JP2002503336A

JP2002503336A - 微量流通システムおよびその使用方法

Info

Publication number: JP2002503336A
Application number: JP54973398A
Authority: JP
Inventors: ジェッドハリソン，ダニエル; アンダーソン，パー; シーエイチリー，ポール; スザルカ，ロダリック; スミス，リチャード; サリミ−ムーサヴィ，ホセイン
Original assignee: Alberta Research Council
Current assignee: Alberta Research Council
Priority date: 1997-05-16
Filing date: 1998-05-15
Publication date: 2002-01-29
Also published as: CA2286601A1; US6900021B1; WO1998052691A1; DE69823347D1; DE69823347T2; AU7421898A; EP0981408A1; EP0981408B1; ATE264717T1; AU734957B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、細胞に対しての様々な化合物の反応や効果をインビトロで研究するための、新規な微量流通デバイスおよびその使用方法に関するものである。より詳細には、個々の細胞に対しての化合物の効果を研究するために、微量流通システム内において、流通を停止させるという方法に関するものである。本発明は、また、白血球ローリングに対しての候補化合物の効果を観測するための方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】微量流通システムおよびその使用方法発明の属する技術分野本発明は、細胞に対しての様々な化合物の反応や効果をインビトロで研究するための、新規な微量流通デバイスおよびその使用方法に関するものである。発明の背景個々の細胞のインビトロでの操作、研究、および、処理は、理論的発展の面からも、そのような細胞中での生物学的括性のための化合物のインビトロでの分析の面からも、重要である。しかしながら、流通血球計算法や潅流チャンバといったような従来の分析システムは、典型的には、１ｍｌ〜１００ｍｌというような薬剤量でもってあるいはそれ以上の薬剤量でもって動作する。大量の細胞を要する技術のさらなる欠点は、細胞が候補化合物に対して接触する前におけるまた接触している時におけるまた接触した後における、細胞に対しての効果を観測できないことである。最後に、細胞数の統計的偏差は、化合物の効果を決定できる可能性を制限する。最近、生物学的試料の取扱いのために、また、制御ベース上においてインビトロでの実験を行うために、小さな使い捨てデバイスが開発されている。例えば、アミノ酸混合物を電気泳動的に分離するために、マイクロチップが使用されている（文献１）。Ｆｌｕｒｉ氏他は、また、アミノ酸混合物を電気泳動的に分離するために使用される毛細管集積型電気泳動デバイスを開示している（文献２）。電気泳動的移動度による単一細胞の操作が、毛細管内において示されている（文献３）。インビトロでの受精のために、精液機能を評価し得るよう原理的には運動性を評価し得るよう構成された、マイクロチップが示されている（文献４）。細胞機能に関しての候補化合物の効果の分析のためには、量と濃度とが制限されているケースの多い候補化合物を、注意深く取り扱うことが要求される。潜在的に高度な多重化に適したデバイス内における個々の細胞に対しての候補化合物の効果の観測可能性は、微量分析を、非常に魅力的なものとする。さらに、非付着性細胞に対しての候補化合物の効果の観測可能性は、有益なものである。マイクロチップ内において実現される微量流通システムであると、小さな容積で済むこととなる。これにより、高価な薬剤を使用する作業に対して、特に、新薬のスクリーニングのために形成された候補化合物を使用する作業に対して、コスト低減という利点をもたらす。また、当然のことながら、そのような微量流通システムであると、要求される候補化合物の量が低減されることとなる。細胞レスポンスをいくつかのクラスに分類し得ること、および、各クラスを個別的に分析し得ることは、多数の細胞が集団的に評価される場合に発生する統計的偏差を低減させることとなる。また、単一細胞の研究は、単一細胞内における事象の進行を、評価可能とする。これは、事象の進行を、細胞全体にわたってしか研究できないような流通血球計算法とは、異なる。集団における統計的偏差は、特定の効果の決定可能性を制限する。これに対して、個々の細胞に対する研究は、与えられた現象に対しての解像度および信号雑音比を最大化させる。したがって、微小に形成された反応デバイス内において細胞を操作して搬送しこれにより細胞反応の観測を可能とすることは、有利なことである。発明の概要本発明は、部分的には、細胞に対しての化合物または化合物混合体の効果を、検出領域を備えた主流通経路と検出領域においてまたは検出領域よりも上流側において主流通経路に対して合流する少なくとも２つの流入経路とを備えた微量流通デバイス内において、観測するための方法に関してなされている。ある方法においては、少なくとも１つの細胞を、第１流入経路に導入するとともに、所望化合物を、第２流入経路に導入し；流出口に向けての、細胞の流れおよび所望化合物の流れを誘起し；第２流入経路と主流通経路との合流箇所において、細胞と候補化合物とを混合し；細胞に対しての候補化合物の効果を、検出領域において観測する。本発明による方法の１つの見地においては、本発明は、細胞に対してのカルシウム流を、検出領域を備えた主流通経路と検出領域よりも上流側において主流通経路に対して順次的に合流する少なくとも２つの流入経路と検出領域よりも下流側に配置された流出口とを備えた微量流通デバイス内において、研究するための方法であって、リンパ球を第１流入経路に導入するとともに、活性化剤を第２流入経路に導入し；流出口に向けての、リンパ球の流れおよび活性化剤の流れを誘起し；第２流入経路と主流通経路との合流箇所において、リンパ球と活性化剤とを相互作用させ；リンパ球に対しての活性化剤の効果を観測する；方法に関するものである。この方法においては、好ましくは、微量流通デバイスが、検出領域よりも上流側において主流通経路に対して合流する第３流入経路を備え、抑制剤をこの第３流入経路に導入し、検出領域において、抑制剤の効果を観測する。本発明による方法の他の見地においては、本発明は、白血球のローリングを研究するための方法であって、検出領域および流出口を備えた主流通経路であるとともに、検出領域における主流通経路の壁には細胞付着性分子が取り付けられている主流通経路と、検出領域よりも上流側において主流通経路に対して合流する少なくとも２つの流入経路と、を備えた微量流通デバイスを準備し；少なくとも１つの白血球細胞を、第１流入経路に導入し；少なくとも１つの白血球細胞と候補化合物とを、第２流入経路に導入し；主流通経路内において流出口へと向かう白血球細胞の流れおよび候補化合物の流れを誘起し；白血球と候補化合吻と細胞付着性分子とを相互作用させ；検出領域において白血球のローリングを観測する；方法に関するものである。この方法においては、好ましくは、微量流通デバイスが、第１検出領域のところにおける主流通経路の壁が付着性分子を一切有しておらずかつ第２検出領域のところにおける主流通経路の壁に対しては付着性分子が取り付けられているといったような少なくとも２つの検出領域を備え、白血球のローリングを、双方の検出領域において観測する。本発明による微量流通デバイスのある見地においては、本発明は、検出領域および流出口を備えた主流通経路と；検出領域においてまたは検出領域よりも上流側において、９０°よりも小さな上流側開き角度でもって主流通経路に対して流体連通可能に合流する、少なくとも２つの流入経路と；を具備する微量流通デバイスに関するものである。本発明による微量流通デバイスの他の見地においては、本発明は、本発明による微量流通デバイスを複数具備してなる観測デバイスであって、複数の徴量流通デバイスのそれぞれの主流通経路どうしが、それぞれの検出領域において、実質的に互いに平行とされている観測デバイスに関するものである。図面の簡単な説明図１は、本発明による微量流通デバイスを概略的に示す図である。図２は、複数の流入経路と複数の検出領域とを備えた微量流通デバイスを概略的に示す図である。図３Ａ、３Ｂ、３Ｃは、図１に示す微量流通デバイスを複数備えた観測デバイスを概略的に示す図であって、微量流通デバイスの主流通経路が検出領域において互いに平行とされている様子が図示されている。図４Ａは、本発明による微量流通デバイスにおける主流通経路を概略的に示す図であって、この主流通経路は、細胞を拘束するための流通制限デバイスとしての堰タイプのトラップを備えている。図４Ｂは、図４Ａの主流通経路を異なったスケールで概略的に示す流通経路に沿った長さ方向断面図であって、細胞を拘束するために使用されている堰タイプのトラップの効果が図示されている。図４Ｃは、本発明による微量流通デバイスにおける主流通経路を概略的に示す図であって、この主流通経路は、細胞を拘束するための流通制限デバイスとしての堰タイプのトラップを備えている。この堰タイプのトラップは、細胞の流通をさらに妨害するチャネルを形成している。図４Ｄは、図４Ｃにおいて使用されている流通制限デバイスを拡大して示す図である。図５Ａ、５Ｂは、マイクロチップＣＯＰＩ（図５Ａ）およびＰＣＲＤ２（図５Ｂ）の構成を示す図である。図６Ａは、微量流通デバイス内を流通するイースト細胞を示す写真である。図６Ｂは、微量流通デバイス内を流通する一群のイースト細胞を示す写真である。図６Ｃは、微量流通デバイスの合流部における大腸菌を示す写真である。図７Ａ、７Ｂは、微量流通デバイスの合流部におけるベンガルローズ色素の混合を示すＣＣＤ像である。図７Ａは、流体の流通を示しており、図７Ｂは、流通が停止したときの流体の混合を示している。図８は、ＰＣＲＤ１の構成を概略的に示す図である。図９は、ＰＣＲＤ３の構成を概略的に示す図である。図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃは、微量流通デバイスの合流部においてＳＤＳが赤血球に対して混合されたときのイヌの赤血球の破壊（リーシス）を示している。図１１は、ヒトのリンパ球内におけるカルシウム流の動きを示すグラフである。図１２は、「Ｙ」字形の微量流通デバイスの構成を概略的に示す図である。図１３は、微量流通デバイスのチャネルの概略的な横断面を示す図である。図１４は、Ｐ−セレクチンによってコーティングされたマイクロチップ上における好中球ローリングの結果を示すグラフである。図１５は、Ｅ−セレクチンによってコーティングされたマイクロチップＨＣＲ IV上における好中球ローリングの第１試行の結果を示すグラフである。図１６は、Ｅ−セレクチンによってコーティングされたマイクロチップＨＣＲ IV上における好中球ローリングの第２試行の結果を示すグラフである。実施形態の詳細な説明本発明は、個々の細胞に対しての１つまたは複数の化合物の効果あるいは複数の化合物からなる混合体の効果を評価するための、微小に形成されたデバイスを提供する。本発明は、さらに、本発明による微小形成デバイスと、例えば顕徴鏡デバイスのような検出デバイスと、を具備してなるシステムを提供する。定義：本発明をさらに詳細に説明するに先立って、まず最初に、以下の用語を定義しておく。「流通経路」という用語は、微量流通デバイス内に存在している毛細管経路または毛細管チャネルを意味している。「流通誘起手段」という用語は、流通を誘発し得る能力を有したすべてのデバイスを包含している。流通は、負圧によって、正圧によって、電気泳動的に、あるいは、浸透方的に、誘起することができる。これは、蠕動ポンプ、往復ポンプ、シリンジ、電気素子、あるいは、圧電素子によって、得ることができる。