JP2002526758A

JP2002526758A - 或る化合物がペプチドと後生的糖化最終産物受容体（ｒａｇｅ）の相互作用を阻害することが可能かどうかを決定する方法。

Info

Publication number: JP2002526758A
Application number: JP2000574569A
Authority: JP
Inventors: シュミット、アン・マリー; スターン、デビッド
Original assignee: Columbia University of New York
Current assignee: Columbia University of New York
Priority date: 1998-10-05
Filing date: 1999-10-05
Publication date: 2002-08-20
Anticipated expiration: 2019-10-05
Also published as: AU766690B2; US20030087302A1; EP1127074A1; WO2000020458A1; US6753150B2; CA2690293C; JP4503845B2; US20040142391A1; HK1040252A1; EP1127074A4; AU1102900A; CA2346339A1; CA2690293A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、或る化合物が、ペプチドと後生的糖化最終産物受容体（RAGE）の相互作用を阻害することが可能かどうかを決定する方法であって： (a)(i)前記ペプチドのアミノ基が化学的な誘導体化によって不活化されたペプチド、(ii) RAGE又はその断片、および(iii) 前記化合物を混合することと； (b) 前記RAGE又はその断片と結合した前記ペプチドの量を測定することと； (c) 工程（b）で測定されたペプチドの結合量を、前記ペプチドが前記化合物の非存在で前記RAGE又はその断片と混合されたときに測定された量と比較することにより、前記化合物が前記ペプチドとRAGE又はその断片との相互作用を阻害することができるかどうかを決定することとを含み、前記化合物の存在下で前記結合量が減少することによって、前記化合物が前記相互作用を阻害することができることが示される方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】

この出願は、1998年10月5日出願の米国出願 SN.09/166,649の優先権を主張す
る。この親出願の内容は参照によりこの開示に援用される。

【０００２】ここに開示される発明は、合衆国保健社会福祉省からのNIH交付番号AG00602に
よる政府支援によってなされた。従って、合衆国政府は本発明に関して一定の権
利を有する。

【０００３】

【発明の背景】

本発明を通して、様々な刊行物が、著者及び日付によって本文中に引用されて
いる。これら刊行物の完全な引用は、本明細書の最後にアルファベット順で列挙
されている。これら刊行物の開示の全体は、ここに開示し且つ請求範囲に記載の
発明がなされた日に当業者に公知であった技術の状態をさらに完全に記述するた
めに、本明細書の一部として本願に援用される。

【０００４】タンパク質の糖化及び酸化による産物である後生的糖化最終産物（AGEs）は、
老化、糖尿病、及び腎不全などの硬化で蓄積する構造をした不均一な群である（
1-2）。AGEsはミエロペルオキシダーゼ経路によって始動され、オイグリセミッ
クな炎症性の環境で形成され得ることが報告されている（3）。AGEsは、細胞の
完全性及びバリヤー特性の減弱（たとえば進行性のグリコキシデーション(glyco
xidation)及びタンパク質の重要な構造の架橋によって媒介される）を起こすこ
とを含む、細胞特性の変化と関連していた。さらに、AGEsは、特異的な細胞表面
結合部位と相互作用して、炎症性細胞のシグナル伝達経路、特に細胞のオキシダ
ントストレスの増強に反応する経路の活性化に連動した方法で、細胞の特性を調
節する。細胞表面のAGEs相互作用部位は多数同定されたが、細胞の最も特徴づけ
られたAGE相互作用部位は、免疫グロブリンスーパーファミリーの一員であるAGE
受容体（RAGE）である(4-9)。

【０００５】 AGEがRAGEに結合することにより細胞の特性が乱されて、結果として血管病巣
の発達を助長する環境を生じ、並びに糖尿病などの病気で起こる合併症の一因と
なるであろう前炎症性の宿主応答を悪化させる（10-23）。

【０００６】

【発明の概要】

本発明は、或る化合物が、ペプチドと後生的糖化最終産物受容体（RAGE）の相
互作用を阻害することが可能かどうかを決定する方法であって、 (a)(i) 前記ペプチドのアミノ基が化学的な誘導体化によって不活化されたペプチド、 (ii) RAGE又はその断片、および (iii) 前記化合物を混合することと； (b) 前記RAGE又はその断片と結合した前記ペプチドの量を測定することと； (c) 工程（b）で測定されたペプチドの結合量を、前記ペプチドが前記化合物
の非存在で前記RAGE又はその断片と混合されたときに測定された量と比較するこ
とにより、前記化合物が前記ペプチドとRAGE又はその断片との相互作用を阻害す
ることができるかどうかを決定することとを含み、前記化合物の存在下で前記結合量が減少することによって、前記化合物が前記
相互作用を阻害することができることが示される方法を提供する。

【０００７】また、本発明は、患者において、後生的糖化最終産物（AGE）と後生的糖化最
終産物受容体（RAGE）の相互作用を阻害する方法であって、患者においてAGEとR
AGEの相互作用を阻害するのに有効な、上記スクリーニング法によって同定され
た化合物のある量を患者に投与することを含む方法も提供する。本発明は、前記
スクリーニング法によって同定され、且つ糖尿病患者の治療に有用な化合物も提
供する。

【０００８】

【発明の詳細な記述】以下の略語がここで使用される。：CML―カルボキシメチル-リジン；AGE―後
生的糖化最終産物；RAGE―後生的糖化最終産物受容体；sRAGE―可溶型後生的糖
化最終産物受容体。

【０００９】本発明は、化合物がペプチドと後生的糖化最終産物受容体（RAGE）の相互作用
を阻害することが可能かどうかを決定する方法であって、 (a)(i) 前記ペプチドのアミノ基が化学的な誘導体化によって不活化されたペ
プチド、 (ii) RAGE又はその断片、および (iii) 前記化合物を混合することと； (b) 前記RAGE又はその断片と結合した前記ペプチドの量を測定することと； (c) 工程（b）で測定されたペプチドの結合量を、前記ペプチドが前記化合物
の非存在で前記RAGE又はその断片と混合されたときに測定された量と比較するこ
とにより、前記化合物が前記ペプチドとRAGE又はその断片との相互作用を阻害す
ることができるかどうかを決定することとを含み、前記化合物の存在下で前記結合量が減少することによって、前記化合物が前記
相互作用を阻害することができることが示される方法を提供する。

【００１０】本発明は、化合物がペプチドと後生的糖化最終産物受容体（RAGE）の相互作用
を阻害することが可能な化合物をスクリーニングする方法であって、 (a)(i) 前記ペプチドのアミノ基が化学的な誘導体化によって不活化されたペ
プチド、 (ii) RAGE又はその断片、および (iii) 前記化合物を混合することと； (b) 前記RAGE又はその断片と結合した前記ペプチドの量を測定することと； (c) 工程（b）で測定されたペプチドの結合量を、前記ペプチドが前記化合物
の非存在で前記RAGE又はその断片と混合されたときに測定された量と比較するこ
とにより、前記ペプチドとRAGE又はその断片との相互作用を阻害することができ
る化合物を同定することとを含む方法を提供する。

【００１１】一つの態様において、前記ペプチドは後生的糖化最終産物（AGE）、又はその
断片である。他の態様において、前記ペプチドはカルボキシメチル修飾ペプチド
である。たとえば、ペプチドはカルボキシメチルリジン修飾AGEであってもよい
。他の態様において、前記ペプチドは合成ペプチドである。

【００１２】ここで使用する「RAGE又はその断片」は、Neeper et al.(1992)に示されたRAG
Eの全長アミノ酸配列を有するペプチドを包含する。前記RAGEの「断片」は、長
さが少なくとも5アミノ酸、好ましくは長さが7アミノ酸以上であるが、Neeper e
t al.(1992)に示された全長よりも短い。一つの態様において、前記RAGEの断片
は、Neeper et al.(1992)に記述された120アミノ酸領域のV-領域を含む。たとえ
ば、前記RAGEの断片は、RAGEのV-領域のアミノ酸配列を有してもよい。

【００１３】前記スクリーニング法の一つの態様として、ペプチドの誘導体化による不活性
化は化学的修飾による。工程(a)(i)の他のペプチド誘導体はアリル誘導体を含み
、アリル誘導体の一例にはベンゾイル誘導体を含む。工程(a)(i)の他のペプチド
誘導体はアルキル誘導体を含み、アルキル誘導体の例にはアセチル誘導体、プロ
ピル誘導体、イソプロピル誘導体、ブチル誘導体、イソブチル誘導体又はカルボ
キシメチル誘導体を含む。

【００１４】一つの態様として、前記スクリーニング方法の工程(a)(ii)におけるRAGE又は
その断片は、合成されたものである。他の態様において、前記化合物は実効陰電
荷又は実効陽電荷を持つ。さらなる態様において、前記化合物は天然に存在する
後生的糖化最終産物の可溶型受容体（sRAGE）の断片を含む。

【００１５】前記スクリーニング法によって同定された化合物は、様々なタイプの化合物を
含む。たとえば、一つの態様において、前記化合物は擬似ペプチドである。他の
態様において、前記化合物は有機分子である。さらなる態様において、前記化合
物は、ポリペプチド、核酸、又は無機化学物質である。さらに、前記化合物は、
分子量が10000ダルトンよりも小さい。他の態様において、前記化合物は、抗体
又はその断片である。前記抗体はポリクローナル又はモノクローナル抗体であっ
てよい。さらに、前記抗体は、ヒト化、キメラ化、霊長類化されてもよい。他の
態様において、化合物は変異AGEもしくはその断片、又は変異RAGEもしくはその
断片である。

【００１６】前記スクリーニング法はインビトロで行われてもよく、その場合、一以上の成
分を固相表面に付着するかもしくは固定するか、又は前記工程aの化合物は細胞
内で混合されるか、又は前記工程（a）の化合物は生体（特にトランスジェニッ
クマウス）内で混合される。たとえば、前記ペプチドは固相表面に固定されても
よい。他の態様において、前記RAGE又はその断片は固相表面に固定される。

【００１７】一つの態様においては、前記ペプチドが検出可能にラベルされる。他の態様に
おいては、前記RAGE又はその断片が検出可能にラベルされる。前記検出可能なラ
ベルは、蛍光、ビオチン、又は放射能を含む。

