JP2001186896A - ｐｆｋＡ遺伝子をコードする新規ヌクレオチド配列 - Google Patents
ｐｆｋＡ遺伝子をコードする新規ヌクレオチド配列Info
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- JP2001186896A JP2001186896A JP2000354681A JP2000354681A JP2001186896A JP 2001186896 A JP2001186896 A JP 2001186896A JP 2000354681 A JP2000354681 A JP 2000354681A JP 2000354681 A JP2000354681 A JP 2000354681A JP 2001186896 A JP2001186896 A JP 2001186896A
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 アミノ酸、特にＬ−リジンの改善された新規
の発酵生産方法の提供。 【解決手段】 次の群、 ａ）コリネバクテリウム グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来の特
定ののアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％が同一であ
るポリヌクレオチド、 ｂ）前記アミノ酸配列に対して少なくとも７０％が同一
であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド、 ｃ）ポリヌクレオチドａ）又はｂ）に対して相補的なポ
リヌクレオチド ｄ）ポリヌクレオチド配列ａ）、ｂ）又はｃ）の連続す
る塩基少なくとも１５個を有するポリヌクレオチドから
選択されたポリヌクレオチド配列を有するコリネフォル
ム細菌を使用する。
の発酵生産方法の提供。 【解決手段】 次の群、 ａ）コリネバクテリウム グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来の特
定ののアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％が同一であ
るポリヌクレオチド、 ｂ）前記アミノ酸配列に対して少なくとも７０％が同一
であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド、 ｃ）ポリヌクレオチドａ）又はｂ）に対して相補的なポ
リヌクレオチド ｄ）ポリヌクレオチド配列ａ）、ｂ）又はｃ）の連続す
る塩基少なくとも１５個を有するポリヌクレオチドから
選択されたポリヌクレオチド配列を有するコリネフォル
ム細菌を使用する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ｐｆｋＡ遺伝子を
コードするヌクレオチド配列およびｐｆｋＡ遺伝子が増
幅されたコリネフォルム細菌（coryneform bacteria）
を用いて、Ｌ−アミノ酸、特にＬ−リジンを発酵生産す
る方法に関する。
コードするヌクレオチド配列およびｐｆｋＡ遺伝子が増
幅されたコリネフォルム細菌（coryneform bacteria）
を用いて、Ｌ−アミノ酸、特にＬ−リジンを発酵生産す
る方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】アミノ酸、殊にリジンは、ヒト医学およ
び製薬工業、しかしながら特には動物飼料学において使
用されている。
び製薬工業、しかしながら特には動物飼料学において使
用されている。
【０００３】コリネフォルム細菌、特にコリネバクテリ
ウム グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）の
菌株を発酵させることによるアミノ酸の生産は公知であ
る。これが極めて重要であることから、製造方法を改善
するための努力が常になされている。方法の改善は、発
酵技術、例えば撹拌および酸素供給に関する基準に関連
してもよいし、あるいは、栄養媒体の組成、例えば発酵
中の糖濃度に関連してもよいし、あるいは、例えばイオ
ン交換クロマトグラフィーによる生成物の後処理に関連
してもよいし、あるいは微生物自体の固有の性能特性に
関連してもよい。
ウム グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）の
菌株を発酵させることによるアミノ酸の生産は公知であ
る。これが極めて重要であることから、製造方法を改善
するための努力が常になされている。方法の改善は、発
酵技術、例えば撹拌および酸素供給に関する基準に関連
してもよいし、あるいは、栄養媒体の組成、例えば発酵
中の糖濃度に関連してもよいし、あるいは、例えばイオ
ン交換クロマトグラフィーによる生成物の後処理に関連
してもよいし、あるいは微生物自体の固有の性能特性に
関連してもよい。
【０００４】これら微生物の性能特性は、突然変異法、
選択法および突然変異選択法を用いて改善される。この
方法で、菌株は、代謝拮抗物質、例えばリジン アナロ
グＳ−（２−アミノエチル）システインに耐性である
か、あるいは調節のために重要な代謝物質に対して栄養
要求性であり、かつＬ−アミノ酸、例えばＬ−リジンを
製造するものが得られる。
選択法および突然変異選択法を用いて改善される。この
方法で、菌株は、代謝拮抗物質、例えばリジン アナロ
グＳ−（２−アミノエチル）システインに耐性である
か、あるいは調節のために重要な代謝物質に対して栄養
要求性であり、かつＬ−アミノ酸、例えばＬ−リジンを
製造するものが得られる。
【０００５】数年来、組み換えＤＮＡ技術の方法は、個
々の生合成遺伝子を増幅させ、かつアミノ酸生産の効果
を試験することによって、アミノ酸を生産するコリネバ
クテリウム菌株を改良するために同様に使用されてい
る。この課題に関する文献は、すなわち、キノシタ（Ki
noshita）（“Glutamic Acid Bacteria”, in: Biology
of Industrial Microorganisms, Demain and Solomon
(Eds.), Benjamin Cummings, London, UK, 1985, 115〜
142）、ヒリガー（Hilliger） (BioTec 2, 40〜44 (199
1) )、エッゲリング（Eggeling） (Amino Acids 6: 261
〜272 (1994) )、ジェッテンおよびシンスキー（Jetten
and Sinskey）(Critical Reviews in Biotechnology 1
5, 73〜103 (1995) )およびシャームら（Sahm et al.）
(Annualsof the New York Academy of Science 782, 2
5〜39 (1996) ）で見出されてもよい。
々の生合成遺伝子を増幅させ、かつアミノ酸生産の効果
を試験することによって、アミノ酸を生産するコリネバ
クテリウム菌株を改良するために同様に使用されてい
る。この課題に関する文献は、すなわち、キノシタ（Ki
noshita）（“Glutamic Acid Bacteria”, in: Biology
of Industrial Microorganisms, Demain and Solomon
(Eds.), Benjamin Cummings, London, UK, 1985, 115〜
142）、ヒリガー（Hilliger） (BioTec 2, 40〜44 (199
1) )、エッゲリング（Eggeling） (Amino Acids 6: 261
〜272 (1994) )、ジェッテンおよびシンスキー（Jetten
and Sinskey）(Critical Reviews in Biotechnology 1
5, 73〜103 (1995) )およびシャームら（Sahm et al.）
(Annualsof the New York Academy of Science 782, 2
5〜39 (1996) ）で見出されてもよい。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、アミ
ノ酸、特にＬ−リジンの改善された発酵生産に関する新
規の方法を提供することである。
ノ酸、特にＬ−リジンの改善された発酵生産に関する新
規の方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明の目的は次のよう
にして達成された。
にして達成された。
【０００８】アミノ酸、特にＬ−リジンはヒト医学、製
薬工業および特に動物飼料学において使用される。した
がって、アミノ酸、特にＬ−リジンを製造する新規の改
善された方法を提供することは、一般に重要である。
薬工業および特に動物飼料学において使用される。した
がって、アミノ酸、特にＬ−リジンを製造する新規の改
善された方法を提供することは、一般に重要である。
【０００９】続くＬ−リジンまたはリジンの任意の記載
は、塩基だけではなく、しかしながら塩、例えばリジン
一塩酸塩またはリジン硫酸塩を意味すべきである。
は、塩基だけではなく、しかしながら塩、例えばリジン
一塩酸塩またはリジン硫酸塩を意味すべきである。
【００１０】本発明は、次の群、 ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％
同一であるポリヌクレオチド、 ｂ）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０
％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド、 ｃ）ポリヌクレオチドａ）またはｂ）に対して相補的な
ポリヌクレオチド、かつ ｄ）ポリヌクレオチド配列ａ）、ｂ）またはｃ）の連続
するヌクレオチド少なくとも１５個を有するポリヌクレ
オチドから選択されたポリヌクレオチド配列を有するコ
リネフォルム細菌から単離されたポリヌクレオチドを供
給する。
コードするポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％
同一であるポリヌクレオチド、 ｂ）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０
％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド、 ｃ）ポリヌクレオチドａ）またはｂ）に対して相補的な
ポリヌクレオチド、かつ ｄ）ポリヌクレオチド配列ａ）、ｂ）またはｃ）の連続
するヌクレオチド少なくとも１５個を有するポリヌクレ
オチドから選択されたポリヌクレオチド配列を有するコ
リネフォルム細菌から単離されたポリヌクレオチドを供
給する。
【００１１】本発明は、請求項１に記載のポリヌクレオ
チドを提供し、この場合、これは好ましくは：（ｉ）配
列番号１に示されたヌクレオチド配列、または、（ｉ
ｉ）遺伝暗号の縮退の範囲内で配列（ｉ）と一致する配
列少なくとも一つ、または、（ｉｉｉ）配列（ｉ）また
は（ｉｉ）の相補的配列とハイブリダイズする配列少な
くとも一つ、かつ場合によっては、（ｉｖ）（ｉ）中の
機能中立センス突然変異を有する複製可能なＤＮＡから
成る。
チドを提供し、この場合、これは好ましくは：（ｉ）配
列番号１に示されたヌクレオチド配列、または、（ｉ
ｉ）遺伝暗号の縮退の範囲内で配列（ｉ）と一致する配
列少なくとも一つ、または、（ｉｉｉ）配列（ｉ）また
は（ｉｉ）の相補的配列とハイブリダイズする配列少な
くとも一つ、かつ場合によっては、（ｉｖ）（ｉ）中の
機能中立センス突然変異を有する複製可能なＤＮＡから
成る。
【００１２】また、本発明は、配列番号１に示されたヌ
クレオチド配列を含有する、請求項４に記載のポリヌク
レオチド、配列番号２に示されたアミノ酸配列を有する
ポリペプチドをコードする、請求項６に記載のポリヌク
レオチド、請求項１に記載のポリヌクレオチドを有する
ベクター、特にシャトルベクターまたはプラスミドベク
ター、ならびにベクターを有するホスト細胞として作用
する、コリネフォルム細菌を提供する。
クレオチド配列を含有する、請求項４に記載のポリヌク
レオチド、配列番号２に示されたアミノ酸配列を有する
ポリペプチドをコードする、請求項６に記載のポリヌク
レオチド、請求項１に記載のポリヌクレオチドを有する
ベクター、特にシャトルベクターまたはプラスミドベク
ター、ならびにベクターを有するホスト細胞として作用
する、コリネフォルム細菌を提供する。
【００１３】また、本発明は、実際に、適した遺伝子ラ
イブラリーのハイブリダイゼーションによるスクリーニ
ングによって得ることが可能なポリヌクレオチド配列か
ら成るポリヌクレオチドを提供し、この場合、これは配
列番号１によるポリヌクレオチド配列を有する完全な遺
伝子、ならびに配列番号１によって示されたポリヌクレ
オチド配列を有するプローブ、またはこれらのフラグメ
ントを含み、かつ示されたＤＮＡ配列を単離する。
イブラリーのハイブリダイゼーションによるスクリーニ
ングによって得ることが可能なポリヌクレオチド配列か
ら成るポリヌクレオチドを提供し、この場合、これは配
列番号１によるポリヌクレオチド配列を有する完全な遺
伝子、ならびに配列番号１によって示されたポリヌクレ
オチド配列を有するプローブ、またはこれらのフラグメ
ントを含み、かつ示されたＤＮＡ配列を単離する。
【００１４】本発明によるポリヌクレオチド配列はＲＮ
Ａ、ｃＤＮＡおよびＤＮＡのためのハイブリダイゼーシ
ョンプローブとして、ホスホフルクトキナーゼをコード
する全長のｃＤＮＡを単離し、かつこのようなｃＤＮＡ
または遺伝子、ホスホフルクトキナーゼの配列と高レベ
ルの類似性を示す配列を単離するために適している。
Ａ、ｃＤＮＡおよびＤＮＡのためのハイブリダイゼーシ
ョンプローブとして、ホスホフルクトキナーゼをコード
する全長のｃＤＮＡを単離し、かつこのようなｃＤＮＡ
または遺伝子、ホスホフルクトキナーゼの配列と高レベ
ルの類似性を示す配列を単離するために適している。
