JP2003093072A

JP2003093072A - 新規プロテアーゼインヒビター様ポリぺプチドおよびそのｄｎａ

Info

Publication number: JP2003093072A
Application number: JP2001294913A
Authority: JP
Inventors: Osamu Obara; 収小原; Takahiro Nagase; 隆弘長瀬; Reiko Kikuno; 玲子菊野; Satoshi Oda; 聡織田; Takeshi Sakaguchi; 岳阪口; Atsuyuki Shimazaki; 淳行島崎
Original assignee: Kazusa DNA Research Institute Foundation; Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Kazusa DNA Research Institute Foundation; Shionogi and Co Ltd
Priority date: 2001-09-26
Filing date: 2001-09-26
Publication date: 2003-04-02

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】新規癌マーカーおよび神経疾患マーカーを提供
すること。【解決手段】神経細胞より分泌されるタンパク質の中に
ｐｓ２０様の、特定の配列を有する新規ポリペプチドを
見出した。該ポリペプチドは、癌マーカーおよび／また
は神経疾患マーカーとして有用である。本発明はまた、
そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにも関
する。このポリヌクレオチドもまた、癌マーカーおよび
／または神経疾患についての検出マーカーとして有用で
ある。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、プロテアーゼイン
ヒビター領域を有する分泌蛋白質に関連する新規ポリペ
プチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ド、該ポリヌクレオチドに対する相補的ポリヌクレオチ
ド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、該ベクターで
形質転換された形質転換体、該ポリペプチドを認識する
抗体、該ポリペプチドを利用した物質のスクリーニング
方法、ならびに本発明のポリペプチドおよび本発明のポ
リヌクレオチドの癌マーカー、および虚血性疾患のマー
カーとしての用途に関する。

【０００２】

【従来の技術】ｐｓ２０は、ＷＡＰ領域を有する分泌
蛋白質であり、細胞増殖阻害活性を有している［Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，４５７４（１９９
８）］。ＴＡＴＩはＰＳＴＩともよばれているＫａｚａ
ｌ型セリンプロテアーゼインヒビター領域を有して
いるトリプシンインヒビターであり、種々の癌細胞で発
現が増大していることが報告されている［Ｉｎｔ．Ｊ．
Ｃａｎｃｅｒ，８３，４８６（１９９９）］［Ａｎｔ
ｉｃａｎｃｅｒＲｅｓ．，１８，４６３５（１９９
８）］。また、Ｋａｚａｌ型セリンプロテアーゼイ
ンヒビター領域がその活性に関与している。ＴＦＰＩは
Ｋｕｎｉｔｚ型のセリンプロテアーゼインヒビター領域
を有しているプロテアーゼインヒビターであり、外因系
血液凝固の開始反応を阻害する機能を有する他、消化器
癌などで発現が増大していることが報告されている［Ｂ
ｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．，１０２，８８９（１９９
８）］。ＴＩＭＰはＮＴＲモジュール領域を有するメタ
ロプロテアーゼインヒビターであり、ＮＴＲモジュール
領域がその活性に関与していると考えれれている［Ｐｒ
ｏｔｅｉｎＳｃｉ．，８，１６３６］。メタロプロテ
アーゼは、癌細胞が転移する際、細胞外マトリックスを
破壊するのに働いており、ＴＩＭＰはプロテアーゼ活性
を阻害することにより癌転移を阻害する働きがある。Ｔ
ＩＭＰは、大腸癌において発現が増大しているという報
告がある［Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１４１，３８９
（１９９２）。ＷＦＩＫＫＮは、ＷＡＰ領域、Ｋａｚａ
ｌ型セリンプロテアーゼインヒビター領域、Ｋｕｎ
ｉｔｚ型のセリンプロテアーゼインヒビター領域および
ＮＴＲモジュール領域を有する蛋白質であるが、その機
能は不明である［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，９８，３７０５（２００１）］。また、Ａ
ＰＰはＫｕｎｉｔｚ型セリンプロテアーゼインヒビター
領域をもつ蛋白質であり、アルツハイマー病におけるア
ミロイド沈着斑の主要な構成成分であり、アルツハイマ
ー病の発症に関与している主要な蛋白質である［Ｃｌｉ
ｎ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．，１４，１４２（１９９
５）］。また、Ｋｕｎｉｔｚ型セリンプロテアーゼイン
ヒビター領域が病態と関連しているという報告がされて
いる。さらに、メタロプロテアーゼインヒビターである
ＴＩＭＰが脳虚血時に発現が増大し、その病態に関与し
ていることが報告されている［Ｓｔｒｏｋｅ，２９，５
１６（１９９８）］。

【０００３】このように、プロテアーゼインヒビター
は、癌細胞および神経細胞の機能に重要な働きをしてい
る。プロテアーゼインヒビターの癌病態への関与として
は、大きく二つの機能が示されている。１）癌細胞が浸
潤、転移する際に、プロテアーゼインヒビターが細胞外
マトリックスを破壊するプロテアーゼの活性を調節し
て、癌細胞の転移を制御する機能、２）増殖因子あるい
は増殖阻害因子としてプロテアーゼインヒビターが、癌
細胞の増殖を直接調節する機能の二である。また、アル
ツハイマー病または脳虚血時の神経疾患の病態への関与
としては、大きく三つの機能が示されている。１）アル
ツハイマー病の病態に関与しているβアミロイド斑形成
を制御する機能、２）神経細胞が変性する際働くプロテ
アーゼを阻害することによる、神経細胞の保護機能、
３）神経細胞に直接作用し、その増殖を調節する機能で
ある。しかしながら、発癌機構および神経変性の機構は
未だ完全に解明されておらず、未知の遺伝子の関与しう
る可能性が考えられている。この様な状況の下、癌およ
び神経疾患の発症に関わる新規遺伝子の同定および同遺
伝子を用いた診断方法が待望されていた。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、癌および神
経変性の診断に有用な新規ポリペプチドおよびポリヌク
レオチドの提供を課題とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、中枢組織
における神経細胞軸索の突起伸展および誘導、または末
梢組織における細胞の癌化に関与する新規遺伝子の単離
を目的として、鋭意研究を行なった結果、分泌型プロテ
アーゼインヒビター様新規ポリペプチドをコードする新
規遺伝子を見出した。さらに研究を進めた結果、本発明
の遺伝子の発現が胃癌、乳癌、および子宮癌組織中で増
加していることを見出し、本発明のポリペプチドおよび
ポリヌクレオチドが癌マーカーとして有用であることを
確認した。さらに、ラットの病態モデルを用いた、脳虚
血実験により、本発明の遺伝子が、脳虚血後により発現
が低下していることを見出し、神経疾患の診断マーカー
として有用であることを確認した。以上により、本発明
を完成させた。

【０００６】本発明は以下を提供する。

【０００７】（１）（ａ）配列番号３に記載の塩基配列
またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチ
ド；（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペ
プチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレ
オチド；（ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１も
しくは数個のアミノ酸が、置換、付加および欠失からな
る群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変
体ポリペプチドであって、生物学的活性を有する改変体
ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；（ｄ）配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡの対
立遺伝子変異体である、ポリヌクレオチド；（ｅ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペ
プチドの種相同体をコードする、ポリヌクレオチド；（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチ
ドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ
生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド；または（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチ
ドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０
％である塩基配列からなり、かつ生物学的活性を有する
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、を含む、
核酸分子。

【０００８】（２）（ａ）配列番号５に記載の塩基配列
またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチ
ド；（ｂ）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペ
プチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレ
オチド；（ｃ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において、１も
しくは数個のアミノ酸が、置換、付加および欠失からな
る群より選択される少なくとも１つの変異を有し、か
つ、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコード
する、ポリヌクレオチド；（ｄ）配列番号５に記載の塩基配列からなるＤＮＡの対
立遺伝子変異体である、ポリヌクレオチド；（ｅ）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペ
プチドの種相同体をコードする、ポリヌクレオチド；（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチ
ドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ
生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド；または（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチ
ドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０
％である塩基配列からなり、かつ生物学的活性を有する
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、を含む、
核酸分子。

【０００９】（３）（ａ）配列番号１に記載の塩基配列
のうち、１９４〜２７４、３１７〜４６６、５９３〜７
１８、８６３〜１０６０、１１７５〜１３２７、１３４
９〜１５０１および１５５６〜１８７９からなる群より
選択される少なくとも１つのドメインを含むポリヌクレ
オチド；（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、１〜２
７、４２〜９１、１３４〜１７５、２２４〜２８９、３
２８〜３７８、３８６〜４３６および４５５〜５６２か
らなる群より選択される少なくとも１つのドメインを含
むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、１〜２
７、４２〜９１、１３４〜１７５、２２４〜２８９、３
２８〜３７８、３８６〜４３６および４５５〜５６２か
らなる群より選択される少なくとも１つのドメインを含
むポリペプチドにおいて、１または数個のアミノ酸が置
換、付加および欠失からなる群より選択される少なくと
も１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有するポリ
ペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；（ｄ）（ａ）において、配列番号１の対立遺伝子変異体
に由来する配列を含む、ポリヌクレオチド；（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、１〜２
７、４２〜９１、１３４〜１７５、２２４〜２８９、３
２８〜３７８、３８６〜４３６および４５５〜５６２か
らなる群より選択される少なくとも１つのドメインを含
むポリペプチドにおいて、配列番号１の種相同体に由来
する配列を含む、ポリヌクレオチド；（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチ
ドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ
生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリ
ヌクレオチド；または（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチ
ドの相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である
塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペ
プチドをコードする、ポリヌクレオチド、を含む、核酸
分子。

【００１０】（４）単離された核酸分子であって、以
下：（ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、少なくとも
８個の連続したフラグメント配列を有するポリヌクレオ
チド；（ｂ）（ａ）に対する同一性が少なくとも７０％であ
る、ポリヌクレオチド；（ｃ）（ａ）または（ｂ）と相補的な塩基配列を有する
ポリヌクレオチド；および（ｄ）（ａ）または（ｂ）において誘導体ヌクレオチド
を含むポリヌクレオチド、からなる群より選択される、
ポリヌクレオチドを含む、核酸分子。

【００１１】（５）前記同一性が少なくとも８０％で
あり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコー
ドする、項目１〜３のいずれか１項に記載の核酸分子。

【００１２】（６）項目１〜５のいずれか１項に記載
の核酸分子がコードする、ポリペプチド。

【００１３】（７）（ａ）配列番号４に記載のアミノ酸
配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１ま
たは数個のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群
より選択される少なくとも１つの変異を有し、かつ、生
物学的活性を有する、ポリペプチド；（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列の対立遺伝子変異体
によってコードされる、ポリペプチド；（ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の種相同体であ
る、ポリペプチド；または（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに
対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を
有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、を
含む、ポリペプチド。

【００１４】（８）（ａ）配列番号６に記載のアミノ酸
配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；（ｂ）配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１ま
たは数個のアミノ酸配列が置換、付加および欠失からな
る群より選択される変異を有し、かつ、生物学的活性を
有する、ポリペプチド；（ｃ）配列番号５に記載の塩基配列の対立遺伝子変異体
によってコードされる、ポリペプチド；（ｄ）配列番号６に記載のアミノ酸配列の種相同体であ
る、ポリペプチド；または（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに
対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を
有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、を
含む、ポリペプチド。

【００１５】（９）（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸
配列のうち、１〜２７、４２〜９１、１３４〜１７５、
２２４〜２８９、３２８〜３７８、３８６〜４３６およ
び４５５〜５６２からなる群より選択される少なくとも
１つのドメイン配列を含む、ポリペプチド；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列ドメイン１〜２７、４
２〜９１、１３４〜１７５、２２４〜２８９、３２８〜
３７８、３８６〜４３６および４５５〜５６２からなる
群より選択される少なくとも１つのドメイン配列を含
み、１または数個のアミノ酸が置換、付加および欠失か
らなる群より選択される少なくとも１つの変異を有し、
かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；（ｃ）（ａ）において、配列番号１の対立遺伝子変異体
に由来する配列を含む、ポリペプチド；（ｅ）（ａ）において、配列番号１の種相同体に由来す
る配列を含む、ポリペプチド；または（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリペプチドに
対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を
有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、を
含む、ポリペプチド。

【００１６】（１０）項目７〜９のいずれか１項に記
載のポリペプチドであって、該ポリペプチドは、生物学
的活性を有し、該生物学的活性は、癌および神経疾患か
らなる群より選択される疾患の少なくとも１つの指標と
なる活性を含む、ポリペプチド。

【００１７】（１１）前記同一性が少なくとも８０％
であり、かつ、生物学的活性を有する、項目７〜９のい
ずれか１項に記載のポリペプチド。

【００１８】（１２）配列番号２に記載のアミノ酸配
列のうち、少なくとも５個の連続したアミノ酸配列を含
む、ポリペプチド。

【００１９】（１３）項目７〜１２のいずれか１項に
記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。

【００２０】（１４）項目１〜５および１３のいずれ
か１項に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベク
ター。

【００２１】（１５）項目１４に記載の組換えベクタ
ーで形質転換させた形質転換体。

【００２２】（１６）前記形質転換体が哺乳動物細胞
株または大腸菌株である、項目１５に記載の形質転換
体。

【００２３】（１７）項目１５または１６に記載の形
質転換体を培養する工程、および生産された組換えタン
パク質を培養培地から回収する工程を包含する、項目７
〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチドまたはその
塩の製造方法。

【００２４】（１８）項目７〜１２のいずれかに記載
のポリペプチドを特異的に認識する抗体。

【００２５】（１９）下記の工程：（ａ）ポリペプチ
ドと項目１８に記載の抗体とを接触させる工程、および
（ｂ）該ポリペプチドと該抗体との結合を検出する工
程、を包含する、項目７〜１２のいずれか１項に記載の
ポリペプチドの検出または定量方法。

【００２６】（２０）項目１９に記載の方法を用いる
ことを特徴とする、項目７〜１２のいずれか１項に記載
のポリペプチドが関連する疾患の検出方法。

【００２７】（２１）前記疾患が癌または癌転移であ
る、項目１９に記載の検出方法。

【００２８】（２２）前記疾患が神経病態である、項
目２１に記載の検出方法。

【００２９】（２３）項目１８に記載の抗体を含むこ
とを特徴とする、疾患検出用キット。

【００３０】（２４）前記疾患が癌または癌転移であ
る、項目２３に記載の疾患検出用キット。

【００３１】（２５）前記疾患が神経病態である、項
目２３に記載の疾患検出用キット。

【００３２】（２６）下記の工程：（ａ）項目６〜１
２のいずれか１項に記載のポリペプチドと被検物質とを
接触させる工程、および（ｂ）該ポリペプチドと被検物
質との結合を検出する工程、を包含する、項目６〜１２
のいずれか１項に記載のポリペプチドの結合物質のスク
リーニング方法。

【００３３】（２７）項目６〜１２のいずれか１項に
記載のポリペプチドを含む、項目６〜１２のいずれか１
項に記載のポリペプチドの結合物質のスクリーニング用
キット。

【００３４】（２８）項目２６に記載のスクリーニン
グ方法より得られる、項目６〜１２のいずれか１項に記
載のポリペプチドの、結合物質。

【００３５】（２９）下記の工程：（ａ）被検物質の
存在下または非存在下、項目６〜１２のいずれか１項に
記載のポリペプチドと項目２８に記載の結合物質を接触
させる工程、および（ｂ）該ポリペプチドと該結合物質
との結合活性を、該被検物質の存在下と非存在下で比較
する工程、を包含する、項目２８に記載の結合物質と項
目６〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチドとの結
合活性調節物質のスクリーニング方法。

【００３６】（３０）項目６〜１２のいずれか１項に
記載のポリペプチドおよび項目２８に記載の結合物質を
含む、項目６〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチ
ドの結合活性調節物質のスクリーニング用キット。

【００３７】（３１）項目２９に記載のスクリーニン
グ方法より得られる、項目６〜１２のいずれか１項に記
載のポリペプチドの、結合活性調節物質。

【００３８】（３２）下記の工程；（ａ）項目６〜１
２のいずれか１項に記載のポリペプチドを発現し得る細
胞と被検物質とを接触させる工程、および（ｂ）該ポリ
ペプチドの発現量または活性を検出する工程、を包含す
る、項目６〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチド
の発現調節物質のスクリーニング方法。

【００３９】（３３）項目１９に記載の方法を用いる
工程を包含する、項目３２に記載のスクリーニング方
法。

【００４０】（３４）項目６〜１２のいずれか１項に
記載のポリペプチドを発現し得る細胞を含む、項目６〜
１２のいずれか１項に記載のポリペプチドの発現調節物
質のスクリーニング用キット。

【００４１】（３５）項目３２または３３に記載のス
クリーニング方法より得られる、項目６〜１２のいずれ
か１項に記載のポリペプチドの発現調節物質。

【００４２】（３６）項目６〜１２のいずれか１項に
記載のポリペプチドをコードするＤＮＡを欠損または変
異させた非ヒトノックアウト動物。

【００４３】（３７）項目６〜１２のいずれか１項に
記載のポリペプチドをコードするＤＮＡを発現させた非
ヒトトランスジェニック動物。

【００４４】（３８）項目１〜５および１３に記載の
ポリヌクレオチド、項目６〜１２に記載のポリペプチ
ド、項目１８に記載の抗体、項目２８に記載の結合物
質、項目３１に記載の結合活性調節物質および項目３５
に記載の発現調節物質からなる群より選択される少なく
とも１つの物質を含む、医薬。

【００４５】（詳細な説明）本発明のポリペプチドは、
配列番号４で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプ
チドまたはその塩、および配列番号６で表されるアミノ
酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩を包含す
る。「塩」としては、酸または塩基との生理学的に許容
される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸
付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば無機酸
（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、
あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、
フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、
リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼ
ンスルホン酸）との塩などが用いられる。

【００４６】本発明のポリペプチドは、「配列番号２、
４および６に記載されるアミノ酸配列において、１また
は数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミ
ノ酸配列を含む、ポリペプチドまたはその塩を包含す
る。このポリペプチドは、ガンマーかであり得る。１も
しくは数個のアミノ酸とは、部位特異的変異誘発法等に
より欠失、置換もしくは付加することができる程度の数
のアミノ酸であり、５０個以下、好ましくは３０個以
下、より好ましくは２０個以下、さらに好ましくは１０
個以下のアミノ酸を意味している。さらに、本発明のポ
リペプチドは、欠失、置換もしくは付加によっても癌マ
ーカーおよび神経疾患マーカーとしての機能を有するポ
リペプチドであり得る。

【００４７】本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポ
リペプチドをコードするＤＮＡを包含する。本発明のポ
リヌクレオチドとしては、請求項１、３および５で表さ
れる塩基配列を含有するポリヌクレオチドが例示され
る。また、本発明のポリヌクレオチドには、本発明のポ
リヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズするポリヌクレオチドが含まれ得る。好ましく
は、このポリヌクレオチドは、癌マーカーであるポリペ
プチドをコードし得る。本発明のポリヌクレオチドは、
好ましくは配列番号３で表されるポリヌクレオチドであ
り、より好ましくは配列番号５で表されるポリヌクレオ
チドである。

【００４８】本発明の核酸分子は、本発明の特徴的ドメ
インのみを少なくとも１つ含むものを包含する。ここ
で、その特徴的なドメインには、配列番号１のヌクレオ
チド配列ドメイン１９４〜２７４、３１７〜４６６、５
９３〜７１８、８６３〜１０６０、１１７５〜１３２
７、１３４９〜１５０１および１５５６〜１８７９が包
含される。これらのドメインは、それぞれ、シグナルペ
プチド領域（１９４〜２７４）、ＷＡＰ領域（３１７〜
４６６）、Ｋａｚａｌ型セリンプロテアーゼインヒビタ
ー領域（５９３〜７１８）、細胞接着に関与することが
知られている免疫グロブリン領域（８６３〜１０６
０）、２つ連続でのＫｕｎｉｔｚ型セリンプロテアーゼ
インヒビター領域（１１７５〜１３２７および１３４９
〜１５０１）、およびＮＴＲ領域（１５５６〜１８７
９）であると予測される。好ましくは、本発明の核酸分
子は、上記ドメインを少なくとも２つ、３つ、４つ、５
つ、６つおよびすべてを含み得る。本明細書において、
このような特徴的ドメインのみを含むものを、ポリヌク
レオチドＡと呼ぶことがある。

【００４９】本発明のポリペプチドは、本発明の特徴的
ドメインのみを少なくとも１つ含むものを包含する。こ
こで、そのような特徴的ドメインとしては、配列番号２
のアミノ酸配列ドメイン１〜２７、４２〜９１、１３４
〜１７５、２２４〜２８９、３２８〜３７８、３８６〜
４３６および４５５〜５６２が挙げられる。これらのド
メインは、それぞれ、シグナルペプチド領域（１〜２
７）、ＷＡＰ領域（４２〜９１）、Ｋａｚａｌ型セリン
プロテアーゼインヒビター領域（１３４〜１７５）、細
胞接着に関与することが知られている免疫グロブリン領
域（２２４〜２８９）、２つ連続でのＫｕｎｉｔｚ型セ
リンプロテアーゼインヒビター領域（３２８〜３７８お
よび３８６〜４３６）、およびＮＴＲ領域（４５５〜５
６２）と予測される。好ましくは、本発明のポリペプチ
ドは、上記ドメインを少なくとも２つ、３つ、４つ、５
つ、６つおよびすべてを含み得る。本明細書において、
このような特徴的ドメインのみを含むものを、ポリペプ
チドＢと呼ぶことがある。

【００５０】本発明は、配列番号１のポリヌクレオチド
中の連続した少なくとも８個のヌクレオチド配列に対す
る同一性が少なくとも７０％である配列を有するオリゴ
ヌクレオチドＣ、およびそのようなオリゴヌクレオチド
Ｃを含む核酸分子にも関する。ここで、そのような核酸
分子は、比較的短い長さであり得、例えば、少なくとも
５個、８個、１０個、１２個、１５個、２０個、２５
個、３０個、４０個、５０個等であり得る。そのような
短い核酸分子は、例えば、遺伝子マーカーとして、ＰＣ
Ｒ用のプローブとして有用であり得る。好ましくは、そ
のような短い核酸分子の配列は、上記のドメイン以外に
由来する。

【００５１】（定義）本明細書において使用される用語
は、特に言及する場合を除いて、当該分野で通常用いら
れる意味で用いられるが、以下に本明細書において用い
られる用語を特に説明する。

【００５２】本明細書において「生物学的活性」とは、
あるポリペプチドまたはタンパク質が、生体内において
有し得る活性のことをいい、種々の機能を発揮する活性
が包含される。例えば、あるポリペプチドが酵素である
場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。
好ましくは、配列番号６に記載のアミノ酸配列が機能す
る活性および／または各ドメインに由来する活性を包含
する。そのような活性としては、プロテアーゼインヒビ
ター活性、細胞増殖阻害活性、血液凝固阻害活性、メタ
ロプロテアーゼインヒビター活性、抗癌活性、抗癌転移
活性などが例示される。

