FR2669935A1 - Procede et appareil pour la regulation de la concentration de source de carbone dans la culture aerobie d'un micro-organisme. - Google Patents

Abstract

On maintient une faible teneur de la source de carbone du substrat dans le récipient de culture pendant l'alimentation de la culture dans des cultures aérobies discontinues, continues ou continues a recyclage des cellules, en contrôlant l'augmentation du pH ou de la teneur en oxygène dissous dans le milieu de culture et en ajoutant par intermittence la solution d'alimentation dans le récipient de culture à un débit calculé en utilisant un dispositif de régulation d'alimentation régulé par ordinateur. Application: production de L-lysine par fermentation avec une productivité améliorée, des concentrations plus élevées du produit accumulé et des rendements accrus en L-lysine.

Description

Domaine de l'invention
La présente invention concerne un procédé pour réguler la concentration de source de carbone dans la culture aérobie d'un micro-organisme. En particulier, la présente invention concerne un procédé pour réguler la source de carbone du substrat qui reste à une faible teneur dans un récipient de culture pendant l'alimentation de culture dans les cultures discontinues, les cultures continues ou les cultures continues à recyclage de cellules aérobies. Ceci est effectué en contrôlant l'augmentation du pH ou de la teneur en oxygène dissous dans les milieux de culture et en ajoutant la solution d'alimentation par intermittence dans les récipients de culture à un débit d'alimentation calculé en utilisant un dispositif de régulation d'alimentation régulé par ordinateur.Un appareil approprié pour la mise en pratique de ce procédé est également proposé.

La présente invention concerne en outre un procédé pour la production de L-lysine par fermentation, qui est un aminoacide important utilisé comme additif alimentaire pour poulets ou cochons puisque la L-lysine est insuffisante dans les céréales pour l'alimentation.

Arrière-plan de l'invention
Afin de produire diverses substances par fermentation, par exemple, divers aminoacides ou acides nucléiques, en utilisant des micro-organismes ou la production de cellules microbiennes, par exemple, des cellules de levures, des micro-organismes sont cultivés par culture aérobie. La culture aérobie d'un microorganisme est effectuée industriellement par culture discontinue, culture continue ou culture continue à recyclage de cellules, en utilisant une ou des sources de carbone telles que le sucre, par exemple, comme principale matière première.

Dans cette méthode de culture, il est nécessaire de maintenir aussi faible que possible la concentration de la source de carbone (substrats) telle que des sucres dans un récipient de culture pendant l'alimentation de la culture. De cette manière, plusieurs objets sont atteints, par exemple éviter l'inhibition du substrat par la source de carbone brute, réduire la perte de source de carbone brute en utilisant efficacement les matières premières pour la culture, isoler facilement le produit du bouillon de fermentation final et empêcher la pollution de l'environnement par la source de carbone restante contenue dans le liquide résiduaire qui reste après isolement du produit.

Dans le cas de la culture continue et de la culture continue à recyclage de cellules, le produit est isolé du bouillon de culture qui est déchargé en continu même pendant l'alimentation des cultures. Il est nécessaire de réguler le débit des sources de carbone, par exemple, les sucres, dans le procédé d'isolement à la teneur la plus faible possible pour que les sources de carbone aient une influence pratiquement nulle sur le processus d'isolement. Il est également nécessaire d'éviter la perte des matières premières. Dans ce type de culture, il a également été souhaitable d'éliminer les opérations manuelles pour l'analyse de la concentration de source de carbone en les remplaçant par le contrôle automatique qui régule la stabilité de la concentration de la source de carbone.

Pour maintenir la concentration de la source de carbone, par exemple le sucre, à de faibles valeurs pendant l'alimentation des cultures, on a décrit antérieurement des méthodes qui comprennent la régulation de la concentration de source de carbone en utilisant un indice indépendant tel que la quantité d'oxygène consommé, la quantité de dioxyde de carbone dégagé, le pH, la quantité de sous-produits ou la quantité d'ammoniaque ajoutée pendant l'addition des sources de carbone comme le sucre en quantité obtenue en les multipliant par un coefficient proportionnel prédéterminé. Selon ces méthodes, l'activité microbienne pendant la culture ne peut pas être mesurée avec une précision élevée, de sorte que dans certains cas, la concentration ne peut pas être régulée de manière satisfaisante lorsque l'activité a varié de manière anormale.Pour ces raisons, il est impossible de réguler efficacement la concentration de source de carbone à une faible teneur (par exemple moins de 3 g/l) pendant la culture.

En outre, il y a une autre méthode connue qui décrit la détection de l'épuisement des concentrations de source de carbone dans un récipient de culture pendant la culture seulement par la concentration d'oxygène dissous. Cependant, la fiabilité de détection est mauvaise. Lorsque l'état d'aération ou d'agitation (vitesse de rotation de l'agitateur, débit d'air) varie, la concentration d'oxygène dissous varie fortement. Dans ce cas, le capteur détecte parfois de manière incorrecte l'épuisement des sources de carbone, de sorte que la concentration de source de carbone dans le récipient de culture ne peut pas être régulée efficacement. Pour ces raisons, cette méthode n'est pas pratique non plus.

Il est donc évident que l'on a besoin d'une méthode et d'un appareil qui régulent automatiquement la concentration de source de carbone dans la culture aérobie de micro-organismes. La présente invention propose ce procédé et cet appareil pour surmonter les problèmes décrits ci-dessus.

Un autre aspect de la présente invention concerne un procédé pour la production de L-lysine par fermentation. On a décrit précédemment des procédés qui consistent à cultiver des micro-organismes capables de produire la L-lysine par un procédé discontinu ou continu, à accumuler la L-lysine dans le milieu et à recueillir le produit, la L-lysine.

Dans le cas d'un procédé discontinu, le milieu liquide contenant des sources de carbone et des sources d'azote est placé dans un fermenteur pour effectuer l'incubation de manière discontinue. Ou bien encore, le milieu contenant la (ou les) source(s) de carbone seule(s) est ajouté en continu ou par intermittence pour effectuer l'alimentation des cultures.

Dans le cas du procédé continu, l'incubation est mise en oeuvre en introduisant en continu le milieu dans un fermenteur et en retirant en continu le même volume de bouillon de culture pour maintenir la quantité de cellules ou la concentration du produit, par exemple, à un niveau constant.

Lorsque la production de L-lysine par fermentation est effectuée par le procédé discontinu classique, l'accumulation du produit dans le bouillon de culture ou les rendements sont élevés mais il est difficile d'obtenir une productivité élevée. Par contre, lorsque l'on utilise le procédé continu classique, la productivité est élevée, mais il est difficile d'obtenir une accumulation élevée de produit ou des rendements élevés. Afin de répondre à la demande croissante en L-lysine et de la préparer à des coûts plus faibles, il est nécessaire d'améliorer la productivité de L-lysine par fermentation et d'améliorer la concentration et le rendement du produit accumulé.

On a donc besoin de disposer d'un procédé pour produire la L-lysine par fermentation qui atténue les problèmes techniques de l'art antérieur. La présente invention combine les avantages du procédé discontinu classique et du procédé continu classique en proposant un nouveau procédé de fermentation pour la production de
L-lysine avec une productivité élevée, une concentration élevée de produit accumulé et un rendement élevé.

RESUME DE L'INVENTION
Un objet de la présente invention est de proposer un procédé pour réguler la concentration de source de carbone dans la culture aérobie d'un micro-organisme et un appareil à utiliser dans la mise en oeuvre de ce procédé. Un autre objet de la présente invention est de proposer un procédé perfectionné pour la production de L-lysine par fermentation.

Dans un mode de mise en oeuvre, la présente invention concerne un procédé pour la culture aérobie d'un micro-organisme dans des cultures discontinues, des cultures continues ou des cultures continues à recyclage de cellules comprenant l'addition intermittente d'une solution d'alimentation de source de carbone à un récipient de culture qui est régulé automatiquement par un ordinateur.

Dans un autre mode de mise en oeuvre, la présente invention concerne un appareil pour la culture aérobie d'un microorganisme dans des cultures discontinues, des cultures continues ou des cultures continues à recyclage de cellules comprenant un récipient de culture muni de capteurs pour détecter le pH et la concentration d'oxygène dissous d'un milieu de culture dans le récipient de culture, respectivement, et d'un appareil pour l'aération et l'agitation du milieu de culture, qui est destiné à recevoir une solution d'alimentation et des moyens pour réguler le débit d'alimentation de la solution d'alimentation dans le récipient de culture, les moyens de régulation comprenant un premier convertisseur de signaux pour recevoir les signaux produits par le capteur de pH et le capteur de concentration d'oxygène dissous respectivement et produire des signaux convertis ; des moyens de calcul pour recevoir les signaux convertis, calculer le débit d'alimentation en utilisant les signaux convertis et produire un signal de débit d'alimentation ; un second convertisseur de signaux pour recevoir le signal de débit d'alimentation et produire un signal de débit d'alimentation converti ; et des moyens de régulation du débit d'alimentation pour réguler le débit d'alimentation de la solution d'alimentation dans le récipient de culture en utilisant le signal de débit d'alimentation converti.

