JP2002017353A

JP2002017353A - 変性ｌｄｌの定量方法

Info

Publication number: JP2002017353A
Application number: JP35817098A
Authority: JP
Inventors: Tatsuya Sawamura; 達也沢村; Makoto Sumiya; 真角谷; Tomoo Mazaki; 知生眞崎
Original assignee: Japan Tobacco Inc
Current assignee: Japan Tobacco Inc
Priority date: 1997-12-19
Filing date: 1998-12-16
Publication date: 2002-01-22
Also published as: CA2315280A1; WO1999032520A1; EP1046652A1; EP1046652A4

Abstract

(57)【要約】【課題】動脈硬化症や高脂血症等の疾患に罹患した
患者の体液中に存在する酸化ＬＤＬ等の変性ＬＤＬを、
インタクトな状態で簡便かつ高感度で検出及び定量でき
臨床上で汎用可能なアッセイ方法、並びに該アッセイ方
法の構成要素としてだけでなく動脈硬化症や高脂血症等
の疾患及び治療に有用な融合ポリペプチドを提供する。【解決手段】酸化ＬＤＬ受容体の細胞外領域と免疫グ
ロブリンの重鎖の定常領域の一部からなる融合ポリペプ
チドを用いた免疫学的アッセイ法を用いることにより、
動脈硬化症や高脂血症等の疾患に罹患した患者の体液中
に存在する酸化ＬＤＬ等の変性ＬＤＬを、簡便かつ高感
度で定量できる。また該融合ポリペプチドは、動脈硬化
症や高脂血症等の疾患の予防及び治療のための医薬品の
有効成分としても極めて有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、哺乳動物の酸化Ｌ
ＤＬ受容体の細胞外領域と哺乳動物の免疫グロブリン
（Ｉｇ）の重鎖の一部とからなる融合ポリペプチド、該
融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む
ベクター、該ベクターで形質転換された形質転換細胞、
該融合ポリペプチドを固定化してなる融合ポリペプチド
固定化不溶性担体、酸化ＬＤＬの検出、定量、分離また
は精製に用いられるキット、酸化ＬＤＬを検出、定量、
分離または精製する方法、該融合ポリペプチドを含んで
なる医薬組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】あらゆる組織及び血中に存在する種々形
態のコレステロール（遊離型、長鎖脂肪酸型、及びエス
テル型）は、主に肝臓での生合成に由来する。肝臓で生
合成された遊離型コレステロールは、超低密度リポ蛋白
（ＶＬＤＬ）に取り込まれ、血中でリポ蛋白リパーゼ
（ＬＰＬ）及び肝性トリグリセリドリパーゼ（ＨＴＧ
Ｌ）の作用により、中間密度リポ蛋白（ＩＤＬ）を経た
後、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ；Low-Density Lipoprotei
n）へと代謝される。このＬＤＬは、ＬＤＬ受容体を介
して末梢細胞へと取り込まれることにより、生体の細胞
膜の構成において重要な役割を果たしている。

【０００３】しかしながら、このＬＤＬが、血管内皮細
胞などの細胞による作用、種々の化学的・物理的な要
因、あるいは熱などの種々の要因により酸化変性を受け
ると、酸化ＬＤＬ（Oxidized LDL）と呼ばれる変性ＬＤ
Ｌが血中に生ずることとなる。血流中には十分量の抗酸
化物質があるため、もともと血流中には酸化ＬＤＬが生
じにくくはあるが、例え生じた場合であっても、それら
のほとんどは肝臓で代謝される。

【０００４】一方、血管内皮下及び血管壁では、血管内
皮細胞やマクロファージなどの細胞依存性化学変性並び
にＦｅ³⁺などの作用による細胞非依存性化学変性とによ
り酸化ＬＤＬが生ずるが、血流中での生成の場合と異な
り、血管内皮下及び血管壁で生じた酸化ＬＤＬは、マク
ロファージの細胞内に蓄積されることとなる。酸化ＬＤ
Ｌのマクロファージ細胞内への蓄積は、そのようにして
生成した酸化ＬＤＬが、種々の変性ＬＤＬ（酸化ＬＤ
Ｌ、アセチルＬＤＬ、サクシニルＬＤＬ、マロンジアル
デヒドＬＤＬ）に対する受容体であるマクロファージの
細胞表面のスカベンジャー受容体を介して細胞内に取り
込まれることによるものである（Nature, Vol.343, p.5
31-535, 1990；Nature, Vol.343, p.570-572, 1990；Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.87, p.9133-9137, 199
0；Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.87, p.8810-881
4, 1990；Curr. Opin. Lipodol., Vol.2, p.295-300, 1
991；及びJ. Clin. Invest., Vol.90, p.1450-1457, 19
92）。

【０００５】このマクロファージスカベンジャー受容体
は、ＬＤＬ受容体と異なり、細胞内のコレステロールの
量に依存した受容体のダウンレギュレーションを受けな
い。従って、血管内皮下や血管壁に潜り込んだマクロフ
ァ−ジは、多量の変性ＬＤＬを取込むことにより細胞内
に多量のコレステロールを蓄積し、泡沫細胞化すること
となる（「分子動脈硬化学」、第４章「炎症細胞１．
スカベンジャー受容体」、第249-258頁、1995年、メデ
ィカルレビュー社発行）。

【０００６】一方、上述の血管内皮下や血管壁に潜り込
んだマクロファ−ジは、血流中、血管内皮下あるいは血
管壁などの種々部位で生じた酸化ＬＤＬの生成シグナル
に応答して、血流中から移入してきたマクロファージに
由来する。即ち、酸化ＬＤＬが、血流中のマクロファー
ジや単球に対して走化性を示し、血管内皮細胞上に単球
やマクロファージを集結させる性質、集結した単球やマ
クロファージの血管内皮下への潜り込み並びに血管壁へ
引き込みを誘導する性質、引き込まれた単球のマクロフ
ァージへ分化を誘導する性質を誘導、さらに分化を完了
したマクロファージの遊走を抑制する性質を有すること
によるものである。

【０００７】この単球やマクロファージの血管内皮細胞
への集結には、最近、本発明者らにより同定された血管
内皮細胞上に発現している酸化ＬＤＬ受容体（Oxidized
-LDLReceptor、Ox-LDL ReseptorまたはＬＯＸ−１と称
される。Nature, Vol.386, p.73-77, 1997、及び脂質生
化学研究, Vol.39, p.83-84, 1997）が深く関与してい
ることが明らかにされつつある。これまでの研究から、
血流中の酸化ＬＤＬが、酸化ＬＤＬ受容体を介して血管
内皮細胞に取り込まれると、細胞内での一酸化窒素（N
O）の産生が阻害され、この結果、血管内皮細胞の表面
に細胞接着分子の発現が誘導されることが実験的に証明
されている。このことから、細胞接着分子が発現する結
果、マクロファージや単球が、血管内皮細胞上にトラッ
プされ、トラップされたマクロファージや単球が、血管
内皮下及び血管壁に潜り込むものと考えられている。そ
うして、血管内皮下及び血管壁に潜り込んだマクロファ
ージは、上述したようにマクロファージスカベンジャー
受容体を介した酸化ＬＤＬの取込みにより泡沫細胞化す
るものと考えられている。

【０００８】この血管壁でのマクロファージの泡沫細胞
化は、動脈硬化症の主な原因であることから、動脈硬化
症の発症の引金は、上述した単球やマクロファージの血
管内皮細胞への集結であると考えられている。この単球
やマクロファージの血管内皮細胞への集結に深く関与す
る酸化ＬＤＬ受容体は、多くの研究者が長年の間求め続
けた結果、本発明者らが１９９７年に初めて同定に成功
し、脚光を浴びているものである。酸化ＬＤＬ受容体に
ついては、上述した性状及び機能以外の詳細な研究は、
目下、精力的に進められているところであり、酸化ＬＤ
Ｌ受容体についての報告はほとんどなく、全く新規な技
術分野である。

【０００９】このような新規かつ動脈硬化症等の疾患の
予防及び治療において医学的に重要な酸化ＬＤＬ受容体
に関する研究開発の遂行においては、血液等の体液中に
含まれる酸化ＬＤＬをはじめ、様々なリガンドと酸化Ｌ
ＤＬ受容体との相互作用を究明することができるアッセ
イ系が必要であるが、未だ全く提供されていない。酸化
ＬＤＬ受容体のような細胞膜貫通蛋白のためのアッセイ
系を構築する場合には、例えば、その細胞外領域ポリペ
プチドを可溶性蛋白として製造する必要がある。昨今の
遺伝子工学技術を用いることにより、細胞外領域ポリペ
プチドのみを組換え可溶性蛋白として製造することも可
能であるが、該組換え蛋白の精製及び該組換え蛋白を用
いたアッセイ（検出、定量）における利便性及び汎用性
を考慮すると、該細胞外領域を他の蛋白（例えば、免疫
グロブリンのＦｃといった免疫グロブリンの一部）との
可溶性融合ポリペプチドとして製造することが好ましい
（特開平5-247094号公報、特表平3-502283号公報、及び
特開平6-160395号公報など）。

【００１０】そのような融合ポリペプチドとしての融合
ポリペプチドは、アッセイ系の構成要素として有用なだ
けでなく、酸化ＬＤＬ等の変性ＬＤＬの分離及び精製に
おいても使用可能であり、またそれ自体が医薬品の有効
成分となり得る。しかしながら、酸化ＬＤＬ受容体につ
いては、そのような種々の有用性を有する融合ポリペプ
チドは、何ら提供されていない。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】動脈硬化症の発症のメ
カニズムは未だ完全に解明されておらず、また動脈硬化
症の有効な予防薬及び治療薬も未だ提供されていない。
上述のとおり、酸化ＬＤＬ受容体は、動脈硬化症等の原
因となる血管壁でのマクロファージの泡沫化進行過程に
おける初期の生体反応である単球やマクロファージの血
管内皮細胞への集結を誘導する引金となる血中酸化ＬＤ
Ｌの取込みを担うことから、酸化ＬＤＬ受容体の機能、
並びに血中に含まれる酸化ＬＤＬをはじめとした様々な
リガンドと酸化ＬＤＬ受容体との相互作用を解明するこ
とは、動脈硬化症や高脂血症等の疾患の予防及び治療に
有用な薬剤開発において極めて重要な意義を有する。

【００１２】即ち、本発明は、このような目的を達成す
るために必須である酸化ＬＤＬ受容体の可溶性融合ポリ
ペプチド（可溶性酸化ＬＤＬ受容体融合ポリペプチド）
を世界に先駆けて初めて提供するものである。当該可溶
性酸化ＬＤＬ受容体融合ポリペプチドは、同目的達成の
ために必須な、哺乳動物（例えば、健常人及び患者等）
の体液中（例えば、血中）の酸化ＬＤＬ等のリガンドの
アッセイ（検出、定量、分離、及び精製など）の構成要
素として有用なだけでなく、それ自体が動脈硬化症や高
脂血症等の疾患の予防及び治療のための医薬品の有効成
分として有用である。より詳細には、動脈硬化症や高脂
血症等の疾患に罹患した患者の体液中に存在する酸化Ｌ
ＤＬ等の変性ＬＤＬを、インタクト（intact）な状態で
簡便かつ高感度で検出及び定量でき、臨床上で汎用可能
な検出及び定量方法及び検出方法、並びに該方法に用い
られるキットを提供するものである。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、動脈硬化
症等の疾患の予防及び治療において医学的に重要な酸化
ＬＤＬ受容体に関する研究開発の遂行において用いるた
めの可溶性酸化ＬＤＬ受容体に関して鋭意研究した結
果、遺伝子工学技術を用いて、酸化ＬＤＬ受容体の細胞
外領域を免疫グロブリンの一部（例えば、Ｆｃ領域）と
の融合ポリペプチドとして製造することにより、酸化Ｌ
ＤＬ受容体を可溶性融合蛋白として得ることに成功し、
本発明を完成するに到った。該融合ポリペプチドを、フ
ァクターＸａ等のプロテアーゼにより処理することによ
り酸化ＬＤＬ受容体の細胞外領域のみを可溶性ポリペプ
チドとして製造することもできる。

【００１４】該酸化ＬＤＬ受容体の可溶性融合ポリペプ
チドは、哺乳動物（例えば、健常人及び患者等）の体液
中（例えば、血中）の酸化ＬＤＬ等のリガンドのアッセ
イ（検出、定量）及び該リガンドの分離及び精製におけ
る構成要素としてだけでなく、動脈硬化症や高脂血症等
の疾患の予防及び治療のための医薬品の有効成分として
極めて有用である。また、前記可溶性酸化ＬＤＬ受容体
を、ＩｇＧ等の免疫グロリンの定常領域の一部（例え
ば、Ｆｃ）との融合ポリペプチドとして製造することに
より、該融合ポリペプチドを、該免疫グロブリン断片に
特異的に結合するというプロテインＡの性質を用いたア
フィニティーカラムクロマトグラフィーにより容易に精
製することが可能である。さらに、種々の免疫グロブリ
ンのＦｃに対する種々の抗体が提供されていることか
ら、該Ｆｃに対する抗体を用いて、該融合ポリペプチド
のイムノアッセイを簡便に行うことができる。

【００１５】即ち、本発明は、下記（１）乃至（３１）
に記載されるとおりの発明である。（１）哺乳動物の酸化ＬＤＬ受容体の細胞外領域と哺乳
動物の免疫グロブリン（Ｉｇ）の重鎖の一部とからなる
融合ポリペプチド。（２）哺乳動物の免疫グロブリンが、ヒトの免疫グロブ
リンであることを特徴とする前記（１）に記載の融合ポ
リペプチド。（３）免疫グロブリンが、ＩｇＧであることを特徴とす
る前記（１）または前記（２）に記載の融合ポリペプチ
ド。（４）免疫グロブリンの重鎖の一部が、免疫グロブリン
の重鎖の定常領域または定常領域の一部であることを特
徴とする前記（１）乃至（３）のいずれかに記載の融合
ポリペプチド。（５）定常領域の一部が、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＤ
のヒンジ領域、Ｃ２ドメイン及びＣ３ドメインからなる
ことを特徴とする前記（４）に記載の融合ポリペプチ
ド。（６）定常領域の一部が、ＩｇＭまたはＩｇＥのＣ２ド
メイン、Ｃ３ドメイン及びＣ４ドメインからなることを
特徴とする前記（４）に記載の融合ポリペプチド。（７）哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖の一部が、ヒト
のＩｇＧのヒンジ領域、Ｃ２ドメイン及びＣ３ドメイン
からなることを特徴とする前記（１）に記載の融合ポリ
ペプチド。（８）哺乳動物の酸化ＬＤＬ受容体が、ヒトの酸化ＬＤ
Ｌ受容体であることを特徴とする前記（１）乃至（７）
のいずれかに記載の融合ポリペプチド。（９）ヒトの酸化ＬＤＬ受容体が、配列番号１に記載の
アミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列
を有するポリペプチドであることを特徴とする前記
（８）に記載の融合ポリペプチド。（１０）哺乳動物の酸化ＬＤＬ受容体が、ウシの酸化Ｌ
ＤＬ受容体であることを特徴とする前記（１）乃至
（７）のいずれかに記載の融合ポリペプチド。（１１）ウシの酸化ＬＤＬ受容体が、配列番号２に記載
のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配
列を有するポリペプチドであることを特徴とする前記
（１０）に記載の融合ポリペプチド。（１２）配列番号３に記載のアミノ酸配列と同一または
実質的に同一のアミノ酸配列を有する融合ポリペプチ
ド。（１３）前記（１）乃至（１２）のいずれかに記載の融
合ポリペプチドをコードするＤＮＡ。（１４）配列番号４または配列番号１０のいずれかに記
載の塩基配列を有するＤＮＡ。（１５）前記（１３）または（１４）に記載のＤＮＡを
含むことを特徴とするベクター。（１６）前記（１５）に記載のベクターで形質転換され
ていることを特徴とする形質転換細胞。（１７）不溶性担体に前記（１）乃至（１２）のいずれ
かに記載の融合ポリペプチドが固定化されていることを
特徴とする融合ポリペプチド固定化不溶性担体。（１８）不溶性担体が、プレート、試験管、チューブ、
ビーズ、ボール、フィルター及びメンブレンからなる群
から選ばれる不溶性担体であることを特徴とする前記
（１７）に記載の融合ポリペプチド固定化不溶性担体。（１９）不溶性担体が、フィルター若しくはメンブレ
ン、またはアフィニティーカラムクロマトグラフィーに
用いられる不溶性担体であることを特徴とする前記（１
７）に記載の融合ポリペプチド固定化不溶性担体。（２０）前記（１７）若しくは前記（１８）に記載の融
合ポリペプチド固定化不溶性担体、または前記（１）乃
至（１２）のいずれかに記載の融合ポリペプチドを含ん
でなることを特徴とし、酸化ＬＤＬの検出または定量に
用いられるキット。（２１）前記（１７）若しくは前記（１８）に記載の融
合ポリペプチド固定化不溶性担体、または前記（１）乃
至（１２）のいずれかに記載の融合ポリペプチドを用い
ることを特徴とするイムノアッセイにより酸化ＬＤＬを
検出または定量する方法。（２２）少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含む
イムノアッセイにより酸化ＬＤＬを検出または定量する
前記（２１）に記載の方法。（ａ）前記（１７）または前記（１８）に記載の融合ポ
リペプチド固定化不溶性担体に、試料を反応せしめる工
程。（ｂ）該融合ポリペプチド固定化不溶性担体と該試料中
に含まれる酸化ＬＤＬとの結合により形成される複合体
に、単独でまたは他の物質と反応することにより検出可
能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識さ
れた抗体であって、酸化ＬＤＬまたはアポリポプロテイ
ンＢに反応性を有する抗体を反応せしめる工程。（２３）少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含む
イムノアッセイにより酸化ＬＤＬを検出または定量する
前記（２１）に記載の方法。（ａ）単独でまたは他の物質と反応することにより検出
可能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識
された抗体であって、酸化ＬＤＬまたはアポリポプロテ
インＢに反応性を有する抗体と、試料を反応せしめる工
程。（ｂ）該抗体と該試料中に含まれる酸化ＬＤＬとの結合
により形成される複合体と、前記（１７）または（１
８）に記載の融合ポリペプチド固定化不溶性担体を反応
せしめる工程。（２４）少なくとも下記（ａ）の工程を含むイムノアッ
セイにより酸化ＬＤＬを検出または定量する前記（２
１）に記載の方法。（ａ）前記（１７）または（１８）に記載の融合ポリペ
プチド固定化不溶性担体、単独でまたは他の物質と反応
することにより検出可能なシグナルをもたらすことがで
きる標識物質で標識された抗体であって、酸化ＬＤＬま
たはアポリポプロテインＢに反応性を有する抗体、及び
試料を含む混合物を反応せしめる工程。（２５）少なくとも下記（ａ）の工程を含むイムノアッ
セイにより酸化ＬＤＬを検出または定量する前記（２
１）に記載の方法。（ａ）前記（１７）または（１８）に記載の融合ポリペ
プチド固定化不溶性担体に、試料、並びに単独でまたは
他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをも
たらすことができる標識物質で標識された酸化ＬＤＬの
標準物質を反応せしめる工程。（２６）前記（１７）または（１９）に記載の融合ポリ
ペプチド固定化不溶性担体を含んでなることを特徴と
し、酸化ＬＤＬの分離または精製に用いられるキット。（２７）前記（１７）または（１９）に記載の融合ポリ
ペプチド固定化不溶性担体を用いたアフィニティークロ
マトグラフィーを用いることを特徴とする酸化ＬＤＬを
分離または精製する方法。（２８）アフィニティクロマトグラフィーがアフィニテ
ィーカラムクロマトグラフィーである前記（２７）に記
載の酸化ＬＤＬの精製方法。（２９）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するヒト
の酸化ＬＤＬ受容体の細胞外領域とヒトの免疫グロブリ
ンの重鎖の一部とからなる融合ポリペプチド、及び薬学
的に許容されうる担体とを含んでなる医薬組成物。（３０）免疫グロブリンの重鎖の一部が、免疫グロブリ
ンの重鎖の定常領域または定常領域の一部であることを
特徴とする前記（２９）に記載の医薬組成物。（３１）医薬組成物が、動脈硬化症または高脂血症の予
防または治療のために用いられるものであることを特徴
とする前記（２９）または（３０）に記載の医薬組成
物。

