JP2002247991A

JP2002247991A - タンパク質の耐熱性を向上させる方法、該方法により耐熱性の向上したタンパク質、および該タンパク質をコードする核酸

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Publication number: JP2002247991A
Application number: JP2001164332A
Authority: JP
Inventors: Akihiko Yamagishi; 明彦山岸
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2000-07-04
Filing date: 2001-05-31
Publication date: 2002-09-03
Also published as: EP1182253A3; US20020137094A1; EP1182253A2

Abstract

(57)【要約】【課題】タンパク質の耐熱性を改善する方法、および
耐熱性の改善されたタンパク質およびそのタンパク質を
コードする核酸、および、耐熱性の改善されたタンパク
質を産生する宿主細胞を提供すること【解決手段】（i）系統樹中の複数の生物種に由来
する、進化的に互いに対応するタンパク質のアミノ酸配
列を比較すること、(ii) （i）で比較したアミノ酸配
列に対応する、祖先型タンパク質のアミノ酸配列を推定
すること、(iii) (i)で比較したタンパク質の１つにお
いて、そのアミノ酸配列中のアミノ酸残基を(ii)で推定
した祖先型タンパク質中の対応する位置のアミノ酸残基
と比較し、前記祖先型と異なるアミノ酸残基の1以上を
前記祖先型タンパク質と同一のアミノ酸残基に置換す
る、ことを含む方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、タンパク質の耐熱
性を向上させる方法に関する。また、本発明は、耐熱性
の向上したタンパク質、耐熱性の向上したタンパク質を
コードする核酸に関する。

【０００２】

【従来の技術】高温で活性を有するタンパク質、特に耐
熱性の酵素は、作用させるときに冷却する必要がないな
ど、高温で失活する他のタンパク質に比較して有利な点
を有する。通常、そのようなタンパク質は、好熱菌と称
される高温下に生育できる細菌によって産生されること
が多い。従って、耐熱性タンパク質を設計する場合に
は、そのような一群の好熱菌の対応するタンパク質のア
ミノ酸配列を解析し、それらに共通して見られるアミノ
酸配列上の特徴を参考にして設計されることが多い。あ
るいは、好熱菌の産生するタンパク質の立体構造を解析
し、その情報に基づいて耐熱性を付与している構造を推
定し、そのような構造をとり得るように非耐熱性タンパ
ク質の構造を改変する等の手法がとられている。好熱菌
タンパク質の例としては、例えばleuBによってコードさ
れる3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ(IPMDH)
が知られており、Thermus thermophilus HB8のIPMDHに
ついてはその立体構造が明らかにされている (K.Imada
ら、J.Mol.Biol. 222,725-738, 1991)。また、IPMDHと
類似の触媒機構、アミノ酸配列、立体構造を有するタン
パク質、すなわち同一ファミリーに属するタンパク質と
して、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(ICDH)が知られて
いる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、タン
パク質の耐熱性を改善する方法、および耐熱性の改善さ
れたタンパク質およびそのタンパク質をコードする核
酸、および、耐熱性の改善されたタンパク質を産生する
宿主細胞を提供することである。特に、本発明の目的は
タンパク質の１次構造の情報のみを利用して、タンパク
質の耐熱性を改善する方法を提供することである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ウーズ(W
oese)らによって示された16srRNAによる系統樹（図１）
を見ると、80℃以上で至適に生育する生物が根元に多い
ことが示されているという事実から、真正細菌、真核生
物、古細菌の共通の祖先は超好熱菌ではないかと考え、
現在見られる多くの好熱菌のタンパク質は必ずしも真の
祖先型ではないが、真の祖先型のアミノ酸配列を有す
る、またはそれに近づいた配列を有するタンパク質は更
に耐熱性が向上しているであろうと考えるに至った。そ
こで、出願人は、耐熱性のタンパク質を設計、製造する
ためには、好熱菌のタンパク質の配列および高次構造の
みを解析してこれを模倣するよりも、祖先型タンパク質
のアミノ酸配列を推定してこれを模倣することがより重
要である、との考えに基づいて本発明を完成させた。

【０００５】即ち、本発明は、（i）系統樹中の複数
の生物種に由来する、進化的に互いに対応するタンパク
質のアミノ酸配列を比較すること、(ii)（i）で比較し
たアミノ酸配列に対応する、祖先型タンパク質のアミノ
酸配列を推定すること、(iii) (i)で比較したタンパク
質の１つにおいて、そのアミノ酸配列中のアミノ酸残基
を(ii)で推定した祖先型タンパク質中の対応する位置の
アミノ酸残基と比較し、前記祖先型と異なるアミノ酸残
基の1以上を前記祖先型タンパク質と同一のアミノ酸残
基に置換すること、を含む、タンパク質の耐熱性を改善
する方法である。特に、本発明は好熱菌または古細菌と
系統樹中で進化的に近い生物種を、対応するタンパク質
のアミノ酸配列に関して比較することを含む。また、本
発明はそのような方法によって、耐熱性の向上した酵
素、その酵素をコードする核酸、および、そのような核
酸を含む宿主細胞である。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明においては、生物種の分子
レベルの情報に基づく分子系統樹（以下、単に系統樹と
いう）、または系統樹作成のためのアルゴリズムが利用
される。系統樹の作製のためのいくつかのアルゴリズ
ム、例えば、最大節約原理に基づくアルゴリズム等が知
られており、それを実現するコンピュータープログラム
も利用あるいは入手することができる。例えば、CLUSTA
LW、PUZZLE、MOLPHY、PHYLIP等の種々の系統樹推定プロ
グラムが利用できる。それらを用いて系統樹を作製する
ことができるが、より簡便には、既に公表されている系
統樹を利用することもできる（図１）。例えば、ウーズ
らによって提唱された16S rRNAのデータに基づく系統樹
を利用することができる。このような系統樹において
は、分子進化的に近い位置の生物種は、系統樹中で近い
位置に現れる。また、系統樹中で根元に近い位置にある
生物種はより祖先に近いと考えられる。

【０００７】本発明の目的には、比較的根元に近い部分
の系統樹を利用することが好ましく、トリあるいは偶蹄
類よりも古い部分を利用することがより好ましく、好熱
菌または古細菌を含む系統樹部分を利用するのが特に好
ましい。なぜならば、好熱菌および古細菌は系統樹中、
かなり根元付近、すなわち進化的に祖先に近いところに
位置し、その産生するタンパク質は祖先型の超耐熱性タ
ンパク質に比較的近いと期待されるからである。あるい
は、どのような種のものでも良いが、同一ファミリーに
属する別のタンパク質を含むことが好ましい。なぜなら
ば、あるタンパク質を、古細菌のタンパク質あるいは同
一ファミリーの別のタンパク質と比較することにより、
後述する方法により系統樹の根本の祖先型アミノ酸残基
（配列）を推定することが可能になるからである。本明
細書において、「好熱菌」とは、好温菌、耐熱菌などと
も称され、高温下に生育できる細菌の総称であり、通常
約55℃以上で生育できる菌を示す。本発明においては、
「好熱菌」とは約75℃以上でも生育する高度好熱菌、約
55℃〜74℃で生育する中等度好熱菌を含み、更に、常温
でも生育できる通性好熱菌および約40℃以上でのみ生育
できる絶対好熱菌をも含む。また、「非好熱菌」とは好
熱菌以外の微生物を言う。「古細菌」とは前述のWoese
の分類による古細菌をいい、メタン生成細菌、高度好塩
菌、硫黄還元古細菌等を含む原核生物群を言う。古細菌
は細胞膜の脂質がエーテル脂質である点で真正細菌と明
確に区別し得る。また、本明細書において、「同一ファ
ミリーに属するタンパク質」とは、機能、アミノ酸配
列、ドメイン構造、立体構造等のいずれか１以上の点で
類似しているタンパク質をいい、これらには、少なくと
もアミノ酸配列の一部が相同でマルチプラルアラインメ
ント可能である一群のタンパク質、特にアミノ酸配列が
相同でマルチプルアラインメント可能である一群のタン
パク質が含まれる。これらの同一ファミリーに属する複
数のタンパク質は同じ祖先型タンパク質に由来すること
が強く期待される。

【０００８】次に、種々の生物種から、耐熱性を改善し
ようとする互いに対応するタンパク質のアミノ酸配列の
情報を取得、または決定する。本発明が適用され得るタ
ンパク質は特に限定されないが、多くの生物種にわたっ
て存在するタンパク質が好ましく、特に産業上の利用価
値の高い酵素が好ましい。例えば、好熱菌が産生するタ
ンパク質、特に耐熱性の酵素が好ましい。そのような例
として、本発明の実施例に記載したスルフォロブスsp.7
株(Sulfolobus sp. strain 7)のIPMDH、ICDHを挙げるこ
とができる。この菌株のIPMDHをコードする遺伝子はSuz
ukiらによってクローニングされているものである（T.
Suzukiら、J. Bacterol. 179(4), 1174-1179, 1997）。
耐熱性を改善しようとするタンパク質のアミノ酸配列
は、既知のデータベースから取得することもできる。新
たにアミノ酸配列を決定する場合は、この技術分野で知
られた何れのアミノ酸配列決定方法も使用することがで
きる。あるいは、部分アミノ酸配列の情報等を利用して
そのタンパク質をコードする核酸を取得し、当業者に広
く知られた塩基配列決定方法によってその核酸の配列を
決定し、その核酸配列を基にアミノ酸配列を推定しても
よい。

