HU202279B - Process for producing isopenicillin n-synthetase and dna compounds encoding it - Google Patents

Description

A jelen találmány tárgya izopenicillin N-szintetáz aktivitást kódoló DNS szekvenciát tartalmazó vektorok és gazdasejtek előállítása.

Az izopenicillin N-6zintetáz katalizálja azt a reakciót, amelyben az izopenicillin N képző- 5 dik é-(L-oC-amino-adipil)-L-ciszteinil-D-valinból. Ez a reakció kritikus lépés fontos antibiotikumok bioszintézisében, pl. a penicillinekében Penicillium chrysogenumból, Cephalosporium acremoniumből, és Sreptomyces cla- 10 vuligerusból, vagy pl. a cefalosporinokéban C. acremoniumből, vagy a 7-oC-metoxi-cefalosporinokéban S. clavuligerusból.

Az új DNS szekvenciát, amely az izopenicillin N-szintetáz aktivitást kódolja, Cepha- 15 losporium acremoniumből izoláljuk és rekombináns DNS kifejeződő vektorok megalkotásához használjuk, amelyek előreviszik az aktivitás kifejeződését. Ezeknek a kifejeződő vektoroknak két típusa különösen hasznos. A 20 vektorok első típusa az izopenicillin N-szintetáz magas szintű kifejeződését E. Coli-ban hajtja előre, a másik típus viszont a Cephalosporium acremoniumban viszi előre az aktivitás kifejeződését. 25

Az E. coli által termelt izopenicillin N-szintetáz aktivitást in vitro vizsgálatokban mutatjuk ki, izopenicillin N-t képezve 4-(L-oC-amino-adipil)-L-ciszteinil-D-valinból. A jelen találmány szerinti E. coli vektorokkal 30 transzformált E. coliból származó nyers sejt-extraktumok izopenicillin N-szintetáz aktivitást mutatnak bármiféle előzetes aktiváló kezelés nélkül. A jelen találmány szerinti E. coli vektorok igy hatásos eszközt nyújtanak 35 nagy mennyiségű aktív izopenicillin szintetáz nyerésére. Az izopenicillin N szintetáz nem csupán az izopenicillin N termeléséhez hasznos, hanem a 6-(L-oC-amino-adipil)-L-ciszteinil-D-valintól eltérő tripeptidek kondenzálá- 40 sához is, ilyen módon új antibiotikumokat képezve.

A jelen találmány szerinti Cephalosporium vektorok törzsjavitás céljaira hasznosak.

A Cephalosporium gazdaságilag fontos orga- 45 nizmus, amely penicillin és cefalosporin antibiotikumok termelésében használatos. A Cephalosporium transzformálása bizonyos, jelen találmány szerintí rekombináns DNS kifejeződő vektorokkal nagyobb in vivő izopeni- 50 cillin N-szintetáz szintet eredményez a transzformánsokban, igy megnóvekedett hatékonyság és magasabb kitermelés mutatkozik ezeknek a transzformánsoknak az alkalmazásával végzett fermentációknál. 55

Az izopenicillin N-szintetázt kódoló DNS-vegyületeket könnyen lehet módosítani, olyan kifejeződő vektorokat alkotva meg, amelyek növelik más organizmusokkal, pl. Penicillium chrysogenummal és Streptomyces 60 clavuligerussal végzett fermentációk hatékonyságát és kitermelését. Bár a jelen találmány szerinti izopenicillin N-szintetázt kódoló DNS-t Cephalosporium acremoniumből izoláltuk, a jelen DNS-vegyületeket lehet hasz- 65 nálni olyan vektorok megalkotására, amelyek az izopenicillin N-szintetáz aktivitás kifejeződését gazdasejtek széles választékában viszik előre, ilyenek pl. a jelen találmányban is bemutatott E. coli vektorok. Minden organizmus, amely termel penicillint és cefalosporint, a közös 4-(L-ct-amino-adipil)-L-cÍ6zteinil-D-valin és izopenicillin N prekurzorokat alkalmazza. Ennek megfelelően a jelen találmány szerinti izopenicillin N-szintetázt kódoló DNS-anyagot lehet alkalmazni olyan vektorok előállítására, amelyek bármely nemzetséghez tartozó penicillin- és cefalosporin antibiotikum-termelő organizmust érintő fermentáció hatékonyságának és kitermelésének javításához használhatók.

A jelen találmány szerinti DNS-anyagok Cephalosporium acremonium genom DNS-éből származnak, és jelentős homológját mutatnak a Streptomyces clavuligerusban, Penicillium chrysogenumban és más, izopenicillin N-szintetázt termelő organizmusokban levő izopenicillin N-szintetázt kódoló DNS-anyagok nukleotid-szekvenciájához. E miatt a homológia miatt a jelen találmány szerinti, izopenicillin N-szintetázt kódoló DNS-anyagokat jelezni lehet és az olyan organizmusok genom könyvtárának átvizsgálására alkalmazni, amelyek izopenicillin N-t vagy hasonló vegyűleteket alakítanak ki izopenicillin N-szintetáz típusú enzimek jelenlétében. Több organizmus tartalmaz olyan DNS-t, amely olyan izopenicillin N-szintetáz aktivitást kódol, amely a jelen találmány szerinti DNS anyag által kódolt aktivitással lényegében egyenértékű, és a jelen találmány magában foglalja ezeket az ekvivalens DNS anyagokat is.

A jelen találmány szerinti, izopenicillin N-szintetázt kódoló DNS anyagok Cephalosporium acremonium genom DNS-böl származnak, és az átíró és transzlációs aktiváló szekvenciával egyesülve vannak izolálva, amely szekvenciák a C. acremonium izopenicillin N-szintetázt kódoló genom DNS kifejeződését szabályozzák. A jelen találmány magában foglalja azt az új átíró és transzlációs aktiváló szekvenciát is, amelyet, amint ezt itt ismertetjük, heterológ gének kifejeződésének végrehajtásához alkalmazunk C. acremoniumban.

A következő részben a jelen találmány részletesebb leírását nyújtjuk. A jelen találmány világosabb megértése céljából a következő kifejezéseket határozzuk meg, amelyeket ez után a leírásban és igénypontokban gyakran használunk.

- Antibiotikum - mikroorganizmus által termelt anyag, amely, vagy természetes formájában, vagy bizonyos kémiai módosítások után, gátolja más mikroorganizmusok vagy eukarióta sejtek növekedését, vagy elpusztítja azokat.

- Antibiotikum bioszintetikus gén DNS-szegmens, amely olyan enzimes aktivitást kódol, amely valamely enzimes reakcióhoz

HU 202279 Β szükséges, primer metabolitok antibiotikummá való átalakításának folyamatában.

Antibiotikum-termelő organizmus bármilyen organizmus, pl. Streptomyces, Bacillus, Monospora, Cephalosporium, Podospora, Penicillium és Nocardia (de nem csak ezekre korlátozva), amely vagy antibiotikumot termel, vagy olyan géneket tartalmaz, amelyek ha kifejeződnek, valamilyen antibiotikumot termelhetnek.

- Antibiotikum rezisztencia-adó gén DNS-szegmens, amely olyan aktivitást kódol, amely egy antibiotikumra való rezisztenciát ad.

- ApR - az ampicillin rezisztenciát adó gén.

- Kétfunkciós klónozó .ingázó* vektor rekombináns DNS klónozó vektor, amely replikálódhat és/vagy integrálódhat két különböző rendszertani osztályba tartozó organizmusban.

- Ceph DNS - Cephalosporium acremoniumból származó DNS.

- Ceph őri ·- Cephalosporium acremonium mitokondriális DNS, amely egy rekombináns DNS vektor extrakromoszomális fenntartásáról gondoskodik.

- Klónozás - DNS egy szegmense beépítésének folyamata rekombináns DNS klónozó vektorba.

- cos - Λ-fág kohéziv vég szekvenciák.

- Kozmid - rekombináns DNS klónozó vektor, amely képes azonos módon replikálódni egy gazdasejtben, mint egy plazmid, de amely képes beburkolódni fágok fejrészébe is.

- Funkcionális polipeptid - kinyerhető, bioaktiv, teljesen heterológ vagy homológ polipeptid vagy prekurzor; kinyerhető, biológiailag aktív polipeptid, amely egy heterológ polipeptidet és egy homológ polipeptid egy részét vagy egészét tartalmazza, vagy egy kinyerhető, biológiailag aktív fúziós polipeptid, amely egy heterológ polipeptidet és egy biológiailag inaktiváló homológ polipeptidet tartalmaz, amelyet fajlagosan lehet hasítani.

- Genom könyvtár - rekombináns DNS klónozó vektorok készlete, amelyekbe DNS szegmenseket - amelyek lényegében egy adott organizmus teljes genomját képviselik - klónozni lehet.

- HmR - a higromicin rezisztenciát adó gén.

- Hibridizálás - két homológ egyszálú DNS molekula összeforrasztásának folyamata kétszálú DNS molekula képzésére, amely lehet teljesen bázis-páros kialakítású, de nem teljesen ilyen is.

- 1PS - izopenicillin N-szintetázt kódoló

DNS.

- IPSp - Cephalosporium acremonium izopenicillin N-szintetáz (IPS, génjének átíró és transzlációs aktiváló szekvenciája.

- IPSt - az IPSg átirás-befejezó és mRNS poliadenilezö és műveleti szignáljai.

- Izopenicillin N-szintetáz - cikláz néven is ismert enzim, amely katalizálja az izopenicillin N képződését é-(L-oC-amino-adipil)-L-ciszteinil-D-valinból.

- KmR - a kanamicin rezisztenciát adó gén.

- mel - a tirozináz gén.

- mRNS - hírvivő (messenger) ribonukleinsav.

- PGK - a Saccharomyces cerevisiae foszfoglicerát kinéz gén átíró és transzlációs, aktiváló szekvenciája.

- Rekombináns DNS klónozó vektor bármilyen autonóm módon replikálódó vagy integrálódó ágens, beleértve (de nem csak erre korlátozva) a plazmidokat, amely egy DNS molekulát tartalmaz, amelybe egy vagy több további DNS molekula lehet vagy van beépítve.

- Rekombináns DNS kifejeződő vektor bármilyen autonóm módon replikálódó vagy integrálódó ágens, beleértve (de nem csak erre korlátozva) a plazmidokat, amely egy átíró és transzlációs aktiváló szekvenciát tartalmaz, amely úgy helyezkedik el, hogy előrevigye egy olyan DNS szegmensnek a kifejeződését, amely egy polipeptidet kódol, vagy egy kutatási vagy kereskedelmi fontosságú RNS kifejeződését.

- Rekombináns' DNS vektor - bármilyen rekombináns DNS kódoló vagy kifejeződő vektor.

- Restrikciós fragmens - egy vagy több enzim hatása alatt keletkezett bármilyen lineáris DNS molekula.

- rRNS - riboszomélis ribonukleinsav.

- Érzékeny gazdasejt - gazdasejt, amely nem képes nőni egy adott antibiotikum jelenlétében egy olyan DNS-szegmens nélkül, amely rezisztenciát ad erre.

- Tcr - a tetraciklin rezisztenciát adó gén.

- Átírás aktiváló szekvencia - DNS szekvencia, amely elősegíti a DNS-átírást.

- Transzfektáns - befogadó gazdasejt, amely fág DNS által végzett transzformációnak volt alávetve.

- Transzformáns - befogadó gazdasejt, amely transzformációnak volt alávetve.

- Transzformálás - DNS bevezetése befogadó gazdasejtbe, amely megváltoztatja a genotípust és igy változást eredményez a befogadó sejtben.

- Transzláció aktiváló szekvencia - DNS szekvencia, amely - amikor átiródik mRNS-sé - elősegíti az mRNS transzlációját fehérjévé.

- trp - E. coli triptofán operonjának átírás- és transzláció aktiváló szekvenciája.

Az alábbiakban röviden bemutatjuk a mellékelt ábrákat.

Az 1-7. ábrákban bemutatott restrikciós hely- és műveleti térképek az itt tárgyalt rekombináns DNS vektorok hozzávetőleges képviselői. A restrikciós helyek térközei a térképen arányosak a restrikciós helyek

HU 202279 Β tényleges térközeivel a vektoron, de a megfigyelt restrikciós hely távolságok valamelyest eltérhetnek a számított térkép-távolságoktól. A restrikciós hely információk nem teljesek, ennélfogva lehet több adott típusú restrikciós hely is a vektoron, mint amelyet a térképen ténylegesen bemutatunk.

1.	ábra.	A pIT335 piazmid restrikciós és működési térképe.	hely-
2.	ábra.	A pCZ106 piazmid restrikciós hely- és működési térképe.
3.	ábra.	A pIT337 piazmid restrikciós és működési térképe.	hely-
4.	ábra.	A pIT221 piazmid restrikciós és működési térképe.	hely-
5.	ábra.	A pPS20 piazmid restrikciós és működési térképe.	hely-
6.	ábra.	A pPS19 piazmid restrikciós és működési térképe.	hely-
7.	ábra.	A pPS21 piazmid restrikciós és működési térképe.	hely-
8.	ábra.	A pPS21A piazmid restrikciós hely- és működési térképe.
9.	ábra.	A pPS25 piazmid restrikciós és működési térképe.	hely-
10.	. ábra.	A pPS28 piazmid restrikciós és működési térképe.	hely-
11,	. óbra.	A pPS29 piazmid restrikciós és működési térképe.	hely-
12.	, ábra.	A pPS26 piazmid restrikciós és működési térképe.	hely-
13,	. óbra.	A pPS34 piazmid restrikciós és működési térképe.	hely-

14. óbra. A pIT336 piazmid restrikciós helyés működési térképe.

15. ábra. A pPS35 piazmid restrikciós helyes működési térképe.

16. óbra. A pPS27 piazmid restrikciós helyes működési térképe.

17. ábra. A pPS37 piazmid restrikciós helyes működési térképe.

A jelen találmány DNS-anyagokkal, vala10 mint rekombináns DNS klónozó és kifejeződő vektorokkal foglalkozik, amelyek izopenicillin N-szintetáz aktivitást kódolnak. Egy ilyen szóban forgó DNS szekvenciát, amely izopenicillin N-szintetáz aktivitást kódol, mutatunk be az alábbiakban. Az ábrázolásban a kettős szálú DNS-nek csak az .értelmes', vagy kódoló szálát mutatjuk be, és a DNS-t balról jobbra ábrázoljuk az 5' -* 3’ orientációban. A nukleotid szekvenciát számozzuk; a számok a DNS szekvencia fölött láthatók. A DNS szekvencia mindegyik vonala alatt közvetlenül az izopenicillin N-szintetáz aminosav gyök szekvenciája van felsorolva balról jobbra az amino-terminális -* karboxi-termi25 nális irányban. Minden aminosav-gyök fel van tüntetve az alatt a DNS alatt, amely kódolja azt. Az aminosav-gyök szekvencia is számozva van, a számok az aminosav-gyök szekvencia alatt láthatók.

Az izopenicillin N-szintetáz aktivitást kódoló DNS szekvencia és az ennek megfelelő aminosa v-szek vencia

5’-	ATG GGT	TCC GTT	CCA GTT CCA GTG GCC AAC GTC CCC CGA ATC GAT GTC
MET	GLY	SER	VAL	PRO VAL PRO VAL 5	ALA	ASN VAL PRO ARG ILE ASP VAL
10	15
50				60	70		80	90
TCG	CCC	CTA	TTC	GGC	GAT GAC AAG GAG	AAG	AAG CTC	GAG GTA GCT CGC
SER	PRO	LEU	PHE	GLY	ASP ASP LYS GLU	LYS	LYS LEU	GLU VAL ALA ARG
			20		25			30
	100			110 120		130	140
GCC	ATC	GAC	GCC	GCA	TCG CGC GAC ALA	GGC	TTC TTT	TAC GCG GTG AAC
ALA	ILE	ASP	ALA	ALA	SER ARG ASP THR	GLY	PHE PHE	TYR ALA VAL ASN
		35			40			45
	150			160 170		180 190
CAC	GGT	GTC	GAC	CTG	CCG TGG CTC TCG	CGC	GAG ACG	AAC AAA TTC CAC
HIS	GLY	VAL	ASP	LEU	PRO TRP LEU SER	ARG	GLU THR	ASN LYS PEH HIS
	50				55		60
		200			210	220		230 240
ATG	AGC	ATC	ACG	GAC	GAG GAG AAG TGG	CAG	CTC GCC	ATC CGG GCC TAC
MET	SER	ILE	THR	ASP	GLU GLU LYS TRP	GLN	LEU ALA	ILE ARG ALA TYR
65					70		75	80

HU 202279 Β

250 260 270 280

AAC AAG GAG CAC GAG TCC CAG ATC CGG GCG GGC TAC TAC CTG CCG ATC ASN LYS GLU HIS GLU SER GLN ILE ARG ALA GLY TYR TYR LEU PRO ILE

90 95

290 300 310 320 330

CCG GGC AAG AAG GCG GTC GAA TCG TTC TGC TAC CTG AAC CCC TCC TTC

PRO GLY LYS LYS ALA VAL GLU SER PHE CYS TYR LEU ASN PRO SER PHE

100 105 110

340 350 360 370 380

AGC CCA GAC SER PRO ASP 115	CAC CCG CGA	ATC AAG GAG CCC ACC CCT ATG CAC GAG GTC
HIS PRO	ARG	ILE LYS GLU 120	PRO THR PRO MET HIS GLU VAL 125
390		400	410	420 430
AAC GTC TGG	CCG GAC	GAG	GCG AAG CAC	CCG GGG TTC CGG GCC TTC GCC
ASN VAL TRP	PRO ASN	GLU	ALA LYS HIS	PRO GLY PHE ARG ALA PHE ALA
130			135	140
440		450		460 470 480
GAG AAG TAC	TAC TGG	GAC	GTC TTC GGC	CTC TCC TCC GCG GTG CTG CGC
GLU LYS TYR	TYR TRP	ASP	VAL PHE GLY	LEU SER SER ALA VAL LEU ARG
145		150		155 160
	490		500	510 520
GGC TAC GCT	CTC GCC	CTA	GGT CGC GAC	GAG GAC TTC TTC ACC CGC CAC
GLY TYR ALA	LEU ALA	LEU	GLY ARG ASP	GLU ASP PHE PHE THR ARG HIS
	165			170 175
530	540		550	560 570
TCC CGC CGT	GAC ACG	ACG	CTC TCG TCG	GTC GTG CTC ATC CGT TAC CCG
SER ARG ARG	ASP THR	THR	LEU SER SER	VAL VAL LEU ILE ARG TYR PRO
	180		185	190
580	590		600	610 620
TAC CTC GAC	CCG TAC	CCG	GAG CCG GCC	ATC AAG ACG GCC GAC GAC GGC
TYR LEU ASP	PRO TYR	PRO	GLU PRO ALA	ILE LYS THR ALA ASP ASP GLY
195			200	205
630		640	650 660 670
ACC AAG CTC	AGC TTC	GAG	TGG CAC GAG	GAC GTG TCC CTC ATC ACG GTG
THR LYS LEU	SER PHE	GLU	TRP HIS GLU	ASP VAL SER LEU ILE THR VAL
210			215	220
680	690	700 710 720
TTG TAC CAG	TCC GAC	GTG	CAG AAT CTG	CAG GTC AAG ACC CCG CAG GGC
LEU TYR GLN	SER ASP	VAL	GLN ASN LEU	GLN VAL LYS THR PRO GLN GLY
225		230		235 240
	730		740	750 760
TGG CAG GAC	ATC CAG	GCT	GAC GAC ACG	GGC TTC CTC ATC AAC TGC GGC
TRP GLN ASP	ILE GLN	ALA	ASP ASP THR	GLY PHE LEU ILE ASN CYS GLY
	245			250 255
770	780		790	800 810
AGC TAC ATG	GCC CAT	ATC	ACC GAC GAC	TAC TAC CCG GCC CCG ATC CAC
SER TYR MET	ALA HIS	ILE THR ASP ASP '	TYR TYR PRO ALA PRO ILE HIS
	260		265	270
820	830		840	850 860
CGC GTC AAA	TGG GTC	AAC	GAG GAG CGC	CAG TCA CTG CCC TTC TTC GRC
ARG VAL LYS	TRP VAL	ASN	GLU GLU ARG	GLN SER LEU PRO PHE PHE VAL
275			280	285

HU 202279 Β

870 880 890 900 910

AAC CTG GGC TGG GAG GAC ACC ATC CAG CCG TGG GAC CCC GCG ACC GCC ASN LEU GLY TRP GLU ASP THR ILE GLN PRO TRP ASP PRO ALA THR ALA

290 295 300

920 930 940 950 960

AAG GAT GGG GCC AAG GAT GCC GCC AAG GAC AAG CCG GCC ATC TCC TAC LYS ASP GLY ALA LYS ASP ALA ALA LYS ASP LYS PRO ALA ILE SER TYR 305 310 315 320

970 980 990 1000

GGA GAG TAT CTG CAG GGG GGA CTG CGG GGC TTG ATC AAC AAG AAT GGT GLY GLU TYR LEU GLN GLY GLY LEU ARG GLY LEU ILE ASN LYS ASN GLY

325 330 335

1010

CAG ACC TAA-3’

GLN THR ahol A jelentése dezoxi-adenil, G jelentése dezoxi-guanil- C jelentése dezoxi-citidil és T jelentése timidil-csoport, mig AlA jelentése alanin-gyök, ARG jelentése arginin-gyök, ASN jelentése aszpar ágin-gyök, ASP jelentése aszparaginsav-gyök, CYS jelentése cisztein-gyök, GLN jelentése glutamin-gyök, GLU jelentése glutaminsav-gyök, GLY jelentése glicin-gyök, HIS jelentése hisztidin-gyök, ILE jelentése izoleucin-győk, LEU jelentése leucin-gyök, LYS jelentése lizin-gyök, MET jelentése metionin-gyök, PHE jelentése metionin-gyök, PHE jelentése fenil-alanin-gyök, PRO jelentése prolin-gyök, SER jelentése szerin-gyök, THR jelentése treonin-gyök, TRP jelentése triptofén-győk, TYR jelentése tirozin-gyök és VAL jelentése valin-gyök.

