DE3789880T2

DE3789880T2 - Isolierung und Expression von bei der Biosynthese von Beta-Laktamen beteiligten Genen.

Info

Publication number: DE3789880T2
Application number: DE3789880T
Authority: DE
Inventors: Martin Karl Russell Burnham; John Edward Hodgson; Ian David Normansell
Original assignee: Beecham Group PLC
Current assignee: Beecham Group PLC
Priority date: 1986-01-31
Filing date: 1987-01-28
Publication date: 1994-09-08
Anticipated expiration: 2007-01-29
Also published as: JPS62198394A; JP3321107B2; JP2930546B2; JPH08266278A; DE3789880D1; JP2540143B2; EP0233715A3; US20030180834A1; JPH11253161A; EP0233715B1; US6066468A; EP0233715A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante DNA-Moleküle und insbesondere rekombinante Vektoren zur Verwendung bei der Transformation eines mikrobiellen Wirts, die eingefügte DNA-Fragmente enthalten, die ein oder mehrere Gene tragen, die ein oder mehrere Enzyme codieren, die an der Biosynthese von β-Lactamantibiotika, besonders von Penicillinen und Cephalosporinen, beteiligt sind.
Erkenntnisse bezüglich der Biosynthese von β-Lactamantibiotika, die von Mikroorganismen produziert werden, wie z. B. Streptomyces clavuligerus sind nur langsam gewonnen worden. Trotzdem hat es sich erwiesen, daß die biosynthetischen Stoffwechselwege bestimmter Penicilline und Cephalosporine (einschließlich Cephamycine eng verwandt sind.
Isopenicillin N ist ein Zwischenprodukt bei der Biosynthese beider Verbindungsgruppen und wird durch die Wirkung eines "Cyclase"-Enzyms auf das Tripeptid δ(L-α-Aminoadipyl)-L-cysteinyl-D-valin gebildet (manchmal als LLD-ACV oder einfacher als ACV bezeichnet, wie hier nachstehend verwendet). Das Zwischenprodukt Isopenicillin N kann entweder in Penicillin G oder durch die Wirkung eines "Epimerase"-Enzyms in Penicillin N umgewandelt werden und von letzterem können verschiedene Cephalosporine und Cephamycine im Anschluß an eine anfängliche Ringerweiterung mit einem "Expandase"-Enzym durch einen mehrere Schritte umfassenden Stoffwechselweg abgeleitet werden. Eine neueste Zusammenfassung des Standes der Technik von J. F. Martin und P. Liras findet sich in Trends in Biotechnology. 3 (1985), 39-44. Bei der Biosynthese von Cephamycin C wird daher Penicillin N in Desacetoxycephalosporin C umgewandelt, das dann durch ein Dioxygenase- Enzym in Desacetylcephalosporin C überführt wird. Letzteres wird mit einer O- Carbamoylgruppe versehen, wodurch sich O-Carbamoyldesacetylcephalosporin C ergibt, das dann in Cephamycin C überführt wird.
Angesichts der Arbeit von J. D. Hood et al. (I. Chem. Soc., Chem. Commun., 1983, Seiten 1187-1188, und Uteraturstellen darin) ist es wahrscheinlich, daß die 7α- Methoxygruppe in zwei Schritten in Cephamycin C eingeführt wird, d. h. über die Wirkung eines 7-Hydroxylase-Enzyms auf O-Carbamoyldesacetylcephalosporin C, wobei sich das 7α-Hydroxyderiyat ergibt, wonach eine spätere Methylierung erfolgt.
Wie jetzt allgemein bekannt, ist es mittels DNA-Rekombinationsyerfahren möglich, auf einem Vektor enthaltene DNA in eine Wirtszelle einzubauen, was zur Folge hat, daß der transformierte Wirt mit der Fähigkeit ausgestattet wird, alle möglichen Proteine oder Enzyme zu synthetisieren, die durch das/die auf dem DNA-Insert enthaltene(n) Gen(e) codiert werden. (Eine ausführliche Diskussion der DNA-Rekombinationsmethoden und ein Glossar der darin verwendeten Begriffe findet sich in "Principles of Gene Manipulation" von R. W. Old und S. B. Primrose, 3. Ausgabe, Blackwell Scientific Publications, 1985).
Die Isolierung des Isopenicillin N-Synthetase (Cyclase)-Gens aus C. acremonium und dessen Expression in E. coli ist kürzlich von S. M. Samson et al. berichtet worden (Nature, 318 (1985), 191-194).
Um die Erfindung klar zu definieren, wird auf die angefügten Graphiken verwiesen, wobei:
Fig. 1(a) eine Restriktionskarte der chromsomalen DNA (I) von S. clavuligerus ATCC 27064 ist, die die an der Penicillin- und Cephalosporin- Biosynthese beteiligten Gene codiert;
Fig. 1(b) eine Restriktionskarte des Teils der DNA (I) ist, die in einem als pBROC 138 bezeichneten Plasmid enthalten ist;
Fig. 1(c) eine Restriktionskarte des Teils der DNA (I) ist, die in einem als pBROC 137 bezeichneten Plasmid enthalten ist;
Fig. 1(d) eine Restriktionskarte des Teils der DNA (I) ist, die in einem als pBROC 303 bezeichneten Plasmid enthalten ist;
Fig. 2 eine Restriktionskarte der Plasmide pBROC 137 und pBROC 138 ist; und
Fig. 3 eine Restriktionskarte des Plasmids pBROC 303 ist.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung DNA (I) oder ein daraus erhaltenes Restriktionsfragment bereit, enthaltend ein oder mehrere Gene, die ein oder mehrere an der Biosynthese von Penicillin- und Cephalosporin-β- Lactamen beteiligte Enzyme codieren, wobei die DNA die hier nachstehend in Fig. 1(a) gezeigte Anordnung von Restriktionsstellen aufweist.
Die vorliegende Erfindung stellt weiter einen rekombinanten Vektor mit der Fähigkeit zur Transformation einer Wirtszelle bereit, wobei der Vektor eine DNA-Insertion oder ein daraus erhaltenes Restriktionsfragment enthält, das ein oder mehrere Gene enthält, die ein oder mehrere an der Biosynthese von Penicillin- und Cephalosporin-β-Lactamen beteiligte Enzyme codieren, wobei die DNA die hier nachstehend in Fig. 1(a) gezeigte Anordnung von Restriktionsstellen aufweist.
Dementsprechend wird in einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform eine Wirtszelle bereitgestellt, die mit dem erfindungsgemäßen rekombinanten Vektor transformiert ist. Als solche Wirtszellen sind Mikroorganismen geeignet, vorzugsweise E. coli oder Streptomycetes z. B. S. lividans 66 (DSM 1567).
Wie für der Fachmann leicht ersichtlich, ist es vielleicht nicht zweckmäßig oder wünschenswert, den ganzen in Fig. 1(a) gezeigten DNA-Abschnitt (I) im erfindungsgemäßen rekombinanten Vektor zu verwenden. Als DNA-Insertion können dementsprechend geeignete Restriktionsfragmente verwendet werden, die aus der in Fig. 1(a) gezeigten DNA (1) voller Länge abgeleitet werden, vorausgesetzt, daß die geeigneten Fragmente ein oder mehrere intakte, an der Biosynthese von Penicillinen und Cephalosporinen beteiligte Gene enthalten.
