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CN104812368B - 去分化植物细胞的美容用途 - Google Patents

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CN104812368B CN201380013044.1A CN201380013044A CN104812368B CN 104812368 B CN104812368 B CN 104812368B CN 201380013044 A CN201380013044 A CN 201380013044A CN 104812368 B CN104812368 B CN 104812368B
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Abstract

本发明涉及蔷薇属植物的去分化植物细胞或者所述细胞的提取物或冻干物作为用于护理老化皮肤或者老化毛发的活性剂的美容用途。本发明还涉及蔷薇去分化细胞，尤其是兰蔻蔷薇去分化细胞。

Description

去分化植物细胞的美容用途
技术领域
本发明属于美容领域，涉及蔷薇属(Rosa sp.)植物的去分化植物细胞作为活性剂对皮肤和毛发的美学护理的用途。
本发明还涉及来源于兰蔻蔷薇丛(rosebush)的去分化植物细胞的细胞系，所述去分化植物细胞能够且有效地修复皮肤的再生能力。
特别地，本发明涉及来源于兰蔻品种的蔷薇丛的去分化植物细胞的细胞系，所述去分化植物细胞能够且有效地修复具有低的再生潜力的重建皮肤的模型的再生能力，并且对来源于人体皮肤活体组织检查(头皮和包皮)的真皮干细胞、皮肤干细胞(SKP)的库(reservoir)的自我更新能力有效。
背景技术
皮肤是一种在个体的整个生命中持续地自我更新的组织。这种自我更新能力通过存在于表皮基底层中的角质形成细胞得以保持。这种细胞群，一方面，包括干细胞，所述干细胞是一种稀有细胞，其特征是具有非常可观的长期的扩增潜能以及自我更新能力，另一方面，包括被称作祖细胞的细胞，当祖细胞向角质层迁移时，增殖活跃并且可能分化。
对于毛囊，已知上皮隔室和真皮隔室的相互作用对毛发的形态发生和再生长以及维持毛囊周期是必不可少的。这两个隔室功能的维持依赖于各种干细胞库的存在和活性。上皮干细胞的第一库已经在啮齿类动物的被称作“隆突”的区域被确认(Cotsarelis等，Cell，1990，61：1329)。自从该第一次发现以来，角质成形细胞干细胞的其他库已经被确认，并且，在人类中，出现多个更活跃或较不活跃的库，其嵌入毛囊的外跟鞘(ORS)中(Rochat等，Cell，1994，76：1063；Commo等，Differentiation，2000，66：157；Jaks等，NatureGenetics，2008，40：1291)。
至于真皮隔室，容纳在真皮乳头及结缔组织鞘中的被称作SKP(皮肤源性前体细胞)的细胞，已经被确认在小鼠的毛发生长诱导及皮肤修复中作为多能细胞(Biernaskie等，Cell Stem Cell，2009，5：310)。数个团队已经证明SKP存在于人体组织中，尤其在毛囊的真皮乳头中(Toma等，Stem Cells，2005，23：727；Hunt等，Stem Cells，2008，26：163)。
尤其通过外皮表面的大量变型、肤色暗沉以及表面不均一性(平滑外观丧失)、弹性丧失、出现皱纹、创伤后的修复/愈合减缓、表皮变薄和/或毛发脱落和/或变白、毛发密度减小等，来显示皮肤室的老化。
在皮肤和毛发上的所有这些可见的变化表明皮肤隔室的再生能力的改变。它们也表明确保这些组织的内稳态和自我更新的基本的生物学功能随着年龄增长被损害。
现有数据表明，随着年龄增长，表皮中的再生细胞数量不会减少(Giangreco等，Aging Cell，2008，7：250)，但是它们的功能性显示出极大地受控制基底层再生能力的微环境的改变的影响。因此，与年龄相关的皮肤质量的下降呈现出与这些细胞的改变的再生能力关联。在细胞的微环境的关键组分中，可以提到细胞间相互作用、基底室的物理约束、以及周围细胞和真皮隔室的常驻型细胞分泌的旁分泌因子。
同样地，与脱发或者自然老化相关的毛发数量的减少和/或毛发质量的降低也表明变化的再生能力。事实上，已经证明：与未脱发头皮的毛囊相比，脱发头皮的毛囊长度收缩，并且具有较少的增殖的角质形成细胞(Ashrafussaman等，Acta Histochem Cytochem，2010，43：9)。此外，近来研究表明缺乏表皮干细胞转化为祖细胞在雄激素源性脱发中起着重要作用(Garza等，J Clin Invest，2010)。在真皮隔室中，体外培养中来源于脱发头皮的真皮乳头的细胞增殖缓慢，并且，相较于来源于未脱发头皮的细胞，显示出过早老化(Bahta等，J Invest Dermatol，2008，128：1088)，随着年龄增长，SKP的数量减少已经在人体组织中发现(Gago等，Stem Cells，2009，27：1164)。所有这些观察结果暗示毛囊隔室的再生能力的改变与脱发和/或自然老化有关。
因此，为了找到抵制皮肤和毛发与年龄关联的改变的解决办法，应尤其关注再生细胞，或甚至是皮肤和毛发的干细胞。
去分化植物细胞起源于Haberland在1902年的研究。在过去的40年中，植物细胞培养物已经被用于感兴趣的代谢产物的生产以及完全一样的植株的增殖(体细胞胚胎发生)。这种植物生物技术是基于细胞全能性的概念：“任何一个植物细胞能够去分化并且再生成另一个与所述细胞来源相同的新个体。”去分化植物细胞是来源于器官(叶、茎、根、花瓣等)的植物细胞，其经过培养、再次生成它的去分化形式，即失去了它的叶、茎、根、花瓣的特异性，能够再次生成完整的植株。
未分化植物细胞相当于源自植物分生组织细胞的真正的植物干细胞，并且不具有器官特异性的生物学历史。
WO 2009/151302和KR 2009-0118877描述了含有来源于人参(Panax ginsen)的形成层或者红豆杉属(Taxus genus)植物的未分化植物细胞的抗老化或抗氧化的组合物。
EP 1 985 280描述了来源于蔷薇科(Rosaceae)植物、尤其是来源于苹果树(Malusdomestica，苹果)的去分化植物细胞的用途，用来保护面对各种内在和外在压力的皮肤的干细胞，尤其用来治疗与年龄相关的皮肤和毛发的损害。
EP 1 699 423描述了来源于嗜盐植物的去分化植物细胞的冻干物的用途，用于复原皮肤表面。
DE-A-102 009 027 361和EP 2 266 529描述了去分化植物细胞的用途，尤其是来源于苹果属(Malus genus)植物的去分化植物细胞的用途，用于处理毛发角蛋白纤维、尤其保护它们免受紫外线辐射，或者用于治疗老化的皮肤。