【００１８】前記スクリーニング法の他の態様において、工程（a）の混合は細胞内で起こ
る。前記スクリーニング法の他の態様において、工程（a）の混合は動物内で起
こる。たとえば、前記動物はRAGEを過剰発現するトランスジェニックマウス、又
はRAGEを発現しないトランスジェニックマウスである。

【００１９】本発明は、患者において、後生的糖化最終産物（AGE）と後生的糖化最終産物
受容体（RAGE）の相互作用を阻害する方法であって、患者においてAGEとRAGEの
相互作用の阻害に有効な該患者のAGEとRAGEの相互作用を効果的に阻害する、上
記スクリーニング法によって同定された化合物のある量を患者に投与することを
含む方法も提供する。

【００２０】一例として、前記患者はヒト、霊長類、マウス、ラット、又はイヌである。他
の態様において、前記投与は、病変局部内、腹腔内、筋肉内、もしくは静脈内へ
の注射；輸液；リポソームを介したデリバリー；又は局所的、鼻腔内、経口、眼
内、もしくは耳内デリバリーである。さらなる例として前記化合物が毎時、毎日
、毎週、毎月、又は毎年投与される。他の例として、前記化合物の有効量は約0.
000001mg/kg体重〜約100mg/kg体重である。

【００２１】一つの態様において、前記患者は腎臓疾患に罹患している。他の態様において
、前記患者は糖尿病に罹患している。さらなる態様において、前記患者は全身性
エリテマトーデス、または炎症性腎炎に罹患している。他の態様において、前記
患者は、肥満患者（たとえば、アメリカ医学界の推薦する身長/体重の表を越え
ている）である。他の態様において、前記患者は、老人患者である（たとえば50
歳、又は好ましくは60歳を越えた人）である。他の態様において、前記患者は、
アミロイドーシスに罹患している。さらなる態様において、前記患者は炎症に罹
患している。

【００２２】他の態様において、患者において、後生的糖化最終産物（AGE）と後生的糖化
最終産物受容体（RAGE）の相互作用を阻害する方法には、患者に化合物を投与す
る際に、薬学的に許容可能なキャリアを患者に投与することをさらに含む。

【００２３】一つの態様において、前記キャリアは賦形剤を含む。他の態様において、前記
キャリアは、ウイルス、リポソーム、マイクロカプセル、ポリマーで包まれた細
胞、又はレトロウイルスベクターを含む。他の態様において、前記キャリアはエ
アロゾル用、静脈内用、経口用、又は局所用キャリアである。たとえば、前記化
合物はタイムリリース移植で投与される。

【００２４】本発明は、前記スクリーニングによって同定され、且つ糖尿病患者の治療に有
用な化合物も提供する。本発明は、前記スクリーニングによって同定された、全
身性エリテマトーデス、又は炎症性腎炎の患者の治療に有用な化合物も提供する
。本発明は、前記スクリーニングによって同定された、アミロイドーシスの患者
の治療に有用な化合物も提供する。本発明は、前記スクリーニングによって同定
された、炎症の患者の治療に有用な化合物も提供する。さらに、本発明は、前記
スクリーニングによって同定された、以前に知られていない化合物を提供する。

【００２５】 RAGEの核酸配列及びアミノ酸配列は、Neeper, M., Schmidt, A. M., Brett, J
., Yan, S.D., Wang, F., Pan, Y.C., Elliston, K., Stern, D.,及びShaw, A.
Cloning and expression of RAGE: a cell surface receptor for sdvenced gly
cosylation end products of proteins. J. Biol. Chem. 267:14998-15004, 199
2、として出版されており、前記内容は本明細書の一部として援用される。ヒトR
AGEcDNAは1406塩基対であり、404アミノ酸の成熟タンパク質をコードする。Neep
er et al .(1992)を参照。ここで使用される「RAGEのV−領域」は、Neeper et a
l .(1992)によって図4に示された1位から120位のアミノ酸を含む、図5に示され
たV-領域にある免疫グロブリン様の可変領域をいう。RAGEタンパク質のAGEタン
パク質結合部位を定義するために最小限必要とされるアミノ酸配列は、120アミ
ノ酸よりもかなり少ないであろう。

【００２６】可溶型RAGE（sRAGE）は、細胞膜から遊離したRAGEタンパク質である。たとえ
ば、sRAGEは細胞膜に埋め込まれていない。一つの態様において、sRAGEは、膜結
合型RAGEのアミノ酸配列のうち、細胞外にある3分の2を含む。

【００２７】ここで使用される「誘導体化によって不活化される」とは、ペプチドのアミノ
基に化学修飾がある場合に、このような化学修飾がない場合よりも反応性が小さ
くなるような、ペプチドの化学的な修飾を含む。このような化学的修飾の例には
、ペプチドのアリル誘導体、又はペプチドのアルキル誘導体を作ることが含まれ
る。他の誘導体には、アセチル誘導体、プロピル誘導体、イソプロピル誘導体、
ブチル誘導体、イソブチル誘導体、カルボキシメチル誘導体、ベンゾイル誘導体
が含まれる。他の誘導体は、当業者の知るところであろう。

【００２８】本発明の態様の一つは、ペプチドと、RAGEのAGE結合部位との相互作用を阻害
することが可能な化合物（たとえば、V-領域又はAGEと結合するために必要とさ
れる最小必要なアミノ酸配列）を同定するためのスクリーニングアッセイであっ
て、(a)前記ペプチドと、RAGEのAGE結合部位の配列を有する第二のペプチドと、
前記化合物とを混合することと、； (b) 前記第二のペプチドと結合した前記ペ
プチドの量を測定することと；(c) 工程（b）で測定されたペプチドの結合量を
、前記ペプチドが前記化合物の非存在で測定された量と比較することにより、前
記ペプチドと、RAGEのAGE結合部位との相互作用を阻害することができる前記化
合物同定するスクリーニングアッセイである。

【００２９】前記スクリーニングアッセイは、前記化合物の一方を固相表面に結合し且つ固
定して実施してもよい。一つの態様においては、前記ペプチドが固相表面に固定
される。他の態様においては、前記RAGEのAGE結合部位の配列を有する第二のペ
プチドが、固相表面に結合されるか、又は固定される。本態様に有用な固相表面
は、当業者の知るところであろう。たとえば、固相表面の一つの態様は、ビーズ
、カラム、プラスチックディッシュ、顕微鏡スライド、ナイロン膜などである。
一つの態様において、前記固相表面を構成する材料は合成によるものである。

【００３０】前記スクリーニングアッセイの工程（a）における成分の一方を、検出可能に
ラベルしてもよい。前記成分（前記化合物、前記ペプチド、又はRAGEもしくはそ
の断片のいずれか）は、蛍光ラベル、ビオチン、ディグオキシジェン、放射活性
原子、常磁性イオン、及び化学発光ラベルを含む検出可能な成分でラベルしても
よい。工程（a）の前記成分は、化学的、酵素的などの共有結合手段または他の
適切な手段によって、酵素もしくは放射性同位体などでラベルしてもよい。

【００３１】一つの態様において、前記患者はほ乳類である。他の態様において、前記患者
は脊椎動物である。好ましい態様において、前記ほ乳類はヒトである。一例とし
て、前記患者は糖尿病患者である。本発明の他の例では、前記患者は糖尿病、腎
臓疾患、アミロイドーシス、老化、又は炎症に罹患している。前記患者は、アメ
リカ医学界の身長と体重基準によって定義される肥満患者でもよい。前記患者は
、老人でもよい。前記患者は、ヒト、霊長類、ウマの患者、オピン患者、鳥類の
患者、ウシ患者、ブタ、イヌ、ネコ、又はネズミの患者でもよい。

【００３２】一つの態様において、前記患者は、AGE関連疾患に罹患している。他の態様に
おいて、このようなAGE関連疾患は脳、網膜、腎臓、血管系、心臓、又は肺に表
れる。他の態様において、前記患者は、アルツハイマー病、又は患者内にAGEsが
蓄積することによって表れる病気に罹患している。他の態様において、前記患者
は、軟組織障害、視力の減退、心臓血管疾患、腎臓疾患などのような糖尿病の兆
候に罹患している。このような兆候は、当業者の知知るところであろう。

【００３３】前記化合物はポリペプチドである。前記ポリペプチドは、ペプチド、擬似ペプ
チド、合成ペプチド、天然ポリペプチドの誘導体、修飾ポリペプチド、ラベルさ
れたポリペプチド、又は非天然ペプチドを含むポリペプチドであることができる
。前記擬似ペプチドは、加速性アテロームに罹り易い患者の加速性アテロームを
妨害することができる化合物を決定するために、様々な化合物の大規模なライブ
ラリーをスクリーニングして同定しすればよい。前記ポリペプチドは、天然に見
出されないキラリティー、特にD−アミノ酸又はL−アミノ酸を有する、非天然ポ
リペプチドであってもよい。

【００３４】一つの態様において、前記化合物はアンタゴニストであり、この場合、前記ア
ンタゴニストはAGEsよりも高い親和性でRAGEと結合して、AGEsの結合効果を競合
的になくしてしまうことができる。

【００３５】他の態様において、前記化合物は、RAGEの発現を阻害することができるリボザ
イムである。他の態様において、前記化合物は抗−RAGE抗体、抗−AGE抗体、抗
−RAGEのV-領域抗体である。前記抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル
抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体でもよい。前記化合物は、このよ
うな抗体の断片であってもよい。

【００３６】本発明の他の態様において、前記方法は、前記ポリペプチドを投与する際、患
者に薬学的に許容可能なキャリアを投与することをさらに含んでもよい。前記投
与は、病変局部内、腹腔内、筋肉内、もしくは静脈内への注射；輸液；リポソー
ムを介したデリバリー；又は局所的、鼻腔内、経口、眼内、もしくは耳内デリバ
リーを含んでいてよい。さらなる態様において、前記投与は、気管支内投与、肛
門又はクモ膜下内投与を含む。

【００３７】前記化合物は、毎時、毎日、毎週、毎月、又は毎年（たとえばタイムリリース
形式で）、又は一回のデリバリーとしてデリバリーされてもよい。前記デリバリ
ーは持続的な、たとえば静脈内デリバリーでもよい。