【００１６】

【発明の実施の形態】以下、本発明の融合ポリペプチド
及びＤＮＡ、本発明で用いられる抗体の一般的製造方
法、並びに本発明で用いる語句の意味を明らかにするこ
とにより、本発明を詳細に説明する。本発明における
「哺乳動物」とは、ヒト、ウシ、ヤギ、ウサギ、マウ
ス、ラット、ハムスター、及びモルモット等を意味し、
好ましくは、ヒト、ウシ、ラット、マウスまたはハムス
ターであり、特に好ましくは、ヒトまたはウシである。
本発明における「酸化ＬＤＬ受容体」とは、前記「哺乳
動物」に由来する酸化ＬＤＬ受容体であって、配列番号
５若しくは配列番号６に記載される塩基配列を有するＤ
ＮＡまたは該いずれかのＤＮＡにストリンジェントな条
件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるア
ミノ酸配列を有し、かつ酸化ＬＤＬ等の変性ＬＤＬと結
合するか、または該変性ＬＤＬの細胞内への取り込みに
おいて作用する受容体を意味する。好ましくは、ヒトま
たはウシの酸化ＬＤＬ受容体であって、具体的には、配
列番号１に記載されるアミノ酸配列と同一若しくは実質
的に同一のアミノ酸配列有するヒト由来ポリペプチド
（ヒト酸化ＬＤＬ受容体）、または配列番号２に記載さ
れるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ
酸配列を有するウシ由来ポリペプチド（ウシ酸化ＬＤＬ
受容体）である。さらに好ましくは、配列番号１に記載
されるアミノ酸配列を有するヒト由来ポリペプチド（ヒ
ト酸化ＬＤＬ受容体）または配列番号２に記載のアミノ
酸配列を有するウシ由来ポリペプチド（ウシ酸化ＬＤＬ
受容体）である。特に、これら２つの酸化ＬＤＬ受容体
は、Nature（Vol.386, p.73-77, 1997）、脂質生化学研
究（Vol.39, p.83-84, 1997）及び特開平9-98787号公報
に報告されるとおりの受容体であり、Oxidized-LDL Rec
eptor、Ox-LDL ReseptorまたはＬＯＸ−１とも称され
る。

【００１７】ここで「ストリンジェントな条件下」とし
ては、例えば、次のような条件を挙げることができる。
例えば、５０塩基以上のプローブを用い、0.9％NaCl下
でハイブリダイゼーションを行う場合には、50％の解離
を生ずる温度（Ｔｍ）の目安を下記計算式から求め、ハ
イブリダイゼーションの温度を下記計算式のように設定
することができる。Ｔｍ＝82.3℃＋0.41×（G+C）％−500／ｎ−0.61×（フ
ォルムアミド）％（ｎはプローブの塩基数を示す。）温度＝Ｔｍ−25℃ また、100塩基以上のプローブ（G+C=40〜50%の場合）を
用いる場合には、Ｔｍが下記（１）及び（２）のように
変化することを目安する。（１）１％ミスマッチ毎に、Ｔｍが約１℃下がる。（２）フォルムアミド１％毎に、Ｔｍが0.6〜0.7℃下が
る。従って、完全相補鎖の組み合わせの場合の温度条件
は下記のようにすることができる。（Ａ）65〜75℃（フォルムアミド無添加）（Ｂ）35〜45℃（50％フォルムアミド存在下）また、不完全相補鎖の組み合わせの場合の温度条件は下
記のようにすることができる。（Ａ）45〜55℃（フォルムアミド無添加）（Ｂ）35〜42℃（30％フォルムアミド存在下）また、23塩基以下のプローブを用いる場合の温度条件
は、３７℃とすることもできるし、また下記計算式を目
安とすることもできる。温度＝２℃×（A+Tの数）＋４℃×（C+Gの数）−５℃ ここで「実質的に同一のアミノ酸配列を有する」とは、
配列表配列番号１、２または３に示されるアミノ酸配列
を含むポリペプチドと実質的に同等の生物学的性質を有
する限り、該アミノ酸配列中の複数個のアミノ酸、好ま
しくは１乃至１０個のアミノ酸、特に好ましくは１乃至
５個のアミノ酸が置換、欠失及び／または修飾されてい
るアミノ酸配列を有するポリペプチド、並びに該アミノ
酸配列に、複数個のアミノ酸、好ましくは１乃至１０個
のアミノ酸、特に好ましくは１乃至５個のアミノ酸が付
加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドも本願発明
の範囲に包含されることを意味する。

【００１８】本発明における「細胞外領域」とは、前記
のとおり定義された「酸化ＬＤＬ受容体」の細胞外領域
を意味する。ここで「細胞外領域」とは、以下のような
意味を有するものである。即ち、前記のような酸化ＬＤ
Ｌ受容体（Oxidized-LDL Receptor、Ox-LDL Reseptorま
たはＬＯＸ−１）に限らず、ほとんどの全ての受容体あ
るいは細胞膜表面分子は、細胞膜貫性通蛋白に属し、膜
の脂質二重層を１回または数回貫通する疎水性ペプチド
領域により膜と連結し、全体として細胞外領域(extrace
llular region)、膜貫通領域(transmembrane region)及
び細胞質領域(cytoplasmic region)の３つの主領域から
構成される構造をとっている。さらにそのような膜貫通
性タンパクは、モノマ−(monomer）として、または、同
一のアミノ酸配列を有するもう１本の鎖あるいは異なる
アミノ酸配列を有する鎖とともにそれぞれホモダイマ−
(homodimer)、ヘテロダイマ−(heterodimer)あるいはオ
リゴマ−(origomer)を形成して存在する。

【００１９】本発明において用いられる「細胞外領域」
とは、前述のような膜貫通性蛋白の全体構造のうち、該
膜タンパクが連結している膜の外界側に存在する部分構
造（部分領域）の全部または一部を意味し、換言すれ
ば、膜内に取り込まれている領域（膜貫通領域）及び該
膜内の領域に引き続いて細胞質内に存在する領域（細胞
内領域）以外の領域の全部または一部を意味する。具体
的には、本発明における酸化ＬＤＬの１つであるウシＬ
ＯＸ−１の細胞外領域とは、配列番号２に記載されるア
ミノ酸配列のアミノ酸番号１乃至５６迄の領域を除いた
領域の一部または全部を意味し、例えば、アミノ酸番号
５７乃至６５のいずれかから引き続くアミノ酸番号２７
０迄の領域の全部または一部を意味する。該領域は所望
応じそのＮ末端及び／またはＣ末端に１乃至５のアミノ
酸が付加されていてもよい。ヒトＬＯＸ−１の細胞外領
域とは、配列番号１に記載されるアミノ酸配列のアミノ
酸番号１乃至５９迄の領域を除いた領域の一部または全
部を意味し、例えば、アミノ酸番号６０乃至６９のいず
れかから引き続くアミノ酸番号２７３迄の領域の全部ま
たは一部を意味する。該領域は所望応じそのＮ末端及び
／またはＣ末端に１乃至５のアミノ酸が付加されていて
もよい。

【００２０】本発明における「哺乳動物の免疫グロブリ
ン（Ｉｇ）の重鎖の一部」とは、前述のような哺乳動物
に由来する免疫グロブリンの重鎖（Heavy Chain，Ｈ
鎖）の一部を意味し、特に好ましくはヒト由来の免疫グ
ロブリンを意味する。該免疫グロブリンは、どのような
クラス及びサブクラスに属する免疫グロブリンであって
もよく、具体的には、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、Ｉ
ｇＧ３及びＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及び
ＩｇＡ２）、ＩｇＤ及びＩｇＥを挙げることができる。
好ましくは、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若
しくはＩｇＧ４）またはＩｇＭである。本発明における
特に好ましい例としては、ヒト由来のＩｇＧ（ＩｇＧ
１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４）に属する免
疫グロブリンである。

【００２１】図１に模式的に提示されるように、免疫グ
ロブリンは、２つの相同な軽鎖（Light Chain，Ｌ鎖）
と２つの相同な重鎖（Heavy Chain，Ｈ鎖）の４つの鎖
が、ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）で結合したＹ字形
の構造単位を有する。軽鎖は、軽鎖可変領域（Ｖ_L）及
び軽鎖定常領域（Ｃ_L）から構成される。重鎖は、重鎖
可変領域（Ｖ_H）と重鎖定常領域（Ｃ_H）から構成され
る。

【００２２】重鎖定常領域は、クラス（ＩｇＧ、Ｉｇ
Ｍ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ）並びにサブクラス（Ｉ
ｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及び
ＩｇＡ２）毎に各々固有のアミノ酸配列を有するいくつ
かのドメインから構成される。ＩｇＧ（ＩｇＧ１、Ｉｇ
Ｇ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）の重鎖は、Ｎ末端から順
に、Ｖ_H、Ｃ_H１ドメイン、ヒンジ領域、Ｃ_H２ドメイン
及びＣ_H３ドメインから構成される。同様にＩｇＧ１の
重鎖は、Ｎ末端から順に、Ｖ_H、Ｃγ₁１ドメイン、ヒン
ジ領域、Ｃγ₁２ドメイン及びＣγ₁３ドメインから構成
される。ＩｇＧ２の重鎖は、Ｎ末端から順に、Ｖ_H、Ｃ
γ₂１ドメイン、ヒンジ領域、Ｃγ₂２ドメイン及びＣγ
₂３ドメインから構成される。ＩｇＧ３の重鎖は、Ｎ末
端から順に、Ｖ_H、Ｃγ ₃１ドメイン、ヒンジ領域、Ｃγ
₃２ドメイン及びＣγ₃３ドメインから構成される。Ｉｇ
Ｇ４の重鎖は、Ｎ末端から順に、Ｖ_H、Ｃγ₄１ドメイ
ン、ヒンジ領域、Ｃγ₄２ドメイン及びＣγ₄３ドメイン
から構成される。

【００２３】ＩｇＡの重鎖は、Ｎ末端から順に、Ｖ_H、
Ｃα１ドメイン、ヒンジ領域、Ｃα２ドメイン及びＣα
３ドメインから構成される。同様にＩｇＡ１の重鎖は、
Ｎ末端から順に、Ｖ_H、Ｃα₁１ドメイン、ヒンジ領域、
Ｃα₁２ドメイン及びＣα₁３ドメインから構成される。
ＩｇＡ２の重鎖は、Ｎ末端から順に、Ｖ_H、Ｃα₂１ドメ
イン、ヒンジ領域、Ｃα₂２ドメイン及びＣα₂３ドメイ
ンから構成される。ＩｇＤの重鎖は、Ｎ末端から順に、
Ｖ_H、Ｃδ１ドメイン、ヒンジ領域、Ｃδ２ドメイン及
びＣδ３ドメインから構成される。ＩｇＭの重鎖は、Ｎ
末端から順に、Ｖ_H、Ｃμ１ドメイン、Ｃμ２ドメイ
ン、Ｃμ３ドメイン及びＣμ４ドメインから構成され、
ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤに見られるようなヒンジ領域
を有しない。ＩｇＥの重鎖は、Ｎ末端から順に、Ｖ_H、
Ｃε１ドメイン、Ｃε２ドメイン、Ｃε３ドメイン及び
Ｃε４ドメインから構成され、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇ
Ｄに見られるようなヒンジ領域を有しない。

【００２４】さらに、ＩｇＧを例に挙げるならば、Ｉｇ
Ｇをパパインで処理すると、２つの重鎖を連結させてい
るヒンジ領域中に存在するジスルフィド結合のややＮ末
端側で切断されて、Ｖ_H及びＣ_H１からなる重鎖断片と１
つの軽鎖がジスルフィド結合で連結した２つの相同なＦ
ａｂ、並びにヒンジ領域、Ｃ_H２ドメイン及びＣ_H３ドメ
インからなる２つの相同な重鎖断片がジスルフィド結合
で連結した１つのＦｃを生ずる（以上、「免疫学イラス
トレイテッド」、原書第２版、第65〜75頁、１９９２
年、南江堂発行、及び「最新医科学の焦点「免疫系の認
識機構」」、第4〜7頁、１９９１年、南江堂発行など参
照）。

【００２５】即ち、本発明における「免疫グロブリンの
重鎖の一部」とは、上述のような構造的特徴を有する免
疫グロブリンの重鎖の一部を意味し、好ましくは、重鎖
の定常領域またはその一部であり、特に好ましくはＣ１
ドメインを欠く定常領域またはＦｃ領域である。具体的
には、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＤの場合には、各々の
ヒンジ領域、Ｃ２ドメイン及びＣ３ドメインからなる領
域が挙げられ、ＩｇＭまたはＩｇＥの場合には、各々の
Ｃ２ドメイン、Ｃ３ドメイン及びＣ４ドメインからなる
領域が挙げられる。とりわけ好ましい例としては、ヒト
由来のＩｇＧ１のＦｃ領域を挙げることができる。

【００２６】本発明の「融合ポリペプチド」とは、前記
の定義されるとおりの「哺乳動物の酸化ＬＤＬ受容体の
細胞外領域」と「哺乳動物の免疫グロブリン（Ｉｇ）の
重鎖の一部」との融合ポリペプチドである。好ましくは
該酸化ＬＤＬ受容体の細胞外領域とヒト免疫グロブリン
の重鎖の定常領域またはその一部との融合ポリペプチド
であり、さらに好ましくは該酸化ＬＤＬ受容体の細胞外
領域とヒトＩｇＧの重鎖の定常領域の一部との融合ポリ
ペプチドであり、特に好ましくは該酸化ＬＤＬ受容体の
細胞外領域とヒトＩｇＧの重鎖のヒンジ領域、ＣH２ド
メイン及びＣH３ドメインからなる領域（Ｆｃ）との融
合ポリペプチドである。

【００２７】ＩｇＧとしては、ＩｇＧ１が好ましい。該
酸化ＬＤＬ受容体としては、ヒトまたはウシの酸化ＬＤ
Ｌ受容体が好ましく、特に好ましくは配列番号１に記載
されるアミノ酸配列を有するヒト酸化ＬＤＬ受容体また
は配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するウシ酸
化ＬＤＬ受容体である。ウシ酸化ＬＤＬ受容体に関する
本発明の融合ポリペプチド具体的態様としては、例え
ば、配列番号３に記載されるアミノ酸配列を有する融合
ポリペプチドが挙げられる。また、配列番号３に記載の
融合ポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番
号４または配列番号１０を挙げることができる。本発明
の融合ポリペプチドまたは細胞外領域ポリペプチドは、
後述するような遺伝子組換え技術のほか、化学的合成
法、細胞培養方法等のような当該技術的分野において知
られる公知の方法あるいはその修飾方法を適宜用いるこ
とにより製造することができる。

【００２８】本発明の「ＤＮＡ」は、前述の本発明の融
合ポリペプチドをコードするＤＮＡであって、本発明の
融合ポリペプチドをコードし得るいかなる塩基配列をも
包含する。好ましくは、ヒトまたはウシの酸化ＬＤＬ受
容体の細胞外領域とヒトの免疫グロブリンの重鎖の定常
領域またはその一部とからなる融合ポリペプチドをコー
ドするＤＮＡであり、さらに好ましくは、ヒトまたはウ
シの酸化ＬＤＬ受容体の細胞外領域とヒトのＩｇＧ（特
にはＩｇＧ１）の定常領域の一部（特には、Ｃ _H２ドメ
イン及びＣ_H３ドメインからなる領域（Ｆｃ））とから
なる融合ポリペプチドをコードするＤＮＡである。前記
においてヒト酸化ＬＤＬ受容体の好適例としては、配列
番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙
げられ、ウシ酸化ＬＤＬ受容体としては配列番号２に記
載のポリペプチドが挙げられる。

【００２９】ウシ酸化ＬＤＬ受容体に関する本発明の融
合ポリペプチドをコードするＤＮＡの具体的な態様とし
ては、例えば、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有
する融合ポリペプチドをコードするＤＮＡが挙げられ、
例えば、配列番号４または配列番号１０に記載の塩基配
列を有するＤＮＡが挙げられる。本発明における融合ポ
リペプチドの一部である酸化ＬＤＬ受容体の細胞外領域
をコードするＤＮＡとしては、ｃＤＮＡ及びゲノミック
ＤＮＡのいずれをも用いることができる。

【００３０】本発明における融合ポリペプチドの一部で
ある免疫グロブリンの重鎖の一部をコードするＤＮＡと
しては、ｃＤＮＡであっても良いし、また各エクソン
（例えば、Ｃ_H１ドメイン、ヒンジ領域、Ｃ_H２ドメイ
ン、Ｃ_H３ドメイン、Ｃ_H４ドメインなどをコードするＤ
ＮＡ）の間にイントロンを含むようなゲノミックＤＮＡ
であっても良い。本発明においては、同一のアミノ酸を
コードするコドンであればどのようなコドンから構成さ
れるＤＮＡを含む。また、本発明のＤＮＡは、いかなる
方法で得られるものであってもよい。例えばｍＲＮＡか
ら調製される相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡか
ら調製されるＤＮＡ、化学合成によって得られるＤＮ
Ａ、ＲＮＡまたはＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法で増幅さ
せて得られるＤＮＡおよびこれらの方法を適当に組み合
わせて構築されるＤＮＡをも全て包含するものである。

【００３１】本発明における酸化ＬＤＬ受容体及び免疫
グロブリンの重鎖をコードするＤＮＡは、常法に従っ
て、該酸化ＬＤＬ受容体及び免疫グロブリンの重鎖をコ
ードするｍＲＮＡからｃＤＮＡをクローン化する方法、
ゲノムＤＮＡを単離してスプライシング処理する方法、
該ｃＤＮＡ配列若しくはｍＲＮＡ配列を鋳型としてＰＣ
Ｒにより調製する方法、または化学合成する方法等によ
り取得することができる。本発明の融合ポリペプチドを
コードするＤＮＡは、そのようにして調製した該酸化Ｌ
ＤＬ受容体及び免疫グロブリンの重鎖をコードする各々
のＤＮＡを適切な制限酵素による切断（消化）し、得ら
れたＤＮＡ断片を、必要に応じてリンカーＤＮＡあるい
はタグ（Ｔａｇ）と共に、適切なＤＮＡポリメラーゼ等
を用いて連結することにより調製することができる。

【００３２】該酸化ＬＤＬ受容体または免疫グロブリン
の重鎖（以下、目的蛋白という）をコードするｃＤＮＡ
をｍＲＮＡからクローン化する方法としては、以下の方
法が例示される。まず、目的蛋白を発現・産生する組織
あるいは細胞から目的蛋白をコードするｍＲＮＡを調製
する。ｍＲＮＡの調製は、例えばグアニジンチオシアネ
ート法（チャーグウィン（Chirgwin）ら、バイオケミス
トリー（Biochemistry）、第１８巻、第５２９４頁、１
９７９年）、熱フェノール法もしくはＡＧＰＣ法等の公
知の方法を用いて調製した全ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セ
ルロースやポリＵ−セファロース等によるアフィニティ
クロマトグラフィーにかけることによって行うことがで
きる。

