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JP2002539799A - プライマー結合ベクター伸長（ＰＡＶＥ）：５’−指向ｃＤＮＡクローニング法 - Google Patents

プライマー結合ベクター伸長（ＰＡＶＥ）：５’−指向ｃＤＮＡクローニング法

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JP2002539799A
JP2002539799A JP2000606772A JP2000606772A JP2002539799A JP 2002539799 A JP2002539799 A JP 2002539799A JP 2000606772 A JP2000606772 A JP 2000606772A JP 2000606772 A JP2000606772 A JP 2000606772A JP 2002539799 A JP2002539799 A JP 2002539799A
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JP
Japan
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molecule
mrna
vector
minutes
cdna
Prior art date
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Application number
JP2000606772A
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English (en)
Inventor
チュアンジェン・ソン
ジュリー・シー・ブラウン
ウー・リーイン
ダニエル・エス・リベラ
Original Assignee
ジェネティックス・インスチチュート・インコーポレーテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR

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Abstract

(57)【要約】 ｃＤＮＡライブラリーを調製するための新規方法が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の分野 本発明は、完全長ｃＤＮＡインサートのパーセンテージが増加したｃＤＮＡラ
イブラリーを調製するための新規方法を提供する。
【０００２】発明の背景 ｃＤＮＡライブラリーの製造を目的とするテクノロジーは生物学的に重要な遺
伝学的配列の発見において重要な道具であるが、しばしば、完全とは程遠いｃＤ
ＮＡライブラリーができる。ｃＤＮＡライブラリーは、ｃＤＮＡが由来した天然
のｍＲＮＡ分子と比較した場合にライブラリーのベクター中のｃＤＮＡインサー
トが完全長でないもののパーセンテージが高い。ｃＤＮＡライブラリーは、「方
向性」があるように設計され、あるいはベクター配列に対して特に５’から３’
への方向で存在するｃＤＮＡインサートを有するｃＤＮＡライブラリーは、しば
しば、ｃＤＮＡインサートがｃＤＮＡインサートの特徴付けおよび発現に最も望
ましい方向とは反対の向きにである、「フリップした（flipped）」インサート
のパーセンテージが高い。さらに、いくつかのｃＤＮＡライブラリーにはマルチ
プルインサートが高頻度で生じ、そこでは無関係なｃＤＮＡ分子が同じベクター
中に異常に連結されている。 ｃＤＮＡライブラリー製造のための新規方法に対する必要性があり、本発明が
指向するのはまさにこのような方法である。
【０００３】 ９０％以上のインサートが対応ｍＲＮＡ分子の完全長コピーである高品質ｃＤ
ＮＡライブラリーの構築は、分泌蛋白をコードするすべてのヒト遺伝子をクロー
ニングするための我々の努力の成功にとり重要である。慣用的方法、すなわち、
ｃＤＮＡ合成、次いで、プラスミドまたはファージベクター中への連結を用いて
構築されるｃＤＮＡライブラリーの低品質にはいくつかの因子が関与している。
第１に、ｍＲＮＡ分子はＲＮＡ単離中および第１鎖ｃＤＮＡ合成プロセス中に分
解される可能性がある。さらに、大部分のｍＲＮＡ試料はオリゴ−ｄＴ捕捉プロ
トコルを用いて全細胞ＲＮＡから単離され、それゆえ、部分的にプロセッシング
されたポリ（Ａ）含有前駆体ＲＮＡならびに部分的に分解されたｍＲＮＡ分子の
３’部分が混入している。第２に、第１鎖ｃＤＮＡ合成の間に、ＲＮＡ二次構造
あるいは酵素自体の不十分なプロッセシング能により、逆転写酵素がＲＮＡ鋳型
から未成熟に脱落する傾向がある。第３に、ｄｓ ｃＤＮＡ合成後の連結工程が
下記の望ましくない事態を生じる可能性がある：Ａ）ｃＤＮＡインサートを含む
クローンの集団を増加させるために使用される高いインサート／ベクター比によ
り複数のｃＤＮＡインサートが同じベクター中に連結される。Ｂ）一方向ライブ
ラリーを構築する場合、高いパーセンテージ（約１０％）のフリップしたｃＤＮ
Ａインサートが存在する。Ｃ）混入ＤＮＡがライブラリー中に含まれる可能性が
ある。例えば、Clontechにより構築された初期のライブラリーは、酵母ｔＲＮＡ
がｃＤＮＡの沈降に使用された場合に、酵母染色体ＤＮＡにより汚染されていた
。もう１つの例は、完全長のｃＤＮＡが選択された場合（Carninci, et al., 19
96）、混入している部分ｃＤＮＡのベクター中への連結によりライブラリーの品
質が低下した。Ｄ）小さなｃＤＮＡインサートは大きなｃＤＮＡインサートより
も効率的に連結されるので、小さなｃＤＮＡインサートに対する選択があった。
【０００４】 一定量のｍＲＮＡから効率よくクローニングを促進するため、および／または
完全長インサートの割合を増加させるために、多くの努力がなされてきた。いく
つかの最も成功したアプローチは下記のものを包含する：Ａ）ＲＮａｓｅ Ｈ活
性を不活性化させるようにGIBCO-BRLにより設計された処理された逆転写酵素は
、それが二次構造の前で停滞した（stutter）場合に、鋳型上の（on-template）
ＲＮＡ開裂を引き起こし、転写を未完のまま終結させた。よって、Superscript
II逆転写酵素（BRL）は第１鎖ｃＤＮＡ合成のための最もポピュラーな酵素であ
り続けている。Ｂ）オリゴ−ｄＴテイルド（tailed）ベクターが第１鎖ｃＤＮＡ
合成のために使用された（Okayama and Berg, 1982; Alexander et al., 1984;
Bellemare et al., 1991; Kato et al., 1994）。この方法はクローニング効率
およびインサート含有クローンの割合を劇的に向上させた。Ｃ）オリゴヌクレオ
チド（Fromont-Racine et al., 1993; Liu and Gorovsky, 1993; Maruyama and
Sugano, 1994; Kato et al., 1994）またはビオチン（Carninci et al., 1996,
1997）を用いてｍＲＮＡ分子の５’末端キャップを特異的捕捉（Edery et al.,
1995）または標識するための方法が、完全長ｃＤＮＡを選択するために用いられ
た。Katoの方法（Kato et al., 1994, the Protagene protocol）のごとき５’
−末端キャップの選択またはビオチン捕捉法（Carninci et al., 1996）を用い
て構築されたライブラリーは高いパーセンテージの完全長ｃＤＮＡインサートを
有し、７０％ないし９５％であった。しかしながら、上記方法は、高い効率、高
い割合の完全長ｃＤＮＡインサート、ならびに汚染またはＤＮＡ連結による異常
なＤＮＡインサートが少ないという必要事項を完全に満足できるものではなかっ
た。
【０００５】詳細な説明 下記実施例、表、および図は、本発明の方法を行いうる方法の例を示す。これ
らの実施例は、当業者がこれらの方法を行う方法の数、またはこれらの方法に使
用できるベクター、プライマー、および他の材料のタイプを何ら限定するもので
はない。詳細には、当業者は、本発明の５’および３’リンカー（これらをプラ
イマーともいう）として異なる配列を選択することにより、特定の制限酵素で消
化された既知ヌクレオチド配列のベクターにアニールするリンカー（プライマー
）を設計できることを理解するであろう。
【０００６】 例えば、本発明は、本明細書開示のポリヌクレオチドの配列に相補的な配列を
有するポリヌクレオチドを包含する。また本発明は、下記方法またはそれらの組
み合わせにより本明細書開示のポリヌクレオチドから誘導されるポリヌクレオチ
ドを包含する：ポリヌクレオチドの残基またはアミノ酸、糖類、脂質またはそれ
らの修飾形態のごとき他の分子についての残基付加；残基欠失；残基置換；ある
いは存在している残基に対する化学修飾。化学修飾の例は、メチル化、他のアル
キルキの付加、芳香族もしくは複素環分子の付加、ヒドロキシルキの付加もしく
は除去、ポリエチレングリコールの付加、糖類、ポリペプチドまたは脂質分子の
付加等を包含するが、これらに限らない。
【０００７】 また本発明は、厳密さを減じた条件下で、より好ましくは厳密な条件下で、最
も好ましくは非常に厳密な条件下で、本明細書記載のポリヌクレオチドにハイブ
リダイゼーションしうるポリヌクレオチドも包含する。厳密さの条件の例を下表
に示す。非常に厳密な条件は、例えば、少なくとも条件Ａ〜Ｆと同程度に厳密で
あり、厳密な条件は、例えば、少なくとも条件Ｇ〜Ｌと同程度に厳密であり、厳
密さを減じた条件は、例えば、少なくとも条件Ｍ〜Ｒと同程度に厳密である。
【表１】 ａ） ：ハイブリッド長さは、ハイブリダイゼーションしているポリヌクレオチ
ドのハイブリッドしている領域（複数も可）に関して予想される長さである。ポ
リヌクレオチドを未知配列の標的ポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションさ
せる場合、ハイブリッド長さは、ハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド
の長さと仮定する。既知配列のポリヌクレオチドがハイブリダイゼーションする