【０００９】得られた複数の生物種からのアミノ酸配列
をマルチプルアライメント（多重整列）し、それぞれの
生物種から取得したアミノ酸配列を比較する。マルチプ
ルアラインメントのための方法も幾つか知られている。
その多くは、挿入、欠失、置換等による変化量を最小化
する最節約原理に基づくものであり、これを実現するコ
ンピュータープログラムも開発され、利用あるいは入手
することができる。そのようなプログラムとして例えば
TreeAlign等が知られており、DDBJからは、その1990年V
ersionであるmalignを利用することができる。本発明に
おいては、系統樹中で進化的に近いとされる生物種を選
択するため、マルチプルアラインメントには系統情報が
既に利用されていることとなり、その結果系統情報を利
用しない場合に比較してより適切なアラインメントを行
なうことができる。マルチプルアラインメントを行なう
ためには少なくとも３種の生物種からの情報を利用す
る。アラインメントに使用するデータの起源の数が多く
なるほど適切な情報が得られる。更に、前述した理由に
より、比較する生物種には１種以上の好熱菌または古細
菌が含まれていることが好ましい。あるいはファミリー
タンパク質、すなわち同一の祖先型タンパク質に由来す
ると期待される別のタンパク質が含まれていることが好
ましい。

【００１０】アラインメントの結果が得られたならば、
系統樹上で祖先型タンパク質のアミノ酸配列を推定する
ことができる。このためには例えば、最大節約法あるい
は最尤法を使用することができ、これらの手順は当業者
に知られたものである（例えば、Young, Z., Kumar,S.
とNei.M, Genetics 141, 1641-16510, 1995、Stewart,
C.-B.Active ancestral molecules, Nature 374, 12-1
3,1995、根井正利「分子進化遺伝学」培風館などを参照
せよ）。例えば、本発明に使用し得る最大節約法とは、
簡単に言うと、祖先型を仮定したときにその後生じると
予想される変異の事象の数が最も少ない祖先型の過程を
真の祖先型と推定する方法である。あるいは、最大節約
法の代わりに最尤法(Maximal likelihood method)を用
いることもできる。また、最大節約法に基づいてアミノ
酸配列から直接に祖先型推定を行なうためのプログラム
PROTPARS（PHYLIPに含まれる）も利用可能である。これ
らの方法では原理的には系統樹の推定と祖先型アミノ酸
の推定が同時に行われるため、これらの方法を使用する
場合は必ずしも系統樹を作成することは必要ではない
が、特に手動計算で祖先型アミノ酸を推定する場合には
系統樹を作成することが好ましい。また、前述したよう
な方法、あるいは他の既知の方法に基づいて作成された
系統樹、特に、公表された系統樹に基づいて以下のよう
な最大節約法あるいは最尤法を用いた手順により祖先型
アミノ酸配列を決定することもできる。

【００１１】最大節約法を用いた手順を、実施例にも記
載したIPMDHを例として以下に更に詳細に説明する。現
在までにクローニングされアミノ酸配列が明らかになっ
ているIPMDHおよびICDHの幾つかの生物種由来のアミノ
酸配列をマルチプルアラインメントする（図２）。次に
この配列を元に、例えば最大節約法あるいは近隣接合法
等を用いて系統樹を作成する（図３）。この時、例えば
最大節約法によれば系統樹を作成せずに直接祖先型アミ
ノ酸配列を推定することも可能であることは前述した
が、以下では手順を理解しやすくするため、系統樹を明
示的に利用する手順を説明する。この手順は既に作成さ
れた、例えば公表された既知の系統樹を利用する場合に
も適用可能である。

【００１２】いずれかの方法で得られた系統樹を利用し
てマルチプルアラインメントした残基のそれぞれの部位
に関して祖先型アミノ酸を決定することができる。例え
ば、図４には種々の生物のIPMDHのスルフォロブスsp.7
株の152番残基に対応するアミノ酸残基が記載されてお
り、この図中に記載された生物においてはその位置のア
ミノ酸はR、S、KあるいはEである。ここで、系統樹中近
接する種における残基が共にRである場合は、両者の共
通の祖先生物種は（系統図中で２つの種を結ぶ枝の結合
点で示される）スルフォロブスsp.7株152番位置に対応
するアミノ酸残基がRであったと推定することができ
る。なぜならば、Sが祖先型であるとすると、２回以上
の変異事象を考慮しなければ、現存する生物種におけ
る、スルフォロブスsp.7株152番残基に対応するアミノ
酸残基を説明できないのに対し、Rが祖先型であると仮
定すれば１回の変異事象で説明がつくからである。

【００１３】２つの種がRとSのように異なった残基を持
つ場合は、共通の祖先型を直ちには決定することができ
ない。しかし、この場合であっても、更に一つ深い枝
（即ち、系統樹中で左側にある結合点）ではもう一方の
枝がRであれば、共通の祖先をRと推定することができ
る。このようにして、進化的に遡る、即ち、図中で左側
へ進んでいくことにより、図中で最も左側の点に対応す
るアミノ酸配列が最も祖先型のアミノ酸配列であると推
定することができる。図４では、スルフォロブスsp.7株
152番位置に対応する祖先型アミノ酸残基はRであると推
定されている。

【００１４】このようにして、マルチプルアラインメン
トした配列の各々の残基に関して祖先型アミノ酸残基を
推定し、その結果、対応する領域の祖先型アミノ酸配列
を推定することができる。この場合、祖先型アミノ酸配
列を推定するために用いる生物種を変えると、系統樹の
樹形が変化し、それと関連して異なる祖先型アミノ残基
が得られる場合もあり、その位置と種類は比較に用いる
タンパク質にも依存する。従って、本発明の目的には、
そのような変動が比較的少ない位置のアミノ酸残基を改
変の対象とすることが好ましい。そのようなアミノ酸残
基は、系統樹の作成に用いる生物種を変える、あるい
は、生物種は変えずに系統樹作成に使用するアミノ酸配
列情報の一部のみを用いるなど、系統樹の作成に使用す
るアミノ酸配列情報を変化させた場合の樹形変化の程度
を見積り、樹形への影響の少ない残基を選択することに
よって決定することもできる。

【００１５】以上のような手順を用いることにより、耐
熱性を改善しようとするタンパク質について、種々の生
物種で互いに対応する領域がある限り、その領域にわた
って祖先型アミノ酸配列を推定することが可能である。
そのようにして決定されたアミノ酸配列中の各アミノ酸
残基は、実際には、現存する生物種、特にそれが好熱菌
あるいは古細菌であれば、これらの生物種は進化的にか
なり古いため、その有するタンパク質のアミノ酸配列中
のアミノ酸残基と多くの位置において一致するであろ
う。従って、本発明においては、このような場合には推
定された祖先型タンパク質のアミノ酸配列と異なるアミ
ノ酸残基のみ改変すればよい。

【００１６】前述した手順に従って、祖先生物種のタン
パク質のアミノ酸配列を推定する際に、比較する生物種
の中に好熱菌、非好熱菌が混在していたとしても、ある
いは、好熱菌のみが比較する他の生物種と異なるアミノ
酸残基を有している場合であっても、それらの事実に影
響されることなく、前述した手順に従って祖先型を決定
することができる。他と相違するアミノ酸配列を有する
タンパク質を有する生物種が多数あって、それらの情報
のみで祖先型が推定できない、あるいは確度が低いと考
えられる場合には、更にアライメントに使用するデータ
を追加することができる。その結果、祖先型アミノ酸残
基が決定できるようならば、そのアミノ酸残基を祖先型
として採用することができる。一般には、そのようなア
ミノ酸残基が存在する位置および領域は、タンパク質中
で複数存在するであろう。それらの領域または位置は離
れている場合も、近接している場合もあるであろう。そ
れらの位置およびアミノ酸残基の全てを後述する改変の
ために記録する。

【００１７】上述のようにして、各位置のアミノ酸残基
について祖先型アミノ酸残基が決定されたならば、解析
対象としたタンパク質について非祖先型であるアミノ酸
残基の少なくとも１つを祖先型アミノ酸残基に置換して
そのタンパク質を改変する。この場合、置換するアミノ
酸残基の数および位置は改変すべきタンパク質、必要と
する耐熱性、および所望の比活性に応じて変動させるこ
とができる。好ましくは十分な耐熱性を有すると同時に
高い比活性を有するように置換すべき位置と数が選択さ
れる。十分な耐熱性と高い比活性を同時に実現するため
には、一般には、活性中心の位置および活性中心周辺の
アミノ酸配列等の更なる情報が利用される。改変すべき
タンパク質は、比較したどの生物種に由来してもよい
が、最も耐熱性の高い生物種に由来するタンパク質を選
択することが好ましい。特に、好熱菌の産生するタンパ
ク質を改変すべきタンパク質として選択することが好ま
しい。なぜならば、耐熱性の高い生物種に由来するタン
パク質は一般には耐熱性が高いことが期待され、既にあ
る程度の耐熱性を有するであろうタンパク質をより完全
な祖先型タンパク質に改変することによって、さらなる
耐熱性の向上が期待できるからである。タンパク質中の
アミノ酸残基の置換は、そのタンパク質をコードする核
酸を改変することによって行なうことができる。簡単に
言えば、アミノ酸残基を置換しようとするタンパク質を
コードする遺伝子を取得し、目的とする部位のアミノ酸
残基が置換されるようなプライマーを用いてKunkel法に
基づく部位特異的変異導入を行なうことができる。ある
いは、PCRを用いた方法によって部位特異的変異導入を
行なってもよい。

