Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

FI121366B - Uusia siiliperäisiä polypeptidejä - Google Patents

Uusia siiliperäisiä polypeptidejä Download PDF

Info

Publication number
FI121366B
FI121366B FI972312A FI972312A FI121366B FI 121366 B FI121366 B FI 121366B FI 972312 A FI972312 A FI 972312A FI 972312 A FI972312 A FI 972312A FI 121366 B FI121366 B FI 121366B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
seq
amino acids
polypeptide
protein
expression
Prior art date
Application number
FI972312A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI972312A0 (fi
FI972312A (fi
Inventor
Philip A Beachy
Randall T Moon
Jeffrey A Porter
Original Assignee
Univ Washington
Univ Johns Hopkins Med
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Washington, Univ Johns Hopkins Med filed Critical Univ Washington
Publication of FI972312A0 publication Critical patent/FI972312A0/fi
Publication of FI972312A publication Critical patent/FI972312A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI121366B publication Critical patent/FI121366B/fi

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5058—Neurological cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/60—New or modified breeds of invertebrates
    • A01K67/61—Genetically modified invertebrates, e.g. transgenic or polyploid
    • A01K67/65—Genetically modified arthropods
    • A01K67/68—Genetically modified insects
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
    • C07K14/43577—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects from flies
    • C07K14/43581—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects from flies from Drosophila
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
    • G01N33/5017—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity for testing neoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/40—Fish
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/50—Amphibians, e.g. Xenopus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/70—Invertebrates
    • A01K2227/706—Insects, e.g. Drosophila melanogaster, medfly
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/23—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a GST-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)

Description

Uusia siiliperäisiä polypeptidejä
Keksinnön tausta 1. Keksinnön ala 5 Tämä keksintö koskee yleisesti proteiinien proses sointi- ja signalointireittejä, ja spesifisesti kahta uutta proteiinia, joilla on erilaiset aktiivisuudet ja jotka on saatu yhteisestä siiliproteiiniprekursorista.
2. Läheisen tekniikan kuvaus 10 Alkionkehitystieteilijät ovat jo pitkään suoritta neet kokeellisia manipulaatioita, jotka paljastavat sel-kärankaisalkioiden tiettyjen rakenteiden silmäänpistävät kyvyt tuottaa kuvio ympäröiviin kudoksiin. Pohdinta näiden kuviointivaikutusten perustana olevista mekanismeista kes-15 kittyy tavallisesti signalointimolekyylin eritykseen, joka synnyttää tarkoituksenmukaisen vasteen kuvioitavissa kudoksissa. Tuoreempi, tällaisten signalointimolekyylien tunnistukseen kohdistuva työ osoittaa pienen joukon gee-niryhmiä yksittäisten jäsenten koodittamia eritettyjä pro-20 teiineja. Yksi tällainen proteiiniryhmä, jolla voi olla merkityksekäs vaikutus kuviointiaktiivisuuksiin, ovat ne • · proteiinit, joita koodittaa siiligeeniryhmä.
·:*·; Siili (hh) -geeni identifioitiin alunperin sen vaa- timuksen normaalista segmentaalisesta kuvioinnista perus- • · : 25 teella Drosoohilassa [Niisslein-Volhard, C. , ja Wieschaus, • · · E., Nature 287 (1980) 795 - 801] . Sen funktioihin kuuluu • · · *... paikallinen signalointi viereisten solujen identiteettien • · · * koordinoimiseksi varhaisalkiosegmenteissä (Hooper, J.E., ja Scott, M.P., "Early Embryonic Development of Animals", • · *···’ 30 1992, s. 1 - 48) ja myöhempi funktio orvaskeden kuvioin- *·*’* nissa, joka kattaa monta soluhalkaisijaa [Heernskerk, J. , ja DiNardo, S., Cell 76 (1994) 449 - 460]. hh-geeni toimii • · .···. myös täysikasvuisten rakenteiden imaginaalisten prekurso- • · ·* rien kuvioinnissa, mukaan lukien sivuelimet ja silmä [Moh- : 35 ler, J., Genetics 120 (1988) 1061 - 1072; Ma et ajL·., Cell • · 2 75 (1993) 927 - 938; Heberlein et aL, Cell 75 (1993) 913 - 92 6; Tabata, T., ja Kornberg, T.D., Cell 76 (1992) 89 - 102; Easier, K. , ja Struhl, G. , Nature 368 (1994) 208 - 214] . Geneettiset ja molekulaariset todisteet osoit-5 tavat, että siiliproteiinit erittyvät ja toimivat solunul-koisessa signaloinnissa [Mohler, J. , supra; Lee et. ai. . Cell 71 (1992) 33 - 50; Taylor et ai. . Mech. Dev. 42 (1993) 89 - 96].
Selkärankaisissa on osoitettu hh-homologien koodit-10 tamia aktiivisuuksia raajan etu/takakuvioinnissa [Riddle et ai.. Cell 75 (1993) 1401 - 1416; Chang et ai.. Development 120 (1994) 339] ja alkion hermostoputken selän/vat- sanpuoleisessa kuvioinnissa [Echelard et ai. . Cell 75 (1993) 1417 - 1430; Krauss et ai. . Cell 75 (1993) 1431 - 15 1444; Roelink et al^., Cell 76 (1994) 761 - 775] .
Selkärankaisen vatsanpuoleiset keskiaivot sisältävät hermosoluja, joiden rappeutuminen tai epänormaali funktio liittyvät lukuisiin sairauksiin, mukaan lukien Parkinsonin tauti ja skitsofrenia. Tiedetään, että liike-20 hermosolut kehittyvät lähellä pohjalevyä vatsanpuoleisissa keskiaivoissa. Keskiaivojen ulokkeet aivojuovioon liitty-vät tahdonalaisen liikkeen kontrolliin (Björklund ja Lind-*:1·· väli kirjassa "Handbook of Chemical Neuroanatomy", toim.
Borklund et ai., Elsevier, Amsterdam, 1984, ss. 55 - 122) • · —........ .' ' ' ' • · : 2 5 ja näiden hermosolujen menetys johtaa Parkinsonin taudin • · · ;·4 1 mukanaan tuomiin liikehäiriöihin [Hirsch et ai. , Nature • · · 334 (1988) 345] . Keskiaivojen dopamiiniliitteiset hermo- • · · • solut, jotka hermottavat limbisiä rakenteita ja aivokuoren, vaikuttavat vastaavasti emotionaaliseen ja kognitii- 0 0 *.··' 30 viseen käytökseen ja näiden hermosolujen epänormaali funk- ***** tio on yhdistetty skitsofreniaan ja lääke/huumeriippuvuu- .1.1. teen [Seeman et ai.. Nature 365 (1993) 441].
• · .···. Vaikka hermosolukohtalon spesifioivien tekijöiden • · ·1 molekulaarista luonnetta ei ole selvitetty, transformoiva • · · 1 • · · *·1 ' 35 kasvuteki jä-β -ryhmän [Lyons et ai. , Trends in Genetics 7.
· 3 (1991) 408] tai siiliproteiiniryhmän [Smith, J.C., Cell 76 (1994) 193] jäsenillä voi olla tällaisilta tekijöiltä odotettuja ominaispiirteitä niiden osallistuessa solukohtalon spesifiointiin, välittäessä kudosten välisiä induktiivisia 5 vuorovaikutuksia ja monissa tapauksissa vaikuttaessa vain muutaman soluhalkaisijan matkan päässä.
Esillä oleva keksintö on selvittänyt, että näiden geenien koodittamat hh-aktiivisuudet esittävät keskeistä osaa kehittyvän silmän varhaisessa kuvioinnissa ja aivojen 10 kuvioinnissa. Ensimmäistä kertaa keksintö osoittaa, että siiliproteiinituotteen sisäinen pilkkominen on kriittistä täydelle toiminnalle, ja että tämän autoproteolyyttisen pilkkomisen kaksi uutta tuotetta osoittavat erilaisia aktiivisuuksia osoittaen siten, että hh-signalointiaktiivi-15 suus on kahden erillisen, yhteisestä hh-proteiiniprekurso-rista saadun signalointiproteiinin komposiittivaikutus. Näin tehdessään keksintö antaa käyttöön keinon haluttujen hermosolutyyppien spesifiseen kuviointiin ja lisääntymiseen häiriöiden hoitamiseksi, jotka ovat syntyneet hermo-20 solujen rappeutumisesta tai epänormaalista funktiosta.
Keksinnön yhteenveto
Esillä oleva keksintö perustuu siihen perustavaa ·;··· laatua olevaan havaintoon, että siiliproteiineille tapah- tuu autoproteolyyttinen pilkkominen, joka johtaa kahteen • · .·, : 25 erilliseen proteiiniin, joilla on erilaiset funktionaali- • · · set ja rakenteelliset ominaisuudet. Nämä kaksi polypepti- • · · *... diä, joita kutsutaan siilin "N"- ja "C"-fragmenteiksi tai • φ · * vastaavasti N-pää- ja C-pääfragmenteiksi, muodostuvat spesifisen pilkkomisen jälkeen autoproteolyyttisen domeenin • · *...* 30 natiivissa proteiinissa tunnistamassa G'CF-kohdassa.
Täten yhtenä suoritusmuotona keksintö antaa käyt-töön oleellisesti puhtaan polypeptidin, jolle on tunnus- • · .···. omaista, että sen aminohapposekvenssi on saatu siilipro- • · ]·* teiinin aminopään aminohapoista ja että sen karboksipäässä *.* * 35 on G' CF-pilkkomiskohta, jonka spesifisesti tunnistaa na- • · 4 tiivin siilipolypeptidin karboksipääfragmentin proteolyyt-tinen aktiivisuus.
Toisena suoritusmuotona keksintö antaa käyttöön oleellisesti puhtaan polypeptidin, jolle on tunnusomaista, 5 että sen aminohapposekvenssi on saatu siiliproteiinin kar-boksipään aminohapoista ja että sen aminopäässä on G'CF-pilkkomiskohta, jonka spesifisesti tunnistaa natiivin siilipolypeptidin karboksipääfragmentin proteolyyttinen aktiivisuus .
10 Keksintö antaa myös käyttöön menetelmän hermosolu jen lisääntymisen tai differentiaation moduloimiseksi, jonka menetelmän mukaan solut saatetaan kosketuksiin siilipolypeptidin kanssa. Natiivi siilipolypeptidi, N- tai C-fragmentti tai näistä saadut funktionaaliset fragmentit 15 ovat mitä käyttökelpoisimpia oleellisesti pohjalevyn hermosoluista saatujen hermosolujen lisääntymisen tai differentiaation indusoimiseksi.
Piirustusten lyhyt kuvaus
Kuviossa 1 esitetään hh-proteiinin prosessointi 20 blot-immuunisiirroilla (A, C) amino- (Abi) ja karboksipää
(Ab2) -epitooppien vastaisilla vasta-aineilla. Kuviot IB
ja D ovat blot-siirtoja näytteistä, jotka on immuunisaos- ·;··· tettu Abi: llä (B, vyöhykkeet 7-9), Ab2:lla (D, vyöhyk- keet 19 - 21) tai esi-immuuniseerumilla (B, vyöhykkeet .·. : 25 10-12, ja D, vyöhykkeet 22 - 24) .
• · · * Kuvioissa IE ja 1F esitetään kaaviollinen esitys • ·· siilipilkkomismekanismista.
• · · *** * Kuviossa 2 esitetään hh-proteiinien ja seriinipro- teaasien välinen sekvenssisamankaltaisuus. hh-proteiini- • · · • · 3 0 sekvenssit asettuvat D-melanogasterproteiinin tähteiden ’·**· 323 - 32 9 rinnalle, jotka on numeroitu asemiksi 1-7 (ryhmä A) . Nisäkkään seriiniproteinaasien katalyyttiset • ♦ .··♦. histidiinit (ryhmä B) on asetettu vaihtumattoman histidii- • · *·’ nin asemassa 7 hh-proteiineissa rinnalle.
··· • · · • · · • · 5
Kuviossa 3 esitetään hh-proteiinin autoproteolyysi. Kuviossa 3A esitetään Coomassie-sinisellä värjätty polyak-ryyliamidigeeli, joka esittää His6-U- ja His6-UH329A-proteii-nien Ek. colista tuotantoa ja puhdistusta. Näytteet olivat 5 molekyylipainomerkit (vyöhykkeet 1 ja 2) ; lysaatteja E. coli -soluista, jotka käsittävät His6-U-ilmentämisraken-teen indusoimatta (vyöhyke 3) ja indusoiden (vyöhyke 4) IPTG:llä; puhdistettu His6-U-proteiini (vyöhyke 5); lysaatteja Eh_ coli -soluista, jotka käsittävät His6-UH329A-ilmentä-10 misrakenteen indusoimatta (vyöhyke 6) ja indusoiden (vyöhyke 7) IPTG:llä; puhdistettu His6-UH329A-proteiini (vyöhyke 8). Kuvio 3(B) on Ab2:lla todettu immuuniblot-siirtokopio, joka esittää hh:n ilmentämään indusoituja transfektoituja S2-soluja (vyöhyke 1) ; His6-U- ja His6-UH329A-proteiineja, 15 joita on inkuboitu pilkkomisreaktiopuskurissa 0 tunnin ajan (vyöhykkeet 2 ja 5), 20 tunnin ajan (vyöhykkeet 3 ja 6) ja 20 tunnin ajan pitoisuuden 20 mM TAME (seriinipro-teaasi-inhibiittori) läsnä ollessa (vyöhykkeet 4 ja 7).
Kuviossa 4 esitetään Drosophila- (4A-C) ja seepra-20 kala (D) -hh-proteiinien autoproteolyyttisten funktioiden kartta karboksipääfragmenteista, jotka on saatu villityy- • · ϊ/·· pin ja mutantti-hh-proteiinien in vitro -translaatioilla.
*:·*: Mutaatioiden ja pilkkomiskohtien (nuolet) sijaintipaikat ·’·*: näissä proteiineissa esitetään kaaviollisesti kuviossa 4E.
• · : 25 Kuviossa 5 esitetään immuuniblot-siirtokopiot, • · · • · ;·. joissa esitetään villityypin ja H329A-mutantti-hh-proteii- • · · nien lämpösokki-indusoitu ilmentyminen Drosophila-alkiois- • · · • sa. (A) ja (B) ovat vasta-ainetta Abi ja vastaavasti Ab2 käyttäen kehitettyjä immuuniblot-siirtokopioita. Vyöhyk- • · '···* 30 keet 1 ja 6, indusoituja ei-transfektoituja S2-soluja; • * vyöhykkeet 2 ja 7, transfektoituja S2-soluja, jotka on j*.*. indusoitu ilmentämään hh; vyöhykkeet 3 ja 8, lämpösokilla • · .···. käsiteltyjä villityypin alkioita; vyöhykkeet 4 ja 9, läm- pösokilla käsiteltyjä hshh-alkioita; vyöhykkeet 5 ja 10, ' 35 lämpösokilla käsiteltyjä hshh-H329A-alkioita.
• ♦ 6
Kuviossa 6 esitetään in situ -hybridisaatio, jossa esitetään kaikkialla läsnä olevasti ilmennettyjen villi-tyypin ja H329A-hh-proteiinien alkiolliset vaikutukset. Kuviossa 6 esitetään siivettömän (wg) RNA:n alkiollinen 5 jakauma osoitettuna in situ -hybridisaatiolla esitettynä (A) villityypin (homotsygoottinen y1 w1118) , (B) hshh- ja (C) hshh-H329A-alkioissa, jotka altistettiin kahdelle 10 minuutin lämpösokille, joita erotti 90 minuutin toipumisjakso (33) . Villityypin alkiot osoittivat vain vähän muutosta 10 wg-ilmentymisessä, kun taas villityyppiproteiini ja vähäisemmässä määrin H329A-proteiini kumpikin indusoivat ek-tooppisen wg-ilmentymisen (taulukko 1) . Paneeleissa (D) , (E) ja (F) esitetään y1 w1118-, hshh- ja vastaavasti hshh-H329A-toukkien selänpuoleiset pinnat 4. vatsasegmentin ta-15 solia. Näille toukille tuotettiin 30 minuutin sokki alkioina ja niiden annettiin saattaa loppuun alkiokehitys. Orvaskesisolutyyppejä (1°, 2°, 3° ja 4°) leimataan, kuten on kuvattu [J. Heemskerk ja S. DiNardo, Cell 76 (1994) 449] . Huomattakoon 2°-solutyypin (paljas orvaskesi) lisääntyminen 20 3°- ja joidenkin 4°-tyyppien kustannuksella hshh-alkiossa (E) olosuhteissa, joissa hshh-H329A-alkioiden fenotyyppi • · i.’·· (F) on identtinen verrokkialkioihin (D) nähden.
*:*·: Kuviossa 7 esitetään X-gal-värjäys kaikkialla läsnä ·*·’: olevien villityypin ja H329-hh-proteiinien imaginaalisten • t 25 levyvaikutusten osoittamiseksi . X-gal-värjäystä käytettiin • · ;·. wg:n (A-C) tai dpp:n (D-L) ilmentymisen seuraamiseksi myö- • ·· [... häisen 3. vaiheen toukkien imaginaalilevyissä, jotka ka- • · · * sittävät wg-lacZ- tai dpp-IacZ-reportterigeenejä. Esitetään jalan (A-F), siiven (G-I) ja silmäantennilevyt (J-L) • · *···* 30 verrokki toukista (A, D, G, J) , toukista, jotka käsittävät * * hshh-siirtogeenin (B, E, H, K), ja toukista, jotka käsit- j*.*; tävät hshh-H329A-siirtogeenin (C, F, I, L) . Kaikissa pa- * · .*··. neeleissa etupuoli on vasemmalla.
• · ···
Kuviot 8(A) ja (B) ovat immuuniblot-siirtokopioita • · · *·* * 35 solupelleteistä (vyöhyke 1) tai supernatanteista (vyöhyke • · 7 2) HH-proteiinien ilmentävistä transfektoiduista S2-soluviljelmistä kehitettyinä Abl:llä (A) ja Ab2:lla (B). Näytteet kussakin vyöhykkeessä olivat samasta tilavudesta uu-delleensuspendoitua täysviljelmää. Kun N pysyi valtaosin 5 assosioituneena solupellettiin (vertaa vyöhykkeitä 1 ja 2 A:ssa), C vapautui lähes kvantitatiivisesti supernatant-tiin (vertaa vyöhykkeitä 1 ja 2 B:ssä). U osoitti N:n ja C:n välissä olevia jakautumisominaisuuksia (A ja B). (C):ssä esitetään in vitro -translaatioilla mikrosomeilla 10 muodostettujen eri HH-proteiinilaj ien hepariinisitoutumis-aktiivisuus (38). Näytteet olivat: kokonaistranslaatioseos (vyöhyke 1); supernatantti inkuboinnin jälkeen hepariini-agaroosi- tai agaroosi (verrokki) -helmillä (vyöhykkeet 2 ja 4); ja materiaali, joka eluoitiin hepariiniagaroosi-15 tai agaroosihelmistä pesun jälkeen (vyöhykkeet 3 ja 5).