【００３８】前記化合物の有効量は、約0.000001mg/kg体重〜約100mg/kg体重を含んでよい
。一つの態様において、前記有効量には、約0.001mg/kg体重〜約50mg/kg体重を
含んでよい。他の態様において、前記有効量には、約0.01mg/kg体重〜約10mg/kg
体重を含んでよい。実際の有効量は、前記化合物のサイズ、前記化合物の生物分
解活性、前記化合物の生物活性、及び前記化合物の生体利用性に基づくであろう
。前記化合物が急速に分解しないのであれば、生体利用性で且つ高い活性を持ち
、効果を持つために少量しか必要とされないであろう。前記有効量は当業者の知
るところであろう；また、それは前記化合物の形態、前記化合物のサイズ、及び
前記化合物の生物活性にも依存するであろう。当業者は、化合物の活性テストを
ルーチンで実施して、バイオアッセイにおいて生物活性を測定ことにより、前記
有効量を決定するであろう。

【００３９】本発明の他の態様において、前記方法はさらに、前記ポリペプチドを投与する
際に、患者に薬学的に許容可能なキャリアをさらに投与することを含んでもよい
。前記投与は、病変局部内、腹腔内、筋肉内、もしくは静脈内への注射；輸液；
リポソームを介したデリバリー；又は局所的、鼻腔内、経口、眼内、もしくは耳
内デリバリーを含んでいてよい。

【００４０】前記化合物は、毎時、毎日、毎週、毎月、又は毎年（たとえばタイムリリース
形式で）、又は一回のデリバリーとしてデリバリーされてもよい。前記デリバリ
ーは期間が連続したデリバリー、たとえば静脈内デリバリーでもよい。

【００４１】前記化合物は、sRAGEの類似体ポリペプチドのようなsRAGEポリペプチドでもよ
い。このような類似体は、sRAGEの断片を含む。公開されたAlton et al.による
出願(WO83/04053)の方法に従って、一致性又は一以上の残基位置（たとえば置換
、末端及び中間付加、及び、欠失）の点で、ここで特定されるものとは異なる一
次構造を有する微生物発現用のポリペプチドをコードする遺伝子を、容易に設計
および製造することができる。あるいは、cDNA及びゲノム遺伝子の修飾は、周知
の部位特異的突然変異技術により実施でき、sRAGEポリペプチドの類似体及び誘
導体を作製するために使用できる。このような産物は、少なくともsRAGEの生物
学的特性を共有しているが、他の特性は異なるであろう。例として、本発明の産
物は、たとえば欠失によって短縮された産物；又は加水分解に対して安定な産物
（したがって、天然に存在するものよりも長期に亘る効果または持続的な効果を
有する）；或いは、一以上の潜在的なO-グリコシレーション、及び/又はN-グリ
コシレーション部位の欠失もしくは付加により改変された産物、又は一以上のシ
ステイン残基が欠失され、又はたとえばアラニンもしくはセリン残基で置換され
て、さらに容易に微生物系から活性型として単離され得る産物；又は一以上のチ
ロシン残基がフェニルアラニンで置換されて、標的タンパク質もしくは標的細胞
の受容体にさらに容易にもしくはより少なく結合する産物を含む。連続したアミ
ノ酸配列、又はsRAGEの二次構造の一部のみを複製したポリペプチド断片も含ま
れ、このような断片は、sRAGEの特性を一つ有し、他の特性を有さない。本発明
のポリペプチドの何れか一以上が治療上の有用性、又はその他の状況（たとえば
sRAGEの拮抗作用の解析）において有用性を持つためには、活性を必要としない
ことは注目に値する。競合的アンタゴニストは、たとえばsRAGEの過剰生産を引
き起こすには、非常に有用であろう。

【００４２】天然に存在するタンパク質、糖蛋白質、及び核タンパク質のアミノ酸配列を実
質上複製した合成ペプチドの免疫学的特性の報告は、本発明のペプチド類似体に
も適応可能である。即ち、比較的低分子量のポリペプチドは、生理学的に重要な
タンパク質（たとえばウイルス抗原、ポリペプチドホルモンなど）による免疫反
応と同様の持続時間及び範囲をもった免疫反応に関与することが示された。この
ようなポリペプチドの免疫応答には、合成ペプチド類の生物学的及び免疫学的特
性に関連して、免疫学的に活性な動物内で特異的抗体を形成させる刺激が含まれ
[Lerner et al., Cell, 23, 309-310(1981); Ross et al., Nature, 294, 654-6
58(1981); Walter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ,78, 4882-4886(1981)
; Wong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ,79,5322-5326(1982); Waron et
al., Cell, 28, 395-404(1982); Dressman e al., Nature, 295, 185-160(1982)
; and Lerner, Scientific American, 248, 66-74(1983).Kaiser et al. Scienc
e, 223, 249-255(1984)も参照]、前記合成ペプチド類はペプチドホルモンの二次
構造をほぼ共有するが、一次構造コンホメーションは共有しなくてもよい。

【００４３】本発明の化合物は、少なくとも一部が非天然であり得る擬似ペプチド化合物で
もよい。前記擬似ペプチド化合物は、sRAGEのアミノ酸配列の一部に似せた小分
子でもよい。この擬似性によって、前記化合物は、増大した安定性、効能、有効
性、及び生物有用性を有していてもよい。さらに、前記化合物は毒性が減少され
ていてもよい。前記擬似ペプチド化合物は腸粘膜透過性が増強されていてもよい
。前記化合物は合成によって調製されてもよい。本発明の化合物は、L−、D−又
は非天然のアミノ酸、アルファ、アルファ二置換アミノ酸、N-アルキル化アミノ
酸、乳酸（アラニンの等電子類似体）を含んでもよい。前記化合物は、さらにト
リフルオロチロシン、p-Cl−フェニルアラニン、p−Br−フェニルアラニン、ポ
リ−L−プロパルギルグリシン、ポリ−D,L-アリルグリシン、又はポリ−L−アリ
ルグリシンを含んでもよい。

【００４４】本発明の一つの態様は擬似ペプチド化合物であり、ここで該化合物は適切な擬
似体で置換された結合、ペプチド骨格、又はアミノ酸を有する。適切なアミノ酸
擬似体でもよい非天然アミノ酸の例には、β−アラニン、L−αー−アミノ酪酸
、L−γ−アミノ酪酸、L−α−アミノイソ酪酸、L−ε−アミノカプロン酸、7−
アミノヘプタン酸、L−アスパラギン酸、L−グルタミン酸、システイン（アセト
アミンドメチル）、N-ε−Boc−N-α−CBZ−L−リジン、L−ノルバリン、N-α−
Boc−N-δCBZ−L−オルニチン、N-α−Boc−N-CBZ−L−オルニチン、Boc−p−ニ
トロ−L−フェニルアラニン、Boc−ヒドロキシプロリン、Boc−L−チオプロリン
が含まれる（Blondelle, et al.1994; Pinilla, et al. 1995）。

【００４５】一つの態様において、前記化合物はペプチドであって、フリーのアミノ基が誘
導体化によって不活化された化合物である。たとえば、前記ペプチドは、アリル
誘導体、アルキル誘導体、又は酸無水物誘導体であってもよい。前記ペプチドは
アセチル化されてもよい。前記ペプチドはその実効電荷が中和されるように誘導
体化される。

【００４６】他の態様において、前記化合物は、可溶型RAGE（sRAGE）又はその断片でよい
。可溶型RAGEは、細胞表面に位置せず、且つ細胞膜に結合していない。

【００４７】前記患者は、ほ乳類又は非ほ乳類でよい。前記患者はヒトでもよい。前記患者
は、マウス、ラット、ウシ、サル、ウマ、ブタ、又はイヌであってよい。前記患
者は、糖尿病患者でもよい。

【００４８】前記化合物の投与は、病変局部内、腹腔内、筋肉内、もしくは静脈内への注射
；輸液；リポソームを介したデリバリー；又は局所的、鼻腔内、経口、肛門、眼
内、もしくは耳内デリバリーを含んでいてよい。前記投与は、一定の期間又は周
期で、及び一定の間隔で、絶えず行ってもよい。前記キャリアは賦形剤、エアロ
ソル用、局所用キャリア、水溶液、非水溶液、又は固体キャリアでもよい。

【００４９】本発明は、患者において、後生的糖化最終産物（AGE）と後生的糖化最終産物
受容体（RAGE）の相互作用を阻害する方法であって、該患者のAGEとRAGEの相互
作用を阻害するのに有効なキニーネ、又はその誘導体のある量を患者に投与する
ことを含む方法を提供する。一つの態様において、前記キニーネ及び前記誘導体
は、全体の電荷がキニーネと同じである。

【００５０】本発明は、患者において、後生的糖化最終産物（AGE）と後生的糖化最終産物
受容体（RAGE）の相互作用を阻害する方法であって、該患者のAGEとRAGEの相互
作用を阻害するのに有効なキニジン、又はその誘導体のある量を患者に投与する
ことを含む方法も提供する。一つの態様において、前記誘導体は、キニジンとは
異なる化学構造を有し、前記誘導体は全体の電荷がキニジンと同じである。

【００５１】本発明の前記方法のいずれかの実施、又は前記医薬組成物のいずれかの調製に
おいて、「治療上有効な量」は、患者においてAGE/RAGEの相互作用を妨害するこ
とができる量である。従って、前記有効な量は、治療される患者、並びに治療さ
れる症状により変化するであろう。本発明の目的のために、前記投与方法は、皮
膚投与、皮下、静脈内、非経口、経口、局所的、又はエアロゾルによるものが含
むが、これらに限定されない。

【００５２】ここで使用される、「適切な薬学的に許容可能なキャリア」の用語は、標準的
な薬学的に許容可能なキャリア、たとえばリン酸緩衝溶液、水、油/水のエマル
ジョン又はトリグリセリドエマルジョンのようなエマルジョン、様々なタイプの
湿潤剤、錠剤、コートされた錠剤、及びカプセルのいずれかを含む。静脈内、及
び腹腔内投与に有用な許容可能であるトリグリセリドの一例は、イントラリピッ
ド（Intralipid）として商業的に知られるトリグリセリドエマルジョンである。

【００５３】一般に、このようなキャリアは、賦形剤、たとえば澱粉、ミルク、砂糖、ある
タイプの粘土、グリコール、又はその他の既知の賦形剤を含む。このようなキャ
リアは、フレーバー、及び染色剤、又は他の成分を含んでいてもよい。

