JP2000514799A

JP2000514799A - オリゴヌクレオチドリンカーおよび固定化および結合オリゴヌクレオチドを用いる技術

Info

Publication number: JP2000514799A
Application number: JP10504429A
Authority: JP
Inventors: ヴァーダイン，グレゴリー・エル; ミン，チャンギー
Original assignee: プレジデント・アンド・フェローズ・オブ・ハーバード・カレッジ
Priority date: 1996-07-03
Filing date: 1997-06-30
Publication date: 2000-11-07
Also published as: WO1998000435A3; AU4038997A; EP0917533A2; AU739391B2; WO1998000435A2; CA2259493A1

Abstract

(57)【要約】一本鎖のＤＮＡなどのオリゴヌクレオチドを別の残基または固相に対して結合する技術を提供する。オリゴヌクレオチドを、固相または他の残基に対して結合したキレート化によっても配位される金属イオンに対して配位されうる、６個の隣接したヒスタミニルプリンによって規定されうる結合官能基と一緒に提供する。本発明は、第一鎖を結合性官能基と一緒に提供し、そのＤＮＡを金属アフィニティークロマトグラフィー固相を通過させることにより、ＤＮＡの一方の鎖をその相補物から分割するのに特に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】オリゴヌクレオチドリンカーおよび固定化および結合オリゴヌクレオチドを用いる技術発明の分野本発明は、概して、一本鎖ＤＮＡ分子の製造、そして更に詳しくは、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを用いる一本鎖ＤＮＡの製造に関する。発明の背景分子生物学において最も広く用いられる操作の多くは、プローブまたは鋳型としての一本鎖ＤＮＡの使用に依る。最大約１００個までの残基を含有するＤＮＡの一本鎖は、固相合成によって容易に製造できるが、更に長いオリゴデオキシヌクレオチドは、典型的に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの酵素法によって生じさせなければならない。混合配列ＤＮＡの合成の生化学的手順は、二本鎖生成物を生じるので、所望の鎖をその相補物から分割する方法が必要である。このような分割は、二つの相補鎖の寸法および電荷などの巨視的な物理的性質の類似性によって、および尿素またはグアニジニウム塩酸塩などの強変性剤の存在下で分割が行われる必要があることによって難しいものとなっている。オリゴヌクレオチド上に単一ビオチンを結合した後、そこにアビジンまたはストレプトアビジンを固定されている固体マトリックスを用いてそのオリゴヌクレオチドを固定する技術がある。このアプローチでの問題は、その技術が有効であるために必要な結合が、適当に折畳まれているタンパク質に依存していることである。したがって、その技術は、強変性条件下で用いることができない。更に、その技術を、表面プラスモン共鳴実験のために一本のＤＮＡ鎖を表面固定するのに用いようとする場合、そのアビジン／ビオチンの組合せは、その技術が、固定された鎖に対する一本鎖のＤＮＡの結合を検出するのに用いられた場合に正確さを欠くことがありうる充分な質量を表面に対して加える。したがって、本発明の目的は、ＤＮＡなどのオリゴヌクレオチドまたは一本鎖のＤＮＡを別の残基または表面に対して結合させる向上した技術を提供すること、およびＤＮＡの所望の鎖をその相補物から分割することである。発明の概要本発明は、金属イオンを配位することができる結合残基に対して結合したヌクレオチド、すなわち、式Ｌ_n−Ｎ_y（式中、Ｎはヌクレオチドであり且つＬは、金属イオンを配位することができる残基であり、ｎは少なくとも１であり、そしてｙは少なくとも１である）を有する種を提供する。一つの実施態様によれば、Ｎ_y はＤＮＡであり、そしてＬは、ｎが約６であるヒスタミニルプリンでありうる。もう一つの態様によれば、本発明は、式Ｒ−Ｃｈ−Ｍ−Ｌ_n−Ｎ_yを有する種を提供する。この態様によれば、Ｒは、表面に対して結合されうるまたは化学種若しくは生物学的種に対して結合されうる化学残基である。Ｃｈは、金属イオンを配位することができるキレート化剤であり、Ｍは、そのキレート化剤によって配位された金属イオンであり、Ｎはヌクレオチドであり、Ｌは、金属イオンを配位することができる残基であり、そしてｎおよびｙはそれぞれ少なくとも１である。キレート化剤は、一つの実施態様によれば、四座キレート化剤、例えば、ニトリロトリ酢酸である。本発明はまた、表面上に固定され、そしてオリゴヌクレオチド鎖の変性を引き起こす条件下で相補鎖をその相補鎖から除去することができない程度に表面上に更に固定されているいずれの相補鎖に対してもハイブリッド形成しない一本鎖オリゴヌクレオチドを提供する。その一本鎖の固定化オリゴヌクレオチドはまた、固定化された状態のままで、２Ｍ尿素より苛酷な条件に耐えるであろう。その鎖はＤＮＡの一つの鎖でありうる。もう一つの態様によれば、本発明は方法を提供する。その方法は、オリゴヌクレオチドの第一および第二相補鎖を提供し、固相表面をそれら第一および第二鎖と接触させ、そして第一鎖をその表面で固定させることを含む。