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IT201800006983A1 - Metodo di estrazione di glicoproteine ricche di idrossiprolina monomeriche ed estratto ottenuto con questo metodo - Google Patents

Metodo di estrazione di glicoproteine ricche di idrossiprolina monomeriche ed estratto ottenuto con questo metodo Download PDF

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IT201800006983A1
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Description

METODO DI ESTRAZIONE DI GLICOPROTEINE RICCHE DI IDROSSIPROLINA MONOMERICHE ED ESTRATTO OTTENUTO CON QUESTO METODO
La presente invenzione riguarda un metodo di estrazione di glicoproteine ricche di idrossiprolina monomeriche (HRGP), incluse le estensine, ricavate dalla parete cellulare di cellule vegetali ottenute mediante coltura in vitro. La presente invenzione è anche diretta ad un estratto arricchito in HRGP ottenuto secondo questo metodo, oltrechè ingredienti, composizioni ed usi dello stesso nel settore medico, veterinario, dietetico e cosmetico.
La parete cellulare vegetale (PCV) è una complessa struttura extracellulare presente in tutte le cellule vegetali. Nei tessuti differenziati, come stelo o foglie, tipici delle piante adulte, il PCV è composto da polisaccaridi, lignina e proteine con funzioni strutturali e difensive. La frazione polisaccaridica della PCV è composta principalmente da cellulosa, emicellulosa e pectine, mentre la lignina deriva dalla polimerizzazione di fenoli molecolari e derivati idrossicinnamici secreti dalle cellule. Questi fenoli formano legami intermolecolari tra loro e tutte le macromolecole presenti.
La principale funzione biologica della PCV è di fornire attorno a ciascuna cellula vegetale una barriera meccanicamente rigida e protettiva, ma permeabile ai nutrienti.
Le PCV sono distinguibili in due diversi tipi.
Le PCV primarie sono tipica delle cellule vegetali giovani, in rapida crescita, che richiedono protezione e supporto meccanico, ma necessitano anche di espandersi rapidamente in volume per proliferare. Così le PCV primarie, che possiede un basso contenuto di lignina, viene continuamente rimodellata e l'aggiunta di nuovi costituenti monomerici e polimerici è costante per aumentare la superficie della cellula.
D'altra parte, le PCV secondarie, con alto contenuto di lignina, sono tipici delle cellule vegetali mature e differenziate con volume fisso. Queste cellule hanno PCV con rigidità elevata e permanente, a causa dei livelli significativi di legami covalenti incrociati tra i costituenti macromolecolari.
Le proteine della PCV sono importanti dal punto di vista funzionale per modificare la struttura del PCV durante la differenziazione o lo stress, e possono essere distinte, in base alle loro interazioni con i componenti della parete cellulare. Le proteine che hanno poca o nessuna interazione con i componenti della parete cellulare e quindi si muovono liberamente nello spazio extracellulare (o apoplasto) possono essere trovate in terreni di coltura liquidi di sospensioni cellulari o piantine o possono essere estratte con tamponi a bassa forza ionica.
Altre proteine sono debolmente legate alla matrice dalle interazioni di Van der Waals, legami idrogeno, interazioni idrofobiche o ioniche. Tali proteine possono essere estratte da soluzioni saline e la maggior parte di esse ha un punto isoelettrico (pI) basico compreso tra 8 e 11, in modo che siano positivamente caricate al pH acido delle pareti cellulari. Le pectine contengono acido poligalatturonico che fornisce cariche negative per le interazioni con le proteine con un pI elevato e basico. Tali interazioni sono modulate dal pH extracellulare e dalla concentrazione di Ca<2>, dal grado di esterificazione delle pectine e dai coefficienti di mobilità e diffusione di queste macromolecole.
Infine, alcune proteine della parete cellulare possono essere legate covalentemente ad altri componenti della PCV, in modo che siano ancora resistenti all'estrazione mediante soluzioni saline.
L'analisi delle proteine che sono strutturalmente presenti nella parete cellulare della pianta ha evidenziato il ruolo svolto dalla grande famiglia di glicoproteine ricche di idrossiprolina (HRGP) come componenti principali. Nel gruppo HRGP sono stati distinti altri sottogruppi come le lectine ricche di idrossiprolina, le proteine arabinogalattane e le estensine.
Più specificamente, la sequenza di amminoacidi delle estensine è altamente ripetitiva e contiene una sequenza penta-peptidica caratteristica (Ser-Pro-Pro-Pro-Pro) in cui i residui di prolina (Pro) sono idrossilati, successivamente alla sintesi proteica, per conversione della prolina in idrossiprolina (Hyp) da parte di una prolil-4-idrossilasi (P4Hs) legata alla membrana per diventare un penta-peptide con idrossiprolina (Ser-Hyp-Hyp-Hyp-Hyp). Essenzialmente tutti i residui di Hyp e Serina (Ser) della sequenza penta-peptidica sono successivamente glicosilati e in alcuni casi la glicosilazione arriva a circa il 50% del peso della molecola. In genere, gli HRGP sono sottoposti a glicosilazione da parte della glicosiltransferasi. Hyp puo essere glicosilata con sino a 4 residui di L-arabinosio (Araf), mentre Ser è glicosilata con un residuo di D-galattosio (Gal). Quindi L-arabinosio è il principale componente dei carboidrati nelle HRGP. Sia l'alto contenuto di residui di Hyp, sia il livello di glicosilazione conferiscono alle HRGP, e in particolare alle estensine, una struttura molto rigida e resistente all'idrolisi mediata dalla proteasi.
Come illustrato in Showalter et al., " A Bioinformatics Approach to the Identification, Classification, and Analysis of Hydroxyproline-Rich Glycoproteins ", Plant Physiology (2010), 153: 485-513, ci sono varie forme di HRGP che differiscono nella sequenza di amminoacidi che è interposta tra due sequenze Ser-(Hyp)4 adiacenti (corrispondenti alle sequenze SPPPP), tra cui vi sono lisine (Lys o K) che precedono la sequenza SPPPP e vi sono una o più tirosine (Tyr o Y) che seguono la sequenza SPPPP, facendo in modo che una sequenza KSPPPPY è molto frequente. È noto che le tirosine sono coinvolte nella formazione di legami covalenti intra- e inter-molecolari e che i residui basici di lisina sono importanti per le interazioni ioniche con la parte carbossilica acida degli acidi poligalatturonico e poliglucuronico della PCV.
