JPH06507635A - 病理学的過程の予防および／または治療用組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 病理学的過程の予防および／または治療用組成物１、発明の分野 本発明は、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）分泌の誘発を含む病理学的過程 の予防および／または治療用医薬組成物に関し、５日から８日間の間隔で投与さ れる低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）の低有効員投薬を含有する。

本発明において用いられるＬＭＷＨは、平均分子量が約３，０００から約６，０ ００で、Ｔ細胞特異抗原、Ｔ細胞マイトジェン、マクロファージ活性化物質、破 壊した細胞外マトリックス（ｄＣＥＭ）　、フィブロネクチン、ラミニンまたは 他のＥＣＭ構成成分による活性化に応答し、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでＴ細胞および／ またはマクロファージを休止させることによりＴＮＦ−α分泌を抑制する。

２、発明の背景 ＴＮＦ−αは、単核細胞（マクロファージ）およびＴリンノく球により産生され るサイトカインで、炎症性反応を生じさせる因子のカスケード（段階的温布）に おける主要要素であり、疾病状態を組織化する主要物質として多くの多形質発現 的効果を有して０る（Ｂ、　ＢｅｕｔｌｅｒおよびＡ、Ｃｅｒａｍｉ　、　Ａｎ ｎ、　Ｒｅｖ、　１ｍｍｕｎｏ１．　（１９８９）　７：６２５−６５５）。

ＴＮＦ−αの生物学的効果は、その濃度および産生部位に依る：低濃度では、Ｔ ＮＦ−αは望ましい恒常的および防御的機能を生じさせることができるが、高濃 度ではＴＮＦ−αは、全身的（こ、またはある組織において、他のサイトカイン 、とりわけインターロイキン−１（ＩＬ−１）と相乗作用を行うことができ、多 くの炎症反応を悪化させる。

下記の活性がＴＮＦ−α（ＩＬ−１とともに）により誘発されることが示されて いる；熱、徐波（ｓｌｏｗ−ｗａｖｅ）睡眠、血行力学的ショック、急性期タン パク質の生成増大、アルブミンの生成減少、血管内皮細胞の活性化、主要組織適 合性複合体（ＭＨＣ）分子の発現増大、リポ蛋白リパーゼの減少、チトクローム Ｐ４５０の減少、血漿亜鉛および鉄の減少、繊維芽細胞増殖、前液細胞コラゲナ ーゼの増大、サイクロ−オキシゲナーゼ活性の増大、Ｔ細胞およびＢ細胞の活性 化、およびサイトカイン類、ＴＮＦ−αそれ自体、ＩＬ−１およびＩＬ−６の分 泌誘発など。

ＴＮＦ−αがどのようにしてその効果を発揮するかということについての詳細は 知られていないが、効果の多くが、ＴＮＦ−αが細胞を刺激して細胞膜のアラキ ドン酸からプロスタグランジンおよびロイコトリエンを生成することができると いうことと関係があると考えられている。

ＴＮＦ−αは、その多形質発現的効果ゆえに、身体の多くの異なった器官におけ る種々の病理学的状態と関わっている。血管内では、ＴＮＦ−αは出血性ショッ クを促進し、内皮細胞トロンボモジュリンを調節して低下させ、前−血液凝固剤 （ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ）活性を高める。それは白血球の、およびたぶん血 小板の、血管壁への付着を惹起し、そして脈管炎のみならずアテローム性動脈硬 化症への過程を促進するであろう。

ＴＮＦ−αは血液細胞を活性化し、好中球、好酸球、単核細胞／マクロファージ 、ＴおよびＢリンパ球の付着を引き起す。ＩＬ−６およびＩＬ−８を誘発するこ とによって、ＴＮＦ−αは炎症性細胞の走化性ならびにそれら細胞の組織内への 浸透を増大させる。したがってＴＮＦ−αは、自己免疫疾患、アレルギーおよび 移植拒絶の組織損傷においである役割を担っている。

ＴＮＦ−αは、脂肪細胞の代謝活性を調節し、癌、慢性感染、慢性心不全、およ び慢性炎症に伴う、るいそうおよび悪液質の一因となっていることから、カケク チンとも呼ばれている。ＴＮＦ−αはまた、脂肪組織の消耗を高める一方、食欲 を抑制することにより、神経性食欲不振における役割もまた担うかもしれない。

ＴＮＦ−αは骨格筋および心筋に代謝効果を及ぼす。それはまた肝臓にも顕著な 効果を及ぼす：それはアルブミンおよびチトクロームＰ４５０の代謝を低下させ 、フィブリノーゲン、αｌ−酸性糖タンパク質および他の急性期タンパク質の生 成を増大させる。

それはまた腸の壊死も引き起し得る。

中枢神経系において、ＴＮＦ−αは、血液脳関門を通過し、熱、睡眠の増加およ び食欲不振を誘発する。ＴＮＦ−α濃度の増大は、多発性硬化症と関連性がある 。それはさらに副腎性出血を引き起し、ステロイドホルモンの生成に影響を与え 、皮膚中のコラゲナーゼとＰＧＥ−２を高め、モして枠骨細胞を活性化すること によって骨および軟骨を破壊する。

要するに、ＴＮＦ−αは自己免疫疾患、移植拒絶、脈管炎およびアテローム性動 脈硬化症における多くの望ましくない炎症状態の病因に含まれる。それは心不全 、癌への応答、および神経性食欲不振において役割を担っているかもしれない。

これらの理由により、種々の疾患を制御する手段としてＴＮＦ−αの分泌を調節 する方法がめられてきた。

免疫系の主要な機能は、微生物などの外来侵襲者による感染に対して個体を保護 することである。しかしながらそれは、個体自身の組織も攻撃して自己免疫疾患 として知られる病理学的状態へと導くかもしれない。移植された器官の望ましく ない拒絶反応の背後にある理由が、他側体からの組織に対する、個体の免疫系の 攻撃的反応である。外来物質に対する系の過反応性が喘息、鼻炎や湿疹などの症 状を示すアレルギーを引き起す。

これらの反応を支配している細胞はリンパ球、主として活性化Ｔリンパ球であり 、それらが支配する病理学的炎症性反応は、標的組織へ、および標的組織から、 血管壁を通して移動するそれらの能力に依存する。したがって、血管壁に付着し て、そこを通して浸透するというリンパ球の能力を低減させることによって、自 己免疫攻撃、移植拒絶およびアレルギーが防止されるであろう。

このことは、今日用いられている治療法に比べてより良好な効力と副作用の低減 化という結果をもたらす新たな治療学的原理を提供するだろう。

アテローム性動脈硬化症および脈管炎は、慢性および急性の病理学的脈管性炎症 の例である。アテローム性動脈硬化症は、冠状動脈疾患、心筋梗塞、大脳梗塞お よび末梢血管疾患に進展する動脈内部の肥大および硬化を含み、また西欧におけ る罹患率および死亡率の主な原因を示す。病理学上、アテローム性動脈硬化症は 、脂肪質と石灰質の沈着によって引き起された病変としてゆっくりとかつ慢性的 に進行する。繊維組織の増殖は、最終的には血管内腔の突然の閉塞を引き起し深 刻な状態へと導く。

ＴＮＦ−ａがｉｎ　ｖｉｔｒｏでヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）の複製を促進 し増大させるということ（Ｍａｔｓｕｙａｍａ、　Ｔ、　ｅｔ−１遺伝子発現を 刺激し、した　がって、たぶん潜在的にＨＩＶ−１に感染している個体にあって は臨床的にＡＩＤＳ進展の引き金となるということが示されている（Ｏｋａｍｏ ｔｏ、Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、、社亜Ｒｅｓ、）Ｉｕｍ、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ （１９８９）５（２）：　１３１−１３８）。