第二鎖は表面で固定されることなくその表面から取り除かれる。一つの実施態様において、この態様は、ＤＮＡの第一および第二相補鎖を流動媒体中で提供し、その流動媒体を固相の表面を越えて通過させ、そして第一鎖をその表面で固定させ、同時に第二鎖を固定させることなく流動媒体によってその表面から除去することを含む。本発明の様々な態様を、種々の方法で組合せることができる。例えば、表面上に固定され、そして変性を引き起こす条件下で相補鎖を除去することができない程度に表面上に更に固定されているいずれの相補鎖に対してもハイブリッド形成しない一本鎖オリゴヌクレオチドを、上のＬ_n−Ｎ_yまたはＲ−Ｃｈ−Ｍ−Ｌ_n− Ｎ_yなどの結合を介して固定することができる。更に、その方法は、オリゴヌクレオチドの固定化を促進しうる種のいずれかを用いて実施することができる。本発明の他の利点、新規な特徴および目的は、添付の図面に関連して考えた場合、次の発明の詳細な説明から明らかになるであろう。図面の簡単な説明図１は、金属イオンに対して配位されて結合した結合残基を介して固相表面に対して固定化された二本鎖ＤＮＡの略図である。図２は、一組の実施例で用いられたプライマーおよび二本鎖ＰＣＲ鋳型を模式的に図示する。図３は、本発明の技法を用いるＤＮＡ鎖分割の変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析のフォトコピーである。発明の詳細な説明 Min,C.，Cushing,T.Verdine,G.,”Template-Directed Interference Footprin ting of Protein-Adenine Contacts”,J.Am.Chem.Soc.1996,118,6116-6120；およびMin,C.Verdine,G.,”Immobilized Metal Affinity Chromatography of DNA, ”Nucleic Acids Res.1996,24,3806-3810は両方とも、本明細書中に援用される。本発明は、オリゴヌクレオチドの別の残基に対するまたは固相の表面に対する結合のための結合性官能基を提供するが、ここにおいて固相は、オリゴヌクレオチドを必要とする手順に関連して用いられる媒体中に不溶性の何等かの材料として定義される。その技法は、例えば、クロマトグラフィー固相などの固相表面に対して、または表面プラスモン共鳴（ＳＲＰ）チップ（ＳＰＲの論評については、例えば、Sternberg,ら，“Quantitative Determination of Surface Concentr ation of Protein with Surface Plasmon Resonance Using Radiolabeled Prote ins”,Journal of Colloid and Interface Science,43:513-526,1991,およびその参考文献を参照されたい）などのバイオセンサー要素の表面に対してオリゴヌクレオチドを結合するのに用いることができる。その技法はまた、例えば、オリゴヌクレオチドをバイオアッセイで用いられるビーズ若しくはプレートの表面に対して、蛍光標識などの標識に対してまたは別の分子若しくは固体物質に対して結合するのに用いることができる。本発明は、一般式Ｌ_n−Ｎ_y（式中、Ｎ_yは、ＤＮＡ中の典型である天然若しくは合成の一本鎖若しくは多重鎖オリゴヌクレオチドまたは一本のＤＮＡ鎖であり、そしてＬ_nは結合官能基であり、ここで、Ｌは金属イオンを配位することができる連結残基であり、そしてｎは少なくとも１、好ましくは少なくとも２、そして更に好ましくは少なくとも５である）を有する種を提供することを包含する。好ましい実施態様によれば、ｎは２〜１０であり、そして最も好ましくは約６である。Ｌは、例えば、オリゴヌクレオチド主鎖のエステル結合を介してオリゴヌクレオチドに対して、化学結合しうる分子であり、そしてＬ_nは、下記の一般式Ｉを有する。式中、Ｚは有機残基であり、そしてＹは、金属イオンを配位する能力を有するリガンドであり、ＺおよびＹは一緒に、オリゴヌクレオチド配列中へまたはその上へのＬ_nの包含を可能にする。当業者は、ＹおよびＺを適当に選択して、オリゴヌクレオチド配列との適合性の必要条件を満たすことができる。ＺおよびＹは、単一の有機残基がオリゴヌクレオチド配列と適合性の官能基を与え、そして更に、金属イオンを配位するような単一残基でありうる。典型的に、Ｚは、約１〜約１０個の炭素原子の長さの炭化水素鎖または環状炭化水素基であって、場合により、ヘテロ原子によって中断されている。本明細書中で用いられる「炭化水素」とは、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アルカリル、アラルキル等を含む意味である。ヘテロ基には、−Ｏ−、−ＣＯＮＨ−、 −ＣＯＮＨＣＯ−、−ＮＨ−、−ＣＳＮＨ−、−ＣＯ−、−ＣＳ−、−Ｓ−、− ＳＯ−、−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_nＲ（但し、ｎ＝１〜１０）、−（ＣＦ₂）_n−（但し、ｎ＝１〜１０）、オレフィン等が含まれうる。