Le HRGP sono tra le principali proteine strutturali e sono presenti nella parete cellulare primaria e contribuiscono in modo significativo alla resistenza all'attacco patogeno da parte di batteri, lieviti e funghi. È noto che le estensine sono particolarmente difficili da estrarre dalla parete cellulare. Infatti, le HRGP e in particolare le estensine, sono inizialmente sintetizzati e secreti nella PCV primaria come grandi monomeri glicosilati solubili (da 60 kDa a 90 kDa) mentre le cellule si espandono e proliferano nei tessuti del meristema. Successivamente, durante la differenziazione, o in seguito a processi ossidativi e stress di origine biotica, le HRGP diventano enzimaticamente reticolati da legami covalenti formati tra residui di tirosina presenti su monomeri HRGP adiacenti, ma anche con polisaccaridi e lignina diventando così insolubili nella PCV attraverso numerosi ponti intermolecolari. Questa struttura rigida e insolubile, insieme ai polisaccaridi come la cellulosa, assicura la necessaria solidità e tensione meccanica per definire la forma e il volume delle cellule vegetali.
Un metodo per estrarre i frammenti HRGP dalla PCV differenziata e secondaria viene descritto da (WO2011/124848), che richiede un trattamento idrolitico con vari agenti chimici per produrre un idrolizzato di HRGP costituito da piccoli frammenti di peptidi glicosilati di varie dimensioni. A seguito dell'estesa idrolisi enzimatica, le HRGP vengono estratte da PCV secondari, essenzialmente come glicopeptidi idrolizzati, come divulgato in WO2011/124848.
Sono stati fatti anche tentativi per estrarre HRGP nella loro forma monomerica, sviluppando piante giovani (US5443855) per ottenere HRGP monomeriche native non digerite, tuttavia non è stata rivelata alcuna determinazione del contenuto di Hyp.
L'interesse per applicazioni commerciali di HRGP deriva dalla loro somiglianza strutturale con il collagene animale a causa dell'alto contenuto di prolina (Pro) e idrossiprolina (Hyp), che varia tra il 10% e il 50% del peso molecolare della proteina ed è molto simile al contenuto di Pro e Hyp determinato in collagene umano (dal 15% al 20% peso/peso). In effetti, alcune applicazioni cosmetiche riportano l'uso di idrolizzati di extensine come "collagene vegetale" (KR20070117355). Il peso molecolare degli idrolisati di extensine è compreso tra i 0,1 KDa e i 1,5 KDa, mentre il peso delle proteine monomeriche HRGP puo essere superiore a 100 KDa. Entrambe le forme di extensine, monomeriche o idrolizzate, si sono dimostrate utili nelle applicazioni cosmetiche come analogo del collagene animale per ridurre le rughe e migliorare il tono della pelle (US5443855).
Tuttavia, i bassissimi rendimenti e la bassa sostenibilità delle procedure di estrazione di HRGP sopra descritte sono forti limiti per un utilizzo economicamente valido di HRGP come sostituto del collagene animale.
È stato proposto, come soluzione a questo problema, l'uso di colture cellulari vegetali (CCV) dedifferenziate e/o meristematiche come fonte di HRGP. Come per le altre cellule eucariote, anche per le CCV ci sono tre pricipali fasi di crescita a seguito dell‘inoculo: 1) una fase Lag iniziale con poche o nessuna divisione cellulare e crescita di biomassa; 2) una fase Logaritmica (Log) esponenziale con la massima valocità di divisione cellulare ed incremento di biomassa; 3) una fase Stazionaria dove il numero di cellule non aumenta, ma in cui il volume delle cellule continua ad espandersi aumentando così il peso fresco della biomassa. Le CCV sottoposte a crescita esponenziale hanno PCV principalmente primarie, contenenti tutte le principali componenti strutturali macromolecolari, ma con livelli ridotti di crosslink inter- e intra-molecolari.
In confronto a piante adulte, le CCV forniscono una biomassa omogenea a crescita rapida, ricca di pareti cellulari primarie che può essere considerata una fonte alternativa rinnovabile, sostenibile e potenzialmente economica di metaboliti vegetali, comprese proteine come le HRGP. Infatti diverse pubblicazioni scientifiche (Smith et al., "Isolation of extensin precurors by direct elution of intact tomato cell suspension cultures ", Phytochemistry (1984), Vol.23, No.6, pp.1233-1239, Heckman et al., " Characterization of Native and Modified Extensin Monomers and Oligomers by Electron Microscopy and Gel Filtration ", Plant Physiol. (1988), 86, 848-856, Ribeiro et al., " The contribution of extensin network formation to rapid, hydrogen peroxide-mediated increases in grapevine callus wall resistance to fungal lytic enzymes ", Journal of Experimental Botany (2006), 57: 2025-2035, Brownleader et al.," Investigations into the molecular size and shape of tomato extensin ", Biochem J. (1996 ), 320, 577-583) e brevetti (EP0800585) indicano che CCV possono essere sottoposte ad estrazione mediante soluzione saline (come NaCl, KCl, CaCl2, AlCl3, LaCl2,) per ottenere HRGP monomerici ionicamente legati al PCV.
Per estrarre HRGP monomeriche, una prima indicazione fornita dalla letteratura scientifica sulle cellule CCV mostra che l'estrazione doveva avvenire con una biomassa utilizzata durante la fase di rapida crescita logaritmica delle cellule. Smith et al. ha riportato che l'estrazione deve avvenire tra 4-7 giorni di coltura dall'inoculo per la linea di cellule di pomodoro e ha rivelato che in questo periodo c'è un picco di resa di estrazione, mentre tra 10 e 14 giorni dall'inoculo, le HRGP estratte mediante soluizoni saline era ridotto a circa il 20% del valore di picco.
Allo stesso modo, Dey et al. ("Extensin from suspension-cultured potato cells: a hydroxyproline-rich glycoprotein, devoid of agglutinin activity ", Planta (1997) 202: 179 - 187) ha rivelato che l'estrazione di HRGP da CCV di patate doveva essere fatta a 7 giorni dall'inoculo, e questa stessa indicazione è stata confermata da altri esperimenti che trovano HRGP essenzialmente insolubile a 14 giorni di coltura, a causa di legami crociati con polisaccaridi (Qi et al., "Solubilization and Partial Characterization of Extensin Fragments from Cell Walls of Cotton Suspension Cultures”, Plant Physiol. (1995), 108: 1691-1701), e successivamente adottato da altri autori (WO96 / 20284, Brownleader et al., "Investigations into the molecular size and shape of tomato extensin", Biochem. (1996) J.320: 577- 583).
Secondo la tecnica nota (Smith et al. E Qi et al.), dopo la fine della fase logaritmica in rapida crescita, il livello di HRGP estraibili è fortemente ridotto a causa dei collegamenti incrociati.
Un'importante limitazione nei metodi descritti nella tecnica anteriore di CCV come fonte di HRGP, di estensin in particolare, è la bassa resa di HRGP che ottienibile, che va da 0,7 mg Hyp/g di peso secco cellulare da linee di cellule di pomodoro (Smith et al.) a 0,092 mg Hyp/g di peso secco cellulare dalle linee cellulari di Zea mays (Kieliszewski et al., "Purification and Partial Characterization of a Hydroxyproline Rich Glycoprotein in a Graminaceous Monocot, Zea mays", Plant Physiol. (1987), 85, 823-827).
