BR112021015614A2 - Método otimizado para exploração industrial de algas vermelhas unicelulares - Google Patents

Abstract

método otimizado para exploração industrial de algas vermelhas unicelulares. a presente invenção se refere a um processo otimizado para o cultivo de algas vermelhas unicelulares (ura) para a valorização dos produtos de cultivo, tanto da biomassa obtida, quanto das ficocianinas extraídas das mesmas ou de outros produtos de cultivo como porfirinas ou extratos proteicos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “MÉTODO

OTIMIZADO PARA EXPLORAÇÃO INDUSTRIAL DE ALGAS VERMELHAS UNICELULARES” CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere a um processo para o cultivo de algas vermelhas unicelulares (URA) otimizado para a valorização dos produtos de cultivo, tanto da biomassa obtida, quanto das ficocianinas extraídas das mesmas ou de outros produtos de cultivo como porfirinas ou extratos proteicos.

TÉCNICA ANTERIOR

[002] Diferentes formas de cultivo de microalgas, em particular algas vermelhas unicelulares (URA), são conhecidas para a fabricação de diferentes produtos para uso industrial ou alimentar.

[003] Em particular, pode ser feita menção a processos de cultivo e processamento de espirulina para a fabricação de suplementos alimentares ricos em proteínas ou para a fabricação de ficocianinas úteis como corantes alimentares.

[004] Também pode ser feita menção a processos para cultivo e processamento de URA para obter produtos semelhantes e, em particular, processos para cultivo e processamento de Galdieria sulphuraria descritos nos pedidos de patente WO 2017/050917, WO 2017/093345 e

WO 2018/178334.

[005] Um processo industrial para cultivar e processar URA, como Galdieria sulphuraria, é mostrado na Figura 1.

[006] Deve-se notar, entretanto, que esses diferentes processos podem ser aprimorados ainda mais a cada etapa da produção e processamento de URA. Em particular, esses processos podem ser melhorados tendo em vista o fato de que URA como Galdieria sulphuraria acumulam grandes quantidades de glicogênio quando cultivadas em condições de cultivo usuais, quantidades de glicogênio que têm impacto em particular nas condições de tratamento da biomassa, em nomeadamente a lise celular, nas condições de isolamento dos produtos da biomassa e na qualidade destes produtos isolados, em particular as ficocianinas.

[007] Em particular, é importante ser capaz de otimizar essas várias etapas para melhor valorizar os produtos obtidos.

DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO

[008] A invenção se refere a um processo otimizado para o cultivo e a valorização de URA, em particular de Galdieria sulphuraria, compreendendo as etapas (a) de cultura de fermentação da URA, (b) de separação da biomassa do suco de fermentação, se necessário (c) de lise celular e, se necessário, uma etapa (d) de extração de produtos valorizáveis da biomassa lisada, que compreende pelo menos uma das seguintes etapas de: (c1) lise por moagem, mantendo a biomassa durante a moagem a uma temperatura abaixo de 50 °C, e/ou (a1) cultura de fermentação com uma fase de maturação com entrada de fonte de carbono limitada no meio de cultura, e/ou (b1) extração de porfirinas do suco de fermentação, e/ou (d1) extração de ficocianinas da biomassa lisada por pelo menos 2 lavagens sucessivas em quantidades de água representando no total menos de 4 vezes o volume total da biomassa lisada.

[009] A invenção também se refere aos produtos obtidos pelo processo, em particular as porfirinas extraídas do suco de fermentação, a biomassa, a biomassa lisada, as proteínas isoladas e/ou as ficocianinas.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0010] A Figura 1 representa um diagrama simplificado do processo de fabricação dos diferentes produtos da cultura de Galdieria sulphuraria.

[0011] A Figura 2 representa o crescimento da cepa de Galdieria sulphuraria em modo descontínuo alimentado em glicerol com fase de maturação.

[0012] A Figura 3 representa o monitoramento da composição da biomassa durante a cultura em batelada alimentada em glicerol com fase de maturação.

[0013] A Figura 4 representa o crescimento da cepa de Galdieria sulphuraria em modo em batelada alimentada em permeado de leite com fase de maturação.

[0014] A Figura 5 representa o monitoramento da composição da biomassa durante a cultura em permeado de leite em modo em batelada alimentada com fase de maturação.

[0015] A Figura 6 representa o monitoramento do crescimento de uma cepa de Galdieria sulphuraria cultivada em modo contínuo em glicerol sem produção de porfirina.

[0016] A Figura 7 representa o monitoramento da composição da biomassa durante a cultura de Galdieria sulphuraria cultivada em modo contínuo em glicerol.

[0017] A Figura 8 representa o monitoramento do crescimento de uma cepa de Galdieria sulphuraria em modo contínuo com glicose.

[0018] A Figura 9 representa o monitoramento da composição da biomassa durante a cultura de Galdieria sulphuraria cultivada em modo contínuo com glicose.

[0019] A Figura 10 representa o monitoramento do crescimento de uma cepa de Galdieria sulphuraria em modo contínuo no permeado de leite.

[0020] A Figura 11 representa o monitoramento da composição da biomassa durante a cultura de Galdieria sulphuraria cultivada em modo contínuo em permeado de leite.

[0021] A Figura 12 mostra os dados de moagem Bertoli HHP (1200 bar) sem resfriamento.

[0022] A Figura 13 mostra os dados de moagem Bertoli HHP (1200 bar) com resfriamento.

[0023] A Figura 14 representa a resistência da ficocianina a 50 °C em lisados ajustados a diferentes pH.

[0024] A Figura 15 representa o efeito do diâmetro do grânulo na taxa de lise celular por moinho de bolas.

[0025] A Figura 16 representa as quantidades de ficocianinas extraídas com lavagens em série em comparação com lavagens únicas para diferentes volumes de água.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0026] As várias etapas do processo de acordo com a invenção são descritas em maior detalhe abaixo e nos exemplos.

[0027] De acordo com a invenção, “valorização” significa as etapas técnicas que permitem o isolamento de produtos úteis para uso na indústria.

[0028] Em particular, o processo de acordo com a invenção compreende as seguintes etapas sucessivas: (a1) de cultura de fermentação com uma fase de maturação que inclui a limitação da fonte de carbono no meio de cultura,

(b1) se necessário, de extração de porfirinas do caldo de fermentação, (c1) se necessário, de lise por moagem, mantendo a biomassa durante a moagem a uma temperatura abaixo de 50 °C e, (d1) se necessário, de extração de ficocianinas da biomassa lisada por pelo menos 2 lavagens sucessivas em quantidades de água totalizando menos de 4 vezes o volume total de biomassa lisada.

[0029] Mais particularmente, o processo de acordo com a invenção compreende as seguintes etapas sucessivas: (a1) de cultura de fermentação com uma fase de maturação que inclui a limitação da fonte de carbono no meio de cultura, (b1) de extração de porfirinas do caldo de fermentação, (c1) de lise por moagem, mantendo a biomassa durante a moagem a uma temperatura abaixo de 50 °C e, (d1) de extração de ficocianinas da biomassa lisada por lavagens sucessivas em quantidades de água totalizando menos de 3 vezes o volume total de biomassa lisada.

[0030] De acordo com uma modalidade particular da invenção, o processo compreende pelo menos as seguintes etapas: (a1) de cultura de fermentação com uma fase de maturação, limitando o fornecimento de fonte de carbono no meio de cultura, e (b1) de extração de porfirinas do caldo de fermentação.

[0031] De acordo com outra modalidade particular da invenção, o processo compreende pelo menos as seguintes etapas: (c1) de lise por moagem, mantendo a biomassa durante a moagem a uma temperatura abaixo de 50 °C e, se necessário, (d1) de extração de ficocianinas da biomassa lisada por lavagens sucessivas em quantidades de água totalizando menos de 3 vezes o volume total da biomassa lisada.