A fentebb bemutatott DNS szekvencia ^63%-ban G-t és C-t tartalmaz, és az izopenicillin N-szintetáz polipeptidet kódolja, 38,476 dalton számított molekulatömeggel és mintegy 40000 dalton ászlelt molekulatömeggel.

Azok, akik a szakterületen jártasak, felismerik, hogy a fentebb ábrázolt DNS szekvencia a jelen találmány fontos része. A fenti szekvenciát hagyományos módon lehet szintetizálni a módosított foszfotriészter módszerrel, teljesen védett dezoxiribonukleotid építőelemeket alkalmazva. Az ilyen szintetikus módszerek jól ismertek a szakterületen és lényegében a következő irodalmi helyeken leirt módszerekkel összhangban lehet elvégezni: Itakura és munkatársai: Science, 198, 1056 (1977); és Crea és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 5765 (1978). Ezeken kivül egy különösen előnyös módszer található a következő irodalmi helyeken: Hsiung és munkatársai: Nucleic Acid Research 11, 3227 (1983); és Narang és munkatársai: Methods in Enzymology 68, 90 (1980). A fentebb referált kézi módszereken kivül a DNS szekvenciát lehet szintetizálni automatizált DNS szintetizátorokat, pl. Systec 1450A- vagy ABS 380A DNS szintetizátorokat alkalmazva.

A genetikai köd degenerált természetének következtében, amely azt eredményezi, hogy több, mint egy kodon kódolja a legtöbb aminosav-gyököt és stop-szignált, az izopeni25 cillin N-szintetáz fentebb ábrázolt aminosav-gyök szekvenciáját különböző DNS szekvenciák sokasága kódolhatja. Mivel ezek a váltakozó DNS szekvenciák ugyanazt a jelen találmány szerinti aminosav-gyök szekvenciát kó39 dolhatják, a jelen találmány magában foglalja ezeket a váltakozó szekvenciákat is.

Ezenkívül a jelen találmány szerinti izopenicillin N-szintetázt kódoló DNS-nek lehetnek genetikai variánsai is. Ezek a genetikai variánsok lényegében DNS és aminosav gyök szekvencia-homológiát mutatnak a jelen találmány szerinti vegyületekkel, és mutathatnak hasonló, vagy akár azonos aktivitást, de valamelyest mégis eltérnek a tényleges, jelen

4° találmány szerinti vegyületektől. Ezek a genetikai variánsok ekvivalensek a jelen találmány szerinti vegyületekkel.

A jelen találmány ezerinti, izopenicillin N-szintetáz aktivitást kódoló DNS vegyülete45 két egy Cephaiosporium acremonium törzsből izoláljuk, amelyet általában Brotzu törzsként ismernek, és amely rendelkezésre áll az American Type Culture Collectionnál (ATCC, Rockville, Maryland), ATCC 11550 letéti szá5θ mon. A C. acremonium törzs teljes genom DNS-ének genom könyvtárát megalkotjuk, és a genom könyvtárat szekvencia-homológia jelenlétére átvizsgáljuk 64 különböző dezoxiribooligonukleotidból álló készlethez. A 64 kü55 lönbözó dezoxiribonukleinsav készletét azzal az információval összhangban alakítjuk ki, amelyet a C. acremonium izopenicillin N-szintetáz amino-termináiis aminosav-szekvenciájából és a genetikai kód ismeretéből nyertünk, θ® a genom könyvtár vektorjainak azéles választékát úgy azonosítjuk, hogy homológ-e a 64 különböző dezoxiribooligonukleotid egyikéhez vagy közülük többhöz. A DNS szekvencia-elemzés feltárja, melyik vektorok kódol55 ják a C. acremonium izopenicillin N-szintetázt. „

-611

HU 202279 Β

Miután azokat a vektorokat, amelyek az izopenicillin N-szintetázt kódolják, azonosítottuk, egy adott izopenicillin N-szintetázt kódoló vektort módosítunk olyan módon, hogy kiiktatjuk a vektoron jelen levő Cephalosporium acremonium DNS legtöbbjét, azokat, amelyek nem kódolnak izopenicillin N-szintetáz enzimet. Az igy létrejött vektort, amelyet pIT335 plazmidnak nevezünk el, E. coli K 12 JA221 gazdasejtekbe transzformáljuk. Az igy létrejött E. coli K 12 JA221/pIT335 transzfermánsokat deponáltuk, így e2ek részévé váltak a Northern Régiónál Research Laboratories (Peoria, Illinois) törzstenyészet-gyűjteményének, NRRL B-15960 letéti számon. A pIT335 restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül az 1. ábrában mutatjuk be.

A pIT335 plazmidot E. coli K 12 JA221-ből izolálhatjuk, az 1. példában leirt eljárással. A pIT335 plazmidot használjuk kiindulási anyagként a pIT337-nek nevezett plazmid megalkotásában, amely plazmid ösztönzi az izopenicillin N-szintetáz magasszintü kifejeződését E. coliban. A pIT337 plazmidot úgy alkotjuk meg, hogy a pIT335 plazmid ~ 1,5 kb-s Ncol-Baniil restrikciós fragmensét ligáljuk a pCZ106 plazmid ~ 8,7 kb-s Ncol-Ncol és - 1,6 kb-s NcoI-őaniHI restrikciós fragmenseihez.

A pCZ106 plazmid tartalmaz egy .elszabadult' replikont, a trp átíró és transzlációs aktiváló szekvenciát és operátort, és egy szarvasmarha növekedési hormon származékát kódoló DNS szekvenciát. A pCZ106 plazmidon levő .elszabadult* replikon tipus alkalmazását a 4 487 835, 4 499 189 és 4 495 787 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban írják le, ez a plazmid ezekbe bele van foglalva. Alacsony hőmérsékleten, kb. 25 °C-on .elszabadult’ replikont tartalmazó plazmid - 10-15 kópiaszámmal rendelkezik E. coli gazdasejtben, de amikor a hőmérséklet kb. 37 °C-ra emelkedik, a kópiaszám mintegy 1000 köpia/E. coli gazdasejtre emelkedik. E. coli K 12 RV308/pCZ106 gazdasejtek, amelyekből a pCZ106 plazmidot lehet izolálni, letétbe vannak helyezve és a Northern, Régiónál Research Laboratories (Peoria, Illinois) törzstenyészet gyűjteményének részét képezik, NRRL B-15959 letéti szóm alatt. A pCZ106 plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül a 2. ábra mutatja be.

A pIT337 plazmid magában foglalja a pCZ106 plazmid .elszabadult' replikonját és trp átíró- és transzlációs aktiváló szekvenciáját, valamint a pIT335 plazmidból az izopenicillin N-ezintetáz fehérje-kódoló szekvenciát. A pIT335 plazmid ~ 1,5 kb-s Ncol-Banül restrikciós fragmense magában foglalja az izopenicillin N-szintetázhoz való teljes fehérje-kódoló szekvenciát, és az Nco! restrikciós enzim felismerő szekvenciát, amely

5'-CCATGG-3' inni

3’-GGTACC-5' és tartalmazza az

5’-ATG-3’

III

3-TAC-5’ szekvenciát, amely az izopenicillin N-szintetáz amino-terminális metionil-győkét kódolja. A pIT337 plazmid olyan módon van megalkotva, hogy a trp átíró és transzlációs aktiváló szekvencia úgy helyezkedjen el, hogy elősegítse az izopenicillin N-szintetázt kódoló DNS kifejeződését. A pIT337 plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül a 3. ábra mutatja be. A 2. példa írja le részletesebben a pIT337 plazmid megalkotását.

°C hőmérsékleten az E. coli K 12 RV308 (NRRL B-15624) sejtjei, amelyek pIT337 plazmidot foglalnak magukban, magas szinten fejeznek ki izopenicillin N-szintetázt, amely megközelíti a teljes sejtfehérje mintegy 9%-át. Az ezekből az E. coli K 12 RV308/pIT337 transzformánsokból nyert nyers sejtextraktumok képesek katalizálni ó-(L-oC-amino-adipil)-L-ciszteinil-D-valin átalakulását izopenicillin N-né, mig a nem transzformált E. Coli K 12 RV 308 sejtekből nyert sejt-extraktumok nem képesek katalizálni ezt az átalakulást. Az átalakulási reakcióhoz tartozó vizsgálat módszereit és a vizsgálat eredményeit a 3. példában adjuk meg.

A pIT337 plazmid hatékony módszert nyújt nagy mennyiségű izopenicillin N-szintetáz termelésére E. coli-ban. Mivel a pIT337 plazmid E. coli transzformánsai az összes sejtfehérje 9%-át megközelítő szinten fejeznek ki izopenicillin N-szintetázt, és mivel az E. coli tenyésztése kevésbé komplex feladat, mint azoké az organizmusoké, amelyek természetes úton termelnek izopenicillin N-szintetázt, az E. coli/pIT337 transzformánsokat használhatjuk, hogy rekombináns izopenicillin N-szintetázt termeljünk sokkal hatékonyabban és gazdaságosabban, mint a nem-rekombináns vagy .természetes izopenicillin N-szintetáz termelők.

Az izopenicillin N-szintetázt arra használhatjuk, hogy izopenicillin N-t termeljünk ó- (L-oC-amino-adipil)-L-ciszteinil-D-valinból sejtmentes rendszerben, amint ezt a 3. példában leírjuk. Az izopenicillin N nem csupán hasznos antibiotikum, hanem kiindulási anyag is olyan fontos antibiotikumokhoz, mint a penicillin N, cefalexin, és más cefalosporinok (lásd a 4 307 192 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leirás). Az izopenicillin N-szintetáznak talán legfontosabb alkalmazási területe az enzim alkalmazása ó-(L-oC-amino-adipil)-L-ciszteinil-D-valintól eltérő tripeptidek kondenzálása új β-laktám származékká.

-713

HU 202279 Β

Penicillin-termelő organizmusok sejtmentes extraktumait lehet használni nem természetes (vagyis a természetben nem termelődő) β-laktámok szintetizálására. A jelen találmány szerinti E. coli kifejeződő vektorok olcsó és hatékony módszert nyújtanak izopenicillin N-szintetáz nyerésére, amelyet azután in vitro lehet alkalmazni olyan tripeptidek kondenzálására, amelyek a természetben nem fordulnak elő, hogy új antibiotikumokat vagy antibiotikum alapszerkezeteket képezhessenek.

A nem természetes tripeptidek kutatását, amelyek szubsztrátumként szolgálhatnak az izopenicillin N-szintetázhoz, ki lehet egészíteni mutáns izopenicillin N-szintetázok kutatásával, amelyek elfogadják a nem természetes tripeptideket, mint szubsztrátumokat. A jelen találmány adja a kiindulási anyagokat egy ilyen kutatáshoz mutáns izopenicillin N-szintetázok számára. Az E. coli a legjobb gazdaszervezet mutációs klónozási kísérletekhez, és a jelen találmány szerinti E. coli kifejeződő vektorokat könnyen lehet mutációnak alávetni a szakterületen jól ismert eljárásokkal, így pl. besugárzásos kezeléssel (röntgen- vagy UV-sugárzás), vagy kémiai mutagénekkel (mint etil-metánszulfonát, nitrozoguanidin, vagy metil-metánszulfonát), vagy hely-specifikus mutagenezissel, hogy mutáns enzimeket nyerjünk, amelyek szubsztrátumként ismernek fel nem természetes tripeptideket, és katalizálják ezeknek a nem természetes tripeptideknek a kondenzálását nem természetes β-laktámokká.

A jelen találmány nem korlátozódik kizárólag azokra a vektorokra, amelyeket itt példaként felhozunk. A jelen találmány valójában magában foglalja mindazokat a DNS vegyületeket, amelyek izopenicillin N-szintetáz aktivitást kódolnak. A jelen találmány szerinti DNS vegyületeket lehet alkalmazni olyan kifejeződő vektorok megalkotására, amelyek elősegítik az izopenicillin N-szintetáz kifejeződését, bármilyen gazdasejtben, amelyben a kifejeződő vektor replikálódik vagy integrálódik, és amelyben izopenicillin N-szintetáz aktivitás kifejezésére használt átíró- és transzlációs aktiváló szekvencia működik.

Ezért, bár az itt példaként felhozott E. coli kifejeződő vektorok egy E. coli-ban funkcionális .elszabadult* replikont hasznosítanak, a jelen találmány magában foglal mindenféle E. coli kifejeződő plazmidot vagy vektort, amely elóreviszi az izopenicillin szintetáz kifejeződését E. coli-ban. igy a jelen találmány magában foglalja azokat a kifejeződő vektorokat, amelyek elősegítik az izopenicillin N-szintetáz kifejeződését és egy E. coli-ban funkcionális replikont hasznosítanak, ilyenek pl. a pBR322, pACYC184, F, ColV-K94, Rl, R6-5 vagy R100 plazmidokból származó replikonok. A jelen találmány nem korlátozódik csupán plazmid vektorokra sem, a jelen találmány magában foglal olyan kifejeződő vektorokat is, amelyek izopenicillin N-szintetáz aktivitást fejeznek ki és integrálódást vagy virális replikációt hasznosítanak, hogy a replikációt és a fenntartást szolgáltassák a gazdasejtben.

A jelen találmány nem korlátozódik egy bizonyos átíró és transzlációs aktiváló szekvenciára, amely elősegíti az izopenicillin N-szintetáz aktivitást kódoló DNS kifejeződését. A jelen találmány magában foglalja bármilyen átíró és transzlációs aktiváló szekvencia alkalmazását, amely E. coli-ban funkcionál, és arra használható, hogy izopenicillin N-szintetázt fejezzen ki E. coliban. Több, E. coliban működő átíró és transzlációs aktiváló szekvencia ismeretes és alkalmas izopenicillin N-szintetáz aktivitás kifejeződésének elősegítésére E. coli-ban. Az ilyen átíró és transzlációs aktiváló szekvenciák lehetnek (bár nem korlátozódnak csak ezekre) az lpp, lac, trp, tac, aPl és aPR átíró és transzlációs aktiváló szekvenciák.

Az itt példaként felhozott különböző E. coli átíró és transzlációs aktiváló szekvenciákon túl más organizmusokból származó átíró és transzlációs aktiváló szekvenciákat is lehet ligálni a jelen izopenicillin N-szintetázt kódoló DNS anyagokhoz, hogy olyan kifejeződő vektorokat képezzünk, amelyek elősegítik az izopenicillin N-szintetáz aktivitást a gazdasejtekben, amelyekben az aktiváló szekvencia működik. Bár az E. coli a gazdaszervezet, amely a legjobban illik az izopenicillin N-szintetáz termeléshez és az ezt követő tisztításhoz in vitro használatra, olyan vektorok is használhatók, amelyek az izopenicillin N-szintetáz aktivitást E. colitól eltérő gazdaszervezetben segítik elő, különösen az adott organizmus β-laktám antibiotikum-termelő képességének és hatékonyságának növelése céljából.

Nagyon sokféle organizmus termel β-laktám antibiotikumokat. Az itt következő táblázat a β-laktám antibiotikum-termelő organizmusok nem mindenre kiterjedő listáját nyújtja.

-815

HU 202279 Β I. TÁBLÁZAT β-laktám antibiotikum-termelő organizmusok

Organizmus Antibiotikum

Agrobacterium

Cephalosporium acremonium Chromobacterium Gluconobacter Nocardia lactomadurans uniformis

Penicillium chrysogenum

Serratia

Streptomyces antibioticus argentealus cattleya cinnamonensis clavuligerus fimbriatus flavovirens flavus fulvoviridis griseus halstedi heteromorphus hygroscopicus lipraanii olivaceus panayensis pluracidomyceticus rochei sioyaensis sp.OA-6129 sp.KC-6643 tokunomensis viridochromogenes wadayamensis különböző β-laktámok penicillinek és cefalosporinok különböző β-laktámok különböző β-laktámok cefamicin C nokardícin különböző penicillinek és más β-laktámok különböző β-laktámok klavulánsav asparenomicin A, MM 4550 és MM 13902 tienamicin, SF 1623 és cefamicin A és B cefamicin A és B

PA-32413-I, cefamicin C, A16886A, penicillinek, cefalosporinok, klavulánsav, és más klavámok cefamicin A és B

MM 4550 és MM 13902

MM 4550 és MM 13902

MM 4550 és MM 13902 cefamicin A és B, karpetimicin A és B cefamicin A és B IC2081X és defamicin A és B dezocetoxi-cefalosporin C cefamicin, penicillin N, 7-metoxi-cefalosporin C,

A16884, MM4550, MM13902 epitienamicin F, MM4550 és MM13902

C2081X és cefamicin A és B pluracidomicin A cefamicin A és B

MM4550 és MM13902

OA-6129A karpetimicin A aszparenomicin A és B cefamicin A és B WS-3442-D

Az előbb felsorolt β-laktám antibiotikum-termelö organizmusok közül sokat alkalmaznak a gyógyszeriparban antibiotikum termelés céljaira. Ezeknek az organizmusoknak az antibiotikum-termelő képességét lehet növelni és sokkal hatékonyabbá tenni az antibiotikum bioszintetizáló enzimek sejten belüli koncentrációjának növelésével a fermentáció során. A jelen találmány szerinti, izopenicillin N-szintetáz aktivitást kódoló DNS anyagokat lehet alkalmazni kifejező vektorok megalkotására, amelyek, amikor a megfelelő gazdasejtbe transzformáljuk, növelik a transzformált gazdasejt izopenicillin N-szintetáz aktivitásának sejten belüli koncentrációját, ezáltal növelik a sejt antibiotikum-termelő képességét és hatékonyságát, feltéve, ha a gazdasejt a β-laktám antibiotikumot izopenicillin N-szintetáz aktivitást is magában foglaló intermedier reakción keresztül termeli.