Pertanto, uno scopo primario della presente invenzione è quello di ovviare a questo inconveniente di scarso rendimento quando si utilizza un processo con CCV e di fornire un nuovo metodo di produzione di HRGP e in particolare di estensine, con rese idonee per uso industriale e di fornire prodotti adatti per applicazioni cosmetiche, farmaceutiche, veterinarie e dietetiche.
Frequentemente, il processo di estrazione di HRGP da piante giovani o tessuti differenziati per adulti comporta anche l’estrazione di molte proteine dal citoplasma intracellulare e di proteine non-HRGP debolmente legate al PCV, che riducono il livello di purezza della preparazione finale di HRGP. Inoltre, i polifenoli che, a seguito dell'ossidazione e della polimerizzazione, sono coinvolti nella formazione della lignina, possono ridurre la resa di estrazione a causa di legami crociati con HRGP presenti nel PCV.
Quindi, un altro scopo della presente invenzione è quello di superare questo inconveniente fornendo un metodo di produzione che consente di ottenere un prodotto di estrazione finale comprendente l'HRGP desiderato non contaminato con protein, intracellulari ed extracellulari, privo di polyfenoli, e che possono essere prodotti industrialmente in reattori di grandi dimensioni.
Secondo l'invenzione, viene fornito un metodo per produrre un estratto di cellule vegetali di glicoproteine monomeriche ricche in idrossiprolina (HRGP), comprese estensine, mediante estrazione da pareti cellulari vegetali (PCV), il metodo comprende di sottoporre una biomassa di cellule vegetali completamente dedifferenziata e/o meristematica al seguente trattamento:
A) Disgregazione delle cellule intere per produrre un omogenato di cellule in cui le molecole intracellulari sono solubilizzate;
B) Recupero del PCV eliminando le molecole intracellulari solubilizzate lavando l'omogenato di cellule intere con una soluzione acquosa;
C) Estrarre l'HRGP dal PCV aggiungendo un sale, o soluzione salina con adeguata forza ionica, formando così una sospensione di estratto salino arricchito con HRGP;
D) Recupero della sospensione di estratto salino arricchito di HRGP scartando i detriti PCV.
La principale differenza con la tecnica nota, in cui la fase di estrazione salina di HRGP deve essere eseguita su una biomassa comprendente cellule vegetali intere, risiede nel fatto che secondo l'invenzione il recupero dell'HRGP viene effettuato su a partire da una biomassa omogenenata, dove le cellule vegetali sono appositamente frantumate e le molecole intracellulari delle cellule sono rilasciate e mescolate con i detriti cellulari come la PCV che comprende l'HRGP.
Al punto A), intere significa chellule integer, non rotte. In questa fase, sostanzialmente tutte le cellule integer vengono frantumate.
Secondo l'invenzione, al punto B) viene eseguita una fase di trattamento sull'omogenato di cellule per eliminare sostanzialmente le molecole intracellulari non-desiderate che altrimenti contaminerebbero l’estratto di HRGP.
Queste fasi del metodo consentono vantaggiosamente di eliminare le molecole non-desiderate e di offrire una lavorazione industriale molto più facile da eseguire rispetto alla manipolazione di celle intere con il rischio di perdite e rotture.
Secondo un altro aspetto vantaggioso, il metodo dell'invenzione fornisce direttamente un estratto finale altamente arricchito in HRGP senza la necessità di ulteriori trattamenti di purificazione.
Inoltre, secondo il metodo dell'invenzione, sorprendentemente e vantaggiosamente, la raccolta della biomassa può essere eseguita nella fase stazionaria di crescita successiva alla fase logaritmica in cui può già essere presente il crosslinking e reticolazione dell'HRGP. Grazie alla fase di rottura secondo l'invenzione, alcuni crosslinks nelle PCV possono essere indeboliti e le HRGP essere più facilmente estraibili. Questo passaggio può essere eseguito mediante lisi meccanica, o lisi chimica, o digestione enzimatica. Preferibilmente il passaggio di disgregazione A) è eseguito da lisi acida che aumenta l'indebolimento di crosslink nella PCV. Quindi per migliorare ulteriormente l'indebolimento dei crosslinks nella PCV dovuta alla lisi acida, l'omogenato di cellule intero ottenuto nel passaggio A) può essere incubato per almeno 30 minuti, preferibilimente per almeno 2 ore, più preferibilmente almeno per 6 ore, ancora più preferibilmente per almeno 18 ore.
La raccolta di cellule dal reattore eseguita nella fase stazionaria fornisce un volume di biomassa più grande, a causa di un volume maggiore di ciascuna cellula e quindi della maggiore superficie e perciò un contenuto maggiore di PCV, è possibile ottenere quantità superiori di HRGP, compatibili con uno sviluppo industriale. Preferibilmente la raccolta viene effettuata dopo circa 12-16 giorni di coltura (o giorni dall'inoculo), preferibilmente 14 giorni; corrispondente ad un aumento della biomassa dopo la fine della fase di proliferazione logaritmica di circa il 50% al 90%, preferibilmente dal 75% all'80%. Gli esempi sono forniti di seguito per illustrare questi risultati. Ad esempio, con una biomassa di cellule di Ajuga reptans si ottiene una resa del 73,3% a 14 giorni di coltura che è molto superiore alla resa massima descritta nella tecnica anteriore.
Secondo altre caratteristiche preferite, la fase c di estrazione HRGP viene eseguita aggiungendo soluzioni saline con cationi inorganici, preferibilmente calcio (Ca2 ), potassio (K ) e sodio (Na ). L’aggiunta di sale di cui al punto C puo essere effettuata con l’aggiunta sia di una soluzione salina, sia di un sale in polvere.
Sempre secondo le caratteristiche preferite, nel passaggio B) del metodo dell'invenzione, l'eliminazione delle molecole intracellulari solubilizzate mediante il lavaggio con una soluzione acquosa viene effettuata mediante diafiltrazione su un filtro da 0,2um o mediante centrifugazione. Allo stesso modo, secondo una caratteristica preferita, lo scarto dei detriti da PCV nel passaggio D) viene eseguita mediante filtraggio o centrifugazione.
Inoltre, allo scopo di aumentare vantaggiosamente la purezza dell'estratto e preparare la soluzione dell'estratto di HRGP alle condizioni tampone adeguate per l'idrolisi enzimatica, un ulteriore passaggio E) eseguito dopo la fase D) è possibile eseguire contemporaneamente la dissalazione e la concentrazione dell'estratto salato HRGP arricchito mediante ultrafiltrazione usando un filtro 10kDa.