EP 0 909 556描述了一种蔷薇科植物提取物的用途，特别是蔷薇的提取物，可选地从未分化植物细胞中获得，作为缓激肽拮抗剂用于处理各种病症、尤其是皮肤病症。
WO2011121051描述了来源于阿干(argania)树的去分化的、非诱导细胞的培养物的制剂，该制剂用于治疗老化皮肤、炎症和疤痕的用途，以及该制剂的生产。
WO200482643描述了一种包含乳香、乳香(Boswelia)或黄荆(Negundo)的去分化、诱导植物细胞并且显示提神作用的美容组合物。
EP2436759描述了来源于茄科(Solanaceae)植物的形成层并且显示抗老化作用的未分化细胞系。
EP2436758描述了来源于银杏科(Ginkgoaceae)植物的形成层并且显示增强的抗氧化作用的未分化细胞系。
EP2436757描述了来源于菊科(Asteraceae)植物的形成层并且显示增强的抗炎作用的未分化细胞系。
WO2010137879描述了来源于杨柳科(Salicaceae)植物的形成层并且显示增强的抗炎作用的去分化细胞系。
EP1064932描述了显示除臭作用的去分化细胞的用途。
EP1244464描述了火绒草属(Leontopodium genus)的去分化植物细胞的提取物作为抗紫外线的遮蔽剂的用途。
因此，据申请人所知，没有文献提及获取具有如本说明书所述的特定的美容性能的蔷薇丛的去分化细胞系。
需要确定技术方案，用于提高再生细胞(包括皮肤和毛发的干细胞)的功能性和/或活性，用于在个体的整个生命期中保持皮肤质量和功能、以及毛发质量、密度和形状，以及尤其用于预防和/或治疗与年龄关联的皮肤和毛发外观的影响。
特别地，需要提供新型的活性剂，用于抵制皮肤或毛发的组织再生中的缺陷，尤其用于减轻表皮变薄、提高皮肤外观、消除皱纹、减缓和/或阻止脱发、或者减缓和/或阻止毛发变白。
发明内容
本发明的目的尤其是满足这些需求。
根据本发明的第一方面，本发明涉及蔷薇属植物的、尤其是兰蔻蔷薇丛的植物的去分化的植物细胞、或者所述细胞的提取物或冻干物作为用来护理老化的皮肤或老化的毛发的活性剂的美容用途。
出乎意料地，发明人发现蔷薇的去分化植物细胞、或者所述细胞的提取物或冻干物已经被证明：在体外尤其能够且有效地修复由几乎不存在上皮干细胞和祖细胞的角质形成细胞群形成的重建皮肤的模型的再生能力。在包括处理两周的三周培养后，已经观察到上皮细胞厚度的增加以及形态质量(基底层的组织、成层和分化，等)的非常明显的改进。
发明人已表明，蔷薇去分化植物细胞、或者所述细胞的提取物或冻干物，通过优化表皮和真皮之间的通讯，至少部分地产生促再生(pro-regenerating)效应。事实上，发明人已经发现使用本发明的蔷薇去分化植物细胞、或者所述细胞的提取物或冻干物处理具有降低的再生潜能的重建皮肤，诱导许多可扩散的生物因子的表达，尤其是，对表皮再生具有有益效果而被熟知的KFG(角质形成细胞生长因子)的表达。因此，发明人已经发现，蔷薇去分化植物细胞、或者所述细胞的提取物或冻干物，已经被证明特别地能够且有效地诱导皮肤产生恢复包含干细胞和祖细胞的基底层的再生能力的生理因子。
出乎意料地，发明人已经发现，蔷薇去分化植物细胞、或者所述细胞的提取物或冻干物，已经被证明对于刺激来自于人体活组织检查(头皮和包皮)的真皮干细胞、SKP的库的自我更新能力特别有效。因此，可以观察到，在处理10天后，SKP的自我更新能力提高了约65％。这种活性剂评价研究可以得到结论：在体外，SKP的自我更新能力可以受到使用蔷薇去分化植物细胞、或者所述细胞的提取物或冻干物的处理的积极影响。
出人意料地，发明人也示出，蔷薇去分化植物细胞、或者所述细胞的提取物或冻干物，具有刺激或恢复皮肤再生能力的能力，然而现有技术所述的具有皮肤再生性能的化合物，如视黄醇，在同样的测试条件下未引起任何可检测到的效果。
这种对皮肤的、真皮的以及毛囊的再生细胞的自我更新能力的刺激容许对皮肤和毛发有益的功能的改进。这种对真皮干细胞库的刺激有利地使得保持、甚至是修复这些细胞的生物学功能、同时具有对皮肤和毛发的美容益处成为可能。
出于本发明的目的，术语“皮肤”用于指个体的整个皮肤的表面，包括头皮。
出于本发明的目的，术语“毛发”用于指包括毛干和毛囊的组合。
根据另一个实施方式，本发明涉及蔷薇属植物、尤其是兰蔻蔷薇的去分化植物细胞以及所述细胞的提取物或冻干物，作为用来处理和/或防止继老化皮肤或老化毛发的组织更新发生缺陷之后的审美缺陷的活性剂的美容用途。
出于本发明的目的，术语“防止”指的是减少所考虑的现象显现的风险。
根据另一个实施方式，本发明针对抵制老化皮肤或毛发的组织更新的缺陷，尤其用于减轻表皮或皮肤变薄、改善皮肤表面外观、消除皱纹、减缓和/或阻止脱发、或者减缓和/或阻止毛发变白。
根据本发明的另一个目的，本发明涉及一种美容用组合物，其包括作为活性剂的蔷薇属植物的至少一种去分化植物细胞、或者所述细胞的提取物或冻干物，所述去分化植物细胞通过把蔷薇属植物的细胞放置于培养基中培养获得，所述培养基至少包括：NH4NO3、KNO3、CaCl2·2H2O、MgSO4、KH2PO4、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、Na2MoO4·2H2O、CuSO4·5H2O、FeSO4·7H2O、肌醇、尼克酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素和蔗糖；以及可选的激动素、KI、Na2EDTA·2H2O、和/或萘乙酸。
根据本发明的另一个主题，本发明涉及一种美容用组合物，其包括作为活性剂的至少一种来源于兰蔻蔷薇丛的去分化植物细胞或者所述细胞的提取物或冻干物。
根据本发明的另一个主题，本发明涉及一种护理老化皮肤或老化毛发的美容方法，该方法包括在于将作为活性剂的蔷薇属植物的至少一种去分化植物细胞或者所述细胞的提取物或冻干物施用于有需要的个体的至少一个步骤。
根据另一的实施方式，根据本发明，蔷薇属植物的去分化植物细胞或者所述细胞的提取物或冻干物，可被口服或者局部施用。根据一个优选的实施方式，本发明为局部施用。
根据本发明的一个有益效果，本发明的活性剂使得可以刺激毛囊的真皮细胞。
还有利地，本发明的活性剂可以刺激皮肤或毛发的干细胞或祖细胞的自我更新，提高它们对皮肤和毛发、尤其是对老化的皮肤和毛发产生有益效果的功能。
根据另一有益效果，本发明的活性剂可以维持甚至是修复皮肤和毛发的干细胞库的生物学功能。
去分化植物细胞及其获取方法