好ましい実施形態においては、流通誘起手段は、流通方向を逆転させる能力を備えている。例えば、正圧と負圧との双方を引き起こし得るデバイスは、正圧によって流通を誘起することができるとともに、負圧によって逆向きの流通を誘起することができる。「流通停止」という用語は、２つまたはそれ以上の流通経路の内容物の混合を可能としそれにより細胞に対しての候補化合物の反応の観測を可能とするために、微量流通デバイスを通しての流通を停止させることまたは一時的に中断させることを意味している。「候補化合物」または「初期薬剤（プロトドラッグ、proto-drug）」または「所望化合物」という用語は、薬剤の候補、初期薬剤、細胞抑制剤（細胞阻害剤）、細胞活性化剤、細胞付着誘起セレクチン、レクチン、インテグリン、細胞受容体、および、細胞に対しての作用を決定することが興味の対象をなすような他の任意の化合物または薬剤を意味している。「細胞」という用語は、バクテリアの細胞、イースト菌の細胞、哺乳類の細胞、等といったように、真核細胞と原核細胞との双方を包含している。好ましくは、細胞は、真核細胞であり、より好ましくは、細胞は、白血球である。他の細胞としては、神経節細胞、線維芽細胞、あるいは、単一細胞懸濁液内に懸濁され得る任意の細胞、がある。好ましくは、細胞は、生存可能である。「細胞付着分子」という用語は、細胞付着を容易とし得るすべての分子を意味している。これら細胞付着分子としては、セレクチン、レクチン、インテグリン、および、デバイスの壁に対しての白血球の付着を容易とし得るすべての任意の細胞表面分子、がある。「活性化剤」という用語は、細胞にレスポンスを誘起すると信じられている候補化合物を意味している。好ましい実施形態においては、活性化剤は、カルシウムイオン透過担体Ａ２３１８７（calcimycin）である。「抑制剤」という用語は、細胞が、活性化化合物に対してあるいは細胞付着分子に対して反応することを抑制すると信じられている候補化合物を意味している。「カルシウム流入」という用語は、白血球内において細胞間Ｃａ²⁺流が誘起されることを記述しており、これは、細胞活性化が起こったことを示す。活性化された白血球は、正常なまたは異常な免疫反応内に直接的に巻き込まれる。細胞間メッセンジャーＣａ²⁺が急激に増加することは、すべての哺乳類細胞の活性化経路における第２信号である。よって、細胞質ゾルのないＣａ²⁺が増加することは、活性化にとっては、キー信号をなす事象である。「白血球のローリング（rolling）」という用語は、組織を通しての細胞移動をもたらすような第１事象としての、内皮に対しての白血球のローリング過程を意味している。炎症性レスポンスの基本分子機構としては、様々な付着受容体の連続的な結合によってもたらされる事象の連鎖反応（カスケード、連続的相互作用）がある。付着連鎖反応の第１ステップは、セレクチンによって仲介された可逆結合である。これは、炎症を起こした内皮に沿っての白血球のローリングを引き起こす。第２ステップは、サイトカインによって仲介された白血球の活性化であり、これにより、白血球が内皮上において平坦化され、白血球が組織内に侵入していく。活性化されて表面に付着した細胞は、流れ内においてローリングのような態様で移動し、非付着細胞よりも小さな平均速度とされる。図１においては、本発明による微量流通デバイスは、主流通経路２を具備している。主流通経路２は、流出口４と、すべての細胞反応の検出を可能とするよう配置された検出領域１０と、検出領域１０および流出口４の上流側において主流通経路２に対して流体的に合流している少なくとも２つの流入経路８，８’と、を備えている。微量流通デバイスは、固体基体から得られる、好ましくは、チップの形態とされた固体基体から得られる。例えばチップとされるようなデバイスの寸法は、重要ではない。しかしながら、好ましくは、寸法は、厚さが約０．００１ｃｍ〜約１０ｃｍの程度であり、一辺の長さが約０．３ｃｍ〜約３０ｃｍの程度である。本発明によるデバイスは、適切な基体すなわちベースプレートの表面内に流通通路を形成しその後その表面上にカバーを取り付けるというように、従来的に形成することができる。また、本発明によるデバイスは、ベースとカバーとの双方の表面に流通通路を形成しその後カバーをベース上に取り付けるに際して互いの流通通路どうしを位置合わせすることによって、形成することもできる。ベースおよびカバーは、シリコン、ポリシリコン、シリカガラス、熱電対材料、ガリウムヒ素、ポリアミド、窒化シリコン、二酸化シリコン、といったような材料を備えることができる。また、カバーおよび／またはベースは、アクリル、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリジメチルシロキサン、あるいは、他の樹脂材料といったような、プラスチック材料を備えることができる。好ましくは、カバーおよびベースは、信号検出が可能な材料を備えることができ、より好ましくは、紫外、赤外、あるいは、可視光に対して透明な材料、すなわち、放射による検出が可能な材料を備えることができる。特に好ましい実施形態においては、材料は、比較的薄く一体化されたまたは電気伝導可能に接合されたガラス層、あるいは、超音波溶接されたプラスチックシート材料である。流通経路２，８，８’の寸法は、およそ深さ０．１μｍ×幅０．１μｍから、およそ深さ１ｍｍ×幅２ｍｍのものである。好ましくは、これら流通経路は、およそ深さ５μｍ×幅５００μｍから、およそ深さ３０μｍ×幅２００μｍのものである。デバイス内の流通経路の幅は、単一細胞に対しての候補化合物の効果を観測し得るほど十分に小さなものである。好ましくは、流通経路の長さは、約５０μｍ〜約２ｍの範囲であり、より好ましくは、約１ｍｍ〜約１００ｃｍである。横断面で見た場合には、流通通路および他の構造は、三角形、楕円形、正方形、長方形、円形、または、他の任意の形状とすることができる。この場合、横断面形状の少なくとも１つの寸法は、与えられた構造を通しての試料流体の流通方向に対して直交方向において、約０．１μｍ〜約２ｍｍであり、好ましくは、約５μｍ〜約５００μｍである。好ましい実施形態においては、１つまたは複数の流入経路は、主流通経路よりも大きな寸法のものとされる。流入経路と主流通経路との間の直径の差は、流速の制御を補助する。例えば、流通誘起手段が電気である場合には、流通経路どうしの幅の差は、主流通経路における電圧降下によって補償することができ、主流通経路に沿ってのより良好な電圧勾配を得ることができる。流入経路は、主流通経路に対して合流する。図１に示すように、主流通経路に対しての各流入経路の上流側合流角度は、好ましくは、９０°よりも小さな角度であり、より好ましくは、７０°よりも小さな角度であり、最も好ましくは、５０°よりも小さな角度である。主流通経路に対しての流入経路の上流側合流角度が９０°以上であると、主流通経路に対しての流入経路の合流によって生成される擾乱が、細胞に損傷を引き起こしたりあるいは細胞を破壊しかねないことがわかっている。候補化合物の効果を正確に決定するためには、そのような損傷や破壊は、避けなければならない。加えて、細胞の破壊は、主流通経路を閉塞する可能性があり、他の細胞の観測を妨害しかねない。主流通経路の流出口４からの、過剰の試料流体、細胞、薬剤、洗浄液、および、類似物は、すべての試料溶液および反応生成物が廃棄用に安全に保持されるよう、適切な容量とされた廃棄物容器へと導くことができる。細胞に対しての候補化合物の効果は、検出領域１０を通して観測することができる。細胞に対しての候補化合物の効果の検出は、透明カバーを通してのまたはベースの半透明部分を通しての手動でのまたは機械による光学検出といったような、様々な方法によって検出することができる。候補化合物の効果は、また、流通特性の変化によっても、また、電気伝導度の変化によっても、観測することができる。バルブ、圧力センサ、および、他の機械的センサ、といったようなデバイスは、周知の技術によって形成することができる。そのようなデバイスは、周知の技術によって、シリコン基板上に直接的に作りつけることができる。また、デバイスは、細胞に対しての候補化合物の効果を観測するための器具と組み合わせて使用することができる。ある実施形態においては、この器具は、効果を観測するための顕微鏡である。この顕微鏡は、反転式顕徴鏡、あるいは、共焦式顕微鏡とすることができる。また、細胞に対しての候補化合物の効果を観測するために、細胞の蛍光作用を活性化するために使用されるＵＶ光源またはレーザービームを使用することができる。他の実施形態においては、上記器具内に、カメラを組み込むことができる。このカメラは、ビデオカメラとすることができる。他の実施形態においては、カメラの代わりに顕微鏡に対して固定された光増倍管（photomultiplier tube、ＰＭＴ）を使用して、データを観測することができる。ＰＭＴが使用される場合には、ＰＭＴの視野を制限するために、顕微鏡に関してピンホールを使用することとなる。また、放射活性色素が使用されているような細胞に対しての候補化合物の効果を検出するためには、シンチレーションデバイスを使用することができる。他の実施形態においては、信号伝達を可能とするために、電気導体を、デバイスのベースに形成することができる。デバイス内の電気導体は、流通システム内における細胞の電気伝導度または圧力の検出を可能とする圧力センサまたは電導度センサからの信号を、伝達する。流入経路に、流入経路内へと細胞および／または候補化合物を配置するための流入用貯蔵器を備えることが想定される。微量流通デバイスは、入力ボート６，６’を介して微量流通デバイスへと流体または細胞を流入させるとともに流出口４を介して微量流通デバイスから流体または細胞を抽出するための器具と組み合わせて使用することができる。この器具は、例えば、微量流通デバイスの流通経路を通して流体および細胞を搬送するためのポンプによって、実現することができる。このポンプは、周知の微小形成技術を使用して、デバイス内に組み込むことができる。流体制御は、微小形成されたポンプ、往復ポンプ、蠕動ポンプ、ダイヤフラムポンプ、シリンジポンプ、容積閉塞ポンプ、といったような様々なポンプを使用して得ることができ、また、内部浸透によって誘起された流れ、ガスの電気化学的形成によって誘起された流れ、および、当業者には公知の他のポンプ手段を使用して得ることができる。Ｆｅｔｔｉｎｇｅｒ氏他は、バルブを使用しない微量流通システムを制御するために、外部ポンプが使用可能であることを示した（文献５）。流入経路６，６’に接触しているいくつかの貯蔵器を大気開放状態としておき、他の貯蔵器を、圧力モードと吸込モードとの組合せで動作しているポンプに接続し、これにより、経路の合流点における流通を制御可能とすることが考えられる。ポンプを負圧モードで運転することは、約２０μｌ〜約２００μｌといったように、初期薬剤用の貯蔵器の容積低減化を容易なものとする。このような流体制御方法の正確さおよび感度は、所望のところで流れを制限できるようにまた必要なところで流通抵抗を最小化できるように、流通チャネルのサイズを構成することにより、増強することができる。良好な流体制御を、微小チャネル内に内部バルブを設けることなく、得ることができる。シリンジポンプは、流速およびバルク容積が所望値であるという理由により、好ましい。代替可能なポンプは、例えばＨＳＧ−ＩＭＴＶＡＭＰ（ドイツ、Villengen）のような微小形成されたポンプ、あるいは、他の市販されている微小ポンプである。微量流通デバイス内における流体の流れは、また、電界を使用しても制御することができる。コーティングされていないガラス製マイクロチップにおいては、電気浸透流に基づく溶媒移動度は、細胞の電気泳動による移動度よりも大きい。そのため、細胞の正味の流通方向は、生理学的ｐＨ値近傍においては、陰極に向かう。イースト細胞に対しては１ｋＶ／ｃｍという程度の、ヒトの赤血球に対しては２〜４ｋＶ／ｃｍという程度の、イースト細胞に対しては５〜１０ｋＶ／ｃｍという程度の高電界が、電気穿孔法によってこれらのタイプのセル内にＤＮＡや他の標識物質を導入するために、以前から使用されてきた。