Secondo il metodo dell'invenzione, un estratto comprendente HRGP arricchito ottenuto dopo la fase D) o il passaggio facoltativo E) ha un profilo di glicoporteine HRGP con peso molecolare variabile da 16 kDa a 91 kDa con il contenuto di proteine più abondante a 31 kDa, 45kDa e 66kDa.
Questo estratto HRGP arricchito ottenuto dopo il passaggio D) o il passaggio opzionale F) può essere sottoposto ad un'ulteriore fase di idrolisi per aumentare il contenuto di piccoli frammenti HRGP, preferibilmente di frammenti di HRGP <5 KDa. Tale idrolisi è preferibilmente una idrolisi enzimatica di carboidrasi e proteasi.
Il metodo dell'invenzione può essere eseguito su una biomassa di cellule de-differenziate di qualsiasi specie botanica, poiché qualsiasi PCV comprende HRGP per natura. Gli esempi sono riportati di seguito sulla biomassa cellulare di Buddleja davidii, Gardenia jasminoides, Ajuga reptans, Syringa vulgaris e Magnolia grandiflora, che mostrano rese particolarmente vantaggiose e non sono mai state divulgate come fonte di HRGP nella tecnica anteriore.
L'invenzione fornisce specificamente un estratto di HRGP da Buddleja davidii, Gardenia jasminoides, Ajuga reptans, Syringa vulgaris e Magnolia grandifolia, che può essere ottenuto secondo il metodo dell'invenzione e comprendendo vantaggiosamente almeno il 20% di proteine al di sotto di 5 KDa. Buddleja davidii, comunemente noto come lilla d'estate, albero delle farfalle o occhio d'arancia, fa parte della famiglia Scrophulariaceae, originaria delle province di Sichuan e Hubei nella Cina centrale e in Giappone, e ampiamente coltivata in Europa. Buddleja davidii è un arbusto vigoroso, che raggiunge i 5 m di altezza. Le infiorescenze profumate, dal lilla al viola, sono pannocchie terminali, lunghe meno di 20 cm. I fiori sono perfetti (con parti sia maschili che femminili), quindi sono ermafroditi. Le cultivar Buddleja davidii sono molto apprezzate in tutto il mondo come ornamentali e per il valore dei loro fiori come fonte di nettare per molte specie di farfalle. Le piante medicinali tradizionali del genere Buddleja sono conosciute per la loro guarigione delle ferite, le proprietà antinfiammatorie e antibatteriche. Gardenia jasminoides, comunemente nota come gardenia, capo gelsomino, capo jessamine, danh-danh o gelsomino, fa parte della famiglia delle Rubiacee, originaria della Cina e dell'Asia. Gardenia jasminoides è un arbusto con corteccia grigiastra e foglie sempreverdi brillanti verde scuro. I fiori bianchi sbocciano in primavera e in estate e sono molto profumati. Sono seguiti da piccoli frutti ovali. Gardenia jasminoides è ampiamente usata come pianta da giardino nei caldi giardini temperati e subtropicali. Può essere usato come una siepe. Gardenia jasminoides fructus (frutto) viene utilizzato nella medicina tradizionale cinese per "drenare il fuoco" e quindi trattare alcune condizioni febbrili. Ajuga reptans, noto anche come bugola comune, bugola blu o erba bugola, è una pianta perenne della famiglia delle Lamiaceae, originaria dell'Europa, del Caucaso e dell'Iran, che cresce nei boschi e nei pascoli. Ajuga reptans è un'erba perenne tentacolare con fusti fioriti eretti e raggiunge un'altezza di circa 10 a 35 cm. Gli steli sono squadrati con peli su due lati e la pianta ha i corridori che si diffondono sulla superficie del terreno. Le foglie a peduncolo verde-violetto sono in coppie opposte. Le lame delle foglie sono glabre e sono ellittiche o ovali con una punta arrotondata e denti leggermente arrotondati sul margine. L'infiorescenza forma un racemo denso ed è composta da spirali di fiori blu, ciascuna con vene scure sul labbro inferiore. Ajuga reptans è tradizionalmente utilizzato per ornamenti e per le sue proprietà anti-infiammatorie, in particolare per alleviare il lieve dolore reumatico. L'erba è stata usata internamente nella medicina tradizionale austriaca come tè per il trattamento di disturbi legati alle vie respiratorie. La bugola è anche conosciuta come "erba del falegname" per la sua presunta capacità di arginare il sanguinamento.
La Siringa vulgaris, nota come lilla o lilla comune, è un arbusto deciduo perenne della famiglia delle Oleaceae. Originario dell'Europa sud-orientale, ora è una pianta spontanea in tutta Europa, dove è ampiamente utilizzato come pianta da giardino ornamentale. Presenta foglie ovate o a forma di cuore con margini pieni. I piccoli fiori sono raggruppati in grappoli fragranti e dai colori vivaci all'estremità dei rami. Dai fiori e dalle foglie si ottiene un colorante verde e dai ramoscelli si ricava un colorante giallo-arancio. Un olio essenziale è ottenuto dai fiori e utilizzato nelle fragranze dei profumi.
La Magnolia grandiflora, conosciuta anche come magnolia meridionale o baia del toro, è un albero grande e bello della famiglia delle Magnoliaceae, con una forma piramidale, che può raggiungere un'altezza di 30 m. È originaria del Nord America ed è ampiamente coltivato come albero ornamentale. Magnolia grandiflora contiene costituenti fenolici che mostrano di possedere una significativa attività antimicrobica. Magnololo, honokiolo e 3,5'-diallil-2'-idrossi-4-metossibifenile hanno mostrato un'attività significativa contro batteri e funghi Gram-positivi e acido-rapidi. Le foglie contengono cumarine e lattoni sesquiterpenici.
La presente invenzione fornisce anche l'uso di un estratto di HRGP che può essere ottenuto secondo il metodo dell'invenzione per un trattamento cosmetico non terapeutico o per un trattamento medico. Secondo altre caratteristiche, la presente invenzione fornisce
- un ingrediente cosmeico, medicinale, dietietico e veterinario comprendente un estratto che può essere ottenuto in accordo con il metodo dell’invenzione e in un mezzo fisiologicamente accettabile,
- una composizione adatta per uso cosmetico, farmaceutico, dietetico o veterinario, comprendente una quantità efficace di un estratto ottenuto secondo il metodo dell'invenzione, o dell’ingrediente dell’invenzione, in un eccipiente fisiologicamente accettabile,
- prodotti veterinari e dietetici comprendenti detta composizione.
La presente invenzione sarà meglio compresa alla luce della seguente descrizione dettagliata di esempi.
Preparazione di biomassa di cellule de-differenziate di diverse piante
I seguenti linee cellulari furono generati, coltivati, stabilizzati e testati: Ajuga reptans, Buddleja davidii, Gardenia jasminoides, Syringa vulgaris e Magnolia grandiflora.
