FR3092586A1 - Procédé optimisé d’exploitation industrielle d’algues rouges unicellulaires - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un procédé de culture d’algues rouges unicellulaires (ARUs) optimisé pour la valorisation des produits de culture, tant la biomasse obtenue, que les phycocyanines qui en sont extraites ou les autres produits de culture comme des porphyrines ou des extraits protéiques.
Description
DOMAINE DE L'INVENTION.
La présente invention concerne un procédé de culture d’algues rouges unicellulaires (ARUs) optimisé pour la valorisation des produits de culture, tant la biomasse obtenue, que les phycocyanines qui en sont extraites ou les autres produits de culture comme des porphyrines ou des extraits protéiques.
ARRIERE PLAN DE L'INVENTION .
ARRIERE PLAN DE L'INVENTION .
On connaît différents moyens de cultiver des microalgues, en particulier des algues rouges unicellulaires (ARUs) pour la fabrication de différents produits pour des usages industriels ou alimentaires.
On citera notamment les procédés de culture et de transformation des spirulines pour la fabrication de compléments alimentaires riches en protéines ou encore pour la fabrication de phycocyanines utiles comme colorant alimentaires.
On citera également les procédés de cultures et de transformation d’ARUs pour l’obtention de produits similaires et en particulier les procédés de culture et de transformation deGaldieria sulphurariadécrits dans les demandes de brevets WO 2017/050917, WO 2017/093345 et WO 2018/178334.
Un procédé industriel de culture et de transformation des ARUs commeGaldieria sulphurariaest représenté sur la figure 1.
On notera toutefois que ces différents procédés peuvent encore être améliorés à chaque étape de la production et de la transformation des ARUs. En particulier ces procédés peuvent être améliorés au regard du fait que les ARUs commeGaldieria sulphurariaaccumulent d’importantes quantités de glycogène lorsqu’elles sont cultivées dans des conditions usuelles de culture, quantités de glycogène qui impactent en particulier les conditions de traitement de la biomasse, lyse cellulaire notamment, les conditions d’isolation des produits à partir de la biomasse et la qualité de ces produits isolés, en particulier les phycocyanines.
En particulier, il est important de pouvoir optimiser ces différentes étapes pour mieux valoriser les produits obtenus.
BREVE DESCRIPTION DE L'INVENTION .
BREVE DESCRIPTION DE L'INVENTION .
L’invention concerne un procédé optimisé de culture et de valorisation des ARUs, en particulier deGaldieria sulphuraria, comprenant des étapes (a) de culture par fermentation des ARUs, (b) de séparation de la biomasse du jus de fermentation, le cas échéant (c) de lyse cellulaire et le cas échéant une étape (d) d’extraction de produits valorisables à partir de la biomasse lysée, qui comprend au moins l’une des étapes suivantes de :
(a1) culture par fermentation avec une phase de maturation avec limitation de l’apport en source de carbone dans le milieu de culture, et/ou
(b1) extraction de porphyrines à partir du jus de fermentation, et/ou
(c1) de lyse par broyage avec maintien de la biomasse pendant le broyage à une température inférieure à 50°C et/ou
(d1) d’extraction des phycocyanines de la biomasse lysée par au moins 2 lavages successifs dans des quantités d’eau représentant au total moins de 4 fois le volume total de biomasse lysée.
L’invention concerne également les produits obtenus par le procédé, en particulier les porphyrines extraites du jus de fermentation, la biomasse, la biomasse lysée, les protéines et/ou les phycocyanines isolées.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES .
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES .
D ESCRIPTION DETAILLEE DE L’ I NVENTION .
Les différentes étapes du procédé selon l’invention sont décrites plus en détail ci-après et dans les exemples.
Par « valorisation », on entend selon l’invention les étapes techniques qui permettent d’isoler des produits utiles pour une utilisation dans l’industrie,
En particulier, le procédé selon l’invention comprend les étapes successives suivantes :
(a1) de culture par fermentation avec une phase de maturation qui comprend la limitation de l’apport en source de carbone dans le milieu de culture,
(b1) le cas échéant d’extraction de porphyrines à partir du jus de fermentation,
(c1) le cas échéant de lyse par broyage avec maintien de la biomasse pendant le broyage à une température inférieure à 50°C et,
(d1) le cas échéant d’extraction des phycocyanines de la biomasse lysée par au moins 2 lavages successifs dans des quantités d’eau représentant au total moins de 4 fois le volume total de biomasse lysée.
Plus particulièrement le procédé selon l’invention comprend les étapes successives suivantes :
(a1) de culture par fermentation avec une phase de maturation qui comprend la limitation de l’apport en source de carbone dans le milieu de culture,
(b1) d’extraction de porphyrines à partir du jus de fermentation,
(c1) de lyse par broyage avec maintien de la biomasse pendant le broyage à une température inférieure à 50°C et,
(d1) d’extraction des phycocyanines de la biomasse lysée par des lavages successifs dans des quantités d’eau représentant au total moins de 4 fois le volume total de biomasse lysée.
Selon un mode particulier de réalisation de l’invention, le procédé comprend au moins les étapes suivantes :
(a1) de culture par fermentation avec une phase de maturation par limitation de l’apport en source de carbone dans le milieu de culture, et
(b1) d’extraction de porphyrines à partir du jus de fermentation.
Selon un autre mode particulier de réalisation de l’invention, le procédé comprend au moins les étapes suivantes :
(c1) de lyse par broyage avec maintien de la biomasse pendant le broyage à une température inférieure à 50°C et,
(d1) d’extraction des phycocyanines de la biomasse lysée par des lavages successifs dans des quantités d’eau représentant au total moins de 4 fois le volume total de biomasse lysée.
Les ARUs sont bien connues de l’homme du métier, en particulier les ARUs susceptibles d’être cultivées de manière industrielle pour la production de biomasse et de ses produits dérivés, protéines ou phycocyanines. On citera en particulier les algues (ou microalgues) des ordres des Cyanidiales. L'ordre des Cyanidiales, englobe les familles des Cyanidiaceae ou des Galdieriaceae, elles-mêmes subdivisées en les genres Cyanidioschyzon, Cyanidium ou Galdieria, auxquelles appartiennent entre autres les espècesCyanidioschyzon merolae 10D,Cyanidioschyzon merolae DBV201,Cyanidium caldarum,Cyanidium daedalum,Cyanidium maximum,Cyanidium partitum,Cyanidium rumpens,Galdieria daedala,Galdieria maxima,Galdieria partitaou encoreGaldieria sulphuraria. On citera en particulier la soucheGaldieria sulphuraria(aussi appeléeCyanidium caldarium(UTEX 2919).
On citera aussi des producteurs connus de phycocyanines comme les cyanobactéries filamenteuses du genreArthrospira, cultivées industriellement sous le nom commun de spiruline.
Les microorganismes qui produisent de la phycocyanine avec une teneur élevée en glycogènes sont plus particulièrement identifiés parmi les microorganismes cités précédemment, en particulier les espèces des genres Arthrospira, Spirulina, Synechococcus, Cyanidioschyzon, Cyanidium ou Galdieria, plus particulièrementGaldieria sulphuraria.
L’invention concerne également les produits obtenus par le procédé, en particulier la biomasse, les porphyrines isolées du jus de fermentation, la biomasse lysée, les protéines et les phycocyanines isolées de la biomasse lysée.
