JP2003523193A - パーキンの活性調節に有用な組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は新規な化合物及びそれらの使用、特に医薬用、診断用または薬理学的ターゲットとしての使用に関する。より特定的には本発明は、ＰＡＰ１と呼ばれる新規なタンパク質、並びに、パーキン遺伝子活性を少なくとも部分的に変調し得る新規なタンパク質及び化合物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、パーキン（ｐａｒｋｉｎｅ）の活性を調節するために有用な組成物
及び方法に関する。より特定的には本発明は、パーキンの結合相手となるＰＡＰ
１と命名された新規なタンパク質並びに該タンパク質から誘導されるかまたは該
タンパク質に相同なペプチドまたはポリペプチドに関する。本発明はまた、パー
キンの活性を少なくとも部分的に変調し得る化合物、特に、パーキンとＰＡＰ１
との相互作用に干渉し得る化合物に関する。本発明は、治療及び診断の分野に有
用であり、また、新規な医薬の開発に役立つ薬理学的ターゲットを構成するため
に有用である。

【０００２】 パーキンソン病のいくつかの家族性形態（若年性常染色体劣性疾患）ではパー
キンの遺伝子が突然変異している（Ｋｉｔａｄａら，１９９８）。パーキンソン
病（Ｌｅｗｙ，１９１２）は、最も代表的な神経変性疾患の１つであり、５５歳
以上の人口の１％以上がこの病気に罹患している。この病気に罹患した患者には
様々な神経障害が見られるが、これらをパーキンソン症候群と総称する。特徴的
な症状は、筋固縮、無動、安静時振戦である。これらの症状は、脳の黒質のドー
パミン作動性ニューロンが変性した結果として生じる。

【０００３】 パーキンソン病の大抵の症例は家族性疾患ではない。しかしながら、家族性の
症例もある程度は存在しており、そのうちの幾つかは一遺伝子遺伝型の疾患であ
る。現時点では、発症例の少ない幾つかの遺伝性形態で異なる３つの遺伝子が同
定されているだけである。第一の形態は、常染色体優性型であり、その原因遺伝
子はアルファシヌクレインをコードしている（Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓら
，１９９７）。このタンパク質は、パーキンソン病のマーカーの役割を果たすＬ
ｅｗｙ体と呼ばれる細胞質内封入体に多い成分である（Ｌｅｗｙ，１９１２）。
第二の形態は、同じく常染色体優性型であり、ユビキチンのカルボキシ末端ヒド
ロラーゼＬ１と呼ばれるヒドロラーゼをコードする遺伝子の突然変異に関係があ
る（Ｌｅｒｏｙら，１９９８）。この酵素はポリマーまたはコンジュゲートの形
態のユビキチンをモノマー形態のユビキチンに加水分解すると推測されている。
第三の形態は、上記の２つの形態に比べて、常染色体劣性型であること、しばし
ば４０歳以前に発病すること、及び、Ｌｅｗｙ体が存在しないことを顕著な特徴
としている。この形態の患者に対しては、パーキンソン病の治療薬として使用さ
れているドーパミン前駆物質Ｌ−ドーパが極めて有効である。この形態に関与す
る遺伝子はパーキンと呼ばれる新しいタンパク質をコードしている（Ｋｉｔａｄ
ａら，１９９８）。

【０００４】 パーキンの遺伝子は、染色体６（６ｑ２５．２−ｑ２７）の５００，０００塩
基対以上のゲノム領域を含む１２個のエキソンから構成されている。現時点では
、病気の初期にこの遺伝子に主として２種類の突然変異、即ち、エキソン２−９
を含む領域に種々のサイズの欠失が生じる突然変異、または、終結コドンの早期
出現もしくはアミノ酸の変化が生じる点突然変異が存在することが知見されてい
る（Ｋｉｔａｄａら，１９９８；Ａｂｂａｓら，１９９９；Ｌｕｃｋｉｎｇら，
１９９８；Ｈａｔｔｏｒｉら，１９９８）。これらの突然変異の特性及び常染色
体劣性伝達モードは、パーキンの機能低下がパーキンソン病に至ることを示唆す
る。

【０００５】 この遺伝子は多くの組織、特に黒質で発現される。種々の選択的スプライシン
グの結果としてこの遺伝子に対応する複数の転写産物が存在する（Ｋｉｔａｄａ
ら，１９９８；Ｓｕｎａｄａら，１９９８）。脳内に２種類のメッセンジャーＲ
ＮＡが存在しており、一方のメッセンジャーＲＮＡではエキソン５に対応する部
分が欠失している。白血球中で同定されたパーキン遺伝子のメッセンジャーＲＮ
Ａはエキソン３、４及び５をコードする領域を含まない。脳内に存在するパーキ
ン遺伝子の長いほうのメッセンジャーＲＮＡは２９６０塩基を含んでおり、４６
５アミノ酸から成るタンパク質をコードしている。

【０００６】 このタンパク質のＮ末端部分はユビキチンとの相同性が小さい。Ｃ末端側の半
分は、システインに富む領域に対応するＩＢＲ（Ｉｎ Ｂｅｔｗｅｅｎ Ｒｉｎ
ｇ）ドメインによって分離された２つの“リングフィンガー”モチーフを含み、
“ジンクフィンガー”ドメインとして金属と結合し得る（Ｍｏｒｅｔｔ，１９９
９）。パーキンがメラミンを含有する黒質のニューロンの細胞質及びゴルジ装置
に局在することは免疫組織化学によって証明された（Ｓｈｉｍｕｒａら，１９９
９）。更に、このタンパク質はパーキンソン病患者の幾つかのＬｅｗｙ体に存在
している。パーキンの細胞性機能はまだ解明されていないが、シナプス小胞内で
も、タンパク質の成熟または分解のときにも、また、細胞の増殖、分化または発
達のコントロールにおいても、輸送体の役割を果たすと考えられる。若年性常染
色体劣性型ではパーキンが存在しない。従って、この機能の喪失が病気の一因で
あると確信し得る。

【０００７】 従って、ドーパミン作動性ニューロンの変性過程でパーキンタンパク質が果た
す正確な役割を解明することは、パーキンソン病の全容を理解しその治療方法を
開発するため、より一般的には中枢神経系疾患の全容を理解しその治療方法を開
発するために最も重要な課題である。

【０００８】 本発明の目的は、生理的条件下でパーキンと相互作用するパーキンの結合相手
を同定することである。パーキンの結合相手は、パーキンの活性を変調し得る化
合物、特にドーパミン作動性ニューロンの変性及び／または神経性疾患の進行に
関するパーキンの活性を変調し得る化合物を製造または研究する薬理学の新しい
対象である。このタンパク質、抗体、対応する核酸及び特異的プローブもしくは
特異的プライマーはまた、生物標本、特に神経組織標本中のタンパク質の検出ま
たは定量にも役立つ。これらのタンパク質または核酸は、パーキンの活性を変調
したり本発明化合物の活性を変調したりするために、パーキンと本発明のポリペ
プチドとの相互作用を変調するような治療方法にも有用である。

【０００９】 より特定的には本発明は、パーキンと相互作用する新規なヒトタンパク質が出
願人らによって知見された結果として得られた。このタンパク質をＰＡＰ１（Ｐ
ａｒｋｉｎｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ １）またはＬＹ１１１
と呼ぶ。ＰＡＰ１タンパク質（配列１または２）は、シナプトタグミンに対して
ある程度の相同性を有しており、特にパーキンの中央領域（配列３または４で表
す）と相互作用し得る。ＰＡＰ１タンパク質はまた、ヒト起原の種々の組織特に
肺（配列１２、１３）及び脳（配列４２、４３）から、また、スプライシングに
起因する変異体に対応する短縮形態（配列１４、１５、４４、４５）から、クロ
ーニングされ、配列決定され、特性決定された。

【００１０】 本発明はまた、パーキンの機能の変調に関与するＰＡＰ１タンパク質の特定領
域を同定及び特性決定した結果として得られた。このタンパク質の存在を知見し
その機能に関与する領域を解明したことによって、医薬として有用な新規な化合
物及び／または組成物を製造すること、及び、このような化合物の工業的なスク
リーニング方法を開発することが可能になった。

【００１１】 従って、本発明の第一の目的は、ＰＡＰ１タンパク質（またはそれらのホモロ
ーグ）とパーキン（特にヒトのパーキン）との相互作用を少なくとも部分的に変
調し得るかまたはこれらのタンパク質の相互作用段階に干渉し得る化合物を提供
することである。

【００１２】 本発明の別の目的は、ＰＡＰ１タンパク質、そのフラグメント、誘導体及びホ
モローグを提供することである。

【００１３】 本発明の別の目的は、ＰＡＰ１タンパク質、そのフラグメント、誘導体または
ホモローグをコードする核酸、このような核酸を含むベクター、このような核酸
またはベクターを含む組換え細胞、及び、このような核酸をその細胞内に含むヒ
ト以外の哺乳動物を提供することである。

【００１４】 本発明はまた、ＰＡＰ１タンパク質、そのフラグメント、誘導体及びホモロー
グに結合し得る抗体、特にポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、より
好ましくはＰＡＰ１タンパク質と結合することができＰＡＰ１タンパク質とパー
キンとの相互作用を少なくとも部分的に阻害し得る抗体に関する。

【００１５】 本発明の別の目的は、任意の生物標本中のｐａｐ１遺伝子または該遺伝子の１
つの領域を検出または増幅するために有用なＰＡＰ１特異的ヌクレオチドプロー
ブまたはプライマーを提供することである。

【００１６】 本発明はまた、医薬組成物、遺伝的異常の検出方法、上記に定義のようなポリ
ペプチドの産生方法、活性化合物のスクリーニングまたはキャラクタリゼーショ
ンの方法に関する。

【００１７】 上述のように、本発明の第一の目的は、ＰＡＰ１タンパク質（またはそのホモ
ローグ）とパーキンとの相互作用の段階に少なくとも部分的に干渉し得る化合物
を提供することである。

【００１８】 本文中で使用されたＰＡＰ１タンパク質という用語は、タンパク質自体及び該
タンパク質のすべての相同形を意味する。相同形という用語は、考察中のタンパ
ク質に等価であり、種々の細胞、特にヒト細胞またはヒト以外の生物の細胞に由
来し、同じタイプの活性を有しているすべてのタンパク質を意味する。このよう
なホモローグはまた、配列２を有しているＰＡＰ１タンパク質の天然変異体、特
に多形性に起因する変異体またはスプライシングに起因する変異体を含意する。
このようなホモローグはまた、コーディング核酸（特に配列１の核酸）との間の
ハイブリダイゼーション実験によって得られる。本文中で使用された範囲では、
この種の配列が、特許請求の範囲に記載のＰＡＰ１タンパク質の生理的挙動と同
様の生理的挙動に導くための有意な一致パーセンテージを有していれば十分であ
る。有意な一致パーセンテージという用語は、少なくとも６０％、好ましくは８
０％、より好ましくは９０％、いっそう好ましくは９５％のパーセンテージを意
味する。この観点から、ヒト起原の組織から同定された配列１３、１５、４３及
び４５は配列２の変異体及び／またはホモローグである。従って、ＰＡＰ１とい
う名称はこれらのポリペプチドも包含する。