F-, U-, Nss- ja N-fragmentit loppuvat reaktioista, joita inkuboidaan hepariiniagaroosi- mutta ei agaroosihelmillä (vertaa vyööhykkeitä 2 ja 4 l:een), ja samat lajit voidaan sitten eluoida hepariiniagaroosi- mutta ei agaroosihelmis-20 tä (vertaa vyöhykkeitä 3 ja 5 vyöhykkeeseen 1).
Kuviossa 9 esitetään N:n ja C:n differentiaaliset sijainnit alkioissa hh-transkriptin in situ -paikannuksel-·;··· la. Kuvio 9(A) esitetään vertailuna N- ja C-epitooppien jakaumaan todettuina Abl:llä ja Ab2:lla vastaavasti panee- • · : 25 leissa (B) ja (C) . Huomattakoon, että N- ja C-epitooppien • · · ’ jakauma kattaa vastaavasti noin 1/3 ja 1/2 kustakin seg- • · · *... mentaalisesta yksiköstä, kun taas transkripti rajoittuu • · · * ’ noin 1/4 kustakin yksiköstä. (D):ssä C-epitooppien sijain ti hh13E-alleelin suhteen homotsygoottisissä alkioissa tode- • · · • · *··.1 30 taan käyttämällä Ab2:ta. C-epitoopit tässä mutantissa, *·**· jotka osoittaa heikentynyttä autoproteolyyttistä aktiivi- suutta (katso teksti) , ovat rajoittuneempia, ja muistutta- • · .···. vat N:n villityyppisi j aintia . Homotsygoottiset hh13E-alkiot • · ** identifoitiin merkityn tasapainottajan menetyksestä hete- • ·· • · · *.1 1 35 rotsygoottisesta kantavarastosta. Kaikki alkiot ovat kes- · 8 keisestä myöhäiseen vaiheeseen 9 (laajentunut pieneliönau-ha) .
Kuviossa 10 esitetään signaalivälitys- ja duaali-funktiomallit hh-proteiinivaikutukselle. Kuviossa 10(A) 5 hh-signaloinnin pitkän tähtäimen vaikutukset saavutetaan epäsuorasti toisen signalointimolekyylin (X)' lyhyen tähtäimen indusoinnilla. Perustuen sen biokemiallisiin ominaisuuksiin ja sen rajattuun kudossijaintiin N:n oletetaan edustavan aktiivista lyhyen aikavälin signaalia, kun taas 10 C:n osuus rajoittuisi sen katalyyttisen koneiston tuottamiseen, joka tarvitaan N:n biogeneesiin. (B):ssä hh:n pitkän ja lyhyen aikavälin signalointifunktiot saadaan N- ja C-proteiineista, jotka ovat peräisin U-prekursorin sisäisestä autoproteolyysistä. N liittyy lyhyen aikavälin sig-15 nalointiin pitäytyessään lähellä sen solusynteesikohtaa, kun taas C on vähemmän rajattu jakaumassaan ja oletettavasti suorittaisi pitkän aikavälin signalointifunktioita. Kummassakin mallissa autoproteolyysi on edellytys täysin aktiivisten signalointiproteiinien muodostamiseksi.
20 Kuvioissa 10C ja D esitetään immuuniblot-siirtoko- pio N-fragmentista, joka on syntetisoitu villityyppiraken- • · :/·· teestä (C) tai rakenteesta, josta puuttuu C-domeeni (D) .
·:*·; Kuvioissa 11A ja B esitetään nukleotidi- ja päätel- ·*·’. ty aminohapposekvenssi osaihmis-hh-klooneille.
• · : 25 Kuvioissa 12A ia B esitetään E. colissa tuotetun ia • ·· J ~~" - • · ;·. homogeeniseksi puhdistetun Drosophila-hh-proteiinin in • · · ]... vitro -pilkkomisreaktiot. Kuviossa 12 paneelissa A esite- • · · * tään pilkkominen ajan funktiona käynnistyksen DTTrtä lisäämällä jälkeen. Paneelissa B esitetään inkuboinnit pi- • · *···* 30 toisuuksille, jotka vaihtelevat kolmen suuruusluokan * * alueella, tietyn aikajakson ajan (neljä tuntia), jolloin •V. ei ole mitään eroa konversion asteessa pilkottuun muotoon * · .···. verrattuna. Paneelissa C esitetään pilkkomiskohtaa ympä- ··· #·# röivä sekvenssi määritettynä pilkotun fragmentin C amino- • · · *·’ ’ 35 pääsekvenssistä. Pilkkomiskohta on merkitty nuolella, ja • · 9 C-fragmentin Edman-pilkkomisella sekventoidut tosiasialliset tähteet on alleviivattu. Paneelissa C esitetään myös kaikkien julkistettujen selkärankais-hh-sekvenssien sekä joidenkin ei-julkistettujen sekvenssien kalasta ja Xeno-5 pus-organismista rinnanasettelu. Esitetyt sekvenssit vas taavat Drosophila-hh:n sitä aluetta, jolla pilkkominen tapahtuu, jolloin tulee osoitetuksi Gly-Cys-Phe-sekvenssin absoluuttinen säilyminen pilkkomiskohdassa. Paneelissa D esitetään SDS-PAGE-geeli, johon on panostettu in vitro 10 transkriptio/translaatioreaktioita, kuten on kuvattu edellisissä esimerkeissä, jolloin templaatteina on käytetty eri hh-geenejä. dhh on Drosophila. twhh ja zfshh ovat "twiggy-winkle"- ja "sonic"-hh-geenit seeprakalasta, ja mshh on shh/Hgh-l/vhh-1-geeni hiirestä. Paneelissa E esi-15 tetään, että C-fragmenttien Edman-pilkkomisessa vapautuu 35s-tuikkeita ensimmäisellä mutta ei seuraavilla kierroksilla kaikille näille proteiineille, mikä osoittaa, että autoproteolyyttisen pilkkomisen kohta kaikille näille hh-proteiineille on amidisidos sen Cys-tähteen aminopääpuo-20 lella, joka muodostaa paneelissa C esitetyn säilyvän Gly-Cys-Phe-sekvenssin keskuksen.
• · ί.1·· Kuviossa 13 esitetään ennustetut aminohapposek- ·:**: venssit yksikirjainkoodilla. 13(A) :ssa esitetään viidelle ·1·1; erilliselle hh:n kaltaiselle geenille yhteiset sekvenssit, • · 25 jolloin piste osoittaa identtisyyden seeprakalan "twiggy- • · winkle"-proteiinin vastaavaan tähteeseen nähden. 13(B) :ssä • · · j···. esitetään twhh- ja shh-aminohapposekvenssejä rinnanasetet- • · · tuina soniclvhh-1-luokan sekvensseihin kananpojasta ja ... hiirestä. Kaikille neljälle hh-geenille yhteinen amino- • 1 *···] 3 0 pään hydrofobinen jakso on varjostettu. Tähti (1) osoittaa * 1 muuttumattomia aminohappotähteitä, jotka liittyvät C-frag- mentin proteolyyttiseen domeeniin eri lajeista. 13(C) :ssä • · .**·. esitetään identtisyysprosentti tähteille, jotka sijaitse- .·. vat hydrofobisesta alueesta karboksipäähän päin.
• · ♦ • · · • · 10
Kuviossa 14 esitetään twhh:n, shh:n ja pax-2:n vertaileva ilmentyminen seeprakalan alkiokehityksen aikana.
Kuviossa 15 esitetään ektooppisen hh:n vaikutukset seeprakalan kehitykseen. Villityypin seeprakalaa (Danio 5 rerio, Ekkwill Waterlife Resources) pidettiin 28,5 °C:ssa, minkä jälkeen joitakin alkioita viljeltiin yön yli huoneenlämpötilassa. Seeprakala-alkioihin ruiskutettiin 1-8 solun vaiheessa twhh:ta, shh:ta tai lacZRNA:ta ja niitä tarkasteltiin kehityksen 28. päivänä. (A - C) Selänpuolei-10 nen kuva keskiaivo-taka-aivoalueesta; etupuoli on vasemmalla. (A) IacZ. (B) twhh. (C) shh. (D - F) Etupuolen optinen leikkaus etuaivoalueesta; etupuoli on ylhäällä. (D) IacZ. (H) twhh. (F) shh. (G - L) Sivukuva silmän alueesta; etupuoli on vasemmalla. (G) IacZ. (H) twhh. (I) twhh.
15 Kuviossa 16 on taulukko, jossa esitetään shh:n, twhh:n ja twhh-mutanttien ektooppisen ilmentymisen vaikutukset seeprakalan alkiokehitykseen.
Kuviossa 17 esitetään seeprakalan "twiggy-winkle"-siilijohdannaisia. 17(A) Kuvia eri avoimista twhh-luku-20 alueista. SS (varjostettu) on ennustettu N-pääsignaalisek-venssi näiden proteiinien eritykselle ja se käsittää en- • * ϊ#*·ϊ simmäiset 2 7 aminohappoa kustakin avoimesta lukualueesta.
·;··; Nuoli osoittaa autoproteolyyttisen pilkkomisen ennustetun
·*·'; sisäisen kohdan. Aminohappotähteet on numeroitu kuvion 13B
• · : 25 mukaan. Umpinainen kolmio osoittaa normaalia päätöskodonia • · ··. avoimelle twhh-lukualueelle. Rakenne UHA sisältää mutaa- • ·· tion, joka salpaa autoproteolyysin (histidiini tähteenä • · · 273 muuttuu alaniiniksi; katso Lee, J.J., et ai.. supra) . Rakenne U356HA sisältää stop-kodonin aminohappotähteen 357 « ♦ *···* 30 tilalla sekä H273A-mutaation UHA:ssa. Rakenne N koodit taa * * vain twhh:n ensimmäisiä 200 aminohappoa. Rakenteesta C on tähteiden 31 - 197 kodonit deletoitu. 17(B) : ssä esitetään • · .**·. ilmentämisrakenteiden in vitro -translaatio, jotka esitet- ··· tiin kaaviollisesti osassa a. Rakenteiden translaatio suo- • · · • · · • · 11 ritettiin in vitro 35S-metioniinin läsnä ollessa ja analysoitiin autoradiografisesti SDS-PAGE:n jälkeen.
Kuviossa 18 esitetään siilin vaikutuksen eri her-momerkkien ilmentymiseen Northern-blot-analyysi.
5 Kuviossa 19 esitetään hh-synergia luonnollisesti esiintyvillä hermomerkeillä tai -aineilla (esim. XAG-1, XANF-2, Otx-A, En-2, Krox-20, Xlh box-6, NCAM ja EF-lo;) .
Kuviossa 20 esitetään siili-N:n tai -C:n vaikutuksen eri hermomerkkeihin Northern-blot-analyysi.
10 Kuviossa 21 esitetään miten Δ-Ν-C häiritsee X-bhh- ja N-aktiivisuutta eläinsiirteissä RT-PCR-analyysillä osoitettuna.
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus
Esillä oleva keksintö antaa käyttöön kaksi uutta 15 polypeptidiä, jotka ovat peräisin yhdestä yksittäisestä prekursoriproteiinista ja joilla kummallakin on erilaiset rakenteelliset ja funktionaaliset ominaispiirteet. Proteiinit saadaan siiliproteiinista, ja ne voidaan luonnollisesti tuottaa täysimittaisen siiliproteiinin autoproteo-20 lyyttisellä pilkkomisella. Tässä annettujen todisteiden perusteella, jotka osoittavat, että siiliprekursoripro- • · !.*·· teiini ja siiliprekursoriproteiinin autoproteolyytt iset *:*·: tuotteet ilmentyvät alkion hermostoputken ja selkä jänteen ·’·’· vatsanpuoleisen keskiviivan pohjalevyssä, keksintö antaa • · : 25 nyt käyttöön menetelmän pohjalevyyn ja selkä jänteeseen • · ;·. liittyvien tai lähellä niitä sijaitsevien hermosolujen * · · j...# lisääntymisen tai dif f erentiaation indusoimiseksi .
• · ·
Ensimmäisessä suoritusmuodossa keksintö antaa käyttöön oleellisesti puhtaan polypeptidin, jolle on tunnus- • · *···* 30 omainen aminohapposekvenssi, joka on saatu siiliproteiinin * * aminopääaminohapoista ja jonka karboksipäässä on glysiini- ;V. kysteiini-fenyylialaniini (G'CF) -pilkkomiskohta, jonka • · .·*·. spesifisesti tunnistaa natiivin siilipolypeptidin karbok- ··· sipääfragmentin proteolyyttinen aktiivisuus. Tätä frag- • · · *·* * 35 menttia kutsutaan tässä N-pääfragmentiksi tai -polypepti- • · 12 diksi tai "N":ksi. Esimerkiksi, kun kyseessä on Drosophi-la-siili, N-fragmentti käsittää aminohapot 1 - 257 siili-proteiinista, jolloin aminohappojen 85 - 257 molekyylipai-no on noin 19 kD ei-pelkistävässä SDS-PAGE:ssa (aminohap-5 potähdenumerot 1 - 257 sisältävät ei-rakenteellisia piirteitä, kuten signaalisekvenssejä). G'CF-pilkkomiskohta Drosophila-siiliprekursoriproteiinissa on aminohappotähteiden 257 - 259 kohdalla. Alan ammattilaiset kykenevät tunnistamaan G*CF-pilkkomiskohdan muissa siiligeeneissä, 10 koska aminohapposijainti on samankaltainen tai vastaavan C-fragmentin autoproteolyyttinen aktiivisuus tunnistaa spesifisesti kohdan.
N-pääpolypeptidille on myös tunnusomaista, että se on soluliitteinen polypeptidin in vitro ilmentävissä so-15 luissa, ja että sen sijainti on spesifinen esimerkiksi selkärankais- tai Drosophila-soluissa tai -alkioissa. Toisin sanoen tämä siilin N-pääfragmentti pysyy lähellä solu-synteesikohtaa. N:n liittyminen soluun on seurausta pro-sessointitapahtumasta, johon sisältyy aminopäädomeenin li-20 pofiilinen modifiointi (katso kuvio IE). Tämän modifikaation käynnistää karboksipäädomeenin vaikutus, jolloin muo- • · *.*·· dostuu tioesterivälituote; karboksipäädomeeni ei tällöin *:**: toimi ainoastaan proteaasina, vaikkakin peptidisidoksen ·*·*: pilkkominen lopulta johtuu sen vaikutuksesta. Lisäksi • · .‘.J 25 N-fragmentti sitoutuu hepariiniagaroosiin in vitro.
• · ;·. Keksinnön mukaiselle N-polypeptidille on tunnus- • ·* omainen aminohapposekvenssi, joka on saatu siiliproteiinin • · ·
aminopääaminohapoista, esim. 1 - 257 Drosophilassa. jol-loin aminohappojen 1 - 257 molekyylipaino on noin 19 kD
• · *···[ 30 ei-pelkistävässä SDS-PAGE: ssa. N-polypeptidiin sisältyy * * pienempiä fragmentteja, joilla on tallella täysimittaisen :*;*· N: n funktionaaliset ominaispiirteet, esim. sitoutuminen • · .**·. hepariiniin. Siiliproteiineja, joista N saadaan, ovat mai- • · · nittuihin kuitenkaan rajoittumatta Drosophila, Xenopus, • · · *·' | 35 kananpoika, seeprakala, hiiri ja ihminen. Kristallografi- • · 13 nen analyysi osoittaa, että rakenteeseen SHH_N sisältyy sinkki-ionin läsnäolo. Haluamatta sitoutua mihinkään nimenomaiseen teoriaan sinkki-ionin läsnäolo viittaa sinkki-hydrolaasiaktiivisuuteen. Sinkkihydrolaaseja ovat proteaa-5 sit, kuten karboksipeptidaasi-A ja termolysiini, lipaasit, kuten fosfolipaasi-C, ja muut entsyymit, kuten hiilihappo-anhydraasi. Muutokset aminopääsignalointidomeenin sinkki -hydrolaasikohdassa saattavat olla käyttökelpoisia siili-proteiinin dif fuusioalueen moduloimiseksi tai aminopääsig-10 nalointidomeenin signalointiominaisuuksien muuttamiseksi.
Esimerkiksi mutaatio sinkkihydrolaasikohdassa voi johtaa liekään kytkettyyn proteiiniin, kun tavanomaisesti proteiini erittyy matkan päässä. Tuloksena olisi solutyypin indusointi, joka ei tyypillisesti indusoidu. Muutos sink-15 kikohdassa voi johtaa molekyyliin, joka kykenee indusoimaan liikehermosoluja eikä pohjalevyä ja päin vastoin.
N:n solupinta- tai solunulkoinen matriisi -sijainnin ja sen ilmentymisen selkäjänne- ja pohjalevyliittei-sissä soluissa identifiointi antaa käyttöön keinon N:n 20 ilmentävien solujen eristämiseksi tai spesifiseksi vali koimiseksi, esim. selkäjännenäytteen eristämiseksi tai : pohjalevysolujen eristämiseksi. Lisäksi N:n vastaiset vas- ·;··· ta-aineet ovat käyttökelpoisia kudosten histologiseen ana- • V. lyysiin, joiden epäillään ilmentävän N-proteiinin.
• · .·. : 25 Keksintö antaa myös käyttöön oleellisesti puhtaan • · · • · ;·. polypeptidin, jolle on tunnusomainen aminohapposekvenssi, • · · *... joka on peräisin siiliproteiinin karboksipääaminohapoista • · · * ja jonka aminopäässä on G'CF-pilkkomiskohta, jonka tunnistaa spesifisesti natiivin siilipolypeptidin karboksipää- • · *···* 30 fragmentin proteolyyttinen aktiivisuus. Tätä fragmenttia ·*’* kutsutaan tässä C-pääfragmentiksi tai -polypeptidiksi tai jV. "C":ksi. Esimerkiksi Drosophilassa tämä "C"-polypeptidi on • · peräisin siiliprekursoriproteiinin C-päädomeenista, joka • · · alkaa aminohappotähteestä 258, kun täysimittaisen C-päädo- • · # '·* ’ 35 meenin molekyylipaino on noin 25 kD ei-pelkistävässä SDS- • · 14 PAGE:ssa, sillä on histidiinitähde asemassa 72 ja proteaa-siaktiivisuutta. Natiivin siilipolypeptidin karboksipää-fragmentin proteolyyttisen fragmentin spesifisesti tunnistama G'CF-pilkkomiskohta sijaitsee aminohappotähteiden 5 257 - 259 kohdalla. Kuten edellä kuvattiin N-fragmentille, nyt esillä oleva keksintö on osoittanut täsmällisen pilk-komistunnistuskohdan siilin autoproteolyyttiselle domee-nille, alan ammattilaiset voivat helposti erottaa pilkko-miskohdan muissa siiliproteiineissa, jolloin on mahdollis-10 ta helposti identifioida minkä tahansa siiliprekursoripro-teiinin mikä tahansa N- tai C-polypeptidi.