このような大きさの電界は、膜の浸透を引き起こすことはあったものの、細胞の破壊を引き起こすことはなかった。好ましくは、電界は、約６００Ｖ／ｃｍよりも小さく、より好ましくは、１００Ｖ／ｃｍよりも小さい。主流通経路内へと流入経路を介して候補化合物および細胞の流れを導入するためのこのような方法を使用することにより、１つまたはいくつかの細胞が検出領域内に存在しておりそれと同時にまたはその直後に候補化合物がその細胞と相互作用を起こすよう、化合物および細胞の流れを停止させることが考えられる。流通の停止によって、細胞に対しての候補化合物の効果を完全に観測することができる。反応条件を増強するために、主流通チャネル内の温度を制御するための手段を、付加的に利用することができる。必要に応じて、主流通流路内の温度を検出するための手段を、設けることもできる。温度検出手段は、検出された温度変化と候補化合物に対しての細胞の相互作用とを相関させるよう、マイクロプロセッサまたはシステムの全体機能を制御する他のデバイスによって制御し得るようにしてマイクロプロセッサ等に対して接続することができる。図２に示すように、本発明による微量流通デバイスは、主流通経路に対して流体的に連結された複数の流入経路８，８’，８”，８’’’を備えることができる。また、微量流通デバイスは、複数の検出領域１０，１０’，１０”を備えることができる。これら検出領域１０，１０’，１０”の各々は、隣接して配置されている、あるいは、主流通経路に対しての流入経路の合流箇所のすぐ下流側の箇所に配置されている。このように構成されたデバイスであると、単一細胞が主流通経路内において下流側へと流れるときに、単一細胞に対してのいくつかの異なる候補化合物の効果の観測を行うことができる。これに代えて、このようなデバイスであると、異なるいくつかの細胞が主流通経路に沿って異なるいくつかの候補化合物に対して合流するときに、異なるいくつかの細胞に対しての異なるいくつかの候補化合物の効果の観測を行うことができる。また、検出領域を、主流通経路に対しての流入経路の合流箇所の上流側と下流側との双方に設置することができる。この場合には、候補化合物に対して曝される前と後との双方に関して細胞の観測を行うことができる。また別の場合には、候補化合物に曝される前と後との双方に関して複数の細胞の同時観測を行うことができる。図３Ａ、３Ｂ、３Ｃは、本発明の他の実施形態を示しており、これら実施形態においては、複数の微量流通デバイスが集積することによって、本発明による方法を実施するのに適した観測デバイス１９，３９，５１を構成している。これら観測デバイスは、白血球のローリングを研究するために使用することができる。これら観測デバイスにおいては、複数のチャネルを使用することによって、ローリングがない場合の速度、ローリングを誘起する表面上での速度、および、薬剤が存在している同一表面上での速度という、白血球ローリングの研究に関しての少なくとも３つの関連パラメータが観測される。顕微鏡を使用して、すべてのチャネルを同時に観測することができる。図３Ａは、観測デバイス１９の構成を示しており、観測デバイス１９は、単一チップ上に、複数の主流通経路を具備している。これにより、同一タイプの細胞に対しての複数の候補化合物の同時的試験を、一度に行うことができる。細胞チャンバ２０は、４つの主流通経路をなすマイクロチップチャネル２２〜２２’’ ’のすべてに対して流体連結された流入口である。試験チャンバ２４〜２４’’ ’は、セルチャンバ２０よりも下流側においてマイクロチップチャネル２２〜２２’’’のそれぞれに対して合流する付加的な流入経路を通して、細胞チャンバ２０から流れてくる細胞に対して反応を起こすべき適切な候補化合物を、供給する。活性化剤チャンバ２６および２６’’’からの流れは、試験チャンバ２４，２４’’’からの適切な候補化合物の添加点よりも下流側において、マイクロチップチャネル２２，２２’’’のそれぞれに対して合流する。マイクロチップチャネル２２〜２２’’’の各々は、観測領域２８を通過し、共通の廃棄物チャンバ３０へと流入する。複数の主流通経路は、観測領域（顕微鏡視野）２８においてマイクロチップチャネル２２〜２２’’’からなるこれら４つの主流通経路の同時的観測が可能であるように、構成して配置することができる。図３Ｂにおけるデバイス３９であると、単一チップ上の複数の微量流通デバイスによって、複数の試験を同時に行うことができる。これら複数の試験は、同一チップ上における個別デバイスによる制御によって行うことができる。デバイス３９においては、マイクロチップチャネル４２〜４２’’’’は、個別のセルチャンバ４０〜４０’’’’のそれぞれを起点とする主流通経路をそれぞれ形成する。試験チャンバ４４〜４４’’’’を起点とした候補化合物の流れは、マイクロチップチャネル４２〜４２’’’’のそれぞれに対して合流する。活性化チャンバ４６〜４６’’’’からの流れは、候補化合物の添加点よりも下流側において、マイクロチップチャネル４２〜４２’’’’のそれぞれに対して合流する。マイクロチップチャネル４２〜４２’’’’の各々は、観測領域４８を通過し、共通の廃棄物チャンバ５０へと流入する。図３Ｂから明らかなように、顕微鏡視野４８は、活性化剤の添加点よりも下流側において、マイクロチップチャネル４２〜４２’’’’を観測する。図３Ｃは、単一のマイクロチップ上において複数の個別の微量流体チャネルを備えた構成とされた、さらに他の観測デバイス５１を示している。徽量チャネル５０〜５０”は、細胞チャンバ５２〜５２”を起点とした３つの主流通経路をそれぞれ形成している。候補化合物貯蔵器５４〜５４”を起点とした流入経路５３〜５３”のそれぞれが、下流側において合流している。さらに下流側においては、主流通経路５０〜５０”の各々は、蜆測領域６０を通過する。観測領域６０は、例えば顕微鏡視野であって、細胞のローリング特性を観測することができる。最後に、微量チャネルは、流出口５８〜５８”へと流入する。デバイス５１には、付加的な流通経賂５７〜５７”がそれぞれ設けられている。これら流通経路５７〜５７”は、それぞれ、流体流通コントローラ５６〜５６ ”に対して接続されている。これら流体流通コントローラは、主流通経路５０〜５０”内の流れに対して、正圧または負圧を誘起することができる。例えば白血球のような所望の細胞が細胞チャンバ５２〜５２”内に搬入されかつ候補化合物が貯蔵器５４〜５４”へと搬入された後には、流通コントローラ５６〜５６”によってもたらされた負圧によって、流通を誘起することができる。この流通は、流通コントローラ５６〜５６”によって正圧を印加することにより、停止したりあるいは逆転したりすることができる。複数チャネルの観測を、上記のようにして行うことができる。図３Ａ、３Ｂ、３Ｃの各々においては、試験化合物と、活性化剤または抑制剤と、の様々な組合せを、同時に試験することができる。図４Ａおよび図４Ｂに示す本発明の他の実施形態は、細胞捕獲領域を形成するために、流通断面積の変化を利用している。この変化は、堰タイプのトラップの形態とすることができる。流入経路８に対しての合流点において、主流通経路２は、２つの障壁（堰）１２，１２’を備えている。これら障壁は、流入経路の両サイドにおいて、主流通経路の底面１４に対しての直交方向に延在している。これら障壁は、主流通チャネルの上面１５にまでは届かないような高さとされている。これら障壁すなわち堰は、流入経路８内に導入された細胞が、細胞貯蔵所１３内に滞留する（拘束される、捕捉される）傾向を有するようにして、細胞貯蔵所１３を形成する。堰すなわち障壁の上流側において主流通経路内に導入された緩衝剤すなわち候補化合物は、障壁を乗り越えて流入し、滞留している（拘束されている）細胞１６に対して、相互作用を起こす。流通経路の形状変更のために堰すなわち障壁を使用することに代えて、主流通経路のうちの、流入経路８との合流箇所を、深くすることが考えられる。すなわち、実効的に細胞貯蔵所１３を形成するよう、主流通経路の底面１４を、流入経路の底面よりも下げることができる、あるいは、主流通経路の両側面を広げることができる。また、障壁すなわち堰１２の上方位置の上面１５に、あるいは、細胞貯蔵所のエッジに、細胞拘束力を付加することができる。このような細胞拘束力は、電気泳動法（文献６）において使用されているような電極によって誘起される電流の形態とすることができる。細胞貯蔵所を形成する障壁（堰）１２，１２’の変形例が、図４Ｃ、４Ｄに示されている。図４Ｃにおいては、堰は、流通経路の方向に沿ったチャネル１８を備えている。このようなチャネル１８は、横断面において三角形状とすることができる。下流側の堰１２’よりも下流側には、第２流入経路８’が設けられている。堰１２’の直後において流入経路８’を通して主流通経路内に、化学走性剤を導入することが考えられる。化学走性剤に対してリンパ球が反応することによって、リンパ球は、化学走性剤へと向けて、堰１２’のチャネル１８を通って移動する。方法論上記の微量流通デバイスは、詳細に後述するように、細胞に対しての化合物の効果を観測するために使用することができる。図１に示すように、観測されるべき特定の細胞を含有した溶液は、流入口６を介して第１流入経路８内へと導入される。候補化合物は、第２流入口６’を介して第２流入経路８’内へと導入される。双方の流入経路８，８’は、主流通経路２に対して流体連結されている（すなわち、流体の流通が可能であるようにして連結されている）。主流通経路に向けての、細胞の流れおよび候補化合物の流れが誘起される。細胞と候補化合物とは、第２流入経路８’と主流通経路２との合流箇所において、相互作用を起こすことができる。細胞に対しての候補化合物の効果は、検出領域１０において観測される。主流通経路２に対しての、第１流入経路および第２流入経路の合流の順序は、重要ではないことを理解されたい。細胞は、第２流入経路８’内に導入することもでき、候補化合物は、第１流入経路８内に導入することもできる。細胞および／または化合物が搬入された後に、微量流通デバイス内に流れが誘起される。好ましい方法においては、流通は、主流通経路２の流出口４に取り付けられたシリンジまたはシリンジポンプによって制御される。シリンジは、システム内に負圧を形成してこれにより流れを誘起するよう、抽気を行う。また、流通は、公知方法であるような電気や圧電素子によって、誘起することもできる。微量流通デバイスは、毛細管流通経路の内容物を観測可能であるような少なくとも１つの検出領域を備えている。細胞および候補化合物の流れは、１つの細胞または一群の細胞が、主流通経路と第２流入経路との間の合流箇所に流入したときには、停止させることができる。これにより、細胞に対しての候補化合物の効果を観測することができる。流通が停止されるあるいは中断される時間の長さは、細胞と化合物との間の反応時間の長さに依存する。流通が一時停止されることよって、細胞は、化合物に対して十分に反応することができる。これにより、細胞に起こった変化あるいは細胞機能に起こった変化を、観測することができる。そのような時間は、好ましくは、０．１秒〜６０分であり、より好ましくは、１秒〜１０分である。細胞が化合物に対して接触したときにそのような反応が起こった後には、あるいは、反応を起こし得るに十分な時間にわたって細胞と化合物とが混合された後には、細胞および化合物の流れが、再度誘起される。これにより、細胞が検出領域から流され、次なる細胞と候補化合物との観測が行われることとなる。微量流通デバイスは、図２に示すように、複数の流入経路を備えることができる。このようなデバイスにおいては、細胞および緩衝剤を、ある流入経路内に搬入し、候補化合物を、第２流入経路内に搬入し、第２化合物を、第３流入経路内に供給することができる。主流通経路内における流出口に向けての細胞および両化合物の流通が引き起こされ、細胞に対しての両化合物の効果が、検出領域内において観測される。第１化合物を抑制剤として、第２化合物を細胞機能の活性化剤とすることができる。好ましい方法においては、細胞および抑制剤は、主流通経路内において混合することができる。