出于本发明的目的，术语“去分化植物细胞”用于指来源于蔷薇属的蔷薇丛的器官并且借助于特定的体外培养条件而获得的任何细胞株，所述去分化植物细胞不再显示任何特异性特征，并且在诱导作用下，能够进行与其基因组一致的任何分化且能够独立地生成其来源的植物的完整植株。这种细胞可以独立生存，且与其他细胞没有依赖关系。
去分化植物细胞与天然地存在于植物中的未分化植物细胞不同。
出于本发明的目的，术语“去分化植物细胞”用于指来源于兰蔻蔷薇丛的器官的通过体内培养或体外培养而获得的细胞株，该细胞株能够分化和/或能够获得特定细胞的新特征，在诱导作用下，成为任何细胞类型(全能性的)或者成为几个细胞类型(多能性的)，尤其为胚胎发生细胞或者分生组织细胞。
在通常的情况下，植物细胞表达它们的基因组的大约20％，剩下的80％只有在对特有的环境条件做出响应才会表达。这些细胞在特有的培养条件下的体外培养，可以“重编程”细胞，从而可以获取该基因组在整个植株中未表达的一部分。某些化合物，难于通过提取从植物中获得，通过细胞培养变得更加易于得到。
因此，有利地，本发明的去分化植物细胞可以获取在整个植株中未出现的新型化合物，也可以显著地提高已知的但是在整个植株中较少的分子的表达。
本发明的去分化植物细胞可以从蔷薇属中的任何植物中获得。这些细胞可以从体内(in vivo)或体外培养的源自整个植株或者植株部分(例如叶、茎、花朵、花瓣、萼片或者根)的植物材料中获得。
术语“体内培养”用于指任何常规形式的培养，也就是说在露天的土壤中，或在温室中，或者不使用土壤。
术语“体外培养”用于指本领域技术人员已知的用于人工获得植株或者植物部分的所有技术方法。在植物细胞的体外生长的过程中，通过物理化学的条件而施加的选择压力，相较于体内培养的植物，可以一年四季都获得标准的植物材料。
优先地，根据本发明，使用源于体内培养的植株。
优选地，本发明的去分化植物细胞从蔷薇属植物的至少一片叶子获得。
蔷薇属包含多于200个的物种，在这些物种中，可提到白蔷薇(Rosa alba)、阿尔卑斯蔷薇(Rosa alpina)、狗蔷薇(Rosa canina)、肉桂蔷薇(Rosa cinnamonea)、法国蔷薇(Rosa gallica)、匍匐蔷薇(Rosa repens)、紫叶蔷薇(Rosa rubrifolia)、锈红蔷薇(Rosarubiginosa)、常绿蔷薇(Rosa sempervirens)、密刺蔷薇(Rosa spinosissima)、平花山地玫瑰(Rosa stylosa)、被绒毛蔷薇(Rosa tomentosa)、或者柔毛蔷薇(Rosa villosa)。
更优选地，本发明的去分化植物细胞从兰蔻蔷薇丛、尤其是被叫做兰蔻delboip蔷薇的蔷薇丛中得到。这种蔷薇丛可以购买得到，例如可从Delbard公司(法国)购买。
最优选地，根据本发明的去分化植物细胞使用作为起始材料的兰蔻delboip蔷薇的叶或者所述叶的细胞得到。
所述兰蔻蔷薇丛是一种茶科杂交种，其雌性的根源是杂交品种，通过品种Dr.Albert Schweitzer×品种[Michèle Meilland×Bayadère]杂交且通过品种Melmet授粉获得。
根据所选的培养方法，尤其根据所选的培养基，可以从同一个植株上获得具有不同特征的去分化植物细胞。
根据一个优选的实施方式，从源于兰蔻蔷薇丛叶的植物材料中获得本发明的去分化植物细胞。
根据一个优选的实施方式，适合于获取本发明的去分化植物细胞的培养基包括天然地存在于植物中的激素。
根据一个优选的实施方式，兰蔻蔷薇丛的去分化细胞是通过包括如下步骤的方法获得的：
a)提供兰蔻蔷薇丛叶片、或源于所述叶片的细胞，
b)在至少一种植物激素存在下，培养步骤a)中所提供的叶片或者细胞，以便生成去分化细胞，和
c)回收在步骤b)结束时获得的去分化细胞。
步骤a)中，“叶片”包括整个叶片和叶子碎片。在步骤a)中，源于叶片的细胞可以通过本领域技术人员熟知的任何技术手段得到。
优选地，叶片或者源于叶片的细胞以无菌的方式提供(未受任何生物污染)。
在方法的步骤b)中，在合适的培养基中培养叶片或者源于叶片的细胞，所述培养基包括至少一种植物激素。在某些实施方式中，所述培养基包括多种植物激素，例如两种或者三种植物激素。
优选地，培养基包括至少一种激素，完全优选地至少一种植物激素。植物激素特别包括生长素、细胞分裂素和赤霉素。
特别适合于本发明的生长素大体上有IAA(吲哚-3-乙酸)、IBA(吲哚丁酸)、苯乙酸以及NAA(萘乙酸)。优选地，2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)不被包含在适合于本发明的生长素中，因为它不是天然化合物。
参与细胞伸长的、特别适合于本发明的细胞分裂素，最重要的是激动素(N-(呋喃-2-基甲基)-7H-嘌呤-6-胺，CAS编号525-79-1)，玉米素(2-甲基-4-(7H-嘌呤-6-基氨基)丁-2-烯基-1-醇，CAS编号1637-39-4)以及苄基腺嘌呤(N-苯基-7H-嘌呤-6-胺，CAS编号1214-39-7)。
赤霉素形成植物的激素或植物激素的集合，其包含超过100种左右的化合物，这些化合物通过它们的次序编号GA1、GA2、.../...GA126被列出。从结构来看，各种赤霉素彼此非常接近。特别适合于本发明的赤霉素基本上来自根，并且包括大量的衍生物，其中最重要的是赤霉酸(也叫做赤霉素A3)，以及赤霉素A1和赤霉素A12。
在所述方法的步骤b)中，植物激素优选地选自吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸、苯乙酸、萘乙酸、激动素、玉米素、苄基腺嘌呤、赤霉酸以及赤霉素A1、赤霉素A3和赤霉素A12。在步骤b)中，植物激素的组合，例如萘乙酸与激动素的组合，可以被使用。
根据一个实施方式，适合于获得本发明的去分化植物细胞的培养基至少包括：NH4NO3、KNO3、CaCl2·2H2O、MgSO4、KH2PO4、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、Na2MoO4·2H2O、CuSO4·5H2O、FeSO4·7H2O、肌醇、尼克酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、和蔗糖；以及可选的KI、激动素、Na2EDTA·2H2O和/或萘乙酸。
根据另一个实施方式，适合于获得本发明的去分化植物细胞的培养基至少包括：NH4NO3、KNO3、CaCl2·2H2O、MgSO4、KH2PO4、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、KI、Na2MoO4·2H2O、CuSO4·5H2O、Na2EDTA·2H2O、FeSO4·7H2O、肌醇、尼克酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、萘乙酸、激动素和蔗糖。