Keksinnön mukainen "C"-polypeptidi saadaan siili-prekursoriproteiinin C-päästä alkaen autoproteolyyttisestä pilkkomiskohdasta identifioituna GCF-aminohapposekvenssi-15 nä, joka Drosophilassa vastaa aminohappoja 257 - 259. Dro-soohilassa histidiinitähde, joka tavataan muuttumattomasti natiivin siiliproteiinin aminohappotähteen 329 kohdalla, ja C-polypeptidin aminohappotähteen 72 kohdalla, on oleellinen autoproteolyyttiselle pilkkomiselle aminohappojen 20 257 ja 258 välistä (G ja C). Keksinnön mukaiset vastaavat C-polypeptidit sisältävät samoin samankaltaisesti sijait- • · *.*·· sevan histidiinitähteen, joka voidaan helposti tunnistaa, *:*·: kuten vertaamalla Drosophila-c-polvpeptidiin. Eri lajien ·*·*: puitteissa proteolyyttistä domeenia voidaan karakterisoida • · .’.J 25 aminohapposekvenssillä -XTXXHLXX-.
• · ;·. Keksinnön mukainen C-polypeptidi, vastoin kuin N, • · · ei merkittävästi sitoudu hepariiniagaroosiin. C:lle on • · · tunnusomaista vapautuminen solujen viljelmäsupernatant-tiin, jotka ilmentävät C-polypeptidin in vitro, ja diffuu- « · *···* 30 si sijainti soluissa ja alkioissa. Koska C-polypeptidi * * diffundoituu vapaasti, se voitaisiin todeta kohteen eri ruumiinnesteistä ja kudoksista. C-polypeptidi-ilmentymisen • · .**·. lähellä alkion hermostoputken keskiviivaa tässä kuvatun • · · mukaisesti antaa käyttöön käyttökelpoisen määrityksen esi- • · · *·* ' 35 merkiksi hermostoputken sulkeutumisesta alkiossa/sikiössä.
• · 15 C-polypeptidin läsnäolo vesikalvonesteessä olisi diagnostinen häiriölle, jossa hermostoputki voi olla epämuodostunut .
C-polypeptidin muuttuneet tasot aivoselkäydinnes-5 teessä voivat merkitä esimerkiksi hermoston rappeutumis-häiriöitä. Koska C-polypeptidi vapautuu solusta natiivin siiliprekursoriproteiinin synteesin ja autoproteolyysin jälkeen, kasvaimet, jotka syntetisoivat ja vapauttavat korkeita C-polypeptiditasoja, voitaisiin todeta tuntematta 10 ennalta kasvaimen tarkkaa sijaintia..
C-fragmentti on tehokas indusoimaan myös aivolisäkkeen ja etuaivojen geenejä. Erityisesti indusointi lisääntyy lisäämällä kasvutekijöiden TGF-E-ryhmän jäsentä. Esimerkiksi ihmisen aktiviini yhdistettynä C-fragmenttiin voi 15 olla tehokas aivolisäkkeen solukasvun ja aktiivisuuden tai kehityksen tehostamiseksi.
C-fragmentti on tehokas indusoimaan aivojen taka-merkkejä inhiboimalla N:n. Tällaisesta fragmentista esitetään esimerkki esimerkissä 18 A-N-C:nä. Tämän vuoksi 20 toisena suoritusmuotona keksintöön sisältyy polypeptidi, josta on deletoitu X-bhh:n aminohappotähteet 28 - 194.
• · '·/·· (Autoproteolyysi tuottaa 198 - 409 :n C-domeenin sekä 7 ·:··· aminohapon peptidin, joka edustaa aminohappoja 24 - 27 ja ·’·*. 195 - 197.) Tämä polypeptidi salpaa X-bhh:n ja N:n aktii- • · : 2 5 visuuden siirteissä ja vähentää selkä-etupuolen rakenteita • · ;·. alkioissa. Samoin mukaan sisältyvät A-N-C:tä koodittavat • · · polynukleotidisekvenssit. Δ-Ν-C on käyttökelpoinen taka- • · · ’ hermomerkkien ilmentymisen lisäämiseksi (esim. En-2, Krox- 20, Xlttbox-6) ja etuhermomerkkien ilmentymisen vähentämi- • · *···* 30 seksi (esim. XANF-2, XAG-1, Otx-A) , milloin täten menette- ·**· ly on toivottavaa hermosolukuvioinnin moduloimiseksi .
Ilmaisu "oleellisesti puhdas" tässä käytettynä • · .*··. viittaa siilin N- tai C-polypeptidiin, joka oleellisesti • · · ei sisällä muita proteiineja, lipidejä, hiilihydraatteja, • · · *·* * 35 nukleiinihappoja tai muita materiaaleja, joiden yhteydessä • · 16 se luonnollisesti esiintyy. Alan ammattilainen voi puhdistaa siilin N- tai C-polypeptidin käyttäen proteiinipuhdis-tuksen tavanomaisia tekniikoita. Oleellisesti puhtaasta polypeptidistä saadaan yksittäinen pääasiallinen nauha ei-5 pelkistävässä polyakryyliamidigeelissä. Siilin N- tai C-polypeptidin puhtaus voidaan myös määrittää aminopään aminohapposekvenssianalyysillä.
Keksintöön sisältyyy funktionaalinen N- tai C-po-lypeptidi ja niiden funktionaaliset fragmentit. Tässä käy-10 tettynä ilmaisu "funktionaalinen polypeptidi" tai "funktionaalinen fragmentti" viittaa polypeptidiin, jolla on biologinen funktio tai aktiivisuus, joka identifioidaan määritellyllä funktionaalisella määrityksellä ja joka liittyy johonkin nimenomaiseen biologiseen, morfologiseen 15 tai fenotyypin muutokseen solussa. Siilin N- tai C-polypeptidin funktionaalisia fragmentteja ovat N- tai C-polypeptidin fragmentit, kunhan aktiivisuus, esim. C-polypeptidin proteolyyttinen aktiivisuus, on tallella. Pienemmät peptidit, jotka sisältävät N- tai C-polypeptidin biologi-20 sen aktiivisuuden, sisältyvät siksi keksintöön. Biologinen funktio voi esimerkiksi vaihdella polypeptidifragmentista, • · joka on niinkin pieni kuin epitooppi, johon vasta-ainemo- ·;·*: lekyyli voi sitoutua, suureen polypeptidiin, joka kykenee ·'·*; osallistumaan fenotyyppimuutosten karakteristiseen indu- • · .·. : 25 sointiin tai ohjelmointiin solussa. "Funktionaalinen poly- • · · • · ;·, nukleotidi" merkitsee polynukleotidia, joka koodittaa täs-
• M
*... sä kuvatun mukaista funktionaalista polypeptidiä.
• · · ' N- tai C-polypeptidin primaarisen aminohapposek venssin vähäiset modifikaatiot voivat johtaa polypeptidei- • · *···* 30 hin, joilla on oleellisesti ekvivalenttinen aktiivisuus *·**· verrattuna tässä kuvattuun N- tai C-polypeptidiin. Tällai- ·*·*· set modifikaatiot voivat olla tarkoituksellisia, kuten • · · · • · .···. paikkakohdennetussa mutagenisoinnissa, tai ne voivat olla • · · spontaaneja. Kaikki näiden modifikaatioiden välityksellä • · · '·* 3 5 tuotetut polypeptidit sisältyvät tähän, kunhan esimerkiksi • · 17 C-polypeptidin proteolyyttinen aktiivisuus on läsnä. Edelleen yhden tai useamman aminohapon deleetio voi myös johtaa saadun molekyylin rakenteen modifikaatioon, ilman että tämän aktiivisuus merkittävästi muuttuu. Tämä voi johtaa 5 pienemmän aktiivisen molekyylin kehittymiseen, jolla olisi laajempaa käyttöä. Esimerkiksi on mahdollista poistaa amino- tai karboksipääaminohappoja, jotka mahdollisesti eivät ole välttämättömiä N- tai C-polypeptidiaktiivisuudelle.
Keksinnön mukainen N- tai C-polypeptidi käsittää 10 myös polypeptidisekvenssin konservatiiviset variaatiot.
Ilmaisulla "konservatiivinen variaatio" tässä käytettynä tarkoitetaan aminohappotähteen korvaamista toisella, biologisesti samankaltaisella tähteellä. Esimerkkejä konservatiivisista variaatioista ovat yhden hydrofobisen täh-15 teen, kuten isoleusiinin, valiinin, leusiinin tai metio-niinin, sijoittaminen toisen tilalle, tai yhden polaarisen tähteen korvaaminen toisella, kuten lysiinin korvaaminen arginiinilla, asparagiinihapon glutamiinihapolla tai aspa-ragiinin glutamiinilla ja muut vastaavat. Ilmaisun "kon-20 servatiivinen variaatio" piiriin kuuluu myös substituoidun aminohapon käyttäminen ei-substituoidun kanta-aminohapon • · ;.1·· tilalla, edellyttäen että substituoitua polypeptidiä vas- *:·1: taan tuotetut vasta-aineet immuunireagoivat myös ei-subs- ;1·1: tituoidun polypeptidin kanssa.
• · • \j 2 5 Keksinnön mukainen N-fragmentti käsittää sekä poly- • · ;·. peptidin aktiivisen muodon että N-fragmentin, johon sisäl- • · · tyy ei-pilkottu signaalisekvenssi. Esimerkiksi Drosophi- • · · lassa. jossa signaalisekvenssi on sisäinen (noin aminohap- ... pojen 60 - 80 kohdalla) , ei-pilkottu N-fragmentti kokonai- • · *···[ 30 suudessaan alkaen lähtömetioniinista sisältyy keksintöön.
' 1 Alan ammattilaiset voivat helposti varmistua signaalisek- venssin luonteesta ja sijainnista käyttämällä esimerkiksi • · .·**. G. von Heijnen kuvaamaa algoritmia, Nucl. Acids Res. 14 (1986) 4683.
• · · ' ' • · · • · · · 18
Keksintö antaa käyttöön myös eristetyn polynukleo-tidisekvenssin, joka koostuu oleellisesti polynukleotidi-sekvenssistä, joka koodittaa polypeptidiä, jolla on keksinnön mukaisen N- tai C-polypeptidin aminohapposekvenssi.
5 Ilmaisun "eristetty" tässä käytettynä piiriin kuuluvat po-lynukleotidit, jotka oleellisesti eivät sisällä muita nukleiinihappoja, proteiineja, lipidejä, hiilihydraatteja tai muita materiaaleja, joiden yhteydessä ne luonnollisesti esiintyvät. Keksinnön mukaisia polynukleotidisekvenssejä 10 ovat DNA-, cDNA- ja RNA-sekvenssit, jotka koodittavat N-tai C-polypeptidiä. Huomattakoon, että kaikki polynukleo-tidit, jotka koodittavat N- tai C-polypeptidiä kokonaisuudessaan tai osittain, sisältyvät myös tähän, kunhan ne koodittavat polypeptidiä, jolla on N- tai C-polypeptidiak-15 tiivisuutta. Tällaisia polynukleotidejä ovat luonnollisesti esiintyvät, synteettiset ja tarkoituksellisesti manipuloidut polynukleotidit. Esimerkiksi N- tai C-polypeptidi-polynukleotidiin voidaan kohdistaa paikkakohdennettu muta-genisointi. N- tai C-polypeptidin polynukleotidisekvenssi 20 käsittää myös antisense-sekvenssit. Keksinnön mukaiset polynukleotidit käsittävät sekvenssejä, jotka ovat degene- • · roituneet tuloksena geneettisestä koodista. On olemassa 2 0 *:**: luonnollista aminohappoa, joista useimpia spesifioi useam- pi kuin yksi kodoni. Tämän vuoksi kaikki degeneroituneet • » j·.^ 25 nukleotidisekvenssit sisältyvät keksintöön, kunhan nukleo- • · ;·. tidisekvenssin koodittaman N- tai C-polypeptidin aminohap- • ·· ].j.# posekvenssi on funktionaalisesti muuttumaton. Lisäksi kek- • · · sintöön kuuluu myös polynukleotidi, joka koostuu oleellisesti polynukleotidisekvenssistä, joka koodittaa polypep- • · *···’ 30 tidiä, jolla on N:n tai C:n aminohapposekvenssi ja jolla * * on ainakin yksi epitooppi N- tai C-polypeptidin kanssa ·*;*; immuunireaktiiviselle vasta-aineelle.
• · .···. N- tai C-polypeptidiä koodittava polynukleotidi • · · käsittää polypeptidin kokonaisuudessaan tai sen fragment- • · · '·* ’ 35 te ja, sekä tuohon sekvenssiin nähden komplementaarisia • · 19 nukleiinihapposekvenssejä. Komplementaarinen sekvenssi voi käsittää antisense-nukleotidin. Kun sekvenssi on RNA, de-oksinukleotidit A, G, C ja T korvaavat vastaavasti ribo-nukleotidit A, G, C ja U. Samoin keksintöön sisältyvät 5 edellä kuvattujen nukleiinihapposekvenssien fragmentit, joiden pituus on ainakin 15 emästä, joka pituus on riittävä salliakseen fragmentin selektiivisen hybridisaation proteiinia koodittavaan DNA:hän fysiologisissa olosuhteissa. Edullisesti fragmentit hybridisoituvat ankarissa olo-10 suhteissa.
Keksinnön mukaiset DNA-sekvenssit voidaan saada useilla menetelmillä. Esimerkiksi DNA voidaan eristää käyttäen alalla hyvin tunnettuja hybridisaatiotekniikoita. Näitä ovat mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta: 1) geno-15 mi- tai cDNA-kirjastojen hybridisaatio koettimiin homolo gisten nukleotidisekvenssien toteamiseksi; 2) ilmentämis-kirjastojen vasta-aineseulonta kloonattujen DNA-fragment-tien toteamiseksi, joilla on yhteisiä rakenteellisia piirteitä; ja 3) halutun nukleotidisekvenssin PCR-monistaminen 20 oligonukleotidialukkeita käyttäen.
Edullisesti keksinnön mukainen siili-, N- tai C-po- • · ·.*·· lynukleotidi saadaan selkärankaisorganismista, ja edulli- *ί**ϊ simmin ihmisestä. Nukleiinihappohybridisaatioon perustu- villa seulomismenettelyillä on mahdollista eristää mikä 25 tahansa geenisekvenssi mistä tahansa organismista, edel- • · i*. ^ lyttäen että saatavilla on sopiva koetin. Oligonukleotidi- koettimia, jotka vastaavat osaa kyseessä olevaa proteiinia koodattavasta sekvenssistä, voidaan syntetisoida kemialla- ... sesti. Tämä edellyttää, että aminohapposekvenssin lyhyitä • · **\ 30 oligopeptidijaksoja on tunnettava. Proteiinia koodattava DNA-sekvenssi voidaan päätellä geneettisestä koodista, :Y: jolloin kuitenkin koodin degeneroituminen on otettava huo- • · ;***; mioon. On mahdollista suorittaa seka-additioreaktio sek- ··· .;. venssin ollessa degeneroitunut. Tämä sisältää heterogeeni- • · · * * 35 sen seoksen denaturoitua kaksisäikeistä DNA:ta. Tällaista • · 20 seulomista varten hybridisaatio suoritetaan edullisesti joko yksisäikeisellä DNA:11a tai denaturoidulla kaksisäi-keisellä DNA:11a. Hybridisaatio on erityisen käyttökelpoinen cDNA-kloonien toteamiseksi, jotka ovat peräisin läh-5 teistä, joissa on läsnä äärimmäisen alhainen määrä kiinnostavaan polypeptidiin liittyviä mRNA-sekvenssejä. Toisin sanoen käyttämällä ei-spesifisen sitoutumisen välttämiseksi ankaria hybridisaatio-olosuhteita on mahdollista esimerkiksi mahdollistaa spesifisen cDNA-kloonin autoradio-10 grafinen visualisointi hybridisoimalla kohde-DNA tuohon yksittäiseen koettimeen seoksessa, joka on sen täydellinen komplementti [Wallace et ai. , Nucl. Acids Res. 9 (1981) 879] .
Siiliä koodittavat spesifiset DNA-sekvenssit voi-15 daan kehittää myös seuraavasti: 1) kaksisäikeisten DNA- sekvenssien eristäminen genomi-DNA:sta; 2) DNA-sekvenssin kemiallinen valmistus tarvittavien kodonien saamiseksi kiinnostavalle polypeptidille; ja 3) kaksisäikeisen DNA-sekvenssin in vitro -synteesi eukaryoottisesta luovutta-20 jasolusta eristetyn mRNA:n käänteisellä kopioinnilla. Viimeksi mainitussa tapauksessa muodostuu lopulta mRNA:n kak- • · ϊ/.j sisäikeinen DNA-kompelementti, jota kutsutaan yleensä ·;··· cDNA:ksi.
·1·’. Kolmesta edellä mainitusta menetelmästä spesifisten • · .·. : 25 DNA-sekvenssien kehittämiseksi yhdistelmä-DNA-menettelyis- • · ;·. sä käytettäviksi genomi-DNA-isolaattien eristäminen on • · · vähiten tavanomainen. Tämä pitää paikkansa etenkin, mil- • · · • loin on toivottavaa saada nisäkäspolypeptidien mikrobiaa-linen ilmentyminen intronien läsnäolon johdosta.
• · *···1 3 0 DNA-sekvenssien synteesi on usein paras menetelmä, • 1 silloin kun halutun polypeptidituotteen aminohappotähtei- den sekvenssi kokonaisuudessaan tunnetaan. Silloin kun • · · • · .···. halutun polypeptidin aminohappotähteiden sekvenssiä koko- • · • naisuudessaan ei tunneta, DNA-sekvenssien suora synteesi • · · *·1 ’ 35 ei ole mahdollinen, ja paras menetelmä on cDNA-sekvenssien · 21 synteesi. Tavanomaisia menettelyjä kiinnostavien cDNA-sek-venssien eristämiseksi on plasmidin tai faagin muodostaminen, jotka käsittävät cDNA-kirjastoja, jotka saadaan mRNA:n käänteisellä kopioinnilla, jota esiintyy runsaasti 5 luovuttajasoluissa, joiden geneettisen ilmentymisen taso on korkea. Käytettäessä yhdessä polymeraasiketjureaktio-teknologiaa jopa harvinaisia ilmentymistuotteita voidaan kloonata. Niissä tapauksissa, joissa tunnetaan merkittäviä osia polypeptidin aminohapposekvenssistä, voidaan käyttää 10 leimattujen yksiä tai kaksisäikeisten DNA- tai RNA-koe-tinsekvenssien tuottamista, jotka jäljittelevät kohde-cDNA:ssa oletettavasti esiintyvää sekvenssiä, DNA/DNA-hyb-ridisaatiomenettelyissä, jotka suoritetaan cDNA:n kloonatuilla kopioilla, jotka on denaturoitu yksisäikeiseen muo-15 toon [Jay et ai., Nucl. Acids Res. 11 (1983) 2325].
