FI67725B - Foerfarande foer framstaellning av enheter avsedda foer bestaemning av antibiotika- och sulfarester i biologiska vaetskor och framstaellda enheter - Google Patents

Description

ΓβΊ λιλ ULUTUSJULICAISU ,rj r70r lBJ UTLÄGGN I NGSSMUFT o//2 5

(51) K^/hta C 12 Q. 1/00, G 01 N 33/W

SUONI—FIN LAND pi) ρκ««»^-Ν«»βι«ι«ι 791736 m 30.05.79 ' ' (23) AHnipaM—GIWgM*4ag 30.05.79 (41) TaMut («riUMkxi — Uhrit offamMf 06.12.79

Ptetewtti- ja rekisterihallitus ............ .._....._ 1 (44) NlKrtHlr^pnoo J« lumLJuftrlliMW pwr*.—

Petant· och registerstyrelsan AmMm utlaed och «itljirifton pobttcorad 31 .01 .85 (32)(33)(31) Pn^««r «wen»»-e^«r* piiortMt O5.O6.78

Alankomaat-Nederländerna(NL) 7806086 (71) Gist-Brocades N.V., Wateringseweg 1, P.O. Box 1, 2600 MA Delft, Alankomaat-Nederländerna(NL) (72) Robert Beukers, Nootdorp, Jan Lambert Van Os, Voorburg, Alankomaat-Nederländerna(NL) (7¾) Berggren Oy Ab (5¾) Menetelmä biologisiin nesteisiin sisältyvien antibiootti- ja sulfajäännösten määrittämiseksi tarkoitettujen yksiköiden valmistamiseksi ja valmistetut yksiköt - Förfarande för framställ-ning av enheter avsedda för bestämning av antibiotika- och sulfarester i biologiska vätskor och framställda enheter Tämä keksintö koskee menetelmää yksikön valmistamiseksi, jolla määritetään antibiootti- ja sulfajäännöksiä biologisissa nesteissä, kuten maidossa, lihan mehussa, seerumissa ja virtsassa. Keksinnön kohteena ovat myös menetelmän mukaisesti valmistetut yksiköt.

Gudding, Acta Vet. Scand. 17 (1976), sivut 458-464 on kuvannut samanlaista menetelmää, jossa käytetään agarväliainele-vyjä tavalla, jonka ovat esittäneet Galesloot et ai.,

Netherlands Milk and Dairy Journal 16 (1962) sivut 89-95, jossa kuitenkin agarväliaine on sovitettu tekemään mahdolliseksi sulfojen määritykset lisäämällä trimetopriimiä (Merck Index 9th Ed. No. 9377). Sulfat ovat yleisesti ottaen yhdisteitä, joissa on substituoitu tai substituoimaton SC^NI^-ryhmä substituoidun tai substituoimattoman aniliinirenkaan para-asemassa, kuten sulfametoksatsoli /4-amino-N-(5-metyyli- 3-isoksatsolyyli)bentseenisulfonamidi?· Tässä menetelmässä käytetään hyväksi mm. termofiilistä mikro-organismia Bacillus stearothermophilus var. calidolactis, jota inkuboidaan mieluummin n. 60°C:ssa, jotta vältettäisiin testattavassa 2 67725 näytteessä olevista mikro-organismeista johtuvat häiriöt.

Sen lisäksi, että jokaista määritystä varten on valmistettava uudet levyt, kokeen tulos voidaan lukea aikaisintaan 6 tunnin kuluttua sen aloittamisesta.

Käytännössä tarvitaan kuitenkin nopeampi koe, jossa käytetään käyttövalmiita välineitä ja joka antaa tuloksen muutamassa tunnissa. Lisäksi käytännössä tarvitaan koetta joka ei välttämättä vaadi koulutettua laboratoriohenkilökuntaa ja jonka voi suorittaa esimerkiksi autonkuljettaja, joka ajaa maidon maatilalta meijeriin.

Brittiläisessä patentissa 1 467 439 kuvataan koetta, joka todella lähtee käyttövalmiista välineistä. Tämä koe antaa tuloksen 1^-4 tunnissa, yleensä 2-3 tunnissa ja sen voi suorittaa kouluttamaton henkilökunta, mutta koe sopii vain biologisissa nesteissä kuten maidossa, lihan mehussa, seerumissa ja virtsassa olevien antibioottien määritykseen ja osoittaa liian pientä herkkyyttä sulfien määritykseen.

Tämän keksinnön mukaisesti brittiläisessä patentissa 1 467 439 kuvattua koetta voidaan sovittaa sulfien määritykseen ja samalla 2-3 tunnin kokeen kestoajalla.

