JP2001187740A

JP2001187740A - 創傷治療剤

Info

Publication number: JP2001187740A
Application number: JP2000005305A
Authority: JP
Inventors: Mamoru Kiyougashima; 守京ヶ島; Yusuke Hori; 祐輔堀; Tokiko Sakai; 登紀子坂井
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 2000-01-05
Filing date: 2000-01-05
Publication date: 2001-07-10

Abstract

(57)【要約】【課題】従来の治療法及び治療剤では十分な臨床効果
が認められなかった表面組織の損傷、特に、火傷、皮膚
潰瘍、褥瘡等の創傷を有効に治療することができ、しか
も、重篤な副作用を示すことがない創傷治療剤を提供す
る。【解決手段】特定のウロン酸組成、コンドロイチナー
ゼＢ消化率、硫酸基数、二糖組成を有するガラクトサミ
ノグリカンまたはその薬理学的に許容される塩を有効成
分とする創傷治療剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は創傷治療剤に関し、
より詳細には、火傷、皮膚潰瘍、褥瘡等を治療すること
ができる創傷治療剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】創傷とは、外科的切開による組織の傷、
消化管潰瘍、火傷、凍傷、裂傷（裂創）、擦過傷、切
創、皮膚潰瘍又は褥瘡等の表面組織の損傷である。

【０００３】創傷治癒には、表皮の形成が不可欠である
が、連続した物理刺激による血流不良や背景となる疾患
の影響により表皮を形成することが困難である場合が多
い。現在は創傷の治療方法として、人工皮膚等が使用さ
れているが、外科的手術が必要となり、細菌感染に弱い
ことが難点である。

【０００４】また現在、褥瘡、皮膚潰瘍の治療には、オ
ルセノン軟膏、アクトシン軟膏、プロスタンディン軟膏
（いずれも商品名）等が臨床で使用されているが、難治
性の創傷には十分な効果は得られなかった。

【０００５】油脂性基剤とコンドロイチン硫酸からなる
創傷治療剤が知られているが（特開平10-120577号）、
実際にはかなり高投与量でコンドロイチン硫酸を含む軟
膏等を使用しなければ効果は発揮されないため、製剤化
に工夫を要するだけでなく、コスト高にもなるものであ
った。

【０００６】また、硫酸デルマタンと身体温度において
ゲルである特定のポリオキシエチレン−ポリオキシプロ
ピレンブロック共重合体からなる組成物を火傷等によっ
て損傷された組織の処置剤として使用することも知られ
ているが（特公平7-76175号）、特定のガラクトサミノ
グリカンのみを有効成分として含む通常の製剤により創
傷治療効果が発揮されることは知られていなかった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、従
来の治療法及び治療剤では十分な臨床効果が認められな
かった表面組織の損傷、特に、火傷、皮膚潰瘍、褥瘡等
の創傷を有効に治療することができ、しかも、重篤な副
作用を示すことがない創傷治療剤を提供することを目的
とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、糖尿病マ
ウスを用いた皮膚欠損モデルにおいて、特定の性質を有
するガラクトサミノグリカンあるいはその薬理学的に許
容される塩の創傷治癒促進効果を試験し、その結果、該
ガラクトサミノグリカンあるいはその薬理学的に許容さ
れる塩が、創傷治癒促進作用を示し、しかも安全性に優
れており、長期使用に耐え得ることを見いだした。

【０００９】従って本発明は、下記特性を有するガラク
トサミノグリカンあるいはその薬理学的に許容される塩
を有効成分として含有する創傷治療剤を提供する。

【００１０】（Ａ）構成糖におけるイズロン酸とグルク
ロン酸のモル比が約４０：６０〜約１００：０である。（Ｂ）コンドロイチナーゼＢによる消化率が約４０重量
％〜約１００重量％である。（Ｃ）構成二糖あたりの硫酸基数が約０．９〜約１．３
である。（Ｄ）コンドロイチナーゼＡＢＣで消化し、高速液体ク
ロマトグラフィーで分析して算出される構成二糖組成に
おいて、ΔDi-0Sで示される２−アセトアミド−２−デ
オキシ−３−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−スレオ−ヘ
キシ−４−エノピラノシルウロン酸）−Ｄ−ガラクト−
ス、ΔDi-4Sで示される２−アセトアミド−２−デオキ
シ−３−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−スレオ−ヘキシ
−４−エノピラノシルウロン酸）−４−Ｏ−スルホ−Ｄ
−ガラクト−ス及びΔDi-6Sで示される２−アセトアミ
ド−２−デオキシ−３−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−
スレオ−ヘキシ−４−エノピラノシルウロン酸）−６−
Ｏ−スルホ−Ｄ−ガラクトースの合計が約７１モル％〜
約９４モル％である。

