JP2000508922A - 間葉幹細胞を用いる皮膚再生 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 開示されるのは、（ｉ）真皮形成細胞をとり込まれた足場層、および（ii）ケラチノサイトを持つ多層皮膚等価物である。更に開示されるのは、（ｉ）乳頭真皮線維芽細胞を含む少くとも１個の皮膚関連細胞外基質成分の第一層、およびそれと層状の関係で（ii）細網真皮芽細胞を含む少くとも１個の皮膚関連細胞外基質成分の第二層、の少くとも１個を持つ多層真皮等価物である。望ましい実施例は、足場すなわち真皮形成層が（ａ）分離乳頭真皮形成細胞を含む層および分離細網真皮形成細胞を含む層、（ｂ）分離乳頭真皮形成細胞を含む層および分離培養拡張間葉幹細胞を含む層、および（ｃ）分離細網真皮形成細胞を含む層および分離培養拡張間葉幹細胞を含む層、よりなるグループから選択される多層であるものを含む。更に含まれるのは、（ｉ）乳頭真皮線維芽細胞を含む少くとも１個の皮膚関連細胞外基質成分の第一層、およびそれと層状に関係して、細網真皮線維芽細胞を含む少くとも１個の皮膚関連細胞外基質成分の第二層を含む足場層、および（ii）ケラチノサイト層、を持つ多層皮膚等価物である。更に開示されるのは、薬理許容注射可能担体内で真皮形成細胞および少くとも１個の皮膚関連細胞外基質成分の注射可能組成物である。注射可能組成物は更にケラチノサイトを含むことができる。

Description

【発明の詳細な説明】 間葉幹細胞を用いる皮膚再生 成人の皮膚は主としてケラチノサイトにより生成された表皮〔１〕および血管 系，毛包、および他の副構造で変化を与えられた間葉源の線維芽細胞により形成 された複合真皮〔２〕よりなる。真皮内には組織学的に異なった領域、つまり表 皮基底膜のすぐ下の真皮乳頭層、および筋および脂肪を含む皮下組織区に深く拡 張する細網真皮層がある。真皮線維芽細胞への正式な系列地図は存在しない。培 養される真皮細胞の型は推敲された形態学および生化学規準により記述されてき た〔３〕が、間葉真皮始原細胞から細網乳頭および小胞真皮細胞への系列進行は 理解されていない。 真皮線維芽細胞の中で、間葉幹細胞（ＭＳＣ_s）の限定された母集団〔４〕が 骨髄間質の多能性着性細胞〔５〕として初めて確認されたように見える。成人に あるＭＳＣ_sは骨、軟骨、筋、腱、靭帯、脂肪細胞、結合組織、および真皮を含 むいろいろな間葉表現型に使用できる細胞である。ケース・ウエスターン・リザ ーブ・ユニバーシティのフレミング他〔４〕は、真皮に備わる線維芽細胞の小副 次集団が骨髄のＭＳＣ_sを特異的に標識する試薬であるモノクローナル抗体ＳＨ ２と反応する〔６〕ことを論証した。ＭＳＣ_sは血管系、毛包に集まり、表皮基 底膜に隣接するがこの局在化のパターンの重要性はまだ決定されていない。興味 深いことに、フレミングおよび協力者〔４〕は更にＳＨ２反応性に基づく真皮に あるＭＳＣ_sの数が 患者の年齢と共に２０歳以上は検出できないレベルまで減少することを示唆する 。この観察は皮膚の老化およびその自己再生能についての我々の理解に貢献する 。 ヒト皮膚の胎生発育については、ホルブルックおよび協力者〔２、７〕が血管 系および付加物要素に焦点をあてて一連の層外観を記述しているけれども、相対 的には殆ど知られていない。細胞外基質分子、細胞表面タンパク質、および成長 因子への標識が発育中の皮膚の層を特徴付けるのに役立つように使用されてきた が、試験管内分化のためのモデル系が欠乏しているためにこの分野での進歩を妨 げた。皮膚器官培養〔７〕あるいは胚側球体は胚発育を研究するために報告され た最良のシステムである。これらの培養物は懸濁培養液に導入された全層側面の パッチよりなり、ここでこれは球体を形成するために円形化される。これらの培 養は外側に表皮、内側に真皮を持ち、それは相対的に正常な発育事象の配列を通 じて進行する。これらの身体の構造の故で、真皮細胞の系列進行を明確に確立す る球体を使用することは難しい。 ここ数年に生体皮膚等価物〔１〕が確立され、自己由来あるいは同種異系ケラ チノサイトから表皮層を再構築する技術が大きく進歩した。ケラチノサイト培養 物の供給層は、一般には副次培養に適した構成にある線維芽細胞である。一方で これらの皮膚等価物は移植片で機能できるが、線維芽細胞供給層は真の多層真皮 とは同じではない。 皮膚修復および再生法と産物を主として必要とするのは重い熱傷および皮膚潰 瘍である。一方で改良された治療に対する大 きな需要があるが市場においてあるいは臨床展開においても完全に満足な産物は 存在しない。合衆国における必要性の範囲は以下のとおり推定される。損傷の型 合衆国推定患者人口 部分厚熱傷 ２，０００，０００ 入院熱傷患者 １００，０００ 皮膚移植を要する熱傷 ７０，０００ 実施された皮膚移植 １５０，０００ （患者当り多部位を反映） 圧迫性（褥瘡）潰瘍 １，５００，０００ 静脈潰瘍 ５００，０００ 糖尿病性潰瘍 ６００，０００ モーズ手術性損傷 １００，０００ 部分厚熱傷は、熱傷が皮膚の表面層（表皮層）を含み、下層真皮層に入りしか しそれを貫通はしないものを構成する。これら損傷の殆どは移植あるいは他の組 織置換なしで処置される。この保守的なアプローチで有効なのは、表皮層の修復 を必要とするケラチノサイト（表皮層の一次細胞型）が真皮、とりわけ毛包およ び脂腺を取り巻く組織に存在するためである。 より広範な熱傷を持つ患者は一般に自然治癒では適切に処置することができな いが、それは（１）これらの熱傷がケラチノサイトの源を提供する下部の真皮層 をしばしば破壊し、（２）全厚創傷の治癒は縁から生じ、それは保護されない組 織を通じて高い感染の危険性に患者をさらす長い過程であり、また（３）自然治 癒はいずれも美容上魅力的でなく柔軟性に欠け動 きの範囲に起因して物理的に拘束性となり得る重大な瘢痕輪および皮膚収縮に導 くからである。 重い熱傷は間葉幹細胞治療の主な適用となるが、何故ならそれは重大な医学的 脅威を表し、それがコストの高い治療を生み出し、またそれが長期の回復期間を 必要とするためである。重い熱傷は特殊な熱傷ユニットを持つ病院に、あるいは 重症の場合には主要熱傷センターに差し向けられる。 褥瘡（圧迫性）潰瘍は寝たきり患者を扱う養護施設および病院での治療と関連 する継続する問題の一つである。これは皮膚への血液循環を制限する局部限定圧 迫のために生じる。潰瘍は区域できわめて大きく真皮層の全層に貫入りすること がある。それは治癒が難しくかなりの保護手段を必要とする。 静脈潰瘍はとりわけ下肢に老化と関連して乏しい循環から生じる。年齢で劣化 した血管は血液の心臓への移動を維持する「バルブ」機能を失わせることができ る。これが起こると、四肢に血液の貯留が生じ毒素の除去を無効にする。これは 影響を受けた血管で供給される皮膚細胞の劣化を生じる。 糖尿症潰瘍は類似の過程を通じて生じる。糖尿病は進行性糖化最終生成物（タ ンパク質と結合する過剰糖分）および多分ソルビトールの累積を通じて動脈の劣 化を起こす。これら動脈が劣化するにつれて、それは皮膚細胞を適切に供給でき ず細胞死滅に導かれる。血行静止場合のように、注入治癒を得るための補正を必 要とする内在する循環欠損が存在する。しかしたとえ欠損が修復されたとしても 適切に治癒されない限り潰瘍は持続することになる。 皮膚置換は真皮潰瘍を治療するための理想的産物である。内在する欠損がしば しば治癒されずまた、潰瘍が事例の２０−５０％で再発するために繰返し適用さ れることが必要となる。 皮膚癌の切除と関連する手術創傷は間葉幹細胞皮膚再生のためのも一つの主要 な適用を表す。手術創傷はしばしば深くまた美容上外観を損う。治癒を加速し瘢 痕を最小にする（顔面および頸部には皮膚癌病変の不均合な発生率がある）治療 は重要な必要性を示している。 現在市場にある皮膚置換産物の数は限定されており、発展中のこれらのものは いずれもとりわけ完全あるいは部分的厚さの産物として臨床的必要性に完全に合 致していないように見える。皮膚置換に臨床的に成功する手段は（１）広い範囲 の真皮損傷を治療する能力、（２）表皮層および真皮皮膚層の両方を置換しある いは再生する能力、（３）内在組織による高い度合いでの「取り入れ」あるいは 受け取りおよび成長、（４）自然治癒過程の短縮、および（５）最小の瘢痕を含 む。 現在の産物が治癒期間を短縮する証拠は殆どない。従って臨床結果を改善し回 復も加速する治療アプローチに関する市場を実質的に拡張するための可能性が存 在する。 真の多層皮膚等価物はこれまで可能ではなかったが、それは現存する皮膚等価 物が加工同種移植片組織あるいは自家移植片皮膚などのようにケラチノサイトと して「代理基質」を使用し、そのような代理はすべて完全な組織形態形成能力を 欠いているためである。 更に採取皮膚からの自家移植片を用いる真皮置換の魅力を弱める非常に重大な 欠点は、長い回復期間を必要とし、真皮関門の更なる分裂を通じて増大する感染 の危険性を患者にさらしまた並み外れて痛みを伴うかなりの手術損傷を創り出す 困った事態が存在することである。 発明の要約 間葉幹細胞（ＭＳＣ_s）の使用は、初めて自己由来真皮再生産物の発展を可能 にする。この発明の皮膚修復産物は、自己由来ＭＳＣ誘導皮膚芽細胞および培養 ヒトケラチノサイトを含みかくして自己由来あるいは自己由来および同種異系細 胞組合せ産物よりなる真の形態形成多層皮膚等価物を提供する。これは治癒を加 速し非アレルゲン性様式で瘢痕を減少する全層真皮再生を提供する。 一つの見地において、この発明は、（ｉ）真皮形成細胞を組み込まれた足場層 、および（ii）ケラチノサイト層を持つ多層皮膚等価物を提供する。真皮形成細 胞は望ましくは自己由来であり、またヒト間葉幹細胞、真皮線維芽細胞（例えば 乳頭あるいは細網真皮線維芽細胞）あるいはそれらの混合物であり得る。足場は 望ましくはタイプＩコラーゲンのみあるいはタイプＩおよびタイプIIIコラーゲ ンの組合せである。真皮形成細胞が多層皮膚等価物で治療される個体から誘導さ れることも望ましい。望ましくは、ケラチノサイトもまた自己由来のものである 。 も一つの見地において、この発明は、（ｉ）乳頭真皮線維芽細胞を含む少くと も１個の皮膚関連細胞外基質成分の一つの 層、および（ii）細網真皮線維芽細胞を含む少くとも１個の皮膚関連細胞外基質 成分の第２の層、よりなるグループから選択される少くとも１個の真皮形成層を 含む多層真皮等価物を提供する。この見地の望ましい実施例は、足場もしくは真 皮形成層が（ａ）分離乳頭真皮形成細胞を含む層および分離細網真皮形成細胞を 含む層、（ｂ）分離乳頭真皮形成細胞を含む層および分離培養拡張間葉幹細胞を 含む層、および（ｃ）分離細網真皮形成層を含む層および分離培養拡張間葉幹細 胞を含む層、よりなるグループから選択される多層であるものを含む。乳頭およ び細網線維芽細胞は望ましくは同一個体からのものであり、これは望ましくは多 層真皮等価物が投与される個体である。 間葉幹細胞を含む層と層状関係にある乳頭真皮線維芽細胞を含む皮膚関連細胞 外基質成分の層を含む実施例において、産物は内在組織と接触する間葉幹細胞を 含む層を持つ受容体の部位に配置される。間葉幹細胞を含む層と層状関係にある 細網真皮線維芽細胞を含む皮膚関連細胞外基質成分の層を含む実施例においては 、産物は内在組織と接触する細網線維芽細胞を含む層を持つ受容体の部位に配置 される。 更にも一つの見地において、この発明は（ｉ）乳頭真皮線維芽細胞を含む少く とも１個の皮膚関連細胞外基質成分の第１層および、層状関係で、細網真皮線維 芽細胞を含む少くとも１個の皮膚関連細胞外基質成分の第２の層を含む足場層、 および（ii）ケラチノサイト層、を持つ多層皮膚等価物を提供する。真皮形成層 のとりわけ望ましい実施例は前に記載のものと同じである。 更なる見地において、この発明は真皮形成細胞を含む注射可能組成物および薬 理許容注射可能担体内での少くとも１個の皮膚関連細胞外基質成分を含む注射可 能組成物を提供する。真皮形成細胞は、分離培養拡張間葉幹細胞、真皮線維芽細 胞およびそれらの組合せであることができる。それらは望ましくはヒトのもので あり、もっとも望ましくは自己由来のものである。真皮線維芽細胞は乳頭真皮線 維芽細胞、細網真皮線維芽細胞あるいはその組合せであり得る。組成物は更にケ ラチノサイトを含むことができる。 ケラチノサイトおよびもしくは委託されたあるいは分化した皮膚芽細胞を持つ ＭＳＣ_sの存在を含むこれらの見地および実施例の順列は、各種細胞型を産物の 製造の間に生体外で組合せることができるもの、あるいは１個もしくはそれ以上 のそのような細胞型を、修復されるべき皮膚の区域にある位置にある間に産物に そのような細胞を加えることによりあるいは選択肢として生体内で全身あるいは 局所に投与できることにより、真皮あるいは皮膚等価物産物の受容体に投与する ことができるものである。 