Linee cellulari stabilizzate e selezionate derivate da queste piante (da cellule vegetali dedifferenziate e/o meristematiche) sono state coltivate su terreno di coltura solido (Gamborg B5 contenente 1% (peso/volume =p/v) di Agar, 30 g/L di saccarosio, 1 g/L di peptone vegetale, 1 mg/L di acido naftalenacetico (NAA), 0,2 mg/L di acido indolacetico (IAA) e 1 mg/L di chinetina, pH finale di 6,5) e poi sono stati inoculati in cinque fiaschi di Erlenmeyer ciascuno della capacità di 3 litri contenente 1000 ml di terreno liquido (Gamborg B5 contenente 30 g/L di saccarosio, 1 g/L di peptone vegetale, 1 mg/L NAA, 0,2 mg/L di IAA e 1 mg/L di cinetina, pH finale di 6.5). La quantità di cellule vegetali inoculate in mezzo liquido era pari al 5% p/v. Le sospensioni così ottenute sono state incubate a 25 ° C al buio e poste su un agitatore orbitale impostato a 120 RPM. Dopo 14 giorni di incubazione, la biomassa vegetale (5 litri di sospensione cellulare) è stata raccolta e filtrata su rete di nylon con un filtro Buchner con una dimensione della maglia dei pori di 50 μm.
Protocollo di estrazione HRGP secondo l'invenzione
Lisi acida: un acido minerale (esempio H3PO4 e HCl) o un acido organico (ad esempio acido acetico, acido lattico o acido citrico) viene aggiunto alla biomassa cellulare dopo 14 giorni di coltura dall'inoculo (alla fine della fase stazionaria di crescita durante la quale cresce la dimensione delle cellule) a pH2;
Incubazione dell'omogenato cellulare in soluzione di lisi acida per 18 ore a 4 ° C;
Lavaggio dell'omogenato cellulare con acqua (mediante diafiltrazione su filtro da 0,2 μm), al fine di rimuovere tutte le molecole intracellulari solubili e ottenere una frazione arricchita in PCV (= frazione PCV);
Estrazione con soluzione salina: 200 mM di CaCl2 e L acido ascorbico (1 g/L) vengono aggiunti direttamente alla frazione PCV e la sospensione viene agitata per 10 minuti a 4 ° C;
Recupero di HRGP: la soluzione arricchita di HRGP viene separata dalla PCV esausta mediante una filtrazione su qualsiasi dispositivo di filtrazione idoneo e raccolta per un'ulteriore elaborazione; il PCV rimanente viene scartato; la soluzione HRGP ricca di calcio viene desalinizata e concentrata alla concentrazione desiderata di Hyp mediante ultrafiltrazione su una membrana 10kDa; il buffer finale dell'estratto di HRGP è il tampone citrato, 0,05 M, a pH4. Dopo l'ultrafiltrazione con la membrana 10 kDa, la soluzione ritenuta, che costituisce l'estratto di HRGP, è liofilizzata.
Per confronto, il protocollo di estrazione HRGP secondo la tecnica anteriore (su cellule intere) sulla stessa coltura usata precedentemente
Le cellule vengono raccolte per filtrazione a 6-10 giorni dall'inoculo (nella fase logaritmica dove cresce il numero di cellule) con un filtro Buchner, a 50 μm;
Il tampone di estrazione (200 mM di CaCl2 1 g/L di acido ascorbico a pH 3) viene aggiunto alle cellule alla concentrazione di 200 mg/ml di tampone e la sospensione cellulare viene agitata per 10 minuti a 4 ° C;
L'estratto viene quindi raccolto dopo la filtrazione con un filtro Buchner (50 μm) e le cellule integre (non frammentate) vengono scartate;
Dalla soluzione HRGP ricca di calcio viene romosso il sale e viene concentrata alla concentrazione desiderata di Hyp mediante ultrafiltrazione su una membrana 10kDa. Il buffer finale dell'estratto di HRGP è il tampone citrato, 0,05 M, a pH4;
Il contenuto di HRGP viene misurato utilizzando l'idrolisi, ad elevata acidità e ad alta temperature, di tutti i componenti macromolecolari della PCV e la successiva determinazione del contenuto di idrossiprolina (Hyp), secondo Kivirikko et al. " A colorimetric method for determination of hydroxyproline in tissue hydrolysates", Scand J Clin e Lab. Investigazioni 128-133, 11, 1959.
Questa procedura consiste in due passaggi successivi, il primo per idrolizzare il campione e il secondo per misurare l'idrossiprolina. Per l'idrolizzare, 1 mL di campione liquido è stato trasferito in un tubo di idrolisi e portato a secchezza con gas azoto nell'evaporatore. Successivamente a ciascun campione essiccato, è stato aggiunto 6M HCl allo stesso volume (1 ml di campione/1 ml di acido); Campioni secchi solidi (50 mg) sono stati aggiunti direttamente a 1 ml di HCl 6M. Tutti i campioni sono stati incubati 15-18 ore a 110 ° C. Dopo l'idrolisi, i campioni sono stati portati a secco con gas azoto.
Per determinare il contenuto di idrossiprolina i campioni sono stati ri-sospesi con tampone acetato/citrato allo stesso volume di HCl 6M, utilizzato nell'idrolisi. Una curva standard con idrossiprolina è stata preparata in provette da 1,5 ml, con tampone acetato/citrato, a concentrazioni: da 0 μg/mL a 10 μg/mL. In un'altra provetta da 1,5 ml, sono stati miscelati 100 μL di campione (o standard) e 100 μL di soluzione di cloramina T al 7% e incubati a 25 minuti a temperatura ambiente al buio. Sono stati poi aggiunti 100 μL di soluzione di Ehlrich ed i campioni sono stati incubati per 15 minuti a 60 ° C al buio. 300 μL di ciascun campione sono stati trasferiti in una piastra a 96 pozzetti e letti su un contatore multilabel a 540-560 nm. La quantità di idrossiprolina (Hyp) è stata estrapolata dalla curva standard, come μg Hyp/ml buffer.
Risultati
La seguente tabella 1 fornisce risultati comparativi per illustrare l'invenzione del contenuto di Hyp e percentuale di recupero dall'intera cella mediante estrazione salina, da sola o dopo lisi dell'acido a 6 giorni, 10 giorni e 14 giorni di coltura.
Tabella 1
Ciò che si osserva dalla tabella è che:
Il totale di Hyp aumenta da 6 a 14 giorni. Questo è in linea con la crescente quantità della biomassa. La percentuale di recupero di HRGP diminuisce da 6 a 14 giorni con il metodo dell'arte nota (solo estrazione salina, nessuna disgregazione delle cellule). Ciò corrisponde a quanto descritto nella tecnica anteriore, cioè che l'estrazione di HRGP diventa più difficile quando gli HRGP sono reticolati nella PCV.