【００１１】特開平10-120577号に記載の油脂性基剤と
コンドロイチン硫酸からなる創傷治療剤は実際にはかな
り高投与量のコンドロイチン硫酸を使用しており、また
この特許公報は、上記の本発明に使用されるもののよう
な特定の特性のガラクトサミノグリカンを開示していな
い。

【００１２】また本発明の創傷治療剤は、特定のポリオ
キシエチレン−ポリオキシプロピレンブロック共重合体
のような担体または基剤と組み合わせることなく治療効
果を発揮し得るという点において特公平7-76175号に開
示されるような公知の処置剤とは異なり、またこの特許
公報においても本発明に使用される特定の性質を有する
ガラクトサミノグリカンについては何等開示されていな
い。また、本発明の創傷治療剤は、火傷だけではなく、
難治性の皮膚潰瘍に対しても優れた治療効果を発揮でき
る。

【００１３】

【発明の実施の形態】一般的に「ガラクトサミノグリカ
ン」とは、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンとＤ−グ
ルクロン酸あるいはＬ−イズロン酸からなる二糖の繰り
返し構造を基本骨格とし、構成糖であるＮ−アセチル−
Ｄ−ガラクトサミンの４位もしくは６位、または／及び
Ｌ−イズロン酸もしくはＤ−グルクロン酸の２位に硫酸
基を有するグリコサミノグリカンの総称で、デルマタン
硫酸及びコンドロイチン硫酸を意味する(Annu. Rev. Bi
ochem., 60, 443-457, 1991)。

【００１４】ガラクトサミノグリカンを酵素（リアー
ゼ）で分解すると下記一般式Ｉで示される不飽和二糖が
生成する。この不飽和二糖組成を分析すれば、ガラクト
サミノグリカンの上記構成二糖単位における硫酸基の数
及び結合位置を解析することができる。このような不飽
和二糖における硫酸基の数及び結合位置による異性体を
下記表１にまとめる。

【００１５】

【化１】式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３は水素原子またはＳＯ_３ ^―を示
し、Ａｃはアセチル基を示す。

【００１６】

【表１】また、上記各異性体の化学名は以下の通りである。

【００１７】ΔDi-0S：２−アセトアミド−２−デオキ
シ−３−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−スレオ−ヘキシ
−４−エノピラノシルウロン酸）−Ｄ−ガラクト−ス ΔDi-4S：２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−
（４−デオキシ−α−Ｌ−スレオ−ヘキシ−４−エノピ
ラノシルウロン酸）−４−Ｏ−スルホ−Ｄ−ガラクト−
ス ΔDi-6S：２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−
（４−デオキシ−α−Ｌ−スレオ−ヘキシ−４−エノピ
ラノシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−ガラクトー
ス ΔDi-diS_D：２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ
−（４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−スレオ−
ヘキシ−４−エノピラノシルウロン酸）−６−Ｏ−スル
ホ−Ｄ−ガラクトース ΔDi-diS_Ｅ：２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ
−（４−デオキシ−α−Ｌ−スレオ−ヘキシ−４−エノ
ピラノシルウロン酸）−４，６−ビス−Ｏ−スルホ−Ｄ
−ガラクトース ΔDi-diS_Ｂ：２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ
−（４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−スレオ−
ヘキシ−４−エノピラノシルウロン酸）−４−Ｏ−スル
ホ−Ｄ−ガラクトース ΔDi-triS：２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ
−（４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−スレオ−
ヘキシ−４−エノピラノシルウロン酸）−４，６−ビス
−Ｏ−スルホ−Ｄ−ガラクトース

【００１８】上記ガラクトサミノグリカンは、通常、ウ
シ、ブタ等のほ乳類または鶏、アヒル、七面鳥、鴨等の
鳥類の腸粘膜、皮膚、肺、腎臓、肝臓、膵臓、大動脈、
脾臓、脳、胸腺、軟骨、臍帯あるいは肉冠等の組織また
は臓器等を原料とし、破砕、抽出、酵素分解、有機溶媒
沈殿、塩析、塩溶、各種クロマトグラフィー等、グリコ
サミノグリカンの分離、精製に通常用いられる方法を適
宜組み合わせて分離、精製して製造することができる。
好ましくは、例えば鶏冠をプロテアーゼで加水分解して
タンパク質を分解し、加水分解液を濾過後、濾液を塩化
ナトリウム存在下でエタノール等のアルコールを用いて
ガラクトサミノグリカン画分を沈殿させて得ることがで
きる。必要に応じて、ヘパリン及びヘパラン硫酸（Hep/
HS）含量を低下させる場合は、回収した沈殿物から後述
する亜硝酸処理（Shively及びConradの方法、Biochemis
try, 15, 3932-3942(1976)）あるいはイオン交換クロマ
トグラフィー（WO95/09188）、またはこれらの両方の処
理操作の組合わせによりHep/HS等の夾雑物を除き、必要
に応じてアルコール沈殿、濾過、脱塩することによりガ
ラクトサミノグリカンを得ることができる。