[0032] As URA são bem conhecidas da pessoa versada na técnica, em particular URA que podem ser cultivadas industrialmente para a produção de biomassa e seus subprodutos, proteínas ou ficocianinas. Pode ser feita menção particular às algas (ou microalgas) das ordens Cyanidiales. A ordem Cyanidiales inclui as famílias Cyanidiaceae e Galdieriaceae, elas próprias subdivididas nos gêneros Cyanidioschyzon, Cyanidium e Galdieria, aos quais pertencem, inter alia, as espécies Cyanidioschyzon merolae 10D, Cyanidioschyzon merolae DBV201, Cyanidium caldarum, Cyanidium daedalum, Cyanidium maximum, Cyanidium partitum, Cyanidium rumpens, Galdieria daedala, Galdieria maxima, Galdieria partita e Galdieria sulphuraria. Uma menção particular pode ser feita à cepa Galdieria sulphuraria (também chamada de Cyanidium caldarium) UTEX

2919.

[0033] Também podem ser citados produtores conhecidos de ficocianinas, como as cianobactérias filamentosas do gênero Arthrospira, cultivadas industrialmente com o nome comum de espirulina.

[0034] Os micro-organismos que produzem ficocianina com alto teor de glicogênio são particularmente identificados entre os micro-organismos mencionados acima, em particular as espécies dos gêneros Arthrospira, Spirulina, Synechococcus, Cyanidioschyzon, Cyanidium ou Galdieria, em particular Galdieria sulphuraria.

[0035] A invenção também se refere aos produtos obtidos pelo processo, em particular a biomassa, as porfirinas isoladas do suco de fermentação, a biomassa lisada, as proteínas e as ficocianinas isoladas da biomassa lisada.

[0036] Ficocianinas (PC) produzidas por micro- organismos incluem c-ficocianinas (C-PC) e aloficocianinas.

De acordo com a invenção, ficocianinas são definidas como C-PCs e aloficocianinas, isoladas ou misturas das mesmas em qualquer proporção, em particular C-PCs.

A cultura da URA (a1).

[0037] A cultura do fermentador de URA e em particular de Galdieria sulphuraria tem sido amplamente descrita na literatura científica, tanto no modo heterotrófico quanto no mixotrófico, no modo de batelada alimentada ou contínuo.

[0038] A biomassa produzida inclui não apenas ficocianinas e proteínas, mas também açúcares de reserva como o glicogênio. Os teores de glicogênio na biomassa são da ordem de 20 a 50% em massa em relação à massa total de matéria seca. Quanto maior o teor de glicogênio na biomassa final, menor a concentração de ficocianina (PC) e proteína.

O glicogênio produzido pela URA, em particular na Galdieria, é solúvel em água fria e, portanto, encontra-se na fase aquosa durante a extração da PC, o que coloca problemas técnicos durante a filtração, como aumento da viscosidade, entupimento das membranas de filtração, aumento da pressão, acúmulo de glicogênio na fração contendo ficocianina e, portanto, obtenção de ficocianina menos pura. A invenção permite, por um “piloto” da fermentação, reduzir os níveis de glicogênio para valores inferiores a 20% em massa/MS.

[0039] A invenção, portanto, se refere a um processo para a produção de biomassa de acordo com a invenção que compreende a cultura de fermentação de URA como definido acima com uma fase de maturação que compreende a limitação do fornecimento de fonte de carbono no meio de cultura.

[0040] As culturas por fermentação são realizadas em um meio de cultura compreendendo vários nutrientes permitindo o crescimento celular. Estes meios de cultura, bem conhecidos da pessoa versada na técnica, incluem uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, uma fonte de fósforo, macroelementos, microelementos, em concentrações apropriadas para permitir o crescimento celular.

[0041] A etapa de maturação é particularmente implementada nos modos de cultura em batelada alimentada ou contínuo.

[0042] A fonte de carbono pode ser qualquer fonte de carbono conhecida pelo especialista e que pode ser usada para o cultivo de URA e em particular Galdieria sulphuraria, como polióis, em particular glicerol, açúcares, como glicose ou sacarose ou também lactose ou meios complexos compreendendo lactose, tal como permeado de leite, permeado de soro, leitelho e misturas dos mesmos e em particular permeado de leite.

[0043] Sabe-se que alguns substratos carbonosos, como a glicose, inibem fortemente a síntese de PC, enquanto outros menos. No entanto, para a viabilidade de um processo de produção de PC industrial, muitos parâmetros econômicos devem ser levados em consideração e, em particular, o custo das matérias-primas. Assim, o uso de uma fonte de carbono como permeado de leite contendo lactose não permite rendimentos de PC tão altos quanto com glicerol, mas a economia geral do processo com o uso de permeado de leite permanece vantajosa porque é um subproduto da indústria de laticínio que é difícil de reciclar. É tanto mais vantajoso quanto a realização do processo de acordo com a invenção permite obter uma alta densidade celular com baixo teor de glicogênio, o que facilita a extração da PC no final do processo.

[0044] A biomassa obtida após a maturação tem a seguinte composição: Biomassa maturada Composição em % de matéria seca Proteína Glicogênio C-PC Biomassa alvo > 45% < 20% > 1,5% Biomassa preferida 55% a 70% 5% a 20% 5 a 10%

[0045] As condições específicas para a implementação da fase de maturação por meio da limitação da fonte de carbono para esses dois métodos de cultivo são especificadas a seguir.

Cultura em batelada/batelada alimentada.

[0046] Em uma cultura em batelada alimentada, o processo de cultura de fermentação de acordo com a invenção compreende uma primeira fase de crescimento celular em um meio de cultura compreendendo uma fonte de carbono conforme definido acima, de modo a obter uma densidade celular no meio de cultura de pelo menos 30 g/L de matéria seca. A pessoa versada na técnica saberá como definir a composição do meio de cultura adequado para obter tal densidade celular e, em particular, o conteúdo da fonte de carbono, em particular no que diz respeito aos processos da técnica anterior descritos em particular nos pedidos de patente WO 2017/050917, WO 2017/093345 e WO 2018/178334.

[0047] Uma vez obtida a densidade celular desejada, é realizada uma fase de “maturação”, que consiste no desmame da cepa do substrato de carbono orgânico.

[0048] De acordo com uma modalidade particular da invenção, a fase de maturação é desencadeada uma vez que a cultura na fase de crescimento atinge pelo menos 30 g/L de matéria seca, de um modo preferido pelo menos 80 g/L de matéria seca, de um modo mais preferido pelo menos 100 g/L de matéria seca.

[0049] Durante a fase em batelada alimentada, a cultura é alimentada com um meio de alimentação compreendendo pelo menos 100 g/L de substrato de carbono, de um modo preferido pelo menos 200 g/L de substrato de carbono, de um modo mais preferido pelo menos 500 g/L de substrato de carbono. Para limitar o acúmulo de glicogênio durante a fase de batelada alimentada. A pessoa versada na técnica saberá como definir as taxas de alimentação que permitem ter conteúdos de substrato carbonáceo na fermentação devem ser inferiores a 5 g/L, de um modo preferido inferiores a 1 g/L, de um modo mais preferido inferiores a 0,1 g/L.

[0050] A fase de crescimento é seguida por uma fase de maturação. Durante esta fase de maturação, observa-se uma diminuição da massa seca por litro de mosto devido ao consumo de açúcares de reserva acumulados durante o crescimento, em especial o glicogênio. Ao mesmo tempo, pode-se observar um aumento na quantidade de ficocianina por grama de matéria seca. O mesmo é verdade para o conteúdo de proteína. Este processo de maturação permite a obtenção de uma biomassa com baixo teor de glicogênio.

[0051] De acordo com uma primeira modalidade da invenção, a cultura é alimentada com um meio de alimentação de maturação que não compreende uma fonte de carbono.

Entende-se que a ausência de fonte de carbono é observada também no caso de o meio de alimentação de maturação compreender traços detectáveis de fonte de carbono.

[0052] De acordo com uma modalidade preferida da invenção, o desmame é total, isto é, as células já não são alimentadas com meio de cultura, as células iniciando a sua maturação alimentando-se dos elementos residuais do mosto de fermentação e das suas reservas celulares.

[0053] Vantajosamente, a biomassa obtida compreende menos de 20% de glicogênio em massa em relação à massa de matéria seca (% MS), de um modo preferido menos de 15% de matéria seca, de um modo mais preferido menos de 10% de matéria seca.

