JP3929744B2

JP3929744B2 - 新規ポリぺプチド、新規ｄｎａ、新規抗体および新規遺伝子改変動物

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Publication number: JP3929744B2
Application number: JP2001322357A
Authority: JP
Inventors: 浩彦柴山; 研也設楽; 安希子古谷
Original assignee: 協和醗酵工業株式会社
Priority date: 2001-03-26
Filing date: 2001-10-19
Publication date: 2007-06-13
Anticipated expiration: 2021-10-19
Also published as: JP2003000271A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞死を抑制する活性を有する新規ポリぺプチド、該ポリぺプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体、該ポリペプチドの製造法、該ポリペプチドを認識する抗体、該ポリペプチドに結合する物質、該ポリペプチドと結合して該ポリペプチドの活性を阻害する物質、該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を制御する物質、該物質のスクリーニング法および該遺伝子の全部または一部が欠損または置換された動物、及びそれらの利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞死、特にアポトーシスは、本来生理的条件下で細胞自らが積極的に引き起こす細胞死を意味しており、発生過程での形態、組織の形成、ホメオスタシスの維持、生体防御に深く関わり、細胞分裂 (増殖) と表裏一体となって個体の生命維持に重要な役割を持つ。アポトーシスは、細胞外あるいは細胞内からの生理的または病的な様々なシグナルによって誘発される。遺伝子により制御されたこの死の過程に先天的あるいは後天的に異常が生じると、アポトーシスが過剰に誘発されたり抑制されたりして様々な疾患を引き起こすと考えられる。アポトーシスによる過剰な細胞死が発症に関わる疾患としては、劇症肝炎やその他のウイルス疾患、アルツハイマー病などの神経変性疾患、放射線障害などがあげられる。逆にアポトーシス抑制が発症に関わる疾患としては、癌や自己免疫疾患などがあげられる。
【０００３】
また、放射線や薬物がアポトーシスを引き起こすことを利用して、癌治療や免疫抑制療法が行われている。逆に、生体で重要な役割を果たす細胞を死から守るといった観点からは、例えば、脳、心臓などの虚血時における細胞死抑制、抗癌剤や放射線治療時における正常細胞の細胞死からの保護のために、アポトーシス抑制を医学的な治療目的に利用することも考えられる。
【０００４】
細胞死を調節する細胞内因子として、これまで多くの遺伝子及び遺伝子産物が知られている。例えば、Ｂｃｌ−２遺伝子ファミリー（Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−ｗ、ｍｃｌ−１、ａ１、ｂｆｌ−１、ＢＨＲＦ−１、ＬＭＷ−５−ＨＬ、Ｅ１Ｂ１９Ｋ等）、ｂａｘサブファミリー（ｂａｘ、ｂａｄ、ｂａｋ）、ｂｉｋサブファミリー（ｂｉｋ、ｂｉｄ、ｂｉｍ、ｈｒｋ）が知られている。Ｂｃｌ−２遺伝子ファミリーはアポトーシス抑制活性を有し、ｂａｘサブファミリーとｂｉｋサブファミリーは、アポトーシス促進活性を有する。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、細胞死に関わる新規な遺伝子を提供することを目的とする。具体的には、アポトーシス制御や糖代謝制御シグナルの異常によって生じる胃癌、卵巣癌、乳癌、膵癌、前立腺癌等の悪性腫瘍、糖尿病等の疾患に対する治療薬、予防薬および診断薬、脳、心臓などの虚血時における細胞死抑制剤、抗癌剤や放射線治療時における正常細胞の細胞死の抑制剤、または既存の治療薬の効果を増強する薬剤を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行い、ヒト第１６番染色体に存在する遺伝子と相同性が高く、マウス由来の細胞死に関わる新規な遺伝子（以下、アナモルシン遺伝子ともいう）を取得し、該遺伝子がコードするポリペプチドが細胞死を抑制する活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明は以下の（１）〜（５４）に関する。
（１）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（２）配列番号２で示されるアミノ酸配列において一個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列を有し、かつ細胞死を抑制する活性を有するポリペプチド。
（３）配列番号２で示されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ細胞死を抑制する活性を有するポリペプチド。
（４）（１）〜（３）のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（５）配列番号１で示される塩基配列の４０番目〜９６９番目で表される塩基配列を有するＤＮＡ。
（６）（４）又は（５）に記載のＤＮＡから選ばれるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつ細胞死を抑制する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【０００８】
（７）配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（８）配列番号４で示されるアミノ酸配列において一個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列を有し、かつ細胞死を抑制する活性を有するポリペプチド。
（９）（７）又は（８）記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（１０）配列番号３で示される塩基配列を有するＤＮＡ。
（１１）（９）又は（１０）に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつ細胞死を抑制する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（１２）（４）〜（６）、（９）〜（１１）のいずれか１項に記載のＤＮＡから選ばれるＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
（１３）（１２）記載の組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体。
【０００９】
（１４）（１３）記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に（１）、（２）、（３）、（７）又は（８）記載のポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物より該ポリペプチドを採取することを特徴とする（１）、（２）、（３）、（７）又は（８）記載のポリペプチドの製造法。
（１５）（１）、（２）、（３）、（７）又は（８）記載のポリぺプチドを認識する抗体またはその抗体断片。
（１６）モノクローナル抗体またはその抗体断片である、（１５）記載の抗体またはその抗体断片。
（１７）ハイブリドーマKM3048（FERM BP−7765）、ハイブリドーマKM3052（FERM BP-7766）またはハイブリドーマKM3057（FERM BP-7767）が生産するモノクローナル抗体またはその抗体断片である、（１６）記載の抗体またはその抗体断片。
（１８）（１５）〜（１７）のいずれか１項に記載の抗体又はその抗体断片を用いる、（１）、（２）、（３）、（７）又は（８）記載のポリペプチドの免疫学的測定法。
【００１０】
（１９）（１８）記載の免疫学的測定法を用いる、細胞死の抑制又は促進に起因する疾患の診断法。
（２０）細胞死の抑制又は促進に起因する疾患が、神経変性疾患、劇症肝炎、ウイルス疾患、糖尿病、放射線障害あるいは虚血時あるいは抗癌剤使用時の細胞死、悪性腫瘍または自己免疫疾患である、（１９）に記載の診断法。
（２１）（１）、（２）、（３）、（７）又は（８）記載のポリペプチドと被験試料とを接触させ、被験試料の中から（１）、（２）、（３）、（７）又は（８）記載のポリペプチドに結合する物質を選択することを特徴とする、（１）、（２）、（３）、（７）又は（８）記載のポリペプチドに結合する物質のスクリーニング法。
（２２）（２１）記載の方法により得られる物質。
（２３）（１）、（２）、（３）、（７）又は（８）記載のポリペプチドと被験試料とを接触させ、被験試料の中から(１)、(２)、(３)、(７)又は(８)記載のポリペプチドの活性を抑制させる物質を選択することを特徴とする、（１）、（２）、（３）、（７）又は（８）記載のポリペプチドの活性を抑制させる物質のスクリーニング法。
【００１１】
（２４）（２３）記載の方法により得られる物質。
（２５）（１）、（２）、（３）、（７）又は（８）記載のポリぺプチドを発現する細胞と被験試料とを接触させ、被験試料より（１）、（２）、（３）、（７）又は（８）記載のポリぺプチドをコードする遺伝子の発現を制御する物質を選択することを特徴とする、（１）、（２）、（３）、（７）又は（８）記載のポリぺプチドをコードする遺伝子の発現を制御する物質のスクリーニング法。
（２６）発現の制御を、(１８)記載の測定法を用いて検出することを特徴とする、（２５）記載のスクリーニング法。
（２７）発現の制御を、（１）、（２）、（３）、（７）又は（８）記載のポリぺプチドをコードするｍＲＮＡ量を測定することにより検出することを特徴とする、（２５）記載のスクリーニング法。
（２８）（２５）〜（２７）のいずれか１項に記載のスクリーニング法により得られる物質。
【００１２】
（２９）（１）、（２）、（３）、（７）又は（８）記載のポリぺプチドをコードする遺伝子の転写を制御する領域の下流にレポーター遺伝子の連結されたＤＮＡを含むプラスミドで形質転換された形質転換体と被験試料とを接触させ、被験試料より（１）、（２）、（３）、（７）又は（８）記載のポリぺプチドをコードする遺伝子の発現を制御する物質を選択することを特徴とする、（１）、（２）、（３）、（７）又は（８）記載のポリぺプチドをコードする遺伝子の発現を制御する物質のスクリーニング法。
（３０）（２９）記載のスクリーニング法により得られる物質。
（３１）（４）〜（６）、（９）〜（１１）のいずれか１項に記載のＤＮＡを含む遺伝子の全部または一部が欠損または置換され、細胞死を抑制する活性を有するポリペプチドの発現量、時期または組織特異性が変化した遺伝子欠失または置換非ヒト動物。
（３２）発現量の変化が、発現が低下する変化または発現しない変化である（３１）記載の動物。
（３３）非ヒト動物が非ヒトほ乳類動物であることを特徴とする（３１）または（３２）記載の動物。
（３４）非ヒトほ乳類動物がマウスであることを特徴とする（３３）記載の動物。
（３５）（３１）〜（３４）のいずれか１項に記載の動物、あるいは該動物の臓器、組織または細胞と被験試料とを接触させ、被験試料の中から該動物、あるいは該動物の臓器、組織または細胞の動態を変化させる物質を選択することを特徴とする、細胞死の抑制あるいは促進に起因する疾患の予防薬、診断薬又は治療薬のスクリーニング法。
（３６）（３５）記載のスクリーニング法により得られる物質。
【００１３】
（３７）（１）、（２）、（３）、（７）又は（８）記載のポリぺプチドを含有する医薬。
（３８）（４）〜（６）、（９）〜（１１）のいずれか１項に記載のＤＮＡを含有する医薬。
（３９）（１２）に記載の組換え体ＤＮＡを含有する医薬。
（４０）（１２）に記載の組換え体ＤＮＡが、細胞死を抑制するための遺伝子治療用ベクターである、（３９）に記載の医薬。
（４１）（１３）に記載の形質転換体を含有する医薬。
（４２）細胞死の促進に起因する疾患の予防、診断又は治療のための、（３７）〜（４１）のいずれか１項に記載の医薬。
（４３）（２２）、（２４）、（２８）、（３０）および（３６）のいずれか１項に記載の物質を含有する医薬。
（４４）細胞死の抑制あるいは促進に起因する疾患の予防、診断又は治療のための、（４３）記載の医薬。
（４５）（１）、（２）、（３）、（７）又は（８）記載のポリぺプチドが有する活性を阻害する物質を含有する医薬。
（４６）該物質が、（４）〜（６）、（９）〜（１１）のいずれか１項に記載のＤＮＡの塩基配列に基づいて調製したアンチセンス鎖ＤＮＡである、（４５）記載の医薬。
【００１４】
（４７）該物質が、（１５）記載の抗体またはその抗体断片である、（４５）記載の医薬。
（４８）細胞死の抑制に起因する疾患の予防、診断又は治療のための、（４５）〜（４７）のいずれか１項に記載の医薬。
（４９）細胞死の促進に起因する疾患が、神経変性疾患、劇症肝炎、ウイルス疾患、放射線障害、糖尿病、又は虚血時あるいは抗癌剤使用時の細胞死である、（４２）又は（４４）に記載の医薬。
（５０）細胞死の抑制に起因する疾患が、悪性腫瘍又は自己免疫疾患である、（４４）又は（４８）に記載の医薬。
（５１）（４）〜（６）、（９）〜（１１）のいずれか１項に記載のＤＮＡの塩基配列に基づいて調製したアンチセンス鎖ＤＮＡを用いて（１）、（２）、（３）、（７）又は（８）に記載のポリペプチドの生産を抑制する方法。
（５２）細胞内の（１）、（２）、（３）、（７）又は（８）記載のポリペプチドが有する活性を制御する工程を含む、細胞死の制御方法。
（５３）インターロイキン３非存在下の培養で生存でき、培養下の細胞外マトリックスに接着可能であることを特徴とするマウスｐｒｏＢ細胞由来のBa/F3−Ａｄ細胞。
（５４）細胞内のＨ−Ｒａｓ分子が活性化状態にあることを特徴とする、（５３）に記載のBa/F3−Ａｄ細胞。
【００１５】
本発明の細胞死を抑制する活性を有するポリペプチド（以下、本発明のポリペプチドとも表記する）は、新規なポリペプチドである。本発明のポリペプチドは、正常組織では、多種の臓器でその発現が見られ、発生時期、例えばマウスでは胎生初期からその発現が見られる。また、本発明のポリペプチドは、白血病や悪性リンパ腫などの造血器由来の腫瘍細胞に強い発現が見られる。一方、本発明のポリペプチドは、エリスロポイエチン、トロンボポイエチン、インターロイキン−３（以下、ＩＬ−３と表記する）等のサイトカインにより発現が誘導される。特に、Ｒａｓ遺伝子産物を介した情報伝達によりその発現が制御されていると考えられる。本発明のポリペプチドの発現は、公知の抗アポトーシス分子であるＢｃｌ−２の発現も維持することから、Ｂｃｌ−２の発現と関連したペプチドであると考えられる。
本発明における細胞死とは、ネクローシス（壊死）とアポトーシスの両方を包含する。本発明においては、好ましくはアポトーシスによる細胞死に関わる。
【００１６】
本発明のポリペプチドとしては、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び配列番号２で示されるアミノ酸配列において一個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列を有し、かつ細胞死を抑制する活性を有するポリペプチドが挙げられる。
更に、本発明のポリペプチドとしては、配列番号４で示されるアミノ酸配列において一個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列を有し、かつ細胞死を抑制する活性を有するポリペプチドも含む。
【００１７】
上記において１個以上のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の方法により欠失、置換、挿入および／または付加できる程度の数のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されることを意味し、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列をあげることができる。
【００１８】
ポリペプチドのアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列を有し、かつ細胞死を抑制する活性を有するペプチドは、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982) 、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409 (1982) 、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81,5662 (1984) 、Science,224, 1431 (1984)、WO85/00817(1985) 、Nature, 316, 601 (1985) 、Gene, 34, 315 (1985) 、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985) 、Current Protocols in Molecular Biology， John and Wily ＆ Sons （1987-1997）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）等に記載の方法に準じて該ポリペプチドをコードするＤＮＡに含まれる塩基を欠失、置換、挿入および／または付加することで得られる変異ＤＮＡを用いて調製することができる。
本発明のポリペプチドは、配列番号２で示されるアミノ酸配列と、好ましくは６０％以上、より好ましくは８５％以上、更に好ましくは９０％以上の相同性を有するポリペプチドも包含する。配列番号４に記載のアミノ酸配列は、ヒト第１６番染色体長腕に存在するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）で、本発明の配列番号２ので示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと約８２％の相同性であるが、それらの機能については知られていない。
【００１９】
本発明のＤＮＡとしては、
上記本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、
配列番号１で示される塩基配列の４０番目〜９６９番目で表される塩基配列を有するＤＮＡ、及び
これら上記のＤＮＡから選ばれるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつ細胞死を抑制する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが挙げられる（いか、これらを本発明の細胞死抑制遺伝子とも表記する）。
【００２０】
上記においてストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞死を抑制する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡとは、細胞死を抑制する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡまたはその染色体遺伝子断片をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザン・ブロット・ハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、0．7〜1．0ＭのＮａＣｌ存在下、42〜68℃でハイブリダイゼーションを行った後、0．1倍〜2倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、150ｍＭ塩化ナトリウム、15ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、42〜68℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、 Molecular Cloning, A laboratory manual， Second Edition．（1989）（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、DNA cloning１：Core Techniques，ＡPractical Approach， Second Edition， Oxford University （1995）に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、BLAST〔Ｊ. Mol. Biol., 215, 403 （1990）〕、FASTA〔Method in
Enzymology, 183, 63 （1990）〕等の解析ソフトを用いて計算したときに、配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
【００２１】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡは、本発明のＤＮＡから選ばれるＤＮＡをモレキュラー・クローニング第２版記載の方法に従ってベクターに連結することで得られる。
本発明のポリペプチドを製造する方法は、上記方法により作製した組換え体ＤＮＡを用いてモレキュラー・クローニング第２版記載の方法に従って形質転換された細胞を、該細胞が生育し得る適当な培養液中で培養し、該培養液中に本発明のポリペプチドを生成蓄積させ、該培養液から該ポリペプチドを採取する方法をあげることができる。また該培養液からポリペプチドを採取するには、ポリペプチドを可溶化後、イオン交換、ゲルろ過あるいは疎水性クロマトグラフィー法等、またはこれらを組み合わせることにより単離精製する方法があげられる。
【００２２】
本発明の抗体又はその抗体断片としては、上記本発明のポリペプチドを認識する抗体又はその抗体断片をあげることができる。
上記本発明のＤＮＡを連結する遺伝子治療用のベクターＤＮＡとしては、レトロウィルスベクター、アデノウィルスベクターまたは該ウィルスベクターの誘導体など、本発明のＤＮＡから選ばれるＤＮＡを動物細胞内に導入し、発現させることができるベクターをあげることができる。
【００２３】
本発明のポリペプチドと特異的に結合する物質としては、本発明のポリペプチドと特異的に結合する物質であればいずれのものでもよい。
本発明のポリペプチドから選ばれるポリペプチドの発現を制御（増強又は抑制）させる化合物としては、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの転写量を特異的に制御（増強又は抑制）させる物質をあげることができる。
【００２４】
本発明の遺伝子改変非ヒト動物としては、ヒト以外の動物であればいかなる動物でもよいが、好ましくはほ乳動物、例えばウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ハムスター、モルモット、マウス、ラットなどが用いられる。特にゲッ歯類はライフサイクルが比較的短く、また繁殖が容易であることからモデル動物としては好ましく、とりわけラット、マウスが好ましい。該動物を用いて作製される遺伝子改変非ヒト動物は、本発明のＤＮＡ、および該ＤＮＡを含む染色体遺伝子を用いて、本発明の細胞死を抑制する作用を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子の全部あるいは一部が欠損あるいは置換した遺伝子を有する胚性幹細胞クローンを作成し、キメラ法によって該胚性幹細胞クローンと正常細胞を掛け合わせることでキメラ個体を作成後、該キメラ個体と正常個体を掛け合わせることにより、すべての細胞が該ＤＮＡに変異を有する個体を得たのち、該個体同士の掛け合わせにより相同染色体双方に変異の入ったホモ個体を得る方法により作成できる。本発明のＤＮＡを含む染色体ＤＮＡとしては本発明のＤＮＡを含む染色体遺伝子を断片をあげることができる。