【００５３】「癌マーカー」とは、癌細胞または癌組織
を検出するのに使用されるマーカーである。あるｍＲＮ
Ａまたはタンパク質は、癌疾患においてそのｍＲＮＡま
たはタンパク質の発現が増加または減少する場合に、癌
マーカーとなり得る。「癌」としては、胃癌、乳癌、前
立腺癌、膀胱癌、卵巣癌、肺癌、大腸癌、肝癌が例示さ
れる。「マーカー」は癌を検出することができる物質で
あればよく、本発明のポリヌレクオチドおよびポリペプ
チドをマーカーとして使用することができる。

【００５４】「神経疾患マーカー」とは、神経疾患を検
出するのに使用されるマーカーである。あるｍＲＮＡま
たはタンパク質は、神経疾患においてそのｍＲＮＡまた
はタンパク質の発現が増加または減少する場合に、神経
疾患マーカーとなり得る。「神経疾患」としては、脳虚
血、老人性痴呆症型アルツハイマー病、ピック病、パー
キンソン病、症候性パーキンソニズム、進行性核上性麻
痺、ハンチントン舞踏病、、線条体黒質変性症、異染性
脳白質ジストロフィー、副腎脳白質ジストロフィー、Ｃ
ａｎａｖａｎ病、脊椎小脳変性症、Ｓｈｙ−Ｄｒａｇｅ
ｒ症候群、多系統変性症、遺伝性脊椎小脳変性疾患、歯
状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、筋萎縮性側索硬化症が例
示される。「マーカー」は、神経疾患を検出することが
できる物質であればよく、本発明のポリヌレクオチドま
たはポリペプチドをマーカーとして使用することができ
る。

【００５５】本発明は、炎症、糖尿病、肝炎の疾患マー
カーとして有用であり得る。胸腺、骨格筋、肝臓で発現
しているからである。

【００５６】本明細書において、「ストリンジェントな
条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当
該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌ
クレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプロー
ブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラ
ーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロッ
トハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そ
のようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的
には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化
したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ
存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、
０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕ
ｍｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組
成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン
酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルタ
ーを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを
意味する。ハイブリダイゼーションは、（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ２ｎｄｅｄ．；以下モレキュ
ラー・クローニング第２版ともいう），Ｃｕｒｒｅｎｔ
ＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢ
ｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）１〜３８（以
下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・
バイオロジーサプルメント１〜３８ともいう）、Ｄ
ＮＡＣｌｏｎｉｎｇ１：ＣｏｒｅＴｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，
ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に
記載されている方法に準じて行うことができる。ここ
で、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配
列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを
含む配列が除外される。

【００５７】「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチ
ド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレ
オチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオ
チドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドと
して具体的には、配列番号２，４または６で表されるア
ミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの
塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリ
ヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有する
ポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同
性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。但
し、好ましくは、配列番号１で表される塩基配列の１１
１３から１８０８番目の塩基配列で示されるポリヌクレ
オチドが除かれ得る。記載の相同性は、たとえばＡｌｔ
ｓｃｈｕｌら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３
−４１０（１９９０））が開発したアルゴリズムを使用
した検索プログラムＢＬＡＳＴを用いることにより、ｓ
ｃｏｒｅで類似度が示される。

【００５８】「誘導体オリゴヌクレオチド」とは、ヌク
レオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結
合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドをいう。そのよ
うなオリゴヌクレオチドとして具体的には、オリゴヌク
レオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエ
ート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリ
ゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ
５’ホスフォアミデート結合に変換された誘導体オリゴ
ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン
酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘
導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラ
シルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オ
リゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルが
Ｃ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌ
クレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５
プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオ
チド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジ
ン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆ
ｉｅｄｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴ
ヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピ
ルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよ
びオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエ
トキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチド
等が例示される。

【００５９】本明細書において、「アミノ酸」は、天然
のものでも非天然のものでもよい。「誘導体アミノ酸」
とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミ
ノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのような誘導
体アミノ酸は、当該分野において周知である。

【００６０】本明細書において「ヌクレオチド」は、天
然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体ヌクレオ
チド」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるが
もとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。
そのような誘導体ヌクレオチドは、当該分野において周
知である。

【００６１】本明細書において、「フラグメント」と
は、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さ
がｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポ
リペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメン
トの長さは、その目的に応じて、適宜変更することがで
き、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの
場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２
０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸
が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表さ
れる長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切
であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、
７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５
０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げ
られ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長
さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり
得る。

【００６２】本明細書において、「エピトープ」とは、
構造の明らかな抗原決定基をいう。エピトープを決定す
る方法は、当該分野において周知であり、そのようなエ
ピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供され
ると、当業者はそのような周知慣用技術を用いて決定す
ることができる。エピトープとして使用するためには、
少なくとも３アミノ酸の長さの配列が必要であり、好ま
しくは、この配列は、少なくとも４アミノ酸、５アミノ
酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ
酸、１０アミノ酸、１５アミノ酸、２０アミノ酸、２５
アミノ酸の長さの配列が必要であり得る。

【００６３】本明細書において、ポリペプチドまたはポ
リヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もと
のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それ
ぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチド
もしくはその代替物が、置き換わること、付け加わるこ
とまたは取り除かれることをいう。このような置換、付
加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、
そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術
などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上
であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、
付加または欠失を有する改変体において目的とする機能
（例えば、癌マーカー、神経疾患マーカーなど）が保持
される限り、多くすることができる。例えば、そのよう
な数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全
体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以
下、５０個以下、２５個以下などであり得る。

【００６４】本明細書において、「改変体」とは、もと
のポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対
して、一部が変更されているものをいう。そのような改
変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、
短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体
などが挙げられる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、
同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体の
ことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある
遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をい
う。「種相同体（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中
で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレ
ベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、よ
り好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、
９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような
種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らか
である。

【００６５】「組み換えベクター」とは、目的のポリヌ
クレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができ
るベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核
細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体
および植物個体等の宿主細胞において自立複製が可能、
または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌク
レオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有して
いるものが例示される。

【００６６】原核細胞に対する「組み換えベクター」と
しては、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２
（いずれもロシュ・バイオケミカルズ社（Ｒｏｃｈｅ
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）より
市販）、ｐＫＫ２３３−２（ファルマシア社（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ））、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、ｐＧＥＭＥＸ−１［プロ
メガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製］、ｐＱＥ−８（キアゲン
（ＱＩＡＧＥＮ）社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−
１１０６００）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳ
Ａ１［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７
７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８
５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋（ストラ
タジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）製）、ｐＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）（ストラタジーン社
製）、ｐＴｒｓ３０（ＦＥＲＭＢＰ−５４０７）、ｐＴ
ｒｓ３２（ＦＥＲＭＢＰ−５４０８）、ｐＧＨＡ２
（ＦＥＲＭＢＰ−４００）、ｐＧＫＡ２（ＦＥＲＭ
Ｂ−６７９８）、ｐＴｅｒｍ２（特開平３−２２９７
９、ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５
１６０７３５）、ｐＥＧ４００［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．，１７２，２３９２（１９９０）］、ｐＧＥＸ（フ
ァルマシア社製）、ｐＥＴシステム（ノバジェン社（Ｎ
ｏｖａｇｅｎ）製）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐ
ＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＴｒｘＦｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ社製）、ｐＭＡＬ−ｃ２（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，３
３，１０３（１９８５）］、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社
製）、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）、ｐＰＡ１（特開昭
６３−２３３７９８）等が例示される。

【００６７】酵母細胞に対する「組み換えベクター」と
しては、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２
４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７
４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等が例示される。

【００６８】動物細胞に対する「組み換えベクター」と
しては、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤ
Ｍ８（いずれもフナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７
［特開平３−２２９７９、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ，３，１３３（１９９０）］、ｐＲＥＰ４（インビト
ロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＭｏ、ｐ
ＡＭｏＡ［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７
８２−２２７８７（１９９３）］等が例示される。

【００６９】植物細胞に対する「組み換えベクター」と
しては、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベク
ター等が例示される。

【００７０】昆虫細胞に対する「組み換えベクター」と
しては、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅ
ＢａｃＩＩＩ（すべてインビトロジェン社製）等が例示
される。

【００７１】「形質転換体」とは、形質転換によって作
製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形
質転換体としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細
胞、昆虫細胞等が例示される。形質転換体は、その対象
に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿
主などともいわれる。

【００７２】原核細胞としては、エシェリヒア属、セラ
チア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバ
クテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス
属等に属する原核細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａｃｏｌｉＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａｃｏｌｉＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａｃｏｌｉＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃ
ｏｌｉＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏ
ｌｉＷ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ
ＪＭ１０９、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＨ
Ｂ１０１、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＮｏ．
４９、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＷ３１１
０、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＮＹ４９、Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）、
ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ
３）ｐＬｙｓＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ
ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃ
ｏｌｉＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｓｅｒｒ
ａｔｉａｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａｆｏｎ
ｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａｌｉｑｕｅｆａｃｉ
ｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒ
ｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕ
ｍＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍＡＴＣＣ１４０６
６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉ
ｃｕｍＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１４０６
７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉ
ｃｕｍＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍＡＴＣ
Ｃ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏ
ｎｉａｐｈｉｌｕｍＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓｓｐ．Ｄ−０１１０等が例示される。

【００７３】酵母細胞としては、サッカロマイセス属、
シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコ
スポロン属、シワニオミセス属、ピチア属等に属する酵
母菌株を挙げることができ、具体的には、Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏ
ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖ
ｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏ
ｒｏｎｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙ
ｃｅｓａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏ
ｒｉｓ等を挙げることができる。組換えベクターの導入
方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればい
ずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーシ
ョン法［Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，
１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９
２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９
２９（１９７８）記載の方法等が例示される。

【００７４】動物細胞としては、マウス・ミエローマ細
胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ
細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細
胞、ＢＨＫ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒト白
血病細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ヒ
ト大腸癌細胞株等を挙げることができる。マウス・ミエ
ローマ細胞としては、ｐｓ２０、ＮＳＯ等、ラット・ミ
エローマ細胞としてはＹＢ２／０等、ヒト胎児腎臓細胞
としてはＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）
等、ヒト白血病細胞としてはＢＡＬＬ−１等、アフリカ
ミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、
ヒト大腸癌細胞株としてはＨＣＴ−１５等が例示され
る。

【００７５】植物細胞としては、ポテト、タバコ、トウ
モロコシ、イネ、アブラナ、大豆、トマト、ニンジン、
小麦、大麦、ライ麦、アルファルファ、亜麻等の植物細
胞等を挙げることができる。組換えベクターの導入方法
としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればい
ずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム
（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（特開昭５９−１４０
８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７
７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１
８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法
（特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３）等が
例示される。

【００７６】昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ
ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌ
ｕｓｉａｎｉの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞
等を用いることができる。Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒ
ｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞としてはＳｆ９、Ｓｆ２１
（バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ
ア・ラボラトリー・マニュアル）等、Ｔｒｉｃｈｏｐ
ｌｕｓｉａｎｉの卵巣細胞としてはＨｉｇｈ５、Ｂ
ＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（インビトロジェン社製）等、
カイコ卵巣由来の培養細胞としてはＢｏｍｂｙｘｍｏ
ｒｉＮ４等が例示される。

【００７７】「ポリペプチドまたはその塩の製造法」と
は、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込
んだ組換え体ベクターを保有する原核細胞、酵母、動物
細胞、植物細胞、昆虫細胞の形質転換体を、通常の培養
方法に従って培養し、本発明のポリペプチドを生成蓄積
させ、その培養物より本発明のポリペプチドを採取する
ことにより、本発明のポリペプチドを製造させる方法を
いう。

【００７８】「抗体」とは、当該分野で通常使用される
意味で用いられ、本明細書においては、抗体の全部およ
びそのフラグメント、誘導体、結合体なども包含する。
好ましくは、本発明のポリペプチドを認識する抗体であ
り、より好ましくは、本発明のポリペプチドを特異的に
認識する抗体である。そのような抗体は、ポリクローナ
ル抗体またはモノクローナル抗体のいずれでもよい。

【００７９】本発明のポリペプチドの「検出または定
量」は、免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達
成され得る。例えば、方法としては、マイクロタイター
プレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体
法、ウェスタンプロット法、免疫組織染色法等が例示さ
れる。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲ
ＩＡ法等が例示される。

【００８０】本発明の抗体を用いて、癌または癌転移を
検出することができる。本発明のポリペプチドは癌マー
カーとなり得ることから、前述のポリペプチドの検出方
法と同様に、免疫学的測定方法を含む適切な方法を用い
ることができる。例えば、検出方法としては、マイクロ
タイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍
光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法等が
例示される。

【００８１】本発明の抗体を用いて、神経病態を検出す
ることができる。本発明のポリペプチドは神経疾患マー
カーとなり得ることから、前述のポリペプチドの検出方
法と同様に、免疫学的測定方法を含む適切な方法を用い
ることができる。例えば、検出方法としては、マイクロ
タイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍
光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法等が
例示される。

【００８２】本発明はまた、本発明の抗体を含むことを
特徴とする癌または癌転移の診断用キットに関する。こ
のキットは、少なくとも本発明の抗体および標準試薬と
して本発明のポリペプチドを含む。本発明のポリペプチ
ドは癌マーカーとなり得ることから、前述の癌または癌
転移の検出方法に基づき、本発明のポリペプチドを免疫
学的に測定することができる。

【００８３】本発明はまた、本発明の抗体を含むことを
特徴とする神経病態の診断用キットに関する。このキッ
トは、少なくとも本発明の抗体および標準試薬として本
発明のポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドは神
経疾患マーカーとなり得ることから、前述の神経病態の
検出方法に基づき、本発明のポリペプチドを免疫学的に
測定することができる。

【００８４】本発明のポリペプチドのｍＲＮＡの「検出
または定量」は、ｍＲＮＡの測定を行う分子生物学的測
定方法を含む任意の適切な方法を用いて行うことができ
る。そのような方法としては、例えば、ノーザンブロッ
ト法、ドットブロット法またはＰＣＲ法等が例示され
る。

【００８５】本発明のｍＲＮＡを測定することによっ
て、癌または癌転移および／あるいは神経病態を検出す
ることができる。本発明のポリヌクレオチドは、癌マー
カーおよび神経疾患マーカーとなり得ることから、前述
のポリペプチドのｍＲＮＡの検出方法と同様に、分子生
物学的測定方法を含む任意の適切な方法を用いて検出す
ることができる。例えば、ノーザンブロット法、ドット
ブロット法またはＰＣＲ法等が例示される。

【００８６】本発明はまた、本発明のポリペプチドのｍ
ＲＮＡまたはその一部および標準試薬としてそのポリヌ
クレオチドまたはその一部を含む、癌または癌転移の診
断用キットおよび神経病態の診断用キットに関する。本
発明のポリヌクレオチドは、癌マーカーおよび神経疾患
マーカーとなり得ることから、前述の癌または癌転移の
検出方法あるいは神経病態検出方法に基づき、ポリヌク
レオチドを分子生物学的に測定することができる。

【００８７】本発明のポリヌクレオチドを用いて、ＤＮ
Ａの転写またはｍＲＮＡの翻訳を抑制することができ
る。本発明のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列を有
するポリヌクレオチド、本発明のポリヌクレオチドとハ
イブリダイズするポリヌクレオチド、本発明のポリヌク
レオチドの塩基配列中の連続した５〜６０塩基と同じ配
列を有するオリゴヌクレオチドと相補的な配列を有する
オリゴヌクレオチド、およびこれらオリゴヌクレオチド
の誘導体オリゴヌクレオチド等を適宜調製し、当該分野
で周知のアンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ技術を用いて、こ
のポリペプチドのＤＮＡの転写またはｍＲＮＡの翻訳を
抑制する方法を実施することができる。

【００８８】「結合物質」とは、本発明のポリペプチド
に結合する任意の物質をいう。この結合物質としては、
例えば、低分子物質、ポリヌクレオチド、ポリペプチド
等が例示される。本発明の「結合物質のスクリーニング
方法」は、当該分野で公知となっている技術を適宜適応
することにより行うことができ、バイオアッセイおよび
結合アッセイ等が例示される。本発明の「結合物質のス
クリーニング用キット」には、少なくとも本発明のポリ
ペプチドまたはその一部が含まれる。このキットを用い
て、前述の本発明の結合物質のスクリーニング方法に基
づき、結合物質を生化学的手法によりスクリーニングす
ることができる。

【００８９】「結合活性」とは、本発明のポリペプチド
またはポリヌクレオチドと上記結合物質との結合に関す
る活性をいう。

【００９０】「結合活性の変化」とは、本発明のポリペ
プチドと本発明の結合物質との結合活性の増強あるいは
減少を意味する。「結合活性調節物質」とは、本発明の
ポリペプチドと本発明の結合物質との結合活性の増強あ
るいは減少を引き起こす物質であり、例えば、低分子物
質、ポリヌクレオチド、ポリペプチド等が例示される。
本発明の結合活性調節物質は、当該分野で公知となって
いる技術を適宜適応することによりスクリーニングする
ことができる。そのような技術としては、バイオアッセ
イおよび結合アッセイ等が例示される。本発明はまた、
「結合活性調節物質のスクリーニング用キット」を提供
する。このキットには、少なくとも本発明のポリペプチ
ドまたはその一部が含まれており、このキットを用い
て、前述の結合活性調節物質のスクリーニング方法に基
づき、結合物質を生化学的手法によりスクリーニングす
ることができる。

【００９１】「発現量」とは、目的の細胞などにおい
て、本発明のタンパク質またはｍＲＮＡが発現される量
をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用
いてＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタン
プロット法、免疫組織染色法等の免疫学的測定方法を含
む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチ
ドのタンパク質レベルでの発現量、またはノーザンプロ
ット法、ドットプロット法、ＰＣＲ法等の分子生物学的
測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発
明のポリペプチドのｍＲＮＡレベルでの発現量が挙げら
れる。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法ま
たは分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法によ
り評価される本発明のポリペプチドのタンパク質レベル
またはｍＲＮＡレベルでの発現量が増加あるいは減少す
ることを意味する。「発現調節物質」とは、上記の免疫
学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の
適切な方法により評価される、本発明のポリペプチドの
タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルでの発現量を増
加あるいは減少させる物質であり、このような物質とし
ては、例えば、低分子物質、ポリヌクレオチド、ポリペ
プチド等が例示される。本発明の「発現調節物質」は、
本発明のポリペプチドの発現量は、指標に当該分野で公
知となっている技術を適宜適応することによりスクリー
ニングすることができる。そのような技術としては、例
えば前記抗体を用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗
体法、ウェスタンプロット法、免疫組織染色法等の免疫
学的測定方法、またはノーザンプロット法、ドットプロ
ット法、ＰＣＲ法等の分子生物学的測定方法等が例示さ
れる。本発明はまた、本発明の発現調節物質についての
スクリーニング用キットを提供する。このキットには、
本発明のポリペプチドまたはその一部が含まれている。
本発明のキットとしては、前述の発現調節物質のスクリ
ーニング方法に基づき発現調節物質を免疫学的手法によ
りスクリーニングするためのキット、または本発明のポ
リヌクレオチドまたはその一部が含まれており、前述の
発現調節物質のスクリーニング方法に基づき発現調節物
質を分子生物学的にスクリーニングするためのキットが
挙げられる。

【００９２】「非ヒトノックアウト動物」とは、本発明
のポリヌクレオチドを含むベクターを用い、目的とする
非ヒト動物、例えばサル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、
ウマ、ニワトリ、マウス、ラット、ハムスター、モルモ
ット等の胚性幹細胞において染色体上の本発明のポリペ
プチドをコードするＤＮＡを公知の相同組換えの手法
［例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３２６，６１１０，２９５
（１９８７）、Ｃｅｌｌ，５１，３，５０３（１９８
７）等］により不活化した非ヒト動物を意味する。「非
ヒトランスジェニック動物」とは、本発明のポリヌクレ
オチドを含むベクターを用い、目的とする非ヒト動物、
例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ニワトリ、マ
ウス、ラット、ハムスター、モルモット等の胚性幹細胞
において染色体上の本発明のポリペプチドをコードする
ＤＮＡを公知の相同組換えの手法［例えば、Ｎａｔｕｒ
ｅ，３２６，６１１０，２９５（１９８７）、Ｃｅｌ
ｌ，５１，３，５０３（１９８７）等］により任意の配
列と置換した非ヒト動物を意味する。具体的には、本発
明のポリペプチドの発現時期、発現部位または発現量等
が調節された非ヒト動物、より具体的には本発明のポリ
ペプチドが過剰に発現された非ヒト動物を意味する。本
発明の「医薬」とは、少なくとも、本発明の抗体、結合
物質、結合活性調節物質、または発現調節物質を含有す
ればよく、特定の疾患、例えば癌あるいは神経疾患等の
予防または治療に用いうる。

【００９３】

【発明の実施の形態】以下に本発明ポリヌクレオチドの
調製、本発明ポリペプチドの調製、組換えベクター、形
質転換体、製造方法、抗体、本発明ポリペプチドの検出
方法、ｍＲＮＡの検出方法、ＤＮＡの転写およびｍＲＮ
Ａの翻訳抑制方法、結合物質のスクリーニング方法、結
合物質のスクリーニング用キット、結合物質、結合活性
調節物質のスクリーニング方法、結合活性調節物質のス
クリーニング用キット、結合活性調節物質、発現調節物
質のスクリーニング方法、発現調節物質のスクリーニン
グ用キット、発現調節物質、ノックアウト動物、トラン
スジェニック動物、癌または癌転移の検出方法、神経病
態の検出方法、癌または癌転移の断用キット、神経病態
診断用キット、医薬、について説明する。

【００９４】本明細書において、特に指示のない限り、
当該分野で公知である遺伝子組換え技術、動物細胞、昆
虫細胞、酵母および大腸菌での組換えタンパク質の生産
技術、分子生物学的手法、発現したタンパク質の分離精
製法、分析法および免疫学的手法が採用される。

【００９５】（１）本発明のポリヌクレオチドの取得ラットの脳、骨格筋もしくは精巣、またはヒトの脳、
胃、骨格筋、卵巣もしくは胃癌組織より、当該分野にお
いて周知慣用である常法によりｃＤＮＡライブラリーを
作製する。

【００９６】ｃＤＮＡライブラリー作製法としては、モ
レキュラー・クローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ２ｎｄｅｄ．）またはカレント・
プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー
サプルメント（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｔｏｖｏｌ
ｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＳｕ
ｐｐｌｅｍｅｎｔ）１〜３８、ＡＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｙＭａｎｕａｌ，２ｎｄＥｄ．（１９８９）、ＤＮ
ＡＣｌｏｎｉｎｇ１：ＣｏｒｅＴｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，Ｓ
ｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ（１９９５）等に記載された
方法、あるいは市販のキット、例えばスーパースクリプ
ト・プラスミド・システム・フォー・ｃＤＮＡ・シンセ
シス・アンド・プラスミド・クローニング［Ｓｕｐｅｒ
ＳｃｒｉｐｔＰｌａｓｍｉｄＳｙｓｔｅｍｆｏｒ
ｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄＰｌａｓｍｉ
ｄＣｌｏｎｉｎｇ；インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ）社製］またはザップ−ｃＤＮＡ・シンセシ
ス・キット［ＺＡＰ−ｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓ
Ｋｉｔ、ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）
製］を用いる方法等があげられる。