Egy vektor, amely növeli egy adott gazdasejt - amelybe a vektort transzformáljuk 10 izopenicillin N-szintetáz aktivitásának sejten belüli koncentrációját, a következő elemeket igényli: 1.) egy, a jelen találmány szerinti, izopenicillin N-szintetáz aktivitást kódoló DNS anyag; 2.) egy átíró ée transzlációs aktiváló szekvencia, amely nem csupán működik a ' transzformálandó gazdasejtben, hanem a korrekt orientációban és helyzetben van elhelyezve, hogy elősegítse az izopenicillin N-szintetáz aktivitást kódoló DNS kifejeződése sét; és 3.) replikációs vagy integrációs funkciók, amelyek a vektorok fenntartását szolgáltatják a gazdasejtben. Természetesen a fentebb leírt vektorok magukban foglalhatnak antibiotikum-rezisztencia gént vagy bizonyos más elemeket is, amelyek módot nyújtanak azoknak a gazdasejteknek a kiválasztására, amelyek tartalmazzák a vektort, de ilyen szelektálható elemek sem nem szükségesek, sem nem kívánatosak, amikor a vektor a gazdasejt kromoszomális DNS-ébe integráló^GG dik.

-9η

HU 202279 Β

A pPS20 plazmid a jelen találmány ezerinti egyik kifejeződő vektor, amely példáját nyújtja olyan típusú vektoroknak, amelyek az izopenicillin N-szintetáz aktivitás intracelluláris koncentrációjára vannak tervezve egy (j-laktám antibiotikum-termelő gazdasejtben. A pPS20 plazmidot úgy alkotjuk meg, hogy a pIT221 plazmid ~ 2,7 kb-s Hindii! restrikciós fragmensét beiktatjuk a pIT335 plazmid egyedi Hindin restrikciós enzim felismerő helyébe. A pIT221 plazmid ~ 2,7 kb-s Hindii! restrikciós fragmense magában foglalja a Saccharomyces cerevisiae élesztő foszfoglicerát kináz (PGK) gén átíró és transzlációs aktiváló szekvenciáját a korrekt helyzetben és orientációban ligáivá, hogy elősegítse a higromicin rezisztencia-átadö gén kifejeződését. Mivel a pIT221 plazmid - 2,7 kb-s Hindin restrikciós fragmensét be lehet iktatni a Hindlll-ál emésztett pIT335 plazmidba a két orientáció bármelyikébe, a ligálás, amely a pPS20 plazmidot hozza létre, termel egy funkcionálisan ekvivalens izomert is, amelyet pPS20.1-nek nevezünk. A pPS20 plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül az 5. ábrában mutatjuk be; a pPS20 és pPS20.1 plazmidok megalkotását a 4. példában Írjuk le.

A pPS20 és pPS20.1 plazmidok megalkotásában kiindulási anyagként használt pIT221 plazmid a 654,919 bejelentési sorszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésbe van foglalva és ott igénypontok tárgya, az ezzel kapcsolatos ügyvédi feljegyzés száma X-6570, a bejelentés benyújtva 1984. szeptember 27-én. Ez a 654,919 bejelentési sorszámú szabadalmi bejelentés az I-VI. folyamatábrákban és 29-57. oldalakon az 1-6. példákban leirja a pIT221 plazmid megalkotását, ez a bejelentés ebbe a bejelentésbe referenciaként van beépítve. A pIT221 plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül a 4. ábra mutatja.

A pIT221 plazmid - 2,7 kb-s Hindii! restrikciós fragmense magában foglal egy higromicin rezisztenciát adó gént, amely az élesztő PGK átíró és transzlációs aktiváló szekvenciájához van ligáivá a korrekt helyzetben és orientációban a higromicin rezisztencia átadó aktivitás (HmR) kifejeződéséhez. Amint ez a 654,919 bejelentési sorszámú amerikai egyesült államokbeli bejelentésben benne foglaltatik, a PGK-HmR gént lehet használni Cephalosporium acremonium és rokon gazdasejtek transzformálására, a higromicin-rezisztens fenotipus kialakítására.

A pPS20 plazmid magában foglalja a PGK-HmR gént, és a Cephalosporium acremonium/pPS20 transzformánsokat a transzformánsok által kifejezett higromicin rezisztencia-átadó aktivitás alapján lehet kiválasztani. A pPS20 plazmid tartalmazza a jelen találmány szerinti, izopenicillin N-szintetázt kódoló DNS-t is a genom DNS-sel együtt, amely szegélyezi az izopenicillin N-szintetázt kódoló

DNS-t a Cephalosporium acremonium genomban.

Mivel a pPS20 plazmid magában foglalja a genom DNS-ből azt a csaknem 3 kb-t, amely az izopenicillin N-szintetázt kódoló DNS-töl .felfelé' helyezkedik el a Cephalosporium acremonium genomban, a pPS20 plazmid szükségszerűen magában foglalja az izopenicillin N-szintetázt kódoló DNS átíró és transzlációs aktiváló szekvenciáját. A legtöbb átíró és transzlációs aktiváló szekvencia az aktiválandó DNS-tól .felfelé' kódolódik, bár néhány riboszomális RNS-kódoló DNS szekvenciát olyan átíró aktiváló szekvenciák aktiválnak, amelyek nem a kódoló területtől .felfelé' helyezkednek el. A .felfelé' olyan kifejezés, amelyet a molekuláris biológia szakterületén alkalmaznak, és a jelen szövegösszefüggésben azt jelenti, hogy a DNS az 5’ irányban van izopenicillin N-szintetázt kódoló DNS kódoló szálának 5’ végétől.

A pPS20 plazmidon kódolt Cephalosporium acremonium átíró és transzlációs aktiváló szekvencia korrektül helyezkedik el, hogy elősegítse az izopenicillin N-szintetáz aktivitást kódoló DNS kifejeződését, mivel a pPS20 plazmid megalkotásában nincsenek átíró és transzlációs aktiváló szekvenciára ható deléciók vagy beiktatások bevezetve az izopenicillin N-szintetáz aktivitást kódoló szál 5’ végét szegélyező DNS-be. A pPS20 plazmidot használjuk ezért a Cephalosporium acremonium és rokon gazdasejtek antibiotikum-termelő képességének és hatékonyságának növelésére, amely gazdasejtekben a C. acremonium átíró- és transzlációs aktiváló szekvencia működik. Ez a megnövekedett antibiotikum-termelö képesség és hatékonyság az izopenicillin N-szintetáz aktivitás megnövekedett szintjének tulajdonítható a transzformánsban, ez pedig az izopenicillin N-szintetáz aktivitást kódoló DNS további, kifejezett kópiái jelenlétének tulajdonítható. A pPS20 plazmid tartalmaz higromicin rezisztencia átadó gént is, amely C. acremoniumban működik, és lehetővé teszi a C. acremonium/pPS20 transzformánsok kiválasztását.

Miután a Cephalosporium acremonium/pPS20 transzformánsokat kiválasztottuk, nincs szükség fenntartani a kiválasztás kényszerét jelentő higromicin B jelenlétét a transzformánsok nővesztő tápközegében. Nincs szükség a szelekció kényszerének fenntartására azért, mert a C. acremonium/pPS20 transzformánsok nagyon stabilak. Ez a stabilitás, úgy véljük, a C. acremoniumot kromoszomális integráció útján transzformáló pPS20 plazmidból ered. A jelen találmány azonban nem korlátozódik azokra a plazmidokra, amelyek C. acremoniumban segítik eló az izopenicillin N-szintetáz aktivitás kifejeződését és kromoszomális integrálás útján transzformálnak. C. acremoniumhoz extrakronioszomális replikáló kifejeződő vektorok könnyen alkothatok a 4 492 758 lajstromszá11

-1019

HU 202279 Β ιηύ amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás kitanitása szerint. A 4 492 758 lajstromszáinú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás mitokondriális DNS szegmenseket ír le, amelyeket be lehet iktatni valamely vektorba, pl. pPS20 plazmidba, hogy a vektor extrák romoszómális replikációhoz szükséges funkciókat szolgáltassa C. acremoniumban.

Amint fentebb leírtuk, a pPS20, és a pIT335, amely egyike azoknak a plazmidoknak amely a pPS20 plazmidból származik, tartalmaznak egy Cephalosporium acremonium átíró és transzlációs aktiváló szekvenciát. Mivel a pIT335 és pPS20 plazmidokon elhelyezkedő C. acremonium átíró és transzlációs aktiváló szekvenciát lehet alkalmazni DNS szekvenciák széles választéka kifejeződésének elősegítésére, az aktiváló szekvencia jelentős részét képezi a jelen találmánynak. Bár a C. acremonium átíró és transzlációs aktiváló szekvenciára vonatkozó szekvenciális adatok korlátozottak, az aktiváló szerkezetről tudjuk, hogy a pIT335 és pPS20 plazmidokon levő, izopenicillin N aktivitást kódoló DNS-től közvetlenül .felfelé’ és azzal szomszédosán elhelyezkedő ~ 500 bp-s SaR-Ncol restrikciós fragmensen kódolódik. Bármilyen restrikciós fragmens, amely tartalmazza a fentebb említett ~ 500 bp-s SaR-Ncol restrikciós fragmenst, szükségszerűen tartalmazza a C. acre5 monium átíró és transzlációs aktiváló szekvenciát.

A pIT335 plazmidon kódolt Cephalosporium acremonium átíró- és transzlációs aktiváló szekvenciára vonatkozó adatok az alábbiak.

Az alábbi szekvencia az a DNS szekvencia, amely .felfelé’ van a pIT335 plazmidon jelen levő izopenicillin N-szintetáz aktivitást kódoló DNS-től. Az ~ 500 bp-s SaR-Ncol restrikciós fragmens szekvenciájának, amely az ak15 tiváló szekvenciát tartalmazza, csupán egy részlete ismert, amely ki is tűnik a szekvenciában ábrázolt .XXXXXXXXXX' területből. Abból a célból, hogy tovább tisztázzuk, hogy az aktiváló szekvencia hogyan orientálódik a pIT335 plazmidban, a restrikciós fragmenst csupán egyszálú DNS átfedésekkel ábrázoljuk, amely a SaR és Ncol restrikciós hasításokra jellemző.

A Cephalosporium acremonium részleges

DNS szekvenciája. A pIT335 plazmidon kódolt átíró és transzlációs aktiváló szekvencia

380 bp -¼

S’-TCGAC XXXXXXXXXX CGAATACTTG AATATTCCTT GGTCGCTCTT ι ii hí 11 ii immiii minim ιιπιιιιιι

3’-G XXXXXXXXXX GCTTATGAAC TTATAAGGAA CCAGCGAGAA

CTGATTTTCG AGGCTTCTCC TTCCGCCATC GTCGCCTCAC llllllllll llllllllll lllllimi ll I III I rn

GACTAAAAGC TCCGAAGAGG AAGGCGGTAG CAGCGGAGTG

GCATATCTCG TCTTTCACAT CTTACACCAG CAGGACAAAC

I III III il ί ΗI Ilin II llllllllll llllllllll

CGTATAGAGC AGAAAGTGTA GAATGTGGTC GTCCTGTTTG

CGTCAC-3’

Ilin

GCAGTGGTAC-5’

T az izopenicillin N-szintetáz kódoló terület kezdete. .TAC ’ komplementer az 5’-ATG-3’-vel, amely az izopenicillin N-szintetáz amino-terminálisán levő metionil gyököt kódolja.

A Cephalosporium acremonium átíró és transzlációs aktiváló szekvenciáját lehet alkalmazni, hogy elősegítse bármilyen DNS szekvencia kifejeződését, amint ezt a pPS21 plazmid illusztrálja. A pPS21 plazmid a pIT221 plazmid származéka, amely úgy jön létre, hogy a higromicin rezisztencia átadó gén kifejeződésének elősegítésére alkalmazott PGK átíró és transzlációs aktiváló szekvenciát helyettesítjük a jelen találmány szerinti Cephalosporium acremonium átíró és transzlációs aktiváló szekvenciával. A helyettesítést 12 úgy hajtjuk végre, hogy először eltávolítjuk

5o a pIT221 plazmid ~ 300 pb-s Xmal fragmensét, a pPS19 plazmidot képezve. Ezt a Xmal deléciót azért hajtjuk végre, hogy eltávolitsunk egy BamHI restrikciós enzim felismerő helyet, amely zavaróan hatna a pPS21 megal55 kötésára. A pPS19 plazmidot azután BamHI-vel emésztjük és E. coli DNS polimeráz I Klenow-fragmenssel kezeljük. A BamHI emésztés kimetsz egy ~ 230 bp-s BamHI restrikciós fragmenst, amely tartalmazza a PGK átíró és transzlációs aktiváló szekvenciát; a Klenow-kezelés kétszálúvá teszi a DNS-t az egyszálú BamHI átfedéseken kivül. A pPS19 plazmid nagy, - 7,7 kb-ε Bandii fragmensét azután ligáljuk a pIT335 plazmid ~ 0,8 kb-ε, Klenow55 -kezelt, Ncol restrikciós fragmenséhez, amely

-1121

HU 202279 Β tartalmazza a C. acremonium átíró és transzlációs aktiváló szekvenciáját.

Természetes, hogy a Klenow-kezelt Ncőí restrikciós fragmens a két orientáció bármelyikébe iktatódik be, amelyek közül csupán az egyik éri el a kívánt eredményt - a Cephalosporium acremonium átíró és transzlációs aktiváló szekvencia korrekt elhelyezkedése olyan, amely elősegíti a higromicin rezisztencia átadó gén kifejeződését. A pPS21 plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül a 7. ábra adja meg, és a pPS19 plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül a

6. ábra adja meg. A pPS21 plazmid megalkotásának részletesebb leírását az 5. példában adjuk meg.

A pPS21A egy másik, találmány szerinti vektor, amely hasznosítja az IPS gén átíró és transzlációs aktiváló szekvenciáját, hogy elősegítse a higromicin rezisztencia-átadó gén kifejeződését Cephalosporium acremoniumban. Egy hasznos köztes plazmidot, amelyet pPS23 plazmidnak jelölünk, alkalmazunk a pPS21A plazmid megalkotásában. A pPS23 plazmidot úgy alkotjuk meg, hogy izoláljuk a pIT335 plazmid - 850 bp-s Ncol restrikciós fragmensét, amely az IPS gén aktiváló szekvenciáját tartalmazza, hozzátapasztunk BamHI-el és Ncol-el Összeférhető, egyszálú átfedésekkel rendelkező kapcsolókat (linkereket, a ~ 850 bp-s Ncőí fragmenshez, és az így létrejött pIT335 plazmid-eredetü, ~ 860 bp-s BamHI restrikciós fragmenst ligáljuk BamHI-vel emésztett pUC8 plazmidhoz. Ez a ligálás két plazmidot eredményez, amelyet pPS23-nak, illetve pPS23.1-nek nevezünk, amelyek csupán a beiktatott BamHI restrikciós fragmens orientációja tekintetében különböznek egymástól. A pUC8 plazmid a Pharmacia P-L Biochemicals-nál (BOO Centennial Ave., Piscataway, New Jersey, 08854, Amerikai Egyesült Államok, rendelkezésére áll.

A pPS23 plazmidot BamHI restrikciós enzimmel emésztjük, és a ~ 860 bp-s BamHI restrikciós fragmenst, amely tartalmazza az IPS átíró és transzlációs aktiváló szekvenciát, izoláljuk és ligáljuk BamHI-el emésztett pPS19 plazmiddal. Ez a ligálás egy sor hasznos plazmidot alakít ki, beleértve a pPS21A plazmidot. A pPS21A a pPS23 plazmid - 0,86 kb-s BamHI restrikciós fragmensének a pPS19 plazmid ~ 7,7 kb-s BamHI restrikciós fragmenséhez való ligálásának eredménye, és tartalmazza a megfelelő orientációban elhelyezve az IPS gén átíró és transzlációs aktiváló szekvenciáját, amely elősegíti a higromicin rezisztencia átadó gén kifejeződését. A pPS23 plazmid megalkotásában alkalmazott linkerek biztosítják, hogy a megfelelő leolvasó keret maradjon fenn a pPS21A plazmidban a higromicin rezisztencia átadó gén kifejeződéséhez. A pPS21A plazmid megalkotását a 7. példa írja le; a pPS21A plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül a 8. ábrában adjuk meg.

Számos más hasznos plazmidot is alkotunk ugyanazzal a ligálással, amely a pPS21A plazmidot alakította ki. A pPS22 plazmid ugyanazokat a szekvenciákat tartalmazza, mint a pPS21A plazmid, de a BamHI restrikciós fragmens, amely az IPS gén aktiváló szekvenciáját tartalmazza, ellenkező irányú orientációban van, mint a pPS21A plazmidban. Következésképpen a pPS22 plazmid nem ad ét higromicin rezisztenciát Cephalosporium acremoniumnak nagy gyakorisággal, így a pPS22 plazmid használható negatív kontrollként szolgál a C. acremonium transzformációkban.

Ebben a ligálásban termelt másik plazmid hasznosítást nyerhet mind negatív kontrollként Cephalosporium acremonium transzformációkban, mind olyan plazmidként, amelyet olyan C. acremonium szekvenciák azonosítására lehet használni, amelyek rendelkeznek átíró és transzlációs aktiváló aktivitással. Amint fentebb leírtuk, a pPS19 plazmid tartalmazza a Saccharomyces cerevisiae T*GK átíró és transzlációs aktiváló szekvenciát a megfelelő orientációban, hogy elősegítse a higromicin rezisztencia átadó gén kifejeződését. A pPS19 plazmid emésztése BamHI restrikciós enzimmel két fragmenst termel; az egyik fragmens mintegy 230 bp méretű és tartalmazza a PGK aktiváló szekvenciát, és a másik fragmens ~ 7,6 kb méretű, és tartalmazza a higromicin rezisztencia átadó génhez szolgáló kódoló szekvencia legnagyobb részét.

A pPS19 plazmid ~ 7,6 kb-s BamHI restrikciós fragmensének kör alakúvá tételével a pPS24 plazmid keletkezik, amely nélkülöz egy átíró és transzlációs aktiváló szekvenciát, amely úgy helyezkedik el, hogy elősegítse a vektoron jelen levő higromicin-rezisztencia átadó gén kifejeződését. A pPS24 plazmid ezért transzformálhatja a Cephalosporium acremoniumot higromicin rezisztenciára, integrálva C. acremonium DNS-be olyan helyzetben, hogy egy endogén C. acremonium átíró és transzlációs aktiváló szekvencia hajtja a gén kifejeződését. Következésképpen a pPS24 plazmid DNS integrálódása helyének azonosítása egy higromicinre rezisztens C. acrenonium/pPS24 transzformánsban azonosít egy C. acremonium átíró és transzlációs aktiváló szekvenciát is. Egy más módszer szerint C. acremonium DNS-t klónozni lehet pPS24 plazmid egyedi BamHI helyébe, és az igy létrejött plazmidot alkalmazni C. acremonium transzformálására. Azok a plazmidok, amelyek transzformálják C. acremoniumot higromicin rezisztenciára nagy gyakorisággal, szükségszerűen magukban foglalnak egy átíró és transzlációs aktiváló szekvenciát, amely működőképes C. acremoniumban.