【００３３】次いで得られたｍＲＮＡを鋳型として、例
えば逆転写酵素を用いる等の公知の方法、例えばオカヤ
マらの方法（モレキュラーセルバイオロジー（Mol. Cel
l. Biol.）、第２巻、第１６１頁、１９８２年及び同誌
第３巻、第２８０頁、１９８３年）やホフマン（Hoffm
an）らの方法（ジーン（Gene）、第２５巻、第２６３
頁、１９８３年）等によりｃＤＮＡ鎖を合成し、ｃＤＮ
Ａの二本鎖ｃＤＮＡへの変換を行う。このｃＤＮＡをプ
ラスミドベクター、ファージベクターまたはコスミドベ
クターに組み込み、大腸菌を形質転換して、あるいはイ
ンビトロパッケージング後、大腸菌に形質移入（トラン
スフェクト）することによりｃＤＮＡライブラリーを作
製する。

【００３４】ここで用いられるプラスミドベクターとし
ては、宿主内で複製保持されるものであれば特に制限さ
れず、また用いられるファージベクターとしても宿主内
で増殖できるものであれば良い。常法的に用いられるク
ローニング用ベクターとしてｐＵＣ１９、λｇｔ１０、
λｇｔ１１等が例示される。ただし、後述の免疫学的ス
クリーニングに供する場合は、宿主内で目的蛋白をコー
ドする遺伝子を発現させうるプロモーターを有したベク
ターであることが好ましい。

【００３５】プラスミドにｃＤＮＡを組み込む方法とし
ては、例えばマニアティス（Maniatis）らの方法（モレ
キュラークローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル
（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second e
dition）、コールドスプリングハーバーラボラトリー
（Cold Spring Harbor Laboratory）、第1.53頁、１９
８９年）に記載の方法などが挙げられる。また、ファー
ジベクターにｃＤＮＡを組み込む方法としては、ヒュン
（Hyunh）らの方法（ＤＮＡクローニング、プラクティ
カルアプローチ（DNA Cloning, a practical approac
h）、第1巻、第49頁、１９８５年）などが挙げられる。
簡便には、市販のクローニングキット（例えば、宝酒造
製等）を用いることもできる。このようにして得られる
組換えプラスミドやファージベクターは、原核細胞（例
えば、Ｅ．ｃｏｌｉ：ＨＢ１０１、ＤＨ５α、ＤＨ１０
ＢまたはＭＣ１０６１／Ｐ３等）等の適当な宿主に導入
する。

【００３６】プラスミドを宿主に導入する方法として
は、（モレキュラークローニング、ア・ラボラトリー・
マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manua
l, second edition）、コールドスプリングハーバーラ
ボラトリー（Cold Spring HarborLaboratory）、第1.74
頁、１９８９年）に記載の塩化カルシウム法または塩化
カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーショ
ン法等が挙げられる。また、ファージベクターを宿主に
導入する方法としてはファージＤＮＡをインビトロパッ
ケージングした後、増殖させた宿主に導入する方法等が
例示される。インビトロパッケージングは、市販のイン
ビトロパッケージングキット（例えば、ストラタジーン
製、アマシャム製等）を用いることによって簡便に行う
ことができる。上記の方法によって作製されたｃＤＮＡ
ライブラリーから、目的蛋白をコードするｃＤＮＡを単
離する方法は、一般的なｃＤＮＡスクリーニング法を組
み合わせることによって行うことができる。

【００３７】例えば、別個に目的蛋白のアミノ酸配列に
対応すると考えられるオリゴヌクレオチドを化学合成し
たのち、これを³²Ｐでラベルしてプローブとなし、公知
のコロニーハイブリダイゼーション法（クランシュタイ
ン（Crunstein）ら、プロシーディングスオブナショナ
ルアカデミーオブサイエンス（Proc. Natl. Acid. Sci.
USA）、第７２巻、第３９６１頁、１９７５年）または
プラークハイブリダイゼーション法（Molecular Clonin
g, A Laboratory Manual, second edition , Cold Spri
ng Harbor Laboratory、第2.108 頁、１９８９年）によ
り、目的のｃＤＮＡを含有するクローンをスクリーニン
グする方法、ＰＣＲプライマーを作製し目的蛋白の特定
領域をＰＣＲ法により増幅し、該領域をコードするＤＮ
Ａ断片を有するクローンを選択する方法等が挙げられ
る。

【００３８】また、ｃＤＮＡを発現しうるベクター（例
えば、λｇｔ１１等のファージベクター）を用いて作製
したｃＤＮＡライブラリーを用いる場合には、目的蛋白
に反応性を有する抗体を用いる抗原抗体反応を利用し
て、目的のクローンを選択することができる。大量にク
ローンを処理する場合には、ＰＣＲ法を利用したスクリ
ーニング法を用いることが好ましい。この様にして得ら
れたＤＮＡの塩基配列はマキサム・ギルバート法（マキ
サム（Maxam）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、第７
４巻、第５６０頁、１９７７年）あるいはファージＭ１
３を用いたジデオキシヌクレオチド合成鎖停止の方法
（サンガー（Sanger）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. US
A.、第７４巻、第５４６３〜５４６７頁、１９７７年）
によって決定することができる。目的蛋白をコードする
遺伝子は、その全部または一部を上記のようにして得ら
れるクローンから制限酵素等により切り出すことにより
取得できる。

【００３９】また、前述のような目的蛋白を発現する細
胞に由来するゲノムＤＮＡから目的蛋白をコードするＤ
ＮＡを単離することによる調製方法としては、例えば以
下の方法が例示される。該細胞を好ましくはＳＤＳまた
はプロテナーゼＫ等を用いて溶解し、フェノールによる
抽出を反復してＤＮＡの脱蛋白質を行う。ＤＮＡを好ま
しくはリボヌクレアーゼにより消化する。得られるＤＮ
Ａを適当な制限酵素により部分消化し、得られるＤＮＡ
断片を適当なファージまたはコスミドで増幅しライブラ
リーを作成する。そして目的の配列を有するクローン
を、例えば放射性標識されたＤＮＡプローブを用いる方
法等により検出し、該クローンから目的蛋白をコードす
る遺伝子の全部または一部を制限酵素等により切り出し
取得する。

【００４０】ヒト由来蛋白をコードするｃＤＮＡを取得
する場合には、さらにヒトゲノムＤＮＡ（染色体ＤＮ
Ａ）が導入されたコスミドライブラリーを作製（「ラボ
マニュアルヒトゲノムマッピング」、堀雅明及び中村祐
輔編、丸善出版）し、該コスミドライブラリーをスク
リーニングすることにより、目的蛋白のコーディング領
域のＤＮＡを含む陽性クローンを得、該陽性クローンか
ら切り出したコーディングＤＮＡをプローブとして用
い、前述のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする
ことにより調製することもできる。

【００４１】目的蛋白をコードするＤＮＡのＰＣＲによ
る調製は、該目的蛋白の既知のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ
等を鋳型として常法により調製することができる（「遺
伝子増幅ＰＣＲ法・基礎と新しい展開」、共立出版株式
会社発行、1992年など）。また、化学的合成による目的
蛋白をコードするＤＮＡの製造は、目的蛋白の塩基配列
をもとにして、常法に従って行うことができる。

【００４２】本発明の融合ポリペプチドは、上述に例示
した方法を用いて調製した酸化ＬＤＬ受容体及び免疫グ
ロブリンの重鎖をコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡあるいは
イントロンを含むゲノミックＤＮＡ）を、各々適切な制
限酵素で切断することにより、該酸化ＬＤＬ受容体の細
胞外領域及び免疫グロブリンの重鎖の一部をコードする
ＤＮＡ断片を得、それらの末端に適切な制限酵素部位を
付加するか、または必要に応じてリンカーＤＮＡあるい
はタグ（Ｔａｇ）を用い、適切なＤＮＡポリメラーゼ等
を用いて連結させ融合ＤＮＡとし、慣用される遺伝子組
換え技術を用いて、常法により組換え蛋白として調製す
ることができる。具体的には下記の例示されるとおりで
ある。

【００４３】酸化ＬＤＬ受容体の細胞外領域をコードす
るＤＮＡ（好ましくはｃＤＮＡ）は、所望の酸化ＬＤＬ
受容体の細胞外領域と細胞膜貫通領域との境界の周辺の
塩基配列を適当な部位で切断することが可能な制限酵素
で切断することにより調製することができる。例えば、
ヒト及びウシの酸化ＬＤＬ受容体ＬＯＸ−１（配列番号
１及び配列番号２）をコードするｃＤＮＡの場合には、
BamHIを用いることができる。

【００４４】免疫グロブリンの重鎖の一部をコードする
ＤＮＡ（好ましくはｃＤＮＡ）は、所望の部位で切断す
ることが可能な制限酵素で切断することにより調製する
ことができる。例えば、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域をコー
ドするｃＤＮＡを調製する場合には、BamHIを用いるこ
とができる。上述のようにして得られた酸化ＬＤＬの細
胞外領域をコードするＤＮＡと免疫グロブリンの重鎖の
一部をコードするＤＮＡとの連結は、例えば、末端に適
切な制限酵素部位を付加するか、または必要に応じてリ
ンカーＤＮＡやタグ（Ｔａｇ）と共に、市販のＤＮＡラ
イゲーションキットを用いて行うことができる。

【００４５】このようにして調製した融合ＤＮＡを、下
記に詳述するようなベクターに挿入して発現ベクターを
作成し、該発現ベクターで後述するような宿主細胞を形
質転換して形質転換体を得る。該形質転換体を培養する
ことにより、培養上清中に該融合ポリペプチドを産生さ
せる。培養上清中の該融合ポリペプチドは、プロテイン
Ａカラムクロマトグラフィー等を用いて容易に精製する
ことができる。本発明は、また本発明の融合ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターに関す
る。本発明の発現ベクターとしては、原核細胞及び／ま
たは真核細胞の各種の宿主内で複製保持または自己増殖
できるものであれば特に制限されず、プラスミドベクタ
ーおよびファージベクターが包含される（Cloning Vect
ors: A Laboratory Manual, エルスビュ−社、ニューヨ
ーク、1985年）。

【００４６】当該発現ベクターは、簡便には当業界にお
いて入手可能な組換え用ベクター（プラスミドＤＮＡお
よびバクテリアファージＤＮＡ）に本発明の融合ポリペ
プチドをコードするＤＮＡを常法により連結することに
よって調製することができる。用いられる組換え用ベク
ターとして具体的には、大腸菌由来のプラスミドとして
例えばpBR322、pBR325、pUC12、pUC13、pUC19など、酵
母由来プラスミドとして例えばpSH19、 pSH15など、枯
草菌由来プラスミドとして例えばpUB110、 pTP5、 pC19
4 などが例示される。また、ファージとしては、λファ
ージなどのバクテリオファージが、さらにレトロウイル
ス、ワクシニヤウイルス、核多角体ウイルスなどの動物
や昆虫のウイルス（pVL1393、インビトロゲン製）が例
示される。

【００４７】本発明の融合ポリペプチドをコードするＤ
ＮＡを発現させ該融合ポリペプチドを生産させる目的に
おいては、プラスミドベクターが有用である。プラスミ
ドベクターとしては、原核細胞および／または真核細胞
の各種の宿主細胞中で該融合ポリペプチドをコードする
遺伝子を発現し、これらのポリペプチドを生産する機能
を有するものであれば特に制限されない。例えば、pMAL
C2 、pEF-BOS（ヌクレイックアシッドリサーチ（Nucle
ic Acid Research）、第１８巻、第５３２２頁、１９９
０年等）あるいはpME18S（実験医学別冊「遺伝子工学ハ
ンドブック」、１９９２年等）等を挙げることができ
る。

【００４８】宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる
場合、一般に発現ベクターは少なくともプロモーター−
オペレーター領域、開始コドン、本発明のタンパクをコ
ードするＤＮＡ、終止コドン、ターミネーター領域およ
び複製可能単位から構成される。宿主として酵母、動物
細胞または昆虫細胞を用いる場合、発現ベクターは少な
くともプロモーター、開始コドン、本発明の融合ポリペ
プチドをコードするＤＮＡ、終止コドンを含んでいるこ
とが好ましい。またシグナルペプチドをコードするＤＮ
Ａ、エンハンサー配列、本発明の融合ポリペプチドをコ
ードする遺伝子の５’側および３’側の非翻訳領域、ス
プライシング接合部、ポリアデニレーション部位、選択
マーカー領域または複製可能単位などを含んでいてもよ
い。また、目的に応じて通常用いられる遺伝子増幅遺伝
子（マーカー）を含んでいてもよい。

【００４９】細菌中で本発明の融合ポリペプチドを発現
させるためのプロモーター−オペレータ−領域は、プロ
モーター、オペレーターおよび Shine-Dalgarno(SD) 配
列（例えば、ＡＡＧＧなど）を含むものである。例えば
宿主がエシェリキア属菌の場合、好適にはＴｒｐプロモ
ーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、
λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔａｃプロ
モーターなどを含むものが例示される。

【００５０】酵母中で本発明の融合ポリペプチドを発現
させるためのプロモーターとしては、ＰＨ０５プロモー
ター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤ
Ｈプロモーターが挙げられ、宿主がバチルス属菌の場合
は、ＳＬ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐ
ｅｎＰプロモーターなどが挙げられる。また、宿主が哺
乳動物細胞等の真核細胞である場合、ＳＶ４０由来のプ
ロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートシ
ョックプロモーターなどが挙げられる。好ましくは、Ｓ
Ｖ−４０、レトロウイルスである。しかし、特にこれら
に限定されるものではない。また、発現にはエンハンサ
ーの利用も効果的な方法である。好適な開始コドンとし
ては、メチオニンコドン（ＡＴＧ）が例示される。終止
コドンとしては、常用の終止コドン（例えば、ＴＡＧ、
ＴＧＡなど）が例示される。

【００５１】ターミネーター領域としては、通常用いら
れる天然または合成のターミネーターを用いることがで
きる。複製可能単位とは、宿主細胞中でその全ＤＮＡ配
列を複製することができる能力をもつＤＮＡを言い、天
然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド（天然
のプラスミドから調製されたＤＮＡフラグメント）およ
び合成プラスミド等が含まれる。好適なプラスミドとし
ては、E. coli ではプラスミドｐＢＲ３２２、もしくは
その人工的修飾物（ｐＢＲ３２２を適当な制限酵素で処
理して得られるＤＮＡフラグメント）が、酵母では酵母
２μプラスミド、もしくは酵母染色体ＤＮＡが、また哺
乳動物細胞ではプラスミドpRSVneo ATCC 37198、プラス
ミドpSV2dhfr ATCC 37145、プラスミドpdBPV-MMTneo AT
CC 37224、プラスミドpSV2neo ATCC 37149、プラスミド
pSV2bsr等があげられる。

【００５２】エンハンサー配列、ポリアデニレーション
部位およびスプライシング接合部位については、例えば
それぞれＳＶ４０に由来するもの等、当業者において通
常使用されるものを用いることができる。選択マーカー
としては、通常使用されるものを常法により用いること
ができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、ま
たはカナマイシン等の抗生物質耐性遺伝子等が例示され
る。遺伝子増幅遺伝子としては、ジヒドロ葉酸レダクタ
ーゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、ネ
オマイシン耐性遺伝子、グルタミン酸合成酵素遺伝子、
アデノシンデアミナーゼ遺伝子、オルニチンデカルボキ
シラーゼ遺伝子、ヒグロマイシン−Ｂ−ホスホトランス
フェラーゼ遺伝子、アスパルラートトランスカルバミラ
ーゼ遺伝子等を例示することができる。

【００５３】本発明の発現ベクターは、少なくとも、上
述のプロモーター、開始コドン、本発明のタンパクをコ
ードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域
を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結すること
によって調製することができる。またこの際、所望によ
り制限酵素での消化やＴ４ＤＮＡリガーゼを用いるライ
ゲーション等の常法により適当なＤＮＡフラグメント
（例えば、リンカー、他のリストリクションサイトな
ど）を用いることができる。本発明の形質転換細胞は、
上述の発現ベクターを宿主細胞に導入することにより調
製することができる。

【００５４】本発明で用いられる宿主細胞としては、前
記の発現ベクターに適合し、形質転換されうるものであ
れば特に限定されず、本発明の技術分野において通常使
用される天然細胞あるいは人工的に樹立された組換細胞
など種々の細胞（例えば、細菌（エシェリキア属菌、バ
チルス属菌）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属な
ど）、動物細胞または昆虫細胞など）が例示される。好
ましくは大腸菌あるいは動物細胞であり、具体的には大
腸菌（ＤＨ５α、ＤＨ１０Ｂ、ＴＢ１、ＨＢ１０１、XL
-2Blue等）、マウス由来細胞（ＣＯＰ、Ｌ、Ｃ１２７、
Ｓｐ２／０、ＮＳ−１またはNIH3T3等）、ラット由来細
胞、ハムスター由来細胞（ＢＨＫおよびＣＨＯ等）、サ
ル由来細胞（ＣＯＳ１、ＣＯＳ３、ＣＯＳ７、ＣＶ１お
よびＶｅｌｏ等）およびヒト由来細胞（Ｈｅｌａ、２倍
体線維芽細胞に由来する細胞、ミエローマ細胞およびNa
malwa等）などが例示される。

【００５５】発現ベクターの宿主細胞への導入（形質転
換（形質移入））は従来公知の方法を用いて行うことが
できる。例えば、細菌（E.coli、 Bacillus subtilis
等）の場合は、例えばCohen らの方法（Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA.、第６９巻、第２１１０頁、１９７２
年）、プロトプラスト法（Mol. Gen. Genet.、第１６
８巻、第１１１頁、１９７９年）やコンピテント法（ジ
ャーナルオブモレキュラーバイオロジー（J. Mol.Bio
l.）、第５６巻、第２０９頁、１９７１年）によって、
Saccharomyces cerevisiaeの場合は、例えばハイネン
（Hinnen）らの方法（Proc. Natl. Acad. Sci.USA.、第
７５巻、第１９２７頁、１９７８年）やリチウム法
（J. Bacteriol.、第１５３巻、第１６３頁、１９８３
年）によって、動物細胞の場合は、例えばグラハム（Gr
aham）の方法（バイロロジー（Virology）、第５２巻、
第４５６頁、１９７３年）によって、昆虫細胞の場合
は、例えばサマーズ（Summers）らの方法（Mol. Cell.
Biol.、第３巻、第２１５６〜第２１６５頁、１９８３
年）によってそれぞれ形質転換することができる。本発
明の融合ポリペプチドは、上記の如く調製される発現ベ
クターを含む形質転換細胞（以下、形質移入体を包含す
る意味で使用する。）を栄養培地で培養することによっ
て製造することができる。

【００５６】栄養培地は、宿主細胞（形質転換体）の生
育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含
でいることが好ましい。炭素源としては、例えばグルコ
ース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖などが、
無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモ
ニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リ
カー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイ
ショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄養
素（例えば、無機塩（例えば塩化カルシウム、リン酸二
水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗
生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、アン
ピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよ
い。