場合、ポリヌクレオチド配列を並置し、最適な配列相補性の領域（複数も可）を
同定することによりハイブリッド長さを決定することができる。 ｂ） ：ハイブリダイゼーションおよび洗浄バッファーにおいてＳＳＰＥ（１Ｘ
ＳＳＰＥは０.１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、および１.２５ｍＭ
ＥＤＴＡ，ｐＨ７.４である）をＳＳＣ（１ＸＳＳＣは０.１５Ｍ ＮａＣｌおよ
び１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）に置き換えることができる。ハイブリダ
イゼーション完了後、洗浄を１５分間行う。 *ＴＢ−ＴＲ：長さ５０塩基対よりも短いと予想されるハイブリッドについての
ハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）よりも５〜１
０℃低くすべきである。下記等式によりＴｍが決定される。長さ１８塩基対未満
のハイブリッドについては、Tm(℃) = 2(A + T塩基の数) + 4(G + C塩基の数)。
長さ１８ないし４９塩基対のハイブリッドについては、 Tm(℃) = 81.5 + 16.6(log10[Na+]) + 0.41(%G+C) - (600/N)であり、Ｎはハイ
ブリッドの塩基数であり、ハイブリダイゼーションバッファー中のナトリウムイ
オン濃度である（１ＸＳＳＣについての［Ｎａ＋］＝０.１６５Ｍ）。 ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションのための厳密さの条件のさらなる例
はSambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Ha
rbor, NY, chapters 9 and 11, and Current Protocols in Molecular Biology,
1995, F.M. Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., sections 2.10
and 6.3-6.4に記載されており、参照により本明細書に記載されているものとみ
なす。 好ましくは、かかるハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドのそれぞれ
が、ハイブリダイゼーションすべき本発明ポリヌクレオチドの少なくとも２５％
（より好ましくは、少なくとも５０％、最も好ましくは、少なくとも７５％）の
長さを有し、ハイブリダイゼーションすべき本発明ポリヌクレオチドに対して少
なくとも６０％の配列同一性（より好ましくは、少なくとも７５％の同一性、最
も好ましくは、少なくとも９０％または９５％の同一性）を有する。配列同一性
は、配列のギャップを最小にしつつ、重複および同一性を最大にするように配列
を並置した場合に蛋白のアミノ酸配列を比較することにより決定される。
【０００８】 詳細には、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ（Washington University BLAST）バージョン２
．０ソフトウェアを用いて配列同一性を決定してもよく、該ソフトウェアは、公
に制限なく使用できるＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴバージョン１．４を基礎としたＷＵ
−ＢＬＡＳＴに基づいて構築されている（Altschul and Gish, 1996, Local ali
gnment statistics, Doolittle ed., Methods in Enzymology 266: 460-480; Al
tschul et al., 1990, Basic local alignment search tool, Journal of Molec
ular Biology 215: 403-410; Gish and States, 1993, Identification of prot
ein coding regions by database similarity search, Nature Genetics 3: 266
-272; Karlin and Altschul, 1993, Applications and statistics for multipl
e high-scoring segments in molecular sequences, Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 90: 5873-5877（参照によりこれらすべての文献を本明細書に記載されている
ものとみなす））。いくつかのユニックスプラットフォーム用のＷＵ−ＢＬＡＳ
Ｔバージョン２．０実行可能プログラムをftp://blast.wustl.edu/blast/execut
ablesからダウンロードすることができる。いくつかのサポートプログラムのほ
かに、検索プログラムの完全な組（ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ
、ＴＢＬＡＳＴＮおよびＴＢＬＡＳＴＸ）がこのサイトにおいて提供される。Ｗ
Ｕ−ＢＬＡＳＴ ２．０には著作権が設定されており、著者の許諾なしにいかな
る形態であっても販売または再頒布してはならないが、業としての使用でない場
合、あるいは研究用途の場合は自由に使用できる。組（ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳ
ＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、ＴＢＬＡＳＴＮおよびＴＢＬＡＳＴＸ）に属するすべての
検索プログラムにおいて、ギャップドアラインメントルーチン（gapped alignme
nt routines）がデータベースサーチ自体に統合されており、そのため、高感度
かつ高選択性であり、解釈容易な結果が得られる。最適には、これらすべてのプ
ログラムにおいてギャッピングをオフにすることができる。長さのギャップに関
するデフォールトペナルティー（default penalty）（Ｑ）は、ＢＬＡＳＴＰに
ついてはＱ＝９であり、ＢＬＡＳＴＮについてはＱ＝１０であるが、ゼロを含め
て、１ないし８、９、１０、１１、１２ないし２０、２１ないし５０、５１ない
し１００等のいずれの整数値に変更してもよい。ギャップを拡張するための残基
１個あたりのデフォールトペナルティー（Ｒ）は、蛋白およびＢＬＡＳＴＰにつ
いてはＲ＝２であり、ＢＬＡＳＴＮについてはＲ＝１０であるが、０、１、２、
３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ないし２０、２１ないし５０、
５１ないし１００等の整数値に変更してもよい。配列を並置比較して重複および
同一性を最大とし、配列のギャップを最小とするために、ＱおよびＲのいずれの
組み合わせを使用してもよい。デフォールトアミノ酸比較マトリックスはＢＬＯ
ＳＵＭ６２であるが、ＰＡＭのごとき他のアミノ酸比較マトリックスを使用する
こともできる。
【０００９】 多くのタイプの細胞は本発明蛋白の発現に適した宿主細胞として作用しうる。
哺乳動物細胞は、例えば、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣 （ＣＨＯ）細胞、ヒト腎臓２９３細胞、ヒト表皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２
０５細胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ−１細胞、他の形質転換された霊長類細胞系、正常
２倍体細胞、一次組織のインビトロ培養から得られる細胞株、一次エクスプラン
ト、ＨｅＬａ細胞、マウス細胞、ＢＨＫ、ＨＬ−６０、Ｕ９３７ＨａＫまたはJu
rkat細胞を包含する。別法として、酵母のごとき下等真核細胞または細菌のごと
き原核細胞において蛋白を製造することが可能である。潜在的に適当な酵母株は
、ｃＤＮＡクローンにて形質転換されうるSaccharomyces cerevisiae、Schizosa
ccharomyces pombe、Kluyveromyces株、Candida、または他の酵母株を包含する
。潜在的に適当な細菌株は、ｃＤＮＡクローンにて形質転換されうるEscherichi
a coli、Bacillus subtilis、Salmonella typhimurium、または他の細菌株を包
含する。
【００１０】 本明細書で引用した特許および文献を、出典明示により本明細書に一体化させ
る。
【００１１】 この提案において、我々は、プライマー結合ベクター伸長（Primers-Attached
-Vector Elongation）（ＰＡＶＥ）と称する改良（Kato et al., 1994と比較し
て）された方法について説明する。当該方法に重要な要素は、第１鎖および第２
鎖両方のｃＤＮＡ合成のためのプライマーに結合した新規ベクターである。ベク
ターの一端に結合したオリゴｄＴプライマーを用いて、キャップが２７量体ビオ
チン化ＲＮＡタグで特異的に標識されているｍＲＮＡのポリ（Ａ）ストレッチか
らの第１鎖ｃＤＮＡ合成を開始させる。ＲＮａｓｅＩで１本鎖ＲＮＡを消化した
後、ストレプトアビジンビーズにより完全長のｃＤＮＡを捕捉する。次いで、ベ
クターの他端においてプライマー（ＲＮＡタグと同じ配列を有する）を用いて第
２鎖の合成を行うと、該プライマーは、ＲＮＡタグに相補的な配列を含む完全長
ｃＤＮＡと特異的に塩基対を形成するであろう。このことにより、次のＥ．ｃｏ
ｌｉ形質転換のための環化プラスミドが得られる。ｃＤＮＡ合成後にＤＮＡ連結
を必要としないので、ｃＤＮＡ−ベクター連結により発生可能なすべての人工的
要因が理論的に除去されるであろう。さらに、第２鎖ｃＤＮＡ合成の前に１本鎖
ｃＤＮＡインサートを含有する２本鎖ベクターの利用できることは、ライブラリ
ー正規化および減法のための機構を提供し、分泌および膜蛋白をコードする下位
集団ならびに可溶性蛋白をコードする下位集団中へのｃＤＮＡライブラリーのサ
ブグループ化を可能にするであろう。