Edullinen menetelmä esimerkiksi genomi-DNA:n saamiseksi on polymeraasiketjureaktio (PCR), joka perustuu nuk-leiinihapposynteesin in vitro -menetelmään, jolla voidaan spesifisesti toistaa jokin nimenomainen DNA-segmentti. 20 Käytetään kahta oligonukleotidialuketta, jotka sivuavat monistettavaa DNA-fragmenttia, toistetuissa sykleissä, • · ·.’·· joissa DNA lämpödenaturoidaan, alukkeet juotetaan niihin *:··: nähden komplementaarisiin sekvensseihin ja juotetut aluk- ·1·1: keet laajennetaan DNA-polymeraasia käyttäen. Nämä alukkeet • · ;1.J 25 hybridisoituvat kohdesekvenssin vastakkaisiin säikeisiin, • · ;·. ja ovat suuntautuneet siten, että DNA-synteesi polymeraa- • · · sin toimesta etenee poikki alukkeiden välisen alueen. Kos- • · · ka laajennustuotteet sinänsä ovat myös komplementaarisia alukkeisiin nähden ja kykenevät sitoutumaan näihin, toi- • · *···1 30 siaan seuraavissa monistussykleissä edellisessä syklissä * 1 syntetisoidun kohde-DNA:n määrä oleellisesti kaksinker- j1;1j taistuu. Tuloksena saadaan spesifisen kohde fragment in eks- • · .·1·. ponentiaalinen akkumulaatio, noin 2n, jossa n on suoritet- • » · tujen monistussyklien lukumäärä (katso "PCR Protocols", • · · • · · « 22 toim. Innis et ai.. Academic Press Inc., 1990, joka sisällytetään tähän viitteeksi).
cDNA-ilmentämiskirjasto, kuten λ-gtll, voidaan seuloa epäsuorasti siili-, N- tai C-polypeptidien suhteen, 5 joissa on ainakin yksi epitooppi, käyttämällä siilille, N:lie tai C:lle spesifisiä vasta-aineita. Tällaiset vasta-aineet voidaan saada joko polyklonaalisesti tai monoklo-naalisesti ja niitä voidaan käyttää ilmentämistuotteen toteamiseksi, joka osoittaa halutun siili-cDNAm läsnä-10 olon.
Polynukleotidisekvenssiin siilille, N:lie tai C:lie sisältyvät myös sekvenssit, jotka ovat komplementaarisia polynukleotidiin nähden, joka koodittaa siiliä, N:ää tai C : ta (antisense-sekvenssit) . Antisense-nukleiinihapot ovat 15 DNA- tai RNA-molekyylejä, jotka ovat komplementaarisia ai nakin osaan spesifistä mRNA-molekyyliä nähden [Weintraub, Scientific American 262 (1990) 40] . Keksintö käsittää kaikki antisense-polynukleotidit, jotka kykenevät inhiboimaan siili-, N- tai C-polypeptidin tuotannon. Solussa an-20 tisense-nukleiinihapot hybridisoituvat vastaavaan mRNA:han muodostaen kaksisäikeisen molekyylin. Antisense-nukleiini- • · ϊ/·· hapot häiritsevät mRNA:n translaatiota, koska solussa ei ·;··: tapahdu kaksisäikeisen mRNA:n translaatiota. Edullisia ·*·*. ovat noin 15 nukleotidin mittaiset antisense-oligomeerit, • · : 25 koska ne on helppo syntetisoida ja ne vähemmän todennäköi- • · ;·, sesti aiheuttavat ongelmia kuin suuremmat molekyylit koh- • «· *·.. teenä olevaan siiliä, N: ää tai C:tä tuottavaan soluun.
• · · • · ·
Antisense-menetelmien käyttö geenien translaation inhiboi-... miseksi on alalla tuttua [Marcus-Sakura, Anal. Biochem.
*···’ 30 172 (1988) 289] . Kohdenukleotidin inhibointi olisi toi- * * vottavaa esimerkiksi solujen lisääntymishäiriöiden, kuten tiettyjen kasvainten, inhiboimiseksi, joita välittävät • · .···. siili, N tai C.
• · • · ·
Lisäksi keksintöön lukeutuvat ribotsyyminukleoti- • · · *·* 35 disekvenssit siilille, N:lle tai Chile. Ribotsyymit ovat • · 23 RNA-molekyylejä, joilla on kyky spesifisesti pilkkoa muita yksisäikeisiä RNA-sekvenssejä analogisesti DNA-restriktio-endonukleaaseihin nähden. Modifioimalla näitä RNA-sekvens-sejä koodittavia nukleotidisekvenssejä on mahdollista val-5 mistaa molekyylejä, jotka tunnistavat spesifisiä nukleotidisekvenssejä RNA-molekyylissä ja pikkovat ne [Cech, j. Amer. Med. Assn. 260 (1988) 3030] . Tämän lähestymistavan pääasiallinen etu on, että vain mRNA:t, joilla on nimenomainen sekvenssi, inaktivoituva, koska ne ovat sekvenssi-10 spesifisiä.
Ribotsyymejä on kahta perustyyppiä, nimittäin tet-rahymena-tyyppi [Hasselhoff, Nature 334 (1988) 585] ja "vasaranpää"-tyyppi. Tetrahymena-tyypin ribotsyymit tunnistavat sekvenssejä, joiden pituus on neljä emästä, kun 15 taas "vasaranpää"-tyypin ribotsyymit tunnistavat pituudeltaan 11 - 18 emäksen emässekvenssejä. Mitä pitempi tunnis-tussekvenssi on, sitä suurempi on todennäköisyys, että sekvenssi esiintyy yksinomaan kohde-mRNA-lajissa. Täten vasaranpäätyypin ribotsyymit ovat edullisempia kuin tetra-20 hymena-tyypin ribotsyymit spesifisen mRNA-lajin inaktivoi- miseksi ja 18 emäksen tunnistussekvenssit ovat edullisem- • · :/.· pia kuin lyhyemmät tunnistussekvenssit.
·:··· Siiliä, N:ää tai C:tä koodittavat DNA-sekvenssit ·’·1; voidaan ilmentää in vitro DNA-siirrolla sopivaan isäntäso- • · 25 luun. "Isäntäsoluja" ovat solut, joissa vektoria voidaan • · :·, lisäännyttää ja sen DNA ilmentää. Ilmaisun piiriin kuulu- • · · vat myös kyseessä olevan isäntäsolun mahdolliset jälkeläi- • · · set. Huomattakoon, että kaikki jälkeläiset eivät välttämättä ole samanlaisia kuin kantasolu, koska replikaation • · *···1 30 aikana voi tapahtua mutaatioita. Kuitenkin tällaisten jäi- • · · · · * 1 keläisten tarkoitetaan kuuluvan mukaan käytettäessä llmai- ·1.1. sua "isäntäsolu" . Menetelmiä stabiilin siirron suorittami- • · · • · .···. seksi, mikä tarkoittaa, että vieras-DNA ylläpidetään jät- • · • · · • · kuvasti solussa, tunnetaan alalla.
·1· • · · • · · 24
Esillä olevassa keksinnössä siili-, N- tai C-poly-nukleotidisekvenssit voidaan insertoida yhdistelmä-DNA-ilmentäisi svektor iin. Ilmaisulla "yhdistelmä-DNA-ilmentämis-vektori" tarkoitetaan plasmidia, virusta tai muuta alalla 5 tunnettua kuljetinta, jota on manipuloitu insertoimalla tai sisällyttämällä siili-, N- tai C-geenisekvenssejä. Tällaiset ilmentämissekvenssit sisältävät promoottorisek-venssin, joka helpottaa isännän insertoidun geenisekvenssin tehokasta transkriptiota. Ilmentämisvektori sisältää 10 tyypillisesti replikaatioalkukohdan, promoottorin, sekä spesifisiä geenejä, jotka mahdollistavat transformoitujen solujen valikoinnin fenotyypin suhteen. Esillä olevassa keksinnössä käytettäviksi sopivia vektoreita ovat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, T7-pohjainen ilmentämis-15 vektori ilmentämiseen bakteereissa [Rosenberg et ai. , Gene 56 (1987) 125], pMSXND-ilmentämisvektori ilmentämiseen ni-säkässoluissa (Lee ja Nathans, J. Biol. Chem. 263 (1988) 3521] ja bakulovirusperäiset vektorit ilmentämiseen hyön-teissoluissa. DNA-segmentti voi esiintyä vektorissa opera-20 tiivisesti kytkettynä säätöelementteihin, esimerkiksi pro moottoriin (esim. T7-, metallotioneiini-I- tai polyhedrii-nipromoottori) .
·;··· Siiliä, N:ää tai C:tä koodittavat polynukleotidi- sekvenssit voidaan ilmentää joko prokaryooteissa tai euka- • · .·. : 25 ryooteissa, vaikkakin eukaryoottisissa soluissa saatujen • · · * polypeptidien translaation jälkeinen modifiointi, kuten • · · karboksylaatio, tapahtuisi eukaryoottisessa isännässä.
• · · • · · * Isäntiä voivat olla mikrobi-, hiiva-, hyönteis- ja nisä-käsorganismit. Menetelmiä eukaryoottisiä tai virussekvens- • · 3 0 sejä käsittävien DNA-sekvenssien ilmentämiseksi prokaryoo-’’’1· teissä tunnetaan alalla hyvin. Alalla tunnetaan biologi- sesti funktionaalisia virus- ja plasmidi-DNA-vektoreita, • · .···. jotka voidaan ilmentää ja replikoida isännässä. Tällaisia • · vektoreita käytetään keksinnön mukaisten DNA-sekvenssien • · · *.1 1 35 mukaan sisällyttämiseksi.
• · 25
Alan ammattilaisille tuttuja menetelmiä voidaan käyttää siili-, N- tai C-koodisekvenssin sekä tarkoituksenmukaiset transkription/translaation kontrollisignaalit sisältävien ilmentämisvektorien rakentamiseksi. Näitä me-5 netelmiä ovat yhdistelmä-DNA-tekniikat in vitro, synteettiset tekniikat ja DNA-yhdistämisen/geneettiset tekniikat in vivo. Katso esimerkiksi tekniikat, joita kuvataan julkaisussa Maniatis et ai. , "Molecular Cloning, A Laboratory Manual"; Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1989.
10 Laajaa valikoimaa isäntä-ilmentämisvektorisysteeme- jä voidaan käyttää siili-, N- tai C-koodisekvenssin ilmentämiseksi. Näitä ovat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, mikro-organismit, kuten bakteerit, jotka on transformoitu yhdistelmä-DNA-bakteriofagi-DNA-, plasmidi-DNA-15 tai kosmidi-DNA-ilmentämisvektoreilla, jotka sisältävät siili-, N- tai C-koodisekvenssin; hiiva, joka on transformoitu yhdistelmä-DNA-hiivailmentämisvektoreilla, jotka sisältävät siili-, N- tai C-koodisekvenssin, kasvisolusys-teemit, jotka on tartutettu yhdistelmä-DNA-virusilmentä-20 misvektoreilla (esim. kukkakaalimosaiikkivirus, CaMV; tu-pakkamosaiikkivirus, TMV) tai transformoitu yhdistelmä- • · DNA-plasmidi-ilmentämisvektoreilla (esim. Ti-plasmidi) , ·:*·· jotka sisältävät siili-, N- tai C-koodisekvenssin; hyön- teissolusysteemit, jotka on tartutettu yhdistelmä-DNA-vi- • · .·. : 25 rusilmentämisvektoreilla (esim. bakulovirus) , jotka sisäl- • · · • · ;·, tävät siili-, N- tai C-koodisekvenssin; tai eläinsolusys- • · · *... teemit, jotka on tartutettu yhdistelmä-DNA-virusilmentä- • ♦ · * misvektoreilla (esim. retrovirukset, adenovirus, lehmän-rokkovirus), jotka sisältävät siili-, N- tai C-koodisek- • · *···* 30 venssin, tai transformoidut eläinsolusysteemit, jotka on *·*’· suunniteltu stabiiliin ilmentämiseen.
Riippuen käytetystä isäntä/vektorisysteemistä mitä • · .···. tahansa lukumäärää sopivia transkriptio- ja translaatio- • · *** elementtejä, mukaan lukien konstitutiiviset ja indusoita- • · · *.* * 35 vat promoottorit, transkriptiota tehostavat elementit, • · 26 transkription päättäjät jne., voidaan käyttää ilmentämis-vektorissa [katso esim. Bitter et ai. , Meth. Enzvm. 153 (1987) 516 - 544]. Esimerkiksi kloonattaessa bakteerisys-teemeissä voidaan käyttää indusoitavia promoottoreita, ku-5 ten bakteriofagin 7 pL, plac, ptrp, ptac (ptrp-lac-hybri-dipromoottori) ja muut vastaavat. Kloonattaessa nisäkässo-lusysteemeissä voidaan käyttää promoottoreita, jotka on saatu nisäkässolujen genomista (esim. metallotioneiinipro-moottori), tai nisäkäsviruksista (esim. retroviruksen pit-10 kä päätoisto; adenoviruksen myöhäispromoottori; lehmänrok-koviruksen 7.5K promoottori). Voidaan käyttää myös yhdis-telmä-DNA- tai synteettisillä tekniikoilla tuotettuja promoottoreita insertoidun siili-, N- tai C-koodisekvenssin transkription saamiseksi.
15 Bakteerisysteemeissä voidaan edullisesti valita lu kuisia erilaisia ilmentämisvektoreita riippuen ilmennetyn aiotusta käytöstä. Esimerkiksi, kun on määrä tuottaa suuria määriä siili-, N- tai C-tuotetta, saattaa olla toivottavaa käyttää vektoreita, jotka ohjaavat helposti puhdis-20 tettavien fuusioproteiinituotteiden ilmentymistä korkeina tasoina. Edullisia ovat ne, jotka on manipuloitu sisältä-:\j mään pilkkomiskohdan talteenoton helpottamiseksi. Tällai- ·;··· siä vektoreita ovat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumat-
ta, Eh. coli -ilmentämisvektori pUR278 [Ruther et ai. , EMBO
• · : 25 J^. 2 (1983) 1791], jossa siili-, N- tai C-koodisekvenssi • «· * voidaan ligatoida vektoriin samalla alueella IacZ-koodi- • ·· *... alueen kanssa siten, että muodostuu hybridi-lacZ-proteii- • · · • · · * ni; pIN-vektorit [Inouye ja Inouye, Nucl. Acids Res. 13 (1985) 3101; Van Heeke ia Schuster, J. Biol. Chem. 264 ··· ' ' —— *··.’ 30 (1989) 5503] ja muut vastaavat.
**”1 Hiivassa voidaan käyttää lukuisia, konstitutiivi- sen tai indusoitavan promoottorin sisältäviä vektoreita.
• · .···. Katsauksen osalta katso "Current Protocols in Molecular • · ♦ Biology", osa 2, toim. Ausubel et al. , Greene Publish.
«·· - ——— • · · *.1 1 35 Assoc. & Wiley interscience, 1988, luku 13; Grant et al. , · 27 "Expression and Secretion Vectors for Yeast", Meth. En-zvm. . toim. Wu ja Grossman, osa 153, Acad. Press, N.Y., 1987, ss. 516 - 544; Glover, "DNA Cloning", osa II, IRL Press, Wash., D.C., 1986, luku 3; ja Bitter, "Heterologous 5 Gene Expression in Yeast", Meth. Enzym.. toim. Berger ja Kimmel, osa 152, Acad. Press, N.Y., 1987, ss. 673 - 684; ja "The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces", toim. Strathern et al., osat I ja II, Cold Spring Harbor Press, 1982. Voidaan käyttää konstitutiivista hiivapro-10 moottoria, kuten ADH tai LEU2, tai indusoitavaa promoottoria, kuten GAL ("Cloning in Yeast", luku 3, R. Rothstein julkaisussa "DNA Cloning, A Practical Approach", osa 11, toim. D.M. Glover, IRL Press, Wash., D.C., 1986). Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää vektoreita, jotka edistävät 15 vieras-DNA-sekvenssien integraatiota hiivakromosomiin.
Tapauksissa, joissa käytetään kasvi-ilmentämisvek-toreita, siili-, N- tai C-koodisekvenssin ilmentymistä voi ohjata mikä tahansa lukuisista promoottoreista. Esimerkiksi voidaan käyttää viruspromoottoreita, kuten CaMV:n 35S 2 0 RNA- ja 19S RNA -promoottorit [Brisson et ai.. Nature 310 (1984) 511] tai kuoriproteiinipromoottoria TMV:lle [Taka-ϊ#·.ϊ matsu et ai. , EMBO J. 6 (1987) 307] ; vaihtoehtoisesti voi- ·:··· daan käyttää kasvipromoottoreita, kuten RUBISCO:n pieni ·*·*; alayksikkö [Coruzzi et ai. , EMBO J. 3. (1984) 1671 - 1680; .‘.j 25 Broglie et ai. . Science 224 (1984) 838] ; tai lämpösokki- • ·
;·. promoottoreita, esim. soijapavun hsp 17.5-E tai hsp 17.3-B
• ·· *... TGurlev et ai.. Mol. Cell. Biol. 6 (1986) 5591 . Nämä ra- • · · —— — ' a · · * kenteet voidaan viedä kasvisoluihin käyttäen Ti-plasmide-ja, Ri-plasmideja, kasvivirusvektoreita, suoraa DNA-trans- • · '··.* 30 formointia, mikroruiskutusta, elektroporaatiota jne. Kat- *·**· sauksien osalta tällaisista tekniikoista katso esimerkiksi
Weissbach ja Weissbach, "Methods for Plant Molecular Bio-• · · -1 .···. logy", osa VIII, Academic press, NY, 1988, s. 421 - 463; • · ja Grierson ja Corey, "Plant Molecular Biology", 2. pai-*.* * 35 nos, toim. Blackie, Lontoo, 1988, luvut 7-9.
• · 28
Vaihtoehtoinen ilmentämissysteemi, joita voitaisiin käyttää ilmentämiseen, on hyönteissysteemi. Yhdessä tällaisessa systeemissä, Autoarapha californica -tumapolyhed-roosivirusta (AcNPV) käytetään vektorina vierasgeenien 5 ilmentämiseksi. Virus kasvaa Spodoptera frugjperda -soluissa. Siili-, N- tai C-koodisekvenssi voidaan kloonata viruksen ei-oleellisille alueille (esimerkiksi polyhedrii-nigeeni) ja sijoittaa AcNPV-promoottorin kontrolliin (esimerkiksi polyhedriinipromoottori). Siili-, N- tai C-koodi-10 sekvenssin menestyksekäs insertointi johtaa polyhedriini-geenin inaktivaatioon ja ei-salvatun yhdistelmä-DNA-viruksen tuotantoon (eli viruksen, jolta puuttuu polyhedriini-geenin koodittama proteiinikuori). Näillä yhdistelmä-DNA-viruksilla tartutetaan sitten Spodoptera frugjperda -solu-15 ja, joissa insertoitu geeni ilmennetään [esim. katso Smith et ai., J. Virol. 46 (1983) 584; Smith, US-patenttijulkai-su numero 4 215 051] .
Eukaryoottiset systeemit ja edullisesti nisäkäsil-mentämissysteemit mahdollistavat ilmennettyjen nisäkäspro-20 teiinien oikeanlaisten translaation jälkeisten modifikaatioiden tapahtumisen. Eukaryoottisia soluja, joilla on • · ί.*·· solukoneisto primaaritranskriptin oikeaoppiseen proses- *:**: sointiin, glykosylaatioon, fosforylaatioon ja edullisesti ·*·*: geenituotteen eritykseen, voidaan käyttää isäntäsoluina • · : 25 siili-, N- tai C-tuotteen ilmentämiseksi. Nisäkässolulin- • *· ' • · ;·, jät voivat olla edullisia. Tällaisia isäntäsolulinjoja
• M
voivat olla, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, -293 ja WI38.