ｈＭＳＣ_sの存在が減少するにつれて、真皮層を再生する皮膚の能力の著しい 減退がやってくる。我々の目的は創傷床と接触する培養拡張自己由来ｈＭＳＣ_s の豊かな足場を提供することにより皮膚を再生する患者の能力を再確立すること である。我々のアプローチは皮膚の正常な多層構造および皮膚代謝回転の正常な 生理学を再生産する能力を提供する。豊富な真皮始原細胞の存在は連続した再移 植片の必要を除去し、また材料が完 全に非外来源の細胞であることから、拒絶反応あるいは免疫応答の危険性はない であろう。 この発明のｈＭＳＣ_s細胞治療は創傷医療のための最初の生体内皮膚始原産物 を提供し、かくしてそれは最初の真皮再生産物となる。ヒトＭＳＣ真皮始原細胞 は創傷あるいは潰瘍部位に直接注射され、足場で真皮皮膚等価物に形成され、あ るいは最初の機能的多層皮膚等価物を創り出すためにケラチノサイトと組合せる ことができる。 非免疫性線維芽細胞あるいは死休組織とは異なり、自己由来ｈＭＳＣ_sは患者 の自家移植片採取あるいは同種移植組織からの拒絶反応なしで局所生物活性因子 （あるいは追加生物活性因子）の制御の下で新しい真皮を形成するであろう。こ れらの状況下では自己由来ｈＭＳＣ_s産物は皮膚自家移植片の治療成果を複製し 、治癒を加速し、患者の真皮採取の必要を減少し、また入院時間と費用を大幅に 節減する。 皮膚および真皮の再生ならびにこの発明の等価産物は分離培養拡張間葉幹細胞 （ｈＭＳＣ_s）と組合せた皮膚関連細胞基質成分、例えばコラーゲン（望ましく はタイプＩあるいはタイプIIIと組合せたタイプＩ）、修飾コラーゲンおよびも しくはエラスチン、ＩＣＡＭ_s、ＮＣＡＭ、ラミニン、フィブロネクチン、プロ テオグリカン（ＨＳＰＧ、ＣＳＰＧ）、テナスチン、ヘパリン結合成長因子、Ｅ −カドヘリンおよびもしくはフィブリリンなどを含む。これらの間葉幹細胞は正 常真皮を含む多重構造および結合組織を生み出す自然発生始原細胞である。コラ ーゲン基質のみから生産されあるいは非特異的線維芽細胞の 層で生産される皮膚等価物とは異なり、この発明の真皮再生産物は、熱傷、潰瘍 形成を通じて変性し、あるいは急性損傷もしくは手術を通じて妨げた患者自身の 真皮を再構築するための著しく多い真皮再生能を持つ。正常真皮を再構築する能 力は、真皮成分を再生することが臨床的に有益である多層皮膚等価物あるいは他 の産物の相対的配置で精製自己由来真皮始原細胞の細胞含有物によるものである 。 皮膚および真皮再生ならびにこの発明の等価物は更に試験管内あるいは生体内 での間葉幹細胞の真皮成分への増殖、委託あるいは分化を高める生物活性因子を 含む。更にこの発明の産物は真皮皮膚等価物の付着あるいは血管形成を促進する 少くとも１個の薬剤を含むことができる。 間葉幹細胞を得るためには、骨髄にある他の細胞あるいは他のＭＳＣ源から希 有多能性間葉幹細胞を分離する必要がある。典型的には、１０−２０ｃｃの吸引 液が患者から採取されこれは１，０００−５，０００ｈＭＳＣ_sを産出する。約 １００−５００万培養拡張自己由来ｈＭＳＣ_sが次いで皮膚等価物の形で戻され 、それは皮膚パッチあるいは創傷カバーとして適用される。骨髄あるいは分離間 葉幹細胞は自己由来、同種異系で、あるいは異種源からのものであり、および胚 あるいは生後源からのものであることができる。自己由来細胞の使用は望ましい 。骨髄細胞は腸骨稜、大腿部、脛骨、脊椎、助骨あるいは他の骨髄腔から得られ る。ヒト間葉幹細胞の他の源は胚卵黄嚢、胎盤、臍帯、骨膜、胎児および青年期 の皮膚、他の軟組織および血液を含む。 この発明の皮膚等価物は、熱傷、潰瘍形成、擦過傷、裂傷損傷、あるいは手術 創傷を通じて失われた真皮を再生するために使用されるよう指示される。それは また部分から全層熱傷まで、各種の皮膚を冒す潰瘍を呈する患者を治療するため 、および形成外科手術中に組織を再生するために適している。これらの皮膚等価 物は自己由来ｈＭＳＣ_sを含み、皮膚形成性であり、そのようなものとして、そ れが１個もしくはそれ以上の真皮形成乳頭、乳頭小胞および細網真皮細胞に分化 できる移植部位で直接真皮を再生する。この過程は再生真皮組織治療として知ら れる。 ｈＭＳＣ_sの直接真皮形成活性は皮膚自家移植片あるいは他の真皮コラーゲン 足場を採取するよりも優れており、それはｈＭＳＣ_sが真皮成長に含まれるもと の形態形成（組織形成）事象を反復できるからである。採取された自家移植片あ るいはコラーゲン基質は、間葉始原細胞（ｈＭＳＣ_s）から周辺組織からあるい はこの課題を適当な期間に達成するために分化した十分な新しく形成された真皮 細胞を強化することができない。 図面の簡単な説明 図１．ＤｉＩと標識された乳頭真皮細胞およびＤｉＯと標識された細網真皮細 胞が一緒に平板培養された。ＤｉＯ標識細胞（矢印）は場所（Ａ）でフルオレセ インフィルターで見た時可視であるが、場所（Ｂ）でのローダミンフィルターで は可視ではない。ＤｉＩ標識細胞は両フィルターで可視である。倍率、３８０× ；１ｃｍ＝２６μｍ 図２．同一個体からの乳頭真皮線維芽細胞（Ａ）を細網真皮線維芽細胞と比較 する成長曲線が、未標識細胞（●）、ＤｉＩ標識細胞（▲）、およびＤｉＯ標識 細胞（■）、±平均値の標準偏差を用いて示された。 図３．タイプＩコラーゲンゲルの収縮が同一個体からの乳頭真皮線維芽細胞（ Ａ）と細網真皮線維芽細胞で比較された。３５ｍｍウエル当り５００，０００個 の細胞が未標識（●）、ＤｉＩ標識（▲）、あるいはＤｉＯ標識（■）、±平均 値の標準偏差で標識された。 図４．タイプＩコラーゲンゲルの収縮がＤｉＩ標識乳頭真皮細胞のみ（●）、 ＤｉＯ標識細網真皮線維芽細胞細胞のみ（▲）、等数の無作為混合ＤｉＩ標識乳 頭真皮細胞およびＤｉＯ標識細網真皮細胞（■）、および等数のＤｉＩ標識乳頭 真皮細胞およびＤｉＯ標識細網真皮細胞を含む二重層ゲル（□）で比較された。 各３５ｍｍウエルは全体で２５０，０００±平均値の標準偏差を含んでいた。 図５．ＤｉＩ標識乳頭真皮細胞（Ａ）および細網真皮細胞（Ｂ）が個別にタイ プＩコラーゲンゲルに播種され１４日間培養された。標識ゲルの断面は真皮細胞 の両方の型がゲルの内側に存在し、ある細胞がゲル表面に移動（矢じり）したこ とを明らかにする。倍率、１５５×；１ｃｍ＝６５μｍ。 図６．ＤｉＯ標識細網真皮がタイプＩコラーゲンゲルに播種され１４日間培養 された。ゲルの断面は図５で示されたものよりもより少ない細胞がゲル表面に移 動（矢じり）したことを明らかにする。倍率、１５５×；１ｃｍ＝６５μｍ。 図７．ＤｉＩ標識乳頭真皮細胞（Ａ）およびＤｉＯ標識細網細胞（Ｂ）が二重 層ゲルを形成するためにタイプＩコラーゲンの個別の層に播種され２８日間培養 された。ゲルの断面はゲルの全層を提供するために重複分野で写真撮影された。 パネルＡで示される分野はローダミンフィルターを用いて撮影され、パネルＢで 示される分野はフルオレセインフィルターを用いて撮影された。ゲルの上面は矢 印で示され下面は矢じりで示される。ＤｉＩ標識の強度は図１で示されたものよ りもかなり低かった。従ってＤｉＩ標識の細胞はフルオレセインフィルターで適 所に見ることはできない。パネルＡの乳頭細胞およびパネルＢの細網細胞はその それぞれの層に留まることに注目しよう。ダッシュの線はゲルの上部および底部 の間の境界を示している。倍率、１３０×；１ｃｍ＝７７μｍ。 発明の詳細な説明 二重層および多層皮膚等価物は一般に置換皮膚の基質床あるいは枠組みへ移動 する真皮形成細胞に依存する。このアプローチは「真皮伝導性」として引用され 、ここでは置換皮膚基質は、局部真皮細胞が置換皮膚基質に移動することができ 、新しい真皮層を形成し、一方皮膚置換基質は再吸収する足場を提供する。これ は、広範な患者の医療を必要とし、治療過程を伸ばし、創傷部位で患者を感染さ れやすいままに留める病勢停止過程である。 これとは逆に、この発明のアプローチは「真皮形成性」として引用され、ここ では患者自身の真皮形成細胞が皮膚等価物の コラーゲン足場に直接取り込まれる。患者自身の真皮始原細胞（ｈＭＳＣ_s）数 を増加しそれを（自家あるいは同種異系移植片ケラチノサイト層と共に）この発 明の皮膚等価物に直接組み込むことにより、身体自身の自然修復メカニズムを用 いて正常で完全機能性多層皮膚を回復することができる。 この発明の皮膚等価物は、正常組織の痛みを伴う患者の自家移植あるいは合成 層もしくは患者の表皮層の多重置換の必要なしで正常な真皮および表皮皮膚層を 再生する唯一のアプローチを含む。 間葉幹細胞は創傷部位の形状に合致する新しい真皮を再生する。周辺正常宿主 組織に完全に組み込まれる新しい真皮が形成する。コラーゲン生物基質成分は最 終的には再吸収される。皮膚等価物では真皮形成単位の密度は一定であるため、 皮膚等価物の大きさに係りなく新しい真皮組織の同一の全割合を形成する。かな りの新しい全層皮膚が移植８−１０週後に形成され、一方表皮および真皮改造過 程が既に十分進行中である。その後著しい組織形態形成が起こり、ダーマーゲン 生物基質の僅かな痕跡が残り、新組織は周辺宿主組織に十分に組み込まれる。 移植改造過程で本来の真皮組織形成事象を反復することはこれまでの創傷部位 での長期構造的完全性を確かにする。真皮始原細胞で出発することのみで、新し い真皮細胞成分、および細胞外基質分子の名目上の構造の形成を実施することが できる。 皮膚等価物は望ましくは（培養拡張自己由来）ｈＭＳＣ_sを 含む。別のものはまたＦＤＡ承認製造実験記録を用いて無菌処理される培養拡張 自己由来あるいは同種異系表皮細胞を含む。ｈＭＳＣ_sは続く外移植のための培 養拡張ケラチノサイトを含むあるいは含まない（新鮮あるいは凍結）無菌パッチ に取り込まれる。 いくつかの実施例は大きさおよび細胞組成物両方にわたる欠損状況に注意を向 けるために熟考され設計され、また以下のものを含む：（１）コラーゲンゲル基 質内のｈＭＳＣ_s、（２）コラーゲンゲル基質内のｈＭＳＣ_sプラス基質内培養拡 張真皮細胞、（３）コラーゲンゲル基質内のｈＭＳＣ_sプラス基質内培養拡張ケ ラチノサイト、および（４）創傷床、自家移植片、あるいは他の皮膚等価物への 直接注射用懸濁ｈＭＳＣ_s。 皮膚等価物は足場材料および精製と拡張のために前に採取された患者自身の細 胞（ｈＭＳＣ_s）を用いて調製される。採取３−４週後、患者の細胞は再生組織 治療過程を開始するために使用される。 無菌産物を使用して、内側後腸骨稜からの骨髄吸引液が患者の枕元あるいは治 療室手順で標準無菌技術により得られる。最小試料サイズの１０−２０ｃｃが一 次培養での適切なｈＭＳＣ_s濃度を確保するために必要とされる。これは骨髄の 濃縮化、試験管内増殖の開始あるいは培養拡張により獲得できる。 ｈＭＳＣ_sは年齢と共に減少するために、適切に開始する幹細胞濃度を得るこ とが重要である。有核細胞が骨髄から採取され続いて患者の希有間葉幹細胞の選 択的付着を促進する無菌組 織培養条件の下で個別の分量（バッチ）で処理される。典型的には１，０００万 −５，０００万個の有核骨髄細胞（年老いた患者の場合はこれよりも少ない）当 り僅か１００−５００個のｈＭＳＣ_sが付着し組織培養で成長する。これは骨髄 吸引液１０ｃｃ当り約５，０００個までのｈＭＳＣ_sに転化する。細胞母集団の 残りは各種の非粘着性造血細胞、間質細胞および他の粘着非ＭＳＣ細胞を含んで おり、これらは細胞培養手順の初期に除去される。 付着骨髄誘導ｈＭＳＣ_sは均質の形態を示し、殆ど全てが線維芽細胞であり、 まれには多角細胞である。粘着細胞は３日で個別細胞あるいはほんの僅かな細胞 の小さいコロニーとして見られる。しかしそれは急速に複製し培養の第１週内で ５０−２００細胞のコロニーを形成する。１０−１４日までに、間葉幹細胞のコ ロニーは数百個から数千個の細胞を含む各コロニーでそのサイズを拡張する。 未分化状態で間葉幹細胞を維持しその複製速度を制御するために、各一次ｈＭ ＳＣ培養は培養が〜８０−９０％密集に達した時に新培養容器で継代培養される 。新しい継代培養の細胞は、それが継代培養される時点で２５−３５％密集であ る細胞の均一分布層を形成するために付着する。細胞は分裂を続け、細胞密度が 〜８０−９０％密集に到達する時に再び継代され、Ｔ型フラスコ培養容器当り平 均５００万個の細胞を産出する。すべての調製品は胎仔ウシ血清、あるいは胎仔 ウシ血清もしくは他の血清補足剤の追加を必要としない合成培地で培養拡張され る。このような合成培地の一つは１９９５年６月５日受理さ れた共通割当て出願中の合衆国連続番号０８／４６４，５９９号に記載されてい る。 各培養容器からの細胞は細胞の骨軟骨形成能を失うことなく何回も繰返すこと ができる。