【００１２】 実施例 実施例１ ベクター−プライマーの調製 プラスミドベクターｐＥＤ６ｄｐｃ４をＥｃｏＩおよびＳａｌＩで完全に消化
した。次いで、製造者により示唆された条件下においてＴ４ ＤＮＡリガーゼ（N
EB）を用い、１．４ｍｌの反応体積として３０マイクログラムの消化プラスミド
ＤＮＡを８４０ｐｍｏｌの下記の２つのリンカーそれぞれと連結した： リンカー 1 ホスフェート-5' -AATTCGAGTGAACACTCGAGCTCACTAGTGACCAGCTGATGCGCCTCAAA-3' (
配列番号：1) 3' -GCTCACTTGTGAGCTCGAG-5' (配列番号：2) リンカー 2 5' -CTAATCTGATCCGCTAGTGGTAC-3' (配列番号：3) 3'-(T)30GATTAGACTAGGCGATCACCATGAGCT-5'- ホスフェート (配列番号：4) 次いで、連結したプラスミドＤＮＡを０．８％アガロースゲル上の電気泳動によ
り精製した。
【００１３】 実施例２ 完全長ｍＲＮＡの５’末端へのビオチン化ＲＮＡタグの連結 製造者により推奨される条件下で、全体積２５０μｌとして１０μｇのウサギ
グロビンｍＲＮＡを５ユニットのＨＫホスファターゼ（Epicentre）で処理した
。３７℃で３０分インキュベーション後、混合物をフェノール／クロロホルムで
抽出し、ＮａＯＡｃ／エタノールで沈殿させた。ペレットを２０μｌのＤＥＰＣ
−水に溶解し、そのうち１９．５μｌを、全体積５０μｌとした５ユニットのタ
バコ酸ピロホスファターゼ（ＴＡＰ）での消化に供した。３７℃で３０分反応を
行い、フェノール／クロロホルム抽出により反応停止させた。ＮａＯＡｃ／エタ
ノール沈殿後、ペレットを２０μｌのＤＥＰＣ−水に溶解した。次いで、５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃ１，ｐＨ７．８，１０ｍＭ ＭｇＣ１２，１０ｍＭ ＤＴＴ，
１ｍＭ ＡＴＰおよび１２ユニットのＴ４ ＲＮＡリガーゼ (Takara)を含有する
１２０μｌの反応混合物中で、１５μｇのＴＡＰ処理ＲＮＡを７μｇのＲＮＡタ
グ（５’ビオチン基を有する２７量体合成リボヌクレオチド）と連結した。室温
で一晩インキュベーション後、試料をフェノール／クロロホルムで抽出し、Ｎａ
ＯＡｃ／エタノールで沈殿させた。ペレットをＤＥＰＣ−水に溶解した。 対照実験として、反応体積４０μｌ中で２．５μｇのＴＡＰ処理ＲＮＡを２．
５μｇの５’ビオチン化ＤＮＡタグに連結し、試料を上記のごとく処理した。 ＲＮＡまたはＤＮＡタグをウサギグロビンｍＲＮＡに連結する効率を評価する
ために、０．２５μｇのＲＮＡ試料を４−２０％ＴＢＥ／ＰＡＧＥミニゲル（No
vex）上で電気泳動し、ナイロン−プラス膜（QIAGEN）上にブロットした。Sambr
ook et al., 1989に従って３２Ｐ−標識抗−タグ（配列番号： 5'-GAGGCGTATCA
GCTGGTCACT-3'）とのハイブリダイゼーションを行った後、ＲＮＡまたはＤＮＡ
タグのいずれかと連結されたｍＲＮＡ分子の位置をオートラジオグラフィーによ
り明らかにした。図４からわかるように、ＲＮＡタグは、ＤＮＡタグよりもＴＡ
Ｐ処理ｍＲＮＡにずっと効率的に連結される。
【００１４】 実施例３ ｃＤＮＡ合成およびクローニング ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃ１，ｐＨ８．３，７５ｍＭ ＫＣ１，３ｍＭ ＭｇＣ１
２，１０ｍＭ ＤＴＴ，各０．５ｍＭの４種のｄＮＴＰｓおよび２００ユニット
のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ(GIBCO BRL)を含有する最終体積２０μｌ中にお
いて約１．２５μｇのビオチン−ＲＮＡ−タグ付加ｍＲＮＡを１．２μｇのベク
ター−プライマーと混合し、４８℃で１時間反応を行った。次いで、ｃＤＮＡを
フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。ペレットを水に
溶解し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃ１，ｐＨ７．９，１０ｍＭ ＭｇＣ１２，５０ｍ
Ｍ ＮａＣ１および１ｍＭ ＤＴＴを含有する６０μｌの反応混合物中で、２５ユ
ニットのＲＮａｓｅ Ｏｎｅ（Promegha）および６ユニットのＥ．ｃｏｌｉ Ｒ
Ｎａｓｅ Ｈ（Epicentre）で消化した。３７℃で１時間インキュベーション後、
３０μｌの水および１０μｌの１０Ｘアニーリングバッファー（０．５Ｍ Ｔｒ
ｉｓ−Ｃ１，ｐＨ８．０，０．１Ｍ ＭｇＣ１２および０．５Ｍ ＮａＣ１）を添
加し、混合物を７０℃で５分加熱し、３０分かけて５０℃までゆっくりと冷却し
た。次いで、１０μｇのグリコーゲンを添加し、ＤＮＡをＮａＯＡｃ／エタノー
ルで沈殿させた。 第２鎖ｃＤＮＡ合成のために、上記ＤＮＡペレットを１３μｌの水に溶解し、
２μｌの１０ＸＴ４ ＤＮＡポリメラーゼバッファー（NEB）、４μｌのｄＮＴＰ
（各２．５ｍＭ）、１μｌの１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡおよび１μｌ（３ユニット）
のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを順次添加した。３７℃で１時間後、ＤＮＡを沈殿
させ、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（DH10B, GIBCO BRL）を形質転換するため
に使用した。 タグ付加ウサギグロビンｍＲＮＡを上記手順に使用した場合、ライブラリーの
効率は約１０６コロニー／μｇ出発ＲＮＡである。 ランダムに拾った個々のコロニーからプラスミドを単離し、Ａｓｃ Ｉおよび
Ｎｏｔ Ｉで消化して挿入した場合、４８個のコロニーのうち３７個が完全長（
約６５０ｂｐ）インサートを有する。さらに、５’−末端および３’−末端ＤＮ
Ａブローブを用いて、プレートに生じたコロニーから釣り上げた複製フィルター
にハイブリダイゼーションさせ、両方のプローブとハイブリダイゼーションする
能力により判断したところ、７５．８％のコロニーが完全長であった（表１）。
【００１５】 実験計画および期待される結果 Ｉ．インビトロおよびインビボでの蛋白発現のための多目的ベクター（ｐＡＶＥ
１）の構築 単一のクローニング工程ですべてのヒト分泌蛋白の完全長ｃＤＮＡを得るため
の我々の大規模な分子生物学的努力のためにベクターｐＡＶＥ１を構築した。ｐ
ＡＶＥ１は、ｐＮＯＴＳのＰｓｔ／ＸｈｏＩフラグメントを１００ｂｐの設計さ
れたリンカーで置換することによりｐＮＯＴＳから誘導される。ｐＡＶＥ１のい
くつかの著しい特徴は下記のものを包含する： Ａ）クローニングされるｃＤＮＡインサートに隣接したＴ７およびＴ３ ＲＮ
Ａポリメラーゼプロモーターが５’から３’方向にＥｃｏ ＲＩおよびＫｐｎ Ｉ
部位間に配置されており、センスおよびアンチ−センスＲＮＡ分子がそれぞれ合
成される。Ｔ７ ＲＮＡプロモーターは、コードされる蛋白生成物のサイズを評
価するために用いられるカップリングされたインビトロ転写および翻訳（ＴＮＴ
）プロトコルを可能にする。 Ｂ）Ｔ７およびＴ３プロモーターに隣接する４つの８塩基認識制限部位により
、ｃＤＮＡインサートのサブクローニングが容易である。 Ｃ）ＳＶ４０複製開始点および真核発現カセットにより、ＣＯＳでの発現に適
する。 Ｄ）ｆ１複製開始点（ｐＮＯＴＳ骨格由来）はライブラリー減法および正規化
するためのｓｓＤＮＡの調製を容易にする。さらに、組み換えｆ１ファージ粒子
を用いてＣＯＳ細胞をトランスフェクションすることができる（Yokoyama-Kobay
ashi and Kato, 1993）。ｆ１ファージ粒子を特異的かつ効率的にエンドサイト
ーシスできる特許可能なＣＯＳ細胞系を製造することができるならば、我々はプ
ラスミドを調製する必要なく大規模にＣＯＳトランスフェクションを行うことが
できる。
【００１６】 ＩＩ．プライマー−結合−ベクターの調製 Ｅｃｏ ＲＩおよびＫｐｎ Ｉで消化したｐＡＶＥ１プラスミドＤＮＡをゲル精
製し、Ｅｃｏ ＲＩ末端に適合し、ＲＮＡタグと同じ１本鎖配列を含む５’末端
リンカー、およびＫｐｎ Ｉに適合し、１本鎖オリゴｄＴ配列を含む３’末端リ
ンカーに連結する。連結したＤＮＡ生成物をゲル精製し、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよ
びＧｓｔ ＸＩでの消化、次いで、ポリアクリルアミドゲル分析によりプライマ
ーの存在を確認する。正しいリンカー／ベクター比を用いる場合、９０％以上の
ベクターが当該２個のプラーマーに結合するはずである。さもなくば、所望プラ
イマー−結合ベクターＤＮＡを、オリゴ−ｄＡカラム、次いで、抗−ＲＮＡタグ
オリゴヌクレオチドカラムで順次精製すべきである。
【００１７】 ＩＩＩ．オリゴヌクレオチドを用いるｍＲＮＡキャップのタグ化 南極の細菌から単離された熱不活性化可能（ＨＫ）ホスファターゼ（Epicente
r）でｍＲＮＡ試料を処理して、分解したＲＮＡ分子の５’末端のホスフェート
基を除去する。完全長ＲＮＡ集団のキャップをタバコ酸ピロホスファターゼ（TA
P; Shinshi et al., 1976a and 1976b; Efstratiadis et al., 1977; Fromont-R
acine, et al., 1993; Maruyama and Sugano, 1994; Kato et al., 1994）で除
去する。次いで、キャップを除去したｍＲＮＡ分子を、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼを
用いて２７量体のビオチン化オリゴヌクレオチド（ＲＮＡタグ）に連結する。繰
り返しエタノール沈殿により、その小型ＲＮＡタグを除去する。 この方法には２つの制限があり、すなわち、低い連結効率（約60%, Tessier,
et al., 1986）およびｍＲＮＡ−ｍＲＮＡ連結の割合が小さいことである。しか
しながら、完全長ｃＤＮＡの選択を第１鎖ｃＤＮＡ合成後（ＲＮａｓｅ Ｉ消化
、次いで、ストレプトアビジン捕捉）および第２鎖合成の間（ベクター−結合プ