有利地，培养基可以包括NH4NO31200mg/l至2000mg/l、KNO31500mg/l至2100mg/l、CaCl2·2H2O300mg/l至500mg/l、MgSO4150mg/l至200mg/l、KH2PO4153mg/l至187mg/l、MnSO4·4H2O10mg/l至30mg/l、ZnSO4·7H2O5mg/l至10mg/l、KI 0至0.91mg/l、Na2MoO4·2H2O0至0.30mg/l、CuSO4·5H2O 0.01mg/l至0.05mg/l、Na2EDTA·2H2O 10.5mg/l至50mg/l、FeSO4·7H2O 10mg/l至30mg/l、肌醇70mg/l至150mg/l、尼克酸0.3mg/l至0.6mg/l、吡哆醇0.4mg/l至0.6mg/l、硫胺素0.08mg/l至0.15mg/l、萘乙酸0至11mg/l、激动素0至0.066mg/l、和蔗糖10g/l至35g/l。
有利地，在温度范围为24℃至30℃，优选为26℃至27℃下实施步骤b)所述的培养。
有利地，在氧气分压约占10％的气氛中实施步骤b)所述的培养。
所述方法优选地分批进行6-10天。
可以根据补料分批发酵或者连续发酵技术实施所述方法。
在合适的介质中培养后，例如通过过滤，在步骤c)中收获本发明的去分化植物细胞，且本发明的去分化植物细胞可以被冻干或者经历提取工艺。
根据一个特定的实施方式，培养步骤b)实施时间为6天至14天，优选为6天至10天。
本发明也涉及兰蔻蔷薇丛的去分化细胞，尤其是兰蔻delboip蔷薇丛的那些去分化细胞，所述去分化细胞借助于本说明书详述的、包括实施例的方法得到。
发明人已经示出，根据本发明的方法可以获取兰蔻蔷薇丛去分化细胞的细胞系，所述细胞系中的细胞可以以去分化细胞的形式被培养很长一段时间、甚至无限期地培养，而它们的形态未发生可检测到的改变，它们的性能未发生可检测到的改变，尤其是它们的皮肤再生性能未发生可检测到的改变。
根据本发明，兰蔻蔷薇丛去分化细胞的细胞系尤其具有如下特征：
–稀有的分离细胞(<5％)的尺寸不超出直径10μm到30μm之间，
–非常主要的细胞聚集体具有50μm和300μm之间的直径，
–该细胞具有球状的形貌，颜色呈白色，
–同其他蔷薇丛细胞系相比，所述培养物包含非常小的细胞碎片，并且这些聚集体是相当均匀的且具有约一百微米的平均直径，
–兰蔻蔷薇丛去分化细胞培养物不表现出任何特殊的气味。
本发明也涉及被申请人分离的、根据布达佩斯条约在2012年7月4日，以编号2-6307保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)[德国微生物菌种保藏中心]的细胞系。
有利地，根据本发明，新鲜的或者冻干的去分化植物细胞或者其提取物，或者配制在对其进行稳定的组合物中的去分化细胞或其提取物可以被使用。
所述冻干的去分化植物细胞能够利用水被再提取。去分化植物细胞的冻干处理有利地可以把活性剂与生物聚合物填充物、如细胞壁多糖分离。
在某些实施方式中，去分化细胞被冻干，然后被再悬浮。可以存在于所得到的悬浮液中的细胞碎片被去除，例如，通过穿过注射器，然后离心分离而去除。去除细胞碎片的悬浮液可以被用来作为来源于根据本发明的去分化植物细胞的活性剂。
根据本发明的一个实施方式，去分化植物细胞的提取物可以被使用。从对老化的皮肤和老化的毛发待要获得的效果的角度出发，本发明必然地涉及去分化植物细胞的活性提取物。本发明提取物的活性能够、特别是借助于下文所示的实施例中详细说明的各种实验方案被评估。
本领域技术人员所知的任何提取方法能够被用来制备根据本发明的去分化植物细胞的提取物。
作为适合于本发明的提取物，可提到水提取物、醇的提取物或者使用有机溶剂的提取物。
术语“水溶剂”用于指任何全部或者部分地由水构成的溶剂。因此，可提到水本身、任何比例的水-醇溶剂、或者由水和诸如丙二醇的化合物以任何比例组成的溶剂。在醇的溶剂中，尤其可提到乙醇。
适合于本发明的提取方法，可以包括例如在冷的水溶液中研磨去分化植物细胞的第一步骤、从第一步骤得到的水溶液中去除悬浮颗粒的第二步骤、以及对第二步骤得到的水溶液灭菌的第三步骤。该水溶液相当于提取物。
然后，获得的提取物可以通过任何常规冻干法被冻干。因此，得到粉末，该粉末可以直接使用或者在使用之前混入合适的溶剂中。
本发明的去分化植物细胞也能够以冻干物的形式使用。这种冻干物能够通过本领域技术人员所知的任何一种冻干法得到。
原则上，冻干法在于借助冷冻和真空的结合操作，从液体的、糊状的或者固态的产品中去除水分。在极其低的压力下，当水在固态时被加热时，水升华，也就是，水直接从固态变为气态。水蒸汽(或者其他任何溶剂的蒸汽)离开产品并且通过使用冷凝器或收集器冷冻被捕获。这种技术使得可以保持被处理的产品的体积和外观。它能自然地发生(在山上干燥)或者在冷冻干燥器内迅速地发生。
冻干法通常包括三个步骤：冷冻、升华以及二次干燥。
冷冻在于非常迅速地使物质温度至-20℃和-80℃之间，以便以冰的形式锁定在该情况下原为液态的水；从而避免细胞溶解。
升华在于消除“自由的”水。在约为100微巴的真空度下，向产品提供热量，但是，从一种产品到另一种产品，该真空度可能变化很大；冰经受升华。根据产品以及生产需求，在循环期间温度可以改变。水蒸气被“收集器”或者冷凝器捕获，产品的脱水将持续进行。当大部分水已经升华时，所述产品已经失去了它的水的大约80％至90％。
干燥在于从产品中去除束缚的(captive)水。在这一步骤中，真空度高，高达约5微巴。在这个阶段，所述产品95％干燥。
例如，通过在具有受控孔隙度(大约80μm)的布上过滤而从培养基回收细胞后，在低温、优选地-20℃至-80℃的低温下，在可以避免能够损害细胞的大冰晶的形成的条件下，细胞被冷冻。然后，冻结的细胞在5微巴至500微巴的真空度下、优选为100微巴的真空度下，进行冰升华步骤。
如上所述，本发明的冷冻-干燥的植物细胞在使用前，能够被再水化。
出人意料地，申请人已经示出根据本发明的去分化兰蔻蔷薇丛细胞或者所述细胞的提取物或冻干物对皮肤再生的影响，与那些利用非去分化蔷薇丛细胞或者所述细胞的提取物或冻干物而观察到的影响显著不同。
特别地，申请人已经示出去分化兰蔻蔷薇丛细胞或者所述细胞的提取物或冻干物对皮肤再生的影响，与那些利用非去分化兰蔻蔷薇丛细胞或者所述细胞的提取物或冻干物而观察到的影响不同。
出人意料地，申请人已经示出兰蔻蔷薇丛去分化细胞或者所述细胞的提取物或冻干物，对于人皮肤细胞的基因表达谱具有特别的效果。发明人已经示出：相较于其他品种的蔷薇丛的去分化细胞(或者所述细胞的提取物或冻干物)以及兰蔻蔷薇丛的非去分化细胞(或者所述细胞的提取物或冻干物)诱导的对人皮肤细胞基因表达的效果，兰蔻蔷薇丛去分化细胞或者所述细胞的提取物或冻干物，对于人皮肤细胞的基因表达具有特异的效果。
