１２】上記のすべての場合において、サンプル調製は、高度に自動化された様式で並
行して９６個のサンプルを処理するために採用され、それによって、スクリーニ
ングが、質量分析計の連続分析の速度に対してのみ速度依存性であることを確実
にした。さらに、増殖条件または産生溶媒に対するこれらの調整は、質量分析計
内への注入のために十分なサンプルの純度を提供する。

【０１１３】（ＶＩ．質量分析法）質量分析法は、多数の種々の異なる低分子代謝物の検出を可能にする一般的な
方法である。イオンスプレー質量分析法およびエレクトロスプレー質量分析法が
、有機化合物の分析および生体高分子の特徴付けについての多くの異なる分野に
おいて使用されている。しかし、これは通常、高速液体クロマトグラフィーまた
はキャピラリーゾーン電気泳動のような分離技術と連結されており、これらの技
術は、質量分析法分析とインラインで行われる。これにより、質量分析法の速度
が減速され、そしてハイスループット方法としてのその使用が限定される。質量
分析法理論および技術の一般的な議論については、例えば、Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍ
ｅｒＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ、第１５巻、第４版、１０７１−１０９４頁およびその文献中のすべての参
考文献を参照のこと。また、ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｆｏｒＢ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＧＳｉｕｚｄａｋ、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓ
ｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ、１９９６；ＥｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙＩｏｎ
ｉｚａｔｉｏｎＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａ
ｌｓ，Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，
Ｒ．Ｃｏｌｅ（編）、ＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ、１９９７；ＭａｓｓＳ
ｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｆｏｒＣｈｅｍｉｓｔｓａｎｄＢｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｓ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅら、ＣａｍｂｒｉｄｇｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
Ｐｒｅｓｓ、１９９６；ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：Ｐｒｉｎｃｉ
ｐｌｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｈｏｆｆｍａｎら、Ｗｉｌｅｙ
ａｎｄＳｏｎｓ、１９９６；ＱｕａｄｒｕｐｏｌｅＭａｓｓＳｐｅｃｔ
ｒｏｍｅｔｒｙａｎｄｉｔｓＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｄａｗｓｏｎ（
編）、ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ、１９９５；およびＡｄｖａｎｃｅｓ
ｉｎＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、Ｋａｒｊａｌａｉｎｅｎら（編）
，ＥｌｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃｅ、１９９８も参照のこと。

【０１１４】エレクトロスプレー法は、ガスクロマトグラフィー手順の代わりに使用される
。なぜなら、事前の誘導体化が、サンプルの注入に必要ではないからである。イ
オンスプレー−イオン化質量分析法およびタンデム質量分析法を伴うフローイン
ジェクション分析方法（ＦＩＡ）は、ハイスループットの質量分析法分析を実施
する本発明の性能をさらに高める。イオンスプレー法によって、サンプルの事前
の誘導体化を伴わないサンプルの注入が可能になり、そしてタンデム質量分析法
（ＭＳ−ＭＳ）によって、この分析において非常に高い有効性が可能になる。従
って、カラム分離を必要としない。

【０１１５】エレクトロスプレーイオン化は、代表的に、事前の誘導体化を伴わずにＧＣ−
ＭＳで検出することが困難である極性分子および高分子の検出を可能にする、非
常に穏やかなイオン化方法である。最新のエレクトロスプレー質量分析計は、フ
ェムトモル量のサンプルを検出する。数マイクロリットルが注入されるので、サ
ンプルは、必要に応じて、ナノモル濃度、アットモル濃度以下で注入される。定
量化は、２％〜５％の範囲の標準誤差を用いて非常に再現可能である。

【０１１６】タンデム質量分析法は、三連四重極ＭＳ内で、前駆イオンのフラグメントイオ
ンへのフラグメント化を使用する。異なる分子量を有する化合物の分離は、前駆
イオンの選択によって第一の四重極で起こる。同定は、第二の四重極における前
駆イオンの衝突誘起解離の後に、フラグメントイオンを単離することによって行
われる。この技術の総説は、Ｋｅｎｎｅｔｈ，Ｌ．ら（１９８８）「Ｔｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆＴａｎｄｅｍＭａｓ
ｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」ＶＣＨｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃにお
いて見出され得る。

【０１１７】三連四重極質量分析計は、サンプルのＭＳ／ＭＳ分析を可能にする。例えば、
エレクトロスプレーおよび大気圧の化学的イオン化源（例えば、Ｆｉｎｎｉｇａ
ｎＴＳＱ７０００）を有する三連四重極質量分析計が、必要に応じて使用さ
れる。この機械は、必要に応じて、ある特定の親イオンが、不活性ガスを用いて
フラグメント化反応を受ける第一の四重極を通ることを可能にするように設定さ
れる。次いで、最も卓越した娘イオンが、第三の四重極において選び出され得る
。この方法は、分析物の同定のための２つのチェックポイントを作成する。粒子
は、親イオンと娘イオンの両方の荷電比に対する正確な分子量を有するはずであ
る。従って、タンデム質量分析法は、より高い特異性を導き、そしてまたしばし
ば、より高いシグナル対ノイズ比を導く。これはまた、同じ質量対荷電比を有す
る不純物から分析物を識別することによる、さらなる分離を導入する。

【０１１８】本発明における使用の他の技術としては、ニュートラルロスおよび親イオンス
キャニングが挙げられるが、これらに限定されない。ニュートラルロスは、衝突
誘起解離（ＣＩＤ）の間に、ニュートラルな分子のフラグメント、すなわち特定
のニュートラルなフラグメントを失うすべての化合物が検出される、質量分析法
スキャニングの方法である。親イオンのモードは、ＣＩＤの間に共通の娘イオン
フラグメントを産生するすべての化合物を検出する。これらの技術は、必要に応
じて、例えば、産物の量および出発物質の量を同時に定量するために使用される
。予期される産物が既知ではない（例えば、標準が利用できない）システムにつ
いては、ニュートラルロスおよび／または親イオン方法は、フラグメント化パタ
ーンに基づいたバックトラッキングまたはデコンヴォルーションを可能にし、出
発物質の構造および／または同一性を決定する。例えば、親の質量は、産生され
た種々のフラグメントに基づいて決定される。これは、本質的に、酵素反応の産
物が、既知ではないが予測可能である場合に、新規の酵素活性を検出するために
有用である。