【００９７】本発明のＤＮＡの両末端にＮｏｔＩ―Ｓａ
ｌＩリンカーを付与した後、グベクターに挿入する。
ベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳ
Ｋ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）（いず
れもＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＤＩＲＥＣＴ［Ｎ
ｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１８，
６０６９（１９９０）］、ｐＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＡｍ
ｐＳＫ（＋）［Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、Ｓｔｒａ
ｔｅｇｉｅｓ，５，６２６４（１９９２）］、ｐＴ７Ｂ
ｌｕｅ［Ｎｏｖａｇｅｎ社製］、ｐＣＲＩＩ［インビ
トロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）製、Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，６５７（１９９１）］、ｐＣＲ
−ＴＲＡＰ［Ｇｅｎｅｈｕｎｔｅｒ社製］、ｐＮｏＴＡ
Ｔ７（５’→３’社製）等を挙げることができる。本発
明のプラスミドを用い、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５ａを形質
転換してｃＤＮＡライブラリーを作製する。作製したｃ
ＤＮＡライブラリーより目的とするＤＮＡを含むクロー
ンを以下の方法で選択する。

【００９８】上記で作製したｃＤＮＡライブラリーよ
り、個々のｃＤＮＡが挿入されたプラスミドを精製し、
塩基配列を解析することにより、ｐｓ２０のアミノ酸配
列とホモロジーを有するが完全には一致しないアミノ酸
配列をコードするＤＮＡ断片を選択する。塩基配列は、
通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓ
ａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７
７）］あるいは３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー［アプ
ライドバイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ）社製］等の塩基配列分析装置を用いてスク
リーニングすることができる。

【００９９】上記で作製したｃＤＮＡライブラリーに対
して、本発明のＤＮＡ断片をプローブとしてコロニーハ
イブリダイゼーション（モレキュラー・クローニング第
２版）を行うことにより、既知のｐｓ２０とホモロジー
を有するポリペプチドをコードするｃＤＮＡを取得する
ことができる。プローブとしては、本発明のＤＮＡ断片
をアイソトープあるいはジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｉ
ｇｅｎｉｎ）標識したものを使用することができる。

【０１００】上記の方法により取得されたＤＮＡの塩基
配列は、本発明のＤＮＡ断片をそのままあるいは適当な
制限酵素等で切断後、モレキュラー・クローニング第２
版等に記載の常法によりベクターに組み込み、通常用い
られる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅ
ｒ）らのジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）］あ
るいは３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー［アプライドバ
イオシステムズ社製］等の塩基配列分析装置を用いて分
析することによりスクリーニングすることができる。

【０１０１】本発明の方法により取得されるＤＮＡとし
て、例えば、配列番号２で表されるポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ等を挙げることができ、具体的には、配列
番号１、３および５で表される塩基配列を有するＤＮＡ
等を挙げることができる。配列番号１、３および５のＤ
ＮＡを含むプラスミドとしては、例えば、後述の実施例
に記載したプラスミドを挙げることができる。

【０１０２】上記のようにして取得したＤＮＡを発現ベ
クターに組み込み発現プラスミドを構築する。得られた
発現プラスミドを適当な動物細胞に導入後、神経細胞軸
索の突起伸展活性あるいは誘導活性、または血管新生活
性を指標に、本発明のＤＮＡが中枢組織における神経回
路の形成または末梢組織における、癌細胞増殖あるいは
癌転移に関与する生理活性を有するかどうかを調べるこ
とができる。

【０１０３】本発明の発現ベクターとしては、本発明の
ｃＤＮＡを組み込んで動物細胞で発現できるベクターで
あればいかなるものでも用いることができ、例えば、ｐ
ｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８（いず
れもフナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７［特開平３
−２２９７９、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１
３３（１９９０）］、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社
製）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０
１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ
［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２−２
２７８７（１９９３）］、ｐＡＳ３−３（特開平２−２
２７０７５）等を用いることができる。

【０１０４】ｃＤＮＡを組み込んだ発現ベクターは、目
的とするｃＤＮＡを選択可能な動物細胞に導入し、形質
転換細胞を取得する。本発明の発現ベクターの導入方法
としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればい
ずれの方法も用いることができ、例えば、エレクトロポ
レーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１
３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法（特開平２−
２２７０７５）、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１
９８７）］、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７
３）に記載の方法等の方法を挙げることができる。

【０１０５】動物細胞としては、ヒトの細胞である２９
３細胞、ＨｅＬａ細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、
チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ラ
ットの細胞であるＰＣ１２細胞を挙げることができ、好
ましくは、２９３細胞あるいはＨｅＬａ細胞を用い得
る。

【０１０６】得られた形質転換細胞を当該分野において
周知慣用の常法により培養する。具体的には、以下の形
質転換体の培養方法により培養することができる。形質
転換体が動物細胞である場合、本発明の細胞を培養する
培地は、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地
［ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉ
ｃａｎＭｅｄｉｃａｌＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１
９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地
［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）］、Ｄ
ＭＥＭ培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５
９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｏｆｔ
ｈｅＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒｔｈｅＢｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）］
またはこれら培地にウシ胎児血清等を添加した培地等が
用いられる。

【０１０７】培養は、通常ｐＨ６〜８、２５〜４０℃、
５％ＣＯ₂存在下等の条件下で１〜７日間行う。また培
養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレ
プトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。

【０１０８】上記培養により得られた細胞を、神経細胞
軸索の突起伸展活性あるいは誘導活性、または血管新生
活性を指標に、本発明のＤＮＡが中枢組織における神経
回路の形成または末梢組織における血管新生、癌細胞増
殖あるいは癌転移に関与する生理活性を有するかどうか
を調べることができる。本発明の発現プラスミドを導入
した細胞において、神経細胞軸索の突起伸展活性あるい
は誘導活性、または癌細胞の増殖および運動能を指標
に、本発明のＤＮＡが中枢組織における神経回路の形
成、または末梢組織における癌細胞増殖あるいは癌転移
に関与する生理活性を有するかどうか検討する。上記生
理活性が検出されれば、本発明のＤＮＡは中枢組織にお
ける神経回路の形成または末梢組織における、癌細胞増
殖あるいは癌転移に関与する新規ｐｓ２０様ポリペプチ
ドをコードしていると考えることができる。

【０１０９】以上のようにして、ラットの脳、骨格筋も
しくは精巣、またはヒトの脳、胃、骨格筋、卵巣もしく
は胃の癌組織において、中枢組織における神経回路の形
成、または末梢組織における癌細胞増殖あるいは癌転移
に関与する生理活性を有する新規ｐｓ２０様ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡを取得することができる。

【０１１０】また、上記方法で取得したＤＮＡとストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを選択
することにより、配列番号２、４または６に記載のアミ
ノ酸配列と比較して、１もしくは数個のアミノ酸が欠
失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリ
ペプチドをコードする目的のＤＮＡを取得することがで
きる。即ち、非ヒト動物、例えば、サル、ウシ、ヒツ
ジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ニワトリ、マウス、ハムスタ
ー、モルモット等由来のｃＤＮＡライブラリーに対して
スクリーニングを行うことにより、目的のＤＮＡを取得
することができる。スクリーニングされたｐｓ２０様活
性を有する新規ポリペプチドのアミノ酸配列に基づい
て、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを化学合
成することによっても目的のＤＮＡを調製することがで
きる。ＤＮＡの化学合成は、チオホスファイト法を利用
した島津製作所社製のＤＮＡ合成機、ホスホロアミダイ
ト法を利用したアプライドバイオシステムズ社製のＤＮ
Ａ合成機ｍｏｄｅｌ３９２等を用いて行うことができ
る。

【０１１１】また、後述のオリゴヌクレオチドをセンス
プライマーおよびアンチセンスプライマーとして用い、
これらＤＮＡに相補的なｍＲＮＡを発現している細胞の
ｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを
行うことによっても、目的とするＤＮＡを調製すること
ができる。（２）本発明のポリペプチドの製造本発明のポリペプチドは、モレキュラー・クローニング
第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラ
ー・バイオロジーサプルメント１〜３８等に記載され
た方法等を用い、例えば以下の方法により、本発明のポ
リヌクレオチドを宿主細胞中で発現させ、製造すること
ができる。

【０１１２】本発明のポリペプチドをコードする全長Ｄ
ＮＡを基にして、必要に応じて、本発明のポリペプチド
をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製
する。また、本発明のポリペプチドをコードする部分の
塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、
塩基を置換したＤＮＡを調製する。このＤＮＡは本発明
のポリペプチドの生産率を向上させるうえで有用であ
る。このＤＮＡ断片、または全長ＤＮＡを適当な発現ベ
クターのプロモーターの下流に挿入することにより、組
換え体ＤＮＡ（組換えベクター）を作製する。この組換
えベクターを、その発現ベクターに適合した宿主細胞に
導入することにより、本発明のポリペプチドを生産する
形質転換体を得ることができる。

【０１１３】宿主細胞としては、原核細胞、酵母、動物
細胞、植物細胞、昆虫細胞等、目的とする遺伝子を発現
できるものであればいずれも用いることができる。発現
ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製が可
能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリ
ペプチド遺伝子の転写に適した位置にプロモーターを含
有しているものが用いられる。

【０１１４】（ｉ）細菌等の原核生物を宿主細胞として
用いる場合新規ｐｓ２０様ポリペプチドのＤＮＡの発現ベクター
は、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモ
ーター、リボソーム結合配列、新規ｐｓ２０様ポリペプ
チドのＤＮＡ、転写終結配列、より構成されていること
が好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれて
いてもよい。

【０１１５】発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒ
ｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもロシュ・
バイオケミカルズ社より市販）、ｐＫＫ２３３−２（フ
ァルマシア社）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン
社）、ｐＧＥＭＥＸ−１［プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）
社製］、ｐＱＥ−８（キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）社
製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐ
ＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４
８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、
ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋（ストラタジーン社製）、ｐ
ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）（ストラタジ
ーン社製）、ｐＴｒｓ３０（ＦＥＲＭＢＰ−５４０
７）、ｐＴｒｓ３２（ＦＥＲＭＢＰ−５４０８）、ｐ
ＧＨＡ２（ＦＥＲＭＢＰ−４００）、ｐＧＫＡ２（Ｆ
ＥＲＭＢ−６７９８）、ｐＴｅｒｍ２（特開平３−２
２９７９、ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、
ＵＳ５１６０７３５）、ｐＥＧ４００［Ｊ．Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）］、ｐＧＥ
Ｘ（ファルマシア社製）、ｐＥＴシステム（ノバジェン
社製）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ
１９４、ｐＴｒｘＦｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社
製）、ｐＭＡＬ−ｃ２（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉ
ｏｌａｂｓ社製）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，３３，１０
３（１９８５）］、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）、ｐＵ
Ｃ１１８（宝酒造社製）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３
３７９８）等を例示することができる。

【０１１６】プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細
胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。
例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロ
モーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモ
ーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌およびファー
ジ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、
ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等を挙げ
ることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモ
ーター（Ｐｔｒｐｘ２）、ｔａｃプロモーター、ｌａ
ｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように
人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることが
できる。

【０１１７】リボソーム結合配列であるシャイン−ダル
ガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コド
ンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節し
たプラスミドを用いることが好ましい。本発明のポリヌ
クレオチドの発現には転写終結配列は必ずしも必要では
ないが、構造遺伝子直下に転写終結配列を配置すること
が好ましい。

【０１１８】宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラ
チア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバ
クテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス
属等に属する微生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａｃｏｌｉＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａｃｏｌｉＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃ
ｏｌｉＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏ
ｌｉＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ
Ｗ１４８５、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＪ
Ｍ１０９、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＨＢ１
０１、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＮｏ．４
９、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＷ３１１０、
ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＮＹ４９、Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）
ｐＬｙｓＳ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＨＭ
Ｓ１７４（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌ
ｉＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｓｅｒｒａｔ
ｉａｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａｆｏｎｔｉ
ｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ
ｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓａ
ｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍａｍｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖ
ｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ
ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍＡＴＣＣ１４０６６、
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕ
ｍＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１４０６７、Ｃ
ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ
ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍＡＴＣＣ１３
８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａ
ｐｈｉｌｕｍＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓｓｐ．Ｄ−０１１０等を挙げることができる。

【０１１９】組換えベクターの導入方法としては、上記
宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用い
ることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｎ
ｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１６，６１２７
（１９８８）］、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２
１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３
−２４８３９４２）、Ｇｅｎｅ，１７，１０７（１９８
２）およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ＆Ｇｅｎｅｒａｌ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）に記載
の方法等を挙げることができる。

【０１２０】（ｉｉ）酵母を宿主細胞として用いる場合酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクタ
ーとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１
５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０
（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を
例示することができる。プロモーターとしては、酵母菌
株中で発現できるものであればいかなるものでもよく、
例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、
ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１
プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショ
ック蛋白質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵ
Ｐ１プロモーター等を挙げることができる。

【０１２１】宿主細胞としては、サッカロマイセス属、
シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコ
スポロン属、シワニオミセス属、ピチア属等に属する酵
母菌株を挙げることができ、具体的には、Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏ
ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖ
ｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏ
ｒｏｎｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙ
ｃｅｓａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏ
ｒｉｓ等を挙げることができる。組換えベクターの導入
方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればい
ずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーシ
ョン法［Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，
１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９
２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９
２９（１９７８）記載の方法等を挙げることができる。

【０１２２】（ｉｉｉ）動物細胞を宿主細胞として用い
る場合動物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクタ
ーとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ
Ｉ、ｐＣＤＭ８（いずれもフナコシ社より市販）、ｐＡ
ＧＥ１０７［特開平３−２２９７９、Ｃｙｔｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、ｐＲＥＰ４
（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡ
Ｍｏ、ｐＡＭｏＡ［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６
８，２２７８２−２２７８７（１９９３）、別名ｐＡＭ
ｏＰＲＳＡ（特開平０５−３３６９６３）］、ｐＡＳ３
−３（特開平２−２２７０７５）等を例示することがで
きる。

【０１２３】プロモーターとしては、動物細胞中で発現
できるものであればいずれも用いることができ、例え
ば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍ
ｍｅｄｉａｔｅｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、Ｓ
Ｖ４０の初期プロモーター、モロニー・ミュリン・ロイ
ケミア・ウイルス（ＭｏｌｏｎｅｙＭｕｒｉｎｅＬ
ｅｕｋｅｍｉａＶｉｒｕｓ）のロング・ターミナル・
リピート・プロモーター（ＬｏｎｇＴｅｒｍｉｎａｌ
ＲｅｐｅａｔＰｒｏｍｏｔｅｒ）、レトロウイルス
のプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲα
プロモーター、あるいはメタロチオネインのプロモータ
ー等を挙げることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺
伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよ
い。

【０１２４】宿主細胞としては、マウス・ミエローマ細
胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ
細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細
胞、ＢＨＫ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒトの
細胞であるＮａｍａｌｗａ細胞またはＮａｍａｌｗａ
ＫＪＭ−１細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、
ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ヒト大腸癌細
胞株等を挙げることができる。マウス・ミエローマ細胞
としては、ｐｓ２０、ＮＳＯ等、ラット・ミエローマ細
胞としてはＹＢ２／０等、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨ
ＥＫ２９３（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）等、ヒト白
血病細胞としてはＢＡＬＬ−１等、アフリカミドリザル
腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ヒト大腸癌
細胞株としてはＨＣＴ−１５等を挙げることができる。

【０１２５】組換えベクターの導入方法としては、動物
細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いるこ
とができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、
リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポ
フェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］、Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）に記載の方法等を
挙げることができる。

【０１２６】（ｉｖ）植物細胞を宿主細胞として用いる
場合植物細胞または植物個体を宿主として用いる場合には、
公知の方法［組織培養，２０（１９９４）、組織培養，
２１（１９９５）、ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ，１５，４５（１９９７）］に準じてポ
リペプチドを生産することができる。発現ベクターとし
て、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルス
ベクター等を挙げることができる。

【０１２７】遺伝子発現に用いるプロモーターとして
は、植物細胞中で発現できるものであればいずれも用い
ることができ、例えば、カリフラワーモザイクウイルス
（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プ
ロモーター等を挙げることができる。また、プロモータ
ーと発現させる遺伝子の間に、トウモロコシのアルコー
ル脱水素酵素遺伝子のイントロン１等を挿入することに
より、遺伝子の発現効率を挙げることもできる。

【０１２８】宿主細胞としては、ポテト、タバコ、トウ
モロコシ、イネ、アブラナ、大豆、トマト、ニンジン、
小麦、大麦、ライ麦、アルファルファ、亜麻等の植物細
胞等を挙げることができる。組換えベクターの導入方法
としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればい
ずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム
（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（特開昭５９−１４０
８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７
７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１
８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法
（特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３）等を
挙げることができる。

【０１２９】（ｖ）培養方法本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ
組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞、あるい
は植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従っ
て培養し、本発明のポリペプチドを生成蓄積させ、本発
明の培養物より本発明のポリペプチドを採取することに
より、本発明のポリペプチドを製造することができる。

【０１３０】（ｖｉ）昆虫細胞を宿主細胞として用いる
場合昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えば、バキュ
ロウイルス・イクスプレッション・ベクターズア・ラ
ボラトリー・マニュアル［ＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓＥ
ｘｐｒｅｓｓｉｏｎＶｅｃｔｏｒｓ，ＡＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ
ａｎｄＣｏｍｐａｎｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９
２）］、モレキュラー・バイオロジーア・ラボラトリ
ー・マニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇ
ｙ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）、カレ
ント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロ
ジーサプルメント１〜３８（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏ
ｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏ
ｇｙ）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１
９８８）等に記載された方法によって、ポリペプチドを
発現することができる。

【０１３１】即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバ
キュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上
清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルス
を昆虫細胞に感染させ、ポリペプチドを発現させること
ができる。本発明の方法において用いられる遺伝子導入
ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１
３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（すべてインビトロジ
ェン社製）等を挙げることができる。

【０１３２】バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗
蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カ
リフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス
（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａｎ
ｕｃｌｅａｒｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓｖｉｒｕ
ｓ）等を用いることができる。

【０１３３】昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ
ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌ
ｕｓｉａｎｉの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞
等を用いることができる。Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒ
ｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞としてはＳｆ９、Ｓｆ２１
（バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ
ア・ラボラトリー・マニュアル）等、Ｔｒｉｃｈｏｐ
ｌｕｓｉａｎｉの卵巣細胞としてはＨｉｇｈ５、Ｂ
ＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（インビトロジェン社製）等、
カイコ卵巣由来の培養細胞としてはＢｏｍｂｙｘｍｏ
ｒｉＮ４等を挙げることができる。

【０１３４】組換えウイルスを調製するための、昆虫細
胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウ
イルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウ
ム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法
［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８
４，７４１３（１９８７）］等を挙げることができる。

【０１３５】また、動物細胞にＤＮＡを導入する方法と
同様の方法を用いて、昆虫細胞にＤＮＡを導入すること
もでき、例えば、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、リ
ン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフ
ェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］等を挙げる
ことができる。

【０１３６】本発明のポリペプチド製造用形質転換体が
大腸菌等の原核生物、酵母菌等の真核生物である場合、
これら本発明の形質転換体を培地に培養し、培養物中に
本発明のポリペプチドを生成蓄積させ、本発明の培養物
から採取することにより、本発明のポリペプチドを製造
することができる。

【０１３７】本発明の形質転換体を培地に培養する方法
は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うこ
とができる。大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核
生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地と
しては、本発明の生物が資化し得る炭素源、窒素源、無
機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える
培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよ
い。

【０１３８】炭素源としては、それぞれの微生物が資化
し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、
スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいは
デンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸
等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール
類を用いることができる。

【０１３９】窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸
アンモニウム等の各種無機酸または有機酸のアンモニウ
ム塩、その他含窒素物質、ならびに、ペプトン、肉エキ
ス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水
分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体
およびその消化物等を用いることができる。

【０１４０】無機塩としては、リン酸第一カリウム、リ
ン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫
酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。培養
は、振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下
で行う。

【０１４１】培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間
は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０
〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機
の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニ
ア等を用いて行う。また培養中必要に応じて、アンピシ
リンまたはテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加
してもよい。

【０１４２】プロモーターとして誘導性のプロモーター
を用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する
ときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加し
てもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベ
クターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプ
ロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐ
プロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生
物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に
添加してもよい。遺伝子を導入した植物の細胞または器
官は、ジャーファーメンターを用いて大量培養すること
ができる。培養する培地としては、一般に使用されてい
るムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト
（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、
サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用
いることができる。

【０１４３】本発明のポリペプチド製造用形質転換体が
動物細胞である場合、本発明の細胞を培養する培地は、
一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［Ｔｈｅ
ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＭ
ｅｄｉｃａｌＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１
９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）］、ＤＭＥＭ培地
［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）］、１９
９培地［ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｏｆｔｈｅＳｏｃｉ
ｅｔｙｆｏｒｔｈｅＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＭｅ
ｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）］またはこれら培
地にウシ胎児血清等を添加した培地等が用いられる。

【０１４４】培養は、通常ｐＨ６〜８、２５〜４０℃、
５％ＣＯ₂存在下等の条件下で１〜７日間行う。また培
養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレ
プトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。

【０１４５】本発明のポリペプチド製造用形質転換体が
昆虫細胞である場合、本発明の細胞を培養する培地とし
ては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（ファー
ミンジェン社（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）製）、Ｓｆ−９
００ＩＩＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）、Ｅ
ｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５［いずれもＪ
ＲＨバイオサイエンシーズ社製］、Ｇｒａｃｅ’ｓＩ
ｎｓｅｃｔＭｅｄｉｕｍ［Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８
８（１９６２）］等を用いることができる。

【０１４６】（ｖｉｉ）製造方法本発明ポリペプチド製造用形質転換体の培養物から、本
発明のポリペプチドを単離または精製するためには、当
該分野で周知慣用の通常の酵素の単離または精製法を用
いることができる。例えば、本発明のポリペプチドが本
発明のポリペプチド製造用形質転換体の細胞外に本発明
のポリペプチドが分泌される場合には、その培養物を遠
心分離等の手法により処理し、可溶性画分を取得する。
その可溶性画分から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法
脱塩法、有機溶媒による沈澱法、ジエチルアミノエチル
（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮＨＰＡ−
７５（三菱化成社製）等レジンを用いた陰イオン交換ク
ロマトグラフィー法、Ｓ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ
（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換
クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニル
セファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフ
ィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティーク
ロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電
点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用い、精製標品を
得ることができる。

【０１４７】本発明のポリペプチドが本発明のポリペプ
チド製造用形質転換体の細胞内に溶解状態で蓄積する場
合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の
細胞を集め、その細胞を洗浄した後に、超音波破砕機、
フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダ
イノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
その無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上
清から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機
溶媒による沈澱法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）
−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、ＤＩＡＩＯＮ
ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等レジンを用いた陰イ
オン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イ
オン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、
フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマ
トグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニ
ティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング
法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用いるこ
とによって、精製標品を得ることができる。

