JP2003155251A - 生体内のアポトーシス細胞の除去促進剤及び除去阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 マクロファージによって生体内のアポトーシ
ス細胞を速やかに除去することができるアポトーシス細
胞の除去促進剤や、マクロファージによる生体内のアポ
トーシス細胞の除去を阻害する除去阻害剤を提供するこ
と。 【解決手段】 脂肪球被膜糖蛋白質（ＭＦＧ−Ｅ８−
Ｌ）や、マクロファージによる生体内のアポトーシス細
胞の除去促進作用を有するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体、好
ましくは組換えヒト若しくはマウスＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ又
は組換えヒト若しくはマウスＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体を
有効成分とする生体内アポトーシス細胞除去促進剤を調
製する。これら除去促進剤は、アポトーシス細胞表面に
露出するホスファチジルセリンなどのアミノリン脂質を
認識することで、アポトーシス細胞に特異的に結合し、
マクロファージによるアポトーシス細胞の貪食作用を促
進する。他方、点変異（Ｄ８９Ｅ）ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変
異体を除去阻害剤とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、マクロファージに
よる生体内でアポトーシスを起こした細胞（以下「アポ
トーシス細胞」という）の除去促進剤や、マクロファー
ジによる生体内のアポトーシス細胞の除去阻害剤に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】生理的な条件下で細胞自らが積極的に惹
起するようにプログラムされた細胞死、すなわちアポト
ーシスは、免疫系において老化した細胞や病態細胞など
の生体にとって好ましくない細胞を排除するために生体
に備わった機構であることが知られている。このアポト
ーシスは細胞サイズの急速な縮小と細胞核の変化を特徴
とし、アポトーシス細胞は通常アポトーシス小体とな
り、最終的にはマクロファージ等の食細胞により貪食さ
れる。すなわち、まず細胞が縮小して隣接細胞から離
れ、核のＤＮＡとタンパク質との複合体であるクロマチ
ンが核膜周辺に凝縮し、核の濃縮が生じると共に細胞表
面の微絨毛が消失して平滑化し、大小の突起が出現し、
やがてそれらがくびれてちぎれ、膜に包まれた大小の球
状のアポトーシス小体に断片化し、これらの小体がマク
ロファージや隣接する食細胞により貪食除去されること
はよく知られている。

【０００３】ところで、ガン細胞や悪性腫瘍細胞のよう
な病態細胞の増殖を阻害して、これらの細胞に起因する
疾病を治療するものとしては、これまで、アミノプテリ
ン、メトトレキセート、８‐アザグアニン、６‐メルカ
プトプリン、５‐フルオロウラシル、１‐（２‐テトラ
ヒドロフリル）‐５‐フルオロウラシルなどの合成物
質、マイトマイシンＣ、クロモマイシン、ブレオマイシ
ンなどの抗生物質、インターフェロン、ＣＳＦ抑制物
質、ＣＢＦなどが知られているが、これらはいずれも所
定の細胞に作用して、それを壊死すなわちネクローシス
を起こさせて病態細胞を排除するものである。ネクロー
シスは病理的要因によって起こるが、アポトーシスはネ
クローシスと異なり、病理的要因のみならず多様な生理
的要因によっても生じるといわれている。

【０００４】アポトーシスは、その初期過程において、
細胞を構成する細胞膜リン脂質の配列変化を伴い、結果
として負電荷のリン脂質であるホスファチジルセリン
（phosphatidylserine）の細胞表面へ露出することが報
告されている（Immunol. Today, 14: 131-136, 1993、C
irk. Res., 77: 1136-1142, 1995）。この細胞表面の変
化がマクロファージや隣接する細胞に認識され、貪食過
程が進行すると考えられている。ホスファチジルセリン
と選択的に結合するアネキシンＶにより前記貪食過程が
阻害されることから、アポトーシス細胞の細胞表面にホ
スファチジルセリンが露出することが貪食機構に重要な
役割を果たしているものと考えられている（Biochem. B
iophys. Res. Commun., 205: 1488-1493,1994、Proc. N
atl. Acad.Sci. USA, 93: 1624-1629,1996）。また、ア
ネキシンＶの標識体を用いて、アポトーシスの初期過程
の検出がフローサイトメトリーにより行われている。

【０００５】他方、脂肪球被膜糖蛋白質（ＭＦＧ−Ｅ
８；milk fat globule-EGF factor8）は、母乳中に多く
含まれる乳腺上皮由来の分泌蛋白質としてクローニング
され（Biochem. Biophys. Res. Commun. 254 (3), 522-
528, 1999）、その後、他の多くの正常組織やいくつか
の腫瘍細胞で強く発現する分泌型糖タンパク質として知
られている。ＭＦＧ−Ｅ８は、N末端側から２つのＥＧ
Ｆ（上皮増殖因子）ドメインと血液凝固因子Ｖ，VIIIの
Ｃ１，Ｃ２ドメインとホモロジーのあるドメインで構成
されている。ＭＦＧ−Ｅ８はヒト（ＢＡ４６，lactadhe
rin）、マウス（ＭＦＧ−Ｅ８）、ラット（ｒＡＧ
Ｓ）、ブタ（Ｐ４７）、ウシ（ＰＡＳ−６，ＰＡＳ−
７）を含め幾つかの哺乳類でそのホモログが報告されて
おり、さらに、ＭＦＧ−Ｅ８とドメイン構造の類似性が
ある内皮細胞特異的細胞接着分子ＤＥＬ１がクローニン
グされており、ＭＦＧ−Ｅ８及びＤＥＬ１は２番目のＥ
ＧＦドメイン内にはインテグリンと結合するＲＧＤ配列
を含んでいる。一方、Ｃ末側のＣ１，Ｃ２ドメインは細
胞膜のリン脂質に結合することが知られている。しか
し、このＭＦＧ−Ｅ８は、酵素活性との関連やその生理
機能について不明な点が多く、この点を明らかにするた
めに、マウス脂肪球被膜糖蛋白質ＭＦＧ−Ｅ８のゲノム
遺伝子と染色体マッピング、発生過程における遺伝子発
現の動態、細胞内局在などについて検討されており、生
殖原基がＭＦＧ−Ｅ８の発生初期の主要発現部位であ
り、発生の後期になると神経細胞や軟骨原基に特徴的な
非常に強い発現があるとされている。また、生体内にお
けるＭＦＧ−Ｅ８の機能を探るために、ＭＦＧ−Ｅ８遺
伝子欠損マウス作製の試みがなされている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】アポトーシスは生体の
恒常性維持に重要な役割を果たしている。アポトーシス
を起こしている細胞（アポトーシス細胞）が分泌する有
害な物質から正常細胞を保護するためにも、アポトーシ
ス細胞は速やかにマクロファージによって除去する必要
がある。例えば、ガン細胞にアポトーシスを積極的に誘
導し、ガンの治療を行うこともできるが、かかる場合で
あってもアポトーシス細胞を速やかに除去する必要があ
る。本発明の課題は、マクロファージによって生体内の
アポトーシス細胞を速やかに除去することができるアポ
トーシス細胞の除去促進剤や、マクロファージによる生
体内のアポトーシス細胞の除去を阻害する除去阻害剤を
提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究し、脂肪球被膜糖蛋白質（Ｍ
ＦＧ−Ｅ８−Ｌ）が、細胞がアポトーシスへ向かいはじ
めると細胞表面に露出するホスファチジルセリン（Ｐ
Ｓ）などのアミノリン脂質を認識することで、アポトー
シス細胞に特異的に結合し、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌがマクロ
ファージによるアポトーシス細胞の貪食作用を促進する
ことや、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌの点変異誘導体であるＤ８９
Ｅ変異体がマクロファージによるアポトーシス細胞の貪
食作用を阻害することを見い出し、本発明を完成するに
至った。

【０００８】すなわち本発明は、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌを有
効成分とすることを特徴とするマクロファージによる生
体内のアポトーシス細胞の除去促進剤（請求項１）や、
ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌを構成するアミノ酸配列において、１
若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され
たアミノ酸配列からなり、かつマクロファージによる生
体内のアポトーシス細胞の除去促進作用を有するＭＦＧ
−Ｅ８−Ｌ変異体を有効成分とすることを特徴とするマ
クロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去促
進剤（請求項２）や、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ又はアポトーシ
ス細胞の除去作用を有するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体が、
組換えＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ又は組換えＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変
異体であることを特徴とする請求項１又は２記載のマク
ロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去促進
剤（請求項３）や、組換えＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ又は組換え
ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体が、組換えヒト若しくはマウス
ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ又は組換えヒト若しくはマウスＭＦＧ
−Ｅ８−Ｌ変異体であることを特徴とする請求項３記載
のマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除
去促進剤（請求項４）や、組換えＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ又は
組換えＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体が、ヒト細胞中での翻訳
産物であることを特徴とする請求項３又は４記載のマク
ロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去促進
剤（請求項５）や、組換えＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ又は組換え
ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体が、ＲＧＤモチーフを有するＥ
ＧＦ−２ドメイン、高プロリン／スレオニン含有ドメイ
ン、２つの因子VIII相同ドメイン（Ｃ１及びＣ２）を有
することを特徴とする請求項３〜５のいずれか記載のマ
クロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去促
進剤（請求項６）に関する。

【０００９】また本発明は、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ又はＭＦ
Ｇ−Ｅ８−Ｌ変異体が、リポソームに封入又は包埋され
ていることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の
マクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去
促進剤（請求項７）や、請求項１〜６のいずれかに記載
されたＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ又はＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体を
コードするＤＮＡを含む組換えベクターを有効成分とす
ることを特徴とするマクロファージによる生体内のアポ
トーシス細胞の除去促進剤（請求項８）や、請求項１〜
６のいずれかに記載されたＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ又はＭＦＧ
−Ｅ８−Ｌ変異体を発現することができる発現系を含ん
でなる宿主細胞を有効成分とすることを特徴とするマク
ロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去促進
剤（請求項９）や、請求項１〜６のいずれかに記載され
たＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体に対する抗体を有効成分とす
ることを特徴とするマクロファージによる生体内のアポ
トーシス細胞の除去促進剤（請求項１０）や、請求項１
〜６のいずれかに記載されたＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体に
対する抗体が、抗ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌモノクローナル抗体
又は抗ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体モノクローナル抗体であ
ることを特徴とする請求項１０記載のマクロファージに
よる生体内のアポトーシス細胞の除去促進剤（請求項１
１）に関する。

【００１０】また本発明は、請求項１〜１１のいずれか
記載の生体内のアポトーシス細胞の除去促進剤を用いる
ことを特徴とするマクロファージによる生体内のアポト
ーシス細胞の除去方法（請求項１２）や、請求項１〜１
１のいずれか記載の生体内のアポトーシス細胞の除去促
進剤を含有することを特徴とするマクロファージによる
生体内のアポトーシス細胞の除去不全に起因する疾病の
治療薬（請求項１３）や、請求項１〜１１のいずれか記
載の生体内のアポトーシス細胞の除去促進剤を含有する
ことを特徴とする生体防御機能増強剤（請求項１４）
や、請求項１３記載の治療薬又は請求項１４記載の生体
防御機能増強剤を用いることを特徴とするマクロファー
ジによる生体内のアポトーシス細胞の除去不全に起因す
る疾病の治療方法（請求項１５）に関する。