【０１１９】ニュートラルロス方法において、目的の成分が、第一の四重極（例えば、三連
の四重極分光計において、特定の質量範囲において、一つずつ第一の四重極をス
キャニングすることによって）を通過することが可能である。この成分（例えば
、イオン）が、ＣＩＤによって第二の質量フィルタにおいてフラグメント化され
る。特定のニュートラルフラグメントがＣＩＤプロセスの間に親イオンから失わ
れる場合、娘イオンが形成され、この娘イオンは、親イオンの質量からニュート
ラルな分子の質量を差し引いた質量に等しい質量を有する。娘イオンは、第三の
フィルタを通過し、そして検出される。このような方法で、第二の四重極におけ
るＣＩＤプロセスの間に、ニュートラルなフラグメント（例えば、定常ニュート
ラルフラグメント（Ｎ₀））を失う任意のイオンまたは成分が、必要に応じて、
同時に、質量Ｎ₀に等しい質量オフセットを有する第一の四重極および第三の四
重極をスキャニングすることによって検出される。

【０１２０】親イオン方法において、目的のイオンまたは成分が、第一の四重極を一つずつ
通過することが可能である。これらのイオンは、ＣＩＤによって、第二の質量フ
ィルタにおいてフラグメント化される。次いで、第三の四重極が、特定のイオン
のみが通過するように設定される。従って、第二の四重極において設定されるよ
うな特定のフラグメントイオンを産生するすべての成分（例えば、産物または反
応物）が、この特定のイオン上の第三の四重極質量フィルタを設定しながら、目
的の範囲において第一の四重極質量フィルタをスキャニングすることによって検
出される。

【０１２１】分析速度は、サンプルの注入のために使用される自動サンプラー（例えば、Ｃ
ＴＣＡｎａｌｙｔｉｃｓ、Ｇｉｌｓｏｎ，Ｉｎｃ．Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，Ｗｉ
ｓｃｏｎｓｉｎ）の運動性移動によってのみ制限される。この速度は、例えば、
必要に応じて、注入針の洗浄を伴わずに３０秒、そして注入針の洗浄を伴って４
０秒に設定される。このようなサンプリング速度は、自動化された一晩の運転が
使用される場合、ＭＳによって、１日あたり２８８０のサンプルの分析を可能に
する。従って、サンプルの９６ウエルマイクロタイタープレート全体が、１時間
未満で運転される。好ましくは、自動サンプラーの速度は、１サンプルあたり約
１５秒で設定され、１日で約５０００のサンプルがスクリーニング、すなわち、
１時間あたり約２００のサンプルのスクリーニングが可能になる。自動サンプラ
ーの会社は、現在、洗浄を含めて１０分での１つのプレートに対するスループッ
トを増大するように動いており、次いで、１日で約８５００ＭＳサンプルを運転
することが可能になる。

【０１２２】目的のサンプルの上記の質量分析法システムおよびオフライン精製を用いる、
機械へのサンプル導入は、代表的には、最大の律速工程である。本発明は、より
速いサンプル精製工程を提供することによって、質量分析法を伴う使用のための
ハイスループットスクリーニング方法を提供する。

【０１２３】スクリーニング速度は、必要に応じて、プーリングストラテジー（例えば、ニ
ュートラルロスを用いる上記の親イオンスクリーニング方法）の使用によって、
自動サンプラーのスクリーニング速度を超えて増大される。複数のサンプル（例
えば、類似のサンプルまたは関連したサンプル）が、必要に応じて、互いにプー
ルされるか混合され、そして１つのサンプルとして質量分析計に注入される。次
いで、このデータがデコンヴォルーションされ、各々のプールされたサンプルに
ついての同定または分析を提供する。例えば、５つの異なる基質が、酵素と反応
され、そして結果がプールされる。５つの異なる基質は、産物として、５つの関
連した化合物または類似の化合物を産生し得る。この産物は、プールされ、そし
て分析される。次いで、ニュートラルロス分析が、必要に応じて、プールされた
サンプルについて行われる。例えば、特定のニュートラルフラグメントが、すべ
てのサンプル（例えば、第二の四重極において）から取り除かれ、次いで、各々
の個々のサンプルについての結果を提供するために、第一の四重極において検出
されるような親イオンを測定するようにデータがデコンヴォルーションされる。

【０１２４】約２〜約１０００サンプルが、必要に応じてプールされ、従って、例えば、１
５秒おきに１回の注入で１時間あたり約４００サンプルから１時間あたり約２４
０，０００サンプルへ、スループットを増大する。自動サンプラーの速度が、１
５秒おきに１回の注入を超えて増大される場合、さらにより速いスクリーニング
速度が得られる。必要に応じて、より多くのサンプルがプールされ、より速いス
クリーニング速度を提供する。代表的には、約５〜約５００サンプルがプールさ
れる。より代表的には、約５〜約１００サンプルがプールされるか、または約１
０〜約２０サンプルがプールされる。注入ＭＳ速度あたり１５秒で、各々１００
サンプルを含むプールについてのスクリーニング速度は、１時間あたり約２４，
０００サンプルまたは１日あたり約５７６，０００サンプルである。代表的には
、少なくとも約５００サンプル（例えば、細胞コロニーまたはライブラリーメン
バー）、少なくとも約１０００サンプル、少なくとも約５０００サンプル、少な
くとも約１０，０００サンプル、少なくとも約２５，０００サンプル、または少
なくとも約１００，０００サンプルがスクリーニングされる（例えば、１時間未
満で、１つ以上の成分（例えば、カラムで分離されない成分）の存在、非存在ま
たは活性について）。換言すれば、少なくとも約１０００サンプル、少なくとも
約２５，０００サンプル、少なくとも約１００，０００サンプル、または少なく
とも約５００，０００サンプル以上が、約１日でスクリーニングされる。