【０１４８】また、本発明のポリペプチドが細胞内に不
溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破
砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈澱画分よ
り、通常の方法により本発明のポリペプチドを回収後、
そのポリペプチドの不溶体をポリペプチド変性剤で可溶
化する。この可溶化液を、ポリペプチド変性剤を含まな
いあるいはポリペプチド変性剤の濃度がポリペプチドが
変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、
本発明のポリペプチドを正常な立体構造に構成させた
後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ること
ができる。

【０１４９】また、通常のタンパク質の精製方法［Ｊ．
Ｅｖａｎ．Ｓａｄｌｅｒら：メソッド・イン・エンザイ
モロジー（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ），８３，４５８］に準じて精製できる。また、本発
明のポリペプチドを他のタンパク質との融合タンパク質
として生産し、融合したタンパク質に親和性をもつ物質
を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して
精製することもできる［山川彰夫，実験医学（Ｅｘｐｅ
ｒｉｍｅｎｔａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ），１３，４６９
−４７４（１９９５）］。例えば、ロウらの方法［Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，
８２２７（１９８９）、ＧｅｎｅｓＤｅｖｅｌｏｐ．，
４，１２８８（１９９０）］に記載の方法に準じて、本
発明のポリペプチドをプロテインＡとの融合タンパク質
として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニテ
ィークロマトグラフィーにより精製することができる。

【０１５０】また、本発明のポリペプチドをＦＬＡＧペ
プチドとの融合タンパク質として生産し、抗ＦＬＡＧ抗
体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精
製することができる［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅ
ｎｅｓＤｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９
０）］。

【０１５１】さらに、本発明のポリペプチド自身に対す
る抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精
製することもできる。本発明のポリペプチドは、公知の
方法［Ｊ．ＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒＮＭＲ，６，１
２９−１３４、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１
１６４、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１０，１６６−１６
８（１９９１）］に準じて、ｉｎｖｉｔｒｏ転写・翻
訳系を用いてを生産することができる。

【０１５２】上記で取得されたポリペプチドのアミノ酸
情報を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカ
ルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニ
ル法）等の化学合成法によっても本発明のポリペプチド
を製造することができる。また、アドバンスト・ケムテ
ック（ＡｄｖａｎｃｅｄＣｈｅｍＴｅｃｈ）社、アプ
ライドバイオシステムズ社、ファルマシアバイオテク
社、プロテイン・テクノロジー・インストゥルメント
（ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｓｔｒ
ｕｍｅｎｔ）社、シンセセル・ベガ（Ｓｙｎｔｈｅｃｅ
ｌｌ−Ｖｅｇａ）社、パーセプティブ（ＰｅｒＳｅｐｔ
ｉｖｅ）社、島津製作所等のペプチド合成機を利用し化
学合成することもできる。

【０１５３】精製した本発明のポリペプチドの構造解析
は、蛋白質化学で通常用いられる方法、例えば遺伝子ク
ローニングのためのタンパク質構造解析（平野久著、東
京化学同人発行、１９９３年）に記載の方法により実施
可能である。本発明の新規ｐｓ２０様ポリペプチドの生
理活性は、公知の測定法［Ｃｅｌｌ，７５，１３８９
（１９９３）、Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏ．ｌ１４６，２３
３（１９９９）、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５８，１２３
８（１９９８）、Ｎｅｕｒｏｎ１７，１１５７（１９
９６）、Ｓｃｉｅｎｃｅ２８９，１１９７（２００
０）］に準じて測定することができる。

【０１５４】（３）変異型ポリペプチドの作製方法本発明ポリペプチドのアミノ酸の欠失、置換もしくは付
加は、出願前周知技術である部位特異的変異誘発法によ
り実施することができる。かかる１もしくは数個のアミ
ノ酸が欠失、置換もしくは付加は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎ
ｕａｌ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳ
ｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰ
ｒｅｓｓ（１９８９）、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃ
ｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，
Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ１〜３８，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ
＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ
ＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１
９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，
ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３
４，３１５（１９８５）、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ，８２，
４８８（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，５６６２（１９８４）、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ，２２４，１４３１（１９８４）、ＰＣＴ
ＷＯ８５／００８１７（１９８５）、Ｎａｔｕｒｅ，３
１６，６０１（１９８５）等に記載の方法に準じて調製
することができる。（４）本発明のポリペプチドを認識する抗体の作製（ｉ）ポリクローナル抗体の作製上述（２）の方法により取得したポリペプチドの全長ま
たは部分断片精製標品、あるいは本発明の蛋白質の一部
のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原として用い、動
物に投与することによりポリクローナル抗体を作製する
ことができる。

【０１５５】投与する動物として、ウサギ、ヤギ、ラッ
ト、マウス、ハムスター等を用いることができる。その
抗原の投与量は動物１匹当たり５０〜１００μｇが好ま
しい。ペプチドを用いる場合は、ペプチドをスカシガイ
ヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅｌｉｍｐｅｔｈａｅ
ｍｏｃｙａｎｉｎ）またはウシチログロブリン等のキャ
リア蛋白に共有結合させたものを抗原とするのが望まし
い。抗原とするペプチドは、ペプチド合成機で合成する
ことができる。その抗原の投与は、１回目の投与の後１
〜２週間おきに３〜１０回行う。各投与後、３〜７日目
に眼底静脈叢より採血し、その血清が免疫に用いた抗原
と反応することを酵素免疫測定法［酵素免疫測定法（Ｅ
ＬＩＳＡ法）：医学書院刊１９７６年、Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ−ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，
ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｖｏｒａ
ｔｏｒｙ（１９８８）］等で確認する。

【０１５６】免疫に用いた抗原に対し、その血清が充分
な抗体価を示した非ヒトほ乳動物より血清を取得し、そ
の血清より、下記方法によりポリクローナル抗体を分
離、精製することができる。抗体を分離、精製する方法
としては、遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウ
ムによる塩析、カプリル酸沈澱［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ
ｓ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌ
ｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ，（１９８８）］、またはＤＥＡＥ−セファロースカ
ラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡまたはＧ−カ
ラムあるいはゲル濾過カラム等を用いるクロマトグラフ
ィー等を、単独または組み合わせて処理する方法があげ
られる。

【０１５７】（ｉｉ）モノクローナル抗体の作製（ａ）抗体産性細胞の調製免疫に用いた本発明のポリペプチドの部分断片ポリペプ
チドに対し、その血清が十分な抗体価を示したラットを
抗体産生細胞の供給源として供する。

【０１５８】このように充分な抗体価を示したラットに
抗原物質を最終投与した後３〜７日目に、脾臓を摘出す
る。その脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断
し、ピンセットでほぐし、１，２００ｒｐｍで５分間遠
心分離した後、上清を捨てる。得られた沈澱画分の脾細
胞をトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）
で１〜２分間処理し赤血球を除去した後、ＭＥＭ培地で
３回洗浄し、得られた脾細胞を抗体産生細胞として用い
る。

【０１５９】（ｂ）骨髄腫細胞の調製骨髄腫細胞としては、マウスまたはラットから取得した
株化細胞を使用する。例えば、８−アザグアニン耐性マ
ウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａ
ｇ８−Ｕ１（以下、Ｐ３−Ｕ１と略す）［Ｃｕｒｒ．Ｔ
ｏｐｉｃｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，
８１，１（１９７８）、Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．，６，５１１（１９７６）］、ｐｓ２０−Ａｇ１４
（ＳＰ−２）［Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９（１９７
８）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）［Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８（１９７９）］、
Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）［Ｎａｔｕｒｅ，２５
６，４９５（１９７５）］等を用いることができる。こ
れらの細胞株は、８−アザグアニン培地［ＲＰＭＩ−１
６４０培地にグルタミン（１．５ｍＭ）、２−メルカプ
トエタノール（５×１０−５Ｍ）、ジェンタマイシン
（１０μｇ／ｍｌ）およびウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｃ
ＳＬ社製、１０％）を加えた培地（以下、正常培地とい
う）に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ／ｍｌ）を
加えた培地］で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正
常培地で培養し、融合にはその細胞を２×１０⁷個以上
用いる。

【０１６０】（ｃ）ハイブリドーマの作製（ａ）で取得した抗体産生細胞と（ｂ）で取得した骨髄
腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム
１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩
７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく
洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１
０：１になるよう混合し、１，２００ｒｐｍで５分間遠
心分離した後、上清を捨てる。

【０１６１】得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐし、
その細胞群に、攪拌しながら、３７℃で、１０８抗体産
生細胞あたり、ポリエチレングライコール−１０００
（ＰＥＧ−１０００）２ｇ、ＭＥＭ２ｍｌおよびジメ
チルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．７ｍｌを混合した溶
液を０．２〜１ｍｌ添加し、さらに１〜２分間毎にＭＥ
Ｍ培地１〜２ｍｌを数回添加する。添加後、ＭＥＭ培地
を加えて全量が５０ｍｌになるように調製する。その調
製液を９００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を捨て
る。得られた沈澱画分の細胞を、ゆるやかにほぐした
後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかにＨ
ＡＴ培地［正常培地にヒポキサンチン（１０^-4Ｍ）、チ
ミジン（１．５×１０^-5Ｍ）およびアミノプテリン（４
×１０^-7Ｍ）を加えた培地］１００ｍｌ中に懸濁する。

【０１６２】その懸濁液を９６穴培養用プレートに１０
０μｌ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ ₂インキュベーター
中、３７℃で７〜１４日間培養する。培養後、培養上清
の一部をとりアンチボディイズ［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ
ｓ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ１４（１９８８）］等に述べられ
ている酵素免疫測定法により、本発明のポリペプチド
の部分断片ポリペプチドに特異的に反応するハイブリド
ーマを選択する。

【０１６３】（５）本発明ポリペプチドの免疫学的検出
方法本発明の抗体を用いる本発明のポリペプチドの免疫学的
検出法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥ
ＬＩＳＡ法・蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫
組織染色法等を挙げることができる。

【０１６４】（６）本発明ポリペプチドの免疫学的定量
方法本発明ポリペプチドの定量方法としては、液相中で本発
明のポリペプチドと反応する抗体のうちエピトープが異
なる２種類のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチ
ＥＬＩＳＡ法、１２６Ｉ等の放射性同位体で標識した本
発明の蛋白質と本発明の蛋白質を認識する抗体とを用い
るラジオイムノアッセイ法等を挙げることができる。

【０１６５】（７）本発明ポリペプチドのｍＲＮＡの定
量方法本発明のポリヌクレオチドあるいはＤＮＡより調製した
上記オリゴヌクレオチドを用い、ノーザンハイブリダイ
ゼーション法またはＰＣＲ法により、本発明のポリペプ
チドをコードするＤＮＡの発現量をｍＲＮＡレベルで定
量することができる。

【０１６６】具体的には、（ｉ）正常あるいは疾患モデ
ル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、
ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対し
て、薬剤（例えば、抗癌剤など）などを与え、一定時間
経過した後に、血液、もしくは特定の臓器（例えば、
脳、胃、腎臓など）、または臓器から単離した、組織も
しくは細胞を得る。得られた細胞に含まれる本発明のポ
リペプチドまたはその部分ペプチドのｍＲＮＡは、例え
ば、通常の方法により細胞等からｍＲＮＡを抽出し、例
えばＴａｑＭａｎＰＣＲなどの手法を用いることにより
定量することができ、自体公知の手段によりノザンブロ
ットを行うことにより解析することもできる。

【０１６７】または、（ｉｉ）本発明のポリペプチドも
しくはその部分ペプチドを発現する形質転換体を前述の
方法に従い作製し、この形質転換体に含まれる本発明の
ポリペプチドまたはその部分ペプチドのｍＲＮＡを同様
にして定量、解析することができる。さらに、本発明の
ポリヌクレオチドをプローブとして、公知の方法［東京
大学医科学研究所制癌研究部編、新細胞工学実験プロト
コール、秀潤社（１９９３年）］を用いて、本発明の遺
伝子のプロモーター領域を取得することが可能である。

【０１６８】現在、多くの機能未知のヒト染色体遺伝子
の配列がデータベースに登録されている。したがって、
本発明のポリペプチドをコードするヒトｃＤＮＡの配列
と、データベースに登録されてるヒト染色体遺伝子の配
列とを比較することにより、本発明のポリペプチドをコ
ードするヒト染色体遺伝子を同定し、その遺伝子の構造
を明らかにできる可能性がある。ｃＤＮＡの配列と一致
する染色体遺伝子配列が登録されていれば、ｃＤＮＡの
配列と染色体遺伝子の配列を比較することにより、本発
明のポリペプチドをコードする染色体遺伝子のプロモー
ター領域、エクソンおよびイントロン構造をスクリーニ
ングすることができる。

【０１６９】プロモーター領域としては、哺乳動物細胞
において本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の転
写に関与するすべてのプロモーター領域があげられる。
例えば、ヒト大腸癌細胞あるいはヒト膵臓癌細胞で、本
発明のポリペプチドをコードする遺伝子の転写に関与す
るプロモータ領域を挙げることができる。具体的には、
例えば、配列番号７で表される塩基配列の１〜５０００
番目の塩基配列中の連続する５０〜５０００ｂｐの配列
を有するプロモーターＤＮＡを挙げることができる。そ
のプロモーターは後述のスクリーニング法に利用するこ
とができる。

【０１７０】（８）癌または癌転移の検出方法癌または癌転移検出方法としては、本発明のポリペプチ
ドの免疫学的検出方法で本発明のポリペプチドと反応す
る抗体のうちエピトープが異なる２種類のモノクローナ
ル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法、¹²⁵Ｉ等の
放射性同位体で標識した本発明の蛋白質と本発明の蛋白
質を認識する抗体とを用いるラジオイムノアッセイ法等
を挙げることができる。上記検出法は、胃癌等の診断に
利用することができる。

【０１７１】本発明のポリペプチドは、胃癌患者の癌細
胞においてその発現が増加していることから、本遺伝子
の多型を調べることにより、胃癌等の診断または予後の
予測に利用できる。

【０１７２】また、本遺伝子の多型と、本遺伝子が発現
している臓器（脳、食道、胃、肺、十二指腸、尿管、小
腸癌、結腸、直腸、胆嚢甲状腺、副腎、膀胱、前立腺）
における疾患との関連を調べることにより、他の疾患の
診断にも利用できる。本遺伝子の多型解析は、本遺伝子
の遺伝子配列情報を用いて行うことができる。具体的に
は、サザンブロット法、ダイレクトシークエンス法、Ｐ
ＣＲ法、ＤＮＡチップ法などを用いて遺伝子多型を解析
することができる［臨床検査，４２，１５０７−１５１
７（１９９８）、臨床検査，４２，１５６５−１５７０
（１９９８）］。

【０１７３】（９）神経病態の検出方法神経病態の検出方法としては、本発明のポリペプチドの
免疫学的検出方法で本発明のポリペプチドと反応する抗
体のうちエピトープが異なる２種類のモノクローナル抗
体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法、¹²⁵Ｉ等の放射
性同位体で標識した本発明の蛋白質と本発明の蛋白質を
認識する抗体とを用いるラジオイムノアッセイ法等を挙
げることができる。上記検出法は、脳梗塞時の神経病態
の診断に利用することができる。

【０１７４】（１０）癌または癌転移の診断用キット本発明の抗体を用いて免疫学的手法によっても癌の診断
を行なうことができる。また、本発明のポリヌクレオチ
ドは、ノーザンハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ
法を用いたそれら癌の診断に利用することが可能であ
る。従って、抗体を用いた診断の場合には、本発明の抗
体の他に、標準抗原として本発明のポリペプチドが含ま
れる。さらにキット中には標準曲線が含まれていてもよ
い。また、ポリヌクレオチドを用いた診断の場合には、
キット中には標識された本発明のポリヌクレオチドが含
まれる。

【０１７５】（１１）神経病態の診断用キット本発明の抗体を用いて免疫学的手法によっても神経病態
の診断を行なうことができる。また、本発明のポリヌク
レオチドは、ノーザンハイブリダイゼーション法または
ＰＣＲ法を用いたそれら神経病態の診断に利用すること
が可能である。従って、抗体を用いた診断の場合には、
本発明の抗体の他に、標準抗原として本発明のポリペプ
チドが含まれる。さらにキット中には標準曲線が含まれ
ていてもよい。また、ポリヌクレオチドを用いた診断の
場合には、キット中には標識された本発明のポリヌクレ
オチドが含まれる。

【０１７６】（１２）本発明ポリペプチドのＤＮＡの転
写抑制およびｍＲＮＡの翻訳抑制方法本発明のポリヌクレオチドを投与することにより、本発
明のポリペプチドの生産を抑制することができる。即
ち、本発明のポリヌクレオチドを用いて、本発明のポリ
ペプチドをコードするＤＮＡの転写の抑制、本発明のポ
リペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳の抑制を行うこ
とが可能である。

【０１７７】（１３）結合物質のスクリーニング方法本発明のポリペプチドまたはその部分ペプチドは、本発
明のポリペプチドに結合する蛋白質を探索し、またはス
クリーニングするための試薬として有用である。すなわ
ち、本発明は、本発明のポリペプチドもしくはその塩ま
たは本発明の部分ペプチドもしくはその塩と被験物質と
を接触させることを特徴とする本発明のポリペプチドに
対する結合物質のスクリーニング方法を提供する。被験
物質としては、例えば、トリプシン等のプロテアーゼに
属するタンパク質、ヒトまたは哺乳動物（例えば、マウ
ス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サルなど）の組織抽
出物、細胞培養上清などが用いられる。これらの被験物
質を本発明のポリペプチドに添加し、結合活性などを測
定しながら分画し、最終的に単一の結合物質を得ること
ができる。また、プロテアーゼに関しては、その活性を
本発明のポリペプチドまたはその部分ペプチドが阻害す
ることが可能かどうか検討することによりスクリーニン
グすることも可能である。

【０１７８】具体的には、本発明の結合物質スクリーニ
ング方法は、本発明のポリペプチドもしくはその部分ペ
プチドを用いるか、組換え型ポリペプチドの発現系を構
築し、その発現系を用いた結合アッセイ系を用いるか、
本発明のポリペプチドに結合して細胞刺激活性（例え
ば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃ
ａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、
イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白
質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化またはｐＨの低下な
どを促進する活性または抑制する活性など）を測定する
か、あるいはプロテアーゼに対する阻害活性を測定して
スクリーニングすることができる。

【０１７９】まず、結合物質スクリーニング方法に用い
るポリペプチドとしては、上記した本発明のポリペプチ
ドまたは本発明の部分ペプチドを含有するものであれば
何れのものであってもよいが、動物細胞を用いて大量発
現させたポリペプチドが適している。本発明のポリペプ
チドを製造するには、前述の発現方法が用いられるが、
そのポリペプチドをコードするＤＮＡを哺乳動物細胞ま
たは昆虫細胞で発現することにより行なうことが好まし
い。目的とする蛋白質部分をコードするＤＮＡ断片に
は、通常、相補的なＤＮＡが用いられるが、必ずしもこ
れに制約されるものではない。例えば、遺伝子断片また
は合成ＤＮＡを用いてもよい。本発明のポリペプチドを
コードするＤＮＡ断片を宿主動物細胞に導入し、それら
を効率よく発現させるためには、そのＤＮＡ断片を昆虫
を宿主とするバキュロウイルスに属する核多角体病ウイ
ルス（ｎｕｃｌｅａｒｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓｖ
ｉｒｕｓ；ＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーター、ＳＶ
４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモータ
ー、メタロチオネインプロモーター、ヒトヒートショッ
クプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、
ＳＲαプロモーターなどの下流に組み込むのが好まし
い。発現したポリペプチドの量と質の検査はそれ自体公
知の方法で行うことができる。例えば、文献［Ｎａｍｂ
ｉ，Ｐ．ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２６７
巻，１９５５５〜１９５５９頁，１９９２年］に記載の
方法に従って行うことができる。

【０１８０】したがって、本発明の結合物質スクリーニ
ング方法において、本発明のポリペプチドもしくはその
部分ペプチドを含有するものとしては、それ自体公知の
方法に従って精製したポリペプチドもしくはその部分ペ
プチドであってもよいし、本発明のポリペプチドを含有
する細胞またはその細胞上清を用いてもよい。本発明の
結合物質スクリーニング方法において、本発明のポリペ
プチドを含有する細胞を用いる場合、その細胞をグルタ
ルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固
定化方法はそれ自体公知の方法に従って行なうことがで
きる。本発明のポリペプチドを含有する細胞としては、
本発明のポリペプチドを発現した宿主細胞をいうが、そ
の宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、酵母、動物細
胞、植物細胞、昆虫細胞などが用いられる。細胞上清画
分としては、細胞の培養上清に含まれる画分のことをい
う。

【０１８１】本発明のポリペプチドまたはその塩に対す
る結合物質をスクリーニングするためには、適当なポリ
ペプチド画分と、標識した被検物質が必要である。ポリ
ペプチド画分としては、天然型のポリペプチド画分か、
またはそれと同等の活性を有する組換え型ポリペプチド
画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等の
結合物質結合活性、シグナル情報伝達作用などを示す。
標識した被検物質としては、［³Ｈ］、［¹²⁵Ｉ］、［¹⁴
Ｃ］、［³⁵Ｓ］などで標識した、例えば、タイプＩＶコ
ラーゲンおよびラミニン等の基底膜タンパク質に属する
タンパク質を挙げることができる。

【０１８２】具体的には、本発明のポリペプチドまたは
その塩に対する結合物質のスクリーニング方法を行なう
には、まず本発明のポリペプチドを含有する細胞培上清
を、スクリーニング方法に適したバッファーに懸濁する
ことによりポリペプチド標品を調製する。バッファーに
は、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バ
ッファー、トリス−塩酸バッファーなどの結合物質とポ
リペプチドとの結合を阻害しないバッファーであればい
ずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的
で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０^TM（花王−アトラス
社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤
またはウシ血清アルブミンまたはゼラチンなどの各種蛋
白質をバッファーに加えることもできる。さらに、プロ
テアーゼによる結合物質の分解を抑える目的でＰＭＳ
Ｆ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペ
プスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することも
できる。０．０１ｍｌ〜１０ｍｌのそのポリペプチド溶
液に、一定量（５０００ｃｐｍ〜５０００００ｃｐｍ）
の［³Ｈ］、［¹²⁵Ｉ］、［¹⁴Ｃ］、［³⁵Ｓ］などで標識
した被検物質を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）
を知るために大過剰の未標識の被検物質を加えた反応チ
ューブも用意する。反応は約０℃から５０℃、望ましく
は約４℃から３７℃で、約２０分から２４時間、望まし
くは約３０分から３時間行なう。反応後、ガラス繊維濾
紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラ
ス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーション
カウンターあるいはγ−カウンターで計測する。全結合
量（Ｂ）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウン
ト（Ｂ−ＮＳＢ）が０ｃｐｍを超える被検物質を本発明
のポリペプチドまたはその塩に対する結合物質として選
択することができる。

【０１８３】本発明のポリペプチドに対する結合物質を
スクリーニングするためには、本発明のポリペプチドを
介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセ
チルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生
成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細
胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの
活性化またはｐＨの低下などを促進する活性または抑制
する活性またはなど）を公知の方法または市販の測定用
キットを用いて測定することができる。具体的には、ま
ず、ポリペプチドを含有する細胞をマルチウェルプレー
ト等に培養する。結合物質スクリーニングを行なうにあ
たっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さ
ない適当なバッファーに交換し、被検物質などを添加し
て一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは
上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従
って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例え
ば、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解
酵素によって検定困難な場合は、その分解酵素に対する
阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃ
ＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリン
などで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対
する産生抑制作用として検出することができる。