Dans un autre mode de mise en oeuvre, la présente invention concerne un procédé pour produire la L-lysine par fermentation qui comprend l'inoculation d'un micro-organisme capable de produire la L-lysine dans un milieu liquide, la culture du micro-organisme tout en introduisant du milieu supplémentaire contenant à la fois des sources de carbone et des nutriments ayant un effet d'accélération de la croissance après la phase de croissance logarithmique du micro-organisme de manière à maintenir les sources de carbone à une concentration de pas plus de 5 g/l dans le milieu de culture et la collecte de la L-lysine produite et accumulée dans le milieu.

Divers autres objets et avantages de la présente invention appara,tront à la lecture de la description détaillée qui va suivre en référence aux dessins annexés dans lesquels :
la figure 1 illustre un mode de mise en oeuvre de l'appareil de la présente invention ;
la figure 2 illustre l'appareil utilisé à l'exemple 1 ;
la figure 3 illustre l'appareil utilisé à l'exemple comparatif 1 ;
la figure 4 représente les conditions pour la culture d'alimentation dans l'exemple 1. Les ordonnées (axe des y) repré sentent la concentration d'oxygène dissous dans la figure 4(a), le pH dans la figure 4(b) et la concentration de sucre dans le fermenteur dans la figure 4(c).Les abcisses (axe des x) représentent le temps dans les figures 4(a)-(c) ;
la figure 5 représente l'état de régulation de la concentration de sucre (axe des y) pendant une période de temps (axe des x) en heure dans l'exemple 1 ; et
la figure 6 représente les conditions de culture dans
l'exemple comparatif 1. Les ordonnées représentent la concentration de sucre et les abscisses le temps (en heure).

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
La présente invention concerne notamment un procédé pour
la culture aérobie d'un micro-organisme en utilisant des cultures discontinues, des cultures continues ou des cultures continues à recyclage de cellules, qui a les avantages que la vitesse d'assimilation des sources de carbone telles que le sucre par le micro-organisme pendant le procédé d'alimentation peut être régulée à un débit d'alimentation convenable de la solution d'alimentation en sources de carbone, l'épuisement des sources de carbone peut être détecté avec une bonne fiabilité et certitude et l'épuisement des sources de carbone peut être détecté sans être influencé par l'état d'aération ou d'agitation. D'autres avantages sont également fournis dans cette méthode.

La présente invention propose également un appareil pour la mise en oeuvre du procédé ci-dessus.

A la suite de recherches poussées pour résoudre les problèmes précédents discutés dans le chapitre "Arrière-plan", la demanderesse a déocuvert que lorsque les sources de carbone telles que le sucre sont ajoutées par intermittence dans un récipient de culture dans la culture aérobie par culture discontinue culture continue ou culture continue à recyclage de cellules, le débit d'alimentation de la solution d'alimentation de source de carbone au moment de l'addition et de la ou des addition(s) subséquente(s) peut être déterminé en utilisant comme indice l'augmentation de pH ou l'augmentation de concentration d'oxygène dissous provoquée par l'épuisement des sources de carbone dans le milieu de culture contenu dans le récipient de culture.Le débit est contrôlé et régulé par un ordinateur comme la période entre la fin de la première addition et la période subséquente d'addition d'alimentation par rapport à l'augmentation de pH ou d'oxygène dissous dans les cultures, résolvant ainsi les problèmes de l'art antérieur.

Ainsi donc, la présente invention concerne notamment un procédé pour la culture aérobie d'un micro-organisme dans lequel la première addition de la solution d'alimentation de source de carbone dans une culture aérobie à charge d'alimentation, une culture continue ou une culture continue à recyclage de cellules pour un micro-organisme est produite par addition intermittente de la solution d'alimentation dans le récipient de culture en ajoutant la solution d'alimentation par intermittence dans le récipient de culture et est effectuée en ajoutant la solution d'alimentation pendant une durée définie à un débit d'alimentation préalablement déterminé.

La seconde addition ou la ou les addition(s) subséquente(s) sont amorcées lorsque l'ordinateur détecte une augmentation de pH ou une augmentation de concentration d'oxygène dissous produite lorsque la source de carbone (substrat) dans le récipient de culture est épuisée à la période de l'arrêt de l'addition précédant une certaine période d'addition et effectuée en ajoutant la solution d'alimentation au récipient de culture pendant une durée définie à un débit d'alimentation calculé par l'ordina- teur à partir du temps pour la période pour arrêter de l'addition et du débit de la solution d'alimentation dans la période d'addition précédant la période pour l'arrêt de l'addition de telle manière que le débit devient plus petit lorsque le temps pour la période pour l'arrêt de l'addition est long et le débit devient plus grand lorsque le temps pour la période pour l'arrêt de l'addition est court.

Le procédé est caractérisé par la régulation automatique de la concentration de substrat à une teneur faible constante dans un récipient de culture dans la culture aérobie du micro-organisme.

Il est bien connu de soumettre un micro-organisme à une culture aérobie discontinue, une culture continue ou une culture continue à recyclage de cellules tout en introduisant en continu une solution d'alimentation contenant les sources de carbone du substrat tel que le sucre dans un récipient de culture afin de produire diverses substances par fermentation ou de produire les cellules elles-mêmes. Le terme "en continu" est utilisé ici dans un sens large et s'entend également dans le sens de "par intermittence".La culture aérobie discontinue, la culture continue ou la culture continue à recyclage de cellules dans la présente invention peuvent aussi être effectuées en modifiant des méthodes bien connues pour la culture discontinue, la culture continue ou la culture continue à recyclage de cellules, sauf la méthode d'introduction de la solution d'alimentation pendant la culture d'alimentation décrite ici.

La première addition de la solution d'alimentation pendant la culture d'alimentation démarre en général lorsque la concentration de source(s) de carbone du substrat dans le milieu de culture atteint une certaine teneur faible dans le milieu de culture dans une culture principale précédant la culture d'alimentation. Le débit d'alimentation prédéterminé de la solution d'alimentation est déterminé au préalable par une expérience préliminaire et en général égale au débit du substrat consommé dans la culture principale au moment du démarrage de la culture d'alimentation, à savoir au moment où la première alimentation démarre.La période de temps définie dans l'addition de la solution d'alimentation est une durée facultative choisie dans un intervalle tel que l'activité du micro-organisme pour consommer la source de carbone, tel que le sucre, ne change pas beaucoup (en général dans la gamme de 10 min à 24 h).

Lorsque le substrat dans le milieu de culture après la fin de la première addition est épuisé, le pH du milieu et la concentration d'oxygène dissous augmentent tous deux. Lorsque l'augmentation est détectée par l'ordinateur au moyen du capteur de pH et du capteur de concentration d'oxygène dissous, l'ordinateur commande l'appareil de régulation du débit de la solution d'alimentation dans le récipient de culture, en démarrant ainsi la seconde addition de la solution d'alimentation.

L'augmentation de pH et l'augmentation de concentration d'oxygène dissous n'ont pas nécessairement lieu simultanément.

Lorsqu'il y a un intervalle de temps entre ces deux augmentations, la seconde addition est démarrée sur la base de la détection de la première de ces augmentations. Le capteur de pH et le capteur de concentration d'oxygène dissous sont parfois en dérangement et sont fréquemment étalonnés. En conséquence, ces capteurs ne sont pas utilisés seuls. En utilisant les deux capteurs simultanément, on peut améliorer notablement la fiabilité de détection de l'épuisement du substrat.

Le débit d'alimentation dans la seconde addition de la solution d'alimentation est un débit obtenu par le calcul de telle manière que si la période pour l'arrêt de l'addition est longue, le débit devient plus petit et si la période est courte, le débit devient plus grand. Ceci permet un équilibrage du débit d'alimentation du substrat avec la vitesse de consommation du substrat, en maintenant ainsi la concentration de substrat dans le milieu de culture dans le récipient de culture à la faible teneur désirée, par rapport à la période pour l'arrêt de l'addition entre la première addition et la seconde addition et le débit d'alimentation de la première addition. Le calcul est fait par l'ordinateur mais ce programme d'ordinateur peut être facilement préparé par l'homme de l'art. Un exemple du programme est représenté à l'exemple 1 décrit ici.

La durée déterminée pendant laquelle est effectuée la seconde addition est déterminée de manière semblable à la durée déterminée pour la première addition. Il peut ne pas être nécessaire que la période pour la seconde addition soit la même que la période pour la première addition, aussi longtemps que la durée est choisie dans un intervalle tel que l'activité du micro-organisme pour consommer la source de carbone (substrat) telle que le sucre, par exemple, ne varie pas fortement. La période d'alimentation est choisie chaque fois à partir de la durée dans laquelle l'activité du micro-organisme pour consommer le substrat ne varie pas forte ment et la concentration de substrat dans le récipient de culture peut etre maintenue à une faible teneur pendant la culture.

L'instant de démarrage, le débit d'alimentation et la période d'alimentation de la troisième addition de la solution d'alimentation et des suivantes sont déterminés de manière semblable à la seconde addition.

Donc, la seconde addition et les suivantes démarrent lorsque l'ordinateur détecte l'augmentation de pH ou l'augmentation de concentration d'oxygène dissous produite lorsque la source de carbone (substrat) dans le récipient de culture est épuisée pendant la période d'arrêt de l'addition précédant une certaine période pour l'addition et sont effectuées pendant une certaine durée au débit d'alimentation calculé par l'ordinateur de telle manière que si la période pour l'arrêt de l'addition est longue, le débit devient plus petit et si la période est courte, le débit devient plus long, sur la base de la période d'arret de l'addition et du débit d'alimentation de l'addition précédente.