【００１９】尚、このガラクトサミノグリカンの分離方
法は、上記方法に限定されることはなく、特公昭60−90
42、特公昭61−21241等に記載された公知の方法に準じ
て抽出、精製して得ることもできる。

【００２０】尚、ガラクトサミノグリカンの一例である
デルマタン硫酸としては、由来動物種及び組織または臓
器などによって平均分子量、硫酸含量、硫酸基の結合位
置、Ｄ−グルクロン酸含量が異なっていることが知られ
ている。代表的な原材料から得られるデルマタン硫酸の
物性、二糖組成の例を下記表２に示す（参考例１参
照）。

【００２１】

【表２】

【００２２】上記表のデルマタン硫酸は、本発明の前記
ガラクトサミノグリカンの例である。尚、上記牛腸、豚
腸、豚皮膚、鶏冠由来のデルマタン硫酸はWO95/09188記
載の方法によって得たものである。

【００２３】本発明の創傷治療剤の有効成分であるガラ
クトサミノグリカンとしては、前記（Ａ）〜（Ｄ）の性
質を有する限り、特に限定されるものではないが、好ま
しくは鳥類の組織または臓器、より好ましくは鶏冠から
抽出、分離されるものである。

【００２４】本発明の創傷治療剤に使用されるガラクト
サミノグリカンの塩は、薬理学的に許容される塩であれ
ばその種類は特に限定されるものではないが、アルカリ
金属塩及びアルカリ土類金属塩、例えば、ナトリウム
塩、カリウム塩、リチウム塩、カルシウム塩等が好まし
く、ナトリウム塩が特に好ましい（以下、特に断らない
限り、用語「ガラクトサミノグリカン」は、その薬理学
的に許容される塩も含めた意味で使用する）。

【００２５】また、本発明に使用されるガラクトサミノ
グリカンには、原材料から抽出、精製して得られた上記
のような修飾、分解等を受けていない物質だけではな
く、これらを化学的に修飾、あるいは分解したものも包
含される。例えば、哺乳動物由来のデルマタン硫酸を分
解して得られる分子量1600 Da〜10000 Da程度の比較的
低分子量のデルマタン硫酸も知られているが（Dol, F.
et al., J. Lab. Clin.Med., 1990, vol. 115, 43-51、
Bianchini, P. et al., Thrombosis and Heamostasis,
1991, vol. 65, 1315あるいは、Barbanti, M. et al.,
Thrombosis andHeamostasis, 1993, vol. 69, 147-15
1）、このような低分子デルマタン硫酸も上記（Ａ）〜
（Ｄ）の性質を有する限り、本発明のガラクトサミノグ
リカンに包含される。

【００２６】なお、本発明における「構成二糖組成」と
は、ガラクトサミノグリカンをコンドロイチナーゼABC
(コンドロイチンABCリアーゼ)で不飽和二糖に分解し、
酵素分解物をポリアミンシリカ担体カラムを用いた高速
液体クロマトグラフィーで分画化し、各不飽和二糖異性
体の含有量を分析する公知の方法（Yoshida K. et al.,
Anal. Biochem. 1989, vol. 177, No. 2, 327-332）に
より得られる不飽和二糖組成（モル％）をいうものであ
る。

【００２７】上記ガラクトサミノグリカンの重量平均分
子量は、約1,600Da〜約10万Da、好ましくは約23kDa〜約
45kDaである。

【００２８】また、上記ガラクトサミノグリカンの構成
糖におけるイズロン酸とグルクロン酸のモル比は、約4
0：60〜約100：0の範囲であり、好ましくは約65：35〜
約90：10である。

【００２９】また、上記ガラクトサミノグリカンにコン
ドロイチナーゼBを作用させたときの消化率は約40重量
％〜約100重量％、好ましくは、約65重量％〜95重量％
である。ここでコンドロイチナーゼBを作用させたとき
の消化率とは、コンドロイチナーゼB消化パターンの分
析により得られる値であり、コンドロイチナーゼB消化
により消化されたものの百分率（重量％）を意味する。

【００３０】更に、上記ガラクトサミノグリカンの構成
二糖あたりの硫酸基数は、約0.9〜1.3の範囲であり、好
ましくは約0.9〜1.1の範囲である。

【００３１】更にまた、上記ガラクトサミノグリカンの
ΔDi-0S、ΔDi-4S及びΔDi-6Sの合計は、約71モル％〜
約94モル％であり、好ましくは、約90モル％〜約94モル
％である。