【００１５】さらに本発明のポリヌクレオチド配列は、
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ホスホフル
クトキナーゼをコードする遺伝子のＤＮＡを製造するた
めのプライマーとして適している。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ホスホフル
クトキナーゼをコードする遺伝子のＤＮＡを製造するた
めのプライマーとして適している。
【００１６】プローブまたはプライマーとして作用する
このようなオリゴヌクレオチドは、少なくとも３０個、
好ましくは少なくとも２０個、特に好ましくは少なくと
も１５個の連続するヌクレオチドを有する。また、少な
くとも４０個または５０個のヌクレオチドの長さを有す
るオリゴヌクレオチドは適している。
このようなオリゴヌクレオチドは、少なくとも３０個、
好ましくは少なくとも２０個、特に好ましくは少なくと
も１５個の連続するヌクレオチドを有する。また、少な
くとも４０個または５０個のヌクレオチドの長さを有す
るオリゴヌクレオチドは適している。
【００１７】「単離された」はその本来の環境から分離
されたことを意味する。
されたことを意味する。
【００１８】「ポリヌクレオチド」は一般に、ポリリボ
ヌクレオチドおよびポリデオキシリボヌクレオチドに関
し、この場合、このＲＮＡまたはＤＮＡは未修飾である
か、あるいは修飾されていてもよい。
ヌクレオチドおよびポリデオキシリボヌクレオチドに関
し、この場合、このＲＮＡまたはＤＮＡは未修飾である
か、あるいは修飾されていてもよい。
【００１９】「ポリペプチド」は、ペプチド結合によっ
てつながれた２個またはそれ以上のアミノ酸を含むペプ
チドまたはタンパク質を意味する。
てつながれた２個またはそれ以上のアミノ酸を含むペプ
チドまたはタンパク質を意味する。
【００２０】本発明によるポリペプチドは、配列番号２
のポリペプチド、特にホスホフルクトキナーゼの生物学
的活性を有するものおよびさらには配列番号２のポリペ
プチドに対して少なくとも７０％、好ましくは８０％お
よび特に好ましくは９０％〜９５％同一であり、かつ示
された活性を表すポリペプチドを含む。
のポリペプチド、特にホスホフルクトキナーゼの生物学
的活性を有するものおよびさらには配列番号２のポリペ
プチドに対して少なくとも７０％、好ましくは８０％お
よび特に好ましくは９０％〜９５％同一であり、かつ示
された活性を表すポリペプチドを含む。
【００２１】さらに、本発明は、コリネフォルム細菌を
用いて、アミノ酸、特にＬ−リジンを発酵生産する方法
に関し、この場合、これは、特にすでにアミノ酸を生産
し、かつそのｐｆｋＡ遺伝子をコードするヌクレオチド
配列が増幅され、特に過剰に発現される。
用いて、アミノ酸、特にＬ−リジンを発酵生産する方法
に関し、この場合、これは、特にすでにアミノ酸を生産
し、かつそのｐｆｋＡ遺伝子をコードするヌクレオチド
配列が増幅され、特に過剰に発現される。
【００２２】これに関連して、「増幅」の用語は微生物
中で一つまたはそれ以上の酵素の細胞内活性の増加を示
し、この場合、この酵素は相当するＤＮＡによってコー
ドされており、例えば一つまたは複数の遺伝子のコピー
数の増加によって、高められた活性を有する相当する酵
素をコードする強いプロモーターまたは遺伝子を使用す
ることによって、かつ場合によっては、これらの方法を
組み合わせることによってコードされる。
中で一つまたはそれ以上の酵素の細胞内活性の増加を示
し、この場合、この酵素は相当するＤＮＡによってコー
ドされており、例えば一つまたは複数の遺伝子のコピー
数の増加によって、高められた活性を有する相当する酵
素をコードする強いプロモーターまたは遺伝子を使用す
ることによって、かつ場合によっては、これらの方法を
組み合わせることによってコードされる。
【００２３】本発明によって提供された微生物は、Ｌ−
アミノ酸、特にＬ−リジンを、グルコース、ショ糖、ラ
クトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプ
ン、セルロースまたはグリセロールおよびエタノールか
ら製造することができる。微生物はコリネフォルム細菌
の典型的なもの、特にコリネバクテリウム属を含んでも
よい。コリネバクテリウム属の中では、コリネバクテリ
ウムグルタミクム種が特に挙げられてもよく、この場
合、これはＬ−アミノ酸を製造するその能力に関して当
業者に公知である。
アミノ酸、特にＬ−リジンを、グルコース、ショ糖、ラ
クトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプ
ン、セルロースまたはグリセロールおよびエタノールか
ら製造することができる。微生物はコリネフォルム細菌
の典型的なもの、特にコリネバクテリウム属を含んでも
よい。コリネバクテリウム属の中では、コリネバクテリ
ウムグルタミクム種が特に挙げられてもよく、この場
合、これはＬ−アミノ酸を製造するその能力に関して当
業者に公知である。
【００２４】コリネバクテリウム属、特にコリネバクテ
リウムグルタミクム種の適した菌株は、例えば公知の野
生型菌株 コリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３
２ コリネバクテリウム アセトグルタミクム（Corynebact
erium acetoglutamicum） ＡＴＣＣ１５８０６ コリネバクテリウム アセトアシドフィルム（Coryneba
cterium acetoacidophilum） ＡＴＣＣ１３８７０ コリネバクテリウム セルモアミノジェネス（Coryneba
cterium thermoaminogenes） ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３
９ コリネバクテリウム メラッセコラ（Corynebacterium
melassecola） ＡＴＣＣ１７９６５ ブレビバクテリウム フラブム（Brevibacterium flavu
m） ＡＴＣＣ１４０６７ ブレビバクテリウム ラクトフェルメントウム（Brevib
acterium lactofermentum） ＡＴＣＣ１３８６９およ
びブレビバクテリウム ジバリカトウム（Brevibacteri
um divaricatum） ＡＴＣＣ１４０２０であり、かつ、
Ｌ−リジン生産突然変異株またはそれから製造された菌
株、例えば、 コリネバクテリウム グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ１７
０９ ブレビバクテリウム フラブム ＦＥＲＭ−Ｐ１７０８ ブレビバクテリウム ラクトフェルメントウム ＦＥＲ
Ｍ−Ｐ１７１２ コリネバクテリウム グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ６４
６３ コリネバクテリウム グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ６４
６４およびコリネバクテリウム グルタミクム ＤＳＭ
５７１５である。
リウムグルタミクム種の適した菌株は、例えば公知の野
生型菌株 コリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３
２ コリネバクテリウム アセトグルタミクム（Corynebact
erium acetoglutamicum） ＡＴＣＣ１５８０６ コリネバクテリウム アセトアシドフィルム（Coryneba
cterium acetoacidophilum） ＡＴＣＣ１３８７０ コリネバクテリウム セルモアミノジェネス（Coryneba
cterium thermoaminogenes） ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３
９ コリネバクテリウム メラッセコラ（Corynebacterium
melassecola） ＡＴＣＣ１７９６５ ブレビバクテリウム フラブム（Brevibacterium flavu
m） ＡＴＣＣ１４０６７ ブレビバクテリウム ラクトフェルメントウム（Brevib
acterium lactofermentum） ＡＴＣＣ１３８６９およ
びブレビバクテリウム ジバリカトウム（Brevibacteri
um divaricatum） ＡＴＣＣ１４０２０であり、かつ、
Ｌ−リジン生産突然変異株またはそれから製造された菌
株、例えば、 コリネバクテリウム グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ１７
０９ ブレビバクテリウム フラブム ＦＥＲＭ−Ｐ１７０８ ブレビバクテリウム ラクトフェルメントウム ＦＥＲ
Ｍ−Ｐ１７１２ コリネバクテリウム グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ６４
６３ コリネバクテリウム グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ６４
６４およびコリネバクテリウム グルタミクム ＤＳＭ
５７１５である。
【００２５】本発明において、酵素 ホスホフルクトキ
ナーゼ（EC 2.7.1.11）をコードする新規ｐｆｋＡ遺伝
子を、Ｃ．グルタミクムから単離することに成功した。
ナーゼ（EC 2.7.1.11）をコードする新規ｐｆｋＡ遺伝
子を、Ｃ．グルタミクムから単離することに成功した。
【００２６】Ｃ．グルタミクムからのｐｆｋＡ遺伝子ま
たは他の遺伝子は、最初にこの微生物の遺伝子ライブラ
リーをＥ．Ｃｏｌｉ中で構築することによって単離され
る。遺伝子ライブラリーの構築は、一般に公知の教科書
および指示書に記載されている。挙げられてもよい例は
ウイナッカー（Winnacker）、Ｇｅｎｅ ｕｎｄ Ｋｌ
ｏｎｅ，Ｅｉｎｅ Ｅｉｎｆｕｅｈｒｕｎｇ ｉｎ ｄ
ｉｅ Ｇｅｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ（Verlag Chemie,
Weinheim, Germany, 1990）またはザンブルックら（Sa
mbrook et al.）による指示書、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ（Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989）で
ある。よく知られた遺伝子ライブラリーの一つは、Ｅ．
Ｃｏｌｉ Ｋ−１２菌株 Ｗ３１１０のものであり、こ
の場合、これはコハラら（Kohara et al.）によって、
λ−ベクター中に構築された。ベイスら（Bathe et a
l.）（Molecular and General Genetics, 252: 255〜26
5, 1996）はＣ．グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３２の
遺伝子ライブラリーを記載しており、この場合、これは
コスミドベクター ＳｕｐｅｒＣｏｓＩ（Wahl et al.,
1987, Proceedingsof the National Academy of Sicenc
es USA, 84: 2160〜2164）を用いて、Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｋ
−１２菌株ＮＭ５５４（Raleigh et al., 1988, Nuclei
c Acids Research 16: 1563〜1575）中で構築された。
また、ボルマンら（Boermann et al.）（Molecular Mic
robiology 6(3), 317〜326, 1992）は、コスミド ｐＨ
Ｃ７９（Hohn and Collins, Gene 11, 291〜298 (198
0)）を用いて、Ｃ．グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３２
の遺伝子ライブラリーを示している。Ｅ．Ｃｏｌｉ中の
Ｃ．グルタミクムの遺伝子ライブラリーは、プラスミ
ド、例えばｐＢＲ３２２（Bolivar Life Sciences, 25,
807〜818 (1979)）またはｐＵＣ９（Vieira et al., 1
982, Gene, 19: 259〜268）を用いて製造されてもよ
い。適したホストは特に制限性の欠如および組み換え系
の欠如を有する前記のＥ．Ｃｏｌｉ菌株である。このよ
うな菌株の一つの例は、菌株ＤＨ５αｍｃｒであり、こ
の場合、これはグラントら（Grant et al.）によって記
載されている（Proceedings of the National Academy
of Sciences USA, 87 (1990) 4645〜4649）。コスミド
の補助によってクローン化された長いＤＮＡフラグメン
トは、その後順に、シークエンシングに適した通常のベ
クター中にサブクローニングされてもよく、その後に、
例えばサンガーら（Sanger et al.）によって記載され
たようにシークエンシングされてもよい（Proceedings
of National Academy of Sciences of the UnitedState
s of America, 74: 5463〜5467, 1977）。
たは他の遺伝子は、最初にこの微生物の遺伝子ライブラ
リーをＥ．Ｃｏｌｉ中で構築することによって単離され
る。遺伝子ライブラリーの構築は、一般に公知の教科書
および指示書に記載されている。挙げられてもよい例は
ウイナッカー（Winnacker）、Ｇｅｎｅ ｕｎｄ Ｋｌ
ｏｎｅ，Ｅｉｎｅ Ｅｉｎｆｕｅｈｒｕｎｇ ｉｎ ｄ
ｉｅ Ｇｅｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ（Verlag Chemie,
Weinheim, Germany, 1990）またはザンブルックら（Sa
mbrook et al.）による指示書、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ（Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989）で