老化的皮肤和皮肤老化的标志
术语“老化的皮肤”用于指自然老化和/或光致老化导致的皮肤的一般美学病症。
特别地，本发明针对防止和/或减轻和/或处理皮肤老化的标志。
表述“皮肤老化的标志”用于指由于自然来源的老化和/或光致诱导来源的老化而引起的皮肤外观的任何改变。
举例来说明本发明所考虑的这种改变，可提到不是非常均匀的且不太光滑的表面、变薄的和/或在屏障功能方面不太有效(创伤后修复缓慢)的表皮、皱纹和细线、干瘪的皮肤、缺乏弹性和/或紧实性的皮肤、真皮变薄和/或胶原蛋白纤维退化，其导致松弛的外观和起皱的皮肤。
所述的表达也用于指皮肤内部的所有改变，所述皮肤内部的改变不是通过改变的外观而系统地体现的，例如，皮肤所有的内部退化，尤其是受到紫外线辐射后，弹性蛋白纤维或弹性纤维的退化。
特别地，本发明针对的皮肤老化的标志选自皮肤变薄、紧致度损失、弹性损失、密度损失或者皮肤紧实性损失、皮肤干燥、皮肤表观的改变、皮肤的显着微起伏的外观、粗糙的外观、细线和/或皱纹的形成和/或出现、皮肤肤色光泽的改变、皮肤干瘪的表观、皮肤气味的改变、皮肤松垂、或皮肤干枯。
优选地，本发明针对的皮肤老化的标志选自皮肤变薄、皮肤的显着的微起伏的外观、细线和/或皱纹的形成和/或出现、皮肤松垂、和皮肤干枯。
更优选地，本发明针对的皮肤老化的标志选自皮肤的明显的微起伏的外观、细线和/或皱纹的形成和/或出现、皮肤松垂、和皮肤干枯。
毛发抗老化
随着年龄出现的毛发质量的改变，尤其是包括纤维外观(薄的、无生机的、软弱的没有支持力的毛发)的改变，其中，没有光泽、和/或变灰、易断，而且毛发密度降低。
因此，本发明针对恢复/维持良好的毛发密度，和/或提高满头毛发和/或毛发纤维的质量，尤其是老化的毛发。更特别地，本发明的去分化植物细胞或者所述细胞的提取物或冻干物，使得防止毛发密度降低以及保护、加强或者提高老化毛发的质量以使毛发呈现年轻且稠密的外观成为可能。
根据一个实施方式，本发明的去分化植物细胞或者所述细胞的提取物或冻干物，尤其适用于防止和/或限制稀疏的、无生气的、易断的、软弱的、无保持力的、没有光泽、和/或变灰的毛发的形成。
根据另一个实施方式，本发明的去分化植物细胞或者所述细胞的提取物或冻干物，也适用于提高角蛋白纤维质量，尤其是通过促进有光泽的和/或浓密的和/或有活力的毛发的生长。
根据另一个实施方式，本发明的去分化植物细胞或者所述细胞的提取物或冻干物，对于防止和/或处理发梢分叉、提高消费者感知的柔软度、提高纤维的活力、提高满头毛发的体积和光泽是有用处的。
根据另一个实施方式，本发明的去分化植物细胞或者所述细胞的提取物或冻干物，适用于防止和/或治疗毛发纤维的部分缺失或全部缺失，尤其是毛发的缺失。优选地，本发明适用于防止和/或治疗脱发。
更具体地，脱发通过个体局部的或者整体的毛发缺失来反映。遭受脱发症的个体，可以是，尤其是弥漫性脱发受害者，如雄激素源性脱发或者脂溢性脱发或者由雄激素(雄性荷尔蒙)过剩导致的普通的脱发。在这种类型的脱发中，应当注意到，主要在男性中，即，在构成头部的顶部(头顶)区域中，有时毛发的生产周期过早停止，这种现象在头部的四周区域、尤其是颈背部未观测到。
根据另一个实施方式，去分化植物细胞或者所述细胞的提取物或冻干物，尤其适用于防止和/或治疗毛发变白，更适宜白发症。
白发症对应于毛发的自然变白，随着年龄或氧化应激出现。更特别地，白发症与特定的逐渐增加的毛发黑色素细胞不足有关，对毛球黑色素细胞和黑色素细胞前体细胞都有影响。
有利地，本发明可以防止、限制和/或降低毛发和/或体毛的变白或变灰。特别地，去分化植物细胞或者所述细胞的提取物或冻干物，对于防止、限制和/或终止白发症的发展和/或进程是有用处的。
去分化植物细胞或者所述细胞的提取物或冻干物，也能被用于防止和/或限制和/或减缓整个头部毛发中白发数量的增加，和/或降低或维持白发相对于毛发总数的百分比。
根据一个特定的实施方式，本发明也针对维持毛发的天然色素。
盖仑制剂
本发明的去分化植物细胞或者所述细胞的提取物或冻干物，可以配制成适用于美容或者药物用途的任何组合物。
根据本发明的组合物包含生理学上或药学上可接受的介质。
在合适的介质中培养后，本发明的去分化植物细胞通过过滤收集，并可以被冻干或者被提取或者被放置在溶液中。
有利地，本发明的去分化植物细胞或者所述细胞的提取物或冻干物，可以以溶液形式配制或放置于水中或水溶性有机溶剂中或者其混合物中。
适用于本发明的水溶性有机溶剂可选自C2至C8、优选C3至C6的包含2至6个羟基、优选3至5个羟基的基于烃的化合物及其混合物。
在适用于本发明的水溶性有机溶剂中，可尤其提到包含2至8个碳原子的二醇，诸如乙二醇、丙二醇或者1,3-丙二醇、1,3-丁二醇、二丙二醇、甘油、山梨醇、及其混合物。优选地，尤为适用于本发明的是丙二醇或者1,3-丙二醇。
按重量计，水溶性有机溶剂可占包含其的组合物的20％至100％，优选为30％至90％，优选为40％至80％，更优选地占包含其的组合物的50％至70％。
适用于本发明的水可以是泉水和/或矿泉水，尤其选自Vittel水、来自于维希盆地(Vichy basin)和拉罗什理肤泉(la Roche Posay)的水。
按重量计，水可占包含其的组合物的20％至100％、优选30％至90％、优选40％至80％，更优选地占包含其的组合物的50％至70％。有利地，按重量计，水占包含其的组合物的高达50％。
根据一个实施方式，包含本发明的去分化植物细胞或者所述细胞的提取物或冻干物的制剂可以至少包括一种亲水性胶凝剂。这种试剂可以避免或者降低细胞的沉降分离。
适用于本发明的亲水性胶凝剂可选自多糖聚合物及其混合物。
出于本发明的目的，术语“多糖聚合物”用于指由大量基本糖类(如木糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、甘露糖、海藻糖以及阿拉伯糖)和其各自的酸连接形成的任何碳水化合物分子。优选地，根据本发明的多糖聚合物选自分子量范围为10kDa至250kDa的聚合物。作为适用于本发明的多糖聚合物，可尤其提到果胶、瓜尔豆胶、纤维素、糊精、麦芽糖糊精、淀粉、塔拉胶、刺槐豆胶、菊粉、金合欢树胶、阿拉伯树胶、富海藻糖聚合物(如岩藻聚糖(Fucogel))、角叉菜胶、魔芋胶、黄原胶、右旋糖酐、壳聚糖、黄蓍胶、印度树胶、刺梧桐胶、塔马林胶(tamarin gum)、琼脂、藻酸盐、结冷胶、及其混合物。优选地使用黄原胶、刺槐豆胶、瓜尔豆胶、结冷胶、琼脂、藻酸盐、及其混合物。
根据一个优选的实施方式，包含本发明的去分化植物细胞或者所述细胞的提取物或冻干物的制剂可以包括黄原胶。