Die erfindungsgemäßen Restriktionsfragmente können aus dem DNA- Abschnitt (I) durch Spaltung mit geeigneten Restriktionsenzymen mittels bekannter Verfahren erhalten werden.
Zu den besonders bevorzugten DNA-Fragmenten gehören diejenigen mit der nachstehend in Fig. 1(b), Fig. 1(c) oder Fig. 1(d) gezeigten Anordnung von Restriktionsstellen.
Die Abkürzungen Cla I, Bcl I usw. in den Fig. 1 bis 3 sind herkömmliche Abkürzungen für Restriktionsendonucleasen (vgl. Old und Primrose, l.c. und die ungefähre DNA-Länge ist in Kilobasen (Kb) angegeben, wie durch Größenbestimmungsexperimente festgestellt, die mittels Agarosegel- Elektrophorese durchgeführt wurden. Die Fig. 1 bis 3 zeigen nur die ungefähren Positionen der Restriktionsenzym-Spaltstellen, wie sie durch solche Größenbestimmungsexperimente ermittelt werden, und müssen nicht notwendigerweise alle auf der dargestellten DNA möglicherweise vorhandenen Restriktionsstellen zeigen.
Die in Fig. 1(a) charakterisierte DNA oder ein daraus erhaltenes geeignetes Restriktionsfragment, wie z. B. die in den Fig. 1(b), 1(c) und 1(d) gezeigten Fragmente, können mit jedem Vektor ligiert werden, mit dem eine Wirtszelle transformiert werden kann, in der die Gene exprimiert werden können, die die Enzyme codieren, welche an der Biosynthese von Penicillinen oder Cephalosporinen beteiligt sind.
Es ist klar, daß die erfindungsgemäße DNA zur Expression in einer solchen Wirtszelle entweder ihre eigene natürliche, von einer RNA-Polymerase der Wirtszelle erkannte Promotorsequenz tragen kann oder mit einer anderen geeigneten Promotorsequenz in geeigneter Weise ligiert werden kann oder in einen eine geeignete Promotorsequenz enthaltenden Vektor an einer passenden Restriktionsstelle und im korrekten Translationsleseraster cloniert werden kann.
Geeignete Wirtszellen, in denen die erfindungsgemäße DNA exprimiert werden kann, sind u. a. E. coli Penicillium-Arten, Cephalosporium-Arten oder Streptomyces-Arten, wie z. B. S. clavuligerus und S. lividans.
Der Vektor, in den die erfindungsgemäße DNA cloniert werden kann, ist normalerweise ein Plasmid, z. B. ein aus einem Streptomyceten erhaltenes Plasmid, oder ein temperenter oder virulenter Phage.
Ein Beispiel für einen geeigneten Vektor ist pIJ 702 (Molekulargewicht 8,9 Megadalton), ein Plasmid mit hoher Kopienzahl, das von Katz, E. et al. in J. Gen. Microbiol., 129 (1983), 2703-2714, beschrieben wird und vom John Innes Institute, Norwich, England, erhältlich ist.
Ein Beispiel für einen geeigneten temperenten Phagen ist derjenige, der als C31 bekannt ist und von Lomovskaya, N. D., Chater, K. F. und Mkrtumian, N. M., in Bacteriol. Rev., 44 (1980), 206-229, beschrieben wird.
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Vektoren können durch Ligierung der in Fig. 1(a) charakterisierten DNA-Insertion oder eines daraus erhaltenen Restriktionsfragments mit dem ausgewählten (linearisierten) Vektor durch jedes herkömmliche Verfahren hergestellt werden, z. B. durch direkte Verbindung kohäsiver Enden, Anhängen homopolymerer Enden (homopolymer tailing) oder durch ein Verbindungs (Linker)- oder Anpassungs (Adapter)-Molekül.
Die nach den vorstehenden Verfahren hergestellten rekombinanten Vektoren können die DNA-Insertion in einer der zwei möglichen Orientierungen enthalten. Rekombinante Vektoren, die beide Orientierungen enthalten, sind in den Schutzumfang der Erfindung einbezogen.
Geeignete rekombinante Vektoren sind Plasmide, die die durch die nachstehend in den Fig. 1(b), 1(c) und 1(d) gezeigte Anordnung von Restriktionsstellen charakterisierten DNA-Fragmente enthalten. Bevorzugte rekombinante Vektoren sind diejenigen, bei denen:
i) das in Fig. 1(b) gezeigte DNA-Fragment in die Bgl II-Stelle von pIJ 702 eingesetzt ist (das Konstrukt wird nachstehend als pBROC 138 bezeichnet); oder
ii) das in Fig. 1(c) gezeigte DNA-Fragment in die Bgl II-Stelle von pIJ 702 eingesetzt ist (das Konstrukt wird nachstehend als pBROC 137 bezeichnet); oder
iii) das in Fig. 1(d) gezeigte DNA-Fragment in die Bgl II-Stelle von pIJ 702 eingesetzt ist (das Konstrukt wird nachstehend als pBROC 303 bezeichnet).
Zur Herstellung der erfindungsgemäßen DNA kann eine Zufallsreihe von DNA- Fragmenten produziert werden, indem man zelluläre Gesamt-DNA von S. clavuligerus ATCC 27064 der partiellen Spaltung mit einem beliebigen geeigneten Restriktionsenzym unterwirft. Die Endonuclease Sau 3AI (nachstehend als Sau 3A abgekürzt) und dessen Isoschizomere sind für diesen Zweck besonders geeignet.
Die DNA-Fragmente können dann auf einem Sucrose-Gradienten entsprechend der Größe fraktioniert werden und Fragmente mit einer Länge > 3 Kb, vorzugsweise < 15 Kb, können isoliert werden. Bevorzugte Fragmente haben eine Größe von 4-14 Kb. Durch herkömmliche Shot-gun-Verfahren können dann die DNA-Fragmente mit einem in geeigneter Weise gespaltenen Vektor ligiert werden, z. B. mit pIJ 702, und nach einer erneuten Circularisierung kann der rekombinante Vektor in einen Stamm von S. clavuligerus dem die Fähigkeit zur Cephamycin C-Produktion fehlt, transformiert werden.
Ein für diesen Zweck geeigneter S. clavuligerus-Stamm ist S. clavuligerus NCP- 5, der am 29. Januar 1986 in der Beecham Culture Collection unter der Eingangsnummer BCC1 hinterlegt und später in die National Collection of Industrial and Marine Bacteria, Aberdeen, Schottland, überführt wurde, wobei die Hinterlegung (NCIB 12208; Datum der Einreichung 19. Februar 1986) unter den Bedingungen des "Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Micro-organisms for the Purposes of Patent Procedure" erfolgte.
Dementsprechend stellt S. clavuligerus NCIB 12208 eine andere erfindungsgemäße Ausführungsform dar.
Die Abstammung und typischen Merkmale von S. clavuligerus NCP-5 (S. clavuligerus NCIB 12208) sind wie folgt.