【０１２５】（ＶＩＩ．キット）本明細書中で記載されるシステムは、必要に応じて、オフラインの並行精製シ
ステムを使用して、ハイスループットの質量分析法の好ましい機能を実施するた
めに必要な試薬のすべてはなくても多くを含むようにパッケージされる。このよ
うなキットはまた、代表的には、デバイスおよび試薬を使用するための適切な容
器および使用説明書を含み、そして試薬が、デバイス自体で前もって処理されな
い場合、試薬を細胞増殖プレートまたはデバイスの質量分析計に導入するための
適切な使用説明書を有する。このようなキットは、代表的には、ウエル中で前も
って処理されるか、または別々にパッケージされる必要な試薬を有する細胞増殖
プレートを含む。一般的には、このような試薬は、長期の保存の間の分解または
他のロス（例えば、漏出からの）を防ぐために、安定な形態で提供される。多く
の安定化プロセスは、保存されるべき試薬（例えば、化学安定剤（すなわち、酵
素インヒビター、ミクロシド／静菌薬、抗凝固剤）、物質の物理的安定化（例え
ば、固体支持体上での固定化、マトリックス（すなわち、ゲル）中での捕捉、凍
結乾燥などを通じて）を含む）について、広範に使用される。

【０１２６】上記の議論は、一般的には、上記の本発明の局面および実施形態に適用可能で
ある。さらに、特許請求の範囲のような本発明の趣旨および範囲から逸脱するこ
となく、本明細書中で記載される方法および装置に対する改変がなされ得、そし
て本発明は、以下を含む多くの異なる使用のために与えられ得る。

【０１２７】酵素反応経路のハイスループットスクリーニングを行うための、質量分析法シ
ステムの使用。

【０１２８】酵素反応の反応物および／または産物のハイスループットスクリーニングを行
うための、本明細書中で記載されるような質量分析法システムの使用。

【０１２９】核酸ライブラリーのハイスループットスクリーニングを行うための、本明細書
中で記載されるような質量分析法システムの使用。

【０１３０】ハイスループット質量分析法スクリーニングを行うための、本明細書中に記載
されるようなオフラインの並行精製の使用。

【０１３１】酵素反応経路のハイスループット質量分析法スクリーニングを行うための、本
明細書中に記載されるようなオフラインの並行精製の使用。

【０１３２】本明細書中に記載される質量分析法システムの使用を利用するアッセイ。

【０１３３】（実施例）以下の実施例は、例示の目的のみで提供され、そして限定を目的とせずに提供
される。当業者は、本質的に類似の結果を得るために、変化され得るかまたは改
変され得る種々の重大ではないパラメータを容易に認識する。

【０１３４】（実施例１：ＨＴＰ−ＭＳ−−アトラジン産生）アトラジンは、トリアジン由来の除草剤のファミリーのメンバーである。この
広範に使用される除草剤で汚染された部位由来の細菌（アトラジンを代謝し得、
そして分解し得る）が単離された。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ株が、ａｔｚＡ（ア
トラジンのヒドロキシアトラジンへの形質転換を触媒する４７３アミノ酸のタン
パク質であり、アトラジンの分解経路における第一工程）をコードする遺伝子を
含むことが見出された（ＤｅＳｏｕｚａ，Ｍ．，Ｓａｄｏｗｓｋｙ，Ｍ．Ｊ．
およびＷａｃｋｅｔｔ，Ｌ．Ｐ．：ＡｔｒａｚｉｎｅＣｈｌｏｒｏｈｙｄｒｏ
ｌａｓｅｆｒｏｍＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．ＳｔｒａｉｎＡＤＰ：
ＧｅｎｅＳｅｑｕｅｎｃｅ，ＥｎｚｙｍｅＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎ
ｄＰｒｏｔｅｉｎＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ．１７８：４８９４−４９００（１９９６）もまた参照のこと）（図１もま
た参照のこと）。

【０１３５】Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ株ｓｐ．ＡＤＰによるアトラジンの生化学的分解は、
汚染された部位を浄化する環境的に安全な様式である。経済的に競合するために
、ａｔｚＡ遺伝子の野生型活性の増大が望ましかった。このａｔｚＡ遺伝子は、
ｌａｃプロモーターの制御下で、ｐＵＣ由来のベクターにクローニングされ、そ
してこのベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉＴＧ１に形質転換された。この遺伝子の発
現は、グルコースの存在下で抑制され、そしてイソプロピルチオガラクトース（
ＩＰＴＧ）で誘導された。プラスミドもまた、カナマイシン耐性についての遺伝
子を含んだ。

【０１３６】（ライブラリー構築および細胞増殖）ａｔｚＡ遺伝子が混合され、そして最初のライブラリーが、カナマイシン／２
％グルコースプレート上に置かれた。ロボットコロニーピッカー（ｒｏｂｏｔ
ｉｃｃｏｌｏｎｙｐｉｃｋｅｒ）（Ｑ−ｂｏｔ，Ｇｅｎｅｔｉｘ）が、すべ
てのコロニーを、１ウエルあたりカナマイシンおよび２％グルコースを添加し
た２ＸＹＴ（１００μＬ）培地を含む９６ウエルのマイクロタイタープレートに
運んだ。細胞を、３７℃で一晩、マイクロタイタープレートのために特別に設計
された振盪機（Ｋｕｅｈｎｅｒ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中で増殖させた。飽
和状態の培養物を、発現を開始するために、カナマイシンおよびＩＰＴＧを添加
した２ＸＹＴ（１００μＬ）で２０倍に希釈し、そして３７℃で一晩再び増殖さ
せた。

