JP2003274943A - グルタチオンペルオキシダーゼ酵素およびグルタチオンペルオキシダーゼ酵素の活性測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 溶液保存中における活性の低下が少ない安定
性に優れた新規なグルタチオンペルオキシダーゼを提供
すること。また、生体内において脂質過酸化物の除去に
関与するグルタチオンペルオキシダーゼ酵素の活性測定
方法として、脂質過酸化物に対する作用を直接的に評価
でき、かつ測定感度の高いグルタチオンペルオキシダー
ゼ活性測定方法を提供すること。 【解決手段】 植物、細菌、藻類、カビ、又はキノコか
ら得られたグルタチオンペルオキシダーゼ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は新規なグルタチオン
ペルオキシダーゼ酵素に関するものである。本発明はま
た、グルタチオンペルオキシダーゼ酵素活性を直接的か
つ高感度に測定する方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】グルタチオンペルオキシダーゼ酵素は、
生体内において脂質過酸化物の除去に関与する酵素のひ
とつである。生物の組織内には様々な原因により脂質過
酸化物が生じる。この脂質過酸化物が分解されて生じる
活性酵素の増加が、動脈硬化、糖尿病などのいわゆる生
活習慣病や、白内障など老化に関わる疾患に関与してい
る。生体内には活性酵素を分解、除去する酵素系が各種
存在しているが、グルタチオンペルオキシダーゼ酵素は
その中のひとつであり、後掲の式１の反応を触媒する酵
素である。グルタチオンペルオキシダーゼ酵素は前記活
性酸素生成のもととなる脂質過酸化物を還元、除去する
働きを有しており、該反応においては水素供与体として
還元型グルタチオンを必要とするペルオキシダーゼであ
る（渡部烈・平塚明：蛋白質核酸酵素（臨時増感）−活
性酸素・生物での生成、消去、作用の分子機構、３３、
２９４９〜２９５６頁（１９８８）参照）。

【０００３】グルタチオンペルオキシダーゼ酵素の活性
を測定する方法は、従来、下記式１および式２に示した
反応を組み合わせることによる、２次的な反応を利用し
た共役酵素法と呼ばれる方法で行われてきた（Ｌｉｔｔ
ｌｅ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２４５巻、３６
３２（１９７０）参照）。すなわち、式１に示す左辺の
過酸化物としてｔ−ブチルヒドロペルオキシドや過酸化
水素のような水溶性物質が用いられるが、反応生成物で
あるヒドロキシ体（過酸化水素の場合は水）の定量化は
困難であることから、式２に示したように、反応液中に
共存するグルタチオン還元酵素を利用して還元型ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオタイドリン酸（ＮＡＤＰ
Ｈ）の減少量を測定する方法であり、ＮＡＤＰＨの減少
量の測定は固定波長における吸光度の減少を測定するこ
とにより行われる。

【０００４】

【化１】

【０００５】グルタチオンペルオキシダーゼ酵素は、こ
れまで動物の血液や各種臓器、ハンヌセラ属微生物に分
布していることが知られており（渡部烈・平塚明：蛋白
質核酸酵素（臨時増感）−活性酸素・生物での生成、消
去、作用の分子機構、３３、２９４９〜２９５６頁（１
９８８）、および特開平４−９４６８２号参照）、ウシ
血小板由来やヒト血小板由来の部分精製品が工業的に生
産されている。しかしながら、これらは得られる量が少
量であること、また溶液中でタンパク質が変性しやすく
失活しやすいという問題点があり、活性安定性の高い新
規なグルタチオンペルオキシダーゼ酵素が求められてい
た。

