CN114480345B - MazF突变体、重组载体、重组工程菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种MazF突变体、重组载体、重组工程菌及其应用。该MazF突变体包括：(a)、由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列缺失、替代或增加一个或多个氨基酸组成的多肽；或，(b)、与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少90％同源性的多肽。上述MazF突变体在37℃下的半衰期在4天以上，高于野生型MazF的半衰期，适于在较高的温度下剪切单链RNA。
Description
技术领域
本申请涉及生物技术领域，特别是涉及一种MazF突变体、重组载体、重组工程菌及其应用。
背景技术
毒素-抗毒素系统是原核生物中的一对基因操纵元件，通常为中间有一个或数个碱基重叠的相邻基因，分别编码一个稳定的毒素蛋白和不稳定的抗毒素蛋白，可以在细菌应对各种胁迫条件时诱导其生长抑制或程序性死亡，具有重要的生理调节功能。目前，研究最为充分的毒素-抗毒素系统是大肠杆菌来源的MazEF基因元件，分别编码毒素蛋白MazF和抗毒素蛋白MazE。MazF是一种特异剪切单链RNA中AˇCA序列核糖核酸内切酶(符号ˇ表示剪切位点)，可以高效剪切mRNA和rRNA，不能切断双链RNA、双链DNA及单链DNA。蛋白质晶体结构研究显示，MazE对MazF的中和作用是通过与MazF形成一个六聚体结构(由2个MazE和4个MazF组成)实现的。MazEF已经被广泛应用于体内、体外的抑菌模型及相关实验中，对于研究基于毒素-抗毒素系统的新型抗菌(如耐药菌、滞留菌)策略具有重要的意义。此外，其对于单链RNA的特异性剪切功能有望为RNA探针及mRNA的合成与分析提供新的方案。
尽管毒素蛋白相对于抗毒素蛋白较为稳定，但在研究中发现，其自身的热稳定性不高、活性保持时间有限，经较短时间的处理或存放会带来显著的活性差异。并且，毒素蛋白由于其自身对宿主菌具有高毒性，使得表达纯化条件相对苛刻，从而导致稳定的高活性毒素蛋白的制备成为制约相关研究工作的瓶颈。
MazF是生物有机体内普遍存在的一种重要酶类，它能催化遗传物质DNA的甲基化，在基因表达及动物生长、发育中起着重要的调控作用；同时，也能催化多种生理过程中间产物的甲基化进而合成或降解生理活性物质。根据研究发现，人类的情绪和许多疾病的发生及植物的抗逆性都与MazF基因的表达有关。然而，市场上大多数MazF突变体的热稳定性较差，难以满足实际需求。
发明内容
基于此，有必提供一种热稳定性较好的MazF突变体、重组载体、重组工程菌及其应用。
一种MazF突变体，所述MazF突变体包括：
(a)、由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列缺失、替代或增加一个或多个氨基酸组成的多肽；或，
(b)、与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少90％同源性的多肽。
研究发现，包括由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列缺失、替代或增加一个或多个氨基酸得到的多肽；或，与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少90％同源性的多肽的MazF突变体具有较好的热稳定性。经试验验证，上述MazF突变体在37℃下的半衰期在4天以上，高于野生型MazF的半衰期，热稳定性较好，适于在较高的温度下剪切单链RNA。
其中一个实施例中，所述MazF突变体包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中第21位氨基酸、第55位氨基酸、第87位氨基酸及第91位氨基酸中的至少一个发生突变得到的多肽。
其中一个实施例中，所述MazF突变体包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生K21A突变、S55I突变、G87L突变及K91I突变中至少一种得到的多肽。
其中一个实施例中，所述MazF突变体包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生K21A突变、S55I突变、G87L突变及K91I突变中的任意一种得到的多肽。
其中一个实施例中，所述MazF突变体包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列同时发生K21A突变、S55I突变、G87L突变及K91I突变中的任意两种得到的多肽。
其中一个实施例中，所述MazF突变体包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列同时发生K21A突变、S55I突变、G87L突变及K91I突变中的任意三种得到的多肽。
其中一个实施例中，所述MazF突变体包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列同时发生K21A突变、S55I突变、G87L突变及K91I突变得到的多肽。
其中一个实施例中，所述MazF突变体的氨基酸序列为如SEQ ID No.3～SEQ IDNo.17所示的序列中的一种。
其中一个实施例中，所述MazF突变体的编码序列包括：
(a)、与如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少90％同源性的多核苷酸；或，
(b)、由如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列缺失、替代或增加一个或多个碱基得到的多核苷酸。
其中一个实施例中，所述MazF突变体的核苷酸序列为如SEQ ID No.28～SEQ IDNo.42所示的序列中的一种。
其中一个实施例中，所述MazF突变体为可溶性酶、固定化酶或者基因工程酶。
一种重组载体，含有上述MazF突变体的编码序列。
其中一个实施例中，包括如下步骤：采用第一扩增引物对对第一载体进行PCR扩增，得到重组载体，其中，所述第一载体含有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列对应的编码序列，所述第一扩增引物对含有所述MazF突变体的突变位点对应的核苷酸序列。
其中一个实施例中，所述第一扩增引物对选自如下引物对中的至少一对：核苷酸序列如SEQ ID No.20和SEQ ID No.21所示的引物对、核苷酸序列如SEQ ID No.22和SEQ IDNo.23所示的引物对、核苷酸序列如SEQ ID No.24和SEQ ID No.25所示的引物对、核苷酸序列如SEQ ID No.26和SEQ ID No.27所示的引物对。