Comme décrit ci-dessus, il est possible de déterminer le débit d'alimentation de la solution d'alimentation de(s) source(s) de carbone du substrat tel que le sucre, par exemple, et d'autres conditions pour l'addition tout en contrôlant l'activité d'un micro-organisme point par point. Il est également possible de réguler facilement la concentration de substrat dans le récipient de culture à une teneur aussi faible que moins de 5 g/l, ensuite moins de 3 g/l.

La présente invention concerne également un appareil utilisé pour le procédé décrit ci-dessus comprenant : (i) un récipient de culture muni de capteurs pour détecter le pH et la concentration d'oxygène dissous d'un milieu de culture dans le récipient de culture, respectivement, et un appareil pour l'aération et l'agitation, qui est destiné à recevoir une solution d'alimentation via un dispositif de régulation du débit et (ii) un ordinateur muni de deux convertisseurs de signaux dans lequel (a) le capteur de pH et le capteur de concentration d'oxygène dissous sont branchés afin que les valeurs de pH et de concentration d'oxygène dissous détectées par les capteurs soient introduits dans l'ordinateur via un convertisseur de signaux, respectivement, et (b) le dispositif de régulation de débit est branché afin que le débit d'alimentation de la solution d'alimentation calculé par l'ordinateur soit transféré au dispositif via l'autre convertisseur de signaux.

L'appareil selon la présente invention est un appareil qui a les fonctions de détecter l'épuisement des sources de carbone du substrat telles que le sucre, par exemple, et de calculer le débit d'alimentation de la solution d'alimentation de source de carbone dans l'ordinateur, à partir des signaux transférés dans l'ordinateur à partir du capteur de pH tel qu'une électrode à pH, par exemple, et du capteur de concentration d'oxygène dissous tel qu'une électrode à oxygène dissous, par exemple, installés dans le récipient de culture et de transmettre le débit d'alimentation calculé au dispositif de régulation du débit de la solution d'alimentation installé dans la conduite pour l'alimentation en sources de carbone dans le récipient de culture.

Comme il est bien connu dans la technique, les capteurs de pH et les capteurs d'oxygène dissous ont très souvent tendance à se détraquer et doivent être fréquemment étalonnés. Selon la présente invention, les capteurs respectifs ne sont pas utilisés seuls mais plutôt en combinaison, de sorte que la fiabilité de détection de l'épuisement des sources de carbone telles que le sucre, par exemple, peut être nettement améliorée. Lorsque chaque capteur est utilisé seul, les effets sont présentés bien que la fiabilité diminue.

Dans un autre mode de mise en oeuvre, la présente invention concerne un procédé de fermentation pour la production de
L-lysine en utilisant des bactéries productrices de L-lysine. La présente invention propose un procédé pour produire la L-lysine qui combine les avantages à la fois de la fermentation continue classique et de la fermentation discontinue classique, ceux étant une productivité élevée, des concentrations élevées de produits accumulés et des rendements élevés de L-lysine.La demanderesse a découvert qu'en inoculant un micro-organisme capable de produire la
L-lysine dans un milieu liquide, en cultivant le micro-organisme tout en introduisant un milieu d'alimentation contenant à la fois des sources de carbone et des nutriments ayant un effet d'accélération de la croissance après la phase de croissance logarithmique du micro-organisme de manière à maintenir les sources de carbone à une concentration de pas plus de 5 g/l dans le bouillon de culture et en recuillant la L-lysine produite et accumulée dans le bouillon de culture, les perfectionnements cités ci-dessus pour la production de L-lysine sont réalisés.

Donc, la présente invention concerne un procédé pour produire la L-lysine par fermentation qui comprend l'inoculation d'un micro-organisme capable de produire la L-lysine dans un milieu liquide, la culture du micro-organisme tout en introduisant un milieu d'alimentation contenant à la fois des sources de carbone et des nutriments ayant un effet d'accélération de la croissance après la phase de croissance logarithmique du micro-organisme tout en maintenant la source de carbone à une concentration de pas plus de 5 g/l dans le bouillon de culture et la collecte de la L-lysine produite et accumulée dans le bouillon.

Dans le procédé de la présente invention, il n'y a pas de limitation particulière aux micro-organismes capables de produire la L-lysine dans la présente invention aussi longtemps que les micro-organismes sont capables de produire la L-lysine. Des exemples de ces micro-organismes comprennent des micro-organismes appartenant au genre Brevibacterium ou Corynebacterium qui possèdent les propriétés nécessaires pour leur conférer la productivité de L-lysine (auxotrophie à l'homosérine, résistance à la S-(2-aminoéthyl)-L-cystéine, résistance à l'a-chlorocaprolactame, etc.). Plus particulièrement, des exemples de micro-organismes comprennent Brevibacterium lactofermentum ATCC 21800,
Brevibacterium flavum ATCC 21475 et Corynebacterium acetoglutamicum
ATCC 21491.

Il n'y a pas de limitation particulière au milieu liquide non plus, mais on peut utiliser un milieu liquide complet classique connu contenant des sources de nutriments organiques et inorganiques telles qu'une source de carbone, une source d'azote et d'autres nutriments à l'état de trace.

Comme sources de carbone utilisées dans l'alimentation selon le procédé de la présente invention, on peut utiliser n'importe lesquels des sucres, acides organiques, alcools et autres généralement utilisés comme matières premières (sources de carbone) pour la fermentation aussi longtemps que lesdites bactéries productrices de lysine peuvent assimiler les sources de carbone.

Les nutriments ayant un effet d'accélération de croissance concernent les aminoacides, les vitamines et les matières naturelles contenant ceux-ci qui sont efficaces pour accélérer la croissance de la bactérie productrice de L-lysine. Des exemples spécifiques comprennent l'hydrolysat de protéine de soja, l'extrait de levure et la liqueur de trempage de mais.

Comme il est connu de l'homme de l'art, le milieu d'alimentation contient en général des sources de carbone seules dans la culture d'alimentation et complètes dans le milieu liquide dans le procédé continu. Dans le procédé de la présente invention, le milieu d'alimentation contient à la fois des sources de carbone et des nutriments ayant un effet d'accélération de la croissance.

L'utilisation de ce milieu d'alimentation est l'une des caractéristiques du procédé de la présente invention.

Dans le procédé de la présente invention, le milieu est introduit pendant ou après la fin de la phase de croissance logarithmique du micro-organisme. L'introduction avant la fin de la phase de croissance logarithmique doit être évitée puisque la croissance initiale des bactéries pourrait être inhibée.

Pour l'introduction du milieu pendant la phase de croissance logarithmique ou après la fin de cette phase, l'alimentation peut être mise en oeuvre soit en continu, soit par intermittence. En outre, lorsqu'on s'attend à ce que le volume de milieu dans le fermenteur dépasse le volume chargé admissible dans le fermenteur, une partie du bouillon de culture est soutirée du fermenteur au préalable, ou bien au moment où le volume atteint le volume admissible, de sorte que l'on puisse continuer l'alimentation.

En conséquence, pour être important pour l'introduction du milieu, le milieu doit être introduit de manière à maintenir toujours la concentration des sources de carbone dans le bouillon de culture à une teneur de pas plus de 5 g/l. Ceci est également l'une des caractéristiques de la présente invention. Pour maintenir la concentration de la source de carbone à la teneur constante, le bouillon de culture doit être soumis à des prélévements d'échantillons pour analyser directement la concentration de la source de carbone. Ou bien encore, le pH ou la concentration d'oxygène dissous peuvent être mesurés et par détection d'une insuffisance de la source de carbone à partir de sa variation, l'alimentation du milieu peut être régulée.A moins que la concentration de la source de carbone soit maintenue constamment à une teneur de 5 g/l ou moins, la croissance des bactéries ou la vitesse de formation de la
L-lysine diminue et ce cas n'est pas conforme avec l'objet de la présente invention.

Les caractéristiques de la présente invention sont comme décrites ci-dessus et il n'y a pas de limitations particulières à d'autres conditions, par exemple, la fermentation. Par exemple, la température pour la production de L-lysine par fermentation selon la présente invention peut être n'importe quelle température à laquelle les bactéries productrices de lysine utilisées peuvent pousser et elle est en général dans l'intervalle de 25 à 45 C, de préférence 30 à 40 C. Le pH fixé pour la fermentation est en général dans la gamme de 5,8 à 8,5, de préférence de 6,5 à 7,5.

Pour le réglage du pH, on peut utiliser des substances acides ou alcalines inorganiques ou organiques et en outre l'urée, le carbonate de calcium ou le gaz ammoniac, par exemple.

Comme fermenteur utilisé dans la présente invention, on peut utiliser n importe quelle forme aussi longtemps que le fermenteur est utilisé de manière classique pour la production d'aminoacides par fermentation. Par exemple, on peut utiliser une cuve de mélange complet munie d'une tubine à hélice ou un fermenteur du type à air comprimé.

Après la fin de l'incubation, la L-lysine peut être recueillie à partir du bouillon de fermentation de manière classique, par exemple par une méthode à la résine échangeuse d'ions, par cristallisation et d'autres méthodes ou par une combinaison de celles-ci.