Voidaan rakentaa nisäkässolusysteemejä, jotka käyt- • « *···] 3 0 tävät yhdistelmä-DNA-viruksia tai -viruselementtejä ilmen- ’ ’ tämisen ohjaamiseksi. Esimerkiksi käytettäessä adenovirus- ilmentämisvektoreita, siili-, N- tai C-koodisekvenssi voi- • · .·**. daan ligatoida adenoviraaliseen transkriptio/translaatio- • · · kontrollikompleksiin, esim. myöhäispromoottori ja kolmi- • · *·’ * 35 osainen johtosekvenssi . Tämä kimeerinen geeni voidaan sit- # · 29 ten insertoida adenovirusgenomiin DNA-yhdistämisellä in vitro tax in vivo. Insertointi virusgenomin ei-oleellisel-le alueelle (esim. alue El tai E3) johtaa yhdistelmä-DNA-virukseen, joka on elinkelpoinen ja kykenee ilmentämään 5 proteiinin tartutetuissa isännissä [esim. katso Logan ja Shenk, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 (1984) 3655]. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää lehmänrokkoviruksen 7.5K-pro-moottoria [esim. katso Mackett et ai. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79 (1982) 7415; Mackett et ah, J. Virol. 49 10 (1984) 857; Panicali et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79 (1982) 4927] . Erityisen kiinnostavia ovat naudan papilloo-mavirukseen perustuvat vektorit, jotka kykenevät replikoi-tumaan kromosomin ulkoisina elementteinä [Sarver et ai. . Mol. Cell. Biol. 1 (1981) 486]. Kohta tämän DNA:n hiiriso-15 luihin viemisen jälkeen plasmidi replikoituu noin 100 -200 kopioksi solua kohden. Insertoidun cDNA:n transkriptio ei edellytä plasmidin integraatiota isännän kromosomiin, jolloin saadaan korkea ilmentymistaso. Näitä vektoreita voidaan käyttää stabiiliin ilmentämiseen sisällyttämällä 20 plasmidiin valikointimerkki, kuten esimerkiksi neo-geeni. Vaihtoehoisesti retrovirusgenomia voidaan modifioida käy- • * tettäväksi vektorina, joka kykenee viemään siili-, N- tai ·:··· C-geenin isäntäsoluihin ja ohjaamaan niiden ilmentymistä ♦*.*. isäntäsoluissa [Cone ja Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sei.
• · .·. : 25 USA 81 (1984) 6349] . Ilmentyminen korkeina tasoina voidaan • · ♦ • « ;·. saada myös käyttämällä indusoitavia promoottoreita mukaan • ·· *... lukien, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, metallotio- • · · • · · * niini-IIA-promoottori ja lämpösokkipromoottorit.
Yhdistelmä-DNA-proteiinien tuottamiseksi pitkän • · *···* 30 aikaa korkeina saantoina stabiili ilmentyminen on edulli- nen. Sen sijaan, että käytettäisiin ilmentämisvektoreita, jotka sisältävät viraalisia replikaatioalkukohtia, isän- • · .♦··. täsolut voidaan transformoida siili-, N- tai C-cDNA:lla, • · y* jota kontrolloivat sopivat ilmentymisen kontrollielemen- • « · *.* * 35 tit (esim. promoottori, tehostinsekvenssit, transkription • · 30 päättäjät, polyadenylaatiokohdat jne.) ja valikointimerk-ki. Valikointimerkki yhdistelmä-DNA-plasmidissa tuottaa resistenssin valikointiin, ja tekee soluille mahdolliseksi integroida stabiilisti plasmidi kromosomeihinsa ja kasvaa 5 fokien muodostamiseksi, jotka puolestaan voidaan kloonata ja lisäännyttää solulinjoiksi. Esimerkiksi vieras-DNA:n viennin jälkeen manipuloitujen solujen voidaan antaa kasvaa 1-2 päivän ajan rikastetussa kasvualustassa, minkä jälkeen ne siirretään valikoivaan kasvualustaan. Voidaan 10 käyttää lukuisia valikointisysteemejä, mukaan lukien, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, herpes simplex -viruksen tymidiinikinaasi- [Wigler et ai , Cell 11 (1977) 223] , hypoksantiini-guaniinifosforibosyylitransferaasi-[Szybalska ja Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 48 15 (1962) 2026] ja adeniinifosforibosyylitransferääsi [Lowry et ai., Cell 22 (1980) 817] -geenejä voidaan käyttää vastaavasti tk'-, hgprt' tai aprt'-soluissa. Samoin antimetabo-liittiresistenssiä voidaan käyttää valikoinnin metotrek-saatille resistenssin tuottavan dhfr- [Wigler et ai. , 20 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77 (1980) 3567; O'Hare et ai..
Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78 (1981) 1527]; mykofenoliha-:\j polle resistenssin tuottavan gpt- [Mulligan ja Berg, Proc.
·;··· Natl. Acad. Sei. USA 78 (1981) 2072] ; aminoglykosidille j*.·. G-418 resistenssin tuottavan neo- [Colberre-Garapin, et • ♦ ,·. : 25 ai. , J. Mol. Biol. 150 (1981) 1] ; ja hygromysiinille re- • ♦· •*t * sistenssin tuottavan hygro [Santerre et ai. , Gene 30 • · · *... (1984) 147] -geenin suhteen perustana, Vastikään on kuvat- • · · « · · * tu muita valikointigeenejä, nimittäin trpB, joka tekee soluille mahdolliseksi käyttää indolia tryptofaanin asemes- • · *...* 30 ta; hisD, joka tekee soluille mahdolliseksi käyttää histi- ’·**· nolia histidiinin asemesta [Hartman ja Mulligan, Proc.
Natl. Acad. Sei. USA 85 (1988) 80471 ; ja ODC (ornitiinide-• · · -------- “““ • · .···. karboksylaasi) , joka tuottaa resistenssin ornitiinidekar- • · *·’ boksylaasi-inhibiittorille, 2-(difluorimetyyli)-DL-orni- • · · *.* · 35 tiini, DFMO (McConlogue, L. , julkaisussa "Current Communi- • · 31 cations in Molecular Biology", Cold Spring Harbor Laboratory toim., 1987).
Isäntäsolun transformointi yhdistelmä-DNA:11a voidaan suorittaa tavanomaisilla tekniikoilla, kuten alan am-5 mattilaisille on tuttua. Silloin kun isäntä on prokaryoot-tinen, kuten EL. coli. transformoitumiskelpoisia soluja, jotka kykenevät DNA:n ottoon, voidaan valmistaa soluista, jotka on otettu talteen eksponentiaalisen kasvuvaiheen jälkeen ja joita on sitten käsitelty CaCl2-menetelmällä 10 käyttäen alalla hyvin tunnettuja menettelyjä. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää MgCl2:ta tai RbCl:ää. Transformointi voidaan haluttaessa suorittaa myös isäntäsolusta muodostetulle protoplastille.
Kun isäntä on eukaryoottinen, voidaan käyttää sel-15 laisia DNA-transfektointimenetelmiä, kuten kalsiumfosfaat-tikopresipitaatit, tavanomaiset mekaaniset menettelyt, kuten mikroruiskutus, elektroporaatio, liposomeihin suljetun plasmidin insertointi tai virusvektorit. Eukaryoottisia soluja voidaan myös kotransformoida keksinnön mukaista 20 siiliä, N:ää tai C:tä koodittavilla DNA-sekvensseillä ja toisella vieras-DNA-molekyylillä, joka koodittaa valikoi- • · !/.! tavaa fenotyyppiä, kuten herpes simplex -tymidiinikinaasi- *:··; geeni. Toinen menetelmä on käyttää eukaryoottista virus- ·1·1; vektoria, kuten apinavirus 20 (SV40) tai naudan papilloo- • · : 2 5 mavirus, eukaryoottisten solujen tilapäiseksi tartuttami- • · ··, seksi tai transformoimiseksi ja proteiinin ilmentämiseksi • ·· (katso esimerkiksi "Eukaryotic Viral Vectors", Cols Spring • · ·
Harbor Laboratory, Gluzman toim., 1982).
Keksinnön käyttöön antaman mikrobiaalisesti ilmen- • « *···1 30 netyn polypeptidin, tai sen fragmenttien, eristäminen ja * 1 puhdistus voidaan suorittaa tavanomaisin keinoin, mukaan **·1: lukien preparatiivinen kromatografia ja immunologiset ero- • · .1·1. tukset, joissa käytetään monoklonaalisia tai polyklonaali-
• M
• siä vasta-aineita.
«M • · · • · · · 32
Keksintöön kuuluvat vasta-aineet, jotka ovat immuu-nireaktiivisia siili-, N- tai C-polypeptidin tai sen funktionaalisten fragmenttien kanssa tai sitoutuvat mainittuihin. Annetaan käyttöön vasta-aine, joka koostuu oleelli-5 sesti pooliksi yhdistetyistä monoklonaalisista vasta-aineista, joilla on eri epitooppispesifisyydet, sekä erillisiä monoklonaalisia vasta-ainevalmisteita. Monoklonaalisia vasta-aineita valmistetaan proteiinin antigeenipitoisista fragmenteista alan ammattilaisille tutuilla menetelmillä 10 [Kohler et ai., Nature 256 (1975) 495] . Ilmaisun "vasta- aine" tässä keksinnössä käytettynä tarkoitetaan käsittävän ehyet molekyylit sekä niiden fragmentit, kuten Fab ja F(ab')2, jotka kykenevät sitoutumaan epitooppimääreeseen siilillä, N:llä tai C:llä. Keksinnön mukaisia vasta-ainei-15 ta ovat vasta-aineet, jotka sitoutuvat N- tai C-polypepti-diin ja jotka sitoutuvat N:n tai C:n immuunireaktiivisiin fragmentteihin.
Ilmaisu "vasta-aine" tässä keksinnössä käytettynä sisältää ehyet molekyylit sekä niiden fragmentit, kuten 20 Fab, F(ab')2 ja Fv, jotka kykenevät sitoutumaan epitooppimääreeseen. Näillä vasta-ainefragmenteilla on tallella • · ϊ.1·{ jonkinasteinen kyky sitoutua selektiivisesti antigeeniinsä *:··: tai reseptoriinsa, ja ne määritellään seuraavasti: ·1·'. (1) Fab, fragmentti, joka sisältää vasta-ainemole- • « 25 kyylin monovalenttisen antigeeniin sitoutuvan fragmentin, • · j·. voidaan tuottaa pilkkomalla kokonainen vasta-aine papaii- • · · nientsyymillä, jolloin saadaan ehyt kevyt ketju ja osa • · · • yhdestä raskaasta ketjusta; (2) Fab', vasta-ainemolekyylifragmentti, joka voi- • · *···1 30 daan saada käsittelemällä kokonaista vasta-ainetta pepsii- • · nillä ja sitten pelkistämällä, jolloin saadaan ehyt kevyt ketju ja osa raskaasta ketjusta; saadaan kaksi Fab'-frag- • · .···. menttia vasta-ainemolekyyliä kohden; • · ·1 (3) (Fab')2, vasta-ainefragmentti, joka voidaan saa- • · · V 1 35 da käsittelemällä kokonaista vasta-ainetta pepsiinientsyy- · 33 millä ilman myöhempää pelkistystä; F(ab')2 on kahden Fab'-fragmentin dimeeri, jota pitävät koossa kaksi disulfidi-siltaa; (4) Fv, määritellään geneettisesti valmistetuksi 5 fragmentiksi, joka sisältää vaihtuvan geneettisesti fuusioidun yksiketjumolekyylin.
Menetelmiä näiden fragmenttien valmistamiseksi tunnetaan alalla (katso esimerkiksi Harlow ja Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 10 New York, 1988, joka sisällytetään tähän viitteeksi).
Tässä keksinnössä käytettynä ilmaisu "epitooppi" merkitsee mitä tahansa antigeenimäärettä antigeenillä, johon vasta-aineen paratooppi sitoutuu. Epitooppimääreet koostuvat tavallisesti molekyylien, kuten aminohappojen 15 tai sokerisivuketjujen, kemiallisesti aktiivisista pinta-ryhmittymistä, ja niillä on tavallisesti spesifiset kolmiulotteisen rakenteen ominaisuudet sekä spesifiset varaus-ominaisuudet .
Vasta-aineita, jotka sitoutuvat keksinnön mukaiseen 20 siili-, N- tai C-polypeptidiin, voidaan valmistaa käyttämällä ehyttä polypeptidiä tai fragmentteja, jotka sisältä-vät kiinnostavia pieniä peptidejä, immunoivana antigeeni-·;··· na. Polypeptidi, kuten N tai C tai niiden fragmentit, joi- tV. ta käytetään eläimen immunoimiseksi, voidaan saada trans- ♦ · : 25 laation läpikäyneestä cDNA:sta tai kemiallisesti synteti- *· ** soimalla ja se voidaan haluttaessa konjugoida kantajapro- • ·· *... teiiniin. Tällaisia tavanomaisesti käytettyjä kantajia, • · · • · · * jotka kytketään kemiallisesti peptidiin, ovat avaimenrei-kä-maljakotilo-hemosyaniini (KLH), tyroglobuliini, nauta- • · '··.1 30 seerumialbumiini (BSA) ja tetanustoksoidi. Kytkettyä pep- ***** tidiä käytetään sitten eläimen (esim. hiiri, rotta tai .1.1. kani) immunoimiseksi .
• · · 0 m .···. Haluttaessa polyklonaalisia tai monoklonaalisia • · *·1 vasta-aineita voidaan edelleen puhdistaa esimerkiksi si- ··· • · · *.1 1 35 tomalla matriisiin, johon on sidottu polypeptidi tai pep- · 34 tidi, jota vastaan vasta-aineet tuotettiin, ja eluoimalla siitä. Alan ammattilaiset tuntevat immunologian alalla tavanomaisia eri tekniikoita polyklonaalisten vasta-aineiden sekä monoklonaalisten vasta-aineiden puhdistamiseksi ja/ 5 tai konsentroimiseksi (katso esimerkiksi Coligan et ai. . yksikkö 9, "Current Protocols in Immunology", Wiley Interscience, 1991, joka sisällytetään tähän viitteeksi). On samoin mahdollista käyttää anti-idiotyyppiteknologiaa epi-tooppia jäljittelevien monoklonaalisten vasta-aineiden 10 tuottamiseksi. Esimerkiksi ensimmäistä monoklonaalista vasta-ainetta vastaan valmistetulla anti-idiotyyppisellä monoklonaalisella vasta-aineella on sitoutumisdomeeni hy-pervariaabelilla alueella, joka on ensimmäisen monoklonaa-lisen vasta-aineen sitoman epitoopin "kuva".
15 Vasta-aineet, joilla kuvataan tässä olevan spesifisyys N-polypeptidille, esim. Abi (tähteet 83 - 160) , ovat käyttökelpoisia siilin N-fragmentin ilmentävien solujen tai kudosten spesifiseksi identifioimiseksi. Vastaavasti vasta-aineet, joilla kuvataan tässä olevan spesifi-20 syys C-polypeptidille, esim. Ab2 (tähteet 300 - 391), ovat käyttökelpoisia siilin C-fragmentin ilmentävien solujen • · tai kudosten spesifiseksi identifioimiseksi. Molemmat vas- •f: ta-aineet toteavat luonnollisesti myös natiivin siilipoly- ·*·*: peptidin.
• · .*.J 25 Keksinnön mukaiset N- ja C-spesifiset vasta-aineet • · ;·. ovat käyttökelpoisia N- ja vastaavasti C-polypeptidin puh- • · · distamiseksi, etenkin käyttäen kiinteään faasiin immobili- ♦ · · soituja vasta-aineita. Saattamalla näyte kosketuksiin an-... ti-N-vasta-aineen kanssa voidaan eristää sekä N- että na- *···| 30 tiiveja siilipolypeptidejä. Saattamalla sitten anti-N-vas- * * ta-aineilla poistettu näyte kosketuksiin anti-C-vasta-ai- neiden kanssa saadaan natiivi siilipolypeptidi poistetuk- • · si, jolloin saadaan puhdistettu N-polypeptidi. Samalla ··· tavalla C-polypeptidi voidaan puhdistaa vasta-aineella • · · '·* 35 näytteestä.
• · 35
Keksinnön mukaiset monoklonaaliset vasta-aineet sopivat käytettäviksi esimerkiksi immuunimäärityksissä, joissa niitä voidaan käyttää nestefaasissa tai sidottuina kiinteäfaasikantajaan. Lisäksi monoklonaaliset vasta-ai-5 neet näissä immuunimäärityksissä voidaan leimata todetta-vasti eri tavoin. Esimerkkejä immuunimääritystyypeistä, joissa voidaan käyttää keksinnön mukaisia monoklonaalisia vasta-aineita, ovat kilpailevat ja ei-kilpailevat immuu-nimääritykset joko suorassa tai epäsuorassa formaatissa. 10 Esimerkkejä tällaisista immuunimäärityksistä ovat radio-immuunimääritys (RIA) ja "sandwich" (immunometrinen) -määritys. Antigeenien toteaminen keksinnön mukaisia monoklonaalisia vasta-aineita käyttämällä voidaan suorittaa käyttämällä immuunimäärityksiä, jotka toteutetaan joko eteen-15 päin, taaksepäin suuntautuvilla tai simultaanisilla muodoilla, mukaan lukien fysiologisten näytteiden immuunihis-tokemialliset määritykset. Alan ammattilaisille ovat tuttuja, tai he voivat helposti selvittää, muut immuunimääri-tysformaatit ilman tarpeetonta kokeilua.
20 Ilmaisun "immunometrinen määritys" tai "sandwich- immuunimääritys" piiriin kuuluvat simultaaniset "sand- • · wich"-, eteenpäin suuntautuneet "sandwich"- ja taaksepäin ·;··; suuntautuneet "sandwich"-immuunimääritykset. Nämä ilmaisut ovat alan ammattilaisille tuttuja. Alan ammattilaiset tie- • · .·. : 25 tävät myös, että esillä olevan keksinnön mukaiset vasta- • · :·, aineet ovat käyttökelpoisia muissa määritysvariaatioissa • · · ja -muodoissa, jotka tunnetaan tällä hetkellä tai jotka • · · ’ mahdollisesti tulevaisuudessa kehitetään. Näiden tarkoite taan sisältyvän esillä olevan keksinnön suojapiiriin.
• · *···' 30 Monoklonaaliset vasta-aineet voidaan sitoa moniin * * erilaisiin kantajiin ja käyttää N- tai C-polypeptidin läs- näolon toteamiseksi. Esimerkkejä tutuista kantajista ovat • · .*··. lasi, polystyreeni, polypropyleeni, polyetyleeni, dekst- • · · ^ raani, nailon, amylaasit, luonnolliset ja modifioidut sei- • · · '·** 35 luloosat, polyakryyliamidit, agaroosit ja magnetiitti.
