JP2002503334A - 粒子の分離と分析用のマイクロフローシステム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 粒子を含有する流体流をフローチャンネルに案内する部材に画定されたフローチャンネル(5)、流体をフローチャンネルに導入するためフローチャンネルの一端に位置した第１の入口手段(2)、流体をフローチャンネルから排出するためフローチャンネルの他端に位置した第１出口手段(7)とを有する微細な構造の部材からなり、粒子を含有する流体流が、一時に１つの粒子がフローチャンネルの断面を通過するように制御され、かつ部材は、フローチャンネルに存在しかつフローチャンネルを横切る場に影響される粒子が場の方向に偏向されるように、フローチャンネルの縦軸に実質的に垂直である場に位置される粒子分離用のマイクロフローシステムが提供される。さらに、流体流をフローチャンネルに案内する部材に画定されたフローチャンネル、粒子をフローチャンネルに導入するための第１入口手段、流体をフローチャンネルから排出するための第１出口手段及び流体がフローチャンネルにある間に複数の成分を分析できる、フローチャンネルに位置し、固定化試薬からなる複数のアッセイ部位を有する微細な構造の部材からなる流体成分の分析用のマイクロフローシステムが提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 粒子の分離と分析用のマイクロフローシステム発明の分野 本発明は、流体中の粒子、例えば細胞、細胞小器官、ビーズ、分子例えばデオ キシリボ核酸(DNA)、タンパク質などを検出、分離、分類および分析する方法と 装置に関する。特に、本発明は、例えば、フローサイトメトリー、光マイクロス コピー、電気泳動分離、磁気泳動などで利用するため、磁気、電気泳動、流体力 学および／または重力のような異なる力を用いることによる粒子の分離に関する 。発明の背景 フローサイトメトリーは、微視的な生体サンプルの光学および／または電気特 性を高い処理量で測定するのに使用される周知の技術である。フローサイトメト リー装置は、特定の物理、生化学および免疫学的性質を有する細胞や細胞小器官 を分析し分離するものである。 従来、フローサイトメトリーでの細胞の分類（蛍光活性化細胞分類）は、表面 マーカーで特定細胞集団を単離選択する方法であった。しかし、フローサイトメ トリーによる細胞分類では、いくつかの欠点、特に所望の細胞サンプルの高い希 釈、低速度及び無効性の問題がある。その上、装置は、高度の操作とメンテナン ス費用がかかり非常に高価であって、特定数の研究所の みに使用可能な技術となっている。 この２〜３年の間に、抗体結合した磁性ビーズと担体での細胞の単離が、細胞 集団の単離と特徴付けに信頼性のある手段として開発されている。免疫磁性細胞 の分離（例えばダイナールＡ／Ｓ アンド ミルテニル バイオテック(Dynal A /S and Miltenyl Biotec)で市場に導入）は、臨床診断での細胞分析の確立され た方法となっている。この方法は、比較的低価であるため、フローサイトメトリ ーで、特に稀な細胞の事象の分類で注目されている。例えば、母親の血液サンプ ルに含有される胎児細胞の分類は、膜絨毛をサンプリングする羊水穿刺のような 出生前診断法に対する非侵襲性の代替案を提供する。他の稀な事象のシナリオと しては、極小の残存疾患の診断と適当な治療法の評価で重要な役割を有する低濃 度の癌細胞の検出がある。 細胞分類システムの他の医療上の応用には細菌とウイルス疾患の診断がある。 この方法は、稀な細胞の事象を分類するのに比較的費用のかからないアプロー チではあるが、全体的に稀な事象の検出にかなりの時間を要し、フローサイトメ トリー技法で容易にできるマルチパラメータの分析ができない。磁性分離の現存 の技術では、分類した細胞フラクションの純度が低く、分類された細胞の回収率 が低い欠点がある。殆どのシステムで、何回かの洗浄工程を分離方法で実施する 必要があり、細胞のロスの原因となっている。加えて、ラベルした細胞の小さな 副集団は、現存する磁性分離技法で直接的に単離することができない。 蛍光活性化細胞の分類法と磁性活性化細胞の分類についての良い概説が、Mela medら、Flow Cytometry and Sorting（Melamed編集、Wiley & Sons Inc.,1990） にみられる。発明の要旨 微細な組立てや微小流動技術の進展が、一般にバイオ分析装置や生化学アッセ イの小規模化への更なる研究を活気づけている。本発明は、例えば、生体細胞、 マイクロビーズ、細胞小器官及びDNAのような高分子の粒子を含有するサンプル を、測定、モニター、分類および分析することを含むような試験を行うための低 価格で非侵襲性の診断試験方法と装置の開発に関する。本発明は、このような粒 子を取扱い、分類し、分析するための安価で、速くかつ信頼性のある方法と装置 を提供するものである。 分離は、蛍光性や他の光学的性質、磁性、密度、電気的性質などのような各種 の物理的性質によって行うことができる。この発明の重要な観点によれば、粒子 が個々に処理されるように、粒子の分離は、粒子をマイクロフローチャンネル中 で１つの粒子列に配置させることにより行われる。 従って、本発明の目的は、従来技術と比較して、改良された効率の粒子分離を 示すマイクロフローシステムと粒子分離法を提供することにある。 本発明の他の目的は、細胞溶解が最小化されるマイクロフローシステムと粒子 分離法を提供することにある。 本発明のその他の目的は、粒子の分離と分析用の粒子含有流 体の製造の改良法を提供するものである。 本発明のさらなる他の目的は、粒子を複数のグループの粒子に同時に分類する マイクロフローシステムと方法を与えるものである。 本発明のさらなる目的は、サンプルの前処理及び／又は後処理の機能を含むマ イクロフローシステムを与えることである。 本発明のさらなる目的は、集積自動マイクロフローシステムを使用して全母性 血液サンプル中の胎児細胞の分離と分析のシステムを開発することである。この システムは、生化学サンプルの取扱、操作と分析の異なる方法を縮小し組み合わ せて考案されている。従って、全母性血液サンプルから分離された胎児細胞の分 析による出生前診断は、ミニチュア化の進歩を示している。 本発明の他の目的は、集積自動マイクロフローシステムを用いて癌細胞及び健 康細胞を含有するサンプルから癌細胞を分離し、分析するシステムの開発である 。このシステムも、生化学サンプルの取扱、操作と分析の異なる方法を縮小し組 み合わせて考案されている。したがって、健康細胞から分離された癌細胞の分析 による癌の診断は、ミニチュア化の進歩を示している。 本発明の第１の観点によると、上記及び他の目的は、粒子を含有する液体の流 れをフローチャンネルに案内する部材中に画定されたフローチャンネルと、流体 をフローチャンネルに導入するためフローチャンネルの一端に位置した第１の入 口手段と、流体をフローチャンネルから排出するためフローチャンネルの 他端に位置した第１出口手段とを有する部材を具備し、粒子を含有する流体の流 れが、一時に１つの粒子がフローチャンネルの断面を通過するように制御され、 かつ部材は、フローチャンネルに存在しかつフローチャンネルを横切る場に影響 される粒子が場の方向に偏向されるように、フローチャンネルの縦軸に実質的に 垂直な場に位置されることからなる粒子分離用のマイクロフローシステムによっ て満たされる。 本発明の第２の観点によると、上記及び他の目的は、粒子を含有する流体の流 れを一時に１つの粒子がフローチャンネルの断面を通過するようにフローチャン ネルに案内し、フローチャンネルをフローチャンネルの縦軸に実質的に垂直であ る場に位置させ、それによりフローチャンネルに存在し、フローチャンネルを横 切る場に影響される粒子が、場の方向に偏向され、流体から分離される工程から なる粒子の分離方法によって満たされる。 本発明の第３の観点によると、上記及び他の目的は、粒子を含有する流体の流 れをフローチャンネルに案内する部材中に画定されたフローチャンネルと、流体 をフローチャンネルに導入するためフローチャンネルの一端に位置した第１入口 手段と、流体をフローチャンネルから排出するためフローチャンネルの他端に位 置した第１及び第２出口手段と、そこで、粒子を含有する流体の流れが、一時に １つの粒子がフローチャンネルの断面を通過するように制御され、フローチャン ネル内の測定容量内にある粒子のパラメータをモニターし、モニターされたパラ メータに対応する出力信号を与えるフローチャンネルに位置したモニター手段と 、流体の第１及び第２出口手段それぞれの通過をモニター手段の出口信号に応じ て制御し、それより粒子がモニター手段によってモニターされたパラメータ値に よって分離される制御手段を有する部材を具備する粒子分離用のマイクロフロー システムによって満たされる。 本発明の第４の観点によると、上記及び他の目的は、粒子を含有する流体の流 れを、一時に１つの粒子がフローチャンネル（流体を排出する第１と第２の出口 手段を備える）の断面を通過するようにフローチャンネルに案内し、フローチャ ンネル内の測定容量内にある粒子のパラメータをモニターし、モニターしたパラ メータ値に応じて第１及び第２出口手段それぞれの流体の通過を制御し、それに よってモニターしたパラメータ値に従って粒子を分離できる工程からなる粒子の 分離方法により満たされる。 本発明の好ましい具体例によれば、胎児細胞と母性細胞を含有する流体中で胎 児細胞を磁性的に選択染色し、胎児細胞を含有する流体の流れを一時に１つの胎 児細胞がフローチャンネルの断面を通過するようにフローチャンネルに案内し、 フローチャンネルに存在する磁性的に染色した胎児細胞が磁場の方向に偏向され るように、フローチャンネルの縦軸に実質的に垂直な磁場にフローチャンネルを 位置させる工程からなる、母性細胞から胎児細胞を分離する方法がある。 さらに、癌細胞と他の細胞を含有する流体中の癌細胞を磁性 的に選択染色し、癌細胞を含有する流体の流れを、一時に１つの癌細胞がフロー チャンネルの断面を通過するようにフローチャンネルに案内し、フローチャンネ ルの縦軸に実質的に垂直な磁場にフローチャンネルを位置させ、フローチャンネ ルに存在する磁性的に染色された癌細胞を磁場の方向に偏向させる工程からなる 癌細胞の他の細胞からの分離方法が提供される。 流体中の他の粒子から分離される粒子及び／又は粒子含有流体から分離される 粒子は、生細胞、染色体、小器官、ビーズ、デオキシリボ核酸(DNA)やタンパク 質などのような生体分子からなることができる。 フローチャンネルを経る流れは層状流が好ましく、従って粒子流は、例えば案 内バッファー流で予測でき制御が容易である。 流れが層状のとき、粒子の流れは、例えば、部材の粒子入口での粒子含有流体 の流速と対応する入口での案内バッファーの流速を制御することにより、フロー チャンネル内で所望のように位置付けることができる。 フローチャンネルは、例えば0.05〜50のような0.01〜500、好ましくは0.1〜25 の範囲の低いレイノルズ数を有するように、チャンネル中の流れに対して小さい ことが好ましい。それによって乱流や二次流の原因となる慣性作用が無視でき、 粘性作用が動力学を特徴づけ、混合が拡散によってのみ生ずる。粒子含有流体と 案内バッファーであるサンプルの流れは、チャンネルを介した案内層で層状化さ れ、チャンネルで粒子の転位は、付加された外的力でのみ生ずる。引用したレイ ノルズ数は、フ ローチャンネルの水力学的直径、軸方向の流速及び流体密度及び粘度に基づき、 Re=pDh/uである。ここで、水力学的直径Dhは、湿った周辺で割った断面積の４倍 とする。 