JP2001505298A - 核酸推定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、核酸物質の特性あるいはパラメーターが核酸物質の電気伝導性と相関性を有していることを利用する、核酸物質の性質あるいはパラメーターの推定方法である。本発明方法は、電気伝導性と前記性質及びパラメーター間の所定の相関性を参照して、核酸物質の電気伝導性測定と前記測定結果から該核酸物質の性質及びパラメーターを推定することから成るものである。本発明は、しばしば望まれる核酸の定量が核酸溶液の伝導性を測定することによって算定可能であるとの核酸の重要な特性の発見に基づくものである。このような特性上の変化は電気伝導性についても対応変化として表れる。溶液中の核酸濃度及びある種の核酸の分子量は、本発明によって測定可能な重要な特性の例である。

Description

【発明の詳細な説明】 核酸推定方法技術分野 本発明は、核酸の推定方法、より具体的には核酸のパラメーターの特性の推定 に関する。本発明は、特に溶液中の核酸濃度測定（定量）及び核酸分子の分子量 測定（サイジング）に関する。背景技術 従来、ＤＮＡ濃度はＤＮＡ分子のヌクレオチド環構造による紫外線（およそ２ ６０ｎｍ）の特徴的吸収に基づく測定法である分光光度計法により測定されてい た。分子量測定に際しては、通常アガロースゲル電気泳動によってＤＮＡ分子を 分離し、次いで分離されたＤＮＡ分子は臭化エチジウム色素を用いて可視化され る。ＤＮＡは、紫外線（およそ３００ｎｍ）による蛍光発光後続励起を測定し、 既知量の標準品と比較することにより、アガロースゲル中で定量することも可能 である。しかし、いずれの方法にも本質的な欠陥がある。ＵＶ分光光度計は高価 な石英製のキュベットの使用を必要とする高価な装置であり、かなり大量のサン プルを損傷させる処理を要するものである。臭化エチジウムを使用してＤＮＡの 可視化及び定量を行う方法は安価な別法となり得るが、極めて高い毒性及び発癌 性の問題から望ましい方法とは言えない。発明の開示 本発明は、核酸物質の性質又はパラメーターが核酸物質の電気伝導性と相関性 を有することを利用した、核酸物質の性質あるいはパラメーターの推定方法から 成るものである。その方法は、電気伝導性と前記性質及びパラメーター間の所定 相関性を参照して、核酸物質の電気伝導性測定と該測定結果から該核酸物質の性 質及びパラメーターを推定することから成るものである。 本発明は、しばしば望まれる核酸の定量が核酸溶液の伝導性を測定することに よって算定可能であるとの核酸の重要な特性の発見に基づくものである。このよ うな特性上の変化は電気伝導性についての対応する変化にも表れる。溶液中の核 酸濃度及びある種の核酸の分子量は、本発明によって測定可能な 重要な特性の例である。 本発明によれば、電気伝導性は、一定表面積の電極を用いて核酸物質溶液中を 流れる電流から便宜的に測定することが可能である。 本発明は、単一種の核酸の特性測定に特に重要なものである。しかしながら、 該核酸物質は必ずしも完全に精製されている必要はなく、本発明は少量の核酸に ついても、或いは、他種核酸をも含む他の物質を含んでいる核酸についても利用 することが可能である。 以下に、本発明の実施態様を、図を参照しながら実施例として述べる。図面の簡単な説明 図１は、ＤＮＡ濃度と電流／伝導率の相関図である。 図２は、供給周波数と伝導率の相関図である。 図３は、濃度と対数分子量の校正曲線である。 図４は、周波数に対するＤＮＡ分子の反応率（％）を示すグラフである。 図５は、反応勾配（％）と分子量の相関図である。実施例の説明 ＤＮＡ濃度は、一定既知の交流電流周波数に於ける電流／伝導率を測定するこ とによって決定することが可能である。何らかの一定周波数で記録した電流は、 ＤＮＡ濃度に比例していることが明らかとなっている。例えば、図１は２ＫＨｚ で記録された電流／伝導率がＤＮＡ濃度と如何に異なるかを示すものである。こ の相関性は単一核酸に適用できるのみならず、大きさの異なる分子について適用 可能である。本発明方法を実施する為の装置の設計に際しては、伝導率測定装置 が直ちに採用され、電流の流れと核酸濃度との一定の相関性に従って測定するこ とが可能である。実用上は、通常均一なＤＮＡ種に対応しているが一定範囲の分 子量には対応していない計器で校正することが好ましい。従って、サンプルは通 常まず適当な大きさにサイジングされ、その後に濃度測定に適当な核酸の設定が 示される。 ＤＮＡ種の分子量は、電極を介して加えられた各周波数に対するこれら分子の 反応から測定される。最大電流／伝導率反応の百分率（％反応率）として記録さ れた電流／伝導率を、２本の電極間に加えられた交流信号の周波数 に対してプロットすると、対応分子の分子量とは異なる特徴的な曲線が与えられ る（図２）。