ヘパリンはグリコサミノグリカンで、多価陰イオンの硫酸化された多糖類であっ て、抗血栓剤として血液凝固を防止するために臨床的に用いられている。動物実 験では、ヘパリンが、自己免疫Ｔリンパ球の標的器官への到達能力を低減化させ ることが示された（Ｌｉｄｅｒ、Ｏ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｕｒ、Ｊ、　１ｍｍｕ ｎｏ１．（１９９０）２０：４９３−４９９）　ｏ　ヘパリンはまた、１日に１ 回、低投与量（マウスでは５μｇ、う・ソトでは２０μｇ）にて注射した場合、 ラットでは実験的自己免疫疾患を抑制し、マウスでは皮膚移植のモデルにおいて 同種異系移植片の生存を長引かせたということが示されている（Ｌｉｄｅｒ、　 ０．ｅｔａｌ、　、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　（＋９８９）８３ニ ア’５２−７５６）。

観測された効果の背後にあるメカニズムは、脈管壁の浸透に必要な酵素のＴリン パ球による放出を抑制することを含むと考えられており、該酵素は主に、血管の 内側を覆っている内皮上細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のグリコサミノグリカン 部分を特異的に攻撃する酵素ヘパラナーゼである（Ｎａｐａｒｓｔｅｋ、Ｙ、　 ｅｔ　ａｔ、、　Ｎａｔｕｒの実験的自己免疫脳を髄炎（ＥＡＥ）において、血 管壁を浸透し脳を攻撃するという自己免疫Ｔリンパ球の能力と関連性がある。

ヨーロッパ特許出願　ＥＰ　０１１４５８９　（Ｆｏｌｋｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、 ）は、は乳類における脈管形成抑制用組成物を記載しており、ここでその活性物 質は本質的に（１）ヘパリンまたはヘキササツカリドもしくはそれ以上のヘパリ ンフラグメント、および（２）コルチゾンまたはヒドロコルチゾンまたはヒドロ コルチゾンのｉｌ−α異性体から成る。開示によれば、ヘパリンそれ自体または コルチゾンそれ自体には効力がない；両者の組合わせによってのみ望ましい効果 が得られる。脈管形成と自己免疫疾患との間に関連性があるということは文献中 には何も証明されていないが、該特許出願の５頁目の記載により、脈管形成と乾 癖および関節炎とが関連付けられ、１日当たりヘパリン２５，０００ユニツトか ら４７．０００ユニツトの高投与量の使用が示されている。

Ｈｏｒｖａｔｈ、Ｊ、Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｕ５ｔ、Ｎ、Ｚ、　Ｊ、Ｍｅｄ 、（１９７５）５（６）＋　５３７−５３９には、皮下ヘパリンの抗凝血以下の 投与量の初期腎同種異系移植片機能への影響が記載されている。１日当たりの投 薬量は高く（５０００Ｕ）、この研究の結論は、抗凝血以下の投与量でのヘパリ ンは初期移植片機能または移植片生存に何も影響を及ぼさず、増大した出血性合 併症と関連性があるかもしれないということである。

ける高投薬量（１００ＯＵ／ラツト）でのヘパリンの影響を実験し、ヘパリンが ラットのアジュバント関節炎の重症度を増大させるということを見出した。

ＷＯ３８１０５３０１で国際公開されているＰＣＴ特許出願：ＰＣＴ／ＡＵ　８ ８／　０００１７　（Ｐａｒｉｓｈ　ｅｔ　ａｌ、）は、抗転移剤および抗炎症 剤としての使用のために、ヘパラナーゼ活性等のエンドグリコシラーゼ活性を遮 断もしくは抑制する硫酸化された多糖類を記載している。ごくわずかな抗凝血薬 活性をもつ、過ヨウ素酸で酸化された、還元されたヘパリンなどのヘパリン誘導 体およびヘパリンが、ラットに毎日１．６−６、　６ｍｇ　（成人患者で毎日７ ５−３０８ｍｇに相当）の範囲内投与量で持続注入によって投与されると、抗転 移活性と抗炎症活性をもつことが示された。

３、発明の概要 本発明は、ＴＮＦ−α分泌の誘発を含む病理学的過程の予防および／または治療 用医薬組成物に関し、該医薬組成物は薬学的に許容され得る担体、および約５− ８日間の間隔で投与される低有効投薬量で存在する低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ ）を含有し、該ＬＭＷＨは、Ｔ細胞特異抗原、マイトジェン、マクロファージ活 性化物質、破壊した細胞外マトリックス（ｄＣＥＭ）、ラミニン、フィブロネク チン、または他のＥＣＭ構成成分に応答し、１ｎｖｉｔｒｏてＴ細胞および／ま たはマクロファージを休止させることによりＴＮＦ−α分泌を抑制することがで きる。

本発明の特別な実施態様において、医薬組成物のＬＭＷＨは約３．０００から約 ６，０００の平均分子量をもち、さらに、５日もしくは７日ごとに投与されるだ ろう。

ＴＮＦ−α分泌の誘発を含む病理学的過程の予防および／または治療のために約 ５−８日間の間隔で投与される医薬組成物を提供することがまた本発明の目的で あり、この医薬組成物は薬学的に許容され得る担体、および低有効投与量で存在 する低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）を含有する。このＬＭＷＨは、医薬組成物の 投与なしに、あるいは医薬組成物投与からの回復後に、抗原を皮膚へ適用した後 に観察された硬化に比べて、医薬組成物の投与の５−７日後に皮膚へ抗原を適用 した後に観察された硬化が軽減化されることより証明されるように、適用された 抗原への実験遅延型過敏症（ＤＴＨ）の反応を抑制することができる。適用され た抗原の例は、破傷風（テタヌス）、ミニリン塩基性タンパク質、精製タンパク 質誘導体、オキサシロン等が含まれるが、これらに限定されるものではない。

さらに、経腸的投与（経口投与を含む）または非経口投与（局所的投与またはエ ーロゾルを用いた吸入を含む）などであるが、これらに限定されるものではない 、手近な特別な適用で示されるような任意の方法によって投与され得る医薬組成 物を提供することが本発明の目的である。より好適な態様において、本発明の医 薬組成物は皮下もしくは静脈内投与される。

したがって、本発明は、例えば同種移植片拒絶の遅延または予防において、およ び自己免疫疾患、アレルギー、炎症性疾患（とりわけ炎症性腸疾患）、または後 天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）等に関連する種々の病理学的過程の治療または 予防において、有用である。本発明はまた、Ｉ型糖尿病、歯周疾患、ブドウ膜炎 、リウマチ性疾患（とりわけリウマチ性関節炎）、アテローム性動脈硬化症、脈 管炎、または多発性硬化症の治療において有用である。

本発明の医薬組成物は、前記したＬＭＷＨの低有効量を含み、一般的には５ｍｇ 未満、より好適には約０．　３から約３ｍｇの単−低投与単位のＬＭＷＨを含み 、最も好適には１から１．５ｍｇの単−低投与単位を含む。