[0054] O tempo de maturação pode ser mais ou menos longo dependendo da temperatura da cultura. Quanto mais próxima estiver a temperatura da temperatura ideal para o crescimento, mais curta será a fase de maturação.

[0055] Também é possível realizar culturas em modo de batelada alimentada, realizando as fases de crescimento e maturação concomitantemente, impondo uma menor taxa de crescimento através do fornecimento da fonte de carbono, limitando assim o acúmulo de glicogênio na cepa. A taxa de crescimento para esta maturação é determinada de acordo com a taxa de crescimento máxima da cepa, que a pessoa versada na técnica será capaz de determinar. Esta taxa de crescimento deve ser inferior a 80% da taxa máxima de crescimento da cepa, de um modo preferido inferior a 70% da taxa máxima de crescimento da cepa, de um modo mais preferido inferior a 50% da taxa máxima de crescimento da cepa.

[0056] O processo de acordo com a invenção em modo de batelada alimentada permite obter mostos de fermentação compreendendo pelo menos 70 g/L de matéria seca (Figura 4), e uma biomassa com um teor de PC, em particular C-PC, de pelo menos 10 mg/g de matéria seca (Figura 5) e um teor de proteína de pelo menos 40% de matéria seca (Figura 5).

Cultura em modo contínuo

[0057] O crescimento em modo contínuo com limitação de substrato já foi descrito por Sloth et al., 2006 com níveis de detecção abaixo de 0,05 g/L, que os autores consideram ser o limite analítico de detecção. Neste caso, o meio de alimentação é em modo contínuo fornecido à cultura, mas é consumido quase instantaneamente pelas células e, portanto, não é quantificável. O objetivo dos autores neste artigo é limitar a inibição da síntese de PC associada a uma concentração significativa de glicose no meio, sendo que a glicose reprime a síntese de PC. O conteúdo de PC nessas condições é muito baixo, cerca de 28 mg/g de matéria seca, com um conteúdo de biomassa de cerca de 5 g/L de matéria seca.

[0058] O objetivo da invenção é realizar uma cultura em modo contínuo para aumentar a biomassa e a produtividade da PC em comparação com uma cultura em batelada alimentada.

É possível, pelo processo de acordo com a invenção, atingir uma massa seca de 65 a 70 g/L, ou ainda mais, e um teor de PC compreendido entre 25 e 90 mg/g de matéria seca, ou ainda mais.

[0059] De acordo com uma primeira modalidade da invenção, a fase de maturação é implementada pela transferência de uma parte do mosto da cultura contínua para um tanque sem fornecimento de nutrientes. Tal como acontece com o modo de cultura em batelada alimentada descrito acima, há uma diminuição concomitante no teor de glicogênio e um aumento no teor de ficocianina e proteína.

[0060] A pessoa versada na técnica saberá como determinar o tempo necessário para a maturação de acordo com parâmetros conhecidos, como a temperatura na qual a biomassa é mantida sem alimentação e de acordo com o objetivo desejado. Este tempo de maturação será de pelo menos 12 h, de um modo preferido pelo menos 48 h, de um modo mais preferido pelo menos 72 h.

[0061] As etapas de crescimento e maturação também podem ser implementadas simultaneamente, impondo uma taxa de crescimento reduzida por meio da taxa de fluxo do meio de alimentação. Vantajosamente, a taxa de crescimento é menor que 0,06 h-1, de um modo preferido menor que 0,03 h-1, de um modo mais preferido menor que 0,015 h-1.

[0062] Vantajosamente, a taxa de crescimento é menor que 80% da taxa máxima de crescimento da cepa, de um modo preferido menor que 60% da taxa máxima de crescimento da cepa, de um modo mais preferido menor que 40% da taxa máxima de crescimento da cepa. Na Figura 7, após 400 h de cultura, a taxa de crescimento foi reduzida para um valor abaixo de 80% da taxa máxima de crescimento, aumentando assim o teor de PC e proteína na biomassa e reduzindo o teor de glicogênio, em comparação com a taxa de crescimento inicialmente imposta.

[0063] O teor da fonte de carbono garante que seja obtido um teor de matéria seca de pelo menos 65 g/L, ou mesmo pelo menos 70 g/L, mais particularmente pelo menos 80 g/L.

[0064] A biomassa assim obtida com maturação separada ou simultânea tem um teor de glicogênio inferior a 20%, vantajosamente inferior a 15% ou mesmo inferior a 10%. A biomassa obtida tem um teor de proteína de pelo menos 45% de matéria seca, vantajosamente pelo menos 50%.

[0065] O teor de ficocianina, em particular C-PC, será de pelo menos 20 mg/g de matéria seca, vantajosamente de 25 a 50 mg/g de matéria seca. Com certas fontes de carbono, como polióis, podem ser alcançados teores de C-PC de mais de 50 mg/g de matéria seca.

Produção de porfirinas no mosto de fermentação (b.1).

[0066] Vários estudos mostraram que várias etapas importantes na via de síntese de ficocianina e clorofila são induzidas pela luz e outras reprimidas na presença de substrato orgânico no meio (Foley et al., 1982; Brown et al., 1982; Troxler et al., 1989; Rhie e Beale, 1994; Stadnichuck et al., 1998). De acordo com a literatura, a cultura heterotrófica leva à excreção da coproporfirina no meio de crescimento e provoca uma redução do conteúdo de pigmento na célula (ficocianobilina e clorofila) durante a transição do coproporfirinogênio III para o protoporfirinogênio IX. Em condições mixotróficas, a luz induz tanto a biossíntese de pigmentos fotossintéticos quanto a excreção de porfirinas no meio ambiente. A transição de uma forma de porfirina para outra às vezes é feita por reação espontânea, portanto, é possível encontrar várias formas de porfirinas no meio de crescimento (Brown et al., 1982; Stadnichuck et al., 1998).

[0067] Ao contrário do que é descrito na literatura, a implementação do processo de acordo com a invenção não leva à excreção de porfirina, desde que uma fonte de carbono orgânico, em particular glicose, glicerol, lactose ou sacarose, esteja presente no meio. As porfirinas são detectadas apenas durante a fase de maturação (sem carbono orgânico no meio) em ambas as culturas em batelada e em modo contínuo. Quando o substrato orgânico é adicionado ao meio após uma fase de maturação, pode-se observar um re- consumo das porfirinas pelas células e um retorno a níveis não detectáveis dessas porfirinas no caldo de fermentação.

[0068] Após uma fase de maturação de acordo com a invenção, obtém-se um mosto de fermentação compreendendo uma biomassa com baixo teor de glicogênio, rica em proteínas e PC, conforme definido acima, e um suco contendo porfirinas.

[0069] Essas porfirinas produzidas pela URA, em particular pela Galdieria sulphuraria, são quelantes naturais que podem ser usados, por exemplo, para tratamentos contra nematoides (US 2006/0206946). Algumas moléculas, como a protoporfirina IX, também podem ser de interesse na área médica para tratamentos de câncer por fototerapia (Huang et al., 2015).

[0070] A invenção, portanto, refere-se a um processo que inclui uma etapa de recuperação do suco de fermentação e extração de porfirinas deste suco.

[0071] O suco de fermentação é recuperado por todos os métodos usuais de separação de biomassa, em particular por centrifugação (centrifugação de placa ou sedicanter), bem conhecida do especialista, ou por filtração (filtro de placa, filtro prensa, filtração cerâmica ou tangencial orgânica).

[0072] As porfirinas podem ser extraídas por métodos usuais, como cromatografia (cromatografia de afinidade ou de exclusão por tamanho).

[0073] As porfirinas extraídas podem ser purificadas e então embaladas para uso posterior, em particular em terapia.

Moagem de biomassa (c.1).

[0074] Para extrair ficocianinas e/ou proteínas da biomassa, é necessário realizar uma lise celular que irá liberar os produtos desejados. URA e em particular Galdieria sulphuraria têm uma parede celular muito resistente que torna a lise por métodos usuais difícil, a menos que as condições operacionais sejam tais que degradem as ficocianinas desejadas.