【００１１】また本発明は、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌを構成す
るアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が
欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、
かつマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の
除去阻害作用を有するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体を有効成
分とすることを特徴とするマクロファージによる生体内
のアポトーシス細胞の除去阻害剤（請求項１６）や、ア
ポトーシス細胞の除去阻害作用を有するＭＦＧ−Ｅ８−
Ｌ変異体が、組換えＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体であること
を特徴とする請求項１６記載のマクロファージによる生
体内のアポトーシス細胞の除去阻害剤（請求項１７）
や、組換えＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体が、組換えヒトＭＦ
Ｇ−Ｅ８−Ｌ変異体又は組換えマウスＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ
変異体であることを特徴とする請求項１７記載のマクロ
ファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去阻害剤
（請求項１８）や、組換えＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体が、
ヒト細胞中での翻訳産物であることを特徴とする請求項
１７又は１８記載のマクロファージによる生体内のアポ
トーシス細胞の除去阻害剤（請求項１９）や、組換えＭ
ＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体が、１つの高プロリン／スレオニ
ン含有ドメイン及び２つの因子VIII相同ドメイン（Ｃ１
及びＣ２）を有しＲＧＤモチーフに点変異をもつＭＦＧ
−Ｅ８−Ｌ変異体であることを特徴とする請求項１７〜
１９のいずれか記載のマクロファージによる生体内のア
ポトーシス細胞の除去阻害剤（請求項２０）や、点変異
をもつＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体が、Ｄ８９Ｅ変異体であ
ることを特徴とする請求項２０記載のマクロファージに
よる生体内のアポトーシス細胞の除去阻害剤（請求項２
１）に関する。

【００１２】さらに本発明は、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体
が、リポソームに封入又は包埋されていることを特徴と
する請求項１６〜２１のいずれか記載のマクロファージ
による生体内のアポトーシス細胞の除去阻害剤（請求項
２２）や、請求項１６〜２１のいずれかに記載されたＭ
ＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体をコードするＤＮＡを含む組換え
ベクターを有効成分とすることを特徴とするマクロファ
ージによる生体内のアポトーシス細胞の除去阻害剤（請
求項２３）や、請求項１６〜２１のいずれかに記載され
たＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体を発現することができる発現
系を含んでなる宿主細胞を有効成分とすることを特徴と
するマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の
除去阻害剤（請求項２４）や、請求項１６〜２４のいず
れか記載のマクロファージによる生体内のアポトーシス
細胞の除去阻害剤を用いることを特徴とするマクロファ
ージによる生体内のアポトーシス細胞の除去阻害方法
（請求項２５）や、請求項１６〜２４のいずれか記載の
マクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去
阻害剤を含有することを特徴とするマクロファージによ
る生体内のアポトーシス細胞の除去阻害不全に起因する
疾病の治療薬（請求項２６）や、請求項２６記載の治療
薬を用いることを特徴とするマクロファージによる生体
内のアポトーシス細胞の除去阻害不全に起因する疾病の
治療方法（請求項２７）や、標識化された、ＭＦＧ−Ｅ
８−Ｌ若しくはマクロファージによる生体内のアポトー
シス細胞の除去促進作用を有するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異
体、又はこれらに対する抗体、あるいは、標識化され
た、マクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の
除去阻害作用を有するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体を有効成
分とすることを特徴とする生体内のアポトーシス細胞の
検出剤（請求項２８）や、標識化された、ＭＦＧ−Ｅ８
−Ｌ若しくはマクロファージによる生体内のアポトーシ
ス細胞の除去促進作用を有するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異
体、又はこれらに対する抗体、あるいは、標識化され
た、マクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の
除去阻害作用を有するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体を有効成
分とする検出剤を用いることを特徴とする生体内のアポ
トーシス細胞の検出方法（請求項２９）や、ＭＦＧ−Ｅ
８−Ｌ若しくはマクロファージによる生体内のアポトー
シス細胞の除去促進作用を有するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異
体、又はこれらに対する抗体と、被検物質を接触させ、
生体内におけるアポトーシス細胞の除去の程度を評価す
ることを特徴とするマクロファージによる生体内のアポ
トーシス細胞の除去促進誘導物質又は除去促進抑制物質
のスクリーニング方法（請求項３０）や、マクロファー
ジによる生体内のアポトーシス細胞の除去阻害作用を有
するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体と、被検物質を接触させ、
生体内におけるアポトーシス細胞の除去阻害の程度を評
価することを特徴とするマクロファージによる生体内の
アポトーシス細胞の除去阻害誘導物質又は除去阻害抑制
物質のスクリーニング方法（請求項３１）に関する。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明のマクロファージによる生
体内のアポトーシス細胞の除去促進剤としては、脂肪球
被膜糖蛋白質（ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ）や、ＭＦＧ−Ｅ８−
Ｌを構成するアミノ酸配列において、１若しくは数個の
アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
からなり、かつマクロファージによる生体内のアポトー
シス細胞の除去促進作用を有するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異
体を有効成分とするものであれば特に制限されるもので
はなく、ここでＭＦＧ−Ｅ８−Ｌとは長鎖ＭＦＧ−Ｅ８
（ＭＦＧ−Ｅ８のロングフォーム）を意味し、例えばマ
ウスＭＦＧ−Ｅ８−Ｌとしては配列表の配列番号１に示
されるように４６３アミノ酸残基からなるＭＦＧ−Ｅ８
−Ｌを挙げることができ、また、マウスＭＦＧ−Ｅ８−
Ｌ変異体としては、配列番号１に示されるアミノ酸配列
において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若し
くは付加されたアミノ酸配列からなり、かつマクロファ
ージによる生体内のアポトーシス細胞の除去促進作用を
有するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体を挙げることができる。
また、上記ＭＦＧ−Ｅ８−ＬやＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体
の由来はマウスに限定されるものでなく、ヒト（別名；
ＢＡ４６，lactadherin）、ラット（別名；ｒＡＧ
Ｓ）、ブタ（別名；Ｐ４７）、ウシ（別名；ＰＡＳ−
６，ＰＡＳ−７）等に由来するＭＦＧ−Ｅ８−ＬやＭＦ
Ｇ−Ｅ８−Ｌ変異体も用いることができるが、マクロフ
ァージによるヒト生体内のアポトーシス細胞の除去促進
には、ヒトＭＦＧ−Ｅ８−Ｌを特に有利に用いることが
できる。

【００１４】また、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌやマクロファージ
によるアポトーシス細胞の除去促進作用を有するＭＦＧ
−Ｅ８−Ｌ変異体としては、組換えＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ又
は組換えＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体、好ましくは、組換え
ヒトＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ若しくは組換えマウスＭＦＧ−Ｅ
８−Ｌや、組換えヒトＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体若しくは
組換えマウスＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体を有利に用いるこ
とができる。これら組換えＭＦＧ−Ｅ８−Ｌや組換えＭ
ＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体は、公知の方法により調製するこ
とができるが、宿主細胞としてヒト細胞を用いたヒト細
胞中での翻訳産物であることが好ましい。ＭＦＧ−Ｅ８
−Ｌの構造の中には、１つのシグナル配列、２つのＥＧ
Ｆドメイン（ＥＧＦ−１及びＲＧＤモチーフを有するＥ
ＧＦ−２）、１つの高プロリン／スレオニン含有ドメイ
ン（高Ｐ／Ｔ含有ドメイン）、２つの因子VIII相同ドメ
イン（Ｃ１及びＣ２）が存在するが、組換えＭＦＧ−Ｅ
８−Ｌ又はマクロファージによるアポトーシス細胞の除
去促進作用を有する組換えＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体とし
て、ＲＧＤモチーフを有するＥＧＦ−２ドメイン、高プ
ロリン／スレオニン含有ドメイン、２つの因子VIII相同
ドメイン（Ｃ１及びＣ２）を有するものが好ましい。

【００１５】また、本発明のマクロファージによる生体
内のアポトーシス細胞の除去促進剤としては、上述のＭ
ＦＧ−Ｅ８−Ｌやマクロファージによるアポトーシス細
胞の除去促進作用を有するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体が、
リポソームに封入又は包埋されている生体内アポトーシ
ス細胞除去促進剤を挙げることができ、リポソーム膜を
構成する脂質としては、ジメチルジオクタデシルアンモ
ニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、ジオレオイルホスファチ
ジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）等のカチオン性リポ
ソーム膜を好適に例示することができる。また、上記Ｍ
ＦＧ−Ｅ８−ＬやＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体を含むリポソ
ーム膜に、アポトーシス細胞に選択的に反応するモノク
ローナル抗体、例えば後述する抗ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌモノ
クローナル抗体を結合させ、イムノリポソームとするこ
ともできる。

【００１６】さらに、本発明のマクロファージによる生
体内のアポトーシス細胞の除去促進剤として、上述のＭ
ＦＧ−Ｅ８−Ｌ又はマクロファージによるアポトーシス
細胞の除去促進作用を有するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体を
コードするＤＮＡを含む組換えベクターを有効成分とす
る生体内アポトーシス細胞除去促進剤を挙げることがで
きる。上記組換えベクターとしては、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ
をコードするＤＮＡ、例えば配列番号２に示される塩基
配列からなるマウスＭＦＧ−Ｅ８遺伝子や、ＭＦＧ−Ｅ
８−Ｌ変異体をコードするＤＮＡを含むベクターであれ
ば特に制限されないが、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ又はＭＦＧ−
Ｅ８−Ｌ変異体を宿主細胞内で発現させることができる
発現系を含むものが好ましく、例えば、染色体、エピソ
ーム及びウイルスに由来する発現系、より具体的には、
細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０の
ようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウ
イルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウ
イルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トラ
ンスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクタ
ー、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミ
ドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを
挙げることができる。この発現系は発現を起こさせるだ
けでなく発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。

【００１７】本発明のマクロファージによる生体内のア
ポトーシス細胞の除去促進剤として、上述のＭＦＧ−Ｅ
８−Ｌ又はマクロファージによるアポトーシス細胞の除
去促進作用を有するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体を発現する
ことができる発現系を含んでなる宿主細胞を有効成分と
する生体内アポトーシス細胞除去促進剤を挙げることが
できる。ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ又はＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体
をコードするＤＮＡやかかるＤＮＡを含むベクターなど
の上記発現系の宿主細胞への導入は、Davisら（BASIC M
ETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びSambrookら
（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed.,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, N.Y., 1989）などの多くの標準的な実験室マニ
ュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムト
ランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トラ
ンスフェクション、トランスベクション(transvectio
n)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介ト
ランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導
入、スクレープローディング (scrape loading)、弾丸
導入(ballistic introduction)、感染等により行うこと
ができる。そして、宿主細胞としては、大腸菌、ストレ
プトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロ
コッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等
の真菌細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９
等の昆虫細胞や、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｈ
ｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞
（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを
欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９
３細胞、Ｂｏｗｅｓ悪性黒色腫細胞等の動物細胞や、植
物細胞等を挙げることができるが、ヒト細胞が好まし
い。