マイクロフローシステムの例示したフローチャンネルは、0.1〜0.55mm、好ま しくは0.1〜0.4mm、特に0.1〜0.2mmの範囲の巾と、0.04〜0.2mm、好ましくは0.0 4〜0.1の深さを有する。フローチャンネルの最低の断面積について、この面積は 0.004〜0.11mm²、特に0.004〜0.02mm²の範囲であることが好ましい。 0.1〜20mm、好ましくは1.0〜3.5mmの範囲内のフローチャンネルの長さが満足 すべき結果を与えると思われる。 システムは、15mm／分〜180mm／分の流速を与える0.1〜200μｌ／分の全容量 流量で操作するのが好ましい。フローチャンネル内の粒子の平均滞留時間は0.1 〜６秒の範囲の分離時間に相当する。サンプルの滞留時間は、システムの全容量 流量によって決まる。 マイクロフローシステムは、フローチャンネルに存在する粒子の時間を調整す る流量調整手段を備えることができる。 流体チャンネルは、効率的な分離のため、粒子がフローチャンネル内に10〜30 μｍで置き換えられるような大きさであるのが好ましい。それによって、粒子は 、ごく短時間のみ場にさらすことができ、従って、粒子の連続分離が促進できる 。 フローチャンネルで偏向される粒子を集めるため、マイクロフローシステムは 、さらに、フローチャンネルで偏向された粒 子を排出する第２出口手段を備えることができる。 マイクロフローシステムは、粒子含有流体と共に第１の案内バッファーをフロ ーチャンネルに導入する第２の入口手段を備えることができる。流れが層状のと き、２つの流体は、フローチャンネルの縦軸に延びる小さな領域に沿って互いに 接触して平行にフローチャンネルを流動し、粒子含有流体の流れの断面とフロー チャンネルの経路が、第１案内バッファー流で制御できる。さらに、粒子含有流 体中の粒子は、２つの流体がフローチャンネルの縦軸に本質的に垂直な場を通過 するとき、案内バッファー流体中に偏向される。その上、２つ（またはそれ以上 ）の出口を、分離した粒子及びフローチャンネルに本質的に垂直な場に影響され る粒子が実質的にない流体を含有する案内バッファーを相応じて排出するため、 フローチャンネルの下流端に備えることができる。 マイクロフローシステムは、さらに、フローチャンネルの粒子流経路の制御を 改良するための第２案内バッファーを導入する第３入口手段を備えていてもよい 。案内バッファーと粒子含有流体の流速を調整することにより、粒子含有流体の フローチャンネル内の流れが、フローチャンネルの縦軸に実質的に平行に延びる 縦軸を有する本質的に円筒状のドメイン内に流れるように制御でき、さらに、フ ローチャンネル内の位置と流れの円筒の直径が、粒子含有流体の流量と案内バッ ファーの流量との容量比を対応して調整することにより制御できる。 サンプル中に含まれた粒子が一列の粒子に整列するようにサ ンプルと１つまたは２つの案内バッファーの容量的流量を調整することにより、 サンプル含有ドメインの断面積を粒子の断面積より少し大きくなるように制御す ることができる。これは非常に重要な特徴で、各粒子の個々の処理を可能とし、 粒子の場への磁性率によって粒子を分類する感度のよい方法となる。サンプルの 流層の厚みは、１μm未満にすることができる。 チャンネルの深さは、チャンネルを流動する粒子を顕微鏡で観察するのに十分 な小ささ、例えば50μｍ以下が好ましい。本発明の重要な具体例では、マイクロ フローシステムはフローチャンネルを覆うためのカバー、例えば透明または半透 明のカバーを備える。カバーが透明または半透明であると、フローチャンネル中 の事象、例えば染色または着色粒子もしくは細胞の通過の観察を可能することが できるであろう。 フローチャンネルを有する部材は、何れかの適切な材料、例えば、シリコン、 フレキシグラス(Plexiglas)、テフロンなどのようなポリマー、ガラス、セラミ ックス、銅、アルミナ、ステンレス鋼などのような金属からつくることができる 。 チャンネルは、適当な製造法、例えばミリング、エッチングなどにより部材中 に備えることができる。 本発明の好ましい具体例では、部材は写真平板を利用して製造したシリコンチ ップで、チャンネルがシリコンチップにエッチングされる。 場は、磁場、電界、重力の場など及びこのような場の組合わせであってもよい 。 磁場は、永久磁石、例えば希土類磁石、例えばサマリウム−ゲルマニウム磁石 、磁性鉄粉末とエポキシなどの混合物など、シリコン集積電磁石などでの電磁石 で発生できる。磁石は、磁場がフローチャンネルの縦軸に実質的に垂直であるよ うにフローチャンネルに隣近して位置していることが好ましい。 本発明の好ましい具体例では、磁石は、シリコンチップにエッチングされる方 形の溝に位置付けして接着される。溝は、分離フローチャンネルに隣近して設定 する。図１に示した例では、永久磁石また電磁石はマイクロフローシステムの溝 で支えることができる。溝は、例えば0.5mm巾、0.5mm長さ、0.2mm深さである。 磁場の発生のため、固体磁性ブロック、例えば希土類磁石を溝に接着できる。代 わりに、磁性鉄粉末とエポキシの混合物を溝に注入し、高い磁場匂配をつくるこ とができる。 マイクロフローシステム内の磁場の強度は、調整できる。電磁石を磁場の発生 に使用すると、場の強さは、電磁石への入力電圧の強さを変化させることにより 変化できる。永久磁石が磁場を生じると、場の強さは、マイクロフローシステム の磁石とフローチャンネル間の距離を変えることにより変化できる。 上記のように、マイクロフローシステム中の粒子の正味の転位(net displacem ent)は、場により付与された力に依存する。これは、流体中の第１群の各種タイ プの粒子を、各組が特定タイプの粒子からなる複数の粒子の組に分離するのに利 用できる。例えば５つの分離出口を有するマイクロフローシステムは、粒子含有 流体を、各組が特定のＦ値を有する次に示した粒子で、 特定の大きさの力を有する場で影響される粒子からなる５つの組の粒子に分離す るのに使用できる。低いＦ値を有する粒子は、場で少量のみ偏向され、対応する 出口を介してフローチャンネルから排出される。粒子の偏向はＦ値の増加と共に 増加し、このような粒子は、対応する他の出口を介してフローチャンネルから排 出される。 流体中の他の粒子から分離すべき粒子及び／又は粒子含有流体から分離すべき 粒子は、磁場での分離を促進するため磁性的に染色できる。 本明細書で、染色の用語は広義で理解さるべきである。この用語は、粒子の検 出を促進するため粒子を標識する何れの方法も含むことを意図する。例えば、細 胞は、アクリジンオレンジ、メチレンブルーなどの蛍光物質で染色して、蛍光検 出器で染色粒子の検出を容易にでき、または粒子は磁性マイクロビーズと結合さ せると磁性的に染色されるといえる。マイクロビーズは、例えば、磁場を利用し て分離される細胞の抗原に結合さすため、その表面にモノクロナールまたはポリ クロナール抗体を担持できる。 粒子が、フローチャンネル中で光学手段で検出しなければならない場合に、こ のような粒子は、発色試薬、つまり蛍光プローブで染色するのが好ましい。 電界は、金電極などのような金属電極のごとき電極で発生できる。電極は、例 えば流体中の荷電分子を分離するため例えば電気泳動力を導入すべくフローチャ ンネル内に、または例えば 場への粒子の磁性率によってフロー中に含まれる粒子の分離のため例えば誘電泳 動力を導入するためフローチャンネルの外に設置できる。電極は、電界がフロー チャンネルの縦軸に本質的に垂直であるように設置するのが好ましい。 電界は、高い周波数の場、例えばフローチャンネル内に設置した電極で発生さ せた５MHzの場であってもよい。電界にある生細胞は分極化され、場に影響され るであろう。従って、変更する場が、生細胞を他の粒子から分離するのに使用で きる。 フローチャンネルに沿って発生した場は、粒子の固定化に利用でき、それによ って例えば図６で略述されるように、粒子は、特定期間フローチャンネル内で実 質的に固定された位置に保持でき、粒子との化学反応を生じさせ、かつ／または 粒子の反応速度を測定させ、かつ／または粒子を異なる化学物質と接触させるか 、または粒子をサンプルから分離させることができる。粒子は、除去の前に洗浄 工程に付すことができ、または場の減少が粒子を再分散する。 本発明の第５の観点によれば、上記及び他の目的は、粒子を含有する流体の流 れをフローチャンネルに案内する部材中で画定されたフローチャンネルと、流体 をフローチャンネルに導入するためフローチャンネルの一端に位置した入口手段 と、フローチャンネルの縦軸に実質的に沿った場を発生させ、それによって粒子 がチャンネルに沿って場に吸引され、場への磁性率と移動性に従って分布される 、フローチャンネルの他方の端近くに位置する場の発生手段を有する部材を具備 することからな る粒子分離用のマイクロフローシステムによって満たされる。 例えば、磁場発生手段は、他端に、磁性ラベルした高分子、すなわちリボ核酸 またはタンパク質含有サンプルを導入する少なくとも１つの入口を有するフロー チャンネルの閉鎖端に位置していてもよい。サンプルはチャンネルに入り、そこ で粒子はチャンネルに沿った磁場で吸引され、電気泳動によるごとく、粒子は、 磁場への磁性率と移動度によって分配されるであろう。発生した磁場は所定時間 間隔後に除去され、次いで粒子の分布が観察できる。 本発明の他の具体例によると、分類出口を経る流れは連続的ではなく、所望の 特性を有する粒子が検出手段で検出されたとき、制御手段例えばバルブでのみ許 容される。流れが、ある規準を満たす粒子を含有したときのみ通常の出口から分 類出口に分かれる意味で、粒子は流体力学力を用いて分類される。結果的に、分 類出口からの流れ中の分類された粒子の濃度は高いであろう。このことは、調べ られる粒子が稀にしか存在しないサンプルの流れに特に有利である。検出手段は 、例えば、光学検出手段または磁性検出手段、例えばハルセンサーあるいは例え ば粒子の電気あるいは他の性質を検出する手段であってもよい。検出手段は、別 の具体例において、分離機能として所望の特性を有する粒子を計測するのに、ま たはここで記載の他の具体例の何れかと関連して使用することができる。 なお他の具体例で、場の強度は、例えば電磁石または１組の電極に付加された 電圧を調整したり、または、永久磁石からフ ローチャンネルの距離を調整することにより調整できる。粒子は、第１の操作様 式で高強度の場でフローチャンネル内に捕捉され、その間同時に分類出口が閉鎖 される。第２の操作様式で場が減じられ、捕捉された粒子が再分散され、分類出 口から移動するように分類出口が開放される。サンプル中で稀な粒子は、これら の２つの操作様式を変換して、高濃度の形で分類される。この具体例を図６に略 述する。 さらなる興味ある具体例では、本発明によるマイクロフローシステムは、粒子 からなる流体の前処理及び／又は後処理の機能を含む。これらの可能性を図５（ ｆ）、７と１０に略示する。例として、粒子はフローチャンネルに入る前に試薬 と処理でき、例えば磁性または発色染色に付すことができる。後処理は、偏向し た粒子を回収又は濃縮する手段、または偏向した粒子を１以上の試薬と接触さす 手段を備えてもよい。 前処理と後処理機能の１つの可能な組合せで、細胞がフローチャンネルに入る 前に磁性染色を行うことができ、分離後に、その染色を、染色細胞を適当な試薬 で処理して除去できる。 本発明の重要な利点は、マイクロフローシステムが、オペレーターの介在を必 要とせずに連続的に操作することである。 本発明の他の利点は、分離が１つの工程で行うことができることである。 本発明のさらに他の利点は、粒子が、流れ自体を実質的に妨げずに連続流で分 離され、分離された粒子が、フローチャンネルの流れを遮断する必要なく、フロ ーチャンネルの対応する分 離された出口で回収され得ることである。 １以上の案内バッファーの流量の調整でサンプルに含まれた粒子が、個々に分 析され分類され得るように１つの列に整列できるのが、発明の他の重要な利点で ある。この結果、分類チャンネルに付加された場への単一粒子の磁性率にもっと も高い感度を有する分類システム及び粒子により示される特性の検出手段のもっ とも高い解像度を有する分類システムが生じる。 マイクロフローシステムが、フローサイトメーター、フロー注入分析システム などのような他の連続フローシステムに容易に一体化されるのが発明のさらなる 他の利点である。 粒子が、異なる群の粒子についてフローチャンネルで生じた場への磁性率の差 により、複数の群の粒子、例えば細胞の異なる副集団に分離できるのが本発明の さらなる利点である。これは図５（ｅ）で略述した多出口マイクロフローシステ ムを用いて得ることができる。 マイクロフローシステムは、顕微鏡を用いてフローチャンネル中の粒子を観察 できることが、本発明のさらなる利点である。 閉鎖システムでは、病原を含むサンプルのような生物災害サンプルを、実験環 境を汚染せずかつ操作者が病原性の生物材料を扱うことにより災害を生じさせず にシステムに導入できることは、本発明のさらに他の利点である。 フロー中で低い剪断応力を有するシステムでは、特に２つの案内バッファーが チャンネルに導入されたとき、生体サンプル、例えば脆い生細胞を柔軟に処理で きることは、本発明のさらな る利点である。 高濃度の分類された粒子が、調査し分類される粒子の存在が希少であるサンプ ルからでも得られることは、本発明のさらなる利点である。 本発明の重要な観点によれば、免疫磁性細胞の分離と操作用の新システムが、 シリコンベースのマイクロ組立フローチップを利用して提供される。このシステ ムは、フローサイトメトリーと免疫磁性分離の技法の利点を合せ持つ。フローチ ップは、細胞分類と分析用のポータブルなマイクロシステムの重要な部材である 。フローチップは、殆んど圧力低下がなく迅速な免疫磁性細胞の分離を目的とす る。その簡単で安価な組立及び多方面の分離と検出性が、通常の細胞分離システ ムに代り提供される。 マイクロフローシステムが、安価、取扱容易、多様、簡単でポータブルで、自 動化の可能性を与えているのが、本発明の利点である。 小規模化したフローチャンネルシステムは、マイクロシステムで有利な流体挙 動を利用している。発明されたシステムは、連続的に作動する。分離ユニットで 磁化性(magnetisable)粒子を保持する代わりに、粒子は、磁場を連続的に通過す る間に磁場の方向に偏向される。流体の流れを２以上の出口に分割することによ り、粒子の偏向が、粒子を異なる組の粒子に分離するのに使用でき、各組の粒子 は、特定の流出口を介してフローチャンネルを出る。 連続分離システム(CSS)は、興味あるラベル化サンプルの内容物の効率的な濃 縮ならびに消耗をすることができる。CSSは、顕微鏡下にサンプルの光学性質の 平行検出と粒子分離の制御をさせるのに適するようにデザインする。 発明した分離フローチャンネルのジオメトリーの利点は、磁化または電子的に 荷電した粒子が、10〜30μｍの距離のみ移動させると、粒子含有流体から分離さ れることである。 その上、本発明は、同時に単一サンプルから多様な細胞または粒子の副集団を 分離できる。磁化性粒子、例えば磁性的にラベルした細胞について力Ｆの大きさ と方向は、磁場の強さとラベルした細胞で誘因される磁場モーメント数に依存す る。 Ｆ＝Ｎ^*Ｓ^*μＢ^*ｇｒａｄＢ 式中、Ｓは粒子当たりのボーア磁子（μＢ）数で、Ｎは細胞当たりの粒子数であ る。 小さなＳを有するビーズは、より大きいＳ値を有するビーズよりフローチャン ネルを経る流れに関し横方向に少ない距離を移動する。これは、異なる磁化性ビ ーズでラベルした細胞の副集団を分離するのに使用できる。フローチャンネルを 各種の排出チャンネルに分割することにより、細胞をそれらの個々のＦ値により 区別し、分離できる。 球状粒子の抗力は、粒子直径、流体に対する粒子速度及び流体粘度と密度に基 づき粒子レイノルズ数から見いだすことができる。100未満のレイノルズ数の流 れで、粒子の抗力Ｄは、ストークの法則の修正から見いだすことができる。 式中、μは液体の粘度、Ｕは粒子の相対速度かつｄは直径である。上記の式の右 側の括弧内の数値は、それが省略できる場合には、１未満のレイノルズ数に対し て１に近い。粒子についての抗力の大きさ、場で粒子に付加された力、粒子が移 動するのに必要な距離、分離に利用できる時間は、全て、分離法とそれを行う装 置をデザインするときに考察すべき重要な観点である。 重力手段による分離の例を示す。浮力のない重力として定義される効果的重力 Ｇは、次式で示される。 式中、ｇは重力定数である。単純化のために、１未満の粒子に対するレイノルズ 数を、抗力Ｄが単純な形態で生じるため、仮定する。これらの２つの力、Ｄ及び Ｇは、最大速度、沈降速度Ｕ_∞に達した際に等しくなる。この速度は、次式で見 いだすことができる。 所定時間ｔの速度は、次式で見いだすことができる。 直径が30μｍ、密度が水の密度の1.2倍を有する水における粒子に対し、沈降 速度は９×10^-5m/sである。粒子は、過渡相を無視できるので、2.1×10^-5秒後に この速度の90％に達する。粒子が30μｍの距離を移動するには0.33秒かかるため 、方法を分離目的に使用することができる。 化学や生化学での器具類は近年より自動化されているが、サンプルの調製は、 高度に実験室的に集約的な仕事が残されている。高い処理量を増大させ、有効な コストの分析装置とアッセイの使用を容易することが望まれている。この機会の 創成に、例えば世界的規模でヒトゲノムをシークエンスする努力がされ、新しい DNA診断と治療の開発がもたらされている。他の重要な傾向としては、患者を試 験し、低費用の環境で治療用途をモニターする、いわゆるポイントオブケアー分 析による、健康体のケアー費用と病院入院の減少がある。 遺伝子センサー(genosensors)として知られた核酸ハイブリッド化部位の配列 を含有するマイクロフロー装置が、ゲノム分析の多様な用途に開発されている。 遺伝子センサー全体の開発努力の大部分は、遺伝子センサーの実用における実験 条件の最適化に関する。 本発明の他の具体例は、マイクロチップ上のオリゴヌクレオチドの配列を含む 、遺伝子センサーと免疫センサー技術の低技術形態を扱うもので、遺伝子地図作 製とシーケンシングで最適な操作条件を決め、ハイブダイゼーション配列の応用 を開発す るのに使用できる。遺伝子センサー配列は、操作をフロースルー様式で行いうる マイクロフローチャンネルシステムに配置される。したがって、微量液体の取扱 いのいくつかの工程、例えば洗浄と染色工程、試薬添加は、自動的なルーチン手 順として一体化できる。加えて、免疫センサーとして公知の抗体／抗原部位の配 列を含むマイクロフロー装置が、同様に設計できる。このシステムは、コンビナ トリアルスクリーニング（高処理量スクリーニング）や薬物動態研究に使用でき る。 本発明の第６の観点によれば、上記及び他の目的は、流体の流れをフローチャ ンネルに案内するためそこに画定されたフローチャンネルと、粒子をフローチャ ンネルに導入する第１入口手段と、流体をフローチャンネルから排出する第１出 口手段及びフローチャンネルに位置し、固定化した試薬からなり、流体がフロー チャンネルに存在する間に複数の成分を分析できる複数のアッセイ部位を有する 部材からなる、流体成分を分析するマイクロフローシステムで満たされる。 このシステムは、さらに、対応するアッセイ部位に隣近した場を発生させるた めにアッセイ部位の少なくとも幾つかに隣近して位置される場の発生手段を備え ていてもよく、それにより、フローチャンネルに存在し、選択されたアッセイ部 位で発生した場に影響される試薬は、選択アッセイ部位に吸引され固定化される か、又は選択アッセイ部位から拒絶される。 本発明の具体例で、その部材は、平行か一連に配置された複数のフローチャン ネルを備え、それにより、その各々がアッセ イ部位を有し粒子含有流体が多数のアッセイ部位と接触する。 本発明の第７の観点によれば、流体成分を分析する方法は、粒子含有流体をフ ローチャンネルに導入し、複数のアッセイ部位を有し、その各々が固定化試薬を 有し、流体がチャンネルに存在する間に複数成分を分析できるチャンネルに流体 を流す工程からなる。 本発明の第８の観点によれば、フローチャンネル中で固定化された試薬からな るアッセイ部位の形成方法が提供され、その方法は、選択された試薬の固定化の ためのアッセイ部位の選択表面を調製し、選択試薬を対応する選択アッセイ部位 に隣接して分散し、選択部位に隣近した場を発生させ、発生した場で選択アッセ イ部位の表面に試薬を吸引及び接着させ、接触で表面に固定化する工程からなる 。 かくして、アッセイ部位を有するフローチャンネルを備えた前節のマイクロフ ローシステムは、各々の場の発生手段が対応する領域に隣近した場を発生する、 固定化試薬からなるように適用された領域の少なくとも幾つかに隣接して位置す る場の発生手段を備えていてもよく、それにより、フローチャンネルに導入され 、その領域で発生した場に影響される試薬は、その領域に吸引され固定化される か拒絶される。代わりに、マイクロフローシステムのチャンネル巾は、平面グリ ッド領域の少なくとも幾つかに隣接して位置した場発生手段を有する固定化試薬 を収容するように、平面グリッド領域を延長できる。他の具体例では、サンプル を同時に多数の試薬で分析するマイクロフ ローシステムは、各々がフローチャンネルに局在させた固定化試薬からなるよう に適応した複数の領域を有する多数の平行チャンネルからなり、かつ、さらに場 に影響される試薬が固定化される領域に隣近して場を発生させる場発生手段から なる配列からなっていてもよい。場発生手段は、例えば永久磁石、電極または電 磁石である。 アッセイ部位を有する装置は、生体または化学サンプル中の高分子、粒子や細 胞の迅速な操作、検出及び分析を可能にし、複数の試験を同じマイクロチップで 行うことができる。本発明によれば、マイクロフローシステムと分子生物学が組 み合わされている。図面の簡単な説明 本発明の具体例を、ここで添付の図面に関して記載する。 図１は、本発明による粒子の分離操作を示す。 図２は、本発明による分離フローチャンネルの断面を示し、（a）は主要な具 体例を示し、(b)は重力分離用の分離フローチャンネルの断面を示す。 図３は、場の発生手段として電極を有するマイクロフローシステムを示す。 図４は、本発明による磁性の粒子分離装置のフロー図を示す。 図５は、本発明の様々な具体例のフロー図を示す。(a)〜(d)は様々な数の入口 及び出口を有する具体例を示し、(e)は拡張した分離チェンバーを有する具体例 を示し、(f)は分離された粒子を回収する拡張されたチェンバーを有する具体例 を示す。 図６は、フローチャンネル内での磁性粒子の取り込みを示す。 図７は、遮断バルブを用いる光検出及び流体力学的分離についてのフロー図を 示す。 図８は、シリンジポンプを用いる光検出及び流体力学的分離についてのフロー 図を示す。 図９は、平行して(a)、及び連続して(b)ならびに(c)連結した２つのフローチ ャンネルのフロー図を示す。 図１０は、後処理機能又は流体力学的分離機能とさらに組合わさったマイクロ フローシステムからなる部材に前処理機能を導入している主材を示す。 図１１は、磁気泳動のためのフローチャンネルを示す。 図１２は、固定化プローブに電極を備えるアッセイ部位の連続した配列を有す るフローチャンネルを示す。 図１３は、固定化プローブに磁石を備えるアッセイ部位の連続した配列を有す るフローチャンネルを示す。 