【００１８】目的とする遺伝子は、既知のアミノ酸配列
情報、またはそのタンパク質についての部分アミノ酸配
列情報に基づき、適切なプローブを設計してハイブリダ
イゼーション技法、または、PCRによって取得すること
ができる。変異導入のための鋳型を予めung^-の宿主で調
製しておくことによって、目的の変異の生じたDNAを効
率よく複製させることができる。また、変異導入のため
のプライマーは制限酵素部位が生じるように設計してお
くと、変異の確認のために便利である。このような、宿
主への遺伝子導入、遺伝子のクローニング、部位特異的
変異導入等の分子生物学的手法は、ung^-の宿主を含めて
当業者に良く知られたものであり、例えば、Sambrook e
t al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manua
l, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Labora
tory Press, Cold Spring Harbor, New York、F.M. Aus
ubel et alo.(eds), Current Protocols in Molecular
Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)等を参照す
ることができる。更に、それらの分子生物学的手法を行
なうためのキット等も商業的に入手可能である。そのよ
うにして導入した変異は塩基配列を決定することによっ
て確認することができるが、変異導入用のプライマーに
制限酵素部位を導入してある場合は、より簡便に、対応
する制限酵素によって消化されることを指標に変異の導
入を確認することができる。

【００１９】このようにして得られた改変遺伝子は、適
切な宿主−ベクター系を用いて発現させることができ
る。利用できる宿主には真核細胞、原核細胞のいずれも
含まれるが、一般的には大腸菌のような微生物が好まし
い。選択した宿主に応じて、前述の改変遺伝子を発現さ
せるために必要な制御配列を有した発現ベクターにその
改変遺伝子を組み込んだ組換えDNA分子を作製すること
ができる。そのような発現ベクターは当業者によく知ら
れており、多くの宿主−ベクター系が商業的に入手可能
である。そのようなベクターのうち、一般には高発現を
目的とした宿主−ベクター系が好ましく、誘導が可能な
宿主−ベクター系が特に好ましい。しかしながら、タン
パク質の性質によっては高発現させると宿主に有害であ
ることもある等、宿主−ベクター系の選択はタンパク質
の性質にも依存するであろう。更に、必要ならば、選択
した宿主に応じてコドンを最適化してもよい。そのよう
な組換えDNA分子を組み込んだ宿主は、当業者によく知
られた方法によって培養され、産生されたタンパク質が
回収される。

【００２０】宿主細胞あるいは培地からのタンパク質の
回収は宿主および産生されるタンパク質の性質に応じて
一般的な方法によって行なえばよい。例えば、菌体から
回収する場合は、超音波処理等によって細胞を破砕し、
遠心分離によって残渣を除去し、更に硫安沈殿、逆相ク
ロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲ
ル濾過等を組み合わせて目的のタンパク質を得ることが
できる。タンパク質が封入体として存在する場合は、6M
グアニジン塩酸塩等によって可溶化した上で再構成させ
ることができる。培地から回収する場合には、遠心分離
によって菌体を除去した後、同様な方法で目的タンパク
質を回収することができる。また、目的とするタンパク
質が細胞膜に結合する性質を有する場合は、適切な界面
活性剤を利用して可溶化してもよい。そのような可溶化
法はいずれも当業者によく知られた方法であり、タンパ
ク質の性質に応じて選択することができる。

【００２１】得られたタンパク質の純度はSDS-ポリアク
リルアミド電気泳動等によって確認することができる。
得られたタンパク質の濃度は、当業者によく知られた方
法によって、例えば、本明細書の実施例において記載し
たように、ウシ血清アルブミンを標準タンパク質として
PIERCE社のBCA Protein Assay Kitを使用して測定する
ことができる。改変されたタンパク質の耐熱性は、その
タンパク質を熱処理した後に活性を測定することによっ
て決定することができる。例えば、IPMDHの場合は以下
のようにして測定することができる。アッセイバッファ
ー（50mM CHES/KOH、pH9.5、200mM KCl、1mM NAD、0.4m
M IPM、5mM MgCl2）をセルに入れ、高温、例えば、50℃
〜99℃で５分間プレインキュベーションする。次に所定
の濃度に調製した酵素溶液を適当量加えて軽く撹拌す
る。その後、所定の温度例えば50℃〜75℃に維持し、NA
DHの増加を340nmにおける紫外光の吸光度によって測定
する。また、IPMDHの比活性は、75℃において、１分間
に１マイクロモルのNADHを生成する活性を1U（ユニッ
ト）とし、比活性はタンパク質1mgあたりのユニット(U)
数として表すことができる。

【００２２】ICDHについては、例えば、アッセイバッフ
ァー（10mM MgCl₂ 、0.4mM D.L-イソクエン酸、0.8mM N
ADP、100mM PIPES pH7.0）をセルに入れ、高温、例えば
50℃〜99℃において５分間インキュベーションした。次
に所定の濃度に調製した酵素溶液を適当量加え軽く撹拌
する。その後、所定の温度、例えば、50℃〜75℃に維持
し、NADPHの増加量を340nmの吸収から求めることで酵素
活性を測定することができる。1unitは70℃における1μ
moleのNADPが1分間に減少する量とすることができる。
このように、場合により、得られた一群の祖先型改変タ
ンパク質について、各酵素に依存して選択される活性測
定法によりその耐熱性を試験し、より耐熱性の優れたタ
ンパク質を選抜してもよい。

【００２３】

【実施例】以下に示す菌株および培地を使用した。（１）大腸菌株 CJ236：ウラシル一本鎖DNA(UssDNA)調製用に使用した。
ウラシル-グリコラーゼとdUTPaseを欠損している。 MC1061、JM109：遺伝子操作の宿主として用いた。 MA153：IPMDH大量発現のための宿主として用いた。leuB
欠損株である。（２）培地 LB寒天培地：1.0％バクトトリプトン、0.5％バクトイー
ストエキストラクト、1％NaCl、1.5％寒天。必要に応じ
てアンピシリンを100μg/ml添加した。 M9寒天培地：１ｘＭ９塩、1mM MgSO₄、0.1mM CaCl₂、0.
001％チアミン、0.2％グルコース、1.5％寒天。大腸菌J
M109のコンピテントセル作製の際に使用した。２ｘＹＴ
培地：1.6％バクトトリプトン、1.0％バクトイーストエ
キストラクト、0.5％NaCl。大腸菌の液体培養に使用し
た。必要に応じてアンピシリンを100μg/ml添加した。（３）IPMDH活性測定 490μlのアッセイバッファー（50mM CHES/KOH、pH9.5、
200mM KCl、1mM NAD、0.4mM IPM、5mM MgCl₂）をセルに
入れ、50℃〜75℃で５分間プレインキュベーションし
た。次に所定の濃度に調製した酵素溶液を10μl加え軽
く撹拌した。その後プレインキュベーション温度と同じ
温度に維持し、NADHの増加を340nmにおける紫外光の吸
光度によって測定した。（４）ICDH活性測定 490μlのアッセイバッファー（10mM MgCl₂ 、0.4mM D.L
-イソクエン酸、0.8mMNADP、100mM PIPES pH7.0）をセ
ルに入れ、50℃〜75℃において５分間プレインキュベー
ションした。酵素溶液を１０μl加え軽く撹拌した。そ
の後、プレインキュベーション温度と同じ温度に維持
し、NADPHの増加量を340nmの吸収から求めることで測定
した。

【００２４】実施例１．スルフォロブスsp.７株からの
祖先型IPMDHの構築（１）ウラシル1本鎖DNA(UssDNA)の調製大腸菌CJ236のコンピテントセルにleuB発現プラスミドp
E7-SB21（図５）を導入した。得られた形質転換CJ236を
2xYT培地で培養し、30mlの培養液を得た。培養液中のCJ
236にヘルバーファージM13KO7を感染させ、37℃にて2xY
T培地で５時間振盪培養した。得られた培養液を4℃にて
5000rmpで10分間遠心し、その上清を更に4℃にて6000rp
mで10分間遠心して上清を得た。上清10mlからPEG/NaCl
を用いてファージを沈殿させた。得られたファージから
常法に従って、UssDNAを10.9μgを得た。濃度は363μg/
mlであった。

【００２５】（２）祖先型IPMDHのアミノ酸配列の推定現在までにクローニングされアミノ酸配列が明らかに成
っているIPMDHおよびICDHのアミノ酸配列をマルチプル
アラインメントした。その結果を表１に示す。次に、表
１に示した各領域（ａ、ｂ或いはb'およびb''、c、d領
域）について祖先型アミノ酸配列を推定した。この推定
は、前述したような手順に従って、例えば152番残基に
ついては以下の様に行なった。まず、これらの生物種を
含む系統樹を近隣接合法で作成した（図３）。次にこの
系統樹中でSaccharomyces cerevisiaeとNuerospora cra
ssaのｂ領域を比較した。この二つの生物種における、
スルフォロブスsp.7株152番残基に対応するアミノ酸残
基はいずれもRであった。従って、この２種の祖先生物
種の対応する位置のアミノ酸残基はRであると推定し
た。次に、Escherichia coliとAgrobacterium tumefaci
ensを比較すると、スルフォロブスsp.7株152番残基に対
応するアミノ酸残基はそれぞれRとSであった。従って、
この２種の祖先生物種の対応する位置のアミノ酸残基は
これだけでは推定することができないが、系統樹中（図
３）で更に左側の枝における接合点では、もう一方の
枝、即ち、Saccharomyces cerevisiaeとNuerospora cra
ssaへ分岐している枝では前述したようにRであることが
推定されているため、Saccharomyces cerevisiaeとNuer
ospora crassa、およびEscherichia coliとAgrobacteri
um tumefaciensを加えた４種の共通の祖先生物種におけ
るこの位置のアミノ酸残基はRであると推定した。さら
に、Bacillus subtilisのスルフォロブスsp.7株152番残
基に対応するアミノ酸残基はRであることから、前述の
４種にBacillus subtilisを加えた５種の生物の祖先生
物種において、この位置に対応するアミノ酸残基はRで
あると推定した。このようにして、図５で示された系統
樹を左へ遡って、祖先型生物のIPMDHにおけるスルホフ
ォブスsp.７株の152番位置に対応するアミノ酸残基はR
であると推定した。