Les phycocyanines (PC) produites par les microorganismes comprennent les c-phycocyanines (C-PC) et les allophycocyanines. Selon l’invention on entend par phycocyanines les C-PC et les allophycocyanines, isolées ou leurs mélanges en toutes proportions, en particulier les C-PC.
La culture des ARUs (a1).
La culture en fermenteur d’ARUs et en particulier deGaldieria sulphurariaa largement été décrite dans la littérature scientifique que ce soit en hétérotrophie ou en mixotrophie, en « Fed-batch » ou en continu.
La biomasse produite comprend non seulement des phycocyanines et des protéines, mais également des sucres de réserve comme le glycogène. Les teneurs en glycogène dans la biomasse sont de l’ordre de 20 à 50% en masses par rapport à la masse totale de matière sèche. Or plus la teneur en glycogène est importante dans la biomasse finale et plus la concentration en phycocyanine (PC) et en protéine est faible. Le glycogène produit par les ARUs en en particulier chezGaldieriaest soluble à l’eau froide et se retrouve donc dans la phase aqueuse lors de l’extraction de la PC, ce qui pose des problèmes techniques lors de la filtration comme une augmentation de la viscosité, le colmatage des membranes de filtration, des montés en pression, une accumulation de glycogène dans la fraction contenant la phycocyanine et donc l’obtention d’une phycocyanine moins pure. L’invention permet, par un « pilotage » de fermentation, de réduire les taux de glycogène à des valeurs inférieures à 20 % en masse/MS.
L’invention concerne donc un procédé de production de biomasse de selon l’invention qui comprend la culture par fermentation d’ARUs telles que définies précédemment avec une phase de maturation qui comprend la limitation de l’apport en source de carbone dans le milieu de culture.
Les cultures par fermentation se font sur un milieu de culture comprenant différents éléments nutritifs permettant la croissance cellulaire. Ces milieux de culture bien connus de l’homme du métier comprennent notamment une source de carbone, une source d’azote, une source de phosphore, des macroéléments, des microéléments, dans des concentrations appropriées pour permettre la croissance cellulaire.
L’étape de maturation est en particulier mise en œuvre dans des modes de cultures en « FedBatch » ou en continu.
La source de carbone peut être toute source de carbone connue de l’homme du métier et pouvant être employée pour la culture des ARUs et en particulier deGaldieria sulphuraria, comme les polyols, en particulier le glycérol, les sucres, comme le glucose ou le saccharose ou encre le lactose ou des milieux complexes comprenant du lactose comme les perméats lactés, comme le perméat de lait, le perméat de sérum, le babeurre et leurs mélanges et en particulier le perméat de lait.
Il est connu que certains substrats carbonés comme le glucose inhibent fortement la synthèse de PC alors que d’autres moins. Toutefois, pour la viabilité d’un procédé industriel de production de PC, de nombreux paramètres économiques sont à prendre en considération, et notamment le coût des matières premières. Ainsi, l’emploi d’une source de carbone comme le perméat de lait comprenant du lactose ne permet pas d’obtenir des rendements en PC aussi élevés qu’avec le glycérol mais l’économie globale du procédé avec l’emploi du perméat de lait reste avantageuse du fait qu’il s’agit d’un sous-produit de l’industrie laitière difficile à recycler. Elle est d’autant plus avantageuse que la mise en œuvre du procédé selon l’invention permet d’obtenir une forte densité cellulaire avec une faible teneur en glycogène, ce qui facilite l’extraction de la PC en fin de procédé.
La biomasse obtenue après maturation a la composition suivante :
| Biomasse maturée | Composition en % de la matière sèche | ||
| Protéines | glycogène | C-PC | |
| Biomasse cible | > 45% | < 20% | > 1,5% |
| Biomasse préférée | 55% à 70% | 5% à 20% | 5 à 10% |
Les conditions particulières de mise en œuvre de la phase de maturation par limitation de la source de carbone pour ces deux modes de culture sont précisées ci-après.
Culture en Batch/Fed Batch.
Culture en Batch/Fed Batch.
Sur une culture en mode « Fedbatch », le procédé de culture par fermentation selon l’invention comprend une première phase de croissance cellulaire sur un milieu de culture comprenant une source de carbone telle que définie précédemment, de manière à obtenir une densité cellulaire dans le milieu de culture d’au moins 30 g/L de MS. L’homme du métier saura définir la composition des milieux de culture appropriés pour obtenir une telle densité cellulaire et en particulier la teneur en source de carbone, notamment au regard des procédés de l’état de la technique décrits notamment dans les demandes de brevets WO 2017/050917, WO 2017/093345 et WO 2018/178334.
Une fois la densité cellulaire recherchée obtenue on effectue une phase de «maturation» qui consiste à sevrer la souche en substrat carboné organique.
Selon un mode particulier de réalisation de l’invention, la phase de maturation est déclenchée une fois que la culture en phase de croissance atteint au moins 30 g/L de MS, de préférence au moins 80 g/L de MS, plus préférentiellement au moins 100 g/L de matière sèche.
Durant la phase Fed-batch on alimente la culture avec un milieu d’alimentation comprenant au moins 100 g/l de substrat carboné, de préférence au moins 200 g/l de substrat carboné, plus préférentiellement au moins 500 g/l de substrat carboné. Afin de limiter l’accumulation de glycogène pendant la phase Fed-batch. L’homme du métier saura définir les débits d’alimentation permettant d’avoir des teneurs en substrat carboné dans le moût de fermentation inférieures 5 g/L, de préférence inférieures à 1 g/L, plus préférentiellement inférieures à 0,1 g/L.
La phase de croissance est suivie par une phase de maturation. Durant cette phase de maturation on peut observer surtout une baisse de la masse sèche par litre de moût liée à la consommation des sucres de réserve accumulés pendant la croissance, en particulier le glycogène. De façon concomitante on peut observer une augmentation de la quantité de phycocyanine par gramme de matière sèche. Il en est de même pour la teneur en protéines. Ce procédé de maturation permet d’obtenir une biomasse à teneur faible en glycogène.
Selon un premier mode de réalisation de l’invention on alimente la culture avec un milieu d’alimentation de maturation ne comprend pas de source de carbone. Il est entendu que l’absence de source de carbone est observée également dans le cas où le milieu d’alimentation de maturation comprendrait des traces détectables de source de carbone.
Selon un mode préféré de réalisation de l’invention, le sevrage est total, c’est à dire que l’on arrête d’alimenter la culture des cellules en milieu de culture, les cellules engageant leur maturation en se nourrissant des éléments résiduels du mout de fermentation et de leurs réserves cellulaires.
De manière avantageuse, la biomasse obtenue comprend moins de 20% de glycogène en masse par rapport à la masse de matière sèche (% de la MS), de préférence moins de 15% de la MS, plus préférentiellement de moins de 10% de la MS.
Le temps de maturation peut-être plus ou moins long en fonction de la température de culture. Plus la température se rapprochera de celle de l’optimum de croissance plus la phase de maturation sera courte.