相对于组合物的总重量，按多糖聚合物的重量计，胶凝剂可以以0.01％至10％、优选地0.1％至5％的比例存在。
根据另一个实施方式，包含本发明的去分化植物细胞或者所述细胞的提取物或冻干物的制剂可以包含至少一种糖。
适用于本发明的糖可以为C4至C6的单糖，尤其可选自肌醇、甘露糖醇、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖、木糖醇和果糖、及其混合物。
在本发明的组合物中，相对于组合物的总重量，糖的含量以重量计范围可以为1％至80％，例如，以重量计为5％至75％，尤其以重量计为10％至70％。
根据一个优选的实施方式，本发明的去分化植物细胞或者所述细胞的提取物或冻干物可以在水、1,3-丙二醇和/或黄原胶的存在下配制。
不论用于采用蔷薇属植物的去分化植物细胞或所述细胞的提取物或冻干物的配制如何，它们必须采用有效量。
有效量是从本发明所考虑的指示的观点出发获得所期望的效果所需的量。
当然这种量取决于各种参数，例如所期望的效果，或待被处理的个体的年龄、体重、身高或类型，和施用途径，因此，可以在很大程度上变化。这种量可以通过本领域技术人员所知的任何方法确定。
为了给出数量级，本发明的去分化植物细胞或者所述细胞的提取物或冻干物，相对于包含其的组合物的总重量，按照干物质的重量计，可以以0.01％至30％的量被使用，优选地，相对于所述组合物的总重量，按照干物质的重量计，以0.1％至50％的量被使用。
本发明的蔷薇属植物的去分化植物细胞或者所述细胞的提取物或冻干物，可以配制成任何美容用组合物，特别用于被吞咽的、被注射的或者涂抹在皮肤、毛发、指甲或粘膜(口腔粘膜、面颊粘膜、生殖器粘膜、齿龈粘膜、眼结膜粘膜)上。根据所的选择施用模式，本发明的组合物可以以通常使用的任何形式的剂型。
为了皮肤的局部施用，组合物可以为：尤其水溶液或油溶液的形式或者洗液或精华素类型的分散液形式；牛奶类型的液体或半液体稠度的乳液形式，通过将油相分散在水相中(O/W)或者将水相分散在油相中(W/O)获得；或者悬浮液或柔软粘稠的乳液形式；或者含水的凝胶或无水的凝胶或霜形式；或者微囊或微粒形式；或者离子和/或非离子型的囊状(vesicular)分散液形式。这些组合物按照通常方法制备。
这些组合物可以构成用于面部、手、脚、主要的解剖学褶皱处、或身体的清洁的、防护的、治疗的或护理的霜剂(例如，日霜、晚霜、卸妆膏、粉底霜或防晒霜)；粉底液；卸妆乳；防护或护理身体乳；防晒乳；护肤用洗液；凝胶或泡沫剂，例如，清洁洗液、防晒洗液、人工晒黑洗液、洗浴用组合物、包含抗菌剂的除臭用组合物，须后水凝胶或洗液、或者脱毛霜。这些组合物也可以包括构成肥皂或清洁棒或被包装成具有加压推进剂的气溶胶组合物的固体制剂。
意在应用于毛发的组合物可以为：水溶液、醇溶液、或水-醇溶液的形式；或者为霜、凝胶、乳剂或摩斯的形式；或者为也包含加压推进剂的气溶胶组合物的形式。这种组合物可以为护发组合物的形式，例如洗发水、毛发定型洗液、处理洗液、定型凝胶或膏、染色(尤其是氧化型染色)组合物、着色洗发水、重构乳液、烫发组合物(尤其是用于烫发的第一步骤的组合物)、抗脱发凝胶或洗液。
对于皮下或皮内施用，组合物可以是水性或油性洗液的形式，或精华素的形式。
适用于吞咽的组合物可以为胶囊、颗粒、糖浆、或片剂的形式。
根据本发明的组合物的各种成分的量是在考虑中的领域的那些惯常使用的量。
当组合物为乳剂时，相对于组合物的总重量，脂肪相的比例按重量计在5％至80％、优选地5％至50％的范围内。在乳剂形式的组合物中使用的油、蜡、乳化剂以及助乳化剂从化妆品领域惯常使用的那些产品中选择。相对于组合物的总重量，乳化剂和助乳化剂按重量计可以0.3％至30％、优选地0.5％至20％范围内的比例存在于组合物中。
当组合物为油溶液或者凝胶时，油相可占组合物总重量的超过90％。
在已知的方式中，本发明的美容组合物也包含在化妆品领域中常见的助剂，如亲水性胶凝剂或亲脂性胶凝剂、亲水性添加剂或亲脂性添加剂、防腐剂、抗氧化剂、溶剂、芳香剂、填充剂、遮蔽剂、除味剂和着色剂。这些不同助剂的用量是那些在化妆品领域中惯常使用的量，例如，为组合物总重量的0.01％至10％。根据它们的性质，这些试剂可以被引入到油相、水相、和/或脂质小球中。
作为可以被用于本发明的油或蜡，可提到矿物油(液体凡士林)、植物油(液体乳木果部分、葵花油)、动物油(全氢鲨烯)、合成油(鸭子尾脂腺油)、硅油或者蜡(环甲硅油)和氟油(全氟聚醚)、蜂蜡、棕榈蜡或者石蜡。脂肪醇和脂肪酸(硬脂酸)可以被加入这些油中。
作为可以被用于本发明的乳化剂，可提到如硬脂酸甘油酯、聚山梨醇酯60、以及PEG-6/PEG-32/硬脂酸乙二醇酯的混合物，所述混合物由Gattefosse公司以名称TefoseR63出售。
作为可以被用于本发明的溶剂，可提到低级醇，尤其是乙醇和异丙醇，以及丙二醇。
作为可以被用于本发明的亲水性胶凝剂，可提到聚羧乙烯(卡波姆)、丙烯酸共聚物(如丙烯酸酯/烷基丙烯酸酯共聚物)、聚丙烯酰胺、多糖(如羟丙基纤维素)、天然树胶(优选黄原胶)，以及粘土；作为亲脂性胶凝剂，可提到改性粘土(如膨润土)、脂肪酸的金属盐(例如硬脂酸铝)、和疏水性二氧化硅、乙基纤维素和聚乙烯。
美容方法
根据其另一个方面，本发明涉及用于护理老化皮肤或老化毛发的美容方法，包括将作为活性剂的蔷薇属植物的至少一种去分化植物细胞或所述细胞的提取物或冻干物施用至有需要的个体的至少一个步骤。根据用于使用本发明的通常技术，尤其可通过施用如上限定的美容组合物来实施这种方法。
根据一个实施方式，本发明涉及用于治疗和/或防止有需要的个体的老化皮肤或老化毛发的组织更新有缺陷之后的美学缺陷的美容方法，该美容方法包括将作为活性剂的蔷薇属植物的至少一种去分化植物细胞或所述细胞的提取物或冻干物施用至所述个体上的至少一个步骤。
根据本发明的方法可以包括在于观察老化皮肤或老化毛发的组织更新缺陷后的美学缺陷的减少或甚至消失的步骤。
有利地，本发明的方法的实施，可以加强、改善或者甚至修复皮肤和/或整头毛发的年轻外观。
根据本发明的美容方法可以被实施，尤其是通过口服或局部施用，优选局部施用上述定义的美容组合物。
根据本发明的方法可以每天实施，例如，按照每天一次、或者一天两次，如早晚各一次的频率实施。
根据本发明的美容方法可以例如根据组合物的形式，以合适的用量和次数通过日常施用组合物来实施，例如，该组合物可配制成凝胶、洗液、霜剂、泡沫剂、凝胶胶囊、糖衣片剂、乳剂、片剂、胶囊或口服液的形式。
本发明的活性剂的有效量可以每天单剂量施用或者一天分剂量施用，例如，一天两到三次。
根据本发明的方法可以有利地包括单次施用。
根据本发明的美容方法，可以在一周到数周、甚至数月的时间段内被实施，在没有治疗的时间间隔后，可重复该时间段，持续几个月或者甚至几年。