従って１００個から５００個の粘着ヒト間葉幹細胞で開始した単一一 次培養は１０億（１×１０⁹）個以上の細胞に拡張することができる。しかし典 型的には小さな１０−２０ｃｃ骨髄吸引液は２５個の一次培養容器で５００万個 までの細胞を提供し、従ってこの発明の大抵の皮膚等価物に対する十分な細胞は １−２継代で得ることができる。 すべての手順は治療創傷管理手順のための認定ガイドラインに従って標準無菌 条件下で実行されねばならない。自己由来間葉幹細胞は無菌封入包み内の液状懸 濁液で保持され、真皮再生手順の時点まで２℃および８℃（３６°Ｆおよび４６ °Ｆ）の間で保持されるか、あるいは説明の前に２時間解凍されねばならない。 患者の自己由来ｈＭＳＣ_s手順のすべての見地は熱傷自家移植および創傷／裂傷 管理のための認定規準に従って行われねばならない。 ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ_s）は３種の領域で産物の活性治療成分として使用 される。まずＭＳＣ_sは、生体皮膚等価産物の生産中に試験管内表皮ケラチノサ イト層の細胞支持系の一部として生産される。第二にＭＳＣ_sは組織再生過程を 援助する活性真皮形成成分として役立つ生体内多層皮膚等価物移植片の一部とし て使用される。第三にＭＳＣ_sは細網真皮層の部分を再生するため、また潜在的 には皮下層の筋組織の再生に寄与す るために深い創傷で使用される。 この発明はＭＳＣ（_s）の真皮系列能の利点を利用して、第三世代多層形態形 成皮膚等価物を創り出すのに有効な再生治療のための産物を提供する。重要な成 分はＭＳＣ_sの培養から出発する試験管内真皮線維芽細胞の発展である。特異型 の真皮線維芽細胞の標識を認識するための学習およびＭＳＣ分化の過程の制御は 真皮再生のより良い成果および成果測定を可能にする。ＭＳＣ_sおよびそれの後 代は皮膚等価移植片の支持のための活性再生真皮床を提供するように設計される 。乳頭真皮、細網真皮、および多分皮膚移植片の下部にある筋層の部分を補充す ることにより、より多くの包括的な治療法を達成することができる。 一つの真皮再生産物の実施例は多層生体皮膚等価物の部分として組み込まれた 自己由来ＭＳＣ_sを含む。も一つの実施例は、生体皮膚等価移植片の配置の前に 深い創傷に移植されるＭＳＣ_sのゲルあるいは他の処方を含む。組織の真皮層の 置換は創傷あるいは潰瘍で皮膚あるいは皮膚等価移植片の適切で急速な組み込み を促進する真皮成長因子を提供する重要な機会を提供する。更に再構築真皮は治 癒を速やかに支持する新しい宿主血管系を補充するための細胞網となる。 ＭＳＣ_sは皮膚の乳頭および細網真皮層で生じ、真皮内のＭＳＣ_s数は２０歳を 越えると一般に消失し年齢と共に減少する。ＭＳＣ_sは胚皮膚球体（ＥＳＳ）お よびコラーゲンゲル層を含む試験管内多重培養システムで真皮細胞への分化を受 ける。ＭＳＣ_sは真皮線維芽細胞になすのと全く同じように培養 内でケラチノサイトの成長を支持する。更に、（１）ＭＳＣ_sが真皮線維芽細胞 を委託するか分化する時、および（２）ＭＳＣによりどのような種類の真皮細胞 が生産されるか、を測定するために試験管内および生体内で使用できる標識を確 定することが重要である。現在の所、真皮細胞に関する機能検定はケラチノサイ トの支持およびコラーゲンゲルの収縮率を含む。細胞自身に関しあるいは細胞外 基質において免疫化学標識は他のものの中でもコラーゲン（Ｉ、III、IV、VI、V II）、Ｉ−ＣＡＭＳ、Ｎ−ＣＡＭ、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリ カン（ＨＳＰＧ、ＣＳＰＧ）、テナスチン、Ｅ−カドヘリン、ヘパリン結合成長 因子、およびフィブリリンを含むものが現在使用されている。 ＭＳＣ_sは適正な真皮再生よりも創傷治癒過程により貢献する。皮下に配置さ れると、ＭＳＣベース移植片は何日間かの内に広範な宿主血管系を展開する。更 にＭＳＣ_sは外部刺激（例えばＩＬ−１）に応答して数多くの造血成長因子（例 えばＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１１）を分泌する線維芽細胞 を含む試験管内各種細胞型に分化する。ＭＳＣ_sが下にある真皮の構造成分を形 成することに加えて血管系を補充し造血細胞を支持することにより治癒過程を支 持する有効なツールになることをこれらの観察結果は示唆する。加えてＭＳＣ_s は細胞培養内の筋に分化し、かつ生体内で編歯類の筋管に分化しとり込まれるこ とが示された。骨格筋は皮下層に存在する間葉組織であり、真皮移植片から移動 するＭＳＣ_sは深い創傷部位に横たわる筋にある種の回復能を与える。かくして ＭＳＣ_s の存在は創傷部位で多くの利点を持つ。 皮膚の深層を構成する線維芽細胞は源が間葉にあるが、その始原細胞からのこ れら細胞分化の正しい系列経路は完全には理解されていない。間葉幹細胞（ＭＳ Ｃ_s）に類似した細胞が小児期全体にわたりまた若い成人期にヒト真皮で持続し 、２０歳以後は検出できない水準まで年齢と共に減少することが予備結果から知 られている。真皮ＭＳＣ_sは真皮表皮インターフェイスのケラチノサイト基底膜 近く、細網真皮の血管系に接近し、また乳頭真皮の小胞に隣接して線維芽細胞の 母集団を構成する。 ＭＳＣ_sを含む皮下移植片は数日で血管を高度に発達させ、この細胞が激しい 血管形成を支持することを示唆している。組織再生のために骨および軟骨部位で ＭＳＣ_sを持つ移植片は免疫化学標識を用いる成長する胚で観察されるもののよ うに同一段階の分化を通じて進歩し、修復が組織の個体発生を反復する真の再生 現象をこの細胞が指示することを示唆している。 この発明の皮膚置換はヒトＭＳＣ誘導真皮始原細胞を表皮置換のための培養ヒ トケラチノサイトと併用して真皮の再生のために使用し、多層生体皮膚等価物を 形成する。ＭＳＣベースの治療は、それが生体皮膚等価物、ヒト死体の皮膚ある いは自家移植片のいずれであろうとも皮膚移植への論理的な補充材となる。ＭＳ Ｃベースの治療は表皮ケラチノサイトの下にある真皮層に再生要素を加え、全層 真皮再生をもたらす。この課程の治癒は創傷部位への真皮始原細胞の受動浸潤に 依存するのではなく、真皮の線維芽細胞前駆体の能動源を提供する。加えて ＭＳＣ_sは宿主血管系のより急速な侵入を合図する。活性真皮再生および増加血 管形成の両方は皮膚移植の受容および周辺宿主組織への組み込みを加速するであ ろう。従ってこの発明の皮膚等価物は傷痕を少なくして治癒を加速し従って入院 期間を短縮する治療を提供する。 活性真皮始原細胞母集団を表皮層としての有効性の論証された培養ヒトケラチ ノサイトと組合せることにより、この発明の皮膚等価物は現在利用できるものよ りもより効果的な生体皮膚等価物を創り出す。自家移植皮膚は不必要となるであ ろう。というのは自己由来調製物あるいは同種異系ケラチノサイトのいずれかの ために患者の他の部位から健全でない組織を犠牲にする必要はないからである。 培養でＭＳＣ_sを拡張する能力は大量の皮膚等価物を最初の骨髄吸引液から製造 することを可能にし、そのため大きな創傷あるいは潰瘍区域を治療するための抑 制的な障害は存在しない。ＭＳＣ_sを分化細胞よりも真皮始原細胞の源として使 用することにより、移植片の脱分化と関連する潜在的な危険性は最小化され、何 故ならＭＳＣ_sの始原細胞の状態を制御することが可能だからである。例えば分 化軟骨細胞の生体外拡張は、コラーゲンIIなどのようにすべての特異的軟骨細胞 標識をもはや作らず、また動物モデルで関節軟骨再生を果たせない脱分化線維芽 細胞の増殖に導く。しかし除去顆の骨軟骨病巣に移植される培養拡張ＭＳＣ_sは 助軟骨下骨、肥厚性軟骨細胞、および関節軟骨細胞の正常層をすべて再生する。 同じような様式で、高度に分化し委託された細胞母集団によるよりも、真皮線維 芽細胞の始原細胞として作用するＭＳＣ_sに より真皮再生が最良に達成される。 注射可能調製物、例えば無菌注射可能水性あるいは油性懸濁液が適切な分散剤 あるいは湿潤剤および懸濁剤を用いる公知の技術に従って形成される。無菌注射 可能調製物はまた無毒性非経口許容希釈剤あるいは溶媒、例えば１、３−ブタン ジオールの溶液としての無菌注射可能溶液あるいは懸濁液である。採用される許 容賦形剤および溶媒は水、リンゲル液および等張塩化ナトリウム溶液である。加 えて、無菌不揮発性油が溶媒あるいは懸濁媒体として従来から採用されている。 この発明の組成物は更に従来の賦形剤、すなわち細胞あるいは活性成分と有害 に反応しない非経口適用に適した薬理許容有機あるいは無機担体物質を含むこと ができる。適切な薬理許容担体は必ずしもそれに限定されないが、水、食塩水、 アルコール、植物油、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、 ステアリン酸マグネシウム、滑石、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸モノ グリセリドおよびジグリセリド、ペトロエスラール脂肪酸エステル、ヒドロキシ メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等を含む。薬理調製物はもし望ましけ れば補助剤、例えば滑剤、防腐薬、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与 える塩類、緩衝液、着色、着香およびもしくは芳香物質、および細胞あるいは活 性成分に有害な反応しない同様のものと混合することができる。非経口投与に特 に適した賦形剤は溶液、とりわけ油性あるいは水性溶液、同じく懸濁液、エマル ジョン、あるいは移植片よりなる。水性懸濁液は懸濁液の粘度を増す物質を含み 、例えばカルボキシメチルセル ロースナトリウム、ソルビトールおよびもしくはデタキストランを含む。選択肢 として、懸濁液は更に安定剤を含む。 下記の実施例は更に説明するが、この発明を限定するものではない。実施例１ ヒト皮膚における間葉幹細胞エピトープ 胚形態形成における複雑なしかも正確な空間配列は、成人生物の構造性および 機能性を獲得するために細胞が特異的時間段階および特異的現場で遺伝子を発現 することを要求する。ヒト皮膚の発育に関する形態学的研究は成人において見ら れる未分化胚前駆体から最終段階表現型までの複雑性および遺伝子発現の段階的 増加を明らかにする。皮膚発育を特徴付ける事象の連続的系列は皮膚発育におけ る異なった段階あるいは事象を特定する標識の使用により助けられた（２７）。 細胞表面標識および抗原の使用は表皮の分化の状態を評価するのに特に価値があ った。何故なら各種の系列段階で表皮の構造タンパク質およびケラチノサイトの 細胞表面標識の両方が利用できるからである（２５、２７、２８）。表皮のこの 標識の利用は表皮胚形成および発育の構造および機能についての詳細な空間時間 配列を可能にしてきた（２４、２８）。 しかし真皮の標識は間葉細胞あるいはより分化した真皮線維芽細胞と関連する 細胞外基質分子に限定された。これらは特異的コラーゲン、エラスチン、プロテ オグリカンの抗体、および真皮の他の構造タンパク質を含む（２７）。しかし完 全に欠除しているのは真皮細胞あるいは真皮間葉細胞もしくは線維芽細 胞の段階特異的副次集団を認識できる標識である。空間時間様式でまた限定され た現場で調節されることが示され得る真皮の特異細胞に対する標識は真皮の胚形 成および新生児から成人までの皮膚の発育に関する価値ある手がかりを提供する であろう。 真皮は胚として側板中胚葉から発育し胚真皮での有力な細胞型は後に真皮線維 芽細胞に分化する間葉細胞である（２３、４２）。その関連基質成分と共に検出 される間葉細胞の中にいくらかより分化した線維芽細胞が存在する。しかし他の 細胞は多能性であり、血管壁および立線毛筋、脂肪細胞、および関連線維芽細胞 に貢献する平滑筋に分化する能力を保持する。そのいくらかは内皮細胞として補 充されることさえある。 間葉細胞が結合組織細胞の未分化前駆体として生後生命に持続すると多くの研 究者は考える（１３）。成人生物の間葉幹細胞は胚中胚葉から誘導され、骨、軟 骨、腱、靭帯、骨髄間質、脂肪細胞、真皮、筋および結合組織を含む各種の間葉 表現型を生じる能力がある（１６）。この概念への支持は、骨髄あるいは骨膜か ら分離された間葉細胞が適当な環境に置かれた時軟骨および骨などのような異な った表現型を形成できることを示す研究から来る（検討のため４０参照）。ヒト 骨髄誘導間葉幹細胞に対する細胞表面抗原はこれらの多能性始原細胞に特異的な モノクローナル抗体（ＳＨ２、ＳＨ３、およびＳＨ４）により検出された。これ らの抗体はまた骨膜および真皮にある希有細胞を認識する（２１）。従って未分 化間葉細胞のためのＳＨ２標識を使用することにより、この細胞の真皮発育に対 する貢献 を検定することができる。 