【００３２】更に、上記構成二糖のそれぞれの組成比は
特に限定されないが、ΔDi-0Sについては約0モル％〜15
モル％、好ましくは、約2モル％〜約15モル％が例示さ
れる。特に、鳥類の組織または臓器由来のガラクトサミ
ノグリカンはΔDi-0Sの比率が比較的高く、通常約2モル
％〜約15モル％、好ましくは約4モル％〜約10モル％で
ある。ΔDi-6Sについては約4モル％〜約40モル％、好ま
しくは、約4モル％〜約30モル％、ΔDi-4Sについては約
45モル％〜約100モル％、好ましくは、約60モル％〜約9
0モル％、ΔDi-diS_Dについては約0モル％〜約5モル％、
好ましくは、約0モル％〜約2モル％、ΔDi-diS_Bについ
ては約1モル％〜約15モル％、好ましくは、約0モル％〜
約2モル％、ΔDi-diS_Eは約0モル％〜約3モル％、好まし
くは、約0モル％〜約2モル％の比率を例示することがで
きる。

【００３３】上記のようなガラクトサミノグリカンを有
効成分とする本発明の創傷治療剤の投与経路は特に限定
されないが、非経口的投与が好ましく、通常は適当な基
剤に混合、溶解、分散等した前記ガラクトサミノグリカ
ンを創傷部位に塗布、貼付、噴霧等により経皮的または
局所的に投与する。眼、鼻、口腔等の粘膜に投与しても
よい。また、水等の適当な溶媒に溶解等して皮下、皮
内、筋肉内に注射することもできる。本発明の創傷治療
剤の剤型は特に限定されないが、軟膏剤、硬膏剤、貼付
剤、液剤、ローション、クリーム、ゲル、エアゾール
剤、スプレー剤（噴霧剤）、点鼻剤及び注射剤等が挙げ
られる。

【００３４】また、本発明の創傷治療剤は、有効成分と
してのガラクトサミノグリカンに加え、上記のような剤
型を形成するのに必要な親水性基剤、疎水性基剤、油
脂、ワックス、コレステロール等の基剤を含んでいても
よい。

【００３５】更に、本発明の創傷治療剤は必要に応じ、
医薬として許容される通常の安定剤、乳化剤、溶解剤、
増粘剤、界面活性剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調節剤等の補
助剤を適宜含有することができる。

【００３６】更にまた、本発明の創傷治療剤は、ステロ
イド剤、抗ヒスタミン剤、免疫抑制剤、抗菌剤、抗生物
質、抗炎症剤等の薬剤と併用することができる。

【００３７】尚、本発明において「治療」とは、対象疾
患の罹患後に事後的に患者に対して行う通常の意味での
治療だけでなく、特に潰瘍、褥瘡等の発生の防止のため
に事前に行う予防的処置も包含する。

【００３８】本発明の創傷治療剤の有効成分であるガラ
クトサミノグリカンの配合量並びに投与量は、その製剤
の投与方法、投与形態、使用目的、患者の具体的症状、
患者の体重等に応じて個別的に決定される事項であり、
特に限定されないが、患者に投与されるガラクトサミノ
グリカン量は、例えば成人に対し、１日あたり約1 mg/k
g〜200 mg/kg、好ましくは、2.5 mg/kg〜150 mg/kg程度
を例示することができる。

【００３９】また、本発明の創傷治療剤の投与回数は、
１日１回でもよく、１日２〜４回、またはそれ以上の回
数に分けて投与することもでき、そのような投与を必要
に応じて毎日、あるいは適当な日数をおいて必要な期間
投与することができる。

【００４０】本発明の創傷治療剤の適用対象は表面組織
の損傷であれば特に限定されず、擦過傷、打撲傷、裂
創、切創、刺創、割創、射創、咬創等の外力によって生
じる創傷；慢性再発性アフタ；ベーチェット病等により
生ずる表皮の損傷を伴うアフタ；単純疱疹、天疱瘡、壊
疽性濃皮症等により生じる主に外陰部潰瘍；静脈（鬱
血）性症候群、全身性エリテマトーデス、結節性多発動
脈炎等により生ずる主に下肢の潰瘍；基底膜細胞種、有
棘細胞種、ケラトアカントーマ等により生ずる主に顔面
の潰瘍；糖尿病性皮膚潰瘍；物理的、化学的な皮膚障
害、例えば、光線による皮膚障害、火傷、凍傷、褥瘡、
薬物による化学熱傷等に広く適用することができる。

【００４１】本発明の創傷治療剤の適用対象動物として
は、ヒトを含む哺乳動物（ヒト等の霊長類、犬、猫等の
愛玩動物、牛、豚、馬等の家畜等）、鶏等の鳥類が挙げ
られ、これらの動物の上記のような症状の予防、治療あ
るいは軽減に使用することができる。

【００４２】

【実施例】以下、本発明を参考例及び実施例により説明
するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００４３】参考例１ガラクトサミノグリカンナトリウム塩（ccgg）の調製