【００２５】
また、細胞死抑制遺伝子の任意の位置へ変異の導入が可能である。例えば細胞死抑制遺伝子の翻訳領域中への塩基置換、欠失、挿入、付加等の変異を導入することにより、その産物の活性を変化させた動物を作ることができる。またその発現制御領域への同様な変異の導入により、発現の程度、時期、組織特異性等を改変させた動物の作成も可能である。さらにCre-loxP系〔 J. Clin. Invest., 98, 600 (1996)〕との組合せにより、より積極的に発現時期、発現部位、発現量等を制御することも可能である。このような例としては脳のある特定の領域で発現されるプロモータを利用して、その領域でのみ目的遺伝子を欠失させた例〔Cell, 87, 1317 (1996)〕やCreを発現するアデノウィルスを用いて、目的の時期に、臓器特異的に目的遺伝子を欠失させた例〔Science, 278, 5335 (1997)〕が知られている。従って本発明の細胞死抑制遺伝子についてもこのように任意の時期や組織で発現を制御できる、または任意の挿入、欠失、置換および／または付加をその翻訳領域や、発現制御領域に有する動物個体を作成することが可能である。このような動物は任意の時期、任意の程度または任意の部位で、細胞死と細胞死に伴って生ずる疾患等の種々の疾患の症状を誘導することができる。従って細胞死や細胞死に伴って生ずる疾患の診断、治療、予防において極めて有用な動物モデルとなる。
【００２６】
本発明の遺伝子改変非ヒト動物を用いたスクリーニング法は、動物、あるいは該動物の臓器、組織または細胞と被験物質を接触させ、被験物質の中から該動物、あるいは該動物の臓器、組織または細胞の動態を変化させる被験物質を選択することを特徴とする、細胞死の抑制あるいは促進に起因する疾患の予防薬、診断薬又は治療薬のスクリーニング法である。具体的には、該動物、あるいは該動物の臓器、組織または細胞を被験物質で処理し、無処理の対照動物、あるいは該動物の臓器、組織または細胞と比較し、該動物の各器官、組織、細胞の動態の変化を観察することにより該物質の効果を調べることができる。該動物、あるいは該動物の臓器、組織または細胞を被験物質で処理する方法としては、該動物に経口投与する、または静脈注射等により投与する方法、臓器、組織または細胞を有する培養液等の液中に被験物質を含有させる方法等があげられるが、特にこれらの方法に限られることはなく、用いられる被験物質の性質により適宜選択することができる。
【００２７】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．本発明の細胞死抑制遺伝子の生産
（１）細胞死を抑制する活性を有するポリペプチドをコードするDNAの取得
本発明のポリペプチドをコードするDNAの取得方法としては、由来の異なる二つのサンプル間で異なる発現形態を取る遺伝子を取得する方法であるサブトラクション法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5738-5742 (1988)]、Representational difference analysis[Nucleic Acids Research, 22, 5640-5648 (1994)]による方法、発現クローニング法[新遺伝子工学ハンドブック（羊土社）]などがあげられる。
【００２８】
サブトラクション法では、Ba/F3-Ad細胞より作製したcDNAライブラリーを、対照細胞であるBa/F3細胞より取得したmRNAを用いてサブトラクションを行う。Ba/F3-Ad細胞に特異的な遺伝子を濃縮した差分化cDNAライブラリーを調製した後、該差分化cDNAライブラリーの挿入cDNA配列を５’末端側よりランダムに塩基配列解析を行い、分泌シグナル配列を持つものだけを選択する（ランダム配列解析）。このようにして得られたcDNAの塩基配列を決定する。
【００２９】
発現クローニング法では、Ba/F3-Ad細胞より作製したcDNAライブラリーをレトロウィルスベクターに組み込み、パッケージング細胞により高い力価のウィルス液を作製し、該ウィルス液を対照細胞に感染させて、細胞のゲノムにDNAを組み込ませる。IL-3非依存的に増殖する細胞を選択し、細胞内のゲノムを、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（Polymerase Chain Reaction:以下、PCRと略記する）を行うことにより、該cDNAを増幅させ、該cDNA配列を決定する。
レトロウィルスベクターとしては、pBabeX〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 9146-9150 (1995）〕、pMXなどがあげられる。
パッケージング細胞としては、BOSC23（ＡＴＣＣＣＲＬ１１５５４）などがあげられる。上記方法により得られたcDNAの塩基配列としては、配列番号１で示される塩基配列があげられる。
【００３０】
ＰＣＲの条件は、該ＰＣＲに用いられるＴａｑポリメラーゼの性質にあわせて適宜変更することが好ましい。該ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片の塩基配列を、例えば、サンガー（Sanger）らのジデオキシ法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)〕あるいは、塩基配列自動分析装置、例えば、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー（Sequencer）等を用いて決定する。
【００３１】
(2)細胞死を抑制する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ断片のクローン化
上記（１）で取得した、細胞死を抑制する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを用いて、該ＤＮＡ断片を含む、より長い染色体遺伝子断片を、例えば染色体遺伝子コスミドライブラリーから（１）で取得した該ＤＮＡ断片を含むコスミドクローンを選択することにより取得することができる。
【００３２】
該選択法としては、（１）で取得したＤＮＡをプローブにしたコロニー・ハイブリザイゼーション法、プラーク・ハイブリザイゼーション法（モレキュラー・クローニング第２版記載）等、あるいは（１）で取得した染色体ＤＮＡ部分断片の塩基配列から選ばれる配列を有する合成ＤＮＡをプライマーにしたＰＣＲを利用した方法等があげられる。
【００３３】
ＰＣＲを利用した具体的方法としては以下に示す方法があげられる。
（１）で取得した配列番号１で示される塩基配列から選ばれる配列を有するプライマーを合成する。プライマーとしては例えば配列番号７および配列番号８で示される塩基配列を有するプライマーのセットをあげることができる。該プライマーを用いてＰＣＲ法により染色体遺伝子コスミドライブラリーをスクリーニングする。染色体遺伝子コスミドライブラリーはモレキュラー・クローニング第２版記載の方法により作製することもできるが、市販の染色体遺伝子コスミドライブラリー（例えばKURABO社）を用いることもできる。取得される染色体ＤＮＡコスミドライブラリーからＰＣＲにより該遺伝子を含むクローンを選択する具体的な方法としては、該プライマーを用いたＰＣＲにより増幅断片を与えるコスミドクローンを選択することにより行われる。ＰＣＲの条件は、該プライマーを用いたＰＣＲにより、特異的なＤＮＡ増幅を増幅できる条件であれば特に限定されない。
【００３４】
次に、上記ＰＣＲによって増幅断片を与えるクローンに含まれる染色体DNAについて制限酵素地図を作成し、(1)で取得したｃＤＮＡ全長をプローブとして用いたサザンハイブリダイゼーション法を組み合わせることにより（１）でクローン化したＤＮＡの染色体上の位置、すなわち該染色体部分断片（エクソン領域）を含んだ制限酵素切断断片を同定できる。マウスの場合には、マウス染色体ＤＮＡの制限酵素地図を常法にしたがって作製できる。次に該マウス染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で消化したＤＮＡ断片に対し、配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ断片をプローブとしたサザン解析を行い、該マウス染色体ＤＮＡ上における配列番号１で示されるＤＮＡの位置を特定することで、エクソン部位が決定できる。該エクソン領域を含む染色体ＤＮＡ断片について、（１）記載の常法により部分塩基配列を決定し、公知の細胞死抑制遺伝子と相同性を比較することにより、コスミドライブラリーから選択したコスミドクローンに含まれるマウス染色体ＤＮＡ断片は、マウス細胞死抑制遺伝子を含む断片であることを確認する。該部分塩基配列の例として配列番号１で示される塩基配列をあげることができる。他の動物についても同様の方法を用いて、細胞死抑制ポリペプチドの一部をコードするＤＮＡを含む染色体ＤＮＡ断片を取得することができる。
【００３５】
(3) 細胞死を抑制する活性を有するポリペプチドをコードするcＤＮＡのクローン化
細胞死を抑制する活性を有するポリペプチドをコードするｃＤＮＡをクローニングする方法としては、上記（２）に記載の方法により同定された、細胞死を抑制する活性を有するポリペプチドの一部をコードする、染色体ＤＮＡ上のエクソン部分の塩基配列から選ばれる配列を有するＤＮＡをプローブにしたサザンハイブリダイゼーションまたはプラークハイブリダイゼーションによりｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする方法、該染色体ＤＮＡ上のエクソン部の配列をもとにプライマーを設計し、ＰＣＲによりｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法等があげられる。
【００３６】
ＰＣＲを用いる方法としては、例えば配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡに含まれる細胞死抑制遺伝子のエクソン部分の塩基配列をもとにプライマーセットを作成し、cDNAライブラリーをPCR法によりスクリーニングする方法があげられる。プライマーは該細胞死抑制遺伝子のエクソン中の配列を特異的に増幅できればどのような配列、組み合わせでもよいが、好適には配列番号７および配列番号８で示される塩基配列を有するＤＮＡがあげられる。ｃＤＮＡライブラリーは該プライマーセットで特異的に増幅断片が出現するもの、つまり、該細胞死抑制遺伝子を発現している組織であれば限定されない。マウスの場合には19日齢胚を用いて作製されるものがあげられる。ｃＤＮＡライブラリーの作製方法は、該胚を用いてモレキュラー・クローニング第２版記載の方法によっても作製可能であるが、市販のものを購入してもよい。市販のｃＤＮＡライブラリーからのＰＣＲによるスクリーニング法の具体的な好適な例として、マウスの場合、19日齢胚ライブラリーをマイクロタイタープレートのウェルに小分割したものを用いた方法をあげることができる〔RAPID-SCREENTM cDNA LIBRARY PANELS (OriGene Technologies, Inc)〕。
【００３７】
配列番号７および配列番号８で示される塩基配列を有するプライマーのセットを用いた該タイタープレートのウェル中の試料に対するＰＣＲにより、増幅断片が認められたウェルに対応するライブラリーのサブプールをさらにＰＣＲによりスクリーニングする。ＰＣＲの条件は、用いたプライマーに特異的な増幅断片を与える条件であれば特に限定されないが、好適には配列番号７および配列番号８で示される塩基配列のプライマーセットを用いた場合、95℃−9分，（９５℃−３０秒、65℃−30秒、72℃−30秒）の反応サイクルを33回、72℃−5分保温の温度条件をあげることができる。つぎに陽性ウェル、すなわち増幅断片を与えたウェル中のｃＤＮＡを含有する大腸菌のコロニーを寒天培地上に形成させた後、配列番号７および配列番号８で示される塩基配列を有するプライマーセットを用いたコロニーＰＣＲ法により、増幅断片が認められるコロニーを選択し、含有するプラスミドを回収し、該プラスミドに含まれるｃＤＮＡ部分の遺伝子配列を（１）記載の常法により決定する。
【００３８】
上記細胞死抑制遺伝子のコードするポリペプチドとしては、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをあげることができる。
【００３９】
２．本発明のポリペプチド、組換え体ＤＮＡ、及び形質転換体の生産
上記のようにして得られる細胞死抑制遺伝子を宿主細胞中で発現させ、本発明のポリペプチドを製造するためには、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法を用いることができる。
【００４０】
即ち、本発明のＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーター下流に挿入した組換え体ＤＮＡを造成し、該ベクターを該ベクターに適合した宿主細胞中に導入することにより、本発明のポリペプチドを発現する形質転換体を取得し、該形質転換体を培養液中で培養し、該培溶液に本発明のポリペプチドを生成蓄積させることにより製造できる。
【００４１】
本発明の組換え体ＤＮＡは、上述の本発明のＤＮＡから選ばれるＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡである。
本発明の形質転換体は、宿主細胞中に上記本発明の組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体である。
【００４２】
宿主細胞としては、目的とする遺伝子を発現できるものは全て用いることができる。例えば、エッシェリヒア属、セラチア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属、ミクロバクテリウム属等に属する原核生物、クルイベロミセス属、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属等に属する酵母菌株や動物細胞宿主等をあげることができる。
【００４３】
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、細胞死抑制遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、細胞死抑制遺伝子発現ベクターは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、細胞死抑制遺伝子、転写終結配列、より構成されていることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００４４】
発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Promega社製）、ｐＱＥ−８（QIAGEN社製）、ｐＫＹＰ１０( 特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)〕、ｐＬＳＡ１〔Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)〕、ｐＧＥＬ１〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)〕、pBluescript （STRATAGENE社）、ｐＴｒｓ３０（ＦＥＲＭＢＰ−５４０７）、ｐＴｒｓ３２（ＦＥＲＭＢＰ−５４０８）、ｐＧＨＡ２（ＦＥＲＭＢＰ−４００）、ｐＧＫＡ２（ＦＥＲＭＢ−６７９８）、ｐＴｅｒｍ２（特開平３−２２９７９、ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＫＫ２３３−２（Pharmacia社製）、ｐＧＥＸ（Pharmacia社製）、ｐＥＴシステム（Novagen社製）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等を例示することができる。
【００４５】
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ｐ_trp）、lacプロモーター（Ｐ_lac）、P_Lプロモーター、P_Rプロモーター、P_letIプロモーター、P_SEプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター（Ｐ_trp ｘ２）、tacプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【００４６】
リボソーム結合配列としては、大腸菌等の宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよいが、シャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミッドを用いることが好ましい。
本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、好適には構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが望ましい。
【００４７】
宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属、ミクロバクテリウム属等に属する微生物、例えば、Escherichia coli XL1-Blue 、Escherichia coli XL2-Blue 、Escherichia coli DH1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485 、Escherichia coli JM109 、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.49 、Escherichia coli W3110 、Escherichia coli NY49、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefacines、Brevibacterium ammoniagenes、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、Brevibacterium flavum ATCC14067、Brevibacterium lactofermentum ATCC13869、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870 、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354 等をあげることができる。
【００４８】
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、プロトプラスト法（特開昭63-248394）、Gene, 17, 107 (1982)やMolecular & General Genetics, 168, 111 (1979)に記載の方法等をあげることができる。
【００４９】
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ATCC37115）、ＹＥｐ２４（ATCC37051）、ＹＣｐ５０（ATCC37419）ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を例示することができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
【００５０】
宿主細胞としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クリュイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、トリコスポロン・プルランス（Trichosporon pullulans）、シュワニオミセス・アルビウス（Schwanniomyces alluvius）等をあげることができる。
【００５１】
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Methods. Enzymol., 194, 182 (1990)〕、スフェロプラスト法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1929 (1978)〕、酢酸リチウム法〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J. Bacteriol.）、153, 163 (1983)〕、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)記載の方法等をあげることができる。
【００５２】
動物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、pｃＤＮＡI、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７〔特開平3-22979 ；サイトテクノロジー（Cytotechnology）、3, 133, (1990)〕、ｐＡＳ３−３（特開平2-227075）、ｐＣＤＭ８〔ネイチャー（Nature）、329, 840, (1987)〕、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）ｐＡＧＥ１０３〔J. Biochem., 101, 1307(1987)〕、ｐＡＧＥ２１０等を例示することができる。
【００５３】
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（immediateearly）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーターあるいはメタロチオネインのプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
【００５４】
宿主細胞としては、ナマルバ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３―２９９）、ＣＯＳ１細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞等をあげることができる。
動物細胞への組換えベクターの導入法としては、動物細胞にＤＮＡを導入できるいかなる方法も用いることができる。例えば、エレクトロポーレーション法〔Cytotechnology, 3, 133(1990)〕、リン酸カルシウム法（特開平２―２２７０７５）、リポフェクション法〔Proc.Natl.Acad.Sci.,USA, 84, 7413(1987)〕、Virology, 52, 456 (1973)に記載の方法等を用いることができる。形質転換体の取得および培養は、特開平２−２２７０７５号公報あるいは特開平２−２５７８９１号公報に記載されている方法に準じて行なうことができる。
【００５５】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばバキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズア・ラボラトリー・マニュアル（Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーサプルメント1-３４、Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記載された方法によって、本発明のポリペプチドを発現することができる。