本発明はまた、ＴＮＦ−α分泌の誘発を含む病理学的過程の予防および／または 治療のため約５−８日間の間隔で投与される医薬組成物の製造のための、低分子 量ヘパリン（ＬＭＷＨ）の使用方法も広（意図するものであり、この低分子量ヘ パリン（ＬＭＷＨ）は、Ｔ細胞特異抗原、マイトジェン、マクロファージ活性化 物質、破壊した細胞外マトリックス（ｄＣＥＭ）、ラミニン、フィブロネクチン 、または他のＥＣＭ構成成分に応答し、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでＴ細胞および／また はマクロファージを休止させることによりＴＮＦ−α分泌を抑制することができ る。上記使用方法は、低有効投与量のＬＭＷＨと薬学的に許容され得る担体とを 組み合わせることからなる。

本発明のさらなる目的は、ＴＮＦ−α分泌の誘発を含む病理学的過程を患ってい る患者の治療方法を提供することであり、この方法は、上述したように約５−８ 日間の間隔で医薬組成物をその患者に投与することからなる。

さらに本発明の目的は、本発明の実施態様の詳細な説明を含む下記の記述のさら なる検討により、当業者にとって明らかになる本発明により、低分子量ヘパリン （ＬＭＷＨ）で治療することによって、Ｔ細胞とマクロファージのＴＮＦ−α分 泌能力が抑制されるということが見出された。この効果の機能的発現は、マウス とヒトにおいて、遅延型過敏症（ＤＴＨ）反応の抑制、マクロファージおよび他 の炎症性細胞を含む細胞によって誘発される炎症性反応の抑制に見出すことがで きる。ＴＮＦ−α産生に影響を及ぼす投与量でのＬＭＷＨを用いた治療はまた、 アジュバント関節炎（ＡＡ）と呼ばれる自己免疫関節炎のモデルを抑制すること ができた。ＬＭＷＨ治療はまたラットにおける同種異系の心臓移植の生存を長引 かせ、ＮＯＤマウスにおけるインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）を阻害した。

さらに、ＬＭＷＨを用いた治療によって、傷害を受けた内皮上細胞外マトリック ス（ＥＣＭ）の刺激に応答し、Ｔ細胞およびマクロファージによるＴＮＦ−α産 生の誘発が妨げられた。脈管損傷部位におけるＴＮＦ−αはおそらくアテローム 性動脈硬化症の過程において役割を担っているので、損傷を受けた内皮下のＥＣ Ｍ部位でのＴＮＦ−α抑制は、アテローム性動脈硬化症の病理学的過程を改善す るであろう。ＬＭＷＨを用いた治療の最も驚くべき側面は、１週間の間隔で低投 与量で投与されたとき、かかる治療が最も効果的であるということである。ＬＭ ＷＨを高投与量あるいはＬＭＷＨを毎日与えることは、ＴＮＦ−α分泌の抑制ま たは免疫応答の抑制に効果的でない。

ヘパリンを分別あるいは制御解重合することにより産生される低分子量ヘパリン は、ヘパリンに比して、改善された抗血栓効果のみならず異なった薬物動態学的 特性を示す：すなわち、半減期が２倍であり、皮下注射後のそれらの抗凝血薬効 果に対して生物学的利用能がより高い（Ｂｒａｔｔ、Ｇ、ｅｔ　ａｌ、　Ｔｈｒ ｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈａｅｍｏｓｔ６：８４５）。

本発明により、数日間の間隔で抗凝血以下の投与量にて投与されたＬＭＷＨが、 ＴＮＦ−αの誘発を含む病理学的過程の予防および／または治療に効果的である ということが今や見出された。

本発明において用いられるＬＭＷＨは、例えばヨーロッパ特許ＥＰ　００１４１ ８４に開示されているＬＭＷＨのように３０００−６０００の平均分子量をもっ たＬＭＷＨに由来する。いくつかのＬＭＷＨは、異なった商品名、例えばフラグ ミン（Ｆｒａｇｍｉｎ：登録商標）、フラキシパリン（Ｆｒａｘｉｐａｒｉｎ： 登録商標）、フラキシバリーネ（Ｆｒａｘｉｐａｒｉｎｅ：登録商標）、ロベノ ックスＣＬｏｖｅｎｏｘ：登録商標）／フレキサン（Ｃ１ｅｘａｎｅ＋登録商標 ）等として、商業的に入手することができる。

Ｌ　Ｍ　Ｗ　Ｈは、いくつかの異なった方法によって製造することができる：エ タノールおよび／または分子ふるいを用いた分別による濃縮で、例えば標準ヘパ リン中に存在しているＬＭＷＨのゲル濾過または膜濾過、および制御された化学 的解重合（亜硝酸、β−説離または過ヨウ素酸酸化による）または酵素的解重合 （ヘパリナーゼによる）など。解重合の条件は、所望の分子量の生成物を得るた めに注意深く管理され得る。通常、亜硝酸解重合が用いられる。β−説離による ヘパリンのベンジル性エステルの解重合もまた用いられ、これによりヘパリナー ゼを用いての酵素的解重合と同し型のフラグメントが製造される。低い抗凝血薬 活性をもち基本的な化学構造を保持しているＬＭＷＨは、過ヨウ素酸酸化を用い た解重合、または吸着のために固定化された抗トロンビンを用いて、他の方法に よって製造されたＬＭＷＨの抗トロンビン−結合フラクションを除去することに よって製造することができる。

フラグミン（登録商標）は、４０００−６０００ダルトンの範囲内の平均分子量 を有する低分子量ヘパリンで、ヘパリンナトリウムの制御された亜硝酸解重合に よりブタ腸粘膜から製造される。

それは２５００　ＩＵｌｏ、２ｍｌおよび５０００１Ｕ１０．２ｍｌ　（それぞ れ約１６ｍｇおよび約３２ｍｇに相当）の単一投与シリンジ中の注射用食塩水と して抗血栓剤としての使用のために、フラグミン（登録商標）の名で、スウェー デンのカビ・ファルマシア（Ｋａｂｉ　Ｐｈａｒａ＋ａｃｉａ）によって製造さ れている。

フラキシパリン（登録商標）、およびフラキシパリーネ（登録商標）は、およそ ４５００ダルトンの平均分子量のＬＭＷＨであり、それぞれ分別または制御され た亜硝酸解重合によって、ブタ腸粘膜からのヘパリンカルシウムから製造される 。それは約３６ｍｇ　（３０７５１Ｕ／水０．３ｍｌに相当）からなる単一投与 量において抗血栓剤として使用するためにサノフィ　（Ｓａｎｏｆｉ）　［コエ イ・ラボラトリーズ（Ｃｈｏａｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）コによって製造 されている。

ロベノックス（登録商標）　（Ｅｎｏｘａｐａｒｉｎ／ｅ）は、β−説離を用い て、ヘパリンナトリウムの解重合により、ブタ腸粘膜から製造されるＬＭＷＨフ ラグメントであり、フランスのファルム力　ＳＦ（Ｐｈａｒｍｕｋａ　ＳＦ）に より製造され、２０ｍｇ／水０．２ｍｌおよび４０ｍｇ／水０．４ｍｌからなる 単一投与シリンジで抗血栓剤としての使用のために、フレキサン（登録商標）お よびロベノックス（登録商標）の名てロータ・ブーラン（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌ ｅｎｃ）から販売されている。