Még további hasznos plazmidokat is állítunk elő ugyanazzal a ligálással, amellyel a pPS21A plazmidot előlállitjuk. Ezeket a plazmidokat, amelyeket pPS25 és pPS25.1-nek jelölünk, a pPS19 plazmid két BamHI

-1223

HU 202279 Β restrikciós fragmensének ligálásával állítjuk elő a pPS23 plazmid - 860 bp-s BamHl restrikciós fraginenséhez. A pPS25 plazmidban mind a PGK, mind az 1PS aktiváló szekvenciák megfelelő orientációban vannak, hogy elősegítsék a higromicin rezisztencia átadó gén kifejeződését. A pPS25 plazmid magában foglalja az IPS aktiváló szekvenciát, közvetlenül a higromicin rezisztencia átadó gén kódoló szekvenciájától .felfelé’, és a PGK aktiváló szekvenciát, közvetlenül az IPS aktiváló szekvenciától .felfelé. A pPS25 plazmid higromicin rezisztenciát ad át Cephalosporium acremoniumnak. A pPS25 plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül a 9. ábra mutatja be. A pPS22, pPS24 és pPS25 plazmidok megalkotását a 7. példa is bemutatja.

A pPS25.1 plazmid csupán abban különbözik a pPS25 plazmidtól, hogy a - 0,23 kb-s Bandii restrikciós fragmens, amely a PGK aktiváló szekvenciát tartalmazza, orientációja eltérő. A pPS25.1 plazmidban a PGK aktiváló szekvencia nem olyan orientációban helyezkedik el, amely lehetővé teszi a PGK aktiváló szekvencia számára, hogy elősegítse a higromicin rezisztencia átadó gén kifejeződését. Mind a pPS25, mind a pPS25.1 plazmid azonban transzformálja a Cephalosporium acremoniumot higromicin-rezisztens fenotípusúvá azonosan nagy frekvenciával, jelezve, hogy a PGK aktiváló szekvencia nem szükségszerű a higromicin rezisztens fenotipus kifejeződéséhez.

További, jelen találmány szerinti hasznos plazmidokat, amelyek higromicin rezisztenciát adnak át Cephalosporium acremoniumnak, meg lehet alkotni pPS21 részleges emésztésével PstI restrikciós enzimmel, majd az ezt követő újra-ligálással. A pPS28 plazmid úgy jön létre, hogy a pPS21A plazmidból kiiktatjuk a - 1,85 kb-s PstI restrikciós fragmenst, amely a Cephalosporium replikációs origóját tartalmazza. A pPS29 plazmid úgy jön létre, hogy a pPS21A plazmidból kiiktatjuk ugyanazt a PstI plazmidot, amelyet kiiktattunk, hogy a pPS28 plazmidot nyerjük, együtt a ~ 0,49 kb-s Psű. restrikciós fragmenssel, amely a Cephalosporium replikációs origó és az IPS gén aktiváló szekvenciája között fekszik a pPS21 plazmidon. A pPS28, illetve pPS29 plazmidnak restrikciós hely- és működési térképét a 10. illetve 11. ábrákban mutatjuk be. A pPS28 és pPS29 plazmidok megalkotását a 8. példában írjuk le.

Még további hasznos származékokat alkotunk meg, pPS21A plazmidot, mint kiindulási anyagot alkalmazva. A pPS21A plazmid 3,45 kb-s HindlII restrikciós fragmensét beiktatjuk a pIT335 plazmid egyedi HindlII helyére, hogy a pPS26 és pPS26.1 plazmidokat nyerjük, amelyek egymástól csupán a pPS21A plazmidból származó, beiktatott Hindii! restrikciós fragmens orientációja szempontjából különböznek. A pPS26 és pPS26.1 plazmidok 14 tartalmazzák a Cephalosporium acremoniumból származó érintetlen IPS gént és az IPS gén aktiváló szekvenciája által hajtott higromicin rezisztencia gént. A pPS26 és pPS26.1 plazniidok megalkotását a 9. példa írja le, és a pPS26 plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül a 12. ábra mutatja be.

A 4 762 786 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás leír egy, a pIT221 plazmidhoz hasonló vektort, amely pIT221 vektor, amint fentebb megállapítottuk, szintén le van írva és bele van foglalva ugyanabba a bejelentésbe, de ez a hasonló vektor magában foglal még egy Cephalosporium acremonium riboszomális RNS-t kódoló DNS-t. Ennek a plazmidnak, amelyet pPS6-nak neveznek, megnövekedett képessége van integrálódni C. acremonium kromoszómáiig DNS-be az rRNS-t kódoló DNS jelenléte következtében. A pPS6 plazmid megalkotása a fentebb említett 654 919 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés 72-75. oldalán a 13. példában van belefoglalva, és ez a hivatkozott 13. példa ide referenciaként épül be. Mivel a pPS6 plazmid ugyanazt a PGK-HmR gént foglalja magában, mint a pIT221 plazmid, az a pPS6 származék, amely a PGK átíró és transzlációs aktiváló szekvenciájának helyettesítéséből jön létre a jelen találmány szerinti C. acremonium aktiváló szekvenciával, tisztán a jelen találmány oltalmi körén belül van.

A pPS6 plazmid egy ~ 3,7 kb-s Xmal restrikciós fragmenst tartalmaz, amely magában foglalja a Cephalosporium acremonium rRNS génjeit. Ennek az Xmal fragmensnek a jelenléte egy plazmidon növeli annak a valószínűségét, hogy a plazmid integrálódni fog a C. acremonium genomba homológ rekombinációval, amikor a plazmid transzformálódik a

C. acremoniumba. igy a pPS30 és pPS30.1 plazmidokat úgy alkotjuk meg, hogy a pPS6 plazmid ~ 3,7 kb-s Xmal restrikciós fragmensét, amely a C. acremonium rRNS gének egy részét tartalmazza, beiktatjuk a pPS21A plazmid egyedi Xmal helyébe; a pPS30 és pPS30.1 plazmidok csupán az Xmal restrikciós fragmens orientációja szempontjából különböznek egymástól. A pPS31 és pPS31.1 plazmidokat úgy alkotjuk meg, hogy a pPS6 plazmid - 3,7 kb-s Xmal restrikciós fragmensét beiktatjuk a pPS29 plazmid egyedi Xmal helyére. A pPS30, pPS30.1, pPS31., és pPS31.1 plazmidok megalkotását a 10. példában írjuk le.

A jelen találmány szerinti plazmid vektorok, amelyek hasznosítják a Cephalosporium acremonium IPS gén átíró és transzlációs aktiváló szekvenciáját, hogy elősegítsék a higromicin-rezisztencia átadó gén kifejeződését, sokkal hatásosabbak azoknál a plazmidoknál, amelyek a Saccharomyces cerevisiae PGK aktiváló szekvenciát hasznosítják a higromicin rezisztencia átadó gén kifejeződésének elősegítésére C. acremoniumban. A jelen vektorok

-1325

HU 202279 Β felsőbbrendűségét két megfigyelés támasztja alá: (1) a transzformációs frekvencia, amelyet a higromicin-rezisztens Cephalosporium acremonium transzformánsok számával mérünk a transzformációban alkalmazott vektor DNS mikrogramjaira számitva, 50-300-szor nagyobb, amikor az IPS aktiváló szekvenciát alkalmazzuk - a PGK aktiváló szekvenciával szemben - a higromicin rezisztencia gén kifejeződésének elősegítésére a vektoron; és (2) a regenerációs idő, amelyet azzal az idővel mérünk, amely a telepek szabad szemmel láthatóvá válásáig telik el a transzformálás után, mintegy 50%-kal kisebb, amikor az IPS aktiváló szekvenciát alkalmazzuk - a PGK aktiváló szekvenciával szemben - a higromicin rezisztencia gén kifejeződésének elősegítésére a vektoron.

A Cephalosporium acremonium átíró és transzlációs aktiváló szekvenciát lehet alkalmazni bármilyen DNS szekvencia kifejezésére C. acremoniumban, amint ezt a fentebb leirt kifejeződő vektorokkal kapcsolatban jeleztük, igy a jelen találmány magában foglalja a pIT335 plazmid - 0,5 kb-s Salí-Ncol restrikciós fragmensén belül kódolt C. acremonium átíró és transzlációs aktiváló szekvenciának alkalmazását bármilyen DNS szekvencia kifejezésének elősegítésére, amely egy hasznos anyagot kódol.

A jelen találmány szerinti vektor egy intakt, funkcionális Cephalosporium acremoniuni DNS szekvencia klónozásából jön létre, amely nem csupán az izopenicillin N-szintetáz aminosav-szekvenciáját kódolja, hanem az átíró és transzlációs szekvenciát is, amely szükséges az izopenicillinn N-szintetáz kifejeződésének elősegítéséhez C. acremoniumban. Hasonlóképpen a jelen találmány szerinti IPS gén magában foglalja a kódoló területtől .lefelé ' elhelyezett szekvenciákat, amelyek felelősek az átírás befejezéséért és az mRNS poliadenilező és feldolgozó jelek szolgáltatásáért. Általában az átírás befejezéséért, a poliadenilezésért és az mRNS feldolgozásért felelős szekvenciák az ~ 5000 bp-s területen belül kódoló terület stop konodjától .lefelé kódolódnak. Ennél fogva a ~ 0,5 kb-s Banúll-Psü restrikcióis fragmens, amely tartalmazza az IPS karboxi-terminális-kódoló DNS-t és az ettől .lefelé levő szekvenciákat, tartalmazza az IPS gén átírás befejeződését valamint mRNS poliadenilező és feldolgozó jeleit (szignáljait).

Megalkotunk egy vektort, amelyet pPS27-nek nevezünk, és amely tartalmazza az IPS átíró és transzlációs aktiváló szekvenciát, amelyet a higromicin rezisztencia átadó gén követ, és amelyet az IPS gén átírás befejeződési és mRNS poliadenilezési és műveleti szignáljai követnek. Hogy a pPS27-et megalkossuk, a pIT335 plazmid ~ 1,4 kb-s őamHI-XhoI restrikciós fragmensét beiktatjuk a Saű-RamHI-gyel emésztett pUC8 plazmid ba (a Sáli és Xhól átfedések összeférhetők), hogy a pIT336 plazmidot nyerjük.

A pIT336 plazmidot Pstl restrikciós enzimmel kezeljük és újból kör alakúvá teszszük, hogy kiiktassuk az összes Cephalosporium DNS szekvenciát a plazmidból, kivéve a ~ 0,5 kb-s RamHI-Pstl restrikciós fragmenst, amely az IPS gén átírás -befejezödési és mRNS poliadenilezési és műveleti szignáljait tartalmazza, így alkotjuk meg a pPS35 plazmidot (15. ábra).

A pPS35 plazmidot azután HindlII restrikciós enzimmel emésztjük, és a pPS29 plazmid ~ 2,3 kb-s HindlII restrikciós fragmensét, amely tartalmazza az IPS gén átíró és transzlációs aktiváló szekvenciáját, amelyet a higromicin rezisztencia átadó gén követ, beiktatjuk a Hindlll-al emésztett pPS35 plazmádba, megfelelő orientációban, hogy a pPS27 plazmidot nyerjük. A pPS27 plazmid megalkotását a 11. példában írjuk le, és a pPS27 plazmid restrikciós hely- és műveleti térképét a mellékelt ábrák közül a 16. ábrában adjuk meg.

A pPS27-nek hasznos származékát alkothatjuk meg a pPS27 plazmid - 2,3 kb-s HindlII és - 0,5 kb-s HindlII-BamHI restrikciós fragmenseinek izolálásával, és ezeknek a fragmenseknek beiktatásával helyes orientációban a pIT335 plazmid ~ 0,9 kb-s BgűII-Hindlll restrikciós fragmensébe, a pPS34 plazmidot termelve. A pPS34 plazmid tartalmazza mind a higromicin rezisztencia-átadó gént, mind az izopenicillin N-szintetázt kódoló gént, amelyeket az IPS gén szabályozó elemei szabályoznak. A pPS34 restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül a 13. ábra adja meg.

A pIT336 plazmidot lehet kiindulási anyagként felhasználni egy olyan plazmid megalkotására, amely integrálódik a Cephalosporium acremonium genomban az izopenicillin N-szintetáz gén lókuszánál. Ez a plazmid, amelyet pPS37-nek jelölünk, hasznosítást nyer a beiktatási inaktiválásos tanulmányokhoz, a pPS37 plazmid transzformációjához egy Cephalosporium acremonium törzsbe, amely ennek a törzsnek az IPS-hiányos mutánsát alakítja ki, amikor a pPS37 plazmid integrálódik az IPS gén kódoló területébe. A pPS37 plazmidot úgy alkotjuk meg, hogy a pPS21A plazmid ~ 3,45 kb-s HindlII restrikciós fragmensét, amely a higromicin rezisztencia átadó gént tartalmazza az IPS gén aktiváló szekvenciájának szabályozása alatt, beiktatjuk Nrul-el emésztett pIT336 plazmádba. A pIT336 plazmidnak van egy egyedi Nrul helye a plazmidon jelen levő IPS kódoló terület egy részletén belül. A ~ 3,45 kb-s HindlII restrikciós fragmens - amely tompa végű lett Klenow-enzimmel végzett kezeléssel beiktatása az Nrul-el emésztett pIT336 plazmid ba valójában két plazmidot alakít ki, amelyeket pPS37-nek és pPS37.1-nek nevezünk, és amelyek csupán a beiktatott fragmens orientációja szempontjából különböznek egymástól. Mind a pPS37 plazmid, mind a 15

-1427

HU 202279 Β pPS37.1 plazmid használható a C. acremonium transzformálására, hogy higromicin-rezisztens, IPS-hiányos transzformánsokat nyerjünk.

A jelen találmány úttörő jellegű találmány annyiban, hogy ez képviseli egy olyan DNS szekvencia első klónozását és gén-manipulációját, amely azt az enzimatikus aktivitást - amelyet cikláz aktivitásnak is neveznek gyakran - kódolja, amely egy tripeptid 10 szubsztrátum kondenzálásának katolizálásához szükséges egy helyettesitett β-laktámmá. Több, C. acremoniumtól eltérő organizmus fejez ki lényegében hasonló, vagy akár azonos, cikláz aktivitást. A cikláz aktivitások hason- 15 lósága különböző nemzetségek antibiotikum- termelő organizmusaiban a különböző ciklázok aminosavai és a cikláz aktivitást kódoló DNS szekvenciák megfelelő hasonlóságának eredménye. 20

A jelen találmány biztosit egy aminosav és egy DNS szekvenciát egy cikláz enzim számára, különösen a Cephalosporium acremonium izopenicillin N-szintetáz számára, és igy lehet használni cikláz enzimet kódoló DNS 25 izolálására β-laktám termelő organizmusokból, igy pl. a jelen DNS szekvenciákat lehet használni jelzett vizsgáló minták elóállitására, amelyeket viszont lehet használni ciklázt kódoló DNS szekvenciák megkeresésére a fen- 30 tebb említett β-laktám termelő organizmusokban. A jelen izopenicillin N-szintetáz-kódoló DNS nagy G és C tartalma, - 63%, teszi a jelen DNS vegyületeket különösen hasznossá £ Streptomyces clavuligerus izopenicillin N- 35 -szintetázt kódoló DNS izolálásához. A Streptomyces DNS-röl tudjuk, hogy nagy G és C tartalmú, gyakran megközelítve a 70%-ot, úgy a jelen találmány szerinti DNS magas G és C tartalma teszi a jelen DNS vegyületet különö- 40 sen hasznossá homológ S. clavuligerus vagy más Streptomyces DNS szekvenciák izolálásához. A jelen találmány olyan DNS vegyületről szól, amelyek cikláz aktivitást kódolnak, valamint tartalmaznak olyan kifejeződő vektoro- 45 kát, amelyek ezeknek a cikláz aktivitásoknak kifejeződését elórehajtják a gazdaorganizmusok széles választékában.

Az itt következő példák azt a célt szolgálják, hogy tovább illusztrálják a jelen ta- 50 lálmányt, de nem szándékunk, hogy ezekkel korlátozzuk a találmány oltalmi körét.

1. példa

E. coli K 12 JA221/pIT335 tenyésztése és a pIT335 plazmid izolálása

A.) Az E. coli K 12 JA221/plT335 tenyésztése

Az E. coli K 12 JA221/pIT335 liofilezett tenyészetét a Northern Régiónál Research Laboratories-tól (Peoria, Illinois) kapjuk, ahol az az NRRL B-15960 letéti számon talál16 ható. A liofilezett tenyészet közvetlenül használható, mint .tenyészet’ az alább leirt folyamatban.

liter L-tápkózeget (10 g tripton, 10 g 5 NaCl és 5 g élesztökivonat literenként), amely 50 pg/ml ampicillint is tartalmaz, inokulálunk E. coli K 12 JA221/pIT335 tenyészetével, és levegőkeveréssel inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten, amíg az optikai sűrűség 590 nm-nél (ODseo) - 1 abszorpciós egység lesz, amikor is 150 mg klóramfenikolt adunk a tenyészethez. Az inkubálást mintegy 16 órán át folytatjuk; a klóramfenikol hozzáadása meggátolja a fehérjeszintézist, és igy meggátolja a további sejtosztódást is, de lehetővé teszi, hogy a plazmid replikáció folytatódjék.

B.) A pIT335 plazmid izolálása

Az 1A. példában elkészített tenyészetet Sorvall GSA rotorban (DuPont Co., Instrument Product, Biomedical Division, Newtown, CN 06470) centrifugáljuk 6000 fordulat/percnél 5 percen át 4 °C hőmérsékleten. Az igy létrejött felülúszót elöntjük, és a sejtüledéket 40 ml TES pufferral mossuk (10 mmól/liter Trisz-HCl, pH 7,5; 10 mmól/liter NaCl; és 1 mmól/liter EDTA), majd újra üledékbe viszszük. Az újabb felülúszó elöntése után a sejtüledéket szárazjég-etanolos fürdőben lefagyasztjuk, majd felengedtetjük. A felengedtetett sejtüledéket újra szuszpendáljuk 10 ml, 25%-os szacharózt és 50 mmól/liter EDTA-t tartalmazó oldatban. Ezután hozzáadjuk a következőket és összekeverjük: 1 ml 5 mg/ral-es lizozim oldat; 3 ml 0,25 mól/literes EDTA oldat, pH = 8,0; és 100 μΐ 10 mg/ml-es RNÁ-z A; az így létrejött oldatot jégen inkubáljuk 15 percen át. 3 ml lizáló oldatot (amelyet 3 ml 10%-os Triton-X 100; 75 ml 0,25 mól/literes EDTA, pH = 8,0; 15 ml 1 mól/literes Trisz-HCl, pH 8,0; és 7 ml viz összekeverésével nyerünk) hozzáadjuk a lizozimmal kezelt sejtekhez, összekeverjük, és az így létrejött oldatot jégen inkübáljuk további 15 percen át. A lizált sejteket szárazjég-etanol fürdőben lefagyasztjuk, majd felengedtetjük.