図１４は、固定化プローブに磁石を備えるアッセイ部位の平面配列を有するフ ローチャンネルを示す。 図１５(a)及び(b)は、それぞれがアッセイ部位を含む平行した配列のマイクロ フローチャンネルからなる２つの装置を示す。 図１６は、マイクロフローシステムの製造を示す。 図１７は、実施例３に記載の磁性分離からの図を示す。 図１８は、実施例４に記載された様々な分離方法を組み合わせることにより、 母親の血液サンプルから胎児細胞を分離する方法を示すフローチャートである。図面の詳細な説明 本発明の好ましい具体例によれば、磁性染色した粒子、例えば抗体結合性磁性 ビーズのような磁性粒子で免疫学的にラベルした細胞は、非磁性粒子、つまり非 ラベル細胞から、永久磁石又は電磁石を用いて生じた磁場に粒子をさらすことに より分離される。用いられ得る選択方法は、陽性又は陰性であってもよい。陽性 の細胞を分離することにより、特異的な細胞タイプの細胞が分離され、不均一な 細胞混合物から単離される。 図１は、本発明による分離方法の原理を示す。マイクロフ ローシステム１は、３つの入口及び２つの出口を有することが示されている。粒 子を含むサンプル９は、中央入口２を通して分離フローチャンネル５に入り、そ れぞれが個々に入口３及び４を介して分離フローチャンネルに入る２つの案内バ ッファー10及び11により、マイクロフローシステム１の分離フローチャンネル５ を通して連続的に案内される。磁石８からなる場の発生手段は、フローチャンネ ル５に隣合って位置し、フローチャンネル５を横切って磁場を生じる。粒子を含 むサンプル９が磁場を通過する際、磁性染色した粒子12は案内バッファー10に吸 引され、分類口６を介して案内バッファー10とともにフローチャンネル５から出 るが、流体９に残存する磁力により影響されない非ラベル細胞13は、排出口７を 通ってフローチャンネル５から出る。 チャンネルの規模が小さいために、フローは、ごくわずかな慣性力の影響で薄 層をなす。サンプルフロー及び案内バッファー混合物は、接触面積が小さく、接 触時間がサブセカンド(subsecond)の範囲に減じられるために検出できない。サ ンプルフローの厚みは、２つの案内バッファーの流量の変化により正確に調整す ることができる。これにより、様々な細胞タイプと大きさ用の磁性マイクロフロ ーシステムを調整し、最適化することができる。サンプルと２つの案内バッファ ーの流量は、サンプル中の粒子が粒子の一つの流れに整列するように調整される 。 マイクロフローチャンネルでの磁場は、磁性粒子、例えば細胞用の非常に感受 性のフィルターとして作用する。超常磁性 ビーズ（例えばMACS、Dynal）でラベルした細胞は磁化され、磁場に引きつけら れ、それにより磁化された粒子流が分類口に偏向される。フローチャンネル中の 流体の短い滞留時間及びフローチャンネル中のフローの低いレイノルズ数は、磁 気力の影響に比較して重力の影響を最小限にする。 図２は、半導体技術を利用して製造したマイクロフローシステム１の２つの変 異型の断面を示す。マイクロフローシステムは、ポリマー、ガラス、半導体（例 えばケイ素、ゲルマニウム、ガリウムアーシネイトなど）のようないずれかの適 切な材で製造することができる。 最初に示したマイクロフローシステム(a)は、３層のサンドイッチである。中 心層14は、それにエッチングされたフローチャンネル５を有するシリコンウェハ である。シリコンウェハ14は、例えば0.16mmの厚みを有するガラスプレートのよ うな透明なプレート15でカバーされる。フローチャンネル５内の流体は、例えば 顕微鏡16（検出手段）を利用してガラスプレート15を介して観察することができ る。流体の入口２及び出口７は、流体を導入するか、又はフローチャンネル５か ら流体を排棄するためのチューブ17、18、例えば取付けられたシリカキャピラリ ー又はテフロンチューブに連結する。バッファーの入口３ならびに４及び分離し た粒子用の出口６は示していない。例えばプラスチックでつくられる底のプレー ト19は、チューブ17、18の取付けを容易にする。 分離用のマイクロチャンネルシステムの変形(b)は、圧力域 として重力を有し、粒子をそれらの密度及ひ／又は拡散定数（主に粒子の形状と 大きさで制御される）により分類することを目的とした。システムは、操作のあ いだ、フローの面を重力方向に実質的に垂直に位置づける。図２(b)に示したよ うに、マイクロフローシステム１のこの具体例は、マイクロフローチャンネル５ の上に位置するサンプルの入口部分２ならびに出口部分７及びマイクロチャンネ ル５の下に位置するバッファーの入口３及び出口６を有する。粒子を含有するサ ンプル９は、入口２を通して分離フローチャンネルに入り、案内バッファー10は 、入口３を通して分離フローチャンネル５に入る。このようにして、水平な面に 沿って広がる流体の２つの薄層は、マイクロフローシステム１の分離フローチャ ンネル５を介して連続的な流れをつくる。粒子は、粒子を含有する層から案内バ ッファーの層に沈降によって移動する。粒子を含有するサンプル９がフローチャ ンネル５を通過する際に、一定の密度及び大きさの特性を有する粒子は、重力に より案内バッファー10に吸引され、出口６を通して案内バッファー10とともにフ ローチャンネル５から出るが、重力の場にあまり感受性ではない粒子はサンプル ９に残り、排出口７を介してフローチャンネル５から出る。サンプル中の特異的 な粒子の軸方向の転位は、その密度及び拡散定数ならびに案内バッファーの層と のサンプルの層の接触時間により生じる。接触時間は、マイクロフローシステム １を通過する流体の全流量及びマイクロフローチャンネル５の長さにより定義さ れる。システムは、所望又は適切な試験体が、 案内バッファーび粒子含有サンプルの容積の流量で調整することによって、それ らの密度及び／又は拡散定数によりサンプル流から回収し、分離することができ るように調整することができる。 また、マイクロフローシステムは、マイクロフローチャンネル５に第二及び第 三の案内バッファーを導入するため、マイクロチャンネルの上部で、サンプルの 入口２の両側に位置する２つのさらなる入口を含んでいてもよい。サンプルの流 量及び第二ならびに第三の案内バッファーは調整することができ、サンプルに含 まれる粒子は１つの列に整列される。 本発明のマイクロフローシステムの例示的な具体例、例えば図１及び２に示す 特徴を表１に示す。 表 １ マイクロフローシステムの特徴 図３は、フローチャンネル５を横切る電界を生じるように電極20、21を利用す るマイクロフローシステム１を示す。電極20、21は、粒子の分離に利用される誘 電性又は電気泳動性の力を誘導することができる。電気泳動分離を生じるために 、金の電極をフローチャンネル５の壁内に位置づけることができる。電極に電圧 を印加することにより、電界が、フローチャンネルの縦軸に実質的に垂直に生じ る。電界は、フローチャンネル５中の荷電粒子又は分子の偏向を引き起こし、そ れにより電気的に荷電した粒子は、マイクロフローチャンネルを流れる粒子を含 有するサンプルから離れて、フローチャンネルでも流れ、マイクロフローチャン ネル内の粒子含有サンプルに接触する案内バッファーに偏向される。 図４は、図１及び２に示すマイクロフローシステム１を含むマイクロフロー装 置22を示す。マイクロフローシステム１は、２つの入口２、３及び２つの出口６ 、７、２つのシリンジポンプ23、24、２つの３方向制御バルブ25、26及びキャピ ラリーチューブ27、28を有する。キャピラリーチューブ27、28は、そぞれ入口３ 、２を有するマイクロフローシステム１の２つのシリンジポンプ23、24を接続す るのに用いられる。 予め決められた速度でピストンを移動させる手段(例えばステッピングモータ ー(図示せず))を有する従来のシリンジポンプは、はめ込みチューブ27を介した 案内バッファーの連続的な流れ及びはめ込みチューブ28を介したサンプルの連続 的な流れを生じるのに利用されている。システムは、２つの３方向制御バルブ25 、26が、それぞれシリンジポンプ23、24及びバッファー貯蔵器29ならびにサンプ ル貯蔵器30間の流れのために開かれ、シリンジポンプ23、24が、それぞれ貯蔵器 29、30からのバッファー及びサンプルで充填されている最初の荷重モードで操作 することができる。連続的な第二の操作モードで、２つの３方向制御バルブ25、 26は、それぞれシリンジポンプ23、24及びマイクロフローシステム１のバッファ ーの入口３へのキャピラリーチューブ27ならびにサンプルの入口２へのキャピラ リーチューブ28間の流れのために開かれる。シリンジポンプは、この第二操作モ ードで制御され、マイクロフローシステム１を通して予め決められた容積の流量 を生じる。 図５は、本発明の様々な具体例を示すものであり、様々なジオメトリーのフロ ーチャンネルを有する様々なマイクロフローシステム31、32、33、34、35及び36 を例示する。２又は３の入口及び２、３又は５つの出口を有するマイクロフロー システムは、それぞれ図５(a)〜(d)に示す。サンプル及び２つの案内バッファー それぞれの入口、分類口ならびに排出口を有する５(a)に示すシステムは、図１ に示すシステムに類似している。図５(b)及び(c)は、それぞれ３及び５の多くの 出口を有する システムを示しており、そのシステムでは、粒子は、用いられる場に対する磁化 率にしたがって分類され、フローチャンネルから出すことができる。２つの入口 及び２つの出口を有する単純なシステムは、重力分類に用いられる図２(b)に類 似した図５(d)に示す。分離チャンネルの巾が分類口及び排出口の分岐点の前で 拡張される磁石を備えた分離チャンネルを有するマイクロフローシステムは、図 ５(e)に示す。フローチャンネル内の液体の挙動によれば、サンプル流により占 められる断面積の大きさは、分離チャンネルの巾に比例する。これにより、２つ の粒子Ａ及びＢ間の横断距離は、分離チャンネルの巾の増大に比例して増加する 。分離されるべき粒子間の距離が大きくなればなるほど、機械的分離の選択性が より高くなる。図５(f)は、流出チャンネル６の巾が増大されて、分類された粒 子がさらなる処理又は解析（例えば検出、染色、脱染色又は培養）のために回収 されるチェンバーが形成されるマイクロフローシステムを示す。 図６は、粒子が、電磁石を備えた装置を用いて、所望の時間マイクロフローチ ャンネル５内に捕らえられるシステムを示す。この場合、磁場が調整されて、磁 性粒子12が電磁石８に近いマイクロフローチャンネル５の内壁に吸引される。電 磁石８への電流を除くことにより、粒子12は再分散され、急速に分類口６に移動 する。この二段階の分類方法は連続的な分類方法に代わるもので、分類された細 胞フラクションの希釈が問題となり得る非常に稀な発生の分類に特に有用である 。分類口６は、電磁 石８へ電流がとおる際に閉じ、電磁石８へ電流がとおらない際に開いてもよい。 図は、連続的なサンプル流９から回収される処理における磁性粒子12を示す。磁 性粒子12は磁場で引きつけられ、電磁石８に近いマイクロフローチャンネル５の 内壁での沈降によりサンプル流９から回収される。電磁石８に供給される電流が 消えた際に、磁性粒子12は再び流れに再放出される。分離フローチャンネルは分 類口を有しないものであってもよく、代わりにバッファーがサンプルの後にマイ クロフローチャンネル５に入り、捕らえられた粒子が、電磁石８に供給される電 流を除去することにより放出できる。 図７は、流休力学的力によりサンプル９から一定の基準を充たす粒子を分離す るための本発明の別の具体例を示す。装置は、２方向バルブ40及び３つの入口２ 、３、４、２つの出口６、７を有する分離フローチャンネル５及び回収チェンバ ー37を有するマイクロフローシステムからなる。