この研究において、我々はヒト真皮における未分化間葉細胞の離散性母集団の 表面における発育の調節された抗原の存在および分布を報告する。この結果は、 付属体、上に重なる表皮、および血管系を発育させる上皮間葉相互作用で見られ るように、特異的現場で皮膚発育における間葉幹細胞の重要な構造的機能的役割 を示している。 材料および方法 死後３６時間以内の検死標本あるいは手術処置からの皮膚試料がケース・ウエ スターン・リザーブ・ユニバーシティのヒューマン・コオペレイティブ・ティッ シュ・ネットワークから得られた。皮膚標本の源は包皮、腹部、あるいは胸部皮 膚であった。この源から提出された年齢グループは１日から８４歳までであった 。これらの生後試料は豊富であったので多くの試料が試験された（結果を参照） 。過剰の皮下組織および脂肪は標本から注意深く切開され固定されていない組織 はＯＣＴ−組織テック凍結培地に包埋され、液体窒素で凍結され、−２０℃で貯 蔵された。６μｍ厚の凍結切片はゼラチン被覆スライドに置かれ空気乾燥された 。 ヒト皮膚凍結切片の胚源はワシントン、シアトルのユニバーシティ・オブ・ワ シントン、生物構造医学部のカレン・ホルブルック博士の好意で提供された。そ れぞれ記載されたコホート（結果参照）からの少くとも３種の異なった標本がこ れらの試料で試験された。試験された年齢グループはヒト胎児の推定妊 娠年齢（ＥＧＡ）５８日からＥＧＡ１４０日までにわたった。 ヒト間葉幹細胞への抗体標識の生成はこれまでにヘインズワースにより記述さ れておりここでは説明されない。ＳＨ２抗体がこれらの研究用としてヘインズワ ース博士の好意で提供された（２１）。組織切片は一次抗体と共に１時間室温で 高湿度チャンバで保温された。培養上澄みが未希釈で使用された。保温に続きス ライドは０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳで３回洗浄され、次いで０．１％ＢＳＡ−ＰＢ Ｓで１：２０００に希釈されたフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ） 接合ヤギ抗マウスＩｇＧ（オルガノン・テクニカ）７５−１００μｍで１時間保 温された。スライドは３回０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳで洗浄され一滴のＰＰＤ免疫 蛍光配設培地（ニューヨーク、ロチェスター、イーストマン・コダック）で覆い ガラスされオリンパスＢＨ−２エピ蛍光顕微鏡で観察された。負の対照スライド は、ヒト組織と交差反応せずしかしＳＨ２抗体として同一の重複規準標本である 抗体あるいはＳＢ１ヒヨコ抗体（５５）を含まない培養培地での切片の同一分析 よりなっていた。この研究で利用された他の抗体はヒト末梢神経、中枢および末 梢神経組織、髄鞘、稀突起神経膠細胞、シュブァン細胞、ニューロン、およびあ る種の神経膠星状細胞の酸性糖タンパク質を認識する神経特異的抗体ＨＮＫ−１ を含む（１２、１７、２９）。モノクローナルマウス抗ヒト因子VIII関連抗原（ ＤＡＫＯ）も内皮細胞および血管組織を認識するために利用された。正の対照は ヘインズワースにより生成された抗体６Ｅ２を用いる切片の分析よ りなり、多種多様のヒト組織と反応するヒト特異的モノクローナル抗体である。 結果 この免疫組織学研究はヒト間葉幹細胞を認識するモノクローナル抗体を用いて 発育中で生後のヒト皮膚にあるエピトープの空間時間的分布を研究した。免疫染 色はＥＧＡ７８日から８４歳の年齢までの皮膚標本で実行された。第３学期（Ｅ ＧＡ１８０日以上）からの標本は利用できなかった。もっとも表面にあるものか らより深い水準までの皮膚のいくつかの層あるいは構造に伴う免疫反応性が表皮 、発育中の毛胚芽あるいは毛包、真皮／表皮連結部、真皮の上半部、真皮深部に ある血管系神経叢、および皮下組織に隣接する部分を含む真皮の下半部を含めて 試験された。すべての標本で正の免疫反応性が反応性エピトープの存在を反映す る選択的緑輝色蛍光染色パターンが視覚化された時に得点記録された。角質層あ るいは真皮および皮下線維の自己蛍光がＦＩＴＣ励起で見られる緑輝色蛍光から たやすく区別できる黄ばんだ色として時々見かけられた。 簡単に述べると、皮膚胚形成および成熟は形態形成に関連した著しい真皮ある いは表皮時間標識構造に基づく発育の特異的な時期に組織化されてきた。これら 発育期間の短い検討が我々の結果で提供される。 細胞真皮。この段階は皮下発育の後の期間と比較して相対的に小さい関連基質 を持つ優勢の細胞真皮により含まれる。８−９週までに皮膚発育の胚および胎児 段階の間での移行がある（３６）。未分化間葉細胞は真皮の優勢細胞であり、そ れは ゆるやかに組織された微小線維化成分の細胞外基質およびグリコサミノグリカン とコラーゲンのゼラチン状混合物により絡まれる。真皮は血管面により皮下区（ 皮下組織）から正確に説明される（３６）。上に重なる表皮は周皮の単一上皮お よび基礎膜と関連する基底細胞への層別化により標識される（２３）。表皮付属 体はまだ形成されていない。ＳＨ２抗体による正の免疫染色が真皮の深部の血管 系管腔に非常に近接した細胞への離散細胞表面染色で観察される。これらの間葉 細胞あるいは脈管周辺細胞は表面表皮に平行に配向される傾向がある。更に決ま った間隔を置いて血管面の離散細胞への免疫染色が存在する。表皮を含め真皮の 血管面上部の層には免疫染色は存在しない。 細胞から線維への移行。第一学期の終り近くで生じるこの段階は細胞組織から より線維の多い組織への真皮の移行により特徴付けられる。小胞形態形成の開始 は約１１週でのこの時期の間に開始する（２８）。毛胚芽（最初に認識できる小 胞前駆体）が基底表皮細胞の焦点として見られ、それは真皮内に発芽し集団形成 間葉細胞の収集物により取り囲まれる。真皮はコラーゲン線維束の拡大を経て線 維基質の累積を開始した（３６）。ＳＨ２抗体での免疫染色は真皮深部での血管 系への細胞ライニングに対する反応性および真皮深部での間葉細胞への分散され た細胞に対する反応性を明らかにする。反応性は更にかなり決まった間隔で再び 真皮の上半部に少しだけ分散された細胞でも見られる。基礎膜の下の細胞あるい は出現する毛胚芽に関連する間葉細胞に対する正の免疫染色は存在しな い。 線維性真皮。この時期での真皮は真皮内深く伸びる発育中の表皮付属体と共に きわだって線維結合組織である。血管および神経は結合組織鞘と共に真皮中を流 れる（４４）。乳頭真皮内に分肢する乳頭下血管神経叢が存在する。皮下組織と の真皮深部境界は脂肪および皮下結合組織で定義される（４４）。乳頭および細 網真皮の間の区別は主として二層にあるコラーゲン束の間の大きさの差により明 らかとなる。ＳＨ２抗体での免疫染色は、表皮の下側にある基礎膜近くの表皮下 層間葉細胞、発育中の毛胚芽および小胞、真皮深部および表皮下層微小血管神経 叢の脈管周辺区域での細胞反応性、および真皮深部での単一細胞あるいは細胞グ ループに対する分散反応性を含む正確な位置で確認された細胞反応性の収集物を 示した。 新生児真皮。出生後最初の２年以内の生後真皮は十分に確立された乳頭および 細網層ならびに完全に形成された上皮付属体を含む成人皮膚と関連する形態形成 標識構造をすべて有している。これは胚皮膚とは異なるが、それは後者で真皮厚 の減少、筋原線維径、タイプＩコラーゲンのタイプIIIコラーゲンに対する比率 、および高い水分濃度によるものである（２６）。ＳＨ２抗体での免疫蛍光は表 皮の基礎膜の下の真皮／表皮連結部に非常に近い離散細胞に対する反応性を明ら かにする。反応性は表皮と共に乳頭真皮でのみ認められ、細網細胞は反応性を欠 いている。胚皮膚と比べてこれらの標本での免疫反応性細胞数の減少が見られる 。 成人真皮。３０歳以上ではＳＨ２抗体での免疫染色は完全に 不在である。全部で６９の生後標本が免疫染色された。男性３０個女性３９個の 試料が染色されたが５歳以上の年齢グループでは著しい差異は見られなかった。 包皮試料の可能な１１個の内１１個全部が５歳以下の年齢のもので反応性を提示 した。５歳以下のグループの４個の腹部、試料の内１個のみが反応性を示した。 ２１歳−３０歳の年齢グループで見られる反応性は女性乳房皮膚からの試料を表 していた。 これら年老いた年齢グループでのＳＨ２抗体に対する免疫反応性の欠除はエピ トープ不顕化では多分説明できないが、それは実験がヒアルロニダーゼ、トリプ シン、コンドロイチナーゼ、およびコラゲナーゼを含むいくつかの細胞外基質消 化酵素を用いて行われたためであった。細胞外基質の消化はＳＨ２抗体で免疫染 色されたエピトープを顕化しなかった（データは示されない）。 神経および血管標識。ＳＨ２抗体染色が真に血管系細胞器官（オルガネラ）の 細胞成分に対するものであったことを確認するために、因子VIII関連抗原に対す る抗体が利用された。抗因子VIII関連抗原抗体免疫染色は発育中の皮膚にある深 部血管系神経叢に対応する深部真皮にある血管系細胞器官に対する反応性を明ら かにした。血管系のライニング細胞（内皮細胞）に対する反応性のいくつかがＳ Ｈ２抗体と反応する同じ細胞であったかどうかを確認することは難しかった。明 らかにＳＨ２抗体はある種の脈管周辺細胞と反応する。しかしＳＨ２抗体が血管 系の外部結合組織鞘成分のいくつかとあるいはいくつかの内皮細胞と反応するこ とは可能である。神経特異的ＨＮＫ−１抗体は、 発育中の皮膚にあるＳＨ２正細胞が神経系の細胞と反応性であるかどうかを決定 するために利用された。表皮下層免疫反応性細胞がＨＮＫ−１抗体で染色された 。ＨＮＫ−１抗体の形態学は長く細い殆ど線型の細胞反応性を明らかにした。発 育中の毛包のもっとも近位位置のものもこの抗体と反応した。これら二つのパタ ーンはＳＨ２免疫反応性で認められたパターンとは明らかに識別された。議論 ヒト皮膚に存在する骨髄誘導間葉幹細胞に対するエピトープが存在し、またこ れら細胞の時間空間的分布は発育および年齢と共に変化する。特異的には、免疫 細胞の数とこれらの細胞が居住する焦点は年齢と共に減少した。間葉幹細胞エピ トープの時間空間パターンについての我々の解釈は表２に要約される。基礎膜近 くの表皮下層間葉細胞、発育中の毛胚芽および小胞の底部にあるユニーク細胞、 真皮の深層部での分散反応性、および発育中の血管系と密接に関連する細胞のグ ループを含む正確な位置は第二学期を通じて胚試料で確認された。生後の皮膚に おいて、間葉幹細胞の反応性は基礎膜に近接する真皮表皮連結部に近い乳頭真皮 の希有細胞で認められた。これらのエピトープは０−２０歳の若い先代の標本の 約８０％で認識された。２０歳以上の年齢の試料はいずれかの正の免疫染色パタ ーンを殆ど示さなかった。しかし重要なことは、真皮の深い区域での細胞に対す る反応性は胚皮膚試料とは著しく対照的に視覚化されなかった。生後試料の包皮 から取られた区域は殆ど一致して反応性を示したけれども、正の試料での免疫染 色パターンによ る局部的あるいは解剖学的変化はなかった。 ヒト胎児組織を使用した観察は表皮下層間葉細胞に対する正の免疫を明らかに した。分娩後、同じく基礎膜下部区域の長さに沿ったより大きな分布と比較して 免疫正であったこの地域での細胞は量的により多かった。また免疫正細胞は分娩 後皮膚と比較した時胎児皮膚の真皮のより深い区域で認められた。特に発育中の 毛包あるいは毛胚芽の底部で離散細胞に免疫染色があり、また血管系のライニン グ細胞に近接する真皮の深層にある細胞グループに対する反応性が存在した。Ｓ Ｈ２が確認した細胞は、神経組織を認識するＨＮＫ−１抗体との実験に基づく神 経系の樹状細胞と同時局在化しなかった。従ってＳＨ２が上部真皮で認識する細 胞が神経系科のものであるかどうかは疑わしい。因子VIII関連抗原抗体での免疫 染色は、ＳＨ２抗体および因子VIII関連抗原抗体が血管系であると解釈された構 造を認識するため、ＳＨ２抗体も同様に発育中血管系に関連する細胞を明らかに することを示す。しかし因子VIII関連抗原は発育中の皮膚において微血管系の成 熟の度合いにつれてより突出するようになる標識であり、内皮細胞分化のための 標識として仮定されてきた（４９）。従ってそれはすべての未分化前駆体血管細 胞、とりわけその初期発育期間中のものを認識しないことがある。 ヒト皮膚のヒト間葉幹細胞に対するエピトープが存在しまた確認細胞の特異的 な発育分布があることはデータから明らかである。変化する発育段階でのヒト骨 髄誘導間葉幹細胞に対するエピトープの免疫反応性パターンにおける差異はそれ ぞれの現 場に基づいて発育中毛包、上に重なる表皮、および血管系の真皮表皮交差作用に おいて重大な機能役割を多分果す間葉間細胞の真皮貯蔵所という仮説を支持する 。