【０１８４】本発明のポリペプチドに対する結合物質と
してプロテアーゼをスクリーニングするためには、本発
明のポリペプチドを介するプロテアーゼ阻害活性を公知
の方法または市販の測定用キットを用いて測定すること
ができる。具体的には、本発明のポリペプチドを、市販
のプロテアーゼ測定キットに加え、阻害活性を測定する
ことにより検出することができる。

【０１８５】（１４）結合物質のスクリーニング用キッ
ト本発明のポリペプチドまたはその塩に結合する蛋白質ス
クリーニング用キットは、本発明のポリペプチドもしく
はその塩、本発明の部分ペプチドもしくはその塩、本発
明のポリペプチドを含有する細胞、または本発明のポリ
ペプチドを含有する細胞上清画分などを含有するもので
ある。本発明の結合物質スクリーニング用キットの例と
しては、次のものが挙げられる。

【０１８６】（ｉ）結合物質のスクリーニング用試薬測定用緩衝液および洗浄用緩衝液Ｈａｎｋｓ’ Ｂａｌ
ａｎｃｅｄＳａｌｔＳｏｌｕｔｉｏｎ（インビトロジ
ェン社製）に、０．０５％のウシ血清アルブミン（シグ
マ社製）を加えたもの。孔径０．４５μｍのフィルター
で濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは用時調製し
ても良い。（ａ）本発明のポリペプチドを発現させたＣＨＯ細胞
を、１２穴プレートに５×１０５個／穴で継代し、３７
℃、５％ＣＯ₂、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。（ｂ）標識被検物質：市販の［³Ｈ］、［¹²⁵Ｉ］、［¹⁴
Ｃ］、［³⁵Ｓ］などで標識した被検物質、または適当な
方法で標識化した被検物質の水溶液状態のものを４℃あ
るいは−２０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて１
μＭに希釈する。水に難溶性を示す被検物質について
は、ジメチルホルムアミド、ＤＭＳＯ、メタノール等に
溶解する。（ｃ）非標識被検物質：標識物質と同じものを１００〜
１０００倍濃い濃度に調製する。

【０１８７】（ｉｉ）測定法（ａ）１２穴組織培養用プレートにて培養した本発明の
ポリペプチド発現ＣＨＯ細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで
２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加
える。（ｂ）標識被検物質を５μｌ加え、室温にて１時間反応
させる。非特異的結合量を知るためには非標識被検物質
を５μｌ加えておく。（ｃ）反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗
浄する。細胞に結合した標識被検物質を０．２ＮＮａ
ＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレータ
ーＡ（和光純薬製）と混合する。（ｄ）液体シンチレーションカウンター（ベックマン社
製）を用いて放射活性を測定する。

【０１８８】（１５）結合活性調節物質のスクリーニン
グ方法本発明のポリペプチドと結合物質との結合性を変化させ
る物質のスクリーニング方法としては、本発明のポリペ
プチドまたは組換え型ポリペプチド等の発現系を構築
し、バイオアッセイ系または結合アッセイ系を用いるこ
とによって、結合物質と本発明のポリペプチド等との結
合性を変化させる物質（例えば、ペプチド、蛋白質、非
ペプチド性物質、合成物質、発酵生産物など）またはそ
の塩を効率よくスクリーニングすることができる。この
ような物質には、（ａ）結合物質と本発明のポリペプチ
ドとの結合を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン
酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞
内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリ
ン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、
ｃ−ｆｏｓの活性化またはｐＨの低下などを促進する活
性または抑制する活性など）を増強あるいは減少させる
物質、（ｂ）結合物質と本発明のポリペプチドとの結合
力を増強する物質あるいは減少させる物質が挙げられ
る。すなわち、本発明は、（ｉ）本発明のポリペプチド
もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、結合物質と
を接触させた場合と（ｉｉ）本発明のポリペプチドもし
くはその部分ペプチドまたはそれらの塩と、結合物質お
よび被検物質とを接触させた場合との比較を行なうこと
を特徴とする結合物質と本発明のポリペプチドもしくは
その部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる
物質のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリ
ーニング方法においては、（ｉ）および（ｉｉ）の場合
における、例えば、細胞刺激活性あるいは本発明のポリ
ペプチドと結合物質との結合量などを測定して、比較す
ることを特徴とする。

【０１８９】より具体的には、本発明のスクリーニング
方法としては、（ａ）標識した結合物質を、本発明のポ
リペプチド等に接触させた場合と、標識した結合物質お
よび被検物質を本発明のポリペプチド等に接触させた場
合における、標識した結合物質の本発明のポリペプチド
等に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする
結合物質と本発明のポリペプチド等との結合性を変化さ
せる物質のスクリーニング方法、（ｂ）標識した結合物
質を、本発明のポリペプチド等を含有する細胞または本
発明の細胞の上清画分に接触させた場合と、標識した結
合物質および被検物質を本発明のポリペプチド等を含有
する細胞または本発明の細胞の上清画分に接触させた場
合における、標識した結合物質の本発明の細胞またはそ
の上清画分に対する結合量を測定し、比較することを特
徴とする結合物質と本発明のポリペプチド等との結合性
を変化させる物質のスクリーニング方法、（ｃ）標識し
た結合物質を、本発明のポリヌクレオチドを含有する形
質転換体を培養することによって細胞上清に分泌された
ポリペプチド等に接触させた場合と、標識した結合物質
および被検物質を本発明のポリヌクレオチドを含有する
形質転換体を培養することによって細胞上清上に発現し
た本発明のポリペプチド等に接触させた場合における、
標識した結合物質の本発明のポリペプチド等に対する結
合量を測定し、比較することを特徴とする結合物質と本
発明のポリペプチド等との結合性を変化させる物質また
はその塩のスクリーニング方法などが列挙される。

【０１９０】（１６）結合活性調節物質のスクリーニン
グ用キット結合物質と本発明のポリペプチド等との結合性を変化さ
せる物質またはその塩のスクリーニング用キットは、本
発明のポリペプチド、本発明のポリペプチドを含有する
細胞、または本発明のポリペプチドを含有する細胞の上
清画分を含有するものなどである。本発明のスクリーニ
ング用キットの例としては、次のものが挙げられる。

【０１９１】（ｉ）スクリーニング用試薬（ａ）測定用緩衝液および洗浄用緩衝液：Ｈａｎｋｓ’
ＢａｌａｎｃｅｄＳａｌｔＳｏｌｕｔｉｏｎ（イ
ンビトロジェン社製）に、０．０５％のウシ血清アルブ
ミン（シグマ社製）を加えたもの。孔径０．４５μｍの
フィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは
用時調製しても良い。（ｂ）ポリペプチド標品：本発明のポリペプチドを発現
させたＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに５×１０⁵個／
穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ₂、９５％ａｉｒで２日
間培養したもの。（ｃ）標識結合物質：市販の［³Ｈ］、［¹²⁵Ｉ］、［¹⁴
Ｃ］、［³⁵Ｓ］などで標識した結合物質の水溶液の状
態のものを４℃あるいは−２０℃にて保存し、用時に測
定用緩衝液にて１μＭに希釈する。（ｄ）結合物質：標準液結合物質を０．１％ウシ血清ア
ルブミン（シグマ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるよ
うに溶解し、−２０℃で保存する。

【０１９２】（ｉｉ）測定法（ａ）１２穴組織培養用プレートにて培養した本発明の
ポリペプチド発現ＣＨＯ細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで
２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加
える。（ｂ）１０^-3〜１０^-10Ｍの被検物質溶液を５μｌ加え
た後、標識結合物質を５μｌ加え、室温にて１時間反応
させる。非特異的結合量を知るためには被検物質の代わ
りに１０^-3Ｍの結合物質を５μｌ加えておく。（ｃ）反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗
浄する。細胞に結合した標識結合物質を０．２ＮＮａ
ＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレータ
ーＡ（和光純薬製）と混合する。（ｄ）液体シンチレーションカウンター（ベックマン社
製）を用いて放射活性を測定し、ＰＭＢを求める。

【０１９３】（１７）発現調節物質のスクリーニング方
法本発明のポリペプチドまたはその部分ペプチドの発現調
節物質のスクリーニング方法は、本発明のポリヌクレオ
チドあるいは上記（５）記載の抗体を、プローブとして
用いることにより、本発明のポリペプチドまたはその部
分ペプチドの発現調節物質のスクリーニングに用いるこ
とができる。すなわち本発明は、例えば、（ｉ）非ヒト
哺乳動物の血液、特定の臓器、臓器から単離した組織も
しくは細胞、または（ｉｉ）形質転換体等に含まれる本
発明のポリペプチドまたはその部分ペプチドのｍＲＮＡ
量あるいはタンパク質量を測定することにより、本発明
のポリペプチドまたはその部分ペプチドの発現調節物質
のスクリーニングを行うことができる。

【０１９４】（１８）発現調節物質のスクリーニング用
キット本発明のポリペプチドの発現調節物質またはその塩のス
クリーニング用キットは、本発明のポリペプチド、本発
明のポリペプチドを含有する細胞、または本発明のポリ
ペプチドを含有する細胞の上清画分を含有するものなど
である。本発明のスクリーニング用キットの例として
は、次のものが挙げられる。

【０１９５】（１９）免疫学的定量方法に基づくスクリ
ーニング用キット本発明ポリペプチドの定量方法としては、液相中で本発
明のポリペプチドと反応する抗体のうちエピトープが異
なる２種類のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチ
ＥＬＩＳＡ法、１２６Ｉ等の放射性同位体で標識した本
発明の蛋白質と本発明の蛋白質を認識する抗体とを用い
るラジオイムノアッセイ法等を挙げることができる。従
って、抗体を用いた診断の場合には、本発明の抗体の他
に、標準抗原として本発明のポリペプチドが含まれる。
さらにキット中には標準曲線が含まれていてもよい。

【０１９６】（２０）分子生物学的定量方法に基づくス
クリーニング用キット本発明のポリヌクレオチドあるいは本発明のＤＮＡより
調製した上記オリゴヌクレオチドを用い、ノーザンハイ
ブリダイゼーション法またはＰＣＲ法により、本発明の
ポリペプチドをコードするＤＮＡの発現量をｍＲＮＡレ
ベルで定量することができる。

【０１９７】具体的には、（ｉ）正常あるいは疾患モデ
ル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、
ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対し
て、薬剤（例えば、抗癌剤など）などを与え、一定時間
経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、
脳、胃、腎臓など）、または臓器から単離した組織、あ
るいは細胞を得る。得られた細胞に含まれる本発明のポ
リペプチドまたはその部分ペプチドのｍＲＮＡは、例え
ば、通常の方法により細胞等からｍＲＮＡを抽出し、例
えばＴａｑＭａｎＰＣＲなどの手法を用いることにより
定量することができ、自体公知の手段によりノザンブロ
ットを行うことにより解析することもできる。

【０１９８】または、（ｉｉ）本発明のポリペプチドも
しくはその部分ペプチドを発現する形質転換体を前述の
方法に従い作製し、本発明の形質転換体に含まれる本発
明のポリペプチドまたはその部分ペプチドのｍＲＮＡを
同様にして定量、解析することができる。さらに、本発
明のポリヌクレオチドをプローブとして、公知の方法
［東京大学医科学研究所制癌研究部編、新細胞工学実験
プロトコール、秀潤社（１９９３年）］を用いて、本発
明の遺伝子のプロモーター領域を取得することが可能で
ある。本発明の抗体を用いて免疫学的手法によって本発
明のポリペプチドの発現量の定量を行なうことができ
る。また、本発明のポリヌクレオチドは、ノーザンハイ
ブリダイゼーション法またはＰＣＲ法を用い、本発明の
ポリペプチドのｍＲＮＡの発現量の定量を行なうことが
できる。また、ポリヌクレオチドを用いた診断の場合に
は、キット中には標識された本発明のポリヌクレオチド
が含まれる。

【０１９９】（ｉ）スクリーニング用試薬（ａ）測定用緩衝液および洗浄用緩衝液：Ｈａｎｋｓ’
ＢａｌａｎｃｅｄＳａｌｔＳｏｌｕｔｉｏｎ（イ
ンビトロジェン製）に、０．０５％のウシ血清アルブミ
ン（シグマ社製）を加えたもの。孔径０．４５μｍのフ
ィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは用
時調製しても良い。（ｂ）ポリペプチド標品：本発明のポリペプチドを発現
させたＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに５×１０⁵個／
穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ₂、９５％ａｉｒで２日
間培養したもの。（ｃ）標識結合物質：市販の［³Ｈ］、［¹²⁵Ｉ］、［¹⁴
Ｃ］、［³⁵Ｓ］などで標識した結合物質の水溶液の状
態のものを４℃あるいは−２０℃にて保存し、用時に測
定用緩衝液にて１μＭに希釈する。（ｄ）結合物質：標準液結合物質を０．１％ウシ血清ア
ルブミン（シグマ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるよ
うに溶解し、−２０℃で保存する。

【０２００】（ｉｉ）測定法（ａ）１２穴組織培養用プレートにて培養した本発明の
ポリペプチド発現ＣＨＯ細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで
２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加
える。（ｂ）１０^-3〜１０^-10Ｍの被検物質溶液を５μｌ加え
た後、標識結合物質を５μｌ加え、室温にて１時間反応
させる。非特異的結合量を知るためには被検物質の代わ
りに１０^-3Ｍの結合物質を５μｌ加えておく。（ｃ）反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗
浄する。細胞に結合した標識結合物質を０．２ＮＮａ
ＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレータ
ーＡ（和光純薬製）と混合する。（ｄ）液体シンチレーションカウンター（ベックマン社
製）を用いて放射活性を測定し、ＰＭＢを求める。

【０２０１】（２１）非ヒトノックアウトおよび非ヒト
トランスジェニック動物の作製本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを用い、目的
とする非ヒト動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、
ウマ、ニワトリ、マウス等の胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏ
ｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌ）において染色体上の本発
明のポリペプチドをコードするＤＮＡを公知の相同組換
えの手法［例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３２６，６１１０，
２９５（１９８７）、Ｃｅｌｌ，５１，３，５０３（１
９８７）等］により不活化または任意の配列と置換した
変異クローンを作成することができる［例えば、Ｎａｔ
ｕｒｅ，３５０，６３１５，２４３（１９９１）］。

【０２０２】このようにして作成した胚性幹細胞クロー
ンを用い、非ヒト動物の受精卵の胚盤胞（ｂｌａｓｔｃ
ｙｓｔ）への注入キメラ法または集合キメラ法等の手法
により胚性幹細胞クローンと正常細胞からなるキメラ個
体を作成することができる。本発明のキメラ個体と正常
個体の掛け合わせにより、全身の細胞の染色体上の本発
明のポリペプチドをコードするＤＮＡに任意の変異を有
する個体を得ることができ、さらにその個体の掛け合わ
せにより相同染色体の双方に変異が入った、ホモ個体を
得ることができる。

【０２０３】このようにして動物個体において、染色体
上の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの任意の
位置へ変異の導入が可能である。例えば染色体上の本発
明のポリペプチドをコードするＤＮＡの翻訳領域中への
塩基置換、欠失、挿入等の変異を導入することにより、
その産物の活性を変化させることができる。

【０２０４】またその発現制御領域への同様な変異の導
入により、発現の程度、時期、組織特異性等を改変させ
ることも可能である。さらにＣｒｅ−ｌｏｘＰ系との組
合せにより、より積極的に発現時期、発現部位、発現量
等を制御することも可能である。このような例として、
脳のある特定の領域で発現されるプロモータを利用し
て、その領域でのみ目的遺伝子を欠失させた例［Ｃｅｌ
ｌ，８７，７，１３１７（１９９６）］またはＣｒｅを
発現するアデノウィルスを用いて、目的の時期に、臓器
特異的に目的遺伝子を欠失させた例［Ｓｃｉｅｎｃｅ，
２７８，５３３５，（１９９７）］が知られている。従
って染色体上の本発明のポリペプチドをコードするＤＮ
Ａについてもこのように任意の時期または組織で発現を
制御できる、または任意の置換、欠失、挿入、不可をそ
の翻訳領域または発現制御領域に有する非ヒトノックア
ウトまたは非ヒトトランスジェニック動物を作製するこ
とが可能である。

【０２０５】このようなノックアウトおよびトランスジ
ェニック非ヒト動物は任意の時期、任意の程度または任
意の部位で、本発明のポリペプチドに起因する種々の疾
患の症状を誘導することができる。従って、本発明のノ
ックアウトおよびトランスジェニック非ヒト動物は、本
発明のポリペプチドに起因する種々の疾患の治療または
予防において極めて有用な動物モデルとなる。特にその
治療薬、予防薬等の評価用モデルとして非常に有用であ
る。

【０２０６】（２２）医薬本発明の抗体、結合物質、結合調節物質、または発現調
節物質を含有する医薬は、治療薬として本発明の物質単
独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に
許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合
し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法
により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。

【０２０７】投与経路は、治療に際して最も効果的なも
のを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、
気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口
投与を挙げることができる。投与形態としては、噴霧
剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座
剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。

【０２０８】経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シ
ロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげら
れる。例えば乳剤およびシロップ剤のような液体調製物
は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエ
チレングリコール、プロピレングリコール等のグリコー
ル類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒド
ロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフ
レーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤と
して用いて製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒
剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦
形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ス
テアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニ
ルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチ
ン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセ
リン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。

【０２０９】非経口投与に適当な製剤としては、注射
剤、座剤、噴霧剤等があげられる。例えば、注射剤は、
塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる
担体等を用いて調製する。座剤はカカオ脂、水素化脂肪
またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。また、
噴霧剤は本発明の物質そのもの、ないしは受容者の口腔
および気道粘膜を刺激せず、かつ本発明の物質を微細な
粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて
調製する。担体として具体的には乳糖、グリセリン等が
例示される。本発明の物質および用いる担体の性質によ
り、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能であ
る。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤
として例示した成分を添加することもできる。

【０２１０】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる物質またはその塩
は、結合物質と本発明のポリペプチド等との結合活性を
変化させる作用を有する物質であり、具体的には、
（ａ）結合物質と本発明のポリペプチドとの結合を介す
る細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチル
コリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、
細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜
電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性
化またはｐＨの低下などを促進する活性または抑制する
活性など）を増強あるいは減少させる物質、（ｂ）結合
物質と本発明のポリペプチドとの結合活性を増強する物
質あるいは減少させる物質である。

【０２１１】本発明の物質としては、ペプチド、タンパ
ク、非ペプチド性物質、合成物質、発酵生産物などが挙
げられ、これら物質は新規な物質であってもよいし、公
知の物質であってもよい。本発明のポリペプチド等に対
するアゴニストは、本発明のポリペプチド等に対する結
合物質が有する生理活性と同様の作用を有しているの
で、本発明の結合物質活性に応じて安全で低毒性な医薬
として有用である。本発明のポリペプチド等に対するア
ンタゴニストは、本発明のポリペプチド等に対する結合
物質が有する生理活性を抑制することができるので、本
発明の結合物質活性を抑制する安全で低毒性な医薬とし
て有用である。結合物質と本発明のポリペプチドとの結
合力を増強する物質は、本発明のポリペプチド等に対す
る結合物質が有する生理活性を増強するための安全で低
毒性な医薬として有用である。結合物質と本発明のポリ
ペプチドとの結合力を減少させる物質は、本発明のポリ
ペプチド等に対する結合物質が有する生理活性を減少さ
せるための安全で低毒性な医薬として有用である。

【０２１２】本発明のポリペプチドまたはその部分ペプ
チドの発現量を変化させる物質を含有する各種疾病の予
防および／または治療剤本発明のポリペプチドは前述の
とおり、例えば中枢機能など生体内で何らかの重要な役
割を果たしていると考えられる。従って、本発明のポリ
ペプチドまたはその部分ペプチドの発現量を変化させる
物質は、本発明のポリペプチドの機能不全に関連する疾
患の予防および／または治療剤として用いることができ
る。本発明の物質を本発明のポリペプチドの機能不全に
関連する疾患の予防および／または治療剤として使用す
る場合は、常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、本発明の物質は、必要に応じて糖衣を施した錠
剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤な
どとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学
的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤など
の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、本発明
の物質を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦
形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに
一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で
混和することによって製造することができる。これら製
剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が
得られるようにするものである。

【０２１３】錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って
処方することができる。注射用の水性液としては、例え
ば、生理食塩水、ブドウ糖またはその他の補助薬を含む
等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトー
ル、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解
補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリ
アルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレン
グリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベ
ート８０^TM、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油
性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いら
れ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアル
コールなどと併用してもよい。

【０２１４】また、上記予防剤および治療剤は、例え
ば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム
緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、
塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アル
ブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例え
ば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止
剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適
当なアンプルに充填される。このようにして得られる製
剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳
動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブ
タ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与するこ
とができる。本発明の物質またはその塩の投与量は、投
与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあ
るが、経口投与の場合、一般的に例えば、高血圧症患者
（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜
１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ま
しくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する
場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、
投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形
では通常例えば、高血圧症患者（６０ｋｇとして）にお
いては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好まし
くは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１
〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合で
ある。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量
を投与することができる。投与量または投与回数は、目
的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等
により異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜
８ｍｇ／ｋｇである。

【０２１５】

【実施例】以下実施例を示す。遺伝子操作的手法とし
て、特に断らない限りモレキュラー・クローニング第２
版に記載された方法を用いた。以下の実施例は、本発明
の例示の目的でのみ提供され、決して限定を意図しない
ことを付記する。

【０２１６】（実施例１ｐｓ２０と相同性を有する新
規ポリペプチド（１４Ｂ２）をコードするｃＤＮＡのク
ローニング）ラット脳より、ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製の
ＴＲＩｚｏｌ試薬（商品番号１５５９−０２６）を用い
て、その処方に従い全ＲＮＡを抽出し、５００μｇの全
ＲＮＡを得た。この全ＲＮＡより、アマシャムファルマ
シアバイオテク社製ＱｕｉｃｋＰｒｅｐＭｉｃｒｏ
ｍＲＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（商品番
号２７−９２５５−０１）のオリゴ（ｄＴ）セルロース
カラムを用いて４μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを得た。こ
のポリ（Ａ）＋ＲＮＡ３μｇをオリゴ（ｄＴ）プライマ
ーおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＭＭＬＶＲ
ＮａｓｅＨ−逆転写酵素（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）
を用いて第一鎖（ｆｉｒｓｔｓｔｒａｎｄ）ＤＮＡ
を合成した後、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒ
ａｓｅＩ、ＲＮａｓｅＨを用いて第二鎖（ｓｅｃｏ
ｎｄｓｔｒａｎｄ）ＤＮＡを合成し、ポリ（Ａ）＋Ｒ
ＮＡから２本鎖ｃＤＮＡを得た。この２本鎖ＤＮＡを
Ｔ４ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＧＩＢＣＯＢＲ
Ｌ社製）で処理し末端を平滑化した後、ＥｃｏＲＩアダ
プター（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）を付加した。この両
末端にＥｃｏＲＩアダプターが付加された２本鎖ＤＮＡ
にＴ４ポリヌクレオチドキナ−ゼ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ
社製）を用いてＥｃｏＲＩアダプターにリン酸基を導入
した。このｃＤＮＡを、ゲル濾過によって約４００ｂｐ
以下のｃＤＮＡを除去し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＧＩＢ
ＣＯＢＲＬ社製）を用いてプラスミドベクターである
ｐＳｐｏｒｔＩ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）に組み込ん
だ。この組み換え体プラスミドＤＮＡをエタノール沈澱
後、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および１
ｍＭＥＤＴＡ（エチレンジアミン４酢酸ナトリウム）か
らなる緩衝液（以下、ＴＥ緩衝液と略記する）２０μｌ
に溶解した。その溶解液を用い、エレクトロポーレーシ
ョン法［ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１
６，６１２７（１９８８）］により大腸菌ＤＨ１０Ｂ株
（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）を形質転換し、約１００万
個のアンピシリン耐性を有する形質転換体を取得し、ｃ
ＤＮＡライブラリー（挿入率９５％）を作製した。こ
のｃＤＮＡライブラリーを有する大腸菌ＤＨ１０Ｂ株
を、公知の方法［モレキュラー・クローニング第２版］
に従ってＬＢプレート上に生育させ、生えてきた約１０
００個のコロニーより、キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）社
製のプラスミド調製キットであるＱＩＡｐｒｅｐＳｐ
ｉｎＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（商品番号２７１０
４）を用いてプラスミドを調製した。