流通は、シリンジまたはシリンジポンプによって制御され、その結果、細胞と抑制剤とは、主流通経路を通して移動するにつれて混合される。その後、細胞／抑制剤からなる混合物は、第３流入経路との合流箇所において、活性化剤と接触する。この方法においては、また、ある流入経路に対して、負圧を印加することもできる。シリンジは、流入経路上に配置され、流出口のシリンジが抽出を行う。開放状態とされた流入経路（シリンジが取り付けられていない）は、より容易に流出口に向けて流通することとなる。これにより、流入経路の主流通経路に対しての制御された混合が可能とされる。候補化合物の細胞に対しての反応の観測を容易とするために、主流通経路に対して、反応剤を添加することができる。そのような反応剤としては、可視色素、蛍光色素、および、放射性色素、がある。これら色素は、候補化合物に反応することによって細胞により生成される成分に対して、直接的に反応することができる。これに代えて、そのような色素は、候補化合物に反応することによって細胞により生成される成分に対して結合する配位子または抗体に対して、共有的にまたは非共有的に結合することができる。放射性色素としては、³²Ｐ、¹²⁵Ｉ、および、³Ｈがある。蛍光色素としては、フルオレセイン、カルセイン−ＡＭ（cal cein-AM）、Fluo−３、Fura−２、Indo-１、Quin-２、および、Molecular Probe s社から入手可能な関連化合物がある。蛍光性ｐＨ指示剤としては、例えば、SNA FL、SNARF、および、関連するｐＨ指示剤といったような、化合物がある。細胞の生存力は、カルセイン−ＡＭ化合物を使用して測定することができる。ＤＮＡは、エチジウムホモダイマー（ethidium homodimer）を使用して、死んだ細胞内において検出することができる。流通経路の壁は、また、デバイス内への細胞および／または化合物の導入に先立って、コーティングすることができる。有効な化合物としては、胎児のふくらはぎの血清、ウシの血清アルブミン、研究される化合物に関連していないタンパク質、ゼラチン、または、卵白アルブミン、がある。好ましい実施形態においては、流通経路の壁上へのコーティングは、流通経路の壁の静電帯電を低減させるよう、静電的に中性である。好ましくは、胎児のふくらはぎの血清が、流通経路をコーティングするために使用される。例えばポリシロキサンまたはポリアクリルアミドまたはポリメチルメタクリレートといったようなポリマーコーティングを、また、デバイスの使用前に流通経路をコーティングするために、使用することもできる。本願発明によるデバイスは、細胞の活性化を示すこととなる白血球内での細胞間Ｃａ²⁺流の誘導を検査するために、使用することができる。活性化された白血球は、正常なまたは異常な免疫反応内に直接的に巻き込まれる。細胞間メッセンジャーＣａ²⁺が急激に増加することは、すべての細胞の活性化経路内における第２信号である。好中球と同様に、細胞質ゾルのないＣａ²⁺の濃度が１０倍に増加することは、活性化のキー信号をなす事象である。本発明による方法は、細胞機能に対しての作用薬または拮抗薬の効果を評価することが考えられる。Ｃａ²⁺の活性化を妨げる薬剤は、異常免疫反応を処置するに際して非常に重要である。非付着性リンパ球のＣａ²⁺チャネルの活性化に対しての効果を評価することによる、候補薬剤または初期薬剤のスクリーニングが、有効である。従来の薬物速度論研究を代替することなく、細胞による初期薬剤の結合または解放の運動学を決定できる可能性は、スクリーニングの初期段階において、付加的な高度に有益なデータをもたらす。Ｃａ²⁺流を測定するための分析においては、細胞と緩衝剤とが、例えばＦｌｕｏ−３といったようなカルシウム指示体（カルシウムインジケーター）とともに混合されて第１流入経路内に供給され、活性化剤が、第２流入経路内に供給され、そして、細胞および活性化剤の流通が引き起こされる。この流通は、主流通経路と第２流入経路との間の合流箇所において、１つまたは複数の細胞が活性化剤と混合されたときに、停止される。そして、検出領域においてＣａ²⁺流が測定される。本発明によるデバイスは、また、下流に対しての初期抑制剤の評価を行うためにも使用することができる。第１流入経路に細胞を供給するよりも前に、初期抑制剤を、細胞、緩衝剤、および、カルシウム指示体と混合しておくことができる。活性化剤が第２流入経路内に供給され、そして、細胞および活性化剤の流通が引き起こされる。この流通は、主流通経路と第２流入経路との間の合流箇所において、１つまたは複数の細胞が活性化剤と混合されたときに、停止される。そして、検出領域においてＣａ²⁺流が測定される。また、３つの流入経路を備えたデバイスを使用することも考えられる。細胞と緩衝剤とが、例えばＦｌｕｏ−３といったようなカルシウム指示体とともに混合されて第１流入経路内に供給され、初期抑制剤が、第２流入経路内に供給され、そして、流通が引き起こされて、これにより、抑制剤と細胞とが混合される。細胞が抑制剤に対して反応するのに十分な時間にわたって流通を停止することができる。活性化剤が、第３流入経路に供給され、そして、細胞および活性化剤の流通が引き起こされる。この流通は、主流通経路と第３流入経路との間の合流箇所において、１つまたは複数の細胞が活性化剤と混合されたときに、停止される。そして、検出領域においてＣａ²⁺流が測定される。本方法は、また、細胞の酸化性破裂を研究するためにも使用することができる。刺激された顆粒球内に存在するＮＡＤＰＨオキシダーゼ酵素は、過酸化アニオンＯ₂ ^-を生成するような多要素酵素反応経路内に関与している。酸化性破裂は、白血球の重要な殺菌特性である。しかしながら、病的異常状態においては、このような酸化性破裂は、組織破壊に寄与する可能性がある。酵素反応経路は、バクテリア全般、ホルボールエステル、ｆＭＬＰ（ホルミルメチオニン−ロイキン− フェニルアラニン、formyl methionine-leucine-phenylalanine）化学走性ペプチド、および、様々なサイトカインといったような、多数の拮抗剤によって活性化することができる。Ｏ₂ ^-の生成は、Ｃａ²⁺流の測定に関して上述した方法と同様の方法によって、酸化剤に敏感な蛍光性色素であるジヒドロロダミン１２３を使用して測定することができる。本発明による方法は、また、付着性マトリクスに対しての白血球のローリングを研究するためにも使用することができる。内皮に対しての（内皮上における）白血球のローリングは、組織を通っての細胞移動における第１事象として、また、関節炎のような自己免疫性疾病におけるキー現象として、認識される。細胞のローリングの主要現象の抑制、すなわち、セレクチンと配位子との相互作用の抑制は、多数の生物学的に重要な事象を阻止すべきである。本発明による方法においては、高純度とされた細胞付着性分子が、主流通経路内に導入され、そして、主流通経路を下流方向へと検出領域を通過して流れるような細胞付着性分子の流れが、引き起こされる。これにより、細胞付着性分子は、検出領域において主流通経路の壁に対して付着することができる。白血球が第１流入経路内に導入され、主流通経路内へと流入される。吸着されている細胞付着性分子に対して曝されることにより、検出領域において、白血球のローリングが観測される。白血球に対して、ローリングの抑制剤および活性化剤を混合することができる。このような混合物は、本発明のデバイス内へと第２流入経路から導入され、白血球のローリングに対してのこれら抑制剤または活性化剤の効果を、検出領域において観測することができる。デバイスの主流通経路の断面寸法が３０μｍ〜５００μｍである場合にはより好ましくは５０μｍ〜３００μｍである場合には、第１および第２流入経路からの細胞は、即座に混合することがなく、一群の細胞のローリング特性に対しての抑制剤または活性化剤の効果を観測することができ、主流通経路内の細胞を制御することができる。これに代えて、本方法において図３のデバイスを使用すれば、様々な細胞付着性分子、様々な抑制剤、および、様々な活性化剤の、様々な細胞に対しての効果を同時に観測することができる。さらに、本発明によるデバイスは、第１流入経路と第２流入経路との間に、主流通経路へと連接された第３流入経路を備えることができる。第３流入経路内には、緩衝剤を導入することができ、これにより、主流通経路内において、第１流入経路からくる細胞と、第２流入経路からくる細胞と、を分離することができる。第３流入経路の断面寸法は、好ましくは５μｍ〜５００μｍであり、より好ましくは３０μｍ〜６０μｍである。本発明は、細胞に対しての化合物の効果を研究するための現在利用可能な方法に対し、いくつかの利点を有している。現在、カルシウム流の生物検定は、微量滴定プレート上においてまたはキュベット混合によって行われている。白血球のローリングに関しての生体検定は、動物内においてまたは大きなローリングチャンバ内において行われている。本発明においては、生体細胞に対しての研究対象化合物の効果を、リアルタイムで観測することができる。微量流通デバイスのサイズにより、物理的に研究することができる化合物の数を増加させることができる。本発明による方法であると、必要とされる試料化合物の量が少なくて済み、個々の細胞のまたは少量の細胞の取扱いを容易に行うことができる。本発明をその利点をさらに説明するために、例示のためのものであって本発明を制限するためのものではない特定の実施形態について、以下、例示する。実験例実験例Ｉ−マイクロチップデバイスの作製改良されたシリコン微小機械加工技術（文献７）を使用して、アルバータマイクロエレクトロニクスセンターにおいて、ガラス基体（３インチ×３インチ）が形成された。基体は、６００μｍ厚さの０２１１ガラスプレート（Corning Glas s Works，Corning，NY）である。ガラスプレート上において、１５μｍ深さのまたは３０μｍ深さのチャネルがエッチングされた。チャネルの長さおよび幅は、図５Ａおよび図５Ｂに示されている。外部からのアクセスのための孔が開けられたカバープレートが、以下のような温度プログラムでもって、エッチング済みのプレートに対して熱的に融着された。この場合の温度プログラムは、４４０℃で０．５ｈ、４７３℃で０．５ｈ、６０５℃で６ｈ、４７３℃で０．５ｈ、その後一晩かけて冷却する、というものであった。エポキシ樹脂を使用して孔の回りに接着された小さなプラスチック製滴定チューブが、試料溶液または緩衝剤溶液を収容するためのデバイス貯蔵器として使用された。Ｐｔワイヤが、電気コンタクトのために挿入された。AquaSil（Piece，Rockfield，IL）を使用して、いくつかのチップが、内面コーティングされた。１％の水性溶液が、シリンジを使用してチャネル内へと導入され、真空下において除去され、その後、一晩放置された。プレートどうしの接着に先立って、双方のプレートが、MicroAutomation社の２０６６型高圧クリーニングステーションを使用して、クラス１００のクリーンフード内において圧力洗浄された。２つのプレートは、コンタクト前には位置合わせされた。コンタクト後には、すべての巻込エアを追い出すよう、十分な圧力が印加された。干渉縞がないことにより、良好なコンタクトが確認された。微小汚染物質が存在すれば、その回りにニュートンリングが見られることとなる。このような場合には、汚染物質の除去を行って、ウェハが再クリーニングされた。このクリーニング方法は、パイレックスウェハに対しても適用された。その場合、結合性欠陥が少ないことにより、ただ１回の結合サイクルだけが必要とされた。実験例II−マイクロチップ内における電気泳動の移動度緩衝剤溶液および反応剤各４０ｍＭずつのＮａ₂ＨＰＯ₄およびＫＨ₂ＰＯ₄（ＢＤＨ分析グレード）からなるリン酸塩緩衝剤が、ＮａＯＨまたはＨＣｌを利用してｐＨ７．４に調整され、イヌの赤血球に対しての等浸透性緩衝剤として使用された。（イヌの血漿内におけるＮａ^-およびＫ^-の血漿濃度は、それぞれ、９４ｍＭおよび６ｍＭである（文献８，９）。対抗イオンとして１価アニオンを仮定すれば、２００ｍＭというオスモル濃度が与えられ、準備された緩衝剤のそれと等しい。）