ライマーからの特異的プライミング）に適用する場合には、このことはｃＤＮＡ
ライブラリーの質に大きな悪影響を及ぼさないかもしれない（一定量のｍＲＮＡ
から得られるコロニー数が減少するとしても）。
【００１８】 ＩＶ．第１鎖ｃＤＮＡ合成および完全長ｃＤＮＡ豊富化 タグ付加ｍＲＮＡをプライマー−結合−ｐＡＶＥ１ベクターにアニールさせ、
Superscript II逆転写酵素（Gibco-BRL）を用いて第１鎖ｃＤＮＡ合成を行う。
随伴するｍＲＮＡ鋳型とともに第１鎖ｃＤＮＡを沈殿させ、ＲＮａｓｅＩ消化に
供して保護されていない１本鎖ＲＮＡ領域ならびに未反応遊離ｍＲＮＡ分子を分
解する。 この反応において、ｃＤＮＡが完全長であるｍＲＮＡのビオチン基のみが、ベ
クター−プライマー−ｃＤＮＡアッセンブリーの刈り込みから防御される。次い
で、完全長ｃＤＮＡ−ベクター分子をストレプトアビジン磁気ビーズを用いて捕
捉し、ＲＮａｓｅ Ｈおよびアルカリ加水分解に供してＲＮＡ鎖を除去する。こ
れにより、ポリ（Ａ／Ｔ）領域を介してｐＡＶＥ１ベクターに共有結合で連結さ
れた１本鎖完全長ｃＤＮＡの集団が得られる。完全長ｃＤＮＡ集団は、Carninci
et al., 1996に従って逆転写酵素により合成された全ｃＤＮＡの約７−１０％
を占めるであろう。
【００１９】 Ｖ．第２鎖ｃＤＮＡ合成および形質転換 ｃＤＮＡ−ベクター分子を希釈し、変性させ、次いで、再アニールさせて、ベ
クター−結合プライマーおよび１本鎖完全長ｃＤＮＡの３’末端の先端との間に
塩基対を生成させる。Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて第２鎖ｃＤＮＡを合成
する。得られる２本鎖環状ＤＮＡ（ｃＤＮＡの各末端に２つのギャップを有する
）を用いてＥ．ｃｏｌｉ １０Ｂ株またはＤＨ５α株を形質転換させる。１マイ
クログラムのベクター−プライマーから１０６個以上の１次コロニーが得られる
はずである。
【００２０】 ＶＩ．ｃＤＮＡライブラリーの品質評価 Ａ）グロビンｍＲＮＡ対照 純粋なグロビンｍＲＮＡ（両サブユニットにつき約７００塩基）を用いてＰＡ
ＶＥ ｃＤＮＡライブラリーを調製する。少なくとも合計１００００コロニーを
含むプレートから複製したフィルターを、５’末端プローブおよび３’末端プロ
ーブそれぞれにハイブリダイゼーションさせると、３’陽性コロニーに対する５
’末端陽性コロニーの割合は１に近いはずである。少なくとも１０００個の１次
コロニーをプラスミドＤＮＡ調製用に拾う。Ａｓｃ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉ消化によりイ
ンサートのサイズを決定する。少なくとも９０％のコロニーが完全長ｃＤＮＡイ
ンサートを有するはずである。 Ｂ）真のｃＤＮＡライブラリー ヒト組織源、好ましくは膵臓から単離された同じｍＲＮＡからＰＡＶＥ ｃＤ
ＮＡライブラリーを作成する。ＧＡＰＤＨ ５’−および３’−末端プローブを
、５’および３’配列を伴ったＧＡＰＤＨ ｃＤＮＡインサートを含むコロニー
の割合を評価するためのコロニーハイブリダイゼーションに使用する。期待され
たように割合が１に近いならば、ライブラリー全体から少なくとも３００コロニ
ーをプラスミド調製用にランダムに拾って、各クローンについてインサートのサ
イズを決定する。９５％以上のコロニーがｃＤＮＡインサートを有しているはず
である。さらに、プラスミドＤＮＡ試料を、３５Ｓ−標識メチオニン存在下にお
けるカップリングしたインビトロ転写および翻訳（ＴＮＴ）分析に供する。４−
２０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いで、オートラジオグラフィーにより、合成され
た蛋白のサイズを分析する。ＴＮＴアッセイにおいて９０％以上のインサート含
有クローンが蛋白生成物を生じる場合、３０００コロニーを５’末端配列決定に
供し、データをバイオインフォーマチックス（bioinformatics）評価に供する。 ライブラリーの品質を評価するために、さらなる、そしておそらくより正確な
アプローチは、ヒトｃＰＬＡ２βに関する７ｋｂの完全長ｃＤＮＡの存在につい
てスクリーニングすることであり、ヒトｃＰＬＡ２βのｍＲＮＡは普遍的に発現
されるが、膵臓において最も豊富である。以前の努力によれば、１００個以上の
陽性コロニーが４つのｃＤＮＡライブラリーから得られたが、それらのうち完全
長であるものはなかった（Song, Kriz, Bean および Knopf, 未公表）。
【００２１】 将来の展望 下記の努力は、分泌または膜蛋白に関するすべてのヒトｃＤＮＡのクローニン
グにおける我々の進歩を促進し、それらの機能分析を容易にするものと考えられ
る。 Ｉ．分泌および膜蛋白に関するｃＤＮＡの豊富化 方法１：ショ糖密度勾配遠心分離パラメーターを調節することにより高純度の
粗面小胞体（ＥＲ）を単離する。ｍＲＮＡ分子を単離し、それらのポリＡテイル
をオリゴ（ｄＴ）−指向ＲＮａｓｅ Ｈ消化により除去し、５’−末端キャップ
をビオチンで標識する（Carninci, et al., 1996）。標識された粗面小胞体ｍＲ
ＮＡを、高品質全ｍＲＮＡかた調製された１本鎖ｃＤＮＡベクター集団とハイブ
リダイゼーションさせる。ストレプトアビジンビーズで捕捉した後、結合ｃＤＮ
Ａを溶離させ、これを用いて、分泌または膜結合蛋白に関するｃＤＮＡ分子が非
常に豊富化されたｃＤＮＡライブラリーの下位集団を調製する。 方法２：インビトロＴＮＴに基づくライブラリーのサブグループ分けの可能性
を調べる。ＰＡＶＥ ｃＤＮＡライブラリー由来のプラスミドＤＮＡを調製し、
一定時間のインビトロＴＮＴに供する。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよび翻訳機
構の阻害剤を添加して、ｃＤＮＡ−ＲＮＡ−発生期ペプチド複合体を凍結させる
。発生期のペプチドが分泌シグナルを有する場合には、シグナル認識粒子（ＳＲ
Ｐ）に結合した固相により複合体を捕捉する。捕捉されたｃＤＮＡ−ベクター集
団を用いてＥ．ｃｏｌｉ細胞を形質転換して、シグナルペプチドを伴った蛋白に
関するｃＤＮＡが豊富化された下位集団を得る。 ＩＩ．減法 ライブラリーの品質評価のために最初の３０００コロニーを配列決定する場合
に、最も豊富なｍＲＮＡ種に関する完全長ｃＤＮＡクローンが得られる。これら
のコロニーを集め、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いてＮｏｔ Ｉで直鎖状にした
プラスミドＤＮＡからビオチン化センスＲＮＡ転写物を作成する。オリゴヌクレ
オチド−指向ＲＮａｓｅ Ｈ消化法を用いてＲＮＡ上の５’および３’ベクター
配列を除去した後、残りのＲＮＡを用いて、１本鎖ｃＤＮＡ−ベクター集団から
それらの対応ｃＤＮＡを差し引く。残りのｃＤＮＡ−ベクター集団を、まれなメ
ッセージに関して豊富化させるべきである。 ＩＩＩ．正規化 増幅された１本鎖ファージミドＤＮＡが用いられた元の正規化プロトコル（So
ares, et al., 1994）とは違って、最初の細菌形質転換工程の前にＰＡＶＥライ
ブラリーの正規化を行うことができる。それゆえ、正規化されたＰＡＶＥ ｃＤ
ＮＡライブラリーは未正規化一次ライブラリーと同じｃＤＮＡ表示を有するはず
であり、増幅中に選択されるいくつかのｃＤＮＡが消失する機会が最小化される
。 ＩＶ．ＥＳ細胞系ライブラリー？ ９５％以上のインサートが完全長であり、ＴＮＴアッセイにより蛋白生成物を
コードしているものである、正規化されたＰＡＶＥ ｃＤＮＡライブラリーの構
築に我々が成功した場合、我々は、マウスゲノム中の特定遺伝子座中にｃＤＮＡ
を組み込むことを指令できる特別なベクターを設計することができる。ライブラ
リーから調製される直鎖状プラスミドＤＮＡを用いてＥＳ細胞をトランスフェク
ションする。期待される位置に個々のｃＤＮＡインサートを含有するＥＳクロー
ンを単離し、ｃＤＮＡのアイデンティティーをＰＣＲおよび配列決定により分析
する。最終的には、我々は、トランスジェニックマウス製造を便利にするための
ＥＳ細胞系ライブラリーを確立できるはずである。このことは、破壊された遺伝
子を有するＥＳ細胞系をノックアウトマススの製造のために集めるMerck-Lexico
nアプローチに相対するものであるが、大部分の薬剤が疾病標的に対する阻害剤
であるので、おそらく、薬剤発見のシナリオにとってより重要なものであろう。
【００２２】ｍＲＮＡのタグ付加 ＊＊＊＊組織培養フード中ですべてのＲＮＡセットアップを行う。 ＊＊シリコナイズしたＲＮＡｓｅ−フリーの１．５ｍｌチューブ（Ambion）にて
下記操作を行う。 すべての試薬をＤＥＰＣ−水（Ambion）中に調製する。 すべての反応にＡＲＴチップのみを使用する。 ＲＮＡｓｅがないようにピペットをエタノールで洗浄する。 実験台に新しい研究室用の紙を置く（プラスチック面を上に）。 常に手袋をはめる。 一般的に、実験区域を清潔に保つ（ＲＮａｓｅはどこにでも存在するから）。
【００２３】 １日目： 本日：０．２４−９．５ＫＢのマーカー（１μｇ／μｌ）、ＴＦ−１ ｍＲＮＡ
（１μｇ／μｌ）およびグロビンｍＲＮＡ（１μｇ／μｌ）を用いる。 ヒートブロックを３７℃にする。 1 μｌ tRNA (5 μｇ/μｌ) 36 μｌ/39 μｌ DEPC-水 (Ambion) 5 μｌ 10X BAP バッファー (Gibco) 0.75 μｌ 0.1 M DTT (Homemade-Sigma) 1.25 μｌ RNAsin (40 u/μｌ) (Promega) 5 μｌ/2μｌ mRNA (1μｇ/μｌ) (2 μｇ)1 μｌ BAP (150 u/μｌ) (Gibco) VT=50μｌ ＊ヒートブロック上にカバー（ピペット箱の上部）をかけて３７℃で０．５時間
インキュベーションする。凝縮が起こったら、素早く遠心分離する。 ＊１００μｌのＤＥＰＣ−水を添加し、次いで、１５０μｌのフェノール／ＣＨ
Ｃｌ２／ＩＡＡ ｐＨ７．９（Ambion）を添加し、０．５分間軽くはじく。微量
遠心分離機にて１４０００ｒｐｍで４−６分遠心分離する。ピペット（TOP）で
１２５μｌの水層を取り、新たな１．５ｍｌのＲＮＡｓｅフリーのチューブに入
れる。 ＊１２５μｌのＤＥＰＣ−水（Ambion）をもとのチューブに入れ（下層）、３０