【０００６】また、上述したグルタチオンペルオキシダ
ーゼ酵素の活性を測定する方法は、２段階の反応に伴っ
て減少するＮＡＤＰＨの減少量を測定しているため、グ
ルタチオンペルオキシダーゼ酵素をいわば間接的に測定
しているといえる。したがって、その結果、反応液にＮ
ＡＤＰＨを再生させるなどの系が存在していると推測さ
れるような場合、正確に活性を測定できないという問題
点があった。また、グルタチオンペルオキシダーゼ酵素
の生体内での働きを考慮して脂質過酸化物に対しての作
用強度を測定しようとした場合、生体内に存在し得ない
合成物質であるｔ−ブチルヒドロペルオキシドを基質と
して用いることは適当ではない。さらに、理論的には溶
液１ミリリットル（ｍＬ）中に酵素が０．１ｕｎｉｔ以
上含まれていれば測定可能であるが、実際には測定試料
に濁りがあるとバックグラウンドの上昇を招くため、１
ｕｎｉｔ以上ないと測定が困難であり、測定しようとす
るグルタチオンペルオキシダーゼ酵素がもともとかなり
高い活性を有するか、あるいは試料溶液を部分精製して
用いない限り正確な測定をすることができないというの
が実情であった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
従来の問題点に鑑みてなされたものであり、溶液保存中
における活性の低下が少ない安定性に優れた新規なグル
タチオンペルオキシダーゼ酵素を提供することを目的と
する。また、本発明は、生体内において脂質過酸化物の
除去に関与するグルタチオンペルオキシダーゼ酵素の活
性測定方法として、脂質過酸化物に対する作用を直接的
に評価でき、かつ測定感度の高いグルタチオンペルオキ
シダーゼ酵素の活性測定方法を提供することを目的とす
る。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を解決すべく鋭意検討した結果、従来においてその存在
が知られていなかった原料からグルタチオンペルオキシ
ダーゼ酵素が得られることを見出した。該グルタチオン
ペルオキシダーゼ酵素は新規なものであり、溶液保存中
における活性の低下が少なく安定性に優れることがわか
った。更に、本発明者等は、基質となる過酸化物として
脂質過酸化物を用いることにより、反応生成物であるヒ
ドロキシ体を直接的に定量することが可能となることを
見出した。この方法によれば、生体内における脂質過酸
化物に対するグルタチオンペルオキシダーゼ酵素作用の
適切な評価が可能となるのみならず、反応性生物を直接
的に定量するためグルタチオンペルオキシダーゼ酵素活
性を極めて高感度に測定することが可能となる。

【０００９】すなわち、本発明は、植物、細菌、藻類、
カビ、又はキノコから得られたグルタチオンペルオキシ
ダーゼ酵素を提供する。

【００１０】また、本発明は、植物、細菌、藻類、カ
ビ、又はキノコから得られたグルタチオンペルオキシダ
ーゼ酵素を含有する抽出物を、極性有機溶媒処理、塩
析、限外濾過処理、吸着クロマトグラフィー、イオン交
換クロマトグラフィーまたはゲル濾過操作により、もし
くはこれらの２種以上を組み合わせて精製することによ
り得られたグルタチオンペルオキシダーゼ酵素を提供す
る。

【００１１】本発明の前記グルタチオンペルオキシダー
ゼ酵素は、分子量が３０，０００〜８０，０００である
ことを特徴とする。

【００１２】また、本発明は、脂質過酸化物と還元型グ
ルタチオンとを主成分として含有する溶液にグルタチオ
ンペルオキシダーゼ酵素を反応させて得られる反応液を
提供する。

【００１３】前記脂質過酸化物は、リノール酸ヒドロペ
ルオキシドまたはリノレン酸ヒドロペルオキシドである
ことが好ましい。

【００１４】また、本発明の反応液においては、植物、
細菌、藻類、カビ、又はキノコから得られたグルタチオ
ンペルオキシダーゼ酵素を用いることが好ましく、前記
原料から抽出されたグルタチオンペルオキシダーゼ酵素
を含有する抽出物を、精製することなく粗酵素液の形態
で用いてもよいし、また極性有機溶媒処理、塩析、限外
濾過処理、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィーまたはゲル濾過操作により、もしくはこれ
らの２種以上を組み合わせて精製した形態で用いてもよ
い。

【００１５】更に、本発明の反応液においては、脂質過
酸化物濃度が０．００１〜１０ミリモル／リットル、還
元型グルタチオン濃度が０．００５〜５０ミリモル／リ
ットルであって、かつ前記脂質過酸化物と還元型グルタ
チオンとの濃度比が１：１〜１：２０であることが好ま
しい。

【００１６】また、本発明は、前記反応液から有機溶媒
を用いて水溶性物質を除去し、高速液体クロマトグラフ
を用いて生成物であるヒドロキシ体を定量する工程を含
む、グルタチオンペルオキシダーゼ酵素の活性測定方法
を提供する。

【００１７】前記高速液体クロマトグラフの溶出液はヘ
キサン、２−プロパノールおよび酢酸を主成分とするこ
とが好ましく、その体積比は９５〜９９：５〜１：０．
０１〜１であることが好ましい。