Abstammung von S. clavuligerus NCP-5

Die Analyse einer Probe von S. clavuligerus ATCC 27064 zeigte eine Vielfalt von Morphologien. Vierzehn verschiedene Typen wurden identifiziert. Davon wurde einer als S. clavuligerus SC-2 isoliert. Nach Züchtung zeigte S. clavuligerus SC-2 selbst eine Vielfalt von Morphologien. Ein Vertreter der kleine Kolonien bildenden Variante produzierte spontan eine große Kolonien bildende Variante, die als S. clavuligerus NCP-5 bezeichnet wurde.

Taxonomie von S. clavuligerus NCP-5

Es zeigte sich, daß die taxonomischen und morphologischen Eigenschaften von S. clavuligerus NCP-5 denen von S. clavuligerus ATCC 27064 im wesentlichen gleich sind, der im US-Patent 3,862,008 und auch bei Higgens, C. E. und Kastner, R.E., Int. I. Systematic Bacteriol. 21(1971), 326-331, beschrieben ist. Das Verfahren zur Züchtung von S. clavuligerus NCP-5 ist dem ähnlich, das für S. clavuligerus ATCC 27064 in der britischen Patentschrift 1 508 977 beschrieben ist.
Die durch die vorstehend beschriebenen Shot-gun-Verfahren gewonnenen Transformanten können im Hinblick auf ihre Fähigkeit zur Produktion von Cephamycin C überprüft werden, indem sie mit einem gegen diese Verbindung sensitiven Mikroorganismus in Kontakt gebracht werden und die Wachstumscharakteristika des Mikroorganismus untersucht werden. Ein für diesen Zweck geeigneter Mikroorganismus ist A. faecalis (der in der National Collection of Industrial and Marine Bacteria unter der Eingangsnummer NCIB 8156 hinterlegt und auch von der Beecham Culture Collection (Eingangsnummer BCC2) auf Wunsch jederzeit erhältlich ist). Für das Überprüfungsverfahren kann A. faecalis zweckmäßigerweise auf Agarplatten gezüchtet werden, in die zur Durchführung eines Komplementationstests Scheibchen mit den Transformanten nach auf dem Fachgebiet bekannten herkömmlichen Verfahren eingesetzt werden können.
Transformanten, die als positiv identifiziert wurden, weil sie Wachstumshemmzonen auf Medien erzeugen können, die mit einem Cephamycin-sensitiven Mikroorganismus frisch beimpft wurden, wie z. B. A. faecalis können isoliert werden und aus jeder "positiven" Kolonie können die darin enthaltenen rekombinanten Vektoren durch herkömmliche Verfahren isoliert werden. Nach Spaltung der rekombinanten Vektoren mittels geeigneter Restriktionsenzyme kann die in jeden Vektor eingeführte S. clavuligerus-DNA, zur Überprüfung, ob sie die erfindungsgemäße DNA enthält, identifiziert und hinsichtlich ihrer Größe bestimmt sowie durch Spaltung mittels einer Vielzahl von Restriktionsenzymen in herkömmlicher Weise kartiert werden.
Zwei oder mehrere der so isolierten "überlappenden" Insertionen (d. h. Insertionen mit gemeinsamer DNA), die in der erfindungsgemäßen DNA völlig oder teilweise enthalten, aber zu klein sind, um intakte, an der Biosynthese von Penicillinen oder Cephalosporinen beteiligte Gene zu enthalten, können häufig miteinander fusioniert werden, indem eine Spaltung an einer gemeinsamen Restriktionsstelle durchgeführt wird, der eine Ligierung (z. B. mit DNA-Ligase) in herkömmlicher Weise folgt, wodurch sich z. B. das DNA- Insert von pBROC 137 und pBROC 138 oder ein davon abgeleitetes, wie vorstehend definiertes geeignetes Restriktionsfragment ergibt.
Die in Fig. 1(a) veranschaulichte DNA (I) kann unter Verwendung von S. clavuligerus-DNA von pBROC 137 und pBROC 138 isoliert werden, wobei E. coli- Zellen durch Koloniehybridisierung identifiziert werden, die aus zellulärer Gesamt-DNA von S. clavuligerus ATCC 27064 und pHC79 (Hohn, B. and Collins, J., Gene, 11 (1980), 291) hergestellte Cosmide tragen. Das Plasmid pBROC 303 kann dann durch ein einfaches Subclonierungsverfahren aus pIJ 702 und dem in Fig. 1(d) veranschaulichten DNA-Fragment [aus DNA (I) gewonnen] konstruiert werden.
Die Produktion von Enzymen, die an der Biosynthese von Penicillinen und Cephalosporinen beteiligt sind, kann erreicht werden, indem die erfindungsgemäße DNA erneut in einen geeigneten Vektor eingesetzt wird, z. B. pIJ 702, und mit dem so gebildeten rekombinanten Vektor ein geeigneter Wirtsmikroorganismus, z. B. S. lividans 66 (DSM 1567), transformiert wird.
Zu den auf diese Weise produzierten, besonders wertvollen Enzymen gehören diejenigen, die auf dem Fachgebiet als "Cyclase" oder Isopenicillin N- Synthetase (kann ACV in Isopenicillin N umwandeln), "Expandase" oder Desacetoxycephalosporin C-Synthetase (kann Penicillin N in Desacetoxycephalosporin C umwandeln), "Epimerase" oder Penicillin N- Synthetase (kann Isopenicillin N in Penicillin N umwandeln) und O- Carbamoyldesacetylcephalosporin C7-Hydroxylase (kann sowohl O- Carbamoyldesacetylcephalosporin C als auch Cephalosporin C in deren entsprechende 7-Hydroxyderivate umwandeln) bekannt sind (J. M. Martin and P. Liras, l.c.). Solche Enzyme von S. clavuligerus ATCC 27064 oder alle anderen Proteine mit der Fähigkeit, die Synthese von Penicillinen und Cephalosporinen herbeizuführen, bilden eine andere erfindungsgemäße Ausführungsform, wenn sie durch die erfindungsgemäßen transformierten Wirte produziert werden. Vorzugsweise werden die Proteine oder Enzyme in hochgereinigter Form gewonnen.
Solche Proteine oder Enzyme können durch herkömmliche Verfahren isoliert und gereinigt werden.
Die erfindungsgemäße DNA und Vektoren, die diese enthalten, können auf vielen industriellen Gebieten Verwendung finden. Das betrifft auch Wirtsmikroorganismen, die mit den Vektoren transformiert sind, und die Enzyme, die sie exprimieren. Z.B. kann die DNA als Hybridisierungsprobe zur Identifizierung und Isolierung verwandter oder überlappender Gene verwendet werden, die in der zellulären Gesamt-DNA von S. clavuligerus ATCC 27064 und anderen Mikroorganismen vorhanden sind, die Enzyme ähnlicher Struktur und Spezifität produzieren.
Dementsprechend betrifft die Erfindung auch die Verwendung der DNA (1) oder jedes Fragmentes davon, das zur Hybridisierung mit der DNA eines β- Lactamantibiotikum-produzierenden Mikroorganismus fähig ist, für die Isolierung von Genen, die an der Biosynthese von β-Lactamantibiotika in diesem Organismus beteiligt sind.
Bei der Herstellung genetisch modifizierter Mikroorganismen, die erhöhte Mengen wertvoller Antibiotika synthetisieren, wie z. B. Cephamycin C, oder bei der Erzeugung neuer oder hybrider Antibiotika über das Gentransfer- Verfahren (vgl. z. B. D. A. Hopwood et al., Nature, 314 (1985), 642-644) können erfindungsgemäße DNA enthaltende rekombinante Vektoren nützlich sein, wenn geeignete Wirte damit transformiert sind. Durch die erfindungsgemäße DNA codierte Enzyme können beispielsweise in zellfreien Systemen verwendet werden, insbesondere bei Immobilisierung auf geeigneten Festträgern, um bekannte β-Lactamantibiotika aus deren natürlichen Vorstufen oder neue β- Lactame aus "unnatürlichen" Vorstufen herzustellen, die z. B. durch chemische Synthese erhalten wurden.
Durch DNA-Rekombinationstechniken oder durch natürliche Rekombinationsprozesse kann die erfindungsgemäße DNA oder ein Fragment davon (das nicht notwendigerweise ein intaktes Gen trägt) mit einem Fragment eines an der β-Lactambiosynthese beteiligten Gens kombiniert werden, um ein Hybridgen herzustellen, das die Synthese eines Hybridenzyms steuern kann. Solche Enzyme können bei der Herstellung neuer Antibiotika durch Verfahren verwendet werden, die analog zu denjenigen sind, die vorstehend beschrieben wurden.
Die erfindungsgemäße DNA kann durch die bekannten Verfahren der ortsgerichteten Mutagenese modifiziert werden (in einer Weise, die analog zu derjenigen ist, die z. B. von G. Winter et al., Nature, 299 (1982), 756-758, oder von Zoller und Smith, Nucleic Acids Research 10 (1982), 6487-6500, beschrieben wurde), wodurch DNA entsteht, bei der spezifische Mutationen und/oder Deletionen herbeigeführt worden sind. Die mutierte DNA kann verwendet werden, um eine erhöhte Ausbeute (oder Titer) bekannter β-Lactamantibiotika aus einem geeigneten Wirtsmikroorganismus zu gewinnen, der bereits solche Verbindungen produziert. Die mutierte DNA kann auch durch Gentransfer zur Gewinnung neuer oder hybrider Antibiotika verwendet oder bei der Produktion mutierter Enzyme (Muteine) genutzt werden, die bei der Produktion neuer Antibiotika durch Verfahren verwendet werden, die analog zu denjenigen sind, die vorstehend beschrieben wurden.
Derartige mutierte DNA wird selbstverständlich vom Schutzumfang der Erfindung umfaßt.
Die Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.