【００５６】
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、本発明のポリペプチドを発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃIII （ともにインビトロジェン社製）等をあげることができる。
【００５７】
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) などを用いることができる。
昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー（W.H.Freeman and Company）、ニューヨーク（New York）、(1992)〕、Trichoplusia niの卵巣細胞であるＨｉｇｈ５（インビトロジェン社製）等を用いることができる。
【００５８】
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84,7413 (1987)〕等をあげることができる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
【００５９】
酵母、動物細胞または昆虫細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加されたポリペプチドを得ることができる。
本発明のＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明のポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物より該ポリペプチドを採取することにより、該ポリペプチドを製造することができる。
【００６０】
該ポリペプチド製造用形質転換体が大腸菌等の原核生物、酵母菌等の真核生物である場合、これら生物を培養する培地は、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類が用いられる。
【００６１】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等が用いられる。
【００６２】
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６〜９６時間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
【００６３】
また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
【００６４】
動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地〔The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Science, 122,501 (1952)〕、ＤＭＥＭ培地〔Virology, 8, 396 (1959)〕、１９９培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。
【００６５】
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ₂存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地〔ファーミンジェン（Pharmingen）社製〕、Sf-900 II SFM培地（ギブコＢＲＬ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５〔いずれもＪＲＨバイオサイエンシーズ（JRH Biosciences）社製〕、Grace's Insect Medium〔Grace, T.C.C.,ネイチャー(Nature), 195, 788 (1962)〕等を用いることができる。
【００６６】
ｐＨ６〜７、培養温度２５〜３０℃がよく、培養時間は、通常１〜５日間である。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
本発明のポリペプチド製造用形質転換体の培養物から、本発明のポリペプチドを単離精製するには、通常の酵素の単離、精製法を用いればよい。
【００６７】
例えば、本発明のポリペプチドが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、DIAION HPA-75 （三菱化学社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(ファルマシア社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
【００６８】
また、該ポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該ポリペプチドを回収後、該ポリペプチドの不溶体をポリペプチド変性剤で可溶化する。該可溶化液を、ポリペプチド変性剤を含まないあるいはポリペプチド変性剤の濃度がポリペプチドが変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該ポリペプチドを正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
【００６９】
本発明のポリペプチドあるいはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該ポリペプチドあるいはその糖鎖付加体等の誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
【００７０】
また、上記方法により発現させたポリペプチドを、Ｆｍｏｃ法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、ｔＢｏｃ法(t-ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法によっても製造することができる。また、桑和貿易(米国AdvancedchemTech社製)、パーキンエルマージャバン(米国Perkin-Elmer社製)、ファルマシアバイオテク(スウューデンPharmacia Biotech社製)、アロカ(米国Protein Technology Instrument社製)、クラボウ(米国Synthecell-Vega社製)、日本パーセプティブ・リミテッド(米国PerSeptive社製)、島津製作所等のペプチド合成機を利用し合成することもできる。
【００７１】
３．本発明のポリペプチドを認識する抗体又はその抗体断片の生産とその利用
本発明のポリペプチドまたは該ポリペプチドの部分断片ポリペプチドの精製標品、あるいは本発明のポリペプチドの一部のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原として用いることにより、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等、本発明のポリペプチドを認識する抗体またはその抗体断片を作製することができる。本発明のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマが生産するモノクローナル抗体、遺伝子組換え抗体などがあげられる。
ハイブリドーマとは、ヒト以外の哺乳動物に抗原を免疫して取得されたB細胞と、マウスなどに由来するミエローマ細胞とを細胞融合させて得られる、所望の抗原特異性を有したモノクローナル抗体を生産する細胞を意味する。
遺伝子組換え抗体とは、ハイブリドーマが生産するモノクローナル抗体をコードする遺伝子の一部または全部を、遺伝子工学的手法を用いて作製した抗体を意味する。
遺伝子組換え抗体としては、ヒト化抗体、ヒト抗体等があげられる。
【００７２】
ヒト化抗体としては、ヒト型キメラ抗体及びヒト型CDR移植抗体などがあげられる。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体重鎖可変領域（H鎖V領域）（以下、HVまたはVHとも称す）および抗体軽鎖（L鎖）V領域（以下、LVまたはVLとも称す）とヒト抗体のH鎖定常領域（Ｃ領域）（以下、CHとも称す）およびヒト抗体のL鎖Ｃ領域（以下、CLとも称す）とからなる抗体を意味する。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ヒト型CDR移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLのCDRのアミノ酸配列をヒト抗体のVHおよびVLの適切な位置に移植した抗体を意味する。
ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体を意味するが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーおよびヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体等も含まれる。
抗体断片としては、Fab、Fab'、F(ab')₂、scFv（一本鎖抗体断片）、dsFv（ジスルフィド抗体断片）、CDRを含むペプチドなどがあげられる。
【００７３】
Fabは、抗体を蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（H鎖の224番目のアミノ酸残基で切断される）、H鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約5万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
F(ab')₂は、ＩｇＧを蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（H鎖の234番目のアミノ酸残基で切断される）、Fabがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約10万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
Fab'は、上記F(ab')₂のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約5万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
【００７４】
scFvは、一本のVHと一本のVLとを適当なペプチドリンカー（以下、Pと称す）を用いて連結した、VH−P−VLないしはVL−P−VHポリペプチドを示す。本発明で使用されるscFvに含まれるVHおよびVLは、ハイブリドーマが産生する抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体のいずれをも用いることができる。
【００７５】
dsFvは、VHおよびVL中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はReiterらにより示された方法［プロテイン・エンジニアリング（Protein Engineering）, 7, 697 (1994)］に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。本発明のdsFvに含まれるVHおよびVLはハイブリドーマが産生する抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体のいずれをも用いることができる。
CDRを含むペプチドは、H鎖またはL鎖CDRの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のCDRは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。
【００７６】
（１）抗原の調製
抗原用部分ペプチドとしては、5〜30残基程度の蛋白質部分配列があげられる。
天然の構造を有する蛋白質を認識する抗体を取得する方法としては、立体構造において蛋白質の表面に存在している部分アミノ酸配列を抗原ペプチドとして選択する方法があげられる。
立体構造において蛋白質の表面に存在する部分アミノ酸配列は、KyteとDoolittleの方法［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー (Journal of Molecular Biology), 157, 105-132 (1982)］などにより、親水性の高い部分配列を予測することができる。親水性の低い部分は立体構造上蛋白質の内部に存在する場合が多く、親水性の高い部分は蛋白質表面に存在する場合が多い。また、蛋白質のN末端およびC末端は蛋白質表面に存在する場合が多い。
【００７７】
さらに、Chou-Fasmanの方法［アドバンセズ・イン・エンザイモロジー(Advances in Enzymology), 47, 45-147 (1978)］などによりアミノ酸配列から予測した蛋白質二次構造において、ターン構造やランダムコイル構造を有する部分を抗原用ペプチドとする方法もあげられる。
しかしながら、このように選択した部分ペプチドが目的通りの抗体を確立する抗原となるとは限らない。
部分ペプチドには、蛋白質と架橋するためにシステインを末端に付加する。蛋白質の内部配列を選択した場合には、必要に応じペプチドのN末端はアセチル化、C末端はアミド化する。
【００７８】
部分ペプチドは一般的な液相、固相ペプチド合成法およびそれらを適宜組み合わせる方法、またはそれらに準じる方法によって合成することができる［インターナショナル・ジャーナル・オブ・ペプタイド・アンド・プロテイン・リサーチ (International Journal of Peptide Protein Research), 35, 161-214 (1990)、「ソリッド−フェーズ・ペプタイド・シンセシス (Solid-Phase Peptide Synthesis)」, メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymology) 第289巻、グレッグ・B・フィールズ (Gregg B. Fields) 編、アカデミック・プレス (Academic Press)、(1997)、「ペプタイド・シンセシス・プロトコール (Peptide Synthesis Protocols)」, メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー(Methods in Molecular Biology) 第35巻、マイケル・W・ペニントン (Michael W. Pennington)、ベン・M・ダン (Ben M. Dunn) 編、ヒューマナ・プレス (Humana Press)、(1994)］。
【００７９】
また、自動ペプチド合成機を用いることもできる。ペプチド合成機によるペプチドの合成は、島津製作所製ペプチド合成機、アドバンスト・ケムテック社（Advanced ChemTech Inc., USA、以後 ACT社と略称する）製ペプチド合成機等の市販のペプチド合成機上で、適当に側鎖を保護した Nα-Fmoc-アミノ酸あるいは Nα-Boc-アミノ酸等を用い、それぞれの合成プログラムに従って実施することができる。原料となる保護アミノ酸および担体樹脂は、ABI 社、島津製作所、国産化学（株）、ノバビオケム社（NovaBiochem）、渡辺化学（株）、ACT 社、アナスペック社（AnaSpec Inc.）、またはペプチド研究所（株）等から入手することができる。
【００８０】
（２）ポリクローナル抗体の作製
ウサギ、ヤギまたは３〜２０週令のラット、マウスもしくはハムスターに、上記２．で取得され、上記３．（１）に従い調製される本発明の細胞死抑制ポリペプチド全長または部分断片精製標品（抗原）を、５０〜１００μｇ／匹程、該動物の皮下、静脈内または腹腔内に、適当なアジュバント〔例えば、フロインドの完全アジュバント(Complete Freund's Adjuvant)または、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕とともに投与する。
【００８１】
該抗原の投与は、1 回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。各投与後、３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法（ELISA 法）：医学書院刊 1976年、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)〕などで確認する。
【００８２】
免疫に用いた抗原に対し、該血清が充分な抗体価を示したウサギ、ヤギ、マウス、ラットまたはハムスターより血清を取得し、該血清より、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析法、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、プロテインＡ−カラムあるいはゲルろ過カラム等を用いたクロマト法等の常法を用いて精製抗体を取得する。
【００８３】
（３）モノクローナル抗体の作製
(a)抗体産性細胞の調製
免疫に用いた本発明のポリペプチドまたはその部分断片に対し、その血清が十分な抗体価を示したラットを抗体産生細胞の供給源として供する。
【００８４】
該抗体価を示したラットに抗原物質を最終投与した後３〜７日目に、脾臓を摘出する。
該脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
得られた沈殿画分の脾細胞をトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去した後、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。
【００８５】
(b)骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスまたはラットから取得した株化細胞を使用する。たとえば、8-アザグアニン耐性マウス（BALB/c由来）骨髄腫細胞株P3-X63Ag8-U1(以下、Ｐ３−Ｕ１と略す)［カレント・トピックス・イン・ミクロバイオロジィ・アンド・イムノロジィ（Curr. Topics Microbiol. Immunol.）, 81, 1(1978)］、［ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジィ(Europ. J. Immunol.),6, 511 (1976)］、SP2/0-Ag14(SP-2)［ネイチャー(Nature), 276, 269 (1978)］、P3-X63-Ag8653(653)［ジャーナル・オブ・イムノロジィ(J. Immunol.), 123,1548 (1979)］、P3-X63-Ag8(X63)［ネイチャー(Nature), 256, 495 (1975)］等を用いることができる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（1.5mmol/L）、２−メルカプトエタノール（5×10^-5Ｍ）、ジェンタマイシン（10μｇ/ｍｌ）および牛胎児血清（ＦＣＳ）（ＣＳＬ社製、10％）を加えた培地（以下、正常培地という）に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ/ｍｌ）を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地で培養し、融合には該細胞を2×10⁷個以上用いる。
【００８６】
(c)ハイブリドーマの作製
(a)で取得した抗体産生細胞と(b)で取得した骨髄腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム1.83ｇ、リン酸一カリウム0.21ｇ、食塩7.65ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ7.2）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝5〜10：1になるよう混合し、1,200ｒｐｍで5分間遠心分離した後、上清を捨てる。
【００８７】
得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に、攪拌しながら、37℃で、10⁸抗体産生細胞あたり、ポリエチレングライコール−１０００（ＰＥＧ−１０００） 2ｇ、ＭＥＭ 2ｍｌおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ） 0.7ｍｌを混合した溶液を 0.2〜1ｍｌ添加し、更に1〜2分間毎にＭＥＭ培地 1〜2ｍｌを数回添加する。
【００８８】
添加後、ＭＥＭ培地を加えて全量が50ｍｌになるように調製する。
該調製液を900ｒｐｍで5分間遠心分離後、上清を捨てる。
得られた沈殿画分の細胞を、ゆるやかにほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかにＨＡＴ培地〔正常培地にヒポキサンチン（10^-4Ｍ）、チミジン（1.5×10^-5Ｍ）およびアミノプテリン（4×10^-7Ｍ）を加えた培地〕100ｍｌ中に懸濁する。
【００８９】
該懸濁液を９６穴培養用プレートに100μｌ／穴ずつ分注し、5％ＣＯ₂インキュベーター中、37℃で7〜14日間培養する。
培養後、培養上清の一部をとりアンチボディイズ〔Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter14(1988)〕等に述べられている酵素免疫測定法により、本発明のポリペプチドまたはその部分断片に特異的に反応するハイブリドーマを選択する。
【００９０】
酵素免疫測定法の具体的例として、以下の方法をあげることができる。
免疫の際、抗原に用いた本発明のポリペプチドまたはその部分断片を適当なプレートにコートし、ハイブリドーマ培養上清もしくは後述の(d)で得られる精製抗体を第一抗体として反応させ、さらに第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗ラットイムノグロブリン抗体を反応させた後に標識物質に応じた反応を行ない、本発明のポリペプチドに特異的に反応するものを抗細胞死抑制ポリペプチドモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマとして選択する。
【００９１】
該ハイブリドーマを用いて、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し〔１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認められたものを抗細胞死抑制ポリペプチド抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
(d)モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理〔２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ） 0.5ｍｌを腹腔内投与し、２週間飼育する〕した 8〜10週令のマウスまたはヌードマウスに、(c)で取得した抗細胞死抑制ポリペプチドモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞5〜20×10⁶細胞／匹を腹腔内に注射する。10〜21日間でハイブリドーマは腹水癌化する。
【００９２】
該腹水癌化したマウスから腹水を採取し、3,000ｒｐｍで5分間遠心分離して固形分を除去する。