Les exemples suivants illustrent la présente invention sans toutefois en limiter la portée.

Exemples
Dans les exemples 1 à 5, on utilise l'appareil représenté à la figure 2 dans lequel le petit fermenteur en verre E8], l'électrode à pH [9], l'électrode à oxygène dissous ElO], l'ordinateur personnel El 13, le convertisseur A/D C123, le convertisseur D/A C13] et la pompe d'alimentation C14] correspondent dans l'appareil représenté à la figure 1 au récipient de culture (fermenteur) El], au capteur de pH E2], au capteur de concentration d'oxygène dissous E3], à l'ordinateur E4], au convertisseur de signaux (i) C5] dans cet ordinateur, au convertisseur de signaux (ii) C6] dans cet ordinateur et au dispositif de régulation de débit E7], respectivement. Dans les figures 1 à 3, C15] correspond à un dispositif d'aération et agitation pour aérer et agiter le milieu de culture, y compris un moteur M. C16] correspond au signal pour déterminer le débit d'alimentation. C17] correspond à la solution d'alimentation qui s'écoule dans la pompe d'alimentation C14] ou le dispositif de régulation du débit E7].

Exemple 1
Production d'acide L-glutamique par fermentation dans une culture
continue à recyclage de cellules
Dans un flacon agité de 500 ml, on a chargé 30 ml d'un milieu aqueux contenant 30 g/l de glucose, 1 g/l de KH2P04, 0,4 g/l de NgSO4,7H2O, 4 g/l d'urée, 20 mg/l de FeS04,7H20 , 20 mg/l de
MnSO4,4H2O, 5 ml/l d'hydrolysat acide de protéine de soja et 300 pg/l de biotine, puis on a stérilisé par chauffage à 1150C pendant 10 min. Après refroidissement à la température ambiante, on a inoculé le milieu par Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 puis on l'a cultivé à 300C pendant 24 h.

Après avoir chargé le milieu de culture d'ensemencement et 270 ml d'un milieu de culture principale aqueux contenant 80 g/l de mélasse de canne à sucre exprimée en sucre, 1 g/l de KH2P04 et 10 ml/l d'hydrolysat acide de protéine de soja dans un petit fermenteur en verre de 1 I préalablement stérilisé, le mélange a été maintenu à 30 C. On a fait barboter de l'air stérilisé dans un filtre à un débit de 300 ml/min et on a démarré l'agitation tout en maintenant le pH à 7,5 par NH3 gazeux (démarrage de la culture principale).

Le petit fermenteur en verre a été branché à un ordinateur personnel de 16 bit comme représenté à la figure 2. Les signaux analogues pour le pH et la concentration d'oxygène dissous détectés par l'électrode à pH et l'électrode à concentration d'oxygène dissous, qui avaient été introduites dans le fermenteur étaient repris dans l'ordinateur personnel via le convertisseur
A/D incorporé dans l'ordinateur personnel. Le débit d'alimentation du milieu aqueux d'alimentation (solution d'alimentation) qui avait été déterminé et calculé par l'ordinateur personnel était transmis à la pompe d'alimentation comme signaux analogues via le convertisseur D/A incorporé dans l'ordinateur personnel.

Au meme moment que le début de la culture principale, les conditions suivantes étaient fixées sur l'ordinateur personnel débit d'alimentation de la solution d'alimentation ajoutée initialement (première addition), 30 ml/h ; informations détectées pour l'épuisement du substrat de sucre par une augmentation de pH, 7,7 ; informations détectées pour l'épuisement du substrat de sucre par une augmentation de concentration d'oxygène dissous, 20 % (la teneur ordinaire en oxygène dissous est de 1 à 10 %) et durée d'alimentation de la solution d'alimentation 3 h.

Afin d'inhiber la croissance des bactéries en produisant ainsi l'acide glutamique, on a ajouté du monopalmitate de polyoxyéthylènesorbitan à une concentration de 0,2 % en poids, 5 h après le démarrage de la culture principale. Après avoir continué la culture principale pendant 5 autres heures, l'ordinateur personnel a été mis en conditions de régulation (état de marche automatique) et la première addition de la solution d'alimentation a été démarrée au débit d'alimentation prédéterminé de 30 ml/h. La solution d'alimentation ajoutée au fermenteur contenait 180 g/l de mélasse de canne à sucre comme sucre, 5 ml/l d'hydrolysat acide de protéine de soja et 0,2 % en poids de monopalmitate de polyoxyéthy lènesorbitan.

En même temps, on a fait passer le milieu de culture à travers un microfiltre à membrane plate qui avait été préalablement stérilisé en quantité de (débit d'alimentation de la solution d'alimentation +20) ml par heure pour fractionner en 20 ml de la solution contenant les cellules et le filtrat. La solution contenant les cellules a été recyclée au fermenteur. L'acide
L-glutamique a été recueilli par recristallisation à partir du filtrat exempt de cellules.

Après démarrage de la première addition de la solution d'alimentation, l'ordinateur a commencé à fonctionner automatiquement et au moment où la durée prédéterminée (3 h) pour l'addition de la solution d'alimentation s'est écoulée, l'addition de la solution d'alimentation a été une fois arrêtée automatiquement en suivant les conditions établies. Après arrêt de l'addition, la concentration en sucre dans le fermenteur a diminué comme indiqué par la portion A dans la figure 4 pour devenir pratiquement égale à 0 g/l.

A ce moment, le pH et la concentration d'oxygène dissous augmentaient presque en même temps.

Au moment où soit le pH, soit la concentration d'oxygène dissous atteignait le niveau antérieur de détection d'épuisement du substrat, l'ordinateur calcule immédiatement et établit le débit d'alimentation de la solution d'alimentation pour la seconde addition. Le niveau déterminé produit par l'ordinateur était introduit dans la pompe d'alimentation. A nouveau, la solution d'alimentation était ajoutée pendant 3 h au débit déterminé. En répétant ce mode opératoire ensuite, la concentration de sucre dans le fermenteur était régulée avec une bonne précision à 0-2 g/l.

Le débit d'alimentation de la solution d'alimentation dans les additions suivant la seconde addition était établi par la règle suivante basée sur la durée (t) lorsque l'addition de la solution d'alimentation était terminée et le débit d'alimentation immédiatement avant que l'addition de la solution d'alimentation soit terminée.

* Si T < 10 min, établir le débit d'alimentation d'une
solution d'alimentation fraîche à 1,1 v, où v désigne
le débit d'alimentation dans la période pour l'addition
immédiatement avant.

* Si 10 min < T < 30 min, établir un nouveau débit d'ali-
mentation à v.

* Si 30 min < T < ( 1 h, établir un nouveau débit d'alimen-
tation à 0,9 v.

* Si 1 h < T < 2 h, établir un nouveau débit d'alimenta
tion à 0,8 v.

Ici, les coefficients v et T varient parfois selon les conditions de culture comme le type de culture, le type de substrat, les propriétés des bactéries utilisées et ainsi de suite.

Le nombre de règles peut être convenablement diminué ou augmenté.

Pour information, dans la culture de cet exemple, il était déjà confirmé par une expérience préliminaire qu'il n'y avait pas de chance de satisfaire T > 2 h. En outre, la durée pour l'addition de la solution d'alimentation était fixée à 3 h chaque fois dans cet exemple ; cependant, comme décrit ci-dessus, il est inutile de maintenir constante la durée d'addition, aussi longtemps que la durée dans une gamme telle que l'activité des bactéries ne varie pas beaucoup.

En continuant la culture pendant 80 h, on a obtenu 132 g d'acide L-glutamique. Après le démarrage de la marche automatique, la concentration de sucre pouvait être régulée de manière stable à 2 g/l de manière totalement automatique comme indiqué à la figure 5.

Exemple comparatif 1 (technique antérieure)
La technique antérieure est caractérisée en ce qu'on utilise NH3 pour réguler le pH et on introduit du sucre (solution d'alimentation) en proportion de la quantité de NH3 utilisée.

Le milieu de culture d'ensemencement obtenu de manière semblable à l'exemple 1 et 270 ml du même milieu de culture principale qu'à l'exemple 1 ont été chargés dans un petit fermenteur en verre de 1 I qui avait été préalablement stérilisé. Le mélange a été maintenu à 30 C et on a fait barboter de l'air stérilisé sur filtre à un débit de 300 ml/min. On a démarré l'agitation en maintenant le pH à 7,5 par NH3 gazeux (démarrage de la culture principale).

Le petit fermenteur en verre a été relié à un ordinateur personnel de 16 bit comme indiqué à la figure 3.

5 h après le démarrage de la culture principale, on a ajouté du monopalmitate de polyoxyéthylènesorbitan à une concentration de 0,2 %. Et après avoir continué la culture principale pendant 5 autres heures, l'ordinateur personnel a été mis dans l'état de régulation.

Les signaux analogues ont été repris dans l'ordinateur personnel à partir d'un débitmètre massique relié à la conduite de
NH3 gazeux via le convertisseur A/D incorporé dans l'ordinateur personnel. Après avoir calculé chaque heure le débit d'alimentation pour la solution d'alimentation en quantité proportionnelle à la quantité de NH3 ajoutée, on a programmé l'ordinateur pour envoyer le débit d'alimentation comme signaux analogues à la pompe d'alimentation via le convertisseur D/A incorporé dans l'ordinateur personnel.