ある。よく知られた遺伝子ライブラリーの一つは、Ｅ．
Ｃｏｌｉ Ｋ−１２菌株 Ｗ３１１０のものであり、こ
の場合、これはコハラら（Kohara et al.）によって、
λ−ベクター中に構築された。ベイスら（Bathe et a
l.）（Molecular and General Genetics, 252: 255〜26
5, 1996）はＣ．グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３２の
遺伝子ライブラリーを記載しており、この場合、これは
コスミドベクター ＳｕｐｅｒＣｏｓＩ（Wahl et al.,
1987, Proceedingsof the National Academy of Sicenc
es USA, 84: 2160〜2164）を用いて、Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｋ
−１２菌株ＮＭ５５４（Raleigh et al., 1988, Nuclei
c Acids Research 16: 1563〜1575）中で構築された。
また、ボルマンら（Boermann et al.）（Molecular Mic
robiology 6(3), 317〜326, 1992）は、コスミド ｐＨ
Ｃ７９（Hohn and Collins, Gene 11, 291〜298 (198
0)）を用いて、Ｃ．グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３２
の遺伝子ライブラリーを示している。Ｅ．Ｃｏｌｉ中の
Ｃ．グルタミクムの遺伝子ライブラリーは、プラスミ
ド、例えばｐＢＲ３２２（Bolivar Life Sciences, 25,
807〜818 (1979)）またはｐＵＣ９（Vieira et al., 1
982, Gene, 19: 259〜268）を用いて製造されてもよ
い。適したホストは特に制限性の欠如および組み換え系
の欠如を有する前記のＥ．Ｃｏｌｉ菌株である。このよ
うな菌株の一つの例は、菌株ＤＨ５αｍｃｒであり、こ
の場合、これはグラントら（Grant et al.）によって記
載されている（Proceedings of the National Academy
of Sciences USA, 87 (1990) 4645〜4649）。コスミド
の補助によってクローン化された長いＤＮＡフラグメン
トは、その後順に、シークエンシングに適した通常のベ
クター中にサブクローニングされてもよく、その後に、
例えばサンガーら（Sanger et al.）によって記載され
たようにシークエンシングされてもよい（Proceedings
of National Academy of Sciences of the UnitedState
s of America, 74: 5463〜5467, 1977）。
【００２７】ｐｆｋＡ遺伝子をコードし、かつ配列番号
１として本発明によって提供されたＣ．グルタミクムか
らの新規ＤＮＡ配列は、この方法で得られた。相当する
タンパク質のアミノ酸配列は、さらに前記の方法を用い
て前記ＤＮＡ配列から推定される。配列番号２は、得ら
れたｐｆｋＡ遺伝子の生成物の得られるアミノ酸配列を
示す。
１として本発明によって提供されたＣ．グルタミクムか
らの新規ＤＮＡ配列は、この方法で得られた。相当する
タンパク質のアミノ酸配列は、さらに前記の方法を用い
て前記ＤＮＡ配列から推定される。配列番号２は、得ら
れたｐｆｋＡ遺伝子の生成物の得られるアミノ酸配列を
示す。
【００２８】また、遺伝子暗号の縮退から生じるコーデ
ィングＤＮＡ配列も本発明によって提供される。さらに
配列番号１または配列番号１の一部分とハイブリダイズ
するＤＮＡ配列も本発明によって提供される。タンパク
質中のアミノ酸の保存的置換、例えばグリジンからアラ
ニンへの置換またはアスパラギン酸からグルタミン酸へ
の置換は、当業者の間では「センス突然変異」として公
知であり、この場合、これは結果としてタンパク質の活
性で本質的な変更を生じない、すなわち、これは機能的
に中立なものである。さらに、タンパク質のＮ末端およ
び／またはＣ末端への変更は実際には支障がないか、あ
るいはそれどころか機能を安定化させる。当業者はすな
わちこれに関する情報をベン・バサットら（Ben-Bassat
et al）（Journal of Bacteriology 169: 751〜757 (1
987)）、オリーガンら（O′Reganet al.）（Gene 77: 2
37〜251 (1989)）、サーヒン・トースら（Sahin-Toth e
tal.）（Protein Sciences 3: 240〜247 (1994)）、ホ
ーチュリら（Hochuli etal.）（Bio/Technology 6: 132
1〜1325 (1988)）および遺伝子学および分子生物学の公
知の教科書中で見出すことができる。配列番号２から相
当する方法で得られるアミノ酸配列は、さらに本発明に
よって提供される。同様に、また、配列番号１または配
列番号１の一部分とハイブリダイズするＤＮＡ配列は、
本発明によって提供される。最終的に、配列番号１から
得られたプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）によって製造されるＤＮＡ配列も本発明によって
提供される。このようなオリゴヌクレオチドは、典型的
には少なくとも１５個のヌクレオチドの長さを有する。
ィングＤＮＡ配列も本発明によって提供される。さらに
配列番号１または配列番号１の一部分とハイブリダイズ
するＤＮＡ配列も本発明によって提供される。タンパク
質中のアミノ酸の保存的置換、例えばグリジンからアラ
ニンへの置換またはアスパラギン酸からグルタミン酸へ
の置換は、当業者の間では「センス突然変異」として公
知であり、この場合、これは結果としてタンパク質の活
性で本質的な変更を生じない、すなわち、これは機能的
に中立なものである。さらに、タンパク質のＮ末端およ
び／またはＣ末端への変更は実際には支障がないか、あ
るいはそれどころか機能を安定化させる。当業者はすな
わちこれに関する情報をベン・バサットら（Ben-Bassat
et al）（Journal of Bacteriology 169: 751〜757 (1
987)）、オリーガンら（O′Reganet al.）（Gene 77: 2
37〜251 (1989)）、サーヒン・トースら（Sahin-Toth e
tal.）（Protein Sciences 3: 240〜247 (1994)）、ホ
ーチュリら（Hochuli etal.）（Bio/Technology 6: 132
1〜1325 (1988)）および遺伝子学および分子生物学の公
知の教科書中で見出すことができる。配列番号２から相
当する方法で得られるアミノ酸配列は、さらに本発明に
よって提供される。同様に、また、配列番号１または配
列番号１の一部分とハイブリダイズするＤＮＡ配列は、
本発明によって提供される。最終的に、配列番号１から
得られたプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）によって製造されるＤＮＡ配列も本発明によって
提供される。このようなオリゴヌクレオチドは、典型的
には少なくとも１５個のヌクレオチドの長さを有する。
【００２９】当業者は、ハイブリダイゼーションによっ
てＤＮＡ配列を同定するための指示書、すなわち、ベー
リンガー・マンハイム社（Boehinger Mannheim GmbH）
（Mannheim, Germany, 1993）からの解説書「The DIG S
ystem Users Guide for Filter Hybridaization」およ
びリーブルら（Liebl et al.）（International Journa
l of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255〜260）
によって見出すことができる。当業者は、ポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてのＤＮＡ配列の増幅に関す
る指示書、すなわち、ガイト（Gait）による解説書、オ
リゴヌクレオチド合成（Oligonucleotide synthesis）:
プラクティカルアプローチ（IRL Press, Oxford, UK, 1
984 ）ならびにニュートンおよびグラハム（Newton & G
raham）、ＰＣＲ（Spektrum Akademischer Verlag, Hei
delberg, Germany, 1994）で見出すことができる。
てＤＮＡ配列を同定するための指示書、すなわち、ベー
リンガー・マンハイム社（Boehinger Mannheim GmbH）
（Mannheim, Germany, 1993）からの解説書「The DIG S
ystem Users Guide for Filter Hybridaization」およ
びリーブルら（Liebl et al.）（International Journa
l of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255〜260）
によって見出すことができる。当業者は、ポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてのＤＮＡ配列の増幅に関す
る指示書、すなわち、ガイト（Gait）による解説書、オ
リゴヌクレオチド合成（Oligonucleotide synthesis）:
プラクティカルアプローチ（IRL Press, Oxford, UK, 1
984 ）ならびにニュートンおよびグラハム（Newton & G
raham）、ＰＣＲ（Spektrum Akademischer Verlag, Hei
delberg, Germany, 1994）で見出すことができる。
【００３０】本発明者らによって、コリネフォルム細菌
は、ｐｆｋＡ遺伝子が一度でも過剰に発現されると、改
善された方法でＬ−アミノ酸、特にＬ−リジンを生産す
ることが見出された。
は、ｐｆｋＡ遺伝子が一度でも過剰に発現されると、改
善された方法でＬ−アミノ酸、特にＬ−リジンを生産す
ることが見出された。
【００３１】過剰発現は、相当する遺伝子のコピー数を
増大させるか、あるいはプロモーターおよび調節領域ま
たは構造遺伝子の上流に位置するリボソーム結合部位を
突然変異させることによって達成されてもよい。構造遺
伝子の上流に組み込まれた発現カセットは、同様の方法
で作用する。誘導プロモーターを使用することによっ
て、Ｌ−リジンの発酵生産中に発現を増大させることは
付加的に可能である。また、発現はｍＲＮＡの寿命を延
長させる方法によって改善される。さらに酵素活性は、
酵素タンパク質の変性を防ぐことによって増幅される。
遺伝子または遺伝子構造物は、種々のコピー数でプラス
ミド中に存在してもよいし、あるいは染色体中に組み込
まれ、増幅されていてもよい。あるいは、考えられ得る
遺伝子の過剰な発現は、栄養媒体の組成および培養条件
を修正することによって達成されてもよい。
増大させるか、あるいはプロモーターおよび調節領域ま
たは構造遺伝子の上流に位置するリボソーム結合部位を
突然変異させることによって達成されてもよい。構造遺
伝子の上流に組み込まれた発現カセットは、同様の方法
で作用する。誘導プロモーターを使用することによっ
て、Ｌ−リジンの発酵生産中に発現を増大させることは
付加的に可能である。また、発現はｍＲＮＡの寿命を延
長させる方法によって改善される。さらに酵素活性は、
酵素タンパク質の変性を防ぐことによって増幅される。
遺伝子または遺伝子構造物は、種々のコピー数でプラス
ミド中に存在してもよいし、あるいは染色体中に組み込
まれ、増幅されていてもよい。あるいは、考えられ得る
遺伝子の過剰な発現は、栄養媒体の組成および培養条件
を修正することによって達成されてもよい。
【００３２】当業者は、これに関するガイドラインを、
すなわち、マーチンら（Martin etal.）（Bio/Technolo
gy 5, 137〜146 (1987)）、ゲレロら(Guerrero et al.)
（Gene 138, 35〜41 (1994)）、ツチヤおよびモリナガ
（Tsuchiya and Mirinaga）（Bio/Technology 6, 428〜
430 (1988) ）、エイクマンら（Eikmanns et al.）（Ge
ne 102, 93〜98 (1991) ）、ヨーロッパ特許（EP 04728
69）、米国特許第４６０１８９３号明細書、シュバルツ
アーおよびピューラー (Schwarzer and Puehler)（Bio/
Technology 9, 84〜87 (1991) ）、レインシェイドら
（Reinscheid et al.）(Applied and Environmental Mi
crobiology 60, 126〜132 (1994))、ラバルレら（Labar
re et al.）（Journal of Bateriology 175, 1001〜100
7 (1993) ）、特許出願ＷＯ９６／１５２４６、マルブ
レスら（Malumbres et al.）（Gene 134, 15〜24 (199
3) ）、特開平１０−２２９８９１、ジェンセンおよび
ハマー（Jensen and Hammer）（Biotechnology and Bio
engineering 58, 191〜195 (1998) ）、マクリド（Makr
ides）（Microbiological Reviews 60: 512〜538 (199
6) ）ならびに遺伝子学および分子生物学の公知の教科
書で見出すことができる。
すなわち、マーチンら（Martin etal.）（Bio/Technolo
gy 5, 137〜146 (1987)）、ゲレロら(Guerrero et al.)