得られた上清を、40〜50％飽和硫酸アンモニウムによる塩析法、カプリル酸沈殿法〔Antibodies , A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)〕、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、プロテインＡ−カラムあるいはセルロファインGSL2000（生化学工業社製）を用いたカラムクロマト法等を用いて、ＩｇＧあるいはＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル抗体として使用する。
【００９３】
抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキットまたはラットモノクローナル抗体タイピングキットを用いて行う。蛋白質量は、ローリー法あるいは280ｎｍでの吸光度より算出する。
【００９４】
（４）遺伝子組換え抗体、各種抗体断片の作製
【００９５】
本発明のヒト型キメラ抗体は、本発明のポリペプチドを認識するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマより、VHおよびVLをコードするcDNAを取得し、ヒト抗体CHおよびヒト抗体CLをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト型キメラ抗体のCHとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、hIgと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、hIgGクラスのものが好適であり、更にhIgGクラスに属するhIgG1、hIgG2、hIgG3、hIgG4といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のCLとしては、hIgに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
【００９６】
本発明のヒト型CDR移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLのCDR配列を任意のヒト抗体のVHおよびVLのCDR配列に移植したV領域をコードするcDNAを構築し、ヒト抗体のCHおよびヒト抗体のCLをコードする遺伝子を有するヒト型CDR移植抗体発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型CDR移植抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入することによりヒト型CDR移植抗体を発現させ、製造することができる。
【００９７】
本発明のヒト型CDR移植抗体のCHとしては、hIgに属すればいかなるものでもよいが、hIgGクラスのものが好適であり、更にhIgGクラスに属するhIgG1、hIgG2、hIgG3、hIgG4といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、該ヒト型CDR移植抗体のCLとしては、hIgに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
【００９８】
ヒト体内に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、EBウイルス等を感染させ不死化、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養でき、培養物中より該抗体を精製することができる。
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトB細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりFab、scFv等の抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、更に遺伝子工学的手法により、2本の完全なH鎖および2本の完全なL鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
本発明のFabは、上記抗体を蛋白質分解酵素パパインで処理して得ることができる。または、該抗体のFabをコードするDNAを発現ベクターに挿入し、該ベクターを宿主細胞へ導入することにより発現させ、Fabを製造することができる。
【００９９】
本発明のF(ab')₂は、上記抗体を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。または、下記のFab'をチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させ、作製することができる。
本発明のFab'は、上記F(ab')₂を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。または、該抗体のFab'断片をコードするDNAを発現ベクターに挿入し、該ベクターを宿主細胞へ導入することによりFab'を発現させ、製造することができる。
本発明のscFvは、上記抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを取得し、scFvをコードするDNAを構築し、該DNAを発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入することによりscFvを発現させ、製造することができる。
【０１００】
本発明のdsFvは、抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを取得し、dsFvをコードするDNAを構築し、該DNAを発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより発現させ、dsFvを製造することができる。
本発明のCDRを含むペプチドは、抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを取得した後、該cDNAを発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより発現させ、CDRを含むペプチドを製造することができる。
また、CDRを含むペプチドは、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によって製造することもできる。
【０１０１】
（５）モノクローナル抗体を用いた免疫細胞染色
付着細胞を用いて免疫細胞染色を行う場合には、予め下記の処理をすることにより、培養フラスコより剥がした細胞を用いることが好ましい。
【０１０２】
即ち、培養付着細胞をＰＢＳ緩衝液で洗浄し、0.05％トリプシン、0.02％ＥＤＴＡ(エチレンジアミン４酢酸)を含むＰＢＳ緩衝液3ｍｌを加え、余分な溶液を除いた後、37℃、5分間インキュベートすることによりフラスコより細胞を剥がす(以下、この操作をトリプシン−ＥＤＴＡ処理と呼ぶ)。
浮遊細胞については培養細胞をそのまま用いることができる。
【０１０３】
免疫細胞染色を行う細胞を免疫細胞染色用緩衝液（1％ＢＳＡ、0.02％ＥＤＴＡ、0.05％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）等に懸濁し、1〜20×10⁵個ずつ丸底９６穴プレートに分注する。
該プレートに、（ｃ）で取得した抗細胞死抑制ポリペプチドモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養上清、（ｄ）で取得した精製モノクローナル抗体、もしくは該モノクローナル抗体を公知の方法（酵素抗体法：学際企画刊1985年）でビオチン標識した抗体を 0.1〜50μｇ／ｍｌの濃度になるように免疫細胞染色用緩衝液あるいは10％動物血清を含む免疫細胞染色用緩衝液を用いて希釈したものを20〜500μｌ／穴となるように分注し、氷冷下で30分間放置する。
【０１０４】
上記において、（ｃ）で取得した抗細胞死抑制ポリペプチドモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養上清または（ｄ）で取得した精製モノクローナル抗体を用いた場合には、上記プレートに免疫細胞染色用緩衝液を添加し、細胞を洗浄後、ＦＩＴＣあるいはフィコエリスリン等の蛍光色素で標識した抗マウスイムノグロブリン抗体あるいは抗ラットイムノグロブリン抗体を0.1〜50μｇ／ｍｌ程度の濃度で含む免疫細胞染色用緩衝液を50〜500μｌ／穴ほど分注し、氷冷下で30分間遮光して放置する。
【０１０５】
ビオチン標識した該モノクロ−ナル抗体を用いた場合には、上記プレートにストレプトアビジンを50〜500μｌ／穴ほど分注し、氷冷下で30分間遮光して放置する。
両ケースとも、放置後、プレートに免疫細胞染色用緩衝液を添加し、細胞を良く洗浄し、セルソーターにより解析する。
（６）本発明のポリペプチドの免疫沈降
本発明のポリペプチドを発現するＣＨＯ細胞あるいは昆虫細胞をシャーレ等の培養容器中で培養する。
【０１０６】
該培養容器にＰＢＳを添加し、細胞を洗浄する。
該培養容器に氷冷した1％ Triton X100、 20mmol/L Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、150mmol/L ＮａＣｌからなる緩衝液（以後、緩衝液１と呼ぶ）等の細胞膜を可溶化する緩衝液を１００〜５００μｌ添加し、氷上で３０分間静置した後、５分間隔でゆっくり振動させ、可溶化処理する。
【０１０７】
該処理液を１．５ｍｌ用遠心チューブに回収し、１４，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離する。
得られた上清に、上記で用いた緩衝液で平衡化させたプロテインＧ−セファロースもしくはプロテインＡ−セファロースを１０〜５０μｌ添加し、４℃で１時間以上振盪した後、５，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を回収する。
【０１０８】
該上清に、（ｃ）で取得した抗細胞死抑制ポリペプチドモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養上清または（ｄ）で取得した精製モノクローナル抗体を０．０１〜５０μｇ／ｍｌとなるように添加し、４℃で１時間以上振盪する。
該振盪液にプロテインＧーセファロースもしくはプロテインＡーセファロースを１０〜５０μｌ添加し、４℃で１時間以上振盪後、５，０００ｒｐｍで２分間遠心分離する。
【０１０９】
得られた沈殿画分に２００μｌの上記の細胞膜を可溶化する緩衝液を添加し、沈殿を懸濁させる。同様の操作を３度以上繰り返し、沈殿画分を洗浄する。
該沈殿にＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動用サンプルバッファーを添加し、ヒートブロックを用いて加熱した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了後、得られたゲル中のポリペプチドをＰＶＤＦ膜等へ転写し、本発明の抗細胞死抑制ポリペプチドポリクローナル抗体等を用いたウエスタンブロッティング法等により細胞死抑制ポリペプチドを検出する。
【０１１０】
４．本発明のポリぺプチドと特異的に結合する物質のスクリーニング法
本発明のポリペプチドと被験試料とを接触させ、被験試料の中から本発明のポリペプチドに結合する物質を選択して、本発明のポリペプチドに結合する物質をスクリーニングすることにより、本発明のポリペプチドと特異的に結合する物質をスクリーニングすることができる。
【０１１１】
被験試料として、合成化合物、天然に存在するまたは人工的に合成された抗体、タンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、糖質、脂質、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡのアンチセンスＤＮＡおよびそれらの修飾体、誘導体などの他に、例えば、哺乳動物（例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル、ヒトなど）の尿、体液、組織抽出物、細胞培養上清、細胞抽出物、さらに発酵生産物、植物その他の生物の抽出物等を挙げることができるが、それらに限定されない。
【０１１２】
具体的には本来、本発明のポリペプチドを発現していない細胞と、該細胞に本発明の細胞死抑制遺伝子を導入発現させた細胞の両細胞に被験試料を接触させ、例えば、細胞内カルシウム、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ等の細胞内情報伝達分子濃度の変化、細胞内蛋白質のリン酸化、初期転写因子遺伝子の発現変化、細胞膜電位の変化、細胞内ｐＨの変化、細胞外情報伝達分子の遊離、細胞の形態変化等、種々の細胞刺激活性を両細胞において測定し、両細胞における差異を詳細に比較、解析することにより、該ポリペプチドに結合する物質をスクリーニングすることができる。
【０１１３】
また、被験試料がポリペプチドである場合、宿主細胞の中に、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターとともに、被験試料であるポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターを導入する。その導入した発現ベクターを発現させて、細胞内で本発明のポリペプチドと被験試料であるポリペプチドを接触できるようにする。その細胞内で本発明のポリペプチドと被験試料であるポリペプチドが結合すると、細胞自体の色が変化するように設定して、目視で本発明のポリペプチドと被験試料であるポリペプチドの結合が確認できるようにする。目視で確認できた細胞を取り出して、被験試料であるポリペプチドをコードするＤＮＡを同定すれば、本発明のポリペプチドに結合する物質をスクリーニングすることができる。
【０１１４】
被験試料のうち、合成化合物、天然に存在するあるいは人工的に合成された蛋白質、糖質、脂質およびそれらの修飾体、誘導体を、酵素、放射能等により標識する。標識された被験試料の、本発明のポリぺプチドを発現する細胞、該細胞膜画分、もしくはマイクロタイタープレート等へ固層化した本発明のポリぺプチドに対する結合量を測定することにより、被験試料の本発明のポリペプチドに結合する物質であるか否かの同定が可能である。
【０１１５】
また、本発明のポリぺプチド、該ポリペプチドの部分改変体又は部分ぺプチドを、BIAcore(Pharmacia Biotech社製)のセンサーチップに共有結合させ被験試料を接触させる方法〔Nature, 368, 558 (1994)〕により、該ポリペプチドに結合する物質を探索し、同定することができる。
更に、標識した本発明のポリぺプチド、または非標識の本発明のポリぺプチドと該ポリぺプチドに対する標識抗体を用いて、該ポリぺプチドと特異的に会合する該ポリペプチドに結合する物質を以下の方法で探索し、同定することが可能である。
【０１１６】
即ち、尿、体液、組織抽出物、細胞培養上清、細胞抽出物などの被験試料を適当な分画を行った後、ポリアクリルアミド電気泳動、アガロース電気泳動、二次元電気泳動などの電気泳動や、ＨＰＬＣ等のカラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー等の手法によりさらに分画し、本発明の細胞死抑制遺伝子を発現している個体と発現していない個体、または本発明の細胞死抑制遺伝子を発現している細胞と発現していない細胞等の間における差異を詳細に比較、解析することにより、本発明の細胞死抑制遺伝子の発現と特異的に相関して認められる(または消失する)バンドやスポット、ピークを特定する。
【０１１７】
該バンド、スポット、ピークより、ブロッティングの手法を用いて、ゲルまたは薄層プレートからニトロセルロース膜、ナイロン膜、ＰＶＤＦ膜等の支持体に写し取った後、標識した本発明の細胞死抑制遺伝子ポリぺプチドまたは非標識の該ポリぺプチドと該ポリぺプチドに対する標識抗体を用いて、該ポリぺプチドと特異的に結合するバンド、スポットを探索し、該バンド、スポットより該ポリペプチドに結合する物質を抽出し、同定することができる。
【０１１８】
５．本発明のポリぺプチドの活性を抑制する物質のスクリーニング法
該スクリーニングにより得られる物質には、本発明のポリぺプチドの有する活性を阻害する活性を有する物質(アンタゴニスト)が含まれる。
【０１１９】
該物質のスクリーニング方法として、例えば、以下の方法をあげることができる。
本発明の細胞死抑制遺伝子を導入発現させた細胞もしくは本来本発明の細胞死抑制遺伝子を発現している細胞に、被験試料を接触させ、例えば、細胞内カルシウム、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ等の細胞内情報伝達分子濃度の変化、細胞内蛋白質のリン酸化、初期転写因子遺伝子の発現変化、細胞膜電位の変化、細胞内ｐＨの変化、細胞外情報伝達分子の遊離、細胞の形態変化、アポトーシス活性等の種々の細胞刺激活性を測定することにより、本発明のポリぺプチドの有する活性を阻害する物質を探索し、同定する方法をあげることができる。
【０１２０】
被験試料として、合成化合物、天然に存在するまたは人工的に合成された抗体、タンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、糖質、脂質、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡのアンチセンスＤＮＡおよびそれらの修飾体、誘導体などの他に、例えば、哺乳動物（例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル、ヒトなど）の尿、体液、組織抽出物、細胞培養上清、細胞抽出物、さらに発酵生産物、植物その他の生物の抽出物等を挙げることができるが、それらに限定されない。
【０１２１】
６．本発明のポリペプチドの発現を制御する物質（以下、発現制御物質と略す）のスクリーニング法
（１）本発明のポリペプチドを認識する抗体を用いたスクリーニング法
ここで、ポリペプチドの発現を制御するとは、その発現を増強する場合とその発現を抑制する場合の両方を包含する。
本発明のポリペプチドを発現する細胞を被験試料と接触させた後、本発明のポリペプチドを認識する抗体を用いて、該ポリペプチドを定量することにより、発現制御物質をスクリーニングすることができる。
本発明のポリペプチドを発現する細胞として、例えば腫瘍細胞、癌細胞、あるいはそれら細胞由来の細胞株（例えば、マウスｐｒｏＢ細胞由来のBa/F3−Ａｄ細胞等）をあげることができる。また、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡが導入された本発明の形質転換体を用いることができる。
【０１２２】
被験試料として、合成化合物、天然に存在するまたは人工的に合成された抗体、タンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、糖質、脂質、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡのアンチセンスＤＮＡおよびそれらの修飾体、誘導体などの他に、例えば、哺乳動物（例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル、ヒトなど）の尿、体液、組織抽出物、細胞培養上清、細胞抽出物、さらに発酵生産物、植物その他の生物の抽出物等を挙げることができるが、それらに限定されない。
【０１２３】
本発明のポリペプチドを発現する細胞を、例えば該細胞の増殖することのできる培地に懸濁し、被験試料を該培地に添加し、該細胞を接触させた後、該細胞の発現したポリペプチド含量を、上記３．記載のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用い、上記４．記載の方法に準じて定量する。被験試料を添加しない系と比較し、ポリペプチド含量を増加あるいは減少させることのできた被験試料を探索することにより、発現制御物質を同定することができる。
【０１２４】
（２）本発明の細胞死抑制遺伝子の転写産物の定量系を利用したスクリーニング法
本発明のポリペプチドを発現する細胞を被験試料と接触させた後、本発明の細胞死抑制遺伝子の転写産物を定量することにより発現制御物質を探索、同定することができる。
本発明のポリペプチドを発現する細胞および被験試料として、上記（１）記載のものを用いることができる。
【０１２５】
本発明のポリペプチドを発現する細胞を、例えば該細胞の増殖することのできる培地に懸濁し、被験試料を該培地に添加し、該細胞を接触させた後、該細胞の発現した細胞死抑制遺伝子の転写産物の量を、通常のノーザン・ブロット・ハイブリダイゼーション法、ＲＮＡのドット・ブロット・ハイブリダイゼーション法、ＲＴ−ＰＣＲ法などを用い定量することができる。
【０１２６】
ハイブリダイゼーション法等に用いることのできるプローブおよびＲＴ−ＰＣＲ法等に用いることのできるプライマーとして、本発明の細胞死抑制遺伝子断片をあげることができ、具体的には配列番号７、８で示される塩基配列から選ばれる配列を有するＤＮＡ断片を好適に用いることができる。
被験試料を添加しない系と比較し、本発明の細胞死抑制遺伝子の転写産物含量を増加あるいは減少させることのできる被験試料を探索することにより、発現制御物質を同定することができる。
【０１２７】
（３）レポーター遺伝子を利用したスクリーニング法
本発明のポリぺプチドをコードする遺伝子の転写を制御する領域（以下、転写制御領域と略す）の下流にレポーター遺伝子の連結されたＤＮＡを含むプラスミドで形質転換された形質転換体と被験試料とを接触させた後、レポーター遺伝子によりコードされたポリペプチドの発現量を定量することにより発現制御物質を探索、同定することができる。
【０１２８】
レポーター遺伝子としては、該遺伝子の翻訳産物が細胞内で安定であり、該翻訳産物の存在量が容易に定量できるものであればいかなるものでも用いることができ、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(ＣＡＴ)、β-ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、グリーンフルオレッセントプロテイン（ＧＦＰ）等をあげることができる。
【０１２９】
被験試料として、上記（１）記載のものを用いることができる。
転写制御領域の下流に常法によりレポーター遺伝子を連結し、作製したプラスミドを用い、常法により宿主細胞を形質転換する。
該形質転換体を、例えば該細胞の増殖することのできる培地に懸濁し、被験試料を該培地に添加し、該細胞を接触させた後、該細胞の発現したレポーター遺伝子の転写産物の量を、該転写産物に適した方法で検出、定量する。
【０１３０】
検出、定量法として、ＣＡＴの場合には、例えば、モレキュラー・クローニング第２版，１６章，６０頁に記載の方法を、β−ｇａｌの場合には、例えば、モレキュラー・クローニング第２版，１６章，６６頁に記載の方法を、ｌｕｃの場合には、例えば、実験医学別冊バイオマニュアルシリーズ４遺伝子導入と発現・解析法, 81(1994)に記載の方法を、GFPの場合には、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94, 4653 (1997)記載の方法等をあげることができる。
【０１３１】
被験試料を添加しない系と比較し、本発明の細胞死抑制遺伝子の転写産物含量を増加又は減少させることのできる被験試料を探索することにより、発現制御物質を同定することができる。
【０１３２】
７．本発明のポリペプチドおよびその関連物質の医薬等への利用