【００５７】培養は当業界において知られている方法に
より行われる。培養条件、例えば温度、培地のｐＨおよ
び培養時間は、本発明の融合ポリペプチドが大量に生産
されるように適宜選択される。なお、下記に宿主細胞に
応じて用いられる具体的な培地および培養条件を例示す
るが、何らこれらに限定されるものではない。宿主が細
菌、放線菌、酵母、糸状菌である場合、例えば上記栄養
源を含有する液体培地が適当である。好ましくは、ｐＨ
が５〜８である培地である。

【００５８】宿主がE. coli の場合、好ましい培地とし
てＬＢ培地、Ｍ９培地（ミラー（Miller）ら、 Exp. Mo
l. Genet、 Cold Spring Harbor Laboratory、第４３１
頁、１９７２年）、ＹＴ培地等が例示される。かかる場
合、培養は、必要により通気、撹拌しながら、通常１４
〜４３℃、約３〜２４時間行うことができる。宿主がBa
cillus属菌の場合、必要により通気、撹拌をしながら、
通常３０〜４０℃、約１６〜９６時間行うことができ
る。宿主が酵母である場合、培地として、例えばBurkho
lder最小培（ボスチアン（Bostian）、 Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA、第７７巻、第４５０５頁、１９８０
年）が挙げられ、ｐＨは５〜８であることが望ましい。
培養は通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行なわ
れ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。

【００５９】宿主が動物細胞の場合、培地として例えば
約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（サイエン
ス（Science）、第１２２巻、第５０１頁、１９５２
年）、ＤＭＥＭ培地（バイロロジー（Virology）、第８
巻、第３９６頁、１９５９年）、ＲＰＭＩ１６４０培
地（J. Am. Med. Assoc.、第１９９巻、第５１９頁、１
９６７年）、１９９培地（proc. Soc. Exp. Biol. Me
d.、第７３巻、第１頁、１９５０年）、ＨａｍＦ１２培
地等を用いることができる。培地のｐＨは約６〜８であ
るのが好ましく、培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜
７２時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うことも
できる。宿主が昆虫細胞の場合、例えば胎児牛血清を含
むGrace's培地（Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第８２
巻、第８４０４頁、１９８５年）等が挙げられ、そのｐ
Ｈは約５〜８であるのが好ましい。培養は通常約２０〜
４０℃で１５〜１００時間行なわれ、必要により通気や
撹拌を行うこともできる。

【００６０】本発明の融合ポリペプチドは、上述のよう
な形質転換細胞（特に動物細胞または大腸菌）を培養す
ることにより、培養上清中に分泌させることにより製造
することができる。すなわち、得られた培養物を濾過ま
たは遠心分離等の方法で培養濾液（上清）を得、該培養
濾液から天然または合成蛋白質を精製並びに単離するた
めに一般に用いられる常法に従って該本発明の融合ポリ
ペプチドを精製、単離する。単離、精製方法としては、
例えばプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー
などの特異的親和性を利用する方法、塩析、溶媒沈澱法
等の溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾
過、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動など分子量の差を利用する方法、イオン交換ク
ロマトグラフィーやヒドロキシルアパタイトクロマトグ
ラフィーなどの荷電を利用する方法、逆相高速液体クロ
マトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電
点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げ
られる。

【００６１】一方、本発明の融合ポリペプチドが培養さ
れた形質転換体のペリプラズムまたは細胞質内に存在す
る場合は、培養物を濾過または遠心分離などの常法に付
して菌体あるいは細胞を集め、適当な緩衝液に懸濁し、
例えば超音波やリゾチーム及び凍結融解などの方法で細
胞等の細胞壁および／または細胞膜を破壊した後、遠心
分離やろ過などの方法で本発明の融合ポリペプチドを含
有する膜画分を得る。該膜画分をトライトン−Ｘ１００
等の界面活性剤を用いて可溶化して粗溶液を得る。そし
て、当該粗溶液を先に例示したような常法を用いること
により、単離、精製することができる。

【００６２】本願における方法の発明において用いられ
る「抗体」とは、ポリクローナル抗体（抗血清）または
モノクローナル抗体を意味する。また、本発明において
は、後述するようなＦａｂ該モノクローナル抗体の一部
も包含される。具体的には、哺乳動物（ヒト、ウシ、マ
ウス、ラット、ハムスター、モルモット及びウサギな
ど、特に好ましくはヒト）の酸化ＬＤＬ等の種々の変性
ＬＤＬ（酸化ＬＤＬ、アセチルＬＤＬ、サクシニルＬＤ
Ｌ、マロンジアルデヒドＬＤＬなど）またはアポリポプ
ロテインＢに反応性を有する抗体である。好ましくは、
少なくとも該哺乳動物（特に好ましくはヒト）のアポリ
ポプロテインＢに反応性を有する抗体である。

【００６３】即ち、血中等の体液中においては、ＬＤＬ
（低密度リポ蛋白）は、アポリポプロテインＢと結合し
ていることから、当該発明においては、酸化ＬＤＬ等の
種々の変性ＬＤＬに反応性を有する抗体、またはアポリ
ポプロテインＢに反応性を有する抗体のいずれをも用い
ることができる。該抗体は、該酸化ＬＤＬ等の種々の変
性ＬＤＬまたはアポリポプロテインＢ（組換蛋白を含
む）に反応性を有する限りどのような抗体をも使用でき
る。即ち、該酸化ＬＤＬ等の種々の変性ＬＤＬまたはア
ポリポプロテインＢ（組換蛋白を含む）を、マウス、ラ
ット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ヤギあるいは
ヒツジ等の哺乳動物に免疫して得られる天然型哺乳動物
抗体、並びに遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメ
ラ抗体（実験医学（臨時増刊号）、第１．６巻、第１０
号、１９８８年、特公平3-73280号公報、及びMolecular
Medicine, Vol.32, No.6, p.638-644, 1995年等）及び
ヒト型抗体（CDR-grafted抗体、特表平４−５０６４５
８号公報、特開昭62-296890号公報、及びMolecular Med
icine, Vol.32,No.6, p.638-644, 1995年等）のいずれ
も用いることができる。

【００６４】またモノクローナル抗体の場合には、Ｉｇ
Ｇ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、Ｉｇ
Ｍ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１、ＩｇＧ２）、ＩｇＤあるいはＩ
ｇＥ等のいずれのクラスあるいはサブクラスに属するモ
ノクローナル抗体をも包含する。好ましくは、ＩｇＧま
たはＩｇＭである。本発明で言うポリクローナル抗体
（抗血清）あるいはモノクローナル抗体は、既存の一般
的な製造方法によって製造することができる。即ち、例
えば、抗原を、必要に応じてフロイントアジュバント
（Freund's Adjuvant）とともに、哺乳動物、好ましく
は、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサ
ギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマあるいはウ
シ、より好ましくはマウス、ラット、ハムスター、モル
モット、ウサギ、ヤギあるいはヒツジに免疫する。ポリ
クローナル抗体は、該免疫感作動物から得た血清から取
得することができる。またモノクローナル抗体は、該免
疫感作動物から得た該抗体産生細胞と自己抗体産生能の
ない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）から細胞融合によ
りハイブリドーマを調製し、該ハイブリドーマをクロー
ン化し、哺乳動物の免疫に用いた抗原に対して特異的親
和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選
択することによって製造される。

【００６５】モノクローナル抗体は、具体的には下記の
ようにして製造することができる。即ち、前述のような
酸化ＬＤＬ等の種々の変性ＬＤＬまたはアポリポプロテ
インＢ（組換蛋白を含む）を免疫原として、該免疫原
を、必要に応じてフロイントアジュバント（Freund's A
djuvant）とともに、マウス、ラット、ハムスター、モ
ルモット、ウサギ、ヤギあるいはヒツジの皮下内、筋肉
内、静脈内、フッドパッド内あるいは腹腔内に１乃至数
回注射するかあるいは移植することにより免疫感作を施
す。通常、初回免疫から約１乃至１４日毎に１乃至４回
免疫を行って、必要に応じて、最終免疫より約１乃至５
日後に免疫感作された該哺乳動物から抗体産生細胞が取
得される。

【００６６】モノクローナル抗体を分泌するハイブリド
ーマの調製は、ケーラー及びミルシュタインらの方法
（ネイチャー(Nature)、第２５６巻、第４９５〜第４９
７頁、１９７５年）及びそれに準じる修飾方法に従って
行うことができる。即ち、前述の如く免疫感作された哺
乳動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄あるいは扁
桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ま
しくはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサ
ギまたはヒト等の哺乳動物、より好ましくはマウス、ラ
ットまたはヒト由来の自己抗体産生能のないミエローマ
細胞との細胞融合させることにより調製される。

【００６７】細胞融合に用いられるミエローマ細胞とし
ては、例えばマウス由来ミエローマP3/X63-AG8.653（６
５３）、P3/NSI/1-Ag4-1（ＮＳ−１）、P3/X63-Ag8.U1
（Ｐ３Ｕ１）、SP2/0-Ag14（Ｓｐ２／Ｏ、Ｓｐ２）、PA
I、F0あるいはBW5147、ラット由来ミエローマ210RCY3-A
g.2.3.、ヒト由来ミエローマU-266AR1、GM1500-6TG-A1-
2、UC729-6、CEM-AGR、D1R11あるいはCEM-T15を使用す
ることができる。モノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマクローンのスクリーニングは、ハイブリドーマ
を、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖
の見られたウェルの培養上清の前述の哺乳動物免疫感作
で用いた免疫抗原に対する反応性を、例えばＲＩＡやＥ
ＬＩＳＡ等の酵素免疫測定法によって測定することによ
り行なうことができる。

【００６８】ハイブリドーマからのモノクローナル抗体
の製造は、ハイブリドーマをインビトロ、またはマウ
ス、ラット、モルモット、ハムスターまたはウサギ等、
好ましくはマウスまたはラット、より好ましくはマウス
の腹水中等でのインビボで行い、得られた培養上清、ま
たは哺乳動物の腹水から単離することにより行うことが
できる。インビトロで培養する場合には、培養する細胞
種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々条件に
合わせて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、
培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用
いられるような既知栄養培地あるいは既知の基本培地か
ら誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施するこ
とが可能である。

【００６９】基本培地としては、例えば、Ｈａｍ’Ｆ１
２培地、ＭＣＤＢ１５３培地あるいは低カルシウムＭＥ
Ｍ培地等の低カルシウム培地及びＭＣＤＢ１０４培地、
ＭＥＭ培地、Ｄ−ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、
ＡＳＦ１０４培地あるいはＲＤ培地等の高カルシウム培
地等が挙げられ、該基本培地は、目的に応じて、例えば
血清、ホルモン、サイトカイン及び／または種々無機あ
るいは有機物質等を含有することができる。モノクロー
ナル抗体の単離、精製は、上述の培養上清あるいは腹水
を、飽和硫酸アンモニウム、ユーグロブリン沈澱法、カ
プロイン酸法、カプリル酸法、イオン交換クロマトグラ
フィー（ＤＥＡＥまたはＤＥ５２等）、抗イムノグロブ
リンカラムあるいはプロテインＡカラム等のアフィニテ
ィカラムクロマトグラフィーに供すること等により行う
ことができる。

【００７０】前述の本発明における「モノクローナル抗
体の一部」とは、F(ab')₂、Fab'、Fab、Ｆｖ（variable
fragment of antibody）、ｓＦｖ、ｄｓＦｖ（disulph
idestabilised Fv）あるいはｄＡｂ（single domain an
tibody）等を意味する（エキスパート・オピニオン・オ
ン・テラピューティック・パテンツ(Exp. Opin. Ther.
Patents)，第６巻，第５号，第441〜456頁，1996年）。
ここで、「F(ab')₂」及び「Fab'」とは、イムノグロブ
リン（モノクローナル抗体）を、蛋白分解酵素であるペ
プシンあるいはパパイン等で処理することにより製造さ
れ、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィ
ド結合の前後で消化されて生成される抗体フラグメント
を意味する。例えば、ＩｇＧをパパインで処理すると、
ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結
合の上流で切断されてＶ_L（Ｌ鎖可変領域）とＣ_L（Ｌ鎖
定常領域）からなるＬ鎖、及びＶ _H（Ｈ鎖可変領域）と
Ｃ_Hγ1（Ｈ鎖定常領域中のγ1領域）とからなるＨ鎖フ
ラグメントがＣ末端領域でジスルフィド結合により結合
した相同な２つの抗体フラグメントを製造することがで
きる。これら２つの相同な抗体フラグメントを各々Fab'
という。またＩｇＧをペプシンで処理すると、ヒンジ領
域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の下流
で切断されて前記２つのFab'がヒンジ領域でつながった
ものよりやや大きい抗体フラグメントを製造することが
できる。この抗体フラグメントをF(ab')₂という。

【００７１】本発明における「不溶性担体」とは、本発
明の融合ポリペプチドを物理学的吸着あるいは化学的結
合等によって坦持させるための支持体を意味する。例え
ば、（１）ポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、
シリコン樹脂あるいはナイロン樹脂等からなるプラスチ
ックや、ガラス等に代表されるような水に不溶性の物質
からなるプレート、試験管若しくはチューブ等の内容積
を有するもの、ビーズ、ボール、フィルター、あるいは
メンブレン等、並びに（２）セルロース系担体、アガロ
ース系担体、ポリアクリルアミド系担体、デキストラン
系担体、ポリスチレン系担体、ポリビニルアルコール系
担体、ポリアミノ酸系担体あるいは多孔性シリカ系担体
等のようなアフィニティークロマトグラフィーに用いら
れる不溶性担体を挙げることができる。

【００７２】「融合ポリペプチド固定化不溶性担体」と
は、前記のような不溶性担体上に、本発明の融合ポリペ
プチドが、物理的吸着あるいは化学的結合等によって坦
持された状態にある不溶性担体を意味する。これらの融
合ポリペプチド固定化不溶性担体は、試料（例えば、血
清や血漿等の体液試料、培養上清あるいは遠心上清等）
中に含まれる酸化ＬＤＬ等の変性ＬＤＬを検出、定量、
分離または精製するために用いることができる。該検出
または定量の目的においては、前記（１）に挙げた不溶
性担体を用いることができ、とりわけ定量に用いる不溶
性担体としては、操作の簡便性及び多数検体の同時処理
の観点を考慮すると、例えば９６穴マイクロタイタープ
レートあるいは４８穴マイクロタイタープレート等の多
数のウェル（Well、穴）を有するマルチウェルプラスチ
ックプレートを用いるのが好ましい。また、該分離また
は精製の目的においては、前記（１）に挙げたフィルタ
ー若しくはメンブレンまたは前記（２）に挙げた不溶性
担体を用いることができる。

【００７３】本発明における「単独でまたは他の物質と
反応することにより検出可能なシグナルをもたらすこと
ができる標識物質」とは、それらを、前述のような抗体
あるいは酸化ＬＤＬの標準物質に物理化学的結合等によ
り結合させることによりそれらの存在を検出可能にする
ために用いられる物質を意味する。

【００７４】具体的には、酵素、蛍光物質、化学発光物
質、ビオチン、アビジンあるいは放射性同位体等であ
り、さらに具体的には、ペルオキシダーゼ（例えば、ho
rseradish peroxidase）、アルカリフォスファターゼ、
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、
グルコ−ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アル
コール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナー
ゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレア
ーゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラ
ーゼ等の酵素、フルオレスセインイソチオシアネート、
フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルク
ロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシア
ネート等の蛍光物質、³Ｈ、¹⁴Ｃ、¹²⁵Ｉ若しくは¹³¹Ｉ
等の放射性同位体、ビオチン、アビジン、または化学発
光物質が挙げられる。ここで、放射性同位体及び蛍光物
質は、単独で検出可能なシグナルをもたらすことができ
る。一方、酵素、化学発光物質、ビオチン及びアビジン
は、単独では検出可能なシグナルをもたらすことができ
ないため、さらに１種以上の他の物質と反応することに
より検出可能なシグナルをもたらす。例えば、酵素の場
合には少なくとも基質が必要であり、酵素活性を測定す
る方法（比色法、蛍光法、生物発光法あるいは化学発光
法等）に依存して種々の基質が用いられる。例えば、ペ
ルオキシダーゼの場合には、基質として過酸化水素を用
いる。また、ビオチンの場合には少なくともアビジンあ
るいは酵素修飾アビジンを反応させるのが一般的である
が、この限りではない。必要に応じてさらに該基質に依
存する種々の発色物質が用いられる。

【００７５】本発明においては、上記のいずれの標識物
質をも使用可能であるが、検出感度あるいは定量感度の
高さ及び操作の利便性の点を考慮すると、ペルオキシダ
ーゼ等の酵素あるいはビオチンで標識するのが好まし
い。ここで「酸化ＬＤＬの標準物質」とは、試料中に含
まれる濃度（含量）未知の酸化ＬＤＬ等の変性ＬＤＬと
対照的に、あらかじめ単離されている酸化ＬＤＬ等の変
性ＬＤＬを意味し、アッセイの目的に応じて自由にその
濃度をコントロールすることができる標品（スタンダー
ド）を意味する。該標準物質は、例えば、検量線の作成
に用いることができる。

【００７６】本発明における「イムノアッセイ」とは、
受容体とそのリガンドとの反応、並びに抗原と抗体との
反応の原理に基づき、試料（例えば、血清あるいは血漿
等の体液試料、培養上清あるいは遠心上清等）中に含ま
れる目的物質の検出あるいは定量を行う方法を意味す
る。本発明においては、該受容体が酸化ＬＤＬ受容体で
あり、該リガンドが該酸化ＬＤＬ受容体のリガンド（酸
化ＬＤＬ等の変性ＬＤＬ）である。また、本発明におい
ては、該抗原が酸化ＬＤＬ受容体のリガンド（酸化ＬＤ
Ｌ等の変性ＬＤＬ）であり、該抗体が該酸化ＬＤＬ受容
体のリガンド（酸化ＬＤＬ等の変性ＬＤＬ）に反応性を
有する抗体または該酸化ＬＤＬ等の変性ＬＤＬと結合す
る性質を有するアポリポプロテインＢに反応性を有する
抗体である。本発明においては、そのような受容体とリ
ガンドの反応、並びに抗原抗体反応を実施できる方法で
あれば、これまでに知られているどのようなイムノアッ
セイをも使用することができる。

【００７７】具体的には、酵素免疫測定法（第３版、石
川榮治ら編集、医学書院発行、１９８７年）に記載され
ているような種々方法の原理を応用することができる。
即ち、該種々方法においては、検出あるいは定量しよう
とする試料中の目的物質の捕捉（キャプチャーリング、
トラッピング）のために、該目的物質に対する１つ以上
の抗体を用いるが、本発明においては、該抗体の１つを
本発明の融合ポリペプチドに置き換えることにより同様
にアッセイを実施することができる。

【００７８】応用できる原理としては、例えば、一抗体
固相法、二抗体液相法、二抗体固相法、サンドイッチ
法、及び特公平２−３９７４７号公報に記載されている
ようなワンポット法を好適な例として挙げることができ
る。また、抗原抗体反応を利用したアッセイとしては、
ＥＭＩＴ法（Enzyme multiplied immunoassay techniqu
e）、エンザイムチャネリングアッセイ（Enzyme channe
ling immunoassay）、酵素活性修飾物質標識イムノアッ
セイ（Enzyme modulator mediated enzyme immunoassa
y、ＥＭＭＩＡ）、酵素阻害物質標識イムノアッセイ（E
nzyme inhibitor immunoassay）、イムノエンザイムメ
トリックアッセイ（Immunoenzymometric assay）、酵素
活性増強イムノアッセイ（Enzyme enhanced immunoassa
y）及びプロキシマールリンケージイムノアッセイ（Pro
ximal linkage immunoassay）等も知られている。