【０１３７】（アトラジン分解）細胞を、遠心分離によって収集し、そして１００μＬの酢酸アンモニウム（１
０ｍＭ、ｐＨ７）中で再懸濁した。５μＬの再懸濁された細胞を、アトラジン（
１００μＭ）および酢酸アンモニウム（１０ｍＭ、ｐＨ７）を添加した１００μ
Ｌの反応緩衝液を含む反応ウエルに移した。この反応を、一定の振盪下において
室温で６時間進行させた。この反応を、等量のメタノール（１００μＬ）の添加
によってクエンチした。反応混合物全体を、フィルタープレート上に移し、そし
て任意の固体細胞片および沈殿物を、濾過によって取り除いた。このサンプルを
、フローインジェクションによってエレクトロスプレー質量分析計に直接注入し
、そしてタンデム質量分析法によって分析した。

【０１３８】（ＭＳ／ＭＳ方法の開発）アセトニトリル中の１ｍＭアトラジン溶液を調製し、そして三連四重極質量
分析計（ＦｉｎｎｉｇａｎＴＳＱ７０００）でのＭＳ／ＭＳ方法を開発する
ために使用した。移動相は、アセトニトリルであった。衝突エネルギーを、−２
０ｅＶに設定した。

【０１３９】ｍ／ｚ＝２１６（親イオン）のｍ／ｚ＝１７４（娘イオン）への遷移をモニタ
ーした（図２、パネルＡおよびＢを参照のこと）。

【０１４０】（ＭＳ／ＭＳ分析）図３は、代表的な９６サンプルのプレートの結果を示す。各々の列は、８つの
カラムを横切って再生される種々の変異を有する１２の異なる反応条件を含む。
周期的なパターンの１２のピークが、明らかに認識できる。細菌性細胞増殖、反
応およびサンプルの精密検査が、上記のような並行様式で行われた。

【０１４１】（物質）酢酸アンモニウム、グルコースおよびＩＰＴＧならびにカナマイシンを、Ｓｉ
ｇｍａから購入した。２ＸＹＴ培地を、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃ
ｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．：ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉ
ｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨ
ａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ１９８９に従って調製した。
細胞増殖のためのマイクロタイタープレートは、Ｎｕｎｃの滅菌した平底の浅い
ウエルプレートであった。反応を、９６ウエルのＣｏｓｔａｒポリスチレンのＶ
底プレートにおいて行った。フィルタープレートは、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＨＶ
０．４５μｍＤｕｒａｐｏｒｅであった。

【０１４２】（実施例２：質量分析法を使用する酵素および経路の指向性進化についてのハ
イスループットスクリーニング）酵素反応のハイスループット化学スクリーニングは、基質および産物の定量的
検出を含む。現在までの最も汎用性の検出方法は、質量分析法であり、これは、
例えば、電荷に対する質量の比に基づいて、特定の有機分子の同定を可能にする
。エレクトロスプレーイオン化は、荷電極性有機分子をガス相に移動させる穏や
かな方法であり、そしてほとんどの生物学的に関連のある有機分子に適用可能で
ある。

【０１４３】ＤＮＡシャッフリング技術を使用して、化学反応を触媒する酵素をコードする
関連する遺伝子配列のライブラリーを作製する。関連する遺伝子配列のライブラ
リーは、例えば、細菌に形質転換されるプラスミド上にある。代表的に、単一の
細菌クローンは、特定の酵素または酵素経路の固有の改変体を提示する固有の遺
伝子配列を保有するが、多くの他のシャッフリング形式もまた、適合する。

【０１４４】図４は、単一の細菌コロニーから、質量分析法によって酵素反応をモニターす
るために代表的に使用される工程を記載する。

【０１４５】（Ａ：９６ウェル形式または３８４ウェル形式における単一コロニーの選択（
ｐｉｃｋｉｎｇ）および増殖）単一コロニーを、Ｇｅｎｅｔｉｘ製のＱ−ｂｏｔを使用して、形質転換プレー
トから、適切な増殖培地を含む３８４または９６ウェルマイクロタイタープレー
トへ直接的に選択する。Ｑ−ｂｏｔの最大速度は、１時間あたり約４０００コロ
ニーである。マイクロタイタープレートを、細胞増殖のために特別なプレート振
盪器中でインキュベートする。

【０１４６】（Ｂ．全細胞、細胞溶解物または精製酵素を使用する産物の産生）各単一コロニーを、単一のマイクロタイターウェル中で均一に増殖させ、次い
で、産物形成を開始させるために、いくつかの異なる方法で処理した。酵素発現
を、細胞増殖の間に意図的に抑制する場合（これは、時折所望される）、サプレ
ッサー分子の除去またはアクチベーター分子の添加によって、発現を誘導し得る
。

【０１４７】活性酵素を含む細胞を、溶解するか、または透過剤で処理して、大量および／
または強力なイオン性基質が細胞壁を透過するのを可能にする。これは、Ｅ．ｃ
ｏｌｉのようなグラム陰性細菌に特に有用である。いくつかの酵素は、培地中に
分泌され（すなわち、ｂａｃｉｌｌｕｓのようなグラム陽性細菌において適切な
シグナル配列と共に発現される場合）、この場合では、さらなる処理が必要とさ
れない。

【０１４８】いくつかの場合、目的の酵素を、精製樹脂上で精製し、そして基質を、その精
製タンパク質に添加する。このタンパク質精製工程は、以下に示されるサンプル
調製工程を排除する（例えば、Ｃを参照のこと）。しかし、タンパク質精製方法
は、代表的には、単一の酵素進化について使用され、そして経路進化については
さほど使用されない。

【０１４９】産物形成の開始もまた、細菌培養物を異なる培地に接種することによって達成
され得る。上記の場合において、産物形成の開始は、例えば、９６ウェル形式ま
たは３８４ウェル形式において、マイクロタイタープレート上で並行様式で行わ
れる。