本出願で示されるように、記載されたＬＭＷＨの新規な特性は、用いられるＬＭ ＷＨが特異抗原、マイトジェン、分断されたＥＣＭまたはそのタンパク質成分（ 例えばフィブロネクチンやラミニンなど）との接触による活性化に応答して、ｉ ｎ　ｖｉｔｒｏでＴ細胞および／またはマクロファージを休止させることにより ＴＮＦ−α分泌を抑制することができるものであれば、その製造方法、構造上の 差異（解重合により生成された、あるいは原料として用いられるヘパリンにおけ る変異に依るもの）あるいは抗凝血薬活性の如何を問わず、すべてのＬＭＷＨに 共通の特徴である。

本発明の目的のために有効なＬＭＷＨを同定するのに有用なもう一つの試験は、 種々の抗原（例えば破傷風抗原、ミニリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、精製タ ンパク質誘導体（ＰＰＤ）、およびオキサシロン）に対する、実験上の遅延型過 敏症（ＤＴＨ）皮膚反応の抑制、つまりＴリンパ球依存性反応の抑制にある。Ｌ ＭＷＨはまた、ＥＣＭおよびそのタンパク質成分へのＴ細胞の付着を抑制する。

本発明による効果的なＬＭＷＨは、例えば、おそらく塩化ナトリウム、安定剤、 他の適当な非活性成分を含む水溶液として医薬組成物に組入れられる。好適な投 与方法は、皮下または静脈内注射であるが、他のいかなる好適な方法も本発明に より包含される。

本発明によれば、ＬＭＷＨは５から８日間の間隔で投与されるが、好ましくは１ 週間に１回の割合である。

本発明により予防されまたは治療されることができる疾患は、ＴＮＦ−α分泌の 誘発を含む病理学的過程に結び付いたすべての疾患であり、アテローム性動脈硬 化症と脈管炎およびそれらに関連した病理学的過程；例えばリウマチ性関節炎、 Ｉ型糖尿病（■ＤＤＭ）等の自己免疫疾患；アレルギー；移植拒絶；例えばブド ウ膜炎、腸炎症などの急性および慢性炎症性疾患；神経性食欲不振；敗血症によ って引き起される出血性ショック、およびＡＩＤＳ−免疫無防備状態の個体−に おける日和見感染等を含む。ＡＩＤＳでは、ＬＭＷＨはＨＩＶの複製を抑制し、 および／または日和見感染に対する抵抗を高め、それによりＡＩＤＳ関連症候群 （ＡＲＣ）の発症を防止するであろう。

本発明によれば、狭い投与量範囲でＬＭＷＨが効果を奏することができ、またＬ ＭＷＨの異なった製剤がそれぞれ別々の最適な生物学的効果を示すことができる ということが観察された。したがって、本発明で用いられるＬＭＷＨ製剤のため に、単位投与量を定めることが必要であったが、該単位投与量は、ＬＭＷＨで治 療されたマウスからのマウス膵臓細胞によるＴＮＦ−α分泌の抑制のバイオアッ セイに基づくか、あるいは、ＬＭＷＨによるＤＴＩ］反応性の抑制のバイオアッ セイに基づくものである。特定の投与量のＬＭＷＨがＴＮＦ−α分泌を抑制する 能力と、それが遅延型過敏症（ＤＴＨ）を抑制する能力とが、明確に相関関係を 有するということがわかった。このｉｎ　ｖｉｖｏの細胞媒介炎症反応は、自己 免疫疾患、移植拒絶、血管炎症およびアレルギーのいくつかの型に含まれる過程 の発現であるため重要である。

かくして少なくとも５０％のＴＮＦ−α抑制、ＤＴＨ反応性の生成または抑制を 起こさせるｋｇ当たりのＬＭＷＨ最小投与量は、ｋｇ当たり１２マウス抑制単位 （１２ｕ／ｋｇ）を構成すると考えられることが本発明により確立された。マウ スとヒトは体表面積および代謝において相違しているので、ヒトはより低投与量 のＬＭＷＨで治療されるべきであり、マウスにおける１２ｕ／ｋｇは、ヒトにお けるｌｕ／ｋｇに相当することが確立される。例えば、ＴＮＦ−α分泌およびＤ ＴＨ反応性の両方を抑制するのに効果的なフラグミン（登録商標）のバッチ３８ ６０９の投与量は、１週間に１回、マウスあたり５μｇである。各マウスの体重 は約２５ｇなので、１２ｕ／ｋｇと同等のフラグミン（登録商標）３８６０９の 投与量は、２００ｇｇ／マウス１ｋｇである。ヒトに適したｌｕ／ｋｇの投与量 はしたがって２００ｇｇ／ｋｇである＋１２＝１．６．６７ｕｇ／ｋｇ、約７０ ｋｇの体重のヒトはしたがって７日ごとに１回、経皮下的に単一投与で約１．２ ｍｇの投与量によって治療されるだろう。ヒト個体は生物学的に種々異なってい るので、最適投与量はおそらく約１．２　ｍ　ｇとは異なるものと思われ、５ｍ ｇ以下、特には０．３から３　ｍ　ｇの範囲内であるだろう。

ラットにおいて効果的であるべきＬＭＷＨの投与量は、う・ソト１ｋｇ当たりの ＬＭＷＨの投与量がマウス１ｋｇあたりの投与量の２分の１、すなわち６ｕ／ｋ ｇであるという事実から導くことができる。例えば、もしフラグミン（登録商標 ）のバッチ３８６０９の１２ｕが２００ｇｇ／ｋｇであるならば、ラットに適し た６ｕ投与量は、ｌｏｏμｇ／ラット１ｋｇ−）まり２００ｇのラットにつき２ ０ｕｇとなり、１週間に１回の割合で投与されるべきである。

本発明は下記の限定的でない実施例により例証されるであろう。

５、実施例 ＬＭＷＨの存在下または不在下で培養された膵臓細胞、またはｉｎ　ｖｉｖｏで ＬＭＷＨで処理されたマウスもしくは未処理のマウスから得られた膵臓細胞の上 澄みを、ＴＮＦ−αを分泌するそれらの能力につき分析する。かかるＴＮＦ−α バイオアッセイは、シクロへキシミド（Ｃ旧）感作細胞に対するＴＮＦ−α細胞 毒性作用およびＷａｌｌａｃｈ　Ｄ、　、　Ｊ、　１＋ｎ＋＋＋ｕｎｏ１ｏ−ｇ Ｙ（１９８４）１３２：２４６４−２４６９に記載されたニュートラル・レッド 結合アッセイによるその定量法に基いている。簡単に言えば、細胞の上澄み中に 存在するＴＮＦ−αによるＣ旧で感作したＨｅＬａ細胞の死滅を測定し、前記の 上澄み中のＴＮＦ−αの濃度を外部から添加されたＴＮＦ−αの滴定曲線との比 較により測定する。細胞生存率は、２時間にわたりニュートラル・レッドでイン キュベートし、過剰の色素を洗浄して除き、細胞にとり込まれたニュートラル・ レッドをソレンソンのクエン酸緩衝液−エタノール混合物で抽出し、そしてそれ をマイクロエリサ・オートリーダー（Ｍｉｃｒｏｅｌｉｓａ　Ａｕｔ。

ｒｅａｄｅｒ）で５７０ｇｍで比色計で定量化することにより測定する。

ＬＭＷＨて処理されたマウス由来の細胞を以下のようにして得る。

群当たり少なくとも５匹のＢＡＬＢ／Ｃ系統の雌のマウス（２５ｇ、生後２ケ月 ）に、通常マウス当たり０．５〜２０ｕｇの範囲において種々の投与量のＬＭＷ Ｈを皮下注射する。５日後に、マウスを頚部脱臼により殺し、膵臓を取り出し、 そして赤血球が枯渇された膵臓細胞の懸濁液をｄＥＣＭ、コンカナバリンＡ（Ｃ ｏｎ　Ａ）またはリボ多糖（ＬＰＳ）による誘発に応答するＴＮＦ−αの生産を 分析する。