粒子を含有するサンプル９は、 中央の入口２を通って分離フローチャンネル５に入り、それぞれが、対応する入 口３及び４を介して分離フローチャンネル５に入る２つの案内バッファー10及び 11により、マイクロフローシステムの分離フローチャンネル５を介して連続的に 案内される。サンプル９は、対物顕微鏡16を利用してモニターする。装置は、２ 方向バルブ40を制御するための制御手段38を有する。制御手段は、光学的な検出 手段、例えば対物顕微鏡16に光学的に接続した光電子増倍管システム(PMT)、CCD カメラ／チップ又はフォトダイオードを有するモニター手段からなる。 対象物16は、フローチャンネル５内に局在する容積の測定に焦点が合わせられる 。測定容積の大きさは、光学検出器の前に位置するピンホール又は溝39及び対象 物16の拡大により定義される。２方向バルブ40、例えば圧電性で必要に応じて滴 下するインクジェットプリンティングバルブは、回収チェンバー37を分類口６に 接続する。排出口チャンネル７の流れの制限は、分類口チャンネルの流れの制限 よりかなり高い。これは、排出口チャンネル７にフローレストリクター（図示せ ず）を取付けることによりなし得る。したがって、２方向バルブ40が開かれると 、粒子を含有するサンプル９は分類口６へ偏向される。回収チェンバー37は、分 析後に分類された粒子を回収し、捕捉するのに用いられる。他の粒子は、排出口 ７を通って流出を続ける。 粒子は、各粒子における光学的な測定による流体力学的力を用いて物理的に分 離される。光電子増倍管(PMT)の信号は、測定容積にある粒子が、制御手段38内 にも含まれるパルス波高分析器をとおった際に生じる。特異的な粒子が予め決め られたタイプの測光特性を示すときは、選択回路は常に活性信号を生じる。特異 的な粒子に対するPMT信号が、粒子が特異的なタイプであることを示す場合は、 駆動(actuation)パルスが生じる。バルブ40が駆動パルスで開くと、特異的な粒 子を含有する液体が分類口６を通って流れ、回収チェンバー37内に捕捉される。 発動パルスの継続時間は、所望の粒子が回収チェンバー37に輸送されるのに十分 な長時間がとられる。光の励起には、幾つかの源、例えばレーザー、タングステ ン電球、フォトダイオード を用いることができる。光の集束には、ファイバーオプティックケーブル、フォ トレンズ、対物又は光学顕微鏡を用いることができる。様々な光学的な検出方法 、例えば蛍光発光、吸光度を用いることができる。 マイクロフローシステムは、顕微鏡に対して選択された位置に移動でき、それ により適切な量のマイクロフローチャンネルが装置の測定容量に移動できるよう に、移動可能なテーブル上に位置していてもよい。 分類の間か、その後に、捕捉されたサンプルは、例えば顕微鏡を用いて再度分 析することができる。バルブ40が閉じられる際に、粒子は回収チェンバー37内に 取り込まれ、所望の時間観察することができる。粒子又は細胞の洗浄、培養又は 染色用の所望の液体又は試薬は、回収チェンバー37内に導入していてもよい。分 離処理後、粒子は、入口２、３、４の１つを介してマイクロフローシステムに入 る適切なバッファーで回収チェンバー37をフラッシングすることにより、回収す ることができる。 分類装置は、分離されたサンプルフラクションを最小限に希釈するようにデザ インした。粒子の流体力学的な分離は、粒子を含有するサンプルの光学的、電気 的、磁性及び／又は他の特性により行うことができる。 蛍光発光検出に基づく装置の光学及び機械的配置の例は、図７に分離的に示す 。サンプル９、例えば粒子の懸濁液は、２つの案内バッファー10、11により分離 チャンネル５を介して案内され、サンプル９に含まれる粒子は、対象物16の光軸 に垂直な 面で単一の流れに整列される。流れは、例えば蛍光測定用の励起を通す水銀アー クランプのフィルターで照らす。ダイクロイックミラーは、顕微鏡の対象物16を 例えば20倍して分類チップに励起光を反射する。蛍光発光は、ダイクロイックミ ラーを通過する同じ対象物16により回収する。ミラーの後ろで、溝39は、小さな 溝に検出領域を限定する磁場停止物として作用する。対象物16を通る各粒子は、 対象物16に光学的に接続する光電子増倍管から短い信号を生じる。光電子増倍管 信号は増巾され、ピーク検出器に伝えられる。 この装置で用いられるバルブ40の駆動頻度は1500Hzで、0.6m秒の最小限の駆動 時間に相当する。 図８は、３つの入口２、３、４及び２つの入口６、７を有する分離フローチャ ンネルを有する図７に示す分離装置の別の具体例を示す。粒子を含むサンプルは 、中央口２を通って分離フローチャンネル５に入り、２つの案内バッファーはそ れぞれ他の２つの入口３、４を通ってチャンネル５に入る。シリンジポンプ41、 42を駆動するステッパーモーターからなる流速調整手段は、それぞれ２つの入口 ６、７に接続する。シリンジポンプ41、42は、それぞれ入口２、３及び４を介し て分離フローチャンネル５を通ったサンプル及びバッファーを吸い込む。細胞は 、対物顕微鏡16の光軸でモニターし、分離点に流れる。案内バッファーびサンプ ルを含む未選択細胞は、排出口のシリンジポンプ42へ流出する。特異的な細胞が 駆動パルスを引き起こす光学的性質を有する場合、分類口でのポンプ41のステッ パーモー ターが駆動され、排出口でのポンプ42のステッパーモーターが停止されて、液体 を分類口６に流れさせる。分類口でポンプ41のスイッチがつけられ、それぞれ排 出口でのポンプ42のスイッチが切られる時間は、所望の細胞が回収チェンバー37 に入るのを確実にするのに十分な時間である。幾らかの操作時間後、１、又は両 方のシリンジポンプ41、42を空にする必要がある際、３方向バルブ43、44は、分 離フローチャンネル５からシリンジポンプ41、42それぞれへの流れのために開く 通常の操作から、３方向バルブ43、44がシリンジポンプ41、42及び排出コンテナ （図示せず）間の流れのために開き、かつシリンジポンプ41、42を駆動するステ ッパーモーターがシリンジポンプ41、42を空にするために通常の操作方向の逆方 向で操作される位置に切り替えられる。 図９(a)は、平行して操作する２つのフローチャンネル45、46を示す。サンプ ルを含む粒子は、それぞれ入口47、48を介してフローチャンネル45、46に入る。 案内バッファーは、それぞれ入口49、50を介してフローチャンネルに入る。フロ ーチャンネル45、46で、それぞれ磁石51、52により生じる磁場に影響される粒子 は、サンプルを含む粒子から対応する案内バッファーへ偏向し、その後分類口53 を通って流れる。サンプルの残りの部分は、排出口54、55それぞれを介してフロ ーチャンネル45、46から出る。分離は、平行して連結した複数のフローチャンネ ルを利用して増大される。 図９(b)及び(c)は、磁気、流体力学又は重力分離用のマイ クロフローシステムの組合せ例を示す。図９(b)で、粒子は、磁性分離チャンネ ル中のサンプルから最初に分離され、その後分類された粒子は、粒子の光学特性 により流体力学的な分離に付される。したがって、サンプルからの粒子を粒子の 光学及び磁性特性の両方の性質に基づいて分析し、分離するか、又は別の特性又 は特徴を組合わせることができる。図９(c)で、２つの磁性分離チャンネルは、 高度に生成される生成物を得るために連続して接続される。 図１０は、蛍光又は磁性プローブで粒子を自動的にラベルする手段を有するマ イクロフローシステムの例を示す。システムは、プローブの除去又は分類された 粒子の他の処理のための処理後手段と組合わさっていてもよい。システムは、液 体、例えば細胞の溶解用又は染色用試薬をサンプルに添加するためのチャンネル 56、57、さらに処理するためのサンプルのインキュベーション及び培養又は貯蔵 用チャンネル58及び分離チャンネル５を含むマイクロフローシステムを含む。サ ンプルは、入口２を介してマイクロフローシステムに導入され、１以上の試薬が サンプルに連続的に加えることができ、インキュベーションチャンネル58に輸送 される。単純なマイクロフロー構造は、処理前のサンプル用に構築した。流量は 、コンピューター制御のシリンジポンプにより管理することが好ましい。サンプ ルの混合及び解析のあいだのインキュベーション時間は、シリンジポンプの容積 の流量及びインキュベーションチャンネルの断面積ならびに長さで生じる。 図１１は、高分子、例えばリボ核酸又はタンパク質をサンプルから磁性分離す るためのマイクロフローシステムを示す。蛍光色素及びプローブ、DNAに特異的 なものでラベルした磁性ビーズはサンプルに加えられ、次いでインキュベートさ れる。このサンプルは、入口２を介して分離チェンバー５に入り、粒子は、それ らの移動度により分離チャンネル５に沿って磁石で生じる磁場により吸引される 。一定時間後に磁場を除き、蛍光バンドを顕微鏡で観察することができる。公知 の大きさのスタンダードを用いることにより、電気泳動と同様にしてシステムを 測定し、大きさ及び形状によって例えばDNAの粒子を分離することができる。 図１２（ｂ）に詳細にしている図１２（ａ）は、連続センサー配列を示す。マ イクロフローチャンネル５は複数のアッセイ部位を有しをおり、そのアッセイ部 位はそれぞれ個別に通電又は切断される場発生手段59を備えている。ここに示す フローチャンネル５は、その底壁に小さな溝状に配置された矩形電極59を有する 。電圧は各電極59に選択的に印加される。フローチャンネル５内に対応するプロ ーブ、レセプター及び指示薬等を含む流体が存在する場合には、選択された電極 59に電圧を印加して種々のプローブ、レセプター及び指示薬を選択された電極59 に誘引又は固定してもよい。複数のアッセイ部位の製造は、特定のプローブを各 アッセイ部位に連続的に負荷して行ってもよい。電圧はマイクロフローチャンネ ル５内の１つ以上の特定の電極に印加され、特定のプローブ、試薬及び指示薬等 を含む 流体はマイクロフローチャンネル５内に導入され、プローブ等は電圧が印加され る電極59に誘引される。次に、電圧が切断される。その後、電圧は次の電極59に 印加され、特定のプローブ等を含む次の流体がマイクロフローチャンネル５内に 導入される。このように、特定のプローブ、試薬又は指示薬をそれぞれ含む種々 のアッセイ部位を作製することができる。プローブの例としては、抗体、蛍光性 分子、DNA、RNA及びタンパク質染料が挙げられる。 磁性を有するプローブ等を所望のアッセイ部位に固定する際には、電極59を用 いるかわりにマイクロフローチャンネル５の表面近傍に配置した電磁石配列を用 いてアッセイ部位に選択的に磁力を印加することができる。又は、アッセイ部位 でのチャンネル５表面への分子又は粒子の共重結合を目的として、光活性法を用 いることもできる。 プローブのひとつの例として、全体的に負の電荷を有し、正のバイアスにより 電極59表面に誘引されるDNAが挙げられる。もうひとつの例としては、磁気手段 によりマイクロフローチャンネル５の表面に吸引されるDNA被膜磁性粒子が挙げ られる。 マイクロフローチャンネル５表面及び／又は電極59又は磁石の固定又は被膜に より、特定の化学的及び機械的特性を得ることができる。プローブの結合力を増 加させるために、特定の層又はマトリクス、例えばウレタンや反応性化学基など のポリマーで表面を被膜してもよい。選択された電極又は電磁石への電流が切断 されたときは、プローブは例えば吸着などにより表 面に残留する。分子の包膜又は固定は、このようにしてなされる。 このように、フローチャンネル５内の選択されたアッセイ部位で発生した場を 生体分子などの粒子の固定に利用することにより、粒子はフローチャンネル内で 実質的に固定された位置に永久的に保持されるか、又は粒子と導入した試薬との 化学反応及び／又は粒子の運動速度測定及び／又は異なる化学物質との粒子の接 触を行うために特定の期間保持される。