【００４４】鶏冠1,500 kgに水4000 Lを加えてミンチし
た後煮沸し、冷却後プロテアーゼ（プロナーゼ、科研製
薬（株）製）を添加して一晩加水分解した。加水分解液
に、塩化ベンザルコニウム溶液32 Lを加えた後、珪藻土
で濾過し、濾過上清を捨て、珪藻土180 kgを得た。

【００４５】この珪藻土に水350 Lと塩化ナトリウム42
kgを加えた後濾過し、濾液にエタノール250 Lを加え、
得られた沈殿物を乾燥させて粉体1.3 kgを得た。

【００４６】上記粉体を水1.3 Lに溶解して、10%溶液と
なるように調製し、前記のShively及びConradの方法(前
掲)により亜硝酸処理を行ってヘパリン及びヘパラン硫
酸を除去した。

【００４７】すなわち、上記粉体を溶解した溶液0.1％
亜硝酸水溶液に混和し、室温で10分間放置した後、沈殿
を濾過して除いた。濾液のpHを10.5に調整し、塩化ナト
リウムを終濃度1％になるように加え、さらにエタノー
ルを終濃度48％になるように30〜40分かけて攪拌しなが
ら加えた。得られた沈殿物に活性炭を加えて吸引濾過
し、濾液をイオン交換樹脂Diaion SA-12A（三菱化学
（株）製）に通して脱塩し、通過液にエタノールを加
え、ガラクトサミノグリカンナトリウム塩の精製品（cc
gg）105 gを得た。

【００４８】更に、上記と同様の方法でガラクトサミノ
グリカンナトリウム塩精製品を18ロット調製した。

【００４９】参考例２ガラクトサミノグリカンの分析（ａ）重量平均分子量の測定

【００５０】重量平均分子量は荒井らの方法（Biochim.
Biophys. Acta, 1117, 60-70, 1992）に準拠して求め
た。すなわち、分子量が既知のコンドロイチン硫酸（重
量平均分子量39100、18000、8050）及びヒアルロン酸ナ
トリウム（重量平均分子量104000）を標準品として高速
液体クロマトグラフィーを用いたゲル濾過（GPC-HPLC）
での溶出時間により決定した。カラムは、TSK gel G400
0 PW_XL、G3000 PW_XL及びG2500 PW_XL（各φ7.8×300mm、
東ソー（株）製）を連結したものを用いた。溶媒は0.2
mol/L塩化ナトリウム溶液を用い、流速は0.6 ml/分と
し、検出器は示差屈折率検出器（RI-8100、東ソー
（株）製）を用いた。

【００５１】（ｂ）コンドロイチナーゼＢ消化パターン
の分析 ccgg1％溶液100μLに緩衝液A（0.001 mol/L 酢酸カルシ
ウム、0.02 mol/L Tris-HCl、pH 7.5）10μLに0.03 Uの
コンドロイチナーゼB（生化学工業（株）製）を溶解し
たものを加え、37℃で2時間消化した。沸騰湯浴中で1分
加熱して反応を停止させ、消化物100μgに相当する10μ
Lを40℃でGPC-HPLCを用いて分析した。カラムはTSK gel
G4000 PW_XL、G3000 PW_XL及びG2500 PW_XL（各φ7.8×30
0 mm、東ソー（株）製）を連結したものを用いた。溶媒
は0.2 mol/L塩化ナトリウム溶液を用い、流速は0.6 mL/
分とし、検出器は示差屈折率検出器（RI-8100、東ソー
（株）製）及び紫外可視検出器（UV-8020、A230 nm、東
ソー（株）製）を使用した。

【００５２】（ｃ）構成二糖組成分析硫酸基位置の分析は、公知の方法、［新生化学実験講座
3、糖質II、p49-62（1991年、東京化学同人発行）に記
載の「2・8グリコサミノグリカン分解酵素とHPLCを組み
合わせた構造分析」参照］により以下のようにして行っ
た。

【００５３】すなわち、ccggをコンドロイチナーゼABC
（生化学工業（株）製）により完全に二糖に消化し、生
成した不飽和結合を含む二糖（不飽和二糖）群をGPC-HP
LCで分析した。

【００５４】さらにこの条件下では分離不能なΔDi-diS
_BとΔDi-diS_Eとを分離するために、消化物をさらにコン
ドロ−6−スルファターゼ（生化学工業（株）製）で消
化し、ΔDi-diS_EをΔDi-4Sにシフトさせ、同様にGPC-HP
LCで分析した。２つの結果を比較分析して構成二糖組成
を算出した。詳細を以下に記載する。

【００５５】（ｉ）コンドロイチナーゼABCによる消化 1％ ccgg溶液50μLに、緩衝液B（0.01 mol/L 酢酸ナト
リウム、0.05 mol/L Tris-HCl、pH 7.5）10μLに0.5U
のコンドロイチナーゼABCを溶解したものを加え、37℃
で２時間消化した。沸騰湯浴中で１分加熱して反応を停
止し、遠心分離により不純物を除去した。この分解物に
対し、緩衝液B 10μLに0.5UのコンドロイチナーゼABCを
溶解したものを加え、37℃で6時間消化した。沸騰湯浴
中で1分間加熱して反応を停止し、遠心分離により不溶
物を除去した（ｉｉ）コンドロ−6−スルファターゼによる消化