【０２１７】得られた１０００個の上記プラスミドの塩
基配列を解析し、既知のｐｓ２０のアミノ酸配列とホモ
ロジーを有するが完全には一致しないアミノ酸配列（配
列番号８）をコードするＤＮＡ断片（配列番号７）を有
するプラスミドを選択した。サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）
らのジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）］により、
ＤＹＥｎａｍｉｃＥＴｄｙｅｔｅｒｍｉｎａｔｏ
ｒｋｉｔ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）
を用いて、そのプラスミドに挿入されているｃＤＮＡの
塩基配列をメガベースＤＮＡシークエンサー（アマシャ
ムファルマシアバイオテク社製）を用いて決定した。ｐ
ｓ２０との比較のためのアミノ酸配列の至適アラインメ
ントは、遺伝子情報処理ソフトウェアであるＧＥＮＥＴ
ＹＸ（ソフトウェア株式会社製）を用いて、Ｌｉｐｍａ
ｎ− Ｐｅａｒｓｏｎ法Ｓｃｉｎｅｎｃｅ．２２７：
１４３５−１４４１（１９８５）により実施した。その
プラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造）で消化した
後、キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）社製のＤＮＡ調製キッ
トであるＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉ
ｏｎＫｉｔ（商品番号２８７０６）等を用いて挿入さ
れているｃＤＮＡ断片を得た。

【０２１８】ヒト胎児脳ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（Ｃｌｏｎ
ｔｅｃｈ社）５μｇをＮｏｔＩ部位を有するオリゴヌ
クレオチド（ＧＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＴＣＧＣＧＡ
ＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣ（Ｔ）１５）（ＧＩＢＣＯＢＲ
Ｌ社製）とＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＭＭＬＶ
ＲＮａｓｅＨ−逆転写酵素（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社
製）を用いて第一鎖（ｆｉｒｓｔｓｔｒａｎｄ）ＤＮ
Ａを合成した後、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡｐｏｌｙｍ
ｅｒａｓｅＩ、ＲＮａｓｅＨを用いて第二鎖（ｓｅ
ｃｏｎｄｓｔｒａｎｄ）ＤＮＡを合成し、ポリ
（Ａ）＋ＲＮＡから２本鎖ｃＤＮＡを得た。この２本鎖
ＤＮＡをＴ４ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＧＩＢＣ
ＯＢＲＬ社製）で処理し末端を平滑化した後、Ｓａｌ
Ｉ部位を有するアダプター（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）
を付加した。その後、ＮｏｔＩ消化し、１％濃度の低融
解アガロース電気泳動により、３ｋｂ以上のＤＮＡ断片
を精製した。精製ｃＤＮＡ断片を、ＳａｌＩ−ＮｏｔＩ
制限酵素処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ
＋プラスミドとライゲーションした。大腸菌Ｅｌｅｃ
ｔｒｏＭａｘＤＨ１０Ｂ株（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）
にエレクトロポレーション法を用いてこの組換えプラス
ミドを導入した。次いで、こうして構築したｃＤＮＡラ
イブラリーから、約３４，０００個の組換え体を選択
し、これらクローンの両末端ＤＮＡ配列を決定した。

【０２１９】得られた個々のそのプラスミドの塩基配列
を解析し、ｐｓ２０のアミノ酸配列とホモロジーを有す
るが完全には一致しないアミノ酸配列をコードするラッ
トＤＮＡ断片（配列番号７）と強い相同性を有するＤＮ
Ａ断片を持つプラスミドを選択した。サンガー（Ｓａｎ
ｇｅｒ）らのジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）］
により、ＤＹＥｎａｍｉｃＥＴｄｙｅｔｅｒｍｉ
ｎａｔｏｒｋｉｔ（アマシャムファルマシアバイオテ
ク社製）を用いて、そのプラスミドに挿入されているｃ
ＤＮＡの塩基配列をメガベースＤＮＡシークエンサー
（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて決
定した。ｐｓ２０との比較のためのアミノ酸配列の至適
アラインメントは、遺伝子情報処理ソフトウェアである
ＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウェア株式会社製）を用いて、
Ｌｉｐｍａｎ− Ｐｅａｒｓｏｎ法Ｓｃｉｎｅｎｃ
ｅ．２２７：１４３５−１４４１（１９８５）により実
施した。

【０２２０】取得されたプラスミドが有するｃＤＮＡの
塩基配列は、ＤＹＥｎａｍｉｃＥＴｄｙｅｔｅｒ
ｍｉｎａｔｏｒｋｉｔ（アマシャムファルマシアバイ
オテク社製）を用いて、ＭｅｇａＢａｓｅＤＮＡシーク
エンサー（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に
より決定した。このｃＤＮＡ（配列番号１）には５７６
個のアミノ酸よりなるポリペプチド（以下、１４Ｂ２と
呼ぶ）がコードされていた（配列番号２）。１４Ｂ２は
アミノ末端より１位から２７位までの領域が、予想され
るシグナルペプチド領域（ＳＰ，Ｓｉｇｎａｌｐｅｐ
ｔｉｄｅ）である。４２位から９１位にはＷＡＰ領域
が、１３４位から１７５位にはＫａｚａｌ型セリンプロ
テアーゼインヒビター領域が、２２４位から２８９位に
は細胞接着に関与することが知られている免疫グロブリ
ン領域が、３２８位から３７８位および３８６位から４
３６位には２つのＫｕｎｉｔｚ型セリンプロテアーゼイ
ンヒビター領域が、さらに４５５位から５６２位にはＮ
ＴＲ領域が存在した（図１）。ラットの１４Ｂ２のｃＤ
ＮＡ断片の対応する領域のアミノ酸配列と９２％の相同
性を有していることから、ヒト１４Ｂ２であることが示
された。ヒト１４Ｂ２のＷＡＰ領域はヒトのｐｓ２０
のＷＡＰ領域と２６％の相同性を有していた。また、全
体としては、ＷＦＩＫＫＮと類似性が最も高く、５４％
の相同性を有していた。

【０２２１】（実施例２ヒト正常組織における１４Ｂ
２のｍＲＮＡの発現）実施例１に記載のｃＤＮＡ断片
（配列番号１）より２つのＰＣＲ用プライマー（５’−
ＣＡＧＡＴＴＡＧＡＣＡＧＧＣＴＴＧＧＧＡＣ−３’
（配列番号９）および、５’−ＡＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴ
ＣＡＣＧＡＧＴＡＡＣ−３’（配列番号１０））を設計
した。このプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲＥＬＩＳ
Ａ法（ＮａｇａｓｅＴ，ＩｓｈｉｋａｗａＫ，Ｓｕ
ｙａｍａＭ，ＫｉｋｕｎｏＲ，Ｍｉｙａｊｉｍａ
Ｎ，ＴａｎａｋａＡ，ＫｏｔａｎｉＨ，Ｎｏｍｕｒ
ａＮ，ＯｈａｒａＯ，ＤＮＡＲｅｓ．１９９８
５；２７７−２８６）を行い、ヒト組織での発現プロフ
ァイルを解析した。各種ヒト組織由来のポリ（Ａ）＋Ｒ
ＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）より、ランダムプライマー
（ＴａＫａＲａ）とＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＭ
ＭＬＶＲＮａｓｅＨ− 逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ
ＢＲＬ社製）を用いて第一鎖（ｆｉｒｓｔｓｔｒａｎ
ｄ）ＤＮＡを合成し、ＲＴ−ＰＣＲの鋳型とした。その
結果、１４Ｂ２のｍＲＮＡは、卵巣で特に強い発現が認
められた。その他、骨格筋、精巣、脊髄、脳では、海馬
において強い発現が認められた。さらに、胎児期には、
脳において強い発現が観察された（図２）。

【０２２２】（実施例３ヒト癌組織における１４Ｂ２
のｍＲＮＡの発現）ヒト由来各種臓器の正常組織および
腫瘍組織における当該遺伝子の発現量の違いについて、
ＭａｔｃｈｅｄＴｕｍｏｒ／ＮｏｒｍａｌＥｘｐｒ
ｅｓｓｉｏｎＡｒｒａｙ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用
いて解析した。このドット・ブロット膜はヒトのガン患
者由来組織とそれぞれの組織に対応した同一患者の正常
組織から抽出したトータルＲＮＡをナイロン膜にスポッ
トしたものである。このナイロン膜を、０．５Ｍ燐酸バ
ッファー（ｐＨ７．２）、１％ウシ血清アルブミン、１
ｍＭＥＤＴＡ、７％ＳＤＳからなるハイブリダイゼー
ション・バッファーに浸し、６５℃で１時間、予備ハイ
ブリダイゼーションを行った。次に、実施例１に記載の
ｃＤＮＡ断片（配列番号１）５０ｎｇを、［α−
³²Ｐ］ｄＣＴＰ（６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ，２０ｍＣ
ｉ／ｍｌ）（ＮＥＮ社）を用いてＲｅｄｉｐｒｉｍｅ
ＩＩＤＮＡＬａｂｅｌｌｉｎｇＳｙｓｔｅｍ
（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を使用し
て、その処方に従い³²Ｐ標識した。³²Ｐ標識当該遺伝子
ｃＤＮＡ断片をプローブとして同バッファーに加えた液
にナイロン膜を移し、６５℃で１６時間ハイブリダイゼ
ーションを行った。引続きこのナイロン膜を２ｘＳＳＣ
で室温で５分濯いだ後、１ｘＳＳＣで５０℃で３０分、
０．５ｘＳＳＣで５０℃で３０分洗浄した。風乾後この
ナイロン膜を富士写真フィルム社のイメージング・プレ
ートに密着させ、同社イメージ・アナライザーＦＬＡ３
０００で画像解析を行った。各シグナルの強度を解析
し、それらの標準化には、同ナイロン膜をデハイブリダ
イズ後、ヒト・ユビキチン遺伝子をプローブとして同様
にハイブリダイズさせた場合のシグナル強度によって補
正を行った。こうして得られた標準化シグナル強度につ
いて、正常組織に対する癌組織の割合を求め、当該遺伝
子の各種癌組織における発現量の変化を解析した。その
結果、４人の胃癌患者、２人の子宮癌患者、２人の乳癌
患者で、正常組織と比較して癌組織における１４Ｂ２遺
伝子の発現の増加が観察された（図３）。

【０２２３】（実施例４ラット組織における１４Ｂ２
のｍＲＮＡの発現）ラット各組織より、ＧＩＢＣＯＢ
ＲＬ社製のＴＲＩｚｏｌ試薬（商品番号１５５９−０２
６）を用いて、その処方に従い全ＲＮＡを抽出し、５０
μｇの全ＲＮＡを得た。このＲＮＡ１μｇを用いて、Ｃ
ｌｏｎｔｅｃｈ社製のＡｄｖａｎｔａｇｅＲＴｆｏ
ｒＰＣＲｋｉｔ（商品番号Ｋ１４０２−２）を用い
てｃＤＮＡを合成した。次に、実施例１に記載のｃＤＮ
Ａ断片（配列番号７）を基に、ＴａｑＭａｎ用のプライ
マーおよびプローブ検索ソフトＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒ
ｅｓｓ（ＡＢＩ社製）によりプライマーとプローブを選
択した。プローブとプライマーはＡＢＩ社に合成を依頼
した。このプライマーおよびプローブを用いて、合成し
たｃＤＮＡを鋳型としてＴａｑＭａｎ反応を行い、ｍＲ
ＮＡ量を定量した。反応試薬としてはＧＩＢＣＯＢＲ
Ｌ社製のＰｌａｔｉｎｕｍＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ
ＰＣＲＳｕｐｅｒＭｉｘ−ＵＤＧ（商品番号１１
７３０−０２５）を用いて、５０℃で２分、９５℃で２
分反応した後、９５℃で２分および６０℃で１分の反応
を４０回行って提唱した。その結果１４Ｂ２のはラット
においては、脳、骨格筋、精巣、胸腺で強く発現してい
た。（図４）。

【０２２４】（実施例５ラット脳虚血における１４Ｂ
２のｍＲＮＡの発現）ラット中大動脈閉塞（ｍｉｄｄｌ
ｅｃｅｒｅｂｒａｌａｒｔｅｒｙｏｃｃｌｕｓｉ
ｏｎ：ＭＣＡＯ）再灌流モデルの作製は、小泉［脳卒
中，８，１（１９８６）］およびＮａｇａｓａｗａ［Ｓ
ｔｒｏｋｅ，２０，１０３７（１９８９）］らの方法に
従い行った。雄性Ｗｉｓｔａｒラット（１０週齢、日本
エスエルシー社）を吸入麻酔機（小動物用麻酔機、ＭＯ
ＤＥＬＴＫ−４、バイオマシナリー社製）を用いて４
％（２Ｌ／分）ハロタン（ＦＬＵＯＴＨＡＮＥ、武田薬
品工業株式会社製）で麻酔を導入し、銅板上に背位に固
定後、麻酔状態は２％ハロタンで維持した。動物の頸部
を脱毛消毒し正中線に沿って皮膚を切開、左側頸動脈を
露出し、迷走神経を傷つけないように剥離を行った。外
頸動脈を止血切除後、頸動脈の一部を切開し、内頸動脈
内へ栓子［長さ２２ｍｍの歯科用ナイロン糸（Ｎｏ．４
−０）の約半分に、歯科用精密印象材ＸＡＮＴＯＰＲＥ
ＮＭ（ＢａｙｅｒＤｅｎｔａｌ）を塗布し、室温乾
燥する。実験には直径０．３５−０．４５ｍｍのものを
用いる］を挿入し、糸で頸動脈とともに結紮後、皮膚を
ミッヘル針で仮縫合した。手術は麻酔による体温の低下
を防ぐため、３７℃のホットプレート上で行った。動物
は麻酔から醒めるまでホットプレート上に置き、覚醒後
ホームケージに戻した。閉塞２０分後にラットの尾を持
ち上げ、右前肢で胸部をつかむ動物だけを用いた。１時
間閉塞後、再びハロタン麻酔下でミッヘル針を取り除
き、栓子を引き抜き再灌流を行い、内頸動脈からの止血
を施し、ミッヘル針で縫合後、ホームケージに戻した。
再灌流４時間後にラットを断頭し、速やかに脳を摘出
し、線条体の分画を行なった。ラット線条体より、ＧＩ
ＢＣＯＢＲＬ社製のＴＲＩｚｏｌ試薬（商品番号１５
５９−０２６）を用いて、その処方に従い全ＲＮＡを抽
出し、３０μｇの全ＲＮＡを得た。このＲＮＡ１μｇを
用いて、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製のＡｄｖａｎｔａｇｅ
ＲＴｆｏｒＰＣＲｋｉｔ（商品番号Ｋ１４０２−
２）を用いてｃＤＮＡを合成した。実施例４に記載した
プライマーおよびプローブを用いて、合成したｃＤＮＡ
を鋳型としてＴａｑＭａｎ反応を行い、ラット脳虚血に
おける１４Ｂ２のｍＲＮＡの発現量を測定した。その結
果１４Ｂ２はラット線条体において、脳虚血時に発現が
低下していた（図５）。

【０２２５】

【発明の効果】本発明により、胃癌マーカーおよび脳梗
塞マーカーであるｐｓ２０様新規ポリペプチド、本発明
のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、本発明
のＤＮＡが組み込まれた組換え体ベクター、本発明の組
換え体ベクターを保有する形質転換体、本発明のポリペ
プチドの製造法、本発明のポリペプチドを認識する抗
体、本発明の抗体を用いる本発明のポリペプチドの定量
方法、本発明のポリペプチドのｍＲＮＡの定量方法、本
発明のポリぺプチドに対する結合物質のスクリーニング
方法、本発明のポリぺプチドと結合物質との結合性を変
化させる物質のスクリーニング方法、本発明のポリぺプ
チドの発現を変動させる物質のスクリーニング方法、ノ
ックアウト動物、トランスジェニック動物、癌診断用キ
ットおよび本発明の抗体、結合物質、結合物質との結合
性を変化させる物質、または発現を変動させる物質を含
有する医薬が提供される。