（１）本発明の抗細胞死抑制ポリペプチド抗体またはその抗体断片を用いる免疫学的測定法により、血液、臓器の一部、細胞等のサンプルでの細胞死抑制ポリペプチドの検出、定量を行うことができる。具体的に好適な手法としてはマイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法などがあげられ、また病理組織切片を用いた免疫組織染色にも利用できる。
従って該抗体は細胞死を抑制する活性を有するポリペプチド発現の増強又は低下に伴う、細胞死が促進されて引き起こされる疾患（例えば、糖尿病、神経変性疾患、劇症肝炎、ウイルス疾患、放射線障害、又は虚血時あるいは抗癌剤使用時の細胞死）、細胞死が抑制されて引き起こされる疾患（例えば、悪性腫瘍、又は自己免疫疾患）の発生の可能性の診断に有用である。同様に該ポリペプチドを対象とした研究における研究用試薬としても有用である。
【０１３３】
（２）本発明のポリペプチドの全長または部分断片を生体に投与することにより細胞死の抑制が可能である。従って細胞死の進行に密接に関連して生ずる種々の疾患、例えば、糖尿病、神経変性疾患、劇症肝炎、ウイルス疾患、放射線障害、又は虚血時あるいは抗癌剤使用時の細胞死等の治療薬、予防薬として有用である。
（３）本発明の細胞死抑制遺伝子をレトロウィルス、アデノウィルス等のウィルスベクターやその他のベクターに組み込み、遺伝子治療用ベクターとすることができる。この遺伝子治療用ベクターを用いることにより細胞死が促進されて引き起こされる疾患の治療に用いることができる。
【０１３４】
（４）本発明の細胞死抑制遺伝子を用いて、ノーザンハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法により、該遺伝子の発現量を測定し、細胞死が促進されて引き起こされる疾患（例えば、糖尿病、神経変性疾患、劇症肝炎、ウイルス疾患、放射線障害、又は虚血時あるいは抗癌剤使用時の細胞死）、細胞死が抑制されて引き起こされる疾患（例えば、悪性腫瘍、又は自己免疫疾患）の発生の可能性の診断するとともに、該細胞死抑制遺伝子を前記疾患の発症抑制に利用することができる。
また、該細胞死抑制遺伝子の先天的な欠損により、細胞死が促進され、細胞死が促進されて引き起こされる疾患を生じやすくなった個体を、該細胞死抑制遺伝子を用いたサザン・ブロット・ハイブリダイゼーションやＰＣＲ法あるいはＳＳＣＰ法により検出し、該検出された個体の核酸配列情報を基に遺伝子診断を行うことができる。更に該細胞死抑制遺伝子は遺伝子研究用試薬としても極めて有用である。
【０１３５】
（５）本発明の組換え体ＤＮＡを含む形質転換体は、本発明のポリペプチドの代替もしくは補助、又は本発明のポリペプチドに結合する物質、本発明のポリペプチドの有する活性を阻害する物質などのスクリーニングなどに使用できる。
【０１３６】
（６）本発明のポリぺプチドは、該ポリペプチドに結合する物質をスクリーニングするための試薬として有用である。
（７）本発明のポリぺプチドと該ポリペプチドに結合する物質とを用いて、該ポリぺプチドと該ポリペプチドに結合する物質の特異的結合を阻害する化合物のスクリーニングに用いることができる。
【０１３７】
（８）本発明のポリぺプチドと該ポリペプチドに結合する物質を利用し、該ポリペプチドと該ポリペプチドに結合する物質が結合した結果誘導される物質を探索、同定することができる。
（９）本発明のポリペプチドに結合する物質、本発明のポリペプチドに結合して該ポリペプチドの有する活性を阻害する物質、本発明のポリぺプチドと該ポリペプチドに結合する物質との特異的結合を阻害する物質、本発明のポリペプチドと該ポリペプチドに結合する物質が結合した結果誘導される物質は、本発明のポリぺプチドの細胞死抑制機能を代替もしくは補助、または阻害すると考えられ、これら物質を含む薬剤は、細胞死が促進されて引き起こされる疾患（例えば、糖尿病、神経変性疾患、劇症肝炎、ウイルス疾患、放射線障害、又は虚血時あるいは抗癌剤使用時の細胞死）、細胞死が抑制されて引き起こされる疾患（例えば、悪性腫瘍、又は自己免疫疾患）のための診断薬、予防薬あるいは治療薬として有用である。
【０１３８】
（１０）本発明のポリペプチドをコードする細胞死抑制遺伝子の発現を制御（増加又は抑制）する物質（発現制御物質）は、本発明のポリペプチド同様、細胞死が促進されて引き起こされる疾患（例えば、糖尿病、神経変性疾患、劇症肝炎、ウイルス疾患、放射線障害、又は虚血時あるいは抗癌剤使用時の細胞死）、細胞死が抑制されて引き起こされる疾患（例えば、悪性腫瘍、又は自己免疫疾患）の治療、予防に有用である。
【０１３９】
（１１）本発明のポリペプチドの細胞死を抑制する活性を阻害する物質としては、前述のスクリーニング法により得られた物質、本発明のＤＮＡの塩基配列に基づいて調製したアンチセンス鎖ＤＮＡあるいは本発明の抗体またはその抗体断片などがあげられる。本発明の抗体またはその抗体断片の調製方法については前述のとおりである。
本発明のＤＮＡの塩基配列に基づいて調製したアンチセンス鎖ＤＮＡは、以下の方法によって調製できる。
上述の方法で取得した本発明のＤＮＡまたはＤＮＡ断片を用いて、モレキュラー・クローニング第２版等に記載の常法により、あるいは該ＤＮＡの塩基配列情報よりＤＮＡ合成機により、本発明のＤＮＡの一部の配列を有するアンチセンス・オリゴヌクレオチド、センス・オリゴヌクレオチド等のオリゴヌクレオチドを調製することができる。
【０１４０】
該オリゴヌクレオチドとしては、上記ＤＮＡの有する塩基配列中の連続した５〜６０塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡをあげることができ、具体的には、配列番号１又は３で表される塩基配列中の連続した５〜６０塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡをあげることができる。センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして用いる場合には、両者の融解温度（Ｔｍ）および塩基数が極端に変わることのない上記記載のオリゴヌクレオチドが好ましい。具体的には、配列番号７，８等に示された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをあげることができる。
【０１４１】
更に、これらオリゴヌクレオチドの誘導体（以下、オリゴヌクレオチド誘導体という）も本発明のアンチセンス鎖ＤＮＡとして利用することができる。
該オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（phenoxazine-modified cytosine)で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、あるいはオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等をあげることができる〔細胞工学, 16, 1463 (1997)〕。
【０１４２】
本発明のポリペプチドの細胞死を抑制する活性を阻害する物質は、細胞死が抑制されて引き起こされる疾患（例えば、悪性腫瘍、又は自己免疫疾患）の発生の診断、予防あるいは治療に有用である。
【０１４３】
８．細胞死抑制遺伝子が欠損または置換した遺伝子改変非ヒト動物、その作製法と利用法
細胞死抑制遺伝子の全部或いはその一部が欠損または置換した、不活性型または置換型細胞死抑制遺伝子を含むベクターを用い胚性幹細胞(embryonic stem cell)において染色体上の細胞死抑制遺伝子を公知の相同組換えの手法〔例えば、Nature, 326, 295 (1987)、Cell, 51, 503 (1987)等〕により不活化または任意の配列と置換した変異クローンを作成することができる〔例えば、Nature, 350, 243 (1991)〕。
【０１４４】
具体的には図１６で示した遺伝子断片を用いることができる。ターゲティングベクターは以下のように造成できるが、これに限定するものではない。
図１６のSpeI-SpeI断片(short arm：約1.5kb)、PGKneobpAカセット〔PGKプロータ-ネオマイシン耐性遺伝子-ウシ成長ホルモン遺伝子ポリアデニレーションシグナル配列からなるネオマイシン耐性遺伝子発現ユニット、 Cell， 64, 693 (1991)〕、図１６のSmaI-KpnI断片(lomg arm：約6kb)、MC1/DT-Aカセット〔MC1プロモータとジフテリア毒素A鎖からなるジフテリア毒素A鎖発現ユニット、 Analytical biochemistry, 214, 77 (1993)〕を図１６のTargeting vectorに示したように連結した断片を含有するpBluescriptIISK(-)を造成する。該ベクターをNotIなどで切断し線状化した後、TT2細胞[Analytical Biochemistry， 214， 70 (1993)]などのES細胞株に導入する。G418耐性を有するクローンよりPCR法またはサザンハイブリダイゼーション法により、相同組換えを起こして本細胞死抑制遺伝子のエクソン１部分が破壊されたクローンを選択する。
【０１４５】
このようにして作成した胚性幹細胞クローンを用い、動物の受精卵の胚盤胞(blastocyst)への注入キメラ法または集合キメラ法等の手法により胚性幹細胞クローンと正常細胞からなるキメラ個体を作成することができる。このキメラ個体と正常個体の掛け合わせにより、全身の細胞の本発明の細胞死抑制遺伝子に変異を有する個体を得ることができ、さらにその個体の掛け合わせにより相同染色体の双方に変異が入った、ホモ個体を得ることができる。
【０１４６】
このようにして動物個体において、細胞死抑制遺伝子の任意の位置へ変異の導入が可能である。例えば細胞死抑制遺伝子の翻訳領域中への塩基置換、欠失、挿入等の変異を導入することにより、その産物の活性を変化させることができる。またその発現制御領域への同様な変異の導入により、発現の程度、時期、組織特異性等を改変させることも可能である。さらにCre-loxP系〔 J. Clin. Invest., 98, 600 (1996)〕との組合せにより、より積極的に発現時期、発現部位、発現量等を制御することも可能である。このような例としては脳のある特定の領域で発現されるプロモータを利用して、その領域でのみ目的遺伝子を欠失させた例〔Cell, 87, 1317 (1996)〕やCreを発現するアデノウィルスを用いて、目的の時期に、臓器特異的に目的遺伝子を欠失させた例〔Science, 278, 5335 (1997)〕が知られている。
【０１４７】
従って本発明の細胞死抑制遺伝子についてもこのように任意の時期や組織で発現を制御できる、または任意の挿入、欠失、置換および／または付加をその翻訳領域や、発現制御領域に有する動物個体を作成することが可能である。このような動物は任意の時期、任意の程度または任意の部位で、細胞死と細胞死に伴って生ずる、細胞死が促進されて引き起こされる疾患（例えば、糖尿病、神経変性疾患、劇症肝炎、ウイルス疾患、放射線障害、又は虚血時あるいは抗癌剤使用時の細胞死）の症状を誘導することができる。従って細胞死や上記の種々の疾患の治療や予防において極めて有用な動物モデルとなる。特にその治療薬、予防薬、また機能性食品、健康食品等の評価用モデルとして非常に有用である。
【０１４８】
上記遺伝子改変非ヒト動物、あるいは該動物の臓器、組織または細胞と被験化合物を接触させ、被験化合物の中から該動物、あるいは該動物の臓器、組織または細胞の動態を変化させる被験化合物を選択することにより、細胞死の抑制あるいは促進に起因する疾患の予防薬、診断薬又は治療薬のスクリーニングを行うことができる。
上述の如く、これらスクリーニング方法により得られる物質は、細胞死が促進されて引き起こされる疾患（例えば、神経変性疾患、劇症肝炎、ウイルス疾患、放射線障害、又は虚血時あるいは抗癌剤使用時の細胞死）、細胞死が抑制されて引き起こされる疾患（例えば、糖尿病、悪性腫瘍、又は自己免疫疾患）の治療、予防に有用である。
【０１４９】
９．本発明のポリペプチドの活性を制御する細胞死の制御方法
本発明において、ポリペプチドの活性を制御するとは、その活性を抑制する場合あるいは促進する場合を意味する。
本発明のポリペプチドの活性を抑制する場合には、上記本発明の抗体またはその抗体断片、上記アンチセンス鎖ＤＮＡ、上記スクリーニングで得られた物質等を用いて行うことができる。
本発明のポリペプチドの活性を促進する場合には、本発明のポリペプチド、本発明のＤＮＡ、本発明の組換え体ＤＮＡ、上記スクリーニングで得られた物質等を用いて行うことができる。
【０１５０】
１０．本発明のマウスｐｒｏＢ細胞由来のBa/F3−Ａｄ細胞
Ba/F3−Ａｄ細胞は、ＩＬ−３がなくとも培養下で生存及び／又は増殖でき、培養下の培養器上の細胞外マトリックスに接着可能な性質を有するマウスｐｒｏＢ細胞由来の細胞株である。このBa/F3−Ａｄ細胞は、細胞内のＨ−Ｒａｓ分子が活性化状態にあることが好ましい。
これらのBa/F3−Ａｄ細胞は、親株であるIL-3依存性マウスproB細胞株Ba/F3（理研ジーンバンク cell number:ＲＣＢ０８０５）細胞を培養している中で、培養器に接着しているものを選択し、それを取りだして、更にIL-3の非存在下で培養し、生存あるいは増殖する細胞を選択することで作成することができる。
具体的には、Ba/F3細胞を通常の培地[0.1ng/mlマウスIL-3(Ｒ＆Ｄsystems社製)を添加した、10%FCS含有RPMI-1640（ナカライテスク社製）]で培養し、細胞皿に付着した細胞のみを分離し、分離された細胞を10%FCS含有RPMI-1640で培養することにより、Ba/F3-Ad細胞を単離することができる。
本発明のBa/F3−Ａｄ細胞は、上記の如く、細胞死についての研究、細胞接着のメカニズムの研究等の材料として特に有用である。
【０１５１】
１１．本発明の医薬
本発明の医薬において、細胞死が促進されて引き起こされる疾患、細胞死が抑制されて引き起こされる疾患としては、以下の疾病があげられる。具体的には、アポトーシスによる過剰な細胞死が発症に関わる疾患として、例えば劇症肝炎やその他のウイルス疾患、アルツハイマー病などの神経変性疾患、放射線障害などがあげられ、逆にアポトーシス抑制が発症に関わる疾患として、例えば胃癌、卵巣癌、乳癌、膵癌、前立腺癌等の悪性腫瘍や自己免疫疾患などがあげられる。また、糖代謝制御シグナルの異常によって生じる疾患として、糖尿病等があげられる。
さらに、本発明の医薬は、脳、心臓などの虚血時における細胞死抑制剤、
抗癌剤や放射線治療時における正常細胞の細胞死からの保護剤、または抗癌剤等の既存の治療薬の効果を増強する薬剤として使用される。
【０１５２】
抗癌剤としては、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質、植物アルカロイドがあげられ、さらに具体的には、ブスルファン (busulfan)、シクロフォスファミド (cyclophosphamide)、イホスファミド (ifosphamide)、メルファラン (melphalan)、ニトロソウレア (nitrosourea)、アムサクリン (amsacrine)、カルボプラチン (carboplatin)、シスプラチン (cisplatin)、ダカルバジン (dacarbazine)、アザシチジン (azacitidine)、クラドリビン (cladribine)、シタラビン (cytarabine)、フルダラビン (fludarabine)、フルオロウラシル (fluorouracil)、ヒドロキシウレア (hydroxyurea)、ロイコボリン (leucovorin)、メトトレキサート (methotrexate)、アクチノマイシンD (actinomycin D)、ブレオマイシン (bleomycin)、ダウノルビシン (daunorubicin)、ドキソルビシン (doxorubicin)、マイトマイシンC (mitomycin C)、ミトキサントロン (mitoxantrone)、エトポシド (etoposide)、パクリタキセル (pacritaxel)、テニポシド (teniposide)、ビンブラスチン (vinblastine)、ビンクリスチン (vincristine)、ビンデシン (vindesine)、ゲルダナマイシンおよびラディシコールがあげられる。
【０１５３】
これらの抗癌剤と同時に本発明の活性成分を患者に投与することも可能であるし、別々の容器に封入した組み合わせ（キット）として、スケジュールを決めて別々に投与することも可能である。また、本発明の活性成分に、スペーサーを介して上記の抗癌剤を結合させて生体へ投与してもよい。
患者への投与方法としては、活性成分であるポリぺプチドをコードする遺伝子を挿入させた遺伝子治療用に調製した組換えベクターを、患者から取り出した細胞に導入させた後、細胞を生体内に戻す方法、レトロウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、単純ヘルペスウィルス、レンチウィルス、センダイウィルス等のウィルスベクターに乗せて生体に投与する方法、リポソームなどの人工的なビークル構造に封入して生体に投与する方法、活性成分であるポリペプチドに細胞内への導入効率を高めるペプチド断片、例えば実施例に記載されたTATペプチド [Science, 285, 1569-1572 (1999)] などを融合させて生体に投与する方法などがあげられる。
抗癌剤と本発明の活性成分の投与比、投与スケジュールは、患者の年齢、体重、治療すべき症状の性質もしくは重篤度を考慮して決定される。
【０１５４】
本発明の活性成分は、医薬製剤として、単独で、あるいは任意の他の治療のための有効成分との混合物として含有することができる。また、それら医薬製剤は、活性成分を薬理学的に許容される一種もしくはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造される。
【０１５５】
投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口または、例えば静脈内などの非経口をあげることができる。
【０１５６】
投与形態としては、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、注射剤などがある。
【０１５７】
経口投与に適当な、例えばシロップ剤のような液体調製物は、水、蔗糖、ソルビット、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、p-ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを使用して製造できる。また、錠剤、散剤および顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、蔗糖、マンニットなどの賦形剤、澱粉、アルギン酸ソーダなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを用いて製造できる。
【０１５８】
非経口投与に適当な製剤は、好ましくは受容者の血液と等張である活性化合物を含む滅菌水性剤からなる。例えば、注射剤の場合は、塩溶液、ブドウ糖溶液または塩水とブドウ糖溶液の混合物からなる担体などを用いて注射用の溶液を調製する。
【０１５９】
また、これら非経口剤においても、経口剤で例示した希釈剤、防腐剤、フレーバー類、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤などから選択される1種もしくはそれ以上の補助成分を添加することもできる。
【０１６０】
本発明の活性成分の投与量および投与回数は、投与形態、患者の年齢、体重、治療すべき症状の性質もしくは重篤度により異なるが、通常経口の場合、成人一人当り0.01 mg〜1 g、好ましくは0.05〜50 mgを一日一回ないし数回投与する。静脈内投与などの非経口投与の場合、成人一人当り0.001〜100 mg、好ましくは0.01〜10 mgを一日一回ないし数回投与する。しかしながら、これら投与量および投与回数に関しては、前述の種々の条件により変動する。
【０１６１】
【実施例】
以下、本発明の実施例を示すが、本発明の内容がこれらに限定されるものではない。
遺伝子操作的手法は特に断らない限り公知のモレキュラー・クローニング第２版及び「実験医学別冊新遺伝子工学ハンドブック」（１９９６年、４月２０日発行）（羊土社）に記載されている方法により行った。
本発明において使用したアミノ酸およびその保護基に関する略号は、生化学命名に関するIUPAC-IUB委員会（IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature）の勧告〔ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（European Journal of Biochemistry），138 巻，9 頁（1984 年）〕に従った。
以下の略号は、特に断わらない限り対応する下記のアミノ酸を表す。
【０１６２】
Ala: L-アラニン
Asn: L-アスパラギン
Asp: L-アスパラギン酸
Asx: L-アスパラギン酸またはL-アスパラギン
Arg: L-アルギニン
Cys: L-システイン
Gln: L-グルタミン
Glu: L-グルタミン酸
Glx: L-グルタミン酸またはL-グルタミン
Gly: グリシン
Ile: L-イソロイシン
Leu: L-ロイシン
Lys: L-リジン
Phe: L-フェニルアラニン
Pro: L-プロリン
Ser: L-セリン
Thr: L-スレオニン
Met: L-メチオニン
Val: L-バリン
【０１６３】
以下の略号は、対応する下記のアミノ酸の保護基および側鎖保護アミノ酸を表す。
【０１６４】
Fmoc: 9-フルオレニルメチルオキシカルボニル
tBu: ｔ-ブチル
Trt: トリチル
Boc: t-ブチルオキシカルボニル
Pmc: 2, 2, 5, 7, 8-ペンタメチルクロマン-6-スルフォニル
Fmoc-Arg(Pmc)-OH: Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-N^g-2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマン-6-スルホニル-L-アルギニン
Fmoc-Asn(Trt)-OH: Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-Nγ-トリチル-L-アスパラギン
Fmoc-Asp(OtBu)-OH: Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-L-アスパラギン酸-β-t-ブチルエステル
Fmoc-Cys(Trt)-OH: Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-S-トリチル-L-システイン
Fmoc-Gln(Trt)-OH: Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-Nε-トリチル-L-グルタミン
Fmoc-Glu(OtBu)-OH: Nα−9−フルオレニルメチルオキシカルボニル-L-グルタミン酸-γ-t-ブチルエステル
Fmoc-Lys(Boc)-OH: Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-Nε-t-ブチルオキシカルボニル-L-リジン
Fmoc-Ser(tBu)-OH: Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-O-t-ブチル-L-セリン
Fmoc-Thr(tBu)-OH: Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-O-t-ブチル-L-スレオニン
【０１６５】
以下の略号は、対応する下記の反応溶媒、反応試薬等を表す。