これらの役割は多分各種のオートクリンおよびパラクリン細胞合図分子の分泌 、ならびに真皮の物性に重要な細胞外基質の保持および精緻化を含む。 細胞グループにおける正確な変更を評価できるように、我々は時系列における 発育細胞の形態形成に焦点をあてた。皮膚組織の発育および老化に伴うＳＨ２エ ピトープの発生と減退、および真皮線維芽細胞および間葉細胞のはっきり識別で きる副次集団が免疫正であるという観察は真皮発育の表現型特異的標識の証拠を 示唆する。皮膚内の間葉幹細胞を認識するエピトープの存在は真皮胚形成からの 源を持つかも知れず、何故なら真皮の成分は体節中胚葉の浅真皮節分節から、ま た皮膚の下方にある身体の間葉区から生じるからである（２３）。段階特異的表 現型で際立った分子をその表面で発現する真皮線維芽細胞の副次集団は発育およ び段階特異的変異体の連続的系列で始原細胞あるいは初期段階を表すものと考え られる。系列と呼ばれるこの発育上の連鎖は免疫学的に検出できない特異的細胞 表面エピトープをしばしば表す（１６）。細胞抗体染色が間葉幹細胞に特異的に 真皮線維芽細胞系列の前駆細胞を表すことを我々は示唆する。ＳＨ₂抗体は間葉 幹細胞の副次集団で発見されたエピトープを認識する。間葉幹細胞は適切な環境 に置かれた時に骨や軟骨などの異なった表現型を形成することを示してきた（２ １、２２）。 更に真皮の発育は表皮に生じる幹細胞の分化に類似してもっ とも遠位の位置からより表面あるいは近位の現場まで進行することを結果が示唆 している（２０）。これはデータで示唆されるがそのデータは真皮の最深部にま た第一学期に真皮を皮下組織から隔てる血管境界で免疫正の間葉幹細胞が豊富で あることを示し、また胚発育の間および初期の生後年齢でこれらの細胞の表皮へ より近位に移行することを示す。 更に間葉幹細胞が皮膚で居住する現場の重要性も考えられねばならない。毛包 の発育は複雑な上皮間充織相互作用を表す。小胞のもっとも初期の認識可能前駆 体である毛胚芽は基底表皮細胞の焦点を表し、この細胞が真皮−表皮連結部の下 部に規則的に隔てられた特殊な間葉細胞の収集物近くの真皮に発芽する（２８） 。これらの細胞のいくつかが真皮間葉の細胞と比較された時異なった標識を発現 することが知られている（５１）。毛胚芽は第二学期までに後で毛ペッグ内に発 育し末端は球根状構造に形成される。この構造の上皮細胞は内側根シートおよび 線維を後で生じさせ周辺間葉細胞は後で真皮乳頭の有機構造をとる（２８）。興 味深いことは、間葉源のものであるこれら真皮乳頭細胞は明らかに小胞形成を誘 導し毛髪成長および毛髪品質を決定することを示されてきた（５２、５３）。 間葉幹細胞抗体反応性は真皮の微小循環系に非常に近接して存在することが認 められた。胚真皮で見られる未分化間葉細胞は血管内皮細胞および多分血管周囲 細胞を生じさせると思われる（１３）。内皮細胞の前駆体、平滑筋細胞、および 血管系の他の特化細胞は脈管周囲間葉細胞であると考えられる（３７、３９）。 これらの前駆体がその分化後代、つまり微小循環 系および血管系自身に近接することが期待されるであろう（４１）。更に血管周 囲間葉細胞は血管形成と関係し毛管新芽形成の初期相となることも知られている （５４）。その解剖位置に基づいて、血管系に近接して位置する間葉幹細胞は血 管形成に参加する未分化前駆体であるように見える。確かに、間葉から誘導され る血管周囲細胞は多能性を示すことができ、骨芽細胞および平滑筋細胞などの細 胞表現型の前駆体となるであろうことも知られている（１５、３９）。 データはまたヒト骨髄誘導間葉幹細胞のエピトープに対する年齢の関連した反 応性の変化を示唆する。結果は年と共に間葉幹細胞数の減少を明らかにする。胚 および新生児の皮膚発育でのとてつもなく大きい形態形成および成長要件のため これは全く筋の通ったことである。年齢と共に間葉幹細胞数が減少することは骨 髄などの他の組織でも見られ、これらの細胞の減少は年齢と共にこの器官での骨 形成組織の能力および量の減少を部分的に説明するものとなる。この間葉幹細胞 数の減少は皮膚での代謝結果を持ち、何故なら真皮に居住する細胞が表皮増殖お よび保持について多くの調節機能を持つためであると仮定することができる。老 化と関連して知られる皮膚の変化は真皮−表皮連結部の平板化、表皮交代の減少 、疾患の増加および表皮ケラチノサイトの異質性、ならびにコラーゲンおよびエ ラスチンなどの細胞外基質成分の変化などを含む（１９、３２、３４、４８）。 この研究の一つの仮定は、間葉幹細胞から誘導される骨髄を認識するエピトー プは更にヒト皮膚にある同じ細胞型も認識す るということである。多能性細胞および複雑な上皮間充織相互作用が生じる区域 へのエピトープ反応性の特異的現場が偶然の一致ではないと我々は信じる。エピ トープ反応性の現場は明らかに間葉源の未分化細胞に解剖学的機能的意味をなす 。この研究は明確な免疫組織化学および組織学的観察に依存するけれども、将来 の研究はこれらの細胞が骨髄から誘導される間葉幹細胞の表現型特性を示すよう に分離され証明されるように実行される必要がある。これらの試験は他の免疫標 識の存在あるいは不在およびもしくは適切な環境に置かれた時に多重表現型を形 成する能力を含むものである。 実施例２ ＭＳＣ_sの真皮線維芽細胞への分化のための試験管内システムの確立 このシリーズの研究はヒト真皮線維芽細胞をＭＳＣから区別する試薬の開発に 向けられる。これらの試薬（抗体、オリゴヌクレオチドプローブ、成長因子への 応答）は、ＭＳＣ分化のこれらの標識が名目上の開発と相関するかどうかを決定 するために発育する皮膚（胚皮膚球体、胎児組織の凍結切片）に対して選別され る。一度標識が選択されると、ＭＳＣ_sは真皮系列内でその分化を促進する条件 （例えば培地、基質分子、可溶成長因子、同時培養細胞を変えることにより）の 下で細胞培養内で試験管内処置される。真皮形成の定量検定を行うことのできる 従来の決められた培地を生産するための真皮分化に必要な成分が確認される。最 終的には、ＭＳＣ_sのための真皮分化の標識が次いでＭＳＣ後代の間で乳頭およ び細網真皮源を区別するた めにこれら２個の亜型を比較される。 真皮分化の標識を区別する試薬の生産はモノクローナル抗体分離および分子ク ローニング戦略を含む。抗体方法論は他の系列で成功したものを利用し、とりわ け骨形成分化のものを利用する。細胞表面抗原はヒト真皮線維芽細胞の健全細胞 調製物あるいは原形質膜分画でマウスをまず免疫化することにより標的とした。 これらの細胞は一次組織外植片からもしくは以下に記載されているように利用さ れるヒト細胞系のいずれかから誘導することができる。免疫血清および続いてハ イブリドーマ上澄みの選別は未分化ＭＳＣ_s対真皮線維芽細胞系の一次組織で行 われる。ＭＳＣ_sよりも真皮細胞に特異的な抗体は免疫蛍光によりヒト胎児新生 児未成熟および成人皮膚生検材料を凍結切片で使用して更に二次選別スクリーン に運ばれる。顕微鏡下での組織の選別は退屈であるがそれは試験管内正常分化を もっとも密接に反映するこれら抗体の選択を可能にする。 選択された抗体は免疫方法により真皮および真皮細胞からの対応する抗原を精 製するために使用される。抗原の部分配列分析はもし知られているならば現存す る配列データベースからのタンパク質を同定するために適切であろう。さもなけ れば、ｃＤＮＡは真皮線維芽細胞ｃＤＮＡライブラリーからの標準分子クローニ ング手順により同定されるであろう。抗原がタンパク質ではない場合（例えば炭 水化物）、標準分析化学技術が化学組成物および質量分析測定のために利用され る。 新規なｃＤＮＡを同定するために分子アプローチが抗体発見と平行して行われ る。これらの実験は１）ＲＴ−ＰＣＲおよび 変性プローブを用いるポリＡ⁺ _-ＲＮＡの直接オリゴヌクレオチドプローブにより 既知の科の分子でのＭＳＣ_sおよび真皮線維芽細胞系の選別、を含む。これは既 知のグループ、例えばＴＧＦ−βレセプター上科、インテグリン科、免疫グロブ リン／細胞付着分子上科、等の部材である新規な分子を決定するために行われる 。これらの選別が継続するにつれて、差別表示技法が真皮細胞に見出されるがＭ ＳＣ_sにはないｃＤＮＡを同定する。部分ＤＮＡ配列は既に知られているものか ら新規な分子を同定するのに十分あったが、新規なイソ型あるいは公知のスプラ イス変異型はより広範な分析を必要とするであろう。同定された新規な分子には ポリクローナル抗体が細菌発現組換え融合タンパク質あるいは合成ペプチド抗原 のいずれかに対してラビットで調製された。これらの抗体は真皮内のタンパク質 産物の存在を確認するために有意義に使用される。 ヒトＭＳＣ_sの一次培養は試験管内真皮分化検定を組立てるために利用された 。簡潔に言えば、腸骨稜骨髄吸引液（２０ｍｌ）がボランチアドナーから得られ 骨片を除去するために濾過される。細胞懸濁液は１．０７３ｇ／ｍｌ密度のパー コル段階勾配で層化され、インターフェイス分画が収集される。細胞はＭＳＣ選 択および拡張のためプラスチック組織培養フラスコで平板培養される。細胞が８ ０−９０％密集に達すると、それはトリプシン消化され、洗浄され、１：３の密 度で再平板培養される。 サイクリン依存性キナーゼ阻害剤（ｃｄｋｉ）として知られる細胞分裂サイク ルの阻害剤がＭＳＣ_sの分化に対する委託に 際し非常に早く発現されることを予備研究が立証した。ルシフェーラゼリポータ ー遺伝子構築物がこれらｃｄｋｉ遺伝子の一つのプロモーターＰ２１（ｃｉｐ １．ｗａｆｌ）の制御の下で調製された。これらの構築物は電気窄孔法によりＭ ＳＣ_sに形質移入され、ＭＳＣ_sで委託を強行する分子はそのルシフェラーゼを発 現する能力を知るため急速に選別される。続いて確立された細胞表面および真皮 線維の基質標識が分化の二次確認として使用される。 このシステムで分化因子を同定することで重要なのは分化細胞の長期生存を促 進するための培養培地および添加物の発達である。添加物候補のリストはＰＤＧ ＦおよびＴＧＦ−β上科のメンバーなどのように他の培養システムでＭＳＣ_sに 作用するものとして知られるポリペプチド成長因子を含む。ＭＳＣ分化を促進す る基質タンパク質は皮膚発育の間に高度に調節されるものとして知られるフィブ ロネクチンを含む。例えばノーザン分析でＭＳＣにより生産される発現フィブロ ネクチンは定量され、培地への添加物としてあるいはコラーゲンに直接付加され るフィブロネクチンの用量依存性が研究される。これらの研究と協力して、細胞 のインテグリンプロファイルが潜在的なフィブロネクチンおよびコラーゲンレセ プターのプロファイルを決定するためにモニターされる。一次ＭＳＣ調製物は例 えばα４およびβ２インテグリンに対し負であるとして知られるが、これらおよ び他の表面標識には力強い変化が起こり得る。分泌プロテオグリカンプロファイ ルは現存のモノクローナル抗体を使用して分析される。 代替的アプローチはＭＳＣ_sとヒトケラチノサイトの同時培養である。ＭＳＣ_s がケラチノサイトの成長を支持できることを予備データが示しており、ケラチノ サイトがＭＳＣ_sに真皮線維芽細胞あるいは真皮前駆細胞への分化を起こさせる 因子を生産することを示唆している。直接同時培養が行われ、また平行して実験 がケラチノサイト調節培地、照射ケラチノサイト培養、およびケラチノサイト培 養により貯蔵された基質で調節された平板で行われる。ケラチノサイト細胞表面 あるいは調節培地もしくは調節基質からの分子は大量培養から大口で分離され、 タンパク質成分の特徴付けが行われる。 実施例３ 生体皮膚等価物を生産するためにＭＳＣｓは試験管内ケラチノサイト成長を支持 する これらの研究はＭＳＣ_sの後代が多層系でのヒトケラチノサイトを支持するこ とを論証できる点まで試験管内真皮分化モデルの発展を述べる。実験作業のため の戦略は以下の通りである。第１、ケラチノサイトの供給層として作用するその 能力を確認するためのＭＳＣ_sの機能検定；第２、乳頭真皮線維芽細胞になすの と同じくコラーゲンゲルを収縮するＭＳＣ_sの能力を確認するためのゲル収縮検 定；および第３、ケラチノサイト層の追加ありもしくはなしで水浸コラーゲンゲ ルでのＭＳＣ誘導真皮細胞の成長。 機能検定 ＭＳＣ_sの最初の検定はラインバルドーグリーン法〔９〕を修飾したものであ り、ここでは照射間質細胞がケラチノサイト の供給層として作用する。２２ケ月および５１歳の患者からの皮膚乳頭あるいは 真皮層からの真皮細胞系が入手された。１００ｍｍ皿当り約１０⁵で播種された 真皮細胞あるいはＭＳＣ_sがコバルト源から５１００ラドを受けた。細胞は増殖 を中止するがなお生存する。包皮ケラチノサイトが低い密度（皿当り２０００細 胞）の皿で播種され培地〔９〕で９日培養された。ケラチノサイトコロニーの計 数がクリスタルバイオレット染色の後で行われた。