Ｙ（またはＹおよびＺ一緒に）は、金属アフィニティークロマトグラフィー固相上に固定された金属イオンなどの金属イオン上のフリーの配位部位を、固相によるイオンの完全な配位を伴なうことなく配位することができるリガンドである（例えば、Hochuliら，”New Metal Chelate Adsorbent Selective for Protein s and Peptides Containing Neighboring Histidine Residues”Journal of Chr omatography,411(1987)177-184を参照されたい）。Ｙは、Ｚについて上に定義の通りでありうるが、好ましくは、金属イオン上の空の配位部位に向けることができる−Ｎ−、アルコール、チオール、カルボキシレート（カルボン酸を含む）等のような基を含む。イミダゾール、フェナントロリン、アデニン、シトシンおよびチミンなどの−Ｎ−を含む環状および複素環式有機化合物が適している。更に、ヒスチジン、リシン、システイン、メチオニン、アスパラギン、チロシン、グルタミン、グルタミン酸およびアスパラギン酸などのこれらの基準を満たすアミノ酸が適している。ヒドロキサム酸などの種も適している。若干の場合、上の残基はＺとして働くことができ、上の異なるものまたは別の残基はＹとして働き且つ金属イオンに対する配位の基準を満たす。例えば、プリン、チミン、アデニン、シトシンまたは組合せは、Ｚとして働きうるし、別の核酸、アミノ酸、または窒素含有環状、多環式若しくは複素環式化合物は、Ｙとして働きうる。例えば、プリン、シトシンまたはアデニンがＺとして用いられる場合、利用可能な−ＮＨ₂ −基は、例えば、ヒスタミンによって規定されるＹを結合するのに用いることができる。好ましい実施態様によれば、６−ヒスタミニルプリンはＹを規定し、そしてＺは環状エーテルである（II，下記）。種Ｌ_n−Ｎ_yは、目的の残基または表面に対して結合しているかまたは結合することができるキレート化剤によって部分的に配位した金属イオンと一緒に用いられる。すなわち、それらの種は、式Ｒ−Ｃｈ−Ｌ_n−Ｎ_y （III）（式中、Ｒは、化学的または物理的残基であり、Ｃｈは、金属イオンを配位することができるキレート化剤であり、そしてＭは、そのキレート化剤によって配位された金属イオンである）の組合せで用いられる。Ｒは、金ゾルなどの粒状種、蛍光標識などの標識、別の種との相互作用のための結合パートナーなどの目的の生体分子、クロマトグラフィー固相、または何等かの望ましい表面若しくは種に対する種IIIの結合に作用しうる結合残基若しくは結合可能残基でありうる。種I IIが結合している特定の粒状種または表面は重要ではないが、本発明は、Ｌ_nによってＮ_yをＲに配位する能力にある。 1994年９月26日出願の、現在来国特許第5,620,850号であり、本明細書中に援用された同時係属、同一所有権の米国特許出願第08/312,388号は、本発明で用いるのに適したＣｈおよびＭの種々の組合せを記載している。具体的に、金属イオンは、好ましくは、少なくとも４個の配位部位、好ましくは、６個の配位部位を有するものから選択される。適当な金属イオンの非制限リストには、Ｃｏ³⁺、Ｃｒ³⁺、Ｈｇ²⁺、Ｐｄ²⁺、Ｐｔ²⁺、Ｐｄ⁴⁺、Ｐｔ⁴⁺、Ｒｈ³⁺、Ｉｒ³⁺、Ｒｕ³⁺、Ｃｏ²⁺、Ｎｉ²⁺、Ｃｕ²⁺、Ｚｎ²⁺、Ｃｄ²⁺、Ｐｂ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｆｅ³⁺、Ｆe²⁺、Ａｕ³⁺、Ａｕ⁺、Ａｇ⁺、Ｃｕ⁺、Ｍｏ₂ ²⁺、Ｔｌ³⁺、Ｔｌ⁺、Ｂｉ³⁺、ＣＨ₃Ｈｇ⁺、Ａｌ³⁺、Ｇａ³⁺、Ｃｅ³⁺、ＵＯ₂ ²⁺およびＬａ³⁺が含まれる。キレート化剤は、好ましくは、二座、三座および四座のキレート化剤から選択され、そしてキレート化剤が金属イオンを配位する場合に、金属の少なくとも２個のフリーの配位部位が残るように、金属イオンと組み合わせて選択される。キレート化剤および金属は、金属イオンがキレート化剤によって表面で固定された状態のままであるのに充分な程度の安定性でキレート化剤が金属イオンを配位することができるように選択される。更に、キレート化剤は、そのリンカー残基によって残基Ｒに対して共有結合できるが、共有結合によって妨げられず且つ金属イオンを配位できるキレート化残基を残すように、キレート化残基および非キレート化リンカー残基を有するものとして選択される。或いは、キレート化剤は、そのような合成がキレート化残基を妨げない状態で残す場合、非キレート化リンカー残基を含むように常套の有機合成によって修飾されうるものとして選択することができる。当業者は、非キレート化リンカー残基が、例えば、エステル結合の形成、アミド結合の形成、チオール置換およびチオールエーテル形成等のためのアミン、アルコール、カルバメート、カルボン酸、チオール、アルデヒド、オレフィン等のような化学結合に適当な官能基を与えるはずであることを理解するするであろう。上の考察を留意して、適当なキレート化剤および対応する金属イオンは、当業者によって選択されうる。このような選択にしたがい、“Chelating Agents and Metal Chelatesi”,Dwyer,F.P.;Mellor,D.P.,Academic Press,および“Critica l Stability Constants”,Martell,A.E.;Smith,R.M.,Plenum Press,New Yorkを参照することができる。これらの著作は、種々のキレート化剤を記載し且つキレート化剤と金属イオンとの間の配位の安定性を論評している。