低浸透性の溶媒として脱イオン水が使用されて、イーストまたは大腸菌の細胞懸濁液が準備された、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、Serva、分析グレード）が、脱イオン水中において３ｍＭ（０．１ｗｔ％）として、準備された。他の化学薬品は、反応剤グレードであり、それ以上の高純度化を要することなく使用された。細胞試料健康なイヌの赤血球は、Heritage医療研究センター（Edmonton,AB,Canada）から得られた。血液試料は、抗凝固剤としてＥＤＴＡを使用して収集された。血液試料は、遠心分離によって、様々な血液成分へと分離された。血漿および軟膜（パフィコート）を除去した後に、赤血球が、細胞ペレットとして分離された。赤血球の貯蔵後生存性を増強するためにヒトの血液全体として貯蔵するために使用されるクエン酸塩−リン酸塩−ブドウ糖溶液（ＣＰＤ溶液、文献９）が、ＫＣｌおよびＮａＣｌをを添加することによって、イヌの細胞を取り扱うためにまた貯蔵するために使用された。溶液は、２．５ｍＭのブドウ糖、１．６ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．２８ｍＭのクエン酸、０．１５ｍＭのＮａ₂ＨＰＯ₄、９４ｍＭのＮａＣｌ、および、６．０ｍＭのＫＣｌを含有している。５％のヘマトクリットの赤血球懸濁液が使用された。細胞は、貯蔵緩衝剤を取り除くために、Sany o社製のNSE MicroCentaur遠心分離器を使用して、等浸透性のリン酸塩緩衝剤によって複数回にわたって洗浄された。タイプIIの製パン用イースト（Saccharomyces cerevisiae）は、Sigma（Milwa ukee,WI）から得られた。大腸菌（非病原性菌株、BlueScript）は、アルバータ大学のRenewable ResoucesのＤ．Ｋｈａｓａ氏から寄贈された。特に断らない限り、イースト細胞は、１ｍｌあたり１０⁸個であり、大腸菌細胞は、１ｍｌあたり３×１０⁸個であった。図５Ａおよび図５Ｂは、この実験のために使用されたデバイス構成の概略を示している。双方のデバイスは、「タブルＴ」構造を使用している。この構造は、形状によって決定された、溶液に対してのプラグの形成を可能とする（文献１，１１，１２）。各貯蔵器に対して電圧が印加され、４つの合流チャネル内における溶媒流が引き起こされた。イースト細胞の搬送に対する実験は、図５Ａに示すようなＣＯＰＩデバイスを使用して行われた。イースト細胞の搬入時には、試料貯蔵器（Ｓ）が＋１００Ｖとされるとともに、試料廃棄物貯蔵器（ＳＷ）が接地された（０Ｖとされた）。注入時には、緩衝剤貯蔵器（Ｂ）が−５００Ｖにセットされ、Ｓ貯蔵器およびＳＷ貯蔵器が共に＋４５０Ｖとされ、緩衝剤廃棄物（ＢＷ）貯蔵器が接地された。大腸菌細胞の搬送に対する実験は、図５Ｂに示すようなＰＣＲＤ２デバイスにおけるＹ字形合流点において行われた。細胞は、ＢＷ１貯蔵器を接地電位として搬入された。そのとき、ＢＷ２貯蔵器は、−２００Ｖであった。他の貯蔵器（Ｂ、Ｓ、および、ＳＷ）の電位は、初期的には、浮遊電位である。流通方向を制御するために、ＢＷ２貯蔵器とＳＷ貯蔵器との間に、−２００Ｖが交互に印加された。他の貯蔵器は、浮遊電位のままとされた。視覚的な細胞破壊実験は、ＣＯＰＩデバイス（図５Ａ）内において行われた。赤血球を含有したＢ貯蔵器と、３ｍＭのＳＤＳを含有したＳ貯蔵器とが、共に＋１５０Ｖとされ、ＳＷ貯蔵器が接地された。ＢＷ貯蔵器は、浮遊電位である。ＰＭＴ検出を使用した細胞破壊実験に対しては、ＰＣＲＤ２デバイス（図５Ｂ）が使用された。細胞は、４００Ｖの電圧が印加されたＳ貯蔵器内へと搬入された。ＳＷ貯蔵器が接地電位とされた。３ｍＭのＳＤＳ溶液は、Ｂ貯蔵器内に搬入された。細胞破壊時には、Ｓ貯蔵器とＢ貯蔵器との双方に４００Ｖが印加された。破壊は、Ｂ貯蔵器を浮遊電位としたまま終了された。他の貯蔵器ＢＷ１およびＢＷ２は、常に浮遊電位のままとされた。観測は、ＪＶＣ製ビデオカメラ（ＴＫ−１２８０）を備えたオリンパス社製顕微鏡（ＢＨ−２）を使用して行われた。像は、まず最初に、ＪＶＣ製Ｓ−ビデオカセットレコーダ（ＨＲ−Ｓ７２００Ｕ）を使用して記録され、その後、コンピュータアイズ／１０２４フレーム獲得基板を使用して獲得され、Cordonics社製ＮＰ１６００写真プリンタを使用してプリントされた。これに代えて、誘起された光散乱を介して細胞の通過を検出するために、顕微鏡上に光増倍管（ＰＭＴ）を配置したアダプタを使用することができる。ＰＭＴの視野を制限するために、直径１０μｍのピンホールが使用される。デバイスの貯蔵器に対して電圧を印加するための、また、ＰＭＴ信号を記録するための、コンピュータ制御システムについては、既に開示がなされている（文献７，１３）。研究された３つのタイプの細胞は、サイズおよび形状が全く異なっている。すなわち、パン用イーストは、球状に閉塞しているとともに、直径が約５μｍであり；使用された大腸菌菌株は、管状であって、サブミクロン〜約２μｍという範囲の長さであり；イヌの赤血球は、直径が８μｍであるとともに厚さが２μｍである（文献９，１４，１５）。これらのタイプの細胞は、すべて負に帯電しており（文献９，１４，１５）、そのため、電界中においては、電気泳動効果によって陽極へと移動する。しかしながら、コーティングされていないガラスチップにおいては、電気浸透流に基づく溶媒移動度は、細胞の電気泳動移動度よりも大きい。その結果、細胞の正味の流通方向は、生理学的ｐＨ値近傍においては、陰極へと向かう。イースト細胞に対しては１ｋＶ／ｃｍという程度の（文献１６）、ヒトの赤血球に対しては２〜４ｋＶ／ｃｍという程度の（文献１７，１８，１９）、イースト細胞に対しては５〜１０ｋＶ／ｃｍという程度の（文献２０）電界が使用されて、電気穿孔法によってこれらのタイプのセル内にＤＮＡや他の標識物質を導入すれた。このような大きさの電界は、膜の浸透を引き起こすことはあったものの、細胞の破壊を引き起こすことはなかった。６００Ｖ／ｃｍよりも小さなより典型的には１００Ｖ／ｃｍよりも小さな電界が、使用された。そのため、破壊が起こることはない。しかしながら、電極の二重層領域内に直接的に位置した少数の細胞は、貯蔵器内において駆動ポテンシャルを担うために使用され、破壊された。電気浸透流が電気力線に従うことにより、試料貯蔵器と試料廃棄物貯蔵器との間に対しての電位差印加によって、細胞は、ダブルＴ構造の合流箇所のコーナー部を通り抜けることができ、主チャネルの軸に沿って細胞のプラグを形成することができる。図６Ａによって、直接的な細胞搬送のためのこのようなバルブレス制御方式がうまく機能することを、確認することができる。１００Ｖという電圧（ダブルＴ領域においては６０Ｖ／ｃｍという電界強度に相当）は、０．１８±０．０２ｍｍ／ｓという平均速度でもってダブルＴを通り抜けるような、イースト細胞の流れを生成する。合流箇所において定常状態としてイースト細胞のプラグが形成された後には、電圧を緩衝剤貯蔵器と緩衝剤廃棄物貯蔵器との間に切り換えることにより、主チャネルに対してそのプラグを注入することができる。図６Ｂは、６個の細胞から構成されているこのようにして形成されたパケットを示しており、パケットは、主チャネルに沿って移動し始めている。Ｂ貯蔵器の電位を５００ＶとしかつＳおよびＳＷの電位を共に４５０Ｖとすれば、主チャネル内の電界が６０Ｖ／ｃｍとなり、速度が０．１６±０．０２ｍｍ／ｓとなる。注入合流箇所における電位を約４５５Ｖとすれば、極性に基づいて、注入時における試料貯蔵器および試料廃棄物貯蔵器内に対しての後方拡散流が得られ、細胞パケットの形成が補助される。１６０Ｖ／ｃｍ以上の電界を印加すれば、イースト細胞の速度を０．４９±０．０８ｍｍ／ｓとすることができる。図６Ｃは、流通方向の制御のために電界を使用した場合の、ＰＣＲＤ２デバイスのＹ字形合流箇所における大腸菌細胞の操作例を示している。細胞の平均速度は、３５Ｖ／ｃｍにおいては０．０５４±０．００５ｍｍ／ｓであり、１４０Ｖ／ｃｍにおいては０．２８±０．０５ｍｍ／ｓであった。高電界は、細胞破壊を引き起こすことなく、より大きな流速をもたらす。ただし、カメラの解像度が細胞の高速移動に追従しきれないことにより、詳細には検討していない。流通方向は、Ｙ字形の１つの枝の電位を浮遊電位とした状態で残りの２つの枝どうしの間で負電位を切り換えることによって、Ｙ字形のその２つの枝間において容易に切り換えることできる。電圧が他方の枝に印加されたときには、浮遊チャネル内の細胞は、静止状態のままである。流通発生および流通方向制御は、赤血球に対しては、ダブルＴ構成であってもＹ合流構成であっても可能であった。等浸透性緩衝剤溶液内においては、赤血球の速度は、９０Ｖ／ｃｍにおいては０．０５８±０．００７ｍｍ／ｓであった。１３７ｍＭのＮａＣｌおよび２．７ｍＭのＫＣｌ、４．２ｍＭのＮａ₂ＨＰＯ₄および１．４ｍＭのＫＨ₂ＰＯ₄、および、１．１ｍＭのブドウ糖を含有した別の緩衝剤中での実験では、例えば１４０Ｖ／ｃｍにおいては０．５５±０．０９ｍｍ／ｓといったような、より速い速度が得られた。表面コーティング細胞は、毛細管の壁に対して付着するという傾向を有している。イースト細胞および大腸菌細胞に関する最初の実験においては、それぞれ、４×１０⁸／ｍＬおよび１３×１０⁸／ｍＬという濃度で行われた。これら細胞は、毛細管壁に対しての付着性を有している。濃度を、イースト細胞および大腸菌細胞に対してそれぞれ１×１０⁸／ｍＬおよび３×１０⁸／ｍＬにまで下げると、実質的にそのような問題点が除去された。１５μｍ×５５μｍという断面積のデバイスであると、断面積がおよそ３０μｍ×７０μｍのチャネルを有したデバイスの場合よりも、イースト細胞および赤血球細胞の粘着性が少なくなることがわかった。しかしながら、すべてのデバイスにおいて、チャネルに連接した溶媒貯蔵器内においてイースト細胞および赤血球細胞の固着が存在する。このことは、チップチャネル内における細胞濃度が、貯蔵器内に搬入した濃度と必ずしも同じとはならないことを意味する。それでもなお、試料貯蔵器の細胞懸濁液を交換しなくても、数時間であれば、実験を行うことができる。市販のトリクロロヘキサデシルシラン剤でもって毛細管の壁を処理することにより壁を疎水性とすることによっても、細胞吸着の問題を低減させることができる。このコーティングは、実質的に電気浸透流を低減させ、その結果、等浸透性溶液中の赤血球は、陽極に向けての正味の移動を示す。それでもなお、十分な残留電荷が、チャネル壁上には残っている。この残留電荷のために、イースト細胞または大腸菌細胞の場合に使用される蒸留水の場合には、電気浸透流は、陰極に向けての正味の移動を示す。イヌの赤血球の破壊所定部位への搬送後における細胞の反応を示すために、洗浄による赤血球の破壊（溶血）を含むような簡単な実験が、行われた。この反応は、合流点において破壊剤を含む他の流れに対して細胞流が混合された後に、起こる。陰イオン性の破壊剤であるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が、チップ内における流れの中で破壊プロセスが起こるほど十分に迅速に細胞を破壊すること、がわかった。ＳＤＳが電気浸透流の流速を変えるけれども、溶媒流の方向は、陰極に向かったままである。そのため、残っている流れは、同様に振る舞う。赤血球の破壊を研究するために、わずかに異なる２つの実験が行われた。１つの研究においては、光増倍管（「ＰＭＴ」）検出器が、図５Ｂに示すＰＣＲＤ２デバイスのダブルＴ近傍における混合箇所よりも下流位置に配置された。４００Ｖという電位が、脱イオン水中に３ｍＭのＳＤＳ溶液を含有した破壊剤を収容しているＢ貯蔵器に対して周期的に接続された。上記電位は、細胞貯蔵器だけが連結されているときには、合流箇所と検出点との間に３８０Ｖ／ｃｍという電界強度をもたらした。細胞チャネルとＳＤＳチャネルとの双方が連結されているときには、５２０Ｖ／ｃｍという電界強度が存在した。細胞破壊反応は、混合点から２．５ｍｍ下流側位置における赤血球からの散乱光の変化による測定（蛍光外顕微鏡が使用された）によって観測された。