Il est possible de réaliser également des cultures en mode « FedBatch » en réalisant de manière concomitante les phases de croissance et de maturation en imposant par l’alimentation en source de carbone un taux de croissance plus faible, limitant ainsi l’accumulation de glycogène dans la souche. Le taux de croissance pour effectuer cette maturation est déterminé en fonction du taux de croissance maximal de la souche que l’homme du métier saura déterminer. Ce taux de croissance devra être inférieur à 80 % du taux de croissance maximal de la souche, préférentiellement inférieur à 70% du taux de croissance maximal de la souche, plus préférentiellement inférieur à 50% du taux de croissance maximal de la souche.
Le procédé selon l’invention en mode « FedBatch » permet d’obtenir des moûts de fermentation comprenant au moins 70 g/L de MS (figure 4), et une biomasse avec une teneur en PC, en particulier en C-PC, d’au moins 10 mg/g de MS (figure 5) et une teneur en protéines d’au moins 40% de la MS (figure 5).
Culture en continu.
Culture en continu.
La croissance en continu avec une limitation en substrat a déjà été décrite par Sloth et al., 2006 avec des niveaux de détection inférieurs à 0,05 g/l, ce que les auteurs estiment être la limite de détection analytique. Dans ce cas de figure le milieu d’alimentation est apporté en continu dans la culture mais est consommé presque instantanément par les cellules et donc n’est pas quantifiable. Le but des auteurs dans cet article est de limiter l’inhibition de la synthèse de PC lié à une concentration en glucose significative dans le milieu, le glucose étant connu pour réprimer la synthèse de PC. Les teneurs en PC dans ces conditions sont très faibles environ 28 mg/g de matière sèche, avec une teneur en biomasse de l’ordre de 5g/l de matière sèche.
L’objet de l’invention est de réaliser une culture en continu pour augmenter la productivité en biomasse et en PC par rapport à une culture en Fed-Batch. Il est possible, par le procédé selon l’invention, d’atteindre une masse sèche de 65 -70 g/l, voir plus, et un contenu en PC compris entre 25 et 90 mg/g de MS, voire plus.
Selon un premier mode de réalisation de l’invention, la phase de maturation est mise en œuvre par transfert d’une partie du moût de la culture en continu dans une cuve sans apport nutritif. Comme pour le mode de culture en « FedBatch » décrit précédemment, il y a de manière concomitante une diminution de la teneur en glycogène et une augmentation de la teneur en phycocyanine et en protéines.
L’homme du métier saura déterminer le temps nécessaire à la maturation en fonction de paramètres connus comme la température à laquelle la biomasse est maintenue sans alimentation et en fonction de l’objectif recherché. Ce temps de maturation sera d’au moins 12h, préférentiellement au moins 48h, plus préférentiellement au moins 72h.
On peut aussi mettre en œuvre simultanément les étapes de croissance et de maturation en imposant un taux de croissance réduit via le débit du milieu d’alimentation. De manière avantageuse, le taux de croissance est inférieur à 0,06 h-1, préférentiellement inférieur à 0,03 h-1, plus préférentiellement inférieur à 0,015h-1.
De manière avantageuse, le taux de croissance est inférieur à 80% du taux de croissance maximal de la souche, préférentiellement inférieur à 60% du taux de croissance maximal de la souche, plus préférentiellement inférieur à 40% du taux de croissance maximal de la souche. Dans la figure 7, après 400h de culture, le taux de croissance a été réduit à une valeur inférieure à 80% du taux de maximal de croissance, ce qui a permis d’augmenter la teneur en PC et en protéines dans la biomasse et de réduire la teneur en glycogène, par rapport au taux de croissance initialement imposé.
La teneur en source de carbone assure l’obtention d’une teneur en matière sèche d’au moins 65 g/L, voire d’au moins 70 g/L, plus particulièrement d’au moins 80 g/L.
La biomasse ainsi obtenue avec maturation séparée ou simultanée à un contenu en glycogène inférieur à 20%, avantageusement de moins de 15% voire de moins de 10%. La biomasse obtenue a une teneur en protéines d’au moins 45% de la MS, avantageusement d’au moins 50%.
La teneur en phycocyanine, en particulier en C-PC sera d’au moins 20 mg/g de MS, avantageusement de 25 à 50 mg/g de MS. Avec certaines sources de carbone, comme les polyols, on peut atteindre des teneurs en C-PC supérieures à 50 mg/g de MS.
Production de Porphyrine dans le moût de fermentation (b.1).
Plusieurs études ont démontré que plusieurs étapes clés de la voie de synthèse de la phycocyanine et de la chlorophylle sont induites par la lumière et d’autres réprimées en présence de substrat organique dans le milieu (Foleyet al.,1982 ; Brownet al.,1982 ; Troxleret al.,1989 ; Rhie and Beale, 1994 ; Stadnichucket al.,1998). D’après la littérature la culture en hétérotrophie conduit à l'excrétion de coproporphyrine dans le milieu de croissance et provoque une réduction des teneurs en pigment dans la cellule (phycocyanobiline et chlorophylle) lors du passage du coproporphyrinogène III au protoporphyrinogène IX. En condition mixotrophe, la lumière induit à la fois la biosynthèse de pigments photosynthétiques et l’excrétion de porphyrines dans le milieu. Le passage d’une forme de porphyrine à une autre se faisant parfois par réaction spontanée, il est donc possible de retrouver plusieurs formes de porphyrines dans le milieu de croissance (Brownet al.,1982 ; Stadnichucket al.,1998).
Contrairement à ce qui est décrit dans la littérature, la mise en œuvre du procédé selon l’invention n’entraine pas d’excrétion de porphyrine tant qu’une source de carbone organique, notamment glucose, glycérol, lactose, ou saccharose, est présente dans le milieu. Les porphyrines ne sont détectées que pendant la phase de maturation (sans carbone organique dans le milieu) que ce soit pour une culture en Fed-batch ou en continu. Lors d’ajout de substrat organique dans le milieu après une phase de maturation on peut observer une re-consommation des porphyrines par les cellules et un retour à des niveaux non détectables de ces porphyrines dans le jus de fermentation.
Après une phase de maturation selon l’invention, on obtient un moût de fermentation comprenant une biomasse avec une teneur faible en glycogène, riche en protéines et en PC, telle que définie plus haut, et un jus contenant des porphyrines.
Ces porphyrines produites par les ARUs, en particulier parGaldieria sulphurariasont des chélatants naturels qui peuvent être utilisés par exemple pour des traitements contre des nématodes (US 2006/0206946). Certaines molécules comme la Protoporphyrine IX pourraient également avoir un intérêt dans le domaine médical pour des traitements de cancers par photothérapie (Huanget al.,2015)
L’invention concerne donc un procédé qui comprend une étape de récupération du jus de fermentation et d’extraction des porphyrines à partir de ce jus.
Le jus de fermentation est récupéré par toutes méthodes usuelles de séparation de la biomasse, en particulier par centrifugation (centrifugeuse à assiettes ou sedicanteur),bien connues de l’homme du métier, ou par filtration (filtre plaque, filtre presse, filtration tangentielle céramique ou organique).
Les porphyrines peuvent être extraites par des méthodes usuelles, comme la chromatographie (Chromatographie d’affinité ou d’exclusion de taille).
Les porphyrines extraites peuvent être purifiées puis conditionnées pour leur usage ultérieur, en particulier en thérapie.
Broyage de la biomasse (c.1).
Broyage de la biomasse (c.1).