VERSUCHE

Ansatz 1. Isolierung von 4-15 kb großen Fragmenten aus Sau 3A-gespaltener S. clavuligerus 27064-DNA

(a) Zelluläre Gesamt-DNA wurde aus S. clavuligerus 27064 in folgender Weise aufbereitet:

i) S. clavuligerus 2706-Sporen wurden in 2 Schüttelkolben mit Wachstumsmedium aus Trypton-Sojanährlösung-Maltose überimpft (30 ml/250 m-Metallkappenschüttelkolben - 30 g/l Trypton- Sojanährlösung, 10 g/l Maltose) und 48 Stunden bei 26ºC bebrütet (240 Upm).
ii) Das Mycel wurde durch Zentrifugation bei 10 000 G geerntet.
iii) Die Überstandsfraktion wurde abgegossen, die Pellets wurden in 10 ml lysierende Lösung resuspendiert (50 mM Tris, pH 8,5, 50 mM Na&sub2;EDTA, 15% Sucrose, 3 mg/ml Lysozym) und 1 Stunde bei 37ºC inkubiert.
iv) 0,5 ml Natriumlaurylsulfat (10%ige Lösung), enthaltend 2 mg Proteinase K (von SIGMA chemicals), wurden zugesetzt und die Inkubation wurde 15 Minuten fortgesetzt, danach wurde eine weitere Menge Natriumlaurylsulfat-/Proteinase K-Lösung zugesetzt und die Inkubation weitere 15 Minuten fortgesetzt.
v) Nach der Zugabe von Na-Acetat (bis 0,3 M) und eiskaltem Ethanol (2 Volumen) wurde die DNA auf einen Glasstab aufgewickelt. Das wurde mehrere Male wiederholt, wodurch sich ein durchsichtiges, viskoses DNA-Präparat ergab.

(b) Partielle Sau 3A-Spaltung chromosomaler DNA aus S. clavuligerus 27064.

180 ug zelluläre Gesamt-DNA wurden mit 12 Einheiten des Restriktionsenzyms Sau 3A ( geliefert von NEW ENGLAND BIOLABS) in dem empfohlenen Puffer 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Umsetzung wurde durch Enzymdenaturierung bei 70ºC beendet.
Das Ausmaß der DNA-Spaltung wurde mittels Agarosegel- Elektrophorese überprüft. Dabei zeigte sich, daß die Fragmentgrößen im Bereich von 15 kb bis 0,16 kb lagen.

(c) Fraktionierung der mit Sau 3A partiell gespaltenen DNA auf einem 40% bis 10%igen (Gew./Vol.) Sucrose-Gradienten.

Ein Sucrose-Gradient (40 - 10%) wurde in einem 13 ml-Zentrifugenröhrchen hergestellt, wie in der von der John Innes Foundation 1985 veröffentlichten Schrift "Genetic Manipulation of Streptomyces - A Laboratory Manual" von den Autoren: D.A.Hopwood et al. beschrieben.
Der Sucrose-Gradient wurde mit der partiellen Sau 3A-Spaltung der S. clavuligerus 27064DNA (100 ug in 0,5 ml) vorsichtig überschichtet und das System wurde 21 Stunden bei 30 000 Upm (10&sup5; gav) zentrifugiert.
Das Röhrchen wurde aus der Zentrifuge entfernt und Fraktionen (400 ul) wurden dem in den Röhrchenboden gebohrten Loch entnommen. 5 ul-Proben dieser Fraktionen wurden mittels Gelelektrophorese untersucht. Fraktionen, bei denen festgestellt wurde, daß sie DNA mit einer Größe von 4-14 Kb enthielten, wurden vereinigt. Auf diese Weise wurden 12 ug Sau 3A-gespaltene, 4-14 Kb große DNA gewonnen.