一种重组工程菌，含上述重组载体。
上述MazF突变体、上述重组载体或者上述重组工程菌在剪切单链RNA中的应用。
附图说明
图1为氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的MazF的蛋白模拟晶体结构示意图及突变点在晶体结构上的分布示意图。
具体实施方式
为使本申请的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本申请的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请。但是本申请能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下做类似改进，因此本申请不受下面公开的具体实施的限制。
本申请一实施方式提供一种MazF突变体包括：
(a)、由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列缺失、替代或增加一个或多个氨基酸组成的多肽；或，
(b)、与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少90％同源性的多肽。
研究发现，包括由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列缺失、替代或增加一个或多个氨基酸得到的多肽；或，与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少90％同源性的多肽的MazF突变体具有较好的热稳定性。经试验验证，上述MazF突变体在37℃下的半衰期在4天以上，高于野生型MazF的半衰期，热稳定性较好，适于在较高的温度下剪切单链RNA。
如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列为来源于Escherichia coli(strain K12)的野生型内切核糖核酸酶毒素MazF，其相应的抗毒素蛋白为MazE，毒素-抗毒素蛋白复合物为MazEF。编码该蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No.1，氨基酸序列为SEQ ID No.2。
在其中一个实施例中，MazF突变体包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中第21位氨基酸、第55位氨基酸、第87位氨基酸及第91位氨基酸中的至少一个发生突变得到的多肽。
本申请对氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的野生型MazF进行结构分析及耐热性研究的过程中，发现第15位氨基酸(即V，缬氨酸)、第21位氨基酸(即K，赖氨酸)、第55位氨基酸(即S，丝氨酸)、第87位氨基酸(即G，甘氨酸)、第91位氨基酸(即K，赖氨酸)对该酶的耐热性能影响较大，尤其是第21位氨基酸、第55位氨基酸、第87位氨基酸及第91位氨基酸对其酶耐热性能影响明显。
经进一步研究发现：MazF突变体，包括由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生K21A突变、S55I突变、G87L突变及K91I突变中至少一种得到的多肽的，其在37℃下半衰期长于野生型MazF，热稳定性较好，适于在较高的温度下剪切单链RNA。
其中，MazF突变体包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生K21A突变、S55I突变、G87L突变及K91I突变中的任意一种得到的多肽。
MazF突变体包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列同时发生K21A突变、S55I突变、G87L突变及K91I突变中的任意两种得到的多肽。
MazF突变体包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列同时发生K21A突变、S55I突变、G87L突变及K91I突变中的任意三种得到的多肽。
MazF突变体包括：由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列同时发生K21A突变、S55I突变、G87L突变及K91I突变得到的多肽。
在一个具体示例中，MazF突变体的氨基酸序列为如SEQ ID No.3～SEQ ID No.17所示的序列中的一种。
其中一个实施例中，MazF突变体的编码序列包括：
(a)、与如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少90％同源性的多核苷酸；或，
(b)、由如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列缺失、替代或增加一个或多个碱基得到的多核苷酸。
在一个具体示例中，MazF突变体的核苷酸序列为如SEQ ID No.28～SEQ ID No.42所示的序列中的一种。
由于同一氨基酸可由几种不同的密码子来决定，故同一氨基酸可对应不同的核苷酸序列。因此本申请中的MazF突变体的氨基酸序列，包括由如SEQ ID No.1所示核苷酸序列进行1个或几个核苷酸取代而得到的密码子同义突变的核苷酸序列所编码得到。本领域技术人员可以根据本申请公开的MazF突变体的氨基酸序列，根据现有分子生物学技术，采用cDNA克隆和定点突变的方法或其他适合的方法获得本申请的MazF突变体，因此，编码上述MazF突变体的核苷酸序列并不仅限于如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。如果编码得到的蛋白与MazF突变体没有明显的功能差异，也包括在本申请的范围内。
此外，由于蛋白编码序列的多态性及变异，天然存在的蛋白质会出现基因突变，编码序列中碱基被缺失、替代或增加，或氨基酸的缺失、插入、取代或其它变异，从而导致蛋白质的氨基酸序列出现一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加。因此，存在着一些生理和生物活性上基本等同于无变异蛋白质的蛋白。这些结构不同于相应的蛋白质，但与该蛋白质没有明显的功能差异的多肽或蛋白称为功能等同变异体。
功能等同的变异体同样适用于通过缺失、插入和突变等人工手段改变一个或多个密码子，从而向一种蛋白质的氨基酸序列中导入这类变异而制成的多肽。尽管这样能获得更多不同形式的变异体，但所得的变异体作为功能等同变异体的前提是其生理活性基本等同于原始无变异蛋白质的活性。