• · 36
Keksinnön tarkoituksiin kantaja voi olla luonteeltaan joko liukoinen tai ei-liukoinen. Alan ammattilaiset tuntevat muita sopivia kantajia monoklonaalisten vasta-aineiden sitomiseksi tai kykenevät havaitsemaan niitä rutiinikokeilu-5 ja käyttäen.
Keksinnön tarkoituksiin N- tai C-polypeptidi voidaan todeta monoklonaalisillä vasta-aineilla sen esiintyessä biologisissa nesteissä ja kudoksissa. Voidaan käyttää mitä tahansa näytettä, joka sisältää todettavan määrän 10 N:ää tai C:tä. Näyte voi olla neste, kuten virtsa, sykli, aivoselkäydinneste, veri, seerumi ja muu vastaava, tai kiinteä tai puolikiinteä, kuten kudokset, uloste ja muut vastaavat, tai vaihtoehtoisesti kiinteä kudos, kuten ne, joita yleisesti käytetään histologisessa diagnoosissa. 15 C-polypeptidi erityisesti voidaan todeta biologisista näytteistä, koska sillä on taipumus diffundoitua helpommin kuin N-polypeptidi.
Määrityksiä suoritettaessa voi olla toivottavaa sisällyttää inkubointiväliaineeseen tiettyjä "salpaajia" 20 (lisätään tavallisesti yhdessä leimatun liukoisen vasta-aineen kanssa). "Salpaajat" lisätään sen varmistamiseksi, • · että kokeellisessa näytteessä läsnä olevat ei-spesifiset *:·*: proteiinit, proteaasit tai anti-C- tai anti-N-immunoglo- ·*·*; buliinien vastaiset anti-heterofiiliset immunoglobuliinit • · .*.J 25 eivät ristireagoi tai tuhoa vasta-aineita kiinteäfaasi- • · tuella, tai radioleimattua indikaattorivasta-ainetta, joi- • ·· * ,*j·. loin saataisiin vääriä positiivisia tai vääriä negatiivi- • · · siä tuloksia. "Salpaajien" valinta voi tämän vuoksi lisätä ... huomattavasti esillä olevassa keksinnössä kuvattujen mää- • · *···* 30 ritysten spesifisyyttä.
* * Keksintö antaa käyttöön myös menetelmän hermosolu- jen lisääntymisen tai dif f erentiaation moduloimi seksi, • · jonka menetelmän mukaan solut saatetaan kosketuksiin sii- • · · /mm lipolypeptidin kanssa. Siilipolypeptidi voi olla natiivi • · · ’·* ’ 35 siilipolypeptidi, tai N- tai C-polypeptidi, tai niiden • · 37 jokin funktionaalinen fragmentti. Edullisesti modulointi on jonkin nimenomaisen solutyypin lisääntymisen tai diffe-rentiaation indusointi. Tämä voi käsittää joko hermosolujen synergistisen positiivisen indusoinnin N:llä tai nega-5 tiivisen moduloinnin delta-N-C:llä esimerkiksi [Lai et ai. , Development 121 (1995) 2349]. Delta-N-C tehostaa etupuolen suhteessa takapuolen hermogeenien ilmentymistä ja tekee tämän inhiboimalla N:ää (katso esimerkki 18 ja kuvio 18D) . Siilipolypeptidin lisäksi myös TGF-β-tekijää voidaan 10 käyttää keksinnön mukaisessa menetelmässä.
Aiemmat tutkimukset rotan siiligeenillä osoittivat, että viljelmällä rotan siiliprekursorigeenin ilmentäviä soluja yhdessä alkion hermostoputkisiirteen kanssa riitti indusoimaan liikeneuronien ja pohjalevyn muodostumisen 15 siirteestä (Jessesl, T., ja Dodd, J., julkaisussa "Cell-Cell Signaling in Vertebrate Development", toim. E.J. Robertson et al., San Diego, CA, 1993, ss. 139 - 155) . Tämän vuoksi tässä esitettyjen esimerkkien nojalla, jotka osoittavat, että siili ilmentyy lähellä alkion hermostoputken 20 ja selkäjänteen vatsanpuoleisen keskiviivan pohjalevyä, oleellisesti pohjalevyn hermosoluista saatuja hermosoluja voidaan indusoida saattamalla solut kosketuksiin siili-, • · ·;··· N- tai C-polypeptidin kanssa. Tässä käytettynä "oleelli- sesti saatu" viittaa soluihin, jotka ovat pohjalevystä tai • · .·. : 25 läheltä pohjalevyä. Esimerkiksi tällaisia soluja ovat lii- • · · keneuronit ja dopamiiniliitteiset hermosolut. Alan ämmät- • · · *... tilaiset kykenevät identifioimaan muita, oleellisesti pöh- • · · * jalevystä saatuja hermosoluja. Edullisesti solut ovat sel-kärankaissoluja ja edullisimmin ihmissoluja.
*·..* 30 Lisäksi, kuten kuvataan tässä esimerkeissä, siili, ***** ja erityisesti C-fragmentti, indusoi aivolisäkegeenien il- mentymistä. Siili on myös tehokas indusoimaan etuaivojen • · .···. geeni-ilmentymistä, josta esimerkki on OTX-A-merkki . Edel- • · *·* leen TGF-β-ryhmäjäsenen, esimerkiksi aktiviinin, lisäämis- • · · '.* * 3 5 tä voidaan käyttää tällaisten geenien ilmentymisen edel- • · 38 leen indusoimiseksi. Alan ammattilaiset tuntevat muita TGF-S-ryhmän jäseniä. Tämä hh-fragmenttien ja TGF^-ryhmä-jäsenten välinen ilmeinen synergia tapahtuu TGF-fi-proteii-nin indusoidessa hermoindusorien, kuten noggiini ja fol-5 listatiini, ilmentymisen, hh-fragmentti vaikutta sitten synergisesti näiden indusorien kanssa hermogeeni-ilmentymisen kuvioittamiseksi.
hh-fragmentit voivat myös olla käyttökelpoisia hermoja säästävinä aineina tai oikeanlaisen kuvioinnin palo lauttamiseksi tai edistämiseksi suuren raajavaurion paranemisen aikana. Lisäksi N- ja C-fragmentit voivat olla käyttökelpoisia geneettisen neuvonnan alalla. Spesifisesti perheittäin esiintyvät keskiviivavajeet, kuten synnynnäinen yksisilmäisyys, monisormisuus tai alkion hermostoput-15 ken virheet, voidaan diagnostisoida kartoittamalla hh:n läheltä. Koska autoproteolyyttiset virheet voivat olla vastuussa näistä häiriöistä, voitaisiin antaa N- tai C-te-rapiaa.
Keksintö antaa käyttöön myös autoproteolyyttisen 20 fuusioproteiinin, joka käsittää ensimmäisen polypeptidin, joka sisältää keksinnön mukaisen C-polypeptidin proteo- • · lyyttisen domeenin, ensimmäisen polypeptidin tunnistaman *:··· pilkkomiskohdan ja toisen polypeptidin (huomattakoon, että ·*·*. ensimmäinen ja toinen polypeptidi voidaan vaihtaa keske- • · : 25 nään) . Natiivin siiliproteiinin autoproteolyyttinen aktii- • « ;·. visuus tavataan kokonaisuudessaan C-polypept idissä, minkä » · · ]... vuoksi C-polypeptidi on käyttökelpoinen fuusiopolypeptidin • · · tuottamiseksi, joka voidaan sitten pilkkoa C-polypeptidin ja toisen polypeptidin liitoskohdasta. Fuusioproteiinissa » · *···* 30 voi mahdollisesti olla puhdistustarra, kuten polyhistidii- * * nitarra, eristykseen nikkelikolonnissa, tai vasta-aine- epitooppitarra, edullisesti C-fragmentissa. Pilkkomiskohta • · .*·*. käsittää sekvenssin "GCF", jonka tunnistaa C-polypeptidin • · · proteolyyttinen domeeni, ja jota käytetään toisen polypep- • · · *·* ' 35 tidin pilkkomiseksi C-fragmentista. Samoin keksintöön si- • · 39 sältyy keksinnön mukaista fuusioproteiiinia koodittava po-lynukleotidi.
Keksintö antaa käyttöön myös menetelmän autopro-teolyyttisen fuusioproteiinin tuottamiseksi, jonka mene-5 telmän mukaan kytketään operatiivisesti ensimmäinen poly-nukleotidi, jolloin ensimmäinen polynukleotidi koodittaa ensimmäistä polypeptidiä, joka sisältää keksinnön mukaisen C-polypeptidin proteolyyttisen domeenin ja proteolyyttisen domeenin tunnistaman pilkkomiskohdan, ja toista polypepti-10 diä koodittava toinen polynukleotidi. Kuten edellä on kuvattu, fuusioproteiini voi myös sisältää kantajapeptidin ja/tai puhdistustarran.
C-polypeptidi tai sen funktionaalinen fragmentti on käyttökelpoinen fuusiopartnerina muiden proteiinien lipo-15 fiilisen modifioinnin ja sitomisen aikaansaamiseksi in vivo tai in vitro. Tällaiset fuusioproteiinit voivat olla toivottavia tekijöille, joiden aktiivisuutta tarvitaan paikallisella tavalla joko kohdentamalla DNA-rakenteita spesifisiin soluihin tai käyttämällä spesifisillä DNA-ra-20 kenteilla transfektoituja soluja esimerkiksi. Voi olla toivottavaa lipidimodifioida normaalisti eritetty proteii- • · ni soluliitteisen proteiinin tuottamiseksi. Esimerkiksi ·:··· voi olla toivottavaa tuottaa virusantigeeni, joka pysyy ”·1. soluliitteisenä.
• · • · .·. : 25 Vaihtoehtoisesti C-polypeptidiä tai sen funktionaa- • · · ··. lisiä fragmentteja voidaan käyttää kiinnostavan proteiinin • · · *... fuusiopartnerina (esim. proteiini X fuusioituna hh-C-do- • · · * meeniin). Tällaiset fuusiot muodostavat tioestereitä proteiinin X ja hh-C:n väliseen liitoskohtaan (S -1 N -siirty- ··· -1 *···1 30 män välityksellä) . Tioesterit ovat sitten käytettävissä *·**· substraateiksi peptidiligatointireaktioon, jossa lisätään mikä tahansa peptidi tai proteiini, jonka aminopäässä on • · .···. kysteiini (peptidi Y) , ja jossa tapahtuu spontaani uudel- • · leenjärjestäytyminen (S -1 N -siirtymä) , jonka tuloksena • · · '.1 1 35 proteiinin X ja peptidin Y välille muodostuu stabiili pep- · 40 tidisidos (proteiini X - peptidisidos - peptidi Y). Esimerkiksi in vivo tuotettuna myrkyllinen proteiini voitaisiin tuottaa in vitro käyttäen hh-C-domeeni-fuusioproteii-nimenetelmää.
5 Fuusiopolypeptidi voi myös sisältää mahdollisen kantajapeptidin. "Kantajapeptidi" tai signaalisekvenssi sijaitsee fuusiopeptidisekvenssin aminoterminaalisessa päässä. Eukaryoottien tapauksessa kantajapeptidin arvellaan toimivan fuusiopolypeptidin kuljettamiseksi endoplas-10 misen retikulumin poikki. Eritysproteiini kuljetetaan sitten Golgin laitteiston kautta eritysrakkuloihin ja solun-ulkoiseen tilaan tai edullisesti ulkoiseen ympäristöön. Kantajapeptidejä, joita voidaan käyttää keksinnön mukaan, ovat pre-pro-peptidit, jotka sisältävät proteolyyttisen 15 entsyymin tunnistuskohdan. Hyväksyttäviä kantajapeptidejä ovat kaisitöniinin tai muiden hormonien aminoterminaalinen pro-alue, jossa tapahtuu pilkkominen sivuavissa kaksiemäk-sisissä kohdissa. Kuitenkin tulisi huomata, että keksintö ei rajoitu minkään nimenomaisen peptidin käyttöön kantaja-20 na. Alan ammattilaiset tuntevat muita kantajapeptidejä tai niitä voidaan helposti todentaa ilman ylenpalttista kokei- ! lua.
• · ·;··; Keksinnön yhdessä suoritusmuodossa kantajapeptidi, joka on signaalisekvenssi, sisältyy ilmentämisvektoriin • · .·. : 25 spesifisesti sijaiten fuusiopolypeptidin N-terminaalisen • · · ··. pään vieressä. Tämä signaalisekvenssi sallii fuusiopro- • · · [... teiinin ohjautumisen kohden endoplasmista retikulumia.
• · · * Tyypillisesti signaalisekvenssi koostuu noin 16 - noin 29 aminohapon johtosekvenssistä, joka alkaa kahdella tai koi- • · '···1 30 mella polaarisella tähteellä ja jatkuu tähteillä, joiden *’** hydrofobisten aminohappojen pitoisuus on korkea; muutoin m j1.1. ei ole tunnetun sekvenssin todettavaa säilymistä. Tällai- • · .···. set signaali sekvenssit ovat tuttuja alan ammattilaisille, • · ja niihin lukeutuu siiliproteiinista saatu luonnollisesti • · · *·1 ' 35 esiintyvä signaalisekvenssi.
· 41
Keksinnön mukainen fuusiopolypeptidi käsittää ra-kennegeenin koodittaman polypeptidin, edullisesti fuusio-polypeptidin aminopäässä. Mikä tahansa rakennegeeni ilmentyy C-polypeptidin (polynukleotidin) ja kantajapeptidin 5 yhteydessä. Rakennegeeni on operatiivisesti kytketty kantajaan ilmentämisvektorissa siten, että fuusiopolypeptidi ilmentyy yhtenä yksittäisenä yksikkönä.
Siilin autoproteolyysin N- ja C-domeeniksi identifiointi on käyttökelpoinen seulomismenetelmässä yhdistei-10 den tai koostumusten identifioimiseksi, jotka vaikuttavat tähän prosessointiaktiivisuuteen. Täten toisessa suoritusmuodossa keksintö antaa käyttöön menetelmän koostumuksen identifioimiseksi, joka vaikuttaa hh:n prosessointiin, mikä voidaan määrittää aktiivisuudesta tai geeni-ilmentymi-15 sestä, jolloin menetelmän mukaan inkuboidaan komponentteja, joita ovat testattava koostumus (esim. lääke, pieni molekyyli, proteiini) ja hh-polypeptidi tai siilin ilmentävä yhdistelmä-DNA-solu tai geeni, joka koodittaa sen C-domeenia tai funktionaalista fragmenttia, operatiivises-20 ti kytkettynä N-domeeniin tai sen funktionaaliseen fragmenttiin, olosuhteissa, jotka ovat riittävät, jotka kom- t · i#1.j ponentit olisivat vuorovaikutuksessa keskenään, minkä jäl- ·;··· keen mitataan vaikutus, joka koostumuksella on siiliaktii- visuuteen tai -ilmentymiseen. Siilipolypeptidin tai -poly- • · : 2 5 nukleotidin fragmentteja voidaan käyttää keksinnön mukai- • · · ;·. sessa menetelmässä, kunhan autoproteolyyttinen aktiivisuus • ·♦ *... on tallella (esim. rakenne, joka esitetään esimerkkinä ku- • · · * viossa 12A ja 12B, esimerkki 10) . Havaittu vaikutus hh:hon voi olla joko inhiboiva tai stimuloiva. Esimerkiksi voi- ♦ ·· • · *..·1 3 0 daan määrittää, onko N-domeeni liittynyt soluun vai erite- *·**· täänkö N-domeeni kasvualustaan, toisin sanoen onko tapah- tunut epätäydellinen prosessointi. Tällaisia menetelmiä • · .···. yhdisteen tai koostumuksen vaikutuksen hh:n prosessointiin • · ’·’ määrittämiseksi ovat tässä kuvatut (katso esimerkki 10, • ·· • · 35 kuviot 12A ja 12B) , kuten autoproteolyyttisen pilkkominen 42 ajan funktiona tai pilkkomisen kulku pitoisuusalueiden perusteella. Vaihtoehtoisesti koostumuksen vaikutus hhrhon voidaan määrittää etu- tai takahermomerkkien ilmentymisestä. Alan ammattilaiset tuntevat muitakin menetelmiä koos-5 tumuksen vaikutuksen N:n ja C:n prosessointiin määrittämiseksi. Erilaisia leimoja voidaan käyttää N- ja C-domeenien toteamiseksi, esimerkiksi radioisotooppia, fluoresoivaa yhdistettä, bioluminoivaa yhdistettä, kerniluminoivaa yhdistettä, metallikelaattoria tai entsyymiä voitaisiin 10 käyttää. Alan keskimääräisetkin taitajat tuntevat muitakin sopivia leimoja tai voivat todentaa niitä rutiinikokeita käyttämällä.
Tässä käytettynä "hh-aktiivisuus" seulontamenetelmässä kuvattuna viittaa edullisesti autoproteolyyttiseen 15 aktiivisuuteen. Kuitenkin huomattakoon, että alan taitaja voisi käyttää edellä kuvattua seulontamääritystä koostumuksen identifioimiseksi, jolla on vaikutus muihin hh-ak-tiivisuuksiin, esimerkiksi sinkkihydrolaasiaktiivisuuteen. Alan ammattilaiset tuntevat sopivia määärityksiä tällai-20 siin aktiivisuuksiin vaikutuksen määrittämiseksi.
Seuraavien esimerkkien on tarkoitus havainnollistaa ί#·.: mutta ei rajoittaa keksintöä. Vaikka ne ovat tyypillisiä ·;··· mahdollisesti käyttökelpoisista esimerkeistä, muitakin alan ammattilaisille tuttuja menettelyjä voidaan vaihtoeh- • · .·. : 25 toisesti käyttää.
• ·· • · ;·. Esimerkki 1 t »· *... Siiliproteiiniprosessointi • · · * hh-proteiinin (F) täysimittaisen muodon liike vastaa 46 kD:n suhteellista molekyylipainoa. Kuviot 1(A) ja • · *···1 30 (C) ovat immuuni-blot-siirtokuvia amino- (Abi) ja karbok- ·1’1 si (Ab2) -terminaalisten epitooppien vastaisilla vasta-ai- neilla. GST-fuusioproteiinit, jotka sisälsivät HH-proteii- • · .···. nista joko tähteet 83 - 160 tai 300 - 391, ilmennettiin • · ^ Escherichia colissa, ne puhdistettiin, kuten on suositeltu • · · *·1 ‘ 3 5 (F.M. Ausubel et ai. . "Current Protocols in Molecular Bio- · 43 logy", Greene ja Wiley-Interscience, New York, 1991), ja niillä immunoitiin kaneja standardimenetelmillä. Vasta-aineet af f initeettipuhdistettiinHis6-U-proteiinikolonnissa (E. Harlow ja D. Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual", 5 Cold Spring Harbor Laboratoty"; Cold Spring Harbor, NY, 1988), jossa proteiini oli kytketty Affi-Gel 10 -helmiin (Bio-Rad). Puhdistus suoritettiin kuvatun mukaisesti (Harlow ja Lne, suora) lukuun ottamatta, että happo- ja emäs-eluointinesteet sisälsivät 10 % dioksaania. Biotinyloituja 10 hh-vasta-aineita valmistettiin puhdistamalla kanivastasee-rumi proteiini A -kolonnissa, minkä jälkeen biotinyloitiin käyttäen Immunoprobe-biotinylointipakkausta (Sigma). Im-muunisaostukset suoritettiin, kuten on kuvattu (Harlow ja Lane) käyttäen kylmää RIPA-lyysipuskuria, joka sisälsi pi-15 toisuudet 0,25 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridi (PMSF) ja 5 mM EDTA kudoshomogenisointiin. Lysaatit esikirkastet-tiin kahdesti esi-immuunikaniseerumilla + proteiini A -helmillä (Gibco-BRL). Sitten lisättiin affiniteettipuh-distettuja vasta-aineita tai esi-immuuniseerumia, ja im-20 muunisaostus suoritettiin proteiini A -helmillä käyttäen pesuihin NP-40-lyysipuskuria.