【００１９】 本文中で使用された範囲では、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の
“一致パーセンテージ”は、最適に位置合せした２つの配列を比較ウインドウで
比較することによって決定される。

【００２０】 従って、比較ウインドウの内部に存在するヌクレオチド配列またはポリペプチ
ド配列の部分は、（付加または欠失を含まない）基準配列に比較して２つの配列
の最適な位置合せが得られるような付加または欠失（例えば“ギャップ”）を含
み得る。

【００２１】 パーセンテージを計算するためには、比較した２つの配列（核酸配列またはペ
プチド配列）について同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が観察される位置の数
を測定し、双方の配列の塩基またはアミノ酸残基の一致が存在する位置の数を比
較ウインドウ内の位置の総数で除算し、次いで、得られた商に１００を乗算する
ことによって、配列一致パーセンテージを得る。

【００２２】 比較用配列の最適位置合せは、ＷＩＳＣＯＮＳＩＮ ＧＥＮＥＴＩＣＳ ＳＯ
ＦＴＷＡＲＥ ＰＡＣＫＡＧＥ，ＧＥＮＥＴＩＣＳ ＣＯＭＰＵＴＥＲ ＧＲＯ
ＵＰ（ＧＣＧ）社，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｏｃｔｏｒ，Ｍａｄｉｓｏｎ，
ＷＩＳＣＯＮＳＩＮのパッケージに含まれた公知のアルゴリズムを用いたコンピ
ュータ処理によって行うことができる。

【００２３】 例えば、ＢＬＡＳＴソフトウェア（１９９６年３月のＢＬＡＳＴ １．４．９
バージョン、１９９８年２月のＢＬＡＳＴ ２．０．４バージョン及び１９９８
年９月のＢＬＡＳＴ ２．０．６バージョン）を用い、端数切り捨てパラメータ
ーを排他的に使用することによって（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．（１９９０）２１５；４０３−４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９７）２５：３３８９−３４０２）配列一致パ
ーセンテージを計算し得る。ＢｌａｓｔはＡｌｔｓｃｈｕｌら（前出）のアルゴ
リズムを用いて基準“リクエスト”配列に類似／相同の配列を探索する。使用す
るリクエスト配列及びデータベースはペプチド配列または核酸配列でもよく、そ
れらの任意の組合せでもよい。

【００２４】 本発明化合物による干渉は種々の形態で現れる。例えば、化合物はＰＡＰ１タ
ンパク質またはその相同形の１つとパーキンとの相互作用を少なくとも部分的に
抑制、阻害または刺激する。好ましくは化合物が、例えば２つのポリペプチド間
の相互作用を検出するツーハイブリッド型システムまたは非細胞性システム中で
上記のような相互作用をｉｎ ｖｉｔｒｏで変調し得る。好ましい本発明化合物
は、この相互作用を少なくとも部分的に変調し得る化合物であり、より好ましい
本発明化合物は、化合物の非存在下のコントロールに比較してこの相互作用を少
なくとも２０％、より好ましくは少なくとも５０％増進させるかまたは阻害し得
る化合物である。

【００２５】 本発明の特定実施態様では、化合物が配列４で表されたパーキンの領域と配列
２、１３、１５、４３または４５で表されたＰＡＰ１タンパク質との間の相互作
用の段階に干渉し得る。

【００２６】 本発明の特定実施態様では、化合物がＰＡＰ１タンパク質またはその相同形の
１つとパーキンとの相互作用ドメインの処に結合し得る。

【００２７】 本発明化合物は多様な種類及び起原を有し得る。特に、ペプチド型、核酸型（
即ち、塩基の連鎖を含む核酸、特にＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子）、脂質型、糖
型の化合物、抗体などでよく、より普遍的には有機または無機のすべての分子を
包含する。

【００２８】 第一種類の本発明化合物はペプチド型である。ペプチドという用語は、アミノ
酸の連鎖を含むすべての分子、例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、
抗体（または抗体のフラグメントまたは誘導体）を含意し、これらのペプチドは
場合によっては修飾されていてもよくまたは別の化合物もしくは化学基に結合し
てもよい。この観点から、“ペプチド”という用語はより特定的には、５０個以
下のアミノ酸、より好ましくは４０個以下のアミノ酸の連鎖から成る分子を意味
する。ポリペプチド（またはタンパク質）は好ましくは５０−５００個またはそ
れ以上のアミノ酸を含む。

【００２９】 第一の好ましい実施態様によれば、本発明化合物は、ペプチド配列２またはそ
の誘導体のいずれか１つの全部または一部、特にペプチド配列１３、１５、４３
または４５またはそれらの誘導体の全部または一部を含むペプチド化合物、より
特定的には配列２、１３、１５、４３または４５を含むＰＡＰ１タンパク質であ
る。

【００３０】 本文中で使用された誘導体という用語は、１つまたは複数の遺伝性修飾及び／
または化学的修飾によって生じた遺伝コードの変性が原因で考察中の配列から異
なるすべての配列、並びに、核酸配列１またはそのフラグメント例えば核酸配列
１２、１４、４２または４４またはそれらのフラグメントとハイブリダイズする
配列によってコードされておりＰＡＰ１タンパク質またはそのホモローグの１つ
とパーキンとの相互作用の段階に干渉する能力を有しているすべてのペプチドを
意味する。遺伝性修飾及び／または化学的修飾という用語は、１つまたは複数の
残基の突然変異、置換、欠失、付加及び／または修飾のいずれかを意味する。誘
導体という用語はまた、別の細胞ソース、特にヒト細胞またはヒト以外の生物の
細胞に由来し考察中の配列と同種の活性を有している考察中の配列に相同の配列
を意味する。このような相同配列はハイブリダイゼーション実験によって得られ
る。ハイブリダイゼーションは、核酸ライブラリーを出発物質とし、天然型配列
またはそのフラグメントをプローブとして使用し種々のハイブリダイゼーション
条件下で行う（Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８９）。更に、“フラグメント”また
は“部分”という用語は、考察中の分子の部分であって連続する５個以上の残基
、好ましくは連続する９個以上の残基、より好ましくは連続する１５個以上の残
基を含むすべての部分を意味する。典型的なフラグメントは少なくとも２５個の
連続する残基を含み得る。

【００３１】 このような誘導体またはフラグメントは、種々の目的で、特に治療効果の増強
または副作用の抑制などの目的、あるいは、これらの誘導体またはフラグメント
に新規な薬理学的及び／または生物学的特性を付与するなどの目的で作製され得
る。

【００３２】 ＰＡＰ１タンパク質及び相同形から誘導されたペプチドとしては特に、パーキ
ンと相互作用する能力を有しているが非機能化されたエフェクター領域を含むペ
プチドが挙げられる。このようなペプチドは、ＰＡＰ１タンパク質及びその相同
形のエフェクター領域に欠失、突然変異または破壊を生じさせることによって得
られる。このような修飾は例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発、付加要素も
しくは合成配列の導入、または、初期要素の欠失もしくは置換によって得られる
。上記に定義したような誘導体が作製されたとき、これらの誘導体がＰＡＰ１タ
ンパク質またはその相同形とパーキンの結合部位との結合を部分的に阻害する活
性を有していることを証明できる。このために、当業者に公知の任意の技術を使
用し得ることは明らかであろう。

【００３３】 本発明はまた、上記のような配列のフラグメントを提供する。このようなフラ
グメントは種々の方法で作製し得る。特に、当業者に公知のペプチドシンセサイ
ザーを使用し、本出願で与えた配列に基づいて、化学的方法で合成できる。また
、所望のペプチドをコードするヌクレオチド配列を細胞宿主中で発現させる遺伝
的方法によって合成できる。この場合、ヌクレオチド配列は、本出願で与えたペ
プチド配列及び遺伝コードに基づいてオリゴヌクレオチドシンセサイザーを使用
して化学的に合成できる。ヌクレオチド配列はまた、本出願で与えた配列を出発
材料とし当業者に公知の技術に従って酵素切断、結合、クローニングなどを行う
ことによって作製してもよく、または、これらの配列から作製したプローブでＤ
ＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって作製してもよい。

【００３４】 更に、本発明のペプチド、即ち、ＰＡＰ１タンパク質及び相同形とパーキンと
の相互作用を少なくとも部分的に変調し得るペプチドはまた、パーキンとの相互
作用を生じるＰＡＰ１タンパク質及び相同形の部位に対応する配列を有するペプ
チドであってもよい。

【００３５】 別の本発明ペプチドは、細胞標的に対して上記に定義のペプチドと競合的に相
互作用するペプチドである。このようなペプチドは特に、考察中のペプチドの配
列に基づいて合成でき、上記に定義のペプチドとの競合能力を測定できる。

【００３６】 本発明の特別な目的はＰＡＰ１タンパク質を提供することである。より特定的
には配列２またはそのフラグメントもしくは誘導体を含むＰＡＰ１タンパク質、
例えば配列１３、１５、４３、４５またはそのフラグメントを含むＰＡＰ１タン
パク質を提供することである。

【００３７】 本発明の別の目的は、上記に定義のようなポリペプチドに対するポリクローナ
ル抗体もしくはモノクローナル抗体またはこれらの抗体のフラグメントもしくは
誘導体を提供することである。このような抗体は、当業者に公知の方法によって
作製できる。特にこれらの抗体は、本発明のペプチド化合物（特に、配列２の全
部または一部を含むポリペプチドまたはペプチド）に対して動物を免疫感作し、
血液を採取し、抗体を単離することによって調製できる。これらの抗体はまた、
当業者に公知の技術に従ってハイブリドーマを調製することによって作製できる
。

【００３８】 より好ましくは、本発明の抗体または抗体フラグメントは、特許請求の範囲に
記載のペプチドとパーキンとの相互作用を少なくとも部分的に変調する能力を有
している。

【００３９】 更にこれらの抗体はまた、生物標本中のＰＡＰ１の発現を検出及び／または定
量するために使用でき、その結果として、ＰＡＰ１タンパク質の活性化状態に関
する情報を得るために使用できる。

【００４０】 抗体のフラグメントまたは誘導体は例えばフラグメントＦａｂ、Ｆａｂ′２、
一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）、などである。特に、元になる抗体の抗原特異性を保存
しているすべてのフラグメントまたは誘導体が包含される。