A sejttörmeléket eltávolítjuk az oldatból, 25000 fordulat/perccel 40 percen át végzett centrifugálással SW 27 rotoron (Beckman, 7360 N. Lincoln Avenue, Lincolnwood, Illinois 60646) és pufferolt fenollal végzett extrahá55 lássál. 30,44 g CsCl és ~ 1 ml 5 mg/ml-es etidium-bromid oldat hozzáadása után az oldat térfogatát 40 ml-re állítjuk be és dekantáljuk egy VTÍ50 ultracentrifuga csőbe (Beckman). A cső leforrasztása után az olda60 tót VTÍ50 rotorban centrifugáljuk 42000 fordulat/percnél ~ 16 órán át. Az igy létrejött plazmid-csikot, amelyet ultraibolya fénnyel teszünk láthatóvá, izoláljuk, majd Ti75 csőbe és rotorba (Beckman) helyezzük, és 50000 65 fordulat/percnél 16 órán át centrifugáljuk.

-1529

HU 202279 Β

Minden szükséges térfogat-beállítást TES-t /[2-(trisz-hidroximetil-metil)-amino]-etánszulfonsav puffer/ alkalmazva végzünk, amely 0,761 g/ml CsCl-t is tartalmaz. A plazmid-csikot ismét izoláljuk, sóval telített izopropanollal extraháljuk, hogy eltávolitsuk az etidium-bromidot, és 1 : 3 arányban hígítjuk TES pufferban. Két térfogat etanolt adunk ezután az oldathoz, ezt követi az inkubálás egy éjszakán át -20 °C hőmérsékleten. A plazmid DNS-t centrifugálással kiülepitjük, a műveletet S534 rotorban (Sorvall) végezve 15 percen át, 10000 fordulat/percnél.

Az ezzel az eljárással nyert mintegy 1 mg pIT335 plazmid DNS-t 1 ml TE pufferban szuszpendáljuk (10 mmól/liter Trisz-HCl, pH 8,0, és 1 mmól/liter EDTA) és -20 °C hőmérsékleten tároljuk. A plT335 plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül az 1. ábra mutatja be.

2. példa

A pIT337 plazmid megalkotása

E. coli K 12 RV308/pCZ106 tenyésztése és a PCZ106 plazmid izolálása

Az E. coli K 12 RV308/pCZ106 tenyészetét a Northern Régiónál Research Laboratories-töl (Peoria, Illinois) kapjuk meg, ahol ez az NRRL B-15959 letéti szám alatt található meg. A liofilezett tenyészetet használjuk 1 liter L-tápközeg inokulálására, amely még 50 pg/ml kanamicint is tartalmaz, és az inokulált tápközeget 25 °C hőmérsékleten levegó-rázógépen inkubáljuk, amíg az optikai sűrűség (OD590) 0,5 és 1,0 abszorpciós egységek közé esik. Amikor a tenyészet eléri a 0,5-1,0 abszorpciós egységet az optikai sűrűségben, a hőmérsékletet 37 °C-ra emeljük, és az inkubálást folytatjuk 2-6 órán át. Az .elszabadult' replikon, amint korábban megállapítottuk, hőmérséklet-érzékeny, és elveszti kópiaszám-szabályozását 37 °C hőmérsékleten. A 2-6 órán inkubálás 37 °C hőmérsékleten elegendő időt szolgáltat a nem szabályozott replikációhoz.

A 2-6 órás, 37 °C hőmérsékleten végzett inkubálás után a sejteket összegyűjtjük, a pCZ106 plazmid DNS-t izoláljuk lényegében az IB. példa eljárása szerint. Mintegy 5 mg pCZ106 plazmid DNS-t nyerünk, és ezt 5 ml TE pufferban felszuszpendáljuk. A pCZ106 restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül a 2. ábrában adjuk meg.

B.) A pCZ106 plazmid Ncol és BamHI emésztése és a pCZ106 plazmid - 8,7 kb-s Ncol-Ncol és ~ 1,6 kb-s NcoI-BamHI resti-ikciós fragmenscinek izolálása

A 2A. példában előállított pCZ106 plazmid mintegy 25 Mg-ját (amely 25 μΐ-nek felel meg) hozzáadjuk 10 pl 10 x BamHI reakciós pufferhoz [1,5 mól/liter NaCl; 60 mmól/liter Trisz-HCl, pH = 7,9; 60 mmól/liter MgClz; és 1 mg/ml bovin szérum albumin (BSA)], 5 pl (~ 50 egység) BamHI restrikciós enzimhez*, 5 pl (50 egység, Ncol restrikciós enzimhez, és 55 pl vízhez, és az egészet összekeverjük. Az igy létrejött reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk, ez után a reakció lényegében teljessé válik.

Az Ncol-BamHI reakciókeveréket ezután elektroforézisnek vetjük alá. 1%-os agaróz gélen, amíg a kívánt - 1,6 kb-s NcoI-BamHI és ~ 8,7 kb-s Ncol-Ncol fragmensek tisztán elkülönülnek a másik emésztési terméktől, a -0,3 kb-s restrikciós fragmenstöl. Az elektroforézisnek alávetett DNS láthatóvá tételét a gél festésével hajtjuk végre etidium-bromid híg (0,5 pg/ml) oldatával, majd a festett gél hosszú hullámú UV fénynek való kitevésével. Miután a kívánt fragmenseket lokalizáltuk, egy kis metszést végzünk a gélben a kívánt fragmensek mindegyike előtt, és egy kis darabka Schleicher and Schuell (Keene, NH 03431) Na-45 DEAE membránt helyezünk mindegyik bemetszésbe. A további elektroforézisre a DNS nem kovalensen kötődik a DEAE membránhoz. Miután a kívánt fragraenseket a DEAE membránhoz kötöttük, ezeket a membránokat eltávolítjuk és kis sókoncentrációjú puffer-oldattal öblítjük (100 mmól/liter KC1; 0,1 mmól/liter EDTA, és 20 mmól/liter Trisz-HCl, pH = 8). Ezután mindegyik membránt egy kis csőbe helyezzük, és nagy sókoncentrációjú pufferba merítjük be (1 mól/liter NaCl; 0,1 mmól/liter EDTA, és 20 mraól/liter Trisz-HCl, pH = 8), majd 65 °C hőmérsékleten inkubáljuk 1 órán át, hogy eltávolitsuk a DNS-t a DEAE papírról. A 65 °C hőmérsékleten végzett inkubálás után az inkubáló puffért összegyűjtjük és a membránt nagy sókoncentrációjú oldattal öblítjük. Az Öblítő oldatot egyesítjük az inkubáló pufferral, mielőtt a kívánt DNS fragmenseket öszszegyűjtjük.

A nagy sókoncentrációjú DNS oldat térfogatát úgy állítjuk be, hogy az NaCl koncentráció 0,25 mól/liter legyen, majd 3 térfogat hideg, abszolút etanolt adunk hozzá. Az így létrejött oldatokat összekeverjük, és -70 °C hőmérsékletre helyezzük 10-20 percre. A lehűtés után az oldatot 15000 fordulat/percnél centrifugáljuk 15 percen át. Egy második kicsapás után a maradék só eltávolítása érdekében, a DNS üledéket etanollal öblítjük, szárítjuk, 20 pl TE pufferban újra szuszpendáljuk, és 5-5 pg-ot alakítunk ki a pCZ106 plazmid kívánt - 1,6 kb-s NcoI-BamHI 17

-1631

HU 202279 Β és ~ 8,7 kb-s Ncól-Ncól restrikciós fragmenseiből. A nyert tisztított fragnienseket egyenként feloldjuk 25 pl TE pufferban, és -20 °C hőmérsékleten tároljuk.

* Hacsak másképpen nem jegyezzük meg, a restrikciós és ligáló enzimeket a New England Biolabs-tól szereztük be (32 Tozer Road, Beverly, Massachussets, MA0191S. Az itt alkalmazott egység definíciója megfelel a gyártó által megadott egység definícióknak.

C. ) .4 pIT335 plazmid Ncol és BamHI emésztése és a ~ 1,5 kb-s NcoI-BamHI restrikciós fragniens izolálása, amely az izopenicillin N-sziritetázt kódolja

Mintegy 25 pg (amely 25 pl-nek felel meg) IB. példa szerint készített plT335 plazmid DNS-t emésztünk Ncol és BamHI restrikciós enzimekkel, lényegében a 2B. példa szerinti folyamattal összhangban. A nyert Ncol-BamHI emésztett DNS-t 1%-os agaróz gélre terheljük és a kivánt - 1,5 kb-s NcoI-BamHI restrikciós fragmenst izoláljuk, lényegében a 2B. példa szerinti eljárással összhangban. Mintegy 5 pg kivánt fragmenst nyerünk, ezt 25 pl TE pufferban izoláljuk, és -20 °C hőmérsékleten tároljuk.

D. ) A pIT337 plazmid végső megalkotása pl, 2B. példa szerint tisztított, pCZ106 plazmid eredetű ~ 1,6 kb-s Ncól-BamHl és 2,5 pl ~ 8,7 kb-s Ncól-Ncol restrikciós fragmenseket ligálunk 5 pl, a 2C. példa szerint tisztított, pIT335 plazmid eredetű, ~ 1,5 kb-s NcoI-BamHI restrikciós fragmenshez, így képezve a pIT337 plazmidot. A reakciótérfogat 30 pl, és a fentebb említett DNS fragmensekből, 1,1 pl (~ 100 egység) T4 DNS ligázból, 3 pl 10 x ligáló pufferból (0,5 mól/liter trisz-HC1, pH 7,8; 100 mmól/liter MgClz; 200 mmól/liter MgCk; 200 mmól/liter ditiotreitol (DTT); 10 mmól/liter ATP; és 1 mg/ml BSA), és 13,4 pl HzO-ból áll. A reakciókeveréket 15 °C hőmérsékleten inkubáljuk 2 órán át, ez után az idő után a reakció lényegében teljessé válik. A ligáit DNS alkotja a kivánt plT337 plazmid DNS-t. A pIT337 plazmid restrikciós hely- és műveleti térképét a mellékelt ábrák közül a 3. ábra mutatja be.

3. példa

Az E. coli K 12 RV308/pIT337 megalkotása és az E. coli által termelt izopenicillin N-szintetáz mérése

A. Az E. coli K 12 RV308/pIT337 megalkotása

E. coli K 12 RV308 (NRRL B-15624) tenyészetét 50 ml L-tápközegben növesztjük, amíg az O.Ds90 érték ~ 0,5 abszorpciós egységet eléri. A tenyészetet jégen hűtjük 10 percen át, és a sejteket centrifugálással öszszegyűjtjük. A sejtüledéket újra szuszpendáljuk 25 ml hideg, 100 mmól/literes CaCk oldatban, és jégen inkubáljuk 25 percen át. A sejteket még egyszer üledékbe visszük centrifugálással, és az üledéket újra szuszpendáljuk 2,5 ml, hideg, 100 mmól/literes CaCk oldatban, és jégen inkubáljuk egy éjjelen át.

200 pl ilyen sejtszuszpenziót összekeverünk a 2D. példa szerint készített, ligáit DNS-sel, és jégen inkubáljuk 20 percen át, majd a sejteket centrifugálással összegyűjtjük. A sejtüledéket újra szuszpendáljuk ~ 1 ml L-tápközegben, és a szuszpenziót °C hőmérsékleten inkubáljuk 1 órán át. A sejtkeverék alikvotjait L-agar lemezekre (L-tápközeg 15 g/1 agarral) helyezzük, amely lemezek 50 pg/ml kanamicint is tartalmaznak, és a lemezeket 25 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Az E. coli K 12 RV308/pIT337 transzformánsokat kanamicin-rezisztencia szelekció alapján, valamint a transzformánsok plazmid DNS-ének restrikciós enzimes elemzése alapján igazoljuk. Az E. coli K 12 RV308/plT337 transzformánsokból a plazmid DNS-t kinyerjük, lényegében az ‘A. példában található kitanítással összhangban, de kisebb méretekben, és a CsCl-gradiens lépés elhagyásával.

B. Az E. coli A' 12 RV308/pIT337 tenyésztése az izopenicillin N-szintetáz aktivitás kifejeződéséhez

A 3A. példa szerint előállított E. coli K 12 RV308/pIT337 több izolátumát egyedileg inokuláljuk L-tápközeg 5 ml-es alikvotjaiba, amely tápközeg 50 pg/ral kanamicint is tartalmaz, és a tenyészeteket levegő-rázógépen inkubáljuk 25 °C hőmérsékleten, amíg az O.Dsso eléri a - 0,2 abszorpciós egységet. A tenyészeteket ezután átvisszük 37 “C hőmérsékletű levegó-rázógépre, és 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk ~ 6 órán át.

A 6 órás, 37 °C hőmérsékleten végzett inkubálás után minden tenyészetből 1 ml-t kiveszünk, és a sejteket centrifugálással üledékbe visszük. A sejtüledéket egyenként mossuk 1-1 ml 10 mmól/literes NaCl oldattal, majd újra szuszpendáljuk 1,0 ml IPS extrakciós pufferral (0,05 mól/liter trisz-HCl, pH = 8,0; 0,01 mól/liter KC1, és 0,01 mól/liter

-1733

HU 202279 Β

MgSOH. A sejteket ultrahangos kezelésnek vetjük alá, hat, 5 másodperces ultrahangos lőkettel, amelyet egy Sonifier Cell Disruptor, W185 Modellel végzünk (Heat Ultrasonics, Inc., Plainview, Long Island, New York), mikro-hegyet használva. Az ultrahangos löketek közti idő 60 másodperc, és a keveréket jég-etanolos fürdőben tartjuk az eljárás alatt. Az ultrahangos kezelés után a sejtkeveréket centrifugáljuk, hogy a sejttörmeléket eltávolitsuk, majd a felülúszót közvetlenül használjuk fel a meghatározásban.

C. Az izopenicillin N-szintetáz aktivitás meghatározása

A következőkben leírt vizsgálati eljárás Shen és munkatársainak eljárásából származik [J. of Antibiotics 37 (9), 1044-1048 (1984JJ.

Az izopenicillin N-szintetáz mérési reakcióját 500 μΐ teljes térfogatban hajtjuk végre. Hogy megindítsuk a reakciót, 1,0 ml, é-(L-cC-amino-adipil)-L-ciszteinil-D valinra 1,4 mmól/literes, és DTT-re 3,75 mmól/literes oldatot hagyjuk reagálni szobahőmérsékleten 30-60 percig, hogy redukáljunk minden dimer tripeptidet monomer formára. 50 1-t a következő törzsoldatok mindegyikéből alikvotokban bemérünk minden egyes vizsgálócsóbe (steril, üveg, eldobható 13 x 100 mm-es csövek): 500 mmól/liter trisz-HCl, pH = 7,4;

100 mmól/liter KC1; 2,0 mmól/liter FeSCM; és 6,7 mmól/liter aszkorbinsav. Ezután különböző mennyiségű, vizzel 150 μΐ-re hígított extraktumokat adunk hozzá. A tripeptid oldat mintegy 100 μΙ-es alikvotjait adjuk ezután minden egyes csőbe; a tripeptid hozzáadása indítja a reakciót. Mindegyik csövet Vortex-berendezésen kezeljük a szubsztrátum hozzáadása után. A reakciókeveréket tartalmazó edényeket ezután forgó-rázó fürdőbe helyezzük (250 fordulat/perc), 25 °C inkubálási hőmérsékleten. A reacióidő 45 perc.

A reakció 45 perce után két 100 μΙ-es mintát veszünk ki mindegyik reakciókeverékből és a biológiai vizsgáló lemezekben levő üregekbe osztjuk szét, a minta maradékába pedig 100 egység penicillináz A-t adunk. A penicillináz A-t a Riker’s Laboratories Inc.-től szerezzük be; az enzimet 100000 egységes ampullákban árusítják, amelyet 5 ml-re rehidrálunk H20-val. 5 μΐ (100 egység) rehidrált penicillináz A-t adunk minden egyes reakciókeverékhez, és hagyjuk reagálni 5 percen át szobahőmérsékleten, majd 100 μΐ-t minden egyes penicillináz A-val kezelt extraktumból egy biológiai mérólemez üregeibe osztunk el. Ezt a penicillináz A kezelést azért végezzük, hogy ellenőrizzük, hogy a biológiai mérölemezeken levő sávok penicillin jelenlétének tulajdoníthatók, vagy esetleg cefalosporinnak vagy más szennyezéseknek.

A penicillin N standard görbét, 0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 10,0; és 20,0 pg penicillin N a biológiai mérólemez üregeibe való hozzáadásával készítjük el. A penicillináz A aktivitást ellenőrizzük még az enzimkészitmény 5 μΐ-ének hozzáadásával - 200μ1 0,2 pg/ml-es penicillin

N-hez.

A biológiai mérólemezeket K31 tápagarból állítjuk össze, amelyet 30,5 g BBL Antibiotic Médium N-ll (Becton Dickinson and Company, Cockeysville, Maryland) oldásával készítünk 1 liter ionmentesitett vizben, az oldatot felforralva, majd 70 °C hőmérsékletre lehűtve, majd 35 percen át autoklávozva 121 °C hőmérsékleten és ~ ΙΟ³ pascal tőbbletnyomáson. A lemezeket Micrococcus luteus (ATCC 9341) ml-es, egy éjszakán át nőtt friss tenyészetével oltjuk be, 700 ml agarra számítva. A M. luteust K544 Lápközegben növesztjük, amely a következőkből áll: 5,0 g Difco pepton; 1,5 g Difco élesztökivonat; 3,5 g nátrium-klorid; 3,7 g dikálium-hidrogén-foszfát (vízmentes); 1,3 g kálium-dihidrogén-foszfát; 1,5 Difco marhahús-kivonat, 1 liter ionmentesitett vizben - az oldatot felforraljuk, 25 °C hőmérsékletre lehűtjük, pH 7,0-ra állítjuk be 1 n HCl-el vagy 1 n NaOH-val, majd 20 percen át 121 °C hőmérsékleten autoklávozzuk - 10⁵ pascal nyomáson felhasználás előtt. A beoltott agart 100 x 15 mm-es lemezekre osztjuk be, lemezenként 15 ml alkalmazva. Az üregeket szivást alkalmazva alakítjuk ki, eldobható ml-es pipettákat használva; minden üreg 10 mm átmérőjű.

Miután a lemezeket elkészítettük, és a mintákat az üregekbe elhelyeztük, a lemezeket 37 °C hőmérsékletű inkubátorba helyezzük 18 órára. A vizsgálati eredményeket úgy határozzuk meg, hogy az egyes mintaüregek körül feltisztult területek átmérőjét megmérjük, amely feltisztult területek annak eredményeképp jönnek létre, hogy a M. luteus nem képes ott nőni, ahol penicillin van jelen.

A vizsgálatok eredményeit az alábbi táblázat adja meg.

II. TÁBLÁZAT

Az E. coli K12 RV308/pIT337-ből származó sejt-extraktumok izopenicillin N-szintetáz aktivitása.