La percentuale di recupero di HRGP rimane sostanzialmente la stessa da 6 a 14 giorni con il metodo dell'invenzione (lisi delle cellule estrazione salina).
A 6 giorni, la percentuale di peso fresco di cellule intere sedimentato è di circa il 20-30%, a 10 giorni la percentuale è di circa il 40-55% e a 14 giorni di circa il 55-87%. Il volume percentuale del peso fresco cellulare (Cell Fresh Weight = FW) è stato determinato arrestando l'agitazione della cellula nel reattore e misurando, dopo 30 minuti, il volume percentuale del sedimento cellulare sul volume totale della sospensione di coltura con un peso specific, o una densità per FW, di circa 1 kg/L. Per le cellule vegetali la densità cellulare specifica è in genere 1,04 kg/L
I risultati mostrano che il metodo dell'invenzione è molto più interessante: ad esempio per Ajuga reptans e Syringa vulgaris, consente di aumentare a 14 giorni la quantità di HRGP del 42% rispetto al metodo della tecnica anteriore.
La seguente tabella 2 mostra la composizione dell'estratto da PCV liofilizzato ottenuto da Ajuga reptans e Gardenia jasminoides mediante estrazione del sale dopo trattamento con lisi acida
Tabella 2
Componente Ajuga reptans Gardenia jasminoides
(% sul peso secco estratto) (% sul peso 15.2/2.secco estratto)
Carboidrati 22.26 25.04
Arabinosio 11.15 12.3
Galactosio 8.44 9.8
Glucosio 1.65 0.82
Xylosio 1.02 2.12
Proteine 23 8
Hyp 3.63 1.52
Sali 22.04 35.92
Insolubli e nonidentifiati 32.36 31.04
Il processo di estrazione e liofilizzazione fornisce un estratto finale che corrisponde per Ajuga reptans ad un aumento di 16.8 volte del contenuto di Hyp dell’estratto rispetto al contenuto di peso secco cellulare e un aumento di 6.5 volte per l'estratto di Gardenia jasminoides.
Inoltre, è stata effettuata un'analisi di sequenza aminoacidica sui campioni di Ajuga reptans e Gardenia jasminoides a seguito di un ulteriore passaggio di precipitazione proteica con acido tricloracetico per aumentare ulteriormente la purezza di HRGP. I campioni sono stati analizzati mediante la valutazione HPLC-MS/MS dopo la digestione con tripsina e diversi peptidi sono stati identificati come frammenti HRGP. Specificamente in Ajuga reptans, un peptide presente nel campione estratto è identico alla proteina 1 ricca in leucina estensina simile di Solanum lycopersicum (accesion gi|460408850) in cui la prolina è il 19,8% della massa totale nella sequenza ammino-acidica. Nel campione di Gradenia jasminoides, cinque diversi peptidi (accession: gi|559237 con Pro al 21,2% di massa; gi|1486263 con Pro al 39,5% di massa; gi|460413353 con Pro al 28,0% di massa; gi|460400459 con Pro a 10,7% della massa e gi|460406916 con Pro al 19,8% della massa) sono stati identificati come HRGP.
Dalla Tabella 2, in Ajuga reptans, l'estrazione salina dopo la procedura di lisi acida seguita dalla liofilizzazione produce 36,3 mg di Hyp e 230 mg di proteine per grammo di estratto secco (EDW). Questo permette di calcolare che con questa procedura si ottengono fino a 157,8 mg di Hyp/g di protein nel peso secco di estratto finale. Insieme all'indicazione che, in Ajuga reptans, il contenuto di massa di Hyp è pari al 19,8% della massa totale di amminoacidi della HRGP identificata, è possibile calcolare HRGP pari ad almeno il 79,7% delle proteine presenti nel campione. Una valutazione analoga per gli estratti di Gardenia jamisnoides fornisce un livello di arricchimento simile.
Inoltre, il contenuto in massa di arabinosio è più di 3 volte la massa di Hyp e più abbondante del galattosio, in linea con la struttura generale nota per le HRGP.
Anche WO 2011/124848 insegna che l'HRGP può essere estratta mediante idrolisi enzimatica da fibre vegetali di soia, ma la qualità e la quantità sono piuttosto diverse rispetto alla composizione dell'estratto ottenuto nella presente invenzione. La quantità di Hyp ottenuta con il metodo WO 2011/124848 nel peso secco dell'estratto finale varia da 18 mg Hyp/g di proteine a un massimo di 30 mg di proteina Hyp/g di proteine estratte.
Un profilo cromatografico su gel di permeazione in HPLC, insieme a un'elettroforesi su gel SDS-PAGE è stato utilizzato per definire il profilo di peso molecolare delle principali proteine HRGP presenti in campioni di Ajuga reptans in cellule intere e dopo lisi acida e non è stata rilevata alcuna differenza principale. Nell'estratto non digerito iniziale con glicoproteine principalmente monomeriche, più del 76% della massa media della proteina misurata era superiore a 5 KDa e il 24% della massa media del peptide era inferiore a 5 KDa.
Idrolisi del HRGP monomerico ottenuto secondo l'invenzione
I peptidi HRGP idrolizzati possono essere preparati mediante proteasi dopo la de-glicosilazione. La rimozione dei rami glicosidici dalla proteina monomerica HRGP può essere ottenuta mediante trattamento con acido fluoridrico (HF) (Mort AJ, Lamport DTA. " Anhydrous hydrogen fluoride deglycosylates glycoproteins” Anal Biochem., 1977: 82: 289-309"). La deglicosilazione delle HRGP è necessaria per consentire l'accesso delle proteasi, come la tripsina, ai legami peptidici della proteina per ottenere frammenti peptidici di dimensioni più piccole mediante idrolisi enzimatica. Inoltre, WO 2011/124848 insegna come utilizzare una sequenza o combinazione di carboidrasi e proteasi per estrarre i peptidi HRGP dalle fibre di soia e sono stati applicati qui. Una sequenza di carboidrasi e proteasi è stata utilizzata per ridurre la dimensione del peptide su estratti di HRGP da CCV di Ajuga reptans.
A seguito di idrolisi enzimatica di carboidrasi e proteasi, la quantità totale di peptidi rilevati con massa media inferiore a 5 kDa è aumentata dal 24% al 57,2% e la frazione di peptidi con massa media superiore a 5 kDa è stata ridotta dal 76% al 43%. Risultati simili sono stati ottenuti per gli estratti HRGP da Gardenia jasminoides, Buddelja davidii e Magnolia grandifolia.
Sia l'estratto di HRGP monomerico non digerito che gli estratti enzimaticamente idrolizzati di piante sono adatti per applicazioni farmaceutiche, nutrizionali, veterinarie e cosmetiche.
Le valutazioni in vitro dell'azione di un estratto di HRGP dell'invenzione sono riportate di seguito, eseguite su un estratto di Gardenia della tabella 2.