举例来说，根据本发明的活性剂可以，例如每天2至3次，甚至更多次重复施用，并且通常经过一个至少4周、或者甚至4至15周的延续期，在适当情况下，经历一个或多个中断期。
附图说明
图1：表示在缺乏兰蔻蔷薇丛去分化细胞(对照)或者含有兰蔻蔷薇丛去分化细胞(浓度为0.43mg/ml或0.043mg/ml)的情况下处理10天且培养13天(上图)或者20天(下图)后，具有低再生潜能的重建皮肤的模型的截面相片。
图2：表示具有低再生潜能的重建皮肤的模型的培养基中所确定的角质形成细胞生长因子(KGF)的数量，该重建皮肤在缺乏兰蔻蔷薇丛去分化细胞或者在含有兰蔻蔷薇丛去分化细胞(0.43mg/ml)的情况下被处理。对D3、D5、D7、D10、D13、D17和D23进行了分析。浅灰色柱状图：对照。深灰色柱状图：兰蔻蔷薇丛去分化细胞浓度0.43mg/ml。白色柱状图：兰蔻蔷薇丛去分化细胞浓度0.0043mg/ml。
图3：表示未被处理(对照)或在蔷薇丛去分化植物细胞(浓度为0.43mg/ml)或者视黄醇(浓度为10μM)存在下处理的具有低再生潜能的重建皮肤的模型的截面照片。
在附图和下面的实施例中，除非特别说明，否则所述百分比为重量百分比，以“在…和…之间”写法的数值范围包括指定的下限和上限。在形成前，各成分按照顺序和本领域技术人员易于确定的条件被混合。
下文的实施例被作为本发明的领域的非限制性的说明。
具体实施方式
实施例
实施例1
使用植物组织培养蔷薇丛(兰蔻蔷薇)去分化植物细胞
蔷薇丛(兰蔻蔷薇)的叶片通过本领域技术人员的常规技术手段净化处理，然后放置在下述培养基上：
大量营养物 mg/l
NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub> 1650
KNO<sub>3</sub> 1900
CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O(CX41) 440
MgSO<sub>4</sub> 180.8
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 170
微量营养物 mg/l
MnSO<sub>4</sub>·4H<sub>2</sub>O 22.3
ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 8.6
KI 0.83
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O 0.25
CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O 0.025
Na<sub>2</sub>EDTA·2H<sub>2</sub>O 37.3
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 27.8
维生素 mg/l
肌醇 100
尼克酸 0.5
盐酸吡哆醇(B<sub>6</sub>) 0.5
盐酸硫胺素(B<sub>1</sub>) 0.1
激素 mg/l
萘乙酸 10
激动素 0.06
碳源 mg/l
蔗糖 30000
所用激素为天然地存在于植物中的激素。
在连续继代培养后，得到去分化植物细胞，所述去分化植物细胞可以在发酵罐中培养，并因此工业化。用于控制生物反应器中培养的参数如下：
T°：24℃至30℃，理想地26℃-27℃
通气：pO210％，通过注入无菌空气和/或鼓风控制，但应避免对细胞产生剪切应力。
分批发酵法持续6至14天。通过在孔隙度80μm的滤布上过滤收集细胞。
在相对于组合物总重量、按新鲜生物质重量计比例为10％的1,3-丙二醇和黄原胶的存在下，在水中配制获得的兰蔻蔷薇丛去分化植物细胞。
实施例2
说明兰蔻蔷薇丛去分化植物细胞对具有低再生潜能的重建皮肤的模型的“促再生”的效果
a-制备具有低再生潜能的重建皮肤的模型
从人体皮肤样本中分离角质形成细胞。
用解剖刀除去皮下组织后，皮肤样本被切割成片，然后在DMEM培养基(生命技术公司，苏格兰)中通过抗菌-抗真菌处理净化去污。
为了使得真皮与表皮分离，样本随后于4℃进行蛋白水解处理(中性蛋白酶II)/胰蛋白酶0.25％)，过夜。与真皮组织分离的表皮碎片，在37℃被放置在1x胰蛋白酶-EDTA溶液中，持续20分钟。通过加入含有10％的胎牛血清(FCS)的培养基中和胰蛋白酶的效果。细胞悬液被均质，然后以角质形成细胞培养基(角质形成细胞生长培养基，KGM)(KGM BulletKit，BioWhittaker，Clonetics Corp.，圣地亚哥，加州，美国)洗涤。然后，将细胞悬液放置在预先“涂覆”有胶原蛋白I型(Sigma化学制品有限公司，Irvine,UK)的培养瓶中。15分钟后，未附着的角质形成细胞通过以PBS缓冲液洗涤被回收。因此选择的非附着的细胞几乎不存在基底层的干细胞和祖细胞。
这个角质形成细胞亚群以150000至450000个细胞的比例，在培养基(N Fortunel等(2011)，Eur J Dermatol，21(S2)：12-20)，被接种在事先放置于嵌入物中的真皮支架的上部。
所用的栽培基质为失活的去除表皮的人的真皮或者包含胶原晶格内的成纤维细胞的活性真皮(拉伸模型，生产)。然后在每个嵌入物的下部和上部加入培养基，并且这种培养基每两天被更换。于37℃和5％CO2下，在培养箱中放置6-7天后，所述样品上部的培养基被完全移走，所述嵌入物下部的培养基被与下文所述相同的但没有转铁蛋白、三碘甲状腺原氨酸和腺嘌呤的培养基替换。诱导表皮隔室成层和分化所必须的再现阶段开启。37℃且5％CO2，样品被培养1-3周，培养基每两天被更换。
b-使用去分化植物细胞的治疗
实施例1获得的蔷薇去分化细胞被冻干，
然后通过连续地经过注射器被重悬。细胞碎片通过离心被去除。得到的除去细胞碎片的活性剂以0.43mg/ml和0.043mg/ml的比例被使用。当真皮支架接种角质形成细胞时，系统地应用活性剂(在嵌入物下面的培养基中)。活性剂应用在第3、6、8和10天被更新。在第13天和第20天时进行组织学分析：
-表皮的厚度，
-整体组织，
-层理
-基底层的质量，等。
该对照对应于缺乏蔷薇去分化细胞的培养基。
如图1所示，在蔷薇去分化细胞的存在下，观察到表皮增厚。另外，基底层更加稠密，形态学质量被提高，并且活跃层的恰当分化(即成层)和粒层的外貌被观察到。
这些结果证明，在实施蔷薇丛(兰蔻蔷薇)的去分化细胞的处理后，具有低再生潜能的重建皮肤的模型的再生能力得到恢复，并且，可以支持此种用于治疗皮肤的成分的应用。
实施例3
具有低再生潜能的重建皮肤的模型经蔷薇丛去分化植物细胞处理所诱导的角质形成细胞生长因子(KGF)的分泌物的滴定