Minta	Zónaméret (mm)
2 pg penicillin N standard	16
5 pg penicillin N standard	18
10 pg penicillin N standard	27
20 pg penicillin N standard	31
25 μ1 E. coli K12
RV308/pIT337 sejtkivonat	10
50 pl E. coli K12
RV308/pIT337 sejtkivonat	22
100 m1 E. coli K12
RV308/pIT337 sejtkivonat	27
150 m1 E. coli K12
RV308/pIT337 sejtkivonat	29

Az összes penicillinázzal

-1835

HU 202279 Β kezelt minta 0

E. coli K12 RV308/pCZ106 sejtkivonat-kontroll 0

Kontrollreakciók szubsztrátum nélkül 0

Bár a vizsgálat linearitása, ahogyan zónamérettel mérjük, jellegzetesen lezuhan, amikor a zónaniéret 21 mm fölé megy, a vizsgálat eredményei világosan jelzik, hogy az E. coli K12 RV308/pIT337 transzformánsok izopenicillin N-szintetáz aktivitást fejeznek ki; mig ugyanezt az E. coli K12 RV308/pCZ106 transzformánsok nem teszik.

Az E. coli által termelt anyag lényegében stabilabb, mint a Cephalosporium acremoniumból származó izopenicillin N-szintetáz. Ezt a nagyobb stabilitást először a fagyasztási-felengedtetési kísérletekben figyeljük meg. A C. acremonium izopenicillin N-szintetáz aktivitás gyorsan Ínaktiválódik újra fagyasztásra és újra felengedtetésre, de a jelen találmány szerinti, E. coli által termelt izopenicillin N-szintetáz aktivitás elég ellenálló a fagyasztásra és felengedtetésre.

A nagyobb stabilitás valószínűleg a C. acremonium és E. coli enzimek közti feldolgozási különbségekből ered. így pl. a C. acremoniumból izolált izopenicillin N-szintetáz aktivitás, úgy tűnik, nem rendelkezik az első két amino-terminális aminosavgyökkel, a metioninnal és glicinnel, amelyek pedig a C. acremonium izopenicillin N-szintetáz aktivitást kódoló DNS-ben kódolnak, és amelyek jelen vannak az E. coli által termelt, jelen találmány szerinti anyagban is. Amint Tsunasawa és munkatársai kifejtették [J. of Bioi. Chem, 260 (9), 5382-91 (1985)1, az E. coli termel egy peptidet, amely lehasitja a fehérje amino-terminális metionin-gyökét, amikor a következő gyök viszonylag kis oldallánccal rendelkezik. Az 1PS fehérjékben az amino-terminális metionint glicin gyök követi, így az amino-terminális metionin lehasad.

Tekintettel az E. coli által termelt izopenicillin N-szintetáz aktivitás nagyobb stabilitására és eltérő aminosavgyők-szekvenciájára, a jelen találmány magában foglal egy új fehérjét is, az E. coli által termelt izopenicillin N-szintetázt.

4. példa

A pPS20 plazmid megalkotása

A. A HindlII által emésztett pIT335 plazmid előállítása μί, IB. példa szerint készített pIT335 plazmid DNS-t, amely 5 pg plazmid DNS-nek felel meg, adunk 5 μί 10 x Hindlll reakciópufferhoz (500 mmól/liter NaCl; 500 mmól/liter trisz-HCl, pH = 8,0; 100 mmól/liter MgClz; és 1 mg/ml BSA), 5 μΐ (- 50 egység) Hindlll restrikciós enzimhez és 35 μί H20-hoz, és 20 összekeverjük ezeket. Az így létrejött reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten 4 órán át kevertetjük, A Hindlll-al emésztett pIT335 plazmid DNS-t extraháljuk egyszer fenollal majd extraháljuk egyszer CHCb-al. Az extrakciók után a HindlU-al emésztett plT335 plazmid DNS-t 0,25 mól/literessé tesszük NaCl-re, hígítjuk két térfogat abszolút etanollal, szárazjég-etanol fürdőben lehűtjük, majd a kicsapódott DNS-t centrifugálással összegyűjtjük. Az ezzel az eljárással nyert - 5 pg, Hindlll-al emésztett pIT335 plazmid DNS-t 10 ml TE pufferban feloldjuk és -20 °C hőmérsékleten tároljuk.

A pIT221 plazmid emésztése és a pIT221 plazmid ~ 2,7 kb-s HindlII restrikciós fragmenseinek izolálása, amely a higromicin rezisztencia átadó gént tartalmazza

A 4 762 786 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás magában foglalja a Cephalosporium acremonium vektorjait és a transzformálásához szükséges körülményeket. A fenti amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás 1-6. folyamatábrái és 1-6. példái, amelyek ebbe a bejelentésbe referenciaként be vannak építve, magukban foglalják a plT221 plazmid megalkotását. A pIT221 plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül a 4. ábra mutatja be.

A pIT221 plazmidot E. coli K12 JA221/pIT221-ból izoláljuk, lényegében a jelen bejelentés 1. példájában leirt eljárással összhangban. Mintegy 50 pg pIT221 plazmidot emésztünk 100 μί 1 x Hindíll reakciópufferban 100 egység Hindlll restrikciós enzimmel lényegében a 4.A. példa eljárásával összhangban. A HindlU-al emésztett pIT221 plazmid DNS extrahálása, kicsapása és újraoldása után a 4A. példa szerinti eljárással összhangban, a DNS-t 1%-os agaróz gélre terheljük elektroforézis céljából. A pIT221 plazmid kívánt ~ 2,7 kb-s Hindlll restrikciós fragmensét, amely a Saccharomyces cerevisiae élesztő foszfoglicerát kinéz átíró és transzlációs aktiváló szekvenciáját tartalmazza és amely egy higromicin rezisztencia átadó foszfotranszferáz enzimet kódol, izoláljuk és tisztítjuk a gélből és más emésztési termékektől, lényegében a 2B. példa szerinti eljárással összhangban.

A kívánt - 2,7 kb-s Hindlll restrikciós fragmensbő) mintegy 5 ug-ot izolálunk a fenti módszerrel. A nyert tisztított fragmenst 10 μί TE pufferban oldjuk έε -20 °C hőmérsékleten tároljuk.

C. A pPS20 plazmid végső megalkotása

Mintegy 1 μί, 4A. példa szerint készített, Hindlll-al emésztett pIT335 plazmid DNS-t és 4 μί, 4B. példa szerint készített, pIT221 plazmid-eredetü ~ 2,5 kb-s Hindlll restrikciós fragmenst ligálunk 30 μΐ ligáló

-1937

HU 202279 Β pufferban 100 egység T4 DNS ligázzal lényegében a 2C. példa szerinti eljárással összhangban. A ligáit DNS alkotja a kívánt pPS20 plazmidot. A pPS20 piazmid restrikciós helyés működési térképét a mellékelt ábrák közül az 5. ábra mutatja be.

A - 2,7 kb-s Hindlíl restrikciós fragnienst két orientációban iktathatjuk be a pIT335 plazmidba, így a ligáit DNS alkot egy másik plazmidot is, amelyet pPS20.1-el jelölünk. A pPS20.1 funkcionálisan ekvivalens a pPS20 plazmiddal, a pPS20 plazmidtól csupán a - 2,7 kb-s HindlII restrikciós fragmens orientációja tekintetében különbözik.

D. Az E. coli K12 JA221/pPS20 megalkotása és a pPS20 DNS izolálása

E. coli K12 JA221 (NRRL B-15211) 50 ml-es tenyészetét növesztjük L-tópközegen, amíg az O.D.sso érték eléri a ~ 0,2-t. A tenyészetet jégen 10 percen át hűtjük, és a sejteket centrifugálással összegyűjtjük. A sejtüledéket 25 ml hideg, 100 mmól/literes CaClz-ben újra szuszpendáljuk és 25 percen át jégen hűtjük. A sejteket még egyszer üledékbe visszük centrifugálással, és az üledéket 2,5 ml hideg, 100 mmól/literes CaCl2-ben újra szuszpendáljuk, és jégen inkubáljuk egy éjszakán át.

Ennek a sejtszuszpenziónak 200 μΙ-ét összekeverjük a 4C. példában készített ligáit DNS-el, és jégen inkubáljuk 20 percen át. A keveréket ezután 40 °C hőmérsékleten inkubáljuk 2 percen át, ezt követi egy 10 perces inkubálás szobahőmérsékleten. 3 ml L-tópközeget adunk a sejtkeverékhez, majd a sejteket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk két órán át, levegö-rázógépen.

A sejtkeverék bői alikvotokat viszünk fel L-agar lemezekre (L-tápközeg, 15 g/1 agárral), amelyek még 100 ug/ml ampicillint is tartalmaznak, és a lemezeket azután 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Az E. coli K12 JA221/pPS20 transzformánsokat az ampicillin-rezisztens transzformánsok piazmid DNS-ének restrikciós enzimes elemzésével igazoljuk. A piazmid DNS-t az E. coli K12 JA221/pPS20 és E. coli K12 JA221/pPS20.1 transzforinánsokból lényegében az 1. példában leírt folyamattal összhangban nyerjük ki, de kisebb méretekben, és a CsCl gradiens lépést elhagyjuk.

5. példa

A pPS21 piazmid megalkotása

A. A pIT335 piazmid DNS Ncol emésztése és Klenow-kezelése, és az igy létrejött - 0,85 kb-s fragmens izolálása, amely a Cephalosporium acremonium átíró és transzlációs aktiváló szekvenciáját kódolja

Mintegy 50 ul (50 ug-nak megfelelő), 1. példa szerint előállított pIT335 piazmid DNS-t adunk 10 ul 10 x őa/jiHl pufferhez, 5 ul (~ 50 egység) Ncol restrikciós enzimhez és 35 μΐ H20-hoz, és összekeverjük ezekkel. Az igy létrejött reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 4 órán ét. A reakciókeveréket ezután 0,25 mól/literessé tesszük NaCl-re, két térfogat abszolút etanoilal higitjuk, 10 percig szárazjég-etanolos fürdőben hütjük, és centrifugáljuk a kicsapott DNS üledékbe vitele érdekében.

Az Ncól-el emésztett plT335 piazmid DNS üledéket 50 μΐ Klenow-pufferban feloldjuk (40 mmól/liter kálium-foszfát puffer, pH = = 7,5; 6,6 mmól/liter MgCh; 1,0 mmól/liter 2-merkapto-etanol; 33 umól/liter dATP; 33 umól/liter dCTP; 33 umól/liter dGTP; és 33 umól/liter TTP). 2 ul (- 10 egység, New England Biolabs) E. coli DNS polimeráz nagy fragmenst, amelyet Klenow-fragmensként ismerünk, adunk hozzá és összekeverjük a DNS-sel, és az így létrejött reakciókeveréket 16 °C hőmérsékleten inkubáljuk 1 órán át. A reakciót pufferolt fenollal végzett extrahálással fejezzük be.

Az Ncol-el emésztett, Klenow-kezelt pIT335 piazmid DNS-t ezután 1%-os agaróz gélre terheljük elektroforézis céljából. A - 0,85 kb-s restrikciós fragmenst, amely a Cephalosporium acremonium IPS gén átíró és transzlációs aktiváló szekvenciáját tartalmazza, izoláljuk a gélről és tisztítjuk, lényegében a 2B. példában leírtakkal összhangban. Mintegy 4 ug kívánt fragmenst nyerünk, ezt 10 ul TE pufferban szuszpendáljuk.

B. A pPS19 köztes piazmid megalkotása ug plT221 piazmid DNS-t feloldunk 5 ul 10 x Xmal pufferban (250 mmól/liter NaCl; 60 mmól/liter trisz-HCl, pH = 7,5; 60 mmól/liter MgCh; 60 mmól/liter 2-merkapto-etanol; és 1 mg/ml BSA), 43 ul HíO-ban és 2 ul (~ 10 egység) Xmáí restrikciós enzimben. Az igy .létrejött reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 4 órán át. A reakciót fenolos extrakcióval állítjuk le. Az A'mal reakciókeverék további, kloroformoe extrakciója után a reakciókeveréket NaCl-re 0,25 mól/literessé állítjuk be, felhígítjuk 2 térfogat abszolút etanoilal, 10 percen ét hűtjük szárazjég-etanolos fürdőben, és a kicsapott, Xmal-el emésztett pIT 221 piazmid DNS-t centrifugálással üledékbe visszük.

-2039

HU 202279 Β

Az A'mal-el emésztett pIT221 DNS plazmidot újra feloldjuk 100 μΐ 1 x ligáló pufferban, amely még 500 egység T4 DNS ligázt is tartalmaz. A ligálási reakciókeveréket 12 °C hőmérsékleten inkubáljuk ~ 16 órán át, majd E. coli K12 JA221 transzformálására használjuk fel, lényegében a 4D. példa eljárása szerint. Az ampicillin-rezisztens pPS19 plazmid transzformánsokat a transzformánsok plazmid DNS-ének restrikciós enzimes elemzésével azonosítjuk. A pPS19 plazmid DNS-t lényegében az 1. példa eljárásával összhangban állítjuk eló. A pPS19 plazmid restrikciós helyés működési térképét a mellékelt ábrák közül a 6. ábra mutatja be.

C. A pPS19 plazmid DNS BamHI-emésztése és Klenow-kezelése, valamint a - 7,7 kb-s fragmens izolálása ug pPS19 plazmid DNS-t emésztünk BamHI restrikciós enzimmel és kezelünk Klenow-fragmenssel, lényegében a 4A. példa eljárásával összhangban, de azzal a kivétellel, hogy Ncól restrikciós enzim helyett BamHI restrikciós enzimet alkalmazunk. A BamHI-vel emésztett, Klenow-kezelt pPS19 plazmid DNS-t 1%-os agaróz gélre terheljük, és a ~ 7,7 kb-s fragmenst izoláljuk és tisztítjuk, lényegében a 2B. példa eljárása szerint. Mintegy 5 Mg kivánt fragmenst nyerünk, amelyet feloldunk 10 m1 TE pufferben, és -20 °C hőmérsékleten tároljuk.

D. A pPS21 plazmid végsó megalkotása ul, 5A. példa szerint készített ~ 0,85 kb-s fragmenst ligálunk 2 ul, 5C. példa szerint készített ~ 7,7 kb-s fragmenshez, 30 1 1 x ligáló pufferban, amely 500 egység T4 ligázt is tartalmaz. A ligálási reakciókeveréket 12 °C hőmérsékleten, 16 órán át ligáljuk, és a ligáit DNS alkotja a kivánt pPS21 plazmid DNS-t.

E. Az E. coli K12 JA221/pPS21 megalkotása

Az 5D. példa szerint készített, ligáit DNS-t használjuk fel E. coli K12 JA221 transzformálására, lényegében a 4D. példa szerinti eljárással összhangban. Az ampicillin-rezisztens transzformánsokat átvizsgáljuk pPS21 plazmid jelenlétére a transzformánsok plazmid DNS-ének restrikciós enzimes elemzésével. Mivel a - 0,85 kb-s fragmens egy vagy két orientációban iktatódhat be a pPS19 plazmid ~ 7,7 kb-s fragmensébe, és mivel csak az egyik orientáció helyezi el megfelelően a Cephalosporium acremonium átíró és transzlációs aktiváló szekvenciáját a higromicin-rezisztencia átadó-gén kifejeződéséhez, a transzformánsok nak csak mintegy fele a kívánt E. coli K12 JA221/pPS21. Egy ilyen E. coli K12 JA221/pPS21 transzformánst alkalmazunk a pPS211 DNS készítésére, lényegében az 1. példában leírt eljárással összhangban.

6. példa

A Cephalosporium acremonium genetikai transzformációja a pPS20 és pPS21 plazmidokkal

A 4 762 786 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás magában foglalja és igénypontokban megfogalmazza az itt következő transzformációs folyamatot.

A. Cephalosporium acremonium törzsek

A transzformáláshoz alkalmazott előnyös Cephalosporium törzset az American Type Culture Collection-tól (Rockville, Marylandi nyerjük, ahol az az ATCC 11550 letéti számon található. Egyéb Cephalosporium törzsek, vagy az ATCC 11550-ből cefalosporin C megnövelt termelése céljából mutációval, szelekcióval vagy genetikai nemesítéssel kialakított bármilyen kereskedelmi forgalomban levő törzs is alkalmasak transzformánsok előállítása céljából a jelen találmány szerinti vektorokkal és plazmidokkal.

B. Inokulum készítése a sejt tenyésztéséhez

Hogy genetikailag hatékonyan transzformáljuk a Cephalosporium acremonium sejteket, el kell távolítani a sejtfalakat, hogy stabil protoplasztokat képezzünk. Az ilyen protoplasztok készítésében nagyon előnyös egységes inokulummal kezdeni. Egyébként a sejtek előállítása tenyészetben nem reprodukálható, és nagy időveszteség kísérletezni C. acremonium protoplasztok előállításával alkalmatlan vagy nem elegendő mennyiségű sejtekből.

C. Egyforma inokulum készítése a sejttenyészetekhez

Egy ampullányi spórát (mintegy 10⁹ konidium 1,5 ml fenntartó közegben: 5% laktóz, 10% glicerin, és 0,1% Tween 80), vagy liofilezett, vagy folyékony nitrogénes tárolóból kivett és szobahőmérsékleten felengedtetett mintát, 5 ml steril fiziológiás sóoldattal felhígítunk. Ebből a szuszpenzióból “mintegy 0,1 ml-t használunk mintegy 50 ferde agar tenyészet beoltásához, az egyes tenyészetek 20 ml Trypticase-Soy-Agar (BBL™, Division of Becton, Dickinson and Company, Cockeysville, Maryland 21030) tápközeget tartalmaznak. Inokulálás előtt a tápközeget száradni hagyjuk, amíg a felület nedvessége már nem látható. Az inokulált lemezeket mintegy négy

-2141

HU 202279 Β napon át inkubáljuk 25 °C hőmérsékleten. Mintegy 10 ml fenntartó tápközeget (lásd fentebb) adunk a micéliumosan növekvő tenyészethez, amely elfedi a tápközeget az egyes ferde agar tenyészetekben. A ferde agar tenyészeteket Vortex-berendezésen homogenizáljuk, hogy a konidiumokat felszuszpendáljuk, és az egyes ferde agarokból származó konidiális szuszpenziókat egyesítjük, majd ebből 10 ml-es alikvotokat fagyasztunk le -80 °C hőmérsékleten. A lefagyasztott konidiális szuszpenzió lassan elveszti életképességét, és ezért nem szabad felhasználni mintegy három hónapos, -80 °C-on végzett tárolás után.

D. A sejtek növesztése protoplaszt készítéséhez

Mintegy 106 ml vizes tápközeget, amely 20 500 ml-es rázóiombikban található, inokulálunk 10 ml, 6C. példa szerint előállított, fagyasztott konidiális szuszpenzióval. A sejteket centrifugálással (10 perc, 2600 fordulat/perc) nyerjük ki, majd közvetlenül szusz- 25 pendáljuk a vizes tápközegbe (összetételét lásd alább). A felülúszó dekantálása a szuszpendálás előtt szükséges, mivel a laktóz és a glicerin ellentétesen hatnak a sejtek növekedésére. A szuszpendált sejteket tartalmazó 30 lombikot forgó, vízfürdős rázógépre helyezzük, és 29-30 °C hőmérsékleten 24 órán át inkubáljuk, a rázógép fordulatszáma 285 fordulat/perc, a kitérés 2,54 cm. A 29-30 °C ajánlott hőmérséklet különösen előnyös a transzformálható protoplasztok készítéséhez, de alacsonyabb, pl. 25 °C hőmérséklet szintén megfelelő. Azok, akik a szakterületen jártasak, felismerik, hogy a 29-30 °C hőmérséklet eltér attól a hőmérséklettől, amelyet a 40 Cephalosporium acremonium tenyésztéséhez alkalmaznak az antibiotikum-termelés céljaira (25 °C).