【００２６】このような手順を繰り返し、最終的に表１
に記載された領域のアミノ酸配列についてその祖先型ア
ミノ酸配列を決定した。次に、そのようにして決定した
祖先型アミノ酸配列とスルフォロブスsp.７株のアミノ
酸配列を比較し、祖先型配列と異なるフルフォロブスs
p.7株のアミノ酸残基および位置を決定した。その結
果、M91、I95、K152、G154、A259、F261、Y282の各アミ
ノ酸残基および位置が祖先型と異なることが明らかにな
った。ここで、例えばM91は91番のM（メチオニン）残基
を表す。他の表記についても同様である。これらを表１
において下線で示した。また、前述の手順に従って決定
した祖先型アミノ酸配列および、改変すべきアミノ酸残
基の位置および種類も併せて表１に示した。なお、表１
中でｘと記載された残基は祖先型が１種類にされなかっ
た位置である。これら結果から、祖先型酵素の91番アミ
ノ酸残基はL、95番アミノ酸残基はL、152番アミノ酸残
基はR、154番アミノ酸残基はA、259番アミノ酸残基は
S、261番アミノ酸残基はP、282番アミノ酸残基はLであ
ると決定した。

【００２７】

【表１】表１．IPMDHおよびICDHのアミノ酸配列のマル
チプルアラインメント上記表中の部分アミノ酸配列は順に配列番号１〜48とし
て配列表に記載した。

【００２８】（３）変異導入用プライマーの設計祖先型IPMDHおよびICDHのアミノ酸配列が決定されたの
で、a、b、c、dの各領域、およびそれらの組み合わせの
領域におけるアミノ酸残基の置換によっていくつかの祖
先型変異体を作製した。それらの祖先型変異体における
アミノ酸残基置換は以下のとおりである。すなわち、a
領域祖先型変異（M91LおよびI95L）、ｂ'領域祖先型変
異（K152R）、b"領域祖先型変異（G154A）、ｂ領域祖先
型変異（K152RおよびG154A）、c領域祖先型変異（A259S
およびF261P）、d領域祖先型変異（Y282L）、a、b、c、
d祖先型変異（M91L、I95L、K152R、G154A、A259S、F265
1PおよびY282L）である。ここで、例えばM91Lなる表記
は91番のM（メチオニン）残基をL（ロイシン）残基に置
換することを表す。他の記号も同様である。

【００２９】これらの祖先型変異体を部位特異的変異導
入法によって作製するために以下のプライマーを設計し
た。各プライマーは、スルフォロブスsp.７株のIPMDHの
塩基配列（配列番号49）及びアミノ酸配列（配列番号5
0）を参考にして設計した（図６および図７）。

【００３０】a領域祖先型変異導入用プライマー、P1 5'-TTTGCTGGTCTTAAGTTGGCATAAAGATCATAAATTTGTC-3'
（配列番号51）下線部は制限酵素AflIIの認識部位である。ｂ'領域祖先型変異導入用プライマー、P２ 5'-AGTTTAGCCCTACGCTCGCGATTCTCTCAGAAGC-3' （配
列番号52）下線部は制限酵素NruIの認識部位である。ｂ"領域祖先型変異導入用プライマー、P3 5'-AATGCAAAGTTTAGCGCTACTTTTGCTATTC-3'
（配列番号53）下線部はEco47 IIIの認識部位である。 b領域祖先型二重変異導入用プライマー、P4 5'-TGCAAAGTTTAGCGCTACTCTTGCTATTCTCTC-3'
（配列番号54）下線部はEco47 IIIの認識部位である。 c領域祖先型変異導入用プライマー、P5 5'-TCCAGCAATGTCCGGAGCACTACCGTGTACTG-3'
（配列番号55）下線部はMroIの認識部位である。 d領域祖先型変異導入用プライマー、P6 5'-TCATACATTCTCTCGAGCATCATACTTAC-3'
（配列番号56）下線部はXhoIの認識部位である。ａbcd祖先型変異は、
上記のプライマーの組み合わせによって導入される変異
を全て含むものであるため、別途プライマーを調製しな
かった。＜配列表フリーテキスト＞配列番号47〜52：部位特異的
変異導入のためのプライマー

【００３１】（４）Kunkel法による変異導入常法に従って、配列番号３〜８に記載のプライマーをそ
れぞれTE（10mM Tris-HCl、1mM EDTA、 pH8.0）に溶解
して10pmol/μlの溶液を作製した。このプライマー溶液
１μlを総量１０μlとして常法に従って、ポリヌクレオ
チドキナーゼによってリン酸化した。反応後は７０℃に
て10分間処理をして酵素失活させた。この反応液各３μ
lずつとり、（１）で得られたUssDNA1.5μlと混合し、
アニーリングさせた。従って、この混合液中には、リン
酸化した配列番号３〜８の全てのプライマーが含まれて
いた。アニーリングは、１０ｘアニーリングバッファー
（200mM Tris-HCl、20mM MgCl₂、100mM DTT、pH8.0）
中、総量20μlにて行なった。混合液を70℃に加温し、
続いて約30℃まで室温に放置して冷却した。

【００３２】アニーリング後の溶液に10x合成バッファ
ー（50mM Tris-HCl、20mM MgCl₂、5mM dNTPs、10mM A
TP、20mM DTT、pH7.9）を２μl、T4 DNAリガーゼを１μ
l、T4DNAポリメラーゼを１μl加えて氷中に５分間、続
いて室温に５分間置き、さらに37℃にて90分間インキュ
ベーションした。反応液を４μlとり、大腸菌MC1061コ
ンピテントセル100μlと混合し、0℃にて20分間、42℃
にて１分間、0℃にて２分間静置し、２xYT培地を450μl
加えて37℃にて1時間放置した。この培養液138.5μlを1
00μg/mlのアンピシリンを含む2xYT液体培地5mlに分注
し、一晩培養後に菌体からアルカリ−ＳＤＳ法によって
プラスミドDNAを回収した。

【００３３】得られたDNAを用いて大腸菌MC1061を再度
形質転換し、100μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培
地上で形質転換コロニーを選抜した。これらのコロニー
を培養し、そこからプラスミドDNAを回収して制限酵素
部位の有無を確認した。変異が導入されたならば、変異
部位に対応するプライマーに存在する制限酵素でDNAが
切断されるはずである。

【００３４】その結果、上記a〜dの領域、またはこれら
の組み合わせに祖先型変異が導入されたプラスミドがい
くつか得られた。このようにして得られた変異体のう
ち、（M91LおよびI95L）祖先型変異体、K152R祖先型変
異体、（G154A）祖先型変異体、（K152RおよびG154A）
祖先型変異体、（A259SおよびF261P）祖先型変異体、
（Y282L）祖先型変異体、を各々、ａ変異体、b'変異
体、b"変異体、b変異体、c変異体、d変異体と命名し、
対応する発現プラスミドをそれぞれ、pE7-SB21a、pE7-S
B21b'、pE7-SB21b"、pE7-SB21b、pE7-SB21c、pE7-SB21d
と命名した。しかしながら、abcd領域祖先型変異体は得
られなかったので、以下のようにしてa領域変異体とbcd
領域祖先型変異体を用いてabcd領域祖先型変異体を構築
した。上述のようにして得られたbcd領域祖先型変異体
プラスミドpE7-SB21bcd DNAをSmaIで切断した。一方、a
変異体プラスミドpE7-SB21a DNAをXbaIとEcoRIで切断
し、目的とする酵素がコードされたDNA断片をpUC118のX
baI−EcoRIマルチクローニング部位にサブクローニング
して、プラスミドpUC118-SB21aを得た。pUC118-SB21aを
SmaIで切断し、上記のSmaI切断bcd領域祖先型変異体プ
ラスミドDNAとライゲーションしてpUC118-SB21abcdを得
た。次にpUC118-SB21abcdおよびpE7-SB21をXbaIとEcoRI
で消化し、両者を混合してabcd領域祖先型変異体のため
の発現プラスミドpE7-SB21abcdを得た。pE7-SB21a、pE7
-SB21b'、pE7-SB21b"、pE7-SB21b、pE7-SB21c、pE7-SB2
1dおよびpE7-SB21abcdが目的とする祖先型変異体を有す
ることは、それぞれに対応する制限酵素切断部位の有無
を調べ、および、塩基配列を決定して確認した。これら
のプラスミドの構築の概略を図８に記載した。

【００３５】実施例２．スルフォロブスsp.IPMDHおよび
祖先型IPMDHの精製天然型、祖先型変異体のそれぞれのプラスミドを有する
大腸菌MA153のコロニーをアンピシリン100μg/mlを含む
2xYT培地100mlに摂取し、一晩培養した後、それぞれア
ンピシリン100μg/mlを含む10Lの２ｘYT培地に摂取し
た。37℃にてOD600=0.6まで振盪培養し、IPTGを最終濃
度0.4mMになるように添加した。更に振盪培養を２時間
行なった後菌体を4℃にて7000rpmｘ10分間の遠心によっ
て回収した。得られた菌体をバッファーＩ（20mM KHP
O₄、0.5mM EDTA、pH7.0）に懸濁し、4℃にて7000rpmｘ2
0分間の遠心によって洗浄した。直ちに次のステップに
入らない場合は、-80℃で菌体を保存した。得られた菌
体は19.6gであった。

【００３６】菌体に1mM DTTを含む２倍量のバッファーI
を加えて懸濁した。懸濁細胞を超音波破砕し、4℃に
て、30,000rpmｘ20分間の遠心によって沈殿を除去し
た。上清を75℃にて20分間熱処理し、4℃にて30,000rpm
ｘ20分間遠心して沈殿した変性タンパク質を除去した。
上清をバッファーＩで平衡化した陰イオン交換カラムDE
-52にかけ、素通り画分を回収した。得られた画分に最
終濃度1Mとなるように3M硫酸アンモニウム(AS)溶液を加
え4℃にて約1時間放置後、4℃、30,000rpmｘ20分間の遠
心によって沈殿を除去した。上清を1MのASを含むバッフ
ァーIで平衡化した疎水性カラムブチル-Toyoperl 650s
カラムに通し、AS濃度1M->０Mの直線勾配によってタン
パク質を溶出させた。得られた各画分について活性測定
を行ない、活性のあった画分をまとめ、バッファーII
（20mM CHES/KOH、0.5mM EDTA、pH9.3）に対して透析し
た。