【００７９】本発明においては、このようなイムノアッ
セイのいずれかの原理を、目的に応じて適宜選択して用
いることができるが、操作上の簡便性及び／または経済
的な利便性、とりわけ臨床上での汎用性の点を考慮する
と、サンドイッチ法、ワンポット法、または一抗体固相
法の原理を用いるのが好ましく、より好ましくは、サン
ドイッチ法またはワンポット法の原理である。特に好ま
しくは、９６穴マイクロプレートに代表されるような多
数のウェルを有するマルチウェルマイクロタイタープレ
ートに本発明のポリペプチドを固定化した融合ポリペプ
チド固定化不溶性担体と、酵素あるいはビオチンにより
標識された標識抗体とを用いるサンドイッチ法、あるい
は本発明の融合ポリペプチドをその表面上に固定化した
ビーズと、ペルオキシダーゼ等の酵素あるいはビオチン
により標識された標識抗体とを用いるワンポット法であ
る。

【００８０】本発明の好適な具体的態様の一例を挙げる
ならば、ヒトまたはウシの酸化ＬＤＬ受容体（好ましく
は、ＬＯＸ−１）の細胞外領域とヒトの免疫グロブリン
（好ましくはＩｇＧ、特に好ましくはＩｇＧ１）の重鎖
の定常領域の一部（好ましくはＦｃ）からなる融合ポリ
ペプチドをマルチウェルマイクロタイタープレートまた
はビーズに固定化した融合ポリペプチド固定化不溶性担
体と、酸化ＬＤＬ等の変性ＬＤＬまたはアポリポプロテ
インＢに反応性を有する抗体を酵素またはビオチンで標
識した標識抗体とを用いるサンドイッチ法またはワンポ
ット法である。

【００８１】以下に、サンドイッチ法、ワンポット法、
及び一抗体固相法の原理を用いた本発明の方法を例示す
る。サンドイッチ法の原理を用いた本発明の方法は、前
述の本発明の（２２）に記載した方法、即ち、少なくと
も下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含むイムノアッセイ法
である。（ａ）本発明の融合ポリペプチド固定化不溶性担体に、
試料を反応せしめる工程。（ｂ）該融合ポリペプチド固定化不溶性担体と該試料中
に含まれる酸化ＬＤＬとの結合により形成される複合体
に、単独でまたは他の物質と反応することにより検出可
能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識さ
れた抗体であって、酸化ＬＤＬまたはアポリポプロテイ
ンＢに反応性を有する抗体を反応せしめる工程。

【００８２】本発明に即して、本方法を、不溶性担体と
してマルチウェルマイクロタイタープレートを用い、ま
た標識物質としてペルオキシダーゼ等の酵素あるいはビ
オチンを用いた方法について具体的に説明すると、例え
ば下記のような工程により構成されるが、該具体例のみ
に限定されるものではない。（工程１）本発明の融合ポリペプチドをマルチウェルマ
イクロタイタープレートに固定化し、融合ポリペプチド
固定化マイクロプレートを作製する工程；（工程２）該マイクロプレートにヒト血漿等の試料を加
え、試料を、該マイクロプレート上に固定化されている
融合ポリペプチドと反応させる工程；（工程３）該マイクロプレートを洗浄し、未反応の試料
を該マイクロプレートから取り除く工程；（工程４）酸化ＬＤＬまたはアポリポプロテインＢに反
応性を有する抗体を、ペルオキシダーゼ等の酵素または
ビオチンにより標識し、標識抗体を作製する工程；（工程５）工程３で洗浄されたマイクロプレートに、該
標識抗体を加え、該マイクロプレート上に固定化された
融合ポリペプチドと試料中に含まれる酸化ＬＤＬ等の変
性ＬＤＬが反応して形成される複合体に該標識抗体を反
応させる工程；（工程６）マイクロプレートを洗浄し、未反応の標識抗
体を該マイクロプレートから取り除く工程；（工程７）工程６で洗浄されたマイクロプレートに、必
要に応じて発色物質と共に、用いた酵素の種類に依存し
て種々の基質（但し、工程５でペルオキシダーゼ等の酵
素で標識した標識抗体を用いた場合）またはアビジンあ
るいは酵素修飾アビジン（但し、工程５でビオチンで標
識した標識抗体を用いた場合）を加え、該基質、アビジ
ンまたは酵素修飾アビジンと標識抗体上の標識物質とを
反応させる工程；（工程８）工程７で酵素修飾アビジンを加えた場合に
は、該修飾に用いた酵素の種類に依存して種々の基質を
加え、アビジンに結合した酵素と基質を反応させる工
程；（工程９）マイクロプレートに反応停止液を加え、酵素
反応及び発色反応を停止させる工程；及び（工程１０）比色強度、蛍光強度あるいは発光強度を測
定する工程。

【００８３】ワンポット法の原理を用いた本発明の方法
は、前述の本発明の（２２）乃至（２４）に記載した方
法である。即ち、第１は、少なくとも下記（ａ）及び
（ｂ）の工程を含むイムノアッセイ法である。（ａ）本発明の融合ポリペプチド固定化不溶性担体に、
試料を反応せしめる工程。（ｂ）該融合ポリペプチド固定化不溶性担体と該試料中
に含まれる酸化ＬＤＬとの結合により形成される複合体
に、単独でまたは他の物質と反応することにより検出可
能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識さ
れた抗体であって、酸化ＬＤＬまたはアポリポプロテイ
ンＢに反応性を有する抗体を反応せしめる工程。

【００８４】第２は、少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）
の工程を含むイムノアッセイ法である。（ａ）単独でまたは他の物質と反応することにより検出
可能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識
された抗体であって、酸化ＬＤＬまたはアポリポプロテ
インＢに反応性を有する抗体と、試料を反応せしめる工
程。（ｂ）該抗体と該試料中に含まれる酸化ＬＤＬとの結合
により形成される複合体と、本発明の融合ポリペプチド
固定化不溶性担体を反応せしめる工程。

【００８５】第３は、少なくとも下記（ａ）の工程を含
むイムノアッセイ法である。（ａ）本発明の融合ポリペプチド固定化不溶性担体、単
独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシ
グナルをもたらすことができる標識物質で標識された抗
体であって、酸化ＬＤＬまたはアポリポプロテインＢに
反応性を有する抗体、及び試料を含む混合物を反応せし
める工程。本発明に即して、上記第１乃至第３の方法
を、不溶性担体としてビーズを用い、また標識物質とし
てペルオキシダーゼ等の酵素あるいはビオチンを用いた
方法について具体的に説明すると、各々例えば下記のよ
うな工程により構成されるが、該具体例のみに限定され
るものではない。

【００８６】第１の方法は、下記のような工程から構成
される。（工程１）本発明の融合ポリペプチドをビーズに固定化
し、融合ポリペプチド固定化ビーズを作製する工程；（工程２）試験管、プレートあるいはチューブ等のよう
な内容積を有する容器に緩衝液とともに該ビーズとヒト
血漿等の試料を加え、該ビーズ上に固定化された融合ポ
リペプチドと試料とを反応させる工程；（工程３）容器中の内溶液を除去し、ビーズを洗浄する
工程；（工程４）酸化ＬＤＬまたはアポリポプロテインＢに反
応性を有する抗体を、ペルオキシダーゼ等の酵素または
ビオチンにより標識し、標識抗体を作製する工程；（工程５）工程３で洗浄されたビーズを含有する容器
に、該標識抗体を加え、該ビーズ上に固定化された融合
ポリペプチドと試料中に含まれる酸化ＬＤＬ等の変性Ｌ
ＤＬとが反応して形成される複合体に、該標識抗体を反
応させる工程；（工程６）容器中の内溶液を除去し、ビーズを洗浄する
ことにより、未反応の標識抗体を取り除く工程；（工程７）工程６で洗浄されたビーズを含む容器に、必
要に応じて発色物質と共に、用いた酵素の種類に依存し
て種々の基質（但し、工程５でペルオキシダーゼ等の酵
素で標識した標識抗体を用いた場合）またはアビジンあ
るいは酵素修飾アビジン（但し、工程５でビオチンで標
識した標識抗体を用いた場合）を加え、該基質、アビジ
ンまたは酵素修飾アビジンと標識抗体上の標識物質とを
反応させる工程；（工程８）工程７で酵素修飾アビジンを加えた場合に
は、該修飾に用いた酵素の種類に依存して種々の基質を
加え、アビジンに結合した酵素と基質を反応させる工
程；（工程９）工程７または工程８の反応系に反応停止液を
加え、酵素反応及び発色反応を停止させる工程；及び（工程１０）比色強度、蛍光強度あるいは発光強度を測
定する工程。

【００８７】第２の方法は、下記のような工程から構成
される。（工程１）酸化ＬＤＬまたはアポリポプロテインＢに反
応性を有する抗体を、ペルオキシダーゼ等の酵素または
ビオチンにより標識し、標識抗体を作製する工程；（工程２）試験管、マイクロプレートあるいはチューブ
等のような内容積を有する容器に、緩衝液と共に、該標
識抗体とヒト血漿等の試料を加え、該標識抗体と試料と
を反応させる工程；（工程３）本発明の融合ポリペプチドをビーズに固定化
し、融合ポリペプチド固定化ビーズを作製する工程；（工程４）工程２の反応系に、該ビーズを加え、標識抗
体と試料中に含まれる酸化ＬＤＬ等の変性ＬＤＬが反応
して形成される複合体と、該ビーズ上に固定化された融
合ポリペプチドとを反応させる工程；（工程５）容器中の内溶液を除去し、該ビーズを洗浄す
ることにより、未反応の標識抗体を取り除く工程；（工程６）工程５で洗浄されたビーズを含む容器に、必
要に応じて発色物質と共に、用いた酵素の種類に依存し
て種々の基質（但し、工程２でペルオキシダーゼ等の酵
素で標識した標識抗体を用いた場合）またはアビジンあ
るいは酵素修飾アビジン（但し、工程２でビオチンで標
識した標識抗体を用いた場合）を加え、該基質、アビジ
ンまたは酵素修飾アビジンと標識抗体上の標識物質とを
反応させる工程；（工程７）工程６で酵素修飾アビジンを加えた場合に
は、該修飾に用いた酵素の種類に依存して種々の基質を
加え、アビジンに結合した酵素と基質を反応させる工
程；（工程８）工程６または工程７の反応系に反応停止液を
加え、酵素反応及び発色反応を停止させる工程；及び（工程９）比色強度、蛍光強度あるいは発光強度を測定
する工程。

【００８８】第３の方法は、下記のような工程から構成
される。（工程１）本発明の融合ポリペプチドをビーズに固定化
し、融合ポリペプチド固定化ビーズを作製する工程；（工程２）酸化ＬＤＬまたはアポリポプロテインＢに反
応性を有する抗体を、ペルオキシダーゼ等の酵素または
ビオチンにより標識し、標識抗体を作製する工程；（工程３）試験管、プレートあるいはチューブ等のよう
な内容積を有する容器に緩衝液とともに、工程１で作製
された融合ポリペプチド固定化ビーズ、工程２で作製さ
れた標識抗体、及びヒト血漿等の試料を加え、該ビーズ
上に固定化された融合ポリペプチド、標識抗体、及び試
料を同時に反応させる工程；（工程４）容器中の内溶液を除去し、該ビーズを洗浄す
ることにより、未反応の標識抗体を取り除く工程；（工程５）工程４で洗浄されたビーズを含む容器に、必
要に応じて発色物質と共に、用いた酵素の種類に依存し
て種々の基質（但し、工程３でペルオキシダーゼ等の酵
素で標識した標識抗体を用いた場合）またはアビジンあ
るいは酵素修飾アビジン（但し、工程３でビオチンで標
識した標識抗体を用いた場合）を加え、該基質、アビジ
ンまたは酵素修飾アビジンと標識抗体上の標識物質とを
反応させる工程；（工程６）工程５で酵素修飾アビジンを加えた場合に
は、該修飾に用いた酵素の種類に依存して種々の基質を
加え、アビジンに結合した酵素と基質を反応させる工
程；（工程７）工程５または工程６の反応系に反応停止液を
加え、酵素反応及び発色反応を停止させる工程；及び（工程８）比色強度、蛍光強度あるいは発光強度を測定
する工程。

【００８９】一抗体固相法の原理を用いた本発明の方法
は、前述の本発明の（２５）に記載した方法、即ち、少
なくとも下記（ａ）の工程を含むイムノアッセイ法であ
る。（ａ）本発明の融合ポリペプチド固定化不溶性担体に、
試料、並びに単独でまたは他の物質と反応することによ
り検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質
で標識された酸化ＬＤＬの標準物質を反応せしめる工
程。本発明に即して、本方法を、不溶性担体としてマル
チウェルマイクロプレートを用い、また標識物質として
ペルオキシダーゼ等の酵素あるいはビオチンを用いた方
法について具体的に説明すると、各々例えば下記のよう
な工程により構成されるが、該具体例のみに限定される
ものではない。

【００９０】（工程１）本発明の融合ポリペプチドをマ
ルチウェルマイクロタイタープレートに固定化し、融合
ポリペプチド固定化マイクロプレートを作製する工程；（工程２）酸化ＬＤＬ受容体のリガンドである酸化ＬＤ
Ｌ等の変性ＬＤＬを、ペルオキシダーゼ等の酵素または
ビオチンにより標識し、標識酸化ＬＤＬ標準物質を作製
する工程；（工程３）該マイクロプレートに、ヒト血漿等の試料及
び該標識標準物質を加え、該試料と標識標準物質とを、
該マイクロプレート上に固定化された融合ポリペプチド
と競合的に反応させる工程；（工程４）マイクロプレートを洗浄し、未反応の標識標
準物質を、マイクロプレートから取り除く工程；（工程５）工程４で洗浄されたマイクロプレートに、必
要に応じて発色物質と共に、用いた酵素の種類に依存し
て種々の基質（但し、工程３でペルオキシダーゼ等の酵
素で標識した標識標準物質を用いた場合）またはアビジ
ンあるいは酵素修飾アビジン（但し、工程３でビオチン
で標識した標識標準物質を用いた場合）を加え、該基
質、アビジンまたは酵素修飾アビジンと標識標準物質上
の標識物質とを反応させる工程；（工程６）工程５で酵素修飾アビジンを加えた場合に
は、該修飾に用いた酵素の種類に依存して種々の基質を
加え、アビジンに結合した酵素と基質を反応させる工
程；（工程７）マイクロプレートに反応停止液を加え、酵素
反応及び発色反応を停止させる工程；及び（工程８）比色強度、蛍光強度あるいは発光強度を測定
する工程。本発明における「アフィニティークロマトグラフィー」
とは、抗原と抗体、酵素と基質、あるいは受容体とその
リガンドといった物質間の相互作用（親和性）を利用す
ることにより、試料（例えば、血清及び血漿等の体液試
料、培養上清あるいは遠心上清等）中に含まれる目的物
質を分離または精製する方法を意味する。

【００９１】本発明の方法は、受容体とそのリガンドと
の親和性を利用する方法に関し、具体的には、酸化ＬＤ
Ｌ受容体と、そのリガンドである酸化ＬＤＬ等の変性Ｌ
ＤＬとの親和性を利用することにより、試料（例えば、
血清及び血漿等の体液試料、培養上清あるいは遠心上清
等）中に含まれる酸化ＬＤＬ等の変性ＬＤＬを分離、精
製する方法に関する。さらに具体的には、（１）前述の
ような不溶性担体であるフィルターあるいはメンブレン
等に本発明の融合ポリペプチドを固定化した後、該フィ
ルターあるいはメンブレンに試料を接触させることによ
り該試料中に含まれる酸化ＬＤＬ等の変性ＬＤＬを分離
する方法、及び（２）前述のようなセルロース系担体、
アガロース系担体、ポリアクリルアミド系担体、デキス
トラン系担体、ポリスチレン系担体、ポリビニルアルコ
ール系担体、ポリアミノ酸系担体あるいは多孔性シリカ
系担体等のような不溶性担体上に本発明の融合ポリペプ
チドを常法により固定化（物理的吸着、架橋による高分
子化、マトリックス中への封印あるいは非共有結合等に
よる固定化）し、該不溶性担体をガラス製、プラスチッ
ク製あるいはステンレス製等のカラムに充填し、該カラ
ム（例えば、円柱状カラム）に、試料（例えば、血清及
び血漿等の体液試料、培養上清あるいは遠心上清等）を
通して溶出させることにより、該試料中に含まれる酸化
ＬＤＬ等の変性ＬＤＬを分離あるいは精製する方法であ
る。後者（２）の方法を特にアフィニティーカラムクロ
マトグラフィーという。

【００９２】該アフィニティーカラムクロマトグラフィ
ーに用いられる前記不溶性担体としては、本発明の融合
ポリペプチドを固定化でき得るものであればどのような
不溶性担体でも使用できる。例えば、市販品である、フ
ァルマシア(Pharmacia)社（製）のSepharose 2B、Sepha
rose 4B、Sepharose 6B、CNBr-activated Sepharose4
B、AH-Sepharose 4B、CH-Sepharose 4B、Activated CH-
Sepharose 4B、Epoxy-activated Sepharose 6B、Activa
ted thiol-Sepharose 4B、Sephadex、CM-Sephadex、ECH
-Sepharose 4B、EAH-Sepharose 4B、NHS-activated Sep
haroseあるいはThiopropyl Sepharose 6B等、バイオラ
ッド(Bio-Rad)社（製）のBio-Gel A、Cellex、Cellex A
E、Cellex-CM、Cellex PAB、Bio-Gel P、Hydrazide Bio
-Gel P、Aminoethyl Bio-Gel P、Bio-Gel CM、Affi-Gel
10 、Affi-Gel 15、Affi-Prep 10、Affi-Gel Hz、Affi
-Prep Hz、Affi-Gel 102、CM Bio-Gel A、Affi-Gel hep
arin、Affi-Gel 501あるいはAffi-Gel 601等、和光純薬
工業社（製）のクロマゲルＡ、クロマゲルＰ、エンザフ
ィックス P-HZ、エンザフィックス P-SHあるいはエン
ザフィックス P-AB等、セルバ(Serva)社（製）のAE-Cel
lurose、CM-CelluroseあるいはPAB Cellurose等を挙げ
ることができる。

【００９３】本発明における「医薬組成物」は、本発明
の融合ポリペプチドを有効成分として、薬学的に許容さ
れ得る担体、即ち、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、
安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘
味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添
加剤等の一つ以上とともに医薬組成物とし、錠剤、丸
剤、散剤、顆粒剤、注射剤、液剤、カプセル剤、トロー
剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等
の形態により経口あるいは非経口的に投与することがで
きる。とりわけ注射剤の場合には、例えば生理食塩水あ
るいは市販の注射用蒸留水等の非毒性の薬学的に許容さ
れ得る担体中に0.1μg抗体／ml担体〜10mg抗体／ｍｌ担
体の濃度となるように溶解または懸濁することにより製
造することができる。このようにして製造された注射剤
は、処置を必要とするヒト患者に対し、１回の投与にお
いて１ｋｇ体重あたり、１μｇ〜100mgの割合で、好ま
しくは50μg〜50mgの割合で、１日あたり１回〜数回投
与することができる。投与の形態としては、静脈内注
射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射あるいは腹腔内注
射のような医療上適当な投与形態が例示できる。好まし
くは静脈内注射である。また、本発明の該医薬組成物
は、酸化ＬＤＬ受容体及び／または酸化ＬＤＬ等の変性
ＬＤＬの動態異常に起因する動脈硬化症や高脂血症等の
種々疾患の予防及び治療において有用である。