【００１８】

【発明の実施の形態】本発明は、植物、細菌、藻類、カ
ビ及びキノコから得られた新規なグルタチオンペルオキ
シダーゼ酵素（以下、「本発明のグルタチオンペルオキ
シダーゼ酵素」とも言う。）を提供するものである。植
物としては、例えばネギ類等を挙げることができ、ネギ
類として更に具体的には長ネギ、万能ネギ等が挙げられ
る。また、藻類としてはワカメ、コンブ等を挙げること
ができ、キノコとしてはシイタケ、シメジ、エノキタケ
等を挙げることができる。これらの原料からグルタチオ
ンペルオキシダーゼが得られることは本発明者等により
初めて見出されたものであり、後述するように本発明の
グルタチオンペルオキシダーゼ酵素は新規なものであっ
て溶液保存中における活性低下が少なく安定性に極めて
優れたものである。なお、本発明のグルタチオンペルオ
キシダーゼ酵素は、特に断りのない限り、植物、細菌、
藻類、カビ、又はキノコから抽出されたまま、精製され
ずに粗酵素液の形態のものでも、また抽出された後、後
述する公知の手段により精製された形態のものでもよ
く、本発明のグルタチオンペルオキシダーゼ酵素を含有
し、グルタチオンペルオキシダーゼ活性を有するもので
あればその形態は問わない。

【００１９】本発明のグルタチオンペルオキシダーゼ酵
素の抽出条件について説明する。まず、本発明において
抽出原料となる植物、細菌、藻類、カビまたはキノコ
（以下、「本発明の原料」とも言う。）を水または緩衝
液中で冷却しながらホモジネートし、原料の粉砕溶液を
得る。用いる水または緩衝液のｐＨ、冷却温度およびホ
モジネート時間は適宜設定することができる。

【００２０】例えば、本発明の原料の１質量部（湿質
量）に対して、通常約１〜１０質量部、好ましくは約３
〜８質量部の水もしくは緩衝液を加えて、ステンレス製
ホモジナイザー（例えばヤマト科学社製Ｕｌｔｒａ−ｄ
ｉｓｐｅｒｓｅｒ ＬＫ−２１、カッタ Ｓ２５Ｎ−１
８Ｇ）にて０〜５℃に冷却しながら、０．５〜１分間、
ホモジネートする。ホモジネート中の温度が０℃を下回
ると溶液が凍結し、５℃を超えるとホモジネート中の機
械的な熱により粉砕中の混合液が加熱され、混合液に含
有されるグルタチオンペルオキシダーゼ酵素の活性が失
われる場合がある。ホモジネート時間が０．５分未満で
は充分にホモジネートされず、１分を超えると加熱によ
りグルタチオンペルオキシダーゼ酵素活性が失活する場
合がある。また、添加する水又は緩衝液のｐＨは５〜９
が好ましく、より好ましくはｐＨ７．５〜８．５であ
る。ｐＨ５〜９の範囲を外れるとグルタチオンペルオキ
シダーゼ酵素活性が失活する場合があるため好ましくな
い。

【００２１】なお、本発明のグルタチオンペルオキシダ
ーゼ酵素の抽出原料としての植物、細菌、藻類、カビ及
びキノコは、生のものでもよいが、水分を凍結乾燥等に
より除去した乾燥物からも同様にグルタチオンペルオキ
シダーゼ酵素を抽出することができる。

【００２２】次いで、このようにして得られた粉砕混合
液を遠心分離し、脂肪を分離除去し、更にこの水層部を
ケイソウ土、セルロースなどの濾過助剤を用いて濾過す
ることにより粗酵素液を得る。この粗酵素液は清澄であ
る。

【００２３】得られた粗酵素液は、必要に応じて極性有
機溶媒処理、塩析、限外濾過処理、吸着クロマトグラフ
ィー、ゲル濾過操作、イオン交換クロマトグラフィー等
の公知の手段により、またはこれらを２種以上組み合わ
せて単一成分として分離精製することができる。後述の
実施例において、極性有機溶媒処理、ゲル濾過操作、イ
オン交換クロマトグラフィーを用いた場合について例示
しているが、塩析、限外濾過処理、吸着クロマトグラフ
ィーについては、例えば「生化学実験講座１−タンパク
質の化学Ｉ」、宇井信生、田宮信雄、成田耕造編、５９
頁、６８頁、１３３頁（１９７６）、東京化学同人、等
に従って行うことができる。

【００２４】従来公知のグルタチオンペルオキシダーゼ
酵素は、ウシ血小板由来のものでその分子量が８５，０
００前後（ゲルろ過法による。V. F. Schneider 等, Ho
ppe-Seyler’s Physoil. Chem. 348巻, 540 (1967 参
照)、ウシ赤血球由来のもので８４，０００前後（ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルゲル電気泳動法による。L. Flohe 等,
Hoppe-Seyler’s Physoil. Chem. 352巻, 151 (1971)
参照）と、８０，０００より大きいが、本発明の原料、
すなわち植物、細菌、藻類、カビまたはキノコから得ら
れた本発明のグルタチオンペルオキシダーゼの分子量を
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定
したところ、３０，０００〜８０，０００であった。