Ansatz 2. Herstellung von DNA des Vektors pIJ 702 die zur Clonierung von Sau 3A-Fragmenten der S. clavuligerus 27064-DNA geeignet ist

(a) Isolierung von Plasmid-DNA.

Sporen von S. clavuligerus 27064: pIJ 702 wurden auf TSB/Maltose- Medium in Schüttelkolben überimpft (bezüglich der Herstellung des Mediums siehe Ansatz 1(a)). Zur Erhaltung der Plasmidstabilität wurde Thiostrepton bis 2,5 ug/ml zugesetzt. Der Mikroorganismus wurde 48 Stunden bei 26ºC gezüchtet. Das Plasmid pIJ 702 (Literarturstelle: Katz, E. et al., J. Gen. Microbiol., 129 (1983), 2703- 2714) wurde aus dem Myzel unter Verwendung des Verfahrens der neutralen Lyse isoliert (vgl. Hopwood et al., 1985, l.c.). Auf diese Weise wurden 50 ug pIJ 702-DNA isoliert.

(b) Bgl II-Spaltung der pIJ 702-DNA aus S. clavuligerus 27064.

30 ug pIJ 702-DNA wurden 30 Minuten bei 37ºC der Spaltung mit dem Restriktionsenzym Bgl II (100 Einheiten wie von Amersham International geliefert) in einem Gesamtvolumen von 400 ul des empfohlenen Puffers unterzogen.
Die Umsetzung wurde durch 30minütige Inkubation bei 70ºC beendet. Die Untersuchung einer Probe des Umsetzungsgemisches durch Agarosegel-Elektrophorese (0,7%iges Gel) zeigte, daß das gesamte, ursprünglich in Form kovalent geschlossener circulärer DNA (CCC) vorhandene Plasmid in die lineare Form überführt worden war.

(c) Behandlung der Bgl II-gespaltenen pIJ 702-DNA mit alkalischer Phosphatase aus Kalbsdarm (CIAP).

Dies wurde durchgeführt, wie in "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", Maniatis, T. et al., (1982), veröffentlicht vom Cold Spring Harbour Laboratory, beschrieben.
Die Untersuchung der CIAP-behandelten DNA in Gegenwart der T4- DNA-Ligase zeigte, daß diese nach der Durchführung der enzymatischen Dephosphorylierung nicht mehr selbstligierbar war.

Ansatz 3. Ligierung der Sau 3A-gespaltenen zellulären Gesamt-DNA von S. clavuligerus 27064 mit Bgl II-gespaltener. CIAP-behandelter pIJ 702-DNA.

In 12 Behälter, jeweils enthaltend 1 ug Sau 3A-gespaltene chromosomale S. clavuligerus 27064-DNA (4-14 Kb) in 50 ul Wasser, wurden jeweils 100 ul Bgl II- gespaltene, CIAP-behandelte pIJ 702-DNA (0,5 ug/Gefäß) in Pufferlösung gegeben, wodurch sich Endkonzentrationen von 1,5 ug DNA/150 ul, 66 mM Tris- HCl, pH-Wert 7,5, 6,6 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreitol und 0,4 mM Adenosintriphosphat ergaben. In jedes Gefäß wurde T4-DNA-Ligase (0, 1 Einheit
- wie von Amersham International geliefert) gegeben und die Ansätze wurden vor der Transformation der gewünschten Rezipienten 72 Stunden bei 15ºC inkubiert.

Ansatz 4. Konstruktion einer Genbank aus S. clavuligerus NCP-5. pIJ 702/27064-Clonen

(a) Untersuchung der ligierten DNA in S. lividans 66 auf die Häufigkeit der eingesetzten DNA in pIJ 702 und die Größe der DNA-Insertionen.

1,5 ug ligierte DNA (4-14 Kb große, durch Sau 3A erzeugte Fragmente von S. clavuligerus 27064, ligiert mit Bgl II-gespaltenem, CIAP- behandeltem, aus S. clavuligerus 27064 aufbereitetem pIJ 702) wurde in 10 ul TE-Puffer gelöst (1 mM Na&sub2;EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 8,2) und als 2·5 ul-Miquots bei der Transformation von 2·100 ul S. lividans 66 (DSM 1567)-Protoplasten verwendet (10¹&sup0; Protoplasten /ml
- hergestellt wie in "Genetic Manipulation of Streptomyces - A Laboratory Manual" beschrieben - in Gegenwart von 25% Polyethylenglycol (durchschnittliches Molekulargewicht 1000)).
Nach der Transformation wurden die Protoplasten in Verdünnungen bis zu 10&supmin;&sup4; auf R2YE-Agar ausplattiert (vgl. Hopwood et al., l.c.).
Nach 24 Stunden Inkubation bei 32ºC wurden die Platten mit Nährweichagar (SNBA) übergossen (8 g/l Difco-Nährbrühe, 3 g/l Agar, enthaltend das Antibiotikum Thiostrepton (500 ug/ml) zur Selektion von plasmidtragenden Kolonien und L-Tyrosin (1 g/l) zum Nachweis derjenigen Kolonien, die Plasmide mit Insertionen im mel-Gen von pIJ 702 tragen).
Nach mehreren Tagen Züchtung konnten die Häufigkeit schwarzer Kolonien (weniger als 2%) und die Transformationseffizienz der ligierten DNA (9,3·10³ Transformanten/ug DNA) durch Zählen ermittelt werden.
Aus 10 der 66 weißen S. lividans-Kolonien wurden Plasmide in der vorher beschriebenen Weise präpariert (Ansatz 2a). Diese Plasmidpräparate wurden mit dem Restriktionsenzym Bcl I gespalten, danach erfolgte eine Agarosegel-Elektrophorese, um die Größe der DNA-Insertionen zu ermitteln.
Auf diese Weise wurde ermittelt, daß die durchschnittliche Größe der clonierten DNA 5 Kb betrug.

(b) Transformation von S. clavuligerus NCP-5 (S. clavuligerus NCIB 12208) mit einer ligierten DNA-Probe