流通している細胞の流れに対してＳＤＳが混合されるにつれて、信号が小さくなり、ＳＤＳ流を停止させた後には、原状へと復帰した。信号は、検出容積内の細胞数が時間的に離散的に変化することに基づいて、細胞の存在下では変動する。この実験は、要望に応じて破壊反応の発生を制御するための赤血球バルブ作用の可能性を示しており、また、チップ上での細胞の化学反応の可能性を示している。第２の実験においては、細胞は、緩衝剤貯蔵器内に搬入された。試料貯蔵器内には、３ｍＭのＳＤＳが存在している。双方の貯蔵器が１５０Ｖとされた。試料廃棄物貯蔵器が接地電位とされ、これにより、細胞流とＳＤＳ流とが定常的に引き起こされた。細胞流とＳＤＳ流とは、ダブルＴ領域において混合され、試料廃棄物貯蔵器に向けてコーナー部を移動する（１３０Ｖ／ｃｍにおいて細胞速度が約０．０５８±０．００７ｍｍ／ｓ）。図１０Ａは、細胞が左側から流入し、上方から流入するＳＤＳと混合することを示している。図１０Ｂにおいては、符号１，４が付された２つの細胞が、ＳＤＳとの反応を開始し壊れかけている。ＳＤＳは、チャネル全体にわたって拡散していない。そのため、壁に沿っている細胞２，３に対しては、目視検査の限りでは、まだ接触していない。図１０Ｃは、細胞１だけが観測領域外へと搬送され、他の３つの細胞が、破壊されたことを示している。実験例III−カルシウム流の分析カルシウム流は、主要細胞機能に関与しており、リンパ球のレスポンスに関与している。この分析においては、リンパ球内へと向かうカルシウムイオンの流れが、カルシウム解放剤であるカルシマイシン（calcimycin、Ａ２３１８７、カルシウムイオン透過担体）によって引き起こされる。細胞間のカルシウム自由イオンの濃度の増大は、蛍光剤によって前処理された細胞からの蛍光信号の増大化をもたらす。カルシウム流の運動結果は、微量流通デバイス内において、流通停止法によって研究することができる。カルシウム流のプロセスの研究には、いくつかのステップがある。まず最初に、活性化剤と、カルシマイシン（Ａ２３１８７、カルシウムイオン透過担体）と、カルシウムイオン錯体とが、細胞表面上に吸着されなければならない。第２に、錯体が、細胞膜を通過して拡散しなければならない。第３に、細胞質ゾル内において、Ａ１３２８７とカルシウムイオンとの間において解離が起こらなければならない。最後に、蛍光剤であるFluo-3 AMが、解放されたカルシウムと共に錯体を形成して、検出可能な光（蛍光）を放射する。反応剤および化学薬品フェノールレッド組織培地のないＲＰＭＩ１６４０、および、Delbeccoのリン酸塩緩衝剤食塩水（「ＰＢＳ」）は、Gibco BRL（Burlington,Ontario,Canada）から得られた。長波長細胞質ゾルカルシウム指示体であるFluo-3 AMと、非イオン性洗浄剤であるPLURONIC F-127と、カルシウムイオン透過担体Ａ２３１８７自由酸（calcimycin）とは、Molecular Probes（Eugene，Oregon）から得られた。ヒトの血清アルブミン（ＨＳＡ）は、Bayer Corp．(Kankakee,Illinois)から得られた。LYMPHOLYTE-polyは、Cedarlane（Hornby，Ontario，Canada）から得られた。ベラパミル、メフェナム酸、胎児のふくらはぎの血清（ＦＣＳ）、Ｄ−（＋）−グルコース、Ｎ−２−ヒドロキシエチルビペラジンＮ’−２−エタンサルフォリックアシッド（ヘペス、HEPES）、および、エチレンジアミンテトラアセティックアシッド（ＥＤＴＡ）といったような、すべての他の化学薬品は、Sigma Chemical Co．(Oakville，Ontario，Canada)から得られた。ヒトのリンパ球の調製および標識化（ラベリング、labeling）カルシウム流の測定のために、カルシウムに特定の蛍光物質であるFluo-3 AM （Molecular Proves）が、アセトキシメチル（ＡＭ）エステルとして、高純化されたヒトのリンパ球内に予め搬入された。健康な提供者の静脈血からのヒトのリンパ球が、Ｂｏｙｕｍ氏によって開示されているように（文献２２）Lympholyte-poly勾配遠心分離によって、分離された。単核細胞の分離後に、細胞ペレットをＰＢＳ／３ｍＭのＥＤＴＡ／１％のＨＳＡ内に再懸濁させて８００ｒｐｍでもって１２分間にわたって遠心分離することにより、残りの血小板が細胞懸濁液から除去された。細胞が、上記手続によって３回洗浄された。高純化されたリンパ球ペレットは、カルシウムのない５．０ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝剤（５ｍＭのＫＣｌ、１４５ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＮａ₂ＨＰＯ₄、０．５ｍＭのグルコース、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨが７．４）中に再懸濁された。 Fluo-3 AM溶液からなる１０μｌの試料が、カルシウムのない５．０ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝剤内に希釈された。５．０ｍｌのリンパ球溶液が、５．０ｍｌのFl uo-3 AH溶液に対して混合され、これにより、２μＭのリンパ球−Fluo-3 AM標識溶液が形成された。リンパ球は、血液ミキサーによって、室温で６０分間培養された。このようなFluo-3 AMによる標識化手法は、Ｈａｇａｒ氏他によって開示されたもの（文献２１）と同様である。リンパ球の標識化の後には、細胞が、カルシウムのないＨＥＰＥＳ緩衝剤によって３回洗浄された。標識化されたリンパ球は、フェノールレッド媒質のないＲＰＭＩ１６４０内において１×１０⁷個／ｍｌの濃度で懸濁され、使用されるまでは２２℃で保管された。混合時間の決定図７Ａにおける場所Ｂにおける混合時間を決定するために、色素であるベンガルローズ（５ｍＭ）が、実験例１に記載した方法によって形成されたＰＣＲＤ１（図８）の活性化チャネル（符号４）内に、導入された。この流れは層流であって、この流速においては、移行時間中における緩衝剤内への色素の拡散は起こらない。流通停止後において、図７Ｂは、０．２秒後における緩衝剤内への色素拡散の程度を示している。約０．４秒後においては、ＣＣＤ検出器に対しては、勾配は、一切見られなかった。単純な拡散推定によると、一様な混合は、１秒以内に起こるであろうことが示された。このことは、１秒よりも遅いような個々の細胞プロセスの運動学の研究を、可能とする。微量流通システムの作製使用前には、フェノールレッド媒質のないＲＰＭＩ１６４０中における５％の胎児のふくらはぎの血清（ＦＣＳ）（Gibco BRL，Burlington，Ontario，Canada ）によって、細胞媒質内が充填され、および／または、３０分間にわたって微量流通システム全体が洗浄された。ＦＣＳによってコーティングされたチャネルにおいては、電気浸透流が大幅に低減される。よって、ステップ式流通方法に対しては、シリンジ吸入によって負圧が印加された動的流通システムが、使用された。微量流通システムの使用図８および図９は、実験例１に記載した方法によって形成されたポストカラム（post column）デバイスの構成を示している。図８においては、緩衝剤がチャネル＃１，＃２に対して供給され、上述のようにして調製されたリンパ球がチャネル＃３に対して供給され、活性化剤Ａ２３１８７がチャネル＃４に対して供給される。溶媒流は、ガラスシリンジによって手動で行われた廃棄物流出口のところにおける吸込操作（負圧形成）によって、引き起こされる。負圧は、４つすべての流入用貯蔵器から、溶液を吸引する。この場合、活性化剤貯蔵器からは、組み合わされている他の３つの貯蔵器と比較して、適切にバランスのとれた程度の量を吸引する。２５倍の対物レンズとＣＣＤカメラとを備えている蛍光顕微鏡が、検出領域をなす図８における位置Ｂ上に配置された。これにより、細胞が検出領域を通過する際の細胞の様子を観測することができる。デバイスは、ただ１つの細胞が観測のために検出領域内に流入したときには流通が停止されるという、流通停止モードで操作された。流通を停止することにより、２つの未混合物どうしを合流箇所において互いに拡散させることができ、すなわち、主流通経路と活性化剤流通経路とからの２つの未混合物どうしを合流箇所において互いに拡散させることができ、添加された活性化剤に基づく細胞反応を開始させることができる。４秒後には、混合箇所において、リンパ球は、Ａ２３１８７による活性化に基づくカルシウム流によって引き起こされた蛍光を示した。非活性化カルシウムチャネルから活性化カルシウムチャネルへの発光の増加は、細胞のタイプおよび方法に依存して２倍〜４０倍となることが以前から報告されている。観測された蛍光の増加は、典型的には、５〜１０倍の程度であった。ヒトのリンパ球に対してのカルシウム流の動きは、図１１に示されている。抑制剤貯蔵器内の溶液は、非抑制型の制御実験においては、緩衝剤へと置き換えられた。これに代えて、プロセスの応用性を拡大するために、活性化剤貯蔵器（チャネル＃４）上に、あるいは、緩衝剤貯蔵器（チャネル＃１）上に、第２シリンジを配置することができる。その場合には、これらチャネルからの流出を防止できるとともに、ポイント「Ｂ」までの細胞搬送は行われる。これにより、制御された実験を行うことができる。２本のシリンジによる制御方式が、チップ上のポイント「Ｂ」においてベンガルローズ色素を使用することにより、調べられた。図８において、緩衝剤が流通経路＃１，＃２，＃３に対して供給され、ベンガルローズ色素が流通経路＃４に対して供給された。２本のシリンジが、「廃棄物」経路と、流通経路＃４と、に配置された。背圧または流速を変化させることにより、色素０％流から色素１００％流までにわたって流通を制御することができた。しかしながら、チャネル内における「流通停止」を確実に行うためには、その「流通停止」チャネル内へのわずかの逆流（後方拡散流）が、必要とされた。実験例IV−リンパ球抑制剤によるカルシウム流入分析微量流通デバイスとヒトのリンパ球とが、実験例IIIのようにして準備された。図８において、抑制剤である１００μＭのベラパミルが、チャネル＃１に導入され；緩衝剤が、チャネル＃２に導入され；リンパ球が、チャネル＃３に導入され；カルシウム活性化剤Ａ２３１８７が、チャネル＃４に導入された。デバイスは、実験例IIIのようにして運転された。ベラパミルは、デバイスのポイント「Ａ」合流点においてリンパ球に対して供給された。リンパ球は、４分間にわたってベラパミルと共に混合されつつ、混合点「Ｂ」に向けて主チャネル内を搬送された。ベラパミルによって処理されたリンパ球は、蛍光を示さないことが観測された。したがって、ベラパミルがヒトのリンパ球に対してカルシウム流の活性化を大幅に低減させていることが、確認された。この実験例は、２０個の個別のリンパ球に対して行われ、各々が同等の結果を示した。ベラパミルによる抑制は、時間依存的であった。例えば、混合チャネル内でのリンパ球とベラパミルとの混合時間が３０秒間の場合には、抑制効果が得られなかった。実験例V−酸化性破裂過酸化アニオンＯ₂-の生成は、酸化剤感応性蛍光色素であるジヒドロロダミン１２３（Molecular Probes）を使用して測定することができる。顆粒球が、２μ Ｍのジヒドロロダミン１２３の存在下において、３７℃で２０分間放置された。標識化された細胞は、その後、洗浄されてＰＢＳ内に再懸濁された。これら細胞は、その後、実験例IIIに記載したような微量流通デバイスを使用して、酸化破裂反応経路の誘起実験に供された。流通停止手法を使用して、単一の顆粒球がｆＭＬＰといったような活性化剤と混合され、蛍光の誘起が観測された。蛍光をベースとした分析と同様のタイプのものとして、細胞間のｐＨ変化を誘起するような作用薬があり、プログラムされた細胞の壊死を研究することができる。実験例VI−堰デバイスマウスのリンパ球（５×１０⁷）が、チップ内においてＰＢＳによって洗浄された。微量流通デバイス内において２つの堰デバイスが使用された。