好ましくは、キレート化剤および金属イオンは、その組合せの水溶液中での解離定数が、生理学的ｐＨにおいて１０ｎＭより良いように、すなわち、１０ｎＭの濃度において、金属イオンの少なくとも半分がキレート化剤によって配位されるように選択される。適当なキレート化剤の非制限例リストには、ニトリロトリ酢酸、２，２’−ビス（サリチリデンアミノ）−６，６’−デメチルジフェニルおよび１，８−ビス（ａ−ピリジル）−３，６−ジチアオクタンが含まれる。種IIIを用いる一つの好ましい配置の一例として、図１を参照する。ここにおいて、固相表面に対して結合した種２５は、オリゴヌクレオチド、特に、第一鎖１２および６個のヒスタミニルプリンによって規定される結合性官能基（Ｌ_n）１６を含む第二の相補鎖１４を含むＤＮＡ１０を含み、ヒスタミニルプリンの内２個（それぞれ、１８および２０）は、金属イオン２２に対して配位されている。金属イオン２２は、キレート化剤２４（ニトリロトリ酢酸誘導体；図示された通り）によっても配位され、これは、金属イオンの６個の配位部位の内４個を配位して、結合性官能基１６に向けられうる２個のフリーの配位部位を残している。キレート化剤２４は、リンカー２６（炭化水素鎖、図示された通り）によって固相３０の表面２８に対して結合している。キレート化剤２４の、リンカー２６を介する表面２８に対する結合は、共有結合等のような何等かの手段によって達成されうる。一本鎖オリゴヌクレオチドもまた、本発明により、図１で示されたように有効に固定される。一つの実施態様によれば、リンカー２６は、表面２８で複数のリンカー２６の自己集合単層の形成を促進するものとして選択され、そしてリンカー２６は、表面２８に対して結合している官能基中のキレート化剤の反対側の末端で終結し、それによって自己集合した単層の形成を促進する。自己集合した単層の一部分として表面で固定された金属配位キレート化剤のこのような配置は、上で参照された現在は米国特許第5,620,850号の同一所有権の同時係属米国特許出願第08/312,388号に記載されている。自己集合単層形成種は、本明細書中で援用されたKumarおよびWhitesidesの1996年４月30日発行の米国特許第5,512,131号にも記載されている。キレート化剤２４を含有する自己集合単層が、結合性官能基１６を含有するＤＮＡ１０のような種Ｌ_n−Ｎ_yと一緒に用いるために与えられる場合、自己集合した混合単層（上で参照された出願第08/312,388号および米国特許第5,620,850号で定義の通り）、すなわち、種２５以外の少なくとももう一つの自己集合単層形成種の規則正しい集合を含む異種の自己集合単層を形成することは好都合でありうる。約５０％未満の種２５、および約５０％を越える別の種（例えばＬ_nまたはＮ_yと相互作用しない残基で終結するもの）により規定される異種単層、更には、約３０％未満の種２５または約２０％未満の種２５等の比率を有するものを形成することができる。Ｍに対する結合性官能基１６の配位が、二つの隣接した連結残基Lによる結合（図１で図示されたような、ヒスタミニルプリンのＨ）または別の配置を含んでいてよいことは理解されるはずである。更に、結合性官能基１６がＭでフリーの配位部位を配位する能力を有する限りにおいて、結合性官能基１６は、隣接した連結残基Ｌおよび／または連結能力がない１個若しくはそれ以上の中間体残基によって隔てられた連結残基Ｌを含んでいてよい。再度式Ｉを参照すると、Ｙ（およびＺが配位能力を有する場合、Ｚとの組合せでのＹ）およびｎは、例えば、オリゴヌクレオチドを固相で固定するように金属イオンに対して配位されたオリゴヌクレオチドを必要とする手順の経過中にオリゴヌクレオチドが金属イオンから離れた状態にならない程度にオリゴヌクレオチドを金属イオンに対して結合するのに充分な配位能力を有するオリゴヌクレオチドを提供するように選択されるべきである。しかしながら、配位は、Ｌ_nが金属イオンがキレート化剤から取除かれる（したがって、例えば、固相、標識または他の残基から取除かれる）程度にキレート化剤による金属イオンの配位と拮抗するほど強くてはならない。例えば、ほとんどの場合、エチレンジアミン四酢酸などのリガンドは不適当である考えられる。当業者は、“Chelating Agents and M etal Chelates”,Dwyer,F.P.;Mellor,D.P.,Academic Press,および“Critical S tability Constants”,Martell,A.E.;Smith,R.M.,Plenum Press,New Yorkを参照して、適当な基Ｙ（および場合によりＺ）、およびフリーの配位部位の具体的な数を含めた具体的な金属イオンについて反復単位数ｎを選択することができる。若干の場合、配位が、本発明において用いるのには充分であるが、金属イオンがキレート化剤から取除かれるほど安定ではないかどうかを確認するために、具体的なＬ_n／Ｍ−Ｃｈ系を調べることは好都合でありうる。例えば、結合した結合性官能基Ｌ_nを含む２個程度の少ない数のまたは最大約６個または８個までのヌクレオチドを含有する極めて簡単なポリヌクレオチド、すなわち、３’−ＮＮＮＮＮ−Ｌ₆（但し、Ｎはいずれかのヌクレオチドまたは種々のヌクレオチド）を製造することは、当業者にとって常套の実験の範囲内である。次に、試験オリゴヌクレオチドを、Ｔ₄ポリヌクレオチドキナーゼと一緒に、続いてγ³²Ｐ−ＡＴＰと一緒に混合することによって５’末端を放射性標識することができる。