マウスの群を、剃った腹部皮膚でアセトン／オリーブ油（４：１゜Ｖ：Ｖ）中の ３％のオキサシロン（ＯＸ）　１００μＩで感作した。ＤＴＨ感受性を以下のよ うにして５日後に誘発する。マウスにアセトン／オリーブ油中０．５％の０Ｘ２ ０ｕｌ（耳の両側に１σμｌ）を抗原投与する。

耳の一定の領域を、抗原投与の直前並びに２４時間後および４８時間後にミツト ヨーエンジニア−（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ　ｅｎｇｉｎｅｅｒ）のミクロメーターで 測定する。耳の膨化を測定する個人にマウスの群の同一性につき隠してお（。耳 の膨化の増分（Δ）を、使用されるミクロメーターに応じて１０−２＋ｎｍまた は１Ｏ−４インチ（±ＳＢ）の単位で平均として表す。抑制率（％）を以下のよ うに計算する。

抑制率（％）＝陽性対照−実験群　Ｘ１００陽性対照−陰性対照 マウスにＯｘへの一次感作の前日に注射して実施例１のようにＬＭＷＨで処理す る。Ｏｘへの感作の５日後に、上記のようにしてマウスに抗原投与してＤＴＨ反 応を誘発する。

陽性対照は、ＬＭＷＨによる治療の不在下で免疫化されたマウスに誘発されたＤ ＴＩ（反応である。陰性対照は、免疫化されたマウスで抗原により生じたバック グラウンド膨化である。

５．３．実施例３：試験管内のＴ細胞およびマクロファージによるＴＮＦ−α分 泌の誘発 マイクロタイタ・プレートを以下のようにして調製した。フィブロネクチン（Ｆ Ｎ）またはラミニン（ＬＮ）（Ｓｉｇｍａ）をウェル当たりｌｕ　ｇ１５０ｕ　 ｌ　ＰＢＳの濃度で平底の９６ウエルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に添加し、１６ 時間後に除去した。残存結合部位を、ウェルに２時間添加されたＢＳ＾／ＰＢＳ （］Ｏｍｇ／ｍｌ）でブロックし、洗浄して除いた。ＥＣＭ被覆ウェルを以下の ようにして調製した。ウシの角膜内皮細胞を平底の９６ウエルプレート中で培養 した。内皮細胞の集密層を溶解し、ＥＣＭを細胞破片のない無傷のままにした（ Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ、　Ｄら、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋ｎ、（１９７８）２５３：３７３６）　、分断ＥＣＭ（ｄｔ ＩＣＭ）を、ＥＣＭを２７Ｇ　シリンジ針で３回軽く引っかくことにより調製し 、続いて露出部位をＢＳＡ／ＰＢＳで被覆した。ミニリン塩基性タンパク質（Ｍ ＢＰ）を認識するに１と称される休止クローン化ラットＣＤ４　”　Ｔ細胞を増 殖させ、培養物中で維持し、モしてウェル当たり１００μｍの１％のＢＳＡおよ び抗生物質が補給されたＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）中、３　ｘ　１０’の 同系膵臓マクロファージと共に、またはこれを使用しないでウェル当たり１０’ の細胞をウェルに添加した。膵臓マクロファージを、特異的モノクローナル抗体 （ｍＡｂ）を使用してＴ細胞およびＢ細胞を除去することにより精製した。示さ れる場合には、抗マウスＴＮＦ−αＩＩＩＡｂ（Ｇｅｎｚｙｍｅ　、　１／３０ ０に希釈）をウェルに添加した。示される場合には、ＭＢＰ（１００μｇ／ｍｌ ）　、Ｃａｎ　Ａ（２，５μｇ／ｍｌ）　、ＬＰＳ（ｌ　μｇ／ｗ＋１）をウェ ルに添加した。プレートを保湿インキュベーター中で３７℃で３時間インキュベ ートした。続いて、ウェル（実験群島たり４個のウェル）の内容物を回収し、遠 心分離し、培地を実施例１のようにＴＮＦ−α分泌につき分析した。培養された マクロファージおよびリンパ球の上澄みをＨｅＬａ細胞（これはＴＮＦ−αによ る殺生に対して感受性である）の培養液に添加し、そして試験培地の存在下のこ れらの細胞の死滅を外部から添加されたＴＮＦ−αの滴定曲線と比較して較正し た。細胞の死亡をブレインキュベートされたＨｅＬａ細胞からのニュートラル・ レッド色素の放出により調べる。

ここに示された結果は、実質的に同様の結果を生じた６回の実験の合計から得ら れたデータを表す。

表１は、−緒に培養されたＴ細胞およびマクロファージが特異的抗原ＭＩＩＩＰ （群４）、マイトジェンＣａｎ　Ａ（群６）またはｌ、ＰＳ（群８）との接触に よりＴＮＦ−αを分泌するように誘発し得ることを示す。

しかしながら、抗原またはマイトジェンによる刺激の不在下では、分断細胞外マ トリックス（ｄＥＣＭ；群１０）もしくはＥＣＭ成分フィブロネクチン（ＦＮ、 群１２）またはラミニン（ＬＮ、群１４）により、ＴＮＦ−αの分泌もまた誘導 された。無傷のＥＣＭはＴＮＦ−αの弱い誘発物質であった（群１６）。

（本頁以下余白） 表１．７細胞およびマクロファージによるＴＮＦ−α分泌が特異的抗原ＭＢＰ　 、　Ｃｏｎ　Ａ　、　ＬＰＳまたはｄＥＣＭ成分により誘発される。

マクロファージと一緒に（有）　分泌されたＴＮＦ〜α　またはそれなしに（無 ）培養　ＴＮＦ−０群　誘発物質　されたに１細胞　（ｐｇ／ｍ１）ｌ　なし　 無　５゜ ２　有　６５ ３　ＭＢＰ抗原　無　３゜ ４　有　９５０ ５ＣｏｎＡ　無　１２０ ６　有　１３００ ７　ＬＰＳ　無　５゜ ８　有　１５００ ９　ｄＥＣＭ　無　３゜ ｌＯ有　９００ １１　ＦＮ　無　２゜ １２　有　６５０ １３　ＬＮ　無　５゜ １４　有　５００ １５　ＥＣＭ　無　３゜ Ｔ細胞および補助細胞培養液を実施例３に記載したように調製した。ＬＭＷＨを 細胞培養の開始時にウェルに添加した。ＴＮＦ−αの量を３時間のインキュベー ション後に調べた。

表２は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるＬＭＷＨ（フラグミン（商標）バッチ３８６ ０９）が存在することにより、特異的抗原（ＭＯＰ　；群４）、マイトジェン（ Ｃｏｎ　ＡおよびＬＰＳ、群６および群８　’）　、ｄＥＣＭＥＣ型たはＥＣＭ 成分（群ｔｏ、　１２および１４）により誘発されたＴＮＦ−α分泌の誘発が抑 制されたことを示す。ｄＥｃＭにより誘発されたＴＮＦ−α分泌はアテローム性 動脈硬化におそらく関与するので、ＬＭＷＨによるＴＮＦ−αの抑制はアテロー ム性動脈硬化に対して有益である。