在实施例2所述的本实验的培养基在第3、5、7、11、13、17和20天被采集。由重建皮肤分泌的以及存在于这些培养基中的KFG可溶的量通过ELISA(酶联免疫吸附法)(R&D系统，目录N°DKG00)被分析。
如图2所示，相比于对照(未被处理)，观察到KGF分泌物的增加，尤其是经蔷薇去分化细胞(0.43mg/ml)处理后的第13天。
所述生长因子是由成纤维细胞所生产，并且因其对角质形成细胞的致有丝分裂的效果而众所周知(Finch等，Science 1989，245：752；Marchese等/J Cell Physiol 1990，144：326)。这个结果显示，蔷薇(兰蔻蔷薇)去分化植物细胞诱导至少部分地由成纤维细胞产生的可扩散因子的分泌，该可扩散因子对表皮再生具有有益效果。因此，在真皮和表皮之间形成促进再生的对话。
实施例4
说明对真皮干细胞在体外的自我更新的有益效果
分离来源于人体活组织检查的真皮干细胞
来源于真皮隔室的干细胞(SKP)具有增殖和自我更新的能力，在FGF2(成纤维细胞生长因子)和EGF(上表皮生长因素)存在下，它们在体外培养时为悬浮的球体的形式。按照出版物Nature Protocols(Biernaskie等，2006)描述的方案，将干细胞与皮肤和毛囊分离。所用的补料培养基包括补充有抗生素(盘尼西林(Lonza)和链霉素(Lonza))、抗真菌剂两性霉素(Invitrogen)、生长因子EGF(BD)和FGF2(BD)、以及血清替代品B27(Invitrogen)的DMEM/F12(Invitrogen)。
所用的SKP来源于皮肤样本，尤其来源于3个不同供者(8岁、10岁、22岁)的包皮。在培养瓶中经过第一次传代培养后，细胞球与胶原酶结合，然后以个体化(individualized)细胞的形式，在50％补料培养基和50％调节培养基(由细胞本身调节)的存在下，放回培养。
在含有或不含蔷薇去分化细胞的情况下评估自我更新的水平
用于评估自我更新的方法与细胞传代期间所用的方法相似。在以每孔3000个细胞(在96-孔板)的比例接种SKP前，首先利用胶原酶离解SKP。在包含如上所述的一半调节培养基和一半如前所述的补料培养基的混合培养基中培养细胞。所述细胞在37℃(21％的O2-5％的CO2)培养，在不含(对照)或含有按照实施例2所述获得的0.43mg/ml的来源于兰蔻蔷薇丛去分化细胞的活性剂的情况下进行处理。培养10天后，计数所形成的球体，以评估处理后的这些细胞的自我更新能力。
结果在下表I中示出。
表I：在第10天，每孔、每种条件、每个活组织检查的球体的平均数(4个孔的平均值)
处理 供体1 供体2 供体3 平均值 SD
+蔷薇去分化细胞 88.67 55.75 183.50 109.31 54.16
- 52.50 33.50 112.25 66.09 33.55
与对照(-处理)相比，在经过来源于蔷薇去分化细胞的活性剂处理(+处理)后真皮干细胞的自我更新显著地提高。
该研究可以得出：利用来源于蔷薇去分化细胞的活性剂处理显著地提高在体外真皮干细胞的自我更新能力。鉴于这些细胞在生物过程(如毛囊再生)、在控制毛干的形状以及在皮肤修复中所起的作用的重要性，该结果强调这种成分作为技术方案用于治疗老化的皮肤和毛发的优势。
实施例5
蔷薇丛去分化细胞与另一参照“抗老化”活性剂对具有低再生潜能的重建皮肤的模型的“促再生”的效果的对比
所述重建皮肤的模型按照实施例2所示制作。按照实施例2所示制备源于蔷薇去分化细胞的活性剂。所述重建皮肤的模型在不含有(对照-只有培养基)或者含有源于蔷薇去分化细胞的活性剂(0.43mg/ml)或者含有视黄醇(10μM)下处理12天。
进行如实施例2所示的组织学观察。
如图3所示，在来源于蔷薇去分化植物细胞的活性剂的存在下，观察到表皮增厚。另外，基底层更加稠密，形态质量被提高，并且观察到恰当的分化(活跃层的成层和粒层外貌)。
另一方面，使用视黄醇的处理并没有提高表皮质量，甚至显示出抑制分化。

Claims (9)

1.来源于兰蔻蔷薇丛的去分化植物细胞或者所述细胞的提取物或冻干物作为用于护理老化的皮肤或老化的毛发的活性剂用于处理和/或防止选自以下的审美缺陷的非治疗性的美容用途：细线、皱纹、毛发变白或变灰，
其中，所述去分化植物细胞从包括萘乙酸和激动素的培养基中获得。
2.一种美容组合物，包含作为活性剂的至少一种来源于兰蔻蔷薇丛的去分化植物细胞或者所述细胞的提取物或冻干物，其中，所述去分化植物细胞从包括萘乙酸和激动素的培养基中获得。
3.根据权利要求2所述的美容组合物，其中，所述去分化植物细胞通过将来源于兰蔻蔷薇丛的细胞放置培养基中培养获得，所述培养基至少包含：NH4NO3、KNO3、CaCl2·2H2O、MgSO4、KH2PO4、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、KI、Na2MoO4·2H2O、CuSO4·5H2O、FeSO4·7H2O、肌醇、尼克酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、和蔗糖。
4.根据权利要求2所述的美容组合物，其中，所述去分化植物细胞或者所述细胞的提取物或冻干物，在水中、或在水溶性有机溶剂中、或在其混合物中配制。
5.根据权利要求2所述的美容组合物，其中，所述去分化植物细胞或者所述细胞的提取物或冻干物，相对于包含它们的所述组合物的总重量，以0.01％至30％的量使用。
6.一种用于护理老化的皮肤或老化的毛发以处理和/或防止审美缺陷的非治疗性的美容方法，包括至少一个将作为活性剂的至少一种来源于兰蔻蔷薇丛的去分化植物细胞或所述细胞的提取物或冻干物施用于有需要的个体的步骤，其中，所述去分化植物细胞从包括萘乙酸和激动素的培养基中获得，
其特征在于，所述审美缺陷选自：细线、皱纹、毛发变白或变灰。
7.一种美容组合物，包含作为活性剂的至少一种蔷薇去分化植物细胞，所述蔷薇去分化植物细胞属于根据布达佩斯条约在2012年7月4日以编号2-6307保藏于德国微生物菌种保藏中心DSMZ的细胞系。
8.一种去分化植物细胞用于制备护理老化的皮肤或老化的毛发以处理和/或防止所述皮肤或所述毛发的组织更新缺陷的组合物的用途，所述去分化植物细胞属于根据布达佩斯条约在2012年7月4日以编号2-6307保藏于德国微生物菌种保藏中心DSMZ的细胞系。
9.来源于兰蔻蔷薇丛的去分化植物细胞或者所述细胞的提取物或冻干物作为用于制备护理老化的皮肤或老化的毛发以处理和/或防止所述皮肤或所述毛发的组织更新缺陷的组合物的活性剂的用途，其中，所述去分化植物细胞从包括萘乙酸和激动素的培养基中获得。
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