A fenti vizes tenyésztő tápközeget a következőképpen készítjük el: 100 ml A olda- 45 tót bemérünk egy 500 ml-es rázólombikba; a lombikot kereskedelemben kapható zárósapkával lefedjük és 121 °C hőmérsékleten 20 percig autoklávozzuk. 2 ml B oldatot és 4 ml C oldatot adunk ez után az A oldathoz, így kapjuk meg a vizes tenyésztő tápközeget.

A oldat: 36 g/liter szacharóz; 7,5 g/liter L-aszparagin; 15 g/liter KH2PO4; 21 g/líter K2HPO4; 0,75 g/liter NazSCri; 0,18 g/liter MgSO4.7HzO; 0,06 g/liter CaCh; 1 ml/liter sóoldat, természetesen beálló pH. A sóoldat összetétele: 15 g/liter Fe(NH4) (SO4)2.6HzO;

g/liter MnSO4.4H2O; 3 g/liter ZnSO4.7H2O;

0,8 g/liter CuSO4.5H2O.

B. oldat: 108 g/liter glükóz (121 °C hőmérsékleten 30 percig autoklávozva).

C. oldat: 25 g/liter szacharóz; 12,5 ml kukoricalekvár (4 súly/térfogat% nitrogén):

5,5 g/liter ammónium-acetát; 5 g/liter CaCO3, a pH KOH-val 6,5-re beállítva; autoklávozva 121 °C hőmérsékleten 20 percen át.

E. Cephalosporium protoplasztok készítése órás tenyészetből sejteket nyerünk ki szívással végzett szűréssel (Whatman N- 1 5 papír, Bűchner-tölcsérben), és Mcllvaine pufferben szuszpendáljuk, pH = 7,1 (0,1 mól/liter citromsav és 0,2 mól/liter dinátrium-hidrogén-foszfét), amelyhez ditiotreitolt is adunk 0,01 mól/liter koncentrációban. 10 Annyi puffért adunk hozzá, hogy a végső sejtkoncentráció (a leszívott szűrlet lemérése után) 1 g sejlmassza/20 ml puffer legyen. A sejtszuszpenziót forgó, vízfürdős rézógépen elhelyezett 50 ml-es rázólombikba helyezzük, 15 és 29-30 °C hőmérsékleten inkubáljuk 90 percen keresztül, 140 fordulat/percnél, 2,54 cm kitéréssel. A ditiotreitollal kezelt sejteket vizzel mossuk, majd újra szuszpendáljuk enzimoldatban [25 mg/ml béta-glükuronidáz (Sigma Chemical Company) Mcllvaine pufferban, pH = 6,35, kiegészítve 0,8 mól/liter NaCl és 0,02 mól/liter MgSŰ4 koncentrációra). A végső sejtkoncentréció 1 g kezelt sejttömeg/10 ml enzimoldat. A sejtszuszpenziót forgó, vízfürdős rázógépre helyezzük, és 29-30 °C hőmérsékleten rázatjuk 3 órán át, 120 fordulat/percnél, 2,54 cm kitéréssel. A protoplasztok szuszpenzióját 4 térfogat mosóoldattal (0,8 mól/liter NaCl, 0,02 mól/liter MgSO4) hígítjuk, azután csak a nehézségi erő segítségével szűrjük két réteg papirtörölközőn át. A protoplasztokat tartalmazó szűrletet szobahőmérsékleten 5 percen át centrifugáljuk 2600 fordulat/perccel. A felül35 úszót dekantáljuk, és a protoplasztok üledékét 10 ml mosóoldatban szuszpendáljuk. A mosási eljárás kétszeri megismétlése után a protoplasztokat újra szuszpendáljuk annyi 0,8 mól/literes NaCl oldatban, hogy elérjük a 2-3.10* protoplaszt/ml koncentrációt, a sejtszámot hemacitometerrel számolva.

F. Transzformációs folyamat

Minden transzformálandó plazmid hoz ml Cephalosporium protoplaszt szuszpenziót (0,8 mól/literes NaCl-ben) adunk 0,005 ml frissen desztillált DMSO-hoz, (dimetil-szulfoxid) és a keveréket CaCl2-re 80 mmól/lite50 réssé tesszük. Mintegy 20 Mg transzformáló plazmidot, vagy pPS20-at, vagy pPS21-et (a transzformálástól függően) és polietilénglikoi 4000-t (Baker, >20 tőmeg/térfogat vízben) adunk a protoplasztok szuszpenziójához, 55 hogy 10 ml keveréktérfogatot érjünk el. A keveréket 10 percen át inkubáljuk szobahőmérsékleten, majd 700 fordulat/percnél centrifugáljuk 5 percen át, ezt követi egy centrifugálás 2500 fordulat/percnél 10 percen át. 60 A protoplasztok üledékét 1 ml 0,8 mól/literes NaCl-ben szuszpendáljuk. 0,1 ml-es alikvotokat terítünk szét Trypticase-Soy Agar (BBL) tápközeg felületére, amely tápközeget 10,8% szacharózzal dúsítottunk, hogy ozmotikusán 65 stabilizáljuk a protoplasztokat. Miután a Pet23

-2243

HU 202279 Β ri-csészéket 15 °C hőmérsékleten 24 órán ét inkubáltuk, 4 ml folyékony agart (0,41 tömeg/térfogat %, 42 “C hőmérsékleten), amely 0,8 mól) liter nátrium-kloridot és 100 Mg/ml végső koncentráció elérésére elegendő higromicint tartalmaz, adunk az egyes Petri-csészékhez. Miután a felső réteg megszilárdult, a Petri-csészéket 25 °C hőmérsékleten inkubáljuk nedvesített kamrában. Bár az altenyészetekhez való megfelelő méretű transzformáns telepek 12 nappal a transzformálás után már jelen vannak, a transzformánsok lassú növekedése eltarthat akár 60 napig is, hogy elérjük az altenyészetekhez alkalmas megfelelő méretet. A korcs transzformánsok könnyen megkülönböztethetők a stabil transzformánsoktól, mivel a korcs transzformánsok nem növekednek altenyészeteken olyan friss tápközegeken, amelyek 100 Mg/ml higromicint tartalmaznak.

G. Cephalosporium acremonium/pPS20 és C. acremonium pPS21 transzformánsok elemzése

A Cephalosporium acreraonium/pPS20 transzformánsok szignifikánsan nagyobb szinten fejeznek ki izopenicillin N-szintetáz aktivitást, mint a kontroll plazmidok C. acremonium transzformánsai, mint pl. a pIT221 plazmid. Ez a magasabb aktivitási szint a transzformánsok megnövekedett képességét eredményezi izopenicillin N előállítására, akár fermentáció folyamán, akár a C. acremonium/pPS20 transzformánsok sejtextraktumaiban.

A Cephalosporium acremonium/pPS21 transzformánsok higromicin-rezisztensek, amelyek jelzik a jelen találmány szerinti C. acremonium átíró és transzlációs aktiváló szekvencia működőképességét.

7. példa

A pPS21A, pPS22, pPS23.1, pPS24, pPS25, és pPS25.1 plazmidok megalkotása

A. A pPS23 és pPS23.1 köztes plazmidok megalkotása (i) őamHI-vel emésztett pUC8 plazmid előállítása

Mintegy 5 Mg pUC8 plazmidot (amelyet a Pharmacia P-L Biochemicals-tól kaphatunk) feloldunk 5 m1 10 x BamHI reakciópufferban és 40 m1 H20-ban. Mintegy 5 m1 (50 egység) őamHI restrikciós enzimet adunk a DNS oldatához, és az igy létrejött reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 2 órán át. A reakciót pufferolt fenollal extrahálva állítjuk le, ezt követi a kloroformos extrahálás. A Ba/nHI-val emésztett pUC8 DNS-t úgy csapjuk ki, hogy 0,25 mól/liter koncentráció eléréséig NaCl-t adunk hozzá, majd két térfogat etanolt, és a keveréket -70 °C hőmérsékleten hütjük 10 percen át. A BamHI-el emésztett 24 pUC8 plazmid DNS-t centrifugálással összegyűjtjük és 5 m1 HzO-ban újra szuszpendéljuk.

(ii) A pIT335 plazmid ~ 0,85 kb-s Ncol fragmensének izolálása

Mintegy 10 Mg pIT335 plazniidot feloldunk 5 pl 10 x BamHI pufferban és 40 μ1 IkO-ban. Mintegy 5 μ! (50 egység) Ncol restrikciós enzimet adunk a DNS oldathoz, és az igy létrejött reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 2 órán át. A reakciókeveréket ezután 1%-os agaróz gélre terheljük, és a kívánt ~ 0,85 kb-s Ncöl restrikciós fragincnst, amely tartalmazza az IPS gén átíró és transzlációs aktiváló szekvenciáját, izoláljuk, lényegében a 2B. példa szerinti eljárással összhangban. Mintegy 1 Mg kívánt fragmenst nyerünk, ezt 5 μ1 H20-ban szuszpendáljuk.

(iii) A pPS23 plazmid megalkotásában használt kapcsoló (linker) előállítása

A kővetkező kapcsoló egyes szálait szintetizáljuk, automatizált DNS szintetizátort alkalmazva.

5’ -CATGAAGAAG-3’

3' - T T C T T C C T A G - 5'

A kapcsoló egy szálából 75-75 pikomólt egyenként feloldunk 22,5 m1 H20-ban és 2,5 m1 ligáz-pufferban. Mintegy 1 μ1 (10 egység) T4 DNS kinázt (Bethesda Research Laboratories) adunk az egyszálú DNS-ek mindegyik oldatához, és a reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 10 percen át. A kináz reakciót követően a reakciókeveréket 70 °C hőmérsékleten inkubáljuk 15 percen át. Ezután, hogy az egyszálú DNS-eket öszszeforrasszuk a kapcsoló kialakítása érdekében, a két reakciókeveréket egyesítjük, 65 °C hőmérsékleten inkubáljuk 10 percen át, majd szobahőmérsékleten 2 órán át inkubáljuk, végül 4 °C hőmérsékleten inkubáljuk egy éjszakán ét.

(iv) A pPS23 és pPS23.1 plazmidok végső megalkotása μ! Őa/nHI-vel emésztett pUC8 plazmid DNS-t adunk egy olyan keverékhez, amely 4 pl pIT35 plazmid ~ 0,85 kb-s Ncöl restrikciós fragmensből és 10 pl összeforrasztott kapcsolóból áll. Mintegy 4 μΐ 10 x ligáz puffért, 2 μ1 (500 egység) T4 DNS ligázt és 29 m1 H2O-t adunk a DNS keverékhez, és az így létrejött reakciókeveréket egy éjszakán át inkubáljuk 4 °C hőmérsékleten. A ligáit DNS alkotja a kívánt pPS23 és pPS23.1 plazmidokat.

E. coli K12 JM109 (amely a Pharmacia P-L Biochemicals-nál rendelkezésre áll) 50 ml-es tenyészetét L-tápközegben növesztjük, amíg a mintegy 0,5 abszorpciós egység értéket O.D.590-re el nem érjük. A tenyészetet jégen hütjük 10 percen át, és a sejteket centrifugálással összegyűjtjük. A sejtüledéket újra szuszpendáljuk 25 ml hideg,

-2345

HU 202279 Β

100 mmól/literes CaCh oldatban, és jégen inkubáljuk 25 percen át. A sejteket még egyszer üledékbe visszük centrifugálással, és az üledéket újra szuszpendáljuk 2,5 ml hideg, 100 mmól/literes CaCh oldatban, majd egy éjszakán át jégen inkubáljuk.

Ebből a sejtszuszpenzióból 200 pl-t öszszekeverünk a fentebb készített ligáit DNS-el, és jégen inkubáljuk 20 percen ét. Ennek az időszaknak a végén a sejteket 42 °C hőmérsékletű vízfürdőbe helyezzük 2 órára, majd visszatesszük jégre további 10 percre. A sejteket centrifugálással összegyűjtjük és újra szuszpendáljuk 1 ml L-tápközegben, és 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 2 órán át.

A sejtkeverék alikvotjait L-agar lemezekre (L-tápközeg 15 g/liter agarral) szélesztjük, a lemezek 100 Mg/ml ampicillint, 40 Mg/ml X-gal-t és 40 Mg/ml IPTG-t is tartalmaznak. A lemezeket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk egy éjszakán át. A telepek, amelyek beiktatott rész nélküli plazmidot tartalmaznak, mint pl. az E. coli K12 JM109/pUC8, kéknek látszanak ezeken a lemezeken. Azok a telepek, amelyek beiktatott résszel rendelkező plazmidot tartalmaznak, mint pl. az E. coli K12 JM109/pPS23, fehérek. Számos fehér telepet választunk ki és vizsgálunk át az IPS aktiváló szekvenciát tartalmazó - 0,85 kb-s BamHI restrikciós fragmens jelenlétére, plazmid DNS-eik restrikciós elemzése alapján. A plazmid DNS-t az E. coli K12 JM109/pPS23 és E. coli K12 JM109/pPS23.1 sejtekből nyerjük ki, lényegében a 2A. példában található kitanítással összhangban.

B. A pPS23 plazmid - 0,85 kb-s BamHI restrikciós fragmensének izolálása

Mintegy 50 pg pPS23 plazmid DNS-t feloldunk 15 m1 10 x BamHI reakciópufferban és 125 pl H2O-ban. Mintegy 10 pl (100 egység) BamHI restrikciós enzimet adunk a DNS oldatához, és az igy létrejött reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 2 órán át. A üfimHI-vel emésztett pPS23 plazmid DNS-t IX-os agaróz gélre terheljük, és a - 0,85 kb-s BamHI restrikciós fragmenst, amely tartalmazza az IPS gén aktiváló szekvenciáját, izoláljuk, lényegében a 2B. példa eljárásával összhangban. Mintegy 5 pg kívánt fragmenst nyerünk, ezt 10 pl vizben szuszpendáljuk.

C. BamHf-eJ emésztett pPS19 DNS előállítása

Mintegy 5 pg pPS19 plazmid DNS-t feloldunk 10 pl 10 x BamHI reakciópufferban és 35 pl HzO-ban. Mintegy 5 pl (50 egység) BamHI restrikciós enzimet adunk a pPS19 plazmid DNS oldatához, és az így létrejött reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 2 órán át. A BamHl-el emésztett pAS19 plazmid DNS reakciókeverékét egyszer pufferolt fenollal, majd kétszer fenollal extraháljuk. A DNS-t ezután kicsapjuk, centrifugálással összegyűjtjük, és újra szuszpendáljuk pl HíO-ban.

D. A pPS21A, pPS22, pPS24, pPS25 és pPS25.1 végső megalkotása

Mintegy 1 pl ~ 0,85 kb-s BamHI restrikciós fragmenst adunk 1 pl, BamHI-vel emésztett pPS119 plazmid DNS-hez, 3 pl 10 x ligáz pufferhoz, 2 pl T4 DNS ligázhoz, és 23 pl HíO-hoz. Az igy létrejött reakciókeveréket 15 °C hőmérsékleten inkubáljuk egy éjszakán át. A ligáit DNS alkotja a kívánt pPS21A, pPS22, pPS24, pPS25 és pPS25.1 plazmidokat.

A ligáit DNS-t használjuk fel E. coli K12 C600 törzs transzformálására, lényegében a 7A példa (iv) fejezetében található eljárással összhangban. Az alkalmazott E. coli törzs az American Type Cultura Collection-nál (Rockville, Maryland 20852) rendelkezésre áll az ATCC 33525 letéti szám alatt. A transzformált sejteket L-agar lemezekre, amelyek 100 pg/ml ampicillint is tartalmaznak, helyezzük és a lemezeket 37 °C hőmérsékleten egy éjszakán át inkubáljuk.

A transzformációs lemezekről egyedi telepeket szúrunk fel, tenyésztjük ezeket, és felhasználjuk ezeket plazmid DNS előállítására. A plazmid DNS-t restrikciós enzimes analízissel elemezzük. A következő táblázat mutatja be a megfelelő restrikciós enzimes emésztéseket, amelyeket lehet használni, hogy megkülönböztessük a plazmidokat.

Plazmid	Enzim	A fragmensek (kb-ban)	méretei
pPS19	BamHI Psü	7,62 és 0,23 5,15; 1,85 és 0,85
PPS21A	BamHI	7,62 és 0,85
	Psü	5,15; 1,85; 0,99 és	0,49
pPS22	BamHI	7,62 és 0,85
	Psü	5,15; 1,85; 0,94 és	0,54
pPS24	Baoáil Psü	7,62 7,62
pPS25 és	BamHI	5,15; 1,85; 0,99 és	0,72
pPS25.1	Psü	7,62; 0,85 és 0,23

A pPS21A illetve pPS25 plazmidok restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül a 8. illetve 9. ábrák mutatják be.

A pPS21A, pPS25.1 és pPS25 plazmidokat Cephalosporium acremonium transzformálására alkalmazzuk, lényegében a 6. példa eljárásával összhangban. A C. acremonium/pPS21A, C. acremonium/pPS25.1 és C. acremonium/pPS25 transzformánsok higromicin-rezisztensek. A 25

-2447

HU 202279 Β pPS22 és pPS24 plazmidokat szintén alkalmazzuk C. acremonium transzformálására, de ezek a plazmidok a C. acremoniumot higromicin rezisztenciára sokkal kisebb gyakorisággal transzformálják, mint ahogyan ezt a PPS21A, pPS25.1 és pPS25 plazmidok teszik, valószínűleg azért, mert a pPS22 és pPS24 plazmidok nak a C. acremonium-genomba a megfelelő helyzetben kell integrálódniok genomos C. acremonium aktiváló szekvenciaként, hogy a higromicin rezisztencia-átadó gén kifejezését előrevigyék.

8. példa

A pPS28 és pPS29 plazmidok megalkotása

A pPS21A plazmid DNS 20 μΐ-ét feloldjuk 10 ul 10 x PstI reakciópufferban (1,0 möl/liter NaCl; 100 mmól/liter trisz-HCl, pH = 7,5; 100 mmól/liter MgClz; és 1 mg/ml BSA) és 88 ul H2O-ban. Mintegy 2 ul (150 egység) PstI restrikciós enzimet a DNS oldathoz adjuk, és a reakciókeveréket 37 “C hőmérsékleten 4 percen át inkubáljuk, majd a reakciókeveréket 70 °C hőmérsékleten, 10 percen át végzett inkubálással állítjuk le. A részlegesen Pstl-el emésztett pPS21A plazmid DNS-t agaróz-gélre terheljük, és elektroforézis, valamint a gél megfestése után a kővetkező fragmenseket figyeljük meg: 8,5 kb (linearizált plazmid); 8,0 kb; 7,5 kb; 7,0 kb; 6,6 kb; 6,1 kb; 5,2 kb; 3,3 kb; 2,3 kb; 1,9 kb; 1,5 kb; 1,0 kb; és 0,5 kb. A - 6,6 kb-s és 6,1 kb-s PstI restrikciós fragmenseket egyedileg izoláljuk, lényegében a 2B. példa eljárásával összhangban; mintegy 0,5 ug-ot nyerünk ki mindkét fragmensből.

A ~ 6,6 kb-s PstI restrikciós fragmenst feloldjuk 3 ul 10 x ligáz pufferban és 25 ul HzO-ban. Mintegy 2 ul T4 DNS ligázt adunk a DNS-oldathoz, és az igy létrejött reakciókeveréket egy éjszakán át inkubáljuk 15 °C hőmérsékleten. A ligáit DNS alkotja a kivánt pPS28 plazmid DNS-t, amelyet E. coli K12 C600 transzformálására használunk, lényegében a 7. példa eljárásával összhangban. Hasonló módon, a ~ 6,1 kb-s PstI restrikciós fragmenst kór alakúvá tesszük iigálással, a pPS29 plazmidot termelve, amelyet szintén E. coli K12 C600 plazmidba transzformálunk. A pPS28 és pPS29 plazmidok restrikciós helyes működési térképét a mellékelt ábrák közül a 10. illetve 11. ábrák mutatják be.