La figure 6A illustre les résultats en montrant le rapport du débit d'alimentation de NH3 au débit d'alimentation de la solution d'alimentation pendant la culture qui entrait de la phase de croissance des cellules dans la phase de production d'acide L-glutamique, dans laquelle la régulation de la concentration du sucre devenait mauvaise. Donc, le coefficient proportionnel a été changé 13 h après. Même après le changement, ce coefficient proportionnel était instable de sorte que la régulation de la concentration de sucre dans le fermenteur n'était pas aussi bonne qu'à la figure 5. En conséquence, la concentration du sucre restant (concentration en sucre dans le fermenteur) était contrôlée 5 fois.A cause de cette instabilité, il était impossible de réduire la concentration du sucre restant à une teneur très faible pendant la culture, de manière à éviter que la concentration de sucre soit de O g/l.

En continuant la culture pendant 80 h, on a produit 120 g d'acide L-glutamique, mais cette quantité était inférieure à 132 g dans la production à l'exemple 1.

Les résultats de l'exemple 1 et de l'exemple comparatif 1 sont résumés dans le tableau 1.

Tableau 1

<tb> <SEP> Paramètre <SEP> de <SEP> comparaison <SEP> Exemple <SEP> compa- <SEP> Exemple <SEP> 1
<tb> <SEP> ratif <SEP> 1 <SEP> (art <SEP> (invention)
<tb> <SEP> antérieur)
<tb> Concentration <SEP> régulable <SEP> de <SEP> sucre
<tb> dans <SEP> la <SEP> culture <SEP> (g/l) <SEP> 5 <SEP> - <SEP> 20 <SEP> 0 <SEP> - <SEP> 2
<tb> Temps <SEP> pour <SEP> la <SEP> culture <SEP> d'alimen
<tb> tation <SEP> (h) <SEP> 80 <SEP> 80
<tb> Nombre <SEP> de <SEP> contrôles <SEP> de <SEP> la <SEP> concen
<tb> tration <SEP> de <SEP> sucre <SEP> restant <SEP> (fois) <SEP> 5 <SEP> O
<tb> Ajustements <SEP> manuels <SEP> du <SEP> rapport <SEP> de
<tb> la <SEP> vitesse <SEP> du <SEP> sucre <SEP> consommé <SEP> au
<tb> débit <SEP> d'alimentation <SEP> en <SEP> NH3 <SEP> (fois) <SEP> 5 <SEP> O
<tb> Quantité <SEP> de <SEP> sucre <SEP> sortie <SEP> du
<tb> système <SEP> (g) <SEP> 28,5 <SEP> 0,1
<tb> Quantité <SEP> d'acide <SEP> glutamique
<tb> produite <SEP> (g) <SEP> 120 <SEP> 132
<tb>
Exemple 2
Production de L-phénylalanine par fermentation en culture par
charge d'alimentation
La L-phénylalanine a été produite par fermentation en utilisant Brevibacterium lactofermentum FERM BP-1071 de manière semblable à l'exemple 1, sauf qu'on a remplacé la culture continue à recyclage de cellules par la culture discontinue.

Le milieu, le récipient de culture, la méthode de programmation de la culture et la méthode de la régulation du débit d'alimentation de la solution d'alimentation ont également été modifiés de la manière suivante.

(1) Milieu
(a) Milieu de culture d'ensemencement
Saccharose 2,0 g/dl
Acide phosphorique 0,1
MgS04 40 mg/dl FeSO4 1 MnSO4 1
Urée 0,3 g/dl
Acétate d'ammonium 0,2
Tyrosine 50 mg/dl
KOH 70
Hydrolysat de protéine (en azote total) 200
Biotine 100 pg/l
Vitamine B1 100
Silicone antimousse 20
pH 7,5
stérilisation 20 min à 1200C
(b) Milieu de culture principale
Glucose 15 g/dl MgSO4 28 mg/dl MnSO4 1
Acide phosphorique 90
Biotine 50 g/dl
Vitamine B1 2
Hydrolysat de protéine (en azote total) 870 mg/dl
Tyrosine 100
KOH 70
Silicone antimousse 2 ,ug/l
pH 7,5
stérilisation 20 min à 1200C
(c) Milieu d'alimentation
Le même que dans le milieu principal, sauf qu'on a utilisé 25 g/dl de glucose.

(2) Récipient de culture et procédé de culture
(a) Culture d'ensemencement : après avoir chargé 30 ml de milieu d'ensemencement dans un ballon de 500 ml, on a mis en oeuvre la culture à 300C en agitant.

(b) Culture principale : après avoir chargé 30 ml de bouillon de culture d'ensemencement et 270 ml de milieu de culture principale dans un petit fermenteur en verre de 1 I, on a mis en oeuvre la culture aérobie à 300C (débit d'air 150 ml/min). Le pH a été ajusté à 7,5 par NH3.

(3) Durée de culture :
(a) culture d'ensemencement : 48 h
(b) culture principale : 96 h
(c) temps de démarrage de l'alimentation : 35 h après le
démarrage de la culture principale.

(4) Méthode de régulation du débit d'alimentation de la solution d'alimentation
Le débit d'alimentation était régulé de manière semblable à l'exemple 1, sauf que le débit d'alimentation initial était fixé à 10 ml/h.

Exemple comparatif 2 (art antérieur)
En utilisant NH3, le pH a été ajusté et le débit d'alimentation de la solution d'alimentation a été régulé en utilisant le pH comme indice. Autrement dit, lorsque le pH augmentait plus que le niveau fixé, le débit d'alimentation était augmenté de 5 % et lorsque l'on n'observait pas d'augmentation de pH pendant 5 h, le débit d'alimentation était diminué de 10 2.

Les résultats de l'exemple 2 et de l'exemple comparatif 2 sont résumés dans le tableau 2.

Tableau 2

<tb> <SEP> Exemple <SEP> com- <SEP> Exemple <SEP> 2
<tb> <SEP> Paramètre <SEP> de <SEP> comparaison <SEP> paratif <SEP> 2
<tb> Concentration <SEP> régulable <SEP> de
<tb> culture <SEP> (g/l) <SEP> 10 <SEP> - <SEP> 30 <SEP> 0 <SEP> - <SEP> 3
<tb> Durée <SEP> de <SEP> culture <SEP> (h) <SEP> 96 <SEP> 96
<tb> Quantité <SEP> de <SEP> sucre <SEP> sortie <SEP> du
<tb> système <SEP> (g) <SEP> 10,5 <SEP> < <SEP> 0,2
<tb> Quantité <SEP> de <SEP> phénylalanine
<tb> produite <SEP> (g) <SEP> 13 <SEP> 15,5
<tb>
Exemple 3
Production de cellules de levure par culture discontinue
On a produit des cellules de levure par fermentation en utilisant Saccharomyces cerevisiae CBS 1523 de manière semblable à l'exemple 1, sauf qu'on a remplacé la culture continue à recyclage des cellules par la culture discontinue.

Le milieu, le récipient de culture, la méthode de culture et la méthode de régulation du débit d'alimentation de la solution d'alimentation ont également été modifiés de la manière suivante.

(a) Milieu de culture d'ensemencement
Glucose 3 g/dl KH2P04 0,1
Sulfate d'ammonium 0,5 9 4 0,05
Hydrolysat de protéine (en azote total) 0,1
Extrait de levure 0,1
pH 6,5
stérilisation 15 min à 1200C
(b) Milieu de culture principale
Glucose 5 g/dl KH2P04 0,1
Sulfate d'ammonium 1,0 9 4 0,05
Liqueur de trempage de mais 0,2
pH 6,5
o
stérilisation 15 min à 120 C
(c) Milieu d'alimentation
Le même que dans le milieu principal, sauf qu'on a uti
lisé 50 g/dl de glucose et 5 g/dl de sulfate d'ammonium.

(2) Récipient de culture et méthode de culture
(a) Culture d'ensemencement : après avoir chargé 30 ml de milieu de culture d'ensemencement dans un ballon de 500 ml, la culture a été mise en oeuvre à 300C pendant 24 h en agitant.

(b) Culture principale : après avoir chargé 30 ml de bouillon de culture d'ensemencement et 270 ml du milieu de culture principale dans un petit fermenteur en verre de 1 I, la culture aérobie a été mise en oeuvre à 300C pendant 10 h (débit d'air 150 ml/min). Le pH était ajusté à 6,5 par NH3. En outre, on a commencé à ajouter la solution d'alimentation (milieu) 10 h après
le démarrage de la culture principale.

(3) Méthode de régulation du débit d'alimentation de la solution d'alimentation
Le débit d'alimentation était régulé de manière semblable à l'exemple 1, sauf que le débit d'alimentation initial était fixé à 5 ml/h.

Exemple comparatif 3 (art antérieur)
Le débit d'alimentation de la solution d'alimentation était régulé en utilisant comme indice la vitesse de formation de
l'éthanol comme sous-produit (l'éthanol gazeux était mesuré dans le gaz résiduaire). Autrement dit, lorsque la vitesse de formation d'éthanol augmentait à plus de la valeur fixée, le débit d'alimentation était augmenté et lorsque la vitesse diminuait au-dessous de la valeur fixée, le débit d'alimentation était augmenté.

Les résultats de l'exemple 3 et de l'exemple comparatif 3 sont résumés dans le tableau 3.