マイクロフローシステム中の反応分析に ついては、光学的な検知手段、例えば顕微鏡を使用してもよい。 この装置の重要な利点は、ひとつの装置で多数のアッセイが可能なことである 。装置の操作中、洗浄工程、試薬添加などの種々の処理工程を行うことができる 。 図１３は、フローチャンネル５、連続配列のアッセイ部位及び分類カートリッ ジ60上に配置した永久磁石８を備えたマイクロフロー装置を示す。第２カートリ ッジ61は、入口２及び排出口７を備えたフローチャンネル５を有する。磁石８を 備えたカートリッジ60は、第２カートリッジ61直下に配置することができるため 、図に示すように、磁石８がカートリッジ61下のフローチャンネル５内のアッセ イ部位の下に正確に配置される。 磁界を利用して特定のアッセイ部位に固定されるプローブは、図１２又は１３ に記載のように、フローチャンネル５表面のアッセイ部位に磁性プローブ又は試 薬を固定するために、インクジェット式ディスペンサ技術を用いて磁性プローブ や試薬を 含む一定容量の液体を永久磁石８上のフローチャンネル５の特定の容量中に配置 する工程からなる方法により、所望のアッセイ部位に配置することができる。こ の方法は、それぞれ種々のアッセイ部位に固定される種々のプローブに繰り返す ることができる。固定したのち、フローチャンネル５を含むカートリッジ61は、 マイクロフローチャンネル５内のプローブを有するアッセイ部位が目視できるよ うに、例えばガラス板等の透明なカートリッジ15で覆われる。アッセイ部位配列 での分析は、サンプルを入口２からマイクロフローチャンネル５内に導入し、ア ッセイ部位配列を通って排出口７からマイクロフローチャンネル５外へ排出する ことにより行う。蛍光顕微鏡などの光学検知器に光学的に接続した対物レンズ16 は、アッセイ部位での化学反応をモニターするためにマイクロフローチャンネル ５内の配列に焦点を合わせることができる。 図１４は、平面配列されたアッセイ部位63を含むマイクロフローチャンネルを 備えたカートリッジ62、永久磁石８を備えたカートリッジ64及びマイクロフロー チャンネルとカートリッジ62を覆うための透明カートリッジ（図示せず）からな る本発明の別の実施例を示す。アッセイ部位63は、マイクロフローチャンネルの 底壁表面にて小さな溝状に形成される。カートリッジ62、64の大きさ及びアッセ イ部位63と磁石８の位置は同じであるので、カートリッジ62が図１４（ｂ）に示 すようにカートリッジ64上に配置された場合、磁石８はアッセイ部位63の下に配 置される。 図１２、１３及び１４に示す実施例は、以下に示すようにDNAハイブリダイゼ ーションに利用してもよい。前記のようにDNAプローブを含む磁性キャリアは、 特定のアッセイ部位に固定してもよい。このようにマイクロフローチャンネル内 にアッセイ部位配列が形成され、各アッセイ部位は異なるDNAプローブを含む。 その後、標的分子を含むサンプルを、好ましくはサンプルがマイクロフローチャ ンネル内に充満するまで導入する。標的分子が特定のアッセイ部位のDNAにハイ ブリダイズされた後、蛍光性プローブ等のリポータープローブ溶液をフローチャ ンネル内に導入し、溶液をハイブリダイズしたDNAを有するアッセイ部位に結合 させる。異なるアッセイ部位に焦点を合わせた光電増倍管などの蛍光検知器を使 用することにより、各アッセイ部位での反応をモニターできる。特定のアッセイ 部位での磁界を排除することによりDNAプローブを含む磁性物質を除去すること ができるので、工程を逆にすることができる。このように更新可能なアッセイ部 位配列が形成され、洗浄工程がアッセイ部位の操作中に行うことができる。 図１５（ａ）は、アッセイ部位の平行配列を用いてマイクロフローシステムで の複合アッセイ分析を行う本発明の装置を示す。装置は平行マイクロフローチャ ンネル65の配列からなり、その配列は前記のように例えば電界、磁界を用いて、 又は光活性により固定された特定のプローブを備えたひとつのアッセイ部位をそ れぞれ有する。例えば、永久磁石（図示せず）を含むカートリッジは平行マイク ロフローチャンネル65の下に配置す ることができるため、磁性プローブは分配技術を用いてマイクロフローシステム に固定することができる。このように、複数の平行マイクロフローチャンネル65 により確定される複数のプローブ又は試薬とサンプルを同時に分析するために、 平行フローチャンネル65に複数のアッセイ部位を形成してもよい。 マイクロフローシステムは、アッセイ部位をそれぞれ含む複数の平行マイクロ フローチャンネル65を介して接続される２つの平行フローチャンネル66及び67か らなる。注入フローチャンネル66は注入口２を有し、遮断バルブ69を介して排出 口68に接続される。排出フローチャンネル67は、遮断バルブ71を介して排出口70 に接続される。２つの排出口68及び70の１つを遮断バルブ69、71でそれぞれ遮断 することにより、アッセイ部位を含むチャンネル配列65又は注入チャンネル排出 口68それぞれへ注入された流れを導くことができる。アッセイ部位を含むすべて のチャンネル65を通る流れは、排出チャンネル67に移動し、排出口70を介して装 置から排出される。アッセイ部位を含むチャンネル65を通過する間、サンプル検 出プローブと接触し、アッセイ部位に固定される。化学反応は図１２に示すよう にして検知される。 図１５（ｂ）は、アッセイ部位を含む平行チャンネル65の配列の別の実施例を 示す。マイクロフローシステムは、システム中に異なる液体を導入するための３ つの注入口２、３及び４を有する。排出口68をフローレストリクターに接続する ことにより、システムを操作する際に必要な遮断バルブは遮断バルブ71 のみとなる。チャンネル配列65と排出口70間の遮断バルブ71が閉鎖されると、チ ャンネル配列65は遮断され、注入口２、３及び４からの流れが注入チャンネル66 を通り、排出口68を介してシステムから排出される。遮断バルブ71が開放されて いるとき、注入チャンネル66に導入された液体は排出口68での流れの制限が剰排 出口70より高いため、センサーチャンネル配列65中に流入する。 図１６は、３層のサンドイッチ状に製造したマイクロフローシステムを示す。 中心層は、フローチャンネルがエッチングされたシリコンウェハである。シリコ ンウェハは、例えば厚み0.16mmのガラス板などの透明板で覆われている。フロー チャンネル内の流体は、例えば顕微鏡又はその他の光学検知手段を用い、ガラス 板を通してモニターできる。流体注入口及び排出口は、流体をフローチャンネル に導入又はフローチャンネル外に排出するため、融合シリカキャピラリー又はテ フロンチューブ等のチューブに接続される。分類された粒子用のバッファー注入 口及び排出口は、図示していない。プラスチックなどで作製した下部取付板は、 チューブの取り付けを容易にする。 図１６（１）から（５）は、マイクロフローシステムの製造及び作製について の以下の記載を例示する。分類フローチャンネルは、シリコン／ガラス結合サン ドイッチ体からなるシステムに適合するようにデザインした。顕微鏡などを用い て観察できるように、マイクロチャンネルは厚さ0.2mmのボロンガラス板で覆わ れたシリコンウェハにエッチングした。分離フロー チャンネルは、4''350μm＜100＞シリコンウェハ上に形成した。1.5μmのSiO₂層 をシリコンウェハ表面に塗布し、チャンネルを組み込んだマスクを用いてパター ニングした。2.6μmのホトレジスト層をSiO₂上に塗布し、中間開口を画定するマ スクを用いてパターニングした。垂直壁を有する２層構造をSF₆:O₂プラズマの反 応性イオンエッチング(RIE)にてエッチングするために、SiO₂マスタとホトレジ ストマスクからなる２段階マスクを用いた。開口は最初に22μmの深さまでエッ チングし、その後チャンネルと共に40〜100μmの範囲でさらに深くエッチングし た。1.8μmのSiO₂層をシリコンウェハの後部にて注入口及び排出口のためのマス クを用いてパターニングした。エッチングはKOH下80℃にて行い、後部からすべ ての中間開口が確認されたときに終了した。最後にガラスウェハをシリコンウェ ハに陽極として結合させた。マイクロチャンネルは、容量流量0.1〜200μl/分、 平均最高流速100(mm／分）となるようにデザインした。 分離フローチャンネルは、１又は２つの永久磁石もしくは電磁石を３つの異な る様式で備えることができる。 a)1.0 ｘ 1.0 ｘ 0.5mmの希土類サマリウム−コバルトブロック磁石（Goudsmit 、オランダ）を分離フローチャンネルの開口溝にシリコンラバーで貼り付けても よい。 b)希土類(Sr)磁性粉末(Tropag，Hamburg，ドイツ)をエポキシと1:1(v/v)にて混 合し、この磁性ペーストを分離フローチャンネルの開口溝に1.0 ｘ 1.0 ｘ 0.5m mの厚い磁性フィルム層を 形成するように貼り付けてもよい。 c)フェライトスチールウールを分離フローチャンネルの開口溝にシリコンラバー を用いて貼り付けてもよい。分離フローチャンネル近傍に配置された電磁石（Go udsmit、オランダ）などによる外部磁界を利用することにより、開口溝内での高 い磁界勾配を誘導することができる。実施例１ 注入口と排出口を各２個ずつ有する図５（ｄ）に記載した配置のマイクロフロ ーシステムにて、種々の磁化性粒子の分離について試験した。試験条件は以下に 示すとおりである。 粒子濃度 10⁷粒子／ml 全流量 25μl/分 フローチップ長 3.5mm チャンネル巾 250μｍ チャンネル深さ 60μｍ 分離時間 2.4秒 所望の粒子偏向 10μm 分離効率（濃縮率）Ｅ及び減損(depletion)率1/Eは、次式により定義される； 異なる大きさの様々な常磁性標準ビーズ及び常磁性磁界強度の分離について、 表２に結果を示す。 表２ 分離効率 ¹全流量：A)=10μl/分，B)=50μl/分，C)=100μL/分実施例２ 続いて、実施例１で用いたマイクロフローシステムをヒトＴリンパ球（JURKAT 細胞）の分離について試験した。磁性染色したものと非染色のJURKAT細胞は、外 来細胞サンプルをつくるのに用いた。細胞の磁性染色には、Miltenyi Biotechの CD-4磁性表面マーカーを用いた。JURKAT細胞は、濃度10⁷／mlで１％のPBS/BSA中 に懸濁した。ビオチン複合CD4磁性マイクロビーズは、製造者の指示に従って２ μｌストック／10⁷細胞で添加した。 磁性染色細胞（10⁷細胞／ml）は10分間マイクロチップ内を流動し、流体は２ つの注入口にて回収された。異なる流量(5、25、50μl/分）にて３つの実験を行 った。同様の実験を磁性染 色していない細胞を用いて行った。 回収したサンプルのアリコートを顕微鏡にて分析し、粒子をニューバウエル顕 微鏡チェンバーを用いて計測した。各実験に対し１μｌのサンプルを分析した。Run 流量（μl／分） 分類口での細胞（％） 陰性(非染色細胞) 5 ＜0.1 25 ＜0.1 50 ＜0.1 コントロール¹ 5 ｎ.ｎ 25 ｎ.ｎ 50 ｎ.ｎ 陽性（染色細胞） 5 95.5 25 92.8 50 80.5 コントロール 5 ｎ.ｎ 25 ｎ.ｎ 50 ｎ.ｎ ¹ 集積(integrated)磁石を用いないマイクロフローシステムを用いた。実施例３ サンプルからの磁化性粒子の分離に用いたシステムを図４に示す。この装置は 、0.5mlのマイクロシリンジ（Hamiltpn，Bonaduz,スイス）を用いて0.1〜100μl /分の流量を一定にする２つの注入ポンプ(Harvard Apparatus，Southantik，Az) 、磁化性粒子を分離するシリコンの分離フローチャンネル及び分類 した粒子を回収する回収ユニットからなる。