【００５６】コンドロイチナーゼABCによる消化物100μ
g相当に対し、緩衝液C（0.02 mol/LTris-AcOH、pH7.0）
50μLに0.25 Uのコンドロ−6−スルファターゼ（生化学
工業（株）製）を溶解したものを加え、37℃で24時間消
化し、遠心分離により不溶物を除去した。

【００５７】（ｉｉｉ）HPLCによる分析上記消化物、即ちコンドロイチナーゼABC消化液、ある
いはそれをさらにコンドロ−６−スルファターゼで消化
した消化液をそれぞれHPLCを用いて分析した。カラムは
YMC-Pack PA-120-S5イオン交換カラム（φ2.6×250 m
m、YMC（株）製）を用いた。

【００５８】流速1.5 mL/分で60分間に0.8 mol/Lリン酸
水素ナトリウムを2％から100％までの直線濃度勾配で流
した。不飽和コンドロ−二糖キット（生化学工業（株）
製）の溶出位置を基準として、この間に溶出する各種不
飽和二糖を232 nmで同定し、不飽和二糖と同定されたピ
ーク面積の総和を100％として計算して二糖組成を求め
た。

【００５９】（ｄ）極限粘度の測定極限粘度の測定は第13改正日本薬局方に準拠して行っ
た。測定装置には自動粘度測定装置（VMC-052、離合社
（株）製）を用いた。溶媒は0.2 mol/L塩化ナトリウム
溶液を用い、ウベローデ型粘度管の流下時間の測定にも
同じ溶液を用いた。粘度の測定は30±0.1℃で行い、流
下時間の百分の１秒を四捨五入し、差が3回連続して0.1
秒以内である測定値を極限粘度算出に用いた。

【００６０】極限粘度は還元粘度(ηred = (ts/t₀−1)/
C)［ts：溶液の流下時間、t₀：溶媒の流下時間、C：試
料濃度(重量％)］を縦軸に、濃度を横軸にプロットして
得られた直線を濃度0に補外したときの切片から求め
た。

【００６１】（ｅ）イズロン酸とグルクロン酸のモル比
の分析ガラクトサミノグリカン中のイズロン酸(IdoA)及びグル
クロン酸(GlcA)の含量測定

【００６２】本測定は、Karamanosらの方法（Analytica
l Biochemistry 172, 410-419, 1988）に従って行っ
た。即ち、5 mgのccggを500μgの蒸留水に溶解し、50 m
gの1-エチル-3,3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミ
ド（EDC）を添加し攪拌した。37℃にて20分放置した
後、次の1時間のうちに40 mMのHClを50μlずつ6〜7回添
加することにより溶液のpHを4〜5の間に保った。さらに
次の1時間において1 mlの2 Mテトラヒドロホウ酸ナトリ
ウム（NaBH₄）溶液を２回添加して50℃で還元反応を行
った。反応終了後室温まで冷却した後、氷酢酸を添加し
て過剰のNaBH₄を分解した。次いで流水透析を一晩行う
ことによって脱塩を行い、透析内液を凍結乾燥に付し
た。

【００６３】次いで、700μgの上記のccgg還元物につ
き、200μlの2 M TFA(トリフルオロ酢酸)を添加後、封
管して105℃にて6時間加水分解を行った。反応終了後、
3 mlの蒸留水を添加し、凍結乾燥した。次いで乾固物に
500μlの蒸留水を添加後、蒸留水で平衡化したDowex 50
-X8（H⁺型）に付し、非吸着画分を2 mlの蒸留水中に回
収した。これを凍結乾燥した後、500μlのピリジン溶液
（1 gの無水安息香酸と0.5 gの4-ジメチルアミノピリジ
ンをピリジンで10 mlに調整したもの）を添加し、37℃
で90分加熱した。4.5 mlの蒸留水を添加し攪拌すること
により反応を停止した後、SepPak-C18カートリッジカラ
ムにより脱塩処理を行った。

【００６４】上記により生成させたccggのウロン酸由来
中性糖のベンゾイル化物につき、HPLCで分析した。すな
わち、75%アセトニトリルで平衡化したCosmosil-5C18-P
カラム（φ4.6×150 mm）を装着した、Shimadzu HPLCシ
ステムを用い、1 ml/分の流速、40℃のカラムオーヴン
温度の条件下、230 nmのUVによる検出で分析を実施し
た。標準品として、ベンゾイル化1,6-アンハイドロイド
ース及びベンゾイル化グルコースを用いた。