【００４１】 より好ましくは本発明の抗体は、配列２、１３、１５、４３または４５を含む
ＰＡＰ１タンパク質、特にパーキンとの相互作用に関与するＰＡＰ１タンパク質
の領域と結合し得る。より好ましくはこれらの抗体（またはフラグメントまたは
誘導体）は、配列２の残基１から残基３４４までの配列中に存在するエピトープ
と結合し得る。

【００４２】 本発明はまた、医薬として有用な非ペプチド性化合物または非ペプチド単独性
化合物に関する。即ち、本出願に記載した活性タンパク質モチーフから医薬用途
に適合する非ペプチド単独性のＰＡＰ１活性変調分子を作製することが可能であ
る。特に、ペプチドの活性モチーフを非ペプチド性構造または非ペプチド単独性
構造と共に複製すればよい。

【００４３】 本発明の目的はまた、本発明のペプチド化合物をコードする核酸のいずれかを
提供することである。本発明は特に、配列１、１２、１４、４２もしくは４４の
全部または一部を含む核酸またはその誘導体の１つを提供する。本文中に使用さ
れた誘導配列という用語は、配列１で示された配列または該配列のフラグメント
とハイブリダイズして本発明のペプチド化合物をコードする任意の配列を意味し
ており、また、遺伝コードの縮重に基づいて上記の配列から得られる配列を意味
している。本発明の核酸は例えば核酸配列１２、１４、４２または４４の全部ま
たは一部を含む。

【００４４】 本発明は更に、配列１に対してまたは配列１のフラグメントに対して有意な一
致パーセンテージを有しておりかつＰＡＰ１タンパク質の生理的挙動に類似の生
理的挙動を有しているペプチド化合物をコードする配列に関する。有意な一致パ
ーセンテージという用語は、少なくとも６０％、好ましくは８０％、より好まし
くは９０％、いっそう好ましくは９５％のパーセンテージを意味する。

【００４５】 本発明の種々のヌクレオチド配列は人工的に産生された配列でもよくそうでな
くてもよい。ヌクレオチド配列は例えば、ゲノム配列、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ハイ
ブリッド配列、合成配列または半合成配列である。これらの配列は、ＤＮＡライ
ブラリー（ｃＤＮＡライブラリー、ゲノムＤＮＡライブラリー）のスクリーニン
グによって得ることもでき、化学合成によって得ることもでき、ライブラリーの
スクリーニングによって得られた配列の化学的または酵素的な修飾を含む混成方
法によって得ることもでき、核酸またはタンパク質のデータベース中のホモロジ
ーの探索、などによって得ることもできる。上述のようなハイブリダイゼーショ
ンは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９，９．５２−９．５５頁）によって記載さ
れた条件下で行うのが好ましい。

【００４６】 ハイブリダイゼーションは高緊縮性ハイブリダイゼーション条件下で行うのが
有利である。本発明で使用された“高緊縮性ハイブリダイゼーション条件”とい
う用語は、以下の条件を表す。

【００４７】 １−膜の競合及びプレハイブリダイゼーション： −４０μｌのサケ精子ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）と４０μｌのヒト胎盤ＤＮＡ（
１０ｍｇ／ｍｌ）とを混合する。 −９６℃で５分間変性し、次いで混合物を氷浴に浸漬させる。 −ＳＳＣ ２×バッファを除去し、膜を収容したハイブリダイゼーション管に４
ｍｌのホルムアミドミックスを注入する。 −２つの変性ＤＮＡの混合物を加える。 −回転しながら４２℃で５−６時間インキュベートする。

【００４８】 ２−標識プローブの競合： −標識し精製したプローブに、非特異的ハイブリダイゼーション量に従って１０
から５０μｌのＣｏｔ Ｉ ＤＮＡを添加する。 −９５℃で７−１０分間変性する。 −６５℃で２−５時間インキュベートする。

【００４９】 ３−ハイブリダイゼーション： −プレハイブリダイゼーションミックスを除去する。 −４０μｌのサケ精子ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）と４０μｌのヒト胎盤ＤＮＡ（
１０ｍｇ／ｍｌ）とを混合する。９６℃で５分間変性し、次いで混合物を氷浴に
浸漬させる。 −ハイブリダイゼーション管に４ｍｌのホルムアミドミックス、２つのＤＮＡの
混合物及び標識プローブ／変性Ｃｏｔ Ｉ ＤＮＡを加える。 −回転しながら４２℃で１５−２０時間インキュベートする。

【００５０】 ４−洗浄 −周囲温度の洗浄用２×ＳＳＣで洗浄する。 −周囲温度の２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳで５分間ずつ２回洗浄する。 −６５℃の０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳで１５分間ずつ２回洗浄する。 膜をサランラップに包んで露光する。

【００５１】 上記のハイブリダイゼーション条件は、２０ヌクレオチドから数１００ヌクレ
オチドまでの範囲の種々の長さの核酸分子を高緊縮性条件下でハイブリダイズす
るために好適な条件である。

【００５２】 勿論、ハイブリダイゼーションさせるべき核酸及び選択された標識の種類に適
応するように上記のハイブリダイゼーション条件を当業者に公知の技術に従って
変更することができる。

【００５３】 例えば、ＨＡＭＥＳ ＆ ＨＩＧＧＩＮＳ（１９８５）の著作（Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｉａｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐ
ｒｏａｃｈ，Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）またはＦ．ＡＵＳＵＢＥＬら（１９９９）の著作（Ｃｕｒｒ
ｅｎｔｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，
Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅ
ｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．）に含まれている教示に従って適正な
ハイブリダイゼーシヨン条件に調整し得る。

【００５４】 特定的な本発明の核酸は配列２またはそのフラグメントもしくは誘導体を含む
ポリペプチドをコードしており、特にヒトＰＡＰ１タンパク質をコードしている
。有利な本発明の核酸は、核酸配列１、１２、１４、４２または４４を含む核酸
である。

【００５５】 このような核酸を本発明のペプチド化合物の製造に使用できる。従って本出願
は、本発明の核酸を含む細胞を該核酸の発現条件下で培養する段階と、産生され
たペプチド化合物を回収する段階とから成るペプチド化合物の製造方法に関する
。この場合、ペプチド化合物をコードする部分は一般に、細胞宿主中で該ペプチ
ド化合物を発現させ得るシグナルのコントロール下に配置されている。使用され
る細胞宿主に応じてこれらのシグナル（プロモーター、ターミネーター、分泌“
リーダー”配列、など）の選択を変更できる。更に、本発明の核酸が自律複製ベ
クターまたは組込みベクターの一部を構成してもよい。特に自律複製ベクターは
、自律複製配列を選択宿主中で使用することによって作製し得る。組込みベクタ
ーは、例えば相同的組換えによってベクターを組込むことができる宿主のゲノム
の幾つかの領域に相同な配列を使用することによって作製できる。組込みベクタ
ーの種類には、プラスミドベクター、エピソームベクター、染色体ベクター、ウ
イルスベクター、などがある。

【００５６】 組換え法によって本発明のペプチド化合物を産生させるために有用な細胞宿主
は真核細胞または原核細胞のいずれでもよい。適当な真核宿主としては、動物細
胞、酵母または真菌類がある。酵母としては特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ
またはＨａｎｓｅｎｕｌａ属の酵母が挙げられる。動物細胞としては、ＣＯＳ細
胞、ＣＨＯ細胞、Ｃ１２７細胞、ＰＣ１２細胞、などが挙げられる。真菌類とし
ては特に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種またはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種が挙げら
れる。原核細胞としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＢａｃｉｌｌｕｓまたはＳｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓのような細菌の使用が好ましい。

【００５７】 本発明の目的は更に、本発明の核酸またはベクターを細胞中に含むヒト以外の
哺乳動物を提供することである。

【００５８】 このような哺乳動物（齧歯類、イヌ、ウサギ、など）はＰＡＰ１の特性研究及
び治療用化合物の同定に有用である。このようなトランスジェニック動物のゲノ
ムの修飾は、１つまたは複数の遺伝子を“ノックイン”または“ノックアウト”
によって改変するかまたは修飾することによって得られる。この修飾は、従来の
変性剤または突然変異誘発物質によって行われてもよく、または、調節的突然変
異誘発によって行われてもよい。ゲノムの修飾はまた、野生型または突然変異型
の（１つまたは複数の）遺伝子の挿入または置換によって得られる。ゲノムの修
飾は、生殖細胞株及び前核に対して行うのが有利である。トランスジェニック生
物を作製するためには、修飾された遺伝子を含む発現カセットを２つの受精前核
にマイクロインジェクションによって注入する。従って本発明の動物は、核酸を
含む発現カセットの注入によって得られる。好ましくはこの核酸はＤＮＡであり
、該ＤＮＡはゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）でもよくまたは相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ
）でもよい。

【００５９】 本発明のトランスジェニック動物は当業者に公知の慣用の技術に従って作製し
得る。当業者は特に、米国特許ＵＳ４，８７３，１９１、ＵＳ５，４６４，７６
４及びＵＳ５，７８９，２１５に記載されているようなトランスジェニック動物
の作製方法、特にトランスジェニックマウスの作製方法を参照し得る。これらの
文献の記載内容は参照によって本発明に含まれるものとする。

【００６０】 簡単に説明すると、本発明の核酸を含むポリヌクレオチド構築物をＥＳ型の細
胞株系に挿入する。ポリヌクレオチド構築物の挿入は、Ｔｈｏｍａｓら（１９８
７，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．５１：５０３−５１２）によって記載されたような電気
穿孔によって行うのが好ましい。

【００６１】 電気穿孔段階で処理した細胞を次に、ポリヌクレオチド構築物の存在に基づい
てスクリーニングし（例えばラベルを用いて選択するか、または、ＰＣＲ、また
はサザン型のＤＮＡ電気泳動ゲル分析を用いる）、場合によっては、相同的組換
えイベントを生じさせた後、外因性ポリヌクレオチド構築物をそのゲノムに組込
んだ陽性細胞を選択する。このような技術は例えばＭＡＮＳＯＵＲら（Ｎａｔｕ
ｒｅ（１９８８）３３６：３４８−３５２）によって記載されている。

【００６２】 次に、ＢＲＡＤＬＥＹ（１９８７，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌ
ｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｈｉｍａｅｒｉｃ ｍｉｃｅ．：Ｅ．Ｊ．ＲＯＢＥＲＴＳＯ
Ｎ Ｅｄ．ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ
ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ： Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ
ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐａｇｅ１１３）によって記載されたような手順
で、選択した陽性細胞を単離し、クローニングし、３．５日齡のマウスの胚盤胞
に注入する。次に胚盤胞を雌の宿主動物に導入し、胚の発達を出産時期まで追跡
する。