無菌溶液操作を目的として、２つの ３方向マイクロバルブ(Lee，Parameter AB、スウェーデン)を装置に組み込んだ 。すべての構成部品は融合シリカキャピラリー(340μm id，Supelco、合衆国)を 用いて相互に接続した。SFCは、分離工程を観察するために倒立顕微鏡（Axiover t 100、Zeiss、ドイツ）下に配置した。すべてのマイクロチャンネル及びチュー ブは、Blankensein，G.Scampavia L，Branebjerg J，Larsen UD.Ruzicka J(1996 ):Flow switch for analyte injection and cell/particle sorting in Analyti cal Methods and Instrumentation，μTAS'96 conference，17〜22，November 1 996、Baselに記載のようにシラン化することにより不活性化させた。488nmの励 起アルゴンレーザを用いたFACScan、前方及び側方散乱回収、フルオレセインの 蛍光発光を全ての実験に使用した（Becton Dickinson、Mountain View CA）。結 果を回収し、FACScan研究用ソフトウェア(Becton Dickinson)を用いて分析した 。 図１７にDynalビーズ用に最適化した永久磁石を備えた分離フローチャンネル を使用した結果を示す。ラベルなしの磁性Dynal粒子(直径4.5μm，M-450)と蛍光 性キャリブレーションビーズ（直径3.2μｍ，Dako A/S,Glostrup,デンマーク） の混合物を含む１〜５×10⁸粒子／mlのビーズ懸濁液を分離した。排出口にて約 １mlの非磁性、非偏向性フラクションを回収し、フローサイトメトリーにより分 析した（Ｂ）。陽極及び陰極フラクションを計測するため、２つの開窓を設けて 統計的に評価 した。分離前、サンプルはそれぞれ蛍光性粒子38.3％、磁性粒子55.8％を含有し ていた(a)。記載のシステムによる分類後、分類排出口に回収された分類フラク ション中にほとんどすべての磁性粒子が確認され(b)、非磁性粒子は排出口から 回収された陰極フラクション(c)中に確認された。最適条件下にて、濃縮率350が 実現可能であった。実施例４ この実施例は、磁性活性細胞分類を目的としたサンプル中の胎児細胞の濃縮に 関する。図７及び１０（上部）に示す本発明の実施例の光学サイトメトリと図４ 及び１０（下部）の磁性細胞分離の組み合わせにより、サンプル中の胎児細胞を 有効に濃縮する効果的な装置が提供される。 母体血液サンプル中の胎児細胞濃度を増加させる工程は、次の２つの工程（図 １８参照）、すなわち(i)体積、大きさ及び密度による母体血液細胞の主要部分 の除去のための第１選別工程、(ii)図７に記載の装置を用いた免疫蛍光分離及び ／又は図４に記載の装置を用いた免疫磁性分離により、胎児血液細胞を残存する 母体血液細胞から単離させる第２分類工程を含む。図９(b)に示す実施例におい て、磁性血液サンプルは最初に磁性分離チェンバーにて分離され、その後サンプ ルの光学特性に基づき分離されるか、またはより高純度の製品を得るために連続 する２回の磁性分離に付される（図９(c)参照）。 非侵襲の出生前スクリーニングテストにてごく低濃度の粒子を母体血液サンプ ルから分類する例を以下に記載する。 母体血液中の有核赤血球細胞は、すべての有核細胞１mlあたり10〜1000の濃度 で確認した。Bianchi(D.W.Bianchi，Journal of Pediatrics，1995，127，6，p. 847-856)には、このような細胞を出生前診断の遺伝子のスクリーニングに使用で きることが示されている。例えば細胞表面マーカーCD71⁺は、母体血液からこの ような細胞を選別する際に適切なマーカーである。試験の結果、磁性活性細胞の 分類は、母体血液から胎児の有核血液細胞を分類し単離するための有効な濃縮体 系であることが示している。この際、本発明に記載したように磁性活性細胞マイ クロ技術を使用している。胎児細胞は、胎児有核血液細胞の細胞膜のみに存在す る特定の表面マーカー(CD71)を使用することにより、母体血液と区別され、分離 される。CD71に磁性抗体プローブを選択的に付着させることにより、磁性プロー ブは実質的に胎児細胞のみに付着される。実施例５ この実施例は、臍帯血でスパイクした母体血液サンプルからの磁性ラベルした CD45陽性細胞（母体の白血球）の減損に関する。図１に記載のフローチップを図 ４に記載のシステムにて使用した。この実験では、磁性分離能力を立証するため に1:3のスパイク(胎児／母親、v/v)を使用した。抗凝固剤としてヘパリンを使用 した。有核細胞は、第１層としてCD45に対するモノクローナル抗体を用いて、CD 45被膜0.1μのマイクロ粒子(Immunicom，合衆国)でラベルした。細胞懸濁液は、 両排出口６及び７で回収した（図１参照）。選別有効力を試験するため、回 収されたフラクションの一部を顕微鏡スライドにて分析した。 その結果、選別排出口６にて回収した細胞のほとんど（95％以上）がCD45陽性で あった。実施例６ 図７に記載の装置を用いた蛍光活性細胞分類。最初の結果は300より高い濃縮 因子(enrichment factor)を示し、使用した装置が希少な細胞の事象の増大に効 果的な道具であることが示された。実施例７ 一回の工程で分析物の群を検知する複数のセンサー配列技術の使用について、 図１２に記載の本発明の実施例の一例を示す。この際、抗原又は抗体等の生体検 知要素をフローチャンネルの特定のアッセイに負荷させて固定することができる 。 抗原プローブを有する磁性粒子は、磁性手段によりマイクロフローチャンネル 表面に固定される。各プローブの固定は、特定の電磁石に通電することにより厳 密に部位に特定される。 異なる群の抗原プローブを表面に負荷させたのち、試験溶液をマイクロチップ のフローチャンネル５に案内する。サンプルが様々な抗体の１つに対して相補的 な抗体を含む場合、サンプルは特定の部位に結合し、この抗体が固定される。第 ３工程において、サンプル溶液を除去し、第１抗体のFC領域に対する第２抗体を 含む液体をマイクロフローチャンネル内に案内する。第２抗体は蛍光染料と結合 し、抗体が結合した特定のアッセイ部位を同定することができる。この装置は、 血液サンプルの迅 速なスクリーニング、例えばウイルス／細菌の特定の抗原プローブを備えたマイ クロフローチャンネルを有する血液中の細菌又はウイルスの同定に用いることが できる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年１１月１２日（１９９８．１１．１２） 【補正内容】 請求の範囲 １． 粒子を含有する流体の流れをフローチャンネルに案内する部材に画定され たフローチャンネルと、 流体をフローチャンネルに導入するためフローチャンネルの一端に位置した第 １の入口手段と、 粒子を含有する流体流のフローチャンネルを経る断面と通路を制御するための 第１案内バッファーを導入する第２入口手段と、 流体をフローチャンネルから排出するためフローチャンネルの他端に位置した 第１出口手段とを有する部材を具備し、 粒子を含有する流体の流れが、一時に１つの粒子がフローチャンネルの断面を 通過するように制御され、かつ部材は、フローチャンネルに存在しかつフローチ ャンネルを横切る場に影響される粒子が場の方向で第１案内バッファーに偏向さ れるように、フローチャンネルの縦軸に実質的に垂直である場に位置される粒子 分離用のマイクロフローシステム。２ ． さらに、第２案内バッファーを導入する第３入口手段を備え、粒子を含有 する流体流のフローチャンネルを経る断面と通路が、粒子を含有する流体流を囲 む第１と第２案内バッファー流によって制御される請求項１によるマイクロフロ ーシステム。３ ． 粒子を含有する流体流の巾と位置が、流体流量と案内バッファー流量の容 量比の調整によって制御される請求項２に よるマイクロフローシステム。４ ． 部材が、さらに、フローチャンネルの縦軸に実質的に垂直な場を発生する ためのフローチャンネルに隣近した場発生手段を有する前記請求項の何れかによ るマイクロフローシステム。５ ． さらに、フローチャンネル内で測定容量内にある粒子のパラメータをモニ ターし、モニターしたパラメータに対応する出力信号を出すフローチャンネルに 位置したモニター手段を有する前記請求項の何れかによるマイクロフローシステ ム。６ ． モニター手段が、フローチャンネル内の測定容量内にある粒子の光学パラ メータをモニターし、光学パラメータに対応する出力信号を出す光学検出手段か らなる請求項５によるマイクロフローシステム。７ ． モニター手段が、フローチャンネルの特定容量内の磁性粒子の磁性パラメ ータの測定用のハルセンサーからなる請求項５又は６によるマイクロフローシス テム。８ ． さらに、モニター手段の出力信号に応じて場発生手段により発生した場の 強度を制御する場発生制御手段を備え、粒子がモニター手段によってモニターさ れたパラメータ値に従って分離される請求項５〜７の何れかによるマイクロフロ ーシステム。９ ． 粒子を含有する流体流のチャンネルにおけるレイノルズ数が、0.01〜500 の範囲、好ましくは0.05〜50の範囲、特に0.1〜25の範囲である前記請求項の何 れかによるマイクロフローシステム。１０ ． フローチャンネルの最低断面積が0.004〜0．11mm²の範囲である請求項 １〜８の何れかによるマイクロフローシステム。１１ ． さらに、フローチャンネルで偏向された粒子を排出する第２出口手段を 備える前記請求項の何れかによるマイクロフローシステム。１２ ． 場発生手段が磁石からなる前記請求項の何れかによるマイクロフローシ ステム。１３ ． 場発生手段が、さらに磁場の焦点化のためにフローチャンネルに位置し たフェライト部材からなる請求項１２によるマイクロフローシステム。１４ ． 場発生手段が電極からなる前記請求項の何れかによるマイクロフローシ ステム。１５ ． 場発生手段のフローチャンネルに対する位置が、フローチャンネルに対 する場の強度を調整するために調整可能である前記請求項の何れかによるマイク ロフローシステム。１６ ． さらに、フローチャンネル内にある粒子の時間を調整するための流速調 整手段を備える前記請求項の何れかによるマイクロフローシステム。１７ ． さらに、フローチャンネルを覆うカバーを備える前記請求項の何れかに よるマイクロフローシステム。１８ ． カバーが、フローチャンネルを光学的にモニターできる透明又は半透明 カバーである請求項１７によるマイクロフローシステム。１９ ． 偏向した粒子が生細胞からなる前記請求項の何れかにるマイクロフロー システム。２０ ． 偏向した粒子が、ビーズ、ミクロスフェア、染色体、小器官、生体分子 又はタンパク質からなる前記請求項の何れかによるマイクロフローシステム。２１ ． 偏向した粒子が、磁性的に、発色的に又は蛍光的に染色される前記請求 項の何れかによるマイクロフローシステム。２２ ． フローチャンネルに対する場への異なる磁化率によって分離された粒子 を排出する複数の出口を備える前記請求項の何れかによるマイクロフローシステ ム。２３ ． 部材が、さらに前処理及び／又は後処理機能を備える前記請求項の何れ かによるマイクロフローシステム。２４ ． 前処理機能が、粒子からなる流体を調製又は予備反応させるインキュベ ーション手段からなる請求項２３によるマイクロフローシステム。２５ ． 