一般的，功能等同变异体的编码序列是同源的，因此，由至少一种改变(如蛋白质的编码序列中一个或多个碱基的缺失、插入或取代或者蛋白质的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸缺失、插入或取代)所得的多肽或蛋白一般具有功能上等同于所述蛋白质的活性，因此，由上述核苷酸序列编码的到的多肽或上述氨基酸序列组成的多肽，如果编码得到的蛋白与MazF突变体没有明显的功能差异，也包括在本申请的范围内。
其中一个实施例中，MazF突变体为可溶性酶、固定化酶或者基因工程酶。
上述MazF突变体具有较高的热稳定性，适于在较高的温度下剪切单链RNA。
本申请一实施方式提供一种重组载体，含有上述MazF突变体的编码序列。
其中，重组载体为克隆载体或表达载体。
具体地，重组载体为含有上述MazF突变体的编码序列的pET28a质粒。需要说明的是，重组载体不限于为含有上述MazF突变体的编码序列的pET28a质粒，也可以将MazF突变体基因整合到其他载体上，例如可以为pET21b、pET22b、pET32a、pQE30等载体。
本申请一实施方式提供上述重组载体的制备方法，包括如下步骤：采用第一扩增引物对对第一载体进行PCR扩增，得到重组载体，其中，第一载体含有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列对应的编码序列。第一扩增引物对含有所述MazF突变体的突变位点对应的核苷酸序列。
其中，第一扩增引物对选自如下引物对中的至少一对：核苷酸序列如SEQ IDNo.20和SEQ ID No.21所示的引物对、核苷酸序列如SEQ ID No.22和SEQ ID No.23所示的引物对、核苷酸序列如SEQ ID No.24和SEQ ID No.25所示的引物对、核苷酸序列如SEQ IDNo.26和SEQ ID No.27所示的引物对。
需要说明的是，MazF突变体的单点突变体的构建中，以上述第一扩增引物对中的一对进行PCR扩增。MazF突变体的多点突变体的构建中，对一个突变位点进行单点突变后，再进行第二突变位点进行突变，依次叠加获得。具体地，按照以下方式进行：一个突变位点的扩增引物对扩增后，再用另一个突变位点的扩增引物对对含有在先突变的扩增产物进行扩增。
在其中一个实施例中，采用第一扩增引物对对第一载体进行PCR扩增的步骤之前，还包括构建第一载体的步骤。
其中，构建第一载体的步骤包括：采用序列如SEQ ID No.18～SEQ ID No.19所示的目的基因扩增引物对扩增目的基因，目的基因为如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列对应的编码序列；将目的基因连接到空载体中，转化，提取阳性质粒，得到第一载体。具体地，如SEQ ID No.18所示的序列为：5’-CGCATATGATGGTAAGCCGATACGTAC-3’(即带下划线碱基为限制性内切酶NdeI识别位点)，如SEQ ID No.19所示的序列为：5’-TCAGCTCTCGAGCCTACCCAATCAGTACGTTAA-3’(带下划线碱基为限制性内切酶XhoI识别位点)。
在其中一个实施例中，在采用第一扩增引物对对第一载体进行PCR扩增的步骤之前，还包括如下步骤：筛选MazF突变体的突变位点。
具体地，筛选MazF突变体的突变位点包括如下步骤：通过在NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索MazF氨基酸序列(如SEQ ID No.2所示)，去除重复出现的相同序列后选取与目标蛋白序列一致性(identity)大于50％的蛋白质序列，然后进行多序列比对及Consensus sequence分析，并对野生型MazF进行结构分析及耐热性研究，发现第15位氨基酸(即V，缬氨酸)、第21位氨基酸(即K，赖氨酸)、第55位氨基酸(即S，丝氨酸)、第87位氨基酸(即G，甘氨酸)、第91位氨基酸(即K，赖氨酸)对该酶的耐热性能影响较大，尤其是第21位氨基酸、第55位氨基酸、第87位氨基酸及第91位氨基酸对其酶耐热性能影响明显；同时根据蛋白模拟晶体结构进行突变位点分析和设计发现如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生K21A、S55I、G87L、K91I中的至少一种得到的MazF突变体的热稳定性较高。
与理性设计基于蛋白质精确结构-功能关系不同的是，本申请以ConsensusConcept理论为指导思想，从进化的角度分析能提高酶热稳定性的信息，对MazF家族序列进行整合分析，并结合生物信息学及晶体学方法辅助，获得具高稳定性的新型MazF突变体。
上述重组载体的构建方法能够表达高稳定性的MazF突变体的重组载体。上述重组载体能够用于生产MazF突变体，以适于在较高的温度下剪切单链RNA，在单链RNA特异性剪切方面具有较好的应用前景。
本申请一实施方式提供一种重组工程菌含有上述实施方式的重组载体。
上述重组工程菌用于生产MazF突变体，以适于在较高的温度下剪切单链RNA；并且构建的高效表达的重组工程菌，具有其培养周期短、培养条件简单、目的蛋白产量高、纯化简单的优点。
进一步地，重组工程菌为含有上述实施方式的重组载体的大肠杆菌。可选地，重组工程菌为含有上述实施方式的重组载体的大肠杆菌BL21(DE3)。需要说明的是，重组工程菌不限于为含有上述实施方式的重组载体的大肠杆菌，也可以使用革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母和真菌等微生物宿主进行目的蛋白的表达。
以下为具体实施例部分。
实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。
以下实施例中，如特别说明，基因来源：野生型MazF来源于Escherichia coli(strain K12)，编码该蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No.1，氨基酸序列为SEQ ID No.2。MazF基因由北京擎科生物科技有限公司提供；PCR扩增酶为东洋纺提供的KOD高保真聚合酶。
实施例1
1、野生型MazF基因的克隆
野生型MazF基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1，表达的氨基酸序列为SEQ IDNo.2。以SEQ ID No.1作为目的基因，采用上游扩增引物SEQ ID No.18和下游扩增引物SEQID No.19扩增目的基因。扩增条件为：在95℃下扩增2min，然后在56℃下扩增20sec、在72℃下扩增90sec，共30个循环，最后在72℃下扩增10min。