【００１８】さらにまた、本発明のマクロファージによ
る生体内のアポトーシス細胞の除去促進剤として、ＭＦ
Ｇ−Ｅ８−Ｌやマクロファージによるアポトーシス細胞
の除去促進作用を有するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体に対す
る抗体を挙げることができる。かかる抗体としては、モ
ノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、
一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的
に挙げることができ、これらの抗体は、慣用のプロトコ
ールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に、上記Ｍ
ＦＧ−Ｅ８−Ｌ若しくはＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体又はそ
の一部、あるいは実施例に述べられているようにチオグ
リコレート刺激腹腔マクロファージを抗原として用いて
作製することができるが、その中でも抗ＭＦＧ−Ｅ８−
Ｌモノクローナル抗体又は抗ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体モ
ノクローナル抗体がマクロファージによるアポトーシス
細胞の優れた除去促進作用の点でより好ましい。例えば
モノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物に
より産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Na
ture 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細
胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）
及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIE
S AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc.,
1985）など任意の方法を用いることができる。さら
に、一本鎖抗体をつくるために、一本鎖抗体の調製法
（米国特許第4,946,778号）を適用することや、また、
ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマ
ウス又は他の哺乳動物等を利用することもできる。

【００１９】本発明の生体内のアポトーシス細胞の除去
方法としては、上述のマクロファージによる生体内のア
ポトーシス細胞の除去促進剤を用いる方法であれば特に
制限されるものではない。また、本発明のマクロファー
ジによる生体内のアポトーシス細胞の除去不全に起因す
る疾病の治療薬や生体防御機能増強剤としては、上述の
マクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去
促進剤を含有するものであれば特に制限されるものでは
なく、かかるマクロファージによる生体内のアポトーシ
ス細胞の除去不全に起因する疾病としては、アポトーシ
ス減少に起因する疾患、例えば、各種癌、各種自己免疫
疾患、各種ウイルス疾患等を挙げることができる。上記
生体内アポトーシス細胞除去促進剤を治療薬や生体防御
機能増強剤として用いる場合は、薬学的に許容される通
常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩
衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各
種調剤用配合成分を添加することができる。またこれら
治療薬や生体防御機能増強剤は、経口的又は非経口的に
投与することができる。すなわち通常用いられる投与形
態、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注
射の型で非経口投与することができ、あるいは、例えば
粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型
で経口的に投与することができるが、経口投与の場合は
生体内アポトーシス細胞除去促進剤を前述のリポソーム
封入・包埋タイプとしておくことが好ましい。そしてま
た、本発明のマクロファージによる生体内のアポトーシ
ス細胞の除去不全に起因する疾病の治療方法としては、
上記治療薬や生体防御機能増強剤を用いる治療方法であ
れば特に制限されるものではない。

【００２０】本発明のマクロファージによる生体内のア
ポトーシス細胞の除去阻害剤としては、ＭＦＧ−Ｅ８−
Ｌを構成するアミノ酸配列において、１若しくは数個の
アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
からなり、かつマクロファージによる生体内のアポトー
シス細胞の除去阻害作用を有するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異
体を有効成分とするものであればどのようなものでもよ
いが、これらアポトーシス細胞除去阻害作用を有するＭ
ＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体としては、組換えＭＦＧ−Ｅ８−
Ｌ変異体、好ましくは組換えヒトＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異
体若しくは組換えマウスＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体を有利
に用いることができる。これら組換えＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ
変異体は、公知の方法により調製することができるが、
宿主細胞としてヒト細胞を用いたヒト細胞中での翻訳産
物であることが好ましい。前記のように、ＭＦＧ−Ｅ８
−Ｌの構造の中には、１つのシグナル配列、２つのＥＧ
Ｆドメイン（ＥＧＦ−１及びＲＧＤモチーフを有するＥ
ＧＦ−２）、１つの高プロリン／スレオニン含有ドメイ
ン（高Ｐ／Ｔ含有ドメイン）、２つの因子VIII相同ドメ
イン（Ｃ１及びＣ２）が存在するが、アポトーシス細胞
除去阻害作用を有するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体として、
１つの高プロリン／スレオニン含有ドメイン及び２つの
因子VIII相同ドメイン（Ｃ１及びＣ２）を有しＲＧＤモ
チーフに点変異をもつＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体、例えば
マウスＭＦＧ−Ｅ８−Ｌの８９番目のアミノ酸Ｄ（アス
パラギン酸）がＥ（グルタミン酸）に置換されたＤ８９
Ｅ変異体を好適に例示することができる。

【００２１】また、本発明のマクロファージによる生体
内のアポトーシス細胞の除去阻害剤としては、前記の生
体内アポトーシス細胞除去促進剤の場合におけると同様
に、上記ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体がリポソームに封入又
は包埋されている生体内アポトーシス細胞除去阻害剤
や、上記ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体をコードするＤＮＡを
含む組換えベクターを有効成分とする生体内アポトーシ
ス細胞除去阻害剤や、上記ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体を発
現することができる発現系を含んでなる宿主細胞を有効
成分とする生体内アポトーシス細胞除去阻害剤を挙げる
ことができる。

【００２２】本発明の生体内のアポトーシス細胞の除去
阻害方法としては、上述のマクロファージによる生体内
のアポトーシス細胞の除去阻害剤を用いる方法であれば
特に制限されるものでなく、また、本発明のマクロファ
ージによる生体内のアポトーシス細胞の除去阻害不全に
起因する疾病の治療薬や治療方法も、マクロファージに
よる生体内のアポトーシス細胞の除去阻害剤を利用する
ものであれば特に制限されるものではない。

【００２３】本発明の生体内のアポトーシス細胞の検出
剤としては、前述のＭＦＧ−Ｅ８−Ｌや、マクロファー
ジによる生体内のアポトーシス細胞の除去促進作用を有
するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体や、又はこれらに対する抗
体や、あるいはマクロファージによる生体内のアポトー
シス細胞の除去阻害作用を有するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異
体の標識体、すなわち標識化ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ、標識化
生体内アポトーシス細胞除去促進作用ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ
変異体、標識化抗ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ抗体、標識化抗生体
内アポトーシス細胞除去促進作用ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異
体抗体、標識化生体内アポトーシス細胞除去阻害作用Ｍ
ＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体を有効成分とするものであればど
のようなものでもよく、上記標識体としては、上記ＭＦ
Ｇ−Ｅ８−Ｌ、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体等に、例えば、
ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラ
メチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、¹²⁵
Ｉ、³²Ｐ、¹⁴Ｃ、³⁵Ｓ又は³Ｈ等のラジオアイソトープ
や、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−
ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識
したものや、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、
ＧＳＴタグなどの従来知られているペプチドタグを結合
させたものや、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の
蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を
具体的に例示することができる。これら標識体は常法に
より作製することができ、これら標識体を用いることに
よって、生体内でアポトーシスを起こしている細胞や組
織を検出することができる。また、上記標識体は、アポ
トーシス細胞・組織の検出剤のほか、例えば、Ｎｉ−Ｎ
ＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用したＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ
等の精製や、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌと相互作用するタンパク
質の検出や、当該分野の研究用試薬としても有用であ
る。

【００２４】本発明のマクロファージによる生体内のア
ポトーシス細胞の除去促進誘導物質又は除去促進抑制物
質のスクリーニング方法としては、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ若
しくはマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞
の除去促進作用を有するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体、又は
これらに対する抗体と、被検物質を接触させ、生体内に
おけるアポトーシス細胞の除去の程度を評価するスクリ
ーニング方法であれば特に制限されるものではなく、ま
た、本発明のマクロファージによる生体内のアポトーシ
ス細胞の除去阻害誘導物質又は除去阻害抑制物質のスク
リーニング方法としては、マクロファージによる生体内
のアポトーシス細胞の除去阻害作用を有するＭＦＧ−Ｅ
８−Ｌ変異体と、被検物質を接触させ、生体内における
アポトーシス細胞の除去阻害の程度を評価するスクリー
ニング方法であれば特に制限されるものではなく、上記
ＭＦＧ−Ｅ８−ＬやＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体等として、
それらを発現している細胞も使用することができる。

【００２５】また、上記生体内におけるアポトーシス細
胞の除去又は除去阻害の程度を評価する方法としては、
例えば、インビボやインビトロで、被検物質とＭＦＧ−
Ｅ８−Ｌ等の存在下、マクロファージによるアポトーシ
ス細胞の貪食作用を測定・観察し、被検物質が非存在下
の対照の場合と比較・評価する方法を具体的に例示する
ことができる。これらスクリーニング方法により得られ
る、生体内のアポトーシス細胞の除去促進誘導物質や除
去阻害抑制物質は、マクロファージによる生体内のアポ
トーシス細胞の除去不全に起因する疾病の治療薬や生体
防御機能増強剤として用いうる可能性があり、他方、除
去促進抑制物質や除去阻害誘導物質は、マクロファージ
による生体内のアポトーシス細胞の除去阻害不全に起因
する疾病の治療薬として用いうる可能性がある。そし
て、生体内のアポトーシス細胞の除去促進誘導物質とし
ては、インテグリンα_Vβ₃をコードするＤＮＡの発現系
やチオグリコール酸塩を、生体内のアポトーシス細胞の
除去促進抑制物質としては、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌをコード
するＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖の全部又は一部
を含む発現系を挙げることができる。

【００２６】

【実施例】以下、実施例により本発明をより具体的に説
明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定さ
れるものではない。 実施例Ａ［材料と方法］ 実施例Ａ−１（インテグリンα_Vβ₃発現マウスＮＩＨ３
Ｔ３形質転換体の樹立） ｐＭＸベクター（Exp. Hematol. 24, 324-329, 1996）
中にマウスインテグリンα_V及びβ₃ ｃＤＮＡをもつレ
トロウィルス（J. Cell. Biol. 132, 1161-1176, 199
6、J. Cell Biochem. 81, 320-332, 2001）をマウス繊
維芽細胞であるＮＩＨ３Ｔ３細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１６５８）に感染させ、インテグリンα_V及びβ₃を発現
するマウスＮＩＨ３Ｔ３形質転換体を樹立した。

【００２７】実施例Ａ−２（抗体の調製） モノクローナル抗体を作製するため、１．５×１０⁷の
チオグリコレート刺激腹腔マクロファージを、４週間間
隔でアルメニアンハムスター（Oriental Yeast社製）に
皮下注射した。フットパッドに細胞を注入し、最終ブー
スターとした。膝窩部リンパ節及び鼠径部リンパ節から
得られた細胞とマウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１
（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５９７）とを常法により融合さ
せ、ＨＡＴ培地中でハイブリドーマを選択した。ハイブ
リドーマの培養上澄液に対して貪食作用分析（phagocyt
osis assay）を行い、陽性ハイブリドーマをＧＩＴ培地
（Nihon Seiyaku社製）で培養し、プロテインＡセファ
ロース（Amersham-Pharmacia社製）で精製し、２４２２
モノクローナル抗体を得た。

【００２８】また、マウスＭＦＧ−Ｅ８に対するウサギ
抗体をペプチド研究所（大阪府箕面市）で調製した。す
なわち、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミドエステル（Pierce社製）と共にスカシガイ
ヘモシアニンと結合したペプチド（ＣＮＳＨＫＫＮＩＦ
ＥＫＰＦＭＡＲ；配列番号３）を用いてウサギを免疫し
た。かかるペプチドを結合させたＡＦ−アミノ−トヨパ
ール（Toyopearl）（Tosoh社製）を使用して、ウサギ血
清から抗体をアフィニティー精製した。