【００２５】次に、グルタチオンペルオキシダーゼ酵素
の活性測定方法（以下、単に「本発明の活性測定方法」
とも言う。）について説明する。なお、本発明の活性測
定方法は、本発明の新規なグルタチオンペルオキシダー
ゼ酵素の活性測定に限定されるものではなく、市販のウ
シ血小板由来等、公知のグルタチオンペルオキシダーゼ
酵素の活性測定にも好適に用いることができる。

【００２６】本発明の活性測定方法は、基質として脂質
過酸化物を用い、グルタチオンペルオキシダーゼの触媒
作用により該脂質過酸化物から変換したヒドロキシ体の
生成量を液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）を用いて直接
的に測定することによりグルタチオンペルオキシダーゼ
酵素活性を求めるものである。基質としてｔ−ブチルヒ
ドロペルオキシドや過酸化水素等の水溶性物質を用いた
場合には反応生成物であるヒドロキシ体の定量化が困難
であるため従来においては２次的な反応を利用した共役
酵素法によってしかグルタチオンペルオキシダーゼ活性
を測定することができなかったところ、本発明によれ
ば、基質として用いる脂質過酸化物が変換して生成する
ヒドロキシ体は定量化が容易であるため、グルタチオン
ペルオキシダーゼ酵素活性とヒドロキシ体の生成量との
相関性を利用して直接的かつ高感度にグルタチオンペル
オキシダーゼ酵素活性を測定することが可能となり、更
に基質として脂質過酸化物を用いたことによりグルタチ
オンペルオキシダーゼ酵素の生体内での作用をより適切
に評価することが可能となった。

【００２７】すなわち、本発明の活性測定方法は、前記
式１の左辺に示す過酸化物（Ｒ−ＯＯＨ）として脂質過
酸化物を用い、該脂質過酸化物と還元型グルタチオン
（ＧＳＨ）との混合物にグルタチオンペルオキシダーゼ
酵素を作用させて得られるヒドロキシ体の生成量を測定
することにより、検体中のグルタチオンペルオキシダー
ゼ酵素活性を求めるものである。本発明において基質と
なる脂質過酸化物は特に限定されるものではなく、例え
ばリノール酸ヒドロペルオキシド、リノレン酸ヒドロペ
ルオキシド等を挙げることができる。また、検体となる
グルタチオンペルオキシダーゼ酵素の形態としては、グ
ルタチオンペルオキシダーゼ酵素活性を含有するもので
あれば特に限定されるものではなく、単離されたグルタ
チオンペルオキシダーゼ酵素を含有する水溶液はもちろ
ん、植物からの抽出液のようにグルタチオンペルオキシ
ダーゼ酵素以外の他の成分を含む溶液であってもグルタ
チオンペルオキシダーゼ酵素活性を含有していればよ
い。

【００２８】以下、本発明の活性測定方法を具体的に説
明する。まず、グルタチオンペルオキシダーゼ酵素の触
媒作用により過酸化物をヒドロキシ体に変換する工程に
ついて説明する。

【００２９】脂質過酸化物と還元型グルタチオンとの混
合物にグルタチオンペルオキシダーゼ酵素を反応させる
ことにより脂質過酸化物をヒドロキシ体に変換させる
が、通常、各成分は適切な緩衝液、例えば、リン酸緩衝
液、グッド緩衝液、トリス緩衝液等に溶解させて利用さ
れる。緩衝液のｐＨは、グルタチオンペルオキシダーゼ
酵素活性を失活させない観点からｐＨ５〜９が好まし
く、ｐＨ７．５〜８．５がより好ましい。

【００３０】脂質過酸化物と還元型グルタチオンとの混
合物にグルタチオンペルオキシダーゼ酵素を反応させて
得られる液を、本明細書において「反応液」と言う。反
応液調製時の脂質過酸化物濃度は、好ましくは０．００
１〜１０ミリモル／リットルである。脂質過酸化物濃度
が０．００１ミリモル／リットル未満ではバックグラウ
ンドノイズに隠れるため生成物であるヒドロキシ体の検
出が困難となる場合がある。一方１０ミリモル／リット
ルを超えると反応が定量的に進まず、試料中のグルタチ
オンペルオキシダーゼ酵素活性とその測定値との関係が
直線性を示さなくなる傾向にある。このため、脂質過酸
化物濃度は０．０２〜０．０５ミリモル／リットルであ
ることがより好ましい。また、反応液調製時の反応液中
の還元型グルタチオン濃度は、好ましくは０．００５〜
５０ミリモル／リットルである。還元型グルタチオン濃
度が０．０５ミリモル／リットル未満では低濃度である
ため補酵素として充分な機能を果たさない場合があり、
一方５０ミリモル／リットルを超えると還元型グルタチ
オンによる自然発生的な脂質過酸化物の還元反応が無視
できなくなる。このため、還元型グルタチオン濃度は
０．１〜０．５ミリモル／リットルであることがより好
ましい。さらに、反応液調製時の脂質過酸化物と還元型
グルタチオンとの濃度比は、好ましくは１：１〜１：２
０である。１：１よりも還元型グルタチオンの濃度比が
下がると補酵素として充分な機能を果たさない場合があ
り、一方還元型グルタチオンが１：２０の濃度比を超え
て存在すると自然発生的な脂質過酸化物の還元反応が無
視できない。このため、それぞれの濃度比は、１：５〜
１：１５であることがより好ましい。