Tableau 3

<tb> <SEP> Exemple <SEP> com
<tb> <SEP> Paramétre <SEP> de <SEP> comparaison <SEP> paratif <SEP> 3 <SEP> Exemple <SEP> 3
<tb> Concentration <SEP> régulable <SEP> de <SEP> sucre
<tb> dans <SEP> la <SEP> culture <SEP> d'alimentation <SEP> (g/l) <SEP> 5 <SEP> - <SEP> 20 <SEP> 0 <SEP> - <SEP> 3
<tb> Durée <SEP> de <SEP> culture <SEP> (h) <SEP> 50 <SEP> 50
<tb> Quantité <SEP> d'éthanol <SEP> formée <SEP> (g) <SEP> 5 <SEP> - <SEP> 10 <SEP> 0 <SEP> - <SEP> 5
<tb> Poids <SEP> sec <SEP> de <SEP> cellules <SEP> de <SEP> levure <SEP> (g) <SEP> 39 <SEP> 48
<tb>
Exemple 4
Production de L-thréonine par fermentation en culture discontinue
La L-thréonine a été produite par fermentation en utilisant Brevibacterium flavum FERM BP-1173 de manière semblable à l'exemple 1, sauf qu'on a remplacé la culture continue à recyclage de cellules par la culture discontinue.

Le milieu, le récipient de culture, la méthode de culture, la durée de culture et la méthode de régulation du débit d'alimentation de la solution d'alimentation étaient modifiés de manière suivante.

(1) Milieu
(a) Milieu de culture d'ensemencement
Glucose 2,0 g/dl KH2P04 0,1 MgSO4 40 mg/dl FeSO4 1 MnSO4 1
Urée 0,3 g/dl
Acétate d'ammonium 0,2 g/dl
Hydrolysat de protéine
(en azote total) 200
Biotine 100 ,ug/l
Vitamine B1 100
Silicone antimousse 20
pH 7,5
stériliation 20 min à 1200C
(b) Milieu de culture principale
Glucose 5 g/dl MgSO4 40 mg/dl MnSO4 1
Acide phosphorique 200
Biotine 50 ,ug/l
Vitamine B1 5 mg/l
Hydrolysat de protéine
(en azote total) 100 mg/dl
KOH 150
Silicone antimousse 2 pg/l
pH 7,5
stérilisation 20 min à 1200C
(c) Milieu d'alimentation
On a utilisé une solution de 50 g/dl d'acide acétique.

(2) Récipient de culture et méthode de culture :
(a) Culture principale : après avoir chargé 30 ml de milieu de culture d'ensemencement dans un ballon de 500 ml, on a mis en oeuvre la culture à 300C en agitant.

(b) Culture principale : après avoir chargé 30 ml de bouillon de culture d'ensemencement et 270 ml de milieu de culture principale dans un petit fermenteur en verre de 1 I, on a mis en oeuvre la culture aérobie à 300C (débit d'air 150 ml/min). Le pH était ajusté à 7,5 par NH3.

(3) Durée de culture :
(a) Culture d'ensemencement : 40 h
(b) Culture principale : 100 h
(c) Instant de démarrage de l'alimentation : 20 h après le démarrage de la culture principale.

(4) Méthode de régulation du débit d'alimentation de la solution d'alimentation
Le débit d'alimentation était régulé de manière semblable à l'exemple 1, sauf que le débit d'alimentation initial était fixé à 1,5 ml/h.

Exemple comparatif 4 (art antérieur)
Le débit d'alimentation de la solution d'alimentation était régulé en utilisant le pH comme indice. Autrement dit, lorsque le pH augmentait au-dessus de la valeur fixée, la solution d'alimentation était ajoutée à temps constant par le débit d'alimentation de 0,5 ml/min en utilisant un chronomètre marche/arrêt.

Les résultats de l'exemple 4 et de l'exemple comparatif 4 sont résumés dans le tableau 4.

Tableau 4

<tb> <SEP> Exemple <SEP> com
<tb> <SEP> Paramètre <SEP> de <SEP> comparaison <SEP> paratif <SEP> 4 <SEP> Exemple <SEP> 4
<tb> Concentration <SEP> régulable <SEP> de <SEP> sucre
<tb> dans <SEP> la <SEP> culture <SEP> d'alimentation <SEP> (g/l) <SEP> 10 <SEP> - <SEP> 30 <SEP> 0 <SEP> - <SEP> 3
<tb> Durée <SEP> de <SEP> culture <SEP> (h) <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> Quantité <SEP> d'acide <SEP> acétique <SEP> sortie <SEP> du
<tb> système <SEP> (g) <SEP> 5,2 <SEP> < <SEP> 0,2
<tb> Quantité <SEP> de <SEP> L-thréonine <SEP> produite <SEP> (g) <SEP> ~~ <SEP> <SEP> 7,8 <SEP> 8,8
<tb>
Exemple 5
Production de guanosine par fermentation en culture discontinue
La guanosine a été produite par fermentation en utilisant
Bacillus subtilis FERM BP-3601 de manière semblable à l'exemple 1, sauf qu'on a remplacé la culture continue à recyclage de cellules par la culture discontinue.

Le milieu, le récipient de culture, la méthode de culture, la durée de culture et la méthode de régulation du débit d'alimentation dans la solution d'alimentation étaient modifiés de la manière suivante (1) Milieu
(a) Milieu de culture d'ensemencement
Glucose 3,0 g/dl
Acide phosphorique 0,04 MgSO4 40,0 mg/dl FeSO4 1 MnSO4 1
ARN 0,5 g/dl
Chlorure d'ammonium 0,3 g/dl
Extrait de levure 50 mg/dl
KOH 70
Hydrolysat de protéine (en azote total) 200
Silicone antimousse 20
pH 6,5
stérilisation 20 min à 12O0C
(b) Milieu de culture principale
Glucose 20 g/dl MgSO4 15 mg/dl MnSO4 1
Acide phosphorique 90
Chlorure d'ammonium 0,5 g/dl
Chlorure de potassium 1,5 g/dl
Hydrolysat de protéine (en azote total) 150 mg/dl
ARN 0,125 g/dl
DL-méthionine 50 mg/dl
KOH 60
Silicone antimousse 2 pg/l
pH 0,5
stérilisation 20 min à 1200C
(c) Milieu d'alimentation
On a utilisé une solution aqueuse à 0,50 g/dl de glucose.

(2) Récipient de culture et méthode de culture
(a) Culture d'ensemencement : après avoir chargé 30 ml de milieu de culture d'ensemencement dans un ballon de 500 ml, on a mis en oeuvre la culture à 300C en agitant.

(b) Culture principale : après avoir chargé 30 ml de bouillon de culture d'ensemencement et 270 ml de milieu de culture principale dans un petit fermenteur en verre de 1 I, on a mis en oeuvre la culture aérobie à 30 0C (débit d'air 200 ml/min). Le pH était ajusté à 6,5 par NH3.

(3) Durée de culture :
(a) Culture d'ensemencement : 30 h
(b) Culture principale : 150 h
(c) Instant de démarrage de l'alimentation : 50 h après
le démarrage de la culture principale.

(4) Méthode de régulation du débit d'alimentation de la solution d'alimentation
Le débit d'alimentation était régulé de manière semblable à l'exemple 1, sauf que le débit d'alimentation initial était fixé à 1 ml/h.

Exemple comparatif 5 (art antérieur)
En utilisant NH3, on a ajusté le pH et régulé le débit d'alimentation de la solution d'alimentation en utilisant le pH comme indice. Autrement dit, lorsque le pH augmentait au-dessus de la valeur fixée, le débit d'alimentation était augmenté de 5 % et lorsque l'on n'observait pas d'augmentation de pH pendant 5 h, le débit d'alimentation était diminué de 10 %.

Les résultats de l'exemple 5 et de l'exemple comparatif 5 sont résumés dans le tableau 5.

Tableau 5

<tb> <SEP> Exemple <SEP> com
<tb> <SEP> Paramètre <SEP> de <SEP> comparaison <SEP> paratif <SEP> 5 <SEP> Exemple <SEP> 5
<tb> Concentration <SEP> régulable <SEP> de <SEP> sucre
<tb> dans <SEP> la <SEP> culture <SEP> d'alimentation <SEP> (g/l) <SEP> 10 <SEP> - <SEP> 30 <SEP> 0 <SEP> - <SEP> 3
<tb> Durée <SEP> de <SEP> culture <SEP> (h) <SEP> 150 <SEP> 150
<tb> Quantité <SEP> de <SEP> sucre <SEP> sortie <SEP> du
<tb> système <SEP> (g) <SEP> 15,0 <SEP> < <SEP> 0,2
<tb> Quantité <SEP> de <SEP> guanosine <SEP> produite <SEP> (g) <SEP> 10,4 <SEP> 13,0
<tb>
Exemple 6
Dans trois flacons agités de 500 ml chacun, on a chargé séparément chaque fois 20 ml d'un milieu contenant 30 g/l de glucose, 10 g/l de chlorure d'ammonium, 3 g/l d'urée, 1 g/l de KH2P04, 100 mg/l de MgS04,7H20, 10 mg/l de FeS04,7H20, 8 mg/l de MnS04,4H20, 1 g/l d'hydrolysat acide de protéine de soja (calculé en azote), 0,1 mg/l de chlorhydrate de thiamine et 0,3 mg/l de biotine. Après avoir stérilisé le milieu par chauffage à 1150C pendant 10 h, on a inoculé sur le milieu avec une boucle de platine
Brevibacterium lactofermentum ATCC 21800 qui avait préalablement poussé pendant 48 h sur gélose inclinée au bouillon puis on a cultivé en agitant à 35,5 C pendant 24 h. Les modes opératoires précédents étaient pour la culture d'ensemencement.