[0075] O rendimento do produto recuperado, ficocianinas e/ou proteínas, não depende apenas do conteúdo do produto na biomassa, mas também da capacidade de extrair o máximo dessa biomassa. Esta capacidade de extração dependerá da eficiência da lise celular, mas também da sua implementação em condições que não levem à degradação substancial das ficocianinas.

[0076] A moagem é baseada em duas questões principais: a taxa de moagem e o calor gerado pelo atrito mecânico. No caso da ficocianina, esse controle de calor é ainda mais importante por se tratar de uma molécula termossensível. Os testes foram realizados com um homogeneizador de alta pressão do tipo Bertoli nas condições descritas no Exemplo

7. A moagem com um homogeneizador de alta pressão requer várias passagens para atingir uma taxa de lise consistente.

A passagem de uma biomassa de Galdieria sulphuraria não permitiu uma taxa de lise superior a 40% a ser obtida apesar de 3 passagens sucessivas. A cada passagem, um aumento de temperatura pode ser observado até que uma biomassa com temperatura em torno de 70 °C foi atingida com uma cor verde-marrom onde a maioria da ficocianina foi degradada.

[0077] A invenção se refere, portanto, a um processo de lise de células de URA, em particular Galdieria sulphuraria, caracterizado por a lise ser realizada por moagem com moinho de bolas, mantendo a biomassa de URA durante a moagem a uma temperatura abaixo de 50 °C.

[0078] A invenção consiste em regular a temperatura da biomassa durante a moagem, dentro da câmara de moagem, de modo que não ultrapasse 50 °C, de um modo preferido 47 °C, de um modo mais preferido 40 °C e menos. Esse controle de temperatura pode ser feito por um sistema de resfriamento a água da camisa do moinho ou pela injeção no moinho de uma biomassa previamente resfriada a temperaturas abaixo de 20 °C.

[0079] O processo de moagem de acordo com a invenção pode ser aplicado à biomassa independentemente da forma como é obtida (modo de fermentação e isolamento). É particularmente adequado e preferível para biomassa obtida pelo processo de cultivo de acordo com a invenção descrita acima com um teor de glicogênio reduzido.

[0080] A invenção também se refere à biomassa lisada assim obtida.

[0081] Os inventores constataram que a biomassa moída de acordo com a invenção fornece melhor digestibilidade da proteína do que a biomassa não moída. Esta melhoria na digestibilidade foi demonstrada por testes de digestibilidade in vitro (Boisen e Fernandez, 1995).

Amostras Digestibilidade Proteína total Espirulina 79,3 (± 2) % 68,2 (± 2) % G. sulphuraria (moída) 92,2 (± 2) % 63,4 (± 1,9) % G. sulphuraria (não 66 (± 2) % 63,9 (± 1,9) % moída)

[0082] A invenção, portanto, refere-se a uma biomassa de URA moída e, em particular, a uma biomassa de Galdieria sulphuraria que pode ser obtida pelo processo de moagem de acordo com a invenção.

[0083] A invenção se refere, em particular, a uma biomassa moída de Galdieria sulphuraria da composição descrita abaixo.

Fatores nutricionais Valor energético 394 (± 22) kcal/100 g Proteína 64,8 (± 9,3) g/100 g Lipídios 6,15 (± 0,5) g/100 g Fibras 7,65 (± 5,16) g/100 g Carboidratos 16,1 (± 2,2) g/100g Cinzas 4,1 (± 0,6) g/100 g Umidades 4,1 (± 0,6) g/100 g Ficocianina 7 (± 0,3) g/100 g

[0084] A composição de aminoácidos é dada na tabela a seguir.

Galdieria g/100g Espirulina sulphuraria Triptofano 0,84 0,76 Treonina 2,78 3,06 Ácido aspártico 5,47 4,73 Serina 2,74 3,54 Lisina 2,7 3,45 Valina 3,48 3,15 Prolina 2,04 2,17 Alanina 4,11 3,44

Fenilalanina + Tirosina 5 5,55 Isoleucina 3,17 2,6 Glicina 2,85 2,30 Arginina 3,6 3,14 Leucina 5,02 4,1 Histidina 1,09 0,86 Ácido glutâmico 8,02 7,41 Metionina + cisteína 2,19 1,88

[0085] A composição lipídica é a seguinte: % de lipídios Ácidos graxos g/100g total C14:0 ácido mirístico 2,6 0,16 C16:0 ácido palmítico 27,9 1,7 C18:0 ácido esteárico 8,8 0,54 C18:1 (n-9c) ácido oleico 33,5 2,1 C18:2 (n-6c) ácido linoleico 19,3 1,18 (LA) 6 C18:3 (n-3) ácido - 1,8 0,1 linolênico (ALA) 3 Razão 6/3 10,32

[0086] A invenção também se refere ao uso desta biomassa moída como suplemento alimentar ou alimento para consumo humano ou animal.

Extração de ficocianina (d1).

[0087] A invenção também se refere a um processo para extrair ficocianina de uma biomassa de células de URA lisadas, em particular Galdieria sulphuraria, caracterizado por compreender lavagens sucessivas em quantidades de água representando no total menos de 4 vezes, de um modo preferido de 2 a 3 vezes, de um modo mais preferido cerca de 3 vezes o volume total de biomassa lisada.

[0088] Esta biomassa lisada compreende uma suspensão de resíduos celulares insolúveis em uma solução aquosa compreendendo vários extratos celulares solubilizados após a lise celular, incluindo ficocianinas. A biomassa lisada vantajosamente compreende uma matéria seca de pelo menos 2%, de um modo preferido de pelo menos 5%, de um modo mais preferido de pelo menos 7%.

[0089] O volume total de água (Vw) necessário para extração é calculado em função do volume de biomassa lisada a ser tratada (Vb) e representará até 4 vezes esse volume (Vw/Vb é menor ou igual a 4). Obviamente, é possível implementar a invenção com um volume total de água maior, mas a economia do processo continua menos interessante devido aos volumes de água a serem tratados posteriormente para recuperação da ficocianina.

[0090] Este volume total de água é então dividido em várias frações que serão usadas para extrair a ficocianina por passagens sucessivas na biomassa, o número de frações (n) sendo pelo menos 2, de um modo preferido pelo menos 3.

A pessoa versada na técnica pode planejar realizar a extração com mais de 3 frações de água, levando em consideração todos os parâmetros econômicos da implantação do processo, como o preço de custo da imobilização do equipamento e a repetição do manuseio da biomassa. De um modo preferido, o número de frações é 3.

[0091] De acordo com uma primeira modalidade da invenção, as frações têm volumes respectivos diferentes uns dos outros. De acordo com outra modalidade da invenção, todas as frações têm o mesmo volume igual a Vw/n.

[0092] A pessoa versada na técnica saberá como determinar o número de frações e o respectivo volume de cada fração, a fim de otimizar o processo de preparação de ficocianina que irá implementar.

[0093] Lavagens sucessivas dos elementos insolúveis peletizados são necessárias para extrair uma quantidade apropriada de ficocianina da biomassa. Após várias lavagens, as proporções de C-PC e APC no pelete são invertidas. É claro na Figura 16 que é melhor extrair ficocianina com pequenos volumes sucessivos de água do que com um grande volume de água equivalente (Figura 16).

[0094] No eixo y e partindo da esquerda do diagrama, existem três blocos S1, S2 e S3 que correspondem a 3 extrações sucessivas feitas com 3 frações de água de igual volume, sendo o volume total de água Vw 1 vez o volume de biomassa Vb para o primeiro bloco (1/2 de diluição em série), 2 vezes para o segundo bloco (1/3 de diluição em série) e 3 vezes para o terceiro bloco (1/4 de diluição em série). A barra S1 fornece o valor da PC extraída pela primeira extração. A barra S2 fornece o valor cumulativo da PC extraída pela primeira e pela segunda extração. A barra

S3 fornece o valor cumulativo para as 3 frações usadas sucessivamente. Existem então 5 testes de extração única com diferentes volumes de água, de 5X a 12X.