【００３１】本工程では反応液を好ましくは５〜６０
℃、より好ましくは２８〜３０℃にて５〜１０分間加温
することにより生成物たるヒドロキシ体を得る。このと
き温度が５℃未満であったり、反応時間が５分未満であ
ると反応の進行が充分でなく、一方温度が６０℃を超え
たり、あるいは反応時間が１０分を超えると酵素が失活
する場合があるため好ましくない。反応時間経過後、反
応液をｐＨ４．０まで酸性化し反応を停止させる。

【００３２】次に生成物であるヒドロキシ体を測定する
工程について説明する。本工程では、前記反応液から有
機溶媒を用いてヒドロキシ体を抽出し、高速液体クロマ
トグラフ（ＨＰＬＣ）を用いてヒドロキシ体を直接的に
測定する。ヒドロキシ体を抽出する有機溶媒としては、
水に不溶のものであれば特に限定されるものではない。
例えばクロロホルム−メタノール混液や、クロロホル
ム、ヘキサン、ベンゼン等の単独又は２種以上の混合物
を用いることができる。この有機溶媒混合液から、遠心
分離または分液ロートにより有機溶媒層を得る。得られ
た有機溶媒層を減圧下で濃縮し、これをヘキサン溶液と
してクロマトグラフに供する。

【００３３】有機溶媒層濃縮物のヘキサン溶液には生成
物であるヒドロキシ体のほか、未反応の脂質過酸化物も
含まれており、該脂質過酸化物は生成物の紫外部吸収を
妨害するため分別測定する必要がある。ヒドロキシ体の
生成量を測定する方法として、順相用シリカカラムを接
続した高速液体クロマトグラフを用い、高速液体クロマ
トグラフ溶出液としてヘキサン：２−プロパノール：酢
酸混合液（好ましくは９５〜９９：５〜１：０．０１〜
１（ｖ／ｖ）、より好ましくは９７〜９９：３〜１：
０．０５〜０．２）を用いて２３０〜２４０nm、好まし
くは２３２〜２３５nmで検出しながら反応生成物である
ヒドロキシ体を定量することができる。溶出液のヘキサ
ン：２−プロパノールの体積比がそれぞれ９５％未満、
５％超、またはそれぞれ９９％超、１％未満になると、
基質である脂質過酸化物と生成物であるヒドロキシ体の
分離が困難となる。また、酢酸濃度比０．０１％未満で
は、脂質過酸化物とヒドロキシタイトの分離が困難とな
り、濃度比１％を超えるとバックグラウンドノイズの増
加の原因となり、感度が低下する。また、検出波長が２
３０nm未満または２４０nmを超えると、バックグラウン
ドノイズが上昇し、感度が低下する。

【００３４】次いで、測定されたヒドロキシ体の生成量
からグルタチオンペルオキシダーゼ酵素活性を公知の手
段により求めればよい。ヒドロキシ体生成量からグルタ
チオンペルオキシダーゼ酵素活性を算出する方法として
は、例えば、既知の活性値を有するグルタチオンペルオ
キシダーゼ酵素標準液を用いて予め検量線を作成してお
き、この検量線を用いて検体中のグルタチオンペルオキ
シダーゼ活性を求めることもできるし、あるいは高速液
体クロマトグラフのチャートに示された面積値からヒド
ロキシ体生成量を算出し、前記式１よりヒドロキシ体１
モル生成する際に還元型グルタチオン２モルを消費する
ことから、１分間に１マイクロモルの還元型グルタチオ
ンを消費する酵素量を１ｕｎｉｔとして算出することも
できる。

【００３５】

【実施例】以下、本発明を実施例により更に詳細に説明
するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。

【００３６】（実施例１）グルタチオンペルオキシダー
ゼ酵素含有抽出液の調製 本発明のグルタチオンペルオキシダーゼ酵素を含有す
る、本発明の原料からの抽出液を以下の手順により調製
した。原料として長ネギ葉を用い、長ネギ葉の（湿）質
量比４倍量の０．０５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．０）を
加え、ホモジナイザー（ヤマト科学社製、Ｕｌｔｒａ−
ｄｉｓｐｅｒｓｅｒ、ＬＫ−２１、カッタＳ２５Ｎ−１
８Ｇ）にて０．５分間粉砕後、１０，０００回転で１０
分間遠心分離を行い、さらに上清液をＴｏｙｏ Ｎｏ．
２ろ紙にてろ過し、ろ液回収することにより本発明のグ
ルタチオンペルオキシダーゼ酵素を含有する抽出液を得
た。前記操作はすべて５℃で行った。ろ液に本発明のグ
ルタチオンペルオキシダーゼ酵素が含まれていることを
実施例２以下で調べた。