（本頁以下余白） 表２゜ｉｎ　ｖｊｔｒｏで誘発されたＴＮＦ−α分泌の誘発がＬＭＷＨ（フラグ ミン（商標）バッチ３８６０９）により抑制される。

Ｔ細胞およびマクロファージ ＴＮＦ−α　ＬＭＷＨの培養液によるＴＮＦ−αの分泌群　誘発物質　（ｌμｇ ／ｎｌ）　（ｐｇ／ｍ１）３　ＭＰ［ｌ抗原　無　９５０ ４　有　６０ ５ＣｏｎＡ　無　１３００ ６　有　８０ ７　ＬＰＳ　無　１５００ ８　有　８０ ９　ｄＥＣＭ　無　９００ ■０　有　９０ １１　ＦＮ　無　６５０ １２　有　９０ １３　ＬＮ　無　５００ １４　無　７０ ５．５．実施例５ ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける膵臓細胞によるＴＮＦ−αの分泌において、ｉｎ　ｖ ｉｖｏでマウスに投与されたＬＭＷＦＩの効果を調べるために、以下の実験を行 った。群島たり５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを、生理食塩水で希釈された種々の投 与量のＬＭＷＨ（フラグミン（商標）バッチ３８６０９）で皮下注射処理した。

１週間後に、動物を殺し、赤血球を言よないそれらの膵臓細胞を、ｄＥｃＭを含 まない対照ウェル（Ａ）またはｄＥｃＭで被覆されたウェル（Ｂ）に応答してＴ ＮＦ−αを分泌するそれらの能力につき調べた。ＴＮＦ−α分泌の量の測定を実 施例１に記載したように行った。表３は、７日前に１回投与された５μｇのＬＭ ＷＨの注射によりｄＥＣＭにより誘発されたＴＮＦ−α分泌が抑制されたことを 示す結果を示す。それより多い投与量またはそれより少ない投与量のＬＭＷＨは 、それ程有効ではなかった。こうして、１週間前に１ｎｖｉｖｏて投与された最 適の投与量のＬＭＷＨが有効であった。

−弄−ｚ、ｆｆ１−倦μ」丼茜膚するＴＭＪ壁媒介ＴＮＦ−α分泌の半ビボ抑制 肺臓細胞培養液による ＢＡＬＢ／ｃ７ウス　試験管内のＴＮＦ−α分泌（ｐｇ／ｍ１）（７）　ＬＭＷ Ｈ治療　Ａ、なし　Ｂ、損傷ＥＣＭ（週１度）　（抑制率、％） １　なＬ　：３ｏ　４００ ２０．５μｇ　５０　３８０（５） ３１μｇ　２５　９０　（７８） ４５μｇ　２５　６０　（８５） ５　１０μｇ　３０　１４０　（６５）６　２２−０−ｔｌ　４０　３２０　（ ２０）表４は、生体内の５μｇの投与量のＬＭＷＨフラグミン（商標）バッチ３ ８６０９がまたＬＰＳにより誘発されたＴＮＦ−α分泌を抑制するのに有効であ ったことを示す。ＢＡＬＢ／ｃ　（実験群島たり４匹のマウス）皮下注射した。

１週間後に、マウスに１０ｍｇのＬＰＳを腹腔内注射し、４時間後に殺し、続い て赤血球を含まないそれらの膵臓細胞を保湿インキュベーター中でｄＥｃＭ被覆 ウェルつで３時間培養した。

ｄＥＣＭに応答して分泌されたＴＮＦ−αの量を培養液の上澄み中で測定した。

結果を表４に示す。

表４．ＬＭＷＨによるマウスの治療がマクロファージによるＴＮＦ−αのＬＰＳ 媒介分泌を抑制する。

ＬＰＳに応答する マウスの　マクロファージによる ＬＭ＊Ｈ治療（ｔｔｇ）　試験管内のＴＮＦ−α分泌（ｌａｇ／ｍｌ）　抑制率 （％）５．６．実施例６ ＴＮＦ−α分泌の抑制およびＤＴＨ応答に関する種々のＬＭＷ）Ｉの効果を調べ るために、マウスに種々の濃度で示されたＬＭＷＨを皮下投与して治療した。１ 週間後に、マウスの幾つかを殺し、試験管内のＣｏｎ　Ａ活性化に応答するＴＮ Ｆ〜α分泌の誘発を測定した。残りのマウスを、抗原オキサシロンに応答するそ れらの能力につき調べた。

結果を、ＬＭＷＨ未治療のマウスの応答と比較した抑制率（％）として表５に表 す。

表５に示された結果を精査することにより二つの結論をだすことができる。

１、それぞれ同様の抗血栓作用（因子Ｘアッセイ）により較正されたＬＭＷＨの 種々のバッチは、ＴＮＦ−α分泌の抑制に関して異なる最適投与量を有する。更 に、試験した投与量の（１ずれかでＴＮＰ−α分泌に対して抑制作用を示さない ＬＭＷＨの製剤、例えば、フレキサン（商標）バッチ４０９６がある。それ故、 ＬＭＷＨ製剤の抗血栓作用（才、ＴＮＦ−α分泌の抑制に関するＬＭｗＨ製剤の 能力に関係しな（１と結論し得る。二つの異なるパイオア・ソセイは、製剤中に 存在する異なる因子により媒介される。

２、　ＴＮＦ−α分泌を抑制する特別な投与量のＬＭＷ）Ｉの能力（ま、［１Ｔ ｌ（反応を抑制するその能力と明確に相関関係があり、そしてＴＮＦ−α分泌を 抑制するのに最良に有効な投与量のＬＭＷＨ製剤Ｇよまｔ、：ＤＴ１１反応を抑 制するのに最良に有効である。

（本頁以下余白） 表５１種々のＬＭＷＨによるマウスの治療はｅｘ　ｖｉｖｏのＴＮＦ−α分泌お よびＤＴＨ反応の両方を抑制する。

ＬＭＷＨによる マｔ’ｙス（Ｄ週　濃度：　ｅｘ　ｖｉｖｏのＣａｎ　Ａバッチ３８６０９なし 　４５０−　２５−０．５　４２５　５　２１　１２ ｔｏ　３５０　２２　２０　２０ バツチ４５３８９なし　３２０−　２８−０．１　２８０　１３　２６　６ クレキサン バッチ２０８８　なし　４００−　２２−０．１　３６０　１０　１７　２３ 表５（続き） ＬＭＷＨによる マウスノ週　濃度：　ｅｘ　ｖｉｖｏのＣｏｎ　Ａ遅１亙（ユＶす込」１旦ｂす 監−」１μｍ−一■ム畦　抑制率（％）　ＤＴＨ抑制率（％）バッチ２０６６　 なし　３５０−　２３−０．１　３３８　６　２０　１３ バツチ４０９６　なし　３２０−　２４０１児−一−−−邦Ｑ　Ｑ　２４−東一 一５．７．実施例７：低投与量のＬＭＷＨによるう・ソトのアジュバント関□ アジュバント関節炎は、幾つかの系統のう・ソトをミコノくクチ１ノウム・ラベ ルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の抗原 で免疫化することにより誘発し得る実験的疾患である（Ｐｅａｒｓｏｎ、　Ｃ， Ｍ、　、　Ｐｒｏｃ、　ＳＯＣ，ＥＸ＋）、　Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ、　（１９５ ６）９１：９１）。この実験的疾患（まヒトの関節リウマチのモデルであると考 えられる（Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｃ，Ｍ、、　Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍ１１ ９６４）７：８０）　。その関節炎は、関節組織中の構造と交差反応性であるＭ 、ラベルクロシスの抗原を認識するＴ　ＩＪンノ々球にヨリ引キ起コサレるよう だ（Ｃｏｈｅｎ、　１．Ｒ，ら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍｌ１９８５） ２８：８４１）。