【００３７】透析後のタンパク質溶液を、バッファーII
で平衡化した陰イオン交換カラムResource Ｑカラムに
かけ、KCl濃度0Ｍ−＞0.1Mの直線勾配でタンパク質を溶
出した。得られた各画分を各々バッファーIに対して透
析しSDS-PAGEによって純度を確認した。SDS-PAGEによっ
て単一バンドが確認された画分を集めてCetnriprep30を
用いて1mg/mlにまで濃縮した。タンパク質濃度は、BSA
を標準として、PIERCE社のBCA Protein Assay Reagent
Kitを用いて測定した。精製結果を表２に示す。

【表２】

【００３８】実施例３．スルフォロブスsp.のIPMDHおよ
び祖先型IPMDHの耐熱性測定スルフォロブスsp.IPMDHの耐熱性はpH7.0では非常に高
いので、99℃での耐熱性を測定した。すなわち、99℃に
おいて活性の半減する時間（半減期Ｔ_1/2）を求めて耐
熱性の指標とした。天然および変異（祖先型）酵素の99
℃における半減期を以下のように測定した。リン酸カリ
ウムバッファー（20mM KHPO4、0.5mM EDTA、1mM DTT、p
H7.0）を用いて、b'、b"、b、c、d変異体についてはタ
ンパク質濃度0.25mg/ml、abcd変異体についてはタンパ
ク質濃度1.0mg/mlとして酵素溶液を調製した。天然型IP
MDHについてもタンパク質濃度0.25mg/mlまたは1.0mg/ml
となるように酵素溶液を調製した。これらの酵素溶液を
99℃において、10分間、20分間、30分間、60分間、120
分間熱処理をした。処理後、氷中に５分間静置し、12,0
00rmp、４℃にて20分間遠心して上清を回収した。各上
清10μlを用いて75℃において活性測定をした。各サン
プルについて３回の測定を行ない、その平均値を残存活
性の測定値とした。横軸に時間をとり、縦軸に時間０を
100とした相対活性をとり、各測定値をプロットして、
相対活性50％となる時間を半減期Ｔ_1/2とした。同時に
比活性の測定も行なった。それらの結果を表３および表
４に示す。

【００３９】

【表３】表３．天然型IPMDHおよびb'、b"、b、c、d変異
体の半減期と比活性

【００４０】

【表４】表４．天然型IPMDHおよびabcd変異体の半減期
と比活性

【００４１】これらの結果から、b'、ｂ"、b、c、dおよ
びabcd変異体のいずれも天然型に比較して耐熱性が向上
していることが明らかになった。また、b'、b"、d変異
体については比活性も同時に増大した。

【００４２】実施例４．Thermus thermophilusからの祖
先型IPMDHの構築（１）祖先型IPMDHのアミノ酸配列の推定現在クローニングされている代表的な生物のIPMDH及びI
CDHのアミノ酸配列をアライメントした(図９：図中の各
アミノ酸配列は、左上から順に配列番号57〜89として配
列表に記載した)。その中で生物種間で保存性が高く、
かつサーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilu
s）で異なるアミノ酸部位いくつかを探し出した。更にI
PMDHとICDHの複合系統樹(図３)と合わせてThermusの手
前で分岐したアミノ酸残基と分岐前のアミノ酸残基がは
っきりと予測できる部位を推定した。図１０にThermus
の53番目にあたる各生物でのアミノ酸残基を示した。こ
れをみると明らかにThermusはLeuからPheに分岐したこ
とが推測される。このようにして明確に推定できた祖先
型変異は、F53L、V181T、P324Tの3つとなった。F53L、V
181T、P324T等の記号の意味は実施例１で使用したもの
と同様である。

【００４３】（２）変異導入 Veronique Picardらの方法（Picard, VC. et. al., Nuc
leic Acid Research,22, 2587-2591 (1994)）に従っ
て、PCRを利用して部位特異的に変異を導入した。すな
わち、プラスミドpET21cにThermus thermophilus IPMDH
(NCBIアクセッション番号AAA16706)がクローニングされ
たプラスミド（図１１）を鋳型として、まず5’プライ
マーから変異プライマーまでを増幅し、次に3’プライ
マーを加えて全長を増幅した。さらに5’プライマーを
加えて全長をさらに増幅した。しかしP324Tは変異部位
がIPMDHの3’末端側にあったため、この手順による変異
導入が出来なかった。このため5P324T3 という逆オリゴ
を作製し3’末端から増幅を行い変異を導入した。変異
導入に使用したプライマーは以下の通りである。 5'プライマーT7T：5'-CTAGTTATTGCTCAGCGGT-3'（配列番
号90） 5'プライマーT7P：5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'（配列
番号91） F53L変異導入用：5'-GGGCTCGGGCAAGGGCTCGC-3'（配列番
号92） V181T変異導入用：5’-AGGTCCGGGGTCGGGGTCTCC-3’（配
列番号93）、 P324T変異導入用：5'-CTTGTCCACGCTCGTCACGTGCTTCCTG3'
（配列番号94）

【００４４】＜配列表フリーテキスト＞配列番号90〜9
4：部位特異的変異導入用オリゴヌクレオチド

【００４５】実施例５．Thermus thermophilusの野生型
IPMDHおよび祖先型IPMDHの比較（１）IPMDHおよび祖先型IPMDHの精製実施例２と同様な方法でThermus thermophilusの野生型
IPMDHおよび祖先型IPMDHを精製した。但し、Thermus th
ermophilusのIPMDH遺伝子はG+C含量が高く、そのままで
はタンパク質発現量が低いため、遺伝子の最初の幾つか
のコドン３文字目をAまたはTに変えた遺伝子を用いるこ
とによりタンパク質を多く発現させた。1Lの培養液から
得られた最終収量は、野生型184mg/L、F53L変異祖先型
は11.3mg/L、V181T変異祖先型は8.4mg/L、P324T変異祖
先型は11.1mg/Lであった。（２）祖先型IPMDHの耐熱性測定野生型IPMDHおよび祖先型IPMDHを熱処理し、その残存活
性を測定した。いずれの実験も１つのサンプルに対し３
回測定を行い、その平均を測定値として残存活性を求め
た。野生型及び祖先型IPMDHをタンパク溶液(20mM KHPO₄
pH7.6・0.5mM EDTA)を0.4mg/mlに調製し、各サンプル5
0μlを0.5mlのマイクロチューブに入れ80、82、84、8
6、88、90℃で10分間熱処理後の５０℃における活性を
測定し、活性が50%になるときの温度に対する残存活性
を求めた。その結果を図1２に示した。その結果、活性
が50%になるときの温度は野生型では85.5℃、F53L変異
型では83.5℃、V181T変異型では86.8℃、P324T変異型で
は86.5℃であった。また野生型と比べると、F53L変異型
は２℃ほど下がってしまったが、V181T変異型は1.3℃、
P324T変異型は1.0℃上昇した。

【００４６】更に、86℃において０、５、１０、１５、
２０分間熱処理後の活性を50℃において測定し活性が50
%になるまでの時間を測定した。その結果を表５に示し
た。

【表５】表５．残存活性が50%に低下するまでの時間
（Ｔ_1/2）

【００４７】表５に示されたように、野生型と比べると
F53Lは5.9分下がってしまったが、V181Tは 12.7分、P32
4Tは3.1分耐熱化した。ここで、F53L 変異型は耐熱性が
野生型よりも低下したが、これは以下の要因によると考
えられる：53番アミノ酸残基の周りのアミノ酸配列を他
の生物間で比較してみるとThermus thermophilusでは58
番目がArgだが、他の生物間ではLeuやValであった。こ
のことより53番目をLeuにしたことで58番目のArgとの間
の空間をPheのように埋めることができず、その結果構
造が不安定化し耐熱性が下がったと考えられる。

【００４８】（３）CDスペクトル野生型及びF53L、V181T、P324Tの各変異型IPMDHを20mM
KHPO₄ (pH7.6)溶液で0.1mg/mlに調製してCDスペクトル
(円二色性スペクトル)を用いて210nm-250nmのタンパク
質の2次構造を調べた。その結果各変異型は野生型と比
較して変化はなかった。従って、これらの変異はタンパ
クの2次構造にあまり変化を与えないことが示された。

【００４９】実施例６．Caldococcus noboribetusのICD
Hおよび祖先型ICDHの構築（１）祖先型ICDHのアミノ酸配列の推定 NCBIのデーターベースから代表的な生物のIPMDHと様々
生物のICDHの配列を入手し、配列アライメントソフトの
Clustal Xを用いてアライメントを行った（図１３）。
またこれらの配列をもとに、系統樹作成ソフトのPuzzle
を用いて IPMDHと ICDHの混合系統樹を作成した。アラ
イメント結果と混合系統樹の常法に基づき、実施例１お
よび４と同様にA336F、Y309I、I310L、I321L、A325P、G
326Sの６つ祖先型変異が推定された。A336F等の記号の
意味は、実施例１および４と同じである。このうちY309
IとI310L、A325PとG326Sは隣り合っており同じ二次構造
上にあるので二重変異として考え、Y309I/I310LをN1変
異、I321LをN2変異、A325P/G326SをN3変異、A336FをN4
変異とした。（２）変異導入実施例１および４と同様な方法で、プラスミドpET21cに
Caldococcus noboribetusのICDH(NCBIアクセッション番
号BAA13177) がクローニングされたプラスミドを鋳型と
してPCRによりN1変異、N2変異、N3変異、N4変異を導入
した。