Näin ollen keksinnön mukaan on saatu aikaan menetelmä biologisiin nesteisiin sisältyvien antibiootti- ja sulfajäännös-ten määrittämiseksi tarkoitettujen yksiköiden valmistamiseksi, jotka yksiköt käsittävät agarväliaineen, joka on ympätty Bacillus stearothermophilus var. calidolactis'in itiöillä ja joka sisältää trimetopriimiä, joka menetelmä on tunnettu siitä, että Bacillus stearothermophilus var. calidolactis'in (LMD 74.1) itiöitä ja trimetopriimiä /2,4-diamino-5-(3,4,5-trimetoksibentsyyli)-1,3-pyrimidiiniä7 lisätään mahdollisesti puskuroituun modifioimattomaan agar- 5 8 liuokseen määrien ollessa 10-10 itiötä agarliuoksen ml:aa 3 67725 kohti ja 10-120yug trimetopriimiä agarliuoksen litraa kohti, että liuokseen lisätään mahdollisesti ravinteita ja mikro-organismien kasvun havaitsemiseksi sopivaa indikaattoria, ja agarliuoksen annetaan jähmettyä putkiin, jolloin menetelmä suoritetaan sellaisissa olosuhteissa, että itiöt pysyvät elävinä, mutteivät voi itää ravinteiden puuttumisen ja/tai alhaisen lämpötilan vuoksi.

Keksinnön mukaisesti valmistetut koeputket mahdollistavat tuloksen saamisen 1J-4 tunnissa, yleensä 2-3 tunnissa sisäl-sipä tai ei biologisen nesteen näyte antibioottia tai sulfaa ylimäärin ennalta määrättyyn pitoisuuteen verrattuna. Yllättäen on havaittu, että koe onnistuu myös ilman väliaineen modifiointia Guddingin selostamalla tavalla niin, että esimerkiksi brittiläisessä patentissa n:o 1 467 439 kuvattua väliainetta voidaan käyttää sellaisenaan. Yllättäen on myös havaittu, että tuloksen lukemiseen tarvittava aika ei välttämättä pitene. Niinpä valitsemalla sopiva trimetopriimi-väkevyys ja lukemalla hapon muodostuminen tai väheneminen esimerkiksi brittiläisen patentin n:o 1 467 439 pystysuoran diffuusiokoemenetelmän mukaisesti tämän menetelmän mukainen koeaika voidaan ylläpitää. Todetaan, että Gudding käytti 0,25^ug/ml:n trimetopriimi-väkevyyttä, kun taas keksinnön mukaisesti trimetopriimi-väkevyys voi olla pienempi, kuten jäljempämä mainitaan.

Osoittautui, että trimetopriimi ei lainkaan tai oleellisesti vaikuta itiöiden säilyvyyteen. Lisäksi tällainen yksikkö voi pysyä käyttökelpoisena yli vuoden ajan.

Esimerkkejä tämän keksinnön tarkoituksiin käyttökelpoisista putkista ovat läpinäkyvät putket, yksin tai sarjassa tai yhdistettynä läpikuultavasta materiaalista tehtyyn lohkoon, joka on varustettu lukuisilla porauksilla. Koeputkisarjän sopiva rakenne on kuvattu brittiläisessä patentissa n:o 1 467 439.

4 67725

Mikro-organismin kasvulle välttämättömät ravinteet sisällytetään mieluimmin tablettiin tai suodatinpaperikiekkoon tai muuhun vastaavaan. Tabletti tai suodatinpaperikiekko asetetaan agarväliaineelle ennen testin suorittamista. Esimerkiksi tabletin muodossa olevat ravinteet voidaan myös sisällyttää koeputkeen etukäteen, jolloin on huolehdittava siitä, ettei kosteutta voi siirtyä agarväliaineesta tablettiin. Tämä voidaan tehdä esimerkiksi päällystämällä tabletti kosteutta hylkivällä kerroksella, esimerkiksi vahalla, jonka kerroksen tulee poistua kokeen aikana. Vaha, jonka sulamislämpötila on 35-55°C ja mieluimmin 40-45°C, on sopiva tähän tarkoitukseen. Ravinteiden on sisällettävä vähintään yhtä assimiloituvaa hiililähdettä, esimerkiksi glukoosia, yhtä assimiloituvaa typpilähdettä, esimerkiksi peptonia, ja kasvutekijän ja mineraalien lähdettä, esimerkiksi hiivauutetta. Jos ravinteet sisältyvät agarväliaineeseen, yksikköä on säilytettävä lämpötiloissa, jotka ovat alempia kuin missä itiöt itävät (2-10°C).