【０２２６】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Shionogi <120> The novel protease inhibito rprotein and DNA thereof <130> J1-01137397 <140> none <141> 2001-09-26 <160> 10 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 3251 <212> DNA <213> Rattus sp. <220> <221> CDS <222> (194)..(1921) <400> 1 aagccgcaca gcccggcagg ctgtgctgac ttggtggagg cagcagcggc agagcagcct 60 gagcagcagc ctgagcagga aacctgctgg ggtggggagg gcaggtgtct gcagcccctg 120 agaagaaggc cctggtgggc cccagaccct ggcatcgttt caggggaggt ctctagccgc 180 cccagcctgc acc atg tgg gcc cca agg tgt cgc cgg ttc tgg tct cgc 229 Met Trp Ala Pro Arg Cys Arg Arg Phe Trp Ser Arg 1 5 10 tgg gag cag gtg gca gcg ctg ctg ctg ctg ctg cta ctg ctc ggg gtg 277 Trp Glu Gln Val Ala Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val 15 20 25 ccc ccg cga agc ctg gcg ctg ccg ccc atc cgc tat tcc cac gcc ggc 325 Pro Pro Arg Ser Leu Ala Leu Pro Pro Ile Arg Tyr Ser His Ala Gly 30 35 40 atc tgc ccc aac gac atg aat ccc aac ctc tgg gtg gac gca cag agc 373 Ile Cys Pro Asn Asp Met Asn Pro Asn Leu Trp Val Asp Ala Gln Ser 45 50 55 60 acc tgc agg cgg gag tgt gag acg gac cag gag tgt gag acc tat gag 421 Thr Cys Arg Arg Glu Cys Glu Thr Asp Gln Glu Cys Glu Thr Tyr Glu 65 70 75 aag tgc tgc ccc aac gta tgt ggg acc aag agc tgc gtg gcg gcc cgc 469 Lys Cys Cys Pro Asn Val Cys Gly Thr Lys Ser Cys Val Ala Ala Arg 80 85 90 tac atg gac gtg aaa ggg aag aag ggc cca gtg ggc atg ccc aag gag 517 Tyr Met Asp Val Lys Gly Lys Lys Gly Pro Val Gly Met Pro Lys Glu 95 100 105 gcc aca tgt gac cac ttc atg tgt ctg cag cag ggc tct gag tgt gac 565 Ala Thr Cys Asp His Phe Met Cys Leu Gln Gln Gly Ser Glu Cys Asp 110 115 120 atc tgg gat ggc cag ccc gtg tgt aag tgc aaa gac cgc tgt gag aag 613 Ile Trp Asp Gly Gln Pro Val Cys Lys Cys Lys Asp Arg Cys Glu Lys 125 130 135 140 gag ccc agc ttt acc tgc gcc tcg gac ggc ctc acc tac tat aac cgc 661 Glu Pro Ser Phe Thr Cys Ala Ser Asp Gly Leu Thr Tyr Tyr Asn Arg 145 150 155 tgc tac atg gat gcc gag gcc tgc tcc aaa ggc atc aca ctg gcc gtt 709 Cys Tyr Met Asp Ala Glu Ala Cys Ser Lys Gly Ile Thr Leu Ala Val 160 165 170 gta acc tgc cgc tat cac ttc acc tgg ccc aac acc agc ccc cca cca 757 Val Thr Cys Arg Tyr His Phe Thr Trp Pro Asn Thr Ser Pro Pro Pro 175 180 185 cct gag acc acc atg cac ccc acc aca gcc tcc cca gag acc cct gag 805 Pro Glu Thr Thr Met His Pro Thr Thr Ala Ser Pro Glu Thr Pro Glu 190 195 200 ctg gac atg gcg gcc cct gcg ctg ctc aac aac cct gtg cac cag tcg 853 Leu Asp Met Ala Ala Pro Ala Leu Leu Asn Asn Pro Val His Gln Ser 205 210 215 220 gtc acc atg ggt gag aca gtg agt ttc ctc tgt gat gtg gtg ggc cgg 901 Val Thr Met Gly Glu Thr Val Ser Phe Leu Cys Asp Val Val Gly Arg 225 230 235 ccc cgg cct gag atc acc tgg gag aag cag ttg gag gat cgg gag aat 949 Pro Arg Pro Glu Ile Thr Trp Glu Lys Gln Leu Glu Asp Arg Glu Asn 240 245 250 gtg gtc atg cgg ccc aac cat gtg cgt ggc aac gtg gtg gtc acc aac 997 Val Val Met Arg Pro Asn His Val Arg Gly Asn Val Val Val Thr Asn 255 260 265 att gcc cag ctg gtc atc tat aac gcc cag ctg cag gat gct ggg atc 1045 Ile Ala Gln Leu Val Ile Tyr Asn Ala Gln Leu Gln Asp Ala Gly Ile 270 275 280 tac acc tgc acg gcc cgg aac gtg gct ggg gtc ctg agg gct gat ttc 1093 Tyr Thr Cys Thr Ala Arg Asn Val Ala Gly Val Leu Arg Ala Asp Phe 285 290 295 300 ccg ctg tcg gtg gtc agg ggt cat cag gct gca gcc acc tca gag agc 1141 Pro Leu Ser Val Val Arg Gly His Gln Ala Ala Ala Thr Ser Glu Ser 305 310 315 agc ccc aat ggc acg gct ttc ccg gcg gcc gag tgc ctg aag ccc cca 1189 Ser Pro Asn Gly Thr Ala Phe Pro Ala Ala Glu Cys Leu Lys Pro Pro 320 325 330 gac agt gag gac tgt ggc gaa gag cag acc cgc tgg cac ttc gat gcc 1237 Asp Ser Glu Asp Cys Gly Glu Glu Gln Thr Arg Trp His Phe Asp Ala 335 340 345 cag gcc aac aac tgc ctg acc ttc acc ttc ggc cac tgc cac cgt aac 1285 Gln Ala Asn Asn Cys Leu Thr Phe Thr Phe Gly His Cys His Arg Asn 350 355 360 ctc aac cac ttt gag acc tat gag gcc tgc atg ctg gcc tgc atg agc 1333 Leu Asn His Phe Glu Thr Tyr Glu Ala Cys Met Leu Ala Cys Met Ser 365 370 375 380 ggg ccg ctg gcc gcg tgc agc ctg ccc gcc ctg cag ggg ccc tgc aaa 1381 Gly Pro Leu Ala Ala Cys Ser Leu Pro Ala Leu Gln Gly Pro Cys Lys 385 390 395 gcc tac gcg cct cgc tgg gct tac aac agc cag acg ggc cag tgc cag 1429 Ala Tyr Ala Pro Arg Trp Ala Tyr Asn Ser Gln Thr Gly Gln Cys Gln 400 405 410 tcc ttt gtc tat ggt ggc tgc gag ggc aat ggc aac aac ttt gag agc 1477 Ser Phe Val Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gly Asn Asn Phe Glu Ser 415 420 425 cgt gag gcc tgt gag gag tcg tgc ccc ttc ccc agg ggg aac cag cgc 1525 Arg Glu Ala Cys Glu Glu Ser Cys Pro Phe Pro Arg Gly Asn Gln Arg 430 435 440 tgt cgg gcc tgc aag cct cgg cag aag ctc gtt acc agc ttc tgt cgc 1573 Cys Arg Ala Cys Lys Pro Arg Gln Lys Leu Val Thr Ser Phe Cys Arg 445 450 455 460 agc gac ttt gtc atc ctg ggc cga gtc tct gag ctg acc gag gag cct 1621 Ser Asp Phe Val Ile Leu Gly Arg Val Ser Glu Leu Thr Glu Glu Pro 465 470 475 gac tcg ggc cgc gcc ctg gtg act gtg gat gag gtc cta aag gat gag 1669 Asp Ser Gly Arg Ala Leu Val Thr Val Asp Glu Val Leu Lys Asp Glu 480 485 490 aaa atg ggc ctc aag ttc ctg ggc cag gag cca ttg gag gtc act ctg 1717 Lys Met Gly Leu Lys Phe Leu Gly Gln Glu Pro Leu Glu Val Thr Leu 495 500 505 ctt cac gtg gac tgg gca tgc ccc tgc ccc aac gtg acc gtg agc gag 1765 Leu His Val Asp Trp Ala Cys Pro Cys Pro Asn Val Thr Val Ser Glu 510 515 520 atg ccg ctc atc atc atg ggg gag gtg gac ggc ggc atg gcc atg ctg 1813 Met Pro Leu Ile Ile Met Gly Glu Val Asp Gly Gly Met Ala Met Leu 525 530 535 540 cgc ccc gat agc ttt gtg ggc gca tcg agt gcc cgc cgg gtc agg aag 1861 Arg Pro Asp Ser Phe Val Gly Ala Ser Ser Ala Arg Arg Val Arg Lys 545 550 555 ctt cgt gag gtc atg cac aag aag acc tgt gac gtc ctc aag gag ttt 1909 Leu Arg Glu Val Met His Lys Lys Thr Cys Asp Val Leu Lys Glu Phe 560 565 570 ctt ggc ttg cac tgaagccccc cacccctccc tgccccctcc ctggccttct 1961 Leu Gly Leu His 575 tccacctatc caccccaatg cctctcagca aactgggcga ggtcagatta gacaggcttg 2021 ggacagcagg gaaacatcaa ccgacgtgtc acagaaaaag ccacagaagg tctcagatca 2081 gcatctattc tttgggttca ataaggggtt catatctttt ttagctgagg gggacaagag 2141 gagaagtcag tggacacatg gaagttactc gtgaccacca gcttgctcag atattctcct 2201 cctcccctca ctggccccac acccctggct ctcccagtca ccctccccta gccagtctcc 2261 cagcaagggt ttaagagatg gccgctgtgt gctggtcaca ggaagtgttg aatggattgg 2321 cttgcaaagg gggtaggtgg ggagagatag gagggcccag ggactcatgg gacacctttc 2381 ccacagcctc ctcgattgct gtgagcagag gccactcgga gttaggggca tgggcaatag 2441 caagctggcg gcagagtcca gcccagcata tgacttgccc tgaatggaag ctgctgaaac 2501 gggtgccttt gggtggtggt cggcttgcct ctgaggccac cacggcacca gcagaatacg 2561 tatttcttct ccttggctgc attggtttgt cgatctagtt cagttcaact cagtggatgt 2621 tctctgaatg cttactgggt gccaggacca cagagagatg ttagtcactg cccagttctt 2681 agagccccaa cacagatacc ctcatcccag ggcccccaga cacacccctc cgctggactc 2741 acaactgtct ggagtttctg tctgatggat ggtgtgcttt catatgccac tggcttcctt 2801 ggacatagat cagacaaaag ccccgggatc tgtttggtag caggagaaat gaaggaagat 2861 gaaaaagcag gcagggaagg gggtagtaaa ggactgagag aggagggagg tggctggaga 2921 aggaaaagga acattgctcg atgctcccat ctggtggcgg cctcaggaac ccacgggaac 2981 ctggaaggag gctctttgtg agacctgggc aaaggatggg gcagctcgtc gatgattttt 3041 ttgtgtttcc aggcttcctg tgtgatcctg gccctccggc cgctagagag aggattggga 3101 aaccccactg tcagctctgc atctgccccc actaccctcc tctgccctat tctgtccctg 3161 cccctccaag ctgaagaagg tccttgtggg gcgtcctcat ttcttcctca aatataagga 3221 ggaagatacc aattaaaagc tcatagtatc 3251 <210> 2 <211> 576 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 2 Met Trp Ala Pro Arg Cys Arg Arg Phe Trp Ser Arg Trp Glu Gln Val 1 5 10 15 Ala Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Pro Pro Arg Ser 20 25 30 Leu Ala Leu Pro Pro Ile Arg Tyr Ser His Ala Gly Ile Cys Pro Asn 35 40 45 Asp Met Asn Pro Asn Leu Trp Val Asp Ala Gln Ser Thr Cys Arg Arg 50 55 60 Glu Cys Glu Thr Asp Gln Glu Cys Glu Thr Tyr Glu Lys Cys Cys Pro 65 70 75 80 Asn Val Cys Gly Thr Lys Ser Cys Val Ala Ala Arg Tyr Met Asp Val 85 90 95 Lys Gly Lys Lys Gly Pro Val Gly Met Pro Lys Glu Ala Thr Cys Asp 100 105 110 His Phe Met Cys Leu Gln Gln Gly Ser Glu Cys Asp Ile Trp Asp Gly 115 120 125 Gln Pro Val Cys Lys Cys Lys Asp Arg Cys Glu Lys Glu Pro Ser Phe 130 135 140 Thr Cys Ala Ser Asp Gly Leu Thr Tyr Tyr Asn Arg Cys Tyr Met Asp 145 150 155 160 Ala Glu Ala Cys Ser Lys Gly Ile Thr Leu Ala Val Val Thr Cys Arg 165 170 175 Tyr His Phe Thr Trp Pro Asn Thr Ser Pro Pro Pro Pro Glu Thr Thr 180 185 190 Met His Pro Thr Thr Ala Ser Pro Glu Thr Pro Glu Leu Asp Met Ala 195 200 205 Ala Pro Ala Leu Leu Asn Asn Pro Val His Gln Ser Val Thr Met Gly 210 215 220 Glu Thr Val Ser Phe Leu Cys Asp Val Val Gly Arg Pro Arg Pro Glu 225 230 235 240 Ile Thr Trp Glu Lys Gln Leu Glu Asp Arg Glu Asn Val Val Met Arg 245 250 255 Pro Asn His Val Arg Gly Asn Val Val Val Thr Asn Ile Ala Gln Leu 260 265 270 Val Ile Tyr Asn Ala Gln Leu Gln Asp Ala Gly Ile Tyr Thr Cys Thr 275 280 285 Ala Arg Asn Val Ala Gly Val Leu Arg Ala Asp Phe Pro Leu Ser Val 290 295 300 Val Arg Gly His Gln Ala Ala Ala Thr Ser Glu Ser Ser Pro Asn Gly 305 310 315 320 Thr Ala Phe Pro Ala Ala Glu Cys Leu Lys Pro Pro Asp Ser Glu Asp 325 330 335 Cys Gly Glu Glu Gln Thr Arg Trp His Phe Asp Ala Gln Ala Asn Asn 340 345 350 Cys Leu Thr Phe Thr Phe Gly His Cys His Arg Asn Leu Asn His Phe 355 360 365 Glu Thr Tyr Glu Ala Cys Met Leu Ala Cys Met Ser Gly Pro Leu Ala 370 375 380 Ala Cys Ser Leu Pro Ala Leu Gln Gly Pro Cys Lys Ala Tyr Ala Pro 385 390 395 400 Arg Trp Ala Tyr Asn Ser Gln Thr Gly Gln Cys Gln Ser Phe Val Tyr 405 410 415 Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gly Asn Asn Phe Glu Ser Arg Glu Ala Cys 420 425 430 Glu Glu Ser Cys Pro Phe Pro Arg Gly Asn Gln Arg Cys Arg Ala Cys 435 440 445 Lys Pro Arg Gln Lys Leu Val Thr Ser Phe Cys Arg Ser Asp Phe Val 450 455 460 Ile Leu Gly Arg Val Ser Glu Leu Thr Glu Glu Pro Asp Ser Gly Arg 465 470 475 480 Ala Leu Val Thr Val Asp Glu Val Leu Lys Asp Glu Lys Met Gly Leu 485 490 495 Lys Phe Leu Gly Gln Glu Pro Leu Glu Val Thr Leu Leu His Val Asp 500 505 510 Trp Ala Cys Pro Cys Pro Asn Val Thr Val Ser Glu Met Pro Leu Ile 515 520 525 Ile Met Gly Glu Val Asp Gly Gly Met Ala Met Leu Arg Pro Asp Ser 530 535 540 Phe Val Gly Ala Ser Ser Ala Arg Arg Val Arg Lys Leu Arg Glu Val 545 550 555 560 Met His Lys Lys Thr Cys Asp Val Leu Lys Glu Phe Leu Gly Leu His 565 570 575 <210> 3 <211> 1728 <212> DNA <213> Rattus sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1728) <400> 3 atg tgg gcc cca agg tgt cgc cgg ttc tgg tct cgc tgg gag cag gtg 48 Met Trp Ala Pro Arg Cys Arg Arg Phe Trp Ser Arg Trp Glu Gln Val 1 5 10 15 gca gcg ctg ctg ctg ctg ctg cta ctg ctc ggg gtg ccc ccg cga agc 96 Ala Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Pro Pro Arg Ser 20 25 30 ctg gcg ctg ccg ccc atc cgc tat tcc cac gcc ggc atc tgc ccc aac 144 Leu Ala Leu Pro Pro Ile Arg Tyr Ser His Ala Gly Ile Cys Pro Asn 35 40 45 gac atg aat ccc aac ctc tgg gtg gac gca cag agc acc tgc agg cgg 192 Asp Met Asn Pro Asn Leu Trp Val Asp Ala Gln Ser Thr Cys Arg Arg 50 55 60 gag tgt gag acg gac cag gag tgt gag acc tat gag aag tgc tgc ccc 240 Glu Cys Glu Thr Asp Gln Glu Cys Glu Thr Tyr Glu Lys Cys Cys Pro 65 70 75 80 aac gta tgt ggg acc aag agc tgc gtg gcg gcc cgc tac atg gac gtg 288 Asn Val Cys Gly Thr Lys Ser Cys Val Ala Ala Arg Tyr Met Asp Val 85 90 95 aaa ggg aag aag ggc cca gtg ggc atg ccc aag gag gcc aca tgt gac 336 Lys Gly Lys Lys Gly Pro Val Gly Met Pro Lys Glu Ala Thr Cys Asp 100 105 110 cac ttc atg tgt ctg cag cag ggc tct gag tgt gac atc tgg gat ggc 384 His Phe Met Cys Leu Gln Gln Gly Ser Glu Cys Asp Ile Trp Asp Gly 115 120 125 cag ccc gtg tgt aag tgc aaa gac cgc tgt gag aag gag ccc agc ttt 432 Gln Pro Val Cys Lys Cys Lys Asp Arg Cys Glu Lys Glu Pro Ser Phe 130 135 140 acc tgc gcc tcg gac ggc ctc acc tac tat aac cgc tgc tac atg gat 480 Thr Cys Ala Ser Asp Gly Leu Thr Tyr Tyr Asn Arg Cys Tyr Met Asp 145 150 155 160 gcc gag gcc tgc tcc aaa ggc atc aca ctg gcc gtt gta acc tgc cgc 528 Ala Glu Ala Cys Ser Lys Gly Ile Thr Leu Ala Val Val Thr Cys Arg 165 170 175 tat cac ttc acc tgg ccc aac acc agc ccc cca cca cct gag acc acc 576 Tyr His Phe Thr Trp Pro Asn Thr Ser Pro Pro Pro Pro Glu Thr Thr 180 185 190 atg cac ccc acc aca gcc tcc cca gag acc cct gag ctg gac atg gcg 624 Met His Pro Thr Thr Ala Ser Pro Glu Thr Pro Glu Leu Asp Met Ala 195 200 205 gcc cct gcg ctg ctc aac aac cct gtg cac cag tcg gtc acc atg ggt 672 Ala Pro Ala Leu Leu Asn Asn Pro Val His Gln Ser Val Thr Met Gly 210 215 220 gag aca gtg agt ttc ctc tgt gat gtg gtg ggc cgg ccc cgg cct gag 720 Glu Thr Val Ser Phe Leu Cys Asp Val Val Gly Arg Pro Arg Pro Glu 225 230 235 240 atc acc tgg gag aag cag ttg gag gat cgg gag aat gtg gtc atg cgg 768 Ile Thr Trp Glu Lys Gln Leu Glu Asp Arg Glu Asn Val Val Met Arg 245 250 255 ccc aac cat gtg cgt ggc aac gtg gtg gtc acc aac att gcc cag ctg 816 Pro Asn His Val Arg Gly Asn Val Val Val Thr Asn Ile Ala Gln Leu 260 265 270 gtc atc tat aac gcc cag ctg cag gat gct ggg atc tac acc tgc acg 864 Val Ile Tyr Asn Ala Gln Leu Gln Asp Ala Gly Ile Tyr Thr Cys Thr 275 280 285 gcc cgg aac gtg gct ggg gtc ctg agg gct gat ttc ccg ctg tcg gtg 912 Ala Arg Asn Val Ala Gly Val Leu Arg Ala Asp Phe Pro Leu Ser Val 290 295 300 gtc agg ggt cat cag gct gca gcc acc tca gag agc agc ccc aat ggc 960 Val Arg Gly His Gln Ala Ala Ala Thr Ser Glu Ser Ser Pro Asn Gly 305 310 315 320 acg gct ttc ccg gcg gcc gag tgc ctg aag ccc cca gac agt gag gac 1008 Thr Ala Phe Pro Ala Ala Glu Cys Leu Lys Pro Pro Asp Ser Glu Asp 325 330 335 tgt ggc gaa gag cag acc cgc tgg cac ttc gat gcc cag gcc aac aac 1056 Cys Gly Glu Glu Gln Thr Arg Trp His Phe Asp Ala Gln Ala Asn Asn 340 345 350 tgc ctg acc ttc acc ttc ggc cac tgc cac cgt aac ctc aac cac ttt 1104 Cys Leu Thr Phe Thr Phe Gly His Cys His Arg Asn Leu Asn His Phe 355 360 365 gag acc tat gag gcc tgc atg ctg gcc tgc atg agc ggg ccg ctg gcc 1152 Glu Thr Tyr Glu Ala Cys Met Leu Ala Cys Met Ser Gly Pro Leu Ala 370 375 380 gcg tgc agc ctg ccc gcc ctg cag ggg ccc tgc aaa gcc tac gcg cct 1200 Ala Cys Ser Leu Pro Ala Leu Gln Gly Pro Cys Lys Ala Tyr Ala Pro 385 390 395 400 cgc tgg gct tac aac agc cag acg ggc cag tgc cag tcc ttt gtc tat 1248 Arg Trp Ala Tyr Asn Ser Gln Thr Gly Gln Cys Gln Ser Phe Val Tyr 405 410 415 ggt ggc tgc gag ggc aat ggc aac aac ttt gag agc cgt gag gcc tgt 1296 Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gly Asn Asn Phe Glu Ser Arg Glu Ala Cys 420 425 430 gag gag tcg tgc ccc ttc ccc agg ggg aac cag cgc tgt cgg gcc tgc 1344 Glu Glu Ser Cys Pro Phe Pro Arg Gly Asn Gln Arg Cys Arg Ala Cys 435 440 445 aag cct cgg cag aag ctc gtt acc agc ttc tgt cgc agc gac ttt gtc 1392 Lys Pro Arg Gln Lys Leu Val Thr Ser Phe Cys Arg Ser Asp Phe Val 450 455 460 atc ctg ggc cga gtc tct gag ctg acc gag gag cct gac tcg ggc cgc 1440 Ile Leu Gly Arg Val Ser Glu Leu Thr Glu Glu Pro Asp Ser Gly Arg 465 470 475 480 gcc ctg gtg act gtg gat gag gtc cta aag gat gag aaa atg ggc ctc 1488 Ala Leu Val Thr Val Asp Glu Val Leu Lys Asp Glu Lys Met Gly Leu 485 490 495 aag ttc ctg ggc cag gag cca ttg gag gtc act ctg ctt cac gtg gac 1536 Lys Phe Leu Gly Gln Glu Pro Leu Glu Val Thr Leu Leu His Val Asp 500 505 510 tgg gca tgc ccc tgc ccc aac gtg acc gtg agc gag atg ccg ctc atc 1584 Trp Ala Cys Pro Cys Pro Asn Val Thr Val Ser Glu Met Pro Leu Ile 515 520 525 atc atg ggg gag gtg gac ggc ggc atg gcc atg ctg cgc ccc gat agc 1632 Ile Met Gly Glu Val Asp Gly Gly Met Ala Met Leu Arg Pro Asp Ser 530 535 540 ttt gtg ggc gca tcg agt gcc cgc cgg gtc agg aag ctt cgt gag gtc 1680 Phe Val Gly Ala Ser Ser Ala Arg Arg Val Arg Lys Leu Arg Glu Val 545 550 555 560 atg cac aag aag acc tgt gac gtc ctc aag gag ttt ctt ggc ttg cac 1728 Met His Lys Lys Thr Cys Asp Val Leu Lys Glu Phe Leu Gly Leu His 565 570 575 <210> 4 <211> 576 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 4 Met Trp Ala Pro Arg Cys Arg Arg Phe Trp Ser Arg Trp Glu Gln Val 1 5 10 15 Ala Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Pro Pro Arg Ser 20 25 30 Leu Ala Leu Pro Pro Ile Arg Tyr Ser His Ala Gly Ile Cys Pro Asn 35 40 45 Asp Met Asn Pro Asn Leu Trp Val Asp Ala Gln Ser Thr Cys Arg Arg 50 55 60 Glu Cys Glu Thr Asp Gln Glu Cys Glu Thr Tyr Glu Lys Cys Cys Pro 65 70 75 80 Asn Val Cys Gly Thr Lys Ser Cys Val Ala Ala Arg Tyr Met Asp Val 85 90 95 Lys Gly Lys Lys Gly Pro Val Gly Met Pro Lys Glu Ala Thr Cys Asp 100 105 110 His Phe Met Cys Leu Gln Gln Gly Ser Glu Cys Asp Ile Trp Asp Gly 115 120 125 Gln Pro Val Cys Lys Cys Lys Asp Arg Cys Glu Lys Glu Pro Ser Phe 130 135 140 Thr Cys Ala Ser Asp Gly Leu Thr Tyr Tyr Asn Arg Cys Tyr Met Asp 145 150 155 160 Ala Glu Ala Cys Ser Lys Gly Ile Thr Leu Ala Val Val Thr Cys Arg 165 170 175 Tyr His Phe Thr Trp Pro Asn Thr Ser Pro Pro Pro Pro Glu Thr Thr 180 185 190 Met His Pro Thr Thr Ala Ser Pro Glu Thr Pro Glu Leu Asp Met Ala 195 200 205 Ala Pro Ala Leu Leu Asn Asn Pro Val His Gln Ser Val Thr Met Gly 210 215 220 Glu Thr Val Ser Phe Leu Cys Asp Val Val Gly Arg Pro Arg Pro Glu 225 230 235 240 Ile Thr Trp Glu Lys Gln Leu Glu Asp Arg Glu Asn Val Val Met Arg 245 250 255 Pro Asn His Val Arg Gly Asn Val Val Val Thr Asn Ile Ala Gln Leu 260 265 270 Val Ile Tyr Asn Ala Gln Leu Gln Asp Ala Gly Ile Tyr Thr Cys Thr 275 280 285 Ala Arg Asn Val Ala Gly Val Leu Arg Ala Asp Phe Pro Leu Ser Val 290 295 300 Val Arg Gly His Gln Ala Ala Ala Thr Ser Glu Ser Ser Pro Asn Gly 305 310 315 320 Thr Ala Phe Pro Ala Ala Glu Cys Leu Lys 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Leu Arg Pro Asp Ser 530 535 540 Phe Val Gly Ala Ser Ser Ala Arg Arg Val Arg Lys Leu Arg Glu Val 545 550 555 560 Met His Lys Lys Thr Cys Asp Val Leu Lys Glu Phe Leu Gly Leu His 565 570 575 <210> 5 <211> 1647 <212> DNA <213> Rattus sp. <400> 5 gtgcccccgc gaagcctggc gctgccgccc atccgctatt cccacgccgg catctgcccc 60 aacgacatga atcccaacct ctgggtggac gcacagagca cctgcaggcg ggagtgtgag 120 acggaccagg agtgtgagac ctatgagaag tgctgcccca acgtatgtgg gaccaagagc 180 tgcgtggcgg cccgctacat ggacgtgaaa gggaagaagg gcccagtggg catgcccaag 240 gaggccacat gtgaccactt catgtgtctg cagcagggct ctgagtgtga catctgggat 300 ggccagcccg tgtgtaagtg caaagaccgc tgtgagaagg agcccagctt tacctgcgcc 360 tcggacggcc tcacctacta taaccgctgc tacatggatg ccgaggcctg ctccaaaggc 420 atcacactgg ccgttgtaac ctgccgctat cacttcacct ggcccaacac cagcccccca 480 ccacctgaga ccaccatgca ccccaccaca gcctccccag agacccctga gctggacatg 540 gcggcccctg cgctgctcaa caaccctgtg caccagtcgg tcaccatggg tgagacagtg 600 agtttcctct gtgatgtggt gggccggccc cggcctgaga tcacctggga gaagcagttg 660 gaggatcggg agaatgtggt catgcggccc aaccatgtgc gtggcaacgt ggtggtcacc 720 aacattgccc agctggtcat ctataacgcc cagctgcagg atgctgggat ctacacctgc 780 acggcccgga acgtggctgg ggtcctgagg gctgatttcc cgctgtcggt ggtcaggggt 840 catcaggctg cagccacctc agagagcagc cccaatggca cggctttccc ggcggccgag 900 tgcctgaagc ccccagacag tgaggactgt ggcgaagagc agacccgctg gcacttcgat 960 gcccaggcca acaactgcct gaccttcacc ttcggccact gccaccgtaa cctcaaccac 1020 tttgagacct atgaggcctg catgctggcc tgcatgagcg ggccgctggc cgcgtgcagc 1080 ctgcccgccc tgcaggggcc ctgcaaagcc tacgcgcctc gctgggctta caacagccag 1140 acgggccagt gccagtcctt tgtctatggt ggctgcgagg gcaatggcaa caactttgag 1200 agccgtgagg cctgtgagga gtcgtgcccc ttccccaggg ggaaccagcg ctgtcgggcc 1260 tgcaagcctc ggcagaagct cgttaccagc ttctgtcgca gcgactttgt catcctgggc 1320 cgagtctctg agctgaccga ggagcctgac tcgggccgcg ccctggtgac tgtggatgag 1380 gtcctaaagg atgagaaaat gggcctcaag ttcctgggcc aggagccatt ggaggtcact 1440 ctgcttcacg tggactgggc atgcccctgc cccaacgtga ccgtgagcga gatgccgctc 1500 atcatcatgg gggaggtgga cggcggcatg gccatgctgc gccccgatag ctttgtgggc 1560 gcatcgagtg cccgccgggt caggaagctt cgtgaggtca tgcacaagaa gacctgtgac 1620 gtcctcaagg agtttcttgg cttgcac 1647 <210> 6 <211> 549 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 6 Val Pro Pro Arg Ser Leu Ala Leu Pro Pro Ile Arg Tyr Ser His Ala 1 5 10 15 Gly Ile Cys Pro Asn Asp Met Asn Pro Asn Leu Trp Val Asp Ala Gln 20 25 30 Ser Thr Cys Arg Arg Glu Cys Glu Thr Asp Gln Glu Cys Glu Thr Tyr 35 40 45 Glu Lys Cys Cys Pro Asn Val Cys Gly Thr Lys Ser Cys Val Ala Ala 50 55 60 Arg Tyr Met Asp Val Lys Gly Lys Lys Gly Pro Val Gly Met Pro Lys 65 70 75 80 Glu Ala Thr Cys Asp His Phe Met Cys Leu Gln Gln Gly Ser Glu Cys 85 90 95 Asp Ile Trp Asp Gly Gln Pro Val Cys Lys Cys Lys Asp Arg Cys Glu 100 105 110 Lys Glu Pro Ser Phe Thr Cys Ala Ser Asp Gly Leu Thr Tyr Tyr Asn 115 120 125 Arg Cys Tyr Met Asp Ala Glu Ala Cys Ser Lys Gly Ile Thr Leu Ala 130 135 140 Val Val Thr Cys Arg Tyr His Phe Thr Trp Pro Asn Thr Ser Pro Pro 145 150 155 160 Pro Pro Glu Thr Thr Met His Pro Thr Thr Ala Ser Pro Glu Thr Pro 165 170 175 Glu Leu Asp Met Ala Ala Pro Ala Leu Leu Asn Asn Pro Val His Gln 180 185 190 Ser Val Thr Met Gly Glu Thr Val Ser Phe Leu Cys Asp Val Val Gly 195 200 205 Arg Pro Arg Pro Glu Ile Thr Trp Glu Lys Gln Leu Glu Asp Arg Glu 210 215 220 Asn Val Val Met Arg Pro Asn His Val Arg Gly Asn Val Val Val Thr 225 230 235 240 Asn Ile Ala Gln Leu Val Ile Tyr Asn Ala Gln Leu Gln Asp Ala Gly 245 250 255 Ile Tyr Thr Cys Thr Ala Arg Asn Val Ala Gly Val Leu Arg Ala Asp 260 265 270 Phe Pro Leu Ser Val Val Arg Gly His Gln Ala Ala Ala Thr Ser Glu 275 280 285 Ser Ser Pro Asn Gly Thr Ala Phe Pro Ala Ala Glu Cys Leu Lys Pro 290 295 300 Pro Asp Ser Glu Asp Cys Gly Glu Glu Gln Thr Arg Trp His Phe Asp 305 310 315 320 Ala Gln Ala Asn Asn Cys Leu Thr Phe Thr Phe Gly His Cys His Arg 325 330 335 Asn Leu Asn His Phe Glu Thr Tyr Glu Ala Cys Met Leu Ala Cys Met 340 345 350 Ser Gly Pro Leu Ala Ala Cys Ser Leu Pro Ala Leu Gln Gly Pro Cys 355 360 365 Lys Ala Tyr Ala Pro Arg Trp Ala Tyr Asn Ser Gln Thr Gly Gln Cys 370 375 380 Gln Ser Phe Val Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gly Asn Asn Phe Glu 385 390 395 400 Ser Arg Glu Ala Cys Glu Glu Ser Cys Pro Phe Pro Arg Gly Asn Gln 405 410 415 Arg Cys Arg Ala Cys Lys Pro Arg Gln Lys Leu Val Thr Ser Phe Cys 420 425 430 Arg Ser Asp Phe Val Ile Leu Gly Arg Val Ser Glu Leu Thr Glu Glu 435 440 445 Pro Asp Ser Gly Arg Ala Leu Val Thr Val Asp Glu Val Leu Lys Asp 450 455 460 Glu Lys Met Gly Leu Lys Phe Leu Gly Gln Glu Pro Leu Glu Val Thr 465 470 475 480 Leu Leu His Val Asp Trp Ala Cys Pro Cys Pro Asn Val Thr Val Ser 485 490 495 Glu Met Pro Leu Ile Ile Met Gly Glu Val Asp Gly Gly Met Ala Met 500 505 510 Leu Arg Pro Asp Ser Phe Val Gly Ala Ser Ser Ala Arg Arg Val Arg 515 520 525 Lys Leu Arg Glu Val Met His Lys Lys Thr Cys Asp Val Leu Lys Glu 530 535 540 Phe Leu Gly Leu His 545 <210> 7 <211> 1024 <212> DNA <213> Rattus sp. <400> 7 ccagtgtgct ggaagacttg gcggaccagt ccagcagccg aaagccagca agcagcctca 60 gcgaggagac ttgctggggt gaggagggca ggtgttgcca gccctggaga agaagggcct 120 ggtggccctc agcccttggt gtcatcacag gggaaccctc tggctactgc agacagcacc 180 atgtgggccc cagggcatca tcggttctgg ttccactggg ggctgctttt gctgctgctc 240 ctcggggctc cccttcgagg cctagcgctg ccacacatcc gatactccca tgcaggcatc 300 tgccccaacg acatgaaccc caacctctgg gtggatgccc agagcacctg caagcgagag 360 tgtgaaacag accaggaatg tgagacctat gagaagtgct gccccaatgt gtgtgggacc 420 aagagctgcg tagcagcccg ctacatggat gtgaaaggga agaagggccc tgtgggcatg 480 cccaaggagg ccacgtgtga ccatttcatg tgtctgcagc agggctccga gtgtgacatc 540 tgggacggcc agcctgtgtg taagtgtaaa gaccgctgtg agaaggagcc cagcttcacc 600 tgtgcctctg acggccttac ctactacaac cgttgttaca tggacgccga ggcctgctcc 660 aagggcgtca cactgtctgt ggtcacctgc cgctatcact tcacctggcc caacaccagc 720 cctcctccgc ccgagaccac tgtacaccct accaccgcct ctccagagac tctcgggctg 780 gacatggccg ccccggccct gctcaaccac cccgtccatc agtcagtcac tgtgggtgag 840 actgtgagtt tcctctgtga cgtagtaggc aggcctaggc cagagctcac ttgggagaaa 900 cagctggagg atcgagagaa tgtggtcatg agacccaacc acgtgcgtgg taatgtggtg 960 gtcaccaaca tcgcccagct ggtcatctac aatgcgcagc cccaggatgc aggtatatac 1020 acct 1024 <210> 8 <211> 281 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 8 Met Trp Ala Pro Gly His His Arg Phe Trp Phe His Trp Gly Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Leu Gly Ala Pro Leu Arg Gly Leu Ala Leu Pro His 20 25 30 Ile Arg Tyr Ser His Ala Gly Ile Cys Pro Asn Asp Met Asn Pro Asn 35 40 45 Leu Trp Val Asp Ala Gln Ser Thr Cys Lys Arg Glu Cys Glu Thr Asp 50 55 60 Gln Glu Cys Glu Thr Tyr Glu Lys Cys Cys Pro Asn Val Cys Gly Thr 65 70 75 80 Lys Ser Cys Val Ala Ala Arg Tyr Met Asp Val Lys Gly Lys Lys Gly 85 90 95 Pro Val Gly Met Pro Lys Glu Ala Thr Cys Asp His Phe Met Cys Leu 100 105 110 Gln Gln Gly Ser Glu Cys Asp Ile Trp Asp Gly Gln Pro Val Cys Lys 115 120 125 Cys Lys Asp Arg Cys Glu Lys Glu Pro Ser Phe Thr Cys Ala Ser Asp 130 135 140 Gly Leu Thr Tyr Tyr Asn Arg Cys Tyr Met Asp Ala Glu Ala Cys Ser 145 150 155 160 Lys Gly Val Thr Leu Ser Val Val Thr Cys Arg Tyr His Phe Thr Trp 165 170 175 Pro Asn Thr Ser Pro Pro Pro Pro Glu Thr Thr Val His Pro Thr Thr 180 185 190 Ala Ser Pro Glu Thr Leu Gly Leu Asp Met Ala Ala Pro Ala Leu Leu 195 200 205 Asn His Pro Val His Gln Ser Val Thr Val Gly Glu Thr Val Ser Phe 210 215 220 Leu Cys Asp Val Val Gly Arg Pro Arg Pro Glu Leu Thr Trp Glu Lys 225 230 235 240 Gln Leu Glu Asp Arg Glu Asn Val Val Met Arg Pro Asn His Val Arg 245 250 255 Gly Asn Val Val Val Thr Asn Ile Ala Gln Leu Val Ile Tyr Asn Ala 260 265 270 Gln Pro Gln Asp Ala Gly Ile Tyr Thr 275 280 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer <400> 9 cagattagac aggcttggga c 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer <400> 10 aagctggtgg tcacgagtaa c 21