【００５０】実施例７．Caldococcus noboribetusのICD
Hおよび祖先型ICDHの性質の比較（１）Caldococcus noboribetus野生型ICDHおよび祖先
型ICDHの精製実施例２と同様にして、pET21cおよびN1−N4の各変異を
導入した変異pET21cと大腸菌を用いてCaldococcus nobo
ribetus野生型ICDHおよび祖先型ICDHを大量発現させ、
常法に従って、野生型ICDHおよび祖先型ICDHを精製し
た。1Lの培養液から、野生型ICDH 10mg、N1変異型ICDH
15.4mg、N2変異型 10.9mg、N3変異型14.2mg、N3変異型1
4.2mg、N4変異型4.39mgのICHDが得られた。（２）祖先型ICDHの耐熱性測定耐熱性を評価するため、精製したCaldococcus noboribe
tus ICDHの野生型と各変異体を様々な温度（80、82、8
4、86、88、90、92、94℃）で10分間熱処理し、そのあ
との残存活性を70℃において測定した。残存活性と温度
との関係は実施例５と同様（図12を参照せよ）であり、
活性が50%になる温度（T_1/2）は野生型およびN1-N4変異
型ICDHについてこの順に、87.5、88.8、88.8、91.3、7
4.0℃であった。野生型ICDHに比べてN1、N2変異型ICDH
は約1℃、N3変異型ICDHは約4℃耐熱性が上昇した。しか
しN4変異型ICDHは約13℃下がった。また80℃における各
変異体の比活性を測定した。変異型ICDHの相対比活性は
N1からN4の順にそれぞれ約72、62、127、21%（野生型を
100％とする）であった。N1、N2およびN3変異型ICDHの
比活性にはそれほど激しい差は見られなかったが、耐熱
性が大幅に下がったN4変異型ICDHについては比活性もま
た大きく下がった。

【００５１】次に、N4変異型ICDHの耐熱性が著しく低下
したので、補助的に立体構造を解析した。その結果、Al
a336の周辺にはLeu327、Tyr363、Leu364があり、疎水コ
アが形成されていると推定された。Ala336 、Leu327に
相当する部分は他の生物においては、 Phe-Ala、Phe-Gl
y、Tyr-Ala、Ala-Metというように片方が大きい残基の
場合、もう片方は小さい残基というペアーで残基が変化
していた。これらの事実を考え合わせると、N4変異型IC
DHの耐熱性が下がったのは、Ala336をPheに置換したこ
とによりこの領域がかなり密な状態になり、立体障害を
おこした為であると考えられる。

【００５２】

【発明の効果】本発明により、タンパク質の２次構造お
よび３次構造の情報を使用せずに、１次構造の情報のみ
からタンパク質の耐熱性を向上させることができる。特
に、好熱菌の産生する耐熱性タンパク質、特に耐熱性の
酵素の耐熱性を更に向上させることができる。そのよう
な耐熱性の酵素を使用すれば、反応の際に温度制御を行
なう必要がなく、高温で反応させることができるため反
応速度が速く、また高温で反応させることができるため
不要な微生物のコンタミネーションも最小に抑えること
ができる。