【００６３】 代替方法では、ＷＯＯＤら（１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９０：４５８２−４５８５）またはＮＡＧＹら（１９９３
，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９０：８４２４−
８４２８）に記載されたような手順で、選択した陽性ＥＳ型細胞を、２．５日齡
の８−１６細胞期の胚（桑実胚）と接触させて、ＥＳ細胞のインターナリゼーシ
ョンを生じさせ、生殖系になる細胞を含めた胚盤胞の広い範囲にＥＳ細胞のコロ
ニーを形成させる。

【００６４】 次いで、後代がポリヌクレオチド構築物（トランスジーン）を組込んでいるか
否かを判定するために後代を試験する。

【００６５】 本発明の核酸はまた、医薬として有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドまた
は遺伝子のアンチセンス鎖の作製に役立つ。アンチセンス配列は、所与の遺伝子
のコーディング鎖に相補的な短鎖オリゴヌクレオチドであり、転写されたｍＲＮ
Ａと特異的にハイブリダイズできるので、該ｍＲＮＡがタンパク質に翻訳される
ことを阻害し得る。従って本発明の目的は、パーキンに対するＰＡＰ１タンパク
質の相互作用を少なくとも部分的に阻害し得るアンチセンス配列を提供すること
である。このような配列は、上記に定義した核酸配列の全部または一部から構成
され得る。このような配列は一般的には、パーキンと相互作用するペプチドをコ
ードする配列に相補的な配列であるかまたは配列フラグメントである。このよう
なオリゴヌクレオチドは、分割などによって作製されてもよく、または、化学合
成によって作製されてもよい。

【００６６】 特許請求の範囲に記載された配列は遺伝子治療の分野で、アンチセンス配列ま
たはＰＡＰ１タンパク質とパーキンとの相互作用を変調し得るペプチドをｉｎ
ｖｉｖｏで導入及び発現させるために使用し得る。このためには、ｉｎ ｖｉｖ
ｏ投与し得るウイルス性または非ウイルス性のベクター（Ｋａｈｎら，１９９１
）に配列を組込む。本発明に好適なウイルス性ベクターとしては特に、アデノウ
イルス、レトロウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）またはヘルペスウイル
スのようなベクターが挙げられる。本出願の目的はまた、本発明のポリペプチド
をコードする核酸、特に配列２またはその誘導体の全部または一部を含むポリペ
プチドまたはペプチドをコードする核酸、例えば、配列１２、１４、４２または
４４またはそれらの誘導体の全部または一部を含むポリペプチドまたはペプチド
をコードする核酸を含む組換え欠陥ウイルスを提供することである。

【００６７】 本発明はまた、上記に定義のヌクレオチド配列またはそれらの相補鎖とハイブ
リダイズし得る合成または非合成のヌクレオチドプローブを提供する。このよう
なプローブは、ＰＡＰ１の発現もしくは超発現を検出するため、または、遺伝的
異常（誤ったスプライシング、多型、点突然変異、など）を証明するために、診
断ツールとしてｉｎ ｖｉｔｒｏで使用され得る。これらのプローブはまた、別
の細胞ソース、好ましくはヒト由来の細胞から上記に定義のようなペプチドをコ
ードする相同核酸配列を発見し単離するために使用され得る。本発明のプローブ
は一般的に少なくとも１０個の塩基を含んでおり、例えば上記配列の１つまたは
それらの相補鎖全体を含んでいてもよい。これらのプローブは使用に先立って標
識するのが好ましい。このために当業者に公知の種々の技術を使用し得る（放射
性標識、蛍光標識、酵素標識、化学的標識、など）。

【００６８】 本発明はまた、ＰＡＰ１をコードする核酸の全部または一部を増幅し得るプラ
イマーまたはプライマー対、例えば、配列１６−４１から選択された配列をもつ
プライマーに関する。

【００６９】 本発明の目的は更に、少なくとも１つの上記に定義の化合物、特にペプチド化
合物を有効成分として含むすべての医薬組成物を提供することである。

【００７０】 本発明の目的は特に、少なくとも１つの上記に定義の抗体及び／または抗体フ
ラグメントを有効成分として含むすべての医薬組成物、並びに、少なくとも１つ
の上記に定義の核酸またはベクターを有効成分として含むすべての医薬組成物を
提供することである。

【００７１】 本発明の目的はまた、ＰＡＰ１タンパク質とパーキンとの相互作用を増強また
は抑制し得る化学分子を有効成分として含むすべての医薬組成物を提供すること
である。

【００７２】 本発明の目的は更に、上記に定義のようなペプチド、抗体、化学分子及びヌク
レオチド配列が互いにまたは別の有効成分と会合している医薬組成物を提供する
ことである。

【００７３】 本発明の医薬組成物は、パーキンタンパク質の活性を変調し、その結果として
ドーパミン作動性ニューロンの生存を維持するために使用され得る。より特定的
にはこれらの医薬組成物の所期の目的は、ＰＡＰ１タンパク質とパーキンとの相
互作用を変調することである。例えばパーキンソン病のような中枢神経系の疾患
の治療を所期の目的とする医薬組成物が好ましい。

【００７４】 本発明の目的はまた、パーキンの活性を変調するためまたは中枢神経系疾患を
タイピングするために上記のような分子を使用することである。本発明では特に
、パーキンの活性を少なくとも部分的に変調するためにこれらの分子を使用する
。

【００７５】 本発明はまた、配列２または配列４またはそれらのフラグメント（または誘導
体）に結合し得る分子の選択から成る、パーキンの機能に対して活性の分子をス
クリーニングまたはキャラクタリゼーションする方法に関する。該方法は好まし
くは、１種または複数の被験分子を配列２または配列４またはそれらのフラグメ
ント（または誘導体）を含むポリペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させる段階
と、配列２（特に残基１−残基３４４の範囲に含まれる領域）または配列４に結
合し得る分子を選択する段階とから成る。被験分子は様々な種類の分子（ペプチ
ド、核酸、脂質、糖など、またはこれらの分子の混合物、例えば、組合せライブ
ラリー、など）でよい。上述のように、上記の方法でパーキンの機能に対して活
性であると同定された分子は、パーキンタンパク質の活性を変調するために使用
でき、神経変性病理を治療するための強力な治療薬となる。

【００７６】 本発明の別の利点は、非限定代表例を表す以下の実施例及び図面から明らかで
あろう。

【００７７】 （図面の簡単な説明） 図１：ベクターｐＬｅｘ９−Ｐａｒｋｉｎｅ（１３５−２９０）の概略図 図２：一次５′−ＲＡＣＥ実験の結果。８個のクローンが得られた。初期電子
配列を図の下端に示す 図３：二次５′−ＲＡＣＥ実験の結果。一次実験で得られた８個のクローンの
うちの２個だけ（クローンＡ１２及びＤ５）が有効であった。初期電子配列を図
の下端に示す。ＤＮＡ及びタンパク質の完全配列は配列１２−１５に示す 図４：二次５′−ＲＡＣＥ実験のクローンＣ５及びＤ４の編成の詳細図。判明
したコンセンサス配列を図の上部に示す 図５：ヒト脳から単離した転写産物の構造 図６：ヒト脳のＬＹ１１１（全長）の核酸及びタンパク質の配列。二重下線：
ジンクフィンガードメインの保存システイン；太字：Ｃ_２１ドメイン；イタリッ
ク体：Ｃ_２２ドメイン 図７：ヒト脳のＬＹ１１１（短縮形）の核酸及びタンパク質の配列。二重下線
：ジンクフィンガードメインの保存システイン；太字：Ｃ_２１ドメイン；イタリ
ック体：Ｃ_２２ドメイン 図８：ＣＯＳ−７細胞中で発現後の短縮形ＬＹ１１１タンパク質（８ｂ）また
は全長ＬＹ１１１タンパク質（８ａ）の局在 図９：ヒト肺のＬＹ１１１（非短縮形）の核酸及びタンパク質の配列。

【００７８】 図１０：ヒト脳のＬＹ１１１（短縮形）の核酸及びタンパク質の配列。

【００７９】 使用材料及び使用技術 （１）酵母株： Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ属のＬ４０株（Ｍａｔａ，ｈｉｓ３Ｄ２００，ｔｒ
ｐ１−９０１，ｌｅｕ２−３，１１２，ａｄｅ２，ＬＹＳ２：：（ｌｅｘＡｏｐ
）_４−ＨＩＳ３，ＵＲＡ３：：（ｌｅｘＡｏｐ）_８−ＬａｃＺ，ＧＡＬ４，ＧＡ
Ｌ８０）を使用して、一方の結合タンパク質がＬｅｘＡタンパク質に融合してい
るときのタンパク質−タンパク質相互作用を検証した。ＬｅｘＡタンパク質は、
リポーター遺伝子ＬａｃＺ及びＨｉｓ３の発現をコントロールするＬｅｘＡ応答
要素を認識し得る。

【００８０】 上記酵母株を以下の培養培地で培養した。完全ＹＰＤ培地 ：−酵母エキス（１０ｇ／リットル）（Ｄｉｆｃｏ） −バクトペプトン（２０ｇ／リットル）（Ｄｉｆｃｏ） −ブドウ糖（２０ｇ／リットル）（Ｍｅｒｃｋ） この培地に２０ｇ／リットルの寒天（Ｄｉｆｃｏ）を加えて固形培地にした。最小ＹＮＢ培地 ：−酵母窒素基（アミノ酸非含有）（６．７ｇ／リットル） （Ｄｉｆｃｏ） −ブドウ糖（２０ｇ／リットル）（Ｍｅｒｃｋ） この培地に２０ｇ／リットルの寒天（Ｄｉｆｃｏ）を加えて固形培地にする。
また、ＣＳＭ培地［ＣＳＭ−Ｌｅｕ，−Ｔｒｐ，−Ｈｉｓ（６２０ｍｇ／リット
ル）、ＣＳＭ−Ｔｒｐ（７４０ｍｇ／リットル）またはＣＳＭ−Ｌｅｕ，−Ｔｒ
ｐ（６４０ｍｇ／リットル）（Ｂｉｏ１０１）］及び／または２．５ｍＭの３−
アミノ−１，２，４−トリアゾールを加えてアミノ酸及び／または３−アミノ−
１，２，４−トリアゾールを補充する。

【００８１】 （２）細菌株： 遺伝子型ｓｕｐＥ，ｈｓｄΔ５，ｔｈｉ，Δ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ），Ｆ′［
ｔｒａ Ｄ３６ ｐｒｏ Ａ^＋Ｂ^＋ｌａｃＩ^ｑｌａｃＺΔＭ１５］をもつ大腸菌
ＴＧ１株を使用してプラスミドを構築し、使用した組換えプラスミドの増幅及び
単離手段とした。