[0095] Pela Figura 16, pode-se observar que um maior volume inicial de água na primeira extração dá melhores resultados até certo limite (5X a 12X). Usando o método de extração em série, um ganho real pode ser visto em termos de eficiência de extração e redução do uso de água. Por exemplo, 3 séries de extrações fornecem melhores resultados do que uma única extração e reduzem a quantidade total de água usada em pelo menos um fator de 2.

[0096] As águas de lavagem recuperadas de cada extração sucessiva, incluindo ficocianina, podem ser tratadas separadamente para recuperar a ficocianina ou montadas antes dessa recuperação.

[0097] O processo de extração de acordo com a invenção é adequado para qualquer biomassa lisada de URA, em particular Galdieria sulphuraria, independentemente do método de cultura empregado para a produção de biomassa e do método empregado para a lise celular. De um modo preferido, o método de extração de acordo com a invenção é particularmente adequado para biomassa com baixo teor de glicogênio obtido pelo processo de acordo com a invenção descrita acima e/ou para biomassa lisada pelo método de moagem de acordo com a invenção definida acima.

[0098] A solução de ficocianina resultante é geralmente tratada para isolar a ficocianina. Os métodos para recuperar ficocianina de uma solução aquosa são bem conhecidos do especialista. Pode ser feita menção particular à precipitação ácida descrita no pedido de patente WO 2018/178334.

[0099] Também pode ser isolado por precipitação seletiva que consiste em ajustar o pH da solução inicial a um valor escolhido em uma faixa de valores de pH em que a ficocianina é menos solúvel (também chamada faixa de instabilidade) e em concentrar a ficocianina na solução para promover sua precipitação, então na recuperação da ficocianina precipitada. Esta faixa de instabilidade vai em particular de pH 4,4 a 5,5 para ficocianinas resistentes a ácidos produzidas por Galdieria sulphuraria. Obviamente, a pessoa versada na técnica saberá como determinar essa faixa de instabilidade para outras ficocianinas produzidas por outras URA por simples experimentação. Tal método é descrito em particular no pedido de patente FR 1900278 depositado em 11 de janeiro de 2019.

[00100] Antes da recuperação da ficocianina, a solução aquosa também pode ser tratada para reduzir seu conteúdo de glicogênio por degradação enzimática do glicogênio. Os traços desses polissacarídeos passíveis de serem transportados com a precipitação das ficocianinas, já baixas, são ainda mais reduzidos quando os polissacarídeos são lisados em polissacarídeos de baixo peso molecular ainda mais solúveis.

Além disso, quando a etapa de concentração é realizada por filtração tangencial, os polissacarídeos de baixo peso molecular são eliminados com as demais moléculas pequenas em solução, o que favorece a obtenção de uma solução com teor de ficocianina ainda maior.

Em particular, a lise enzimática do glicogênio é realizada a um pH de 5 ou menos, de um modo preferido cerca de 4,5, à temperatura ambiente.

Estas condições de temperatura e pH são particularmente adequadas para preservar a ficocianina durante a reação enzimática.

As enzimas ativas sob condições de pH ácido e temperatura ambiente são selecionadas a partir de enzimas conhecidas por terem atividade de -1-4 glucuronidase, -1-4 glucosidase (ou alfa-glucosidase). Pode ser feita menção particular às pectinases conhecidas por degradarem a pectina e em particular as pectinases extraídas de fungos filamentosos como Aspergillus, mais particularmente as pectinases extraídas de Aspergillus aculeatus, tais como as enzimas comercializadas sob o nome Pectinex® pela empresa

Novozymes.

A lise enzimática do glicogênio também pode ser realizada com uma -1-6 glicosidase além da -1-4 glicuronidase ou -1-4 glicosidase. -1-6 glucosidases ativas sob as condições de pH e temperatura estabelecidas acima também são conhecidas do especialista. Em particular, estas são pululanases conhecidas por hidrolisar ligações glicosídicas -1-6 de pululano, em particular conhecidas por remover ramificações de amido. Geralmente são enzimas extraídas de bactérias, principalmente do gênero Bacillus.

US 6.074.854, US 5.817.498 e WO 2009/075682 descrevem pululanases extraídas de Bacillus deramificans ou Bacillus acidopullulyticus. As pululanases disponíveis comercialmente também são conhecidas, em particular sob os nomes “Promozyme D2” (Novozymes), “Novozym 26062” (Novozymes) e “Optimax L 1000” (DuPont-Genencor). Será notado que as misturas de pululanase/alfa-amilase são descritas na técnica anterior, mas em particular para produzir xarope de glicose a partir de amido (US 2017/159090). A pessoa versada na técnica saberá como determinar as condições de reação apropriadas para melhor reduzir as quantidades de glicogênio, dependendo do teor de glicogênio inicial na solução a ser tratada, da quantidade de enzimas empregadas e da pureza buscada para a ficocianina produzida. Tal método é descrito em particular no pedido de patente FR 1900278 depositado em 11 de janeiro de 2019.

[00101] A ficocianina recuperada pode então ser purificada por métodos conhecidos do especialista, como a diafiltração.

[00102] A ficocianina obtida pelo processo de extração de acordo com a invenção tem um índice de pureza de pelo menos 2, de um modo preferido pelo menos 3, ou mesmo superior a 4. Este índice de pureza é medido por medição de absorbância com o método descrito por Moon et al. (2014).

[00103] Vantajosamente, a ficocianina obtida é uma ficocianina que tem uma razão glicogênio/ficocianina (em uma base de peso seco) inferior a 6, vantajosamente inferior a 4, de um modo preferido inferior a 3, de um modo mais preferido inferior a 2,5, de um modo ainda mais preferido inferior a 1.

[00104] A invenção também se refere ao uso das ficocianinas obtidas como corantes, em particular como corantes alimentares. Também se refere a produtos alimentares, sólidos ou líquidos, em particular bebidas que contêm uma ficocianina obtida pelo processo de extração de acordo com a invenção.

[00105] Os resíduos sólidos remanescentes após a lavagem também são recuperados. É um resíduo de biomassa enriquecido em proteínas que também pode ser utilizado na preparação de suplementos alimentares ou alimentos para consumo humano ou animal.

[00106] De acordo com uma modalidade particular, a lavagem da biomassa lisada compreende a acidificação da suspensão de biomassa a um pH menor ou igual a 5. A biomassa residual obtida após a extração de ficocianina compreende pelo menos 60% de proteína com base na matéria seca e pelo menos um total teor de açúcar inferior a 20% com base na matéria seca e/ou um teor de glicogênio inferior a 10% com base na matéria seca e/ou um teor de gordura de pelo menos 5% com base na matéria seca. Tal método para recuperar uma biomassa enriquecida com proteína é descrito em particular no pedido de patente FR 1857950 depositado em 5 de setembro de 2018.

EXEMPLOS

MATERIAIS E MÉTODOS Cepa

[00107] Galdieria sulphuraria UTEX # 2919, também chamada de Cyanidium caldarium.

Condições de cultivo em modo de batelada alimentada

[00108] As culturas são realizadas em biorreatores de 1 a 2 L de volume útil com manipuladores de líquidos dedicados e supervisão por estação de computador. O pH da cultura é regulado pela adição de base (solução de amônia 14% NH3 p/p) e/ou ácido (solução de ácido sulfúrico 4N). A temperatura da cultura é fixada em 37 °C. A agitação é feita por 2 fusos de agitação: 1 turbina Rushton com 6 lâminas retas posicionadas na extremidade inferior do eixo de agitação acima do aspersor e 1 hélice de três pás HTPG2 colocada no eixo de agitação. A pressão do oxigênio dissolvido na fase líquida é regulada no meio ao longo da cultura pela velocidade de rotação do eixo de agitação (250 a 1800 rpm), fluxo de ar e/ou oxigênio. Os parâmetros de regulação, integrados no autómato de supervisão, permitem manter uma pressão parcial do oxigênio dissolvido na fase líquida compreendida entre 5 e 30% do valor de saturação pelo ar em idênticas condições de temperatura, pressão e composição do meio. O tempo de cultivo foi de 50 a 300 horas.