• · ·.1♦· Immuuni-blot-siirtokopiot toteutettiin affiniteet- *:2 3: tipuhdistetulla Abl:llä tai Ab2:lla jommallakummalla kah- desta kemiluminointiin perustuvasta protokollasta. Ensim- • » : 25 mäisessä protokollassa (jota käytettiin kuvioihin 1, 3 ja • · ;·. 5) näytteet liuotettiin 10-%: isiin tai 12-%: isiin SDS-po- • «· lyakryyliamidigeeleihin (F.M. Ausubel et ai. . supra) ja • · · siirettiin Magnagraph-nailonmembraaneille (MSI) sähköisellä blot-siirrolla. Blot-kopiot kehitettiin käyttäen ai- • · *···' 30 kaliseen fosfataasiin konjugoitua aasin sekundaarista an- * 1 tikani-IgG-vasta-ainetta ja Lumi-Phos 530 valmistetta (Boehringer Mannheim) suositusten mukaisissa olosuhteissa.
• · .··1. Toisessa protokollassa (jota käytettiin kuviossa 8) näyt- • · ··· teet siirettiin nitroselluloosasuodattimille (Schleicher 2 ··· • · · 3 ' 35 ja Schiill) , ja blot-kopiot kehitettiin käyttäen ECL-rea- • · 44 genssia (Amersham) suositusten mukaan. Sekundaarivasta-aine oli tässä tapauksessa piparjuuriperoksidaasiin konju-goitu vuohen antikani-IgG (Jackson ImmunoResearch). Vyöhykkeet sisältävät proteiinia indusoiduista ei-transfek-5 toiduista S2-soluista (vyöhykkeet 1 ja 13) , transfektoi-duista S2-soluista, jotka oli indusoitu ilmentämään hh (vyöhykkeet 2 ja 14), imaginaalilevyistä (vyöhykkeet 3 ja 15), villityyppialkioista (vyöhykkeet 6 ja 18) ja synteettisen h-mRNA:n in vitro -translaatioista mikrosomien sekä 10 läsnä ollessa (vyöhykkeet 5 ja 17) ja puuttuessa (vyöhykkeet 4 ja 16).
Eri hh-proteiinilajeja koodittavia cDNA-sekvenssejä kloonattiin pMK33-vektoriin, joka mahdollistaa indusoitavan ilmentymisen metallotioneiinipromoottorin kontrollissa 15 [M.R. Koelle et ai., Cell 67 (1991) 59] . Stabiileja S2-so- lulinjoja tehtiin hh/pMK33-plasmidien transfektoinnilla valikoiden jatkuvasti hygromysiiniresistenssin suhteen. Proteiinit ilmennettiin maljaamalla solujen log-faasivil-jelmää laimennettuna 0,1 A595-yksi kköön, odotettiin 48 tun-20 tia, suoritettiin indusointi lisäämällä CuS04:ää loppupi-toisuuteen 0,2 mM ja otettiin talteen solut ja/tai super- • · ·.’·· natantti 24 tuntia myöhemmin. Solunäytteet immuuni-blot-
*ί**ί siirtoihin valmistettiin lisäämällä 10 tilavuutta IX SDS
PAGE -panostuspuskuria solujen pelletoimiseksi.
:*·.· 25 In vitro -translaatiot suoritettiin käyttäen TNT- • · Γ. kytkettyä transkriptio-translaatiosysteemiä (Promega) . 35S- metioniinia (DuPont NEN) käytettiin detektointiin auto- • · · radiografisesti . Hepariinisitoutumiskokeessa in vitro ... -translaatiolysaattia villityypin hh-proteiinia tuottavil- •*\ 30 la mikrosomeilla lisättiin hepariiniagaroosi- (Sigma) tai
Sepharose CL-4B (Pharmacia) -helmiin, joita oli edeltäpäin
:V: tasapainoitettu hepariinisitoutumispuskurissa [HBB; 20 mM
:***: Tris (7,4), 150 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100 -valmistetta).
• · · .;. Näytteitä inkuboitiin 4 °C-.ssa 4 tunnin ajan niitä kevyes- • · · • · · • . 35 ti keinuttaen. Helmien pelletoinnin jälkeen supernatantit • · 45 joistakin näytteistä analysoitiin (vyöhykkeet 2 ja 4) . Sitten helmet pestiin 5 kertaa jäähdytetyllä HBB:llä, minkä jälkeen näytteet (vyöhykkeet 3 ja 5) eluoitiin 80 °C:ssa 10 minuutissa SDS PAGE -panostuspuskurissa (F.M. Ausubel 5 et ai.. supra) .
Alkioita villityypin Canton-S-linjasta ja pariutumisista hshh/hshh tai hshh H329A/hshh H329A X y; Sco/CyO, enlacZll::wg [Kassis et ai . Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 (1992) 1919] kerättiin 0-16 tunnin kuluttua munimisesta 10 (AEL) 25 °C:ssa. Niille aiheutettiin 30 minuutin lämpösokki 37 °C:ssa, minkä jälkeen niiden annettiin toipua 1 tunnin ajan 25 °C:ssa. Alkiot kuviossa 1 (Canton-S) kerättiin 4 -8 tuntia AEL 25 °C:ssa. Valmistauduttaessa immuuni-blot-siirtoihin kaikki alkiot dekorionoitiin 2,6-%:isessa nat-15 riumhypokloriitissa ja homogenisoitiin 10 tilavuudessa IX SDS PAGE -panostuspuskuria.
Monia lajeja todettiin, ja vähäisiä ristireaktiivi-sia nauhoja havaitaan useimmissa näytteissä mukaan lukien uutteet indusoiduista ei-transfektoiduista S2-soluista 20 (vyöhykkeet 1 ja 13) . Yksi näistä nauhoista (joka esiintyy molemmissa paneeleissa) kulkee yhdessä U.-n kanssa (kohdas- • · ·.*·· sa 39 kD) ja sitä esiintyy erityisen runsaasti kuvion 1(A) *!’*! vyöhykkeessä 6 .
Kuviot 1(B) ja (D) ovat blot-siirtokuvia näytteis-·’·.· 25 tä, jotka saostettiin Abl:llä (B, vyöhykkeet 7-9), Ab2 j‘.#> (D, vyöhykkeet 19 - 21) tai esi-immuuniseerumilla (B, vyö- hykkeet 10 - 12 ja D, vyöhykkeet 22 - 24) . Detektointi • « · suoritettiin Abi:n (B) ja Ab2:n (D) biotinyloiduilla joh- ... dannaisilla. Käytetyt näytteet olivat: indusoidut ei- • · ·*·. 30 transf ektoidut S2-solut, vyöhykkeet 7, 10, 19 ja 22; transfektoidut S2-solut, jotka oli indusoitu ilmentämään hh, vyöhykkeet 8, 11, 20 ja 23; ja alkiot, vyöhykkeet 9, :***; 12, 21 ja 24. Kumman tahansa vasta-aineen kohdalla hh-pro- »·« .1. teiinif ragmentit immuuni saostettiin spesifisesti hh:n il- • · · ’ . 35 mentävistä soluista ja alkioista, mutta ei ei-transfektoi- • · 46 duista soluista. (E) Kaaviollisessa diagrammissa pilkko-miskohdat on merkitty nuolilla. Tähdellä merkitty pilkko-miskohta päätellään vain yhden pilkkomistuotteen identifikaatiosta, jolloin se voi esiintyä toisessa kohdassa 5 C-fragmentissa. Ensimmäiset kaksi pylvästä diagrammin oikeanpuoleisessa osassa osoittaa Abl:n ja Ab2:n reaktiivisuutta kunkin hh-fragmentin suhteen. Muut pylväät osoittavat kunkin hh-fragmentin läsnäoloa (+) tai puuttumista (-) eri näytteistä. Sulut F:n ja Nss:n ympärillä merkitsevät, 10 että nämä lajit havaitaan translaatioreaktioissa in vitro mutta ei in vivo.
46 kD:n laji todettiin in vitro -translaatiouut-teista Abl:llä ja Ab2:lla (kuvio 1, vyöhykkeet 4 ja 16), ja se muuttui osittain lajiksi 39 kD (U) , silloin kun 15 translaatio tapahtui mikrosomien läsnä ollessa (kuvio 1, vyöhykkeet 5 ja 17) . 39 kD:n laji, joka liikkuu yhdessä U:n kanssa, esiintyy myös uutteissa kaikista in vivo -lähteistä, mutta mikään näistä uutteista ei sisällä todettavia tasoja F:ää. U edustaa F:n signaalipilkottua muotoa; 20 signaalipilkkominen vaikuttaa siten suhteellisen tehottomalta in vitro, kuten aiemmin on raportoitu [J.J. Lee, et !/·· ai. , Cell 71 (1992) 33] , mutta on erittäin tehokasta in ·:··; vivo. Sen vahvistamiseksi, että signaalipilkkominen todel- ·*·*; la tapahtuu tässä epätavallisessa sisäisessä kohdassa, ψ m : 25 tehtiin mutaatio, joka vaihtaa tähteen S84 Niksi ennuste- • · tussa signaalipilkkomiskohdassa. Tämä mutaatio esti F:n • ## #·.·β konversion U:ksi mikrosomeilla ja tuotti myös lajin, joka • · · kulki yhdessä F:n kanssa transfektoitaessa S2-soluviljel-mään. Tarkasteltiin myös kahden signaalisekvenssistä ylä- • · *···* 30 virtaan sijaitsevan met ioni inikodonin riippumattoman muta- * * genisoinnin vaikutuksia. Sekvenssin in vitro -translaa- ·*·*· tiossa, jossa ensimmäinen metioniini poistetaan, muodostuu • · .··*. proteiinilaj i, jonka liikkuvuus on F:n ja U:n väliltä, ja ··# tämä laji muutetaan lajiksi, joka kulkee yhdessä U:n kans- • · · *·* * 35 sa mikrosomien läsnä ollessa tai tuotettuna in vivo. Toi- • · 47 sen metioniinikodonin muuttaminen ei aiheuttanut mitään muutosta in vivo tai in vitro tuotetun hh-proteiinin elektroforeettiseen liikkeeseen.
Pienempiä Hh-proteiinilajeja in vivo -lähteistä on 5 raportoitu aiemmin [T. Tabata ja T.B. Kornberg, Cell 76 (1994) 89]. Viimeksi mainitussa tutkimuksessa ei tutkittu endogeenisiä proteiinejä, vaan proteiineja, jotka oli indusoitu ilmentymään korkeina tasoina eksogeenisesti tehdyistä rakenteista. Käytetty vasta-aine ei erottanut epi-10 tooppeja molekyylin selkeistä osista.
Signaalipilkkomisen lisäksi U-prekursorin lisäpilk-kominen on vastuussa muiden, in vivo havaittujen hh-pro-teiinimuotojen muodostamisesta. Tämä pääteltiin siitä havainnosta, että sekä Abi että Ab2 totesivat U (ei-pilko-15 tun) -lajin, mutta olivat myös yksittäin vuorovaikutuksessa pienempien proteiinilajien kanssa, jotka ilmentyivät endogeenisesti alkioissa ja imaaginaalilevyissä, tai lajien kanssa, jotka ilmentyivät vietäessä hh-geeni S2-so-luihin. Abi on siten vuorovaikutuksessa 19 kD:n lajin 20 kanssa kaikista näistä kudoksista (kuvio 1, vyöhykkeet 2, 3, 6, 8, 9) , kun taas Ab2 on vuorovaikutuksessa 25 kD:n lajin ja 16 kD:n lajin kanssa (kuvio 1, vyöhykkeet 14, • · • ;..j 156, 18, 20, 21) . 19 kD:n lajia kutsutaan tästä eteenpäin N:ksi (N-terminaalinen fragmentti), 25 kD:n lajia C:ksi • · ; 25 (C-terminaalinen fragmentti) ja 16 kD:n lajia C°:ksi; nämä • · · .1 * läjit edustavat in vivo esiintyvän endogeenisen hh-pro- • ♦ · *... teiinin pääasiallisia muotoja.
• · · *·* * Ehdotetut pilkkomiset, joissa nämä lajit muodostu vat, esitetään kaaviollisesti kuvion 1F alaosassa. Abi ja ««· 30 vastaavasti Ab2 toteavat ainutkertaisesti N- ja C-lajit, ja kahden pienemmän lajin suhteellisten massojen summa on suurin piirtein sama kuin U:n suhteellinen massa. F- ja • · · • · .···. U-lajien elektroforeettiset liikkuvuudet ovat jonkin ver- • · ran varianssissa niiden ennustettujen suhteellisten mas- • · · *.· * 35 sojen kanssa (52,1 kD ja vastaavasti 43,3 kD) . Näiden la- • · 48 jien identiteetit vahvistettiin erilaisten avointen siili-lukualueiden in vitro -translaatiolla, jolloin lukualueita oli modifioitu sisältämään eri määrin sekvenssiä NH2- tai COOH-päässä, ja insertoimalla epitooppitarroja. Migraation 5 epänormaaliudet vaikuttavat liittyvän proteiinilajeihin, joissa esiintyvät samanaikaisesti sekvenssejä sekä Nidettä COOH-terminaalisista fragmenteista. NH2- ja COOH-ter-minaalisten fragmenttien liikkuvuudet sitä vastoin vastaavat suhteellisia massoja (19 kD ja vastaavasti 25 kD) , 10 joiden summa on 44 kD, joka on suurin piirtein sama kuin U:n odotuksia vastaava suhteellinen massa.
Yksinkertainen mekanismi, joka voisi selittää kahden pienemmän lajin johdannaismuodostuksen, olisi tämän vuoksi U-prekursorin yksittäinen sisäinen pilkkominen, hh-15 proteiinin prosessoinnissa translaation in vitro yhteydessä syntyy myös 25 kD:n laji (C; vyöhykkeet 16 ja 17) ja joko 2 9 kD:n tai 19 kD:n (N) laji (vyöhykkeet 4 ja 5) . 19 kD:n laji kulkee yhdessä N:n kanssa, ja sen muodostuminen on riippuvainen mikrosomien läsnäolosta, mikä sopi 20 siihen ehdotukseen, että N muodostuu F:stä signaalipilkko-misen ja sisäisen lisäpilkkomisen tuloksena. Kaiken kaik-^•.j kiseen reittiin in vivo havaittujen pääasiallisten hh-pro- ····· teiinimuotojen muodostamiseksi vaikuttaa siten liittyvän jV. F:n signaalipilkkominen U:n muodostamiseksi. U pilkotaan • · : 25 sitten sisäisesti N:n ja C:n muodostamiseksi, jotka ovat • «· j·. pääasialliset in vivo tavatut muodot. 25 kD:n C-lajin jät- • · · koprosessoinnissa saattaisi sitten muodostua 16 kD:n C°-la- • · · • · · * jia, mutta se, onko tämä prosessointi yksittäinen pilkko-mistapahtuma vai ei, ei ole selvää, koska Ab2 ei tunnista • · *···' 30 pienempää 9 kD:n fragmenttia, joka olisi tuloksena. C:n * * prosessointi C°:n muodostamiseksi vaikuttaa tapahtuvan te- hokkaammin imaginaalilevyissä alkioihin verrattuna (vertaa * · .*··. vyöhykkeitä 15 ja 18) ; tämän saattaa aiheuttaa imaginaali- • · · levyjen laajempi massaeristysmenettely [O.M. Eugene et '·’ * 35 ai. , Tissue Culture Assn. Man. 5 (1979) 1055] .
• · 49
Esimerkki 2
Siiliproteiinin autoproteolyysi
Endogeenisen ja in vitro -muodostetun hh-proteiini-lajin komigraatio viittasi siihen, että in vitro -proses-5 sointi on samankaltainen kuin se, joka havaitaan in vivo. Kuviossa 2 esitetään hh-proteiinien ja seriiniproteinaa-sien välinen rajoitettu sekvenssisamankaltaisuus. hh-pro-teiinisekvenssit asettuvat Dj. melanogaster -proteiinin tähteiden 323 - 329 rinnalle, jotka numeroidaan asemiksi 10 1-7 (ryhmä A). Säilyvät hh-tähteet on merkitty lihavoi duilla kirjaimilla. Nisäkässeriiniproteinaasien (ryhmä B) katalyyttiset histidiinit (A.J. Barrett julkaisussa "Proteinase Inhibitors", A.J. Barrett, G. Salvesen, toim., Elsevier, Amsterdam, 1986, s. 3 - 22) asettuvat muuttumat-15 toman histidiinin Hh-proteiinin asemassa 7 rinnalle. Lyhenteet ovat seuraavat: C-Shh, kananpojan "Sonic"-hh [R.D. Riddle et ai., Cell 75 (1993) 1401]; M-Shh, hiiren "So nic"-hh [Y. Echelard et ai.. Cell 75 (1993) 1417] {identtinen Hhg-1; R vhh-1, rotta vhh-1 nähden [H. Roelink et 20 ai. . Cell 76 (1994) 761]}; Z-Shh, seeprakalan "Sonic"-hh [S. Krauss et ai. . Cell 75 (1993) 1431] [identtinen • · shh:hon nähden ja seeprakala vhh-1 (H. Roelink et ai.. ·;··: supra) ] ; twhh, ei muuta lyhennettä; M-Dhh, hiiren "De- sert" - hh [Y. Echelard et ai. . Cell 75 (1993) 1417]; M-Ihh, • · : 25 hiiren "Indian"-hh (Y. Echelard et ai. , supra) ; CHT, nau- • ♦ · ;·. takymotrypsiini ; TRP, naut at rypsiini; ELÄ, sikaelastaasi; • « · UKH, ihmisen urokinaasi; C1R, ihmisen kömpiementtitekijä • · · * 1R; CIS, ihmisen kömpiementtitekijä IS; MCP, rotan syöttö-soluproteaasi; FAX, ihmisen veren hyytymistekijä X; TPA, • · *···’ 30 ihmisen kudosplasminogeeniaktivaattori.