【００８２】 この大腸菌株を以下の培地で培養した。ＬＢ培地 ：−ＮａＣｌ（５ｇ／リットル）（Ｐｒｏｌａｂｏ） −バクトトリプトン（１０ｇ／リットル）（Ｄｉｆｃｏ） −酵母エキス（５ｇ／リットル）（Ｄｉｆｃｏ） この培地に１５ｇ／リットルの寒天（Ｄｉｆｃｏ）を加えて固形培地にする。

【００８３】 アンピシリンを１００μｇ／ｍｌの濃度で使用した。この抗生物質は、この抗
生物質に耐性の遺伝子をマーカーとして含むプラスミドを受容した細菌の選択に
役立つ。

【００８４】 遺伝子型ｓｕｐＥ４４，ａｒａ１４，ｇａｌＫ２，ｌａｃＹ１，Δ（ｇｐｔ−
ｐｒｏＡ）６２，ｒｐｓＬ２０（Ｓｔｒ^ｒ），ｘｙｌ−５，ｍｔｌ−１，ｒｅｃ
Ａ１３，Δ（ｍｃｒＣ−ｍｒｒ），ＨｓｄＳ⁻（ｒ⁻ｍ⁻）をもつ大腸菌ＨＢ１
０１株を、ヒトリンパ球ｃＤＮＡライブラリーから得られたプラスミドの増幅及
び単離手段として使用した。

【００８５】 この大腸菌株を以下の培地で培養した。Ｍ９培地 ：−Ｎａ２ＨＰＯ４（７ｇ／リットル）（Ｐｒｏｌａｂｏ） −ＫＨ２ＰＯ４（３ｇ／リットル）（Ｐｒｏｌａｂｏ） −ＮＨ４Ｃｌ（１ｇ／リットル）（Ｐｒｏｌａｂｏ） −ＮａＣｌ（０．５ｇ／リットル）（Ｐｒｏｌａｂｏ） −ブドウ糖（２０ｇ／リットル）（Ｓｉｇｍａ） −ＭｇＳＯ４（１ｍＭ）（Ｐｒｏｌａｂｏ） −サイアミン（０．００１％）（Ｓｉｇｍａ） この培地に１５ｇ／リットルの寒天（Ｄｉｆｃｏ）を加えて固形培地にする。
ＨＢ１０１株が増殖できるようにするためにはロイシン（５０ｍｇ／リットル）
（Ｓｉｇｍａ）及びプロリン（５０ｍｇ／リットル）（Ｓｉｇｍａ）をＭ９培地
に加える必要がある。

【００８６】 リンパ球ｃＤＮＡのツーハイブリッドライブラリーからプラスミドを選択する
ときには、プラスミドがＬｅｕ２選択マーカーを有しているので培地にロイシン
を添加しなかった。

【００８７】 （３）プラスミド： ベクターｐＬｅｘ９（ｐＢＴＭ１１６）（Ｂａｒｔｅｌら，１９９３）：細菌
リプレッサーＬｅｘＡをコードする配列の下流でターミネーターの上流に多重ク
ローニング部位を含むｐＧＢＴ１０に相同の５ｋｂのベクター。このベクターは
融合タンパク質を形成するために使用した。

【００８８】 ｐＬｅｘ−ＨａＲａｓＶａｌ１２：哺乳動物のＲａｆタンパク質との相互作用
が知られている（Ｖｏｊｔｅｋら）Ｖａｌ１２位に突然変異をもつＨａＲａｓタ
ンパク質をコードする配列を含む、国際特許出願ＷＯ９８／２１３２７に記載さ
れているようなプラスミドｐＬｅｘ９。このプラスミドは、Ｌ４０株におけるＰ
ＡＰ１タンパク質の相互作用特異性を試験するために使用した。

【００８９】 ｐＬｅｘ９−ｃＡＰＰ：ＦＥ６５のＰＴＢ２ドメインとの相互作用が知られて
いるＡＰＰタンパク質の細胞質ドメインをコードする配列を含むプラスミドｐＬ
ｅｘ９。このプラスミドは、Ｌ４０株におけるＰＡＰ１タンパク質の相互作用特
異性を試験するために使用した。

【００９０】 （４）合成オリゴヌクレオチド： ＴＴＡＡＧＡＡＴＴＣ ＧＧＡＡＧＴＣＣＡＧ ＣＡＧＧＴＡＧ（配列５） ＡＴＴＡＧＧＡＴＣＣ ＣＴＡＣＡＣＡＣＡＡ ＧＧＣＡＧＧＧＡＧ（配列６） ＥｃｏＲＩ部位とＢａｍＨＩ部位とに挟まれたパーキンの中央領域に対応するＰ
ＣＲフラグメントを得るために使用したオリゴヌクレオチド。 ＧＣＧＴＴＴＧＧＡＡ ＴＣＡＣＴＡＣＡＧ（配列７） ＧＧＴＣＴＣＧＧＴＧ ＴＧＧＣＡＴＣ（配列８） ＣＣＧＣＴＴＧＣＴＴ ＧＧＡＧＧＡＡＣ（配列９） ＣＧＴＡＴＴＴＣＴＣ ＣＧＣＣＴＴＧＧ（配列１０） ＡＡＴＡＧＣＴＣＧＡ ＧＴＣＡＧＴＧＣＡＧ ＧＡＣＡＡＧＡＧ（配列１１）
ＰＡＰ１遺伝子に対応するインサートを配列決定するために使用したオリゴヌク
レオチド。 オリゴヌクレオチドはＡｐｐｌｉｅｄ Ｓｙｓｔｅｒｍ ＡＢＩ ３９４−０
８装置で合成する。合成したオリゴヌクレオチドをアンモニア水によって合成マ
トリックスから剥離させ、１０倍容のｎ−ブタノールで２回沈降させ、次いで水
に入れる。光学密度の測定によって定量する（１ＯＤ_２６０は３０μｇ／ｍｌに
対応する）。

【００９１】 （５）プラスミドＤＮＡの調製 ＤＮＡ精製キットを製造業者であるＱｕｉａｇｅｎによって指示されたプロト
コルに従って使用してプラスミドＤＮＡの少量生産及び大量生産を行った： −Ｑｕｉａｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット，ｒｅｆ：２７１０６
−Ｑｕｉａｐｒｅｐ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉｐｒｅｐキット，ｒｅｆ：１２
１６３。

【００９２】 （６）ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によるＤＮＡの酵素増幅： ＤＮＡマトリックス、ｄＮＴＰ（０．２ｍＭ）、ＰＣＲバッファ（１０ｍＭの
トリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．５、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＫＣｌ、０．０１
％のゼラチン）、各１０−２０ピコモルのオリゴヌクレオチド及び２．５ＩＵの
Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）の存在
下、最終容量１００μｌでＰＣＲ反応を行う。標本が蒸発しないように混合物を
２滴のパラフィン油で覆う。Ａｐｐｌｉｇｅｎｅの“Ｃｒｏｃｏｄｉｌｅ ＩＩ
”装置を使用した。

【００９３】 マトリックス変性温度としては９４℃、ハイブリダイゼーション温度としては
５２℃、酵素による伸長温度としては７２℃を使用した。

【００９４】 （７）結合： すべての結合反応は、１００−２００ｎｇのベクター、０．１−０．５μｇの
インサート、４０ＩＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼ酵素（Ｂｉｏｌａｂｓ）及び結合
バッファ（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．８；１０ｍＭのＭｇＣｌ_２；１
０ｍＭのＤＴＴ；１ｍＭのＡＴＰ）の存在下、最終容量２０μｌで３７℃で１時
間行った。陰性対照はインサートの非存在下でベクターを結合させることによっ
て作製した。

【００９５】 （８）細菌の形質転換： プラスミドによる細菌の形質転換は、以下のプロトコルで行う。１０μｌの結
合容量を使用してＴＧ１細菌をＣｈｕｎｇの方法（Ｃｈｕｎｇら，１９８９）に
従って形質転換させる。形質転換後の細菌をアンピシリンを加えたＬＢ培地で平
板培養し、３７℃で１６時間インキュベートする。

【００９６】 （９）ＤＮＡの分離及び抽出： Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８９）のアガロースゲル電気泳
動によってＤＮＡをサイズに基づいて分離する。ＴＢＥバッファ（９０ｍＭのト
リス塩基；９０ｍＭのホウ酸塩；２ｍＭのＥＤＴＡ）中の１％アガロースゲル（
Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を使用する。

【００９７】 （１０）プラスミドＤＮＡの蛍光配列決定： 配列決定技術としては、Ｓａｎｇｅｒの方法（Ｓａｎｇｅｒら，１９７７）を
基本とし、この方法をＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって開発され
た蛍光による配列決定に応用できるように修正した方法を使用した。使用したプ
ロトコルは、システム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，１９９７）の考案者によっ
て記載されたプロトコルである。

【００９８】 （１１）酵母の形質転換： Ｇｉｅｔｚによって開発された従来の酵母形質転換技術（Ｇｉｅｔｚら，１９
９２）を以下のように修正した方法で酵母にプラスミドを導入する： 特にリンパ球ｃＤＮＡライブラリーによって酵母を形質転換させる場合には、
使用される酵母がＬｅｘＡタンパク質に融合したパーキンの中央部分をコードす
るプラスミドｐＬｅｘ９−Ｐａｒｋｉｎｅ（１３５−２９０）を含む。この酵母
をアミノ酸ＣＳＭ−Ｔｒｐを補充した２００ｍｌのＹＮＢ最小培地中、３０℃で
撹拌下に１０^７細胞／ｍｌの密度になるまで培養する。上記プロトコルに従って
酵母を形質転換させるために、各々に５μｇのライブラリーを加えておいた５０
μｌ容の１０本の管に細胞浮遊液を注ぎ分けた。熱ショックを２０分間与え、次
いで遠心によって細胞を収集し、１００ｍｌのＹＰＤ培地に再浮遊させて３０℃
で１時間維持し、ＣＳＭ−Ｌｅｕ，−Ｔｒｐを補充した１００ｍｌのＹＮＢ培地
に再浮遊させて３０℃で３時間３０分間維持した。ＣＳＭ−Ｔｒｐ，−Ｌｅｕを
補充した固形ＹＮＢ培地に形質転換細胞を種々の希釈度で平板培養することによ
って形質転換効率を測定した。培養物を３０℃で３日間維持した後、得られたコ
ロニーを計数し、リンパ球ライブラリーのＤＮＡ１μｇあたりの形質転換率を算
定した。