秒間軽くはじく。微量遠心分離機にて１４０００ｒｐｍで４−６分遠心分離する
。ピペット（TOP）で１２５μｌの水層を取り、他の水層とともに１．５ｍｌの
ＲＮＡｓｅフリーのチューブに入れる。 ＊２５μｌの３Ｍ ＮａＯＡｃ，ｐＨ４．５（メディアプレプ（media prep）か
らオートクレーブ）および６２５μｌのエタノールを添加する。ドライアイス上
で５−８分間インキュベーションする。 ＊４℃、１４０００ｒｐｍで１０−１５分遠心分離する。約５０μｌを除きすべ
てのエタノール層を取り、保存する（１．５ｍｌのＲＮＡｓｅフリーのチューブ
中に）。上記のごとく５分間遠心分離する。ペレットを破壊することなく残りの
エタノールを除去する。−２０℃に冷却した８０％エタノール２００μｌでペレ
ットを洗浄し、４℃、１４０００ｒｐｍで２−５分遠心分離する。エタノールを
除去し、１４０００ｒｐｍで１分間再遠心分離し、エタノール液滴の端に２０μ
ｌのピペットチップで軽く触れることにより残っている１−５μｌのエタノール
を除去する。氷上でフタを開けて５分間風乾する。 ・２０μｌのＤＥＰＣ−水（Ambion）中に再懸濁する（１００ｎｇ／μｌ）。 ・＊＊＊＊５００ｎｇ（５μｌ）のＲＮＡマーカーのみをとっておく。 1μl tRNA (5μｇ/μｌ) 21.7μｌ/26.7μｌ DEPC-水 (Ambion) 5μｌ 10X TAP バッファー (Epicenter) 1.3μｌ RNAsin (Promega) 20μｌ/15μｌ "BAP-ed" mRNA1μｌ TAP (10u/μｌ) (Epicenter) Ｖｔ＝５０μｌ ＊ヒートブロック上でカバー（ピペット箱の上部）をかけて３７℃で０．５時間
インキュベーションする。凝縮が起こったら、素早く遠心分離する。 ＊１５０μｌの水を添加する。１５０μｌのフェノール／ＣＨＣｌ２／ＩＡＡ
ｐＨ７．９（Ambion）を添加し、３０秒間軽くはじく。微量遠心分離機にて１４
０００ｒｐｍで４−６分遠心分離する。ピペット（TOP）で１２５μｌの水層を
取り、新たな１．５ｍｌのＲＮＡｓｅフリーのチューブに入れる。 ＊１２５μｌのＤＥＰＣ−水（Ambion）をもとのチューブに入れ（下層）、３０
秒間軽くはじく。微量遠心分離機にて１４０００ｒｐｍで４−６分遠心分離する
。ピペット（TOP）で１２５μｌの水層を取り、他の水層とともに１．５ｍｌの
ＲＮＡｓｅフリーのチューブに入れる。 ＊２５μｌの３Ｍ ＮａＯＡｃ，ｐＨ４．５（メディアプレプ（media prep）か
らオートクレーブ）および６２５μｌのエタノールを添加する。ドライアイス上
で５−８分間インキュベーションする。 ＊４℃、１４０００ｒｐｍで１０−１５分遠心分離する。約５０μｌを除きすべ
てのエタノール層を取り、保存する（１．５ｍｌのＲＮＡｓｅフリーのチューブ
中に）。上記のごとく５分間遠心分離する。ペレットを破壊することなく残りの
エタノールを除去する。−２０℃に冷却した８０％エタノール４００μｌでペレ
ットを洗浄し、４℃、１４０００ｒｐｍで２−５分遠心分離する。エタノールを
除去し、１４０００ｒｐｍで１分間再遠心分離し、エタノール液滴の端に２０μ
ｌのピペットチップで軽く触れることにより残っている１−５μｌのエタノール
を除去する。氷上でフタを開けて５分間風乾する。 ・２０μｌのＤＥＰＣ−水（Ambion）中に再懸濁する（７５ｎｇ／μｌ）。 ・＊＊＊＊５００ｎｇ（６．７μｌ）のＲＮＡマーカーのみをとっておく。 ＊＊リガーゼバッファー：0.25 M Tris pH7, 0.25 M Tris pH8, 0.1M, MgCl2 (
すべてAmbion溶液) ＊＊この時点で連結するために約２μｇを用意する。 ＊＊（１）ＲＮＡマーカー、（２）グロビン、（３）ＴＦ−１ ｍＲＮＡ 1μｌ tRNA (5μｇ/μｌ) 56.95 μｌ/58 μｌ/64.7 μｌ DEPC-水 (Ambion) 10 μｌ 10X 新鮮Ligaseバッファー (ホームメイド−レシピ参照) 1 μｌ lM DTT (ホームメイド−レシピ参照) 2.5 μｌ RNAsin (40 u/μｌ) (Promega) 1.8 μｌ 新鮮 10 mM ATP (Gibco-BRL) 1.75 μｌ/0.7 μｌ/0.7 μｌ RNA-TAG (100 pmol/μｌ) (IDT) 20μ/20 μｌ/13.3 μｌ TAP-処理 mRNA (2 μｇ) (上記反応)5 μｌ T4 RNA リガーゼ (5u/μｌ) (GIBCO-BRL) VT-100 μｌ＊１６℃で１６時間インキュベーション（一晩）する。 ＊５０μｌのＤＥＰＣ−水を添加する。１５０μｌのフェノール／ＣＨＣｌ２／
ＩＡＡ ｐＨ７．９（Ambion）を添加し、３０秒間軽くはじく。微量遠心分離機
にて１４０００ｒｐｍで４−６分遠心分離する。ピペット（TOP）で１２５μｌ
の水層を取り、新たな１．５ｍｌのＲＮＡｓｅフリーのチューブに入れる。 ＊１２５μｌのＤＥＰＣ−水（Ambion）をもとのチューブに入れ（下層）、３０
秒間軽くはじく。微量遠心分離機にて１４０００ｒｐｍで４−６分遠心分離する
。ピペット（TOP）で１２５μｌの水層を取り、他の水層とともに１．５ｍｌの
ＲＮＡｓｅフリーのチューブに入れる。 ＊２５μｌの３Ｍ ＮａＯＡｃ，ｐＨ４．５（メディアプレプ（media prep）か
らオートクレーブ）および６２５μｌのエタノールを添加する。ドライアイス上
で５−８分間インキュベーションする。 ＊４℃、１４０００ｒｐｍで１０−１５分遠心分離する。約５０μｌを除きすべ
てのエタノール層を取り、保存する（１．５ｍｌのＲＮＡｓｅフリーのチューブ
中に）。上記のごとく５分間遠心分離する。ペレットを破壊することなく残りの
エタノールを除去する。−２０℃に冷却した８０％エタノール４００μｌでペレ
ットを洗浄し、４℃、１４０００ｒｐｍで２−５分遠心分離する。エタノールを
除去し、１４０００ｒｐｍで１分間再遠心分離し、エタノール液滴の端に２０μ
ｌのピペットチップで軽く触れることにより残っている１−５μｌのエタノール
を除去する。氷上でフタを開けて５分間風乾する。 ・４μｌのＤＥＰＣ−水（Ambion）に再懸濁する。（２５０ｎｇ／μｌ）（マー
カー）、（５００ｎｇ／μｌ）（ｍＲＮＡ）。 ・５００ｎｇ（２μｌ）のＲＮＡマーカーをとっておく。
【００２４】２日目 ： ＊＊＊２μｇおよび５μｌのＴＦ−１ ｍＲＮＡを用いて継続する（ビオチン−
捕捉のために）。第１鎖合成 ＊＊記載された順にすべての成分を添加する。 1.0μｌ 1.0μｌ tRNA ------ 1.0μｌ DEPC-処理水 4.0μｌ 5X 第１標準バッファー 2.0μｌ 100mM DTT 0.5μｌ 20mM dNTPs (新鮮) 4.7μｌ 3.7μｌ pED4 NT35 (8/14/98, 300 ng/μｌ) 合計 1.1 μｇ 0.5μｌ RNAsin 4.0μｌ グロビンmRNA (合計 1μｇ)/MG63 mRNA (合計 2μｇ) 2.0μｌ Superscript II (Gibco-BRL) 1.3μｌ Thermoscript RT ----------------------- VＴ = 20 μｌ ＊４８℃で１時間、５５℃で３０分インキュベーションする。 ＊１３０μｌの水および１５０μｌのフェノール／ＣＨＣｌ２／ＩＡＡ ｐＨ７
．９（Ambion）を添加し、０．５分間軽くはじく。微量遠心分離機にて１４００
０ｒｐｍで４−６分遠心分離する。ピペット（TOP）で１２５μｌの水層を取り
、新たな１．５ｍｌのＲＮＡｓｅフリーのチューブに入れる。 ＊１２５μｌのＤＥＰＣ−水（Ambion）をもとのチューブに入れ（下層）、３０
秒間軽くはじく。微量遠心分離機にて１４０００ｒｐｍで４−６分遠心分離する
。ピペット（TOP）で１２５μｌの水層を取り、他の水層とともに１．５ｍｌの
ＲＮＡｓｅフリーのチューブに入れる。 ＊２５μｌの３Ｍ ＮａＯＡｃ，ｐＨ４．５（メディアプレプ（media prep）か
らオートクレーブ）および６２５μｌのエタノールを添加する。ドライアイス上
で５−８分間インキュベーションする。 ＊４℃、１４０００ｒｐｍで１０−１５分遠心分離する。約５０μｌを除きすべ
てのエタノール層を取り、保存する（１．５ｍｌのＲＮＡｓｅフリーのチューブ
中に）。上記のごとく５分間遠心分離する。ペレットを破壊することなく残りの
エタノールを除去する。−２０℃に冷却した８０％エタノール４００μｌでペレ
ットを洗浄し、４℃、１４０００ｒｐｍで２−５分遠心分離する。エタノールを
除去し、１４０００ｒｐｍで１分間再遠心分離し、エタノール液滴の端に２０μ
ｌのピペットチップで軽く触れることにより残っている１−５μｌのエタノール
を除去する。氷上でフタを開けて５分間風乾する。 ５１．５μｌのＤＥＰＣ−処理水に懸濁する＊＊＊＊０．８％ ＴＢＥアガロースゲル ＊＊＊脱パイロジェンされたガラス器具のみを使用してバッファーおよびゲルを
調製する。 ＊＊＊ＲＮａｓｅを遠ざけてゲルボックスおよび鋳型トレイを洗浄する。 ＊１１０ｍｌの１０Ｘ ＴＢＥを１Ｌのmilli-Q水に添加することによりＴＢＥバ
ッファーを調製する。ゲルのサイズによっては２個のビンが必要かもしれない。 ＊脱パイロジェンした目盛りつきシリンダーを用いて１２０ｍｌの１Ｘ ＴＢＥ
バッファーを計り、それを５００ｍｌの脱パイロジェンしたフラスコに入れる。
秤量皿に降りかけることにより１ｇの超高純度アガロース（Ｂ１０１）を計りと
る。アガロースをフラスコ中のバッファーに添加し、回転混合する。 ＊マイクロウェーブにて約１．５分間、あるいはアガロースが透明になるまでア
ガロースを加熱する。素手で触れるようになるまで約１０分それを冷却する。１
０μｌの１０ｍｇ／ｍｌ臭化エチジウムを添加し、回転混合し、それを鋳型トレ
イ中に注ぐ。コームをゲルに入れ、ピペットチップですべての気泡を除去する。 ＊完全に固化するまで約２０分待つ。その間に、すでに行った３つの反応から得
た保存試料に、同体積のゲルローディングバッファーＩＩ（Ambion）を添加する
。（例：１μｌを保存していたならば、１μｌの色素を添加する。）種々の反応
後に３つのＲＮＡマーカーの試料を用意する。さらに、０．５μｌの０．２４−
９．５ＫＢのＲＮＡラダー（Gibco-BRL）を２μｌの水および２μｌのゲルマー
カー用色素とともに添加する。 ＊５００ｍｌビーカー中の２００ｍｌのmilli-Q水を沸騰するまでマイクロウェ