ルイスラットを油中のＭ、ラベルクロシス（１ｍｇ）で免疫化してアジュバント 関節炎を誘発した（Ｐｅａｒｓｏｎ、　Ｃ，Ｍ、　、　Ｐｒｏｃ、　Ｓｏｃ、　 Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ。

Ｍｅｄ、　（１９５Ｂ）９１　：９１）。５日後に、ラットに示された投与量の ＬＭＷＨおよび／またはヘパリンを皮下接種し、そしてＨｏ１ｏｓｈｉ　ｔｚ、 　Ｙ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ（１９８３）２１９：５６に記載されたように０〜１ ６のスケールで関節炎の発症につきスコアをつけた。全ての実験をフラグミン（ 商標）バッチ３８６０９により行った。

フラグミン（商標）に対する投与量応答を研究するために、ＡＡを誘発するよう に免疫化されたラットを、注射後の５日目に開始して０．５　μｇ（○）、ｌμ ｇ（◆）、２μｇ（・）　、１０μｇ（◇）、１５ａｇｃΔ）　、２０μｇ（Ｉ Ｉ）　、３０μｇ（ム）　、４０μｇ（ｘ）およびＰＢＳ対照（ロ）で週１度皮 下注射した（図１）。その投与量は関節炎を抑制するのに最高に有効であった。

ＡＡの経過に関する２０μｇの投与量のフラグミン（商標）の効果を図２に示す 。ＰＢＳ対照（ロ）；５日目に１回の治療（ム）；日１度（・）；５日毎（○） ；週１度（■）。５日間隔および７日間隔の両方のフラグミン投与が関節炎を抑 制することが示される。

図３は、ＡＡに関する標準のヘパリンと比較したフラグミン（商標）（バッチ３ ８６０９）の週１度の投与の効果を示す。ルイスラットを免疫化してＡＡを誘発 した。５日目に開始して、ラットに週１度の間隔て２０μｇの投与量のフラグミ ン（商標）（・）、ヘパリン（○）またはリン酸緩衝液（ＰＢＳ）対照（ロ）を 皮下接種した。結果はフラグミン（商標）とヘパリンの効力の著しい相違を示す 。フラグミン（商標）は関節炎を完全に抑制したが、一方、ヘパリンは抑制作用 を有していなかった。

ＡＡに関する抑制作用は２０μｇの投与量のＬＭＷＨの日１度の投与では見られ なかったが、驚（ことに、ヘパリンの抑制作用は図４（フラグミン（商標）（バ ッチ３８６０９）　（・）、ヘパリン（○）、ＰＢＳ対照（ロ））に示されるよ うに日１度のフラグミン（商標）投与の抑制作用よりも強かった。

同様の抑制作用が、ＡＡを誘発するように免疫化されたルイスラットに投与され た幾つかのその他のＬＭＷＨで観察された。図５は、２０μｇの投与量のフラキ シパリン（商標）（日１度（ロ）；週１度（■））：フラキシバリーネ（商標） （日１度（Δ）；週１度（ム））、ロベノックス（商標）／フレキサン（商標） （日１度（・）；週１度（○））、およびＰＢＳ対照（Ｘ）の注射の結果を示す 。異なる型および源の三種のＬＭＷＨの全てが、日１度ではなく週１度投与され た場合に関節炎の顕著な抑制を示した。

５．８．実施例８　：　ＬＭＷＨによる治療が同種異系移植片の拒絶を防止工ゑ 一一−−−−−−−−−−−−−−−−−一−−−−ウイスターラットを同種間 ＢＮ心臓移植した（Ｏｎｏ、　Ｋ、およびＬｉｎ−５ａｙ、　Ｅ、　Ｓ、　、　 Ｊ、　Ｔｈｏｒａｃ、　Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ、　Ｓｕｒｇ、　（１９６９）４ ５：２２５−２２９）。移植の前日から、ラットに７日間隔で２０μｇのフラグ ミン（商標）またはＰＢＳ対照（図６、それぞれ■および口）を皮下注射し、そ して生存率につきスコアをつけた。拒絶の日を、移植心臓が拍動を停止した日と 決め、腹部の触診により測定した。図６は、ＬＭＷＨの週１度の投与で治療され たう・ソトが心臓の同種異系移植片の著しく増大された生存率を有していたこと を示す。

５．９．実施例９：ＮＯＤマウスのインシュリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ） に関するＬＭＷＨの生物効果ＮＯＤ系統のマウスは、ヒトＩＤＤＭに関して認め られたモデルであるＩ型インシュリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）の形態を自 然に発生する（Ｃａｓｔａｎｏ、　Ｌ、およびＥｉｓｅｎｂａｒｔｈ、　Ｇ、　 Ｓ、　、　Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｉ＋ｕ＋ｕｎｏｌ。

（１９９０）　８：６４７−６７９）。その病気は、膵島の炎症、インスリン炎 の兆候により生後４〜５週に始まる。インスリン炎は、ＴＮＦ−αによる損傷に 感受性であるインシュリン生産β細胞を次第に損傷する。

生後約４〜５ケ月で、充分な数のβ細胞が破壊され、その結果、糖尿病が明らか になる。

ＬＭＷ）ｌによる治療がＩＤＤＭプロセスに影響し得るか否かを試験するために 、１０匹の雌のＮＯＤマウスの群をマウス当たり５μｇのフラグミン（商標）（ バッチ３８６０９）の週１度の皮下注射で治療し、その投与量を１ｋｇ当たり１ ２マウス単位に相当すると決めた。１０匹の対照マウスの群を生理塩類溶液の注 射で処理した。生後５ケ月で、全てのマウスから採血して標準の手法（Ｅｌｉａ ｓ、　Ｄ、ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、（１９９０）　８７：１５７６−１５８０） を使用してＩＤＤＭの発生を測定した。図７は、対照マウス（“なし”）が異常 な血糖（４００ｍｇ／ｄ１）を有していたことを示す。対照的に、ＬＭＷ）Ｉで 治療されたマウスは正常な血糖（１００ｍｇ／ｄｌ）を有していた。こうして、 ＬＭＷＨによる治療は実際にＩＤＤＭプロセスを治癒し得る。

５、１０．実施例１吐ヒトＤＴＨのＬＭＷＨ治療図治療図体重８５ｋｇの４０才 の年齢の男性の志願者を破傷風抗原（メリエウクス（Ｍｅｒｉｅｕｘ）皮膚試験 アプリケーター）に対するＤＴＨ反応性につき試験した実験を示す。約１８＋ｎ ｍの硬化を２４時間および４８時間で測定した。次に志願者をフラグミン（商標 ）（バッチ３８６０９）　３ｍｇの皮下注射で治療した。５日後に、再度志願者 を破傷風に対する彼のＤＴＨ反応につき試験したところ、硬化を約５１１ＩＩ１ １に抑制した。３週後（“回復”）に、再度志願者をＤＴＨにつき試験し、そし てその試験は陽性反応性（２４時間および４８時間で２３ｍ＋ｎの硬化）を示し た。次に志願者を前記のフラグミン（商標）で治療し、７日後（″７日後”）に 再度反応性を測定した。再度、ＤＴＨを約５１１ｍの硬化に抑制した。再度、Ｄ ＴＨの回復が３週後に見られた。こうして、５μ未満の投与量のＬＭＷＨが５日 および７日の治療間隔でヒトのＤＴＨを抑制し得る。