【００９９】 （１２）酵母から抽出したプラスミドの単離： ３０℃で１６時間インキュベートした５ｍｌの酵母培養物を遠心し、２００μ
ｌの溶菌バッファ（１Ｍのソルビトール、０．１ＭのＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ
４，ｐＨ７．４、１２．５ｍｇ／ｍｌのザイモリアーゼ）に入れ、３７℃で１時
間インキュベートする。次に、ＤＮＡ精製キット、Ｑｕｉａｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ
Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット，ｒｅｆ２７１０６を製造業者であるＱｕｉａｇｅｎ
が指示したプロトコルに従って使用して溶菌液を処理する。

【０１００】 （１３）β−ガラクトシダーゼの活性試験： ばらばらにした酵母クローンを収容したシャーレにニトロセルロースシートを
予め配置する。次いでこのシートを液体窒素に３０秒間浸漬させて酵母を破裂さ
せ、β−ガラクトシダーゼ活性を遊離させる。解凍後、ニトロセルロースシート
のコロニー付着面を上にして別のシャーレに配置する。このシャーレには、Ｎ，
Ｎ−ジメチルホルムアミド中に４０ｍｇ／ｍｌの濃度で１５μｌのＸ−Ｇａｌ（
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含む１．
５ｍｌのＰＢＳ溶液（６０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、４０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、
１０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＳＯ_４，ｐＨ７）を予め含浸させたＷｈａｔｍ
ａｎペーパーを敷いておく。次にシャーレを３７℃のオーブンに入れる。１２時
間後に膜上のコロニーが青色に変色すると試験結果は陽性であると判定する。

【０１０１】 実施例１：パーキンの中央部分と細菌リプレッサーＬｅｘＡとの融合タンパク
質を発現させ得るベクターの構築 ツーハイブリッドシステムを使用するライブラリースクリーニングでは、パー
キンの中央領域が細菌リプレッサーＬｅｘＡのようなＤＮＡ結合タンパク質に融
合していることが必要である。この融合タンパク質を発現させるために、配列３
または４で表される配列中に存在するパーキンの中央領域をコードする配列をＬ
ｅｘＡタンパク質に対応する配列と同じ読取り枠に導入したベクターｐＬｅｘ９
（材料及び方法の項参照）を使用する。

【０１０２】 アミノ酸１３５を起点とするパーキンの中央領域の１５６個のアミノ酸に対応
する４６８ｂｐのＤＮＡフラグメントがオリゴヌクレオチド（配列５及び６）か
らＰＣＲによって得られた。これらのオリゴヌクレオチドはまた、５′末端にＥ
ｃｏＲＩ部位を導入し、３′末端に終結コドン及びＢａｍＨＩ部位を導入した。
ＬｅｘＡタンパク質をコードする配列の下流でプラスミドｐＬｅｘ９の多重クロ
ーニング部位のＥｃｏＲＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間にＰＣＲフラグメントを
導入し、ベクターｐＬｅｘ９−Ｐａｒｋｉｎｅ（１３５−２９０）（図１）を作
製した。

【０１０３】 ＤＮＡの配列決定によって構築物を検証した。この検証から、このフラグメン
トがＰＣＲ反応中に生じる突然変異を有していないこと、及び、ＬｅｘＡに対応
するフラグメントの読取り枠と同じ読取り枠に融合していることが判明した。

【０１０４】 実施例２：リンパ球融合ライブラリーのスクリーニング この実施例ではツーハイブリッド法（Ｆｉｅｌｄｓ ＆ Ｓｏｎｇ，１９８９
）を使用した。融合ライブラリーのスクリーニングによって、ＧＡＬ４のトラン
スアクチベータードメインに融合タンパク質を産生し実施例１に記載の有益なタ
ンパク質（パーキンの中央領域）と相互作用できるクローンを同定し得る。この
相互作用によってトランスアクチベーターが復元され、Ｌ４０株中でリポーター
遺伝子Ｈｉｓ３及びＬａｃＺの発現を誘発し得る。

【０１０５】 このスクリーニングを行うために、Ｒｉｃｈａｒｄ Ｂｅｎａｒｏｕｓ（Ｐｅ
ｙｔａｖｉら，１９９９）によって提供されたヒト末梢リンパ球に由来のｃＤＮ
Ａから作製された融合ライブラリーを選択した。リンパ球ライブラリーによって
酵母を形質転換させ、後述する手順で陽性クローンを選択した。

【０１０６】 スクリーニングの際には、少なくとも１つの酵母中に融合ライブラリーの独立
プラスミドの各々とプラスミドｐＬｅｘ９−Ｐａｒｋｉｎｅ（１３５−２９０）
とが十分な確率で共存していなければならない。この確率が十分に維持されるた
めには、酵母が高い形質転換効率を有していることが重要である。このために、
１μｇのＤＮＡあたり２．６×１０^５の細胞を形質転換させるという形質転換効
率を与える酵母形質転換プロトコルを選択した。更に、異なる２つのプラスミド
によって酵母の同時形質転換を行うと形質転換効率が低下するので、好ましい方
法としてプラスミドｐＬｅｘ９−Ｐａｒｋｉｎｅ（１３５−２９０）によって予
め形質転換させた酵母を使用した。表現型Ｈｉｓ−，Ｌｙｓ−，Ｌｅｕ−，Ａｄ
ｅ−をもつこの菌株Ｌ４０ ｐＬｅｘ９−Ｐａｒｋｉｎｅ（１３５−２９０）を
、融合ライブラリーの５０μｇのプラスミドＤＮＡによって形質転換させた。こ
の量のＤＮＡから概算で１．３×１０^７の形質転換細胞を得ることができたが、
この数は、ライブラリーを構成する独立プラスミドの数をやや上回る数に対応す
る。この結果から、ライブラリーのプラスミドのほぼ全部が酵母を形質転換させ
るために役立ったと考えることができる。機能性トランスアクチベーターを復元
し得る形質転換細胞の選択は、２．５ｍＭの３−アミノ−１，２，４−トリアゾ
ール及び６２０ｍｇ／リットルのＣＳＭ（Ｂｉｏ１０１）を補給したヒスチジン
、ロイシン及びトリプトファン非含有のＹＮＢ培地で行った。

【０１０７】 この選択によって、表現型Ｈｉｓ＋を有している多数のクローンが得られた。
得られたクローンの有効性を別のリポーター遺伝子ＬａｃＺの発現によって検査
するために、これらの形質転換体にβ−ガラクトシダーゼ活性試験を行った。１
１５個のクローンがタンパク質−タンパク質相互作用に対応できる二重表現型Ｈ
ｉｓ＋，β−Ｇａｌ＋を有していた。

【０１０８】 実施例３：選択クローン中のライブラリーのプラスミドの単離 パーキンの中央領域と相互作用できるタンパク質を同定するために、ツーハイ
ブリッドスクリーニングによって選択した酵母に含まれていた融合ライブラリー
のプラスミドを抽出した。このようなプラスミドを大量に得るためには、この単
離に先立って、陽性酵母株のＤＮＡ抽出物によって大腸菌を形質転換しておくこ
とが必要である。この抽出物に含まれているライブラリーのプラスミドは酵母／
大腸菌シャトルプラスミドなので、細菌体内で容易に複製し得る。ロイシン欠失
培地におけるロイシン要求性ＨＢ１０１菌株の相補性によってライブラリーのプ
ラスミドを選択した。

【０１０９】 ＤＮＡ抽出物による酵母の形質転換後に得られた細菌コロニーのプラスミドＤ
ＮＡを、制限酵素消化及びＤＮＡフラグメントのアガロースゲル分離によって分
析した。分析した１１５個のクローン中で、ライブラリーの１つのプラスミドを
含むクローンが残りのクローンとは異なるプロフィルを有していた。このプラス
ミドをｐＧＡＤ−Ｌｙ１１１ｂと命名し、より詳細に検討した。

【０１１０】 実施例４：同定されたプラスミドに含まれていたインサートの配列決定 同定されたプラスミドに含まれていたインサートを配列決定するために、先ず
第一段階で、リンパ球ｃＤＮＡライブラリー挿入ＥｃｏＲＩ部位の近傍のＧＡＬ
４ＴＡ配列に相補的な配列７のオリゴヌクレオチドを使用した。次に第二段階で
、配列決定の進行中に得られたインサートの配列に対応する配列８から配列１１
のオリゴヌクレオチドを使用した。得られた配列を配列１に示す。このようにし
て同定されたタンパク質をＰＡＰ１（パーキン結合タンパク質１）と命名した。

【０１１１】 このインサートの配列とデータバンクＧＥＮＢａｎｋ及びＥＭＢＬ（Ｅｕｒｏ
ｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂ）に含まれていた配列
とを比較すると、シナプトタグミンファミリーの種々の構成員にタンパク質レベ
ルで２５％の相同性を示した。シナプトタグミンは脳及びその他の組織で発現さ
れる少なくとも１１個の異なる遺伝子によってコードされている膜タンパク質フ
ァミリーの構成員である。これらは非反復のトランスメンブランドメインとＣ_２ と呼ばれる２つのカルシウム調節ドメインとを含んでいる。シナプトタグミンと
ＰＡＰ１タンパク質との相同性はこのドメインに見出される。その他の有意な相
同性は全く観察されなかった。

【０１１２】 実施例５：パーキンの中央領域とＰＡＰ１タンパク質との相互作用特異性の分
析 ＰＡＰ１タンパク質に対応するフラグメントとパーキンの中央領域との相互作
用特異性を決定するために、無関係の別のタンパク質と共に特異的ツーハイブリ
ッド相互作用試験を実施した。この試験を行うために、プラスミドｐＬｅｘ９−
Ｐａｒｋｉｎ（１３５−２９０）に代えて、それぞれがＡＰＰの細胞質ドメイン
またはＬｅｘＡのＤＮＡ結合ドメインに融合したＨａＲａｓＶａｌ１２タンパク
質をコードしている対照プラスミドｐｌｅｘ９−ｃＡＰＰまたはｐＬｅｘ９−Ｈ
ａＲａｓＶａｌ１２、及び、ツーハイブリッドライブラリーのスクリーニングの
際に単離されたプラスミドによってＬ４０株を形質転換させた。タンパク質−タ
ンパク質相互作用を判定するために、種々のプラスミドによって形質転換させた
細胞に対してβ−Ｇａｌ活性試験を行った。この試験の結果によれば、ツーハイ
ブリッドライブラリーのスクリーニングの際に単離されたプラスミド及びプラス
ミドｐＬｅｘ９−Ｐａｒｋｉｎｅ（１３５−２９０）によって形質転換させた酵
母だけがβ−Ｇａｌ＋活性を有しており、従ってＰａｒｋｉｎｅの中央領域とＰ
ＡＰ１タンパク質との相互作用を示した。このＰＡＰ１フラグメントはｃＡＰＰ
タンパク質またはＨａＲａｓＶａｌ１２タンパク質と相互作用しないと考えられ
るので、この相互作用は特異的であることが判明する。