ーブにて加熱するか、あるいは８０℃のヒートブロックをセットアップする、色
素を伴うゲル試料を８０℃の水中に５分間置く。次いで、それらをゲルに乗せる
準備ができるまでそれらを直接氷上に置く。 ＊ゲルが固化したならば、それをバッファーチャンバー中に置き、それを覆うよ
うにバッファーを入れる。試料をゲル上に乗せる。１００ボルトで約１時間、あ
るいは最初の色素ラインがゲルの長さの２／３のところに来るまで泳動する。泳
動を止めて写真を撮る。 ＊各反応が進行するにつれていくつかのｍＲＮＡが消失するかもしれず、染色さ
れたｍＲＮＡの強度の減少により示される。しかしながら、ｍＲＮＡはすべてゲ
ル上で同じサイズのはずである。分解が起こったならば、プロセスの進行ととも
にｍＲＮＡのサイズが小さいほうにシフトするであろう。
【００２５】ＲＮａｓｅ処理 52.0 μｌ 51.5 μｌ cDNA (1.1 μｇ) 6.0 μｌ 10X NEB バッファー #2 2.0 μｌ Rnase One (Promega, 10 U/μｌ) ----- 0.5 μｌ E. coli Rnase H (Epicenter) (10 u/μｌ) ------------------------------ VＴ = 60 μｌ ３７℃で６０分インキュベーションする *****５μｇのｃＤＮＡライブラリーを停止する*****
【００２６】 アニーリング ＊ＪＣＢアニーリングバッファー＝30mM Tris pH 8, 10 mM MgCl2, 300 mM NaCl (Ambion溶液を用いて調製) 60μｌ 以前の Rxn 30μｌ DEPC-水 10μｌ 10X JCB アニーリングバッファー ---------------- ＶＴ＝１００μｌ ８０℃で５分加熱し、加熱クロックを取り、温度が３７℃になるまで冷却する（
３０分間）。 グリコーゲンとともにエタノール沈殿させる。 １０μｌの０．５Ｘ ＴＥに再懸濁する（１１０ｎｇ／μｌ）。
【００２７】第２鎖合成 2μｌ 10X T7 バッファー 3.6μｌ 水 10μｌ アニールしたcDNA (1.1 μｇ) 0.5μｌ 20 mM dNTPs (Epicenter) 0.9μｌ BSA (1 mg/ml) (NEB) 3μｌ T7 DNAポリメラーゼ（３ユニット／μｌまで希釈） (NEB) --------------------- VＴ = 20 μｌ ３７℃で３−５分インキュベーションする。
【００２８】形質転換 1μｌ(第２鎖) 第２鎖反応物 (11 ng) *希釈したもの(1:5) 40μｌ Electromax DH10B E. coli -------------------- VＴ = 41 μｌ １．８ボルトで形質転換反応物をエレクトロポレーションする。 １ｍｌのＳＯＣ培地を細胞に添加し、培養チューブに移す。 ３７℃で１時間増殖させる。 ＬＢ＋１００ｍｃｇ／ｍｌ ＡＭＰプレート（大）に撒く−−５０μｌおよび ２００μｌ。 約１６時間増殖させる。
【００２９】３日目および４日目 ＊＊＊コロニーをカウントし、力価（ｃｆｕ／μｇ）を計算する。Mini-Prep用の培養 ・ＡＭＰ（１００μｇ／ｍｌ）を含有する１ｍｌのＴＢを９６−深ウェル培養デ
ィッシュに満たす。 ・つまようじを用いて単一コロニーを拾い、１のウェルに入れる。すべてのウェ
ルに接種するまで操作を継続する。つまようじを取り、通気性テープでカバーす
る。一晩少なくとも１６時間（２４時間まで）増殖させる。Mini-Prep（Qiagen） ・４０００ｒｐｍで１０分間プレートを遠心分離する（プログラム＃７）。 ・ペレットをチェックし、次いで、培地を注ぎ出す。 ・Qiagenの９６−ウェルTuebo Mini-prepプロトコルに従って操作を継続する。消化 ・Ｕ字型９６−ウェル培養プレートを消化に使用する。 ・１５μｌ／反応にて１０５ Ｒｘｎ 210μｌ 2μｌ バッファー #3 5μｌ プラスミド 1218μｌ 11.6μｌ milli-Q-水 63μｌ 0.6μｌ Xho I 63μｌ 0.6μｌ Pst I 21μｌ 0.2μｌ 100X BSA VＴ = 1575μｌ VＴ = 20μｌ ３７℃で２時間インキュベーションする。 ３μｌの６Ｘ ローディング色素を添加する。 ２５０ボルトで１．５−２時間ゲル上で泳動する。 ゲルを１０−１５分染色する。
【００３０】 文献 Alexander, D.C., McKnight, T.D., and Williams, B.G. (1984). A simplifie
d and efficient vector-primer cDNA cloning system. Gene, 31(1-3):79-89. Bellemare, G., Potvin, C. and Bergeron, D. (1991). High-yield method fo
r directional cDNA Library construction. Gene, 98:231-235. Carninci, P., Kvam, C., Kitamura, A., Ohsumi, T., Okazaki, Y., Itoh, M.,
Kamiya, M., Shibata, K., Sasaki, N., Izawa, M., Muramatsu, M., Hayashiz
aki, Y., & Schneider, C., (1996), High-efficiency full-length cDNA cloni
ng by bionylated CAP trapper. Genomics, 37:327-336. Carninci, P., Westover, A., Nishiyama, Y., Ohsumi, T., Itoh, M., Nagaoka
, S., Sasaki, N., Okazaki, Y., Muramatsu, M., Schneider, C. and Hayashiz
aki, Y., (1997). High efficiency selection of full-length cDNA by impro
ved biotinylated cap trapper. DNA Res., 4(1):61-66. Edery, I., Chu, L.L., Sonenberg, N., and Pelletier, J., (1995). An effi
cient strategy to isolate full-length cDNAs based on an mRNA cap retensi
on procedure (CAPture)., Mol. Cell. Biol., 15(6):3363-3371. Efstratiadis, A., Vournakis, J.N., Donis-Koller, H., Chaconas, G., Douga
ll, D., K., and Kafatos, F.C., (1977). End labeling of enzymatically de
capped mRNA. Nucleic Acids Res., 4(12):4165-4174. Fromont-Racine, M., Bertrand, E., Pictet, R., and Grange, T., (1993). A
highly sensitive method for mapping the 5' termini of mRNAs. Nucleic A
cids Res., 21(7):1683. Kato, S., Sekine, S., Oh, S.-W., Kim, N.-S., Umezawa, Y., Abe, N., Yokoy
ama-Kobayashi, M. & Aoki, T. (1994). Construction of a human full-leng
th cDNA bank, Gene, 150:243-250. Liu, X., and Gorovsky, M.A., (1993). Mapping the 5' and 3' ends of Tetr
ahymena thermophila mRNA using RNA ligase mediated amplification of cDNA
ends (PLM-RACE). Nucleic Acids Res., 21(21):4954-4960. Maruyama, K., and Sugano, S., (1994). Oligo-capping: a simple method to
replace the cap structure of eukaryotic mRNAs with oligoribonucleotides
. Gene, 138:171-174. Shinshi, H., Miwa, M., Kato, K., Noguchi, M., and Matsushima, T., (1976a
). A novel phosphodiesterase from cultured tobacco cells. Biochemistry
, 15:2185-2190. Soares, M.B., Bonaldo, M.F., Jelene, P., Su, L., Lawton, L., and Efstrat
iadis, A., (1994). Construction and characterization of a normalized cD
NA library. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91(20):9228-9232. Tessier, D.C., Brousseau, R., and Vernet, T., (1986). Ligation of singl
e-stranded oligodeoxyribonucleotides by T4 RNA ligase. Analy. Biochem.,
158:171-178. Yokoyama-Kobayashi, M., and Kota, S., (1993). Recombinant f1 phage part
icles can transfect monkey COS-7 cells by DEAE detran method. Biochem.