（Gene 138, 35〜41 (1994)）、ツチヤおよびモリナガ
（Tsuchiya and Mirinaga）（Bio/Technology 6, 428〜
430 (1988) ）、エイクマンら（Eikmanns et al.）（Ge
ne 102, 93〜98 (1991) ）、ヨーロッパ特許（EP 04728
69）、米国特許第４６０１８９３号明細書、シュバルツ
アーおよびピューラー (Schwarzer and Puehler)（Bio/
Technology 9, 84〜87 (1991) ）、レインシェイドら
（Reinscheid et al.）(Applied and Environmental Mi
crobiology 60, 126〜132 (1994))、ラバルレら（Labar
re et al.）（Journal of Bateriology 175, 1001〜100
7 (1993) ）、特許出願ＷＯ９６／１５２４６、マルブ
レスら（Malumbres et al.）（Gene 134, 15〜24 (199
3) ）、特開平１０−２２９８９１、ジェンセンおよび
ハマー（Jensen and Hammer）（Biotechnology and Bio
engineering 58, 191〜195 (1998) ）、マクリド（Makr
ides）（Microbiological Reviews 60: 512〜538 (199
6) ）ならびに遺伝子学および分子生物学の公知の教科
書で見出すことができる。
【００３３】例として、本発明によるｐｆｋＡ遺伝子を
プラスミドの補助によって過剰に発現させた。
プラスミドの補助によって過剰に発現させた。
【００３４】適したプラスミドは、コリネフォルム細菌
中で複製されたプラスミドである。多くの公知のプラス
ミドベクター、例えばｐＺｌ（Menkel et al., Applied
andEnvironmental Microbiology (1989) 64: 549〜55
4）、ｐＥＫＥｘ１（Eikmanns et al., Gene 102: 93〜
98 (1991) ）またはｐＨＳ２−１（Sonnen et al., Gen
e 107: 69〜74 (1991)）は、内在プラスミドｐＨＭ１５
１９、ｐＢＬ１またはｐＧＡ１に基づく。他のプラスミ
ドベクター、例えばｐＣＧ４（US-A 4489160）に基づく
もの、あるいはｐＮＧ２（Serwold-Davis et al., FEMS
MicrobiologyLetters 66, 119〜124 (1990)）、あるい
はｐＡＧ１（US-A 5158891）は同様の方法で使用されて
もよい。
中で複製されたプラスミドである。多くの公知のプラス
ミドベクター、例えばｐＺｌ（Menkel et al., Applied
andEnvironmental Microbiology (1989) 64: 549〜55
4）、ｐＥＫＥｘ１（Eikmanns et al., Gene 102: 93〜
98 (1991) ）またはｐＨＳ２−１（Sonnen et al., Gen
e 107: 69〜74 (1991)）は、内在プラスミドｐＨＭ１５
１９、ｐＢＬ１またはｐＧＡ１に基づく。他のプラスミ
ドベクター、例えばｐＣＧ４（US-A 4489160）に基づく
もの、あるいはｐＮＧ２（Serwold-Davis et al., FEMS
MicrobiologyLetters 66, 119〜124 (1990)）、あるい
はｐＡＧ１（US-A 5158891）は同様の方法で使用されて
もよい。
【００３５】他の適したプラスミドベクターは、染色体
への組み込みによって実施されてもよい遺伝子増幅の補
助を含むものであり、例えば、これはレインシェイドら
（Reinsheid et al.）（Applied and Environmental Mi
crobiology 60, 126〜132 (1994) ）によって、ｈｏｍ
−ｔｈｒＢオペロンの重複または増幅のために記載され
ている。この方法において、完全な遺伝子はホスト（典
型的にはＥ．Ｃｏｌｉ）中で複製することができるプラ
スミドベクター中にクローニングされるが、しかしなが
ら、Ｃ．グルタミクム中ではない。考えられ得るベクタ
ーは、例えばｐＳＵＰ３０１（Simon et al., Bio/Tech
nology 1, 784〜791 (1983) ）、ｐＫ１８ｍｏｂまたは
ｐＫ１９ｍｏｂ（Schaefer et al., Gene 145, 69〜73
(1994)）、ｐＧＥＭ−Ｔ（Promega corporation, Madis
on, WI, USA）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Shuman (199
4). Journal of Biological Chemisty 269: 32678〜84;
US-A 5487993）、ｐＣＲ（登録商標）Ｂｌｕｎｔ（Inv
itrogen, Groningen, Netherlands; Bernard et al., J
ournal of Molecular Biology, 234: 534〜541(1993)）
またはｐＥＭ１（Schrumpf et al.,1991, Journal of B
acteriology 173: 4510〜4516）である。増幅されるべ
き遺伝子を含むプラスミドベクターはその後に望ましい
Ｃ．グルタミクム菌株中に接合（conjugation）か形質
転換によってトランスファーされる。接合法は、例えば
シェーファーら（Schaefer et al.）（Applied and Env
iromental Microbiology 60, 756〜759 (1994)）に記載
されている。形質転換法は、例えばチェールバッハら
（Theirbach et al.）（Applied Microbiology and Bio
technology 29, 356〜362 (1988)）、ダニカンおよびシ
ビナン（Dunican and Shivinan）(Bio/Technology 7, 1
067〜1070 (1989))およびタウチら（Tauch et al.）（F
EMS Microbiological Letters 123, 343〜347(1994)）
に記載されている。“乗り換え”による均質な組み換え
の後に、生じる菌株は本発明の遺伝子のコピー少なくと
も２個を有する。
への組み込みによって実施されてもよい遺伝子増幅の補
助を含むものであり、例えば、これはレインシェイドら
（Reinsheid et al.）（Applied and Environmental Mi
crobiology 60, 126〜132 (1994) ）によって、ｈｏｍ
−ｔｈｒＢオペロンの重複または増幅のために記載され
ている。この方法において、完全な遺伝子はホスト（典
型的にはＥ．Ｃｏｌｉ）中で複製することができるプラ
スミドベクター中にクローニングされるが、しかしなが
ら、Ｃ．グルタミクム中ではない。考えられ得るベクタ
ーは、例えばｐＳＵＰ３０１（Simon et al., Bio/Tech
nology 1, 784〜791 (1983) ）、ｐＫ１８ｍｏｂまたは
ｐＫ１９ｍｏｂ（Schaefer et al., Gene 145, 69〜73
(1994)）、ｐＧＥＭ−Ｔ（Promega corporation, Madis
on, WI, USA）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Shuman (199
4). Journal of Biological Chemisty 269: 32678〜84;
US-A 5487993）、ｐＣＲ（登録商標）Ｂｌｕｎｔ（Inv
itrogen, Groningen, Netherlands; Bernard et al., J
ournal of Molecular Biology, 234: 534〜541(1993)）
またはｐＥＭ１（Schrumpf et al.,1991, Journal of B
acteriology 173: 4510〜4516）である。増幅されるべ
き遺伝子を含むプラスミドベクターはその後に望ましい
Ｃ．グルタミクム菌株中に接合（conjugation）か形質
転換によってトランスファーされる。接合法は、例えば
シェーファーら（Schaefer et al.）（Applied and Env
iromental Microbiology 60, 756〜759 (1994)）に記載
されている。形質転換法は、例えばチェールバッハら
（Theirbach et al.）（Applied Microbiology and Bio
technology 29, 356〜362 (1988)）、ダニカンおよびシ
ビナン（Dunican and Shivinan）(Bio/Technology 7, 1
067〜1070 (1989))およびタウチら（Tauch et al.）（F
EMS Microbiological Letters 123, 343〜347(1994)）
に記載されている。“乗り換え”による均質な組み換え
の後に、生じる菌株は本発明の遺伝子のコピー少なくと
も２個を有する。
【００３６】アミノ酸、特にはＬ−リジンを製造するた
めに、ｐｆＫＡ遺伝子ばかりでなく、解糖系、アナプレ
ロティック代謝経路、クエン酸回路またはアミノ酸排出
の特別な生合成経路の酵素一つまたはそれ以上を増殖さ
せるか、あるいは過剰に発現させることは付加的に有利
であってもよい。
めに、ｐｆＫＡ遺伝子ばかりでなく、解糖系、アナプレ
ロティック代謝経路、クエン酸回路またはアミノ酸排出
の特別な生合成経路の酵素一つまたはそれ以上を増殖さ
せるか、あるいは過剰に発現させることは付加的に有利
であってもよい。
【００３７】Ｌ−リジンを製造するために、例えば、次
の群から選択された一つまたはそれ以上の遺伝子を同時
に過剰に発現させることは可能である。
の群から選択された一つまたはそれ以上の遺伝子を同時
に過剰に発現させることは可能である。
【００３８】●ジヒドロピコリネート シンターゼをコ
ードするｄａｐＡ遺伝子（EP-B 0197335）または ●グリセルアルデヒド−３−リン酸 デヒドロゲナーゼ
をコードするｇａｐ遺伝子（Eikmanns (1992), Journal
of Bacteriology 174: 6076〜6086）または ●トリオースリン酸 イソメラーゼをコードするｔｐｉ
遺伝子（Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 1
74: 6076〜6086）または ●３−ホスホグリセレート キナーゼをコードするｐｇ
ｋ遺伝子（Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology
174: 6076〜6086）または ●ピルベート カルボキシラーゼをコードするｐｙｃ遺
伝子（Eikmanns (1992),Journal of Bacteriology 174:
6076〜6086）または ●リジン排出をコードするｌｙｓＥ遺伝子（ＤE-A-195
48 222）。
ードするｄａｐＡ遺伝子（EP-B 0197335）または ●グリセルアルデヒド−３−リン酸 デヒドロゲナーゼ
をコードするｇａｐ遺伝子（Eikmanns (1992), Journal
of Bacteriology 174: 6076〜6086）または ●トリオースリン酸 イソメラーゼをコードするｔｐｉ
遺伝子（Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 1
74: 6076〜6086）または ●３−ホスホグリセレート キナーゼをコードするｐｇ
ｋ遺伝子（Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology
174: 6076〜6086）または ●ピルベート カルボキシラーゼをコードするｐｙｃ遺
伝子（Eikmanns (1992),Journal of Bacteriology 174:
6076〜6086）または ●リジン排出をコードするｌｙｓＥ遺伝子（ＤE-A-195
48 222）。
【００３９】さらにアミノ酸、特にＬ−リジンの製造の
ために付加的にｐｆｋＡ遺伝子を増幅させ、同時に次の
遺伝子を転写減衰（attenuate）することも有利であっ
てもよい。
ために付加的にｐｆｋＡ遺伝子を増幅させ、同時に次の
遺伝子を転写減衰（attenuate）することも有利であっ
てもよい。
【００４０】●ホスホエノルピルベート カルボキシラ
ーゼをコードするｐｃｋ遺伝子（DE 19950 409.1, DSM
13047）および／または ●グリコース６−リン酸 イソメラーゼをコードするｐ
ｇｉ遺伝子（US 09/396478, DSM12969）。
ーゼをコードするｐｃｋ遺伝子（DE 19950 409.1, DSM
13047）および／または ●グリコース６−リン酸 イソメラーゼをコードするｐ
ｇｉ遺伝子（US 09/396478, DSM12969）。
【００４１】さらにアミノ酸、特にＬ−リジンの製造の
ために、ｐｆｋＡ遺伝子を過剰に発現させ、好ましくな
い二次反応を抑制することは有利であってもよい（Naka
yama: “Breeding of Amino Acid Producing Micro-org
anisms”, in : Overproduction of Microbial Product
s, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Pres
s, London, UK, 1982）。
ために、ｐｆｋＡ遺伝子を過剰に発現させ、好ましくな
い二次反応を抑制することは有利であってもよい（Naka
yama: “Breeding of Amino Acid Producing Micro-org
anisms”, in : Overproduction of Microbial Product
s, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Pres
s, London, UK, 1982）。
【００４２】アミノ酸、特にＬ−リジンを製造する目的
のために、本発明によって製造された微生物を連続的ま
たは断続的に、回分法または半回分法または反復半回分
法を用いて培養してもよい。公知の培養方法の概略は、
シェミール（schmiel）による教科書(Bioprozesstechni
k 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik (Gust
av Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))またはストーハ
ス（Storhas）による教科書(Bioreaktoren und periphe
re Einrichtungen（Vieweg Verlag, Braunschweig/Wies
baden, 1994））で得られる。
のために、本発明によって製造された微生物を連続的ま
たは断続的に、回分法または半回分法または反復半回分
法を用いて培養してもよい。公知の培養方法の概略は、
シェミール（schmiel）による教科書(Bioprozesstechni
k 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik (Gust
av Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))またはストーハ
ス（Storhas）による教科書(Bioreaktoren und periphe
re Einrichtungen（Vieweg Verlag, Braunschweig/Wies
baden, 1994））で得られる。
【００４３】使用されるべき培地は、特別な菌株の要求
を十分に満たすものでなければならない。種々の微生物
のための培地はアメリカンソサエティー・フォー・バク
テリオロジー（American Society for Bacteriology）
（Washington D.C., USA 1981）からの“Ｍａｎｕａｌ
ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ”に記載されている。使用され
てもよい炭素源は糖および炭化水素、例えばグルコー
ス、ショ糖、ラクトース、フルクトース、マルトース、
糖蜜、デンプンおよびセルロース、油および脂肪、例え
ば大豆油、ヒマワリ油、落花生油およびココナッツ油、
脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸およびリノ
レイン酸、アルコール、例えばグリセロールおよびエタ
ノール、かつ有機酸、例えば酢酸である。前記物質は別
個にかまたは混合物として使用されてもよい。使用され
てもよい窒素源は、窒素含有有機化合物、例えばペプト
ン、イーストエクストラクト、肉エキス、麦芽エキス、
コーン浸漬液、大豆ミールおよび尿素または無機化合
物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン
酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニ
ウムである。窒素源は別個にかまたは混合物として使用
されてもよい。使用されてもよいリン源は、リン酸、リ
ン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは
相当するナトリウム含有塩である。培地は付加的に、成
長に必要な金属塩、例えば硫酸マグネシウムまたは硫酸
鉄を含んでいなければならない。最終的に、必須成長促
進物質、例えばアミノ酸およびビタミンは前記物質に加
えて使用することができる。さらに適した前駆物質は、
培地に添加されてもよい。示された供給物質は単一回分
として培地に添加されるか、あるいは培養中に適切に供
給されてもよい。
を十分に満たすものでなければならない。種々の微生物
のための培地はアメリカンソサエティー・フォー・バク
テリオロジー（American Society for Bacteriology）
（Washington D.C., USA 1981）からの“Ｍａｎｕａｌ
ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ”に記載されている。使用され
てもよい炭素源は糖および炭化水素、例えばグルコー
ス、ショ糖、ラクトース、フルクトース、マルトース、
糖蜜、デンプンおよびセルロース、油および脂肪、例え
ば大豆油、ヒマワリ油、落花生油およびココナッツ油、
脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸およびリノ
レイン酸、アルコール、例えばグリセロールおよびエタ
ノール、かつ有機酸、例えば酢酸である。前記物質は別
個にかまたは混合物として使用されてもよい。使用され
てもよい窒素源は、窒素含有有機化合物、例えばペプト
ン、イーストエクストラクト、肉エキス、麦芽エキス、
コーン浸漬液、大豆ミールおよび尿素または無機化合
物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン
酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニ
ウムである。窒素源は別個にかまたは混合物として使用
されてもよい。使用されてもよいリン源は、リン酸、リ
ン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは
相当するナトリウム含有塩である。培地は付加的に、成
長に必要な金属塩、例えば硫酸マグネシウムまたは硫酸
鉄を含んでいなければならない。最終的に、必須成長促
進物質、例えばアミノ酸およびビタミンは前記物質に加
えて使用することができる。さらに適した前駆物質は、
培地に添加されてもよい。示された供給物質は単一回分
として培地に添加されるか、あるいは培養中に適切に供
給されてもよい。
【００４４】塩基性化合物、例えば水酸化ナトリウム、
水酸化カリウム、アンモニアまたはアンモニア水、ある
いは酸性化合物、例えばリン酸または硫酸は培地のｐＨ
を調整するために適切に使用されてもよい。起泡は、起
泡抑制剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルを使用
することによって調整されてもよい。プラスミド安定性
は、適した培地に選択的作用物質、例えば抗生物質を添
加することによって保持することができる。酸素または
酸素含有ガス混合物、例えば空気は、空気条件を維持す
るために培地中に装入される。培養温度は通常２０℃〜
４５℃、かつ好ましくは２５℃〜４０℃である。培養は
リジンの最大量が形成されるまで続けられる。この目的
は、通常１０〜１６０時間内で達成される。
水酸化カリウム、アンモニアまたはアンモニア水、ある
いは酸性化合物、例えばリン酸または硫酸は培地のｐＨ
を調整するために適切に使用されてもよい。起泡は、起
泡抑制剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルを使用
することによって調整されてもよい。プラスミド安定性
は、適した培地に選択的作用物質、例えば抗生物質を添
加することによって保持することができる。酸素または
酸素含有ガス混合物、例えば空気は、空気条件を維持す
るために培地中に装入される。培養温度は通常２０℃〜
４５℃、かつ好ましくは２５℃〜４０℃である。培養は
リジンの最大量が形成されるまで続けられる。この目的
は、通常１０〜１６０時間内で達成される。
【００４５】Ｌ−リジンの分析は、スパックマンら（Sp
ackman et al.）で記載されたようにアニオン交換クロ
マトグラフィーおよび後のニンヒドリン誘導体化によっ
ておこなわれてもよい（Analytical Chemistry, 30, (1
958), 1190）。
ackman et al.）で記載されたようにアニオン交換クロ
マトグラフィーおよび後のニンヒドリン誘導体化によっ
ておこなわれてもよい（Analytical Chemistry, 30, (1
958), 1190）。
【００４６】本発明による方法の目的は、アミノ酸、例
えばＬ−リジンの発酵生産である。
えばＬ−リジンの発酵生産である。
【００４７】
【実施例】本発明は以下の実施例によってより詳細に例
証される。
証される。
【００４８】例１ コリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３
２からのゲノミックコスミド遺伝子ライブラリーの作製 コリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３
２からの染色体ＤＮＡをタウチら（Tauch et al.）（19
55, Plasmid 33: 168〜179）で記載されたように単離
し、かつ部分的に制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（Amersham Pha
rmacia, Freiburg, Germany, Product description Sau
3AI, code no. 27-0913-02）で切断した。ＤＮＡフラグ
メントを、エビ アルカリフォスファターゼ（shrimp a
lkaline phosphatase）（Roche Molecular Biochemical
s, Mannheim, Germany, product description SAP, cod
e no. 1758250）で脱リン酸化した。ストラタジーン社
（Stratagene）（La Jolla, USA, product description
SuperCos1 Cosmid Vector kit, code no. 251301）か
ら購入したコスミドベクター ＳｕｐｅｒＣｏｓ１のＤ
ＮＡ（Wahl et al. (1987) Proceedings of the Nation
al Academy of SciencesUSA 84: 2160〜2164）を、制限
酵素ＸｂａＩ（Amersham Pharmacia, Freiburg,German
y, product description XbaI, code no. 27-0948-02）
で切断し、かつ、さらにエビ アルカリフォスファター
ゼで脱リン酸化した。その後にコスミドＤＮＡを制限酵
素ＢａｍＨＩ（Amersham Pharmacia, Freiburg, German
y, product description BamHI, code no. 27-0868-0
4）で切断した。この方法で処理されたコスミドＤＮＡ
を、処理されたＡＴＣＣ１３０３２のＤＮＡと混合さ
せ、かつ回分をＴ４ＤＮＡリガーゼ（Amersham Pharmac
ia, Freiburg, Germany, product description T4 DNA
Ligase, code no. 27-0870-04）で処理した。ライゲー
ション混合物をその後にギガパックＩＩＸＬパッキング
エクストラクト（Stratagene, La Jolla, USA, product
description Gigapack II XL Packing Extract,code n
o. 200217）を用いてファージ中でパックした。Ｅ．Ｃ
ｏｌｉ菌株ＮＭ５５４（Raleigh et al. 1988, Nucleic
Acid Res. 16:1563〜1575）を、１０ｍＭＭｇＳＯ4中
の細胞を懸濁することによって感染させ、かつこれをフ
ァージ懸濁液のアリコートと混合させた。コスミドライ
ブラリーを感染させ、かつサンブルックら（Sambrook e
t al.）（1989, Molecular Cloning: A laboratory Man
ual, Cold Spring Harbor）で記載されたように滴定
し、この場合、この細胞をアンピシリン１００μｇ／ｍ
ｌを含むＬＢアガー（Lannox, 1955, Virology, 1:19
0）上に播いた。３７℃で一晩の培養後に、独立した組
み換えクローンを選択した。
２からのゲノミックコスミド遺伝子ライブラリーの作製 コリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３
２からの染色体ＤＮＡをタウチら（Tauch et al.）（19
55, Plasmid 33: 168〜179）で記載されたように単離
し、かつ部分的に制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（Amersham Pha
rmacia, Freiburg, Germany, Product description Sau
3AI, code no. 27-0913-02）で切断した。ＤＮＡフラグ
メントを、エビ アルカリフォスファターゼ（shrimp a
lkaline phosphatase）（Roche Molecular Biochemical
s, Mannheim, Germany, product description SAP, cod
e no. 1758250）で脱リン酸化した。ストラタジーン社
（Stratagene）（La Jolla, USA, product description
SuperCos1 Cosmid Vector kit, code no. 251301）か
ら購入したコスミドベクター ＳｕｐｅｒＣｏｓ１のＤ
ＮＡ（Wahl et al. (1987) Proceedings of the Nation
al Academy of SciencesUSA 84: 2160〜2164）を、制限
酵素ＸｂａＩ（Amersham Pharmacia, Freiburg,German
y, product description XbaI, code no. 27-0948-02）
で切断し、かつ、さらにエビ アルカリフォスファター
ゼで脱リン酸化した。その後にコスミドＤＮＡを制限酵
素ＢａｍＨＩ（Amersham Pharmacia, Freiburg, German
y, product description BamHI, code no. 27-0868-0
4）で切断した。この方法で処理されたコスミドＤＮＡ
を、処理されたＡＴＣＣ１３０３２のＤＮＡと混合さ
せ、かつ回分をＴ４ＤＮＡリガーゼ（Amersham Pharmac
ia, Freiburg, Germany, product description T4 DNA
Ligase, code no. 27-0870-04）で処理した。ライゲー
ション混合物をその後にギガパックＩＩＸＬパッキング
エクストラクト（Stratagene, La Jolla, USA, product
description Gigapack II XL Packing Extract,code n
o. 200217）を用いてファージ中でパックした。Ｅ．Ｃ
ｏｌｉ菌株ＮＭ５５４（Raleigh et al. 1988, Nucleic
Acid Res. 16:1563〜1575）を、１０ｍＭＭｇＳＯ4中
の細胞を懸濁することによって感染させ、かつこれをフ
ァージ懸濁液のアリコートと混合させた。コスミドライ
ブラリーを感染させ、かつサンブルックら（Sambrook e
t al.）（1989, Molecular Cloning: A laboratory Man
ual, Cold Spring Harbor）で記載されたように滴定
し、この場合、この細胞をアンピシリン１００μｇ／ｍ
ｌを含むＬＢアガー（Lannox, 1955, Virology, 1:19
0）上に播いた。３７℃で一晩の培養後に、独立した組
み換えクローンを選択した。
【００４９】例２ ｐｆＫＡ遺伝子の単離およびシークエンシング 別個のコロニーからのコスミドＤＮＡをキアプレップ
スピン ミニプレップキット（Qiaprep Spin Miniprep
Kit）（製品番号27106, Qiagen, Hilden, Germany）を
用いて製品取り扱い説明書に従って単離し、かつ部分的
に制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（Amersham Pharmacia, Freibu
rg, Germany, product description Sau3AI, 製品番号2
7-0913-02）で切断した。ＤＮＡフラグメントをエビ
アルカリフォスファターゼ（shrimp alkaline phosphat
ase）（Roche molecular Biochemicals, Mannheim, Ger
many, product description SAP, 製品番号1758250）で
脱リン酸化した。ゲル電気泳動によって分離して直ぐ
に、１５００〜２０００ｂｐの大きさのコスミドフラグ
メントをキアＥＸＩＩ ゲル抽出キット（QiaEXIIGel E
xtraction kit）（製品番号20021, Qiagen, Hilden, Ge
rmany）を用いて単離した。インビトロジェン社（Invit
rogen）から購入したシークエンシングベクターｐＺｅ
ｒｏ−１のＤＮＡ（Groningen, Netherlands, product
descriptionZero Background Cloning kit, 製品番号K2
500-01）を制限酵素ＢａｍＨＩ（Amersham Pharmacia,
Freiburg, Germany, product description BamHI, 製品
番号27-0868-04）で切断した。シークエンシングベクタ
ーｐＺｅｒｏ−１中へのコスミドフラグメントのライゲ
ーションをサンブルックら（Sambrook et al.）による
記載のようにおこない（1989, Molecular Cloning: A l
aboratory Manual, Cold Spring Harbor）、この場合、
このＤＮＡ混合物をＴ４リガーゼ（PharmaciaBiotech,
Freiburg, Germany）で一晩培養した。このライゲーシ
ョン混合物をその後にＥ．Ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５αＭＣＲ
（Grant, 1990, Proceedings of the National Academy
of Siences U.S.A., 87: 4645〜4649）（Tauch et al.