次に、そのオリゴヌクレオチドを、固定され配位された金属イオンを含有する樹脂のビーズと一緒に混合することができ、ビーズを洗浄し、そして放射能がビーズに存在するかどうかについて確認を行うことができる。放射能が存在する場合、Ｌ（すなわち、ＹまたはＹおよびＲ一緒に）およびｎの選択は、オリゴヌクレオチドを固定するのに充分であるが、金属イオンがキレート化剤から取除かれるほどではない配位能力を与えるのに適当である。放射能がビーズに存在しない場合、Ｌ、ｎ組合せが不十分な配位を引き起こすかまたは金属イオンが取除かれるほど過度に配位を引き起こすかの確認は、ビーズおよび／またはビーズをフラッシするのに用いられた溶液を紫外分光分析またはＩＣＰに供して、金属イオンの位置を確認することによって行うことができる。これら簡単なスクリーニング技術は、当業者によって、具体的な手順において有用なＤＮＡフラグメントなどの完全なオリゴヌクレオチドの合成を必要とすることなく行うことができる。若干の場合、カラムからの溶離の場合と同様、金属イオンからリンカー−ヌクレオチドを分離できることが望ましいし、そして若干の場合、本質的に不可逆な結合が望ましいと考えられる。したがって、次の試験として、ビーズを、２００ｍＭイミダゾールなどの溶離液でフラッシすることができ、そして放射能がまだビーズに存在するかどうかについて確認を行うことができる。本発明はまた、ビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトアビジン結合を介する、一本鎖オリゴヌクレオチドの表面での固定化にまさる改良を示す。その結合は、僅か最大２モルまでまたはそれ未満の尿素の条件に耐えるであろう。本発明は、２モル尿素より苛酷な条件に耐える固定化を伴なう。本発明のこれらおよび他の実施態様の機能および利点は、下記の実施例から更に充分に理解されるであろう。次の実施例は、本発明の利点を例示するためのものであるが、発明の完全な範囲を示しているのではない。実施例１：金属イオンを配位することができる残基を含むヌクレオチドの合成その目的の残基（式Ｌ_n−Ｎ_yを有する）の包含によって金属イオンを配位することができるヌクレオチド、具体的には、ＤＮＡの５’末端に付加された６個連続した６−ヒスタミニルプリン残基を含有するＤＮＡ配列決定用プライマーを合成した。６−ヒスタミニルプリン残基は、報告された手順と同様に、コンバーティブルヌクレオチド法によって導入された(Ferenz,A.E.;Verdine,G.L.,J.Am.Che m.Soc.1991,113,4000-4002；Ferenz,A.E.;Verdine,G.L.Nucleic Acids and Mole cular Biology:Eckstein,F.,Lilley,D.M.J.監修；Springer-Verlag,Berlin,1994 ；８巻，14-40頁中）。簡単にいうと、ｄＨ残基の代わりにＯ⁶−フェニル−２’ −デオキシイノシン（φｄＩ）を含有する樹脂結合オリゴヌクレオチドを、温和なアンモニア処理（濃ＮＨ₄ＯＨ，ｎｔ，４ｂ）によって樹脂から脱保護し、凍結乾燥させた後、５Ｍ水性ヒスタミンで処理して（５５℃，１４時間）、φｄＩ残基をｄＨに変換した。粗製オリゴヌクレオチドを、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製した。追加のｄＧ残基を５’末端に付加して、ポリヌクレオチドキナーゼを用いる有効な末端標識を確実にした。本発明のＩＭＡＣに基づく方策が有意の実用的価値を持つためには、それは、ＰＣＲ増幅された二重らせんＤＮＡをその二つの成分鎖に分割することができなければならない。この応用を直接的に調べるために、本発明者は、一つのＨ₆標識プライマーと一つの非修飾プライマーを用いて、プラスミドｐＵＣ１８−ｍＡＲＲＥ２の１８３塩基対セグメントを増幅させ、それによって二重らせん産物の一方の鎖だけにＨ₆標識を取付けた。ＰＣＲ増幅用のＤＮＡ鋳型ｐＵＣ１８−ｍＡＲＲＥ２は、ネズミインターロイキン−２エンハンサーのセグメントをＢａｍＨＩ部位中に挿入することによって市販のクローニングベクターｐＵＣ１８から誘導された（Chen,L.;Jain,J.;Oakley,M.G.;Glover,J.N.M.:Dervan,P.B.:Hogan, P.G.:Rao,A.;Verdine,G.L.Curr.Biol.1995,5,882-889）。ｐＵＣ１８および近縁のものは、細菌クローニングにおいてより広く用いられている。非結合および結合画分それぞれに９００μｌの無水エタノール（２０℃で貯蔵された）を加えた後、それら試験管を軽くボルテックスし、乾燥粉末ＣＯ₂上で３０分間冷却した。それら試験管を１６，０００×ｇで３０分間ミクロ遠心分離した。上澄みを除去し、そしてペレットを２００μｌの８０％水性ＥｔＯＨ（−２０℃）で洗浄した。エタノール溶液の除去後、試験管を遠心凍結乾燥（SpeedVac,Savant）によって乾燥させた。それぞれの乾燥試験管に対して、５０μｌのＴＥ緩衝液を加えた。ＤＮＡ濃度はＵＶ分光測光で測定された。「上部」および「下部」鎖の表示は、図２の地図で示された配列を意味する。「上部」鎖は、ｌａｃＺ’αペプチドのコーディング鎖にも対応し、その一部分は、ｐＵＣ１８のポリリンカー領域内でコードされている。