【００２９】実施例Ａ−３（組換えＭＦＧ−Ｅ８の作
製） 組換えＭＦＧ−Ｅ８の作製には、配列番号２に示される
マウスＭＦＧ−Ｅ８遺伝子を用いた。pEF-BOS-EXベクタ
ー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 3461-3466, 199
8）を用いて、Ｃ末端にマーカーペプチドであるＦＬＡ
Ｇを結合させたＭＦＧ−Ｅ８を、常法によりヒト２９３
Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３）中で発現させた。
抗ＦＬＡＧ Ｍ２アフィニティーゲル（Sigma社製）を用
いて、培地中に分泌されたＭＦＧ−Ｅ８を精製した。Ｍ
ＦＧ−Ｅ８−Ｌの構造の中には、１つのシグナル配列、
２つのＥＧＦドメイン（ＥＧＦ−１及びＲＧＤモチーフ
を有するＥＧＦ−２）、１つの高プロリン／スレオニン
含有ドメイン（高Ｐ／Ｔ含有ドメイン）、２つの因子VI
II相同ドメイン（Ｃ１及びＣ２）が存在する（図３上図
参照）。そこで、組換えＰＣＲを利用して、以下のＭＦ
Ｇ−Ｅ８−Ｌ変異体をコードするＤＮＡを常法により作
製し、上記pEF-BOS-EXベクターを用いて発現プラスミド
を構築した。これら発現プラスミドをヒト２９３Ｔ細胞
中で発現させ、高Ｐ／Ｔ含有ドメインを欠失したスプラ
イスバリアントである“ＭＦＧ−Ｅ８−Ｓ”や、シグナ
ル配列がインフレームでＣ２ドメインと融合した“Ｃ２
変異体”や、シグナル配列がインフレームでＣ１−Ｃ２
ドメインと融合した“Ｃ１Ｃ２変異体”や、Ｃ１及びＣ
２ドメインを欠失した不完全な形態である“Ｅ１Ｅ２Ｐ
Ｔ”や、ＲＧＤモチーフの８９位のアスパルギン酸をグ
ルタミン酸に置換した“Ｄ８９Ｅ変異体”を作製した。

【００３０】実施例Ａ−４（貪食作用分析） １２週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内に３％（ｗ／
ｖ）のチオグリコール酸塩（Sigma社製）を注入した。
チオグリコール酸塩で刺激された腹腔マクロファージを
４日後に回収し、１０％のＦＣＳを含んだＤＭＥＭで培
養した。貪食作用分析のために、４週齢から８週齢のＩ
ＣＡＤ−Ｓｄｍマウス（Genes Dev. 14,549-558, 200
0）の胸腺細胞を、１０％のＦＣＳを含んだＤＭＥＭに
おいて、１０μＭのデキサメタゾンとともに３７℃で４
時間インキュベーションした。４８ウェルの細胞培養プ
レート上で成長した２．５×１０⁵のマクロファージ
に、胸腺細胞（１×１０⁶）を添加し、１．５時間貪食
させた。かかるプレートからマクロファージを分離し、
２．５μｇ／ｍｌのラット抗マウスＦｃγIII／II受容
体（BD PharMingen社製）の存在下で、４μｇ／ｍｌの
フィコエリトリン結合ラット抗マウスＭａｃ−１抗体
（BD PharMingen社製）を含むＦＡＣＳ染色緩衝液（２
％のＦＣＳ及び０．０２％のＮａＮ₃を含むＰＢＳ）を
用いて氷上で３０分間のインキュベーションを行った。
かかる細胞を１％のパラホルムアルデヒドで固定し、
０．１％のトリトンＸ−１００で処理して、１ｍＭのＣ
ｏＣｌ₂及び０．０１％のＢＳＡを含む１００ｍＭのカ
コジル酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）１００μｌ中に懸濁し
た。１００単位／ｍｌの末端デオキシヌクレオチジル転
移酵素（Takara Shuzo社製）及び２．５μＭのＦＩＴＣ
標識ｄＵＴＰ（Roche Diagnostics社製）を用いて、Ｔ
ＵＮＥＬ反応を３７℃で４５分間行い、ＦＡＣＳキャリ
バー（Becton-Dickinson社製）を使用したフローサイト
メトリーで分析した。

【００３１】また、顕微鏡下での細胞観察によっても、
貪食作用を評価した。すなわち、腹腔マクロファージ
（１×１０⁵個）又はＮＩＨ３Ｔ３細胞（２×１０⁴個）
を、０．１％のゼラチンでコーティングした８ウェルの
Ｌａｂ−ＴｅｋIIチャンバースライド（Nalge Nunc社
製）中で培養し、アポトーシス下の胸腺細胞への貪食作
用を上記のとおり進行させた。固定後、Apoptag kit（I
ntergen社製）を用いて、かかる細胞をＴＵＮＥＬ反応
させ、光学顕微鏡で観察した。

【００３２】実施例Ａ−５（ＭＦＧ−Ｅ８の同定） ジメチルピメリミデート（dimethyl pimelimidate）
（ＤＭＰ、Pierce社製）を用いて、２４２２モノクロー
ナル抗体をプロテインＡセファロース（蛋白質２ｍｇ／
ｍｌベッド容積）に共有結合させた。２４２２モノクロ
ーナル抗体が認識した分子を、マウスＰ３８８Ｄ１細胞
から免疫沈降法で精製した。すなわち、２．４×１０⁹
の細胞を、ＲＩＰＡ緩衝液（１％のトリトンＸ−１０
０、０．１％のＳＤＳ、０．５％のデオキシコール酸ナ
トリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣ
ｌ₂、１ｍＭのＥＧＴＡ、１０％のグリセロール、１ｍ
Ｍの[ｐ−アミジノフェニル]メタンスルホニルフルオラ
イドハイドロクロライド([p-amidinophenyl] methanesu
lfonyl fluoride hydrochloride)、１μｇ／ｍｌのロイ
ペプチン及び１μｇ／ｍｌのペプスタチンを含む５０ｍ
ＭのＨｅｐｅｓ−ＮａＯＨ緩衝液[ｐＨ７．６]）に溶解
した。３ｍｌのヒトＩｇＧセファロースでかかる溶解物
をあらかじめ処理し、１５０μｌの２４２２モノクロー
ナル抗体−プロテインＡセファロースとともに２時間イ
ンキュベーションした。０．５ＭのＮａＣｌを含んだＲ
ＩＰＡ緩衝液で洗浄した後、０．１％のトリトンＸ−１
００を含んだ１００ｍＭのトリエチルアミン（ｐＨ１
１．５）で、ビーズに結合した蛋白質を溶出し、１０％
のポリアクリルアミドゲル上での電気泳動により分離
し、ＰＶＤＦ膜にブロットした。かかる固定化した蛋白
質を還元し、Ｓ−カルボキシメチル化し（S-carboxymet
hylated）、文献（J. Biochem. (Tokyo) 120, 29-34, 1
996）記載のとおり、アクロモバクタープロテアーゼＩ
で分解した。かかる膜から解離したペプチドに、マトリ
ックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬ
ＤＩ−ＴＯＦ）質量分析を行った。

【００３３】実施例Ａ−６（固相ＥＬＩＳＡ及び細胞接
着分析） 文献（Biochemistry 36, 5441-5446, 1997）記載のとお
り、リン脂質と結合したＭＦＧ−Ｅ８に対して固相ＥＬ
ＩＳＡを行った。すなわち、リン脂質のメタノール溶液
（３μｇ／ｍｌで１００μｌ）を９６ウェルのマイクロ
タイタープレートに添加し、風乾した。１０ｍｇ／ｍｌ
のＢＳＡを含むＰＢＳでかかるウェルを処理した。ＭＦ
Ｇ−Ｅ８をウェルに添加し、室温で１時間インキュベー
ションした。０．０５％のツイーン２０を含むＰＢＳで
洗浄した後、ビオチン化抗ＦＬＡＧ抗体及びペルオキシ
ダーゼ結合ストレプトアビジンを用いて、ウェルに結合
したＭＦＧ−Ｅ８をＥＬＩＳＡで定量した。ペルオキシ
ダーゼ検出キット（Sumitomo Bakelite社製）で、ペル
オキシダーゼ活性を検出した。

【００３４】細胞をリン脂質に結合させるＭＦＧ−Ｅ８
の能力を分析するため、前述のとおり、リン脂質でコー
ティングしたマイクロタイタープレートにＭＦＧ−Ｅ８
を結合させた。細胞（４×１０⁴）を含むタイロード緩
衝液（５ｍＭのＨｅｐｅｓ−ＮａＯＨ緩衝液[ｐＨ７．
４]、１３５ｍＭのＮａＣｌ、５．４ｍＭのＫＣｌ、
１．０ｍＭのＭｇＣｌ₂、１０ｍＭのグルコース、及び
１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）を各ウェルに添加し、室温で
１時間インキュベーションした。励起波長４８５ｎｍ及
び発光（emission）波長５２０ｎｍに設定した蛍光マイ
クロプレートリーダー（fluorescent microplate reade
r）（BioLumin 960、Molecular Dynamics社製）を用い
たCyQUANT Cell Proliferation Assay kit（Molecular
Probes社製）により、プレートに付着した細胞を定量し
た。

【００３５】実施例Ｂ［結果］ 実施例Ｂ−１（アポトーシス細胞への貪食作用を増大さ
せるモノクローナル抗体の樹立） カスパーゼ活性化ＤＮアーゼ（ＣＡＤ）の阻害たんぱく
質であるＩＣＡＤのカスパーゼ抵抗変異体を発現してい
る細胞はアポトーシスによってＤＮＡが断片化すること
はないが、マクロファージに貪食されるとＤＮＡが切断
される（GenesDev. 14, 549-558, 2000）。このシステ
ムを利用して、マクロファージによるアポトーシス細胞
の貪食作用について調べた。ＩＣＡＤ−Ｓｄｍ（短鎖カ
スパーゼ抵抗性ＩＣＡＤ）マウス由来の胸腺細胞をデキ
サメタゾンで４時間処理して、又は無処理のままで、フ
ィコエリトリン結合アネキシンＶ（BD PharMingen社
製）又はＦＩＴＣ結合ｄＵＴＰを用いたＴＵＮＥＬで染
色した。図１ａに示される結果からわかるように、ＩＣ
ＡＤ−Ｓｄｍマウスの胸腺細胞をデキサメタゾンで処理
したところ、およそ５０％の細胞が４時間以内にアネキ
シンＶ陽性となったが、ＴＵＮＥＬによる染色はされな
かった。