最初のデバイスにおける堰間距離は、１μｍとされ、第２のデバイスにおける堰間距離は、３μｍとされた。シリンジによって圧力を印加することにより、流通が引き起こされた。双方のデバイスにおいて、リンパ球は堰を超えて移動した。細胞が堰に到達したときには、細胞は、液体が通る面積のすべてを占有した。これにより、流体流通を低減させるような有効なプラグが形成される。その場合、細胞移動を再開させるには、より大きな圧力が必要とされた。これにより、細胞は、堰を乗り越えて移動した。図４Ａおよび図４Ｂは、ガラスにおいて２つのマスクプロセスを使用して形成されるような、物理的な細胞拘束原理として堰を採用したデバイスを、概略的に示している。単一の細胞のカルシウム摂取のおよびカルシウム放出という動きは、これら構造に従うことができる。実験例VII−微量流通デバイスのチャネルを選択するためのセレクチン結合この実験例は、セレクチンが、本発明によるデバイスにおける特定の流通経路に対して結合できることを示すものである。図８（ＰＣＲＤ１）および図５Ｂ（ＰＣＲＤ２）に示すような微量流体流通経路は、まず最初に、真空とされ、流通経路内に固着していて閉塞を起こしかねないようなダストや粒子が除去された。濾過されたDulbeccoのリン酸塩緩衝剤食塩水（ＰＢＳ）（Gibco）が、流通経路に供給され、室温で３０分間にわたって真空洗浄された。マイクロチップの洗浄後には、流通経路がエアバブルに対してチェックされた。真空を継続することにより、エアバブルが、流通経路から除去された。各実験において、微量流通デバイスは、流通経路内をセレクチンを流通させるときには、３７℃で２時間放置された。放置期間の後に、流通経路は、真空下で１０分間にわたってＰＢＳでもって洗浄された。その後、１０分の１に希釈された１００μｌのマウスの単一クローンの一次抗体（anti-PあるいはＥ−セレクチン）が、予め結合されたセレクチンに対して結合するよう供給された。一次抗体は、１．０時間にわたって背圧でもって流通経路から除去された。一次抗体の放置後に、流通経路が、ＰＢＳでもって洗浄された。その後、１０分の１に希釈された１００μｌの、フルオロセイン（Pierce）によって標識化された二次抗体（ヤギのＦ（ａｂ’）₂抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ））が、流通経路に対して供給された。二次抗体は、３７℃で１５〜３０分間にわたって流通経路内において真空洗浄された。二次抗体の放置後には、流通経路が、再度、ＰＢＳでもって洗浄された。これと共に、顕微鏡下において、セレクチンが結合した流通経路が可視化された。結合しなかった蛍光性二次抗体が洗い流された後に、結合した二次抗体が、チャネル壁上において可視化され、対応したセレクチンがチャネル壁に結合していることを示した。最初の実験においては、高純化されたセレクチン（ＰまたはＥ）が、ＰＣＲＤ１（図８）の廃棄物流出口に添加され；シリンジが、流入経路＃４上に配置されて、セレクチンが、流入口＃４へと引っ張られた。一次抗体が、廃棄物流出口に添加され、シリンジが、流入経路＃２上に配置されて、一次抗体が、流入口＃２へと引っ張られた。最後に、二次抗体が、流入口＃１，＃２，＃３，＃４に添加され、シリンジが、廃棄物流出口上に配置されて、二次抗体が、廃棄物流出口へと引っ張られた。廃棄物チャネルにおいてのみ、蛍光が観測された。第２の実験においては、セレクチンを含有したメンブラン抽出物が、流入経路＃１，＃２に添加され、胎児のふくらはぎの漿液が、流入経路＃３に添加された。シリンジが廃棄物流出口上に配置され、セレクチンと胎児ふくらはぎ漿掖とが、廃棄物流出口へと引っ張られた。一次抗体が、流入経路＃１，＃２，＃３，＃４に添加され、シリンジが、廃棄物流出口上に配置されて、吸引が行われた。二次抗体が、流入口＃１，＃２，＃３，＃４に添加され、シリンジが、廃棄物流出口上に配置されて、吸引が行われた。蛍光は、経路＃１，＃２において観測されたものの、経路＃３，＃４においては観測されなかった。このことは、セレクチンをどの流通経路に対しても結合させることができることを示しており、また、流通経路上においてセレクチンを結合させる特定領域を制御できることを示している。実験例VIII−細胞のローリング白血球は、３つのメカニズムのもとに、組織内を移動する。まず最初に、未経験の（刺激を受けていない）白血球は、ホーミングレスポンスを起こす、すなわち、二次リンパ系組織内へと内皮小静脈を通って移動する。第２に、刺激された白血球および／またはメモリ細胞は、例えば粘膜上皮または皮膚といったような部位へと、組織制限された移動を示す。最後に、白血球、好中球、および、単球が、局所的な刺激に応じて炎症を起こした組織内へと移動する。炎症反応の基礎分子メカニズムは、既に特徴づけられていて、細胞付着レセプタの順次的結合によってもたらされる事象の連鎖を備えている。この付着連鎖の第１ステップは、セレクチンによって仲介された可逆結合である。セレクチンは、炎症内皮に沿っての白血球のローリングを引き起こす。次なるステップにおいては、サイトカインによって仲介された白血球活性化事象が、内皮上における白血球の平坦化を誘起する。これにより、白血球は、組織内へと移動（移住）する。移動は、インテグリン−配位子結合に依存する。付着連鎖のこれら基本ステップ、および、これらプロセスに関与するレセプタが、また、未経験の白血球のおよび記憶した白血球の通行にも使用されることが認識される。従来の細胞ローリング法は、１回のテストごとに最大５０ｍｌの溶液を必要とする。あるいは、１００ｍｇ／ｋｇの程度で動物に対しての投薬を必要とする。これに対し、本システムを使用すれば、数百数千の細胞のテストに対して、血液に対しての１００μｇ／ｍｌの程度の典型的な投薬量は、１〜２０μｇの初期薬剤を要するだけである。微小形成されたチャネルは、また、チャネルの一部における細胞のローリングを研究するために、また、同一チャネルの他の部分におけるローリングの抑制（例えば、内部制御）を研究するために、使用することもできる。これは、連続流によって、例えば流通停止技術を使用することなく、行うことができる。図１２および図１３は、この実験において使用されたデバイスを示している。図１２は、デバイスのうちの１つの構成を示しており、図１３は、以下の表Ｉに対応した様々な測定に関し、デバイスにおける複数チャネルのうちの１つの概略断面を示している。横断面は、より詳細には、湾曲側面と平坦底面とを有してなる浅くて細長い形状によって近似される。表Ｉは、様々な測定におけるチャネルの様々な寸法を示している。微量流通デバイスの洗浄微量流通デバイスは、最初の使用前には、濃硝酸でもって１時間にわたって洗浄されなければならない。また、各実験の前後には、１）濃硝酸で１０分間、２）脱イオン蒸留水で１０分間、３）２モル硫酸で１０分間、４）脱イオン蒸留水で１０分間、５）１モルＮａＯＨで１０分間、６）脱イオン蒸留水で１０分間、洗浄されなければならない。この手法は、３つの個別のチャネルＡ、Ｂ、Ｃを洗浄することにより決定された。チャネルＡは、ステップ１，２を使用して洗浄され、チャネルＢは、ステップ１〜４を使用して洗浄され、チャネルＣは、ステップ１〜６を使用して洗浄された。その後、各チャネルは、セレクチンでコーティングされ、細胞ローリングが観測された。チャネルＣにおける細胞ローリングが、再現性が良好であって、チャネルＡ、Ｂよりも程度が大きいことがわかった。チャネルＣにおけるセレクチンの表面被覆が良好であることの結果であると思われる。流速細胞ローリングの研究に先立って、各チャネルにおける流速と、各貯蔵器からの試料供給と、の双方を調べておく必要がある。各チャネル内の流速は、既知容積の水がチャネルを流通するのに要する時間を測定することによって計算された。これは、シリンジポンプを校正するために様々なシリンジポンプ速度で行われた。以下の流通式に従うような線形の速度（層流の速度）が評価された。流速＝（体積流速：ｃｍ³ｓ^-1）／（チャネルの断面積：ｃｍ²）深さが１００μｍのＨＣＲIVaと深さが５０μｍのＨＣＲIVcとに関する結果が、以下の表IIに示されている。表IIにおいては、図１２の特定のチャネルに対しての最適値が太字で示されている。試料の搬送各貯蔵器に関して試料と緩衝剤との搬送時間を決定するために、ＲＰＭＩ１６４０（Gibco BRL，Burlington Ontario，Canada）中にベンガルローズ色素を溶解させた濃縮溶液が、第１貯蔵器内に搬入され、ＲＰＭＩ１６４０だけが、第２貯蔵器内に搬入された。両貯蔵器チャネルの合流箇所から約１〜２ｃｍのところにおいて、主流通チャネルが、顕微鏡で観測された。ＨＣＲ IVcデバイスが使用され、かつ、色素が右側の貯蔵器からチャネル内へと搬送され、かつ、緩衝剤だけが左側の貯蔵器からチャネル内へと搬送されたときには、色素は、チャネルの１５０μｍをカバーし、緩衝剤は、チャネルの１２０μｍだけをカバーした。そして、チャネルの中央部分において３０μｍの拡散領域が存在した。したがって、同一チャネル内において、一方の細胞は抑制剤に曝されかつ他方の細胞は抑制剤に曝されていないといったように、２つの細胞ローリングを観測することができる。チャネルの中央（拡散領域）における細胞ローリングは、抑制剤の効果を受けることとなり、考慮すべきではない。また、デバイスに関して、第１流入経路と第２流入経路との間に、第３流入経路を組み込むことができる。緩衝剤は、主チャネル内へと、第３流入経路から流入させることができる。緩衝剤の流れは、第１流入経路からの細胞と、第２流入経路からの細胞と、を分離することとなる。好中球の細胞ローリング細胞ローリングのための準備として、チャネルは、実験例VIIと同様の方法によって、所望のセレクチンによってコーティングされた。細胞ローリングを研究するために、１つのチャネルへと連通する２つの貯蔵器が、細胞で充填される。第１貯蔵器と第２貯蔵器との双方の内容物（細胞のみ）が、チャネル内へと吸引され、細胞ローリングが観測される。その後、所望の抑制剤が、第２貯蔵器内の細胞に対して添加され、第２貯蔵器が、チャネル内へと吸引される。この場合、第１貯蔵器からの細胞流と第２貯蔵器からの細胞流とが、チャネルのエッジにおいて混合しないようにされ、双方の細胞流が、サイドバイサイドに並んでチャネル内を流れるものとされる。細胞ローリングは、Ｐ−セレクチンがコーティングされたマイクロチップを使用して、また、Ｅ−セレクチンがコーティングされたマイクロチップを使用して、観測された。１）Ｐ−セレクチンがコーティングされたチップＨＣＲ IVaマイクロチップは、実験例VlIIにおける方法と同様の方法によって、２０μｇ／ｍｌのＰ−セレクチンでもってコーティングされ、２時間放置された。分離されたヒトの好中球が、１０μｌ／ｍｉｎの流速でローリングマイクロチップを通って移動した（約８００／ｃｍの剪断速度＝４０ｄｙｎｅ／ｃｍ²の剪断力）。対照実験における結果は、流通によって、多数の好中球が、Ｐ−セレクチンによってコーティングされた左右両方をチャネル上においてローリングすることを示した。流通時において、左側のチャネルは、ローリング抑制剤を受領しておらず、一方、右側の貯蔵器には、抗−Ｐ−セレクチン抗体が、流通の途中において１：１５：１７の時点で添加された。この抗体は、細胞と共に右側のチャネルを流れた。抗−Ｐ−セレクチン抗体が、右側のチャネルに関して、Ｐ−セレクチンによってコーティングされた表面上における好中球のローリングを抑制したことが観測された。これら結果は、図１４のグラフに示されており、また、表IIIにまとめられている。２）Ｅ−セレクチンがコーティングされたチップ第２のＨＣＲ IVaマイクロチップは、実験例VIIにおける方法と同様の方法によって、２０μｇ／ｍｌのＥ−セレクチンでもってコーティングされ、２時間放置された。分離されたヒトの好中球が、１０μｌ／ｍｉｎの流速でローリングマイクロチップを通って移動した（約８００／ｃｍの剪断速度＝４０ｄｙｎｅ／ｃｍ²の剪断力）。