Condições de cultura em modo contínuo

[00109] As culturas são realizadas em reatores de 1 a 2 L de volume útil com manipuladores de líquidos dedicados e supervisão por estação de computador. O pH da cultura é regulado pela adição de base (solução de amônia 14% (NH3 p/p) e/ou ácido (solução de ácido sulfúrico 4N). A temperatura da cultura é fixada em 37 °C. A agitação é feita por dois fusos de agitação: 1 turbina Rushton com 6 lâminas retas posicionadas na extremidade inferior do eixo de agitação acima do aspersor e 1 hélice de três lâminas HTPG2 colocada no eixo de agitação. A pressão do oxigênio dissolvido na fase líquida é regulada no meio ao longo da cultura, pela velocidade de rotação do eixo de agitação (250 a 1800 rpm), pelo fluxo de ar e/ou oxigênio. Os parâmetros de regulação, integrados no autômato de supervisão, permitem manter uma pressão parcial do oxigênio dissolvido na fase líquida compreendida entre 5 e 30% do valor de saturação pelo ar em condições idênticas de temperatura, pressão e composição do meio. O tempo de cultivo foi entre 50 e 300 horas. A taxa de alimentação do fermentador contínuo foi ajustada de modo que em nenhum momento a fonte de carbono foi detectada no meio de cultura.

Meio de alimentação

[00110] Para meio de alimentação em batelada alimentada ou em modo contínuo, a quantidade de fonte de carbono é ajustada para o peso seco alvo no final do lote alimentado ou 100 g/L de peso seco para cultura contínua.

Todos os outros elementos do meio são adicionados nas proporções usadas para o meio inicial definido nos exemplos.

Acompanhamento de cultura

[00111] O crescimento é monitorado medindo a massa seca (filtração em filtro GF/F, Whatman, então secagem em forno a 105 °C por 24 h no mínimo antes da pesagem).

Determinação de porfirinas

[00112] A determinação dos ácidos orgânicos foi realizada por HPLC (Shimatsu) no modo isocrático H2SO4 (5 mM) e detecção de RI (Índice de Refração).

Determinação da PC

[00113] A estimativa do teor de ficocianina por grama de matéria seca foi realizada em diferentes tempos de cultura usando o processo descrito por Moon e colaboradores [Moon et al., Korean J. Chem. Eng., 2014, 1 a 6].

Determinação de glicogênio

[00114] A estimativa do conteúdo de glicogênio por grama de matéria seca foi realizada em diferentes tempos de cultura usando o processo de extração descrito por Martinez-Garcia e colaboradores [Martinez-Garcia et al., Int J Biol Macromol. 2016; 89: 12 a 18].

Exemplo 1: Fermentação em batelada alimentada com fase de maturação em glicerol Meio de cultura

[00115] Iniciador: 30 g/L de glicerol, 8 g/L de (NH4)2SO4, 250 mg/L de KH2PO4, 716 mg/L de MgSO4, 44mg/L de CaCl2, 2 H2O, 0,2843849 g/L de K2SO4, 0,07 g/L de FeSO4, 7 H2O, 0,01236 g/L de Na2EDTA, 0,00657 g/L de ZnSO4, 7 H2O, 0,0004385 g/L de CoCl2, 6 H2O, 0,00728 g/L de MnCl2, 4 H2O, 0,005976 g/L de (NH4)6Mo7O24, 4 H2O, 0,005976 g/L de CuSO4, 5 H2O, 0,00016 g/L de NaVO3, 0,01144 g/L de H3BO3, 0,00068 g/L de Na2SeO3.

[00116] Os resultados são apresentados nas Figuras 2 e 3.

Exemplo 2: Fermentação em batelada alimentada em glicose com fase de maturação Meio de cultura

[00117] Iniciador: 30 g/L de glicose, 8 g/L de (NH4)2SO4, 250 mg/L de KH2PO4, 716 mg/L de MgSO4, 44 mg/L de CaCl2, 2 H2O, 0,2843849 g/L de K2SO4, 0,07 g/L de FeSO4, 7 H2O, 0,01236 g/L de Na2EDTA, 0,00657 g/L de ZnSO4, 7 H2O, 0,0004385 g/L de CoCl2, 6 H2O, 0,00728 g/L de MnCl2, 4 H2O, 0,005976 g/L de (NH4)6Mo7O24, 4 H2O, 0,005976 g/L de CuSO4, 5 H2O, 0,00016 g/L de NaVO3, 0,01144 g/L de H3BO3, 0,00068 g/L de Na2SeO3.

[00118] Os resultados são apresentados nas Figuras 4 e 5.

Exemplo 3: Fermentação em batelada alimentada em sacarose com fase de maturação Meio de cultura

[00119] Iniciador: 30 g/L de sacarose, 8 g/L de (NH4)2SO4, 250 mg/L de KH2PO4, 716 mg/L de MgSO4, 44mg/L de CaCl2, 2 H2O, 0,2843849 g/L de K2SO4, 0,07 g/L de FeSO4, 7 H2O, 0,01236 g/L de Na2EDTA, 0,00657 g/L de ZnSO4, 7 H2O, 0,0004385 g/L de CoCl2, 6 H2O, 0,00728 g/L de MnCl2, 4 H2O, 0,005976 g/L de (NH4)6Mo7O24, 4 H2O, 0,005976 g/L de CuSO4, 5 H2O, 0,00016 g/L de NaVO3, 0,01144 g/L de H3BO3, 0,00068 g/L de Na2SeO3.

[00120] Os resultados são mostrados nas Figuras 6 e

7.

Exemplo 4: Fermentação em batelada alimentada em permeado de leite com fase de maturação Meio de cultura

[00121] Iniciador: 30 g/L de permeado de leite, 8 g/L de (NH4)2SO4, 716 mg/L de MgSO4, 0,07 g/L de FeSO4, 7 H2O, 0,01236 g/L de Na2EDTA, 0,00657 g/L de ZnSO4, 7 H2O, 0,0004385 g/L de CoCl2, 6 H2O, 0,00728 g/L de MnCl2, 4 H2O, 0,005976 g/L de (NH4)6Mo7O24, 4 H2O, 0,005976 g/L de CuSO4, 5 H2O, 0,00016 g/L de NaVO3, 0,01144 g/L de H3BO3, 0,00068 g/L de Na2SeO3.

[00122] Os resultados são apresentados nas Figuras 8 e 9.

Exemplo 5: Cultura em modo contínuo de uma cepa de Galdieria em glicerol Meio de cultura

[00123] Iniciador: iniciador: 30 g/L de glicerol, 8 g/L de (NH4)2SO4, 250 mg/L de KH2PO4, 716 mg/L de MgSO4, 44 mg/L de CaCl2, 2 H2O, 0,2843849 g/L de K2SO4, 0,07 g/L de FeSO4, 7 H2O, 0,01236 g/L de Na2EDTA, 0,00657 g/L de ZnSO4, 7 H2O, 0,0004385 g/L de CoCl2, 6 H2O, 0,00728 g/L de MnCl2, 4 H2O, 0,005976 g/L de (NH4)6Mo7O24, 4 H2O, 0,005976 g/L de CuSO4, 5 H2O, 0,00016 g/L de NaVO3, 0,01144 g/L de H3BO3, 0,00068 g/L de Na2SeO3.

[00124] Os resultados são mostrados nas Figuras 10 e

11.

Exemplo 6: Cultura em modo contínuo de uma cepa Galdieria em permeado de leite Meio de cultura

[00125] Iniciador: 30 g/L de permeado de leite, 8 g/L de (NH4)2SO4, 716 mg/L de MgSO4, 0,2843849 g/L de K2SO4, 0,07 g/L de FeSO4, 7 H2O, 0,01236 g/L de Na2EDTA, 0,00657 g/L de ZnSO4, 7 H2O, 0,0004385 g/L de CoCl2, 6 H2O, 0,00728 g/L de MnCl2, 4 H2O, 0,005976 g/L de (NH4)6Mo7O24, 4 H2O, 0,005976 g/L de CuSO4, 5 H2O, 0,00016 g/L de NaVO3, 0,01144 g/L de H3BO3, 0,00068 g/L de Na2SeO3.