【００５４】本発明は医薬組成物であって、適切な賦形剤、防腐剤、安定化剤、乳化剤、ア
ジュバント及び/又はキャリアと共に、治療上有効な量のポリペプチド組成物及
び化合物を含む医薬組成物を提供する。このような組成物は、液体、又は凍結乾
燥、又は別の方法で乾燥された調合物であってもよく、様々な緩衝液（たとえば
Tris-HCl、酢酸、リン酸）、pH、及びイオン強度の希釈液、表面への吸着を妨げ
るためのアルブミン又はゲラチンのような添加物、界面活性剤（Tween20、Tween
80、Pluronic F68、胆汁酸塩）、可溶化剤（たとえばグリセロール、ポリエチレ
ングリセロール）、抗酸化剤（たとえばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウ
ム）、防腐剤（たとえば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、増
量物質又は浸透圧調節剤（たとえばラクトース、マンニトール）、前記化合物へ
のポリエチレングリコールのようなポリマーの共有結合付加、金属イオンとの錯
体形成、或いはポリ乳酸、ポリグリコール酸（polglycolic acid）、及びヒドロ
ゲルなどのポリマー化合物粒子製剤内へ又はリポソーム、マイクロエマルジョン
、ミセル、単層状もしくは層状担体、赤血球ゴースト、又はスフェロプラスト製
剤上への前記化合物の取り込みを含んでもよい。このような組成物は、物理的状
態、溶解性、安定性、前記化合物もしくは組成物のインビボ放出の効率、及びイ
ンビボクリアランスの効率に影響を与えるであろう。組成物の選択は、前記化合
物の物理的及び化学的特性に依存するであろう。

【００５５】放出が制御され又は持続される組成物は、親油性デポ剤（たとえば、脂肪酸、
ロウ、油）中の調合物を含む。ポリマー（たとえばポロクサマー(poloxamer)又
はポロクサミン(poloxamine)）でコートされた微粒子状組成物、及び組織特異的
受容体、リガンド、もしくは抗原に対する抗体に結合され、又は組織特異的受容
体のリガンドに結合された前記化合物も本発明に含まれる。本発明の組成物の他
の態様には、粒子形態の保護コーティング、プロテアーゼ阻害剤、又は非経口、
肺動脈、鼻腔、経口を含む様々な投与経路のための透過性増強剤が組込まれる。

【００５６】投与されたとき、化合物はしばしば急速に循環系から除去されることから、薬
理活性は比較的短命であることが明らかであろう。従って、治療効果を維持する
ためには、比較的大量の生物活性な化合物を頻繁に接種することが必要とされる
であろう。ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレン
グリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビ
ニルアルコール、ポリビニルピロリドン又はポリプロリンのような水溶性ポリマ
ーの共有結合付加によって修飾された化合物は、静脈内注射後の血液内で、未修
飾の化合物の場合よりも実質的に長い半減期を示すことが知られている（Abucho
waki et al., 1981; Newmark et al., 1982; and Katre et al., 1987）。この
ような修飾は、水溶液中の化合物の溶解性、凝集の除去、前記化合物の物理的及
び化学的安定性を増加させ、前記化合物の免疫原性及び反応性も劇的に減少する
であろう。その結果、所望されるインビボにおける生物学的活性は、このような
ポリマー／化合物付加物の投与により、未修飾化合物よりも少ない回数又は低い
濃度で実施されるであろう。

【００５７】ポリエチレングリコール（PEG）は、ほ乳類では非常に毒性が低いため、化合
物へのPEGの付加は特に有用である（Carpenter et al/.1971）。たとえば、アデ
ノシンデアミナーゼのPEG付加物は、合衆国において、重度の複合免疫欠損症候
群の治療に使用することが認可されている。PEGの結合によって得られる第二の
有用性は、異種化合物の免疫原性及び抗原性を効果的に減少することである。た
とえば、ヒトタンパク質のPEG付加物は、重度の免疫反応を引き起こす危険がな
く、他のほ乳類種疾患の治療に有用であろう。本発明のポリペプチド又は組成物
は、前記ポリペプチドに対する、もしくは前記ポリペプチドを産生するであろう
細胞に対する宿主免疫反応を減少するか又は妨げるように、マイクロカプセルデ
バイス内でデリバリーしてもよい。本発明のポリペプチド又は組成物は、リポソ
ームなどの膜内にマイクロカプセル化してデリバリーされてもよい。

【００５８】 PEGのようなポリマーは、タンパク質中の一以上の反応性アミノ酸残基、たと
えばアミノ末端アミノ酸のα−アミノ基、リジン側鎖のεアミノ基、システイン
側鎖のスルフヒドリル基、アスパルチル及びグルタミル側鎖のカルボキシル基、
カルボキシ末端アミノ酸のαカルボキシル基、チロシン側鎖に容易に付加するこ
とができ、又は一定のアスパラギン、セリン、もしくはスレオニン残基に付加さ
れた糖鎖の活性型誘導体に容易に付加することができる。

【００５９】タンパク質との直接反応に適した活性型PEGの多くは、すでに記載されている
。タンパク質のアミノ基との反応に有用なPEG試薬は、カルボン酸又は炭酸誘導
体の活性型エステル、特に、脱離基がN-ヒドロキシスクシニミド、p−ニトロフ
ェノール、イミダゾール又は1−ヒドロキシ−2−ニトロベンゼン−4−スルホネ
ートのものを含む。マレイミド又はハロアセチル基を含むPEG誘導体は、スルフ
ヒドリル基の修飾に有用な試薬である。同様に、アミノヒドラジン、又はヒドラ
ジド基を含むPEG試薬は、タンパク質の含水炭素基を過ヨウ素酸塩で酸化するこ
とによって発生するアルデヒドとの反応に有用である。

【００６０】＜キャリアと医薬＞好ましい態様において、前記医薬キャリアは液体であってよく、且つ前記医薬
組成物は溶液の形態であろう。他の同等に好ましい態様において、前記薬学的に
許容可能なキャリアは、固体であり、且つ前記組成物は粉末又は錠剤である。さ
らなる態様において、前記医薬キャリアはゲルであり、且つ前記組成物は座薬又
はクリームである。さらなる態様において、前記活性成分は、薬学的に許容可能
な経皮パッチの一部として処方されてもよい。

【００６１】固体キャリアは、香味剤、潤滑剤、安定化剤、縣濁剤、充填剤、潤滑剤、圧縮
補助剤、成形剤又は錠剤崩壊剤（マイクロカプセル化剤であってもよい）として
機能し得る一以上の物質を含むことができる。粉末の場合、前記キャリアは、微
細化された活性成分と混合された微細固体である。錠剤では、前記活性成分は、
必要な圧縮性を有するキャリアと混合されて、所望の形、及びサイズに圧縮され
る。前記粉末及び錠剤は、好ましくは、99％以下の活性成分を含む。適切な固形
キャリアは、たとえばリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、滑石、シ
ョ糖、ラクトース、デキストリン、澱粉、ゲラチン、セルロース、ポリビニルピ
ロリジン、低融点ロウ、及びイオン交換樹脂を含む。

【００６２】液体キャリアは、溶液、縣濁液、エマルジョン、シロップ、エリキシル、及び
加圧された組成物の調製に使用される。前記活性成分は、水、有機溶媒、両者の
混合物、又は薬学的に許容可能な油もしくは脂肪などの薬学的に許容可能な液体
キャリアに溶解するか、又は縣濁することができる。前記液体キャリアは、可溶
化剤、乳化剤、緩衝剤、防腐剤、甘味料、香味剤、縣濁剤、増粘剤、色素、粘度
調節剤、安定化剤又は浸透圧調節剤のような、他の適切な医薬添加物を含むこと
ができる。経口及び非経口投与のための液体キャリアに適した例には、水（特に
上記の添加物を含み、たとえばセルロース誘導体、好ましくはカルボキシメチル
ナトリウムセルロース溶液）、アルコール（一価アルコール及び多価アルコール
、たとえばグリセロール）及びそれらの誘導体、並びに油（たとえば精留された
ヤシ油及びラッカセイ油）が含まれる。非経口投与の場合、前記キャリアは、オ
レイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピルのような油状エステルでもよい。滅
菌された液体キャリアは、非経口投与のための滅菌液状組成物に有用である。圧
縮された組成物用の液体キャリアは、ハロゲン化炭化水素又はその他の薬学的に
許容可能な推進剤でもよい。

【００６３】滅菌された溶液又は縣濁液である液体医薬組成物は、たとえば、筋肉内、髄腔
内、硬膜外、腹腔内、又は皮下注射により利用することができる。滅菌溶液は、
静脈内に投与することもできる。前記活性成分は、滅菌水、生理食塩水、又は他
の適切な滅菌注射可能な媒質を使用して投与時に溶解又は縣濁させるように、滅
菌された固形組成物として調整されてもよい。キャリアは、必須の又は不活性な
成形剤、縣濁試薬、潤滑剤、香味剤、甘味料、防腐剤、色素、及びコーティング
剤を含むものである。

【００６４】本発明の活性成分は、（特に前記スクリーニング法によって同定された化合物
またはそれの組成物）は、他の溶質又は縣濁剤、たとえば等張液を作るのは十分
な食塩水又はグルコース、胆汁塩、アラビアゴム、ゲラチン、ソルビタンモノオ
レートポリソルベート80（ソルビトールのオレアートエステル及びエチレンオキ
シドで共重合化されたその酸無水物）などを含有する滅菌溶液、又は縣濁液の形
態で経口的に投与できる。

【００６５】活性成分は、液体又は固体のどちらの形態の組成物でも、経口で投与すること
ができる。経口投与に適した組成物には、固形状組成物、たとえば、丸薬、カプ
セル、顆粒、錠剤、及び粉末を、並びに液状組成物、たとえば、溶液、シロップ
、エリキシル剤及び縣濁液が含まれる。非経口投与に有用な形態には、滅菌溶液
、エマルジョン、及び縣濁液を含む。

【００６６】本発明の他の態様において、前記患者は、糖尿病を保有していてもよい。前記
患者は、糖尿病に関連する合併症を示してもよい。このような合併症のいくつか
の例は、内皮及びマクロファージのAGE受容体の活性化、リポタンパク質、マト
リクス、及び基底膜タンパク質の変化；血管平滑筋の収縮性及びホルモン応答性
の変化、；内皮細胞透過性の変化、；ソルビトールの蓄積、神経系のミオイノシ
トール欠乏、又はNa-K ATPase活性の変化を含む。このような合併症は、Porte a
nd Schwartzによる最近の刊行物で論じられている（糖尿病合併症：なぜグルコ
ースは潜在的に毒性があるのか。Science, Vol. 272, pages699-700）。