対照実験における結果は、流通によって、多数の好中球が、Ｅ −セレクチンによってコーティングされた左右両方をチャネル上においてローリングすることを示した。第１運転においては、抗−Ｅ−セレクチン抗体が、およそ１：５４：４２の時点で右側の貯蔵器に添加された。第２運転においては、抗 −Ｅ−セレクチン抗体が、およそ０：３９：３０の時点で右側の貯蔵器に添加された。これらの結果は、図１５および図１６のグラフに示されており、また、表 IVおよび表Vにまとめられている。また、１０００μｇ／ｍｌのシアリルルイス（sialyl Lewis^X）のフレッシュ溶液に関して、Ｅ−セレクチンの存在下における好中球のローリング抑制能力がテストされた。シリアルルイスが、瞬時にローリングを抑制することがわかった。Ｅ−セレクチンまたはＰ−セレクチンの存在下におけるフコイジン（fucoidin e）（Sigma，St.Louis MO）は、好中球のローリングの抑制に、より多くの時間を要した。実験例IX−希釈していないヒトの血液に対しての細胞ローリング分析希釈していないヒトの全体血液を使用して、実験例VIIに記載した細胞ローリング分析を行った。この分析は、異なる深さ（ａ＝３００μｍ：ｂ＝２００μｍ：ｃ＝５０μｍ）とされたＨＣＲ IVcデバイスを使用して行われた。このデバイスは、予め、上述のようにしてＥ−セレクチンによってコーティングされている。ヘパリンが添加された５０μｌのヒトの全血液（血液に対して、１ｍｇ／ｍｌの割合でヘパリンが添加された）が、図１２に示す「Ｙ」字形デバイスの第１貯蔵器内に搬入された。ヒトの血液は、シリンジポンプによって、貯蔵器からチャネル内へと、デバイスにとって最適の流速（表II参照）でもって移動した。そして、「Ｙ」字形合流箇所から約１〜２ｃｍのところにおいて主流通チャネルが、顕微鏡によって１５分間、観測された。抑制剤とヘパリン添加血液とからなる５０μｌの混合体が、第２貯蔵器内に配置され、チャネル内へと３〜１０分間にわたって導入された。全血液内において白血球のローリングを抑制するのに要する時間は、研究される抑制剤によって決まる。Ｅ−セレクチンの存在下における抗−Ｅ−セレクチン抗体、あるいは、Ｅ −セレクチンの存在下における１０００μｇ／ｍｌのシリアルルイスのフレッシュ溶液は、白血球のローリングを瞬時に抑制した。Ｅ−セレクチンの存在下におけるフコイジン（Sigma，St.Louis MO）は、全血液中において白血球のローリングを抑制するのに、より多くの時間を要した。細胞のローリングは、第１貯蔵器からの流れにおいて観測され、これに対し、ローリングの抑制は、第２貯蔵器からの流れにおいて観測された。細胞ローリングの観測は、赤血球の存在のために、全血液では困難であり、特に、プレートの底部近傍の細胞に対しては困難である。この問題点は、上部プレートおよび底部プレートの双方における細胞ローリングが困難なく容易に同時に観測することができるような、より薄いデバイス（深さ５０μｍ）を使用することにより、解決される。本発明の様々な実施形態を行うに際しての上記様々なモードを修正し得ることは、本発明による開示によって、当業者には自明であろう。上記の様々な実験例は、本発明を制限するものではなく、単なる例示である。本発明の範囲は、請求範囲に規定されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ 37/00 １０１ 37/00 １０１ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者アンダーソン，パーカナダ国アルバータＴ６Ｇ１Ｒ８エドモントンセヴンティーナインスアヴェニュ 10530 アパートメント９ (72)発明者リー，ポールシーエイチ中華人民共和国ホンコンクァントンラグナシティブロック 17 20Ｅ (72)発明者スザルカ，ロダリックカナダ国アルバータＴ６Ｊ７Ａ６エドモントンテンスアヴェニュ 11712 (72)発明者スミス，リチャードカナダ国アルバータＴ６Ｒ２Ａ６エドモントンブチャナンプレイス 1010 (72)発明者サリミ−ムーサヴィ，ホセインカナダ国アルバータＴ６Ｇ１Ｋ７エドモントン 112 ストリートノースウエスト 8515 アパートメント 901

Claims

【特許請求の範囲】１．微量流通デバイスであって、検出領域および流出口を備えた主流通経路と；前記検出領域においてまたは前記検出領域よりも上流側において、９０°よりも小さな上流側開き角度でもって前記主流通経路に対して合流する、少なくとも２つの流入経路と；を具備することを特徴とする微量流通デバイス。２．請求項１記載の微量流通デバイスにおいて、２つの流入経路を具備していることを特徴とする微量流通デバイス。３．請求項１記載の微量流通デバイスにおいて、３つの流入経路を具備していることを特徴とする微量流通デバイス。４．請求項３記載の微量流通デバイスにおいて、前記主流通経路は、該主流通経路に対しての前記各流入経路の各合流箇所のところにまたはそこよりも下流側に、少なくとも１つの検出領域を備えていることを特徴とする微量流通デバイス。５．請求項１記載の微量流通デバイスにおいて、前記主流通経路は、およそ深さ０．１μｍ×幅０．１μｍ〜およそ深さ１ｍｍ ×幅２ｍｍとされていることを特徴とする微量流通デバイス。６．請求項１記載の微量流通デバイスにおいて、第１流入経路は、およそ深さ０．１μｍ×幅０．１μｍ〜およそ深さ１ｍｍ× 幅２ｍｍとされていることを特徴とする微量流通デバイス。７．請求項１記載の微量流通デバイスにおいて、さらに、流通誘起力を印加するための手段を具備していることを特徴とする微量流通デバイス。８．請求項６記載の微量流通デバイスにおいて、前記流通誘起力が、電気力であることを特徴とする微量流通デバイス。９．請求項６記載の微量流通デバイスにおいて、前記流通誘起力が、負の流体圧力または正の流体圧力であることを特徴とする微量流通デバイス。１０．請求項９記載の微量流通デバイスにおいて、負の流体圧力または正の流体圧力が、前記流出口に印加されることを特徴とする微量流通デバイス。１１．請求項１記載の微量流通デバイスにおいて、少なくとも１つの前記流入経路および前記主流通経路内に、細胞を含有していることを特徴とする微量流通デバイス。１２．請求項１記載の微量流通デバイスにおいて、前記主流通経路内に、白血球、カルシウム色素、および、候補化合物を含有していることを特徴とする微量流通デバイス。１３．請求項１に記載された微量流通デバイスを複数具備してなる観測デバイスであって、前記複数の微量流通デバイスのそれぞれの検出領域を共有していることを特徴とする観測デバイス。１４．請求項１３記載の観測デバイスにおいて、前記複数の微量流通デバイスのそれぞれの前記主流通経路どうしが、前記共有検出領域において、実質的に互いに平行とされていることを特徴とする観測デバイス。１５．請求項１に記載された微量流通デバイスを複数具備してなる観測デバイスであって、前記複数の微量流通デバイスのそれぞれの前記主流通経路どうしが、それぞれの検出領域において、実質的に互いに平行とされていることを特徴とする観測デバイス。１６．細胞に対しての候補化合物の効果を微量流通デバイス内において観測するための方法であって、（ａ）検出領域および流出口を備えた主流通経路と、前記検出領域においてまたは前記検出領域よりも上流側において前記主流通経路に対して合流する少なくとも２つの流入経路と、を備えた微量流通デバイスを準備し；（ｂ）少なくとも１つの細胞を、第１流入経路に導入するとともに、前記候補化合物を、第２流入経路に導入し；（ｃ）前記流出口に向けての、前記細胞の流れおよび前記候補化合物の流れを誘起し；（ｄ）前記第２流入経路と前記主流通経路との合流箇所において、前記細胞と前記候補化合物とを混合し；（ｅ）前記細胞に対しての前記候補化合物の効果を、前記検出領域において観測する；ことを特徴とする方法。１７．請求項１６記載の方法において、前記微量流通デバイスが、３つの流入経路を備え、第２候補化合物が、第３流入経路に導入されることを特徴とする方法。１８．請求項１６記載の方法において、前記細胞が前記検出領域内に位置している時に、前記流れを停止させることを特徴とする方法。１９．請求項１７記載の方法において、前記主流通経路が複数の検出領域を備えているとともに、各検出領域が、前記主流通経路に対しての前記各流入経路の各合流箇所のところにまたはそこよりも下流側に位置している場合に、複数の検出領域の各々において観測を行うことを特徴とする方法。２０．請求項１６記載の方法において、研究されるべき前記候補化合物が、細胞活性化剤であるとともに、前記細胞が、リンパ球であることを特徴とする方法。２１．請求項１７記載の方法において、細胞が第１流入経路に導入され、細胞活性化剤が第２流入経路に導入され、候補化合物が第３流入経路に導入されることを特徴とする方法。２２．請求項２１記載の方法において、研究されるべき前記候補化合物が抑制剤であり、前記細胞がリンパ球であることを特徴とする方法。２３．請求項１６記載の方法において、前記主流通経路および前記各流入経路が、タンパク質、糖タンパク質、リン脂質、親水性ポリマー、および、疎水性ポリマーからなるグループの中から選択された物質でコーティングされていることを特徴とする方法。２４．請求項２３記載の方法において、前記主流通経路および前記各流入経路が、タンパク質でコーティングされていることを特徴とする方法。２５．請求項２３記載の方法において、前記流れを、電気力によって誘起することを特徴とする方法。２６．請求項２４記載の方法において、前記流れを、正の流体圧力または負の流体圧力によって誘起することを特徴とする方法。２７．リンパ球におけるカルシウム流を研究するための方法であって、（ａ）検出領域を備えた主流通経路と、前記検出領域よりも上流側において前記主流通経路に対して順次的に合流する少なくとも２つの流入経路と、前記検出領域よりも下流側に配置された流出口と、を備えた徴量流通デバイスを準備し；（ｂ）リンパ球を第１流入経路に導入するとともに、活性化剤を第２流入経路に導入し；（ｃ）前記流出口に向けての、前記リンパ球の流れおよび前記活性化剤の流れを誘起し；（ｄ）前記第２流入経路と前記主流通経路との合流箇所において、前記リンパ球と前記活性化剤とを混合し；（ｅ）前記リンパ球に対しての前記活性化剤の効果を観測する；ことを特徴とする方法。２８．請求項２７記載の方法において、前記微量流通デバイスが、３つの流入経路を備え、候補化合物を第３流入経路に導入し、前記検出領域において、前記リンパ球に対しての前記候補化合物の効果を観測することを特徴とする方法。２９．白血球のローリングを研究するための方法であって、（ａ）検出領域および流出口を備えた主流通経路であるとともに、前記検出領域における壁には細胞付着性分子が取り付けられている主流通経路と、前記検出領域のところにおいてまたは前記検出領域よりも上流側において前記主流通経路に対して順次的に合流する少なくとも２つの流入経路と、を備えた微量流通デバイスを準備し；（ｂ）少なくとも１つの白血球を、第１流入経路に導入し；（ｃ）少なくとも１つの白血球と候補化合物とを、第２流入経路に導入し；（ｄ）前記主流通経路内において前記白血球の流れおよび前記候補化合物の流れを誘起し；（ｅ）前記白血球と前記細胞付着性分子とを相互作用させ；（ｆ）前記候補化合物の存在下においてまたはそれがない状態において、前記検出領域において前記白血球のローリングを観測する；ことを特徴とする方法。３０．請求項２９記載の方法において、前記微量流通デバイスが、約３０μｍ〜約５００μｍという断面積とされた主流通経路を備えていることを特徴とする方法。３１．請求項２９記載の方法において、前記微量流通デバイスが、さらに、第３流入経路を備え、緩衝剤を、この第３流入経路に導入することを特徴とする方法。３２．請求項１記載のデバイスにおいて、前記主流通経路の断面積が、場所によって変化していることを特徴とするデバイス。３３．請求項３２記載のデバイスにおいて、前記断面積変化が、細胞拘束領域を形成していることを特徴とするデバイス。３４．請求項３２記載のデバイスにおいて、前記断面積変化が、堰によってもたらされていることを特徴とするデバイス。