Pour extraire les phycocyanines et/ou les protéines de la biomasse, il est nécessaire d’effectuer une lyse cellulaire qui libérera les produits recherchés. Les ARUs et en particulierGaldieria sulphurariaont une paroi cellulaire très résistante qui rend difficile la lyse par des méthodes usuelles à moins de se mettre dans des conditions opératoires qui vont dégrader les phycocyanines recherchées.
Or le rendement de produit récupéré, phycocyanines et/ou protéines, ne dépend pas que de la teneur en produit dans la biomasse, mais aussi de la capacité à en extraire le maximum de cette biomasse. Cette capacité d’extraction dépendra d’une part de l’efficacité de la lyse cellulaire, mais aussi de sa mise en œuvre dans des conditions qui n’entraine pas de dégradation substantielle des phycocyanines.
Le broyage s’axe autour de deux problématiques majeures, à savoir : le taux de broyage, et la chaleur générée par la friction mécanique. Dans le cas de la phycocyanine, cette maitrise de la chaleur est d’autant plus importante car il s’agit d’une molécule thermosensible. Des essais ont été réalisés avec un homogénéisateur à haute pression de type Bertoli dans les conditions décrites dans l’exemple 7. Le broyage par homogénéisateur haute pression nécessite d’effectuer plusieurs passages pour obtenir un taux de lyse conséquent. Le passage d’une biomasse deGaldieria sulphurarian’a pas permis d’obtenir un taux de lyse supérieur à 40 % malgré 3 passages successifs. A chacun des passages une hausse de la température a pu être observée jusqu’à atteindre une biomasse ayant une température aux alentours de 70°C ayant une couleur verte marron où la majorité de phycocyanine a été dégradée.
L’invention concerne donc un procédé de lyse des cellules d’ARUs, en particulier deGaldieria sulphurariacaractérisé en ce que la lyse est faite par broyage avec un broyeur à billes en maintenant la biomasse d’ARUs pendant le broyage à une température inférieure à 50°C.
L’invention consiste à réguler la température de la biomasse pendant le broyage, à l’intérieur de la chambre de broyage, pour que celle-ci n’excède pas les 50°C, préférentiellement 47°C, plus préférentiellement 40°C et moins. Cette régulation de température peut se faire par un système de refroidissement par eau de la double enveloppe du broyeur ou bien par injection dans le broyeur d’une biomasse préalablement refroidie à des températures inférieures à 20°C.
Le procédé de broyage selon l’invention s’applique pour une biomasse indépendamment de son mode d’obtention (mode de fermentation et isolation). Il est particulièrement adapté et de manière préférentielle pour une biomasse obtenue par le procédé de culture selon l’invention décrit plus haut avec une teneur diminuée en glycogène.
L’invention concerne aussi la biomasse lysée ainsi obtenue.
Les inventeurs ont pu constater que la biomasse broyée selon l’invention permettait une meilleure digestibilité des protéines que la biomasse non broyée. Cette amélioration de la digestibilité est montrée par des tests de digestibilitéin vitro(Boisen and Fernandez, 1995).
| Echantillons | Digestibilité | Protéines totales |
| Spiruline | 79,3 (± 2) % | 68,2 (± 2) % |
| G. sulphuraria(broyée) | 92,2 (± 2) % | 63,4 (± 1,9) % |
| G. sulphuraria(non broyée) | 66 (± 2) % | 63,9 (± 1,9) % |
L’invention concerne donc une biomasse d’ARUs broyée et en particulier une biomasse deGaldieria sulphurariasusceptible d’être obtenue par le procédé de broyage selon l’invention.
L’invention concerne en particulier une la biomasse broyée deGaldieria sulphurariade composition décrite ci-dessous.
| Facteurs Nutritionnels | |
| Valeur Energétique | 394 (± 22) kcal/100 g |
| Protéines | 64.8 (± 9.3) g/100 g |
| Lipides | 6.15 (± 0.5) g/100 g |
| Fibres | 7.65 (± 5.16) g/100 g |
| Carbohydrates | 16.1 (± 2.2) g/100g |
| Cendres | 4.1 (± 0.6) g/100 g |
| Humidité | 4.1 (± 0.6) g/100 g |
| Phycocyanine | 7 (± 0.3) g/100 g |
La composition en acides aminés est donnée dans le Tableau suivant.
| g/100g | Spiruline | Galdieiria sulphuraria |
| Tryptophan | 0,84 | 0,76 |
| Threonine | 2,78 | 3,06 |
| Aspartic acid | 5,47 | 4,73 |
| Serine | 2,74 | 3,54 |
| Lysine | 2,7 | 3,45 |
| Valine | 3,48 | 3,15 |
| Proline | 2,04 | 2,17 |
| Alanine | 4,11 | 3,44 |
| Phénylalanine +Tyrosine | 5 | 5,55 |
| Isoleucine | 3,17 | 2,6 |
| Glycine | 2,85 | 2,30 |
| Arginine | 3,6 | 3,14 |
| Leucine | 5,02 | 4,1 |
| Histidine | 1,09 | 0,86 |
| Acide Glutamique | 8,02 | 7,41 |
| Méthionine + cystéine | 2,19 | 1,88 |
La composition Lipidique est la suivante.
| Acides gras | % lipides totaux | g/100g |
| C14:0 Ac. myristique | 2,6 | 0,16 |
| C16:0 Ac. palmitique | 27,9 | 1,7 |
| C18:0 Ac. stéarique | 8,8 | 0,54 |
| C18:1 (n-9c) Ac. oléique | 33,5 | 2,1 |
| C18:2 (n-6c) Ac. linoléique (LA) ω6 | 19,3 | 1,18 |
| C18:3 (n-3) Ac. α-linolénique (ALA) ω3 | 1,8 | 0,1 |
| Ratio ω6 / ω3 | 10,32 |
L’invention concerne aussi l’utilisation de cette biomasse broyée comme complément alimentaire ou comme aliment pour l’alimentation humaine ou animale.
Extraction de la phycocyanine (d1).
Extraction de la phycocyanine (d1).
L’invention concerne aussi un procédé d’extraction de la phycocyanine à partir d’une biomasse de cellules lysées d’ARUs, en particulier deGaldieria sulphuraria, caractérisé en ce qu’il comprend des lavages successifs dans des quantités d’eau représentant au total moins de 4 fois, de préférence de 2 à 3 fois, plus préférentiellement environ 3 fois le volume total de biomasse lysée.
Cette biomasse lysée comprend une suspension de résidus cellulaires insolubles dans une solution aqueuse comprenant différents extraits cellulaires solubilisés suite à la lyse cellulaire, dont les phycocyanines. La biomasse lysée comprend avantageusement une matière sèche d’au moins 2%, préférentiellement d’au moins 5%, plus préférentiellement d’au moins 7%.
Le volume total d’eau (Ve) nécessaire à l’extraction est calculé en fonction du volume de la biomasse lysée à traiter (Vb) et représentera jusqu’à 4 fois ce volume (Ve/Vb est inférieur ou égal à 4). On peut bien entendu mettre en œuvre l’invention avec un volume total d’eau plus important, mais l’économie du procédé reste alors moins intéressante du fait des volumes d’eau à traiter par la suite pour récupérer la phycocyanine.