前処理機能が、磁性、蛍光又は発色染色の手段からなる請求項２３又は ２４によるマイクロフローシステム。２６ ． 後処理機能が、偏向した粒子を回収又は濃縮する手段からなる請求項２ ３によるマイクロフローシステム。２７ ． 後処理機能が、偏向した粒子を１以上の試薬と接触させる手段からなる 請求項２３によるマイクロフローシステム。２８ ． 粒子を含有する流体流を一時に１つの粒子がフローチャンネルの断面を 通過するように案内バッファーとともにフローチャンネルに案内し、フローチャ ンネルを、フローチャン ネルの縦軸に実質的に垂直である場に位置させ、それによりフローチャンネルに 存在し、フローチャンネルを横切る場に影響される粒子が場の方向に偏向され、粒子を含有する 流体から案内バッファーに分離される工程からなる粒子を分離す る方法。２９ ． 染色細胞がフローチャンネルが位置する場に影響されるように胎児細胞 を磁性的に選択染色する工程からなる、フローチャンネルが位置する場が磁場で 、粒子が胎児細胞及び母体細胞を含む請求項２８による方法。３０ ． 染色細胞がフローチャンネルが位置する場に影響されるように癌細胞を 磁性的に選択染色する工程からなる、フローチャンネルが位置する場が磁場で、 粒子が癌細胞及び他の細胞を含む請求項２８による方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ 【要約の続き】 析用のマイクロフローシステムが提供される。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 粒子を含有する流体の流れをフローチャンネルに案内する部材に画定され たフローチャンネルと、 流体をフローチャンネルに導入するためフローチャンネルの一端に位置した第 １の入口手段と、 流体をフローチャンネルから排出するためフローチャンネルの他端に位置した 第１出口手段とを有する部材を具備し、 粒子を含有する流体の流れが、一時に１つの粒子がフローチャンネルの断面を 通過するように制御され、かつ部材は、フローチャンネルに存在しかつフローチ ャンネルを横切る場に影響される粒子が場の方向に偏向されるように、フローチ ャンネルの縦軸に実質的に垂直である場に位置される粒子分離用のマイクロフロ ーシステム。 ２． 部材が、さらに、フローチャンネルの縦軸に実質的に垂直な場を発生する ためのフローチャンネルに隣近した場発生手段を有する請求項１によるマイクロ フローシステム。 ３． さらに、フローチャンネル内で測定容量内にある粒子のパラメータをモニ ターし、モニターしたパラメータに対応する出力信号を出すフローチャンネルに 位置したモニター手段を有する請求項１又は２によるマイクロフローシステム。 ４． モニター手段が、フローチャンネル内の測定容量内にある粒子の光学パラ メータをモニターし、光学パラメータに対応する出力信号を出す光学検出手段か らなる請求項３によるマイ クロフローシステム。 ５． モニター手段が、フローチャンネルの特定容量内の磁性粒子の磁性パラメ ータの測定用のハルセンサーからなる請求項３又は４によるマイクロフローシス テム。 ６． さらに、モニター手段の出力信号に応じて場発生手段により発生した場の 強度を制御する場発生制御手段を備え、粒子がモニター手段によってモニターさ れたパラメータ値に従って分離される請求項３〜５の何れかによるマイクロフロ ーシステム。 ７． 粒子を含有する流体流のチャンネルにおけるレイノルズ数が、0.01〜500 の範囲、好ましくは0.05〜50の範囲、特に0.1〜25の範囲である前記請求項の何 れかによるマイクロフローシステム。 ８． フローチャンネルの最低断面積が0.004〜0.11mm²の範囲である請求項１〜 ６の何れかによるマイクロフローシステム。 ９． さらに、フローチャンネルで偏向された粒子を排出する第２出口手段を備 える前記請求項の何れかによるマイクロフローシステム。 １０． 場発生手段が磁石からなる前記請求項の何れかによるマイクロフローシ ステム。 １１． 場発生手段が、さらに磁場の焦点化のためにフローチャンネルに位置し たフェライト部材からなる請求項１０によるマイクロフローシステム。 １２． 場発生手段が電極からなる前記請求項の何れかによる マイクロフローシステム。 １３． 場発生手段のフローチャンネルに対する位置が、フローチャンネルに対 する場の強度を調整するために調整可能である前記請求項の何れかによるマイク ロフローシステム。 １４． さらに、フローチャンネル内にある粒子の時間を調整するための流速調 整手段を備える前記請求項の何れかによるマイクロフローシステム。 １５． さらに、フローチャンネルを覆うカバーを備える請求項の何れかによる マイクロフローシステム。 １６． カバーが、フローチャンネルを光学的にモニターできる透明又は半透明 カバーである請求項１５によるマイクロフローシステム。 １７． さらに、第１案内バッファーを導入する第２入口手段を備え、粒子を含 有する流体流のフローチャンネルを経る断面と通路が、第１案内バッファー流に よって調整される前請求項の何れかによるマイクロフローシステム。 １８． さらに、第２案内バッファーを導入する第３入口手段を備え、粒子を含 有する流体流のフローチャンネルを経る断面と通路が、粒子を含有する流体流を 囲む第１と第２案内バッファー流によって調整される請求項１７によるマイクロ フローシステム。 １９． 粒子を含有する流体流の巾と位置が、流体流量と案内バッファー流量の 容量比の調整によって制御される請求項１８によるマイクロフローシステム。 ２０． 偏向した粒子が生細胞からなる前請求項の何れかにるマイクロフローシ ステム。 ２１． 偏向した粒子が、ビーズ、ミクロスフェア、染色体、小器官、生体分子 又はタンパク質からなる前請求項の何れかによるマイクロフローシステム。 ２２． 偏向した粒子が、磁性的に、発色的に又は蛍光的に染色される前請求項 の何れかによるマイクロフローシステム。 ２３． フローチャンネルに対する場への異なる磁化率によって分離された粒子 を排出する複数の出口を備える前請求項の何れかによるマイクロフローシステム 。 ２４． 部材が、さらに前処理及び／又は後処理機能を備える前請求項の何れか によるマイクロフローシステム。 ２５． 前処理機能が、粒子からなる流体を調製又は予備反応させる培養手段か らなる請求項２４によるマイクロフローシステム。 ２６． 前処理機能が、磁性、蛍光又は発色染色の手段からなる請求項２４又は ２５によるマイクロフローシステム。 ２７． 後処理機能が、偏向した粒子を回収又は濃縮する手段からなる請求項２ ４によるマイクロフローシステム。 ２８． 後処理機能が、偏向した粒子を１以上の試薬と接触させる手段からなる 請求項２４によるマイクロフローシステム。 ２９． 粒子を含有する流体流をフローチャンネルに案内する部材の中で画定さ れたフローチャンネルと、 流体をフローチャンネルに導入するためフローチャンネルの 一端に位置した第１入口手段と、 流体をフローチャンネルから排出するためフローチャンネルの他端に位置した 第１と第２出口手段と、 そこで、粒子を含有する流体流は、一時に１つの粒子がフローチャンネルの断 面を通過するように制御され、 フローチャンネル内の測定容量内にある粒子のパラメータをモニターし、モニ ターされたパラメータに対応する出力信号を与えるフローチャンネルに位置した モニター手段と、 第１及び第２出口手段それぞれの流体の通過をモニター手段の出口信号に応じ て制御し、それより粒子がモニター手段によってモニターされたパラメータ値に よって分離される制御手段を有する部材を具備する粒子分離用のマイクロフロー システム。 ３０． 粒子を含有する液体流をフローチャンネルに案内する部材中で画定され たフローチャンネルと、 流体をフローチャンネルに導入するためのフローチャンネルの一端に位置した 入口手段と、 フローチャンネルの縦軸に実質的に沿った場を発生させ、それによって粒子が チャンネルに沿って場に吸引され、場への磁化率と移動性に従って分布される、 フローチャンネルの他端に隣近して位置する場発生手段を有する部材を具備する ことからなる粒子分離用のマイクロフローシステム。 ３１． 流体流をフローチャンネルに案内するため部材中に画定されたフローチ ャンネルと、粒子をフローチャンネルに導入 する第１入口手段と、流体をフローチャンネルから排出する第１出口手段及び流 体がフローチャンネルに存在する間に複数の成分を分析できる、フローチャンネ ルに位置し固定化した試薬からなる複数のアッセイ部位を有する部材を具備する ことからなる、流体成分を分析するマイクロフローシステム。 ３２． さらに、対応するアッセイ部位に隣近した場を発生させるためアッセイ 部位の少なくとも幾つかに隣近して位置する場発生手段を備え、それによって、 フローチャンネルに存在し、選択されたアッセイ部位で発生した場に影響される 試薬が、選択されたアッセイ部位に吸引されかつ固定されるか、選択されたアッ セイ部位から拒絶される請求項３１によるマイクロフローシステム。 ３３． 部材が、平行又は一連に配置された複数のフローチャンネルを有し、そ の各々がアッセイ部位を有し、それによって粒子を含有する流体が多数のアッセ イ部位と接触される請求項３１又は３２によるマイクロフローシステム。 ３４． 粒子を含有する流体流を一時に１つの粒子がフローチャンネルの断面を 通過するようにフローチャンネルに案内し、フローチャンネルを、フローチャン ネルの縦軸に実質的に垂直である場に位置させ、それによりフローチャンネルに 存在し、フローチャンネルを横切る場に影響される粒子が、場の方向に偏向され 流体から分離される 工程からなる粒子を分離する方法。 ３５． 胎児細胞と母体細胞を含有する流体中で胎児細胞を磁 性的に選択染色し、胎児細胞を含有する流体流を一時に１つの胎児細胞がフロー チャンネルの断面を通過するようにフローチャンネルに案内し、フローチャンネ ルを、フローチャンネルの縦軸に実質的に垂直である磁場に位置させ、フローチ ャンネルに存在する磁性的に染色した胎児細胞が磁場の方向に偏向される工程か らなる、母体細胞から胎児細胞を分離する方法。 ３６． 癌細胞と他の細胞を含有する流体中の癌細胞を磁性的に選択染色し、癌 細胞を含有する流体流を、一時に１つの癌細胞がフローチャンネルの断面を通過 するようにフローチャンネルに案内し、フローチャンネルをフローチャンネルの 縦軸に実質的に垂直である磁場に位置させ、フローチャンネルに存在する磁性的 に染色された癌細胞を磁場の方向に偏向させる工程からなる、他の細胞から癌細 胞を分離する方法。 ３７． 粒子を含有する流体流を、一時に１つの粒子がフローチャンネル（流体 を排出する第１と第２の出口手段を備える）の断面を通過するようにフローチャ ンネルに案内し、 フローチャンネル内の測定容量内にある粒子のパラメータをモニターし、 モニターしたパラメータ値にそれぞれ応じて第１及び第２出口手段の流体の通 過を制御し、それによって粒子をモニターしたパラメータ値に従って分離できる 工程からなる粒子を分離する方法。 ３８． 粒子を含有する流体をフローチャンネルに導入し、流体を複数のアッセ イ部位を有するチャンネルに流し、各アッセ イ部位は固定化試薬からなり、それによって流体がチャンネル中に存在する間に 複数の成分を分析できる工程からなる、流体成分の分析方法。 ３９． 選択した試薬の固定化のためのアッセイ部位の選択した表面を調製し、 対応する選択したアッセイ部位に隣近して選択した試薬を分配し、選択した部位 に隣近して場を発生させ、それによって、発生した場で選択したアッセイ部位の 表面に試薬を吸引かつ接触させ、接触でその表面に固定化する工程からなる、フ ローチャンネルにおける固定化試薬からなるアッセイ部位を形成する方法。