Biophys. Res. Comm., 192:935-939.
【００３１】表の説明 表１は、本発明のＰＡＶＥ法を用いてウサギグロビンｍＲＮＡのｃＤＮＡライ
ブラリーを製造した結果を示す。 表２は、「慣用的」方法および本発明のＰＡＶＥ法を用いて種々のｍＲＮＡ源
からｃＤＮＡライブラリーを製造した結果を示す。「慣用的」方法にはＧＩＢＣ
Ｏ／ＢＲＬから得たキットを使用し、さらに３’オリゴ−ｄＴプライマーおよび
ＳａｕＩアダプターを用いた。 表３は、反応の最適効率を得るために修飾されうるＴ４ ＲＮＡリガーゼ反応
の多くのパラメーターを示す。最も好ましい反応条件は、反応を室温で一晩（ま
たは１６時間）行い；２μｇのｍＲＮＡ（平均サイズ１．５ｋｂ）を１７５ｐｍ
ｏｌの２７残基ＲＮＡタグと反応させて得られるのと同じアクセプター／ドナー
比を用い；ＲＮＡｓｅ不含Ｔｒｉｓ ＭｇＣｌ２バッファー中でｔＲＮＡ、ＤＴ
Ｔ、および５．８ｎＭのＡＴＰを添加して反応を行うことを包含する。
【００３２】 表１．ウサギグロビンｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡライブラリーの分析 ａ．複製フィルターを１のプレートから持ち上げ、ウサギβ−グロビンｍＲＮＡ
の５’末端および３’末端に相補的な２種の標識オリゴヌクレオチドにハイブリ
ダイゼーションさせた。陽性合計数を計数した。 ｂ．完全長クローンは５’および３’プローブに対して二重陽性であった。 ｃ．３’末端プローブにのみハイブリダイゼーションしたクローン。 ｄ．５’末端プローブにのみハイブリダイゼーションしたクローン。
【表２】 表３: Ｔ４ ＲＮＡリガーゼによるＲＮＡ−ＲＮＡ連結の最適化 １．温度の影響: 4oC, 一晩; 16oC, 一晩; 室温, 一晩; 37oC, 一晩; 37oC, 3
時間 ２．適当な温度でのタイムコース: 0.5, 2, 4, 8, 16, 24 時間 ３．変性剤の影響: DMSO: 10%, 20%, 30%, 40% 尿素: 0.5 M, 1M, 2M, 3M, 4M ホルムアミド: 5%, 10%, 20%, 40% ４．アクセプター／ドナー比の影響: 1, 10, 20, 50, 100, 200 ５．ＰＥＧの影響: 5%, 10%, 15%, 20%, 25% ６．バッファーの影響(?): グリシルグリシン, HEPES または Tris ７．無機ピロホスファターゼの影響(Ppiは阻害的であるが、Piは阻害的でない) ８．ＨＣＣ（ヘキサミンコバルトクロリド）の影響: 0.5 mM, 1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM ９．１本鎖ＲＮＡ結合蛋白(すなわち、Ｔ４遺伝子３２蛋白)の影響
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのｍＲＮＡ分子を
調製するための開示方法を図式的に示したものである。ｍＲＮＡをホスファター
ゼ、次いで、ピロホスファターゼで処理し、その後、完全長ｍＲＮＡ分子上に唯
一存在するであろう５’ホスフェートにＲＮＡタグを付加するためにＲＮＡリガ
ーゼで連結する。
【図２】 図２は、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼを用いた、タバコ酸ピロホスファ
ターゼ（ＴＡＰ）処理（レーン１および２）またはキャップした（ＴＡＰ処理せ
ず、レーン３）ウサギグロビンｍＲＮＡと、ＲＮＡタグ（レーン１および３）ま
たはＤＮＡタグ（レーン２）との連結を示すノーザンブロットのオートラジオグ
ラフである。タグ配列に相補的な放射性標識オリゴデオキシヌクレオチドとブロ
ットとをハイブリダイゼーションさせた。矢印は完全長のタグ付加ウサギグロビ
ンｍＲＮＡの位置を示す。このノーザンブロットは、ＴＡＰ処理が効率的なＲＮ
Ａ連結に必要であり、ＤＮＡタグと比較すると、ＲＮＡタグはＴ４ ＲＮＡリガ
ーゼによって、ｍＲＮＡ分子により効率的に連結されることを示す。
【図３】 図３は、本明細書に開示したようにｃＤＮＡライブラリーの構築
に使用でき、ｐＥＤ６ｐｄｃ４ベクターのポリリンカー領域のヌクレオチド配列
を含むｐＥＤ６ｐｄｃ４ベクターを図式的に示したものである。
【図４】 図４は、ｐＥＤ６ｐｄｃ４ベクターが誘導され、ｐＥＤ６ｐｄｃ
２ベクターのポリリンカー領域のヌクレオチド配列を含むｐＥＤ６ｐｄｃ２ベク
ターを図式的に示したものである。
【図５】 図５は、ｐＥＤ６ｐｄｃ２ベクターのもう１つの図式的説明であ
り、ｐＥＤ６ｐｄｃ２ベクターの属性に関するさらなる情報を含む。ｐＥＤ６ｐ
ｄｃ２ベクターはｃＤＮＡクローニングを容易化するために新たなポリリンカー
を挿入することによりｐＥＤ６ｐｄｃ１から誘導された（Kaufman et al., 1991
, Nucleic Acids Res. 19: 4485-4490）。
【図６】 図６は、ｐＥＤ６ｐｄｃ２とｐＥＤ６ｐｄｃ４ベクターとの間の
ヌクレオチドの相違を詳細に示すヌクレオチド配列並置比較である。
【図７】 図７は、本明細書に開示したようにｃＤＮＡライブラリーの構築
に使用できるｐＥＤ６ｐｄｃ４ベクターを図式的に示したものであり、ベクター
がある種の制限酵素で消化され、特定の５’および３’リンカーに連結されてｐ
ＥＤ６ｐｄｃ４ベクター−プライマー構築物が得られた。
【図８】 図８は、本明細書に開示したようにｃＤＮＡライブラリーの構築
に使用できるｐＡＶＥ１ベクターを図式的に示したものであり、ベクターがある
種の制限酵素で消化され、特定の５’および３’リンカーに連結されてｐＡＶＥ
１ベクター−プライマー構築物が得られた。
【図９】 図９は、ｐＡＶＥ１ベクターが誘導されたｐＮＯＴｓベクターを
図式的に示したものである。ｐＮＯＴｓベクターは、ＤＨＦＲ配列の欠失、新た
なポリリンカーの挿入、およびＣａｌＩ部位中へのＭ１３複製開始点の挿入によ
りｐＭＴ２（Kaufman et al., 1989, Mol. Cell. Biol. 9: 946-958）から誘導
された。
【図１０】 図１０は、ＲＮＡタグ付加ｍＲＮＡ分子とｐＥＤ６ｐｄｃ４ベ
クター−プライマー構築物分子との組み合わせ、次いで、第１鎖合成（アニーリ
ングおよび逆転写酵素による伸長）、ＲＮＡｓｅ消化、分子内再生、そして第２
鎖合成によるｃＤＮＡライブラリーの作成を図式的に示す。
【図１１】 図１０は、ＲＮＡタグ付加ｍＲＮＡ分子とｐＡＥＶ１ベクター
−プライマー構築物分子との組み合わせ、次いで、第１鎖合成（アニーリングお
よび逆転写酵素による伸長）、ＲＮＡｓｅ消化、分子内再生、そして第２鎖合成
によるｃＤＮＡライブラリーの作成を図式的に示す。この図において、ベクター
−プライマー構築物の３’末端の配列が逆向きになっている。３’は、図８に示
された３’リンカーと同様にＮＶ（Ｔ）４８として示されるべきである。
【図１２】 図１２は、ＲＮＡタグ付加グロビンｍＲＮＡとともにプライマ
ー結合ベクター伸長（ＰＡＶＥ）法を用いた結果を示す、消化ｃＤＮＡクロ−ン
のアガロースゲルを示す。約８０％のグロビンｃＤＮＡは完全長ｃＤＮＡインサ
ートの予想サイズ（矢印）であるが、タグ付加していないＲＮＡ対照完全長ｃＤ
ＮＡインサートはずっと低頻度で存在する。
【図１３】 図１３は、図１３−１７の実験に使用されるＲＮＡタグ付加Ｃ
ＰＬＡ２−γ ｍＲＮＡ分子の構造を図式的に示す。
【図１４】 図１４は、ＲＮＡ−ＲＮＡ連結後、１本鎖ＲＮＡを除去するた
めのＲＮＡｓｅ消化により得ることができた異なるプローブ−ＲＮＡハイブリッ
ドの構造および推定サイズ（ヌクレオチド残基数）を図式的に示す。
【図１５】 図１５は、ゲル上の電気泳動により分離され放射活性により検
出されたＲＮＡ分子のデジタルスキャンであり、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼを用いた
ｍＲＮＡ分子へのＲＮＡタグ付加反応の効率に対するＡＴＰ濃度の影響を示す。
０．１Ｘ（５．８ｎＭ ＡＴＰ）の相対濃度において、連結されていない分子と
比較すると、検出された放射活性の５０．８パーセントが連結された分子に存在
した。
【図１６】 図１６は、ゲル上の電気泳動により分離され放射活性により検
出されたＲＮＡ分子のデジタルスキャンであり、Ｔ４、ＰＦＵ（Promega, Madis
on WI）、およびＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（Amersham Pharmacia Biotech）ＤＮＡポ
リメラーゼと比較した場合、Ｔ７ポリメラーゼが最も有効であることを示す。
【図１７】 図１７は、一連のゲル上の電気泳動により分離されたｃＤＮＡ
分子のデジタルスキャンであり、第２鎖合成反応前のＲＮＡｓｅ消化反応へのｔ
ＲＮＡの混入はｃＤＮＡ反応生成物中にｔＲＮＡ分子の混入を生じさせなかった
ことを示す。さらに、この図は、第２鎖合成なしで生成したｃＤＮＡ分子（図中
「アニール」）は宿主細胞中に形質転換されることができ、その中で維持される
ことを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ， ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，Ｃ Ｚ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ジュリー・シー・ブラウン アメリカ合衆国02176マサチューセッツ州 メルローズ、レバノン・ストリート46番 (72)発明者 ウー・リーイン アメリカ合衆国02134マサチューセッツ州 オールストン、アパートメント８、ブライ トン・アベニュー57番 (72)発明者 ダニエル・エス・リベラ アメリカ合衆国02043マサチューセッツ州 ヒンガム、サクスター・ストリート９番 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA04 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ42 QQ52 QR62 QS34