Ce volume total d’eau est ensuite scindé en plusieurs fractions qui serviront à extraire la phycocyanine par des passages successifs sur la biomasse, le nombre de fractions (n) étant d’au moins 2, de préférence au moins 3. L’homme du métier peut prévoir d’effectuer l’extraction avec plus de 3 fractions d’eau, tout en devant prendre en considération l’ensemble des paramètres économiques de la mise en œuvre du procédé, comme le prix de revient de l’immobilisation du matériel et de la répétition des manipulations de la biomasse. De manière préférée, le nombre de fraction est de 3.
Selon un premier mode de réalisation de l’invention, les fractions ont des volumes respectifs différents les uns des autres. Selon un autre mode de réalisation de l’invention, toutes les fractions ont le même volume égal à Ve/n.
L’homme du métier saura déterminer le nombre de fractions et le volume respectif de chaque fraction de manière à optimiser le procédé de préparation de phycocyanine qu’il mettra en œuvre.
Des lavages successifs des éléments insolubles culotés sont nécessaires pour extraire une quantité appropriée de la phycocyanine de la biomasse. Après plusieurs lavages, on constate que les proportions de C-PC et d'APC dans le culot sont inversées. On voit bien sur la figure 16 qu'il est préférable d'extraire la phycocyanine avec de petits volumes successifs d'eau plutôt qu'avec un grand volume équivalent d'eau (figure 16).
On trouve en ordonnée et en partant de la gauche du diagramme trois blocs S1, S2 et S3 qui correspondent à 3 extractions successives faites avec 3 fractions d’eau de volume égal, le volume total d’eau Ve étant de 1 fois le volume de biomasse Vb pour le premier bloc (dilution 1/2 en série), de 2 fois pour le deuxième bloc (dilution 1/3 en série) et de 3 fois pour le troisième bloc (dilution 1/4 en série). La barre S1 donne la valeur de PC extraite par la première extraction. La barre S2 donne la valeur cumulée de PC extraite par la première et la deuxième extraction. La barre S3 donne la valeur cumulée pour les 3 fractions employées de manière successive. On trouve ensuite 5 essais d’extraction en une seule fois avec différents volumes d’eau, de 5X à 12X.
D'après la figure 16, on peut voir qu'un volume d'eau initial plus important, lors de la première extraction, donne de meilleurs résultats jusqu'à une certaine limite (5X à 12X). En utilisant la méthode des extractions en série, nous pouvons constater un gain réel en termes d'efficacité d'extraction et de réduction d’utilisation d'eau. Par exemple, 3 séries d'extractions donnent de meilleurs résultats qu'une seule extraction et réduisent la quantité totale d'eau utilisée d'au moins un facteur 2.
Les eaux de lavages récupérées pour chaque extraction successive comprenant la phycocyanine peuvent être traitées séparément pour récupérer la phycocyanine ou bien assemblées avant cette récupération.
Le procédé d’extraction selon l’invention est adapté pour toute biomasse d’ARUs, en particulier deGaldieria sulphuraria, lysée, quel que soit la méthode de culture employée pour la production de la biomasse et la méthode employée pour la lyse cellulaire. De manière préférentielle, la méthode d’extraction selon l’invention est particulièrement adaptée pour une biomasse avec de faibles teneurs en glycogène obtenues par le procédé selon l’invention décrit plus haut et/ou pour la biomasse lysée par la méthode de broyage selon l’invention définie plus haut.
La solution de phycocyanine obtenue est généralement traitée de manière à en isoler la phycocyanine. Les méthodes pour récupérer la phycocyanine d’une solution aqueuse sont bien connues de l’homme du métier. On citera en particulier la précipitation acide décrite dans la demande de brevet WO 2018/178334.
Elle peut également être isolée par précipitation sélective qui consiste à ajuster le pH de la solution initiale à une valeur choisie dans une plage de valeurs de pH dans laquelle la phycocyanine est moins soluble (également appelée plage d’instabilité) et à concentrer la phycocyanine dans la solution pour favoriser sa précipitation, puis à récupérer la phycocyanine précipitée. Cette plage d’instabilité va en particulier de pH 4,4 à 5,5 pour des phycocyanines résistantes aux pH acides produites parGaldieria sulphuraria. Bien entendu, l’homme du métier saura déterminer une telle plage d’instabilité pour d’autres phycocyanines produites par d’autres ARUs par simple expérimentation. Une telle méthode est décrite en particulier dans la demande de brevet FR 1900278 déposée le 11 janvier 2019.
On peut également, avant récupération de la phycocyanine, traiter la solution aqueuse pour baisser sa teneur en glycogène, par une dégradation enzymatique du glycogène. Les traces de ces polysaccharides susceptibles d’être entrainés avec la précipitation des phycocyanines, déjà faibles, sont encore plus réduites lorsque les polysaccharides sont lysés en polyosides de faibles poids moléculaires encore plus solubles. Au surplus, lorsque l’étape de concentration est réalisée par filtration tangentielle, les polyosides de faibles poids moléculaires sont éliminés avec les autres petites molécules en solution, ce qui favorise l’obtention de solution en phycocyanines à plus grande teneur encore. En particulier, la lyse enzymatique du glycogène est mise en œuvre à un pH inférieur ou égal à 5, de préférence d’environ 4,5, à température ambiante. Ces conditions de température et de pH sont particulièrement adaptées pour préserver la phycocyanine au cours de la réaction enzymatique. Les enzymes actives en condition de pH acide et à température ambiante sont choisies parmi des enzymes connues pour une activité glucuronidase α1-4 , glucosidase α1-4 (ou alpha-glucosidase). On citera en particulier des pectinases connues pour dégrader la pectine et en particulier des pectinases extraites de champignons filamenteux commeAspergillus, plus particulièrement de pectinases extraites d’Aspegillus aculeatus, comme les enzymes commercialisées sous la dénomination Pectinex® par la société Novozymes. La lyse enzymatique du glycogène pourra également être réalisée avec une glucosidase α1-6 en plus de la glucuronidase α1-4 ou glucosidase α1-4. Des glucosidases α1-6 actives dans les conditions de pH et de température exposées ci-dessus sont également connues de l’homme du métier. Il s’agit en particulier des pullulanases connues pour hydrolyser les liaisons glucosidiques α1-6 de la pullulane, notamment connues pour supprimer les ramifications de l’amidon. Il s’agit généralement d’enzymes extraites de bactéries, notamment des genresBacillus. US 6,074,854, US 5,817,498 et WO 2009/075682 décrivent de telles pullulanases extraites deBacillus deramificansou deBacillus acidopullulyticus. On connaît aussi des pullulanases disponibles dans le commerce, notamment sous les dénominations « Promozyme D2 » (Novozymes), « Novozym 26062 » (Novozymes) et « Optimax L 1000 » (DuPont-Genencor). On notera que des mélanges pullulanases/alpha-amylases sont décrits dans l’état de la technique, mais en particulier pour produire du sirop de glucose à partir de l’amidon (US 2017/159090). L’homme du métier saura déterminer les conditions réactionnelles appropriées pour réduire au mieux les quantités de glycogène en fonction de la teneur initiale en glycogène dans la solution à traiter, la quantité d’enzymes employée et la pureté recherchée pour la phycocyanine produite. Une telle méthode est décrite en particulier dans la demande de brevet FR 1900278 déposée le 11 janvier 2019.