【００５３】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Ajinomoto Co., Inc. <120> A method for improving the thermostability of a protein, a protein having improved thermostability and a nucleic acid sequence encoding the protein <130> Y1I0476 <140> <141> <150> JP 2000-201920 <151> 2000-07-04 <160> 104 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Sulfolobus sp. <400> 1 Tyr Asp Met Tyr Ala Asn Ile Arg Pro 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Sulfolobus sp. <400> 2 Ile Ala Lys Val Gly Leu Asn Phe Ala 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Sulfolobus sp. <400> 3 Val His Gly Ala Ala Phe Asp Ile 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Sulfolobus sp. <400> 4 Met Met Tyr Glu Arg Met 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Thermus thermophilus <400> 5 Gln Asp Leu Phe Ala Asn Leu Arg Pro 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Thermus thermophilus <400> 6 Val Ala Arg Val Ala Phe Glu Ala Ala 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Thermus thermophilus <400> 7 Val His Gly Ser Ala Pro Asp Ile 1 5 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Thermus thermophilus <400> 8 Met Met Leu Glu His Ala 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 9 Leu Asp Leu Phe Ala Asn Leu Arg Pro 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 10 Val Ile Arg Glu Gly Phe Lys Met Ala 1 5 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 11 Val His Gly Ser Ala Pro Asp Ile 1 5 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 12 Met Leu Leu Arg Thr Ser 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 13 Phe Lys Leu Phe Ser Asn Leu Arg Pro 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 14 Ile Ala Arg Ile Ala Phe Glu Ser Ala 1 5 <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 15 Ala Gly Gly Ser Ala Pro Asp Ile 1 5 <210> 16 <211> 6 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 16 Leu Leu Leu Arg Tyr Ser 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Agrobacterium tumefaciens <400> 17 Leu Glu Leu Phe Ala Asn Leu Arg Pro 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Agrobacterium tumefaciens <400> 18 Ile Ala Ser Val Ala Phe Glu Leu Ala 1 5 <210> 19 <211> 8 <212> PRT <213> Agrobacterium tumefaciens <400> 19 Val His Gly Ser Ala Pro Asp Ile 1 5 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Agrobacterium tumefaciens <400> 20 Met Cys Leu Arg Tyr Ser 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 21 Leu Gln Leu Tyr Ala Asn Leu Arg Pro 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 22 Ile Thr Arg Met Ala Ala Phe Met Ala 1 5 <210> 23 <211> 8 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 23 Cys His Gly Ser Ala Pro Asp Leu 1 5 <210> 24 <211> 6 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 24 Met Met Leu Lys Leu Ser 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Neurospora crassa <400> 25 Leu Gly Thr Tyr Gly Asn Leu Arg Pro 1 5 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Neurospora crassa <400> 26 Ile Ala Arg Leu Ala Gly Phe Leu Ala 1 5 <210> 27 <211> 8 <212> PRT <213> Neurospora crassa <400> 27 Ile His Gly Ser Ala Pro Asp Ile 1 5 <210> 28 <211> 6 <212> PRT <213> Neurospora crassa <400> 28 Met Met Leu Arg Tyr Ser 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 29 Phe Gly Leu Phe Ala Asn Val Arg Pro 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 30 Val Ile Arg Tyr Ala Phe Glu Tyr Ala 1 5 <210> 31 <211> 8 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 31 Val His Gly Ser Ala Pro Asp Ile 1 5 <210> 32 <211> 6 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 32 Met Met Leu Asn His Met 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 33 Phe Asp Leu Tyr Ala Asn Val Arg Pro 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 34 Ile Ala Glu Phe Ala Phe Glu Tyr Ala 1 5 <210> 35 <211> 8 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 35 Val His Gly Ser Ala Pro Asp Ile 1 5 <210> 36 <211> 6 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 36 Met Met Leu Arg His Met 1 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 37 Leu Asp Leu Phe Val Cys Leu Arg Pro 1 5 <210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 38 Leu Val Arg Ala Ala Ile Asp Tyr Ala 1 5 <210> 39 <211> 8 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 39 Thr His Gly Thr Ala Pro Lys Tyr 1 5 <210> 40 <211> 6 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 40 Leu Leu Leu Glu His Leu 1 5 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 41 Leu Asp Leu Tyr Ile Cys Leu Arg Pro 1 5 <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 42 Leu Val Arg Ala Ala Ile Glu Tyr Ala 1 5 <210> 43 <211> 8 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 43 Thr His Gly Thr Ala Pro Lys Tyr 1 5 <210> 44 <211> 6 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 44 Met Met Leu Arg His Met 1 5 <210> 45 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:predicted ancestor sequence <220> <221> UNSURE <222> (1) <220> <221> UNSURE <222> (4) <400> 45 Xaa Asp Leu Xaa Ala Asn Leu Arg Pro 1 5 <210> 46 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:predicted ancestor sequence <220> <221> UNSURE <222> (4) <220> <221> UNSURE <222> (6) <220> <221> UNSURE <222> (9) <400> 46 Ile Ala Arg Xaa Ala Xaa Phe Glu Xaa Ala 1 5 10 <210> 47 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:predicted ancestor sequence <400> 47 Val His Gly Ser Ala Pro Asp Ile 1 5 <210> 48 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:predicted ancestor sequence <220> <221> UNSURE <222> (4)..(6) <400> 48 Met Met Leu Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 49 <211> 1014 <212> DNA <213> Sulfolobus sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1011) <400> 49 atg ggc ttt act gtt gct tta ata caa gga gat gga att gga cca gaa 48 Met Gly Phe Thr Val Ala Leu Ile Gln Gly Asp Gly Ile Gly Pro Glu 1 5 10 15 ata gta tct aaa tct aag aga ata tta gcc aaa ata aat gag ctt tat 96 Ile Val Ser Lys Ser Lys Arg Ile Leu Ala Lys Ile Asn Glu Leu Tyr 20 25 30 tct ttg cct atc gaa tat att gaa gta gaa gct ggt gat cgt gca ttg 144 Ser Leu Pro Ile Glu Tyr Ile Glu Val Glu Ala Gly Asp Arg Ala Leu 35 40 45 gca aga tat ggt gaa gca ttg cca aaa gat agc tta aaa atc att gat 192 Ala Arg Tyr Gly Glu Ala Leu Pro Lys Asp Ser Leu Lys Ile Ile Asp 50 55 60 aag gcc gat ata att ttg aaa ggt cca gta gga gaa tcc gct gca gac 240 Lys Ala Asp Ile Ile Leu Lys Gly Pro Val Gly Glu Ser Ala Ala Asp 65 70 75 80 gtt gtt gtc aag tta aga caa att tat gat atg tat gcc aat att aga 288 Val Val Val Lys Leu Arg Gln Ile Tyr Asp Met Tyr Ala Asn Ile Arg 85 90 95 cca gca aag tct atc ccg gga ata gat act aaa tat ggt aat gtt gat 336 Pro Ala Lys Ser Ile Pro Gly Ile Asp Thr Lys Tyr Gly Asn Val Asp 100 105 110 ata ctt ata gtg aga gaa aat act gag gat tta tac aaa ggt ttt gaa 384 Ile Leu Ile Val Arg Glu Asn Thr Glu Asp Leu Tyr Lys Gly Phe Glu 115 120 125 cat att gtt tct gat gga gta gcc gtt ggc atg aaa atc ata act aga 432 His Ile Val Ser Asp Gly Val Ala Val Gly Met Lys Ile Ile Thr Arg 130 135 140 ttt gct tct gag aga ata gca aaa gta ggg cta aac ttt gca tta aga 480 Phe Ala Ser Glu Arg Ile Ala Lys Val Gly Leu Asn Phe Ala Leu Arg 145 150 155 160 agg aga aag aaa gta act tgt gtt cat aag gct aac gta atg aga att 528 Arg Arg Lys Lys Val Thr Cys Val His Lys Ala Asn Val Met Arg Ile 165 170 175 act gat ggt tta ttc gct gaa gca tgc aga tct gta tta aaa gga aaa 576 Thr Asp Gly Leu Phe Ala Glu Ala Cys Arg Ser Val Leu Lys Gly Lys 180 185 190 gta gaa tat tca gaa atg tat gta gac gca gca gcg gct aat tta gta 624 Val Glu Tyr Ser Glu Met Tyr Val Asp Ala Ala Ala Ala Asn Leu Val 195 200 205 aga aat cct caa atg ttt gat gta att gta act gag aac gta tat gga 672 Arg Asn Pro Gln Met Phe Asp Val Ile Val Thr Glu Asn Val Tyr Gly 210 215 220 gac att tta agt gac gaa gct agt caa att gcg ggt agt tta ggt ata 720 Asp Ile Leu Ser Asp Glu Ala Ser Gln Ile Ala Gly Ser Leu Gly Ile 225 230 235 240 gca ccc tct gcg aat ata gga gat aaa aaa gct tta ttt gaa cca gta 768 Ala Pro Ser Ala Asn Ile Gly Asp Lys Lys Ala Leu Phe Glu Pro Val 245 250 255 cac ggt gca gcg ttt gac att gct gga aag aat ata ggt aat ccc act 816 His Gly Ala Ala Phe Asp Ile Ala Gly Lys Asn Ile Gly Asn Pro Thr 260 265 270 gca ttt tta ctt tct gta agt atg atg tat gaa aga atg tat gag cta 864 Ala Phe Leu Leu Ser Val Ser Met Met Tyr Glu Arg Met Tyr Glu Leu 275 280 285 tct aat gac gat aga tat ata aaa gct tca aga gct tta gaa aac gct 912 Ser Asn Asp Asp Arg Tyr Ile Lys Ala Ser Arg Ala Leu Glu Asn Ala 290 295 300 ata tac tta gtc tac aaa gag aga aaa gcg tta acc cca gat gta ggt 960 Ile Tyr Leu Val Tyr Lys Glu Arg Lys Ala Leu Thr Pro Asp Val Gly 305 310 315 320 ggt aat gcg aca act gat gac tta ata aat gaa att tat aat aag cta 1008 Gly Asn Ala Thr Thr Asp Asp Leu Ile Asn Glu Ile Tyr Asn Lys Leu 325 330 335 ggc taa 1014 Gly <210> 50 <211> 337 <212> PRT <213> Sulfolobus sp. <400> 50 Met Gly Phe Thr Val Ala Leu Ile Gln Gly Asp Gly Ile Gly Pro Glu 1 5 10 15 Ile Val Ser Lys Ser Lys Arg Ile Leu Ala Lys Ile Asn Glu Leu Tyr 20 25 30 Ser Leu Pro Ile Glu Tyr Ile Glu Val Glu Ala Gly Asp Arg Ala Leu 35 40 45 Ala Arg Tyr Gly Glu Ala Leu Pro Lys Asp Ser Leu Lys Ile Ile Asp 50 55 60 Lys Ala Asp Ile Ile Leu Lys Gly Pro Val Gly Glu Ser Ala Ala Asp 65 70 75 80 Val Val Val Lys Leu Arg Gln Ile Tyr Asp Met Tyr Ala Asn Ile Arg 85 90 95 Pro Ala Lys Ser Ile Pro Gly Ile Asp Thr Lys Tyr Gly Asn Val Asp 100 105 110 Ile Leu Ile Val Arg Glu Asn Thr Glu Asp Leu Tyr Lys Gly Phe Glu 115 120 125 His Ile Val Ser Asp Gly Val Ala Val Gly Met Lys Ile Ile Thr Arg 130 135 140 Phe Ala Ser Glu Arg Ile Ala Lys Val Gly Leu Asn Phe Ala Leu Arg 145 150 155 160 Arg Arg Lys Lys Val Thr Cys Val His Lys Ala Asn Val Met Arg Ile 165 170 175 Thr Asp Gly Leu Phe Ala Glu Ala Cys Arg Ser Val Leu Lys Gly Lys 180 185 190 Val Glu Tyr Ser Glu Met Tyr Val Asp Ala Ala Ala Ala Asn Leu Val 195 200 205 Arg Asn Pro Gln Met Phe Asp Val Ile Val Thr Glu Asn Val Tyr Gly 210 215 220 Asp Ile Leu Ser Asp Glu Ala Ser Gln Ile Ala Gly Ser Leu Gly Ile 225 230 235 240 Ala Pro Ser Ala Asn Ile Gly Asp Lys Lys Ala Leu Phe Glu Pro Val 245 250 255 His Gly Ala Ala Phe Asp Ile Ala Gly Lys Asn Ile Gly Asn Pro Thr 260 265 270 Ala Phe Leu Leu Ser Val Ser Met Met Tyr Glu Arg Met Tyr Glu Leu 275 280 285 Ser Asn Asp Asp Arg Tyr Ile Lys Ala Ser Arg Ala Leu Glu Asn Ala 290 295 300 Ile Tyr Leu Val Tyr Lys Glu Arg Lys Ala Leu Thr Pro Asp Val Gly 305 310 315 320 Gly Asn Ala Thr Thr Asp Asp Leu Ile Asn Glu Ile Tyr Asn Lys Leu 325 330 335 Gly <210> 51 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for site directed mutagenesis <400> 51 tttgctggtc ttaagttggc ataaagatca taaatttgtc 40 <210> 52 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for site directed mutagenesis <400> 52 agtttagccc tacgctcgcg attctctcag aagc 34 <210> 53 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for site directed mutagenesis <400> 53 aatgcaaagt ttagcgctac ttttgctatt c 31 <210> 54 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for site directed mutagenesis <400> 54 tgcaaagttt agcgctactc ttgctattct ctc 33 <210> 55 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for site directed mutagenesis <400> 55 tccagcaatg tccggagcac taccgtgtac tg 32 <210> 56 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for site directed mutagenesis <400> 56 tcatacattc tctcgagcat catacttac 29 <210> 57 <211> 13 <212> PRT <213> Neurospora crassa <400> 57 Asp Pro Ile Thr Asp Glu Ala Leu Asn Ala Ala Lys Ala 1 5 10 <210> 58 <211> 13 <212> PRT <213> Neurospora crassa <400> 58 Val Trp Ser Leu Asp Lys Ala Asn Val Leu Ala Ser Ser 1 5 10 <210> 59 <211> 7 <212> PRT <213> Neurospora crassa <400> 59 Lys Thr Lys Asp Leu Gly Gly 1 5 <210> 60 <211> 13 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 60 Val Pro Leu Pro Asp Glu Ala Leu Glu Ala Ser Lys Lys 1 5 10 <210> 61 <211> 13 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 61 Ile Trp Ser Leu Asp Lys Ala Asn Val Leu Ala Ser Ser 1 5 10 <210> 62 <211> 7 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 62 Arg Thr Gly Asp Leu Gly Gly 1 5 <210> 63 <211> 13 <212> PRT <213> Agrobacterium tumefaciens <400> 63 Val Ala Ile Ser Asp Ala Asp Asn Glu Lys Ala Leu Ala 1 5 10 <210> 64 <211> 13 <212> PRT <213> Agrobacterium tumefaciens <400> 64 Val Cys Ser Met Glu Lys Arg Asn Val Met Lys Ser Gly 1 5 10 <210> 65 <211> 7 <212> PRT <213> Agrobacterium tumefaciens <400> 65 Arg Thr Ala Asp Ile Met Ala 1 5 <210> 66 <211> 13 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 66 Asn Pro Leu Pro Glu Glu Thr Val Ala Ala Cys Lys Asn 1 5 10 <210> 67 <211> 13 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 67 Val Thr Ser Val Asp Lys Ala Asn Val Leu Glu Ser Ser 1 5 10 <210> 68 <211> 6 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 68 Arg Thr Arg Asp Leu Ala 1 5 <210> 69 <211> 13 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 69 Gln Pro Leu Pro Pro Ala Thr Val Glu Gly Cys Glu Gln 1 5 10 <210> 70 <211> 13 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 70 Val Thr Ser Ile Asp Lys Ala Asn Val Leu Gln Ser Ser 1 5 10 <210> 71 <211> 7 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 71 Arg Thr Gly Asp Leu Ala Arg 1 5 <210> 72 <211> 13 <212> PRT <213> Thermus thermophilus <400> 72 Glu Pro Phe Pro Glu Pro Thr Arg Lys Gly Val Glu Glu 1 5 10 <210> 73 <211> 13 <212> PRT <213> Thermus thermophilus <400> 73 Val Val Ser Val Asp Lys Ala Asn Val Leu Glu Val Gly 1 5 10 <210> 74 <211> 9 <212> PRT <213> Thermus thermophilus <400> 74 Glu Thr Pro Pro Pro Asp Leu Gly Gly 1 5 <210> 75 <211> 13 <212> PRT <213> Sulfolobus sp. <400> 75 Glu Ala Leu Pro Lys Asp Ser Leu Lys Ile Ile Asp Lys 1 5 10 <210> 76 <211> 13 <212> PRT <213> Sulfolobus sp. <400> 76 Val Thr Cys Val His Lys Ala Asn Val Asn Arg Ile Thr 1 5 10 <210> 77 <211> 9 <212> PRT <213> Sulfolobus sp. <400> 77 Lys Ala Leu Thr Pro Asp Val Gly Gly 1 5 <210> 78 <211> 13 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 78 Thr Thr Ile Pro Asp Pro Ala Val Gln Ser Ile Lys Thr 1 5 10 <210> 79 <211> 13 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 79 Val Ser Ala Ile His Lys Ala Asn Ile Asn Gln Lys Thr 1 5 10 <210> 80 <211> 9 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 80 Glu Asn Arg Thr Gly Asp Leu Ala Gly 1 5 <210> 81 <211> 13 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 81 Trp Met Ile Pro Pro Glu Ala Lys Glu Ser Asn Asp Lys 1 5 10 <210> 82 <211> 13 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 82 Val Thr Ala Val His Lys Ala Asn Ile Asn Arg Met Ser 1 5 10 <210> 83 <211> 9 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 83 Asn Met His Thr Pro Asp Ile Gly Gly 1 5 <210> 84 <211> 13 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 84 Glu Trp Leu Pro Ala Glu Thr Leu Asp Val Ala Arg Glu 1 5 10 <210> 85 <211> 13 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 85 Val Thr Leu Val His Lys Gly Asn Ile Asn Lys Phe Thr 1 5 10 <210> 86 <211> 9 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 86 Arg Val Leu Thr Gly Asp Val Val Gly 1 5 <210> 87 <211> 13 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 87 Val Trp Leu Pro Ala Glu Thr Leu Asp Leu Ile Arg Glu 1 5 10 <210> 88 <211> 13 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 88 Val Thr Leu Val His Lys Gly Asn Ile Asn Lys Phe Thr 1 5 10 <210> 89 <211> 8 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 89 Val Val Thr Tyr Asp Phe Ala Arg 1 5 <210> 90 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:oligonucleotide for site directed mutagenesis <400> 90 ctagttattg ctcagcggt 19 <210> 91 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:oligonucleotide for site directed mutagenesis <400> 91 taatacgact cactataggg 20 <210> 92 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:oligonucleotide for site directed mutagenesis <400> 92 gggctcgggc aagggctcgc 20 <210> 93 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:oligo nucleotide for site directed mutagenesis <400> 93 aggtccgggg tcggggtctc c 21 <210> 94 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:oligonucleotide for site directed mutagenesis <400> 94 cttgtccacg ctcgtcacgt gcttcctg 28 <210> 95 <211> 32 <212> PRT <213> Sulfolobus sp. <400> 95 Val Ile Val Thr Glu Asn Val Tyr Gly Asp Ile Leu Ser Asp Glu Ala 1 5 10 15 Ser Gln Ile Ala Gly Ser Leu Gly Ile Ala Pro Ser Ala Asn Ile Gly 20 25 30 <210> 96 <211> 6 <212> PRT <213> Sulfolobus sp. <400> 96 Ala Leu Phe Glu Pro Val 1 5 <210> 97 <211> 32 <212> PRT <213> Thermus thermophilus <400> 97 Val Ile Val Thr Thr Asn Met Asn Gly Asp Ile Leu Ser Asp Leu Thr 1 5 10 15 Ser Gly Leu Ile Gly Gly Leu Gly Phe Ala Pro Ser Ala Asn Ile Gly 20 25 30 <210> 98 <211> 6 <212> PRT <213> Thermus thermophilus <400> 98 Ala Ile Phe Glu Ala Val 1 5 <210> 99 <211> 32 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 99 Val Leu Val Met Pro Asn Leu Tyr Gly Asp Ile Leu Ser Asp Leu Cys 1 5 10 15 Ala Gly Leu Ile Gly Gly Leu Gly Val Thr Pro Ser Gly Asn Ile Gly 20 25 30 <210> 100 <211> 6 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 100 Ala Ile Phe Glu Ala Val 1 5 <210> 101 <211> 33 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 101 Val Ser Val Cys Pro Asn Leu Tyr Gly Asp Ile Leu Ser Asp Leu Asn 1 5 10 15 Ser Gly Leu Ser Ala Gly Ser Leu Gly Leu Thr Pro Ser Ala Asn Ile 20 25 30 Gly <210> 102 <211> 6 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 102 Ser Ile Phe Glu Ala Val 1 5 <210> 103 <211> 32 <212> PRT <213> Caldococcus noboribetus <400> 103 Val Ile Val Thr Pro Asn Leu Asn Gly Asp Tyr Ile Ser Asp Glu Ala 1 5 10 15 Asn Ala Leu Val Gly Gly Ile Gly Met Ala Ala Gly Leu Asp Met Gly 20 25 30 <210> 104 <211> 6 <212> PRT <213> Caldococcus noboribetus <400> 104 Ala Val Ala Glu Pro Val 1 5