Käytetty indikaattori on pH-arvolle n. 5,5 tarkoitettu happoemäsindikaattori, mieluimmin brcndkresolipurppura tai fenolipunainen, tai hapetus-pelkistys-indikaattori, mieluimmin 2,3,5-trifenyylitetratsoliuirikloridi tai Brilliant- musta. Jos mikro-organismin kasvulle välttämättömät ravinteet valmistetaan erikseen, indikaattori voidaan lisätä joko agarliudkseen tai ravinteisiin.

Kanta Bacillus stearothermophilus var. calidolactis, jonka itiöitä käytetään keksinnön mukaisessa menetelmässä , on talletettu Delft'in Teknillisen Yliopiston Mikrobiologian laboratorioon numerolla LMD 74.1 , josta kanta on yleisön saatavissa. Tämä mikro-organismi on erittäin herkkä penisilliinille. Se kasvaa nopeasti ja sillä on se lisäetu, että sen op-timikasvulämpötila on niin korkea, että muut mikro-organismit eivät yleensä kasva, mistä on seurauksena vain pieni häiritsevien mikro-organismien muutos. Mikro-organismilla on edelleen suuri herkkyys muille antibiooteille.

Itiöitä sisältävän agarväliaineen valmistusta kuvataan tarkemmin brittiläisessä patentissa n:o 1 467 439.

5 67725

Biologisissa nesteissä, kuten maidossa, lihan mehussa, seerumissa ja virtsassa olevien antibiootteja ja sulfajäännöksiä määritettäessä keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetuilla yksiköillä ennalta määrätty määrä testattavaa näytettä asetetaan yksikköön ja jätetään siihen tai poistetaan riittävän pitkän ajan, esimerkiksi 15-30 minuutin kuluttua, joka tarvitaan antibiootti- ja sulfajäännösten diffundoitu-miseen, minkä jälkeen tarvittaessa ravinteet asetetaan agar-väliaineelle ja koeputken sisältöä inkuboidaan mikro-organismien optimilämpötilassa tai lähellä sitä ennalta määrätty ajanjakso, minkä jälkeen todetaan indikaattorin väri, mikä osoittaa antibiootin ja/tai sulfan läsnäoloa tai muuttumista tietyn minimiväkevyyden yläpuolella. Testi on hyvin yksinkertainen suorittaa, niin että koulutettua henkilökuntaa ei tarvita kokeeseen. Määritys voidaan tehdä 1^-4 tunnissa, mieluummin 2-3 tunnissa kokeen aloittamisesta, mikä on merkittävästi lyhyempi aika kuin Gudding'in kuvaama menetelmä vaatii.

6

Esimerkki 1 67725

Koeputkien valmistus.

Bacillus stearothermophilus var. calidolactis L.M.D. 74.1 ympättiin väliaineeseen, joka sisälsi:

Bacto ravintoagaria, Difco koodi 0001 15 g

Bacto agaria, Difco koodi 0140 5 g dekstroosia 0,5 g

MnS04*H20 30 mg tislattua vettä määrään 1000 ml ja joka oli steriloitu 20 min. 120°C:ssa.

Ymppäyksen jälkeen väliaine inkuboitiin 60°C:ssa ainakin 48 tuntia, kunnes voitiin havaita hyvä itiöiden muodostus. Itiöt otettiin talteen, pestiin tislatulla vedellä ja säilytettiin 4°C:ssa. Elinvoimaisten itiöiden määrä todettiin koestamalla väliaineessa, joka sisälsi:

Bacto agaria, Difco 0140 20 g

Bacto tryptonia, Difco koodi 0123 8,5 g

Phytone peptonia, BBL koodi 11905 1,5 g dekstroosia 5 g tislattua vettä määrään 1000 ml ja joka oli steriloitu 20 min. 120°C.

Ymppäyksen jälkeen väliaine inkuboitiin 48 tuntia 60°C:ssa, minkä jälkeen pesäkkeet laskettiin. Tislattua vettä lisättiin itiösus-pensioon tai vettä poistettiin siitä, kunnes suspensio sisälsi g noin 10 elävää itiötä/ml.

g 10 ml edellä mainittua itiösuspensiota, joka sisälsi 10 itiötä/ml, lisättiin seuraavaan liuokseen:

Bacto agar, Difco koodi 0140 9 g natrium kloridi 9 g trimetopriimi 40 ^ug trietanoliamiinipuskuri pH 9 100 ml tislattu vesi määrään 1000 ml joka oli steriloitu 20 min. 120°C:ssa.

Trietanoliamiinipuskuri valmistettiin liuottamalla 0,5 g trieta-noliamiini.HC1 90 ml:an tislattua vettä, säätämällä pH arvoon 9 lisäämällä 4-N NaOH (noin 0,5 ml tarvitaan) ja lisäämällä tis- 7 67725 lattua vettä niin, että lopulliseksi tilavuudeksi tuli 100 ml.