2·100 ul S. clavuligerus NCP 5-Protoplasten (1010 Protoplasten/ml, hergestellt wie in Hopwood et al., (1985), l.c.) wurden mit 1,5 ug ligierter DNA in 2·5 ul TE-Puffer transformiert. Die transformierten Protoplasten wurden bei 26ºC auf R5-Agar regeneriert (100 g/l Sucrose, 10 g/l Dextrin, 5,1 g/l MgCl&sub2;·6 H&sub2;O, 1 g/l Casamino-Säuren, 0,05 g/l MgSO&sub4;·7 H&sub2;O, 2,5 g/l L-Arginin-HCl, 1 ml/l Spurenelemente, 20 g/l technischer Oxoid-Agar Nr. 3, 0,05 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 3,7 g/l CaCl&sub2; ·2 H&sub2;O, 5,7 g/l TES-Puffer, pH 7,2. Die Spurenelemente-Lösung bestand aus 1 g/l FeSO&sub4;·7 H&sub2;O, 1 g/l MnCl&sub2;·4 H&sub2;O, 1 g/l ZnSO&sub4;·7 H&sub2;O.). Nach 48 Stunden Regeneration wurden Thiostrepton-resistente Kolonien durch Überschichten mit Thiostrepton (50 ug/ml) enthaltendem SNAB selektiert (wie in Ansatz 4a beschrieben). Nach weiteren 72 Stunden wurden die transfomierten Zellen in bestimmten Anordnungen auf einem zur Antibiotikaproduktion geeigneten und Thiostrepton (2,5 ug/ml) enthaltenden Nähragar einzeln ausgestrichen (M5D&spplus;-Agar, enthaltend 10 g/l Dextrin, 1 g/l K&sub2;HPO&sub4;, 1 g/l MgSO&sub4;·7 H&sub2;O, 1 g/l (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 4 g/l technische Kreide, 1 ml/l Spurenelemente-Lösung, 20 g/l Agar, 2 g/l Hefeextrakt und 2,5 g/l bakteriologisches Pepton. Die Spurenelemente-Lösung besteht aus 0,1% FeSO&sub4;·7 H&sub2;O, 0,1% MnCl&sub2;·4 H&sub2;O und 0,1% ZnSO&sub4;·7 H&sub2;O).
Auf diese Weise wurden 4500 NCP 5-Kolonien erhalten, die die durch pIJ 702: S. clavuligerus 27064-DNA-Plasmide vermittelte Thiostreptonresistenz zeigten.

Ansatz 5. Überprüfung der NCP-5: pIJ 702/5. clavuligerus 27064-Genbank auf Cephamycin C-Produktion

Nach 10 Tagen Züchtung auf M5D&spplus;-Agar bei 26ºC wurden Agarscheibchen mit 8 mm Durchmesser aus jedem Myzelgeflecht ausgeschnitten und auf DST-Agar (40 g Oxoid-DST-Agar/l Wasser) gelegt, der mit Alcaligenes faecalis ATCC 8750/NCIB 8156 frisch beimpft worden war (vgl. Claridge, C. A. and Johnson, D. L, Antimicrob. Ag. Chemother., (1962), 682-686). Dieser Organismus ist gegenüber bestimmten Cephalosporinen, wie z. B. Cephalosporin C und Cephamycin C, sensitiv, aber nicht gegenüber Penicillin N, selbst in Gegenwart geringer Mengen Clavulansäure, die unter den verwendeten Züchtungsbedingungen von NCP-5 produziert wird. NCP-5, der Penicillin N und Clavulansäure nur in normalen Mengen produziert, zeigt folglich auf A. faecalis NCIB 8156 keine Wachstumshemmzone, im Gegensatz zu seinem Elternstamm S. clavuligerus (weil dieser Penicillin N, Clavulansäure und Cephamycin C produziert). Man ließ das Antibiotikum aus den Scheibchen in den DST/A. faecalis-Agar diffundieren und inkubierte über Nacht bei 37ºC. Danach wurde das A. faecalis-Wachstum auf Antibiosezonen untersucht.
Auf diese Weise wurde nach einer möglichen Cephalosporinantibiotika- Produktion der Clone der Genbank gesucht. Bei zwei, als NCP-5/36/5 und NCP- 5/10/7 bezeichneten Clonen wurde gefunden, daß sie Antibiosezonen gegen A. faecalis erzeugen.

Ansatz 6. Untersuchung des Plasmidgehalts von NCP-5/36/5 und NCP-5/10/7

(a) Strukturelle Untersuchung der Plasmide

Aus NCP-5/36/5 und NCP-5/10/7 wurden, wie in Ansatz 2 beschrieben, Plasmidpräparate hergestellt. Es war möglich, mehrere Mikrogramm Plasmidmaterial aus jeweils 30 ml-Kulturen der zwei positiven Clone zu isolieren. Die Restriktionsstellen-Kartierung zeigte deutlich, daß in NCP-5/36/5 nur eine einzige Plasmidart und in NCP-5/10/7 auch nur eine einzige unterschiedliche Plasmidart vorhanden war.
Restriktionskartierung (vgl. Fig. 1) deutete darauf hin, daß die aus NCP-5/36/5 bzw. NCP-5/10/7 isolierten Plasmide pBROC 137 und pBROC 138 ungefähr 5,7 Kb bzw. ungefähr 5,8 Kb große DNA-Insertionen in pIJ 702 enthielten. Die zwei DNA-Insertionen schienen ein gemeinsames Fragment von ungefähr 2,7 Kb zu enthalten. Darauf deuteten die kartierten Restriktionsstellen. Später wurde dies durch eine starke Hybridisierung des ³²P-markierten pBROC 13 8-Fragments mit dem vorausgesagten Teil der pBROC 137-DNA unter Verwendung des Southernanalyseverfahrens bewiesen.

(b) Erneute Einführung der Plasmide pBROC 137 und pBROC 138 in NCP-5.

Je 100 Nanogramm pBROC 137- und pBROC 138-DNA wurden zur erneuten Transformation von S. clavuligerus NCP-5 verwendet. Die transformierten Kolonien wurden isoliert und anschließend wie in Ansatz 5 beschrieben auf A. faecalis-Biotestplatten getestet. Es war offensichtlich, daß nun mindestens 90% der mit pBROC 137 oder pBROC 138 transformierten NCP 5-Kolonien fähig waren, Antibiosezonen auf A. faecalis zu erzeugen. Das bestätigte, daß die in pBROC 137 und pBROC 138 vorhandene DNA genetische Information enthielt, die die von NCP-5 verursachte Mutation reparieren konnte.

Ansatz 7. Test neuer enzymatischer Aktivitäten von Streptomyces lividans 66 verliehen durch pBROC 137, pBROC 138 und pBROC 303

S. lividans 66 wurde mit jeweils 100 Nanogramm-Mengen von pBROC 137-, pBROC 138- und pBROC 303-DNA transformiert (wie in Ansatz 4a).
Kulturen von S. lividans 66 : pBROC 137, S. lividans 66 : pBROC 138 und S. lividans 66 : pBROC 303 wurden in Schüttelkolben mit YEME gezüchtet (30 ml mit 10 g/l Glucose, 340 g/l Sucrose, 3 g/l Malzextrakt, 5 g/l bakteriologisches Pepton, 3 g/l Hefeextrakt (Oxoid), enthaltend 50 ug / m l Thiostreptonantibiotikum). Die Kulturen wurden 48 Stunden bei 32ºC bei 240 Upm gezüchtet. Das Myzel wurde durch Zentrifugation bei 10 000 g geerntet und mit Tris-HCl-Puffer (0,05 M), pH-Wert 7,0, gewaschen. Das Myzel wurde erneut zentrifugiert und das Pellet in 2,5 ml Tris-Puffer resuspendiert. Der Zellaufschluß wurde unter Verwendung einer French Press Cell-Vorrichtung bei 1000 psi durchgeführt und die aufgebrochenen Zellpräparate wurden 60 Minuten bei 105 g zentrifugiert, wodurch sich ein zellfreies, teilchenfreies, lösliches Enzympräparat ergab.