Dans trois petits fermenteurs de 1 I, on a chargé séparément chaque fois 300 ml de milieu (pH 7,0) contenant 80 g/l de mélasse (calculée en sucre), 50 g/l de sulfate d'ammonium, 1 g/l de KH2P04, 1 g/l de MgS04,7H20, 100 mg/l d'hydrolysat acide de protéine de soja (calculé en azote), 0,1 mg/l de chlorhydrate de thiamine et 0,3 mg/l de biotine. Le milieu a été stérilisé par chauffage à 1200C pendant 15 min. Après refroidissement à 31,50C, le milieu ci-dessus qui terminait l'incubation dans le ballon a été ajouté dans les fermenteurs en quantité de 15 ml dans chaque fermenteur.L'incubation a été effectuée dans les conditions suivantes : température 31,50C, vitesse spatiale horaire (VSH) de -1 l'air 1/2 min et vitesse d'agitation 700 tr/min.

Avec l'un des trois fermenteurs, l'incubation était terminée au moment où le sucre dans le milieu était totalement consommé (incubation discontinue classique) et la concentration de
L-lysine accumulée dans le milieu était déterminée quantitativement par colorimétrie par la ninhydrine de cuivre acide. Dans les deux autres fermenteurs, on a commencé à introduire le milieu d'alimentation au moment où la concentration de sucre dans le milieu était de 5 g/l ou moins. Dans l'un des fermenteurs, le milieu d'alimentation contenait 40 g/l de glucose seul (culture d'alimentation classique) et dans le fermenteur de la présente invention, le milieu d'alimentation contenait 40 g/l de glucose, 100 mg/l d'hydrolysat de protéine de soja (en azote), 0,1 mg/l de chlorhydrate de thiamine et 0,3 mg/l de biotine.Tout en régulant le débit d'alimentation du milieu d'alimentation de manière à maintenir la concentration de sucre dans le bouillon de culture à 5 g/l ou moins, l'incubation a été mise en oeuvre dans ces fermenteurs.

Après introduction de 100 ml du milieu d'alimentation dans chaque culture, l'incubation était terminée au moment où le sucre dans le bouillon de culture était totalement consommé. La concentration de
L-lysine accumulée dans le bouillon de culture était déterminée quantitativement.

Les résultats de l'incubation dans les trois fermenteurs sont représentés dans le tableau 6.

Tableau 6

<tb> <SEP> Productivité <SEP> de <SEP> Rendement
<tb> <SEP> Méthode <SEP> de <SEP> fermentation <SEP> L-lysine <SEP> en <SEP> L-lysine
<tb> <SEP> (g/l.h) <SEP> (X) <SEP>
<tb> <SEP> Culture <SEP> discontinue <SEP> (art <SEP> antérieur) <SEP> 2,2 <SEP> 32
<tb> <SEP> Culture <SEP> avec <SEP> alimentation <SEP> 2,3 <SEP> 0 <SEP> <SEP> 33
<tb> <SEP> art <SEP> antérieur)
<tb> Invention <SEP> 2,8 <SEP> 35
<tb>
On voit d'après le tableau 6 que la productivité et le rendement de L-lysine sont tous deux excellents.

Exemple 7
Dans deux flacons agités de 500 ml, on a chargé séparément chaque fois 20 ml d'un milieu contenant 30 g/l de glucose, 10 g/l de chlorure d'ammonium, 3 g/l d'urée, 1 g/l de KH2P04, 100 mg/l de MgS04,7H20, 10 mg/l de FeSO4,7H2O, 8 mg/l de MnSO4,4H2O, 100 mg/l d'hydrolysat acide de protéine de soja
(calculé en azote), 0,1 mg/l de chlorhydrate de thiamine et 0,3 mg/l de biotine. Après avoir stérilisé le milieu par chauffage à 1150C pendant 10 min, on a inoculé sur le milieu avec une boucle de platine Brevibacterium flavum ATCC 21475 qui avait poussé précédemment pendant 48 h sur gélose inclinée au bouillon puis on a cultivé en agitant à 31,50C pendant 24 h.Les modes opératoires précédents étaient pour la culture d'ensemencement.

Dans deux petits fermenteurs de 1 I chacun, on a chargé séparément chaque fois 300 ml d'un milieu (pH 7,0) contenant 50 g/l de sulfate d'ammonium, 1 g/l de KH2P04, 1 g/l de MgS04,7H2O, 100 mg/l d'hydrolysat acide de protéine de soja (calculé en azote), 0,1 mg/l de chlorhydrate de thiamine et 0,3 mg/l de biotine. Le mélange a été stérilisé par chauffage à 120 C pendant 15 min. Après refroidissement à 31,50C, le milieu mentionné ci-dessus qui terminait l'incubation dans le ballon a été ajouté aux fermenteurs en quantité de 15 ml dans chaque fermenteur.L'incubation a été effectuée dans les conditions suivantes : température 31,50C, VSH de l'air 1/2 min 1 et vitesse d'agitation 700 tr/min.

On a commencé à introduire le milieu d'alimentation au moment où la concentration de sucre dans le bouillon de culture était de 5 g/l ou moins. Le milieu d'alimentation contenait 40 g/l de glucose, 100 mg/l d'hydrolysat de protéine de soja (en azote), 0,1 mg/l de chlorhydrate de thiamine et 0,3 mg/l de biotine. Dans un fermenteur, l'incubation était continuée en régulant le débit d'alimentation du milieu d'alimentation de manière à maintenir la concentration de sucre dans le bouillon de culture constamment à une teneur de 5 g/l ou moins (présente invention). Dans l'autre fermenteur, l'incubation était continuée à un débit d'alimentation tel que la concentration de sucre était dans la gamme de 5 à 15 g/l (comparaison).Après avoir introduit dans chaque culture 100 ml du milieu d'alimentation, l'incubation était terminée au moment où le sucre dans le bouillon de culture était totalement consommé. La concentration de L-lysine accumulée dans le bouillon de culture était déterminée quantitativement.

Les résultats de l'incubation dans les deux fermenteurs sont indiqués dans le tableau 7.

Tableau 7

<tb> <SEP> Productivité <SEP> Rendement
<tb> Régulation <SEP> de <SEP> la <SEP> teneur <SEP> en <SEP> sucre <SEP> (g/l) <SEP> de <SEP> L-lysine <SEP> en <SEP> L-lysine
<tb> <SEP> (g/l.h) <SEP> (%)
<tb> Moins <SEP> de <SEP> 5 <SEP> (présente <SEP> invention) <SEP> 2,9 <SEP> 1 <SEP> 34
<tb> 5-15 <SEP> (comparaison) <SEP> 2,5 <SEP> 32
<tb>
Exemple 8
Dans trois flacons agités de 500 ml chacun, on a chargé séparément chaque fois 20 ml d'un milieu contenant 30 g/l de glucose, 10 g/l de chlorure d'ammonium, 3 g/l d'urée, 1 g/l de KH2P04, 100 mg/l de MgS04,7H20, 10 mg/l de FeS04,7H20, 8 mg/l de MnSO4,4H2O, 1 g/l d'hydrolysat acide de protéine de soja (calculé en azote), 0,1 mg/l de chlorhydrate de thiamine et 0,3 mg/l de biotine. Après avoir stérilisé le milieu par chauffage à 1150C pendant 10 min, on a inoculé sur le milieu au moyen d'une boucle de platine Brevibacterium flavum ATCC 21475, qui avait préalablement poussé pendant 48 h sur gélose inclinée au bouillon puis on a cultivé en agitant à 31,5 C pendant 24 h. Les modes opératoires précédents étaient pour la culture.

Dans trois petits fermenteurs de 1 I, on a chargé séparément chaque fois 300 ml d'un milieu (pH 7,0) contenant 80 g/l de mélasse (calculé en sucre), 50 g/l de sulfate d'ammonium, 1 g/l de KH2P04, 1 g/l de MgS04,7H20, 100 mg/l d'hydrolysat acide de protéine de soja (calculé en azote), 0,1 mg/l de chlorhydrate de thiamine et 0,3 mg/l de biotine. On a stérilisé le milieu par chauffage à 1200C pendant 15 min. Après refroidissement à 31,50C,
le milieu de culture d'ensemencement ci-dessus qui terminait
l'incubation dans le ballon a été ajouté aux fermenteurs en quantité de 15 ml dans chaque fermenteur.L'incubation a été effectuée dans les conditions suivantes : température 31,50C, VSH de l'air 1/2 min 1, vitesse d'agitation 700 tr/min.