【００６５】その結果、ベンゾイル化1,6-アンハイドロ
イドースは、約5.7分の保持時間に一本のピークとして
溶出され、一方、ベンゾイル化グルコースは、約12分の
保持時間においてα、βアノマーに相当するピークとし
て溶出された（図1参照）。また、検出波長のUV 230 nm
では、α、βベンゾイル化グルコースの検出強度を5と
すると、ベンゾイル化1,6-アンハイドロイドースのそれ
は3である。ピーク面積と検出強度を考慮して、ウロン
酸組成は、IdoA:GlcA（イズロン酸：グルクロン酸）=7
6.5:23.5と算出された。

【００６６】（ｆ）硫酸基数の測定構成二糖あたりの硫酸基数は、各ガラクトサミノグリカ
ンの不飽和二糖組成（モル％）に硫酸基個数の係数を乗
じることにより得られるものであり、下記式により求め
た。構成二糖あたりの硫酸基数（個） = [ΔDi-0Sのモル％
×0 + (ΔDi-6Sのモル％+ΔDi-4Sのモル％)×1 + (ΔDi
-diS_Dのモル％ + ΔDi-diS_Bのモル％ + ΔDi-diS _Eのモ
ル％)×2 + ΔDi-triSのモル％×3] ÷ 100

【００６７】（ｇ）結果表３には参考例１で調製したccggについての結果、表４
には参考例１で調製したccgg以外のガラクトサミノグリ
カンナトリウム塩18ロットについて上記（ａ）〜（ｆ）
と同じ方法で分析して得られた結果をまとめた。

【００６８】

【表３】

【００６９】

【表４】

【００７０】参考例3 鶏冠以外に由来するデルマタン硫酸の分析鶏冠以外に由来するガラクトサミンの例として、豚皮膚
または牛腎を原料とし、参考例１に準じた方法でデルマ
タン硫酸を製造し、参考例２の方法で分析を行った。結
果を表５に示す。尚、ここで使用した豚皮膚由来のデル
マタン硫酸は、表2に記載した豚皮膚由来デルマタン硫
酸とは異なるものである。

【００７１】

【表５】

【００７２】実施例１（製剤例）参考例１で得られたガラクトサミノグリカンナトリウム
塩（ccgg）の５％水溶液を調製し、下記組成の親水ワセ
リンと均一になるまで混合して創傷治療用軟膏剤（ccgg
軟膏）を調製した。

【００７３】サラシミツロウ（（株）セラリカＮＯＤＡ製） 80 g ステアリルアルコールまたはセタノール（日本油脂（株）製） 30 g コレステロール（関東化学（株）製） 30 g 白色ワセリン（島貿易（株）製）適量全量 1000 g また、表４のccgg以外のガラクトサミノグリカンナトリ
ウム塩18ロットについても同様に製剤化を行った。

【００７４】実施例２ラット背部皮膚欠損モデルを用いたガラクトサミノグリ
カンの創傷治癒効果の検討（１）実験材料動物は10週齢のSprague-Dawley系雌性ラット（SPF、日
本チャールスリバー）を用い、薬物としては実施例１の
ccgg軟膏を用いた。尚、対照群には親水ワセリンに水を
加えたエマルジョン（親水ワセリンエマルジョン）を使
用した。ccgg軟膏ならびに親水ワセリンエマルジョンに
防腐剤は加えないものを用いた。

【００７５】（２）モデル動物の作製ラットの背部をバリカンで毛刈りした後、除毛クリーム
を用いて除毛した。次に直径8 mmの眼科用トレパンで皮
膚を皮下まで切開し、眼科用バサミとピンセットを用い
て剥離し、完全皮膚欠損創を背部に２カ所作製した。

【００７６】（３）実験方法 10匹のラットに皮膚欠損創作製日から連日14日間、1日1
回0.1gのccgg軟膏を欠損創に塗布し、対照群として10匹
のラットに親水ワセリンエマルジョンを同様に塗布し
た。皮膚欠損部位の写真を撮影し、欠損部作製直後の面
積から測定時点の面積を差し引いた値を治癒面積とし
た。

【００７７】（４）結果対照群は、欠損部位作製後3日から欠損部の縮小が認め
られ、７日目には47％の欠損部縮小が認められた。ccgg
軟膏投与群では、投与後3日から創傷治癒効果が認めら
れ、7日目には74％の欠損部縮小が認められた。結果を
図２に示す。

【００７８】実施例３糖尿病マウス皮膚欠損モデルを用いたガラクトサミノグ
リカンの創傷治癒効果の検討（１）実験材料動物は22週齢の自然発症性糖尿病雌性マウス（SPF、ク
レア（株））を用い、薬物としては実施例１のccgg軟膏
を用いた。尚、対照群としては親水ワセリンエマルジョ
ンを使用した。ccgg軟膏ならびに親水ワセリンエマルジ
ョンに防腐剤は加えないものを用いた。