1994, FEMS Microbiol Letters, 123: 343〜７）中に
電気穿孔し、かつゼオシン（Zeocin）５０μｇ／ｍｌを
含むＬＢアガー（Lennox, 1955, Virology, 1:190）上
に播いた。組み換えクローンのプラスミドをバイオロボ
ット９６００（Biorobot 9600）（製品番号900200, Qia
gen, Hilden, Germany）を用いて調製した。シークエン
シングをサンガーら（Sanger et al.）によるジデオキ
シ連鎖停止法（Dideoxychain termination method）（1
977, Proceedings of the National Academy of Scienc
es U.S.A., 74: 5463〜5467）を用いてジメルマンら（Z
immermann et al.）（1990, Nucleic Acids Research,
18: 1067）によって修正されたようにおこなった。ＰＥ
アプライド バイシステムズ（PE Applied Biosystem
s）からの“ＲＲ ｄローダミン ターミネーター サ
イクル シークエンシング キット（RR dRhodamin ter
minator Cycle sequencing kit）”（製品番号403044,
Weiterstadt, Germany）を使用した。ゲル電気泳動によ
る分離およびシークエンシング反応の分析を、“ローチ
ホレース（Rotiphorese）ＮＦ”アクリルアミド／ビス
アクリルアミドゲル（２９：１）（製品番号A124.1, Ro
th, Karlsruhe, Germany）中で、ＰＥ アプライド バ
イオシステムズ（PE Applied Biosystems）からの“Ａ
ＢＩ Ｐｒｉｓｍ３７７シークエンサー”（Weiterstad
t, Germany）を用いておこなった。
スピン ミニプレップキット（Qiaprep Spin Miniprep
Kit）（製品番号27106, Qiagen, Hilden, Germany）を
用いて製品取り扱い説明書に従って単離し、かつ部分的
に制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（Amersham Pharmacia, Freibu
rg, Germany, product description Sau3AI, 製品番号2
7-0913-02）で切断した。ＤＮＡフラグメントをエビ
アルカリフォスファターゼ（shrimp alkaline phosphat
ase）（Roche molecular Biochemicals, Mannheim, Ger
many, product description SAP, 製品番号1758250）で
脱リン酸化した。ゲル電気泳動によって分離して直ぐ
に、１５００〜２０００ｂｐの大きさのコスミドフラグ
メントをキアＥＸＩＩ ゲル抽出キット（QiaEXIIGel E
xtraction kit）（製品番号20021, Qiagen, Hilden, Ge
rmany）を用いて単離した。インビトロジェン社（Invit
rogen）から購入したシークエンシングベクターｐＺｅ
ｒｏ−１のＤＮＡ（Groningen, Netherlands, product
descriptionZero Background Cloning kit, 製品番号K2
500-01）を制限酵素ＢａｍＨＩ（Amersham Pharmacia,
Freiburg, Germany, product description BamHI, 製品
番号27-0868-04）で切断した。シークエンシングベクタ
ーｐＺｅｒｏ−１中へのコスミドフラグメントのライゲ
ーションをサンブルックら（Sambrook et al.）による
記載のようにおこない（1989, Molecular Cloning: A l
aboratory Manual, Cold Spring Harbor）、この場合、
このＤＮＡ混合物をＴ４リガーゼ（PharmaciaBiotech,
Freiburg, Germany）で一晩培養した。このライゲーシ
ョン混合物をその後にＥ．Ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５αＭＣＲ
（Grant, 1990, Proceedings of the National Academy
of Siences U.S.A., 87: 4645〜4649）（Tauch et al.
1994, FEMS Microbiol Letters, 123: 343〜７）中に
電気穿孔し、かつゼオシン（Zeocin）５０μｇ／ｍｌを
含むＬＢアガー（Lennox, 1955, Virology, 1:190）上
に播いた。組み換えクローンのプラスミドをバイオロボ
ット９６００（Biorobot 9600）（製品番号900200, Qia
gen, Hilden, Germany）を用いて調製した。シークエン
シングをサンガーら（Sanger et al.）によるジデオキ
シ連鎖停止法（Dideoxychain termination method）（1
977, Proceedings of the National Academy of Scienc
es U.S.A., 74: 5463〜5467）を用いてジメルマンら（Z
immermann et al.）（1990, Nucleic Acids Research,
18: 1067）によって修正されたようにおこなった。ＰＥ
アプライド バイシステムズ（PE Applied Biosystem
s）からの“ＲＲ ｄローダミン ターミネーター サ
イクル シークエンシング キット（RR dRhodamin ter
minator Cycle sequencing kit）”（製品番号403044,
Weiterstadt, Germany）を使用した。ゲル電気泳動によ
る分離およびシークエンシング反応の分析を、“ローチ
ホレース（Rotiphorese）ＮＦ”アクリルアミド／ビス
アクリルアミドゲル（２９：１）（製品番号A124.1, Ro
th, Karlsruhe, Germany）中で、ＰＥ アプライド バ
イオシステムズ（PE Applied Biosystems）からの“Ａ
ＢＩ Ｐｒｉｓｍ３７７シークエンサー”（Weiterstad
t, Germany）を用いておこなった。
【００５０】得られる粗シークエンシングデータをその
後にスターデン ソフトウェア パッケージ（Staden s
oftware package）（1986, Nucleic Acids Research, 1
4: 217〜231）バージョン９７−０を用いて続けた。ｐ
Ｚｅｒｏ１誘導体の別個の配列を、まとまりのあるコン
ティグに組み立てた。コンピューター処理されたコーデ
ィング領域の分析は、ＸＮＩＰソフトウェア（Staden,
1986, Nucleic AcidsResearch, 14: 217〜231）を用い
ておこなった。他の分析を“BLAST search programs”
（Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 2
5: 3389〜3402）を用いて、“National Center for Bio
technology Information”（NCBI, Bethesda, MD, US
A）の非冗長的なデータベースに対しておこなった。
後にスターデン ソフトウェア パッケージ（Staden s
oftware package）（1986, Nucleic Acids Research, 1
4: 217〜231）バージョン９７−０を用いて続けた。ｐ
Ｚｅｒｏ１誘導体の別個の配列を、まとまりのあるコン
ティグに組み立てた。コンピューター処理されたコーデ
ィング領域の分析は、ＸＮＩＰソフトウェア（Staden,
1986, Nucleic AcidsResearch, 14: 217〜231）を用い
ておこなった。他の分析を“BLAST search programs”
（Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 2
5: 3389〜3402）を用いて、“National Center for Bio
technology Information”（NCBI, Bethesda, MD, US
A）の非冗長的なデータベースに対しておこなった。
【００５１】得られるヌクレオチド配列は配列番号１に
示されている。ヌクレオチド配列の分析は１０２９ｂｐ
の転写解読枠を明らかにし、この場合、これはｐｆｋ遺
伝子をデザインした。ｐｆｋ遺伝子は３４３個のアミノ
酸のタンパク質をコードする。
示されている。ヌクレオチド配列の分析は１０２９ｂｐ
の転写解読枠を明らかにし、この場合、これはｐｆｋ遺
伝子をデザインした。ｐｆｋ遺伝子は３４３個のアミノ
酸のタンパク質をコードする。
【００５２】例３ コリネバクテリウムグルタミクム中で過剰に発現するｐ
ｆｋＡのためのプラスミドの製造。
ｆｋＡのためのプラスミドの製造。
【００５３】３．１．ｐＣＲ２−ブラント ベクター中
でのｐｆｋＡのクローニング コリネバクテリウムグルタミクム ＡＴＣＣ１３０３２
からの染色体ＤＮＡを、タウチら（Tauch et al.,）（1
955, Plasmid 33: 168〜179）で示されたように単離し
た。例２から公知のＣ．グルタミクムに関するｐｆｋＡ
遺伝子の配列に基づいて、以下のオリゴヌクレオチドを
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のために選択した：
でのｐｆｋＡのクローニング コリネバクテリウムグルタミクム ＡＴＣＣ１３０３２
からの染色体ＤＮＡを、タウチら（Tauch et al.,）（1
955, Plasmid 33: 168〜179）で示されたように単離し
た。例２から公知のＣ．グルタミクムに関するｐｆｋＡ
遺伝子の配列に基づいて、以下のオリゴヌクレオチドを
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のために選択した：
【００５４】
【化１】
【００５５】示されたプライマーをＭＷＧバイオテク社
（company MWG Biotech）（Ebersberg, Germany）で合
成し、かつＰＣＲ反応をイニスら（Innis et al.）の標
準ＰＣＲ反応（PCR protocols. A guide to methods an
d applications, 1990, Academic Press）に従い、ロッ
シェ バイアグノスティクス社（Roche DiagnosticsGmb
H）（Mannheim, Germany）からのＰｗｏ ポリメラーゼ
を用いておこなった。ｐｆｋＡ遺伝子を有する約１１６
０ｂｐの大きさのＤＮＡフラグメントを、ポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）の補助によって単離した。
（company MWG Biotech）（Ebersberg, Germany）で合
成し、かつＰＣＲ反応をイニスら（Innis et al.）の標
準ＰＣＲ反応（PCR protocols. A guide to methods an
d applications, 1990, Academic Press）に従い、ロッ
シェ バイアグノスティクス社（Roche DiagnosticsGmb
H）（Mannheim, Germany）からのＰｗｏ ポリメラーゼ
を用いておこなった。ｐｆｋＡ遺伝子を有する約１１６
０ｂｐの大きさのＤＮＡフラグメントを、ポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）の補助によって単離した。
【００５６】増幅されたＤＮＡフラグメントをベクター
ｐＣＲ２ブラントベクター（Bernard et al., (1983) J
ournal of Molecular Biology. 234: 534〜541）中に、
インビトロジェン社（Invitrogen Corporation）（Carl
sbad, CA, USA; カタログ番号 K-2700-20）からのゼロ
ブラント ＰＣＲ クローニングキット（Zero Blunt
PCR Cloning kit）を用いてライゲートした。Ｅ．Ｃｏ
ｌｉ菌株 Ｔｏｐ１０Ｆ（Grand et al. (1990) Procee
dings of the National Academy of Sciences,USA. 87:
4645〜4649）を、ライゲーション回分で形質転換し
た。
ｐＣＲ２ブラントベクター（Bernard et al., (1983) J
ournal of Molecular Biology. 234: 534〜541）中に、
インビトロジェン社（Invitrogen Corporation）（Carl
sbad, CA, USA; カタログ番号 K-2700-20）からのゼロ
ブラント ＰＣＲ クローニングキット（Zero Blunt
PCR Cloning kit）を用いてライゲートした。Ｅ．Ｃｏ
ｌｉ菌株 Ｔｏｐ１０Ｆ（Grand et al. (1990) Procee
dings of the National Academy of Sciences,USA. 87:
4645〜4649）を、ライゲーション回分で形質転換し
た。
【００５７】プラスミド含有細胞を、カナマイシン５０
ｍｇ／ｌが補われたＬＢアガー（Sambrok et al., Mole
cular coloning: a laboratory manual. 第２版 Cold S
pring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
N.Y.）上に形質転換回分を播くことによって選択し
た。プラスミドDＮＡを形質転換体から、キアジェン社
（Qiagen）からのキアプレップ スピン ミニプレップ
キット(QIAprep SpinMiniprep kit)を用いて単離し、
かつ制限酵素ＥｃｏＲＩおよび後のアガロースゲル電気
泳動（０．８％）で制限することによって確認した。プ
ラスミドをｐＣＲＢ１−ｐｆＫＡｅｘｐ１と名付けた。
ｍｇ／ｌが補われたＬＢアガー（Sambrok et al., Mole
cular coloning: a laboratory manual. 第２版 Cold S
pring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
N.Y.）上に形質転換回分を播くことによって選択し
た。プラスミドDＮＡを形質転換体から、キアジェン社
（Qiagen）からのキアプレップ スピン ミニプレップ
キット(QIAprep SpinMiniprep kit)を用いて単離し、
かつ制限酵素ＥｃｏＲＩおよび後のアガロースゲル電気
泳動（０．８％）で制限することによって確認した。プ
ラスミドをｐＣＲＢ１−ｐｆＫＡｅｘｐ１と名付けた。
【００５８】３．２．シャトルベクターｐＥＣ−Ｔ１８
ｍｏｂ２の製造 従来の技術に従ってＥ．Ｃｏｌｉ−Ｃ.グルタミクム
シャトルベクターを構築した。ベクターは、プラスミド
ｐＧＡ１の複製領域ｒｅｐを含み、この場合、これは複
製作用物質ｐｅｒ（US-A-5175108; Nesvera et al., Jo
urnal of Bacteriology 179, 1525〜1532 (1997) ）、
テトラサイクリン耐性を付与するプラスミドｐＡＧ１の
ｔｅｔＡ（Ｚ）遺伝子（US-A 5158891; gene library e
ntry atthe National Center for Biotechnology Infor
mation (NCBI, Bethesda, MD, USA) with the accessio
n number AF121000）、プラスミドｐＭＢ１の複製起点
ｏｒｉＶ（Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium
on Quantitative Biology43, 77〜90 (1979)）、ｌａｃ
プロモーターおよびマルチクローニング部位（ｍｃｓ）
（Norrander et al. Gene 26, 101〜106 (1983) ）を含
むＬａｃＺα遺伝子フラグメントおよびプラスミドＲＰ
４のｍｏｂ領域（Simon et al., (1983) Bio/Technolog
y 1: 784〜791）を有する。次いで、構築されたベクタ
ーをＥ．Ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５α中に形質転換した（Hana
han, in: DNA cloning. A practical approach. Vol.