本明細書に詳しく開示されていないその他の組成物および方法は、それにもかか わらず、それにより意図されていることは、当業者に明らかであるべきである。

このようなその他の組成物および方法は本発明の範囲および精神の中にあると考 えられる。それ故、本発明は本明細書に開示された特別な実施態様の記載により 限定されるべきではなく、下記の請求の範囲のみにより限定される。

ＡＣ’ｆ：’ｏ’Ｖ ＬＣ’１ １ｒニア 、４ＣＹ せ　せ ｃＹ （％）掌ガ軍 フラグミン治療がＮＯＤマウスの自然ＩＤＤＭを停止する血中グルコース　（ｍ ｇ／ｄｌｌ Ｆｉｇｕｒｅ　７ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３１／７２５ 　ＡＣＪ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　Ｃ３，ＦＩ、　ＨＵ、ＪＰ。

ＫＲ，ＬＫ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　Ｎｏ、ＰＬ、　ＲＯ，ＲＵ、５Ｄ （７１）出願人　へルシュコヴイソッ、ラミイスラエル国　へルツリャ、イーガ ル　アロン　ストリート　２ ＦＩ （７２）発明者　コーヘン、イルン　アール。

イスラエル国　レホヴオット、ハンキンストリート１１ （７２）発明者　リダー、オファー イスラエル国　レホヴオット、ゴートンストリート　２１ （７２）発明者　へルシュコヴイソッ、ラミイスラエル国　へルツリャ、イーガ ル　アロン　ストリート　２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．医薬上許される担体および有効な低投与量で存在する低分子量ヘパリン（Ｌ ＭＷＨ）を含み、かつＬＭＷＨがＴ細胞特異的抗原、マイトジェン、マクロファ ージ活性化因子、分断細胞外マトリックス（ｄＥＣＭ）、ラミニン、フィブロネ クチン、またはその他のＥＣＭ成分に応答してＴ細胞および／またはマクロファ ージを休止させることにより試験管内のＴＮＦ−α分泌を抑制し得ることを特徴 とする、５〜８日の間隔で投与されるＴＮＦ−α分泌の誘発を伴う病理学的過程 の予防および／または治療のための医薬組成物。 ２．ＬＭＷＨが約３，０００〜約６，０００の平均分子量を有する請求項１に記 載の医薬組成物。 ５日毎の投与のための請求項１または２に記載の医薬組成物。 ７日毎の投与のための請求項１または２に記載の医薬組成物。 前記のＬＭＷＨが、実験的遅延型過敏性（ＤＴＨ）反応を抑制できることを更に 特徴とする請求項１、２、３、または４に記載の医薬組成物。 ６．皮下投与または静脈内投与のための請求項１、２、または５に記載の医薬組 成物。 ７．同種異系移植片拒絶を遅延または予防するのに有効である請求項１または２ に記載の医薬組成物。 ８．前記の病理学的過程が自己免疫疾患、アレルギー、炎症疾患、およびこれら に関連するその他の病理学的過程を含む請求項１または２に記載の医薬組成物。 ９．前記の病理学的過程がエイズに関連する請求項１または２に記載の医薬組成 物。 １０．Ｉ型糖尿病、歯周疾患、炎症性腸疾患、ブドウ膜炎、リウマチ病または多 発性硬化症の治療のための請求項１または２に記載の医薬組成物。 １１．慢性関節リウマチの治療のための請求項９に記載の医薬組成物。 １２．慢性炎症の治療のための請求項７に記載の医薬組成物。 １３．アテローム性動脈硬化症、脈管炎、およびこれらに関連する病理学的過程 の予防および／または治療のための請求項７に記載の医薬組成物。 １４．前記のＬＭＷＨが５ｍｇ未満の単一の低投与量単位で存在する請求項２に 記載の医薬組成物。 １５．前記のＬＭＷＨが３ｍｇ未満の単一の低投与量単位で存在する請求項１３ に記載の医薬組成物。 １６．前記のＬＭＷＨが約０．３〜約３ｍｇの単一の低投与量単位で存在する請 求項１４に記載の医薬組成物。 １７．前記のＬＭＷＨが１〜１．５ｍｇの単一の低投与量単位で存在する請求項 １４に記載の医薬組成物。 １８．ＴＮＦ−α分泌の誘発を伴う病理学的過程の予防および／または治療のた めに約５〜８日の間隔で投与される医薬組成物の調製のために、Ｔ細胞特異的抗 原、マイトジェン、マクロファージ活性化因子、分断細胞外マトリックス（ｄＥ ＣＭ）、ラミニン、フィブロネクチン、またはその他のＥＣＭ成分に応答してＴ 細胞および／またはマクロファージを休止させることにより試験管内のＴＮＦ− α分泌を抑制し得る低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）を使用する方法であって、有 効な低投与量の前記のＬＭＷＨを医薬上許される担体と組み合わせることを含む 前記の使用方法。 １９．前記の医薬組成物が７日毎に投与される請求項１７に記載の方法。 ２０．前記のＬＭＷＨが約３，０００〜約６，０００の平均分子量を有する請求 項１７に記載の方法。 ２１．前記の有効な低投与量が前記のＬＭＷＨの５ｍｇ未満である請求項１７に 記載の方法。 ２２．前記の病理学的過程が同種異系移植片拒絶、アレルギー、自己免疫疾患お よび炎症疾患を含む請求項１７に記載の方法。 ２３．前記の病理学的過程がエイズに関連する請求項１７に記載の方法。 ２４．前記の病理学的過程がＩ型糖尿病、歯周疾患、炎症性腸疾患、ブドウ膜炎 、リウマチ病、慢性炎症、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化症、および脈管 炎に関連する請求項１７に記載の方法。 ２５．ＴＮＦ−α分泌の誘発を伴う病理学的過程の予防および／または治療のた めに約５〜８日の間隔で投与される医薬組成物であって、医薬上許される担体お よび有効な低投与量で存在する低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）を含み、かつＬＭ ＷＨが、前記の組成物の不在下またはその投与からの回復後に皮膚への抗原の適 用後に観察された硬化と比べて、前記の医薬組成物の投与の５〜７日後に皮膚へ の前記の抗原の適用後に観察された硬化の減少により証明されるように、適用さ れた抗原に対する実験的遅延型過敏性（ＤＴＨ）反応を抑制できることを特徴と する前記の医薬組成物。 ２６．前記のＬＭＷＨが約３，０００〜約６，０００の平均分子量を有する請求 項２４に記載の医薬組成物。 ２７．前記の抗原が、破傷風、ミエリン塩基性タンパク質、精製タンパク質誘導 体、およびオキサゾロンからなる群から選ばれる請求項２４に記載の医薬組成物 。 ２８．ＴＮＦ−α分泌の誘発を伴う病理学的過程を患っている患者の治療方法で あって、このような患者に約５〜８日の間隔で請求項１、２、２４、または２５ に記載の医薬組成物を投与することを特徴とする前記の治療方法。 ２９．投与間の前記の間隔が５日である請求項２７に記載の方法。 ３０投与間の前記の間隔が７日である請求項２７に記載の方法。 ３１．前記の医薬組成物が約５ｍｇ未満の前記のＬＭＷＨを含む請求項２７に記 載の方法。