[00126] Os resultados são mostrados nas Figuras 12 e

13.

Exemplo 7: Moagem HHP sem resfriamento de biomassa Procedimento

[00127] Uma biomassa de uma cultura em modo contínuo é lavada por centrifugações sucessivas e, em seguida, concentrada a uma concentração de 1,4.1010 células/mL. Um volume de 1 L de biomassa é então resfriado a 16 °C antes de passar por 3 homogeneizações sucessivas a 1200 bar em um homogeneizador Bertoli Atomo, sem resfriamento entre cada série. Para cada um deles, são monitoradas a temperatura da biomassa, a lise celular por contagem com células de Malassez e a concentração de ficocianina na biomassa.

[00128] As temperaturas de moagem medidas para as 3 homogeneizações sucessivas são 46,7 °C, 57,6 °C e 67 °C,

respectivamente.

[00129] As porcentagens de células não lisadas e conteúdos de ficocianina são dadas na Figura 12.

Exemplo 8: Moagem HHP com resfriamento de biomassa Procedimento

[00130] Uma biomassa de uma cultura em modo contínuo é lavada por centrifugações sucessivas e, em seguida, concentrada a uma concentração de 2.1010 células/mL. Um volume de 1 L de biomassa é então resfriado a 16 °C antes de passar por 3 homogeneizações sucessivas a 1200 bar em um homogeneizador Bertoli Atomo. Entre cada homogeneização, a temperatura da biomassa é trazida de volta para 16 °C. Da mesma forma, são monitoradas a temperatura da biomassa, a lise celular por contagem com células de Malassez e a concentração de ficocianina na biomassa.

[00131] As temperaturas da biomassa medidas no início e no final do processo de moagem são as seguintes.

T° no início da moagem 16 °C 16,1 °C 15,4 °C 14,4 °C T° no final da moagem 42 °C 45,2 °C 47,7 °C 46°C

[00132] As porcentagens de células não lisadas e conteúdos de ficocianina são dadas na Figura 13.

[00133] Também foi verificado que quanto mais ácido o pH da biomassa do solo, mais sensível a ficocianina é à degradação pelo calor. Portanto, é preferível ajustar o pH das células entre 5 e 7 antes da moagem, independentemente do método de moagem se for acompanhado de liberação de calor.

Exemplo 9: Termossensibilidade de ficocianina na biomassa Procedimento

[00134] Uma biomassa de uma cultura contínua é lavada por centrifugações sucessivas e concentrada até uma matéria seca de 150 mg/g antes de ser moída em moinho de bolas (WAB, multilab) em condições que permitem a preservação do pigmento e uma taxa de lise de 90%. As amostras de lisado são ajustadas para pH 2,4 a 6 e a cinética de 0 a 120 minutos é realizada em diferentes temperaturas variando de 50 a 70 °C. Para cada vez, uma quantificação de ficocianina é realizada.

[00135] Os resultados são mostrados na Figura 14.

Exemplo 10: Efeito do tamanho do grânulo na moagem e controle de temperatura Procedimento

[00136] As células de Galdieria sulphuraria são centrifugadas durante 5 minutos a 20000 g e, em seguida, ressuspensas em tampão Tris-Cl 10 mM pH 7. Uma alíquota de células de 1/3 do volume de um tubo Safelock Eppendorf de 2 mL é preenchida com esta suspensão, outro 1/3 com grânulos de cerâmica do diâmetro testado (Netzsch 0,8 mm; 0,6 mm; 0,3 mm; Plus 0,2 mm; Nano 0,2 mm; Plus 0,1 mm; e 0,05 mm). Os tubos são colocados em um aparelho TissueLyser

II (Qiagen) e agitados por 2 minutos a 30 Hz. A taxa de lise é calculada pela contagem de células de Malassez em comparação com o tubo de controle sem grânulos.

[00137] Os resultados são mostrados na Figura 15.

[00138] Pode-se observar que o diâmetro dos grânulos afeta muito a eficiência da moagem. À medida que o diâmetro do grânulo diminui, a taxa de lise aumenta até atingir um valor ótimo para grânulos com um diâmetro de 0,2 mm. Abaixo desse diâmetro, a eficiência de lise diminui novamente até atingir a taxa mais baixa para grânulos com um diâmetro de 0,05 mm.

[00139] Taxas de moagem próximas a 100% podem ser alcançadas com grânulos maiores se o tempo de moagem for aumentado. No entanto, o aumento do tempo de moagem resulta em um aumento na temperatura na câmara de moagem com a taxa de alimentação do moinho de bolas imposta. Este aumento de temperatura ocorre às custas do teor de ficocianina da biomassa lisada.

Exemplo 11: Efeito da taxa de enchimento da câmara na taxa de moagem Procedimento

[00140] As células são moídas em um moinho de bolas modelo Multilab da WAB. A câmara de moagem é preenchida com grânulos de cerâmica de 0,8 mm de diâmetro a 50% e 65%. A taxa de enchimento de 65% é a taxa de enchimento máxima. A velocidade do módulo de moagem e a taxa de fluxo são idênticas em ambos os casos. A taxa de lise na saída da moagem é calculada pela contagem na célula de Malassez em comparação com a biomassa de entrada não moída.

[00141] Percebe-se que a melhor taxa de lise é obtida quando a câmara está com a taxa de enchimento máxima recomendada pelo fabricante, ou seja, 65%. Quando a taxa de enchimento é inferior a 65%, a taxa de lise diminui.

Exemplo 12: Efeito da concentração de células na taxa de moagem e controle de temperatura Procedimento

[00142] As células são moídas em um moinho de bolas modelo Multilab da WAB. A câmara de moagem é preenchida com grânulos de cerâmica de 0,8 mm de diâmetro a uma taxa de 65%. A velocidade do módulo de moagem e a taxa de fluxo são idênticas em todos os casos. A taxa de lise na saída da moagem é calculada pela contagem de células de Malassez em comparação com a biomassa de entrada não moída.

[00143] Pode ser visto que para os mesmos parâmetros de moagem (velocidade do módulo de moagem, taxa de alimentação, taxa de enchimento da câmara, diâmetro do grânulo) a taxa de lise obtida foi equivalente qualquer que seja a concentração de células no produto a ser moído (biomassa a 10%, 20% ou 30% de matéria seca). No entanto, deve-se notar que quanto maior for a massa seca do produto de entrada, maior será a temperatura do lisado que sai da fábrica. Para aumentar a produtividade da etapa de moagem, aumentando a massa seca de entrada, também é necessário fornecer capacidades de resfriamento adaptadas para manter a temperatura do lisado abaixo de 45 °C.

Exemplo 13: Estimativa de taxas de fluxo em um moinho de bolas industrial Materiais e métodos

[00144] Cepa: Galdieria sulphuraria (também chamada de Cyanidium caldarium) UTEX # 2919.

Procedimento

[00145] As células são moídas em um moinho de bolas modelo Multilab da WAB. A câmara de moagem (600 mL) é preenchida com grânulos de cerâmica de 0,8 mm de diâmetro a uma taxa de 65%. A velocidade do módulo de moagem e a taxa de avanço são idênticas em ambos os casos. A taxa de lise na saída do moinho é calculada pela contagem de células de Malassez em comparação com a entrada de biomassa não moída.

Para uma taxa de moagem de 95 a 100%, a taxa de fluxo aplicada nessas condições está entre 1 e 2 litros por hora.

Uma extrapolação dessas taxas de fluxo foi feita usando os resultados obtidos no Exemplo 10.

Multilab (0,6 mL) AP60 (60L) Tamanho do fornecimento L/h fornecimento L/h grânulo 0,8 mm 1 a 2 100 a 200

0,6 mm 1,4 a 2,8 140 a 280 0,3 mm 1,7 a 3,4 170 a 340 0,2 mm 2,3 a 4,6 230 a 460

REFERÊNCIAS

[00146] Bailey, RW., and Staehelin LA. The chemical composition of solated cell walls of Cyanidium caldarium.

Microbiology 54, 2 (1968): 269 a 276.