【０１６６】
HBTU: 2-（1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスフェート
HOBt: N-ヒドロキシベンゾトリアゾール
DIEA: ジイソプロピルエチルアミン
DMF: N,N-ジメチルホルムアミド
TFA: トリフルオロ酢酸
【０１６７】
以下の実施例において、化合物の理化学的性質は次の方法により測定した。
質量分析は、日本電子JMS-HX110Aを用いFAB-MS法により、もしくはブルカー社質量分析装置REFLEXを用いMALDI-TOFMS法により行った。行った。アミノ酸分析は、コーエン（Cohen, S. A.）らの方法［アナリティカル・バイオケミストリー (Analytical Biochemistry), 222, 19 (1994)］により行った。加水分解は塩酸蒸気中110℃で20時間行い、加水分解物のアミノ酸組成はウォーターズ・アキュ・タグ（Waters AccQ-Tag）アミノ酸分析計（Waters社製）を用い分析した。
【０１６８】
実施例１．マウス遺伝子の単離
IL-3依存性マウスproB細胞株Ba/F3（理研ジーンバンク cell number:ＲＣＢ０８０５）から、IL-3非依存性増殖能を示す亜株であるBa/F3-Ad細胞を分離し、樹立した。
【０１６９】
Ba/F3細胞は、通常の培養に用いる培地[0.1ng/mLマウスIL-3（R&D systems社製）を添加した10% FCS RPMI-1640液（ナカライテスク株式会社製）中で培養した。Ba/F3細胞は、通常は浮遊しているが、培養中培養皿に付着している細胞が観察された。培養皿に付着した細胞のみを分離するために、浮遊している細胞及び培地を培養皿から捨てた。分離された細胞を10%FCS RPMI-1640液のみで培養することにより、親株のBa/F3から接着性の細胞を分離、純化した。この接着性の細胞を亜株Ba/F3-Ad細胞と命名した。亜株Ba/F3-Ad細胞は、培養皿に付着する性質、詳しくは細胞外マトリックスであるフィブロネクチンに結合する性質を有しており、培養皿に付着しつつ増殖していた。また、IL-3非存在下で生存または増殖しているが、IL-3存在下では増殖が促進される。
【０１７０】
Ba/F3-Ad株がIL-3非依存性細胞となった原因遺伝子を調べるために、発現クローニング法（Expression Cloning）（例えば、「実験医学別冊新遺伝子工学ハンドブック」（１９９６年、４月２０日発行）、５章、２４５〜２４９頁（羊土社）に記載の方法に従って行うことができる）を行った。発現クローニング法は、以下の手順で行う。すなわち、Ba/F3-Ad細胞から常法によりｃDNAライブラリーを作製し、該ｃDNAライブラリーをレトロウィルスベクターｐＢａｂｅＸ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA: Vol. 92, 9146-9150, 1995）に組み込み、パッケージング細胞により、高い力価のウィルス液を作製した。該ウィルス液を親株Ba/F3に感染させることにより、Ba/F3-Ad細胞から得られた遺伝子（ｃDNA）をBa/F3に導入することになる。
その後、遺伝子導入したBa/F3細胞の培養液からIL-3を除去することにより、IL-3非依存化させる遺伝子（ｃDNA）が導入された細胞は、生き残るが、それ以外は、死んでいくことになる。このようにして得られた生き残りBa/F3クローンから、導入したｃDNAを回収し、該cDNAの配列を解析することにより、Ba/F3-Ad細胞がIL-3非依存性となった原因遺伝子を単離した。
得られた遺伝子配列をDNAデータベースにて比較することによって、新規の遺伝子配列であることが判明した。
【０１７１】
以下に実験方法の詳細を示す。
（1）ｃDNAライブラリーの作製：
Ba/F3-Ad細胞から10μｇのmRNAを抽出し（ＲＮＡ Maxiprep, Oligotex poly A mRNA purification; Qiagen）、ｃDNAライブラリー作製キット（cDNA Synthesis Kit; Stratagene）を用いて、該mRNAよりライブラリーを作製した。5×10⁵のクローンを含む平均長約1.5KbのcDNAライブラリーを作製した。
（2）ウィルス液の作製とBa/F3への感染：
北村らの方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 9146-9150 (1995）〕に準じ、Ba/F3-Ad細胞から作製したcDNAをレトロウィルスベクターpBabeXに組み込み、BOSC23パッケージング細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１１５５４）を用いて、ウィルス液を作製した。そのウィルス液を親株のBa/F3細胞に感染させることにより、遺伝子導入をおこなった。
【０１７２】
（3） IL-3非依存性Ba/F3クローンの選択：
Ba/F3細胞は、IL-3依存性の細胞である。したがって、Ba/F3細胞を培養している培地からIL-3を除去すると、急速なアポトーシスにより、Ba/F3細胞は死ぬ。そこで、上記（２）で得られたウィルス液をBa/F3細胞に感染させることにより、各種遺伝子を導入したBa/F3細胞をIL-3を含まない培地に培養する。該培地からIL-3を除去することにより、目的の遺伝子(cDNA)が導入されたBa/F3細胞株は生き残るが、それ以外のBa/F3細胞はすべて死ぬ。この方法を用いることにより、IL-3非依存性となったBa/F3クローンを選択した。
【０１７３】
（4） cDNAの単離と配列決定：
cDNAをウィルスベクターpBabeＸに組み込んだ。組み込む際に、cDNAの組み込まれる位置は決まっているので、DNAを組み込んだ両端の塩基配列をもとに、配列番号５および６で示される塩基配列を有するプライマーを設計し、合成DNAを作製した。IL-3非依存性となったBa/F3クローンから、ゲノムDNAを抽出し、ゲノムDNAを鋳型として、ＰＣＲを行なった。増幅されたＰＣＲ産物であるcDNAを精製し、direct sequenceを行なった（Applied Biosystems）。これにより、ポリＡ配列を除く1505塩基のcDNAの塩基配列（そのうち、コード領域（coding region）は930塩基（終始コドンを含む）で、配列番号１の40番〜969番）が明らかとなった。その塩基配列を配列番号１に、該塩基配列のコード領域にコードされたアミノ酸配列を配列番号２にそれぞれ示す。配列番号１に示される塩基配列について、DNAデータバンク（http://www.ddbj.nig.ac.jp）サイトにて検索したところ、既知の遺伝子とは一致せず、新規の遺伝子であった。また、ホモロジー検索によって、シークエンスのみ行われ、機能が不明であるヒトの遺伝子（16番染色体長腕上にある遺伝子）と非常に相同性が高かった。本発明のポリペプチドをアナモルシン（Anamorsin：以下、ＡＭとも略記する)と命名し、アナモルシンの遺伝子をＡＭ遺伝子とも略記する。
【０１７４】
（5）抗アポトーシス機能：
上記（４）で得られたcDNAを発現ベクターであるpCDNA3（Invitrogen社製）に組み込んだ後、該発現ベクターをエレクトロポレーションにより、親株Ba/F3細胞に導入し、AM遺伝子を強制発現させた。AM遺伝子を強制発現しているBa/F3細胞（Ba/F3/AM）を用いて、培養培地からIL-3を除去した後の細胞について検討した。アポトーシスの指標となる、酵素キャスパーゼの活性状態を検査するキャスパーゼアッセイ（Caspase Assay）と、ＤＮＡ量を検査するＰＩ染色（PI Staining）を行った。キャスパーゼアッセイは、キャスパーゼアッセイキット（医学生物学研究所製）を用い、そのマニュアルに従って検査した。ＰＩ染色は、通常の方法により、ＰＩ（Propidium iodide）により細胞を染色した。それらの結果を図１と図２に示す。図１と図２において左側の時間（０時間（Ｈｒ）から４８時間（Ｈｒ））は、培養からＩＬ−３を抜いた時からの経過時間を表す。
【０１７５】
図１において、コントロールBa/F3細胞（発現ベクターpCDNA3のみ導入したBa/F3細胞）は、ＩＬ−３を抜いた当初から酵素キャスパーゼの活性状態であるのに対して、AM遺伝子を強制発現しているBa/F3細胞（AM-gene transfected Ba/F3）は、しばらく酵素キャスパーゼの不活性状態である。
図２において、コントロールBa/F3細胞は、時間とともに低分子ＤＮＡが増加しているのに対して、AM遺伝子を強制発現しているBa/F3細胞は、低分子ＤＮＡが殆ど増加しない。
従って、AM遺伝子を強制発現しているBa/F3細胞は、コントロール（発現ベクターpCDNA3のみ導入したBa/F3細胞）と比較して、有意に細胞死が抑制され、その細胞死がアポトーシスであることがわかった。
【０１７６】
また、Ba/F3細胞と同様にIL-3依存性であるマウス骨髄系細胞32D（理研ジーンバンク cell number: RCB1145）を用いて同様の検討を行なったところ、やはりＡＭ遺伝子を導入、強制発現させた３２Ｄクローン（32D/AM）では、IL-3除去後の細胞死が有意に抑制された。
ただし、AM遺伝子は、いずれの細胞においても細胞増殖を起こす機能は有さず、細胞死抑制すなわち、抗アポトーシス機能を有していた。
【０１７７】
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる本発明のポリペプチドは、ヒトの第１６染色体の長腕に存在する遺伝子にコードされているポリペプチドとアミノ酸配列で約８０％の相同性を示していた。本発明のポリペプチドは、細胞死を抑制する活性を有していた。したがって、ヒトの第１６染色体の長腕に存在する遺伝子にコードされているポリペプチドは本発明のポリペプチドと同様の機能、すなわち細胞死を抑制する活性を有するポリペプチドであると考えられる。
【０１７８】
実施例２．アナモルシン(AM)の発現
（１）ノーザンブロッティングによる解析１
AM遺伝子の発現について、BamHＩサイトで切り出したＤＮＡ断片（BamHI−DNAと略記する）をプローブとして、ノーザンブロッテイング（ＮＢ）解析を行なった。ＮＢ解析は、「実験医学別冊新遺伝子工学ハンドブック」（１９９６年、４月２０日、羊土社発行）に記載の方法に準じて行った。
プローブとして切り出したＤＮＡ断片（BamHI−DNAと略記する）は、配列番号１の塩基２９４番目〜６０３番目の配列からなるＤＮＡ断片を用いた。各細胞からＲＮＡをトリゾール（Trizol;Gibco BRL製）により抽出し、それを上記プローブとハイブリッド形成させた。ハイブリッド溶液としてRAPID HYB BUFFER（アマシャム社製）を用い、６５℃で３時間ハイブリッド形成させた。
【０１７９】
まず最初に、Ba/F3細胞とBa/F3-Ad細胞でのAM遺伝子の発現をみた。
Ba/F3細胞とBa/F3-Ad細胞を各培養培地中でそれぞれ培養し、Ba/F3細胞およびＢａ/F3-Ad細胞からRNAを抽出した後、AM遺伝子の発現をノーザンブロッティングで確認した。その結果を図３に示す。その結果両方ともAM遺伝子の発現が認められた。
次に、Ba/F3細胞とBa/F3-Ad細胞を各培養培地中でそれぞれ培養し、各培養培地中のIL-3を除去後１２時間経過したBa/F3細胞およびBa/F3-Ad細胞からRNAを抽出した後、AM遺伝子の発現をノーザンブロッティングで確認した。Ba/F3細胞ではAM遺伝子の発現を示すバンドが消失したのに対し、Ba/F3-Ad細胞ではAM遺伝子の発現が認められた。
以上より、実施例１でクローニングされたＡＭ遺伝子がIL-3除去後のBa/F3細胞のアポトーシスを抑制する活性を有することが示された。
【０１８０】
（２）各種臓器や細胞でのAM遺伝子発現
（正常臓器でのAM遺伝子発現）
正常臓器でのAM遺伝子発現について、まず、ヒトの種々の臓器から得たｍRNA（クローンテック社製）を用いて、上記（１）と同様にNB解析した。プローブとしては、配列番号１の塩基４８１番目〜７４５番目の配列からなるＤＮＡ断片を用いた。その結果を図４に示す。図４に示すようにAM遺伝子はユビキタスに発現しており、特に心臓、肝臓、膵臓において強い発現がみられた。
【０１８１】
次に、マウスの種々の臓器（図５）あるいはマウス胚（図６）から調製したｃDNA（クローンテック社製）を用いて、RT-PCR法によりAM遺伝子発現を観察した。RT-PCR法に用いたプライマーは、配列番号７および８に示される塩基配列のプライマーを用いた。図５を見るとマウスの種々の臓器でも、ヒトと同様にユビキタスに発現がみられた。また、図６を見ると、７日目のエンブリオですでにAM遺伝子の発現が認められたことから、胎生初期から発現している分子であることがわかった。図４〜６におけるβ−アクチンとＧＡＰＤＨは、インターナルコントロールである。
【０１８２】
（造血系細胞株と造血器腫瘍患者から得られた腫瘍細胞でのAM遺伝子発現）
造血系細胞株と造血器腫瘍患者から得られた腫瘍細胞から得たｍRNAを用いて、上記（１）と同様にNB解析した。プローブとしては、配列番号１の塩基４８１番目〜７４５番目の配列からなるＤＮＡ断片を用いた。その結果を図７及び８に示す。
造血系細胞株としては、Ba/F3細胞（レーン１）、ＵＴ−７細胞〔レーン２；Miura Y., et al., Prog. Clin. Biol. Res., 356, 259-270 (1990)〕、Ｍｏ７ｅ細胞〔レーン３;Avanzi GC., et al., (Br. J. Haematol., 69, 359-366, (1988)〕、ＴＦ−１細胞〔レーン４；ECACC 93022307/ Exp. Cell Res., 208(1), 35, (1993)〕、ＨＬ−６０細胞（レーン５；ATCC CCL 240）、Ｕ９３７細胞（レーン６；ATCC CRL 1593）、ＴＨＰ−１細胞（レーン７；ATCC TIB 202）、Ｋ−５６２細胞（レーン８；ATCC CCL 243）、ＨＥＬ細胞〔レーン９；Science, 216 1233 (1982)〕、ＣＭＫ細胞〔レーン１０; Sato T., et al., Br. J. Haematol., 72, 184-190 (1989)〕、Ｍｅｇ−０１細胞〔レーン１１;Ogura M., et al., Blood, 66, 1384-1392, (1985)〕、Ｊｕｒｋａｔｔ細胞（レーン１２；ATCC TIB-152）、Ｍｏｌｔ−４細胞（レーン１３；ATCC CRL 1582）、ＹＴＣ−３細胞〔レーン１４;Yodoi J., et al., J. Immunol, 134, 1623-1630 (1985)〕、Ｄａｕｄｉ細胞（レーン１５；ATCC CCL 213）、Ｒａｊｉ細胞（レーン１６；ATCC CCL 86）、ＲＰＭＩ−８２２６細胞（レーン１７；ATCC CCL 155）、ＡＲＨ−７７細胞（レーン１８；ATCC CRL 1621）、Ｕ２６６細胞（レーン１９；ATCC TIB-196）、ＫＭ１０１細胞〔レーン２０；Academy of Sciences of the United States of America, 82, 3477-3480 (1985）〕を用いた。
【０１８３】
造血器腫瘍患者から得られた腫瘍細胞としては、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の腫瘍細胞（レーン２〜４）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）の腫瘍細胞（レーン５、６）、成人Ｔ細胞性白血病（ＡＴＬ）の腫瘍細胞（レーン７）、非ホジキン悪性リンパ腫（ＮＨＬ）の腫瘍細胞（レーン８、９）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）からＡＭＬへの移行例（ＭＤＳｏｖｅｒｔＡＭＬ）の腫瘍細胞（レーン１０，１１）、正常末梢血単核球（ＰＢＭＮＣ）の細胞（レーン１２）を用いた。参考としてBa/F3細胞（レーン１）を示した。
【０１８４】
図７の結果から、造血系細胞株では、正常細胞でのAM発現は弱いが、種々の造血器腫瘍細胞株（Myeloid, Erythroid, Megakaryocytic, T cell, B cell, Plasma cell）では、強く発現している細胞株もあった。また、図８の結果から、白血病、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍患者から得られた白血病細胞、悪性リンパ腫細胞などで、強く発現している例を認めた。
【０１８５】
実施例３．AM発現誘導
（１）H-RasによるAM発現誘導
Ba/F3-Ad細胞について、さらに解析をすすめたところ、H-Ras分子が活性化されている状態であることが判明した。具体的には、Ｒａｓアッセイを、Methods in Enzymology, 238, 255-258(1994)に記載の方法に準じて行った。具体的なＲａｓアッセイの方法としては以下の方法を用いた。
Ba/F3細胞及びBa/F3-Ad細胞を³²Ｐでラベルされたオルソリン酸（１ｍＣｉ）で１時間インキュベートした。次に、それぞれの細胞について０．１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３存在下あるいはＩＬ−３非存在下の培養液でそれぞれ１０分間培養した。各々の細胞を１０⁷細胞ずつ採取し、それぞれの細胞を溶解させた。各細胞溶解液において抗Ｈ−Ｒａｓ抗体（Santa Cruz社製）１μｇ／１検体を用いて、免疫沈降を行った。その免疫沈降検体からＧＴＰあるいはＧＤＰを溶出し、その溶出液を薄層クロマトグラフィーで展開し、最後にオートラジオグラフィーを行った。その結果を図９に示す。図９を見ると、Ba/F3-Ad細胞は、ＩＬ−３存在下あるいはＩＬ−３非存在下のいずれにおいてもＧＴＰのシグナルが強いことにより細胞内のＨ−Ｒａｓが活性状態であった。
【０１８６】
IL-3、Epo、Tpo、SCFなどのサイトカイン刺激によって、細胞内のH-Rasが活性化されることが知られていることから、AMはH-Rasによって、発現誘導される可能性があると考えられた。そこで、H-RasによるAMの発現が誘導されるか否かを調べた。
【０１８７】
これを証明するのに、constitutively active H-Ras（Upstate Biotechnology社製）を強制発現させた。具体的には、Blood, 93, 1540-1548(1999)に記載の方法に準じて、constitutively active H-Rasの遺伝子を発現プラスミドベクターに組み込み、上述のBa/F3細胞に遺伝子導入し、強制発現させた。Ba/F3細胞の培地からIL-3を除去したときのAM遺伝子発現を上記と同様にNBにより解析を行った。その結果を図１０に示す。
図１０に示したように、その親株Ba/F3細胞（強制発現させてないもの）では、IL-3除去後12時間で、AM遺伝子が消失するのに対し、constitutively active H-Ras を強制発現させたBa/F3では、IL-3除去後36時間経過してもAM遺伝子の発現が維持されていた。
また、dominant-nagative H-Ras の発現をIPTG添加によって誘導できるBa/F3細胞において、IL-3存在下で、dominant-nagative H-Ras の発現誘導を行い、AM遺伝子発現を上記と同様にNBにより解析を行った。その結果を図１１に示す。dominant-nagative H-Ras の発現をIPTG添加によって誘導できるBa/F3細胞は、J Biol Chem, 275, 24096-24105, 2000に記載の方法に従って作製した。Lac Switch II 誘導発現システム（Stratagene社製）を用い、IPTG添加によってBa/F3細胞にdominant-nagative H-Ras の発現誘導を行った。図１１に示したように、dominant-nagative H-Ras の発現誘導されたBa/F3細胞は、AM遺伝子の発現が時間とともに減弱した。
【０１８８】
（２）サイトカインによるAM発現誘導
IL-3を除去したBa/F3細胞を培養した培地に、再度IL-3を添加したときのBa/F3細胞でのＡＭ遺伝子の発現について、上記実施例２の（１）に示したＮＢの方法により解析を行った。その結果を図１２に示す。その結果、Ba/F3細胞は、刺激後３時間頃より、ＡＭ遺伝子の発現がみられはじめた。
【０１８９】
次に、各種サイトカインによるAM遺伝子の発現について、上記実施例２の（１）に示したNBにより解析を行った。
Ba/F3細胞に、ヒトエリスロポイエチン（Epo）レセプター〔Blood, 76, 1-5 (1990), Blood, 76, 24-30 (1990)〕、マウストロンボポイエチン（Tpo）レセプター〔EMBO J., 12, 2645-53 (1993), Oncogene, 8, 2607-15 (1993)〕、Stem cell factor（SCF）レセプター〔Cell 63, 213-24 (1990), Cell 63, 203-11 (1990)〕、G-CSF/gp130キメラレセプター〔J. Biol. Chem., 269, 16297-304 (1994) , Immunity 5, 449-60 (1996)〕
をそれぞれ発現させたBa/F3細胞を作製した。
【０１９０】
その細胞のIL-3除去した状態から、それぞれ、Epo ５μｇ／ｍｌ、Tpo（３０ｎｇ／ｍｌ）、SCF（１００ｎｇ／ｍｌ）、G-CSF（１００ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。そのＮＢの結果を図１３に示す。図１３の横軸はIL-3刺激後の経過時間を表す。IL-3刺激と同様に刺激後3時間頃より発現がみられた。
以上より、AM遺伝子は、種々のサイトカイン刺激によって、発現が誘導されることがわかった。
以上のことから、種々のサイトカイン刺激によるAM分子の発現は、H-Rasを介したシグナル伝達によって、誘導されることが明らかとなった。また、AM分子と関わるH-Rasは、細胞の増殖ばかりでなく、AM分子を介し、細胞の生存にも関わっていると考えられる。
【０１９１】
実施例４．AM分子と既知の抗アポトーシス分子Bcl-2との関係
AM分子が、抗アポトーシス作用を示す作用機序について検討した。
AM遺伝子を強制発現させたBa/F3細胞株（Ba/F3/AM）および親株Ba/F3細胞の培地中のIL-3を除去してから０、６，１２，１８、２４、３０、３６時間後の、既知の抗アポトーシス分子であるBcl-2についてノーザンブロット解析（図１４）とウェスターンブロット解析（図１５）を行った。ノーザンブロット解析とウェスターンブロット解析は、Blood, 93, 1540-1548 (1999)に記載の方法に準じて行った。尚、ウェスタンブロット解析で用いたBcl-2の抗体は、Transduction Laboratory社製を用いた。
【０１９２】
その結果を図１４と１５に示す。図１４に示したように、親株Ba/F3細胞では、IL-3除去後、Bcl-2のｍRNAは、どちらも12時間で完全に消失するが、Ba/F3/AM細胞（AM-gene Transfected Ba/F3）では、36時間を経過しても、Bcl-2のｍRNA発現が維持されていた。また、図１５に示したように、Ba/F3細胞は、Bcl-2の蛋白質は、どちらも24時間で消失するのに対して、Ba/F3/AM細胞では、36時間を経過してもBcl-2の蛋白質が維持されていた。
以上のことから、AM分子のアミノ酸配列は、そのホモロジー検索から、既知の抗アポトーシス分子であるBcl-2とホモロジーを示さないが、Bcl-２の発現を維持することを介して、抗アポトーシス作用を示す可能性が示唆された。
【０１９３】
実施例５．遺伝子改変動物作成用のターゲットベクターの調製
１．ゲノミックDNA（genomic DNA）の入手：