1) Miglioramento del derma e del derma/epidermide junction (DEJ)
a) Valutazione di Immunofluorescenza (FMI): sintesi di collagene I.
La perdita di densità e spessore del derma è correlata a una riduzione della sintesi di macromolecole durante l'invecchiamento (intrinseco o estrinseco) da parte dei fibroblasti dermici, le cellule responsabili della loro sintesi. Il collagene I è la proteina più abbondante nel derma.
Protocollo
I fibroblasti umani normali (NHF) vengono coltivati in piastre da 24 pozzetti per 24 ore. Le cellule vengono messe a contatto con i prodotti di test (o il loro eccipiente come controllo) per 6 giorni. Il collagene I prodotto dalle cellule viene quindi quantificato mediante immunocitologia a fluorescenza (n = 3) sui tappetini fissi e quantificato mediante analisi delle immagini, i risultati vengono espressi in unità di fluorescenza arbitrarie. Ogni risultato è correlato al numero di cellule valutate utilizzando il metodo Hoescht 33258, che segna il DNA. Il valore ottenuto per l'estratto secondo l'invenzione viene confrontato con quello ottenuto per il solvente del prodotto (controllo). Sono stati eseguiti uno studio delle varianze e un test t di Student per le serie accoppiate per giudicare il significatività statistica dei risultati.
Risultati
Tabella 3: Variazione della sintesi di collagene I con NHF in presenza dell'estratto secondo l'invenzione (metodo IMF)
Concentrazioni % variazione/controllo; significatività (t-test di Student)
Controllo Referenza
80 ppm 98.2; p<0.01
Nessun effeto tossico è stato osservato
b) Valutazioni di ELISA: sintesi di macromolecole del derma e del DEJ
L'elastina viene sintetizzata e secreta nello spazio dermico extracellulare. È il componente principale, fino al 90%, delle fibre elastiche.
La fibronectina è una glicoproteina presente nella matrice extracellulare, che svolge un ruolo chiave nell'adesione cellulare alla matrice extracellulare. Può contemporaneamente legarsi alla cellula e ad altre molecole di matrice extracellulare, come il collagene o un'altra molecola di fibronectina. A questo scopo, le molecole di fibronectina si riuniscono per formare fibre elastiche adesive sulla superficie di molte cellule. Questo determina le proprietà meccaniche (elasticità, elasticità e compattezza) della pelle.
Il Collagen IV forma una rete bidimensionale ed è uno dei componenti principali del DEJ.
Le laminine sono anche contenute nello strato basale e partecipano all'ancoraggio delle superfici cellulari alla lamina basale.
L'aumento della sintesi di collagene IV e laminina aiuta a rafforzare/ripristinare il DEJ e quindi la flessibilità dell'intero sistema del derma / epidermide.
L'acido ialuronico presenta caratteristiche che legano e attraggono l'acqua a riempire gli spazi tra le fibre connettive di collagene ed elastina nel derma. L'aumento di acido ialuronico aiuta a rafforzare/ripristinare la densità del derma.
Protocollo
I fibroblasti umani normali confluenti (NHF) in coltura sono portati in contatto con l'estratto dell'invenzione da testare o il loro eccipiente (controllo negativo) per 72 ore. Dopo il contatto, i surnatanti di coltura vengono recuperati e la quantità di macromolecole dermiche sintetizzate viene testata con ELISA. Ogni risultato è correlato al numero di cellule valutate utilizzando il metodo Hoescht 33258, che marca il DNA. Il valore ottenuto per l'estratto secondo l'invenzione viene confrontato con quello ottenuto per il solvente del prodotto (controllo). Sono stati eseguiti uno studio delle varianze e un t-test di Student per le serie accoppiate per giudicare il significato dei risultati.
Nessun effeto tossico è stato osservato
Questi dati indicano la capacità dell'estratto secondo l'invenzione di prevenire e ripristinare le proprietà meccaniche della pelle: densità, compattezza, elasticità ed elasticità. La pelle è più densa e voluminosa.
Possono essere previsti trattamenti cosmetici legati alla perdita di elasticità, spessore, compattezza, densità e/o volume della pelle, o per prevenire tali perdite, in particolare trattamenti di rughe e linee sottili, di rilassamento cutaneo.
Possono anche essere previsti trattamenti medici indicati per riparare la matrice extracellulare di tessuti
2) Miglioramento dell'epidermide
Anche l'acido ialuronico è un elemento importante nell'epidermide in cui partecipa alla sua buona idratazione. Sintetizzato e secreto dai cheratinociti, agisce nell'epidermide come una vera spugna, attraendo e trattenendo fino a 1000 volte il suo peso in acqua.
La laminina 5 è importante a livello di DEJ. Assicura il corretto ancoraggio dei cheratinociti basali sulla membrana basale ed è responsabile della morbidezza dell'epidermide. Inoltre, stimola la proliferazione dei cheratinociti, permettendo loro di impegnarsi nella differenziazione. Nelle cellule più vecchie la laminina 5 non è più sostituita in modo efficiente come nelle cellule giovani, stimolando quindi la sua biosintesi l'interesse di un migliore rinnovamento dei cheratinociti.
Protocollo
Cheratinociti confluenti in coltura vengono messi in contatto con i prodotti da testare o con il loro eccipiente (controllo negativo) per 72 ore. Dopo il contatto, i surnatanti di coltura vengono recuperati e viene dosata la quantità di laminine e acido ialuronico sintetizzato. Ogni risultato è correlato al numero di cellule valutate utilizzando il metodo Hoescht 33258, che segna il DNA. Il valore ottenuto per gli estratti secondo l'invenzione viene confrontato con quello ottenuto per il solvente del prodotto (controllo). Sono stati eseguiti uno studio delle varianze e un test t di Student per le serie accoppiate per giudicare il significatività statistica dei risultati.
Tabella 5: risultati Acido Ialuronico Laminine 5
Concentrazioni 160 ppm 80 ppm
%Variazione/controllo 59 % 71%
Significatività (t- test di Student) p<0.05 p<0.01
Miglioramento della qualità della differenziazione dei cheratinociti
I cheratinociti umani quasi confluenti vengono trattati al giorno 2, 3 e 6 con l'estratto secondo l'invenzione (o il suo placebo) in un terreno di coltura adatto per studiare le loro modificazioni fenotipiche al microscopio considerando l'aspetto delle cellule. Con l'estratto secondo l'invenzione (a 200ppm), i risultati mostrano una chiara accelerazione dei fenotipi caratteristici della differenziazione con presenza di strutture tipiche degli strati superiori dell'epidermide (presenza di strutture ramificate caratteristiche del rigido strato proteolipidico) e aspetto lamellare dello strato corneo, (network rifrattivo).