【０１５０】（Ｃ：生物学的基質由来の分析物のオフライン（ｏｆｆ−ｌｉｎｅ）並行精製
）質量分析計における分析物の定量的検出に影響を与える、少なくとも２つの因
子が存在する。シグナルは、基質中の不純物によって抑制またはマスクされ得る
。また、質量分析計は、高感度な装置であり、代表的には、粗サンプルを扱うよ
うには設計されていない。基質中の強イオン性の緩衝液および高分子（ＤＮＡま
たはタンパク質のような）は、シグナルの減少およびいくつかの場合において機
械の目詰まりを引き起こし得る。従って、サンプルの清浄化が、しばしば、有益
である。

【０１５１】伝統的に、粗サンプルは、それらを機械に導入する前に、液相クロマトグラフ
ィーカラム上で清浄化した。質量分析計に接続された液体クロマトグラフィー（
ＬＣ／ＭＳ）は、粗サンプルを清浄化するための有用である。しかし、各カラム
動作は、時間消費的であり、サンプル分析の速度を制限する。フローインジェン
クション分析（ＦＩＡ）は、代表的に、オートサンプラーの速度に依存する速さ
であり、現在の形式では、１回の注入あたり約３０秒〜約４０秒の範囲であり、
そしてオートサンプラーのより新しいモデルが製造されるにつれ、より速くなっ
ている。

【０１５２】ＦＩＡのためのサンプル調製は、細胞との反応から質量分析計への導入までの
工程を考慮する。１つの因子としては、スクリーニングの質を損なうことなくＭ
Ｓの適合性に適応するように、産物形成のための反応条件を調整することである
。反応条件は、代表的に、スクリーニングが有意なものであることを確実にする
ために、これらの酵素が使用される標的環境条件に可能な限り近い。これらの条
件は、プロジェクト依存的である。一旦条件を規定すると、さらなるサンプル清
浄化が、しばしば、有益である。効果的なサンプル清浄化は、分析物および基質
の物理化学的性質に依存性である。

【０１５３】いくつかのストラテジーを使用して、種々の生物学的基質における種々の異な
る分析物に適応させる。２、３のこれらのストラテジーを、以下に提供する。

【０１５４】実施例１に上記されるように、アトラジンのような疎水性部分を有する低分子
基質は、溶解を伴わずにＥ．ｃｏｌｉ細胞質内に浸透する。揮発性緩衝液（例え
ば、酢酸アンモニウム）を使用することによって、非常に単純な清浄化が可能に
なった。基質を添加し、そして細胞細片を並行様式で濾過除去した。

【０１５５】小さい無機イオン分析物は、しばしば、金属イオンを配位させることによって
マスクした。反応緩衝液を、イオン性種の濃度を最少に減少するように選択し、
そして残存するカチオンをカチオン交換樹脂によって除去した。

【０１５６】オリゴサッカリド分析物は、混合イオン交換樹脂を使用して、全てのイオン性
種を除去することによって清浄化した。細胞（Ｅ．ｃｏｌｉ）を部分的に溶解し
たので、細胞細片、ＤＮＡおよびタンパク質の不純物を、エタノールで沈殿し、
濾過によって除去した。

【０１５７】ポリケチドのような疎水性分子は、有機溶媒（これはまた、全てのイオン性不
純物を除去するための効果的な方法であった）によって水相から抽出した。

【０１５８】サンプル調製は、９６サンプルを高度に自動化された様式で並行して処理する
ように適合し、これによって、スクリーニング速度を、質量分析計における引き
続く分析の速度にのみ依存することを確実にする。

【０１５９】（Ｄ：エレクトロスプレータンデム質量分析計上でのフローインジェクション
分析）３連四重極質量分析計は、サンプルのＭＳ／ＭＳ分析を可能にする。この機械
は、１つの特定の親イオンを第１の四重極に通して、不活性ガスでの分裂反応を
受けるように設定され得る。次いで、最も顕著な娘イオンが、第３の四重極に標
的され得る。この方法は、分析物同定のための２つのチェックポイントを生じる
。検出される粒子は、親イオンおよび娘イオンの両方について、電荷に対する正
確な分子量の比を有する。従って、タンデム質量分析法は、より高い特異性を導
き、そしてまた、しばしば、高いシグナル：ノイズ比を導く。これはまた、分析
物と同じ電荷に対する質量の比を有する不純物とを区別することによる、さらな
る分離を導入した。

【０１６０】タンデム質量分析法を使用するオフライン精製されたサンプルのフローインジ
ェンクション分析は、１時間未満に約１００以上のサンプルのサンプル分析を可
能にした。スループットの制限は、他の検出方法の並行分析（すなわち、ＵＶ／
ＶＩＳ分光計）とは対照的に、質量分析計の引き続く分析の性質によって設定さ
れる。機械へのサンプル導入は、速度制限性の工程であった。

【０１６１】前述の発明は、理解の明確さの目的のための例示および実施例によって、いく
らか詳細に記載されているが、特定の変化および改変が、添付の特許請求の範囲
の精神および範囲を逸脱することなく、本発明に対してなされ得ることが、本発
明の教示を考慮して当業者に容易に明らかである。本明細書中に引用される全て
の特許、特許出願および刊行物は、全ての目的のためにそれらの全体が参考とし
て援用される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ａｔｚＡによるアトラジンのヒドロキシアトラジンへの酵素的転換を
示す。