λFIX II（ファージ；Stratagene社製）にマウスゲノミックDNA（マウスstrain；１２９SVJ、ゲノミックDNAの長さは、9-23Kb）を挿入したファージライブラリー〔Kawagoe K., et al. Genomics vol. 23, 566-574(1994)に記載の方法に準じて作成した。〕から、non-RI（ジゴキシゲニンシステム：Roche社製）でラベルしたAnamorsin-cDNA全長をプローブとし、プラークハイブリダイゼーション（方法は、バイオ実験イラストレイテッド4巻、第４章、125-163ページ：秀潤社に準ずる。）によって、目的遺伝子のマウスゲノミックDNA断片を含むファージをスクリーニングし、３クローンのファージを得た。
【０１９４】
２．Anamorsin-genomic DNAのシークエンスと制限酵素地図の作成：
得られた３クローンのファージからゲノミックDNA断片（１３−２０Kbの長さ）をベクタープラスミドであるｐBSIISK（+）（Stratagene社製）に組み込み、BamH I、HindIII、SpeI、Sma I、Pst I（Promega社製）などのさまざまな制限酵素によるdigestionおよびnon-RI（ジゴキシゲニンシステム：Roche社製）でラベルしたAnamorsin-cDNAをプローブに用いたサザン法（方法は、バイオ実験イラストレイテッド２巻、第８章、137-152ページ：秀潤社に準ずる。）による解析、シークエンサー（Applied Biosystems社製）により目的遺伝子のexonの位置関係と制限酵素サイトを決定し、薬剤耐性遺伝子にて置換する領域（本実験では、exon１を欠失させることにした。）と、その前後で組換えをおこさせる為の5'および3' 相同領域、および致死遺伝子の挿入箇所、組換え体を選別するためのPCRプライマーとサザン法のプローブの位置を決定した。
【０１９５】
３．ターゲットベクターの作製：
薬剤耐性遺伝子としてPGKneobpAカセット〔PGKプロータ-ネオマイシン耐性遺伝子-ウシ成長ホルモン遺伝子ポリアデニレーションシグナル配列からなるネオマイシン耐性遺伝子発現ユニット、 Cell， 64, 693 (1991)〕、致死遺伝子としてMC1/DT-Aカセット〔MC1プロモータとジフテリア毒素A鎖からなるジフテリア毒素A鎖発現ユニット、 Analytical biochemistry, 214, 77 (1993)〕を使用し、ｐBSIISK（+）をベースにつなぎ合わせ、ターゲットベクター（targeting vector）を作製した(図１６参照)。以下、通常のノックアウトマウスを作製する方法に準じてノックアウトマウスを作製することができる。
【０１９６】
実施例６マウスアナモルシン抗原ペプチドの調製
１. 抗原の調製
蛋白配列を解析し、親水性の高い部分、N末端、C末端、二次構造上ターン構造、ランダムコイル構造を有する部分の中から、抗原として適当と考えられる部分アミノ酸配列として、化合物1(mAd-1)、2(mAd-2)、3(mAd-3)、4(hAM-1)、5(hAM-2)、6(hAM-3)を選択した。
【０１９７】
１-1化合物1(mAd-1)（配列番号９）（H-Cys-Leu-Phe-Leu-Lys-Glu-Pro-Val-Glu-Thr-Ala-Glu-Val-Asn-Asn-Asp-Lys-Met-Lys-Thr-Ala-Ser-Lys-Leu-NH₂）の合成化合物１は、配列番号２で示されるアミノ酸配列の９２〜１１５番目のアミノ酸配列に対応するペプチドである。
Fmoc-NH、17μmol が結合した担体樹脂（NovaSyn TGR resin樹脂、ノバビオケム社製）80mg を自動合成機（島津製作所）の反応容器に入れ、600μlのDMFを加えて3分間攪拌し溶液を排出した後、島津製作所の合成プログラムに従い次の操作を行った。
【０１９８】
(a)30% ピペリジン-DMF 溶液500μl を加えて混合物を 4 分間攪拌し、該溶液を排出し、この操作をもう 1 回繰り返した。
(b)担体樹脂を 600μl の DMF で 1 分間洗浄し、該溶液を排出し、この操作を 5 回繰り返した。
(c)Fmoc-Leu-OH (168μmol)、HBTU (168μmol)、HOBt 1 水和物 (168μmol) およびDIEA (336μmol) を DMF (672μl)中で 3 分間攪拌し、得られた溶液を樹脂に加えて混合物を 60 分間攪拌し、溶液を排出した。
(d)担体樹脂を600μl の DMF で 1 分間洗浄後溶液を排出し、これを５回繰り返した。
こうして、Fmoc-Leu-NH が担体上に合成された。
次に、(a) (b)の工程の後、(c)の工程で Fmoc-Lys(Boc)-OH を用いて縮合反応を行い、(d)の洗浄工程を経て、Fmoc-Lys(Boc)-Leu-NH が担体上に合成された。
【０１９９】
以下、工程(c)において、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OHを順次用いて、(a)〜(d)を繰り返した後、(a)(b)の脱保護、洗浄工程を経て、メタノール、ブチルエーテルで順次洗浄し、減圧下 12 時間乾燥して、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。これに、TFA（90%）、チオアニソール（5%）および1,2-エタンジチオール（5%）からなる混合溶液 1ml を加えて室温で2時間放置し、側鎖保護基を除去するとともに樹脂よりペプチドを切り出した。樹脂を濾別後、得られた溶液にエーテル約 10ml を加え、生成した沈澱を遠心分離およびデカンテーションにより回収し、粗ペプチドとして39mgを取得した。この粗生成物全量を酢酸水溶液に溶解後、逆相カラム（資生堂製、CAPCELL PAK C18 30mmI.D. X 250mm）を用いた HPLC で精製した。0.1% TFA 水溶液に、TFA 0.1% を含む 90% アセトニトリル水溶液を加えていく直線濃度勾配法で溶出し、220nm で検出し、化合物1を含む画分を得た。この画分を凍結乾燥して、化合物1を8.3mg 得た。
【０２００】
質量分析［TOFMS］; m/z = 2707 (M+H⁺)
アミノ酸分析; Asx 2.3 (3), Glx 3.0 (3), Ser 1.1 (1), Thr 2.2 (2), Ala 2.2 (2), Pro 1.1 (1), Val 1.9 (2), Met 1.2 (1), Leu 3.2 (3), Phe 0.9 (1), Lys 4.1 (4), Cys 1.0 (1)
【０２０１】
１-2化合物2(mAd-2)（配列番号１０）（H-Cys-Arg-Val-Thr-Gly-Lys-Lys-Pro-Asn-Phe-Glu-Val-Gly-Ser-Ser-Ser-Gln-NH₂）の合成
化合物２は、配列番号２で示されるアミノ酸配列の１５８〜１７２番目のアミノ酸配列に対応し、さらにＮ末端にCys残基が付加されたペプチドである。
【０２０２】
Fmoc-NH、17μmol が結合した担体樹脂（NovaSyn TGR resin樹脂、ノバビオケム社製）80mg を出発物質として、上記１-1と同様にして、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OHを順次縮合した後に、Fmoc基除去、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。これに、TFA（82.5%）、チオアニソール（5%）、水（5%）、エチルメチルスルフィド（3%）、1,2-エタンジチオール（2.5%）およびチオフェノール（2%）からなる混合溶液 1ml を加えて室温で8時間放置し、側鎖保護基を除去するとともに樹脂よりペプチドを切り出した。樹脂を濾別後、得られた溶液にエーテル約 10ml を加え、生成した沈澱を遠心分離およびデカンテーションにより回収し、粗ペプチドとして31mgを取得した。この粗生成物全量を酢酸水溶液に溶解後、逆相カラム（資生堂製、CAPCELL PAK C18 30mmI.D. X 250mm）を用いた HPLC で精製した。0.1% TFA水溶液に、TFA 0.1% を含む 90% アセトニトリル水溶液を加えていく直線濃度勾配法で溶出し、220nm で検出し、化合物2を含む画分を得た。この画分を凍結乾燥して、化合物2を3.1mg 得た。
【０２０３】
質量分析［TOFMS］; m/z = 1822.9 (M+H⁺)
アミノ酸分析; Asx 0.6 (1), Glx 2.0 (2), Ser 3.0 (3), Gly 2.3 (2), Arg 0.9 (1), Thr 1.0 (1), Pro 1.0 (1), Val 1.9 (2), Phe 1.0 (1), Lys 1.8 (2), Cys 1.3 (1)
【０２０４】
１-3化合物3(mAd-3)（配列番号１１）（H-Cys-Gly-Leu-Ala-Glu-Glu-Leu-Glu-Arg-Glu-Gln-Ser-Lys-Ala-Gln-Ser-Ser-Gln-Pro-Lys-Ser-Ala-NH₂）の合成
化合物３は、配列番号２で示されるアミノ酸配列の２４９〜２７０番目のアミノ酸配列に対応するペプチドである。
【０２０５】
Fmoc-NH、17μmol が結合した担体樹脂（Rink Amide MBHA resin樹脂、ノバビオケム社製）30mg を出発物質として、上記１-1と同様にして、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OHを順次縮合した後に、Fmoc基除去、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。これに、TFA（82.5%）、チオアニソール（5%）、水（5%）、エチルメチルスルフィド（3%）、1,2-エタンジチオール（2.5%）およびチオフェノール（2%）からなる混合溶液 1ml を加えて室温で8時間放置し、側鎖保護基を除去するとともに樹脂よりペプチドを切り出した。樹脂を濾別後、得られた溶液にエーテル約 10ml を加え、生成した沈澱を遠心分離およびデカンテーションにより回収し、粗ペプチドとして42mgを取得した。この粗生成物全量を酢酸水溶液に溶解後、逆相カラム（資生堂製、CAPCELL PAK C18 30mmI.D. X 250mm）を用いた HPLC で精製した。0.1% TFA 水溶液に、TFA 0.1% を含む 90% アセトニトリル水溶液を加えていく直線濃度勾配法で溶出し、220nm で検出し、化合物3を含む画分を得た。この画分を凍結乾燥して、化合物3を5.3mg 得た。
【０２０６】
質量分析［TOFMS］; m/z = 2375.3 (M+H⁺)
アミノ酸分析; Glx 6.9 (7), Ser 3.8 (4), Gly 1.1 (1), Arg 1.0 (1), Ala 3.2 (3), Pro 1.0 (1), Leu 2.1 (2), Lys 2.0 (2), Cys 1.4 (1)
【０２０７】
１-4化合物4(hAM-1)（配列番号１２）（H-Cys-Leu-Phe-Leu-Lys-Glu-Pro-Val-Glu-Thr-Ala-Val-Asp-Asn-Asn-Ser-Lys-Val-Lys-Thr-Ala-Ser-Lys-Leu-NH₂）の合成
化合物４は、配列番号４で示されるアミノ酸配列の９２〜１１５番目のアミノ酸配列に対応するペプチドである。
【０２０８】
Fmoc-NH、15μmol が結合した担体樹脂（NovaSyn TGR resin樹脂、ノバビオケム社製）70mg を出発物質として、上記１-1と同様にして、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OHを順次縮合した後に、Fmoc基除去、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。これに、TFA（90%）、チオアニソール（5%）および1,2-エタンジチオール（2.5%）からなる混合溶液 1ml を加えて室温で2時間放置し、側鎖保護基を除去するとともに樹脂よりペプチドを切り出した。樹脂を濾別後、得られた溶液にエーテル約 10ml を加え、生成した沈澱を遠心分離およびデカンテーションにより回収し、粗ペプチドとして82mgを取得した。この粗生成物全量を酢酸水溶液に溶解後、逆相カラム（資生堂製、CAPCELL PAK C18 30mmI.D. X 250mm）を用いた HPLC で精製した。0.1% TFA 水溶液に、TFA 0.1% を含む 90%アセトニトリル水溶液を加えていく直線濃度勾配法で溶出し、220nm で検出し、化合物4を含む画分を得た。この画分を凍結乾燥して、化合物4を6.9mg 得た。質量分析［TOFMS］; m/z = 2733.8 (M+H⁺)
【０２０９】
１-5化合物5(hAM2)（配列番号１３）（H-Cys-Gln-Ile-Thr-Gly-Lys-Lys-Pro-Asn-Phe-Glu-Val-Gly-Ser-Ser-Arg-Gln-NH₂）の合成
化合物５は、配列番号４で示されるアミノ酸配列の１５８〜１７３番目のアミノ酸配列に対応し、さらにＮ末端にCys残基が付加されたペプチドである。
【０２１０】
Fmoc-NH、15μmol が結合した担体樹脂（NovaSyn TGR resin樹脂、ノバビオケム社製）70mg を出発物質として、上記１-1と同様にして、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OHを順次縮合した後に、Fmoc基除去、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。これに、TFA（82.5%）、チオアニソール（5%）、水（5%）、エチルメチルスルフィド（3%）、1,2-エタンジチオール（2.5%）およびチオフェノール（2%）からなる混合溶液 1ml を加えて室温で8時間放置し、側鎖保護基を除去するとともに樹脂よりペプチドを切り出した。樹脂を濾別後、得られた溶液にエーテル約 10ml を加え、生成した沈澱を遠心分離およびデカンテーションにより回収し、粗ペプチドとして32mgを取得した。この粗生成物全量を酢酸水溶液に溶解後、逆相カラム（資生堂製、CAPCELL PAK C18 30mmI.D. X 250mm）を用いた HPLC で精製した。0.1% TFA水溶液に、TFA 0.1% を含む 90% アセトニトリル水溶液を加えていく直線濃度勾配法で溶出し、220nm で検出し、化合物5を含む画分を得た。この画分を凍結乾燥して、化合物5を7.0mg 得た。
質量分析［TOFMS］; m/z = 1878.3 (M+H⁺)
【０２１１】
１-6化合物6(hAM3)（配列番号１４）（H-Cys-Gly-Leu-Ala-Glu-Glu-Leu-Glu-Lys-Glu-Lys-Ser-Arg-Glu-Gln-Met-Ser-Ser-Gln-Pro-Lys-Ser-Ala-NH₂）の合成化合物６は、配列番号４で示されるアミノ酸配列の２５１〜２７３番目のアミノ酸配列に対応するペプチドである。
【０２１２】
Fmoc-NH、15μmol が結合した担体樹脂（NovaSyn TGR resin樹脂、ノバビオケム社製）70mg を出発物質として、上記１-1と同様にして、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OHを順次縮合した後に、Fmoc基除去、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。これに、TFA（82.5%）、チオアニソール（5%）、水（5%）、エチルメチルスルフィド（3%）、1,2-エタンジチオール（2.5%）およびチオフェノール（2%）からなる混合溶液 1ml を加えて室温で8時間放置し、側鎖保護基を除去するとともに樹脂よりペプチドを切り出した。樹脂を濾別後、得られた溶液にエーテル約 10ml を加え、生成した沈澱を遠心分離およびデカンテーションにより回収し、粗ペプチドとして47mgを取得した。この粗生成物全量を酢酸水溶液に溶解後、逆相カラム（資生堂製、CAPCELL PAK C18 30mmI.D. X 250mm）を用いた HPLC で精製した。0.1% TFA 水溶液に、TFA 0.1% を含む 90% アセトニトリル水溶液を加えていく直線濃度勾配法で溶出し、220nm で検出し、化合物6を含む画分を得た。この画分を凍結乾燥して、化合物6を14.5mg 得た。
質量分析［TOFMS］; m/z = 2565.88 (M+H⁺)
【０２１３】
実施例７アナモルシンを認識するモノクローナル抗体の作製
（１）免疫原の調製
実施例６で得られた化合物1〜３は、免疫原性を高める目的で以下の方法でＫＬＨ（カルビオケム社製）とのコンジュゲートを作製し、免疫原とした。すなわち、ＫＬＨをＰＢＳに溶解して10mg/mLに調整し、１/１０容量の25mg/mL ＭＢＳ[Ｎ-(m-Maleimidobenzoyloxy)succinimide;ナカライテスク社]を滴下して３０分間撹拌反応させる。あらかじめＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ−２５カラムなどのゲルろ過カラムでフリーのＭＢＳを除いて得られたＫＬＨ−ＭＢＳ2.5mgを0.1Mりん酸ナトリウムバッファー（pH7.0）に溶解したペプチド１ｍｇと混合し、室温で３時間、攪拌反応させた。反応後、ＰＢＳで透析したものを免疫原として用いた。
【０２１４】
（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
実施例７（１）で調製した化合物１〜３のＫＬＨコンジュゲート100μgをそれぞれ水酸化アルミニウムアジュバント〔Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p99、1988〕2 mgおよび百日咳ワクチン（千葉県血清研究所製）1×10⁹細胞とともに4週令雌SDラット各３匹に投与した。投与２週間後より、各ＫＬＨコンジュゲート１００μｇを１週間に１回、計４回投与した。該ラットの心臓より採血し、その血清抗体価を以下に示す酵素免疫測定法で調べ、十分な抗体価を示したラットから最終免疫３日後に脾臓を摘出した。
脾臓をMEM（Minimum Essential Medium）培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（250 ×g、５分間）した。得られた沈殿画分にトリス−塩化アンモニウム緩衝液（pH7.6）を添加し、１〜２分間処理することにより赤血球を除去した。得られた沈殿画分（細胞画分）をＭＥＭ培地で３回洗浄し、細胞融合に用いた。
【０２１５】
（３）酵素免疫測定法（バインディングＥＬＩＳＡ）
アッセイ用の抗原には実施例１で得られた各化合物をサイログロブリン（以下、ＴＨＹと略す。）とコンジュゲートしたものを用いた。作製方法は実施例７（１）に記した通りであるが、架橋剤にはＭＢＳの代わりにＳＭＣＣ[4-(N-Maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxylic acid N-hydroxysuccinimido ester；シグマ社]を用いた。９６穴のＥＩＡ用プレート（グライナー社）に、上記のように調製したコンジュゲートを１０μｇ／ｍL,５０μL／穴で分注し、４度で一晩放置して吸着させた。該プレートを洗浄後、1％牛血清アルブミン（BSA）/ダルベッコりん酸バッファー（Phosphate buffered saline：PBS）を100 μL／穴加え、室温で１時間放置し、残っている活性基をブロックした。
放置後、1％ BSA/PBSを捨て、該プレートに被免疫ラット抗血清を５０μL／穴分注し、２時間放置した。該プレートを0.05% ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノラウレート[（ICI社商標Tween 20相当品：和光純薬社製）]/PBS（以下Tween-PBSと表記）で洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットイムノグロブリン（DAKO社）を50 μL／穴加えて室温、1時間放置した。該プレートをTween-PBSで洗浄後、ABTS基質液〔2.2-アジノビス（3-エチルベンゾチアゾール-6-スルホン酸）アンモニウム、1mmol/L ABTS/ 0.1mol/Lクエン酸バッファー（pH4.2）〕を添加し、発色させOD415 nmの吸光度をプレートリーダー（Emax；Molecular Devices社）を用いて測定した。
【０２１６】
（４）マウス骨髄腫細胞の調製
8-アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株P3X63Ag8U.1（P3-U1：ATCCより購入）を正常培地（10％ウシ胎児血清添加RPMI培地）で培養し、細胞融合時に2×10⁷個以上の細胞を確保し、細胞融合に親株として供した。
【０２１７】
（５）ハイブリドーマの作製
実施例７（２）で得られたラット脾細胞と実施例２（４）で得られた骨髄腫細胞とを１０：１になるよう混合し、遠心分離（250 ×g、５分間）した。得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、37℃で、ポリエチレングリコール−1000（PEG-1000）2 g、MEM培地２ｍLおよびジメチルスルホキシド0.7ｍLの混液を10⁸個のマウス脾細胞あたり０．５ｍL加え、該懸濁液に１〜２分間毎にＭＥＭ培地１ｍLを数回加えた後、MEM培地を加えて全量が50 ｍLになるようにした。
該懸濁液を遠心分離（900 rpm、５分間）し、得られた沈澱画分の細胞をゆるやかにほぐした後、該細胞を、メスピペットによる吸込み吸出しでゆるやかにHAT培地〔10％ウシ胎児血清添加RPMI培地にHAT Media Supplement（ベーリンガーマンハイム社製）を加えた培地〕100 ｍL中に懸濁した。該懸濁液を96穴培養用プレートに200 μL／穴ずつ分注し、5％CO₂インキュベーター中、37℃で10〜14日間培養した。
【０２１８】
培養後、培養上清を実施例７（３）に記載した酵素免疫測定法で調べ、抗原ペプチドに反応してコントロールペプチドに反応しない穴を選び、そこに含まれる細胞から限界希釈法によるクローニングを２回繰り返し、抗マウスアナモルシンモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを確立した。
化合物１を抗原に用いてKM3046、KM3047、KM3048およびKM3049を、化合物２を抗原に用いてKM3050、KM3051、KM3052、KM3053、KM3054およびKM3055を、化合物３を抗原に用いてKM3056およびKM3057を取得した。
ハイブリドーマKM3048、KM3052、KM3057は、平成１３年１０月１１日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東一丁目１番地中央第６）に、それぞれＦＥＲＭＢＰ−７７６５、ＦＥＲＭＢＰ−７７６６、ＦＥＲＭＢＰ−７７６７として寄託されている。
図１７に示すように、いずれのモノクローナル抗体も免疫原に用いた化合物に特異的な反応性を示した。
【０２１９】
（６）モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した８週令ヌード雌マウス（BALB/c）に実施例７（５）で得られたハイブリドーマ株を5〜20×10⁶細胞／匹それぞれ腹腔内注射した。10〜21日後、ハイブリドーマが腹水癌化することにより腹水のたまったマウスから、腹水を採取（1〜8 ｍL／匹）した。
該腹水を遠心分離（1200 ×g、５分間）し固形分を除去した。精製IgMモノクローナル抗体は、該腹水を50％硫酸アンモニウムを用いて塩析し、塩化ナトリウム0.5 mol/Lを添加したPBSで透析後、セルロファインGSL2000（生化学工業社製）（ベットボリューム750 mL）のカラムに流速15 mL／時で通塔しIgM画分を集めることにより取得した。