(a) Nachweis der Exnandase-Enzymaktivität

Zur Bestimmung der Gegenwart der Desacetoxycephalosporin C-Synthetase wurden Enzympräparate aus S. lividans 66 : pIJ 702, S. lividans 66: pBROC 137 und S. lividans 66 : pBROC 138 in Ringerweiterungs-Testsystemen verwendet (wie in Jensen, S. E., Westlake, D.W.S. and Wolfe, S., Antimicrob. Ag. Chemother., 24(3) (1983), 307-312, beschrieben).
Unter Verwendung des von diesen Autoren beschriebenen E. coli- ESS/Penicillinase-Biotestsystems (10&sup4; Einheiten DIFCO-Penicillinasekonzentrat/ml) konnte gezeigt werden, daß S. lividans 66 : pIJ 702-Extrakte Penicillin N nicht in Penicillinase-resistente Antibiotika umwandeln konnten, während die Extrakte aus S. lividans 66 : pBROC 137 und S. lividans 66 : pBROC 138 die Umwandlung durchführen konnten. S. lividans 66 : pBROC 137- Enzymextrakte konnten im Testsystem eine wesentliche Umwandlung von Penicillin N in Penicillinase-resistente Antibiotika bewirken, während die Enzymextrakte aus S. lividans 66 : pBROC 138 in dieser Hinsicht eine viel niedrigere Aktivität zeigten. Zusammen mit authentischen Proben von Penicillin N, Desacetoxycephalosporin C und Desacetylcephalosporin C wurden die Ringerweiterungs-Tests anschließend einer Chromatographie auf Cellulose-Dünnschichtchromatographie (t.l.c. )-Platten (Butanol/Essigsäure/ Wasser, 3/1/1) unterworfen. Ein Biotest der Chromatogramme auf E. coli- ESS/Difco-Penicillinase enthaltendem Agar zeigte nach Inkubation über Nacht bei 37ºC, daß S. lividans 66 : pBROC 137-Enzymextrakte Penicillin N in Desacetoxycephalosporin C umgewandelt hatten, während Enzymextrakte aus S. lividans 66 : pIJ 702 dies nicht getan hatten. Es konnte kein Desacetoxycephalosporin C nachgewiesen werden, das durch einen der Zellextrakte aus Penicillin N synthetisiert worden war. (Rf-Wert von Desacetoxycephalosporin C = 0,55, Rf-Wert von Desacetylcephalosporin C = 0,39).
(Wegen der Gegenwart von Penicillinase wird Penicillin N nicht nachgewiesen.)

(b) Umwandlung von Isopenicillin N in eine chemische Form, die aktiver gegen E. coli-ESS ist

Unter Verwendung des von Jensen, S.E. et al. (Can. I. Microbiol., 29 (11) (1983), 1526-1531) entwickelten Isopenicillin N-Epimerasetests war der Nachweis möglich, daß ein zellfreier, teilchenfreier Enzymextrakt (wie in Ansatz 7a) aus S. lividans 66 : pBROC 137 Isopenicillin N in eine chemische Form umwandeln kann, die gegen E. coli-ESS mindestens 10mal aktiver ist als Isopenicillin N selbst. Ein ähnlicher Extrakt aus S. lividans 66: pIJ 702 war dazu nicht in der Lage.

(c) Umwandlung von O-Carbamoyldesacetylcephalosporin C und Cephalosporin C in deren 7-Hydroxyderivate durch zellfreie Präparate von S. lividans 66 : pBROC 303

Zellfreie Präparate aus S. lividans 66 : pBROC 303 (0,9 ml) wurden bei 22ºC mit Natriumascorbat (2,8 mM), Eisen(II)-sulfat (0,045 mM), α-Ketoglutarat (1 mM), Kaliumchlorid (7,5 mM), Magnesiumsulfat (7,5 mM), Tris-Hydrochlorid (0,05 M), pH-Wert 7,0, und entweder mit O-Carbamoyldesacetylcephalosporin C (0,5 mM) oder mit Cephalosporin C (0,5 mM) in einem Endvolumen von 1,2 ml inkubiert.
Nach 2 Stunden Inkubation wurden 25 ul Eisessig unter Schütteln zugesetzt und ein entproteinisierter Überstand wurde durch Zentrifugation erhalten (5 Minuten bei 10 000 G). Diese Flüssigkeit wurde an einer CAE-Sephadex-Säule (1 ml Volumen) absorbiert. Das Harz wurde mit 250 ul Wasser und 200 ul 0,2 M NaCl gewaschen. Die Cephalosporine wurden aus dem Harz mit weiteren 250 ul 0,2 M NaCl eluiert.
20 ul-Proben dieser konzentrierten Umsetzungsprodukte wurden mit Hochdruckflüssigkeitschromatographie unter Verwendung von C&sub1;&sub8;- Microbondak-Säulen vom Umkehrphasentyp analysiert. 0,1 M NaH&sub2;PO&sub4;, pH- Wert 3,2, diente als mobile Phase zur Trennung von O-Carbamoyldesacetylcephalosporin C und 7-Hydroxy-O-carbamoyldesacetylcephalosporin C. Um Cephalosporin C von 7-Hydroxycephalosporin C zu trennen, wurde der pH-Wert der mobilen Phase auf 4,2 erhöht. Die Elution wurde bei 2 ml/Minute mit UV- Nachweis bei 260 nm durchgeführt.
Auf diese Weise war es möglich, eine etwa 50%ige Umwandlung von O- Carbamoyldesacetylcephalosporin C (Retentionszeit 5,7 Minuten) in dessen 7- Hydroxyderivat (Retentionszeit 3,0 Minuten) und eine etwa 35%ige Umwandlung von Cephalosporin C (Retentionszeit 18,2 Minuten) in 7- Hydroxycephalosporin C (Retentionszeit 6,6 Minuten) nachzuweisen. Extrakte aus S. lividans 66 : pIJ 702 konnten diese Umwandlungen nicht bewirken.

Ansatz 8. Natriumlaurylsulfat/Polyacrylamid-Gelelektrophorese der von S. lividans 66: pBROC 137 und S. lividans 66: pBROC 138 produzierten Proteine

Volumen (5 ul, 10 ul) zellfreier, teilchenfreier Extrakte aus S. lividans 66 pBROC 137, S. lividans 66 : pBROC 138 und S. lividans 66 : pIJ 702 (wie in Ansatz 7a) wurden zur Denaturierung der gelösten Proteine mit Natriumlaurylsulfat (SLS) behandelt und durch SLS/12% Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter Verwendung des Verfahrens von Laemmli, U.K. (Nature, 227 (1970), 680) aufgetrennt. Die Anfärbung mit Coomassie-Brilliantblau zeigte, daß, wie aufgrund von mitgelaufenen Proteinen mit bekanntem Molekulargewicht anzunehmen, die Extrakte aus S. lividans 66 : pBROC 137 und S. lividans 66: pBROC 138 ein Protein von etwa 29 500 Dalton aufwiesen, das in Extrakten aus S. lividans 66 : pIJ 702 entweder nicht oder viel schwächer vorhanden war. Die Extrakte aus S. lividans 66 : pBROC 137 zeigten auch eine auffällig gefärbte Proteinbande mit einer Größe von etwa 60 000 Dalton.