【００６７】この発明を、以下の実験の詳細の項においてさらに説明する。この項は、この
発明の理解を補助するために提示されるものであり、いかなる点においても、特
許請求の範囲に記載される発明を限定することを意図するものではなく、そのよ
うに解釈されるべきものでもない。

【００６８】

【実験の詳細】

例1：タンパク質のカルボキシメチル−リジン付加物（CML）は、後生的糖化最
終産物受容体（RAGE）と結合して細胞シグナル経路を活性化し、且つ遺伝子発現
を調整する後生的糖化最終産物（AGE）である。

【００６９】後生的糖化最終産物（AGE）、即ち、グリコキシデーションの過程で生じる修
飾化合物群は、構造が不均一な群であって、その血漿及び組織への蓄積が、老化
、糖尿病、腎不全、及び炎症などの疾患で起こる合併症に関連している。AGEsは
、多くの方法で病原性の効果を付与する。；そのうちの一つでは、RAGEなどの細
胞表面受容体に結合して、細胞の摂動及び機能異常を生じさせる多様な機構を引
き起こす。既知のAGE構造のうちでRAGEと相互作用するものを決定するために、
我々は、一連の合成AGEsを作製して、それらがRAGEと相互作用する能力をテスト
した。CMLで修飾されたBSA（遊離BSAではない）は、濃度依存的に、Kd＝76±3.7
nMでRAGEと結合したが、ペントシジン又はメチルグリオキサル修飾タンパク質で
は結合しなかった。競合実験により、CML修飾体との相互作用部位を含むIg−タ
イプ領域として、RAGEのV-領域が同定された。細胞培養研究において、CML修飾
型のタンパク質が、ヒト臍静脈内皮細胞(HUVECs)の細胞表面VCAM-1の機能的活性
を増加し、且つヒト末梢血由来単核球ファゴサイト（MPs）の遊走をRAGE依存的
に増加した。さらに、CML-修飾タンパク質とHUVECのインキュベーションは、NF
−kBの活性化を引き起こすが、ペントシジン修飾体では起こらず、プロセスは、
抗−RAGE IgG、抗体過剰のRAGEの存在下で、又は細胞内末端欠損RAGEの形質導入
（ドミナントネガティブ効果）により阻害された。正常マウスにCML-修飾BSAを
輸液することにより、肺のVCAM-1 mRNAが増加した。CML-及びRAGEエピトープの
両者は、糖尿病又は全身性エリテマトーデスに特徴的な細胞の摂動におけるそれ
らの相互作用が果たす役割と一致して、糖尿病又は全身性エリテマトーデスのヒ
ト患者由来の腎臓組織で増加し、且つコローカライズされた。我々の研究により
、細胞の摂動、及び、おそらくはAGE（CML）の蓄積疾患の特徴である血管系及び
炎症性細胞の合併症をブロックする試薬を設計するための重要な標的として、CM
L-修飾構造及びRAGEのV-領域を同定した。

【００７０】これまでに多くの重要なAGE構造が同定され、特徴づけられ、且つ組織にロー
カライズされた。しかし、どのグリコキシデーション産物が受容体非依存的及び
受容体依存的な効果を媒介するのか明らかではない。脂質の過酸化、及びグリコ
キシデーション産物であるN^e−（カルボキシメチル）リジン（CML）は、老化及
び糖尿病において主要なAGEであることが報告されている（24-27）。Schleicher
ら（25）は、糖尿病患者の血清中のCML含量が増加していたことを示した。さら
に、皮膚、肺、心臓、肝臓、腎臓、結腸、椎間円板、及び特に老化した動脈で、
CML含量が増加した：（糖尿病で加速されるプロセスである）。高レベルのCML修
飾体が、アテローム性動脈硬化症斑及び泡沫細胞でも観測された。ペントシジン
は、グリコキシデーションの産物でもあり、リジンとアルギニンの架橋によって
形成され、アマドリ転位産物のグリコキシデーション、又はグルコースの自己酸
化生産物であるアラビノースの反応により生じる可能性がある（27）。ペントシ
ジンの蓄積は、糖尿病及び老人の組織で見出された（27-28）。ピラリンは、3−
デオキシグルコソンとタンパク質の相互作用によって生じる糖化産物であって、
アマドリ転位産物の生成により生じる構造であり、最近糖尿病の腎臓で同定され
た（27，29）。メチルグリオキサル化によるAGE修飾がインビボに存在する証拠
が示された。メチルグリオキサル化合物は、メイラード反応の主要な中間体であ
り、糖化及び糖の自動酸化を含む、多くの代謝経路で形成され得る（30）。Naga
rajらは、コントロール、並びに老人患者由来の角膜間質領域と比較して、糖尿
病患者の血清中ではMGに対する免疫応答性が増加していたことを見出した（30）
。基礎となる分子機構は未だに同定されていないが、実際に、MG−修飾タンパク
質がマクロファージ様の細胞と培養液中で相互作用して、インターロイキン−1
βなどのサイトカイン産生を誘導し得ることが最近示された。

【００７１】 AGEに共通な構造、たとえばCML-、ペントシジン、及びメチルグリオキサル修
飾タンパク質が多数報告されているが、CML修飾タンパク質は少なくとも一部分
がRAGEのリガンドであることをここで初めて報告する。さらに、我々の以前の観
測と一致して、CML-修飾タンパク質は、RAGEのV-タイプ免疫グロブリン領域と相
互作用する（31）。

【００７２】これらのデータは、CML修飾体のような病原性AGEsとRAGEの相互作用を阻害す
る構造を同定するためのスクリーニング戦略を開発するための骨組みを提供する
。このような構造は、CMLのようなAGEsが生じる疾患（糖尿病、腎不全、アミロ
イドーシス、老化、アルツハイマー病及び炎症を含むが、これらに限定されない
）治療的のための基礎を形成する可能性がある。

【００７３】材料と方法。

【００７４】放射性リガンド結合アッセイ。

【００７５】 CML（遊離）、CML-修飾タンパク質、ペントシジン（遊離）、ペントシジン修
飾タンパク質、メチルグリオキサール修飾タンパク質を、以前に出版公表された
方法に従って調製した（24−30）。全ての材料は、Detoxi-gel system(PIERCE)
を使用してエンドトキシンを除き、カブトガニ変形細胞アッセイ（SIGMA）で陰
性であることをテストした。ガスクロマトグラフィー／マススペクトロスコピー
及びHPLC解析を行って、調整したAGEsの一致性を確認した。特異的AGE又はコン
トロールタンパク質（5μg）の炭酸ナトリウム/重炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.8
）溶液をNUNC MAXISORPディッシュのウェルに乗せて4℃で一晩おいた。次の朝、
ウェルを吸引し、ウシ血清アルブミン（1％）を含むリン酸緩衝化生理食塩水（
カルシウム/マグネシウムを含む）で2時間、37℃でブロックした。次にウェルを
、Tween20（0.05％）を含むリン酸緩衝化生理食塩水（カルシウム/マグネシウム
を含まない）で一回洗浄した；0.150ml/ウェル。放射性リガンド結合アッセイは
、放射性ラベル（¹²⁵I ; Iodogen（PIERCE）を使用して）された可溶型全長RAGE
(100nM；比活性7000-8000 cpm/ng)を、非ラベル可溶型RAGE（50×過剰モル）も
しくは指示した過剰モルの競合物質の存在下、又は非存在下で使用して、ウシ血
清アルブミン（0.2％）を含むリン酸緩衝化生理食塩水中で2時間、37℃で行った
。ウェルを、NP-40(1%)とNaCl（0.15M）を含むバッファーで上記のように洗浄後
、溶出した。次に、回収した物質をガンマカウンター（LKB）で計測した。いく
つかの実験では、示したように、指示したアッセイにおいて競合する能力をテス
トするために、抗体又は過剰の可溶型RAGEを使用した。

【００７６】構築物 GST融合タンパク質システムを可溶型V-領域、及び可溶型C1およびC2−領域を
調整するために、製造者（PHARMACIA）の指示に従って利用した。

【００７７】 Molt-4結合アッセイ Molt-4結合アッセイは、Maruiら（32）の一般的な方法に従って実施した。ヒ
ト臍静脈内皮細胞を、競合物質の存在下又は非存在下において、37℃で6時間、
指示した化合物で刺激した。VCAM-1のリガンドであるVLA-4を発現するMolt-4細
胞(ATCC)をウシ胎児血清（10％）を含むRPMI1640で培養した。放射性ラベルは、
Molt-4細胞（2×107細胞/ml）を、51-Cr（0.2mCi/ml）を含む上記培地中におい
て、16時間37℃でインキュベートすることにより行った。結合アッセイの前に、
ハンク緩衝食塩水で細胞を洗浄して、取り込まれていない放射性活性を除き、次
に、4×106細胞/mlとなるように、ウシ胎児血清（10％）を含むRPMIに再び懸濁
した。Molt-4細胞を内皮細胞と共に37℃で1時間インキュベートし、ウシ胎児血
清（1％）を含むMedium199で二回洗浄して接着していない細胞を除去し；接着細
胞をSDS（1％）で可溶化し；放射性活性をガンマーカウンターで計測した。

【００７８】走化性アッセイ走化性アッセイは、ポリカーボネート膜を含む48穴のマイクロケモタクシスチ
ャンバー（Neuro-Probe）内で行い、以前に記載したように（15）実施した。本
研究では、細胞表面にRAGEを持つヒト末梢血由来単核球ファゴサイトを使用した
。

【００７９】電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）核抽出物を、Schreiber（33）の方法に従って、HUVECsから調製した。タンパ
ク質濃度は、Bradford試薬（BIO-RAD）を使用して測定した。NF−kB部位を含む
ヒトVCAM-1プロモータの一部に相当する二本鎖オリゴヌクレオチドを合成した（
Life-Technologies）。オリゴヌクレオチドは、以下のようにプローブとして使
用した。：NF−kB：5’CCTTGAAGGGATTTCCCTCC3’(配列番号1)。プローブは、5’
末端を、g−[³²P]およびポリヌクレオチドリン酸化酵素でラベルされた。各反応
には、10fmolのプローブと2-5μl（1.5μl）の核抽出物が含められた。結合反応
は以前に記載したように（19）バッファー中で実施した。複合体は、トリス（50
mM）、ホウ酸（45mM）及びEDTA（0.5mM）溶液（0.5×TEバッファー；最終pH7.5
）中で、非変性ポリアクリルアミドゲル（６％）により分割した。10V/cmで2時
間、サンプルの電気泳動を行った。スーパーシフトアッセイでは、複合体を抗−
p65 IgG、抗−p50 IgG又はその両者共に、又は非免疫IgGと共に、前反応液20μl
で前インキュベートした。