【００３６】次に、チオグリコレート刺激マウス腹腔マ
クロファージを、調製したばかりのＩＣＡＤ−Ｓｄｍマ
ウス由来の胸腺細胞又はデキサメタゾンで処理したＩＣ
ＡＤ−Ｓｄｍマウス由来の胸腺細胞とともにインキュベ
ーションした。かかる細胞を、フィコエリトリン結合抗
Ｍａｃ−１抗体で染色し、ついでＦＩＴＣ−ｄＵＴＰで
ＴＵＮＥＬ染色した。マクロファージを、調製したばか
りの胸腺細胞ではなく、アポトーシス下のＩＣＡＤ−Ｓ
ｄｍ胸腺細胞と共培養すると、およそ４０％のＭａｃ−
１⁺細胞（マクロファージ様細胞株の細胞表面抗原Ｍａ
ｃ−１発現細胞）がＴＵＮＥＬ陽性となった（図１ｂ
下）。デキサメタゾン処理した胸腺細胞とインキュベー
ションする３０分前に、バフィロマイシン（１００ｎ
Ｍ）をマクロファージに添加した。このように、リソソ
ームの酸化を妨げるバフィロマイシン（Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA 85, 7972-7976, 1988）でマクロファージ
を処理すると、ＴＵＮＥＬ陽性マクロファージの出現が
阻害された。なお、図１ｂ上は、Ｍａｃ−１⁺群におけ
るＴＵＮＥＬ染色のプロフィールを示す。これらの結果
より、かかるマクロファージはアポトーシス細胞を特異
的に取り込み、その染色体ＤＮＡを分解することがわか
った。

【００３７】このプロセスを仲介する物質を同定するた
め、チオグリコレート刺激マウス腹腔マクロファージを
用いて、アルメニアンハムスターを免疫し、ハイブリド
ーマを調製した。特定の抗体（２４２２モノクローナル
抗体）が、貪食作用を促進することがわかった。すなわ
ち、１２μｇ／ｍｌの正常ハムスターＩｇＧ、又は２４
２２モノクローナル抗体の存在下又は非存在下で貪食作
用を分析した。Ｍａｃ−１⁺群におけるＴＵＮＥＬ染色
のＦＡＣＳのプロフィールを図１ｃに示す。数字は、Ｍ
ａｃ−１⁺群におけるＴＵＮＥＬ陽性細胞の比率を示
す。これらの結果から、２４２２モノクローナル抗体の
存在下で、アポトーシス細胞を取り込むマクロファージ
の比率が４４％から５７％に上昇することがわかった。
また、光学顕微鏡（×４００）で観察したところ、図１
ｄに示されるように、２４２２モノクローナル抗体の存
在下では、アポトーシス細胞を取り込むマクロファージ
の数だけではなく、１つのマクロファージが取り込むア
ポトーシス細胞の数も増大することがわかった。

【００３８】実施例Ｂ−２（２４２２モノクローナル抗
体認識蛋白質の同定） ２４２２モノクローナル抗体により認識される蛋白質を
同定するため、チオグリコレート刺激腹腔マクロファー
ジ及びマクロファージ細胞株Ｐ３８８Ｄ１をビオチンで
表面標識し、２４２２モノクローナル抗体により認識さ
れる蛋白質の免疫沈降を行った。ストレプトアビジン−
ペルオキシダーゼを用いて免疫沈降物のウェスタンブロ
ットを行ったところ、図２ａに示されるように、７２ｋ
Ｄａ及び５６ｋＤａのバンドが現れた。図２ａからわか
るように、Ｐ３８８Ｄ１細胞株は腹腔マクロファージよ
りも豊富にかかる蛋白質を発現するため、Ｐ３８８Ｄ１
細胞の大規模な培養を行い、２４２２モノクローナル抗
体を用いて細胞溶解物からかかる抗体が認識する蛋白質
をアフィニティー精製し、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動で分離し、ＰＶＤＦ膜に移してPonceau-Sで染色し
た。結果を図２ｂに示す。図２ｂ中の矢印は、蛋白質配
列分析にかけた蛋白質及びプロテインＡセファロースか
ら解離したＩｇＧを示す。７２ｋＤａ及び５６ｋＤａの
蛋白質から作製したペプチドの質量分析を行ったとこ
ろ、それらがマウスＭＦＧ−Ｅ８であることがわかった
（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8417-8421, 1990、
Biochem.Biophys. Res. Commun. 254. 522-528, 199
9）。

【００３９】マウスＭＦＧ−Ｅ８配列を有するプライマ
ーを用いて、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣ
Ｒ）により、マウス腹腔マクロファージからｃＤＮＡの
２つのクラス（ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ及びＭＦＧ−Ｅ８−
Ｓ）を単離した。次に、チオグリコレート刺激腹腔マク
ロファージ及びＰ３８８Ｄ１細胞由来の全ＲＮＡ（７．
５μｇ）を、１．５％のアガロースゲル上での電気泳動
で分離し、³²Ｐ標識マウスＭＦＧ−Ｅ８ ｃＤＮＡを使
用したノーザンハイブリダイゼーションで分析した（図
２ｃ上図；図２ｃ下図では、フィルターを０．０５％
（ｗ／ｖ）のメチレンブルーで染色している。）ノーザ
ンブロット分析によって、チオグリコレート刺激腹腔マ
クロファージ及びＰ３８８Ｄ１においてＭＦＧ−Ｅ８
ｍＲＮＡが豊富に発現していることがわかった。これに
対し、休止期の腹腔マクロファージ及び胸腺細胞では、
ＭＦＧ−Ｅ８ ｍＲＮＡがほとんど検出されなかった。
Ｊ７７４Ａ．１及びＢＡＭ３など他のマクロファージ細
胞株、並びに繊維芽細胞系ＮＩＨ３Ｔ３は、ＭＦＧ−Ｅ
８ ｍＲＮＡをほとんど発現していなかった（図２
ｃ）。

【００４０】チオグリコレート刺激腹腔マクロファージ
及びＰ３８８Ｄ１由来の全ＲＮＡ（０．３μｇ）をＲＴ
−ＰＣＲで分析した。図２ｄ右図は、ＭＦＧ−Ｅ８ ｍ
ＲＮＡの一部分を示す概略図である。矢印は、使用した
プライマーの位置を示す：センスプライマーはATGCAGGT
CTCCCGTGTGCT（配列番号４：Ｐ１）、アンチセンスプラ
イマーはGCGGAAATCTGTGAATCAGC（配列番号５：Ｐ２）で
ある。アガロースゲル電気泳動により、ＰＣＲ産物を分
離した。ＲＴ−ＰＣＲ分析により、チオグリコレート刺
激腹腔マクロファージ中のＭＦＧ−Ｅ８ ｍＲＮＡが主
に長鎖（ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ）をコードするのに対し、Ｐ
３８８Ｄ１細胞が発現するのは圧倒的に短鎖（ＭＦＧ−
Ｅ８−Ｓ）であることがわかった。そこで、チオグリコ
レート刺激腹腔マクロファージ及びＰ３８８Ｄ１を４８
時間培養した。細胞溶解物と培養上澄液を２４２２モノ
クローナル抗体で免疫沈降し、ウサギ抗ＭＦＧ−Ｅ８抗
体を用いてウェスタンブロットを行った。結果を図２ｅ
に示す。図２ｅ中右側矢印は、ＭＦＧ−Ｅ８蛋白質を示
す。ＭＦＧ−Ｅ８は、Ｎ−末端にシグナル配列を有して
いるが、推定膜貫通領域は有していないことから、分泌
蛋白質であると示唆されている。これら結果に示されて
いるように、チオグリコレート刺激腹腔マクロファージ
の培養上澄液には、実際、７４ｋＤａのＭＦＧ−Ｅ８が
大量に含まれている。一方、Ｐ３８８Ｄ１細胞は、その
細胞溶解物中にはかなりの量のＭＦＧ−Ｅ８が含まれて
いるにもかかわらず、無視できる程度のＭＦＧ−Ｅ８し
か分泌していなかった。このことは、Ｐ３８８Ｄ１中で
発現したＭＦＧ−Ｅ８が充分に分泌されていないことを
示唆している。なお、図２ｅ中＊で示したバンドは、Ｍ
ＦＧ−Ｅ８の分解生成物と思われる。

【００４１】実施例Ｂ−３（アポトーシス細胞上に露出
したアミノリン脂質へのＭＦＧ−Ｅ８の結合） ＭＦＧ−Ｅ８がアポトーシス細胞に結合するかどうかを
調べるため、ＦＬＡＧ結合組換えＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ（図
３ａ）をヒト２９３Ｔ細胞中で作製し、精製して均一化
した。調製したばかりの野生型胸腺細胞（５×１０
⁵個）又はデキサメタゾンで４時間処理した胸腺細胞
を、０．２５μｇ／ｍｌのＦＬＡＧ結合ＭＦＧ−Ｅ８−
Ｌとともに４℃で３０分間インキュベーションし、つい
でビオチン化抗ＦＬＡＧ抗体及びフィコエリトリン結合
ストレプトアビジンで二重染色した。固定した後、ＦＩ
ＴＣ−ｄＵＴＰを用いて細胞をＴＵＮＥＬ染色し、ＦＡ
ＣＳで分析した。結果を図３ｂに示す。図３ｂからもわ
かるように、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌは単離したばかりの胸腺
細胞には結合しないが、デキサメタゾンで処理した胸腺
細胞にはしっかりと結合した。かかるデキサメタゾンで
処理した胸腺細胞を、ＭＦＧ−Ｅ８−ＬとＴＵＮＥＬで
二重染色すると、ＭＦＧ−Ｅ８−ＬがＴＵＮＥＬ陽性の
アポトーシス細胞に特異的に結合していることがわか
る。

【００４２】前記のように、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌには、１
つのシグナル配列、２つのＥＧＦドメイン、１つの高プ
ロリン／スレオニン含有ドメイン（高Ｐ／Ｔ含有ドメイ
ン）、及び２つの因子VIII相同ドメイン（Ｃ１及びＣ
２）がある。ＭＦＧ−Ｅ８−Ｓは、異なる形でスプライ
シングされたＭＦＧ−Ｅ８ ｍＲＮＡにコードされてお
り、高Ｐ／Ｔ含有ドメインを欠失している。ＭＦＧ−Ｅ
８−Ｌのどのドメインがアポトーシス細胞への結合に関
与しているのかを調べるために、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｓ及び
一連のＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体を用いて調べてみた。胸
腺細胞をデキサメタゾンで６時間処理し、種々のＭＦＧ
−Ｅ８誘導体０．２５μｇ／ｍｌとともにインキュベー
ションした。胸腺細胞に結合したＭＦＧ−Ｅ８に対し、
ＦＩＴＣ標識抗ＦＬＡＧ抗体を用いたＦＡＣＳ分析を行
った。結果を図３ｃに示す。なお、図３ｃ中の点線はＭ
ＦＧ−Ｅ８非存在下での染色のプロフィールを示す。図
３ｃに示すように、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌだけではなく、Ｍ
ＦＧ−Ｅ８−Ｓ、ＲＧＤモチーフに点変異をもつＤ８９
Ｅ、Ｃ１ドメインとＣ２ドメインのみを含むＣ１Ｃ２
も、アポトーシス下の胸腺細胞に結合した。