乳頭真皮細胞およびＭＳＣ_s が類似の数のケラチノサイトを支持し、これらは細網真皮細胞で支持されるコロ ニー数よりも著しく高いことを予備研究は示している。 コラーゲンゲル収縮検定はＭＳＣ誘導真皮細胞が浮遊するタイプＩコラーゲン ゲルを収縮する速度をモニターするために使用される。コラーゲンゲルでの最初 の４８時間の平板培養の間に、細網真皮細胞は乳頭真皮細胞に比べて著しく高い ゲル収縮速度を示す。従って、分化の規準として、ＭＳＣ_sおよびその後代はそ のゲル収縮速度が乳頭あるいは細網速度により密接に類似するかどうかを試験さ れる。乳頭真皮細胞への類似性はケラチノサイト培養の有効な支持と相関するで あろう。 細胞同時培養の最適化 ＭＳＣ分化の試験管内システムからの条件は同時培養でのケラチノサイト成長 を促進するために最適化された。これは可溶ポリペプチド因子ならびに基底培地 成分の用量および時間依存性を伴う。これらの研究の詳細についての実施例はア ミノ酸、ビタミン、イオン、ステロイドおよび脂質を変化させた個別の 培地処方を含む。目標は包皮ケラチノサイト成長を支持するＭＳＣ誘導真皮細胞 の非照射培養物のための条件を最適化することである。最終的に、多層同時培養 は表皮表面の角質化を開始するために空気−水インターフェイスにまで持ち上げ られた。 実施例４ ヒト乳頭・細網真皮線維芽細胞を含む二重層化真皮等価物の構築 ヒトあるいは他の種からの線維芽細胞を含む真皮等価物は公知である（５６− ６１）。一方これらの真皮等価物はケラチノサイト増殖および分化を支持するが 、その設計は乳頭真皮および細網真皮という２種の形態学的にも機能的にも異な った層よりなる真皮の天然の二層相対配置を模倣することで改良される（６２） 。相対的に薄くきわめて細胞性である乳頭層は基底層および表皮の下部に直接隣 接して位置しており、一方より深部で密度の高いコラーゲン状細網層は大量の真 皮を含む。これら２種の真皮層それぞれは内因子的に異なった細胞母集団を含む （６３−６６）。これらの細胞が個別にあるいはいろいろな組合せでケラチノサ イトの増殖および分化をどのようにして支持するかについては殆どわかっていな い。この実施例はそれぞれが定められた層で乳頭および細網真皮細胞を含む二重 層真皮等価物の構成を示す。 ここで企画された研究は層化真皮等価物の構築の実現可能性を立証する。組合 せられたヒト乳頭・細網真皮細胞系（すなわち同一個体からのもの）がこれらの 細胞を無作為混合物として あるいは決定された層としてタイプＩコラーゲンゲルに播種して真皮等価物を構 築するために使用された。これら真皮細胞の異なった母集団の移動を追跡するた めに、これらの細胞が一度ゲルに播種されると、それを分化させる技術を発展さ せることが必要となった。従って、我々は特異的かつ個別に乳頭および細網真皮 細胞を標識しコラーゲンゲル内でその細胞の動きをモニターする手段を提供する ために、蛍光生体染料、１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テト ラメチルインドカルボシアニン・パークロレート；ＤｉＩＣ₁₈（３）（ＤｉＩ） および３，３’−ジオクタデシルオキサカルボシアニン・パークロレート；Ｄｉ ＯＣ₁₈（３）（ＤｉＯ）の使用を探究した。 標識手段は２個の基本的規準と合致する。第１に、細胞は研究期間を通じて標 識を保持する。第２に、標識細胞の生理機能は弱められない。細胞の混合母集団 を含むゲル内で乳頭細胞と細網細胞の分類は行われず、また乳頭細胞と細網細胞 は層に播種される時それぞれの層に留められる。従って真皮の天然の相対配置を 真皮等価物に再創出することが可能となる。材料および方法 乳頭および細網真皮線維芽細胞細胞系 ２種の異なった乳頭および細網真皮細胞系（オハイオ、クリーブランド、メト ロヘルス・メディカル・センター、Ｉ、Ａ．シェイファ博士の提供による）がこ れらの研究に使用された。細胞系の一つの組合せセットは５１歳の個体（ライン ４乳頭および４細網）から確定されまた第２組合せセットは２２ケ 月の個体（ライン６乳頭および６細網）から確定された。組合せ乳頭および細網 細胞系の分離および培養に関する詳細は公開されている（６）。簡潔に述べると 、皮膚節が０．３８ｍｍの深さで腕の上側内部からの皮膚の上部層を入手するた めに使用されまたこの上部層から成長する線維芽細胞が細胞の乳頭母集団を構成 する。残る真皮は皮下組織に切断されこの層から成長する線維芽細胞は細胞の細 網母集団を構成する。乳頭および細網真皮細胞は単層細胞、成長動力学、密集で の集合密度およびタイプＩコラーゲンゲルを収縮する相対能力に従って特徴付け られた。 真皮細胞系の２種の組合せセットの検定は同時に行われた。ドナーの離れた年 齢から予期したように（６６）、細胞系の２組に対する成長運動および収縮運動 はお互いに異なっていた。しかし生体染料の存在は細胞のいずれの組合せセット の成長特性あるいはゲル収縮特性を著しく変更しなかった。単純化のために５１ 歳の個体からの１セットだけのデータが提供される。 カルボシアニン染料ＤｉＩおよびＤｉＯはオレゴン、ユージン、モレキュラー ・プローブより購入された。無水エタノール内でのＤｉＩの２ｍｇ／ｍｌ貯蔵液 が前もって調製され、２０℃で貯蔵された。使用の直前に、貯蔵液は１０％胎仔 ウシ血清で補充されたダルベッコ修飾イーグル培地（完全ＤＭＥＭ）で１：２５ ０で希釈された。真皮細胞の単層培養から回収された培地は染料を含む完全ＤＭ ＥＭで置換され、培養液はいろいろな時間期間で保温された。５％ＣＯ₂９５％ 空気を含む加湿雰囲気で３７℃で一晩保温されたものが最適である ことが発見された。染料を含む培地は除去され過剰染料は無菌タイロード液で２ 回すすぎ洗いで除去された。標識細胞は研究に必要な時まで培養皿で保持された 。通常これらの細胞は標識後直ちに使用された。この時点で、細胞はニューヨー ク、グランドアイランド、ライフ・テクノロジーズの０．２５％トリプシン−１ ｍｍＥＤＴＡを用いて皿から分離された。細胞ペレットは再平板培養前に完全Ｄ ＭＥＭで２回洗浄された。しかしタイプＩコラーゲンゲルに取り込まれるべきこ れらの細胞は洗浄され無血清ＤＭＥＭに再懸濁された。 ＤｉＯ飽和溶液が染料１−２ｍｇを無水エタノール１ｍｌに加えて調製され貯 蔵液は４℃で貯蔵された。使用の直前に貯蔵液は遠心分離され上澄みのアリコー トが無血清ＤＭＥＭで１：２０に希釈された。０．２５％トリプシン−１％ＥＤ ＴＡで培養皿から遊離された細胞は無血清ＤＭＥＭで２回洗浄され、ペレット化 細胞は希釈ＤｉＯで再懸濁され各種時間期間で保温された。室温で１０分の保温 が最適であることが発見された。染色細胞は平板培養前に完全ＤＭＥＭで、ある いはもし細胞がコラーゲンゲルに取り込まれるべき場合には無血清ＤＭＥＭで２ 回洗浄された。 細胞数の決定 未染色乳頭および細網真皮線維芽細胞が重複して皿当り５０、１００、１５０ 、２００および２５０×１０³細胞の密度で３５ｍｍ培養皿に播種された。細胞 数は血球計数器の計数で決定された。最初の平板培養効率は乳頭細胞と細網細胞 で変っていた。しかし２日までに皿当り細胞数は最初の接種材料 のそれと同等であった。従って２日が標準曲線の世代として使用された。 細胞数はクリスタルバイオレット検定により決定された。単層培養物はタイロ ード平衡塩類溶液の１％グルタルアルデヒドで２−１５分平板に固定され、水で 洗浄され、空気乾燥された。細胞は０．１％クリスタルバイオレットで３０分染 色され、過剰染料を除去するために水で３回洗浄された。空気乾燥後染料は水の 中で１％のトライトンＸ−１００で抽出された。クリスタルバイオレット染料抽 出物の吸光度は６００ｎｍで分光測光器で読み取られた。ＤｉＩもＤｉＯも６０ ０ｎｍで光を吸収しない。従ってそれらのものの存在はクリスタルバイオレット 検定に影響しない。各細胞系の標準曲線はこれらの読み取りの平均値から用意さ れた。これら標準曲線から外挿して、２５０，０００乳頭細胞の吸光度は０．９ ４２であり、細網細胞の値は１．１６６であった。 コラーゲンゲル ウシ皮膚から酸抽出されたタイプＩコラーゲンはガットフォッス（フランス、 サンプリースト）から購入された。この産物は３ｍｇ／ｍｌのコラーゲンを含み 、その９５−９７％はタイプＩである。使用の前に、コラーゲンはｐＨ３．０塩 酸で調節された水に対し４℃で透析され、また温度は４℃で維持されたまま２− ３時間紫外線の下で無菌化された。乳頭および細網線維芽細胞はＤｉＩあるいは ＤｉＯで標識あるいは標識されたもののいずれも室温で無血清ＤＭＥＭに懸濁さ れた。細胞懸濁液の１．５ｍｌアリコートが冷却コラーゲン１．５ｍｌア リコートと混合された。この混合物は速やかにマサチューセッツ、ケンブリッジ 、コスターの６−ウエル（３５−ｍｍウエル）培養皿のウエルに注がれた。平板 は３７℃で１５分保温され、コラーゲンのゲル生成を可能にした。丁度十分なＤ ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳがゲル（約１ｍｌ）を覆うためウエルに加えられた。二重 層化ゲルが前記と同じ方法で調製され、但し量としては各細胞懸濁液およびコラ ーゲンの０．７５ｍｌが各層のために使用された。第１層は約１５分ゲル化され 、第２層は第１層の上に注がれた。ゲルは無菌の平たい秤量へらを用いてプラス チックから遊離され、次いで追加の１ｍｌの培地が各ウエルに加えられた。浮遊 するゲルを含む平板は５％ＣＯ₂および９５％空気を含む加湿雰囲気で３７℃で 保温され、培地は４−５日毎に交換された。ゲル収縮の範囲はゲルの直径を測定 して決定された。３個の複製ゲルが各実験セット毎に測定された。ゲル収縮研究 の終結に際して、各セットからの１個のゲルが組織学試験で処置された。各ゲル の半分はｐＨ７．４のリン酸緩衝液０．１Ｍ内で１０％ホルマリンで４時間４℃ で固定された（７１）。固定および非固定ゲルは組織テックＯ．Ｃ．Ｔ．包埋培 地（インディアナ、エルカート、マイルズ、サイエンティフィック）に凍結され 、８μｍ凍結切片が切断されスライドが調べられる直前まで凍結貯蔵された。カ バーガラスはフェニレンジアミンを含むグリセリンベース配設培地で配設された 。 週間隔で５週まで取られた他のコラーゲンゲルは半分に切断された。ゲルの半 分はＯ．Ｃ．Ｔ．包埋培地に直ちに包埋され、ゲルの半分はＯ．Ｃ．Ｔ．培地に 包埋される前に緩衝 １０％ホルマリンで一晩固定された。前もっての固定なしで、染料はカバーガラ スが配設された時速やかに切断細胞から拡散された。標識細胞は同定できたけれ ども、より良い結果はホルマリンで最低30分固定された試料から得られた。 すべての写真はオリンパスＢＨ２写真用顕微鏡でフルオレセインあるいはロー ダミンフィルターセットおよびコダックＴｍａｘＡＳＡ４００フィルムで撮影さ れた。結果 ＤｉＩおよびＤｉＯでの真皮細胞の標識 染料寿命の研究 乳頭真皮および細網真皮から個別に固定されたヒト細胞系はＤｉＩおよびＤｉ Ｏ生体染料の存在下で保温され、すべての細胞が標識されることになった。Ｄｉ Ｉで標識された細胞はローダミンフィルターで見た時明るい赤色に見え、また大 抵のこれらの細胞は適所でフルオレセインフィルターでも見ることができたがそ の強度は非常に弱いものであった。あるフルオレセインフィルターを使うと、Ｄ ｉＩ標識細胞は黄色に見え、それは緑色のＤｉＯ標識細胞から、またフルオレセ インイソチオシアネート接合抗体を持つ免疫標識からＤｉＩ標識細胞を識別する ことを可能にした。他のフルオレセインフィルターを使うと、ＤｉＩ標識細胞は 緑色に見えるがそれでもローダミンおよびフルオレセインフィルターの両方で見 た時その可視性のおかげでまだ同定することができた。４個の細胞は図１で顕微 鏡視野に存在する。パネルＡでは、写真はフルオレセインフィルターで適所で撮 影され４個の細胞すべてが可視である。しかしパネル Ａで矢印で示されるＤｉＯ標識細胞はローダミンフィルターが適所にある時はも はや可視でない（パネルＢ参照）。ＤｉＩ標識の強度は適所にあるフルオレセイ ンフィルターを用いた視覚化では重要な因子である。図１に示されるように、無 傷細胞は切開細胞よりもＤｉＩにより強力な信号を放出し、そこではフィルター を切り換えることによりＤｉＩ標識細胞とＤｉＯ標識細胞の間を明らかに識別す ることがしばしば可能である。 染料の寿命は二つの状況下で研究された。単層として成長した細胞、およびタ イプＩコラーゲンゲルに取り込まれた細胞の場合である。真皮線維芽細胞がプラ スチック培養皿に播種される時、それは密集を達成するまで付着し分裂する。こ れらの染料が細胞分裂に際して希釈されるので、十分な量の染料が密集で保持さ れるかどうかを決定することが重要になる。これとは逆に成人真皮細胞がタイプ Ｉコラーゲンゲルに播種された時、細胞増殖は著しく抑制される（７３−７５） 。