すなわち、プライマー１ａ＋２ｂを用いて生成されたＰＣＲ産物は、「上部」鎖のみにＨ₆標識を有するが、２ａ＋１ｂを用いて生成されたものは、「下部」鎖のみにＨ₆標識を有するであろう。これらの反応で形成されたＰＣＲ産物の収量は、非修飾プライマーのみを用いる平行した反応（データは示されていない）で見られたより少なくはなかったので、Ｈ₆ 標識はＰＣＲ増幅に悪影響を与えないことが示された。プライマー１ａ／１ｂは、プラスミドｐＵＣ１８−ｍＡＲＲＥ２の「上部」鎖のストレッチ部分（影付き）と一致する配列を含み、それらは、ＰＣＲの際に右方向（５’−３’）に伸長する。プライマー２ａ／２ｂは、ｐＵＣ１８−ｍＡＲＲＥ２の「下部」鎖のストレッチ部分（影付き）と一致する配列を含み、それらは左方向に伸長する。プライマー１ａおよび２ａの影付きの配列はＨ₆標識を示す。ＥおよびＨはそれぞれ、ｐＵＣ１８ポリリンカーのＥｃｏＲＩおよびＨｎｄ III部位を示し、ネズミＩＬ−２エンハンサー（ｍＡＲＲＥ２，斜線）のストレッチ部分をＢａｍＨＩ部位に挿入してｐＵＣ１８−ｍＡＲＲＥ２を生じた。（ｃ）一方の鎖にＨ₆標識を含有する二重らせんＤＮＡを製造するＰＣＲ増幅、およびＩＭＡＣを用いる二つの構成鎖の分割の手順の略図。実施例２：表面でのＬ_n−Ｎ_yの固定化金属イオンを配位することができる残基を含むヌクレオチドを表面で固定化した。具体的には、Ｎｉ²⁺荷電キレート化樹脂上で選択的滞留性を有するＤＮＡを与えるＨ₆標識の能力を評価するために、Ｈ₆で標識されたオリゴヌクレオチド（２ａ／２ｂ）およびそれらの未修飾対応物（１ｂ／２ｂ）を、³²Ｐで５’末端標識した後、平行して、Ｎｉ²⁺−ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）−アガロース樹脂を通過させた。特に、ＰＣＲ産物を６−Ｍグアニジニウム・ＨＣｌ中で変性させた後、Ｎｉ₂₊−ＮＴＡ−アガロースと一緒にバッチ法でインキュベートした。実施例３：ＤＮＡの第一および第二相補鎖の第二鎖の選択的除去による第一鎖の表面での固定化、並びに結合鎖対非結合鎖の定量的測定実施例２の手順の後、Ｈ₆標識は、表面、具体的にはＮｉ²⁺−ＮＴＡ−アガロース上に選択的に且つ可逆的に滞留する能力をオリゴヌクレオチドに対して与えることを示した。特に、その技法が、表面上に固定化され、そしてオリゴヌクレオチド鎖の変性を引き起こす条件下で相補鎖をその相補鎖から除去することができない程度に表面上に固定化されているいずれの相補鎖に対してもハイブリッド形成しない一本鎖オリゴヌクレオチドを生じることを示した。非結合ＤＮＡを含有する上澄みの除去後、樹脂を洗浄し、そして結合ＤＮＡを２００ｍＭイミダゾールで溶離した。粗製ＰＣＲ産物およびＩＭＡＣ工程からの二つのＤＮＡ含有画分のアリコートを、³²Ｐで５’末端標識し、そして変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分析した。鎖分割の検定としてのＰＡＧＥの使用は、ＰＣＲにより生成した相補鎖に相対して僅かに減少したＨ₆標識ＤＮＡ鎖の移動度によって可能になった。非修飾鎖に相対して遅れたＨ₆ 標識鎖の移動度は、ｐＨ８でのその６個のイミダゾール側基の部分的な陽電荷およびＰＣＲの際のＨ₆の反対側のＴ₆伸長部分の不完全な重台による一層大きい長さに起因しうる。鎖の同一性は、一つの³²Ｐ標識プライマーおよび一つの非放射性プライマーを用いたＰＣＲ反応のＰＡＧＥ分析によって別々に確認された。この移動度の僅かな差は、ＩＭＡＣによる鎖分割を検定する好都合な手段を与えるが、それは、ゲル電気泳動および抽出による分離用鎖分割を可能にするほど充分に大きくはない。図３は、ＩＭＡＣを用いるＤＮＡ鎖分割の変性ＰＡＧＥの結果のフォトコピーである。３つのレーンのそれぞれのパネルは、１対のＰＣＲプライマーを用いて得られた結果を示す。一方（１ａまたは２ａ）はＨ６標識を含有し、他方（それぞれ、２ｂまたは１ｂ）は未修飾である。Ｃ（レーン１および４）：ＩＭＡＣ分割前のＰＣＲによって直接的に得られた鎖の混台物を示す対照；Ｕ（レーン２および５）：ＩＭＡＣからの非結合画分；Ｂ（レーン３および６）：２００ｍＭイミダゾールで溶離後のＩＭＡＣからの結合画分。図３のＩＭＡＣからの非結合画分は、主として、より速い泳動種を含み、これは、それぞれの非修飾鎖に該当するが、イミダゾールで溶離された結合画分は、主として、それぞれのＨ₆標識鎖を含有した。鎖分割法の反復実験からの定量的ホスホロイメージング分析は、非修飾鎖が、典型的に、非結合ＤＮＡの＞９０％を含み且つＨ₆標識ＤＮＡが結合画分の９５％を含むことを示した。したがって、本発明者は、ＩＭＡＣは、独特にＨ₆で標識されたＰＣＲ産物をその二つの成分鎖に明確に分割すると結論付けた。微量のものを除く全ての結合放射能が、２００−ｍＭ水性イミダゾールでの洗浄で樹脂から溶離されることができた。実施例４：表面固定化Ｎ_n−Ｎ_yを用いる鋳型指示性重合ＰＣＲ−ＩＭＡＣ配列によって生じた一本鎖ＤＮＡの生物活性を検定するために、本発明者は、分割された鎖をサンガージデオキシ配列決定実験において鋳型として用いた。この実験は、本発明にしたがって、表面に対して結合できるように合成されたオリゴヌクレオチド鎖を用いて行われたが、実験中にそれらを表面に対して結合させなかった。したがって、この実験は、本発明によって表面で固定された一本鎖オリゴヌクレオチドがその生物活性を保持するという概念を証明する。