Väliaine nesteytettiin lämmittämällä ja jäähdytettiin sitten 60°C:seen. Steriileihin koeputkiin, joiden halkaisija oli noin 9 mm, pantiin jokaiseen 0,5 ml täten saatua väliainetta ja koeputkien sisällön annettiin jähmettyä putkien ollessa pystyasennossa. Putket varastoitiin 4°C:n lämpötilassa.

Ravinnekiekkojen valmistaminen Valmistettiin seuraavat väliaineet: (a) bromikresolipurppuraa (0,1 g) liuotettiin 9,2 mitan 0,02-N NaOH ja laimennettiin tislatulla vedellä 25 ml:n tilavuuteen.

(b) dekstroosia 50 g tislattua vettä 50 ml (c) Bacto tryptonia, Difco koodi 0123 34 g

Phytone peptonia, BBL koodi 11905 6 9 tislattua vettä. 100 ml

Liuokset (a) ja (b) steriloitiin syöttämällä Seitz-suodattimen läpi ja väliaine (c) steriloitiin 110°C:ssa 30 min., ja väliaine (c) pysyi suspensiona. Viisi osaa liuosta (a), kaksi osaa liuosta (b) ja kolme osaa suspensiota (c) sekoitettiin, ja 0,04 ml näin saatua liuosta saatettiin kosketukseen suodatinpaperikiekkojen kanssa, joiden läpimitta oli noin 8 mm, ja sitten kiekot kuivattiin .

Esimerkki 2

Kokeen suoritus maitonäytteiden kanssa.

Sulfadiatsiinia lisättiin tuoreeseen lehmänmaitoon niin, että saatiin 1,5, 1,0, 0,75, 0,5, 0,35, 0,2 ja 0,1 ^ug/ml, ja ilman sulfadiatsiinia olevaa maitonäytettä käytettiin vertailuna. Kahdeksan esimerkin 1 mukaisesti valmistettua koeputkea varustettiin kukin ravinnekiekolla ja 0,1 ml kutakin näytettä lisättiin koeputkiin. Koeputket sijoitettiin vesihauteeseen, jonka lämpötila oli 65°C, ja havaintoja tehtiin 2 1/2, 2 3/4, 3 ja 3 1/2 tunnin kuluttua. Tulokset olivat seuraavat. Vertailunäytteen agar muuttui keltaiseksi 2 1/2 tunnin kuluttua. Näytteissä, jotka sisälsivät 0,5 ^ug/ml sulfadiatsiinia tai enemmän, agar muuttui violetiksi, myös viimeisen havainnon ajankohtana.

Claims (4)

1. 8 67725 Näyte, joka sisälsi 0,35yUg, muuttui keltaiseksi 3$ tunnin kuluttua, 0,2^ug sisältävä näyte 3 tunnin kuluttua ja 0,1^ug sisältävä näyte 2 3/4 tunnin kuluttua.
2. 1. Menetelmä biologisiin nesteisiin sisältyvien antibiootti- ja sulfajäännösten määrittämiseksi tarkoitettujen yksiköiden valmistamiseksi, jotka yksiköt käsittävät agarväliaineen, joka on ympätty Bacillus stearothermophilus var. calidolactis'in itiöillä ja joka sisältää trimetopriimiä, tunnettu siitä, että Bacillus stearothermophilus var. calidolactis'in (LMD 74.1) itiöitä ja trimetopriimiä /2,4-diamino-5-(3,4,5-tri- metoksibentsyyli)-1,3-pyrimidiiniä/ lisätään mahdollisesti puskuroituun modifioimattomaan agarliuokseen määrien ollessa 5 8 10—10 itiötä agarliuoksen ml kohti ja 10-120 ^ug trimetopriimiä agarliuoksen litraa kohti, että liuokseen lisätään mahdollisesti ravinteita ja mikro-organismien kasvun havaitsemiseksi sopivaa indikaattoria, ja agarliuoksen annetaan jähmettyä putkiin, jolloin menetelmä suoritetaan sellaisissa olosuhteissa, että itiöt pysyvät elävinä, mutteivät voi itää ravinteiden puuttumisen ja/tai alhaisen lämpötilan vuoksi.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä ilman ravinteiden lisäämistä valmistetut yksiköt yhdistelmänä ravinteiden kanssa, jotka on sisällytetty tablettiin tai suodatinpa-perikiekkoon, joka on tarkoitettu sijoitettavaksi agarväliaineen päälle ennen määrityksen suoritusta.
4. 1. Förfarande för framställning av enheter avsedda för bestämning av antibiotika- och sulfarester i biologiska vätskor, vilka enheter omfattar ett agarmedium ympat med sporer av Bacillus stearothermophilus var. calidolactis och innehällande trimetoprim, känne tecknat av att sporer av