Claims (33)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 少なくとも１のリボヌクレオチド残基を含むタグを１または
    それ以上のｍＲＮＡ分子の５’末端に連結することを特徴とし、タグがデオキシ
    リボヌクレオチド残基を含まないものである、修飾ｍＲＮＡ分子の製造方法。
  2. 【請求項２】 少なくとも１のｍＲＮＡ分子をピロホスファターゼで処理し
    て、少なくとも１のｍＲＮＡ分子の５’末端から７−メチルグアノシン（７ｍＧ
    ）キャップを除去する前工程をさらに特徴とする請求項１の方法。
  3. 【請求項３】 ピロホスファターゼがタバコ酸ピロホスファターゼである請
    求項２の方法。
  4. 【請求項４】 少なくとも１のｍＲＮＡ分子をピロホスファターゼで処理し
    て、７−メチルグアノシン（７ｍＧ）キャップを有しない少なくとも１のｍＲＮ
    Ａ分子から５’ホスフェートを除去する前工程をさらに特徴とする請求項１の方
    法。
  5. 【請求項５】 ホスファターゼがＨＫホスファターゼおよびＢＡホスファタ
    ーゼからなる群より選択されるものである請求項４の方法。
  6. 【請求項６】 タグがビオチン残基をさらに含むものである請求項１の方法
    。
  7. 【請求項７】 タグが下記ヌクレオチド配列： 5'-ACUAGUGACCAGCUGAUACGCCUCAAA-3' を有するものである請求項１の方法。
  8. 【請求項８】 Ｔ４ ＲＮＡリガーゼを用いて連結反応が行われる請求項１
    の方法。
  9. 【請求項９】 連結反応が室温で一晩行われる請求項１の方法。
  10. 【請求項１０】 ｔＲＮＡ分子の存在下において連結反応が行われる請求項
    １の方法。
  11. 【請求項１１】 ２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、４．５ｎＭ、５ｎＭ、５．５ｎ
    Ｍ、５．８ｎＭ、６ｎＭ、６．５ｎＭ、７ｎＭ、７．５ｎＭ、８ｎＭ、９ｎＭお
    よび１０ｎＭからなる群より選択されるＡＴＰ濃度において連結反応が行われる
    請求項１の方法。
  12. 【請求項１２】 ＡＴＰ濃度が５．８ｎＭである請求項１１の方法。
  13. 【請求項１３】 請求項１の方法により得られる修飾ｍＲＮＡ分子。
  14. 【請求項１４】 少なくとも１のプライマーを少なくとも１のベクター分子
    に接触させて、プライマーとベクター分子との間に少なくとも１の相捕的塩基対
    を形成させることを特徴とする、少なくとも１のベクター−プライマー分子の製
    造方法。
  15. 【請求項１５】 ベクターがｐＥＤ６ｄｐｃ２、ｐＥＤ６ｄｐｃ４、ｐＮＯ
    ＴｓおよびｐＡＶＥ１からなる群より選択されるものである請求項１４の方法。
  16. 【請求項１６】 少なくとも１のプライマーが図７および８において「３’
    リンカー」および「５’リンカー」として示されるものから選択されるヌクレオ
    チド配列を有するものである請求項１４の方法。
  17. 【請求項１７】 少なくとも１のプライマーを少なくとも１のベクター分子
    に連結する後工程をさらに特徴とする請求項１４の方法。
  18. 【請求項１８】 Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結反応が行われる請求項
    １７の方法。
  19. 【請求項１９】 請求項１４の方法により得られるベクター−プライマー分
    子。
  20. 【請求項２０】 下記工程： （ａ）少なくとも１のリボヌクレオチド残基を含むタグを１またはそれ以上の
    ｍＲＮＡ分子の５’末端に連結し、タグはデオキシリボヌクレオチド残基を含ま
    ないものであり；次いで （ｂ）工程（ａ）の生成物をベクター−プライマー分子に接触させて、工程（
    ａ）の少なくとも１の生成物とベクター−プライマー分子との間に少なくとも１
    の相捕的な塩基対を形成させる を特徴とするｃＤＮＡライブラリーの製造方法。
  21. 【請求項２１】 後で行うＲＮＡｓｅ消化工程をさらに特徴とする請求項２
    ０の方法。
  22. 【請求項２２】 後で行うＤＮＡポリメラーゼ第２鎖合成工程をさらに特徴
    とする請求項２０の方法。
  23. 【請求項２３】 ＤＮＡポリメラーゼがＴ４、Ｔ７、ＰｆｕおよびＳＥＱＵ
    ＥＮＡＳＥ ＤＮＡポリメラーゼから選択されるものである請求項２２の方法。
  24. 【請求項２４】 ＤＮＡポリメラーゼ反応が１分、２．５分、５分、７．５
    分、１０分、２０分、３０分または６０分からなる群より選択される時間行われ
    るものである請求項２２の方法。
  25. 【請求項２５】 ＤＮＡポリメラーゼ反応が５分間行われる請求項２４の方
    法。
  26. 【請求項２６】 請求項２０の工程（ｂ）の生成物で宿主細胞を形質転換す
    ることを特徴とする後工程をさらに特徴とする請求項２０の方法。
  27. 【請求項２７】 ＤＮＡポリメラーゼ第２鎖合成工程が行われずに、宿主細
    胞が請求項２０の工程（ｂ）の生成物で形質転換される請求項２６の方法。
  28. 【請求項２８】 ＤＮＡリガーゼ工程が行われずに、宿主細胞が請求項２０
    の工程（ｂ）の生成物で形質転換される請求項２６の方法。
  29. 【請求項２９】 請求項２０の方法により得られるｃＤＮＡ分子を含むｃＤ
    ＮＡライブラリー。
  30. 【請求項３０】 ｍＲＮＡ分子がヒトｍＲＮＡ分子である請求項２０の方法
    。
  31. 【請求項３１】 ｍＲＮＡ分子が哺乳動物ｍＲＮＡ分子である請求項２０の
    方法。
  32. 【請求項３２】 ｍＲＮＡ分子が植物種から抽出されたｍＲＮＡである請求
    項２０の方法。
  33. 【請求項３３】 請求項２０のｍＲＮＡ分子がヒトｍＲＮＡ分子である請求
    項２９のｃＤＮＡライブラリー。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009268362A (ja) * 2008-04-30 2009-11-19 Dnaform:Kk Ｒｎａの修飾とｒｎａからｄｎａを調製する方法

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002028876A2 (en) * 2000-10-05 2002-04-11 Riken Oligonucleotide linkers comprising a variable cohesive portion and method for the preparation of polynucleotide libraries by using said linkers.
WO2002046435A2 (en) * 2000-12-05 2002-06-13 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Engineered plasmids and their use for in situ production of genes
JP2009072062A (ja) * 2006-04-07 2009-04-09 Institute Of Physical & Chemical Research 核酸の５’末端を単離するための方法およびその適用
US7572585B2 (en) * 2006-07-31 2009-08-11 Agilent Technologies, Inc. Enzymatic labeling of RNA
WO2013063308A1 (en) * 2011-10-25 2013-05-02 University Of Massachusetts An enzymatic method to enrich for capped rna, kits for performing same, and compositions derived therefrom
CN103710336B (zh) * 2012-09-29 2017-02-22 深圳华大基因科技服务有限公司 从rna样本富集转录本的方法及其用途

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2733762B1 (fr) * 1995-05-02 1997-08-01 Genset Sa Methode de couplage specifique de la coiffe de l'extremite 5' d'un fragment d'arnm et preparation d'arnm et d'adnc complet

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009268362A (ja) * 2008-04-30 2009-11-19 Dnaform:Kk Ｒｎａの修飾とｒｎａからｄｎａを調製する方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP1163357A1 (en) 2001-12-19
US6730481B2 (en) 2004-05-04
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US20030008298A1 (en) 2003-01-09
AU3763200A (en) 2000-10-09

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