具体的には、一本鎖ＤＮＡを上記のようにカラムの表面に固定化した後、その表面に固定されたＤＮＡをカラムからフラッシュし、そしてキレート化剤を用いて、溶液中の残留するまたは遊離のニッケルイオンを錯体形成させた。最初に、非修飾鎖は優れた配列決定用鋳型であることが判ったが、Ｈ₆標識鎖は鋳型指示性重合を支持できなかった。結局、Ｈ₆標識ＤＮＡ溶液は、ＤＮＡポリメラーゼ酵素の充分な阻害を引き起こすのに充分な量の偶発的Ｎｉ²⁺を含有することを発見した。この問題は、エタノールでの沈澱の前に、１，１０−フェナントロリンをイミダゾール含有溶離液に対して加えることによって簡単に克服された。この方法で製造された一本鎖鋳型は、一様に高品質のＤＮＡ配列データを与える。当業者は、本明細書中で挙げられたパラメーターが全て例示のためのものであり、そして実際のパラメーターは、本発明の方法および配置が用いられる具体的な用途に依存するであろうということを容易に理解するであろう。したがって、前述の実施態様が単に例示として与えられていること、そして更に、請求の範囲およびその同等物の範囲内で、本発明をそれ以外におよび具体的に記載されたように実施することができることは理解されるはずである。

【手続補正書】【提出日】平成１２年１月１１日（２０００．１．１１）【補正内容】（１）明細書第１４頁の次に、頁を改めて以下の記載を挿入します。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 30/48 Ｇ０１Ｎ 30/48 ＲＮ 33/547 33/547 (72)発明者ミン，チャンギー大韓民国デジョン 302―173，スー・ク, ドーンサン・ドン，ドーングジ・アパートメント 109―1404

Claims

【特許請求の範囲】１．式Ｌ_n−Ｎ_y（式中、Ｎはヌクレオチドであり、Ｌは金属イオンを配位することができる残基であり、ｎは少なくとも１であり、そしてｙは少なくとも１である）を有する種。２．Ｌ_nが、一般式（式中、Ｚは有機残基であり、そしてＹは、金属イオンを配位する能力を有するリガンドである）を有し、ＺおよびＹは一緒に、オリゴヌクレオチド配列中へまたはその上へのＬ_nの包含を可能にする請求項１に記載の種。３．Ｚが、約１〜約１０個の炭素原子の長さの、場合によりヘテロ原子によって中断されている、炭化水素鎖または環状炭化水素基である、請求項２に記載の種。４．Ｙが、またはＹおよびＺが一緒に、金属アフィニティークロマトグラフィー固相上に固定された金属イオンなどの金属イオン上のフリーの配位部位を、固相によるイオンの完全な配位を伴なうことなく配位することができるリガンドである請求項２または３のいずれかに記載の種。５．Ｙが、金属イオン上の空の配位部位に向けることができる−Ｎ−、アルコール、チオール、カルボキシレート、イミダゾール、フェナントロリン、アデニン、シトシン、チミン、ヒスチジン、リシン、システイン、メチオニン、アスパラギン、チロシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸およびヒドロキサム酸または組合せを含む請求項２〜４のいずれかに記載の種。６．Ｌが、クロマトグラフィー固相表面で固定化された金属イオンを配位することができる残基である請求項１〜５のいずれかに記載の種。７．Ｌがヒスタミニルプリンであり且つｎが６である請求項１〜６のいずれかに記載の種。８．Ｎ_yがＤＮＡである請求項１〜７のいずれかに記載の種。９．式Ｒ−Ｃｈ−Ｍ−Ｌ_n−Ｎ_y（式中、Ｒは、化学的または物理的残基であり、Ｃｈは、金属イオンを配位することができるキレート化剤であり、Ｍは、そのキレート化剤によって配位された金属イオンであり、Ｎはヌクレオチドであり、Ｌは、金属イオンを配位することができる残基であり、そしてｎおよびｙはそれぞれ少なくとも１である）を有する種。１０．Ｒが、金ゾル、蛍光標識などの標識、別の種との相互作用のための結合パートナーなどの目的の生体分子、クロマトグラフィー固相、または何等かの望ましい表面若しくは種に対する種の結合に作用しうる結合残基若しくは結合可能残基である請求項９に記載の種。１１．Ｒが、複数の同様の種の自己集合した単層の形成を促進する種である請求項９または１０のいずれかに記載の種。１２．ＣｈおよびＭが、その組合せの水溶液中の解離定数が生理学的ｐＨで１０ｎＭより良いように一緒に選択される請求項９〜１１のいずれかに記載の種。１３．Ｃｈが、ニトリロトリ酢酸、２，２’−ビス（サリチリデンアミノ）− ６，６’−デメチルジフェニルまたは１，８−ビス（ａ−ピリジル）−３，６− ジチアオクタンである請求項９〜１２のいずれかに記載の種。１４．Ｃｈが四座キレート化剤である請求項９〜１３のいずれかに記載の種。１５．Ｃｈがニトリロトリ酢酸である請求項１４に記載の種。１６．ＣｈおよびＭが、キレート化剤が金属配位部位の少なくとも二つを除く全部に配位するように一緒に選択される請求項９〜１５のいずれかに記載の種。１７．Ｃｈが四座キレート化剤であり且つＭが６個の配位数を有する請求項９〜１６のいずれかに記載の種。１８．ＭがＮｉ²⁺である請求項９〜１７のいずれかに記載の種。１９．オリゴヌクレオチドの第一および第二相補鎖を提供し；固相の表面をそれらの第一および第二鎖と接触させ；そして第一鎖をその表面で固定させ、同時に、第二鎖を表面で固定させることなくその表面から除去することを含み、ここにおいて、第一鎖は、２モル尿素より苛酷な条件に耐えうる結合を介して表面で固定化されていることを含む方法。