【００４３】ところで、アネキシンＶは、ホスファチジ
ルセリン（ＰＳ）を認識することによってアポトーシス
細胞に結合することが知られている（Blood 84, 1415-1
420,1994）。そこで、デキサメタゾンで６時間処理した
胸腺細胞を、１．２５μｇ／ｍｌのＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ又
は種々の変異体とともにインキュベーションし、フィコ
エリトリン結合アネキシンＶで染色した。結果を図３ｄ
示す。図３ｄ中の点線は、ＭＦＧ−Ｅ８非存在下でのア
ネキシンＶ染色のプロフィールを示す。図３ｄからわか
るように、アポトーシス下の胸腺細胞をＭＦＧ−Ｅ８−
Ｌ又はＤ８９Ｅで前処理すると、アネキシンＶのアポト
ーシス細胞への結合が大きく阻害された。また、アネキ
シンＶの結合に対するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌの阻害効果は投
与量依存的であり、０．２５μｇ／ｍｌのＭＦＧ−Ｅ８
−Ｌで処理すると、アネキシンＶの結合が５０％阻害さ
れた。一方、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｓ又はＣ１Ｃ２の存在によ
ってアネキシンＶのアポトーシス細胞への結合が阻害さ
れることはなかった。このことから、アポトーシス細胞
に対するＭＦＧ−Ｅ８−Ｓの親和性は、ＭＦＧ−Ｅ８−
Ｌの親和性と比較してかなり低いことがわかる。

【００４４】アネキシンＶのアポトーシス細胞への結合
に対するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌの拮抗的作用から、ＭＦＧ−
Ｅ８−ＬがＰＳに結合することが示唆された。そこで、
ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌの各種リン脂質への結合について調べ
てみた。ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジ
ルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン
（ＰＣ）又はホスファチジルイノシトール（ＰＩ）でコ
ーティングしたマイクロタイタープレートを、段階的に
濃度を上昇させたＭＦＧ−Ｅ８−Ｌとともにインキュベ
ーションし、ウェルに結合したＭＦＧ−Ｅ８−Ｌを、抗
ＦＬＡＧ抗体を用いたＥＬＩＳＡで定量した。結果を図
３ｅに示す。図３ｅからわかるように、ＭＦＧ−Ｅ８−
Ｌは、ＰＳ又はＰＥでコーティングしたプレートに飽和
状態で結合したが、ＰＣ又はＰＩでコーティングしたプ
レートにはＭＦＧ−Ｅ８−Ｌは有意とされるほど結合し
なかった。

【００４５】次に、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌと同様にアネキシ
ンＶのアポトーシス細胞への結合に対して拮抗作用を有
する、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌの点変異誘導体であるＤ８９Ｅ
変異体についても、ホスファチジルセリンへの結合性に
ついて調べてみた。ＰＳでコーティングしたマイクロタ
イタープレートを、段階的に濃度を上昇させたＤ８９Ｅ
の他、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｓ又はＣ１Ｃ
２変異体とともにインキュベーションし、ウェルに結合
したＭＦＧ−Ｅ８を、ＥＬＩＳＡで定量した。結果を図
３ｆに示す。図３ｆからもわかるように、ＭＦＧ−Ｅ８
−ＬのＤ８９Ｅ変異体は、野生型ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌと同
程度の効率で、ＰＳでコーティングしたプレートに結合
したが、ＰＳでコーティングしたプレートに対するＭＦ
Ｇ−Ｅ８−Ｓ及びＣ１Ｃ２変異体の親和性は、ＭＦＧ−
Ｅ８−Ｌの親和性の８分の１であった。これらの結果か
ら、ＭＦＧ−Ｅ８−ＬがそのＣ１Ｃ２ドメインを介して
アミノリン脂質を認識できること、及びＭＦＧ−Ｅ８−
Ｌに存在する高Ｐ／Ｔ含有ドメインが、これらのリン脂
質に対するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌの親和性に関与しているこ
とがわかった。

【００４６】実施例Ｂ−４（ＭＦＧ−Ｅ８を介したＮＩ
Ｈ３Ｔ３細胞のアミノリン脂質への結合） ＭＦＧ−Ｅ８の第２ＥＧＦドメインには、細胞接着に関
与する細胞膜貫通受容体であるインテグリンファミリー
のいくつかのメンバーが認識可能なＲＧＤモチーフが存
在する（Cell 69, 11-25, 1992）。そのため、ＭＦＧ−
Ｅ８−Ｌがアミノリン脂質を発現するアポトーシス細胞
とインテグリンを発現する貪食細胞との掛け橋の役割を
果たすとの可能性について考察した。マウスα_Vβ₃イン
テグリンを発現するＮＩＨ３Ｔ３形質転換体を、フィコ
エリトリン結合ハムスター抗マウスインテグリンα_V抗
体又はフィコエリトリン結合ハムスター抗マウスインテ
グリンβ₃抗体を使用してＦＡＣＳで分析した。結果を
図４ａに示す。図４ａ中の点線は、ＮＩＨ３Ｔ３親細胞
に対するＦＡＣＳ染色のプロフィールを示す。図４ａか
らわかるように、マウスＮＩＨ３Ｔ３親細胞は、α_Vイ
ンテグリンやβ₃インテグリンを低レベルで発現する
が、α_V及びβ₃インテグリン発現ベクターでこの親細胞
株を形質転換したところ、α_Vインテグリン及びβ₃イン
テグリンの両方を豊富に発現した。

【００４７】ＦＬＡＧ結合ＭＦＧ−Ｅ８を用いたＦＡＣ
Ｓ分析では、ＭＦＧ−Ｅ８−ＬとＮＩＨ３Ｔ３又はその
α_Vβ₃インテグリン形質転換体との間に特異的な結合は
見られなかった。そこで、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌがインテグ
リン発現細胞に結合するのは、かかる細胞がリン脂質に
結合された後なのではないかとの可能性について調べて
みた。ＰＳ又はＰＥでコーティングしたマイクロタイタ
ーウェルについて、三種類の濃度（０．１μｇ／ｍｌ、
１．０μｇ／ｍｌ及び２．０μｇ／ｍｌ）のＭＦＧ−Ｅ
８−Ｌ又はＤ８９Ｅを用いて、及び、ＮＩＨ３Ｔ３（３
Ｔ３／ＷＴ）又はα_Vβ₃インテグリン発現形質転換体
（３Ｔ３／α_Vβ₃）を用いて、連続してインキュベーシ
ョンし、細胞接着アッセイを行った。ウェルに付着した
細胞の数を、実施例Ａ−６記載の方法で定量した。結果
を図４ｂに示す。図４ｂに示すように、ＮＩＨ３Ｔ３親
細胞（３Ｔ３／ＷＴ）は、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌの非存在下
ではＰＳでコーティングしたプレートに接着しなかっ
た。一方、ＰＳでコーティングしたプレートをＭＦＧ−
Ｅ８−Ｌ存在下でプレインキュベーションしていた場合
は、かなりの数のＮＩＨ３Ｔ３細胞がウェルに接着し
た。Ｄ８９Ｅ変異体はＰＳでコーティングしたウェルへ
のＮＩＨ３Ｔ３細胞の接着を仲介することができなかっ
た。これは、このＭＦＧ−Ｅ８−Ｌの効果がそのＲＧＤ
モチーフによるものであることを示している。α_Vβ₃イ
ンテグリンを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞（３Ｔ３／α_V
β₃）を標的として使用すると、ＰＳでコーティングし
たウェルへの細胞の接着に対するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌの作
用は、さらに劇的なものになった。すなわち、無処理の
ウェル又はＤ８９Ｅで処理したウェルには２０個の細胞
が接着したに過ぎないのに対し、１．０μｇ／ｍｌのＭ
ＦＧ−Ｅ８−Ｌで前処理したウェルには約７０００個の
細胞が接着していた。ＰＥに対するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌの
結合能力に関しては、ＰＳでコーティングしたウェルの
場合と同様の効率で、ＰＥでコーティングしたウェルに
ついても、ＮＩＨ３Ｔ３細胞形質転換体の接着を助け
た。

【００４８】実施例Ｂ−５（ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌによるア
ポトーシス細胞の取り込み） 次に、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を刺激してアポトーシス細胞を
取り込ませることが、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌに可能かどうか
を調べてみた。ＮＩＨ３Ｔ３（３Ｔ３／ＷＴ）又はα_V
β₃インテグリンを発現するその形質転換体（３Ｔ３／
α_Vβ₃）を、０．１μｇ／ｍｌのＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ、Ｍ
ＦＧ−Ｅ８−Ｓ又はＤ８９Ｅの存在下又は非存在下
（-）で、ＩＣＡＤ−Ｓｄｍマウスから調製したばかり
の胸腺細胞（Ｄｅｘ（-））とともに、又はデキサメタ
ゾンで４時間処理した胸腺細胞（Ｄｅｘ（+））ととも
にインキュベーションした。胸腺細胞を４個以上取り込
んだＮＩＨ３Ｔ３細胞を計数し、ＮＩＨ３Ｔ３細胞総数
（１５０個）に対するこうした細胞の比率を求めた。３
つ一組の実験を少なくとも２回行った。その平均値をＳ
Ｄ（バー）として図５ａに示す。図５ａからわかるよう
に、ＩＣＡＤ−Ｓｄｍマウスから調製したばかりの胸腺
細胞をＮＩＨ３Ｔ３細胞と２時間共培養したところ、Ｍ
ＦＧ−Ｅ８−Ｌの存在下又は非存在下で、ＮＩＨ３Ｔ３
細胞に付着されたり取り込まれたりする胸腺細胞は皆無
であったが、デキサメタゾンで処理した胸腺細胞とＮＩ
Ｈ３Ｔ３細胞とを共培養した場合は、およそ６％のＮＩ
Ｈ３Ｔ３細胞が、それぞれ４個以上の胸腺細胞を取り込
んでいた。また、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌの存在により、４個
以上の胸腺細胞を内部に取り込んだＮＩＨ３Ｔ３細胞の
比率は２３％に上昇した。

【００４９】次に、α_Vβ₃インテグリンを発現するＮＩ
Ｈ３Ｔ３細胞形質転換体を、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ又はＤ８
９Ｅの存在下又は非存在下（コントロール）で、アポト
ーシス下の胸腺細胞とともにインキュベーションし、光
学顕微鏡（×２００）で観察した。結果を図５ｂに示
す。図５に示されるように、貪食作用に対するＭＦＧ−
Ｅ８−Ｌの影響は、α_Vβ₃インテグリンを発現するＮＩ
Ｈ３Ｔ３形質転換体を貪食細胞として使用する場合には
さらに明白なものとなった。この場合、４個以上の胸腺
細胞を取り込んだＮＩＨ３Ｔ３形質転換体の比率は、Ｍ
ＦＧ−Ｅ８−Ｌを分析混合系に添加すると９％から４６
％に上昇し、およそ２０％の細胞が７個以上の胸腺細胞
を内部に取り込んでいた。ＮＩＨ３Ｔ３細胞の貪食活動
に対するＭＦＧ−Ｅ８−ＳやＤ８９Ｅの影響は、ほとん
どなかった。

【００５０】α_Vβ₃インテグリンを発現するＮＩＨ３Ｔ
３細胞形質転換体を、段階的に濃度を上昇させたＭＦＧ
−Ｅ８−Ｌ又はＤ８９Ｅの存在下で、アポトーシス下の
胸腺細胞と共培養し、４個以上の胸腺細胞を取り込んだ
細胞の比率を測定した。３つで一組とした２回の実験で
得られた平均数値をＳＤ（バー）でプロットした結果を
図５ｃに示す。各種濃度のＭＦＧ−Ｅ８−Ｌを用いた図
５ｃに示される結果より、貪食作用を増大させるための
ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌの至適濃度が存在することがわかっ
た。０．１μｇ／ｍｌ以下では、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌは投
与量依存的に貪食作用を増大させるが、その濃度を超え
ると、阻害的な影響が現れる。この阻害作用は、２４２
２モノクローナル抗体の添加によって消滅する。