Tutti questi risultati mostrano che l'estratto secondo l'invenzione ha un effetto benefico sull'epidermide, attraverso una migliore differenziazione dei cheratinociti, una migliore idratazione e elasticità. La funzione di barriera dell'epidermide contro le aggressioni esterne è migliorata. La carnagione della pelle è abbellita.
Pertanto, l'invenzione fornisce l'uso dell'estratto di HRGP per migliorare lo stato generale della pelle compreso il cuoio capelluto e i suoi annessi (come unghie, capelli, ciglia, sopracciglia), in particolare:
- prevenire e / o trattare i segni intrinseci ed estrinseci dell'invecchiamento cutaneo: rughe, linee sottili, discontinuità e ruvidità della pelle, rilassamento cutaneo e/o
- migliorare le proprietà meccaniche della pelle, la tonicità e / o la fermezza e / o l'elasticità della pelle; e/o
- migliorare la densità del derma e dell'epidermide, per dare o ripristinare il volume del derma e dell'epidermide; e/o
- prevenire e/o trattare la disidratazione della pelle; e/o
- per migliorare la luminosità della carnagione.
I risultati sull'abbellimento e sullo stato generale della pelle e dei suoi annessi possono essere osservati con l'uso degli estratti di HRGP secondo l'invenzione, in particolare:
- sulla consistenza: la capacità idratante della pelle è migliorata; la pelle è meno ruvida e più morbida e la perdita d'acqua della pelle è ridotta; la pelle è protetta meglio dalle aggressioni esterne;
- sulle proprietà meccaniche: la pelle è più densa, più ripiena, più soda, più tonica e quindi più elastica; l'estratto ha un effetto di incremento della voluminosità;
- sulla carnagione: la pelle è più luminosa.

Claims (20)

  1. Rivendicazioni 1. Un metodo per produrre un estratto da cellule vegetali di glicoproteine monomeriche ricche di idrossiprolina (HRGP), comprese le estensine, mediante estrazione dalle pareti cellulari vegetali (PCV), il metodo comprende sottoporre una biomassa di cellule vegetali dedifferenziate e/o meristematiche al seguente trattamento: A) Disgregazione di cellule intere per produrre un omogenato di cellule in cui le molecole intracellulari sono solubilizzate; B) Recupero della parete cellulare vegetale eliminando le molecole intracellulari solubilizzate lavando l'omogenato di cellule intere con una soluzione acquosa; C) Estrarre l'HRGP dalla parete cellulare vegetale aggiungendo un saline formando così una sospensione di estratto salato arricchito con HRGP e; D) Recupero della sospensione di estratto salato arricchito di HRGP scartando i detriti della parte cellulare vegetale.
  2. 2. Un metodo secondo la rivendicazione 1, in cui la fase A). viene eseguita utilizzando una lisi chimica, meccanica o digestione enzimatica.
  3. 3. Un metodo secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui nella fase B) l'eliminazione delle molecole intracellulari solubilizzate mediante il lavaggio con una soluzione acquosa viene eseguita mediante diafiltrazione su un filtro da 0,2 μm o mediante centrifugazione.
  4. 4. Un metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui lo scarto dei detriti della parete cellulare vegetale nel passaggio C) viene eseguita mediante filtraggio o centrifugazione.
  5. 5. Un metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, comprendente un passaggio aggiuntivo E). dopo il passaggio D) simultaneamente desalinizzando e concentrando l'estratto salino arricchito in HRGP mediante una ultrafiltrazione con filtro da 10KDa.
  6. 6. Un metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la biomassa è una biomassa raccolta durante la fase stazionaria di crescita della biomassa in cui il numero di cellule è costante e la dimensione delle cellule cresce.
  7. 7. Un metodo secondo la rivendicazione 6, in cui la biomassa è una biomassa raccolta dopo circa 12-16 giorni di coltura, corrispondente ad una fase di aumento della biomassa dopo la fine della fase di proliferazione dal 50% al 90%.
  8. 8. Un metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 7, in cui il punto A) viene eseguito mediante lisi chimica, l'omogenato cellulare intero ottenuto nel passaggio a. è incubato per almeno 30 minuti.
  9. 9. Un metodo secondo al rivendicazione 8, dove il punto A) viene effettualto con lisi acida, con le cellule omogennate incubate in una soluzione di lisi acida.
  10. 10. Un metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 9, in cui la fase di estrazione al punto C) viene eseguita aggiungendo cationi inorganici.
  11. 11. Un metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 10, in cui l'estratto di HRGP arricchito ottenuto dopo i punti E) o F) è sottoposto ad un ulteriore passaggio di idrolisi per aumentare il contenuto di HRGP di KDa <5.
  12. 12. Un metodo secondo la rivendicazione 11, in cui l'idrolisi è una idrolisi enzimatica con carboidrasi e proteasi.
  13. 13. Un metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 12, in cui la biomassa di cellule vegetali meristematiche o dedifferenziate viene preparata coltivando una linea cellulare selezionata in un appropriato terreno di coltura, condizioni di coltura e reattore.
  14. 14. Un estratto di HRGP che può essere ottenuto secondo il metodo di una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 13.
  15. 15. Un ingrediente cosmetic, medico dietetico o verterinario comprendente un estratto secondo la ricendicazione 14 in un mezzo fisiologico accettabile
  16. 16 Una composizione adattata per uso cosmetico, farmaceutico, dietetico o veterinario, comprendente una quantità efficace di un estratto secondo la rivendicazione 14, o una quantità efficace di un ingrediente secondo la rivendicazione 15, in un eccipiente fisiologicamente accettabile.
  17. 17 Uso di un estratto secondo la rivendicazione 14, o un ingrediente secondo la rivendicazione 15, o una composizione secondo la rivendicazione 16, per un trattamento cosmetico non terapeutico.
  18. 18. Uso secondo la rivendicazione 17 per migliorare lo stato generale della pelle e dei suoi annessi, in particolare: - prevenire e/o trattare i segni intrinseci ed estrinseci dell'invecchiamento cutaneo: rughe, linee sottili, discontinuità e ruvidità della pelle, rilassamento cutaneo e/o - migliorare le proprietà meccaniche della pelle, la tonicità e / o la fermezza e / o l'elasticità della pelle; e/o - migliorare la densità del derma e dell'epidermide, per dare o ripristinare il volume del derma e dell'epidermide; e/o - prevenire e/o trattare la disidratazione della pelle; e/o - per migliorare la luminosità della carnagione.
  19. 19. Un estratto ottenuto secondo la rivendicazione 14, o un ingrediente secondo la rivendicazione 15, o una composizione secondo la rivendicazione 16, per un trattamento medico.
  20. 20. Un prodotto alimentare o un prodotto veterinario comprendente una quantità efficace di un ingredient secondo la rivendicazione 15 o una composizione secondo la rivendicazione 16.
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