待反应结束，采用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，得到360bp左右的条带，其长度符合预期结果。按照市售DNA胶回收试剂盒标准操作，回收、纯化该目的片段，使用限制性核酸内切酶XhoI和NdeI对该目的片段以及pET28a质粒进行双酶切，然后采用T4DNA连接酶进行连接，将得到的连接产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，将转化细胞涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB平板上，提取阳性克隆质粒，进行测序，结果显示克隆的MazF基因序列正确，且已正确接入pET28a质粒，得到重组质粒pET28a-MazF。
2.MazF蛋白的表达和纯化
在大肠杆菌中大量表达有活性的MazF蛋白会导致菌体死亡，因此我们选择了在较低温度下(MazF活性低)短时间诱导表达目的蛋白，极大地降低了目标蛋白对宿主菌的伤害性。具体操作如下：将甘油管中的工程菌按体积比1％接种到含100μg/mL Kan的4mL LB培养基试管中，在37℃、220rpm条件下培养12h；取菌液4mL转接至含100μg/mL Kan的1L LB培养基摇瓶中，在37℃、220rpm条件下培养2.5h，使OD600达到0.6-0.8，加入1mM IPTG诱导剂，在25℃、200rpm条件下诱导培养3h。将发酵后收获的大肠杆菌菌体悬液超声破碎，再经过一步Ni-NTA亲和层析处理，得到纯度＞90％的MazF蛋白，氨基酸序列为SEQ ID No.2。
实施例2
MazF突变体的构建、表达及纯化
本申请对野生型MazF进行结构分析及耐热性研究的过程中，发现第15位氨基酸(即V，缬氨酸)、第21位氨基酸(即K，赖氨酸)、第55位氨基酸(即S，丝氨酸)、第87位氨基酸(即G，甘氨酸)、第91位氨基酸(即K，赖氨酸)对该酶的耐热性能影响较大，尤其是第21位氨基酸、第55位氨基酸、第87位氨基酸及第91位氨基酸对其酶耐热性能影响明显；同时根据蛋白模拟晶体结构进行突变位点分析和设计发现如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列发生K21A、S55I、G87L、K91I中的至少一种得到的MazF突变体的热稳定性较高。该野生型MazF的蛋白模拟晶体结构示意图如图1所示。
1、MazF蛋白单点突变体的构建
以实施例1得到的重组质粒pET28a-MazF为模板，以带有突变位点的一对互补的寡核苷酸为扩增引物，用KOD高保真酶(由TakaRa公司提供)进行全质粒PCR扩增，获得具有特定突变位点的重组质粒；
其中，所采用的扩增引物对为：
(1)突变位点K21A：上游扩增引物的序列如SEQ ID No.20所示，下游扩增引物的序列如SEQ ID No.21所示。
(2)突变位点S55I：上游扩增引物的序列如SEQ ID No.22所示，下游扩增引物的序列如SEQ ID No.23所示。
(3)突变位点G87L：上游扩增引物的序列如SEQ ID No.24所示，下游扩增引物的序列如SEQ ID No.25所示。
(4)突变位点K91I：上游扩增引物的序列如SEQ ID No.26所示，下游扩增引物的序列如SEQ ID No.27所示。
扩增条件为：在95℃下扩增2min，然后在56℃下扩增20sec、在72℃下扩增90sec，共30个循环，最后在72℃下扩增10min；胶回收PCR扩增产物，采用DpnI酶(由TakaRa公司提供)在37℃条件下消化胶回收产物2h，降解初始模板；将消化产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂布到含有100μg/mL卡那霉素LB琼脂平板上，37℃过夜培养，筛选阳性克隆，测序验证，得到含MazF单点突变体的重组菌。
2、MazF蛋白组合突变体的构建
使用与单点突变体相似的构建方法，将稳定性提高的单点突变体累加组合，在SEQID No.2所示的氨基酸序列选择多个突变位点进行组合，如从上述4个突变位点中选择2～4个突变位点进行组合，分别得到不同的MazF组合突变体：
(1)选择2个突变位点进行组合，可构建6种热稳定性提高的MazF突变体及MazF组合突变体，其组合突变位点分别为：K21A/S55I、K21A/G87L、K21A/K91I、S55I/G87L、S55I/K91I、G87L/K91I；该6种热稳定性提高的MazF组合突变体的氨基酸序列分别如SEQ IDNo.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12所示。
(2)选择3个突变位点进行组合，可构建4种热稳定性提高的MazF组合突变体，其组合突变位点分别为：K21A/S55I/G87L、K21A/S55I/K91I、S55I/G87L/K91I、K21A/G87L/K91I，该4种热稳定性提高的MazF组合突变体的氨基酸序列分别如SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16所示。
(3)选择4个突变位点进行组合，可构建1种热稳定性提高的MazF组合突变体，其组合突变位点分别为：K21A/S55I/G87L/K91I，该种热稳定性提高的MazF组合突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.17所示。
其中，各MazF突变体的氨基酸序列和核苷酸序列如下：
突变位点为K21A的MazF突变体：氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，核苷酸序列为SEQ ID No.28所示；
突变位点为S55I的MazF突变体：氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，核苷酸序列为SEQ ID No.29所示；
突变位点为G87L的MazF突变体：氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，核苷酸序列为SEQ ID No.30所示；
突变位点为K91I的MazF突变体：氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，核苷酸序列为SEQ ID No.31所示；
突变位点为K21A/S55I的MazF突变体：氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，核苷酸序列为SEQ ID No.32所示；
突变位点为K21A/G87L的MazF突变体：氨基酸序列如SEQ ID No.8所示，核苷酸序列为SEQ ID No.33所示；