I. IRL-Press, Oxford, Washinton DC, USA）。プラス
ミド含有細胞を、テトラサイクリン５ｍｇ／ｌが補われ
ているＬＢアガー（Sambrook et al., Molecular cloni
ng: a laboratory manual. 第２版 Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.）上に形
質転換回分を播くことによって選択した。プラスミドＤ
ＮＡをキアジェン社（Qiagen）からのキアプレップ ス
ピン ミニプレップ キット（QIAprep Spin Miniprep
kit）を用いて形質転換体から単離し、制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩおよび後のアガロースゲル電
気泳動（０．８％）を用いての制限によって確認した。
プラスミドをｐＥＣ−Ｔ１８ｍｏｂ２と名付け、かつ図
１で示した。
ｍｏｂ２の製造 従来の技術に従ってＥ．Ｃｏｌｉ−Ｃ.グルタミクム
シャトルベクターを構築した。ベクターは、プラスミド
ｐＧＡ１の複製領域ｒｅｐを含み、この場合、これは複
製作用物質ｐｅｒ（US-A-5175108; Nesvera et al., Jo
urnal of Bacteriology 179, 1525〜1532 (1997) ）、
テトラサイクリン耐性を付与するプラスミドｐＡＧ１の
ｔｅｔＡ（Ｚ）遺伝子（US-A 5158891; gene library e
ntry atthe National Center for Biotechnology Infor
mation (NCBI, Bethesda, MD, USA) with the accessio
n number AF121000）、プラスミドｐＭＢ１の複製起点
ｏｒｉＶ（Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium
on Quantitative Biology43, 77〜90 (1979)）、ｌａｃ
プロモーターおよびマルチクローニング部位（ｍｃｓ）
（Norrander et al. Gene 26, 101〜106 (1983) ）を含
むＬａｃＺα遺伝子フラグメントおよびプラスミドＲＰ
４のｍｏｂ領域（Simon et al., (1983) Bio/Technolog
y 1: 784〜791）を有する。次いで、構築されたベクタ
ーをＥ．Ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５α中に形質転換した（Hana
han, in: DNA cloning. A practical approach. Vol.
I. IRL-Press, Oxford, Washinton DC, USA）。プラス
ミド含有細胞を、テトラサイクリン５ｍｇ／ｌが補われ
ているＬＢアガー（Sambrook et al., Molecular cloni
ng: a laboratory manual. 第２版 Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.）上に形
質転換回分を播くことによって選択した。プラスミドＤ
ＮＡをキアジェン社（Qiagen）からのキアプレップ ス
ピン ミニプレップ キット（QIAprep Spin Miniprep
kit）を用いて形質転換体から単離し、制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩおよび後のアガロースゲル電
気泳動（０．８％）を用いての制限によって確認した。
プラスミドをｐＥＣ−Ｔ１８ｍｏｂ２と名付け、かつ図
１で示した。
【００５９】３．３．シャトルベクターｐＥＣ−Ｔ１８
ｍｏｂ２中へのｐｆｋＡのクローニング 使用されたベクターは、例３．２．に示されたＥ．Ｃｏ
ｌｉ−Ｃ．グルタミクム シャトルベクター ｐＥＣ−
Ｔ１８ｍｏｂ２であった。このプラスミドからのＤＮＡ
を制限酵素ＥｃｏＲＩで完全に切断し、かつその後にエ
ビ アルカリホスファターゼ（Shrimp alkaline phosph
atase）（Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, G
ermany, product description SAP, 製品番号1758250）
を用いて脱リン酸化した。
ｍｏｂ２中へのｐｆｋＡのクローニング 使用されたベクターは、例３．２．に示されたＥ．Ｃｏ
ｌｉ−Ｃ．グルタミクム シャトルベクター ｐＥＣ−
Ｔ１８ｍｏｂ２であった。このプラスミドからのＤＮＡ
を制限酵素ＥｃｏＲＩで完全に切断し、かつその後にエ
ビ アルカリホスファターゼ（Shrimp alkaline phosph
atase）（Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, G
ermany, product description SAP, 製品番号1758250）
を用いて脱リン酸化した。
【００６０】ｐｆｋＡ遺伝子を例３．１．に示されたプ
ラスミドｐＣＲＢ１−ｐｆｋＡｅｘｐ１から、酵素Ｅｃ
ｏＲＩを用いての完全な切断によって単離した。約１１
６０ｂｐのｐｆｋＡフラグメントをキアＥＸＩＩ ゲル
抽出キット（QiaEXII Gel Extraction kit）（製品番号
20021, Qiagen, Hilden, Germany）を用いてアガロース
ゲルから単離した。
ラスミドｐＣＲＢ１−ｐｆｋＡｅｘｐ１から、酵素Ｅｃ
ｏＲＩを用いての完全な切断によって単離した。約１１
６０ｂｐのｐｆｋＡフラグメントをキアＥＸＩＩ ゲル
抽出キット（QiaEXII Gel Extraction kit）（製品番号
20021, Qiagen, Hilden, Germany）を用いてアガロース
ゲルから単離した。
【００６１】この方法で得られたｐｆｋＡフラグメント
を、調製したｐＥＣ−Ｔ１８ｍｏｂ２ベクターと混合さ
せ、かつＴ４リガーゼで処理した（Amersham Pharmaci
a, Freiburg, Germany, product description T4 DNA L
igase, code no. 27-0870-04）。次いでライゲーション
回分をＥ．Ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５α（Hanahan, in: DNAcl
oning. A practical approach. Vol. I. IRL-Press, Ox
ford, Washington DC, USA）に形質転換した。プラスミ
ド含有細胞を、テトラサイクリン５ｍｇ／ｌを含むＬＢ
アガー（Lennox, 1995, Virology, 1:190）上に形質転
換回分を播くことによって選択した。３７℃で一晩の培
養の後に、独立した組み換えクローンを選択した。プラ
スミドＤＮＡをキア スピン ミニプレップ キット
（Qia Spin Miniprep kit）（製品番号27106, Qiagen,
Hilden, Germany）を用いて製品取り扱い説明書に従っ
て形質転換体から単離し、かつ続いてのアガロースゲル
電気泳動によってプラスミドを確認するために制限酵素
ＥｃｏＲＩで切断した。得られたプラスミドをｐＴ−ｐ
ｆｋＡｅｘｐと名付けた。これを図２に示した。
を、調製したｐＥＣ−Ｔ１８ｍｏｂ２ベクターと混合さ
せ、かつＴ４リガーゼで処理した（Amersham Pharmaci
a, Freiburg, Germany, product description T4 DNA L
igase, code no. 27-0870-04）。次いでライゲーション
回分をＥ．Ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５α（Hanahan, in: DNAcl
oning. A practical approach. Vol. I. IRL-Press, Ox
ford, Washington DC, USA）に形質転換した。プラスミ
ド含有細胞を、テトラサイクリン５ｍｇ／ｌを含むＬＢ
アガー（Lennox, 1995, Virology, 1:190）上に形質転
換回分を播くことによって選択した。３７℃で一晩の培
養の後に、独立した組み換えクローンを選択した。プラ
スミドＤＮＡをキア スピン ミニプレップ キット
（Qia Spin Miniprep kit）（製品番号27106, Qiagen,
Hilden, Germany）を用いて製品取り扱い説明書に従っ
て形質転換体から単離し、かつ続いてのアガロースゲル
電気泳動によってプラスミドを確認するために制限酵素
ＥｃｏＲＩで切断した。得られたプラスミドをｐＴ−ｐ
ｆｋＡｅｘｐと名付けた。これを図２に示した。
【００６２】例４：プラスミドｐＴ−ｐｆｋＡｅｘｐを
用いての菌株ＤＳＭ５７１５の形質転換菌株DSM５７１
５（ＥＰ−Ｂ−0435132）をリーブルら（Liebl et a
l.）によって示された電気泳動法を用いてプラスミドｐ
Ｔ−ｐｆｋＡｅｘｐで形質転換した（FEMS Microbiolog
y Letters, 53: 299〜303 (1989)）。形質転換体の選択
を、脳−心臓浸出液ブイヨン １８．５ｇ／ｌ、０．５
Ｍソルビトール、バクト トリプトン（Bacto trypton
e） ５ｇ／ｌ、バクト イーストエクストラクト（Bac
to yeast extract） ２．５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／
ｌおよびバクトアガー（Bacto agar）１８ｇ／ｌを含む
ＬＢＨＩＳアガー上でおこない、この場合、これはテト
ラサイクリン ５ｍｇ／ｌが補われていた。培養を３３
℃で２日間に亘っておこなった。
用いての菌株ＤＳＭ５７１５の形質転換菌株DSM５７１
５（ＥＰ−Ｂ−0435132）をリーブルら（Liebl et a
l.）によって示された電気泳動法を用いてプラスミドｐ
Ｔ−ｐｆｋＡｅｘｐで形質転換した（FEMS Microbiolog
y Letters, 53: 299〜303 (1989)）。形質転換体の選択
を、脳−心臓浸出液ブイヨン １８．５ｇ／ｌ、０．５
Ｍソルビトール、バクト トリプトン（Bacto trypton
e） ５ｇ／ｌ、バクト イーストエクストラクト（Bac
to yeast extract） ２．５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／
ｌおよびバクトアガー（Bacto agar）１８ｇ／ｌを含む
ＬＢＨＩＳアガー上でおこない、この場合、これはテト
ラサイクリン ５ｍｇ／ｌが補われていた。培養を３３
℃で２日間に亘っておこなった。
【００６３】プラスミドＤＮＡを慣例の方法（Peters-W
endisch et al., 1998, Microbiology, 144, 915〜92
7）を用いて形質転換体から単離し、かつ続いてのアガ
ロースゲル電気泳動によってプラスミドを確認するため
に、制限エンドヌクレースＥｃｏＲＩで切断した。得ら
れた菌株をＤＳＭ５７１５／ｐＴ−ｐｆｋＡｅｘｐと名
付けた。
endisch et al., 1998, Microbiology, 144, 915〜92
7）を用いて形質転換体から単離し、かつ続いてのアガ
ロースゲル電気泳動によってプラスミドを確認するため
に、制限エンドヌクレースＥｃｏＲＩで切断した。得ら
れた菌株をＤＳＭ５７１５／ｐＴ−ｐｆｋＡｅｘｐと名
付けた。
【００６４】例５ リジンの生産 例４で得られたＣ．グルタミクム菌株ＤＳＭ５７１５／
ｐＴ−ｐｆｋＡｅｘｐをリジンの生産に適した栄養媒体
中で培養し、かつ培養上清中のリジン含量を測定した。
ｐＴ−ｐｆｋＡｅｘｐをリジンの生産に適した栄養媒体
中で培養し、かつ培養上清中のリジン含量を測定した。
【００６５】この目的のために、菌株を最初に３３℃で
２４時間に亘って適切な抗生物質を含むアガープレート
（テトラサイクリン（５ｍｇ／ｌ）を含む脳−心臓アガ
ー）上で培養した。このアガープレートから培養を始
め、前培養に接種した（１００ｍｌの三角フラスコ中に
１０ｍｌの培地）。前培養のために使用された培地は完
全培地ＣｇＩＩＩ（ＮａＣｌ ２．５ｇ／ｌ、バクト
ペプトン １０ｇ／ｌ、バクト イーストエクストラク
ト １０ｇ／ｌ、グルコース ２０ｇ／ｌ、ｐＨ７．
４）であった。テトラサイクリン（５ｍｇ／ｌ）をこの
培地に添加した。前培養を振とう器上で２４０ｒｐｍで
３３℃で１６時間に亘って培養した。主培養をこの前培
養から接種し、したがって主培養の最初のＯＤ（６６０
ｎｍ）は０．１であった。ＭＭ培養液を主培養に使用し
た。
２４時間に亘って適切な抗生物質を含むアガープレート