【図２Ａ】図２Ａのパネルは、アトラジンのＭＳ／ＭＳプロットを示す。

【図２Ｂ】図２Ｂのパネルは、アトラジンのＭＳ／ＭＳプロットを示す。

【図３】図３は、相対的な量対時間を示すグラフである。

【図４】図４は、本発明の典型的なハイスループット法の概略図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 27/62 Ｇ０１Ｎ 33/483 Ｅ４Ｂ０６５ 33/483 37/00 １０３ 37/00 １０３Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (31)優先権主張番号０９／５０２，２８３ (32)優先日平成12年２月11日(2000．2．11) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者クレバー，クラウスアメリカ合衆国カリフォルニア 94043，マウンテンビュー，ロックストリートナンバー１ 1935 (72)発明者ステマー，ウィレムピー．シー．アメリカ合衆国カリフォルニア 95030，ロスガトス，キャシーコート 108 (72)発明者ミンシュル，ジェレミーアメリカ合衆国カリフォルニア 94025，メンローパーク，ハーモサウェイ 842 Ｆターム(参考） 2G045 AA24 AA28 CB01 CB21 DA12 DA13 DA36 FA40 4B024 AA11 GA16 HA11 4B029 AA07 BB02 CC03 FA01 FA13 4B050 CC03 DD02 LL03 4B063 QA18 QQ06 QQ13 QQ15 QQ30 QS02 QS12 QS14 QS39 QX10 4B065 AA26 AB01 AC20 BA02 BA24 BB14 CA31 CA46 CA56