表１ 単−ＤＮＡ種に関しては、分子量はまず(周波数範囲が０−５×１０⁵Ｈｚ以上 の)周波数曲線に対する反応勾配を計算して決定することが可能である。次いで 勾配値は勾配に対してプロットされた長い分子量の勾配曲線（図３）と比較する ことができる。試験された全てのＤＮＡ分子に関しては、勾配値が大きければ大 きい程分子量は小さくなるように勾配は分子量に従って変動する。このような相 関性の根拠は、周波数の変化につれてＤＮＡ分子の運動性が変化し、周波数が増 加すると分子量の大きな分子が分子量の小さな分子と比較して変化に対応できな くなる為だと推定されている。 本発明に基づくＤＮＡ定量方法及び分子量測定方法は、従来方法に伴った問題 点を回避させる一方、これら従来の方法に存する多数の明らかな利点を 付与するものである。従い、本発明は分子量及び濃度の迅速かつ正確な測定を可 能とするものであり、より感度が高く正確であり、作業者に安全かつ少ないサン プル量で測定を可能とする測定方法である。 上記略述したＤＮＡのキャラクタリゼーションは、ＤＮＡを含む溶液中の２本 の細い白金電極線（銅、ステンレス等の他の金属を代用してもよい。）間の周波 数の調節された交流信号を用いて達成されている。通常、２本の細い伝導性電極 線間の一定の交流信号。この交流信号周波数範囲は０−１ＭＨｚであり、これら の電極を通して作用され、対応する伝導率は前記溶液を介して通過する電流とし て各周波数ごとに順に記録される。例えば、サンプルＤＮＡを少なくとも１０μ ｌの水あるいはＴＥ緩衝液中に溶解する。便宜上、５００μｌの標準プラスチッ クチューブを用いても良い。２本の細い白金性電極線を溶液中へ設置し、これを 交流１Ｖで作動する関数発生器へ接続する。溶液中へ０−１ＭＨｚの周波数を通 し、発生した電流を電流計を用いてｍＡ単位で測定する。ＤＮＡ濃度は、周波数 ２ＫＨｚで溶液中を通った電流を（一定の周波数での電流とＤＮＡ濃度に関する ）標準曲線を参照して計算する。他の周波数を用いても可能である。実施例の詳細な説明 溶液中のＤＮＡ分子の分子量が伝導率法によって測定できることの確認は、４ 種の異なるミリＱ水及びトリスＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液（塩基オリゴヌクレオチ ド２５、塩基対フラグメント７００、ｐＵＣ１８（＝２，６９０塩基対）及びラ ムダ（＝５０，０００塩基対）双方のＤＮＡ溶液と分子量の不明なＤＮＡを含む ５番目の溶液（ＵＮ）を調製することによって達成された。これらの溶液の伝導 率は、周波数２×１０⁴Ｈｚ−１０⁵Ｈｚの範囲にわたってｕＡ単位で測定した。 ＤＮＡの保存に用いられる最もありふれたバッファー中でＤＮＡ分子が精密に一 定の大きさに分離されることを示すような有為な差異はミリＱとＴＥ緩衝液間に は認められなかった。 分子量と伝導率との関係を確認する為、溶液を３反復調製し試験に供した。表 ２はこれを確認するものであり、その反復間での差異が軽微であることを示すも のである。表３は主要な伝導率をｕＡで、また最大伝導率を％で示す ものである。データを％反応率で表す主要な理由は、実験範囲での誤差は（表１ に示したように）小さいが、電流測定装置の調子によって実験ごとのｕＡの読み 取りに多大な誤差が生じる為である。しかし、（％反応率で表される）伝導率の 変化には、実験間で一定している傾向が認められるからである。 図４は、表３の平均％反応率データをグラフにプロットして示すものである。 ＤＮＡ溶液間での最も明らかな相違は傾斜の勾配である。この勾配を２×１０⁴ 及び４×１０⁵での伝導率から計算した場合、勾配と対数分子量間にほぼ直線的 な関係を認め得る（図５参照）。従って、この勾配を分子量の算出に利用するこ とが可能である。 図５から得られたサンプルＵＮの分子量は約１０４７ｂｐｓであり、これは同 一サンプルのアガロースゲル・サイジングで行った推定とよく一致している。 上記の通り、電流測定装置の調子によって実験ごとに大きな誤差が生ずる。こ れらの問題を解決する為に下記考案について述べる。製造に関する説明 ここで略述される技術は、核酸を一定の大きさにし、定量の為に使用すべき実 験室装置の基礎を創出することを意図するものである。本装置は、（核酸等の） 少量の溶液を正確に移す為にあらゆる分子生物学者が使用する道具であるピペッ トを基盤としている。ピペット・ユニットの本体中に生じた減圧状態を利用して ディスポーザブル・チップ（分離形ピペット先端）中へ溶液を引き上げる。これ により溶液の分配が行われる。ＤＮＡ−ピペットは、ピペット本体中に感知可能 な電子を閉じ込め保持している。本センサーはピペット・ユニットとは分離した ものであり、殺菌済あるいは未殺菌のディスポーザブル・チップ中へ差し込まれ ているものである。