この状況では起こるかもしれないいずれかの染料損失は膜あるいは細胞器官の 代謝回転などの代謝因子によるものであろう。 低密度で播種される場合には、真皮線維芽細胞は１２日までの期間分裂を続け 、この時までに培養は密集になる。この研究で採用された条件の下で、乳頭真皮 細胞は典型的には６乃至７回の細胞分裂を受ける。このような分裂に続き、強く 染色、適度に染色、あるいは未染色の細胞の割合は培養皿からの細胞のトリプシ ン消化およびその細胞を計数に適したより低い細胞密度で顕微鏡用スライドに再 平板培養することにより決定された（表１）。 表１ 活発に分裂する真皮線維芽細胞におけるＤｉＩおよびＤｉＯ標識 乳頭細胞 ＤｉＩ標識 ＤｉＯ標識 強く標識 １４３^a ４６^b ４２ １４ 弱く標識 １７１ ５４ １０４ ６５ 未標識 ０ ０ ６３ ２１ 細網細胞 強く標識 ７７ ５１ １３ ７ 弱く標識 ７４ ４９ １３０ ６９ 未標識 ０ ０ ４５ ２４ ａ 計数された細胞数。ｂ 計数された全細胞数の割合。 初めに、すべての細胞は標識された。ここで示された標識細胞の割合は標識１ ４日後に測定された。 細網真皮細胞よりも速い速度で成長する乳頭真皮細胞では、すべての細胞が６ 回から７回の細胞分裂後にＤｉＩで標識を続けられた。しかしＤｉＯ標識細胞は 標識されるとして記録されたＤｉＯで染色された細胞の僅か約６０−７０％で強 度を減少させた。二つの染料は細胞分裂で希釈されるように見えたが、細胞は染 料の著しい損失なしでいくつかの分裂を受けることができることをこれらの観察 が示している。ＤｉＩの寿命はＤｉＯよりも優れているように見えるが、それは 多分前者のより高い励起強度の故でありおよびもしくは多分より高い量が細胞に より吸収される故である。いずれの染料で染色した結果でも細胞形態上検出可能 な変化はなかった。 タイプＩコラーゲンゲルに取り込まれた標識細胞は５週までの期間培養された 。固定されたゲルの凍結切片の顕微鏡試験はすべての標識真皮細胞が染色され続 けたことを明らかにした。これは、ここで報告された条件下でこれらの染料を保 持する細胞膜および細胞質細胞器官の代謝回転による染料損失が最小であること を示している。 標識化および未標識乳頭および細網真皮細胞の成長運動 成長曲線は三つ組みの３０，０００個細胞を３５ｍｍ培養皿で平板培養し、２ 日から１０日までクリスタルバイオレット検定を用いて細胞数を測定することに より決定された（６９、７０）。図２で示された成長曲線を創り出すために使用 されたデータは対ｔ試験を用いて統計的に分析されＤｉＩ−およびＤｉＯ−標識 細胞に対する値は９５％密集水準で異なっていないことが発見された。かくして これらの生体染料で標識された細胞はその未標識相手方がなしたと同じ速度で成 長した。８日のＤｉＯ標識乳頭真皮細胞に明らかな減少があった。この減少はこ の時点で統計的に有意ではなかったけれども、ＤｉＯ標識真皮細胞が平板から分 離し始める過程の開始を示すように見える。この過程は細胞がより長い時間培養 される時に強まる。ＤｉＩ−およびＤｉＯ−標識真皮細胞を用いる真皮等価物の 構築 遊離浮遊タイプＩコラーゲンゲルに取り込まれた時、真皮線維芽細胞はゲルの 収縮を誘導する（５６−５９、６６、６７、７４）。収縮は最初の急速相で起こ り、それは約４８時間継続し次いでより緩やかな収縮の持続相となる。最初の４ ８時間の 収縮速度は乳頭および細網真皮細胞を識別するものとして有用であることが示さ れてきた（６６）。期待されたように、等数の細網真皮細胞は乳頭真皮細胞がな したよりも速い最初の速度でゲルを収縮した（図３）。ここで報告された条件の 下でＤｉＩおよびＤｉＯでの標識化はゲルを収縮するどちらの型の真皮細胞の能 力をも変更しなかった（図３）。未標識および染料標識細胞のデータは対ｔ試験 を用いて比較され９５％密集水準で統計的に有意であることが発見されなかった 。しかし染料のより高い濃度で標識された細胞は著しく減少した速度でゲルを収 縮した（データは示されていない）。 混合二重層化ゲル内での乳頭および細網真皮細胞の同定 真皮および皮膚等価物は乳頭および細網真皮線維芽細胞をその天然相対配置、 すなわち二重層に含むように調製された。等数の乳頭および細網真皮細胞を含む コラーゲンゲルが無作為混合物あるいは明確な層としてのいずれかでタイプＩコ ラーゲンゲルに播種された。以下に記載された研究はコラーゲンゲルに一度播種 された特異的な細胞の型を同定するためにＤｉＩ標識乳頭細胞およびＤｉＯ標識 細網細胞を使用して行われた。 図４で示されるように、ゲル収縮の最初の速度は図３で示されるものとは異な っていたが、何故ならこれらのゲルは細胞数の半分を含んでいたためであった。 しかし、乳頭および細網真皮細胞は異なった速度でゲルを収縮するそれぞれの能 力を保持していた。ＤｉＩあるいはＤｉＯでの標識化はゲル収縮に干渉しなかっ た。無作為に混合した乳頭および細網真皮細胞を含む ゲルは乳頭および細網細胞だけのものの中間の速度でゲルを収縮した。層化ゲル のデータが他のゲルのそれと比較され、９５％密集の水準で統計的に有意である ことが発見された。乳頭および細網細胞を含む二重層ゲルは細網細胞のみを含ん だゲルがなしたのと同じ速度で収縮した。更にこれらのゲルは単一存在物として 収縮し、これは二層の融合を示している。 収縮の研究に続き、ゲルは固定され凍結切片は組織試験のために切断された。 ゲルのいくらかは５週まで培養内に留まった。ＤｉＩ標識乳頭真皮細胞およびＤ ｉＩ標識細網細胞を含む２週間培養された収縮ゲルの例はそれぞれ図５Ａおよび ５Ｂで示される。両方の場合で細胞は細胞カプセルを形成するためにこれらのゲ ルの表面に移動した。しかしより少ないＤｉＯ標識細胞がゲル表面に移動する（ 図６）。乳頭（ＤｉＩ−標識）および細網（ＤｉＯ−標識）真皮細胞の無作為混 合母集団で播種されたこれらのゲルはこの無作為組織を少くとも５週間保持した 。しかしこれらのゲルの表面に移動した細胞の非常に少ない１０％以下のものは 細網真皮細胞であった。層化ゲルは単一ゲルを形成するために融合した。乳頭細 胞および少ない範囲ではあるが細網細胞のゲル表面への移動が観察されたけれど もこれらの細胞の付着層への移動はなかった（図７）。議論 成人皮膚の真皮は２種の異なったまた機能層つまり乳頭および細網真皮を含み 、そのそれぞれは内在的に異なった細胞母集団を含む（６５、６６）。乳頭真皮 細胞は真皮の上部を占め上に重なる表皮の支持と栄養を提供し、一方下部の細網 細胞はよ り深部の真皮に特徴的な広範なコラーゲン性基質を精緻化する（６２）。乳頭あ るいは細網真皮細胞いずれかの高度に富化された母集団を得るための技術が存在 する（６５、６６）。試験管内研究は、乳頭および細網真皮細胞が単層培養にお ける彼等の形態構造、成長運動、およびタイプＩコラーゲンゲルを収縮する能力 で異なることを示す（６５、６６）。 ここで提示されるデータは、ヒト真皮細胞を生体染料で差別的に標識すること ができ、タイプＩコラーゲンゲルに一度標識され包埋されると、そのような細胞 は５週の期間にわたり検出されるこれらの染料の十分な量を保持することを示し ている。これらの染料、とりわけＤｉＩは二つの重大な多成分および高度に調整 された細胞機能、すなわち細胞増殖およびタイプＩコラーゲンゲルの収縮を実行 するヒト真皮細胞の能力を損わなかった。増殖しまたゲルを収縮する乳頭および 細網真皮細胞の固有の差異は影響されなかったし、それはこれらの細胞が基本的 な生理学的特性を保持したことを示す。前もって標識された乳頭および細網真皮 細胞を用いて、真の二重層ゲルが創り出されたことを示すことが可能となった。 組織学的分析は、ゲルの２個の半分が融合されたことを示し、これら二重層ゲル が単一存在物として収縮されたという事実により確認された。ゲルの２個の半分 が融合したけれども、異なった細胞型の混ぜ合せは起こらなかった。 実施例５ 深い創傷での組織再生のためのＭＳＣ_s 二つの型の処方がここで記載される。最初のものはヒトケラ チノサイト層と共にＭＳＣ誘導真皮線維芽細胞の１個もしくはそれ以上の層を利 用する多層皮膚等価物である。第２は、注射可能処方のもので、例えば下部細網 層を再生するために皮膚等価物あるいは他の移植片の下にある深い創傷に適用さ れるＭＳＣ_sのゆるいコラーゲンゲル懸濁液である。 最初のものは現在の線維芽細胞の科学技術よりもケラチノサイトの成長を支持 するより複雑な多重真皮層を提供することにより現在の皮膚等価物を改良する。 単一線維芽供給層より優る真皮層の有利性は細網層に対する改良された血管侵入 の可能性であり、一方同時にケラチノサイト増殖を高める乳頭細胞の優れた層を 持つことである。完全に成熟した真皮線維芽細胞よりも初期始原細胞（ＭＳＣ_s ）が利用できることは患者へのより急速な取り込みを提供する。 ＭＳＣ誘導真皮細胞は浸水コラーゲンゲルで成長しケラチノサイトで同時培養 される。処方で変化する主要なパラメーターはコラーゲンの型、濃度、ＭＳＣを ゲルに投与する的確なタイミング、ＭＳＣ_sがゲルに置かれる時のＭＳＣ_sの分化 の状態およびケラチノサイト培養の配置のタイミングである。最後に表皮の角質 化を開始するため、空気水インターフェイスに同時培養物を持ち上げることも変 更することが可能である。これらの変数は無胸腺マウスの創傷内で生体内研究の ための実行処方を創り出すために最適化される。皮膚移植片は対照として前もっ ての分化なしでコラーゲンゲル内でＭＳＣ_sを補充したものと並べて試験される 。 多層移植片は次いで試験管内実験がＭＳＣを細網真皮細胞対 乳頭真皮細胞に向けて動かすことを明らかにするように実験で使用される。この 前記の処方は２個のコラーゲンゲル、つまりＭＳＣ_sを播種され細網真皮細胞に 向けての分化を可能にするゲル、および別にＭＳＣ_sを播種され乳頭真皮細胞を 活性化する条件で保温されるも一つのゲルよりなる。２個のゲルは培養で一緒に 融合され移植の前に差別的に収縮することができる。層の厚みは最適化される。 他の徴候のために既に使用されているＭＳＣ_sの注射可能処方の収縮は調製の 際に、コラーゲンおよび細胞の濃度を変更することでゆるやかなコラーゲン懸濁 液を提供する。引用文献 １．パレントー、Ｎ．Ｌ．、ノルト、Ｃ．Ｍ．、ビルボ、Ｐ．、ローゼンバーグ 、Ｍ．、ウイルキンズ、Ｌ．Ｍ．、ジョンソン、Ｅ．Ｍ．、ワトソン、Ｓ．、メ ーソン、Ｖ．Ｓ．、ベル、Ｅ．試験管内生成表皮：実践的考察および適用。細胞 生化学ジャーナル４５：２４５−２５１、１９９１。 ２．ホルブルック、Ｋ．Ａ．発育中のヒト皮膚の構造と機能。皮膚の生理学、生 化学、および分子生物学、第２版（ＬＡゴールドスミス編）所収。オクスフォー ド・ユニバーシティ・プレス、オクスフォード、１９９１、６３−１１０ページ 。 ３．バイロイター、Ｋ．、ローデマン、Ｈ．Ｐ．、フランク、Ｐ．Ｉ．、マイア ー、Ｋ．線維芽細胞の分化 ｓｔｅｍ ｃｅｆｉｓ．細胞科学ジャーナル１０（ 補遺）：１１５−１３０、１９８８。 ４．フレミング、Ｊ．Ｅ．ジュニア、ヘインズワース、Ｓ．Ｅ．、ベイバー、Ｍ ．Ａ．、キャプラン、Ａ．Ｉ．ヒト皮膚における間葉幹細胞エピトープ。準備中 、１９９６。 ５．キャプラン、Ａ．Ｉ．間葉幹細胞、整形外科研究ジャーナル、９：６４１− ６５０、１９９１。 ６．ヘインズワース、Ｓ．Ｅ．、ベイバー、Ｍ．Ａ．、キャプラン、Ａ．Ｉ．ヒ ト骨髄誘導間葉細胞の細胞表面抗原はモノクローナル抗体で検出される。骨１３ ：６９−８０、１９９２。 ７．ホルブルック、Ｋ．Ａ．、南、Ｓ．Ａ．ヒトにおける毛包胚形成：生体内試 験管内事象の特徴付け。ニューヨーク科学アカデミー年報、６４２：１６７−１ ９６、１９９１。 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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ｉ）真皮形成細胞をとり込む足場層、および （ｉｉ）ケラチノサイト層 を含む一つの多層皮膚等価物。 ２．請求の範囲第１項記載の多層皮膚等価物であってここで真皮形成細胞が自己 由来であることを特徴とする多層皮膚等価物。 ３．請求の範囲第１項記載の多層皮膚等価物であって、ここで真皮形成細胞がヒ ト間葉幹細胞であることを特徴とする多層皮膚等価物。 ４．請求の範囲第１項記載の多層皮膚等価物であって、ここで真皮形成細胞が真 皮線維芽細胞であることを特徴とする多層皮膚等価物。 ５．請求の範囲第１項記載の多層皮膚等価物であって、ここで真皮形成細胞がヒ ト間葉幹細胞と真皮線維芽細胞の組合せであることを特徴とする多層皮膚等価物 。 ６．請求の範囲第１項記載の多層皮膚等価物であって、ここで足場層が少くとも １個の皮膚関連細胞外基質成分を含むことを特徴とする多層皮膚等価物。 ７．