突变位点为K21A/K91I的MazF突变体：氨基酸序列如SEQ ID No.9所示，核苷酸序列为SEQ ID No.34所示；
突变位点为S55I/G87L的MazF突变体：氨基酸序列如SEQ ID No.10所示，核苷酸序列为SEQ ID No.35所示；
突变位点为S55I/K91I的MazF突变体：氨基酸序列如SEQ ID No.11所示，核苷酸序列为SEQ ID No.36所示；
突变位点为G87L/K91I的MazF突变体：氨基酸序列如SEQ ID No.12所示，核苷酸序列为SEQ ID No.37所示；
突变位点为K21A/S55I/G87L的MazF突变体：氨基酸序列如SEQ ID No.13所示，核苷酸序列为SEQ ID No.38所示；
突变位点为K21A/S55I/K91I的MazF突变体：氨基酸序列如SEQ ID No.14所示，核苷酸序列为SEQ ID No.39所示；
突变位点为S55I/G87L/K91I的MazF突变体：氨基酸序列如SEQ ID No.15所示，核苷酸序列为SEQ ID No.40所示；
突变位点为K21A/G87L/K91I的MazF突变体：氨基酸序列如SEQ ID No.16所示，核苷酸序列为SEQ ID No.41所示；
突变位点为K21A/S55I/G87L/K91I的MazF突变体：氨基酸序列如SEQ ID No.17所示，核苷酸序列为SEQ ID No.42所示。
测试例1
MazF的酶学性质表征
将野生型MazF以及实施例2提供的多种MazF突变体进行热稳定性测试，MazF及突变体的酶活力测定采用荧光探针法，本申请设计并委托北京擎科生物公司合成了序列为Cy3-5’-AGTCGACAGTCA-3’-Iowa的单链DNA/RNA杂交核酸探针，其中核酸序列中的加粗字体表示核糖核苷酸、正常字体表示脱氧核糖核酸，且序列的5’端偶联了荧光基团Cy3，3’偶联了荧光猝灭基团Iowa，AˇCA为MazF及突变体的识别序列和剪切位点(用ˇ表示)。正常情况下，该探针的荧光基团Cy3和猝灭基团Iowa相距很近，导致Cy3不能发射荧光；当使用MazF或突变体将探针中的AˇCA序列在所示位置切开，产生Cy3-5’-AGTCGA-3’和5’-CAGTCA-3’-Iowa两段独立的序列，此时Cy3由于和Iowa距离变远而得以发射荧光，使用酶标仪检测限时反应产生的荧光信号强度即可反映MazF及突变体的酶活力。
反应体系如表1所示，配制完成后加入96孔黑色酶标板中，每组平行3孔。酶标仪检测参数设置为恒温37℃，激发波长550nm、发射波长57nm，增益60，每30s读取一次荧光值，连续检测10min。将3个平行组的数据取平均值作为各时刻点的平均荧光值，将第10min的平均荧光值减去第0min的平均荧光值，所得差值作为MazF或突变体的10min酶活。
表1.MazF酶活力检测反应体系
| 试剂 | 体积/终浓度 |
| 5×MazF Buffer | 20μL |
| 荧光探针 | 0.1μM |
| MazF或突变体 | 0.2μg |
其中，5×MazF Buffer组分为200mM磷酸钠(pH7.5)、0.05％Tween-20；阴性对照组使用等体积的蛋白洗脱液代替蛋白。
将MazF及突变体的蛋白溶液在水浴锅中37℃持续孵育，每天相同时间取样，测定MazF野生型及突变体的10min残余活力百分比，以残余活力百分比的ln值对时间t(min)作图，直线的斜率为失活常数kinact，由t1/2＝ln2/kinact得到MazF野生型或突变体在该温度下的半衰期。
实验结果表明，以上多种MazF突变体中，有4种单点突变体和11种组合突变体的热稳定性得到明显提升，如表2所示：
表2.MazF野生型、单点突变体和组合突变体的热稳定性
从表1可以看出，上述MazF突变体在37℃下的半衰期在4天以上，均长于野生型MazF在37℃下的半衰期，尤其是组合突变体表现出单点突变体热稳定性的叠加效果，特别是发生K21A/S55I/G87L突变得到的MazF突变体在37℃下的半衰期达9天，是野生型MazF的3倍，具有较好的热稳定性。
综上，本申请的MazF突变体的热稳定性更好，适于在更长的时间内保持较高的核糖核酸内切酶活性，可应用于各种基于MazEF毒素-抗毒素系统的细菌自杀机制研究以及特定序列mRNA的合成与分析。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 苏州瀚源新酶生物科技有限公司
<120> MazF突变体、重组载体、重组工程菌及其应用
<160> 42
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggtaagcc gatacgtacc cgatatgggc gatctgattt gggttgattt tgacccgaca 60
aaaggtagcg agcaagctgg acatcgtcca gctgttgtcc tgagtccttt catgtacaac 120
aacaaaacag gtatgtgtct gtgtgttcct tgtacaacgc aatcaaaagg atatccgttc 180
gaagttgttt tatccggtca ggaacgtgat ggcgtagcgt tagctgatca ggtaaaaagt 240
atcgcctggc gggcaagagg agcaacgaag aaaggaacag ttgccccaga ggaattacaa 300
ctcattaaag ccaaaattaa cgtactgatt gggtag 336
<210> 2
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Val Ser Arg Tyr Val Pro Asp Met Gly Asp Leu Ile Trp Val Asp
1 5 10 15
Phe Asp Pro Thr Lys Gly Ser Glu Gln Ala Gly His Arg Pro Ala Val
20 25 30
Val Leu Ser Pro Phe Met Tyr Asn Asn Lys Thr Gly Met Cys Leu Cys
35 40 45
Val Pro Cys Thr Thr Gln Ser Lys Gly Tyr Pro Phe Glu Val Val Leu
50 55 60
Ser Gly Gln Glu Arg Asp Gly Val Ala Leu Ala Asp Gln Val Lys Ser
65 70 75 80
Ile Ala Trp Arg Ala Arg Gly Ala Thr Lys Lys Gly Thr Val Ala Pro