使用者はピペット・チップ中へサンプルを引き上げる。適当 量のサンプルが一旦引き上げられると、分子量及び濃度がピペットのディスプレ イ（例えばＬＣＤ）上に表示される。 前記センサーは、シリコン、ガラスあるいはポリカーボネート等の適当な基盤 上にすだれ状に配列形成された動作電極と対電極から成っている。補助 電極を使用してもよいが、特に必要ではない。電極に用いる素材は適当なもので あれば何でもよい。プラチナ・金・銀等の不活性金属、カーボン、黒鉛、カーボ ンペースト、プラチナインク、電子の移動が電子受容化合物又は電子供与化合物 によって介在されている変形電極を使用することも可能である。電極幾何学によ れば、いかなる便宜的な対称形状も可能である。単一の薄い電極線を形成し、す だれ状あるいは並列のセンサー装置を配列して成る球状、半球状、ディスク状、 リング状、直線状の電極を使用できる。電極は、マクロ、ミクロあるいはウルト ラミクロ・ディメンジョンであってもよい。先端部とピペット本体との連結は、 ピペット円筒部にあるインターフェイス／接点を介して行われる。 上述した装置はポータブル型計器である。利用法によっては独立して作動可能 な装置であることを要求される。例えば、多数のサンプルについて迅速な処理を 要求される場合である。本実施態様は同様に重要なサンプルを通しで扱う他の装 置にも利用できる。特に、微量滴定技術によれば、大量のサンプルを標準のプレ ート状の型を用いて篩にかけることも可能である。本技術はスクリーニング及び 診断学研究分野で利用可能であろう。 表２：各周波数に対するＤＮＡ溶液の伝導率（μＡ） 表３：各周波数に対するＤＮＡ溶液の伝導率（μＡ及び％反応率） 本特許出願の優先権主張の基礎となるイギリス特許出願第96 04292号中の開示 及び該イギリス特許出願に添付の要約中の開示をここに引用して合体する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年２月１９日（１９９８．２．１９） 【補正内容】 １３． 核酸物質の電気伝導率が測定可能な伝導率測定装置と、電気伝導率と前 記特性あるいはパラメーターとの所定の相関性を参照して電気伝導率の測定値か ら核酸物質の特性あるいはパラメーターを推定する装置から構成される、先行す るいずれかの請求項に記載の方法を実施する為の装置。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 コッブ ベンジャミン デヴィッド イギリス国 ビーエー２ ７エーワイ バ ス、スクール オブ バイオロジー アン ド バイオケミストリ、ユニバーシティー オブ バス

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 核酸物質の特性あるいはパラメーターが核酸物質の電気伝導率と相関性 を有し、核酸物質の電気伝導率を測定する手段と、該電気伝導率と前記特性ある いはパラメーター間の所定の相関性を参照して前記測定値から核酸物質の特性あ るいはパラメーターを推定する手段から成る、核酸物質の特性あるいはパラメー ターの推定方法。 ２． 推定されるパラメーターが核酸溶液中の核酸濃度であることを特徴とす る請求項１に記戟の推定方法。 ３． 核酸物質が主として単一種の核酸から成っていることを特徴とする請求 項２に記載の推定方法。 ４． 推定される特性が核酸の分子量であることを特徴とする請求項１に記載 の推定方法。 ５． 異なる周波数にわたる交流電流を用いて核酸含有溶液の伝導率を測定す ることことを特徴とする請求項４に記載の推定方法。 ６． 核酸の分子量を、分子量と電気電流／周波数反応の特徴曲線又はその一 部との所定の相関性から推定することを特徴とする請求項５に記載の推定方法。 ７． 前項記載の相関性が分子量と周波数曲線に対する反応勾配に関するもの であることを特徴とする請求項６に記載の推定方法。 ８． 推定される特性が一定範囲の核酸種に対する分子量の全体的表示である 請求項４−７のいずれかに記載の推定方法。 ９． 測定が所定の相関性に従って予め校正されている装置を用いて行われる ことを特徴とする先行するいずれかの請求項に記載の推定方法。 １０． 前記装置が、分子量／伝導率相関性及び濃度／伝導率相関性の双方に関 して予め校正されていることを特徴とする請求項６に記載の推定方法。 １１． 伝導率が核酸物質溶液を通して流れる交流電流の測定によって測定され ることを特徴とする先行するいずれかの請求項に記載の推定方法。 １２． 核酸がＤＮＡである、先行するいずれかの請求項に記載の推定方法。 １３． 核酸物質の電気伝導率が測定可能な伝導率測定装置と、電気伝導率を測 定する手段及び前記交流電流に用いられる周波数を変化させる手段を備えた、先 行するいずれかの請求項に記載の方法を実施する為の装置。