【００８０】ノーザンブロット解析 VCAM-1及びG3PDHのノーザンブロット解析は以前に記載したように（19）実施
した。

【００８１】免疫組織化学アフィニティー精製された抗−CML及び抗−ペントシジンIgGは、AGE/キーホー
ルリンペットヘモシアニンをウサギに接種して調製した。前記IgGをプロテインA
カラム（PIERCE）で精製し、未修飾KLHに対する抗体のみを、アフィニティーカ
ラムクロマトグラフィー（Bio-Rad）によりKLH（SIGMA）を吸収させて除去した
。カラムに接着しなかった物質を、指示したAGE-BSAが吸着されたアフィゲルカ
ラムクロマトグラフィーにかけた。次に、NaCl（1M）で材料を溶出して、特異性
をELISAでテストした。RAGEの免疫組織化学は、単一特異性ポリクローナル抗−R
AGE IgGを使用して行った。全ての抗体はウサギで調製し、免疫組織化学は、以
前に記載したように、ホルマリン固定されてパラフィン包理された組織で実施し
た（10、14、17、20）。

【００８２】結果放射性リガンド結合実験我々は上記のように、特異的AGEsを合成して調製した。ガスクロマトグラフィ
ー／マススペクトロスコピー及びHPLC解析を行って、CML-及びペントシジン修飾
タンパク質を検査した。放射性リガンド結合アッセイは、CML-BSA、ペントシジ
ン−BSA又メチルグリオキサル−ヒト血清アルブミンをプラスチックウェルに吸
着させて実施した。放射性リガンド結合アッセイは、記載されたように実施して
、結合平衡のデータをKlotzとHunstonの式に従って解析した。CML-BSA（黒丸）
のみが、濃度依存的に、Kd＝76±.7nMでsRAGEに結合した（RAGEに結合する異種A
GEで観測された場合と同様の50-75nMである（4、15）。）。逆にペントシジン−
BSA（白丸）はsRAGEと特異的な結合を示さなかった（図1）。さらに、メチルグ
リオキサル−HASはRAGEと特異的に結合しなかった。抗−CML IgG又は抗−RAGE I
gGとインキュベートすると、CML-BSAとRAGEの結合を有意に減少するという実験
から、CML-修飾体とRAGEの結合は特異的であり、CMLによるペプチドの修飾が必
要とされることが示された。逆に、免疫前IgG、遊離CML又は遊離ペントシジンで
は全く効果がなかった（図2）。CML-BSAとRAGEの結合は、RAGEのV-タイプIg領域
との相互作用を介して起こっており、RAGEの第一の又は第二のC−タイプIg領域
のいずれかとの相互作用にるものではない（図3）。

【００８３】細胞の活性化実験内皮細胞インビトロのグリコキシデーション又は患者由来のAGEsから調製されたAGEsの
混合物が細胞表面のRAGEと結合すると、細胞の活性化を誘導する。CML-オボアル
ブミン又はペントシジン−オボアルブミンのインキュベーションがECを活性化す
るかどうかをテストするために、特異的AGEsをエンドトキシンフリーにして（デ
トキシゲルカラム（PIERCE））、エンドトキシンが存在しないことをカブトガニ
変形細胞アッセイ（SIGMA）によってテストした。培養HUVECをCML-オボアルブミ
ンに暴露すると、放射性ラベルされた51Cr−Molt4細胞（VCAM-1，VLA-4のカウン
ターリガンドを持つ；参照24）とHUVECの結合が2.3倍に有意に増加した。；増加
は、抗−RAGE F（ab’）によって（濃度依存的に）阻害されたが、免疫前F（ab
’）では阻害されたかった。逆に、天然のオボアルブミン及びペントシジン−オ
ボアルブミンでは、効果がなかった（図4）。さらに、過剰のsRAGEとCML-オボア
ルブミンのインキュベーションでも、Molt-4細胞とHUVECの結合が減少した（未
修飾オボアルブミンと細胞をインキュベーションした場合に観測された値と一致
した）。これらのデータは、CML-オボアルブミンとHUVECのインキュベーション
が、細胞表面のVCAM-1の増加を生じることを示唆する。

【００８４】単核球ファゴサイト CML-オボアルブミンがヒト末梢血由来単核球の走化性増加を媒介するかどうか
を測定するために、上記の修正走化性チャンバーで実験を行った。走化性チャン
バーの下段のウェルに静置した場合、CML-オボアルブミンで刺激されたモノサイ
トは濃度依存的に走化性を示した。逆に、天然のオボアルブミン又はペントシジ
ンBSAでは効果がなかった（図5）。さらに、抗−RAGE F（ab’）過剰のsRAGE
の存在下では、CML-オボアルブミンを介したモノサイトの走化性は完全に阻害さ
れた。

【００８５】 CML-オボアルブミン−RAGEの相互作用は、HUVECにおいてNF−kBを活性化する
。

【００８６】これらのデータは、EC及びMP RAGEとCML-修飾タンパク質の相互作用が、特異
的細胞のシグナル経路を活性化することを示唆する。我々は、異種AGEsがRAGEに
結合すると、細胞の酸化ストレスの増強を生じることを以前に示した。この増強
は、主としてNADPHオキシダーゼの活性化によって媒介されて（14、20）、NF−k
B活性化に関するオキシダント感受性な近接事象としてp21ras及びerk1／erk2リ
ン酸化酵素活性の増加をともなう（20）。我々は、CML-オボアルブミンがRAGEに
結合して、細胞シグナル経路を活性化する能力をテストした。HUVECをCML-オボ
アルブミンとインキュベーションすると、NF−kBの核内移行の増加を起こしたが
、天然のオボアルブミン又はペントシジンオボアルブミンでは起こさなかった（
それぞれ図6のレーン1、2、及び3）。これが細胞のRAGEとCML−オボアルブミン
の相互作用によることを、高濃度の抗−RAGE IgGの前処理をするとNF−kBの活性
化を阻害したが低濃度では活性化しなかったという実験によって示された（それ
ぞれ図6のレーン6、及びレーン5）。免疫前IgGの前処理しても効果がなかった（
図6、レーン4）。過剰のsRAGEとCML-オボアルブミンのインキュベーションでも
、NF−kBの活性化を阻害した。CML-オボアルブミンがRAGEに結合することによっ
て誘導される核複合体は、スーパーシフトアッセイによると、p50/p65 NF−kBの
ヘテロダイマーである（図6、レーン8-11）。CML-オボアルブミンを介した現象
におけるRAGEの主要な役割は、細胞質領域を欠損したRAGEをコードする構築物が
一過性に形質導入されたHUVECの実験により、さらに詳述された。HUVECに一過性
に形質導入すると、CML-オボアルブミンを介したNF−kBの活性化が、有意に減少
した。；ベクターのみを形質導入した場合は効果がなかった（それぞれ図6のレ
ーン13、及び12）。

【００８７】 CML-BSAを正常マウスに輸液すると、血管細胞接着分子−1のmRNAを増加する。

【００８８】 CML修飾型タンパク質が、インビボで遺伝子発現を調節するという重要な役割
と一致して、CML-BSAをCD−1に輸液すると、肺組織のVCAM-1のmRNAが増加する結
果となった（ノーザンブロット解析による）（図7、レーン2）。逆に、未修飾BS
Aの輸液では効果がなかった（図7、レーン1）。

【００８９】ヒト糖尿病腎臓におけるCML-エピトープ及びペントシジンエピトープの同定。

【００９０】我々の以前の研究において、アフィニティー精製された異種AGEsに対するIgG
を使用して、我々は、糖尿病の腎臓では血管内REGEとAGEsが著しく増加し、且つ
共在していたことを示した（13）。従って、我々はこれらAGE修飾型KLH（キーホ
ールリンペットヘモシアニン；潜在的免疫原）を使用して、アフィニティー精製
された抗−CMLと抗−ペントシジンIgGを調製した（25）。これらの抗体を使用し
て、我々はヒト糖尿病腎症患者由来の腎臓組織で、ペントシジン及びCMLに対す
る免疫反応性が増加していることを確認した（図8A及び8B）。特に有足細胞（図
8C）、血管ECs及びSMCsにおいて、RAGEの発現が目立ってアップレギュレートさ
れており、且つ蓄積が増加されたCML-修飾体と共在していた。ペントシジンを染
色すると、対応する年齢の腎臓におけるCML及びRAGEはほとんど陰性であった。
総合して、これらのデータはさらに、インビボにおいてCML-修飾AGEsと細胞のRA
GEの間に重要な関係が存在するであろうことを示唆する。

【００９１】炎症性腎炎において、CML及びRAGEが増加される。

【００９２】我々の研究室のみ出版されていない観測において、高レベルなRAGEの発現が、
一時的なアレルギー及び全身性エリテマトーデス（SLE）のヒト患者の血管組織
で示された。我々は最近、ECs及びVSCMsにおけるRAGEの発現が、LPS処理によっ
て増加することを報告した（34）。RAGEプロモーターの調査により、二箇所の機
能的なNF−kB結合部位が明らかとなった。；これらを同時に変異させると、炎症
性刺激によるRAGEの発現増強が阻止される結果となった。CMLの形成が炎症過程
（ミエロペルオキシダーゼ経路による）と関連する（3）という最近の情報を総
合して、我々は、RAGEが炎症性刺激による細胞の摂動を媒介する役割を果たして
いるであろうという仮説を設けた。この仮説と一致して、活性型腎炎のヒト患者
由来腎臓組織では、特に有足細胞（図9b）及び血管系内において、RAGE発現が増
加すること、及び共在することに加えて、CMLに対する免疫応答性が増加するこ
とが示された（図9）。