【００９４】

【実施例】以下、実施例を以て本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明が該実施例に記載される態様のみに限
定されるものではないことは言うまでもない。

【００９５】［実施例１］融合ポリペプチドの調製ウシ酸化ＬＤＬ受容体ＬＯＸ−１（ｂＬＯＸ−１）をコ
ードするｃＤＮＡ（配列番号６）を、既報（Natute, Vo
l.386, p.73-77, 1997及び特開平9-98787号公報）に記
載の方法と同様にして調製した。得られたｃＤＮＡを、
２つのプライマー（5'-GGGGATCCTGATCTCATAAAGAAACAG-
3'（配列番号８）、及び5'-GCGGATCCTGTGCTCTCAATAGATT
CGC-3'（配列番号９））を用いてＰＣＲにより増幅し、
BamHI切断部位が両端に付加されたウシＬＯＸ−１の細
胞外領域をコードするｃＤＮＡ（配列番号６の塩基番号
２１５乃至８４４）を含むｃＤＮＡ断片を調製した。ヒ
トＩｇＧ１のヒンジ領域、Ｃγ1２、及びＣγ1３の各々
コードするエクソンを含むゲノミックＤＮＡを含んでい
るプラスミドpCd5lneg1（DNA and Cell Biol., Vol.9,
p.347-353, 1990参照。マサチューセッツ・ゼネラル・
ホスピタルのシード博士（B. Seed）から入手。配列番
号７に記載の塩基配列を有する）を、BamHIで消化して
線状化した。

【００９６】前述のようにして得られたウシＬＯＸ−１
の細胞外領域をコードするｃＤＮＡを、T4 DNAリガーゼ
を用いて、この線状化プラスミドのBamHI切断部位（配
列番号７の塩基番号１６９番目）に連結し、プラスミド
pBLOX-1-Fcを構築した（図２）。１０％ＦＢＳ（fetal
bovine serum）含有HamF12培地中でサブコンフルエント
に単層培養したCHO-K1細胞を、リポフェクタミン（Lipo
fectamine、GIBCO製）を用いて、pBLOX-1-Fc（１μｇ）
並びに発現プラスミドベクターpSVbsr（１０ｎｇ、フナ
コシ製；ｂｓｒ（Blasticidin S-resistance）遺伝子及
びＳＶ４０ウイルス由来のプロモーターを含む）により
共形質転換した。

【００９７】４８時間の培養後、培地を、blasticidin-
S（10μg/ml、フナコシ製）含有HamF12培地に替えたさ
らに培養することにより、pBLOX-1-Fc及びpSVbsrで共形
質転換された形質転換細胞を選択、取得した。得られた
形質転換細胞は、１０％ＦＣＳ（fetal calf serum）及
びblasticidin-S（10μg/ml、フナコシ製）を含有するH
amF12培地中で維持した。bLOX-1-Fcを精製するため、bl
asticidin-S（10μg/ml、フナコシ製）を含有するHamF1
2培地中でコンフルエントに培養した形質転換体CHO-K1
細胞の培地をCHO-SFM-II（GIBCO/BRL製）に替え、３日
間培養した。この操作を数回繰返した後、培養上清800m
lを得た。培養上清中のbLOX-1-Fcは、Affi-Gel Protein
A MAPS-IIkit（Bio-rad製）を用いて次のように精製し
た。

【００９８】培養上清を、予め結合緩衝液（binding bu
ffer）で平衡化したプロテインＡアガロースゲルカラム
に加えた。次いで、カラムを結合緩衝液（15 bed volum
e）で洗浄した後、溶出緩衝液（elution buffer、5 bed
volume）で溶出させた。溶出液を回収し、リン酸緩衝
液で２回以上外液交換することにより透析し、精製bLOX
-1-Fcを得た。得られた精製bLOX-1-Fcを、濃縮するため
Centriprep（アミコン製）を用いて限外濾過した。BCA
protein assay kit（PIERCE製）を用いて、866μg/mlの
精製bLOX-1-Fcが得られたことを確認した。また、上記
精製bLOX-1-Fcの取得は、下記ウェスタンブロッティン
グによっても確認した。精製bLOX-1-Fcを12.5%SDSアガ
ロースゲル（第一化学）にアプライし、電気泳動した。
泳動終了後、Immobilonメンブラン（ミリポア製）にブ
ロッティングした。メンブランをBlock Ace（雪印製）
で一晩ブロッキングした。一次抗体としてのビオチン標
識ヤギ抗ヒトIgG抗体及びＡＢＣキット（Vector製）を
用いて反応を行い、コニカイムノステインキットを用い
て発色を行った（図３）。なお、bLOX-1-Fcのアミノ酸
配列を配列番号３に、またbLOX-1-FcのｃＤＮＡ配列を
配列番号４に示す。

【００９９】［実施例２］融合ポリペプチド固定化マ
イクロプレートの作成実施例１で調製した精製bLOX-1-Fcでリン酸緩衝液で、
５μg/mlに希釈した。該希釈液を、９６穴マイクロプレ
ート（Nunc製）の各ウェルに加え、４℃で一晩インキュ
ベートし、bLOX-1-Fcをマイクロプレートに吸着させ
た。次いで、各ウェルを、リン酸緩衝液で２回洗浄し
た。洗浄溶液を捨て、各ウェルに、ブロッキング試薬
（320μｌ、25%(v/v)、Block Ace）、大日本製薬
（製））を加え室温で６時間インキュベートし、bLOX-1
-Fcが結合していない部位をブロックした。各ウェル
を、リン酸緩衝液で３回洗浄し、bLOX-1-Fc固定化マイ
クロプレートとした。

【０１００】［実施例３］ヒト酸化ＬＤＬの標準物質
の調製健常人の血漿を、臭化カリウム（ＫＢｒ）を加えて、比
重を1.019に調整した後、Beckman L-80超遠心機で遠心
し（20時間、58000rpm）、下層を別のチューブに回収し
た。回収した液量を測定し、臭化カリウムを加えて比重
を1.063に調整した。次いで、Beckman L-80超遠心機で
遠心し（20時間、58000rpm）、上層を別のチューブに回
収した。回収した画分を、リン酸緩衝液で透析（外液を
２回以上交換）し、精製ヒトＬＤＬを得た。蛋白量をBC
A protein assay kit（PIERCE製）を用いて測定した。
蛋白量は、10.3 mg/mlであった。

【０１０１】得られた精製ＬＤＬから酸化ＬＤＬを調製
するため、精製ＬＤＬ及び硫酸銅（CuSO₄）の濃度が、
各々3 mg/ml及び75μMとなるように調整した溶液を、Ｃ
Ｏ₂インキュベーター内で２０時間インキュベートし
た。次いで、EDTAを含有する0.15Mの塩化ナトリウム溶
液にて透析し（外液を２回以上交換）、ヒト酸化ＬＤＬ
を得た。蛋白量をBCA protein assay kit（PIERCE製）
を用いて測定した。蛋白量は、2.32 mg/mlであった。上
記のように調製した精製ＬＤＬ及び酸化ＬＤＬの各々
を、アガロースゲル（Titan Gel Lipoproteins, ヘレナ
研究所製）にのせ、アガロース電気泳動を行った（定電
圧：90ボルト、25分間）。ゲルを55℃の乾燥機中で乾燥
させ、Fat red7B染色液を加え、脂質の染色を行った。
次いで、70％メタノールで脱色させ、再度ゲルを55℃の
乾燥機中で乾燥させた。TBARS（過酸化脂質LPO）測定キ
ット（LPOテストワコー（和光製））を用いて、脂質の
酸化度を計測した。得られた脂質の酸化度は24.74 mol/
mg proteinであった。このようにして得たヒト酸化ＬＤ
Ｌを標準物質として用いた。

【０１０２】［実施例４］ウサギ酸化ＬＤＬの標準物
質の調製日本白色ウサギの血漿を、臭化カリウム（ＫＢｒ）を加
えて、比重を1.019に調整した後、Beckman L-80超遠心
機で遠心し（20時間、58000rpm）、下層を別のチューブ
に回収した。回収した液量を測定し、臭化カリウムを加
えて比重を1.063に調整した。次いで、Beckman L-80超
遠心機で遠心し（20時間、58000rpm）、上層を別のチュ
ーブに回収した。回収した画分を、リン酸緩衝液で透析
（外液を２回以上交換）し、精製ウサギＬＤＬを得た。
蛋白量をBCA protein assay kit（PIERCE製）を用いて
測定した。蛋白量は、895.6 μg/mlであった。

【０１０３】得られた精製ＬＤＬから酸化ＬＤＬを調製
するため、精製ＬＤＬ及び硫酸銅（CuSO₄）の濃度が、
各々100 μg/ml及び75μMとなるように調整した溶液
を、ＣＯ ₂インキュベーター内で２０時間インキュベー
トした。次いで、EDTAを含有する0.15Mの塩化ナトリウ
ム溶液にて透析し（外液を２回以上交換）、ウサギ酸化
ＬＤＬを得た。蛋白量をBCA protein assay kit（PIERC
E製）を用いて測定した。蛋白量は、307.1 μg/mlであ
った。このようにして得たウサギ酸化ＬＤＬを標準物質
として用いた。

【０１０４】［実施例５］検量線の作成＜試験１＞実施例３で調製した精製ヒト酸化ＬＤＬの標準物質を、
２０％ウシ新生児血清（bovine newborn serum、GIBCO
製）を含有するリン酸緩衝液で種々濃度（500,250, 12
5, 62.5, 31.25, 15.625及び7.8125 ng/ml）に希釈し、
実施例２で作成したbLOX-1-Fc固定化マイクロプレート
の各ウェルに加え、４℃で２４時間インキュベートし
た。同様に、実施例４で調製した精製ウサギ酸化ＬＤＬ
の標準物質を、２０％ウシ新生児血清（GIBCO製）を含
有するリン酸緩衝液で種々濃度（10, 5, 2.5, 1.25,0.6
25, 0.3125及び0.15625 μg/ml）に希釈し、実施例２で
作成したbLOX-1-Fc固定化マイクロプレートの各ウェル
に加え、４℃で24時間インキュベートした。

【０１０５】各々のプレートを、リン酸緩衝液で３回洗
浄した後、１％ＢＳＡ（bovine serum albumin）で1/10
00に希釈したペルオキシダーゼ標識ヒツジ抗ヒトアポリ
ポプロテインＢ抗体（100μｌ、フナコシ製（コード番
号：PP086））を各ウェルに加え、室温下で２時間イン
キュベートした。プレートをリン酸緩衝液で６回洗浄し
た後、各ウェルに、0.1Mのクエン酸ナトリウム緩衝液
（pH 5.5）中に溶解したオルトフェニレンジアミン（o-
phenylene diamine、100μg/mlの100μｌ）及び0.02%過
酸化水素を加え、室温下でインキュベートした。２０分
後、各ウェルに２Ｍ硫酸（50μｌ）を加え、反応を停止
させた。波長４９０ｎｍのでの蛍光強度を９６穴マイク
ロプレートリーダーで測定することにより酵素活性を求
め、検量線を作成した。ウサギ酸化ＬＤＬの標準物質を
用いた場合の検量線を図４に、またヒト酸化ＬＤＬの標
準物質を用いた場合の検量線を図５に示す。ヒト酸化Ｌ
ＤＬの場合には、極めて低濃度である少なくとも約7.81
25 ng/mlから500 ng/mlの濃度範囲で直線的検量線が得
られた（相関係数：ｒ＝0.997）。ウサギ酸化ＬＤＬの
場合には、極めて低濃度である少なくとも約0.15625μg
/mlから10 μg/mlの濃度範囲で直線的検量線が得られた
（相関係数：ｒ＝0.996）。

【０１０６】＜試験２＞精製ヒト酸化ＬＤＬ標準物質及び精製ウサギ酸化ＬＤＬ
標準物質の希釈濃度の範囲を下記のとおりさらに拡大し
て前記試験１と同様の方法により検量線を作成した。（ヒト酸化ＬＤＬ） 2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.
8125及び3.90625 ng/ml （ウサギ酸化ＬＤＬ） 40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125及び0.15625
μg/ml ウサギ酸化ＬＤＬの標準物質を用いた場合の検量線を図
７に、またヒト酸化ＬＤＬの標準物質を用いた場合の検
量線を図８に示す。ヒト酸化ＬＤＬの場合には、極めて
低濃度である少なくとも約3.90625 ng/mlから1000 ng/m
lの濃度範囲で直線的検量線が得られた（相関係数：ｒ
＝0.996）。ウサギ酸化ＬＤＬの場合には、極めて低濃
度である少なくとも約0.15625μg/mlから10 μg/mlの濃
度範囲で直線的検量線が得られた（相関係数：ｒ＝0.99
2）。

【０１０７】［実施例６］ウサギ酸化ＬＤＬの定量正常日本白色ウサギ（１７匹）及び高脂血症モデルウサ
ギ（Watanabe Heritable Hyperlipidemic Rabbit (WHH
L)、１２匹）の各々から採取した各々の血漿を、２０％
ウシ新生児血清（bovine newborn serum、GIBCO製）を
含有するリン酸緩衝液で希釈した。希釈した各々の血漿
（100μｌ）を、実施例２で作成したbLOX-1-Fc固定化マ
イクロプレートの各ウェルに加え、４℃で２４時間イン
キュベートした。プレートを、リン酸緩衝液で３回洗浄
した後、１％ＢＳＡ（bovine serum albumin）で1/1000
に希釈したペルオキシダーゼ標識ヒツジ抗ヒトアポリポ
プロテインＢ抗体（100μｌ、フナコシ製（コード番
号：PP086））を各ウェルに加え、室温下で２時間イン
キュベートした。プレートをリン酸緩衝液で６回洗浄し
た後、各ウェルに、0.1Mのクエン酸ナトリウム緩衝液
（pH 5.5）中に溶解したオルトフェニレンジアミン（o-
phenylene diamine、100μg/mlの100μｌ）及び0.02%過
酸化水素を加え、室温下でインキュベートした。２０分
後、各ウェルに２Ｍ硫酸（50μｌ）を加え、反応を停止
させた。波長４９０ｎｍのでの蛍光強度を９６穴マイク
ロプレートリーダーで測定することにより酵素活性を求
め、血漿中に含まれる酸化ＬＤＬを定量した。結果を図
６に示す。正常ウサギの血漿中の酸化ＬＤＬ量は、有意
に低濃度であり、一方、高脂血症モデルウサギの血漿中
の酸化ＬＤＬ量は、正常ウサギに比べ有意に高濃度であ
った。また、本実施例におけるウサギ酸化ＬＤＬの定量
感度（検出感度）は、極めて高い定量感度（検出感度）
であることが確認された。

【０１０８】［実施例７］ヒト酸化ＬＤＬの定量高脂血症患者（２０名以上）並びに採血の時点で高脂血
症の臨床症状が現れていない健常人（２０名以上）の個
々について、静脈からのヘパリン採血により血液を採取
した。血液を遠心分離して血清を分離した（約3,000rp
m、20分）。得られた血清を直ちにマイナス80℃に凍結
し保存した。なお、被験者の平均年齢は約57.5歳であっ
た（最低40歳、最高70歳）。凍結血清を冷蔵庫で溶解
し、リン酸緩衝液で１０倍に希釈し、実施例２で作成し
たbLOX-1-Fc固定化マイクロプレートの各ウェルに加
え、４℃で２４時間インキュベートした。プレートを、
リン酸緩衝液で３回洗浄した後、１％ＢＳＡ（bovine s
erum albumin）で1/1000に希釈したペルオキシダーゼ標
識ヒツジ抗ヒトアポリポプロテインＢ抗体（100μｌ、
フナコシ製（コード番号：PP086））を各ウェルに加
え、室温下で２時間インキュベートした。プレートをリ
ン酸緩衝液で６回洗浄した後、各ウェルに、0.1Mのクエ
ン酸ナトリウム緩衝液（pH 5.5）中に溶解したオルトフ
ェニレンジアミン（o-phenylene diamine、100μg/mlの
100μｌ）及び0.02%過酸化水素を加え、室温下でインキ
ュベートした。２０分後、各ウェルに２Ｍ硫酸（50μ
ｌ）を加え、反応を停止させた。波長４９０ｎｍのでの
蛍光強度を９６穴マイクロプレートリーダーで測定する
ことにより酵素活性を求め、血清中に含まれる酸化ＬＤ
Ｌを定量した。結果を図９に示す。高脂血症患者血清中
の変性ＬＤＬ（LOX-1リガンド）の平均量は、健常人の
それに比べ約1.6倍であり、高脂血症患者では変性ＬＤ
Ｌ（LOX-1リガンド）の量が有意に増加していることが
確認された。

【０１０９】［実施例８］医薬組成物の調製及び酸化
ＬＤＬ阻害活性実施例１で調製した精製bLOX-1-Fc（1〜200μg/ml）を
注射用蒸留水（10ml）に加え注射剤とした。この注射剤
を1〜10 mg/kgの濃度で高脂血症モデルウサギ（WHHL）
あるいは動脈硬化モデルウサギに静脈内投与（初回投
与、０時間）し、引き続き10〜30時間おきに同濃度で投
与する。各投与後定期的にに血漿を採取し、実施例６と
同様にして各血漿試料中の酸化ＬＤＬ量を測定する。bL
OX-1-Fcが、ウサギ血中の酸化ＬＤＬ量を低減すること
が期待できる。

【０１１０】

【発明の効果】本発明の融合ポリペプチド、具体的に
は、酸化ＬＤＬ受容体（例えば、ヒトＬＯＸ−１）の細
胞外領域と免疫グロブリンの重鎖の定常領域の一部（例
えば、ヒトＩｇＧのＦｃ）からなる融合ポリペプチド
は、哺乳動物（例えば、健常人及び患者等）の体液中
（例えば、血清及び血漿など）の酸化ＬＤＬ等の変性Ｌ
ＤＬのを検出及び定量するためのアッセイにおける構成
要素として有用であるだけでなく、該酸化ＬＤＬ等の変
性ＬＤＬの分離及び精製における構成要素としても有用
である。本発明の融合タンパクを用いることにより、動
脈硬化症や高脂血症等の疾患に罹患した患者の体液中に
存在する酸化ＬＤＬ等の変性ＬＤＬを、インタクト（in
tact）な状態で簡便かつ高感度で検出及び定量でき、ま
た臨床上で汎用可能な定量方法及び検出方法、並びに該
方法に用いられるキットを提供できる。本発明の検出方
法及び定量方法並びにキットは、動脈硬化症や高脂血症
等の種々疾患の診断において極めて有用である。また、
本発明の融合ポリペプチドは、ＩｇＧ等の免疫グロリン
の定常領域の一部（例えば、Ｆｃ）を融合パートナーと
して有することから、該免疫グロブリン断片に特異的に
結合するというプロテインＡの性質を用いたアフィニテ
ィーカラムクロマトグラフィーを用いることにより該融
合ポリペプチドを極めて容易に精製することが可能であ
る。さらに、種々の免疫グロブリンのＦｃに対する種々
の抗体が提供されていることから、該Ｆｃに対する抗体
を用いて、該融合ポリペプチドのイムノアッセイを簡便
に行うことができる。本発明の融合ポリペプチドは、前
記のような酸化ＬＤＬ等の変性ＬＤＬのアッセイ（検
出、定量など）並びに分離及び精製におけるツールとし
て有用であるだけでなく、それ自体が、動脈硬化症や高
脂血症等の疾患の予防及び治療のための医薬品の有効成
分として極めて有用である。