【００５１】他方、野生型ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌとは異な
り、Ｄ８９Ｅ変異体はＮＩＨ３Ｔ３及びその形質転換体
の貪食活動を、広い濃度範囲で阻害する（図５ａ及び５
ｃ）。Ｄ８９Ｅのこの特性を使って、腹腔マクロファー
ジによるアポトーシス細胞の貪食に対するＭＦＧ−Ｅ８
−Ｌの関与について評価した。ＩＣＡＤ−Ｓｄｍマウス
由来の胸腺細胞をデキサメタゾンで４時間処理し、図５
ｄに示す濃度のＤ８９Ｅの存在下で、チオグリコレート
刺激腹腔マクロファージと共培養した。反応終了後、フ
ィコエリトリン結合抗Ｍａｃ−１抗体でかかる細胞を染
色し、ＦＩＴＣ−ｄＵＴＰでＴＵＮＥＬを行った。Ｍａ
ｃ−１⁺細胞群におけるＴＵＮＥＬ陽性細胞のＦＡＣＳ
のプロフィールを図５ｄに示す。図５ｄ中の数字は、２
つの別個の実験で得られたＴＵＮＥＬ陽性マクロファー
ジの比率を示す。図５ｄに示すように、チオグリコレー
ト刺激腹腔マクロファージを、デキサメタゾンで処理し
たＩＣＡＤ−Ｓｄｍマウス由来の胸腺細胞と共培養する
と、およそ４２％のマクロファージがＴＵＮＥＬ陽性と
なる。ＴＵＮＥＬ陽性細胞の出現及びマクロファージに
よる胸腺細胞の貪食は、Ｄ８９Ｅによって投与量依存的
に大きく阻害された。これにより、マクロファージ中に
発現したＭＦＧ−Ｅ８−Ｌがアポトーシス細胞の貪食に
重要な役割を果たしたことがわかる。

【００５２】実施例Ｃ［まとめ］ 貪食細胞中に発現する多くの蛋白質が、アポトーシス細
胞の取り込みに関与する受容体として報告されている
（Trends Cell Biol. 8, 365-372, 1998、Cell Death D
iffer. 5, 551-562, 1998、 Nature 407, 784-788, 200
0）。しかし、こうした受容体が直接アポトーシス細胞
に結合するかどうかは、はっきりとしていなかった。本
発明者らはここに、ＭＦＧ−Ｅ８−ＬがＰＳやＰＥなど
のアミノリン脂質を認識することで、アポトーシス細胞
に特異的に結合することを示した。増殖期又は休止期の
細胞の原形質膜内部小葉（inner leaflet）に局在する
アミノリン脂質は、細胞がアポトーシスへ向かいはじめ
ると、細胞表面に露出する（J. Immunol. 149, 4029-40
35, 1992, Exp. Cell Res. 232, 430-434, 1997, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 95, 6349-6354, 1998）。リポ
ソームトランスファー法を用いてＰＳを発現させた細胞
は、貪食細胞により認識され取り込まれる（J.Biol. Ch
em. 270, 1071-1077, 2001）。これらのことから、露出
状態のＰＳは、「食べろ」シグナルとしての基準を満た
していることがわかる。アポトーシス細胞の受容体とし
て挙げられている分子の多くは、ＰＳだけではなくＰＩ
にも結合する（Cell Death Differ. 5, 551-562, 199
8、J. Biol. Chem. 276, 16221-16224, 1995）。一方、
ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌが結合するのはＰＳとＰＥだけであ
り、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌがアポトーシス細胞を特異的に認
識するとの考えを裏付けている。

【００５３】インテグリンは、いくつかのシステムにお
けるアポトーシス細胞に対する受容体であると示唆され
ている（Nature 343, 170-173, 1990、Nature 392, 86-
89,1998）。しかし、α_Vβ₃インテグリンもα_Vβ₅イン
テグリンもＰＳとは結合できないため、こうしたインテ
グリンがアポトーシス細胞を認識する方法は不明であ
る。ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌによってこのジレンマが解消し、
チオグリコレート刺激腹腔マクロファージ中のアポトー
シス細胞に対する受容体としてインテグリンが認められ
るものと思われる。他の貪食細胞がこのシステムを使用
しているのか、それともＰＳＲ（Nature 405, 85-90, 2
000）やＭＥＲ（Nature 411, 207-211, 2001）といった
他のシステムを使用しているのかについては、さらなる
研究を待つ必要がある。

【００５４】ＭＦＧ−Ｅ８は本来、乳脂肪小球体（milk
fat globules）の膜中にもっとも豊富に存在する蛋白
質の１つとして同定されたものである（Proc. Natl. Ac
ad.Sci. USA 87, 8417-8421, 1990）。授乳や搾乳をし
なくなると、乳腺はかなり退縮する（J. Mammary Gland
Biol. Neoplasia 4, 129-136, 1999）。この過程で、
大量の上皮細胞がアポトーシスにより死滅する。そし
て、浸潤したマクロファージや生存上皮細胞により、そ
うしたアポトーシス細胞を除去して、次回の乳汁分泌に
向けて乳腺を再構築できるようにする必要がある（J. M
ammary Gland Biol. Neoplasia 4, 203-211, 1999）。
アポトーシス細胞を認識する分子としてＭＦＧ−Ｅ８−
Ｌを同定することは、乳汁分泌終了時の乳腺の退縮と再
構築の背後にある分子的機構を解明するのに有用であ
る。

【００５５】

【発明の効果】本発明によると、マクロファージによっ
て生体内のアポトーシス細胞を速やかに除去することが
できるアポトーシス細胞の除去促進剤や、マクロファー
ジによる生体内のアポトーシス細胞の除去を阻害する除
去阻害剤を提供することができる。

【００５６】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> JAPAN SCIENCE AND TECHNOLOGY CORPORATION <120> Exclusion activator and exclusion inhibitor of apoptotic cells in vivo <130> A131P18 <140> <141> <160> 5 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 463 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Met Gln Val Ser Arg Val Leu Ala Ala Leu Cys Gly Met Leu Leu Cys 1 5 10 15 Ala Ser Gly Leu Phe Ala Ala Ser Gly Asp Phe Cys Asp Ser Ser Leu 20 25 30 Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Leu Thr Gly Gln Asp Asn Asp Ile Tyr 35 40 45 Cys Leu Cys Pro Glu Gly Phe Thr Gly Leu Val Cys Asn Glu Thr Glu 50 55 60 Arg Gly Pro Cys Ser Pro Asn Pro Cys Tyr Asn Asp Ala Lys Cys Leu 65 70 75 80 Val Thr Leu Asp Thr Gln Arg Gly Asp Ile Phe Thr Glu Tyr Ile Cys 85 90 95 Gln Cys Pro Val Gly Tyr Ser Gly Ile His Cys Glu Thr Glu Thr Asn 100 105 110 Tyr Tyr Asn Leu Asp Gly Glu Tyr Met Phe Thr Thr Ala Val Pro Asn 115 120 125 Thr Ala Val Pro Thr Pro Ala Pro Thr Pro Asp Leu Ser Asn Asn Leu 130 135 140 Ala Ser Arg Cys Ser Thr Gln Leu Gly Met Glu Gly Gly Ala Ile Ala 145 150 155 160 Asp Ser Gln Ile Ser Ala Ser Ser Val Tyr Met Gly Phe Met Gly Leu 165 170 175 Gln Arg Trp Gly Pro Glu Leu Ala Arg Leu Tyr Arg Thr Gly Ile Val 180 185 190 Asn Ala Trp Thr Ala Ser Asn Tyr Asp Ser Lys Pro Trp Ile Gln Val 195 200 205 Asn Leu Leu Arg Lys Met Arg Val Ser Gly Val Met Thr Gln Gly Ala 210 215 220 Ser Arg Ala Gly Arg Ala Glu Tyr Leu Lys Thr Phe Lys Val Ala Tyr 225 230 235 240 Ser Leu Asp Gly Arg Lys Phe Glu Phe Ile Gln Asp Glu Ser Gly Gly 245 250 255 Asp Lys Glu Phe Leu Gly Asn Leu Asp Asn Asn Ser Leu Lys Val Asn 260 265 270 Met Phe Asn Pro Thr Leu Glu Ala Gln Tyr Ile Arg Leu Tyr Pro Val 275 280 285 Ser Cys His Arg Gly Cys Thr Leu Arg Phe Glu Leu Leu Gly Cys Glu 290 295 300 Leu His Gly Cys Ser Glu Pro Leu Gly Leu Lys Asn Asn Thr Ile Pro 305 310 315 320 Asp Ser Gln Met Ser Ala Ser Ser Ser Tyr Lys Thr Trp Asn Leu Arg 325 330 335 Ala Phe Gly Trp Tyr Pro His Leu Gly Arg Leu Asp Asn Gln Gly Lys 340 345 350 Ile Asn Ala Trp Thr Ala Gln Ser Asn Ser Ala Lys Glu Trp Leu Gln 355 360 365 Val Asp Leu Gly Thr Gln Arg Gln Val Thr Gly Ile Ile Thr Gln Gly 370 375 380 Ala Arg Asp Phe Gly His Ile Gln Tyr Val Ala Ser Tyr Lys Val Ala 385 390 395 400 His Ser Asp Asp Gly Val Gln Trp Thr Val Tyr Glu Glu Gln Gly Ser 405 410 415 Ser Lys Val Phe Gln Gly Asn Leu Asp Asn Asn Ser His Lys Lys Asn 420 425 430 Ile Phe Glu Lys Pro Phe Met Ala Arg Tyr Val Arg Val Leu Pro Val 435 440 445 Ser Trp His Asn Arg Ile Thr Leu Arg Leu Glu Leu Leu Gly Cys 450 455 460 <210> 2 <211> 1392 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 2 atgcaggtct cccgtgtgct ggccgcgctg tgcggcatgc tactctgcgc ctctggcctc 60 ttcgccgcgt ctggtgactt ctgtgactcc agcctgtgcc tgaacggtgg cacctgcttg 120 acgggccaag acaatgacat ctactgcctc tgccctgaag gcttcacagg ccttgtgtgc 180 aatgagactg agagaggacc atgctcccca aacccttgct acaatgatgc caaatgtctg 240 gtgactttgg acacacagcg tggggacatc ttcaccgaat acatctgcca gtgccctgtg 300 ggctactcgg gcatccactg tgaaaccgag accaactact acaacctgga tggagaatac 360 atgttcacca cagccgtccc caatactgcc gtccccaccc cggcccccac ccccgatctt 420 tccaacaacc tagcctcccg ttgttctaca cagctgggca tggaaggggg cgccattgct 480 gattcacaga tttccgcctc gtctgtgtat atgggtttca tgggcttgca gcgctggggc 540 ccggagctgg ctcgtctgta ccgcacaggg atcgtcaatg cctggacagc cagcaactat 600 gatagcaagc cctggatcca ggtgaacctt ctgcggaaga tgcgggtatc aggtgtgatg 660 acgcagggtg ccagccgtgc cgggagggcg gagtacctga agaccttcaa ggtggcttac 720 agcctcgacg gacgcaagtt tgagttcatc caggatgaaa gcggtggaga caaggagttt 780 ttgggtaacc tggacaacaa cagcctgaag gttaacatgt tcaacccgac tctggaggca 840 cagtacataa ggctgtaccc tgtttcgtgc caccgcggct gcaccctccg cttcgagctc 900 ctgggctgtg agttgcacgg atgttctgag cccctgggcc tgaagaataa cacaattcct 960 gacagccaga tgtcagcctc cagcagctac aagacatgga acctgcgtgc ttttggctgg 1020 tacccccact tgggaaggct ggataatcag ggcaagatca atgcctggac ggctcagagc 1080 aacagtgcca aggaatggct gcaggttgac ctgggcactc agaggcaagt gacaggaatc 1140 atcacccagg gggcccgtga ctttggccac atccagtatg tggcgtccta caaggtagcc 1200 cacagtgatg atggtgtgca gtggactgta tatgaggagc aaggaagcag caaggtcttc 1260 cagggcaact tggacaacaa ctcccacaag aagaacatct tcgagaaacc cttcatggct 1320 cgctacgtgc gtgtccttcc agtgtcctgg cataaccgca tcaccctgcg cctggagctg 1380 ctgggctgtt aa 1392 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:peptide <400> 3 Cys Asn Ser His Lys Lys Asn Ile Phe Glu Lys Pro Phe Met Ala Arg 1 5 10 15 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:P1 <400> 4 atgcaggtct cccgtgtgct 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:P2 <400> 5 gcggaaatct gtgaatcagc 20