[00147] Boisen, S. and J. A. Fernandez. 1995.

Prediction of the apparent ileal digestibility of protein and amino acids in feedstuffs and feed mixtures for pigs by in vitro analyses. Anim. Feed Sci. Technol. 51:29 a 43.

[00148] Li SY, Shabtai Y, and Arad S. Floridoside as a carbon precursor for the synthesis of cell-wall polysaccharide in the red microalga Porphyridium sp.(Rhodophyta). Journal of phycology 38, no 5 (2002): 931 a 938.

[00149] Marquardt, J, and Rhiel E. The membrane- intrinsic light-harvesting complex of the red alga Galdieria sulphuraria (formerly Cyanidium caldarium): biochemical and immunochemical characterization. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics 1320, 2 (1997): 153 64.

[00150] Martinez-Garcia M, Stuart MC, van der Maarel MJ. Characterization of the highly branched glycogen from the thermoacidophilic red microalga Galdieria sulphuraria and comparison with other glycogens. Int J Biol Macromol.

2016 Agosto ;89:12 a 18.

[00151] Martinez-Garcia M, Kormpa A, van der Maarel MJEC. The glycogen of Galdieria sulphuraria as alternative to starch for the production of slowly digestible and resistant glucose polymers. Carbohydr Polym. 2017 Agosto 1;169:75 a 82

[00152] Moon M, Mishra S.K, Kim C.W, Suh W.I, Park M.S, and Yang J-W. Isolation and Characterization of Thermostable Phycocyanin from Galdieria Sulphuraria. 2014.

31:1 a 6.

[00153] Sloth J.K, Wiebe M.G, Eriksen N.T.

Accumulation of phycocyanin in heterotrophic and mixotrophic cultures of the acidophilic red alga Galdieria sulphuraria. Enzyme and Microbial Technology 38 (2006) 168 a 175

[00154] Huang H, Song W, Rieffel J, and Lovell J.F.

Emerging applications of porphyrins in photomedicine.

Frontiers in physics (2015) 3 a 23.

[00155] Eriksen, NT.Production of Phycocyanin—a Pigment with Applications in Biology, Biotechnology, Foods and Medicine. Applied Microbiology and Biotechnology 80, 1 (2008): 1 14.

[00156] Cruz de Jesús, Verónica, Gabriel Alfonso Gutiérrez-Rebolledo, Marcela Hernández-Ortega, Lourdes

Valadez-Carmona, Angélica Mojica-Villegas, Gabriela Gutiérrez-Salmeán, et German Chamorro-Cevallos. “Methods for Extraction, Isolation and Purification of C- Phycocyanin: 50 Years of Research in Review” 3, no 1 (2016).

[00157] Montalescot V, Rinaldi T, Touchard R, Jubeau S, Frappart M, Jaouen P, Bourseau P, et Marchal L.

Optimization of bead milling parameters for the cell disruption of microalgae: Process modeling and application to Porphyridium cruentum and Nannochloropsis oculata.

Bioresource Technology 196 (2015): 339 46.

Claims (22)

REIVINDICAÇÕES

1. Processo otimizado para o cultivo e a valorização de algas vermelhas unicelulares (URA) compreendendo as etapas (a) de cultura de fermentação da URA, (b) de recuperação da biomassa e (c) de lise celular e, se necessário, uma etapa (d) de extração de produtos valorizáveis da biomassa lisada, caracterizado pelo fato de compreender uma etapa (c1) de lise por moagem, mantendo a biomassa durante a moagem a uma temperatura abaixo de 50 °C.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender também uma etapa (d1) de extração das ficocianinas da biomassa lisada por lavagens sucessivas em quantidades de água totalizando menos de 3 vezes o volume total de biomassa lisada.

3. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de compreender também uma das seguintes etapas (a1) de cultura de fermentação com uma fase de maturação com entrada de fonte de carbono limitada no meio de cultura, e/ou (b1) de extração de porfirinas do caldo de fermentação.

4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que as URA pertencem aos gêneros Cyanidioschyzon, Cyanidium ou Galdieria.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que as URA pertencem ao gênero Galdieria e à espécie sulphuraria.

6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que as URA são cultivadas por fermentação em batelada alimentada ou em modo contínuo.

7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a temperatura de moagem não ultrapassa 47 °C.

8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a temperatura de moagem não ultrapassa 40 °C.

9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a temperatura é mantida por um sistema de resfriamento de água da camisa do moinho.

10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a temperatura é mantida injetando-se no moinho uma biomassa previamente resfriada a temperaturas abaixo de 20 °C.

11. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a ficocianina é recuperada da solução de lavagem da biomassa lisada.

12. Processo otimizado para o cultivo e a valorização de algas vermelhas unicelulares (URA) que compreende as etapas (a) de cultura de fermentação da URA, (b) de recuperação da biomassa e (c) de lise celular e, se necessário, uma etapa (d) de extração de produtos valorizáveis da biomassa lisada, caracterizado pelo fato de compreender uma etapa (a1) de cultura de fermentação com uma fase de maturação que inclui a limitação da fonte de carbono no meio de cultura, e se necessário, uma etapa (b1) de extração de porfirinas do suco de fermentação, e/ou (c1) de lise por moagem, mantendo a biomassa durante a moagem a uma temperatura abaixo de 50 °C, e/ou (d1) se necessário, de extração de ficocianinas da biomassa lisada por pelo menos 2 lavagens sucessivas em quantidades de água totalizando menos de 4 vezes o volume total de biomassa lisada.

13. Processo otimizado para o cultivo e a valorização de algas vermelhas unicelulares (URA) compreendendo as etapas (a) de cultura de fermentação da URA, (b) de recuperação da biomassa e (c) de lise celular e, se necessário, uma etapa (d) de extração de produtos valorizáveis da biomassa lisada, caracterizado pelo fato de compreender uma etapa (b1) de extração de porfirinas do caldo de fermentação, e se necessário, uma etapa (a1) de cultura de fermentação com uma fase de maturação que inclui limitar a entrada da fonte de carbono para o meio de cultura e/ou (c1) de lise por moagem, mantendo a biomassa durante a moagem a uma temperatura abaixo de 50 °C, e/ou (d1) de extração de ficocianinas da biomassa lisada por pelo menos 2 lavagens sucessivas em quantidades de água representando no total menos de 4 vezes o volume total da biomassa lisada.

14. Processo otimizado para o cultivo e a valorização de algas vermelhas unicelulares (URA) compreendendo as etapas (a) de cultura de fermentação da URA, (b) de recuperação da biomassa e (c) de lise celular e, se necessário, uma etapa (d) de extração de produtos valorizáveis da biomassa lisada, caracterizado pelo fato de compreender uma etapa (d1) de extração de ficocianinas da biomassa lisada por pelo menos 2 lavagens sucessivas em quantidades de água representando no total menos de 4 vezes o volume total de biomassa lisada, e se necessário, uma etapa (a1) de cultura de fermentação com uma fase de maturação que inclui limitar a entrada da fonte de carbono para o meio de cultura e/ou (b1) de extração de porfirinas do caldo de fermentação, e/ou (c1) de lise por moagem com a biomassa sendo mantida durante a moagem a uma temperatura abaixo de 50 °C.

15. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de que as URA pertencem aos gêneros Cyanidioschyzon, Cyanidium ou Galdieria.

16. Processo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que as URA pertencem ao gênero Galdieria e à espécie sulphuraria.

17. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 16, caracterizado pelo fato de que as URA são cultivadas por fermentação em batelada alimentada ou em modo contínuo.

18. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 17, caracterizado pelo fato de que a ficocianina é recuperada da solução de lavagem da biomassa lisada.

19. Biomassa lisada caracterizada pelo fato de ser obtida pelo processo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18.

20. Porfirinas caracterizadas pelo fato de serem obtidas pelo processo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 3 a 18.

21. Ficocianina caracterizada pelo fato de ser obtida pelo processo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 2 a 18.

22. Alimento ou suplemento alimentar caracterizado pelo fato de compreender uma biomassa lisada conforme definida na reivindicação 19 ou uma ficocianina conforme definida na reivindicação 21.