【００３７】（実施例２）実施例１で得られたグルタチ
オンペルオキシダーゼ酵素の活性測定 グルタチオンペルオキシダーゼ酵素活性を測定するため
の基質となる脂質過酸化物としてリノール酸ヒドロペル
オキシド溶液を用いた。表１に示した組成の反応液を３
０℃で５分間保温した後、クロロホルム−メタノール＝
２：１（ｖ／ｖ）からなる有機溶媒３ｍｌを加え、遠心
分離にて有機溶媒層を回収して未反応のリノール酸ヒド
ロペルオキシドおよび反応生成物であるヒドロキシ体混
合溶液を得た。

【００３８】次に、この溶液を減圧蒸留装置に供し、有
機溶媒を除去した。得られた濃縮物をヘキサンに溶解さ
せ、カラムとしてＩｎｅｒｔｓｉｌ ＳＩＬ（４．６×
１５０ｍｍ、ＧＬ ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏ．ＬＴＤ）を
接続し、カラムの温度が３５℃に設定されたＨＰＬＣに
供し、溶出液としてヘキサン：２−プロパノール：酢酸
＝９９：１：０．１（ｖ／ｖ／ｖ）（ｍｌ／ｍｉｎ）を
用いて、２３５ｎｍで検出しながら反応生成物であるヒ
ドロキシ体を分別定量した。

【００３９】

【表１】

【００４０】活性の単位はＨＰＬＣチャートに示された
面積値からヒドロキシ体生成量を算出し、ヒドロキシ体
を１モル生成する際に還元型グルタチオン２モルを消費
することから、１分間に１マイクロモルの還元型グルタ
チオンを消費する酵素量を１ｕｎｉｔとした。本発明の
活性測定方法により、長ネギ葉部のグルタチオンペルオ
キシダーゼ活性は０．１３８ｕｎｉｔｓ／ｇであった
（表４）。

【００４１】（実施例３）グルタチオンペルオキシダー
ゼ酵素の精製 実施例１の方法で長ネギ葉１００ｇから得られた抽出液
４３０ｍＬにアセトンを、その総体積に対するアセトン
体積比が３０％となるように徐々に添加し、４℃で１時
間静置した。次いで、遠心分離により沈殿物を除き、こ
の分離液に更にアセトンを、総体積に対する体積比で６
０％になるまで徐々に加え、４℃で１時間静置後、遠心
分離を行い、析出沈澱物を得た。この沈澱物をｐＨ８．
０のトリス緩衝液４０ｍＬに溶解させた。この酵素液に
含まれるグルタチオンペルオキシダーゼ酵素の比活性
は、含有されたタンパク質量当たり０．２４１ｕｎｉｔ
／ｍｇタンパク質であった。

【００４２】上記酵素液をさらに、直径３．０ｃｍ×９
０ｃｍのＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００ゲルろ過カラム
クロマトグラフ（ファルマシアハイテク社製）に供し、
酵素活性を持つ画分２０ｍＬの溶液を得た。得られた画
分に含まれるグルタチオンペルオキシダーゼ酵素の比活
性は含有されたタンパク質量当たり３．１２ｕｎｉｔ／
ｍｇタンパク質であった。

【００４３】上記のカラムクロマトグラフによって得ら
れた長ネギ葉のグルタチオンペルオキシダーゼ酵素溶液
を限外濾過膜（モルカットII：日本ミリポア社製）にて
１０倍に濃縮したものを、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．０）にて平衡化された直径１．０ｃｍ×２０ｃｍ
のCM-Sephadex C-50 陽イオン交換カラムクロマトグラ
フ（ファルマシアバイテク社製）に供し、同緩衝液で塩
化ナトリウム濃度０〜０．１Ｍまでグラジエントを行
い、本酵素活性をもつ画分１０ｍＬの溶液を得た。得ら
れた画分に含まれるグルタチオンペルオキシダーゼ酵素
の比活性は含有されたタンパク質量当たり９．２６ｕｎ
ｉｔｓ／ｍｇタンパク質であった。

【００４４】（実施例４）長ネギ葉から抽出精製した本
発明のグルタチオンペルオキシダーゼの酵素化学的性質 長ネギ葉から抽出されたグルタチオンペルオキシダーゼ
が本発明の新規なグルタチオンペルオキシダーゼである
ことを示すべく、例３で得られたタンパク質の精製物に
ついて、酵素としての諸性質を調べた。