A pPS28 és pPS29 plazmidokat alkalmazzuk Cephaiosporium acremonium transzformálására, lényegében a 6. példa eljáráséval összhangban. A C. acremonium/pPS28 és C. acremonium pPS29 transzformánsok higromicin-rezisztens fenotipust mutatnak, és a pPS28 és pPS29 plazmid a C. acremoniumot nagy gyakorisággal transzformálja higromicin-rezisztenciára.

9. példa

A pPS26 és pPS26.1 plazmidok megalkotása

Mintegy 20 ug pPS21A plazmidot oldunk fel 10 ul 10 x HindlII reakciópufferban és 85 ul vízben. Mintegy 5 ul (50 egység) HindlII restrikciós enzimet adunk a DNS oldathoz, és az így létrejött reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 2 órán át. A Hindlll-al emésztett pPS21A DNS plazmidot 1%-os agaróz gélre terheljük, és elektroforézisnek vetjük alá, amig a - 3,45 kb-s, - 3,16 kb-s, - 1,2 kb-s és - 0,69 kb-s Hindin restrikciós fragmensek tisztán elkülönülnek a gélen. A ~ 3,45 kb-s HindlII restrikciós fragmenseket lényegében a 2B. példa szerinti eljárással összhangban izoláljuk. Mintegy 5 ug kivánt ~ 3,45 kb-s Hindin restrikciós fragmenst nyerünk, ezt 10 ul H2O-ban szuszpendáljuk.

A pPS21A plazmid - 3,45 kb-s HindlII restrikciós fragmenséböl mintegy 2 ul-t adunk 1 ul, Hindlll-al emésztett pIT335 plazroidhoz (amelyet a 4A példában állítottunk elő), 3 ul 10 x ligáz pufferhez, 22 ul H20-hoz és 2 ul T4 DNS ligázhoz. Az igy létrejött ligációs reakciókeveréket 15 °C hőmérsékleten inkubáljuk egy éjszakán át. A ligáit DNS alkotja a kívánt pPS26 és pPS26.1 plazmidokat. A ligáit DNS-t alkalmazzuk E. coli K12 C600 transzformálására, lényegében a 7. példa eljáráséval összhangban. Az E. coli K12 C600/pPS26 és E. coli K12 C600/pPS26.1 transzformánsokat ampicillin-rezisztens fenotípusok és plazmid DNS-ük restrikciós-elemzése alapján azonosítjuk. A pPS26 plalzmid restrikciós hely- és műveleti térképét a mellékelt ábrák közül a 12. ábra adja meg.

A pPS26 és pPS26.1 plazmidokat használjuk Cephaiosporium acremonium transzformálására, lényegében a 6. példa eljárásával összhangban. A pPS26 és pPS26.1 plazmidok nagy gyakorisággal transzformálják a C. acremoniumot higromicin-rezisztenicéra, és a C. acremonium/pPS26 és C. acremonium/pPS26.1 transzformánsok jelentősen több izopenicillin N-L termelnek - a Micrococcus luteus növekedés gátlási zónái alapján mérve - mint a nem transzformált társaik.

10. példa

A pPS30, pPS30.1, pPS31 és pPS31.1 plazmidok megalkotása

A. A pPS6 plazmid -3,7 kb-s Xmal restrikciós fragmensének izolálása

A pPS6 plazmid a 4 762 786 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban szerepel, a 13. példában, a 72-75. oldalon, ez az irodalmi hivatkozásként van beépítve a jelen bejelentésbe. Mintegy 10 ug

-2549

HU 202279 Β pPS6 plazmidot feloldunk 20 pl 10 x Xmal reakciópufferban (250 mmól/liter NaCl;

100 mmól/liter trisz-HCl, pH = 7,5; 100 mmól/liter MgCh; 100 mmól/liter 2-merkapto-etanol; és 1 mg/ml BSA) és 165 ul H2O-ban. Mintegy 5 15 pl (30 egység) Xmal restrikciós enzimet adunk a pPS6 DNS oldatához, és az igy létrejött reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 4 órán át·

Az Xmal-el emésztett pPS6 plazmid DNS- 10 -t 1%-os agaróz gélre terheljük és elektroforézisnek vetjük alá, amíg a - 3,7 kb-s Xmal restrikciós fragmens tisztán elkülönül a többi emésztési terméktől. A - 3,7 kb-s Xmal restrikciós fragmenst azután izoláljuk, lénye- 15 gében a 2B. példa eljárásával összhangban. Mintegy 5 pg kívánt ~ 3,7 kb-s Xmal restrikciós fragmenst nyerünk, ezt felszuszpendáljuk 10 pl HzO-ban.

B. A pPS30 és pPS30.1 plazmidok végső megalkotása

Mintegy 1 pg pPS21A plazmid DNS-t feloldunk 2 ul 10 x Xmal reakciópufferban és 25 6 pl HíO-ban. Mintegy 2 pl (6 egység) Xmal restrikciós enzimet adunk a pPS21A plazmid DNS oldatához, és az így létrejött reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 4 órán át. A reakciót pufferolt fenollal végzett 30 extrahálással állítjuk le, ezt követi két extrahálás kloroformmal. A reakciókeveréket ezután kicsapjuk, centrifugálással összegyűjtjük és 23 pl ΗϊΟ-ban újra szuszpendáljuk.

A pPS6 plazmid ~ 3,7 kb-s Xmal rest- 35 rikciós fragmenséből mintegy 2 pl-t, 3 pl 10 x ligáz puffért és 2 pl T4 DNS ligázt adunk az Xmal-el emésztett pPS21A plazmid DNS-hez, és az így létrejött reakciókeveréket 15 °C hőmérsékleten inkubáljuk egy éjszakán 40 ét. A ligáit DNS alkotja a kívánt pPS30 és pPS30.1 plazmidokat, amelyek egymástól csupán a ~ 3,7 kb-s Xmal restrikciós fragmens orientációjában különböznek.

A ligáit DNS-t alkalmazzuk E. coli K12 45 C600 transzformálására, lényegében a 7. példa eljárásával összhangban. Az E. coli K12 C600/pPS30 és E. coli K12 C600/pPS30.1 transzformánsokat ampicillin-rezisztens fenotipusok alapján és plazmid DNS-ük restrikci- 50 ós enzimes elemzése alapján azonosítjuk.

A pPS30 és pPS30.1 plazmidokat használjuk Cephalosporium acremonium transzformálására is. A C. acremonium/pPS30 és C. acremonium/pPS30.1 transzformánsok reziszten- 55 sek higromicinre.

C. A pPS31 és pPS31.1 plazmidok végső megalkotása

A pPS31 és pPS31.1 plazmidokat megalkotjuk és E. coli K12 C600-ba, illetve Cephalosporium acremoniumba transzformáljuk, lényegében a 10B. példa eljárásával összhangban, azzal a különbséggel, hogy a pPS21A plazmid helyett a pPS29 plazmidot alkalmazzuk, mint kiindulási anyagot a megalkotásban.

11. példa

A pPS27 plazmid megalkotása

A. A pIT336 plazmid megalkotása

Mintegy 1 pg pUC8 plazmidot feloldunk 2 pl 10 x BamHI reakciópufferban és 16 pl HzO-ban. Mintegy 2 pl (20 egység) BamHI restrikciós enzimet adunk a pUC8 plazmid DNS oldatához, és az igy létrejött reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk két órán át. A BamHI-vel emésztett pUC8 plazmidot kicsapjuk, centrifugálással összegyűjtjük, és újra szuszpendáljuk 2 pl 10 x Sáli ciópufferban (1,5 mól/liter NaCl; 60 mmól/liter trisz-HCl, pH = 7,9; 60 mmól/liter MgCk;

mmól/liter 2-merkapto-etanol; és 1 mg/ml BSA) és 16 pl HíO-ban. Mintegy 2 pl (20 egység) Saü restrikciós enzimet adunk a BamHI-vel emésztett pUC8 plazmid DNS-hez, és az igy létrejött reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten két órán ét inkubáljuk. A reakciót fenolos extrakcióval állítjuk le, ezt követi két extrakció kloroformmal. A SaÜBamHI-emésztett pUC8 plazmid DNS-t kicsapjuk, centrifugálással összegyűjtjük és újra szuszpendáljuk 5 pl HzO-ban.

Mintegy 10 pg pIT335 plazmidot feloldunk 10 pl 10 x Baitül reakciópufferban és 80 pl HzO-ban. Mintegy 5-5 pl (50 egység) Xhol és BamHI restrikciós enzimet adunk a plT335 plazmid DNS oldatához, és az igy létrejött reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 2 órán át. A reakciókeveréket ezután 1% agaróz gélre terheljük és elektroforézisnek vetjük alá, amig a ~ 1,4 kb-s

BamHI-XhoI restrikciós fragmens elkülönül a többi reakcióterméktől, ezek az 5,6 kb-s, 1,3 kb-s és 0,01 kb-s fragmensek. A ~ 1,4 kb-s BamHI-XhoI restrikciós fragmenst, amely tartalmazza az IPS gén átírás-befejező és mRNS poliadenilező és műveleti szignáljait, izoláljuk, lényegében a 2B. példa eljárásával összhangban. Mintegy 2 pg kívánt fragmenst nyerünk, ezt 5 pl HíO-ban szuszpendáljuk.

A SaŰ-BamHI-emésztett pUC8 plazmid 5 pl-ét hozzáadjuk a pIT335 plazmid - 1,4 kb-s BamHI-XhoI restrikciós fragmensének 2 pl-éhez, 3 pl 10 x ligáz pufferhoz, 18 pl HzO-hoz, és 2 pl T4 DNS ligázhoz. Az így létrejött reakciókeveréket 15 °C hőmérsékleten inkubáljuk egy éjszakán át. A Saű és Xhol átfedések összeférhetók ligáláshoz, de ha egyszer ligáltunk, sem a Sah, sem az Xhol nem hasítják a DNS-t az elágazásoknál. A ligáit DNS alkotja a kívánt plT336 plazmidot és ezt használjuk E. coli K12 RRIaMIő transzformálására, lényegében a 7A. példa (iv) részének eljárásával összhangban. A 27

-2651

HU 202279 Β fenti E. coli törzs az NRRL törzsgyüjteménynél all rendelkezésre NRRL B-15440 letéti számon. A transzformált sejteket L-agar lemezekre szélesztjük, amelyek még 100 Mg/ml ampicillint, 40 Mg/ml X-gal-t és 40 Mg/ml 5 IPTG-t tartalmaznak. Azokat a telepeket, amelyek nem mutatnak kék színt a transzformáló lemezeken, tenyésztjük, felhasználjuk plazmid DNS készítésére, és a plazmid DNS-t restrikciós enzimes elemzéssel elemezzük, 10 hogy azonosítsuk az E. coli K12 RRlaM15/pIT336 transzformánsokat. A pIT336 plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül a 14. ábra mutatja be.

B. A pPS35 plazmid megalkotása

Mintegy 2 Mg pIT36 plazmidot feloldunk 2 m1 10 x Psü reakciópufferban és 17 μί HíO-ban. Mintegy 1 m1 (10 egység) Psü rest- 20 rikciós enzimet adunk a pIT336 DNS oldatához, és az így létrejött reakciókeveréket inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten 2 órán át. A reakciót fenollal végzett extrakcióval állitjuk le, ezt követi két extrahálás kloroformmal. A 25 Pstl-el emésztett pIT336 plazmid DNS-t azután kicsapjuk, centrifugálással összegyűjtjük, és újra szuszpendáljuk 86 μ! HiO-ban.

Mintegy 10 μί 10 x ligáz puffért és 4 μ1 T4 DNS ligázt adunk a Pstl-el emésztett 30 pIT336 plazmid DNS-hez, és az így létrejött reakciókeveréket egy éjszakán át inkubáljuk 15 °C hőmérsékleten. A ligáit DNS alkotja a kívánt pPS35 plazmidot, ezt használjuk E. coli K12 JA221 transzformálására, lényegében 35 a 7A. példa (iv) részének eljárásával összhangban. A fenti törzs az NRRL-nál rendelkezésre áll, NRRL B 15211 letéti számon.

A transzformált sejteket L-agar lemezekre szélesztjük, amely lemezek tartalmaz- 40 nak 100 Mg/ml ampicillint is. Több ampicillin-rezisztens telepet izolálunk és használunk fel plazmid DNS készítésére. A kivánt E. coli K12 JA221/pPS35 transzformánsokat plazmid DNS-ük restrikciós enzimes elemzésével azo- 45 nősítjük. A pPS35 plazmid restrikciós helyes működési térképét a mellékelt ábrák közül a 15. ábra adja meg.

C. A pPS27 plazmid végső megalkotása

Mintegy 2 Mg pPS35 plazmidot feloldunk 2 μί 10 x Hindin reakciópufferban és 17 μί HíO-ban. Mintegy 1 μί (10 egység) HindllI restrikciós enzimet adunk a pPS35 plazmid DNS oldatához, és az igy létrejött reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten 2 órán át inkubéljuk. A reakciót fenolos extrahálással állitjuk le, ezt követi két extrahálás kloroformmal. A HindIII-al emésztett pPS35 plazmid DNS-t ezután kicsapjuk, centrifugálással öszszegyüjtjük és 3 μί 10 x ligáz pufferban és 23 μ1 ΗϊΟ-ban újra szuszpendáljuk.

A pPS29 plazmid - 2,3 kb-s HindllI restrikciós fragmensének, amelyet lényegében a 9. példa eljárásával összhangban állítunk elő azzal a különbséggel, hogy kiindulási anyagként pPS29-et alkalmazunk pPS21A helyett, és amely tartalmazza az IPS gén aktiváló szekvenciája által elősegített higromicin rezisztencia átadó gént, 2 μί-ét, valamint 2 μί T4 DNS ligázt a HindIII-al emésztett pPS35 plazmid DNS oldatához adjuk. Az így létrejött reakciókeveréket 15 °C hőmérsékleten inkubáljuk egy éjszakán át. A ligáit DNS alkotja a kívánt pPS27 plazmidot, ezt használjuk E. coli K12 JA221 transzformálására, lényegében a 11B. példa eljárásával összhangban.

Az ampicillin-rezisztens transzformánsokat tenyésztjük és plazmid DNS készítésére használjuk fel, amelyet restrikciós enzimes elemzésnek vetünk alá, hogy azonosítsuk a kivánt E. coli K12 JA221/pPS27 transzformánsokat. A beiktatott - 3,45 kb-s HindllI restrikciós fragmensnek csak az egyik orientációja termeli a kívánt pPS27 plazmidot. A pPS27 plazmid restrikciós hely- és műveleti térképét a mellékelt ábrák közül a 12. ábra adja meg.

A pPS27 plazmid higromicin-rezisztens fenotípusúvá transzformálja a Cephalosporium acremoniumot nagy gyakorisággal. A C. acremonium/pPS27 transzformánsokat lényegében a 6. példa eljárásával összhangban állitjuk elő.

Claims (12)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás izopenicillin N-szintetázt kódoló rekombináns DNS vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy a pIT335 plazmid 5 (NRRL B-15960) - 1,5 kb-s Nco-BamHI restrikciós fragmensét megfelelő hordozó vektorba építjük be.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alábbi DNS-szekvenciát 10 építjük be a hordozó vektorba:

   5’- ATG GGT TCC GTT CCA GTT CCA GTG GCC AAC GTC CCC CGA ATC GAT GTC TCG CCC CTA TTC GGC GAT GAC AAG GAG AAG AAG CTC GAG GTA GCT CGC GCC ATC GAC GCC GCA TCG CGC GAC ACA GGC TTC TTT TAC GCG GTG AAC CAC GGT GTC GAC CTG CCG TGG CTC TCG CGC GAG ACG AAC AAA TTC CAC ATG AGC ATC ACG GAC GAG GAG AAG TGG CAG CTC GCC ATC CGG GCC TAC AAC AAG GAG CAC GAG TCC CAG ATC CGG GCG GGC TAC TAC CTG CCG ATC CCG GGC AAG AAG GCG GTC GAA TCG TTC TGC TAC CTG AAC CCC TCC TTC AGC CCA GAC CAC CCG CGA ATC AAG GAG CCC ACC CCT ATG CAC GAG GTC AAC GTC TGG CCG GAC GAG GCG AAG CAC CCG GGG TTC CGG GCC TTC GCC GAG AAG TAC TAC TGG GAC GTC TTC GGC CTC TCC TCC GCG GTG CTG CGC GGC TAC GCT CTC GCC CTA GGT CGC GAC GAG GAC TTC TTC ACC CGC CAC TCC CGC CGT GAC ACG ACG CTC TCG TCG GTC GTG CTC ATC CGT TAC CCG TAC CTC GAC CCG TAC CCG GAG CCG GCC ATC AAG ACG GCC GAC GAC GGC ACC AAG CTC AGC TTC GAG TGG CAC GAG GAC GTG TCC CTC ATC ACG GTG TTG TAC CAG TCC GAC GTG CAG AAT CTG CAG GTC AAG ACC CCG CAG GGC TGG CAG GAC ATC CAG GCT GAC GAC ACG GGC TTC CTC ATC AAC TGC GGC AGC TAC ATG GCC CAT ATC ACC GAC GAC TAC TAC CCG GCC CCG ATC CAC CGC GTC AAA TGG GTC AAC GAG GAG CGC CAG TCA CTG CCC TTC TTC GTC AAC CTG GGC TGG GAG GAC ACC ATC CAG CCG TGG GAC CCC GCG ACC GCC AAG GAT GGG GCC AAG GAT GCC GCC AAG GAC AAG CCG GCC ATC TCC TAC GGA GAG TAT CTG CAG GGG GGA CTG CGG GGC TTG ATC AAC AAG AAT GGT CAG ACC TAA - 3’, 1

   ahol A jelentése dezoxiadenil-gyök, G jelen- 40 tése dezoxiguanil-gyök, C jelentése dezoxicitidil-gyök és T jelentése timidil-győk.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-szekvenciát valamely plazmidba építjük be. 45
4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pIT337 plazmidot állítjuk elő.
5. 5. Eljárás izopenicillin N-szintetáz termelésére képes mikroorganizmusok elöállitá- 50 sara, azzal jellemezve, hogy egy E. coli vagy Cephalosporium acremonium gazdasejtet az 1. igénypont szerint előállított rekombináns DNS vektorral transzformálunk.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal 55 jellemezve, hogy E. coli törzset transzformálunk.
7. 7. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Cephalosporium acremonium törzsei transzformálunk. 60
8. 8. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az E. coli K12/pIT335 törzset hozzuk létre.
9. 9. A 7, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Cephalosporium acremonium/pPS21 törzset hozzuk létre.
10. 10. Eljárás izopenicillin N-szintetáz előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely 5. igénypont szerint előállított gazdasejtet, ahol az izopenicillin N-szintetázt kódoló DNS-szakasz a gazdasejtben funkcionális átíró és transzlációs aktiváló szekvenciából való kifejeződéshez van elhelyezve, önmagában ismert körülmények között tenyésztjük, majd elválasztjuk a keletkezett terméket.
11. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az E. coli /plT337 gazdasejtet tenyésztjük.
12. 12. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Cephalosporium acremonium/pPS20 gazdasejtet tenyésztjük.