【０１１１】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Japan Tobacco,Inc. <120> Method to quantify denaturated LDL <130> J98-0225 <140> <141> <150> JP P1997-364981 <151> 1997-12-19 <150> JP P1998-349648 <151> 1998-12-9 <160> 10 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 273 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Thr Phe Asp Asp Leu Lys Ile Gln Thr Val Lys Asp Gln Pro Asp 1 5 10 15 Glu Lys Ser Asn Gly Lys Lys Ala Lys Gly Leu Gln Phe Leu Tyr Ser 20 25 30 Pro Trp Trp Cys Leu Ala Ala Ala Thr Leu Gly Val Leu Cys Leu Gly 35 40 45 Leu Val Val Thr Leu Met Val Leu Gly Met Gln Leu Ser Gln Val Ser 50 55 60 Asp Leu Leu Thr Gln Glu Gln Ala Asn Leu Thr His Gln Lys Lys Lys 65 70 75 80 Leu Glu Gly Gln Ile Ser Ala Arg Gln Gln Ala Glu Glu Ala Ser Gln 85 90 95 Glu Ser Glu Asn Glu Leu Lys Glu Met Ile Glu Thr Leu Ala Arg Lys 100 105 110 Leu Asn Glu Lys Ser Lys Glu Gln Met Glu Leu His His Gln Asn Leu 115 120 125 Asn Leu Gln Glu Thr Leu Lys Arg Val Ala Asn Cys Ser Ala Pro Cys 130 135 140 Pro Gln Asp Trp Ile Trp His Gly Glu Asn Cys Tyr Leu Phe Ser Ser 145 150 155 160 Gly Ser Phe Asn Trp Glu Lys Ser Gln Glu Lys Cys Leu Ser Leu Asp 165 170 175 Ala Lys Leu Leu Lys Ile Asn Ser Thr Ala Asp Leu Asp Phe Ile Gln 180 185 190 Gln Ala Ile Ser Tyr Ser Ser Phe Pro Phe Trp Met Gly Leu Ser Arg 195 200 205 Arg Asn Pro Ser Tyr Pro Trp Leu Trp Glu Asp Gly Ser Pro Leu Met 210 215 220 Pro His Leu Phe Arg Val Arg Gly Ala Val Ser Gln Thr Tyr Pro Ser 225 230 235 240 Gly Thr Cys Ala Tyr Ile Gln Arg Gly Ala Val Tyr Ala Glu Asn Cys 245 250 255 Ile Leu Ala Ala Phe Ser Ile Cys Gln Lys Lys Ala Asn Leu Arg Ala 260 265 270 Gln <210> 2 <211> 270 <212> PRT <213> Bovine <400> 2 Met Thr Val Asp Asp Pro Lys Gly Met Lys Asp Gln Leu Asp Gln Lys 1 5 10 15 Pro Asn Gly Lys Thr Ala Lys Gly Phe Val Ser Ser Trp Arg Trp Tyr 20 25 30 Pro Ala Ala Val Thr Leu Gly Val Leu Cys Leu Gly Leu Leu Val Thr 35 40 45 Val Ile Leu Leu Ile Leu Gln Leu Ser Gln Val Ser Asp Leu Ile Lys 50 55 60 Lys Gln Gln Ala Asn Ile Thr His Gln Glu Asp Ile Leu Glu Gly Gln 65 70 75 80 Ile Leu Ala Gln Arg Arg Ser Glu Lys Ser Ala Gln Glu Ser Gln Lys 85 90 95 Glu Leu Lys Glu Met Ile Glu Thr Leu Ala His Lys Leu Asp Glu Lys 100 105 110 Ser Lys Lys Leu Met Glu Leu His Arg Gln Asn Leu Asn Leu Gln Glu 115 120 125 Val Leu Lys Glu Ala Ala Asn Tyr Ser Gly Pro Cys Pro Gln Asp Trp 130 135 140 Leu Trp His Glu Glu Asn Cys Tyr Gln Phe Ser Ser Gly Ser Phe Asn 145 150 155 160 Trp Glu Lys Ser Gln Glu Asn Cys Leu Ser Leu Asp Ala His Leu Leu 165 170 175 Lys Ile Asn Ser Thr Asp Glu Leu Glu Phe Ile Gln Gln Met Ile Ala 180 185 190 His Ser Ser Phe Pro Phe Trp Met Gly Leu Ser Met Arg Lys Pro Asn 195 200 205 Tyr Ser Trp Leu Trp Glu Asp Gly Thr Pro Leu Thr Pro His Leu Phe 210 215 220 Arg Ile Gln Gly Ala Val Ser Arg Met Tyr Pro Ser Gly Thr Cys Ala 225 230 235 240 Tyr Ile Gln Arg Gly Thr Val Phe Ala Glu Asn Cys Ile Leu Thr Ala 245 250 255 Phe Ser Ile Cys Gln Lys Lys Ala Asn Leu Leu Arg Ala Gln 260 265 270 <210> 3 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Chimeric protein consisting of extracellular region of bovine LOX-1 and Fc region of human immunoglobulin IgG1 <400> 3 Asp Leu Ile Lys Lys Gln Gln Ala Asn Ile Thr His Gln Glu Asp Ile 1 5 10 15 Leu Glu Gly Gln Ile Leu Ala Gln Arg Arg Ser Glu Lys Ser Ala Gln 20 25 30 Glu Ser Gln Lys Glu Leu Lys Glu Met Ile Glu Thr Leu Ala His Lys 35 40 45 Leu Asp Glu Lys Ser Lys Lys Leu Met Glu Leu His Arg Gln Asn Leu 50 55 60 Asn Leu Gln Glu Val Leu Lys Glu Ala Ala Asn Tyr Ser Gly Pro Cys 65 70 75 80 Pro Gln Asp Trp Leu Trp His Glu Glu Asn Cys Tyr Gln Phe Ser Ser 85 90 95 Gly Ser Phe Asn Trp Glu Lys Ser Gln Glu Asn Cys Leu Ser Leu Asp 100 105 110 Ala His Leu Leu Lys Ile Asn Ser Thr Asp Glu Leu Glu Phe Ile Gln 115 120 125 Gln Met Ile Ala His Ser Ser Phe Pro Phe Trp Met Gly Leu Ser Met 130 135 140 Arg Lys Pro Asn Tyr Ser Trp Leu Trp Glu Asp Gly Thr Pro Leu Thr 145 150 155 160 Pro His Leu Phe Arg Ile Gln Gly Ala Val Ser Arg Met Tyr Pro Ser 165 170 175 Gly Thr Cys Ala Tyr Ile Gln Arg Gly Thr Val Phe Ala Glu Asn Cys 180 185 190 Ile Leu Thr Ala Phe Ser Ile Cys Gln Lys Lys Ala Asn Leu Leu Arg 195 200 205 Ala Gln Asp Pro Glu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 4 <211> 1335 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: DNA encoding a chimeric protein consisting of extracellular region of bovine LOX-1 and Fc region of human immunoglobulin IgG1 <400> 4 gat ctc ata aag aaa cag caa gca aat att act cac cag gaa gat atc 48 Asp Leu Ile Lys Lys Gln Gln Ala Asn Ile Thr His Gln Glu Asp Ile 1 5 10 15 ctg gag gga cag att tta gcc cag cgc cga tca gaa aaa tct gcc cag 96 Leu Glu Gly Gln Ile Leu Ala Gln Arg Arg Ser Glu Lys Ser Ala Gln 20 25 30 gag tca cag aag gaa ctc aaa gaa atg ata gaa acc ctt gcc cac aag 144 Glu Ser Gln Lys Glu Leu Lys Glu Met Ile Glu Thr Leu Ala His Lys 35 40 45 ctg gat gag aaa tcc aag aaa cta atg gaa ctt cac cgc cag aac ctg 192 Leu Asp Glu Lys Ser Lys Lys Leu Met Glu Leu His Arg Gln Asn Leu 50 55 60 aat ctc caa gaa gtt ctg aaa gag gca gca aac tat tca ggt cct tgt 240 Asn Leu Gln Glu Val Leu Lys Glu Ala Ala Asn Tyr Ser Gly Pro Cys 65 70 75 80 ccc caa gac tgg ctc tgg cat gaa gaa aac tgt tac caa ttt tcc tct 288 Pro Gln Asp Trp Leu Trp His Glu Glu Asn Cys Tyr Gln Phe Ser Ser 85 90 95 ggc tct ttt aat tgg gaa aaa agc cag gag aac tgc ttg tct ttg gat 336 Gly Ser Phe Asn Trp Glu Lys Ser Gln Glu Asn Cys Leu Ser Leu Asp 100 105 110 gcc cac ttg ctg aag att aat agc aca gat gaa ctg gaa ttc atc cag 384 Ala His Leu Leu Lys Ile Asn Ser Thr Asp Glu Leu Glu Phe Ile Gln 115 120 125 caa atg att gcc cat tcc agt ttc ccc ttc tgg atg ggg ttg tca atg 432 Gln Met Ile Ala His Ser Ser Phe Pro Phe Trp Met Gly Leu Ser Met 130 135 140 agg aaa ccc aat tac tcg tgg ctt tgg gaa gat ggt act cct ttg acg 480 Arg Lys Pro Asn Tyr Ser Trp Leu Trp Glu Asp Gly Thr Pro Leu Thr 145 150 155 160 ccc cac ttg ttt aga att cag gga gct gtt tcc cgt atg tat cct tca 528 Pro His Leu Phe Arg Ile Gln Gly Ala Val Ser Arg Met Tyr Pro Ser 165 170 175 ggg acc tgt gca tat att caa agg gga act gtt ttt gct gaa aac tgc 576 Gly Thr Cys Ala Tyr Ile Gln Arg Gly Thr Val Phe Ala Glu Asn Cys 180 185 190 att tta act gca ttc agt ata tgt caa aag aag gcg aat cta ttg aga 624 Ile Leu Thr Ala Phe Ser Ile Cys Gln Lys Lys Ala Asn Leu Leu Arg 195 200 205 gca cag gat ccc gag gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc 672 Ala Gln Asp Pro Glu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 210 215 220 cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc 720 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag 768 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag 816 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 260 265 270 ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag 864 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgg gtg gtc agc gtc ctc 912 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag 960 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa 1008 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc 1056 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa 1104 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag 1152 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc 1200 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag 1248 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac 1296 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa 1335 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 5 <211> 1318 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> 5'UTR <222> (1)..(126) <220> <221> CDS <222> (127)..(948) <220> <221> 3'UTR <222> (949)..(1318) <400> 5 ggggccgcac tagtgattct ggttcggccc acctctgaag gttccagaat cgatagtgaa 60 ttcgtgattt tagtttgttg aagttcgtga ctgcttcact ctctcattct tagcttgaat 120 ttggaa atg act ttt gat gac cta aag atc cag act gtg aag gac cag 168 Met Thr Phe Asp Asp Leu Lys Ile Gln Thr Val Lys Asp Gln 1 5 10 cct gat gag aag tca aat gga aaa aaa gct aaa ggt ctt cag ttt ctt 216 Pro Asp Glu Lys Ser Asn Gly Lys Lys Ala Lys Gly Leu Gln Phe Leu 15 20 25 30 tac tct cca tgg tgg tgc ctg gct gct gcg act cta ggg gtc ctt tgc 264 Tyr Ser Pro Trp Trp Cys Leu Ala Ala Ala Thr Leu Gly Val Leu Cys 35 40 45 ctg gga tta gta gtg acc att atg gtg ctg ggc atg caa tta tcc cag 312 Leu Gly Leu Val Val Thr Leu Met Val Leu Gly Met Gln Leu Ser Gln 50 55 60 gtg tct gac ctc cta aca caa gag caa gca aac cta act cac cag aaa 360 Val Ser Asp Leu Leu Thr Gln Glu Gln Ala Asn Leu Thr His Gln Lys 65 70 75 aag aaa ctg gag gga cag atc tca gcc cgg caa caa gca gaa gaa gct 408 Lys Lys Leu Glu Gly Gln Ile Ser Ala Arg Gln Gln Ala Glu Glu Ala 80 85 90 tca cag gag tca gaa aac gaa ctc aag gaa atg ata gaa acc ctt gct 456 Ser Gln Glu Ser Glu Asn Glu Leu Lys Glu Met Ile Glu Thr Leu Ala 95 100 105 110 cgg aag ctg aat gag aaa tcc aaa gag caa atg gaa ctt cac cac cag 504 Arg Lys Leu Asn Glu Lys Ser Lys Glu Gln Met Glu Leu His His Gln 115 120 125 aat ctg aat ctc caa gaa aca ctg aag aga gta gca aat tgt tca gct 552 Asn Leu Asn Leu Gln Glu Thr Leu Lys Arg Val Ala Asn Cys Ser Ala 130 135 140 cct tgt ccg caa gac tgg atc tgg cat gga gaa aac tgt tac cta ttt 600 Pro Cys Pro Gln Asp Trp Ile Trp His Gly Glu Asn Cys Tyr Leu Phe 145 150 155 tcc tcg ggc tca ttt aac tgg gaa aag agc caa gag aag tgc ttg tct 648 Ser Ser Gly Ser Phe Asn Trp Glu Lys Ser Gln Glu Lys Cys Leu Ser 160 165 170 ttg gat gcc aag ttg ctg aaa att aat agc aca gct gat ctg gac ttc 696 Leu Asp Ala Lys Leu Leu Lys Ile Asn Ser Thr Ala Asp Leu Asp Phe 175 180 185 190 atc cag caa gca att tcc tat tcc agt ttt cca ttc tgg atg ggg ctg 744 Ile Gln Gln Ala Ile Ser Tyr Ser Ser Phe Pro Phe Trp Met Gly Leu 195 200 205 tct cgg agg aac ccc agc tac cca tgg ctc tgg gag gac ggt tct cct 792 Ser Arg Arg Asn Pro Ser Tyr Pro Trp Leu Trp Glu Asp Gly Ser Pro 210 215 220 ttg atg ccc cac tta ttt aga gtc cga ggc gct gtc tcc cag aca tac 840 Leu Met Pro His Leu Phe Arg Val Arg Gly Ala Val Ser Gln Thr Tyr 225 230 235 cct tca ggt acc tgt gca tat ata caa cga gga gct gtt tat gcg gaa 888 Pro Ser Gly Thr Cys Ala Tyr Ile Gln Arg Gly Ala Val Tyr Ala Glu 240 245 250 aac tgc att tta gct gcc ttc agt ata tgt cag aag aag gca aac cta 936 Asn Cys Ile Leu Ala Ala Phe Ser Ile Cys Gln Lys Lys Ala Asn Leu 255 260 265 270 aga gca cag tga atttgaaggc tctggaagaa aagaaaaaag tctttgagtt 988 Arg Ala Gln ttattctgga atttaagcta ttctttgtca cttgggtgcc aaacatgaga gcccagaaaa 1048 ctgtcattta gctggctgca gaactccttt gcagaaactg gggttccagg tgcctggcac 1188 ctttatgtca acatttttga ttctagctat ctgtattatt tcacctagct tgtcccaagc 1168 ttccctgcca gcctgaagtc cattttcccc tttttatttt aaaatttgac tcctcttcaa 1228 gcttgaaaac cctctgaact cagtcttctt tacctcatta tcaccttccc ctcacactcc 1288 taaaattgca tgaaagacag accggaattc 1318 <210> 6 <211> 1897 <212> DNA <213> Bovine <220> <221> 5'UTR <222> (1)..(34) <220> <221> CDS <222> (35)..(847) <220> <221> 3'UTR <222> (848)..(1897) <220> <221> polyA_signal <222> (1859)..(1864) <220> <221> polyA_site <222> (1880)..(1897) <400> 6 gcttcactct ctcattcttg gaatacattt gaaa atg act gtt gat gac ccc 52 Met thr Val Asp Asp Pro 1 5 aag ggt atg aaa gat caa ctt gat cag aag cca aat ggc aag aca gca 100 Lys Gly Met Lys Asp Gln Leu Asp Gln Lys Pro Asn Gly Lys Thr Ala 10 15 20 aaa ggt ttt gtt tcc tct tgg agg tgg tac cct gct gct gtg act cta 148 Lys Gly Phe Val Ser Ser Trp Arg Trp Tyr Pro Ala Ala Val Thr Leu 25 30 35 ggg gtc ctt tgt ctg gga tta ctg gtg act gtt ata ttg ttg ata ctg 196 Gly Val Leu Cys Leu Gly Leu Leu Val Thr Val Ile Leu Leu Ile Leu 40 45 50 caa tta tcc cag gtc tct gat ctc ata aag aaa cag caa gca aat att 244 Gln Leu Ser Gln Val Ser Asp Leu Ile Lys Lys Gln Gln Ala Asn Ile 55 60 65 70 act cac cag gaa gat atc ctg gag gga cag att tta gcc cag cgc cga 292 Thr His Gln Glu Asp Ile Leu Glu Gly Gln Ile Leu Ala Gln Arg Arg 75 80 85 tca gaa aaa tct gcc cag gag tca cag aag gaa ctc aaa gaa atg ata 340 Ser Glu Lys Ser Ala Gln Glu Ser Gln Lys Glu Leu Lys Glu Met Ile 90 95 100 gaa acc ctt gcc cac aag ctg gat gag aaa tcc aag aaa cta atg gaa 388 Glu thr Leu Ala His Lys Leu Asp Glu Lys Ser Lys Lys Leu Met Glu 105 110 115 ctt cac cgc cag aac ctg aat ctc caa gaa gtt ctg aaa gag gca gca 436 Leu His Arg Gln Asn Leu Asn Leu Gln Glu Val Leu Lys Glu Ala Ala 120 125 130 aac tat tca ggt cct tgt ccc caa gac tgg ctc tgg cat gaa gaa aac 484 Asn Tyr Ser Gly Pro Cys Pro Gln Asp Trp Leu Trp His Glu Glu Asn 135 140 145 150 tgt tac caa ttt tcc tct ggc tct ttt aat tgg gaa aaa agc cag gag 532 Cys Tyr Gln Phe Ser Ser Gly Ser Phe Asn Trp Glu Lys Ser Gln Glu 155 160 165 aac tgc ttg tct ttg gat gcc cac ttg ctg aag att aat agc aca gat 580 Asn Cys Leu Ser Leu Asp Ala His Leu Leu Lys Ile Asn Ser Thr Asp 170 175 180 gaa ctg gaa ttc atc cag caa atg att gcc cat tcc agt ttc ccc ttc 628 Glu Leu Glu Phe Ile Gln Gln Met Ile Ala His Ser Ser Phe Pro Phe 185 190 195 tgg atg ggg ttg tca atg agg aaa ccc aat tac tcg tgg ctt tgg gaa 676 Trp Met Gly Leu Ser Met Arg Lys Pro Asn Tyr Ser Trp Leu Trp Glu 200 205 210 gat ggt act cct ttg acg ccc cac ttg ttt aga att cag gga gct gtt 724 Asp Gly Thr Pro Leu Thr Pro His Leu Phe Arg Ile Gln Gly Ala Val 215 220 225 230 tcc cgt atg tat cct tca ggg acc tgt gca tat att caa agg gga act 772 Ser Arg Met Tyr Pro Ser Gly Thr Cys Ala Tyr Ile Gln Arg Gly Thr 235 240 245 gtt ttt gct gaa aac tgc att tta act gca ttc agt ata tgt caa aag 820 Val Phe Ala Glu Asn Cys Ile Leu Thr Ala Phe Ser Ile Cys Gln Lys 250 255 260 aag gcg aat cta ttg aga gca cag tga atttgaagga tctggaggaa 867 Lys Ala Asn Leu Leu Arg Ala Gln 265 270 aagaaggaaa cctttgaatt ctcttctgga atttaagcta tacttcatca cttagatgta 927 aaccattaga gcccagggaa atgcctgcta ctggttgagt gcagaactcc ttagcagaga 987 ctggcccagc tgcctggcac cttgatagca aaagttgcaa ttccctctgt atatttttcc 1047 ctaacttgtt ccaagtcctc ccctgcagga cttcagagaa gtcaattttt ctgtttccat 1107 tgtttctaag aacttgttgc ctaactcaag gtcacagcat ttttctcact tttgtcctat 1167 gctttcttct aggcattgta gagttttaga ttttacatgg aaatctagaa cttattttag 1227 attaatttct aagtgatata tggatgtatg gaagttttct gtttgttttt tgcttgtgag 1287 tattcaattg tttttgcaac atttgctgaa aagactattc ttccttcact acattgcctt 1347 tgcactgttg tcaacaatta tccatacatg cctggctcta tttctggatt ttctattcct 1407 ttccatttat ttatttatta ttcttggctt acaacatcac catgatattt tgaattctat 1467 ggttctttaa tatatcttgg aatcacatgg tagtagttat tcattgttgt tcttttttag 1527 agttgtttgg ttaatctatg cttttgtatt tctgtcttaa attggcttgt ccatttctaa 1587 aaaaacttga aattttgaat tgcactgaat ccatacataa atttagggaa aattgaattc 1647 ttaaaaatac tgatttgttc aactcatgaa aaaggtgtat tgctctattt aggtattcct 1707 tattttcttt aagcaatgct ttttaatgtt ctttgtgtag atattgttag attatcatca 1767 tgtatttcac attatttatg ctactgtaga tagtattgtt atcatttgtt gttcttattt 1827 tcaaagtctt ctgctagtat gtagaattat aataaagttt gatattaata ttaaaaaaaa 1887 aaaaaaaaaa 1897 <210> 7 <211> 1459 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Vector DNA of pCd5lneg1 containing genomic DNA comprising exons encoding a Fc region of human immunoglobulin IgG1 <400> 7 ctcgagatcc attgtgctct aaaggagata cccggccaga caccctcacc tgcggtgccc 60 agctgcccag gctgaggcaa gagaaggcca gaaacc atg ccc atg ggg tct ctg 114 Met Pro Met Gly Ser Leu 1 5 caa ccg ctg gcc acc ttg tac ctg ctg ggg atg ctg gtc gct tcc gtg 162 Gln Pro Leu Ala Thr Leu Tyr Leu Leu Gly Met Leu Val Ala Ser Val 10 15 20 cta gcg gat ccc gag ggtgagtact aagcttcagc gctcctgcct ggacgcatcc 217 Leu Ala Asp Pro Glu 25 cggctatgca gccccagtcc agggcagcaa ggcaggcccc gtctgcctct tcacccggag 277 cctctgcccg ccccactcat gctcagggag agggtcttct ggctttttcc caggctctgg 337 gcaggcacag gctaggtgcc cctaacccag gccctgcaca caaaggggca ggtgctgggc 397 tcagacctgc caagagccat atccgggagg accctgcccc tgacctaagc ccaccccaaa 457 ggccaaactc tccactccct cagctcggac accttctctc ctcccagatt ccagtaactc 517 ccaatcttct ctctgca gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc 567 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 30 35 cca ccg tgc cca ggtaagccag cccaggcctc gccctccagc tcaaggcggg 619 Pro Pro Cys Pro 40 acaggtgccc tagagtagcc tgcatccagg gacaggcccc agccgggtgc tgacacgtcc 679 acctccatct cttcctca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc 730 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 45 50 ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct 778 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 55 60 65 gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc 826 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 70 75 80 85 aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca 874 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 90 95 100 aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgg gtg gtc agc gtc 922 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 105 110 115 ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc 970 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 120 125 130 aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc 1018 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 135 140 145 aaa gcc aaa ggtgggaccc gtggggtgcg agggccacat ggacagaggc 1067 Lys Ala Lys 150 cggctcggcc caccctctgc cctgagagtg accgctgtac caacctctgt cctaca ggg 1126 Gly cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag 1174 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 155 160 165 ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat 1222 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 170 175 180 185 ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac 1270 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 190 195 200 aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc 1318 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 205 210 215 ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac 1366 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 220 225 230 gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg 1414 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 235 240 245 cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tga gtgcgacggc cg 1459 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 250 255 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(27) <400> 8 ggggatcctg atctcataaa gaaacag 27 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(28) <400> 9 gcggatcctg tgctctcaat agattcgc 28 <210> 10 <211> 1921 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: DNA consisting of a DNA encoding an extracellular region of bovine LOX-1 and genomic DNA comprising exons encoding a Fc region of human immunoglobulin IgG1 <400> 10 gat ctc ata aag aaa cag caa gca aat att act cac cag gaa gat atc 48 Asp Leu Ile Lys Lys Gln Gln Ala Asn Ile Thr His Gln Glu Asp Ile 1 5 10 15 ctg gag gga cag att tta gcc cag cgc cga tca gaa aaa tct gcc cag 96 Leu Glu Gly Gln Ile Leu Ala Gln Arg Arg Ser Glu Lys Ser Ala Gln 20 25 30 gag tca cag aag gaa ctc aaa gaa atg ata gaa acc ctt gcc cac aag 144 Glu Ser Gln Lys Glu Leu Lys Glu Met Ile Glu Thr Leu Ala His Lys 35 40 45 ctg gat gag aaa tcc aag aaa cta atg gaa ctt cac cgc cag aac ctg 192 Leu Asp Glu Lys Ser Lys Lys Leu Met Glu Leu His Arg Gln Asn Leu 50 55 60 aat ctc caa gaa gtt ctg aaa gag gca gca aac tat tca ggt cct tgt 240 Asn Leu Gln Glu Val Leu Lys Glu Ala Ala Asn Tyr Ser Gly Pro Cys 65 70 75 80 ccc caa gac tgg ctc tgg cat gaa gaa aac tgt tac caa ttt tcc tct 288 Pro Gln Asp Trp Leu Trp His Glu Glu Asn Cys Tyr Gln Phe Ser Ser 85 90 95 ggc tct ttt aat tgg gaa aaa agc cag gag aac tgc ttg tct ttg gat 336 Gly Ser Phe Asn Trp Glu Lys Ser Gln Glu Asn Cys Leu Ser Leu Asp 100 105 110 gcc cac ttg ctg aag att aat agc aca gat gaa ctg gaa ttc atc cag 384 Ala His Leu Leu Lys Ile Asn Ser Thr Asp Glu Leu Glu Phe Ile Gln 115 120 125 caa atg att gcc cat tcc agt ttc ccc ttc tgg atg ggg ttg tca atg 432 Gln Met Ile Ala His Ser Ser Phe Pro Phe Trp Met Gly Leu Ser Met 130 135 140 agg aaa ccc aat tac tcg tgg ctt tgg gaa gat ggt act cct ttg acg 480 Arg Lys Pro Asn Tyr Ser Trp Leu Trp Glu Asp Gly Thr Pro Leu Thr 145 150 155 160 ccc cac ttg ttt aga att cag gga gct gtt tcc cgt atg tat cct tca 528 Pro His Leu Phe Arg Ile Gln Gly Ala Val Ser Arg Met Tyr Pro Ser 165 170 175 ggg acc tgt gca tat att caa agg gga act gtt ttt gct gaa aac tgc 576 Gly Thr Cys Ala Tyr Ile Gln Arg Gly Thr Val Phe Ala Glu Asn Cys 180 185 190 att tta act gca ttc agt ata tgt caa aag aag gcg aat cta ttg aga 624 Ile Leu Thr Ala Phe Ser Ile Cys Gln Lys Lys Ala Asn Leu Leu Arg 195 200 205 gca cag gat ccc gag ggtgagtact aagcttcagc gctcctgcct ggacgcatcc 679 Ala Gln Asp Pro Glu 210 cggctatgca gccccagtcc agggcagcaa ggcaggcccc gtctgcctct tcacccggag 739 cctctgcccg ccccactcat gctcagggag agggtcttct ggctttttcc caggctctgg 799 gcaggcacag gctaggtgcc cctaacccag gccctgcaca caaaggggca ggtgctgggc 859 tcagacctgc caagagccat atccgggagg accctgcccc tgacctaagc ccaccccaaa 919 ggccaaactc tccactccct cagctcggac accttctctc ctcccagatt ccagtaactc 979 ccaatcttct ctctgca gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc 1029 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 215 220 cca ccg tgc cca ggtaagccag cccaggcctc gccctccagc tcaaggcggg 1081 Pro Pro Cys Pro 225 acaggtgccc tagagtagcc tgcatccagg gacaggcccc agccgggtgc tgacacgtcc 1141 acctccatct cttcctca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc 1192 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 230 235 ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct 1240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 240 245 250 255 gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc 1288 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca 1336 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgg gtg gtc agc gtc 1384 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc 1432 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc 1480 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 320 325 330 335 aaa gcc aaa ggtgggaccc gtggggtgcg agggccacat ggacagaggc 1529 Lys Ala Lys cggctcggcc caccctctgc cctgagagtg accgctgtac caacctctgt cctaca 1585 ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat 1633 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 340 345 350 gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc 1681 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 355 360 365 370 tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag 1729 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 375 380 385 aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc 1777 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 390 395 400 ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg 1825 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 405 410 415 aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac 1873 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 420 425 430 acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tga gtgcgacggc cg 1921 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445