La phycocyanine récupérée peut ensuite être purifiée par des méthodes connues de l’homme du métier, comme la diafiltration.
La phycocyanine obtenue par le procédé d’extraction selon l’invention a un indice de pureté d’au moins 2, de préférence d’au moins 3, voire supérieur à 4. Cet indice de pureté est mesuré par mesure d’absorbance avec la méthode décrite par Moon & al. (2014).
De manière avantageuse, la phycocyanine obtenue est une phycocyanine qui a un rapport glycogène/phycocyanines (en poids sec) inférieur à 6, avantageusement inférieur à 4, de préférence inférieur à 3, plus préférentiellement inférieur à 2,5, encore plus préférentiellement inférieur à 1.
L’invention concerne également l’utilisation des phycocyanines obtenues comme colorants, en particulier comme colorants alimentaires. Elle concerne aussi des aliments, solides ou liquides, en particulier des boissons qui comprennent une phycocyanine obtenue par le procédé d’extraction selon l’invention.
Les résidus solides restant après lavage sont également récupérés. Il s’agit d’un résidu de biomasse enrichi en protéines qui peut également être employé pour la préparation de compléments alimentaires ou d’aliments pour l’alimentation humaine ou animale.
Selon un mode particulier de réalisation, le lavage de la biomasse lysée comprend une acidification de la suspension de biomasse à un pH inférieur ou égal à 5. La biomasse résiduelle obtenue après extraction de la phycocyanine comprend au moins 60% de protéines par rapport à la matière sèche, et au moins une teneur en sucres totaux inférieure à 20% par rapport à la matière sèche et/ou une teneur en glycogène inférieure à 10% par rapport à la matière sèche et/ou teneur en matières grasses d’au moins 5% par rapport à la matière sèche. Une telle méthode de récupération d’une biomasse enrichie en protéines est notamment décrite dans la demande de brevet FR 1857950 déposée le 5 septembre 2018.
EXEMPLES .
Matériel et méthodes.
Souche.
EXEMPLES .
Matériel et méthodes.
Souche.
Galdieria sulphuraria UTEX#2919, également appelée Cyanidium caldarium.
Conditions de culture en mode « FedBatch ».
Conditions de culture en mode « FedBatch ».
Les cultures sont réalisées dans des bioréacteurs de 1 à 2 L de volume utile avec automates dédiés et supervision par station informatique. Le pH de la culture est régulé via l’ajout de base (solution d’ammoniaque 14% NH3 w/w) et/ou d’acide (solution d’acide sulfurique 4N). La température de culture est fixée à 37°C. L’agitation est réalisée grâce à 2 mobiles d’agitation : 1 turbine Rushton à 6 pâles droites positionnées à l’extrémité inférieure de l’arbre d’agitation au-dessus du "sparger" et 1 hélice tripâle HTPG2 placé sur l’arbre d’agitation. La pression en oxygène dissout dans la phase liquide est régulée dans le milieu tout au long de la culture par la vitesse de rotation de l’arbre d’agitation (250-1800 t/min), le débit de ventilation par l’air et/ou d’oxygène. Les paramètres de régulation, intégrés dans l’automate de supervision, permettent de maintenir une pression partielle en oxygène dissout dans la phase liquide comprise entre 5 et 30 % de la valeur de saturation par l’air dans des conditions identiques de température, de pression et de composition du milieu. Le temps de culture a été compris entre 50 et 300 heures.
Conditions de culture en mode continu.
Conditions de culture en mode continu.
Les cultures sont réalisées dans des réacteurs de 1 à 2 L de volume utile avec automates dédiés et supervision par station informatique. Le pH de la culture est régulé via l’ajout de base (solution d’ammoniaque 14% (w NH3/w) et/ou d’acide (solution d’acide sulfurique 4N). La température de culture est fixée à 37°C. L’agitation est réalisée grâce à 2 mobiles d’agitation : 1 turbine Rushton à 6 pâles droites positionnée à l’extrémité inférieure de l’arbre d’agitation au-dessus du "sparger" et 1 hélice tripâle HTPG2 placéé sur l’arbre d’agitation. La pression en oxygène dissout dans la phase liquide est régulée dans le milieu tout au long de la culture, par la vitesse de rotation de l’arbre d’agitation (250-1800 t/min), le débit de ventilation par l’air et/ou d’oxygène. Les paramètres de régulation, intégrés dans l’automate de supervision, permettent de maintenir une pression partielle en oxygène dissout dans la phase liquide comprise entre 5 et 30 % de la valeur de saturation par l’air dans des conditions identiques de température, de pression et de composition du milieu. Le temps de culture a été compris entre 50 et 300 heures. Le débit d’alimentation du fermenteur en continu est ajusté pour qu’à aucun moment la source de carbone ne soit détectée dans le milieu de culture.
Milieu d’alimentation.
Milieu d’alimentation.
Pour le milieu d’alimentation en mode « Fed-batch » ou en continu, la quantité de source de carbone est ajustée en fonction de la masse sèche cible de fin de « FedBatch » ou de 100g/L de masse sèche pour la culture en continu. Tous les autres éléments du milieu sont ajoutés en respectant les proportions utilisées pour le milieu pied de cuve défini dans les exemples.
Suivi des cultures.
Suivi des cultures.
Le suivi de croissance se fait par mesure de la masse sèche (filtration sur filtre GF/F, Whatman, puis séchage en étuve, à 105°C, pendant 24 h minimum avant pesée).
Dosage des porphyrines.
Dosage des porphyrines.
Le dosage des acides organiques a été réalisé par HPLC (Shimatsu) en mode isocratique H2SO4(5 mM) et détection RI (Refractive Index).
Dosage de PC.
Dosage de PC.
L’estimation de la teneur en phycocyanine par gramme de matière sèche a été réalisée à différents temps de culture grâce à la méthode décrite par Moon et collaborateur [Moonet al., Korean J. Chem. Eng.,2014, 1-6]
Dosage du glycogène.
Dosage du glycogène.
L’estimation de la teneur en glycogène par gramme de matière sèche a été réalisée à différents temps de culture grâce à la méthode d’extraction décrite par Martinez-Garcia et collaborateur [Martinez-Garciaet al., Int J Biol Macromol. 2016 ; 89:12-8].
Exemple
1 :
Fermentation en mode Fed-batch avec phase de maturation sur glycérol.
Milieu de culture.
Milieu de culture.
Pied de cuve : 30 g/L glycérol, 8 g/L (NH4)2SO4, 250mg/L KH2PO4, 716mg/L MgSO4, 44mg/L CaCl2, 2H2O, 0.2843849 g/L K2SO4, 0.07 g/L FeSO4, 7H2O, 0.01236 g/L Na2EDTA, 0.00657 g/L ZnSO4,7H2O, 0.0004385 g/L CoCl2,6H2O, 0.00728 g/L MnCl2,4H2O, 0.005976 g/L (NH4)6Mo7O24, 4H2O, 0.005976 g/L CuSO4,5H2O, 0.00016 g/L NaVO3, 0.01144 g/L H3BO3, 0.00068 g/L Na2SeO3.
Les résultats sont présentés dans les figures 2 et 3.
Exemple
2 :
Fermentation en mode « Fed-batch » sur glucose avec phase de maturation.
Milieu de culture.
Milieu de culture.