精製IgGモノクローナル抗体は、カプリル酸沈殿法〔Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988〕により精製することにより取得した。モノクローナル抗体のサブクラスはサブクラスタイピングキットを用いたELISA法により表１に示すように決定された。表１で○は反応性があったことを示す。
【０２２０】
【表１】

【０２２１】
実施例８抗マウスアナモルシン抗体を用いたマウスアナモルシン蛋白質の検出（１）ウェスタンブロッティングによるマウスアナモルシン蛋白質の検出
実施例１（５）抗アポトーシス機能に記載の方法に従い遺伝子導入したBaf3細胞及び無処置Baf3細胞をピペッティングにより回収した。これらの細胞をＰＢＳで一回洗浄後、細胞溶解用緩衝液(50mM Tris-HCl pH7.2, 1% TritonX, 150mM NaCl,2mM MgCl₂, 2mM CaCl₂, 0.1% NaN₃, 50mM iodoacetamide, 50mM N-ethylmaleimide, 1mg/ml leupepcin, 0.1mM dithiothreitol)を５×１０⁷細胞に１ｍｌ添加し、4℃、３０分間放置後、遠心分離し、上清を細胞可溶化液として取得した。
上記のように調製した細胞可溶化液を1０μL(１×10⁵個)／レーンでSDS-PAGE（5-20%グラジエントゲル、アトー社製）〔Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988〕にて分画した後、PVDF膜（ミリポア社製）にブロッティングした。
【０２２２】
該膜を1％ BSA-PBSでブロッキング後、該膜に抗マウスアナモルシンモノクローナル抗体の培養上清を原液で添加し、室温で２時間放置した。該膜をTween-PBSでよく洗浄した後、第二抗体として1000倍希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットイムノグロブリン抗体〔DAKO社製〕を添加し、室温で１時間放置した。
該膜をTween-PBSでよく洗浄した後、ECL kit（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて検出した。
図１８に示すように、抗マウスアナモルシンモノクローナル抗体KM3046〜3057は、マウスアナモルシン蛋白質の分子量に相当する４０Kダルトン付近のバンドに特異的に反応した。無処理のBaf3細胞にも内在性のアナモルシンが存在する為、遺伝子導入細胞より弱いが、同位置にバンドが検出された。
【０２２３】
（２）蛍光抗体法（セルソーター解析）によるマウスアナモルシンの検出
実施例１（５）抗アポトーシス機能に記載の方法に従い遺伝子導入したBaf3細胞及び無処置Baf3細胞をピペッティングにより回収した。PBSで洗浄した後、細胞膜の抗体透過性を上げるため、１００％メタノール（氷冷）にて４℃で１０分間処理した。ＰＢＳで洗浄後、１０％正常マウス血清にて４℃で３０分ブロッキングした。１×１０⁵個／チューブで分注した後、遠心分離を行い上清を捨て、抗マウスアナモルシンモノクローナル抗体の培養上清を加えて４℃で３０分間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、FITC標識抗ラットイムノグロブリン抗体（ラットイムノグロブリンに特異的なもの；CALTAG社製）を４２倍希釈３０μL／チューブで分注し、４℃、30分間遮光反応させた。よくＰＢＳで洗浄した後、セルアナライザー（コールター社；EPICS XLsystemII）にて解析した。
化合物１より得られたKM3046、KM3047、KM3048およびKM3049、化合物２から得られたKM3052およびKM3055、化合物３から得られたKM3056およびKM3057はBaf3発現マウスアナモルシンを特異的に検出した。図１９に、KM3048、KM3052およびKM3057の結果を示す。縦軸は細胞数、横軸は蛍光強度を示す。
【０２２４】
（３）免疫沈降
実施例２（１）で調製したマウスアナモルシン遺伝子導入Baf3細胞可溶化液を用い、免疫沈降を検討した。
９６穴ＥＩＡプレートに抗ラットイムノグロブリン（DAKO社）を１００μL／穴ずつ分注し、４℃で一晩放置してプレートにコートした後、ＢＳＡ−ＰＢＳを２００μL／穴分注し、室温１時間放置してプレート上に残った蛋白質との結合残基をブロック（ブロッキング）した。その後、ＢＳＡ−ＰＢＳを捨てコントロール抗体、KM3046〜KM3057の各ハイブリドーマ培養上清を原液で１００μL／穴ずつ分注し、室温で2時間反応させた。ＰＢＳでよく洗浄した後、上記のように調製した細胞可溶化液を１００μL／穴で分注し、４℃で一晩反応させた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎでよく洗浄した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー（×５濃度）を２０μL／穴で加え、室温２時間プレートを振とうした後回収した。ＰＢＳにて5倍希釈して常法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッティングを行ない、実施例７（１）〜（４）で得られた抗マウスアナモルシンモノクローナル抗体KM3046〜KM3057のハイブリドーマ培養上清の混合液を用いて抗体染色を行なったところ、KM3046、KM3047、KM3048、KM3049、KM3052、KM3055、KM3056およびKM3057により、抗マウスアナモルシンモノクローナル抗体ハイブリドーマ培養上清混合液で検出される分子量４０ＫＤａの蛋白が沈降されることがわかった。コントロール抗体を用いた場合には、沈降蛋白質は検出されなかった。図２０にKM3048、KM3052およびKM3057の結果を示す。
【０２２５】
（４）抗原液相系における抗原化合物に対する反応性（インヒビションELISA）
KM3046〜KM3057の液相系における抗原化合物に対する反応性を、インヒビションELISAで調べた。
実施例１（３）に示したように抗原を固相化したプレートを準備し、２０μｇ／ｍLより５倍希釈で段階的に希釈した実施例６の１で得られた化合物１、化合物２および化合物３、ならびにそれぞれのヒトアナモルシンに相当するアミノ酸配列である化合物４、化合物５、化合物６を50μｌ／ウェルでそれぞれ分注後、KM3046〜KM3057の培養上清を希釈して（希釈倍率；KM3046、KM3047、KM3048、KM3049、KM3052、KM3055：×５００、KM3050、KM3054：×１０００、KM3051：×２０００、KM3053：×５、KM3056、KM3057：×６２５）50μL／穴で分注し、ウェル内で混合して室温で２時間反応させた。ウェルをTween−PBSで洗浄後、希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットイムノグロブリン（DAKO社）を50μL／穴で加えて室温、１時間反応させ、Tween−PBSで洗浄後ABTS基質液［2.2-アジノビス（3-エチルベンゾチアゾール-6-スルホン酸）アンモニウム］を用いて発色させOD415nmの吸光度をプレートリーダー（Emax;和光純薬）にて測定した。
KM3046〜KM3049はいずれも液相系において化合物１にのみ反応した。KM3047は化合物２にのみ反応した。KM3052、KM3053およびKM3055は化合物２、化合物５に反応した。KM3056およびKM3057は化合物３、化合物６に反応した。図２１にKM3048、KM3052およびKM3057の結果を示す。
【０２２６】
【発明の効果】
本発明は、細胞死を抑制する活性を有するポリぺプチド、該ポリぺプチドをコードするＤＮＡ、該ポリペプチドを認識する抗体、該ポリペプチドに結合する物質、該ポリペプチドと該ポリペプチドに結合する物質との特異的な結合を阻害する物質、該ポリペプチドをコードする細胞死抑制遺伝子の発現を制御する物質、該物質のスクリーニング法および該細胞死抑制遺伝子を欠損あるいは一部改変された動物とそれらの有効な用途を提供する。
【０２２７】
【配列表フリーテキスト】
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号１０−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号１１−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号１２−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号１３−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号１４−人工配列の説明：合成ペプチド
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】 Ba/F3細胞とＡＭ−gene transfected Ba/F3細胞のキャスパーゼアッセイの結果を示す図である。
【図２】 Ba/F3細胞とＡＭ−gene transfected Ba/F3細胞のＰＩ染色の結果を示す図である。
【図３】 Ba/F3細胞とBa/F3−Ａｄ細胞においてＡＭ遺伝子の発現をノザンブロッティングを用いて検査した結果を示す図である。
【図４】ヒト正常臓器でのＡＭ遺伝子の発現をノザンブロッティングを用いて検査した結果を示す図である。
【図５】マウス正常臓器でのＡＭ遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲ法を用いて検査した結果を示す図である。
【図６】マウス胚でのＡＭ遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲ法を用いて検査した結果を示す図である。
【図７】造血系細胞株でのＡＭ遺伝子の発現をノザンブロッティングを用いて検査した結果を示す図である。
【図８】造血器腫瘍患者から得られた腫瘍細胞でのＡＭ遺伝子の発現をノザンブロッティングを用いて検査した結果を示す図である。
【図９】 Ba/F3細胞とBa/F3−Ａｄ細胞においてＨ−Ｒａｓの活性状態を見るためにＲａｓアッセイを行った時の結果を示す図である。
【図１０】 Ba/F3細胞とConstitutively active H-Ras遺伝子を強制発現させたBa/F3細胞においてＨ−Ｒａｓの活性化とＡＭの発現の関係を見るためにノザンブロッティングを用いて検査した結果を示す図である。
【図１１】 Ba/F3細胞とdominant-negative H-Ras遺伝子を強制発現させたBa/F3細胞においてＨ−Ｒａｓの活性化とＡＭの発現の関係を見るためにノザンブロッティングを用いて検査した結果を示す図である。
【図１２】 Ba/F3細胞においてＩＬ−３刺激後のＡＭ遺伝子の発現をノザンブロッティングを用いて検査した結果を示す図である。
【図１３】 Ba/F3細胞においてサイトカイン刺激によるＡＭ遺伝子の発現をノザンブロッティングを用いて検査した結果を示す図である。
【図１４】 Ba/F3細胞とＡＭ−gene transfected Ba/F3細胞において、ＩＬ−３除去後のｂｃｌ−２の発現とＡＭの発現の関係を見るためにノザンブロッティングを用いて検査した結果を示す図である。
【図１５】 Ba/F3細胞とＡＭ−gene transfected Ba/F3細胞において、ＩＬ−３除去後のｂｃｌ−２の発現とＡＭの発現の関係を見るためにウエスタンブロッティングを用いて検査した結果を示す図である。
【図１６】遺伝子改変動物作成用のターゲットベクターの構成を示す図である。
【図１７】ラット抗マウスアナモルシンモノクローナル抗体の反応特異性を示す図である。
【図１８】ラット抗マウスアナモルシンモノクローナル抗体のウエスタンブロッティングによるマウスアナモルシンの検出を示す図である。
【図１９】ラット抗マウスアナモルシンモノクローナル抗体の蛍光抗体法によるマウスアナモルシンの検出を示す図である。
【図２０】ラット抗マウスアナモルシンモノクローナル抗体の免疫沈降法によるマウスアナモルシンの検出を示す図である。
【図２１】ラット抗マウスアナモルシンモノクローナル抗体の抗原液相系における抗原化合物に対する反応性を示す図である。

Claims

以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれるポリペプチドを認識する抗体を用いる細胞死の抑制又は促進に起因する疾患の診断のための免疫学的測定法。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において一個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ細胞死を抑制する活性を有するポリペプチド。
（ｃ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列において一個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ細胞死を抑制する活性を有するポリペプチド。
抗体が、モノクローナル抗体又はその抗体断片である、請求項１記載の免疫学的測定法。
抗体が、ハイブリドーマＫＭ３０４８（ＦＥＲＭＢＰ−７７６５）、ハイブリドーマＫＭ３０５２（ＦＥＲＭＢＰ−７７６６）又はハイブリドーマＫＭ３０５７（ＦＥＲＭＢＰ−７７６７）が生産するモノクローナル抗体又はその抗体断片である、請求項１又は２記載の免疫学的測定法。
細胞死の抑制又は促進に起因する疾患が、神経変性疾患、劇症肝炎、ウイルス疾患、糖尿病、放射線障害あるいは虚血時あるいは抗癌剤使用時の細胞死、悪性腫瘍又は自己免疫疾患である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫学的測定法。
以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれるポリペプチドと被験試料とを接触させ、被験試料の中から該ポリペプチドに結合する物質を選択することを特徴とする、細胞死の抑制又は促進に起因する疾患の予防薬、診断薬又は治療薬のスクリーニング方法。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において一個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ細胞死を抑制する活性を有するポリペプチド。
（ｃ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列において一個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ細胞死を抑制する活性を有するポリペプチド。
以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれるポリペプチドと被験試料とを接触させ、被験試料の中から該ポリペプチドの活性を抑制させる物質を選択することを特徴とする、細胞死の抑制又は促進に起因する疾患の予防薬、診断薬又は治療薬のスクリーニング方法。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において一個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ細胞死を抑制する活性を有するポリペプチド。
（ｃ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列において一個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ細胞死を抑制する活性を有するポリペプチド。
以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれるポリペプチドを発現する細胞と被験試料とを接触させ、被験試料より該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を制御する物質を選択することを特徴とする、細胞死の抑制又は促進に起因する疾患の予防薬、診断薬又は治療薬のスクリーニング方法。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において一個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ細胞死を抑制する活性を有するポリペプチド。
（ｃ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列において一個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ細胞死を抑制する活性を有するポリペプチド。
発現の制御を、請求項１〜４のいずれか１項に記載の測定法を用いて検出することを特徴とする、請求項７記載のスクリーニング方法。
発現の制御を、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ量を測定することにより検出することを特徴とする、請求項７記載のスクリーニング方法。
以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれるポリペプチドを含有する、細胞死の促進に起因する疾患の予防薬、診断薬又は治療薬。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において一個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ細胞死を抑制する活性を有するポリペプチド。
（ｃ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列において一個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ細胞死を抑制する活性を有するポリペプチド。
以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれるポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する、細胞死の促進に起因する疾患の予防薬、診断薬又は治療薬。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において一個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ細胞死を抑制する活性を有するポリペプチド。
（ｃ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列において一個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ細胞死を抑制する活性を有するポリペプチド。
以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれるポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを含有する、細胞死の促進に起因する疾患の予防薬、診断薬又は治療薬。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において一個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ細胞死を抑制する活性を有するポリペプチド。
（ｃ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列において一個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ細胞死を抑制する活性を有するポリペプチド。
以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれるポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を含有する、細胞死の促進に起因する疾患の予防薬、診断薬又は治療薬。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において一個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ細胞死を抑制する活性を有するポリペプチド。
（ｃ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列において一個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ細胞死を抑制する活性を有するポリペプチド。
以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれるポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列に基づいて調製したアンチセンス鎖ＤＮＡを含有する、細胞死の抑制に起因する疾患の予防薬、診断薬又は治療薬。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において一個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ細胞死を抑制する活性を有するポリペプチド。
（ｃ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列において一個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ細胞死を抑制する活性を有するポリペプチド。
以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれるポリペプチドを認識する抗体又はその抗体断片を含有する、細胞死の抑制に起因する疾患の予防薬、診断薬又は治療薬。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において一個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ細胞死を抑制する活性を有するポリペプチド。
（ｃ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列において一個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ細胞死を抑制する活性を有するポリペプチド。
細胞死の促進に起因する疾患が、神経変性疾患、劇症肝炎、ウイルス疾患、放射線障害、糖尿病、又は虚血時あるいは抗癌剤使用時の細胞死である、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の予防薬、診断薬又は治療薬。
細胞死の抑制に起因する疾患が、悪性腫瘍又は自己免疫疾患である、請求項１４又は１５に記載の予防薬、診断薬又は治療薬。
細胞内のポリペプチドが有する活性を制御する工程を含む、細胞死の制御方法であって、ポリペプチドが、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれるポリペプチドである細胞死の制御方法。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において一個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ細胞死を抑制する活性を有するポリペプチド。
（ｃ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列において一個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ細胞死を抑制する活性を有するポリペプチド。