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Glu Glu Leu Gln Leu Ile Lys Ala Lys Ile Asn Val Leu Ile Gly
100 105 110
<210> 3
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Val Ser Arg Tyr Val Pro Asp Met Gly Asp Leu Ile Trp Val Asp
1 5 10 15
Phe Asp Pro Thr Ala Gly Ser Glu Gln Ala Gly His Arg Pro Ala Val
20 25 30
Val Leu Ser Pro Phe Met Tyr Asn Asn Lys Thr Gly Met Cys Leu Cys
35 40 45
Val Pro Cys Thr Thr Gln Ser Lys Gly Tyr Pro Phe Glu Val Val Leu
50 55 60
Ser Gly Gln Glu Arg Asp Gly Val Ala Leu Ala Asp Gln Val Lys Ser
65 70 75 80
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85 90 95
Glu Glu Leu Gln Leu Ile Lys Ala Lys Ile Asn Val Leu Ile Gly
100 105 110
<210> 4
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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1 5 10 15
Phe Asp Pro Thr Lys Gly Ser Glu Gln Ala Gly His Arg Pro Ala Val
20 25 30
Val Leu Ser Pro Phe Met Tyr Asn Asn Lys Thr Gly Met Cys Leu Cys
35 40 45
Val Pro Cys Thr Thr Gln Ile Lys Gly Tyr Pro Phe Glu Val Val Leu
50 55 60
Ser Gly Gln Glu Arg Asp Gly Val Ala Leu Ala Asp Gln Val Lys Ser
65 70 75 80
Ile Ala Trp Arg Ala Arg Gly Ala Thr Lys Lys Gly Thr Val Ala Pro
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<210> 5
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Val Ser Arg Tyr Val Pro Asp Met Gly Asp Leu Ile Trp Val Asp
1 5 10 15
Phe Asp Pro Thr Lys Gly Ser Glu Gln Ala Gly His Arg Pro Ala Val
20 25 30
Val Leu Ser Pro Phe Met Tyr Asn Asn Lys Thr Gly Met Cys Leu Cys
35 40 45
Val Pro Cys Thr Thr Gln Ser Lys Gly Tyr Pro Phe Glu Val Val Leu
50 55 60
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65 70 75 80
Ile Ala Trp Arg Ala Arg Leu Ala Thr Lys Lys Gly Thr Val Ala Pro
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Glu Glu Leu Gln Leu Ile Lys Ala Lys Ile Asn Val Leu Ile Gly
100 105 110
<210> 6
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Val Ser Arg Tyr Val Pro Asp Met Gly Asp Leu Ile Trp Val Asp
1 5 10 15
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20 25 30
Val Leu Ser Pro Phe Met Tyr Asn Asn Lys Thr Gly Met Cys Leu Cys
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Ile Ala Trp Arg Ala Arg Gly Ala Thr Lys Ile Gly Thr Val Ala Pro
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<210> 7
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
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1 5 10 15
Phe Asp Pro Thr Ala Gly Ser Glu Gln Ala Gly His Arg Pro Ala Val
20 25 30
Val Leu Ser Pro Phe Met Tyr Asn Asn Lys Thr Gly Met Cys Leu Cys
35 40 45
Val Pro Cys Thr Thr Gln Ile Lys Gly Tyr Pro Phe Glu Val Val Leu
50 55 60
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65 70 75 80
Ile Ala Trp Arg Ala Arg Gly Ala Thr Lys Lys Gly Thr Val Ala Pro
85 90 95
Glu Glu Leu Gln Leu Ile Lys Ala Lys Ile Asn Val Leu Ile Gly
100 105 110
<210> 8
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Met Val Ser Arg Tyr Val Pro Asp Met Gly Asp Leu Ile Trp Val Asp
1 5 10 15
Phe Asp Pro Thr Ala Gly Ser Glu Gln Ala Gly His Arg Pro Ala Val