On a commencé à introduire le milieu d'alimentation au moment où la concentration de sucre dans le bouillon de culture était de 5 g/l ou moins. Le milieu d'alimentation de la présente invention contenait 40 g/l de glucose, 100 mg/l d'hydrolysat de protéine de soja (en azote), 0,1 mg/l de chlorhydrate de thiamine et 0,3 mg/l de biotine. On a mis en oeuvre l'incubation tout en régulant le débit d'alimentation du milieu d'alimentation de manière à maintenir la concentration de sucre dans le milieu toujours à une teneur de 5 g/l ou moins. Après avoir introduit dans la culture 100 ml du milieu d'alimentation, on a retiré des fermenteurs 100 ml du milieu au moment ou le sucre dans le bouillon de culture était totalement consommé.

On a continué l'incubation en introduisant encore le milieu d'alimentation. Dans ce cas également, la concentration de sucre dans le bouillon de culture était fixée pour maintenir une teneur de 5 g/l ou moins. Après avoir introduit 100 ml du milieu d'alimentation, on a terminé l'incubation au moment où le sucre dans le bouillon de culture était totalement consommé. Le milieu dans le fermenteur et le milieu préalablement soutiré ont été combinés et la concentration de L-lysine accumulée dedans a été déterminée quantitativement.

Les résultats révèlent que la productivité de la lysine était de 3,8 g/l.h et le rendement en lysine était de 42 %.

Exemple 9
Dans deux flacons agités de 500 ml chacun, on a chargé séparément chaque fois 20 ml d'un milieu contenant 30 g/l de glucose, 10 g/l de chlorure d'ammonium, 3 g/l d'urée, 1 g/l de KH2P04, 100 mg/l de MgS04,7H2O, 10 mg/l de FeS04,7H20, 8 mg/l de MnSO4,4H2O, 1 g/l d'hydrolysat acide de protéine de soja (calculé en azote), 0,1 mg/l de chlorhydrate de thiamine et 0,3 mg/l de biotine.Après avoir stérilisé le milieu par chauffage à 1150C pendant 10 min, on a inoculé sur le milieu au moyen d'une boucle de platine Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 21491, qui avait poussé précédemment pendant 48 h sur une gélose inclinée au bouillon, puis on a cultivé en agitant à 31,5 C pendant 24 h. Les modes opératoires précédents étaient pour la culture d'ensemencement.

Dans deux petits fermenteurs de 1 I, on a chargé séparément chaque fois 300 ml d'un milieu (pH 7,0) contenant 80 g/l de mélasse (calculé en sucre), 50 g/l de sulfate d'ammonium, 1 g/l de KH2P04, 1 g/l de MgS04,7H20, 100 mg/l d'hydrolysat acide de protéine de soja (calculé en azote), 0,1 mg/l de chlorhydrate de thiamine et 0,3 mg/l de biotine. Le milieu a été stérilisé par chauffage à 1200C pendant 15 min. Après refroidissement à 31,50C, le milieu de culture d'ensemencement ci-dessus qui terminait l'incubation dans le ballon a été ajouté aux fermenteurs en quantité de 15 ml dans chaque fermenteur.L'incubation a été effectuée dans les conditions suivantes : température 31,50C, VSH -1 de l'air 1/2 min , vitesse d'agitation 700 tr/min.

Dans l'un des fermenteurs, on a commencé à introduire le milieu d'alimentation au moment où la concentration de sucre dans le bouillon de culture atteignait 5 g/l ou moins. Le milieu d'alimentation contenait 40 g/l de glucose, 100 mg/l d'hydrolysat de protéine de soja (calculé en azote), 0,1 mg/l de chlorhydrate de thiamine et 0,3 mg/l de biotine (présente invention). L'incubation a été continuée tout en régulant le débit d'alimentation du milieu d'alimentation de manière à maintenir la concentration de sucre dans le bouillon de culture toujours à la teneur de 5 g/l ou moins.

Après avoir introduit 100 ml du milieu d'alimentation, on a soutiré du fermenteur 100 ml du bouillon au moment où le sucre dans le bouillon était totalement consomme.

L'incubation a été continuée tout en introduisant encore le milieu d'alimentation. Dans ce cas également, la concentration de sucre dans le milieu était fixée pour maintenir la teneur à 5 g/l ou moins. Après avoir introduit 100 ml du milieu d'alimentation, on a terminé l'incubation au moment où le sucre dans le bouillon de culture était totalement consommé. On a combiné le bouillon de culture dans le fermenteur et le bouillon précédemment soutiré et on a déterminé quantitativement la concentration de L-lysine accumulée dedans.

Les résultats révèlent que la productivité de lysine était de 3,9 g/l.h et le rendement en lysine était de 41 %.

Dans l'autre fermenteur, on a commencé à introduire le milieu d'alimentation pour la culture continue 25 h après le démarrage de l'incubation. On a utilisé comme milieu d'alimentation un milieu obtenu en diluant quatre fois le milieu initial. On a fait couler environ 1 I du milieu d'alimentation à un grossissement de dilution de 0,05 h 1 pour effectuer la culture continue. Après avoir atteint l'état constant, on a déterminé quantitativement la concentration de L-lysine dans le milieu.

Les résultats révèlent que la productivité de lysine étaient de 3,5 g/l.h et le rendement en lysine était de 35 %.

Selon la présente invention comme indiqué dans les exemples 6 à 9, la L-lysine peut être produite par fermentation avec une productivité élevée comme dans le procédé continu classique, tout en maintenant la concentration élevée du produit accumulé et le rendement élevé obtenu par fermentation dans le procédé discontinu classique. Donc, la productivité peut être fortement améliorée et les coûts peuvent être réduits dans la production industrielle de L-lysine en utilisant la présente invention.

Toutes les publications mentionnées ci-dessus sont incorporées ici par référence.

Bien que l'on ait décrit l'invention avec certains détails pour la clarté et la compréhension, le spécialiste admettra à la lecture de cette description qu'il peut y apporter diverses modifications de formes et de détails sans s'écarter toutefois du cadre et de l'esprit de l'invention.

Claims (8)

1. REVENDICATIONS

   faible par régulation automatique.

   dans ledit récipient de culture à une teneur constante

   (iii) ladite concentration de substrat étant maintenue

   période sans addition est courte ; et

   le débit devienne plus grand lorsque la durée de la

   la durée de la période sans addition est longue et que

   telle manière que le débit devienne plus petit lorsque

   période d'addition précédant la période sans addition de

   d'alimentation de la solution d'alimentation dans la

   durée de la période sans addition et du débit

   calculé en utilisant ledit ordinateur à partir de la

   culture pendant une durée définie et avec un débit

   ajoutant la solution d'alimentation dans le récipient de

   ladite seconde addition ou les additions suivantes en

   période où une addition est effectuée, et on effectue

   épuisé, durant une période sans addition précédant une

   lorsque la substrat dans le récipient de culture est

   augmentation de concentration d'oxygène dissous produite

   ordinateur détecte une augmentation du pH ou une

   suivantes de ladite solution d'alimentation lorsqu'un

   (ii) on initialise la seconde addition ou les additions

   (i) on effectue une première addition d'une solution d'alimentation de substrat par addition intermittente de ladite solution d'alimentation par intermittence dans le récipient de culture pendant une durée définie à un débit d'alimentation déterminé précédemment

   l. Procédé pour la culture aérobie d'un micro-organisme dans une culture discontinue, une culture continue ou une culture continue avec recyclage des cellules, comprenant les étapes suivantes
2. 2. Procédé selon la revendication l, caractérisé en ce que ledit substrat est une source de carbone.
3. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite source de carbone est un sucre.
4. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 et 3, caractérisé en ce que le micro-organisme est capable de produire de la L-lysine en milieu liquide.
5. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ladite source de carbone est maintenue à une concentration qui n'est pas supérieure à 5g/l dans le milieu de culture.
6. 6. Un appareil pour réguler la concentration d'une source de carbone de substrat dans les cultures aérobies discontinues, continues ou continues avec recyclage des cellules, comprenant

   (i) un récipient de culture muni d'un capteur pour

   détecter le pH et d'un capteur pour détecter la concen

   tration d'oxygène dissous d'un milieu de culture dans le

   récipient de culture, respectivement, et des moyens

   pour l'aération et l'agitation du milieu de culture, qui

   est destiné à recevoir une solution d'alimentation, et

   (ii) des moyens de régulation pour réguler un débit

   d'alimentation de la solution d'alimentation dans le

   récipient de culture, les moyens de régulation comprenant

   un premier convertisseur de signaux pour recevoir les

   signaux respectifs produits par le capteur de pH et le

   capteur de concentration d'oxygène dissous et produire

   des signaux convertis ; des moyens de calcul pour

   recevoir les signaux convertis, calculer le débit d'uti

   lisation en utilisant les signaux convertis et produire

   un signal de débit d'alimentation ; un second convertis

   seur de signaux pour recevoir le signal de débit d'ali

   mentation et produire un signal de débit d'alimentation

   converti ; et des moyens de régulation du débit d'alimen

   tation pour réguler le débit d'alimentation de la

   solution d'alimentation dans le récipient de culture en

   utilisant le signal de débit d'alimentation converti.
7. 7. L'appareil selon la revendication 6, caractérisé en ce que ledit premier convertisseur de signaux comprend un convertisseur analogique/numérique et ledit second convertisseur de signaux comprend un convertisseur numérique/analogique.
8. 8. L'appareil selon l'une quelconque des revendications 6 et 7, caractérisé en ce que lesdits moyens de régulation du débit d'alimentation comprennent un régulateur de débit d'alimentation et une pompe d'alimentation.