２０．提供工程が、ＤＮＡの第一および第二相補鎖を流動媒体中で提供することを含み、そして接触工程が、その流動媒体を固相の表面を越えて通過させることを含む請求項１９に記載の方法。２１．提供工程が、オリゴヌクレオチドの第一および第二相補鎖を提供することを含み、その第一鎖はＮ_y（式中、Ｎはヌクレオチドである）で示され、そしてそのオリゴヌクレオチドは、一般式Ｌ_n−Ｎ_y(式中、Ｌは、金属イオンを配位することができる残基であり、ｎは少なくとも１であり、そしてｙは少なくとも２である)を有する種の一部分である請求項２０〜２１のいずれかに記載の方法。２２．Ｌ_nが、一般式（式中、Ｚは有機残基であり、そしてＹは、金属イオンを配位する能力を有するリガンドである）を有し、ＺおよびＹは一緒に、オリゴヌクレオチド配列中へまたはその上へのＬ_nの包含を可能にする請求項２１に記載の方法。２３．Ｚが、約１〜約１０個の炭素原子の長さの、場合によりヘテロ原子によって中断されている、炭化水素鎖または環状炭化水素基である、請求項２２に記載の方法。２４．Ｙが、またはＹおよびＺが一緒に、金属アフィニティークロマトグラフィー固相上に固定された金属イオンなどの金属イオン上のフリーの配位部位を、固相によるイオンの完全な配位を伴なうことなく配位することができるリガンドである請求項２２または２３のいずれかに記載の方法。２５．Ｙが、金属イオン上の空の配位部位に向けることができる−Ｎ−、アルコール、チオール、カルボキシレート、イミダゾール、フェナントロリン、アデニン、シトシン、チミン、ヒスチジン、リシン、システイン、メチオニン、アスパラギン、チロシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸およびヒドロキサム酸または組合せを含む請求項２２〜２４のいずれかに記載の方法。２６．Ｌが、クロマトグラフィー固相表面で固定化された金属イオンを配位することができる残基である請求項２１〜２５のいずれかに記載の方法。２７．Ｌがヒスタミニルプリンであり且つｎが６である請求項２１〜２６のいずれかに記載の方法。２８．Ｎ_yがＤＮＡである請求項２１〜２７のいずれかに記載の方法。２９．固定および除去工程が、第一鎖を結合Ｒ−Ｃｈ−Ｍ−Ｌ_n−Ｎ_y（式中、Ｒは表面であり、Ｃｈは、金属イオンを配位することができるキレート化剤であり、Ｍは、そのキレート化剤によって配位された金属イオンであり、Ｎ_yは第一鎖であり、Ｌは、金属イオンを配位することができる残基であり、ｎは少なくとも１であり、そしてｙは少なくとも２である）を介して表面で固定させることを含む請求項１９または２０のいずれかに記載の方法。３０．Ｒが、金ゾルの表面またはクロマトグラフィー固相の表面である請求項２９に記載の方法。３１．Ｒが、クロマトグラフィー固相の表面である請求項２９に記載の方法。３２．ＣｈおよびＭが、その組合せの水溶液中の解離定数が生理学的ｐＨで１０ｎＭより良いように一緒に選択される請求項２９〜３１のいずれかに記載の方法。３３．Ｃｈが、ニトリロトリ酢酸、２，２’−ビス（サリチリデンアミノ）− ６，６’−デメチルジフェニルまたは１，８−ビス（ａ−ピリジル）−３，６− ジチアオクタンである請求項２９〜３２のいずれかに記載の方法。３４．Ｃｈが四座キレート化剤である請求項２９〜３３のいずれかに記載の方法。３５．Ｃｈがニトリロトリ酢酸である請求項３４に記載の方法。３６．ＣｈおよびＭが、キレート化剤が金属配位部位の少なくとも二つを除く全部に配位するように一緒に選択される請求項２９〜３５のいずれかに記載の方法。３７．Ｃｈが四座キレート化剤であり且つＭが６個の配位数を有する請求項２９〜３６のいずれかに記載の方法。３８．ＭがＮｉ²⁺である請求項２９〜３７のいずれかに記載の方法。３９．表面上に固定され、そしてオリゴヌクレオチド鎖の変性を引き起こす条件下で相補鎖をその相補鎖から除去することができない程度に表面上に固定されているいずれの相補鎖に対してもハイブリッド形成しない一本鎖オリゴヌクレオチドであって、２Ｍ尿素より苛酷な条件に耐えうる結合によって固定されている上記一本鎖オリゴヌクレオチドを含む種。４０．一本鎖オリゴヌクレオチドが、式Ｌ_n−Ｎ_y［式中、Ｎ_yはオリゴヌクレオチドであり、Ｌは、金属イオンを配位することができる残基であり、ｎは少なくとも１であり、そしてｙは少なくとも１であり、Ｌ_nは、一般式（式中、Ｚは有機残基であり、そしてＹは、金属イオンを配位する能力を有するリガンドである）を有し、ＺおよびＹは一緒に、オリゴヌクレオチド配列中へまたはその上へのＬ_nの包含を可能にする］を有する種中への包含によって固定されている請求項３９に記載の種。４１.Ｌがヒスタミニルプリンであり且つｎが６である請求項４０に記載の種。４２．一本鎖オリゴヌクレオチドが一本鎖ＤＮＡである請求項３９〜４１のいずれかに記載の種。４３．一本鎖オリゴヌクレオチドが、式Ｒ−Ｃｈ−Ｍ−Ｌ_n−Ｎ_y（式中、Ｒは、化学的または物理的残基であり、Ｃｈは、金属イオンを配位することができるキレート化剤であり、Ｍは、そのキレート化剤によって配位された金属イオンであり、Ｎ_yは一本鎖オリゴヌクレオチドであり、Ｌは、金属イオンを配位することができる残基であり、そしてｎは少なくとも２であり、そしてｙは少なくとも１である）を有する種の一部分である請求項３９〜４２のいずれかに記載の種。４４．Ｒがクロマトグラフィー固相である請求項４３に記載の種。