20 25 30
Val Leu Ser Pro Phe Met Tyr Asn Asn Lys Thr Gly Met Cys Leu Cys
35 40 45
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Ile Ala Trp Arg Ala Arg Leu Ala Thr Lys Lys Gly Thr Val Ala Pro
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<210> 9
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
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1 5 10 15
Phe Asp Pro Thr Ala Gly Ser Glu Gln Ala Gly His Arg Pro Ala Val
20 25 30
Val Leu Ser Pro Phe Met Tyr Asn Asn Lys Thr Gly Met Cys Leu Cys
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Ile Ala Trp Arg Ala Arg Gly Ala Thr Lys Ile Gly Thr Val Ala Pro
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<210> 10
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Met Val Ser Arg Tyr Val Pro Asp Met Gly Asp Leu Ile Trp Val Asp
1 5 10 15
Phe Asp Pro Thr Lys Gly Ser Glu Gln Ala Gly His Arg Pro Ala Val
20 25 30
Val Leu Ser Pro Phe Met Tyr Asn Asn Lys Thr Gly Met Cys Leu Cys
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<210> 11
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Met Val Ser Arg Tyr Val Pro Asp Met Gly Asp Leu Ile Trp Val Asp
1 5 10 15
Phe Asp Pro Thr Lys Gly Ser Glu Gln Ala Gly His Arg Pro Ala Val
20 25 30
Val Leu Ser Pro Phe Met Tyr Asn Asn Lys Thr Gly Met Cys Leu Cys
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Val Pro Cys Thr Thr Gln Ile Lys Gly Tyr Pro Phe Glu Val Val Leu
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<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
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Val Leu Ser Pro Phe Met Tyr Asn Asn Lys Thr Gly Met Cys Leu Cys
35 40 45
Val Pro Cys Thr Thr Gln Ser Lys Gly Tyr Pro Phe Glu Val Val Leu
50 55 60
Ser Gly Gln Glu Arg Asp Gly Val Ala Leu Ala Asp Gln Val Lys Ser
65 70 75 80
Ile Ala Trp Arg Ala Arg Leu Ala Thr Lys Ile Gly Thr Val Ala Pro
85 90 95
Glu Glu Leu Gln Leu Ile Lys Ala Lys Ile Asn Val Leu Ile Gly
100 105 110
<210> 13
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Met Val Ser Arg Tyr Val Pro Asp Met Gly Asp Leu Ile Trp Val Asp
1 5 10 15
Phe Asp Pro Thr Ala Gly Ser Glu Gln Ala Gly His Arg Pro Ala Val
20 25 30
Val Leu Ser Pro Phe Met Tyr Asn Asn Lys Thr Gly Met Cys Leu Cys
35 40 45
Val Pro Cys Thr Thr Gln Ile Lys Gly Tyr Pro Phe Glu Val Val Leu
50 55 60
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65 70 75 80
Ile Ala Trp Arg Ala Arg Leu Ala Thr Lys Lys Gly Thr Val Ala Pro
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Met Val Ser Arg Tyr Val Pro Asp Met Gly Asp Leu Ile Trp Val Asp
1 5 10 15
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20 25 30
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Met Val Ser Arg Tyr Val Pro Asp Met Gly Asp Leu Ile Trp Val Asp
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ggcaagacta gcaacgaaga aaggaacagt tg 32
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tcttcgttgc tagtcttgcc cgccaggcga tac 33