Ansatz 9. Isolierung, Charakterisierung und Subclonierung von DNA aus dem S. clavuligerus-Chromosom, die zu der in pBROC 137 und pBROC 138 enthaltenen DNA benachbart ist

a) Konstruktion einer Genbank aus DNA von S. clavuligerus ATCC 27064 in pHC 79.

10 ug pHC 79-DNA (Holm, B. and Collins, J., Gene, 11, (1980), 291-298) wurden mit den Restriktionsenzymen Sal I und Bam HI vollständig gespalten. Weitere 10 ug pHC 79-DNA wurden mit Eco RI und Bam HI vollständig gespalten. Zur Isolierung der erforderlichen "Cosmidarme" wurden beide Spaltungen auf einem Sucrosegradienten (10-40%) fraktioniert. Die Ausbeute bei jedem Cosmidarm war > 5 ug.
100 ug chromosomale DNA von S. clavuligerus ATCC 27064 wurden mit Sau 3A I partiell gespalten und auf einem Sucrosegradienten (10-40%) fraktioniert. Fraktionen, die Restriktionsfragmente > 30 Kb und < 50 Kb enthielten, wurden vereinigt, wodurch etwa 10 ug Sau 3A I-Fragmente in diesem Größenbereich bereitgestellt wurden. Diese Fragmente wurden mit den Cosmidarmen in einem Molverhältnis von 1 : 1 : 1 ligiert (DNA-Konzentration 200 ug·ml&supmin;¹). Nach 24 Stunden wurde das Ligierungsgemisch in vitro in den lambda-Phagen verpackt. (Verpackungsextrakte des lambda-Phagen und Protokolle geliefert von Amersham International PLC). Die Transfektion von F. coli DHI (Low, B., PNAS, 60 (1968), 161-167) ergab 5·10&sup7; Transfektanten/ug verpackte DNA.

b) Isolierung des DNA-Abschnittes (I) aus der DNA-Genbank von S. clavuligerus ATCC 27064 und Subclonierung dieser DNA in pIJ 702.

5000 E. coli DHI-Kolonien, enthaltend pHC 79 mit S. clavuligerus ATCC 2706- DNA-Insertionen, wurden auf Nitrocellulosefiltern immobilisiert und lysiert. Das je ein Bcl I- und Kpn I-Ende enthaltende 1,2 Kb-Fragment aus pBROC 137 wurde isoliert und durch das Nick-Translationsverfahren markiert. Unter Verwendung dieses Fragmentes als Sonde wurden die Filter Standard- Koloniehybridisierungsverfahren unterworfen. Sieben Kolonien wurden erhalten, die Hybridisierung zeigten, wobei eine den in Fig. 1(a) veranschaulichten DNA-Abschnitt (I) enthielt.
Die Subclonierung von Fragmenten des DNA-Abschnitts (I) wurde erreicht, indem zuerst 10 ug dieser clonierten DNA mit Bam HI gespalten wurden. 5 ug des Vektors pIJ 702 wurden mit Bgl II gespalten und zur Verhinderung einer erneuten Circularisierung mit CIAP behandelt. Die durch Bam HI erzeugten Fragmente wurden mit dem Bgl II-gespaltenen und CIAP-behandelten pIJ 702 in einem Molverhältnis von 2 : 1 bzw. in einer DNA-Konzentration von 50 ug· ml&supmin;¹ ligiert. Nach 24 Stunden Inkubation bei 15ºC wurde S. lividans 66 mit 0,5 ug Ligierungsgemisch transformiert und es wurden 2·10&sup5; Transformanten/ug erhalten. Die Überprüfung der Transformanten ermöglichte die Isolierung von pBROC 303 zusammen mit den anderen Clonen, die Bam HI-Fragmente enthielten.

Claims

1. DNA (I), erhältlich als ein Sau 3A-Restriktionsfragment aus einer Streptomyces clavuligerus-DNA-Cosmidban)t, enthaltend mehr als ein Gen, das mehr als ein Enzym codiert, das an der Biosynthese von Penicillin und Cephalosporin-β-Lactamen beteiligt ist, wobei die DNA die in Fig. 1(a) gezeigte Anordnung von Restriktionsstellen aufweist.

2. DNA, erhältlich als Sau 3A-Restriktionsfragmente aus einer Streptomyces clavuligerus-DNA-Bank, wobei die DNA Penicillin N-Synthetase oder Desacetoxycephalosporin C- Synthetase codiert und die in Fig. 1(b) und 1(c) gezeigte Anordnung von Restriktionsstellen aufweist.

3. DNA-Fragment, erhältlich als BamHI-Restriktionsfragment aus der DNA nach Anspruch 1, wobei die DNA O-Carbamoyldesacetylcephalosporin C7-Hydroxylase codiert und die in Fig. 1(d) gezeigte Anordnung von Restriktionsstellen aufweist.

4. Rekombinanter Vektor, umfassend ein DNA-Molekül nach Anspruch 1 oder 2, cloniert in ein Plasmid, das von einem Streptomyceten oder einem temperenten Phagen stammt.

5. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 4, wobei das Plasmid pIJ702 ist.

6. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 5, umfassend pBROC 137 von etwa 11,5 kb wie in Fig. 2 gezeigt, pBROC 138 von etwa 11,6 kb, wie in Fig. 2 gezeigt oder pBROC 303 von etwa 12,5 kb, wie in Fig. 3 gezeigt.

7. Wirt, der mit mindestens einem rekombinanten Vektor nach einem der Ansprüche 4 bis 6 transformiert ist.

8. Wirt nach Anspruch 7, wobei der Wirt ein Streptomycet ist.

9. Wirt nach Anspruch 8, wobei der Streptomycet S. lividans 66 (DSM 1567) ist.

10. O-Carbamoyldesacetylcephalosporin C7-Hydroxylaseenzym von S. clavuligerus ATCC 27064 oder irgend ein anderes Protein, das O-Carbamoyldesacetylcephalosporin C in O- Carbamoyldesacetyl-7-hydroxycephalosporin C oder Cephalosporin C in 7-Hydroxycephalosporin C umwandeln kann, wenn es von einem transformierten Wirt nach einem der Ansprüche 7 bis 9 produziert wird.

11. S. clavuligerus NCIB 12208.

12. Verwendung von DNA (I) nach Anspruch 1 oder eines beliebigen Fragments davon, das zur Hybridisierung mit der DNA eines β-Lactamantibiotikum produzierenden Mikroorganismus fähig ist, für die Isolierung von Genen, die an der β-Lactamantibiotium-Biosynthese in dem Organismus beteiligt sind.