【００４５】１）酵素の分子量：ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動による分子量が約４６，０００Ｄａ
であった。

【００４６】２）補酵素：還元型グルタチオンを添加し
た場合にのみ反応が生じ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、アスコルビ
ン酸、メルカプトエタノール、エチルメルカプタン、シ
ステインでは反応は起こらなかった。従って、長ネギ葉
から抽出、精製した精製物にグルタチオンペルオキシダ
ーゼの存在を示した。なお、長ネギの葉、中心部、皮で
も同じグルタチオンペルオキシダーゼ酵素が検出され
た。

【００４７】３）至適ｐＨおよび安定ｐＨ：ｐＨ８．０
において最大活性を示した。またｐＨ３〜１２の範囲の
緩衝液に溶解させ、４０℃で１０分放置した後、活性が
８０％保持されたのはｐＨ５〜９の範囲であった。従っ
て、ｐＨ５〜９の範囲で安定であった。

【００４８】４）至適温度：温度約３０℃において作用
が至適であった。

【００４９】５）熱安定性：６０℃で２０分間熱処理し
た場合に失活し、７５℃以上では５分以内に失活した。

【００５０】６）冷凍耐性：安定化剤を加えることなく
凍結しても失活せず、３ヶ月以上の保存が可能である。

【００５１】（実施例５）グルタチオンペルオキシダー
ゼ酵素活性の測定（１） グルタチオンペルオキシダーゼ酵素活性の測定方法に関
し、ウシ血小板由来のグルタチオンペルオキシダーゼを
用いて本発明と従来法との比較を行った（表３）。本発
明によるグルタチオンペルオキシダーゼ酵素の活性測定
は、実施例２に示す方法と同様に行った。また、従来法
（基質としてｔ−ブチルヒドロペルオキシドを用いた共
役酵素法）によるグルタチオンペルオキシダーゼ酵素の
活性測定は、表２に示した組成の反応液の３４０ｎｍに
おける吸光度の減少で測定した。その他、基質として過
酸化水素およびリノール酸ヒドロペルオキシドを用いた
共役酵素法による従来法についても検討を行った（表
３）。活性の単位は、１分間に１マイクロモルのＮＡＤ
Ｐを生成する酵素量を１ｕｎｉｔとした。

【００５２】ウシ血小板由来のグルタチオンペルオキシ
ダーゼ酵素の同一試料を、０．１Ｍのトリス緩衝液に表
３に示した各濃度になるよう溶解させ、該溶液中のグル
タチオンペルオキシダーゼ酵素活性を本発明と前記従来
法を用いて測定した結果を表３に示す。従来の方法と本
発明の方法とでは、グルタチオンペルオキシダーゼ酵素
の活性値、すなわちｕｎｉｔｓ／ｍＬ数はほぼ同一値を
示した。しかし、単位ｕｎｉｔｓが０．３以下では従来
法は測定不能になるのに対し、本発明では表３に示すよ
うに、測定感度が約１００倍向上しているのがわかる。
また、本発明の活性測定方法は、従来法で基質としてリ
ノール酸ヒドロペルオキシドを用いた例に比べても感度
の向上が見られたことから、本発明による感度の向上
は、ＨＰＬＣを用いて生成物たるヒドロキシ体を直接的
に定量することによりもたらされたものであり、生成物
たるヒドロキシ体を直接的に測定可能としたことに本発
明の極めて重要な効果が見出されることが示された。

【００５３】

【表２】

【００５４】

【表３】

【００５５】（実施例６）グルタチオンペルオキシダー
ゼ酵素の活性測定（２） 植物等の本発明の原料に対し、本発明の活性測定方法お
よび従来法により測定されたグルタチオンペルオキシダ
ーゼ活性を表４に示す。本発明による活性の測定は実施
例２に示す方法と同様に、また従来法による測定は、基
質としてｔ−ブチルヒドロペルオキシドを用いて実施例
５に示す方法と同様に行った。ここに示した植物、細
菌、海藻、カビ、キノコからの抽出物については従来法
ではグルタチオンペルオキシダーゼ活性は測定されなか
ったが、本発明の方法では活性が認められた。従来法を
用いた場合、これら原料からの試料抽出液の濁りの影響
があり、上記に示された感度よりさらに測定感度が低下
しており、試料湿質量１ｇ当たりの検出感度が１ｕｎｉ
ｔ以上に限られていたが、本発明の方法では０．００１
ｕｎｉｔ／ｇまで検出が可能であった。