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、１４Ｂ２ポリペプチドの概略図であ
る。１４ポリペプチドは５７６個のアミノ酸よりなる分
泌蛋白質である。アミノ末端より１位から２７位までの
領域が、予想されるシグナルペプチド領域（ＳＰ，Ｓｉ
ｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ）である。４２位から９１位
にはＷＡＰ領域が、１３４位から１７５位にはＫａｚａ
ｌ型セリンプロテアーゼインヒビター領域が、２２４位
から２８９位には細胞接着に関与することが知られてい
る免疫グロブリン領域が、３２８位から３７８位およ
び３８６位から４３６位には２つのＫｕｎｉｔｚ型セリ
ンプロテアーゼインヒビター領域が、さらに４５５位か
ら５６２位にはＮＴＲ領域が存在する。

【図２】図２は、ヒト正常組織における１４Ｂ２ｍＲ
ＮＡの発現である。

【図３】図３は、ヒト癌組織における１４Ｂ２ｍＲＮ
Ａの発現である。

【図４】図４は、ラット正常組織における１４Ｂ２ｍ
ＲＮＡの発現である。

【図５】図５は、ラット脳虚血における１４Ｂ２ｍＲ
ＮＡの発現である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 43/00 １１１４Ｃ０８５ 35/04 Ｃ０７Ｋ 14/47 ４Ｈ０４５ 43/00 １１１ 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/21 16/18 9/99 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 9/99 33/50 ＺＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19 Ｇ０１Ｎ 33/15 1:91 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 5/00 ＢＣ１２Ｒ 1:19）Ａ６１Ｋ 37/64 (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者長瀬隆弘千葉県木更津市矢那1532番３号財団法人かずさディー・エヌ・エー研究所内 (72)発明者菊野玲子千葉県木更津市矢那1532番３号財団法人かずさディー・エヌ・エー研究所内 (72)発明者織田聡大阪府大阪市福島区鷺洲５丁目12番４号塩野義製薬株式会社内 (72)発明者阪口岳滋賀県甲賀郡甲賀町五反田1405番地塩野義製薬株式会社内 (72)発明者島崎淳行大阪府大阪市福島区鷺洲５丁目12番４号塩野義製薬株式会社内Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA36 FB03 4B024 AA01 AA11 BA19 CA04 CA06 DA02 DA06 EA02 EA04 GA11 HA15 4B064 AG23 CA02 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA26X AA90X AA90Y AB01 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 AA14 AA17 BA01 BA02 BA08 BA22 BA23 CA18 DC32 NA14 ZB261 ZC202 4C085 AA13 AA14 BB01 BB22 CC03 DD62 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA45 DA75 EA21 EA28 EA50 EA51 FA72 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）配列番号３に記載の塩基配列または
そのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペ
プチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレ
オチド；（ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１も
しくは数個のアミノ酸が、置換、付加および欠失からな
る群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変
体ポリペプチドであって、生物学的活性を有する改変体
ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；（ｄ）配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡの対
立遺伝子変異体である、ポリヌクレオチド；（ｅ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペ
プチドの種相同体をコードする、ポリヌクレオチド；（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチ
ドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ
生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド；または（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチ
ドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０
％である塩基配列からなり、かつ生物学的活性を有する
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、を含む、
核酸分子。
【請求項２】（ａ）配列番号５に記載の塩基配列または
そのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；（ｂ）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペ
プチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレ
オチド；（ｃ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において、１も
しくは数個のアミノ酸が、置換、付加および欠失からな
る群より選択される少なくとも１つの変異を有し、か
つ、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコード
する、ポリヌクレオチド；（ｄ）配列番号５に記載の塩基配列からなるＤＮＡの対
立遺伝子変異体である、ポリヌクレオチド；（ｅ）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペ
プチドの種相同体をコードする、ポリヌクレオチド；（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチ
ドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ
生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド；または（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチ
ドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０
％である塩基配列からなり、かつ生物学的活性を有する
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、を含む、
核酸分子。
【請求項３】（ａ）配列番号１に記載の塩基配列のう
ち、１９４〜２７４、３１７〜４６６、５９３〜７１
８、８６３〜１０６０、１１７５〜１３２７、１３４９
〜１５０１および１５５６〜１８７９からなる群より選
択される少なくとも１つのドメインを含むポリヌクレオ
チド；（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、１〜２
７、４２〜９１、１３４〜１７５、２２４〜２８９、３
２８〜３７８、３８６〜４３６および４５５〜５６２か
らなる群より選択される少なくとも１つのドメインを含
むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、１〜２
７、４２〜９１、１３４〜１７５、２２４〜２８９、３
２８〜３７８、３８６〜４３６および４５５〜５６２か
らなる群より選択される少なくとも１つのドメインを含
むポリペプチドにおいて、１または数個のアミノ酸が置
換、付加および欠失からなる群より選択される少なくと
も１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有するポリ
ペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；（ｄ）（ａ）において、配列番号１の対立遺伝子変異体
に由来する配列を含む、ポリヌクレオチド；（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、１〜２
７、４２〜９１、１３４〜１７５、２２４〜２８９、３
２８〜３７８、３８６〜４３６および４５５〜５６２か
らなる群より選択される少なくとも１つのドメインを含
むポリペプチドにおいて、配列番号１の種相同体に由来
する配列を含む、ポリヌクレオチド；（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチ
ドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ
生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリ
ヌクレオチド；または（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチ
ドの相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である
塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペ
プチドをコードする、ポリヌクレオチド、を含む、核酸
分子。
【請求項４】単離された核酸分子であって、以下：（ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、少なくとも
８個の連続したフラグメント配列を有するポリヌクレオ
チド；（ｂ）（ａ）に対する同一性が少なくとも７０％であ
る、ポリヌクレオチド；（ｃ）（ａ）または（ｂ）と相補的な塩基配列を有する
ポリヌクレオチド；および（ｄ）（ａ）または（ｂ）において誘導体ヌクレオチド
を含むポリヌクレオチド、からなる群より選択される、
ポリヌクレオチドを含む、核酸分子。
【請求項５】前記同一性が少なくとも８０％であり、
かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードす
る、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項６】請求項１〜５のいずれか１項に記載の核
酸分子がコードする、ポリペプチド。
【請求項７】（ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列ま
たはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１ま
たは数個のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群
より選択される少なくとも１つの変異を有し、かつ、生
物学的活性を有する、ポリペプチド；（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列の対立遺伝子変異体
によってコードされる、ポリペプチド；（ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の種相同体であ
る、ポリペプチド；または（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに
対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を
有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、を
含む、ポリペプチド。
【請求項８】（ａ）配列番号６に記載のアミノ酸配列ま
たはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；（ｂ）配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１ま
たは数個のアミノ酸配列が置換、付加および欠失からな
る群より選択される変異を有し、かつ、生物学的活性を
有する、ポリペプチド；（ｃ）配列番号５に記載の塩基配列の対立遺伝子変異体
によってコードされる、ポリペプチド；（ｄ）配列番号６に記載のアミノ酸配列の種相同体であ
る、ポリペプチド；または（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに
対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を
有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、を
含む、ポリペプチド。
【請求項９】（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の
うち、１〜２７、４２〜９１、１３４〜１７５、２２４
〜２８９、３２８〜３７８、３８６〜４３６および４５
５〜５６２からなる群より選択される少なくとも１つの
ドメイン配列を含む、ポリペプチド；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列ドメイン１〜２７、４
２〜９１、１３４〜１７５、２２４〜２８９、３２８〜
３７８、３８６〜４３６および４５５〜５６２からなる
群より選択される少なくとも１つのドメイン配列を含
み、１または数個のアミノ酸が置換、付加および欠失か
らなる群より選択される少なくとも１つの変異を有し、
かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；（ｃ）（ａ）において、配列番号１の対立遺伝子変異体
に由来する配列を含む、ポリペプチド；（ｅ）（ａ）において、配列番号１の種相同体に由来す
る配列を含む、ポリペプチド；または（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリペプチドに
対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を
有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、を
含む、ポリペプチド。
【請求項１０】請求項７〜９のいずれか１項に記載の
ポリペプチドであって、該ポリペプチドは、生物学的活
性を有し、該生物学的活性は、癌および神経疾患からな
る群より選択される疾患の少なくとも１つの指標となる
活性を含む、ポリペプチド。
【請求項１１】前記同一性が少なくとも８０％であ
り、かつ、生物学的活性を有する、請求項７〜９のいず
れか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】配列番号２に記載のアミノ酸配列のう
ち、少なくとも５個の連続したアミノ酸配列を含む、ポ
リペプチド。
【請求項１３】請求項７〜１２のいずれか１項に記載
のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１４】請求項１〜５および１３のいずれか１
項に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクタ
ー。
【請求項１５】請求項１４に記載の組換えベクターで
形質転換させた形質転換体。
【請求項１６】前記形質転換体が哺乳動物細胞株また
は大腸菌株である、請求項１５に記載の形質転換体。
【請求項１７】請求項１５または１６に記載の形質転
換体を培養する工程、および生産された組換えタンパク
質を培養培地から回収する工程を包含する、請求項７〜
１２のいずれか１項に記載のポリペプチドまたはその塩
の製造方法。
【請求項１８】請求項７〜１２のいずれかに記載のポ
リペプチドを特異的に認識する抗体。
【請求項１９】下記の工程：（ａ）ポリペプチドと請
求項１８に記載の抗体とを接触させる工程、および
（ｂ）該ポリペプチドと該抗体との結合を検出する工
程、を包含する、請求項７〜１２のいずれか１項に記載
のポリペプチドの検出または定量方法。
【請求項２０】請求項１９に記載の方法を用いること
を特徴とする、請求項７〜１２のいずれか１項に記載の
ポリペプチドが関連する疾患の検出方法。
【請求項２１】前記疾患が癌または癌転移である、請
求項１９に記載の検出方法。
【請求項２２】前記疾患が神経病態である、請求項２
１に記載の検出方法。
【請求項２３】請求項１８に記載の抗体を含むことを
特徴とする、疾患検出用キット。
【請求項２４】前記疾患が癌または癌転移である、請
求項２３に記載の疾患検出用キット。
【請求項２５】前記疾患が神経病態である、請求項２
３に記載の疾患検出用キット。
【請求項２６】下記の工程：（ａ）請求項６〜１２の
いずれか１項に記載のポリペプチドと被検物質とを接触
させる工程、および（ｂ）該ポリペプチドと被検物質と
の結合を検出する工程、を包含する、請求項６〜１２の
いずれか１項に記載のポリペプチドの結合物質のスクリ
ーニング方法。
【請求項２７】請求項６〜１２のいずれか１項に記載
のポリペプチドを含む、請求項６〜１２のいずれか１項
に記載のポリペプチドの結合物質のスクリーニング用キ
ット。
【請求項２８】請求項２６に記載のスクリーニング方
法より得られる、請求項６〜１２のいずれか１項に記載
のポリペプチドの、結合物質。
【請求項２９】下記の工程：（ａ）被検物質の存在下
または非存在下、請求項６〜１２のいずれか１項に記載
のポリペプチドと請求項２８に記載の結合物質を接触さ
せる工程、および（ｂ）該ポリペプチドと該結合物質と
の結合活性を、該被検物質の存在下と非存在下で比較す
る工程、を包含する、請求項２８に記載の結合物質と請
求項６〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチドとの
結合活性調節物質のスクリーニング方法。
【請求項３０】請求項６〜１２のいずれか１項に記載
のポリペプチドおよび請求項２８に記載の結合物質を含
む、請求項６〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチ
ドの結合活性調節物質のスクリーニング用キット。
【請求項３１】請求項２９に記載のスクリーニング方
法より得られる、請求項６〜１２のいずれか１項に記載
のポリペプチドの、結合活性調節物質。
【請求項３２】下記の工程；（ａ）請求項６〜１２の
いずれか１項に記載のポリペプチドを発現し得る細胞と
被検物質とを接触させる工程、および（ｂ）該ポリペプ
チドの発現量または活性を検出する工程、を包含する、
請求項６〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチドの
発現調節物質のスクリーニング方法。
【請求項３３】請求項１９に記載の方法を用いる工程
を包含する、請求項３２に記載のスクリーニング方法。
【請求項３４】請求項６〜１２のいずれか１項に記載
のポリペプチドを発現し得る細胞を含む、請求項６〜１
２のいずれか１項に記載のポリペプチドの発現調節物質
のスクリーニング用キット。
【請求項３５】請求項３２または３３に記載のスクリ
ーニング方法より得られる、請求項６〜１２のいずれか
１項に記載のポリペプチドの発現調節物質。
【請求項３６】請求項６〜１２のいずれか１項に記載
のポリペプチドをコードするＤＮＡを欠損または変異さ
せた非ヒトノックアウト動物。
【請求項３７】請求項６〜１２のいずれか１項に記載
のポリペプチドをコードするＤＮＡを発現させた非ヒト
トランスジェニック動物。
【請求項３８】請求項１〜５および１３に記載のポリ
ヌクレオチド、請求項６〜１２に記載のポリペプチド、
請求項１８に記載の抗体、請求項２８に記載の結合物
質、請求項３１に記載の結合活性調節物質および請求項
３５に記載の発現調節物質からなる群より選択される少
なくとも１つの物質を含む、医薬。