【００９３】考察予想されるように、広範囲のAGEsがインビボで形成され、蓄積される可能性が
ある。しかし、特異的AGEそれぞれの正確な生物学的関係が、さらに同定されな
ければならない。我々は以前に、アルドースショ糖、たとえばグルコース、グル
コース−6−リン酸又はリボース、不均一混合物と共にタンパク質をインキュベ
ーションすることによりインビトロで調製したAGEs（又はスクリーニング試薬と
して抗−AGE IgGを使用したインビボ由来AGEs）が、細胞シグナル経路及び遺伝
子発現の調節に関連した方法によりAGE（RAGE）受容体と結合することができる
構造を含むことを示した。本研究において、我々は、我々の所見を拡張して、糖
尿病及び老化の最も影響を与えるAGE（24−25）であるタンパク質のカルボキシ
メチル−リジン付加物が、RAGE（V-タイプIg領域）と相互作用することができ、
細胞シグナル伝達を開始して、遺伝子発現を変化させることを示した。逆に、他
のAGEであるペントシジンは結合せず、また摂動及び機能不全に関連した方法で
は細胞を活性化しない。

【００９４】しかし、今回、我々の発見はRAGEのリガンドとして、他のAGEsを除外しないこ
とに留意しなければならない。。しかし、共通して実験されたペントシジン−及
びメチルグリオキサール付加物などのAGEsは、大部分が考慮から除かれた。それ
でも、これに関連して、他のAGEsを合成し、特徴づけし、テストするための研究
が現在進行中である。

【００９５】結論として、インビボで形成／蓄積して、血管及び炎症性細胞の摂動に連動し
ていそうな経路に導く細胞を活性化できるAGEsの理解において、我々の今回の発
見は極めて重要な飛躍である。重要なことに、これらのデータは、細胞の受容体
RAGEと病原性AGE（CML付加物）の相互作用をブロックできる試薬を発見するため
に計画された方法の開発を目指した骨組みを提供することによって、AGE（CML−
）関連疾患、たとえば糖尿病、老化、炎症、及び腎不全で発生する合併症の発生
に関与していそうな病原性AGEsについての我々の知識を拡大した。。

【００９６】スクリーニングアッセイを実施して、AGEとRAGEの相互作用を阻害することが
できる二種の各化合物として、キニーネ及びキニジンを同定した。前記アッセイ
は以下のように実施された。：CML-修飾AGE-BSAをプラスチックディッシュに、
適切な結合溶液中で固定した。放射性ラベルされたRAGEのV-領域を未ラベルのキ
ニーネ又はキニジンのいずれかの溶液と混合した。前記アッセイの結果は、キニ
ーネとキニジンの両者がAGEとRAGEのV-領域の結合を減少できることを示した。
本発明は、患者において後生的糖化最終産物と受容体の相互作用を阻害する方法
であって、キニーネ又はその誘導体又はキニジンもしくはその誘導体を、患者の
AGEとRAGEの相互作用を阻害するための有効量投与することを含む方法を提供す
る。たとえば、キニーネの誘導体は、キニーネの化学修飾によって調製されても
よく、前記化学修飾はキニーネの構造を変化させるが、キニーネ分子の電荷は変
化させない。たとえば、前記分子の総電荷の分布は同じままであろう。しかし、
その化学構造は変化してもよい。さらに、キニジンの誘導体は上記キニーネの記
載と同様に調製してよい。さらに、前記キニジン分子のチャージは、化学修飾後
にも変化しないであろう。しかし、前期分子の化学構造は変化してもよい。

【００９７】例2 細胞シグナル伝達経路を活性化するRAGEリガンドである、カルボキシメチル−
リジン（CML）後生的糖化最終産物（AGE）の修飾。

【００９８】後生的糖化最終産物（AGE）は、高血糖、高酸化的環境、及び腎不全で形成さ
れる不均一化合物である。AGEsは、糖尿病患者の血漿及び組織に蓄積する。；そ
の存在は、医学的に合併症の発生に関連していた。AGE受容体（RAGE）とAGEsの
相互作用は、血管系／炎症性細胞で合併症の発生を助長するように、内皮細胞（
Ecs）及び単球（Mps）などの細胞を活性化する。AGEsは、カルボキシメチル−リ
ジン及びペントシジン（遊離型及びタンパク質結合型の両方で）などの構造から
成る。どちらのAGEがRAGEとの相互作用を形成するのか調査するために、我々は
、遊離型のCML及びペントシジン、並びにCML-−及びペントシジン−、ウシ血清
アルブミン（BSA）及びオボアルブミン（OVA）を調製した。CML-BSA及びCML-OVA
は、固定化されたRAGEを濃度依存的に、及び飽和可能な方法で結合し、Kd＝60nM
であり、結合は抗−RAGE IgG及び可溶型RAGE（sRAGE）の存在下で阻害されるが
、非免疫IgG、BSA、OVA、遊離CML、遊離ペントシジンでは阻害されない。EcsをC
ML-OVAにさらすと、NF−kBが活性化され、Molt-4細胞（VCAM-1，VLA-4のカウン
ターリガンドにさらしたもの）の結合が増加した。；増加は、抗−RAGE IgGの存
在下ではブロックされる。さらに、CML-BSA又はCML-OVAに MPsをさらすとRAGE依
存的にNF-kBを活性化した。ペントシジンBSAでは効果がなかった。これらのデー
タは、RAGEのリガンドとしてのCML修飾タンパク質が、細胞シグナル伝達経路を
活性化し、且つ遺伝子発現を変化させることを証明する。総合して、これらのデ
ータは、糖尿病などの疾患における病原性AGEsの理解に改善をもたらし、標的と
される阻害剤を同定するための骨組みを提供する。

【００９９】

【参照文献】

【図面の簡単な説明】

【図１】放射性リガンド結合研究：濃度応答性実験 CML-又はペントシジンBSA（5μg）をプラスチックウェルに固定して、過剰量
の非ラベルsRAGE（50倍モル過剰）+/-において、精製された125-I sRAGEの濃度
を増加させていき放射性ラベルアッセイを行った。結合したトレーサーは、NP40
（1％）、及びNaCl（0.15M）を含むバッファーで溶出し、実験の詳細の説に記載
されたようにデータを解析した。CML-BSA（黒丸）のみが、sRAGEと特異的に結合
した（KD=±3.7nM）。ペントシジンBSAは、sRAGEと特的な結合を示さなかった（
白丸）。

【図２】放射性リガンド結合研究：競合実験 CML-BSAをウェルに固定した。；結合は、示した競合物質と共に125-I sRAGE（
100nM）を用いて行った。過剰のsRAGE、抗-CML IgG、及び抗-RAGE IgGは、sRAGE
とCML-BSAの結合を阻害した。最大結合％は、競合物質の非存在下（100％）にお
いて、固定されたCML-BSAとの結合を比較して報告した。

【図３】放射性リガンド結合研究：CML付加物は、RAGEのV−タイプIg領域と相互作用す
る。 CML-BSAをウェルに固定した。；結合は、過剰(100倍)の非ラベルV−タイプIg
領域、C1 Ig領域、もしくはC2 Ig領域の存在下又は非存在下において、125-I sR
AGE（100nM）を用いて実施した。最大結合％は、競合物質の非存在下（100％）
において、固定されたCML-BSAとの結合を比較して報告した。

【図４】細胞の活性化研究：内皮細胞 HUVECを示されたメディエーターの存在下で6時間培養した。示した中で、いく
つかの細胞を抗−RAGE/免疫前IgGと1時間、プレインキュベートした。細胞を洗
い、51Cr-Molt-4細胞(bear VLA-4)を1時間インキュベートした。結合した放射性
活性をSDS（1％）の存在下で溶出し、ガンマカウンターで計測した。結果は、天
然のオボアルブミンにさらした細胞に結合したMolt-4（「1」と定義した）と比
較して報告した。

【図５】細胞の活性化研究：単核球ファゴサイトヒトモノサイト（5×104）を修正走化性チャンバーのウェル上段に、示したメ
ディエータをウェルの下段に入れて3時間静置した。膜をギムザで染色して、走
化性刺激に向かって膜を通過して移動した細胞をhpf毎に計測した。

【図６】電気泳動移動度シフト解析(electrophoretic mobility shift assay) ヒト臍静脈内皮細胞（HUVEC）をメディエーターと6時間インキュベートした。
；核抽出物を調整し、電気泳動移動度シフト解析は、32PラベルされたNF-kB用の
プローブを用いて行った。レーンには上記のメディエーターを含む（全てのAGEs
は50μg/mlで添加した。）。レーンには、：レーン1、CML-オボアルブミン；レ
ーン2、天然のオボアルブミン；レーン3、ペントシジンオボアルブミン；レーン
4、非免疫IgGとCMLオボアルブミン；レーン5、抗−RAGE IgG：7μg/ml；レーン6
、抗−RAGE IgG：70μg/ml、レーン7、CML-オボアルブミン/100倍過剰の非ラベ
ルNF−kB、スーパーシフトアッセイ（レーン8：抗-p50 IgG；レーン9：抗−p65
IgG；レーン10、抗−p50 IgGと抗−p65 IgG；レーン11、免疫前IgG）、全て+CML
-オボアルブミン。レーン12：CML-オボアルブミン：ベクター単独/13：末端欠失
されたRAGEをのせる。

【図７】インビボ研究：マウスへのCML-BSAの輸液は遺伝子発現を調整する。 CML-BSA（レーン2）又は天然のBSA（レーン1）（どちらも100μg）を正常CD1
マウスに輸液した。LPS（100μg）をポジティブコントロールとして輸液した（
レーン3）。6時間後、マウスを人道的に犠牲にして、RNA調整のために即座に肺
を除去した。ノーザンブロット解析を、上記のVCAM−1に記載したように行った
。；次に膜をはがして、32-P-ラベルされたG3PDHのcDNAの再プローブとした。

【図８】ヒト糖尿病腎臓の免疫組織化学アフィニティー精製されたCML-及びペントシジンに対する抗体を上記のように
調整した。腎組織を糖尿病のヒト患者から得て、上記のように免疫組織化学を行
った。 A. ペントシジンを間質コラーゲンで検出した。 B. CMLエピトープは基底膜及び小節で検出された。 C. RAGEは糖尿病の有足突起でアップレギュレートされた。免疫前IgGによる
コントロールではネガティブだった。非糖尿病の腎臓染色は最小であった。