請求の範囲第６項記載の多層皮膚等価物であって、ここで皮膚関連性細胞外 基質成分がコラーゲン、エラスチン、ＩＣＡＭ_s、ＮＣＡＭ、ラミニン、ヘパリ ン結合成長因子、フィブロネクチン、プロテオグリカン（ＨＳＰＧ、ＣＳＰＧ） 、テナスチン、Ｅ−カドヘリンおよびフィブリリンよりなるグループから選択さ れることを特徴とする多層皮膚等価物。 ８．請求の範囲第１項記載の多層皮膚等価物であって、ここで前記層の少くとも １個が試験管内あるいは生体内のいずれかで真皮成分への間葉幹細胞の増殖、委 託あるいは分化を高める生物活性因子を更に含むことを特徴とする多層皮膚等価 物。 ９．請求の範囲第１項記載の多層皮膚等価物であって、ここで前記層の少くとも １個が真皮皮膚等価物の付着あるいは血管形成を促進する少くとも１個の薬剤を 更に含むことを特徴とする多層皮膚等価物。 １０．請求の範囲第１項記載の多層皮膚等価物であって、ここで真皮形成細胞が 多層皮膚等価物で治療される個体からのものであることを特徴とする多層皮膚等 価物。 １１．請求の範囲第１項記載の多層皮膚等価物であって、ここでケラチノサイト が多層皮膚等価物で治療される個体からのものであることを特徴とする多層皮膚 等価物。 １２．請求の範囲第１項記載の多層皮膚等価物であって、ここで真皮形成細胞が 増殖されることを特徴とする多層皮膚等価物。 １３．請求の範囲第１０項記載の多層皮膚等価物であって、ここで真皮形成細胞 が間葉幹細胞であることを特徴とする多層皮膚等価物。 １４．請求の範囲第１項記載の多層皮膚等価物であって、ここでケラチノサイト が足場層で増殖されることを特徴とする多層皮膚等価物。 １５．請求の範囲第１項記載の多層皮膚等価物であって、ここでケラチノサイト がラインバルド・グリーン培地にある足場層 で増殖されることを特徴とする多層皮膚等価物。 １６．請求の範囲第１項記載の多層皮膚等価物であって、ここで真皮形成細胞が 間葉幹細胞であり、それが生物活性真皮系列誘導因子で前処理されておりその結 果真皮線維芽細胞が足場で増殖あるいは更に分化されることを特徴とする多層皮 膚等価物。 １７．（ｉ）乳頭真皮形成細胞を含む少くとも１個の皮膚関連細胞外基質成分の 層、および （ｉｉ）細網真皮形成細胞を含む少くとも１個の皮膚関連細胞外基質成分の層 、 よりなるグループから選択される少くとも１個の真皮形成層を含む一つの多層真 皮等価物。 １８．請求の範囲第１７項記載の真皮等価物であって、ここでいずれかの層の真 皮形成層が（ａ）間葉幹細胞と細網線維芽細胞の組合せおよび（ｂ）間葉幹細胞 と乳頭線維芽細胞の組合せおよび（ｃ）いずれかの層が間葉幹細胞、細網線維芽 細胞および乳頭線維芽細胞のどれか一つであるものよりなるグループから選択さ れることを特徴とする真皮等価物。 １９．請求の範囲第１７項記載の真皮等価物であって、 （ｉ）分離乳頭真皮形成細胞を含む少くとも１個の皮膚関連細胞外基質成分の 層、および、それと層状関係で、 （ｉｉ）分離細網真皮形成細胞を含む少くとも１個の皮膚関連細胞外基質成分 の層 を含むことを特徴とする真皮等価物。 ２０．請求の範囲第１７項記載の真皮等価物であって、 （ｉ）分離乳頭真皮形成細胞を含む少くとも１個の皮膚関連細胞外基質成分の 層、および、それと層状関係で、 （ｉｉ）分離培養拡張間葉幹細胞を含む少くとも１個の皮膚関連細胞外基質成 分の層 を含むことを特徴とする真皮等価物。 ２１．請求の範囲第１７項記載の真皮等価物であって、 （ｉ）分離細網真皮形成細胞を含む少くとも１個の皮膚関連細胞外基質成分の 層、および、それと層状関係で、 （ｉｉ）分離培養拡張間葉幹細胞を含む少くとも１個の皮膚関連細胞外基質成 分の層 を含むことを特徴とする真皮等価物。 ２２．請求の範囲第１７項記載の真皮等価物であって、ここで第一層および第二 層の皮膚関連細胞外基質成分が、コラーゲン、エラスチン、ＩＣＡＭ_s、ＮＣＡ Ｍ、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン（ＨＳＰＧ、ＣＳＰＧ）、 テナスチン、ヘパリン結合成長因子、Ｅ−カドヘリン、およびフィブリリンより なるグループから個別に選択されることを特徴とする真皮等価物。 ２３．請求の範囲第１８項記載の真皮等価物であって、ここで第一層および第二 層の皮膚関連細胞外基質成分が、コラーゲン、エラスチン、ＩＣＡＭ_s、ＮＣＡ Ｍ、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン（ＨＳＰＧ、ＣＳＰＧ）、 テナスチン、ヘパリン結合成長因子、Ｅ−カドヘリン、およびフィブリリンより なるグループから個別に選択されることを特徴とする真皮等価物。 ２４．請求の範囲第１９項記載の真皮等価物であって、ここで第一層および第二 層の皮膚関連細胞外基質成分が、コラーゲン、エラスチン、ＩＣＡＭ_s、ＮＣＡ Ｍ、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン（ＨＳＰＧ、ＣＳＰＧ）、 テナスチン、ヘパリン結合成長因子、Ｅ−カドヘリン、およびフィブリリンより なるグループから個別に選択されることを特徴とする真皮等価物。 ２５．請求の範囲第２０項記載の真皮等価物であって、ここで第一層および第二 層の皮膚関連細胞外基質成分が、コラーゲン、エラスチン、ＩＣＡＭ_s、ＮＣＡ Ｍ、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン（ＨＳＰＧ、ＣＳＰＧ）、 テナスチン、ヘパリン結合成長因子、Ｅ−カドヘリン、およびフィブリリンより なるグループから個別に選択されることを特徴とする真皮等価物。 ２６．請求の範囲第１７項記載の多層皮膚等価物であって、ここで前記層の少く とも１個が試験管内あるいは生体内のいずれかで真皮成分への間葉幹細胞の増殖 、委託あるいは分化を高める生物活性因子を更に含むことを特徴とする多層皮膚 等価物。 ２７．請求の範囲第１７項記載の多層皮膚等価物であって、ここで前記層の少く とも１個が真皮皮膚等価物の付着あるいは血管形成を促進する少くとも１個の薬 剤を更に含むことを特徴とする多層皮膚等価物。 ２８．請求の範囲第１７項記載の真皮等価物であって、ここで乳頭および細網真 皮形成細胞が真皮線維芽細胞であることを特徴とする真皮等価物。 ２９．請求の範囲第１７項記載の真皮等価物であって、ここで乳頭および細網真 皮形成細胞が同じ個体からのものであることを特徴とする真皮等価物。 ３０．請求の範囲第２９項記載の真皮等価物であって、ここで乳頭および細網線 維芽細胞が多層真皮等価物を投与されるべき個体からのものであることを特徴と する真皮等価物。 ３１．一つの多層皮膚等価物であって、 （ｉ）（ａ）乳頭真皮形成細胞を含む少くとも１個の皮膚関連細胞外基質成分 の層、（ｂ）細網真皮形成細胞を含む少くとも１個の皮膚関連細胞外基質成分の 層、（ｃ）分離培養拡張間葉幹細胞を含む少くとも１個の皮膚関連細胞外基質成 分の層を含み、更に、 （ｉｉ）ケラチノサイト層 を含むことを特徴とする多層皮膚等価物。 ３２．請求の範囲第３１項記載の皮膚等価物であって、ここで真皮形成層が （ｉ）分離乳頭真皮形成細胞を含む少くとも１個の皮膚関連細胞外基質成分の 層、および、それと層状関係で、 （ｉｉ）分離細網真皮形成細胞を含む少くとも１個の皮膚関連細胞外基質成分 の層 を含むことを特徴とする皮膚等価物。 ３３．請求の範囲第３１項記載の皮膚等価物であって、ここで真皮形成層が （ｉ）分離乳頭真皮形成細胞を含む少くとも１個の皮膚関連細胞外基質成分の 層、および、それと層状関係で、 （ii）分離培養拡張間葉幹細胞を含む少くとも１個の皮膚関連細胞外基質成分 の層 を含むことを特徴とする皮膚等価物。 ３４．請求の範囲第３１項記載の皮膚等価物であって、ここで真皮形成層が （ｉ）分離細網真皮形成細胞を含む少くとも１個の皮膚関連細胞外基質成分の 層、および、それと層状関係で、 （ii）分離培養拡張間葉幹細胞を含む少くとも１個の皮膚関連細胞外基質成分 の層 を含むことを特徴とする皮膚等価物。 ３５．請求の範囲第31項記載の皮膚等価物であって、ここで第一層および第二層 の皮膚関連細胞外基質成分が、コラーゲン、エラスチン、ＩＣＡＭ_s、ＮＣＡＭ 、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン（ＨＳＰＧ、ＣＳＰＧ）、テ ナスチン、ヘパリン結合成長因子、Ｅ−カドヘリン、およびフィブリリンよりな るグループから個別に選択されることを特徴とする皮膚等価物。 ３６．請求の範囲第３２項記載の皮膚等価物であって、ここで第一層および第二 層の皮膚関連細胞外基質成分が、コラーゲン、エラスチン、ＩＣＡＭｓ、ＮＣＡ Ｍ、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン（ＨＳＰＧ、ＣＳＰＧ）、 テナスチン、ヘパリン結合成長因子、Ｅ−カドヘリン、およびフィブリリンより なるグループから個別に選択されることを特徴とする皮膚等価物。 ３７．請求の範囲第３３項記載の皮膚等価物であって、ここで 第一層および第二層の皮膚関連細胞外基質成分が、コラーゲン、エラスチン、Ｉ ＣＡＭｓ、ＮＣＡＭ、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン（ＨＳＰ Ｇ、ＣＳＰＧ）、テナスチン、ヘパリン結合成長因子、Ｅ−カドヘリン、および フィブリリンよりなるグループから個別に選択されることを特徴とする皮膚等価 物。 ３８．請求の範囲第３４項記載の皮膚等価物であって、ここで第一層および第二 層の皮膚関連細胞外基質成分が、コラーゲン、エラスチン、ＩＣＡＭ_s、ＮＣＡ Ｍ、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン（ＨＳＰＧ、ＣＳＰＧ）、 テナスチン、ヘパリン結合成長因子、Ｅ−カドヘリン、およびフィブリリンより なるグループから個別に選択されることを特徴とする皮膚等価物。 ３９．請求の範囲第３１項記載の多層皮膚等価物であって、ここで前記層の少く とも１個が試験管内あるいは生体内のいずれかで真皮成分への間葉幹細胞の増殖 、委託あるいは分化を高める生物活性因子を更に含むことを特徴とする多層皮膚 等価物。 ４０．請求の範囲第３１項記載の多層皮膚等価物であって、ここで前記層の少く とも１個が真皮皮膚等価物の付着あるいは血管形成を促進する少くとも１個の薬 剤を更に含むことを特徴とする多層皮膚等価物。 ４１．請求の範囲第３１項記載の皮膚等価物であって、ここで乳頭および細網線 維芽細胞が同じ個体からのものであることを特徴とする皮膚等価物。 ４２．請求の範囲第４１項記載の皮膚等価物であって、ここで 乳頭および細網線維芽細胞が多層皮膚等価物を投与されるべき個体からのもので あることを特徴とする皮膚等価物。 ４３．薬理許容注射可能担体内で真皮形成細胞および少くとも１個の皮膚関連細 胞外基質成分を含む一つの注射可能組成物。 ４４．請求の範囲第４３項記載の組成物であって、ここで真皮形成細胞が分離培 養拡張間葉幹細胞、真皮線維芽細胞およびそれらの組合せよりなるグループから 選択されることを特徴とする組成物。 ４５．請求の範囲第４４項記載の組成物であって、ここで真皮線維芽細胞が乳頭 真皮線維芽細胞、細網真皮線維芽細胞およびそれらの組合せよりなるグループか ら選択されることを特徴とする組成物。 ４６．請求の範囲第４３項記載の組成物であって、ここで真皮形成細胞がヒトの ものであることを特徴とする組成物。 ４７．請求の範囲第４６項記載の組成物であって、ここで乳頭および細網線維芽 細胞が同じ個体からのものであることを特徴とする組成物。 ４８．請求の範囲第４７項記載の組成物であって、ここで乳頭および細網線維芽 細胞が多層真皮等価物を投与されるべき個体からのものであることを特徴とする 組成物。 ４９．請求の範囲第４３項記載の組成物であって、ここで少くとも１個の皮膚関 連細胞外基質成分がコラーゲン、エラスチン、Ｉ−ＣＡＭ_s、Ｎ−ＣＡＭ、ラミ ニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン（ＨＳＰＧ、ＣＳＰＧ）、テナスチ ン、Ｅ−カドヘリン、およびフィブリリンよりなるグループから個 別に選択されることを特徴とする組成物。 ５０．請求の範囲第４３項記載の組成物であって、それが更にケラチノサイトを 含むことを特徴とする組成物。 ５１．請求の範囲第４３項記載の注射可能組成物であって、それが試験管内ある いは生体内のいずれかで真皮成分への間葉幹細胞の増殖、委託あるいは分化を高 める生物活性因子を更に含むことを特徴とする注射可能組成物。 ５２．請求の範囲第４３項記載の注射可能組成物であって、それが真皮皮膚等価 物の付着あるいは血管形成を促進する少くとも１個の薬剤を更に含むことを特徴 とする注射可能組成物。