（テトラサイクリン（５ｍｇ／ｌ）を含む脳−心臓アガ
ー）上で培養した。このアガープレートから培養を始
め、前培養に接種した（１００ｍｌの三角フラスコ中に
１０ｍｌの培地）。前培養のために使用された培地は完
全培地ＣｇＩＩＩ（ＮａＣｌ ２．５ｇ／ｌ、バクト
ペプトン １０ｇ／ｌ、バクト イーストエクストラク
ト １０ｇ／ｌ、グルコース ２０ｇ／ｌ、ｐＨ７．
４）であった。テトラサイクリン（５ｍｇ／ｌ）をこの
培地に添加した。前培養を振とう器上で２４０ｒｐｍで
３３℃で１６時間に亘って培養した。主培養をこの前培
養から接種し、したがって主培養の最初のＯＤ（６６０
ｎｍ）は０．１であった。ＭＭ培養液を主培養に使用し
た。
【００６６】 ＭＭ培養液 ＣＳＬ（コーン浸漬液） ５ｇ／ｌ ＭＯＰＳ（モルホリノプロパンスルホン酸） ２０ｇ／ｌ グルコース（別個にオートクレーブしたもの） ５０ｇ／ｌ （ＮＨ4）2ＳＯ4 ２５ｇ／ｌ ＫＨ2ＰＯ4 ０．１ｇ／ｌ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．０ｇ／ｌ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ １０ｍｇ／ｌ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ／ｌ ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ ５．０ｍｇ／ｌ ビオチン（濾過滅菌されたもの） ０．３ｍｇ／ｌ チアミン・ＨＣｌ（濾過滅菌されたもの） ０．２ｍｇ／ｌ Ｌ−ロイシン（濾過滅菌されたもの） ０．１ｇ／ｌ ＣａＣｏ3 ２５ｇ／ｌ ＣＳＬ、ＭＯＰＳおよび塩溶液をアンモニア水を用いて
ｐＨ７に調整し、かつオートクレーブをした。滅菌され
た物質およびビタミン溶液ならびに乾式オートクレーブ
をかけたＣａＣＯ3をその後に添加した。
ｐＨ７に調整し、かつオートクレーブをした。滅菌され
た物質およびビタミン溶液ならびに乾式オートクレーブ
をかけたＣａＣＯ3をその後に添加した。
【００６７】培養をフロースポイラー（flow spoiker）
を備えた１００ｍｌの３角フラスコ中で容量１０ｍｌで
おこなった。カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を添加し
た。培養を３３℃で、かつ大気湿度８０％でおこなっ
た。
を備えた１００ｍｌの３角フラスコ中で容量１０ｍｌで
おこなった。カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を添加し
た。培養を３３℃で、かつ大気湿度８０％でおこなっ
た。
【００６８】２４時間後に、ＯＤをＢｉｏｍｅｋ（バイ
オメク）１０００（Beckmann Instrumants GmbH, Munic
h）を用いて測定波長６６０ｎｍで測定した。形成され
たリジン量を、エッペンドルフビオトロニク社（Eppend
orf-BioTronik）（Hamburg,Germany）からのアミノ酸分
析器を用いてイオン交換クロマトグラフィーおよびニン
ヒドリン検出を含むポストカラム誘導体化反応（post-c
olumn derivatisation）によって測定した。
オメク）１０００（Beckmann Instrumants GmbH, Munic
h）を用いて測定波長６６０ｎｍで測定した。形成され
たリジン量を、エッペンドルフビオトロニク社（Eppend
orf-BioTronik）（Hamburg,Germany）からのアミノ酸分
析器を用いてイオン交換クロマトグラフィーおよびニン
ヒドリン検出を含むポストカラム誘導体化反応（post-c
olumn derivatisation）によって測定した。
【００６９】第１表は試験結果を示す。
【００７０】
【表１】
【００７１】
【配列表】
【００７２】
【外１】
【００７３】
【外２】
【００７４】
【外３】
【００７５】
【外４】
【図１】プラスミドｐＥＣ−Ｔ１８ｍｏｂ２の制限地図
【図２】プラスミドｐＴ−ｐｆｋＡｅｘｐの制限地図
Ｔｅｔ： テトラサイクリン耐性遺伝子 ｏｒｉＶ： Ｅ．Ｃｏｌｉのプラスミド暗号化複製起点 ＲＰ４ｍｏｂ： プラスミド可動化のためのｍｏｂ領域 ｒｅｐ： Ｃ．グルタミクム プラスミドｐＧＡ１から
のプラスミド暗号化複製起点 ｐｅｒ： ｐＧＡ１からのコピー数を調整するための遺
伝子 ｌａｃＺ−ａｌｐｈａ： β−ガラクトシダーゼ遺伝子
のｌａｃＺα遺伝子フラグメント（Ｎ末端） ‘ｌａｃＺａ’： ｌａｃＺα遺伝子フラグメントの
５’末端 ｌａｃＺ−ａｌｐｈａ’： ｌａｃＺα遺伝子フラグメ
ントの３’末端 ｐｆｋＡ：Ｃ．グルタミクム ＡＴＣＣ１３０２２から
のｐｆｋＡ遺伝子 ＢａｍＨＩ：制限酵素ＢａｍＨＩの制限部位 ＥｃｏＲＩ：制限酵素ＥｃｏＲＩの制限部位 ＨｉｎｄＩＩＩ：制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの制限部位 ｋｐｎＩ：制限酵素ｋｐｎＩの制限部位 ＰｓｔＩ：制限酵素ＰｓｔＩの制限部位 ＰｖｕＩ：制限酵素ＰｖｕＩの制限部位 ＳａｌＩ：制限酵素ＳａｌＩの制限部位 ＳａｃＩ：制限酵素ＳａｃＩの制限部位 ＳｍａＩ：制限酵素ＳｍａＩの制限部位 ＳｐｈＩ：制限酵素ＳｐｈＩの制限部位 ＸｂａＩ：制限酵素ＸｂａＩの制限部位 ＸｈｏＩ：制限酵素ＸｈｏＩの制限部位
のプラスミド暗号化複製起点 ｐｅｒ： ｐＧＡ１からのコピー数を調整するための遺
伝子 ｌａｃＺ−ａｌｐｈａ： β−ガラクトシダーゼ遺伝子
のｌａｃＺα遺伝子フラグメント（Ｎ末端） ‘ｌａｃＺａ’： ｌａｃＺα遺伝子フラグメントの
５’末端 ｌａｃＺ−ａｌｐｈａ’： ｌａｃＺα遺伝子フラグメ
ントの３’末端 ｐｆｋＡ：Ｃ．グルタミクム ＡＴＣＣ１３０２２から
のｐｆｋＡ遺伝子 ＢａｍＨＩ：制限酵素ＢａｍＨＩの制限部位 ＥｃｏＲＩ：制限酵素ＥｃｏＲＩの制限部位 ＨｉｎｄＩＩＩ：制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの制限部位 ｋｐｎＩ：制限酵素ｋｐｎＩの制限部位 ＰｓｔＩ：制限酵素ＰｓｔＩの制限部位 ＰｖｕＩ：制限酵素ＰｖｕＩの制限部位 ＳａｌＩ：制限酵素ＳａｌＩの制限部位 ＳａｃＩ：制限酵素ＳａｃＩの制限部位 ＳｍａＩ：制限酵素ＳｍａＩの制限部位 ＳｐｈＩ：制限酵素ＳｐｈＩの制限部位 ＸｂａＩ：制限酵素ＸｂａＩの制限部位 ＸｈｏＩ：制限酵素ＸｈｏＩの制限部位
【手続補正書】
【提出日】平成１２年１２月２０日（２０００．１２．
２０）
２０）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７５】
【外４】
【外５】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 1/20 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15）
Claims (16)
- 【請求項１】 次の群、 ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％
が同一であるポリヌクレオチド、 ｂ）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０
％が同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチド、 ｃ）ポリヌクレオチドａ）またはｂ）に対して相補的な
ポリヌクレオチド、および ｄ）ポリヌクレオチド配列ａ）、ｂ）またはｃ）の連続
する塩基少なくとも１５個を有するポリヌクレオチド から選択されたポリヌクレオチド配列を有するコリネフ
ォルム細菌から単離されたポリヌクレオチド。 - 【請求項２】 ポリヌクレオチドが、好ましくはコリネ
フォルム細菌中で複製可能な組み換えDNAである、請求
項１に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項３】 ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求
項１に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項４】 配列番号１に示された核酸配列を有す
る、請求項２に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項５】 次の群、（ｉ）配列番号１に示されたヌ
クレオチド配列、または（ｉｉ）配列（ｉ）と遺伝暗号
の縮退の範囲内で一致する配列少なくとも一つ、または
（ｉｉｉ）配列（ｉ）または（ｉｉ）に対して相補的な
配列とハイブリダイズする配列少なくとも一つ、かつ場
合によっては、（ｉｖ）（ｉ）中の機能中立センス突然
変異を有する請求項２に記載の複製可能なＤＮＡ。 - 【請求項６】 配列番号２に示されたアミノ酸配列を有
するポリペプチドをコードする、請求項２に記載のポリ
ヌクレオチド配列。 - 【請求項７】 Ｌ−アミノ酸、特にＬ−リジンを発酵生
産する方法において、次の工程、 ａ）少なくともｐｆｋＡ遺伝子またはこの遺伝子をコー
ドするヌクレオチド配列が増幅され、特に過剰に発現さ
れる、Ｌ−アミノ酸を生産するコリネフォルム細菌を発
酵し、 ｂ）培地または細菌の細胞中にＬ−アミノ酸を蓄積さ
せ、かつ、 ｃ）Ｌ−アミノ酸を単離することを特徴とする、Ｌ−ア
ミノ酸、特にＬ−リジンを発酵生産する方法。 - 【請求項８】 望ましいＬ−アミノ酸の生合成経路の他
の遺伝子が付加的に増幅された細菌を使用する、請求項
７に記載の方法。 - 【請求項９】 Ｌ−リジンの形成を減少させる代謝経路
が少なくとも部分的に抑制された細菌を使用する、請求
項７に記載の方法。 - 【請求項１０】 プラスミドベクターで形質転換された
菌株が使用され、かつこのプラスミドベクターがｐｆｋ
遺伝子をコードするヌクレオチド配列を有する、請求項
７に記載の方法。 - 【請求項１１】 Ｌ−リジンを生産するコリネフォルム
細菌を使用する、請求項７から１０までのいずれか１項
に記載の方法。 - 【請求項１２】 次の群、 １２．１ ジヒドロピコリネート シンターゼをコード
するｄａｐＡ遺伝子、 １２．２ ピルベート カルボキシラーゼをコードする
ｐｙｃ遺伝子、 １２．３ トリオースリン酸 イソメラーゼをコードす
るｔｐｉ遺伝子、 １２．４ スクシニルジアミノピメレート デスクシニ
ラーゼをコードするｄａｐＥ遺伝子、 １２．５ グリセルアルデヒド３−リン酸 デヒドロゲ
ナーゼをコードするｇａｐ遺伝子、 １２．６ ３−ホスホグリセレート キナーゼをコード
するｐｇｋ遺伝子、 １２．７ リジンの排出をコードするｌｙｓＥ遺伝子か
ら選択された一つまたはそれ以上の遺伝子が同時に増幅
され、特に過剰に発現される細菌をリジン生産のために
発酵させる、請求項６に記載の方法。 - 【請求項１３】 次の群、 １３．１ ホスホエノルピルベート カルボキシキナー
ゼをコードするｐｃｋ遺伝子、 １３．２ グルコース６−リン酸 イソメラーゼをコー
ドするｐｇｉ遺伝子から選択された一つまたはそれ以上
の遺伝子が同時に転写減衰された細菌を、Ｌ−リジン生
産のために発酵させる、請求項９に記載の方法。 - 【請求項１４】 コリネバクテリウム グルタミクム種
の微生物が使用される、請求項１から１３までのいずれ
か１項に記載の方法。 - 【請求項１５】 ホスホフルクトキナーゼをコードする
遺伝子のＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応によって製造す
るためのプライマーとしての、請求項１に記載のポリヌ
クレオチド配列の使用。 - 【請求項１６】 ハイブリダイゼーションプローブとし
ての請求項１に記載のポリヌクレオチド配列の使用。
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|---|---|---|---|
| DE19956133 | 1999-11-23 | ||
| DE19956133.8 | 1999-11-23 | ||
| DE10011922A DE10011922A1 (de) | 1999-11-23 | 2000-03-11 | Neue für das pfkA-Gen codierende Nukleotidsequenzen |
| DE10011922.0 | 2000-03-11 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000354681A Pending JP2001186896A (ja) | 1999-11-23 | 2000-11-21 | ｐｆｋＡ遺伝子をコードする新規ヌクレオチド配列 |
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