【００５６】

【表４】

【００５７】

【発明の効果】本発明により、従来には知られていなか
った原料から新規なグルタチオンペルオキシダーゼが提
供された。この新規グルタチオンペルオキシダーゼは公
知のウシ血小板由来やヒト血小板由来のものと比べて活
性安定性が高く、試薬の保管、管理が容易となる。かか
る原料は乾燥物であってもよいため、例えばネギの廃棄
部位の有効資源化を図ることも可能となる。

【００５８】また、本発明により、脂質過酸化物に対す
るグルタチオンペルオキシダーゼ作用を直接的に評価す
ることができるグルタチオンペルオキシダーゼの活性測
定方法が提供された。この方法は、測定感度を従来の約
１ｕｎｉｔ／ｍＬから約０．００１ｕｎｉｔ／ｍＬまで
高めることを可能とするものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 寺尾 純二 徳島県徳島市蔵本町３丁目18−15 徳島大 学医学部内 Ｆターム(参考） 4B050 CC01 DD02 DD03 DD13 FF01C FF04C FF05C FF09C FF11C FF12C LL03 4B063 QA01 QQ22 QR45 QR48 QR50 QX01 4H055 AA01 AA03 AB37 AC60 AD32 BA50 CA10 CA60

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 植物、細菌、藻類、カビ、又はキノコか
   ら得られたグルタチオンペルオキシダーゼ酵素。
2. 【請求項２】 植物、細菌、藻類、カビ、又はキノコか
   ら得られたグルタチオンペルオキシダーゼ酵素を含有す
   る抽出物を、極性有機溶媒処理、塩析、限外濾過処理、
   吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
   ーまたはゲル濾過操作により、もしくはこれらの２種以
   上を組み合わせて精製することにより得られたグルタチ
   オンペルオキシダーゼ酵素。
3. 【請求項３】 分子量が３０，０００〜８０，０００で
   ある、請求項１または２に記載のグルタチオンペルオキ
   シダーゼ酵素。
4. 【請求項４】 脂質過酸化物と還元型グルタチオンとを
   主成分として含有する溶液にグルタチオンペルオキシダ
   ーゼ酵素を反応させて得られる反応液。
5. 【請求項５】 脂質過酸化物がリノール酸ヒドロペルオ
   キシドまたはリノレン酸ヒドロペルオキシドである、請
   求項４に記載の反応液。
6. 【請求項６】 グルタチオンペルオキシダーゼ酵素が、
   植物、細菌、藻類、カビ、又はキノコから得られたもの
   である、請求項４または５に記載の反応液。
7. 【請求項７】 グルタチオンペルオキシダーゼ酵素が、
   植物、細菌、藻類、カビ、又はキノコから得られたもの
   であって、植物、細菌、藻類、カビ、又はキノコから抽
   出されたグルタチオンペルオキシダーゼ酵素を含有する
   抽出物を、精製することなく粗酵素液の形態で用いる、
   請求項４または５に記載の反応液。
8. 【請求項８】 グルタチオンペルオキシダーゼ酵素が、
   植物、細菌、藻類、カビ、又はキノコから得られたもの
   であって、植物、細菌、藻類、カビ、又はキノコから抽
   出されたグルタチオンペルオキシダーゼ酵素を含有する
   抽出物を、極性有機溶媒処理、塩析、限外濾過処理、吸
   着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー
   またはゲル濾過操作により、もしくはこれらの２種以上
   を組み合わせて精製した形態で用いる、請求項４または
   ５に記載の反応液。
9. 【請求項９】 グルタチオンペルオキシダーゼ酵素の分
   子量が３０，０００〜８０，０００である、請求項６〜
   ８のいずれか１項に記載の反応液。
10. 【請求項１０】 脂質過酸化物濃度が０．００１〜１０
    ミリモル／リットル、還元型グルタチオン濃度が０．０
    ０５〜５０ミリモル／リットルであって、かつ前記脂質
    過酸化物と還元型グルタチオンとの濃度比が１：１〜
    １：２０である、請求項４ないし９のいずれか１項に記
    載の反応液。
11. 【請求項１１】 請求項４ないし１０のいずれか１項に
    記載の反応液から有機溶媒を用いて水溶性物質を除去
    し、高速液体クロマトグラフを用いて生成物であるヒド
    ロキシ体を定量する工程を含む、グルタチオンペルオキ
    シダーゼ酵素の活性測定方法。
12. 【請求項１２】 高速液体クロマトグラフの溶出液がヘ
    キサン、２−プロパノールおよび酢酸を主成分とする、
    請求項１１に記載の活性測定方法。
13. 【請求項１３】 ヘキサン、２−プロパノールおよび酢
    酸の体積比が９５〜９９：５〜１：０．０１〜１であ
    る、請求項１２に記載の活性測定方法。