【図９】ヒト糖尿病腎臓の免疫組織化学（活性型ループス腎炎） A. CMLエピトープは、活性型ループ巣腎炎のヒト患者由来腎臓組織において
糸球体の病巣及び脊髄半月の証拠とされた。 B. RAGE発現の増加は、有足突起で検出された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｋ 45/00 ４Ｃ０８６Ａ６１Ｐ 3/00 Ａ６１Ｐ 3/00 3/04 3/04 3/10 3/10 13/12 13/12 29/00 29/00 37/06 37/06 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/68 ＺＮＡ 1/68 ＺＮＡＺＧ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ // Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者シュミット、アン・マリーアメリカ合衆国、ニュージャージー州 07417 フランクリン・レイクス、ハブン・ロード 242 (72)発明者スターン、デビッドアメリカ合衆国、ニューヨーク州 11020 グレート・ネック、タナーズ・ロード 63 Ｆターム(参考） 2G045 BB20 DA12 DA36 FB03 FB08 4B063 QA08 QQ08 QQ42 QQ79 QR48 QR51 QR56 QR77 QS16 4B065 AA90X AB01 AC14 BA02 CA46 4C076 AA19 AA24 AA61 BB01 BB11 BB13 BB15 BB24 BB25 BB26 CC04 CC07 CC17 CC21 4C084 AA17 MA13 MA24 MA38 MA52 MA56 MA59 MA66 NA14 ZA70 ZA81 ZB08 ZB11 ZC21 ZC35 ZC42 4C086 AA01 AA02 CB17 MA01 MA04 MA13 MA24 MA38 MA52 MA56 MA59 MA66 NA14 ZA70 ZA81 ZB08 ZB11 ZC21 ZC35 ZC42

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】或る化合物が、ペプチドと後生的糖化最終産物受容体（RAGE
）の相互作用を阻害することが可能かどうかを決定する方法であって、 (a)(i) 前記ペプチドのアミノ基が化学的な誘導体化によって不活化されたペプチド、 (ii) RAGE又はその断片、および (iii) 前記化合物を混合することと； (b) 前記RAGE又はその断片と結合した前記ペプチドの量を測定することと； (c) 工程（b）で測定されたペプチドの結合量を、前記ペプチドが前記化合物
の非存在で前記RAGE又はその断片と混合されたときに測定された量と比較するこ
とにより、前記化合物が前記ペプチドとRAGE又はその断片との相互作用を阻害す
ることができるかどうかを決定することとを含み、前記化合物の存在下で前記結合量が減少することによって、前記化合物が前記
相互作用を阻害することができることが示される方法。
【請求項２】請求項1に記載の方法であって、前記ペプチドは後生的糖化
最終産物(AGE)、又はその断片である方法。
【請求項３】請求項1に記載の方法であって、前記ペプチドはカルボキシ
メチルで修飾されたペプチドである方法。
【請求項４】請求項1に記載の方法であって、前記ペプチドはカルボキシ
メチルリジンで修飾されたAGEである方法。
【請求項５】請求項1に記載の方法であって、前記ペプチドは合成ペプチ
ドである方法。
【請求項６】請求項1に記載の方法であって、前記RAGEの断片はそのV-領
域である方法。
【請求項７】請求項1に記載の方法であって、前記RAGEの断片はRAGEのV-
領域のアミノ酸配列を有する方法。
【請求項８】請求項1に記載の方法であって、前記ペプチドの誘導体化に
よる不活化は、化学的な修飾による方法。
【請求項９】請求項1に記載の方法であって、前記工程(a)(i)のペプチド
誘導体はアリル誘導体を含む方法。
【請求項１０】請求項9に記載の方法であって、前記アリル誘導体はベン
ゾイル誘導体を含む方法。
【請求項１１】請求項1に記載の方法であって、前記工程(a)(i)のペプチ
ド誘導体はアルキル誘導体を含む方法。
【請求項１２】請求項11に記載の方法であって、前記アルキル誘導体はア
セチル誘導体、プロピル誘導体、イソプロピル誘導体、ブチル誘導体、イソブチ
ル誘導体、又はカルボキシメチル誘導体を含む方法。
【請求項１３】請求項1に記載の方法であって、前記工程(a)(ii)のRAGE又
はその断片は合成されたものである方法。
【請求項１４】請求項1に記載の化合物であって、前記化合物は実効陰電
荷又は実効陽電荷を持つ化合物。
【請求項１５】請求項1に記載の方法であって、前記化合物は天然に存在
する後生的糖化最終産物の可溶型受容体（sRAGE）の断片を含む方法。
【請求項１６】請求項1に記載の方法であって、前記化合物は擬似ペプチ
ドである方法。
【請求項１７】請求項1に記載の方法であって、前記化合物は有機分子で
ある方法。
【請求項１８】請求項1に記載の方法であって、前記化合物はポリペプチ
ド、核酸、又は無機化学物質である方法。
【請求項１９】請求項1に記載の方法であって、前記化合物は10000ダルト
ンより小さい分子である方法。
【請求項２０】請求項1に記載の方法であって、前記化合物は抗体又はそ
の断片である方法。
【請求項２１】請求項20に記載の方法であって、前記抗体はポリクローナ
ル又はモノクローナル抗体である方法。
【請求項２２】請求項20に記載の方法であって、前記抗体はヒト化、キメ
ラ化、又は霊長類化された抗体である方法。
【請求項２３】請求項1に記載の方法であって、前記化合物は、変異AGEも
しくはその断片、又は変異RAGEもしくはその断片である方法。
【請求項２４】請求項1に記載の方法であって、前記ペプチドは固相表面
に固定された方法。
【請求項２５】請求項1に記載の方法であって、前記RAGE又はその断片が
固相表面に固定された方法。
【請求項２６】請求項1に記載の方法であって、前記ペプチドは検出可能
にラベルされた方法。
【請求項２７】請求項1に記載の方法であって、前記RAGE又はその断片は
検出可能にラベルされた方法。
【請求項２８】請求項26又は27に記載の方法であって、前記検出可能なラ
ベルは、蛍光、ビオチン、又は放射能を含む方法。
【請求項２９】請求項1に記載の方法であって、工程(a)が細胞内で起こる
方法。
【請求項３０】請求項1に記載の方法であって、工程(a)が動物内で起こる
方法。
【請求項３１】請求項30に記載の方法であって、前記動物はRAGEを過剰発
現するトランスジェニック動物、又はRAGEを発現しないトランスジェニック動物
である方法。
【請求項３２】患者において、後生的糖化最終産物（AGE）と後生的糖化
最終産物受容体（RAGE）の相互作用を阻害する方法であって、該患者のAGEとRAG
Eの相互作用を効果的に阻害する化合物のある量を患者に投与することを含む方
法。
【請求項３３】請求項32に記載の方法であって、前記患者はヒト、霊長類
、マウス、ラット、又はイヌである方法。
【請求項３４】請求項32に記載の方法であって、前記投与は病変局部内、
腹腔内、筋肉内、もしくは静脈内への注射；輸液；リポソームを介したデリバリ
ー；又は局所的、鼻腔内、経口、眼内、もしくは耳内デリバリーである方法。
【請求項３５】請求項32に記載の方法であって、前記化合物が毎時、毎日
、毎週、毎月、又は毎年投与される方法。
【請求項３６】請求項32に記載の方法であって、前記化合物の有効量が約
0.000001mg/kg体重〜約100mg/kg体重を含む方法。
【請求項３７】請求項32に記載の方法であって、前記患者は腎臓疾患に罹
患している方法。
【請求項３８】請求項32に記載の方法であって、前記患者は糖尿病に罹患
している方法。
【請求項３９】請求項32に記載の方法であって、前記患者は全身性エリテ
マトーデス、または炎症性腎炎に罹患している方法。
【請求項４０】請求項32に記載の方法であって、前記患者は肥満患者であ
る方法。
【請求項４１】請求項32に記載の方法であって、前記患者は老人患者であ
る方法。
【請求項４２】請求項32に記載の方法であって、前記患者はアミロイドー
シスに罹患している方法。
【請求項４３】請求項32に記載の方法であって、前記患者は炎症に罹患し
ている方法。
【請求項４４】請求項32に記載の方法であって、前記化合物を投与する際
に、薬学的に許容可能なキャリアを患者に投与することを、さらに含む方法。
【請求項４５】請求項44に記載の方法であって、前記キャリアは賦形剤を
含む方法。
【請求項４６】請求項44に記載の方法であって、前記キャリアはウイルス
、リポソーム、マイクロカプセル、ポリマーで包まれた細胞、又はレトロウイル
スベクターを含む方法。
【請求項４７】請求項44に記載の方法であって、前記キャリアはエアロゾ
ル用、静脈内用、経口用、又は局所用キャリアである方法。
【請求項４８】請求項44に記載の方法であって、前記化合物はタイムリリ
ース移植で投与される方法。
【請求項４９】患者において、後生的糖化最終産物（AGE）と後生的糖化
最終産物受容体（RAGE）の相互作用を阻害する方法であって、該患者のAGEとRAG
Eの相互作用を阻害するのに有効なキニーネ、又はその誘導体のある量を患者に
投与することを含む方法。
【請求項５０】請求項49に記載の方法であって、前記誘導体はキニーネと
は異なる化学構造を有し、前記誘導体は全体の電荷がキニーネと同じである方法
。
【請求項５１】患者において、後生的糖化最終産物（AGE）と後生的糖化
最終産物受容体（RAGE）の相互作用を阻害する方法であって、該患者のAGEとRAG
Eの相互作用を阻害するのに有効なキニジン、又はその誘導体のある量を患者に
投与することを含む方法。
【請求項５２】請求項51に記載の方法であって、前記誘導体はキニジンと
とは異なる化学構造を有し、前記誘導体は全体の電荷がキニジンと同じである方
法。
【請求項５３】請求項1に記載の方法によって同定された化合物であって
、患者の糖尿病の治療に有用である化合物。
【請求項５４】請求項1に記載の方法によって同定された化合物であって
、患者の全身性エリテマトーデス、又は炎症性腎炎の治療に有用な化合物。
【請求項５５】請求項1に記載の方法によって同定された化合物であって
、患者のアミロイドーシスの治療に有用な化合物。
【請求項５６】請求項1に記載の方法によって同定された化合物であって
、患者の炎症の治療に有用である化合物。
【請求項５７】請求項1に記載の方法によって同定された以前に知られて
いない化合物。