【０１１３】 従ってこれらの結果は、パーキンと特異的に相互作用し得るＰＡＰ１と命名さ
れた新規なタンパク質の存在を示す。シナプトタグミンに近縁のこのタンパク質
は既知タンパク質に対しては有意な相同性を全く有していないので、治療用途ま
たは診断用途で、抗体、プローブまたはペプチドを産生させるため、あるいは、
活性分子をスクリーニグするために使用することができる。

【０１１４】 実施例６：ヒト肺ＤＮＡライブラリーからのＰＡＰ１遺伝子のクローニング ヒトＰＡＰ１遺伝子の完全配列を同定し変異形態の存在を特性決定する目的で
、配列１を２つの電子伸長方法で処理した。この処理によって、配列１に比べて
３３０ｂｐの伸長を有しているそれぞれ１６４４ｂｐ及び１６４６ｂｐの２つの
電子配列が得られた。しかしながらこれらの配列を分析すると、翻訳後のコンセ
ンサス領域が明らかな違いを有していた。即ち、一方の配列では４２０ａａのＯ
ＲＦ、他方の配列では２３０ａａのＯＲＦが得られた。得られたタンパク質配列
を既知の配列に比較すると、ヒトシナプトギャミンＩ（ｐ６５）（ｐ２１５７９
）とオーバーラップする２９３個のアミノ酸で２４％の相同性が判明した。シナ
プトギャミンＩの機能は、シナプスのゾーンにシナプス小胞を輸送しているとき
の膜相互作用の調節機能である。シナプトギャミンＩはある程度特異的に酸性リ
ン脂質と結合する。更に、シナプトギャミンと活性化プロテインキナーゼＣ受容
体との間でカルシウム依存性相互作用が報告されている。シナプトギャミンはま
た、別の３つのタンパク質、即ち、ノイレキシン、シンタキシン及びａｐ２と結
合し得る。同定された配列とシナプトギャミンファミリーとの間の相同性がいず
れも早期に急激に消滅することを考察すると、同定された配列は天然配列に比較
して欠失を有している可能性が大きい。この仮説を検証し、配列の有効性を確認
するために、１６４４ｂｐの配列を使用してＲＴ−ＰＣＲ及び配列決定の実験を
行った。得られた配列は４２０ａａのＯＲＦを含んでおり、同程度のシナプトギ
ャミン相同性を有している。

【０１１５】 もっと長い配列を作製するため、及び、得られた配列がスプライシング形態に
対応するか否かを検証するために、ヒト肺のｃＤＮＡ調製物に対してオリゴＬ１
及びＬ２を使用し、有効性が確認された配列の３′領域から５′−ＲＡＣＥによ
る伸長実験を行った。

【０１１６】 得られた結果を図２に示す。これらの結果は、６個の異なる５′末端に対応す
る８個のクローンが同定されたことを示す。３つのクローン（クローンＡ１２、
Ｆ２、Ｆ１２）はＯＲＦを遮断するＳＴＯＰコドンを含んでおり、クローンＡ３
はＯＲＦを全く含んでいない。ＲＴ−ＰＣＲ及びｎｅｓｔｅｄ ＲＴ−ＰＣＴに
よって種々の転写物の存在を確認した（表１）。

【０１１７】

【表１】

【０１１８】 プライマー対Ｕ３−Ｌ３及びＣ−Ｂは配列の共通フラグメントに特異的であり
、オリゴＡ及びＵ１は初期配列及びクローンＣ１１に特異的であり、オリゴＬ４
は初期配列に特異的であり、プライマーＵ２はクローンＡ３に特異的である。種
々のクローンの共通領域に局在するオリゴＬ３及びＬ７（図２）によって二次５
′−ＲＡＣＥを行った。得られた結果を図３及び図４に示す。種々の転写物の存
在をＲＴ−ＰＣＲ及びｎｅｓｔｅｄ ＲＴ−ＰＣＴによって確認した（表２）。

【０１１９】

【表２】

【０１２０】 プライマー及びオリゴヌクレオチドの配列を表３及び４（配列１６−３７）に
示す。

【０１２１】

【表３】

【０１２２】

【表４】

【０１２３】 これらの結果を総合すると、ヒト肺から同定されたＰＡＰ１タンパク質の長い
アイソフォーム（図９、配列１２及び１３）及び短いアイソフォーム（図１０、
配列１４及び１５）に対応するコンセンサス配列は有効である。以後の実施例で
はこのタンパク質をＬＹ１１１と呼ぶ。長いアイソフォームは配列１２の残基２
３７−２０６９に局在する１８３３ｂｐのＯＲＦによってコードされており、６
１０個のアミノ酸を含んでいる。ポリアデニル化シグナルはヌクレオチド２３１
５以後に局在している。短いアイソフォームは配列１４の残基４２９−１３７０
に局在する９４２ｂｐのＯＲＦによってコードされており、３１３個のアミノ酸
を含んでいる。ポリアデニル化シグナルはヌクレオチド１６１６以後に局在して
いる。

【０１２４】 次に、プローブ（ａｍｐｌｉｍｅｒＣＤ及びＥ−Ｆ）によって種々のヒト組織
に対するノーザンブロット実験を行うと、筋肉で６ｋｂの転写産物、心臓で３ｋ
ｂの転写産物、胎児肝で６ｋｂの転写産物が検出された。、更に、ヒト胎児脳の
転写産物のクローニングについて実施例７に記載する。 種々のタンパク質データベースで種々の相同試験を実施した。その結果を以下の
表５に示す。

【０１２５】

【表５】

【０１２６】 実施例７：ヒト胎児脳の相補的ＤＮＡを用いたＰＡＰ１の２つの全長転写産物
（Ｌｙ１１１Ｂ）のクローニング ヒト脳内に全長（“完全”）Ｌｙ１１１ｂ転写産物が存在することを確認する
ために、ヒト胎児脳に由来の相補的ＤＮＡからＰＣＲを実施した（Ｍａｒａｔｈ
ｏｎ Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）。プライマーとしてオリゴヌ
クレオチドＬｙＦ１（ＡＡＴ ＧＧＡ ＡＧＧ ＧＣＧ ＴＧＡ ＣＧＣ、図５
、配列３８）及びＨＡ７１（ＣＣＴ ＣＡＣ ＧＣＣ ＴＧＣ ＴＧＣ ＡＡＣ
ＣＴＧ、配列３９）を使用した。約２キロ塩基の短いＤＮＡフラグメントを増
幅した。この一次ＰＣＲの産物をｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲのマトリックスとして使
用した。このＰＣＲにはオリゴヌクレオチドＬｙＥｃｏＦ（ＧＣＡＣＧＡＡＴＴ
Ｃ ＡＴＧ ＧＣＣ ＣＡＡ ＧＡＡ ＡＴＡ ＧＡＴ ＣＴＧ、配列４０）及
びＨＡ７２（ＣＴＧ ＴＣＴ ＴＣＧ ＴＡＴ ＴＴＣ ＴＣＣ ＧＣＣ ＴＴ
Ｇ、配列４）を使用した。増幅産物を制限酵素ＥｃｏＲＩ（オリゴヌクレオチド
ＬｙＥｃｏＦに組込んだ）及びＢｓｔＥＩＩ（図２）で消化し、発現ベクターｐ
ｃＤＮＡ３に挿入し、次いでそれらの配列を決定した。得られたクローンの配列
を解析すると、ヒト胎児脳に２つの全長転写産物Ｌｙ１１ｂが存在し得ることが
判明した（図５）。第一の転写産物（Ｌｙ１１１ｂ_{ｆｕｌｌＡ}）はヒトの肺で同
定されたｍＲＮＡに対応し（実施例６）、６０９アミノ酸のタンパク質（ｐＬｙ
１１１ｂ_{ｆｕｌｌＡ}；図５及び６の配列４２及び４３）をコードしている。第二
の転写産物（Ｌｙ１１１ｂ_{ｆｕｌｌＢ}）は共通の一次ｍＲＮＡの選択的スプライ
シング産物を表す可能性が高い。この転写産物はＬｙ１１ｂ_{ｆｕｌｌＡ}に等しい
が、ヒト肺で有効性が確認された配列のヌクレオチド７５２と９５６との間の配
列が存在しない（配列４２）。従って、Ｌｙ１１１ｂ_{ｆｕｌｌＢ}は、アミノ酸１
７２−２４０のドメイン（図５、７、配列４４−４５）が欠失したｐＬｙ１１１ _{ｆｕｌｌＡ} に等しい５４１個のアミノ酸から成るタンパク質（ｐＬｙ１１１ｂ_{ｆ ｕｌｌＢ} ）をコードしている。２つのタンパク質ｐＬｙ１１１ｂ_{ｆｕｌｌＡ}／_{ｆ ｕｌｌＢ} は、酵母で同定されたアミノ酸１３５−２９０を含むパーキンのフラグ
メントと相互作用するドメイン（初期配列Ｌｙ１１１ｂ、図５）を組込んでおり
、従って理論的にこの相互作用を維持し得る。 ｐＬｙ１１１ｂ_{ｆｕｌｌＡ／ｆｕｌｌＢ}タンパク質はＲＩＭ／Ｒａｂｐｈｉｌｉ
ｎｅファミリーに属する。