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ハイスループット質量分析法によるスクリーニングを実行す
る方法であって、該方法は、以下：（ｉ）１以上の細胞を増殖する工程；（ｉｉ)該１以上の細胞からカラムで分離されない１以上の成分を精製する工
程であって、該精製工程が、細胞増殖条件のオフライン並行調整を包含する、精
製工程；および（ｉｉｉ）エレクトロスプレータンデム質量分析法を用いてフローインジェク
ション分析を実行する工程であって、該工程によって、質量電荷比のデータを得
、そして該カラムで分離されない１以上の成分の、ハイスループット質量分析法
によるスクリーニングを提供する、工程、を包含する、方法。
【請求項２】前記工程（ｉ）が、前記工程（ｉｉ）と同時に起こる、請求
項１に記載の方法。
【請求項３】少なくとも約１００の細胞のコロニーが、１時間未満で、前
記カラムで分離されない１以上の成分の存在または活性についてスクリーニング
される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】少なくとも約２００の細胞のコロニーが、１時間未満で、前
記カラムで分離されない１以上の成分の存在または活性についてスクリーニング
される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】請求項１に記載の方法であって、ここで、少なくとも約５０
０の細胞のコロニー、少なくとも約１０００の細胞のコロニー、少なくとも約５
０００の細胞のコロニー、少なくとも約１０，０００の細胞のコロニー、少なく
とも約２５，０００の細胞のコロニー、または少なくとも約１００，０００の細
胞のコロニーが、１時間未満で、前記カラムで分離されない１以上の成分の存在
または活性についてスクリーニングされる、方法。
【請求項６】請求項１に記載の方法であって、ここで、少なくとも約２０
０の細胞のコロニー、少なくとも約１０００の細胞のコロニー、少なくとも約２
５，０００の細胞のコロニー、少なくとも約１００，０００の細胞のコロニー、
少なくとも約５００，０００の細胞のコロニーまたはこれらより多くの細胞のコ
ロニーが、約１日で、前記カラムで分離されない１以上の成分の存在または活性
についてスクリーニングされる、方法。
【請求項７】複数の細胞のコロニーに対してフローインジェクション分析
を同時に実行する工程を包含する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】前記複数の細胞のコロニーが約２〜約１０００の細胞のコロ
ニーを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】前記複数の細胞のコロニーが約５〜約５００の細胞のコロニ
ーを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】前記複数の細胞のコロニーが約５〜約１００の細胞のコロ
ニーを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】前記複数の細胞のコロニーが約５〜約２０の細胞のコロニ
ーを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】カラムで分離されない１以上の成分を精製する前記工程が
、揮発性緩衝液、イオン種の濃度を減少させる緩衝液、イオン交換樹脂、または
有機溶媒中で前記工程（ｉｉ）を実行する工程を包含する、請求項１に記載の方
法。
【請求項１３】前記カラムで分離されない成分が、全細胞、細胞溶解物、
細胞上清から産生されるか、または精製された細胞酵素の添加された基質との反
応から産生される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】請求項１に記載の方法であって、ここで、前記カラムで分
離されない１以上の成分が、タンパク質、タンパク質結合分子、炭水化物、炭水
化物結合分子、酵素触媒反応の産物、核酸および核酸触媒反応の産物から選択さ
れる、方法。
【請求項１５】前記カラムで分離されない１以上の成分が、酵素、酵素基
質および酵素産物から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】前記カラムで分離されない１以上の成分が、１以上の疎水
性部位を有する基質、無機イオン、オリゴ糖、疎水性分子、アトラジン、および
ポリケチドから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】前記カラムで分離されない１以上の成分を精製する工程が
、該カラムで分離されない１以上の成分を固体支持体に付着させる工程を包含す
る、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】前記固体支持体が、１以上の磁性ビーズ、１以上のアガロ
ースビーズ、１以上のポリスチレンビーズ、１以上のピン、マイクロウェルプレ
ートまたは膜を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】前記カラムで分離されない１以上の成分が、酵素のライブ
ラリを含み、該酵素の各々が、タグ部分を含み、ここで、前記固体支持体が、タ
グ結合部分を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】前記タグ部分が、ビオチン、アビジンまたはストレプトア
ビジンを含み、そして前記タグ結合部分が、ビオチン、アビジンまたはストレプ
トアビジンを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】請求項１９に記載の方法であって、１以上の産物を産生す
るために、前記酵素のライブラリを１以上の酵素基質に接触させる工程をさらに
包含し、ここで、フローインジェクション分析を実行する工程が、該１以上の産
物に関してフローインジェクション分析を実行する工程を包含する、方法。
【請求項２２】請求項１に記載の方法であって、前記カラムで分離されな
い１以上の成分が、１以上の酵素基質および酵素反応の１以上の産物を含み、該
方法が、該酵素反応の１以上の産物および１以上の酵素基質の量を同時に定量す
る工程をさらに包含する、方法。
【請求項２３】エレクトロスプレータンデム質量分析法を用いて、フロー
インジェクション分析を実行する工程が、１以上のニュートラルロス質量分析法
および親イオン質量分析法を実行する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】３連四重極質量分析計で前記ニュートラルロス質量分析法
および前記親イオン質量分析法を実行する工程を包含する、請求項２３に記載の
方法。
【請求項２５】請求項２４に記載の方法であって、ここで、前記ニュート
ラルロス質量分析法を実行する工程が、以下：（ａ）特定の質量範囲で第１の四重極において前記カラムで分離されない１以
上の成分を走査する工程；（ｂ）衝突誘起解離によって、第２の四重極において前記カラムで分離されな
い１以上の成分を断片化する工程であって、これにより、１以上の中性フラグメ
ントおよび１以上の娘イオンを産生する工程；および（ｃ）１以上の該娘イオンを検出する工程、を包含する、方法。
【請求項２６】請求項２４に記載の方法であって、ここで、前記親イオン
質量分析法を実行する工程が、以下：（ａ）第１の四重極において前記カラムで分離されない１以上の成分を走査す
る工程；（ｂ）衝突誘起解離によって、第２の四重極において、該カラムで分離されな
い１以上の成分を断片化する工程；および（ｃ）特定の質量で第３の四重極を走査する工程、を包含する、方法。
【請求項２７】ハイスループット質量分析法によって、１以上の産物また
は反応物をモニターするための方法であって、該方法が、以下：（ｉ）関連する遺伝子配列のライブラリの１以上のメンバーを含むプラスミド
を用いて形質転換された細胞を提供する工程；（ｉｉ）該細胞から細胞のコロニーまたは培養物を増殖させる工程；（ｉｉｉ）生物学的マトリックス中の前記細胞のコロニーまたは培養物由来の
該１以上の産物または反応物を産生する工程であって、これによりカラムで分離
されないサンプルを産生する、工程；（ｉｖ）該生物学的マトリックスから該カラムで分離されないサンプルを精製
する工程であって、該精製する工程が、該カラムで分離されないサンプルを産生
するために使用される該生物学的マトリックスのオフライン並行調整を含む、工
程；および（ｖ）エレクトロスプレータンデム質量分析法を用いるフローインジェクショ
ン分析によって該カラムで分離されないサンプルをモニターする工程であって、
それによって、該１以上の産物または反応物をモニターする、工程、を包含する、方法。
【請求項２８】前記産物または反応物が、タンパク質、タンパク質反応の
産物、核酸、および核酸触媒反応の産物から選択される、請求項２７に記載の方
法。
【請求項２９】前記産物または反応物が、酵素および酵素触媒反応の産物
から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】前記工程（ｉｉｉ）が、前記工程（ｉｖ）と同時に起こる
、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】前記精製工程が、前記カラムで分離されないサンプルが産