Pied de cuve : 30 g/L glucose, 8 g/L (NH4)2SO4, 250mg/L KH2PO4, 716mg/L MgSO4, 44mg/L CaCl2, 2H2O, 0.2843849 g/L K2SO4, 0.07 g/L FeSO4, 7H2O, 0.01236 g/L Na2EDTA, 0.00657 g/L ZnSO4,7H2O, 0.0004385 g/L CoCl2,6H2O, 0.00728 g/L MnCl2,4H2O, 0.005976 g/L (NH4)6Mo7O24, 4H2O, 0.005976 g/L CuSO4,5H2O, 0.00016 g/L NaVO3, 0.01144 g/L H3BO3, 0.00068 g/L Na2SeO3.
Les résultats sont présentés sur les figures 4 et 5.
Exemple
3 :
Fermentation en mode « Fed-Batch » sur saccharose avec phase de maturation
Milieu de culture
Milieu de culture
Pied de cuve : 30 g/L saccharose, 8 g/L (NH4)2SO4, 250mg/L KH2PO4, 716mg/L MgSO4, 44mg/L CaCl2, 2H2O, 0.2843849 g/L K2SO4, 0.07 g/L FeSO4, 7H2O, 0.01236 g/L Na2EDTA, 0.00657 g/L ZnSO4,7H2O, 0.0004385 g/L CoCl2,6H2O, 0.00728 g/L MnCl2,4H2O, 0.005976 g/L (NH4)6Mo7O24, 4H2O, 0.005976 g/L CuSO4,5H2O, 0.00016 g/L NaVO3, 0.01144 g/L H3BO3, 0.00068 g/L Na2SeO3.
Les résultats sont présentés sur les figures 6 et 7.
Exemple
4 :
Fermentation en mode « Fed-Batch » sur Perméat de lait avec phase de maturation.
Milieu de culture.
Milieu de culture.
Pied de cuve : 30 g/L perméat de lait, 8 g/L (NH4)2SO4, 716mg/L MgSO4, 0.07 g/L FeSO4, 7H20, 0.01236 g/L Na2EDTA, 0.00657 g/L ZnSO4,7H2O, 0.0004385 g/L CoCl2,6H2O, 0.00728 g/L MnCl2,4H2O, 0.005976 g/L (NH4)6Mo7O24, 4H2O, 0.005976 g/L CuSO4,5H2O, 0.00016 g/L NaVO3, 0.01144 g/L H3BO3, 0.00068 g/L Na2SeO3.
Les résultats sont présentés sur les figures 8 et 9.
Exemple
5 :
Culture en Continu d’une souche de
Galdieria
sur glycérol.
Milieu de culture.
Milieu de culture.
Pied de cuve : Pied de cuve : 30 g/L glycérol, 8 g/L (NH4)2SO4, 250mg/L KH2PO4, 716mg/L MgSO4, 44mg/L CaCl2,2H2O, 0.2843849 g/L K2SO4, 0.07 g/L FeSO4, 7H20, 0.01236 g/L Na2EDTA, 0.00657 g/L ZnSO4,7H2O, 0.0004385 g/L CoCl2,6H2O, 0.00728 g/L MnCl2,4H2O, 0.005976 g/L (NH4)6Mo7O24, 4H2O, 0.005976 g/L CuSO4,5H2O, 0.00016 g/L NaVO3, 0.01144 g/L H3BO3, 0.00068 g/L Na2SeO3.
Les résultats sont présentés sur les figures 10 et 11.
Exemple
6 :
Culture en Continu d’une souche de
Galdieria
sur perméat de lait.
Milieu de culture.
Milieu de culture.
Pied de cuve : Pied de cuve : 30 g/L perméat de lait, 8 g/L (NH4)2SO4, 716mg/L MgSO4, 0.2843849 g/L K2SO4, 0.07 g/L FeSO4, 7H2O, 0.01236 g/L Na2EDTA, 0.00657 g/L ZnSO4,7H2O, 0.0004385 g/L CoCl2,6H2O, 0.00728 g/L MnCl2,4H2O, 0.005976 g/L (NH4)6Mo7O24, 4H2O, 0.005976 g/L CuSO4,5H2O, 0.00016 g/L NaVO3, 0.01144 g/L H3BO3, 0.00068 g/L Na2SeO3.
Les résultats sont représentés sur les figures 12 et 13.
Exemple
7 :
Broyage par HHP sans refroidissement de biomasse.
Mode opératoire.
Mode opératoire.
Une biomasse issue d’une culture selon un mode continu est lavée par centrifugations successives puis concentrée jusqu’à une concentration de 1.4.1010cellules/mL. Un volume de 1L de biomasse est alors refroidi à 16°C avant de subir 3 homogénéisations successives à 1200 bars sur homogénéisateur Bertoli Atomo, sans refroidissement entre chaque série. Pour chacune d’elle est suivi, la température de la biomasse, la lyse cellulaire par dénombrement avec cellules de Malassez et la concentration en phycocyanine dans la biomasse.
Les températures de broyage mesurées pour les 3 homogénéisations successives sont respectivement de 46,7°C, 57,6 °C et 67 °C.
Les pourcentages de cellules non lysées et les teneurs en phycocyanine sont donnés sur la figure 12.
Exemple
8 :
Broyage par HHP avec refroidissement de biomasse.
Mode opératoire.
Mode opératoire.
Une biomasse issue d’une culture selon un mode continu est lavée par centrifugations successives puis concentrée jusqu’à une concentration de 2.1010cellules/mL. Un volume de 1L de biomasse est alors refroidi à 16°C avant de subir 3 homogénéisations successives à 1200 bar sur homogénéisateur Bertoli Atomo. Entre chaque homogénéisation la température de la biomasse est ramenée à 16°C. De la même façon sont suivies, la température de la biomasse, la lyse cellulaire par dénombrement avec cellules de Malassez et la concentration en phycocyanine dans la biomasse.
Les températures de la biomasse mesurées en début et fin de broyage sont les suivantes.
| T° début de broyage | 16°C | 16,1°C | 15,4°C | 14,4°C |
| T° fin de broyage | 42°C | 45,2°C | 47,7°C | 46°C |
Les pourcentages de cellules non lysées et les teneurs en phycocyanine sont donnés sur la figure 13.
Il est apparu également que plus le pH de la biomasse broyée est acide et plus la phycocyanine est sensible à la dégradation par la chaleur. Il est donc préférable d’ajuster le pH des cellules entre 5 et 7 avant de les broyer, et ce qu’elle que soit la méthode de broyage si celle-ci s’accompagne d’un dégagement de chaleur.
Exemple
9 :
Thermosensibilité de la phycocyanine dans la biomasse.
Mode opératoire.
Mode opératoire.
Une biomasse issue d’une culture selon un mode continu est lavée par centrifugations successives puis concentrée à une matière sèche de 150 mg/g avant d’être broyée par broyeur à billes (WAB, multilab) dans des conditions permettant la préservation du pigment et un taux de lyse de 90%. Des échantillons de lysat sont ajustés à des pH de 2.4 à 6 et une cinétique de 0 à 120 minutes est réalisée sur différentes températures allant de 50 à 70°C. Pour chaque temps une quantification de la phycocyanine est réalisée.
Les résultats sont présentés sur la figure 14.