【図面の簡単な説明】

【図１】アポトーシス細胞への貪食作用を増大させるモ
ノクローナル抗体の樹立に関する実験結果を示す図であ
る。

【図２】ＭＦＧ−Ｅ８の同定及びその発現に関する実験
結果を示す図である。

【図３】アポトーシス細胞上に露出したアミノリン脂質
へのＭＦＧ−Ｅ８の結合に関する実験結果を示す図であ
る。

【図４】ＭＦＧ−Ｅ８を介したＮＩＨ３Ｔ３細胞のアミ
ノリン脂質への結合に関する実験結果を示す図である。

【図５】ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌによるアポトーシス細胞の取
り込みに関する実験結果を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｔ ４Ｃ０８６ 45/00 ４Ｃ０８７ 45/00 48/00 48/00 Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/00 43/00 １０５ 43/00 １０５ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 ＺＮＡ // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 4B024 AA01 AA11 AA12 BA80 CA04 DA03 EA04 GA11 HA12 4C076 AA19 CC27 DD63F FF16 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 AA17 BA01 BA08 BA22 BA23 CA23 CA25 MA01 MA24 NA14 ZB212 ZB262 4C085 AA13 AA14 CC32 DD62 EE01 GG01 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB21 ZB26 4C087 AA01 AA02 AA03 BB33 BB37 BB65 BC01 BC22 BC30 BC34 BC61 BC65 BC71 CA04 CA09 CA12 CA16 MA01 MA02 NA14 ZB21 ZB26

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌを有効成分とすること
   を特徴とするマクロファージによる生体内のアポトーシ
   ス細胞の除去促進剤。
2. 【請求項２】 ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌを構成するアミノ酸配
   列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若
   しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつマクロフ
   ァージによる生体内のアポトーシス細胞の除去促進作用
   を有するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体を有効成分とすること
   を特徴とするマクロファージによる生体内のアポトーシ
   ス細胞の除去促進剤。
3. 【請求項３】 ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ又はアポトーシス細胞
   の除去作用を有するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体が、組換え
   ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ又は組換えＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体で
   あることを特徴とする請求項１又は２記載のマクロファ
   ージによる生体内のアポトーシス細胞の除去促進剤。
4. 【請求項４】 組換えＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ又は組換えＭＦ
   Ｇ−Ｅ８−Ｌ変異体が、組換えヒト若しくはマウスＭＦ
   Ｇ−Ｅ８−Ｌ又は組換えヒト若しくはマウスＭＦＧ−Ｅ
   ８−Ｌ変異体であることを特徴とする請求項３記載のマ
   クロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去促
   進剤。
5. 【請求項５】 組換えＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ又は組換えＭＦ
   Ｇ−Ｅ８−Ｌ変異体が、ヒト細胞中での翻訳産物である
   ことを特徴とする請求項３又は４記載のマクロファージ
   による生体内のアポトーシス細胞の除去促進剤。
6. 【請求項６】 組換えＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ又は組換えＭＦ
   Ｇ−Ｅ８−Ｌ変異体が、ＲＧＤモチーフを有するＥＧＦ
   −２ドメイン、高プロリン／スレオニン含有ドメイン、
   ２つの因子VIII相同ドメイン（Ｃ１及びＣ２）を有する
   ことを特徴とする請求項３〜５のいずれか記載のマクロ
   ファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去促進
   剤。
7. 【請求項７】 ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ又はＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ
   変異体が、リポソームに封入又は包埋されていることを
   特徴とする請求項１〜６のいずれか記載のマクロファー
   ジによる生体内のアポトーシス細胞の除去促進剤。
8. 【請求項８】 請求項１〜６のいずれかに記載されたＭ
   ＦＧ−Ｅ８−Ｌ又はＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体をコードす
   るＤＮＡを含む組換えベクターを有効成分とすることを
   特徴とするマクロファージによる生体内のアポトーシス
   細胞の除去促進剤。
9. 【請求項９】 請求項１〜６のいずれかに記載されたＭ
   ＦＧ−Ｅ８−Ｌ又はＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体を発現する
   ことができる発現系を含んでなる宿主細胞を有効成分と
   することを特徴とするマクロファージによる生体内のア
   ポトーシス細胞の除去促進剤。
10. 【請求項１０】 請求項１〜６のいずれかに記載された
    ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体に対する抗体を有効成分とする
    ことを特徴とするマクロファージによる生体内のアポト
    ーシス細胞の除去促進剤。
11. 【請求項１１】 請求項１〜６のいずれかに記載された
    ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体に対する抗体が、抗ＭＦＧ−Ｅ
    ８−Ｌモノクローナル抗体又は抗ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異
    体モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１
    ０記載のマクロファージによる生体内のアポトーシス細
    胞の除去促進剤。
12. 【請求項１２】 請求項１〜１１のいずれか記載の生体
    内のアポトーシス細胞の除去促進剤を用いることを特徴
    とするマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞
    の除去方法。
13. 【請求項１３】 請求項１〜１１のいずれか記載の生体
    内のアポトーシス細胞の除去促進剤を含有することを特
    徴とするマクロファージによる生体内のアポトーシス細
    胞の除去不全に起因する疾病の治療薬。
14. 【請求項１４】 請求項１〜１１のいずれか記載の生体
    内のアポトーシス細胞の除去促進剤を含有することを特
    徴とする生体防御機能増強剤。
15. 【請求項１５】 請求項１３記載の治療薬又は請求項１
    ４記載の生体防御機能増強剤を用いることを特徴とする
    マクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去
    不全に起因する疾病の治療方法。
16. 【請求項１６】 ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌを構成するアミノ酸
    配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換
    若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつマクロ
    ファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去阻害作
    用を有するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体を有効成分とするこ
    とを特徴とするマクロファージによる生体内のアポトー
    シス細胞の除去阻害剤。
17. 【請求項１７】 アポトーシス細胞の除去阻害作用を有
    するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体が、組換えＭＦＧ−Ｅ８−
    Ｌ変異体であることを特徴とする請求項１６記載のマク
    ロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去阻害
    剤。
18. 【請求項１８】 組換えＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体が、組
    換えヒトＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体又は組換えマウスＭＦ
    Ｇ−Ｅ８−Ｌ変異体であることを特徴とする請求項１７
    記載のマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞
    の除去阻害剤。
19. 【請求項１９】 組換えＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体が、ヒ
    ト細胞中での翻訳産物であることを特徴とする請求項１
    ７又は１８記載のマクロファージによる生体内のアポト
    ーシス細胞の除去阻害剤。
20. 【請求項２０】 組換えＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体が、１
    つの高プロリン／スレオニン含有ドメイン及び２つの因
    子VIII相同ドメイン（Ｃ１及びＣ２）を有しＲＧＤモチ
    ーフに点変異をもつＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体であること
    を特徴とする請求項１７〜１９のいずれか記載のマクロ
    ファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去阻害
    剤。
21. 【請求項２１】 点変異をもつＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体
    が、Ｄ８９Ｅ変異体であることを特徴とする請求項２０
    記載のマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞
    の除去阻害剤。
22. 【請求項２２】 ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体が、リポソー
    ムに封入又は包埋されていることを特徴とする請求項１
    ６〜２１のいずれか記載のマクロファージによる生体内
    のアポトーシス細胞の除去阻害剤。
23. 【請求項２３】 請求項１６〜２１のいずれかに記載さ
    れたＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体をコードするＤＮＡを含む
    組換えベクターを有効成分とすることを特徴とするマク
    ロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去阻害
    剤。
24. 【請求項２４】 請求項１６〜２１のいずれかに記載さ
    れたＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体を発現することができる発
    現系を含んでなる宿主細胞を有効成分とすることを特徴
    とするマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞
    の除去阻害剤。
25. 【請求項２５】 請求項１６〜２４のいずれか記載のマ
    クロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去阻
    害剤を用いることを特徴とするマクロファージによる生
    体内のアポトーシス細胞の除去阻害方法。
26. 【請求項２６】 請求項１６〜２４のいずれか記載のマ
    クロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去阻
    害剤を含有することを特徴とするマクロファージによる
    生体内のアポトーシス細胞の除去阻害不全に起因する疾
    病の治療薬。
27. 【請求項２７】 請求項２６記載の治療薬を用いること
    を特徴とするマクロファージによる生体内のアポトーシ
    ス細胞の除去阻害不全に起因する疾病の治療方法。
28. 【請求項２８】 標識化された、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ若し
    くはマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の
    除去促進作用を有するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体、又はこ
    れらに対する抗体、あるいは、標識化された、マクロフ
    ァージによる生体内のアポトーシス細胞の除去阻害作用
    を有するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体を有効成分とすること
    を特徴とする生体内のアポトーシス細胞の検出剤。
29. 【請求項２９】 標識化された、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ若し
    くはマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の
    除去促進作用を有するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体、又はこ
    れらに対する抗体、あるいは、標識化された、マクロフ
    ァージによる生体内のアポトーシス細胞の除去阻害作用
    を有するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体を有効成分とする検出
    剤を用いることを特徴とする生体内のアポトーシス細胞
    の検出方法。
30. 【請求項３０】 ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ若しくはマクロファ
    ージによる生体内のアポトーシス細胞の除去促進作用を
    有するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体、又はこれらに対する抗
    体と、被検物質を接触させ、生体内におけるアポトーシ
    ス細胞の除去の程度を評価することを特徴とするマクロ
    ファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去促進誘
    導物質又は除去促進抑制物質のスクリーニング方法。
31. 【請求項３１】 マクロファージによる生体内のアポト
    ーシス細胞の除去阻害作用を有するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変
    異体と、被検物質を接触させ、生体内におけるアポトー
    シス細胞の除去阻害の程度を評価することを特徴とする
    マクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去
    阻害誘導物質又は除去阻害抑制物質のスクリーニング方
    法。