【図面の簡単な説明】

【図１】16S rRNAの比較による系統樹を示す。

【図２】種々の生物種由来のIPMDHおよびICDHのアミノ
酸配列のマルチプルアラインメントを示す。

【図３】IPMDHおよびICDHの同時比較によって構築され
た系統樹を示す。

【図４】Sulforobus sp.7株の152番残基の進化を示す。

【図５】pE7-SB21の制限酵素地図を示す。pE7-SB21は発
現ベクターpET21cのNdeI-EcoEI領域にleuB遺伝子を挿入
して作製された。図中の記号は以下の制限酵素切断部位
を表す：N:Nde I、Sm:Sma I、E:EcoR I、E₄₇:Eco47 II
I、B:Bgl II、Xb:Xba I、H:Hind III、Xh:Xho I、M:Mro
I

【図６】スルフォロブスsp. leuB遺伝子の塩基配列およ
びアミノ酸配列を示す。

【図７】スルフォロブスsp. leuB遺伝子の塩基配列およ
びアミノ酸配列（続き）。

【図８】abcd領域における変異導入の概略を示す。図中
の記号は以下の制限酵素切断部位を表す：N:Nde I、Sm:
Sma I、E:EcoR I、E₄₇:Eco47III、B:BglII、X_b:Xba I、
H:Hind III、Xh:XhoI、M:Mro I、Na:Nae I、Sa:Sal I

【図９】IPMDHおよびICDHのマルチプルアラインメント
を示す。(ICDH)は各生物種のICDHアミノ酸配列を表し、
表示がない配列はIPMDHを表す。N. Cra: Neurospora cr
assa, S. Cer: Saccharomyces cerevisiae, A. tum:Agr
obacterium tumefacience, B. sub:Bacillus subtilis,
E. Col: Escherichia coli, T. The: Thermus thermop
hilus, Sub sp.#7: Sulfolobus stain #7、Cs. Cer: Sa
ccharomyces cerevisiae (ICDH)、CB. Tau: Bos taurus
(ICDH)、CB. Sub: Bacillus subtilis (ICDH)、CE. Co
l: Escherichia coli (ICDH)。

【図１０】Thermus thermophilus IPMDHの53番残基の
進化を表す。

【図１１】Thermus thermophilus IPMDHがクローニング
されたプラスミドpET21cを鋳型とした変異導入手順を示
す。

【図１２】Thermus thermophilus野生型及び祖先型IPMD
H活性の熱処理後の残存を示す。

【図１３】IPMDHおよびICDHのマルチプルアラインメン
トを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:19） //(Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:19） 5/00 Ａ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（i）系統樹中の複数の生物種に由来
する、進化的に互いに対応するタンパク質のアミノ酸配
列を比較すること、(ii)（i）で比較したアミノ酸配列
に対応する、祖先型タンパク質のアミノ酸配列を推定す
ること、(iii) (i)で比較したタンパク質の１つにおい
て、そのアミノ酸配列中のアミノ酸残基を(ii)で推定し
た祖先型タンパク質中の対応する位置のアミノ酸残基と
比較し、前記祖先型と異なるアミノ酸残基の1以上を前
記祖先型タンパク質と同一のアミノ酸残基に置換するこ
と、を含む、タンパク質の耐熱性を改善する方法。
【請求項２】更に、(iv)アミノ酸が置換されたタンパ
ク質の耐熱性を試験すること、(V)耐熱性の向上したタ
ンパク質を選抜すること、を含む，請求項１に記載の方
法。
【請求項３】請求項１または２に記載のタンパク質の
耐熱性を改善する方法であって、（ａ）(i)において比
較するタンパク質が由来する生物種に好熱菌または古細
菌が含まれること、または、（ｂ）(i)において比較す
るタンパク質に同一ファミリーに属する複数のタンパク
質が含まれること、を特徴とする、前記方法。
【請求項４】請求項１〜３のいずれか１項に記載の方
法よって耐熱性が改善されたタンパク質。
【請求項５】請求項４に記載のタンパク質をコードす
る核酸。
【請求項６】請求項５に記載の核酸を発現可能な形で
含む組換えDNA分子。
【請求項７】請求項６に記載の組換えDNA分子を有す
る宿主細胞。