【０１１２】「配列表フリーテキスト」配列番号：３他の情報：ウシLOX-1の細胞外領域とヒトイムノグロブ
リンIgG1のＦcとからなる融合タンパク。配列番号：４他の情報：ウシLOX-1の細胞外領域とヒトイムノグロブ
リンIgG1のＦcとからなる融合タンパクをコードするDN
A。配列番号：７他の情報：ヒトイムノグロブリンIgG1のＦcをコードす
るエクソンを含むゲノミックDNAを含むベクター（pCd5l
neg1）DNA。配列番号：８他の情報：人工的に合成したプライマー配列。配列番号：９他の情報：人工的に合成したプライマー配列。配列番号：１０他の情報：ウシLOX-1の細胞外領域をコードするDNAとヒ
トイムノグロブリンIgG1のＦcをコードするエクソンを
含むゲノミックDNA。

【０１１３】

【図面の簡単な説明】

【図1】免疫グロブリン（ＩｇＧ）の構造を模式的に表
した図。

【図２】プラスミドpBLOX-1-Fcにおける、ウシLOX-1の
細胞外領域をコードするｃＤＮＡとベクターＤＮＡとの
連結の状態を模式的に示す図。

【図３】ウェスタンブロッティングアッセイにおける、
組換え融合ポリペプチド（bLOX-1-Fc）の電気泳動パタ
ーンを示す図。

【図４】本発明の定量法によるウサギ由来酸化ＬＤＬ標
準物質の検量線を示す図。

【図５】本発明の定量法によるヒト由来酸化ＬＤＬ標準
物質の検量線を示す図。

【図６】本発明の定量法により測定した正常ウサギ及び
高脂血漿モデルウサギの血漿中の酸化ＬＤＬの量を示す
図。

【図７】本発明の定量法によるウサギ由来酸化ＬＤＬ標
準物質の検量線を示す図。

【図８】本発明の定量法によるヒト由来酸化ＬＤＬ標準
物質の検量線を示す図。

【図９】本発明の定量法により測定した健常人及び高脂
血症患者の血清中の変性ＬＤＬの量を示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 1/22 Ｃ０７Ｋ 14/705 ４Ｈ０４５ 14/705 16/46 16/46 17/00 17/00 19/00 19/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＷＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）Ｇ０１Ｎ 33/53 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91）Ｃ１２Ｒ 1:91）Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:91）Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA20 BA53 BA61 BA63 CA04 CA07 DA02 EA04 GA11 GA13 HA11 4B064 AG20 AG26 AG27 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 DA20 4B065 AA90X AA90Y AB01 AB05 AC14 BA02 BA08 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA01 AA02 AA06 AA07 BA01 BA22 BA41 BA44 CA18 CA20 DA39 DC50 ZA452 ZC332 4C085 AA13 AA14 AA17 AA18 BB13 BB33 BB34 BB35 BB36 DD63 DD88 GG02 GG03 GG04 GG05 GG06 GG08 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA50 DA75 DA76 EA24 EA50 EA61 FA72 FA74 FA80 HA05 HA06

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】哺乳動物の酸化ＬＤＬ受容体の細胞外領
域と哺乳動物の免疫グロブリン（Ｉｇ）の重鎖の一部と
からなる融合ポリペプチド。
【請求項２】哺乳動物の免疫グロブリンが、ヒトの免
疫グロブリンであることを特徴とする請求項１に記載の
融合ポリペプチド。
【請求項３】免疫グロブリンが、ＩｇＧであることを
特徴とする請求項１または請求項２に記載の融合ポリペ
プチド。
【請求項４】免疫グロブリンの重鎖の一部が、免疫グ
ロブリンの重鎖の定常領域または定常領域の一部である
ことを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれかに記
載の融合ポリペプチド。
【請求項５】定常領域の一部が、ＩｇＧ、ＩｇＡまた
はＩｇＤのヒンジ領域、Ｃ２ドメイン及びＣ３ドメイン
からなることを特徴とする請求項４に記載の融合ポリペ
プチド。
【請求項６】定常領域の一部が、ＩｇＭまたはＩｇＥ
のＣ２ドメイン、Ｃ３ドメイン及びＣ４ドメインからな
ることを特徴とする請求項４に記載の融合ポリペプチ
ド。
【請求項７】哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖の一部
が、ヒトのＩｇＧのヒンジ領域、Ｃ２ドメイン及びＣ３
ドメインからなることを特徴とする請求項１に記載の融
合ポリペプチド。
【請求項８】哺乳動物の酸化ＬＤＬ受容体が、ヒトの
酸化ＬＤＬ受容体であることを特徴とする請求項１乃至
請求項７のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項９】ヒトの酸化ＬＤＬ受容体が、配列番号１
に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドであることを特徴とする
請求項８に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１０】哺乳動物の酸化ＬＤＬ受容体が、ウシ
の酸化ＬＤＬ受容体であることを特徴とする請求項１乃
至請求項７のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項１１】ウシの酸化ＬＤＬ受容体が、配列番号
２に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のア
ミノ酸配列を有するポリペプチドであることを特徴とす
る請求項１０に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１２】配列番号３に記載のアミノ酸配列と同
一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する融合ポリ
ペプチド。
【請求項１３】請求項１乃至請求項１２のいずれかに
記載の融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１４】配列番号４または配列番号１０のいず
れかに記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項１５】請求項１３または請求項１４に記載の
ＤＮＡを含むことを特徴とするベクター。
【請求項１６】請求項１５に記載のベクターで形質転
換されていることを特徴とする形質転換細胞。
【請求項１７】不溶性担体に請求項１乃至請求項１２
のいずれかに記載の融合ポリペプチドが固定化されてい
ることを特徴とする融合ポリペプチド固定化不溶性担
体。
【請求項１８】不溶性担体が、プレート、試験管、チ
ューブ、ビーズ、ボール、フィルター及びメンブレンか
らなる群から選ばれる不溶性担体であることを特徴とす
る請求項１７に記載の融合ポリペプチド固定化不溶性担
体。
【請求項１９】不溶性担体が、フィルター若しくはメ
ンブレン、またはアフィニティーカラムクロマトグラフ
ィーに用いられる不溶性担体であることを特徴とする請
求項１７に記載の融合ポリペプチド固定化不溶性担体。
【請求項２０】請求項１７若しくは請求項１８に記載
の融合ポリペプチド固定化不溶性担体、または請求項１
乃至請求項１２のいずれかに記載の融合ポリペプチドを
含んでなることを特徴とし、酸化ＬＤＬの検出または定
量に用いられるキット。
【請求項２１】請求項１７若しくは請求項１８に記載
の融合ポリペプチド固定化不溶性担体、または請求項１
乃至請求項１２のいずれかに記載の融合ポリペプチドを
用いることを特徴とするイムノアッセイにより酸化ＬＤ
Ｌを検出または定量する方法。
【請求項２２】少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）の工
程を含むイムノアッセイにより酸化ＬＤＬを検出または
定量する請求項２１に記載の方法。（ａ）請求項１７または請求項１８に記載の融合ポリペ
プチド固定化不溶性担体に、試料を反応せしめる工程。（ｂ）該融合ポリペプチド固定化不溶性担体と該試料中
に含まれる酸化ＬＤＬとの結合により形成される複合体
に、単独でまたは他の物質と反応することにより検出可
能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識さ
れた抗体であって、酸化ＬＤＬまたはアポリポプロテイ
ンＢに反応性を有する抗体を反応せしめる工程。
【請求項２３】少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）の工
程を含むイムノアッセイにより酸化ＬＤＬを検出または
定量する請求項２１に記載の方法。（ａ）単独でまたは他の物質と反応することにより検出
可能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識
された抗体であって、酸化ＬＤＬまたはアポリポプロテ
インＢに反応性を有する抗体と、試料を反応せしめる工
程。（ｂ）該抗体と該試料中に含まれる酸化ＬＤＬとの結合
により形成される複合体と、請求項１７または請求項１
８に記載の融合ポリペプチド固定化不溶性担体を反応せ
しめる工程。
【請求項２４】少なくとも下記（ａ）の工程を含むイ
ムノアッセイにより酸化ＬＤＬを検出または定量する請
求項２１に記載の方法。（ａ）請求項１７または請求項１８に記載の融合ポリペ
プチド固定化不溶性担体、単独でまたは他の物質と反応
することにより検出可能なシグナルをもたらすことがで
きる標識物質で標識された抗体であって、酸化ＬＤＬま
たはアポリポプロテインＢに反応性を有する抗体、及び
試料を含む混合物を反応せしめる工程。
【請求項２５】少なくとも下記（ａ）の工程を含むイ
ムノアッセイにより酸化ＬＤＬを検出または定量する請
求項２１に記載の方法。（ａ）請求項１７または請求項１８に記載の融合ポリペ
プチド固定化不溶性担体に、試料、並びに単独でまたは
他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをも
たらすことができる標識物質で標識された酸化ＬＤＬの
標準物質を反応せしめる工程。
【請求項２６】請求項１７または請求項１９に記載の
融合ポリペプチド固定化不溶性担体を含んでなることを
特徴とし、酸化ＬＤＬの分離または精製に用いられるキ
ット。
【請求項２７】請求項１７または請求項１９に記載の
融合ポリペプチド固定化不溶性担体を用いたアフィニテ
ィークロマトグラフィーを用いることを特徴とする酸化
ＬＤＬを分離または精製する方法。
【請求項２８】アフィニティクロマトグラフィーがア
フィニティーカラムクロマトグラフィーである請求項２
７に記載の酸化ＬＤＬの精製方法。
【請求項２９】配列番号１に記載のアミノ酸配列を有
するヒトの酸化ＬＤＬ受容体の細胞外領域とヒトの免疫
グロブリンの重鎖の一部とからなる融合ポリペプチド、
及び薬学的に許容されうる担体とを含んでなる医薬組成
物。
【請求項３０】免疫グロブリンの重鎖の一部が、免疫
グロブリンの重鎖の定常領域または定常領域の一部であ
ることを特徴とする請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】医薬組成物が、動脈硬化症または高脂
血症の予防または治療のために用いられるものであるこ
とを特徴とする請求項２９または請求項３０に記載の医
薬組成物。