Exemple
10 :
Effet de la taille des billes sur le broyage et le contrôle de la température.
Mode opératoire.
Mode opératoire.
Des cellules deGaldieria sulphurariasont centrifugées 5 min à 20 000g puis re-suspendues dans un tampon Tris-Cl 10 mM pH 7. Un aliquot de cellules 1/3 du volume d’un tube Eppendorf de 2 ml Safelock est rempli avec cette suspension, un autre 1/3 avec des billes céramiques du diamètre testé (Netzsch 0,8 mm ; 0,6 mm ; 0,3 mm ; Plus 0,2 mm ; Nano 0,2 mm ; Plus 0,1 mm ; et 0,05 mm). Les tubes sont placés dans un appareil de type TissueLyser II (Qiagen) et agités 2 min à 30Hz. Le taux de lyse se calcule par dénombrement à la cellule de Malassez comparativement au tube témoin ne contenant pas de billes.
Les résultats sont représentés sur la figure 15.
On voit que le diamètre des billes affecte grandement l’efficacité du broyage. Plus le diamètre de bille diminue plus le taux de lyse augmente jusqu’à atteindre un optimum pour des billes de 0,2 mm de diamètre. En dessous de ce diamètre l’efficacité de lyse diminue de nouveau jusqu'à atteindre le taux le plus faible pour les billes de 0,05 mm de diamètre.
Des taux de broyage proche de 100% peuvent être atteint avec des billes plus grosses si le temps de broyage est augmenté. Toutefois, l’augmentation du temps de broyage se traduit par une élévation de la température dans la chambre de broyage avec le débit d’alimentation du broyeur à billes imposé. Cette élévation de température se fait au détriment de la teneur en phycocyanine de la biomasse lysée.
Exemple
11 :
Effet du taux de remplissage de la chambre sur le taux de broyage.
Mode opératoire.
Mode opératoire.
Les cellules sont broyées dans un broyeur à billes de modèle Multilab de chez WAB. La chambre de broyage est remplit avec des billes en céramique avec de 0,8 mm de diamètre a 50% et 65%. Le taux de remplissage à 65% étant le taux maximal de remplissage. La vitesse de module de broyage et le débit sont identiques dans les deux cas. Le taux de lyse en sortie de broyage se calcule par dénombrement à la cellule de Malassez comparativement à la biomasse d’entrée non broyée.
On constate que le meilleur taux de lyse est obtenu lorsque la chambre est à son taux de remplissage maximum recommandé par le fabriquant soit 65%. Lorsque le taux de remplissage est inférieur à 65% le taux de lyse diminue.
Exemple
12 :
Effet de la concentration en cellules sur le taux de broyage et le contrôle de la température.
Mode opératoire.
Mode opératoire.
Les cellules sont broyées dans un broyeur à billes de modèle Multilab de chez WAB. La chambre de broyage est remplit avec des billes en céramique de diamètre 0,8 mm de diamètre à un taux 65%. La vitesse de module de broyage et le débit sont identiques dans tous les cas. Le taux de lyse en sortie de broyage se calcule par dénombrement à la cellule de Malassez comparativement à la biomasse d’entrée non broyée.
On voit que pour les mêmes paramètres de broyage (vitesse de module de broyage, débit d’alimentation, taux de remplissage de la chambre, diamètre de bille) le taux de lyse obtenu était équivalent quelque soit la concentration en cellules dans le produit à broyer (biomasse à 10%, 20% ou 30% de matière sèche). Toutefois, il faut noter que plus la masse sèche du produit d’entrée est élevée plus la température du lysat en sortie de broyeur est élevée également. Pour augmenter la productivité de l’étape de broyage en augmentant la masse sèche d’entrée il faut prévoir également des capacités de refroidissement adaptées au maintien d’une température de lysat inférieure à 45°C.
Exemple
13 :
Estimation des débits sur un broyeur à billes de type industriel.
Mode opératoire.
Mode opératoire.
Les cellules sont broyées dans un broyeur à billes de modèle Multilab de chez WAB. La chambre de broyage (600 ml) est remplit avec des billes en céramique de diamètre 0,8 mm à un taux de 65%. La vitesse de module de broyage et le débit d’alimentation sont identiques dans les deux cas. Le taux de lyse en sortie de broyage se calcule par dénombrement à la cellule de Malassez comparativement à la biomasse d’entrée non broyée. Pour un taux de broyage de 95 -100% le débit appliqué dans ces conditions est compris entre 1 et 2 litres par heure. Une extrapolation de ces débits a été faite en utilisant les résultats obtenus dans l’Exemple 10.
| Multilab (0,6 mL) | AP60 (60L) | |
| Taille de billes | Alimentation L/h | Alimentation L/h |
| 0,8 mm | 1 à 2 | 100 à 200 |
| 0,6 mm | 1,4 à 2,8 | 140 à 280 |
| 0,3 mm | 1,7 à 3,4 | 170 à 340 |
| 0,2 mm | 2,3 à 4,6 | 230 à 460 |
RÉFÉRENCES.
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WO 2009/075682WO 2017/050917, WO 2017/093345, WO 2018/178334, US 6,074,854 et US 5,817,498.
Claims (11)
- Procédé optimisé de culture et de valorisation d’algues rouges unicellulaires (ARUs) comprenant des étapes (a) de culture par fermentation des ARUs, (b) de récupération de la biomasse et (c) de lyse cellulaire et le cas échéant une étape (d) d’extraction de produits valorisables à partir de la biomasse lysée, qui comprend au moins l’une des étapes suivantes :
(a1) culture par fermentation avec une phase de maturation avec limitation de l’apport en source de carbone dans le milieu de culture, et/ou
(b1) extraction de porphyrines à partir du jus de fermentation, et/ou
(c1) de lyse par broyage avec maintien de la biomasse pendant le broyage à une température inférieure à 50°C et, le cas échéant
(d1) d’extraction des phycocyanines de la biomasse lysée par des lavages successifs dans des quantités d’eau représentant au total moins de 4 fois le volume total de biomasse lysée. - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les ARUs appartiennent aux Genres Cyanidioschyzon, Cyanidium ou Galdieria.
- Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les ARUs appartiennent au GenreGaldieria et à l’Espèce sulphuraria.
- Procédé selon l’une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les ARUs sont cultivées par fermentation en mode « FedBatch » ou en mode continu.
- Procédé selon l’une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la lyse est faite par broyage avec un broyeur à billes en maintenant la biomasse d’ARUs pendant le broyage à une température inférieure à 50°C.
- Procédé selon l’une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la température de broyage n’excède pas 47°C, de préférence n’excède pas 40°C.
- Procédé selon l’une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la phycocyanine est récupérée à partir de la solution de lavage de la biomasse lysée.
- Biomasse lysée obtenue par le procédé selon l’une des revendications 1 à 5.
- Porphyrines obtenues par le procédé selon la revendication 1.
- Phycocyanine obtenue par le procédé selon l’une des revendications 1 à 7.
- Aliment ou complément alimentaire caractérisé en ce qu’il comprend une biomasse lysée selon la revendication 8 ou une phycocyanine selon la revendication 10.
Priority Applications (11)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR1901259A FR3092586A1 (fr) | 2019-02-08 | 2019-02-08 | Procédé optimisé d’exploitation industrielle d’algues rouges unicellulaires |
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