【０１２７】 ｐＬｙ１１１ｂ_{ｆｕｌｌＡ／ｆｕｌｌＢ}はＲＩＭ／ｒａｂｐｈｉｌｉｎｅファ
ミリーのタンパク質に相同性を有しており（Ｗａｎｇ Ｙ，Ｓｕｇｉｔａ Ｓ
＆ Ｓｕｄｈｏｆ ＴＧ，Ｔｈｅ ＲＩＭ／ＮＩＭ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｎｅ
ｕｒｏｎａｌ Ｃ２ ｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅ
ｍ（２０００）２７５，２００３３−２００４４）、特にｇｒａｎｕｌｏｐｈｉ
ｌｉｎｅｓに相同性を有している（Ｗａｎｇ Ｊｉｅ，Ｔａｋｅｕｃｈｉ Ｔ，
Ｙｏｋｏｔａ Ｈ ＆ Ｉｚｕｍｉ Ｔ．Ｎｏｖｅｌ Ｒａｂｐｈｉｌｉｎ−３
−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｉｎｓｕｌｉ
ｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｇｒａｎｕｌｅｓ ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ
ｂｅｔａ ｃａｌｌｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９９９）２７４，２８５４
２−２８５４８）。該タンパク質の特徴は、Ｎ末端部にジンクフィンガードメイ
ンが存在し、Ｃ末端部に２つのＣ_２ドメインが存在することである（図６及び図
７）。ＲＩＭ／ｒａｂｐｈｉｌｉｎｅファミリーのタンパク質のジンクフィンガ
ードメインはＲａｂタンパク質との相互作用に関与していた。Ｒａｂタンパク質
はＧＴＰに結合するタンパク質なので、真核細胞の膜輸送機構の必須成分である
。また、ＲＩＭ／ｒａｂｐｈｉｌｉｎｅファミリーのタンパク質のＣ_２ドメイン
がリン脂質との相互作用を介して膜に結合し得ることは既に文献に記載されてい
る。 ＣＯＳ−７系の細胞におけるｐＬｙ１１１ｂ_{ｆｕｌｌＡ／ｆｕｌｌＢ}タンパク質
の発現：パーキン遺伝子との共存的局在 転写産物Ｌｙ１１１ｂ_{ｆｕｌｌＡ／Ｂ}のコーディング配列を真核発現ベクター
ｐｃＤＮＡ３に、Ｎ末端ｍｙｃエピトープをコードする配列に位相合せして挿入
した（ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃＬｙ１１１ｂ_{ｆｕｌｌＡ／Ｂ}）。これらのベクター
をトランスフェクトしたＣＯＳ−７系の細胞は、約６７ｋＤａの見掛け分子量を
もつタンパク質（ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃＬｙ１１１ｂ_{ｆｕｌｌＡ}）と６０ｋＤａ
の見掛け分子量をもつタンパク質（ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃＬｙ１１１ｂ_{ｆｕｌｌ Ｂ} ）とを産生する。これらの分子量は予想分子量に一致する。Ｎ末端ｍｙｃエピ
トープに対する抗体で免疫標識することによってこのタンパク質を検出すると、
このタンパク質は、ＣＯＳ−７系の細胞の細胞質、細胞突起及びときには核の内
部に不均一に点状に分布している（図８ａ，ｂ、カラムＡ）。ＣＯＳ−７系の細
胞中で抗パーキンＡｓｐ５抗体を用いて検出されたパーキンによってこれらのタ
ンパク質が超発現するとき（図８ａ，ｂ、カラムＢ）、これらのタンパク質の相
似的分布及び共存的局在が観察される（図８ａ，ｂ、カラムＣ）。

【０１２８】 （参考文献）

【０１２９】

【表６】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ベクターｐＬｅｘ９−Ｐａｒｋｉｎｅ（１３５−２９０）の概略図である。

【図２】 一次５′−ＲＡＣＥ実験の結果を示す。

【図３】 二次５′−ＲＡＣＥ実験の結果を示す。

【図４】 二次５′−ＲＡＣＥ実験のクローンＣ５及びＤ４の編成の詳細図を示す。

【図５】 ヒト脳から単離された転写物の構造を表す。

【図６】 ヒト脳のＬＹ１１１（全長）の核酸及びタンパク質の配列を示す。二重下線：
ジンクフィンガードメインの保存システイン；太字：Ｃ_２１ドメイン；イタリッ
ク体：Ｃ_２２ドメイン。

【図７】 ヒト脳のＬＹ１１１（短縮形）の核酸及びタンパク質の配列を示す。二重下線
：ジンクフィンガードメインの保存システイン；太字：Ｃ_２１ドメイン；イタリ
ック体：Ｃ_２２ドメイン。

【図８ａ】 ＣＯＳ−７細胞中で発現後の短いＬＹ１１１タンパク質（８ｂ）または長いＬ
Ｙ１１１タンパク質（８ａ）の局在を示す。

【図８ｂ】 ＣＯＳ−７細胞中で発現後の短いＬＹ１１１タンパク質（８ｂ）または長いＬ
Ｙ１１１タンパク質（８ａ）の局在を示す。

【図９】 ヒト肺のＬＹ１１１（非短縮形）の核酸及びタンパク質の配列を示す。

【図１０】 ヒト脳のＬＹ１１１（短縮形）の核酸及びタンパク質の配列を示す。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 25/00 ４Ｃ０８５ 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 ４Ｃ０８７ Ａ６１Ｐ 25/00 16/18 ４Ｈ０４５ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 7/00 16/18 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 7/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ブリス，アレクシ フランス国、エフ−75006・パリ、リユ・ サン・タンドレ・デ・ザール、51 (72)発明者 フルニエ，アラン フランス国、エフ−92290・シヤトネイ・ マラブリ、アブニユ・ロジエ・サレング ロ、28 (72)発明者 プラデイエ，ローラン フランス国、エフ−91370・ベルエール、 アブニユ・カーンバセレ、23 (72)発明者 プラデ，カトリーヌ フランス国、エフ−94320・テイエ、アブ ニユ・ドユ・ジエネラル・ドウ・ゴール、 30 (72)発明者 アルヌウ−レギーニユ，イザベル フランス国、エフ−94430・シユネビエ ル・シユール・マルヌ、リユ・ドウ・ブ リ、112 (72)発明者 ロジエ−モントユ，マリー−フランソワー ズ フランス国、エフ−92160・アントニー、 リユ・デ・バコネ、21 (72)発明者 コルテイ，オルガ フランス国、エフ−75013・パリ、リユ・ ドウ・シユバルレ、151 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA44 BA80 CA04 DA02 EA04 GA11 HA12 HA17 4B063 QA18 QQ42 QQ52 QR56 QR62 QS25 QS34 4B064 AG01 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA87X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA03 AA06 AA07 AA13 AA17 BA44 MA02 NA13 NA14 ZA02 4C085 AA13 AA14 BB11 DD61 DD62 DD63 EE01 4C087 AA01 AA02 BC83 MA02 NA13 NA14 ZA02 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA45 DA76 DA86 EA20 EA30 EA50 FA74

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＰＡＰ１タンパク質またはそのホモローグとパーキンとの相
   互作用を少なくとも部分的に変調し得る化合物。
2. 【請求項２】 前記相互作用を少なくとも部分的に、抑制、阻害または刺激
   することを特徴とする請求項１に記載の化合物。
3. 【請求項３】 ＰＡＰ１タンパク質またはそのホモローグとパーキンとの相
   互作用ドメインに結合し得ることを特徴とする請求項１または２に記載の化合物
   。
4. 【請求項４】 ペプチド型、核酸型、脂質型、糖型の化合物または抗体であ
   ることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物。
5. 【請求項５】 ペプチド配列２またはその誘導体の１つを全面的または部分
   的に含むことを特徴とする請求項４に記載の化合物。
6. 【請求項６】 パーキンと相互作用するＰＡＰ１タンパク質の部位の全部ま
   たは機能部に対応する配列をもつ領域を含むペプチド化合物であることを特徴と
   する請求項４に記載の化合物。
7. 【請求項７】 非機能化したエフェクター領域を含むＰＡＰ１タンパク質（
   及び／または相同形態）から誘導されたペプチド化合物であることを特徴とする
   請求項４に記載の化合物。
8. 【請求項８】 配列２またはその誘導体もしくはフラグメントを含むポリペ
   プチド。
9. 【請求項９】 配列２の少なくとも５個、好ましくは少なくとも９個、より
   好ましくは少なくとも１５個の連続する残基を含む請求項８に記載のポリペプチ
   ド。
10. 【請求項１０】 配列１３、１５、４３もしくは４５またはそれらの変異体
    の全部または一部、特に配列１３、１５、４３もしくは４５の少なくとも５個、
    好ましくは少なくとも９個、より好ましくは少なくとも１５個の連続する残基を
    含む請求項８に記載のポリペプチド。
11. 【請求項１１】 請求項４から１０のいずれか一項に記載のペプチド化合物
    をコードしている核酸。
12. 【請求項１２】 配列１、１２、１４、４２もしくは４４またはこれらの配
    列から誘導された配列の全部または一部を含むことを特徴とする請求項１１に記
    載の核酸。
13. 【請求項１３】 請求項８または１１に記載のポリペプチドをコードしてい
    る核酸。
14. 【請求項１４】 請求項１１から１３のいずれか一項に記載の核酸またはそ
    れらの相補鎖とハイブリダイズし得る核酸、特にヌクレオチドプローブ。
15. 【請求項１５】 請求項１１から１４のいずれか一項に記載の核酸を含むベ
    クター。
16. 【請求項１６】 請求項１１から１４のいずれか一項に記載の核酸を含む組
    換え欠陥ウイルス。
17. 【請求項１７】 配列１６−４１及び４６の核酸から選択された核酸。
18. 【請求項１８】 請求項４から１０のいずれか一項に記載のペプチド化合物
    に対する抗体であることを特徴とする抗体または抗体のフラグメントもしくは誘
    導体。
19. 【請求項１９】 請求項９または１０に記載のポリペプチドを認識すること
    を特徴とする請求項１８に記載の抗体。
20. 【請求項２０】 請求項１から１０のいずれか一項に記載の化合物または請
    求項１８または１９に記載の抗体を少なくとも含む医薬組成物。
21. 【請求項２１】 ＰＡＰ１タンパク質またはそのホモローグとパーキンとの
    相互作用を少なくとも部分的に変調し得る非ペプチド性化合物または非ペプチド
    単独性化合物。
22. 【請求項２２】 請求項５から７のいずれか一項に記載のペプチドの活性モ
    チーフが非ペプチド性構造または非ペプチド単独性構造と共に複製されているこ
    とを特徴とする請求項２１に記載の化合物。
23. 【請求項２３】 請求項１１から１４のいずれか一項に記載の核酸または請
    求項１５または１６に記載のベクターを少なくとも含む医薬組成物。
24. 【請求項２４】 請求項４から１０のいずれか一項に記載のペプチド化合物
    を含む医薬組成物。
25. 【請求項２５】 神経変性疾患の治療に使用される請求項２２から２４のい
    ずれか一項に記載の組成物。
26. 【請求項２６】 配列２または配列４またはそれらのフラグメントに結合し
    得る分子の選択段階を含む活性分子のスクリーニングまたはキャラクタリゼーシ
    ョン方法。
27. 【請求項２７】 配列１３、１５、４３及び４５またはそれらのフラグメン
    トから選択された配列に結合し得る分子の選択段階を含む活性分子のスクリーニ
    ングまたはキャラクタリゼーション方法。
28. 【請求項２８】 請求項１１から１４のいずれか一項に記載の核酸または請
    求項１５または１６に記載のベクターを含む細胞を前記核酸の発現条件下で培養
    する段階と、産生されたペプチド化合物を回収する段階とを含む請求項４から１
    ０のいずれか一項に記載のペプチド化合物の製造方法。
29. 【請求項２９】 単離された形態のヒトＰＡＰ１タンパク質。
30. 【請求項３０】 請求項１１から１４のいずれか一項に記載の核酸または請
    求項１５または１６に記載のベクターを含む細胞。
31. 【請求項３１】 請求項１１から１４のいずれか一項に記載の核酸をその細
    胞中に含むヒト以外の哺乳動物。