生される生物学的マトリックスを変更するかまたは緩衝液を添加する工程を包含
し、該工程によって、該サンプルの分析のために質量分析計に直接注入され得る
サンプルを産生する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】請求項２７に記載の方法であって、ここで、少なくとも約
２００のライブラリメンバー、少なくとも約１０００のライブラリメンバー、少
なくとも約５０００のライブラリメンバー、少なくとも約１０，０００のライブ
ラリメンバー、少なくとも約２５，０００のライブラリメンバー、または少なく
とも約１００，０００のライブラリメンバーが、約１時間未満で産物または反応
物の存在または非存在についてスクリーニングされる、方法。
【請求項３３】請求項２７に記載の方法であって、ここで、少なくとも約
２００のライブラリメンバー、少なくとも約１０００のライブラリメンバー、少
なくとも約２５，０００のライブラリメンバー、少なくとも約１００，０００の
ライブラリメンバー、少なくとも約５００，０００のライブラリメンバー、また
は少なくとも約１，０００，０００以上のサンプルが、約１日で産物または反応
物の存在または非存在についてスクリーニングされる、方法。
【請求項３４】前記反応が、酵素反応である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】前記遺伝子配列が、酵素をコードする、請求項２７に記載
の方法。
【請求項３６】前記１以上の産物または反応物が、酵素基質および酵素反
応の産物を含む、請求項３５に記載の方法であって、該方法が、該酵素基質の量
および該酵素反応の産物の量を定量する工程をさらに包含する、方法。
【請求項３７】前記細胞が、細菌である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】前記精製工程が、環境的細胞条件を実質的に模倣する反応
条件において起こる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３９】前記精製工程が、揮発性緩衝液、イオン種の濃度を減少さ
せる緩衝液、イオン交換樹脂、または有機溶媒中で前記工程（ｉｖ）を実行する
工程を包含する、請求項２７に記載の方法。
【請求項４０】請求項２７に記載の方法であって、ここで、前記カラムで
分離されないサンプルが、全細胞、細胞溶解物、細胞上清、または少なくとも１
つの精製された細胞酵素と少なくとも１つの該細胞酵素に対する少なくとも１つ
の基質との反応を用いて産生される、方法。
【請求項４１】前記カラムで分離されないサンプルが、１以上の疎水性部
位、無機イオン、オリゴ糖、疎水性分子、アトラジン、脂質分子、および二次性
代謝物を有する基質から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項４２】前記二次性代謝物が、ポリケチドである、請求項４１に記
載の方法。
【請求項４３】請求項２７に記載の方法であって、前記工程（ｖ）が、ニ
ュートラルロス／親イオン質量分析法を実行する工程を包含し、該工程によって
、１以上の産物または反応物の量を定量する、方法。
【請求項４４】ハイスループット質量分析法によるスクリーニングのため
の装置であって、該装置が、以下：（ｉ）細胞サンプルを増殖させかつ１以上の酵素、酵素基質、および酵素産物
を反応させるための細胞増殖プレート；（ｉｉ）該サンプルを精製するための、該細胞増殖プレートに結合されるかま
たはこれの中にあるオフライン並行精製システム；（ｉｉｉ）該オフライン並行精製システムに操作可能に結合される自動サンプ
ラー；ならびに（ｉｖ）該自動サンプラーに操作可能に結合される質量分析計であって、該自
動サンプラーが、注入および分析のために、該オフライン並行精製システムから
のサンプルを該質量分析計に輸送するサンプルハンドラーを備える、質量分析計
、を備える、装置。
【請求項４５】前記自動サンプラーが、約１時間で少なくとも約１００サ
ンプルを輸送する、請求項４４に記載の装置。
【請求項４６】前記自動サンプラーが、約１時間で少なくとも約２００サ
ンプルを輸送する、請求項４４に記載の装置。
【請求項４７】前記自動サンプラーが、２つ以上のサンプルを組合せ、そ
して該２つ以上のサンプルを前記質量分析計に同時に注入する、請求項４４に記
載の装置。
【請求項４８】前記質量分析計が、少なくとも約２００サンプル、少なく
とも約１０００サンプル、少なくとも約５０００サンプル、少なくとも約１００
００サンプル、少なくとも約２５，０００サンプル、または少なくとも約１００
，０００サンプルを約１時間でスクリーニングする、請求項４７に記載の装置。
【請求項４９】前記質量分析計が、少なくとも約２００サンプル、少なく
とも約１０００サンプル、少なくとも約２５０００サンプル、少なくとも約１０
０，０００サンプル、少なくとも約５００，０００サンプル、または少なくとも
約１，０００，０００サンプルを約１日でスクリーニングする、請求項４７に記
載の装置。
【請求項５０】前記スクリーニングの速度が、前記自動サンプラーがオフ
ライン精製システムと前記質量分析計との間でサンプルを輸送する最大速度によ
って、決定される、請求項４４に記載の装置。
【請求項５１】前記オフライン精製システムが、揮発性緩衝液、イオン種
の濃度を減少させる緩衝液、イオン交換樹脂または有機溶媒を含む、請求項４４
に記載の装置。
【請求項５２】前記オフライン精製システムが、成分反応装置を備える、
請求項４４に記載の装置。
【請求項５３】前記成分反応装置が、酵素反応装置を備える、請求項５２
の装置。
【請求項５４】前記酵素反応装置が、１以上の成分を固定化するための固
体支持体を備える、請求項５２に記載の装置。
【請求項５５】前記１以上の成分が、１以上の酵素、タンパク質、核酸、
炭水化物、脂質、糖、オリゴ糖、ペプチド、ポリヌクレオチド、小有機分子、ま
たは二次性代謝物を含む、請求項５４に記載の装置。
【請求項５６】前記固体支持体が、１以上の磁性ビーズ、１以上のアガロ
ースビーズ、１以上のポリスチレンビーズ、１以上のピン、または膜を含む、請
求項５４に記載の装置。
【請求項５７】請求項４４に記載の装置であって、ここで、前記細胞増殖
プレートが、タンパク質または酵素をコードする、関連する遺伝子のライブラリ
を含み、ここで、各遺伝子が、特定のタグ部位を含む、装置。
【請求項５８】前記オフライン並行精製システムが、前記細胞増殖プレー
ト内にあり、そして固体支持体を備え、該固体支持体が、タグ結合部分を含み、
該タグ結合部分が、特定のタグに結合する、請求項５７に記載の装置。
【請求項５９】前記自動サンプラーが、前記細胞増殖プレートから前記固
体支持体を取り除く、請求項５８に記載の装置。
【請求項６０】前記質量分析計が、エレクトロスプレータンデム質量分析
計である、請求項４４に記載の装置。
【請求項６１】前記質量分析計が、三連四重極質量分析計である、請求項
４４に記載の装置。
【請求項６２】前記質量分析計からのデータを記録および分析するために
前記装置に操作可能に結合されたコンピューターおよびソフトウェアをさらに含
む、請求項４４に記載の装置。
【請求項６３】前記コンピューターが、前記自動サンプラーを制御するた
めのソフトウェアをさらに備える、請求項６２に記載の装置。
【請求項６４】複数の成分を分析するための方法であって、該方法が、以
下：（ｉ）複数の成分を提供する工程であって、該成分が、タグ化成分を含む、工
程；（ｉｉ）該タグ化成分を固体支持体上のタグ結合部分に結合させる工程；（ｉｉｉ）該タグ化成分を反応混合物中の１以上の試薬と反応させる工程であ
って、これにより、１以上の産物を生じる工程；（ｉｖ）該反応混合物から該タグ化成分を取り除くか、または該固体支持体か
ら該反応混合物を洗浄する工程；ならびに（ｖ）ハイスループットシステムにおいて、該タグ化成分、該１以上の試薬、
または該１以上の産物を分析する工程、を包含する、方法。
【請求項６５】前記固体支持体が、１以上の磁性ビーズ、１以上のアガロ
ースビーズ、１以上のポリスチレンビーズ、１以上のピン、マイクロウェルプレ
ート、または膜を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】前記タグ化成分が、ビオチン、アビジンまたはストレプト
アビジンを含み、ここで、前記タグ結合部分が、ビオチン、アビジンまたはスト
レプトアビジンを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】前記成分が、酵素、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオ
チド、炭水化物、脂質、糖、オリゴ糖、小有機分子、二次性代謝物または核酸を
含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】請求項６４に記載の方法であって、該方法が、１以上の酵
素をコードする遺伝子のライブラリを提供する工程をさらに包含し、該酵素が、
複数のタグ化成分を含む、方法。
【請求項６９】請求項６８に記載の方法であって、１以上の細胞中で１以
上のタグ化酵素を発現する工程をさらに包含し、該細胞または細胞上清が、前記
反応混合物を含む、方法。
【請求項７０】前記１以上の細胞を溶解させる工程をさらに包含する、請
求項６９に記載の方法。
【請求項７１】前記ハイスループットシステムが、質量分析計を含む、請
求項６４に記載の方法。