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gcaacgaaga taggaacagt tgccccagag 30
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atggtaagcc gatacgtacc cgatatgggc gatctgattt gggttgattt tgacccgaca 60
gcaggtagcg agcaagctgg acatcgtcca gctgttgtcc tgagtccttt catgtacaac 120
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gcaggtagcg agcaagctgg acatcgtcca gctgttgtcc tgagtccttt catgtacaac 120
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ctcattaaag ccaaaattaa cgtactgatt gggtag 336
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<400> 35
atggtaagcc gatacgtacc cgatatgggc gatctgattt gggttgattt tgacccgaca 60
aaaggtagcg agcaagctgg acatcgtcca gctgttgtcc tgagtccttt catgtacaac 120
aacaaaacag gtatgtgtct gtgtgttcct tgtacaacgc aaataaaagg atatccgttc 180
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atggtaagcc gatacgtacc cgatatgggc gatctgattt gggttgattt tgacccgaca 60
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atggtaagcc gatacgtacc cgatatgggc gatctgattt gggttgattt tgacccgaca 60
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aacaaaacag gtatgtgtct gtgtgttcct tgtacaacgc aatcaaaagg atatccgttc 180
gaagttgttt tatccggtca ggaacgtgat ggcgtagcgt tagctgatca ggtaaaaagt 240
atcgcctggc gggcaagact agcaacgaag ataggaacag ttgccccaga ggaattacaa 300
ctcattaaag ccaaaattaa cgtactgatt gggtag 336
<210> 38
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
atggtaagcc gatacgtacc cgatatgggc gatctgattt gggttgattt tgacccgaca 60
gcaggtagcg agcaagctgg acatcgtcca gctgttgtcc tgagtccttt catgtacaac 120
aacaaaacag gtatgtgtct gtgtgttcct tgtacaacgc aaataaaagg atatccgttc 180
gaagttgttt tatccggtca ggaacgtgat ggcgtagcgt tagctgatca ggtaaaaagt 240
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<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atggtaagcc gatacgtacc cgatatgggc gatctgattt gggttgattt tgacccgaca 60
gcaggtagcg agcaagctgg acatcgtcca gctgttgtcc tgagtccttt catgtacaac 120
aacaaaacag gtatgtgtct gtgtgttcct tgtacaacgc aaataaaagg atatccgttc 180
gaagttgttt tatccggtca ggaacgtgat ggcgtagcgt tagctgatca ggtaaaaagt 240
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atggtaagcc gatacgtacc cgatatgggc gatctgattt gggttgattt tgacccgaca 60
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<400> 42
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atcgcctggc gggcaagact agcaacgaag ataggaacag ttgccccaga ggaattacaa 300
ctcattaaag ccaaaattaa cgtactgatt gggtag 336
Claims (5)
1.一种MazF突变体，其特征在于，所述MazF突变体的氨基酸序列为如SEQ ID No.3～SEQ ID No.17所示的序列中的一种。
2.根据权利要求1所述的MazF突变体，其特征在于，编码所述MazF突变体的核苷酸序列为如SEQ ID No.28～SEQ ID No.42所示的序列中的一种。
3.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求1-2任一项所述的MazF突变体的编码序列。
4.一种重组工程菌，其特征在于，含有权利要求3所述的重组载体。
5.权利要求1-4任一项所述的MazF突变体、权利要求3所述的重组载体或者权利要求4所述的重组工程菌在剪切单链RNA中的应用。
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Applications Claiming Priority (1)
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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