【００７９】（２）モデル動物の作製マウスの背部をバリカンで毛刈りした後、除毛クリーム
を用いて除毛した。次に直径8 mmの眼科用トレパンで皮
膚を皮下まで切開し、眼科用バサミとピンセットを用い
て剥離し、完全皮膚欠損創を背部に１カ所作製した。

【００８０】（３）実験方法 10匹のラットに皮膚欠損創作製日から連日21日間、1日1
回0.1 gのccgg軟膏を欠損創に塗布し、対照群として10
匹のマウスに親水ワセリンエマルジョンを同様に塗布し
た。

【００８１】皮膚欠損部位の写真を撮影し、欠損部作製
直後の面積から測定時点の面積を差し引いた値を治癒面
積とした。（４）結果対照群は、欠損部位作製後11日から欠損部の縮小が認め
られ、14日目には約15％の欠損部縮小が認められた。cc
gg軟膏投与群では、投与後11日目から創傷治療促進効果
が認められ、投与後14日目には53％の欠損部縮小が認め
られた。結果を図３に示す。

【００８２】上記の結果からガラクトサミノグリカン軟
膏は、糖尿病等による難治性皮膚潰瘍の治癒促進に有効
であることが示された。

【００８３】

【発明の効果】本発明の創傷治療剤によれば、従来の治
療法及び治療剤では十分な臨床効果が認められなかった
表面組織の損傷、特に、火傷、皮膚潰瘍、褥瘡等の創傷
を有効に治療することができ、しかも、重篤な副作用を
示すことがない創傷治療剤を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】参考例２(e)において、イズロン酸とグルク
ロン酸を高速液体クラマトグラフィーで測定した結果を
示す図である。

【図２】ラット背部皮膚欠損モデルに対するガラクト
サミノグリカンの創傷治癒効果を示すグラフである。＊
は危険率５％で有意差あり。

【図３】自然発症糖尿病マウス背部皮膚欠損モデルに
対するガラクトサミノグリカンの創傷治癒効果を示すグ
ラフである。＊は危険率５％で有意差あり。

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Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記特性を有するガラクトサミノグリカ
ンまたはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする
創傷治療剤；（Ａ）構成糖におけるイズロン酸とグルク
ロン酸のモル比が約４０：６０〜約１００：０である、
（Ｂ）コンドロイチナーゼＢによる消化率が約４０重量
％〜約１００重量％である、（Ｃ）構成二糖あたりの硫
酸基数が約０．９〜約１．３である、（Ｄ）コンドロイ
チナーゼＡＢＣで消化し、高速液体クロマトグラフィー
で分析して算出される構成二糖組成において、ΔDi-0S
で示される２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−
（４−デオキシ−α−Ｌ−スレオ−ヘキシ−４−エノピ
ラノシルウロン酸）−Ｄ−ガラクト−ス、ΔDi-4Sで示
される２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（４
−デオキシ−α−Ｌ−スレオ−ヘキシ−４−エノピラノ
シルウロン酸）−４−Ｏ−スルホ−Ｄ−ガラクト−ス及
びΔDi-6Sで示される２−アセトアミド−２−デオキシ
−３−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−スレオ−ヘキシ−
４−エノピラノシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−
ガラクトースの合計が約７１モル％〜約９４モル％であ
る。
【請求項２】ガラクトサミノグリカンの構成糖におけ
るイズロン酸とグルクロン酸のモル比が約６５：３５〜
約９０：１０であることを特徴とする請求項１に記載の
創傷治療剤。
【請求項３】コンドロイチナーゼＢによる消化率が約
６５重量％〜約９５重量％であることを特徴とする請求
項１に記載の創傷治療剤。
【請求項４】ガラクトサミノグリカンが鳥類の組織ま
たは臓器由来であることを特徴とする請求項１に記載の
創傷治療剤。
【請求項５】ガラクトサミノグリカンの重量平均分子
量が約１，６００Da〜約１０万Daであることを特徴とす
る請求項１に記載の創傷治療剤。
【請求項６】ガラクトサミノグリカンの重量平均分子
量が約23 kDa〜約45 kDaであることを特徴とする請求項
５に記載の創傷治療剤。
【請求項７】コンドロイチナーゼＡＢＣで消化し、高
速液体クロマトグラフィーで分析して算出される構成二
糖組成において、ΔDi-0Sで示される２−アセトアミド
−２−デオキシ−３−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−ス
レオ−ヘキシ−４−エノピラノシルウロン酸）−Ｄ−ガ
ラクト−スが約２〜約１５％であることを特徴とする請
求項１に記載の創傷治療剤。
【請求項８】火傷、皮膚潰瘍、および褥瘡からなる群
から選ばれた創傷の治療に使用される請求項１に記載の
創傷治療剤。