* 1 2 3 Kuviossa 2 esitetään, että 7 tähteen alue hh-koodi- tussekvenssistä (tähteet 323 - 329 Drosophila-proteiinis- * · .···. sa) osoittaa jonkin verran samankaltaisuutta seriinipro- • · teaasisekvensseihin nähden. Tämä alue sijaitsee noin 2/3 2 • · · ' • · · 3 1 35 matkasta signaalipilkkomiskohdasta karboksipäähän, ja se • « 50 sisältää Thr:n ja His:in, tähteet (asemat 4 ja 7 kuviossa 2), jotka ovat muuttumattomia kaikkien lajien kaikissa hh-sekvensseissä. Seriiniproteaaseissa tämä säilyvä sekvenssi sisältää muuttumattoman His:in, joka toimii yleisemäksenä 5 katalyysissä (A.J. Barrett julkaisussa "Proteinase Inhibitors", A.J. Barrett, G. Salvesen, toim., Elsevier, Amsterdam, 1986, s. 3 - 22).
Sen määrittämiseksi, esittääkö tämä muuttumaton His-tähde hh-proteiinissa todella osaa autoproteolyysissä, 10 puhdopuhdistettiin kaksi proteiinia Ek. colista: yksi käsitti villityyppisekvenssin ja toinen His-kodonin asemassa 329 (H329A) substituution Ala-kodonilla. Molemmat nämä proteiinit manipuloitiin sisältämään heksahistidiinitarran aminopäässä fuusioituna Drosophila-sekvensseihin, jotka 15 jatkuvat juuri signaalipilkkomiskohtaa edeltävästä tähteestä karboksipäähän (tähteet 83 - 471; tämän proteiinin villityyppimuotoa kutsutaan His6-U:ksi) . Kumpaakin proteiinia puhdistettiin perusteellisesti denaturoivissa olosuhteissa käyttäen Ni++-kelatointimatriisia. Kuviossa 3(A) 20 esitetään Coomassie-sinisellä värjätty polyakryyliamidi-geeli, josta ilmenee His6-U- ja His6-UH329A-proteiinien tuo- • · :/·· tanto ja puhdistus Eh_ colista. Näytteet olivat molekyyli- *:*·: painomerkit (vyöhykkeet 1 ja 2) ; lysaatit Eh_ coli -soluis- ·’·*: ta, jotka käsittivät His6-U-ilmentämisrakenteen indusoimat- • * • 25 ta (vyöhyke 3) ja indusoiden (vyöhyke 4) IPTG:llä; puhdis- e · ;·, tettu His6-U-proteiini (vyöhyke 5) ; lysaatit Eh_ coli -so- • · · luista, jotka käsittivät His6-UH329A-ilmentämisrakenteen in- • · · dusoimatta (vyöhyke 6) ja indusoiden (vyöhyke 7) IPTG:llä; ... puhdistettu His6-UH329A-proteiini (vyöhyke 8) . Puhdistetut • · *···| 30 proteiinit olivat oleellisesti homogeenisia lukuun otta matta lukuisia vähäisiä lajeja, joiden suhteellinen massa oli alhaisempi; nämä lajit ovat täysimittaisten proteii- • · .***. nien endogeenisiä hajoamistuotteita, koska ne puuttuivat • · · ei-indusoiduista uutteista ja voitiin todeta hh-vasta-ai- • · · "·’ ’ 35 neilla. Kuviossa 3 (B) esitetään Ab2:lla todettu immuuni- • · 51 blot, jossa näkyy hh:n ilmentämään indusoituja transfek-toituja S2-soluja (vyöhyke 1) ; His6-U- ja His6-UH329A-pro-teiinit, joita on inkuboitu pilkkomisreaktiopuskurissa 0 tunnin ajan (vyöhykkeet 2 ja 5); 20 tunnin ajan (vyöhyk-5 keet 3 ja 6); ja 20 tunnin ajan pitoisuuden 20 mM TAME (seriiniproteaasi-inhibiittori) läsnä ollessa (vyöhykkeet 4 ja 7) . Inkuboinnissa His6-U- mutta ei His6-U-H329A-pro-teiinista vapautui fragmentti, joka oletettiin C:ksi, koska se reagoi Ab2:n kanssa ja kulki yhdessä S2-soluissa 10 tuotetun C:n kanssa. TAME inhiboi vain osittain C:n vapautumisen (vyöhyke 3).
Alustavia proteinaasi-inhibiittoritutkimuksia on suoritettu in vitro translaation läpikäyneellä Hh-proteii-nilla lisäämällä eri inhibiittoreita translaatioreaktion 15 alkaessa. Näitä tutkimuksia on mutkistanut se seikka, että lukuisat proteaasi- inhibiittorit laskevat tai salpaavat translaatiotehoa. Joissakin tapauksissa inhibiittorin tehokkuus määritettiin määrittämällä, inhiboiko inhibiittorin lisääminen valmiiseen translaatioreaktioon sitä auto-20 prosessointia, joka normaalisti edelleen tapahtuu. Tällä hetkellä voimme varmuudella esittää vain seuraavaa: (i) seriiniproteaasi-inhibiittori TAME (p-tolueenisulfonyyli-·;··· L-arginiinimetyyliesteri) inhiboi in vitro translaation läpikäyneen Hh-proteiinin autoproteolyysiä; (ii) soija- • · .·. : 25 paputrypsiini - inhibiittori, al anti-trypsiini, aprotinii- • · · .* * ni, leupeptiini ja E-64 eivät salpaa translaation läpikäy- • ·· *... neen Hh-proteiinin autoproteolyysiä; ja (iii) TAME inhiboi • · · • · · * osittain puhdistetun His6-U-proteiinin autoproteolyysin (kuvio 3, paneeli B).
··· • · 3 0 Kuten nähdään kuviosta 3B, laimennettaessa denatu- *·’*· roivaa ainetta villityyppiproteiinistä, mutta ei H329A-mu- tanttiproteiinista, vapautui 25 kD:n laji, joka voitiin • · .···. todeta Ab2:lla, ja joka oli liikkeessään identtinen C-la- • · *·* jiin nähden, jota muodostui translaatioissa in vitro ja • · · *.· * 35 jota esiintyy erilaisissa in vivo -lähteissä. Tämä pilkko- • · 52 minen havaittiin myös silloin, kun villityyppiproteiini puhdistettiin ja renaturoitiin muilla protokollilla ja pilkottiin selkeissä olosuhteissa. His6-U- ja his6-UH329A-proteiineja koodittavia plasmideja muodostettiin insertoi-5 maila sekvenssejä, jotka vastasivat tähteitä 83 - 471 vil-lityyppi- tai hh-H329A-ORF:stä pRSETB-ilmentämisvektoriin (Invitrogen) . Proteiineja indusoitiin BL21(DE3)/pLys E. coli -soluissa, kuten on kuvattu (F.M. Ausubel et ai.. suora) . Peruspuhdistus suoritettiin Ni-NTA-agaroosihelmil-10 lä (Qiagen) denaturointiprotokollalla käyttäen 6 M guani-dinium-HCl:ää ja 8 M ureaa oleellisesti, kuten on kuvattu (yksityiskohtainen protokolla käytetyistä tarkoista olosuhteista on saatavana pyydettäessä). Pesut sisälsivät 0,2 % Tween-20-valmistetta ja pitoisuuden 5 mM β-merkapto-15 etanoli. Viimeinen pesupuskuri oli: 6 M urea, 100 mM Tris, 500 mM NaCl, 20 % glyserolia (pH 7,4). Eluutiot suoritettiin viimeisellä pesupuskurilla, joka sisälsi pitoisuuden 250 mM imidatsoli. Pilkkomisreaktiot in vitro suoritettiin inkuboimalla puhdistettua proteiinia (laimennettuna 1:30 20 lopulliseen seokseen) pilkkomispuskurissa [50 mM Tris, 500 mM NaCl, 5 % glyserolia, 0,2 % Triton-X-100-valmistetta, :\i 50 mM DTT (pH 7,4)]. Liukoisen täysimittaisen His6-U-pro- *:··· teiinin eristämiseksi, joka ei sisällä denaturoivia ai- j·.'. neita tai detergenttejä, suoritettiin lisävaiheita (tämä • · .·. : 25 viittaa muihin renaturointiprotokolliin, jotka mainitaan • · · ;·4 ’ tekstissä) . Täysimittaista proteiinia edellä kuvatusta • · ♦ *... eluaatista puhdistettiin edelleen hajoamistuotteista saos- ♦ · · • ♦ · * tamalla, poistamalla urea diaysoimalla. Sakka uudelleen-liuotettiin sitten puskuriin, joka sisälsi guanidinium- • · *·..* 30 HC1:ää, ja liuos panostettiin toiseen Ni-NTA-agaroosiko- *·’*· lonniin. Pesun jälkeen kuvatun mukaisesti proteiini uudel- leenlaskostettiin (helmiin kiinnitettynä) laimentamalla • · .···. ureaa vähän kerrassaan (6 M -* 0,5 M) laimennospuskuril- • · la [100 mM Tris, 500 mM NaCl, 20 % glyserolia (pH 7,4)] '.* * 3 5 8 tunnin aikana 4 °C:ssa. Proteiini eluoitiin laimennospus- • · 53 kurilla, joka sisälsi pitoisuudet 250 mM imidatsoli ja 0,5 M urea. Eluaattia dialysoitiin liuosta vastaan, joka sisälsi pitoisuudet 100 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 % glyserolia (pH 7,4), 4 °C.ssa ja se varastoitiin -70 °C:seen.
5 Esimerkki 3 hh:n autoproteolyyttisten funktioiden kartoitus Tästä autoproteolyysitapahtumasta vastuussa olevan hh-proteiinidomeenin täsmällisemmäksi määrittämiseksi tarkasteltiin usean eri tyypin mutaatioiden vaikutuksia in 10 vitro -prosessointiin. Eniten tietoa antava mutaatio oli deleetio, joka poistaa tähteet 89 - 254 (Δ89-254) , jotka yhdessä muodostavat valtaosan aminohapoista molekyylin siinä osassa, jonka oletetaan muodostavan N-fragmentin. Esitetään villityyppi- ja mutantti-Hh-proteiinien Drosop-15 hilasta (kuviot 4A - C) ja seeprakalasta (kuvio 4D) in vitro -translaatioita. Mutaatioiden ja pilkkomiskohtien (nuolet) sijainnit näissä proteiineissa esitetään kaaviol-lisesti (kuvio 4E). Drosophila-proteiinissa (kuviot 4A; B ja C) autoproteolyysin salpaavat tai sitä inhibioivat voi-20 makkaasti useat mutaatiot COOH-päässä (H329A, 294 trunc, 410 trunc, flu408 ja 456 trunc), mutta siihen ei vaikuta suuri deleetio (Δ89-254) tai flu-tag-epitooppitrimeerin ·;··· (flu227) insertointi NH2-päähän. Autoproteolyysi on täten ·*.*. pääasiassa riippuvainen tähteistä C-fragmentin puitteissa • · .·. : 25 (sekvenssit oikealle pilkkomiskohdasta esitetyssä kaavios- • · · ;·. sa; katso kuvio 1). Edelleen H329A/flu227-kaksoismutantti • ·· *... ei tule pilkotuksi villityyppiproteiinin toimesta sekoi- • · · ’ tuskokeessa (vyöhyke 11), mikä viittaa siihen, että auto proteolyysin mekanismi on solunsisäinen. Seeprakalageenien • · ’···* 30 twhh ja shh koodittamat Hh-proteiinit osoittavat samankal- : *· täistä prosessointikuviota (D) kuin Drosophila-proteiinin.
vaikkakin kummankin seeprakalaproteiinin (23 kD twhh: lie • · .···. ja 22 kD shh: lie) NH2-terminaali sen fragmentin näennäinen • · #*# massa on alhaisempi kuin COOH-terminaalisen fragmentin (25 • · · *·* * 35 kD twhh:lle ja shh:lle). Tämä on seurausta lyhyemmästä • · 54 signaalisekvenssejä edeltävästä tähdejaksosta Drosophila-proteiiniin verrattuna. Prosessoinnin salpaavat H273A- ja H270A-mutaatiot twhh- ja vastaavasti shh-proteiineissa (analoginen H329A-mutaatioon nähden Drosophila-proteiini s -5 sa) , mikä viittaa siihen, että käytetty autoproteolyysime-kanismi on samankaltainen kuin Drosophila-proteiinilie havaittu.
In vitro -translaatiot suoritettiin käyttämällä TNT-kytkettyä transkriptio-translaatiosysteemiä (Promega) . 10 35S-metioniinia (DuPont NEN) käytettiin detektointiin auto-radiografisesti. Hepariinisitoutumiskokeessa (kuvio 8C) in vitro -translaatiolysaattia ja villityyppi-Hh-proteiinia tuottavia mikrosomeja lisättiin hepariiniagaroosi- (Sigma) tai Sepharose CL-4B (Pharmacia) -helmiin, joita oli edel-15 täpäin tasapainoitettu hepariinisitoutumispuskurissa [HBB; 20 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100) .
Näytteitä inkuboitiin 4 °C:ssa 4 tunnin ajan kevyesti sekoittaen. Helmien pelletoinnin jälkeen analysoitiin supernatant it joistakin näytteistä (vyöhykkeet 2 ja 4). Helmet 20 pestiin sitten 5 kertaa jäähdytetyllä HBB:llä, minkä jälkeen näytteitä (vyöhykkeet 3 ja 5) eluotiin lämpötilassa ί.*·ί 80 °C 10 minuutin ajan SDS-PAGE-panostuspuskurilla (F.M.
*:·*: Ausubel et ai. . supra) .
·*·'; Kaikki mutaatiot hh-geeniin muodostettiin plasmi- • · 25 dissa pFl (J.J. Lee et ai. , supra) . Mutaatiot seeprakalan • · ;·, twhh- ja shh-geeneihin muodostettiin alkuperäisillä cDNA- • · · klooneilla, kuten on kuvattu [Ekker et ai. . Current Biolo- • · · ’ gy, 5.:8 (1995) 944]. Kaikki pistemutaatiot muodostettiin käyttämällä yhdistelmä-DNA-ympyrä-PCR:ää [D.H. Jones ja • · *···* 30 S.C. Winistorfer, Biotechniaues 12 (1992) 528]. flu408- ja * * flu227-mutaatiot muodostettiin insertoimalla influenssahe- m :V: magglutiniiniantigeenin trimeeri (42 tähdettä flu408:lle • · .·**. ja 43 tähdettä flu227:lle) hh-ORF:llä esiintyviin AlwNI- ··· ja Bgll-kohtiin (nukleotiditasemat 1 604 ja vastaavasti • · · *·* * 35 1 058) (J.J. Lee et ai. , supra) . Δ89-254-mutaatio muodos- • · 55 tettiin poistamalla sekvenssejä EcoNI-kohdan (644) ja Pmll-kohdan (1 145) välistä. 294 trunc -mutaatio muodostettiin poistamalla sekvenssejä Accl-kohdan (1 265) ja
XcmI-kohdan (1 792) välistä. 410 trunc -mutaatio muodos-5 tettiin aiemmin ja identifioitiin Uhaksi (J.J. Lee et ai. . suora) . Mutaation hh-13E-alleelissa (emäsmuutos C1 756 -» A; kooditusmuutos Tyr457 h> STOP) kartoittamiseksi hh13E/ TM3:sta eristettyä DNA:ta käytettiin alukkeena PCR-reak-tioissa, joissa muodostettiin hh-ORF ja sivuavia sekvens-10 sejä, jotka alakloonattiin Bluescript KSM:ään (Stratage-ne) . Sekventoitiin kulloinkin kuusi kloonia, jotka oli saatu kahdesta eri PCR-monistamisesta.
Kuten nähdään kuvion 4A vyöhykkeissä 1 ja 2, tämä rakenne muodostaa täysimittaisen lajin, jonka liike vastaa 15 odotettua suhteellista massaa 33 kD, ja kaksi pilkottua tuotetta, joiden näennäisten suhteellisten massojen (25 ja 9 kD) summa on sama kuin suuremman lajin suhteellinen massa. Pilkotuista tuotteista pienempi kulkee ajoittain kahtena nauhana, kuten nähdään kuviosta 4A. Valitsimme alhai-2 0 semman näistä kahdesta nauhasta 14,3 kD:n ja 6,2 kD:n merkkien väliltä molekyylipainomittaukseemme. Suurempi ky-seisistä kahdesta pilkotusta tuotteesta kulkee yhdessä ·;··· vi 11 ityyppiproteiinistä tuotetun C-lajin kanssa, mikä ·*·'. viittaa siihen, että Δ89-254-hh-proteiini sisältää normaa- • · : 25 listi C:ssä esiintyvät tähteet ja kaikki autoproteolyysiin • · · • · ;·. vaaditut määreet, mukaan lukien normaali pilkkomiskohta; • · · *... useimmat tähteet N:n puitteissa eivät ole välttämättömiä • · · * autoproteolyyttiselle aktiivisuudelle.
Sitä vastoin vauriot, jotka vaikuttavat tähteisiin, • · ’···* 30 joiden oletetaan sijaitsevan C:n puitteissa, salpaavat * * autoproteolyysin in vitro. Kaikkia in vitro -translaatios- sa testattuja mutaatioita tarkasteltiin myös S2-soluissa * · .·*·. käyttäen blot - immuunimääritystä . Kaikissa tapauksissa • · · pilkkomiskuviot S2-soluissa olivat identtiset translaa- • · · *·’ 35 tioissa havaittuihin nähden lukuun ottamatta, että C*:tä • · 56 esiintyi aina, kun C:tä muodostui. Edellistä fragmenttia ei havaittu translaatioissa. Näitä ovat H329A-mutaatio, jota kuvattiin edellä, mutaatio, joka insertoi influenssa-virusepitoopin tähteiden 408 ja 409 (flu408) väliin, ja 5 kolme mutaatiota, jotka aiheuttavat proteiinin ennenaikaisen päätöksen karboksipäässä. Kaksi rajuinta typistystä, 294 trunc ja 410 trunc, ovat in vitro muodostettuja mutaatioita. Ne aiheuttavat 177:n ja vastaavasti 61 tähteen menetyksen proteiinin karboksyylipäästä, eikä kummassakaan 10 tapahdu proteolyysiä. 456 trunc -hh-proteiini on kuten EMS-indusoidun hh13E-mutanttialleelin koodittama, jossa on 15 tähteen menetys proteiinin karboksipäässä. Tässä proteiinissa tapahtuu autoproteolyysi, kuten osoittaa 24 kD:n nauhan ilmaantuminen C:n tilalle, mutta reaktion tehokkuus 15 kärsii paljon in vitro (kuvio 4B). hh-proteiinin autoproteolyysi perustuu pääasiassa C:n puitteissa sijaitseviin tähteisiin; tähteiden tällä domeenilla deleetioon tai muutokseen liittyy laskenut prosessointiteho, ja yksi tällainen deleetio vaikuttaa olevan hh13E-mutaation syy.
20 Täysimittaisen hh-proteiinin sekvenssihomologia ja autoproteolyyttinen funktio viittaa siihen mahdollisuu-:\i teen, että F- tai C-fragmentti on sekvenssispesifinen pro- ·;··· teaasi. Ensimmäisenä vaiheena autoproteolyysin mekanis- min selvittämiseksi influenssavirusepitooppitarra vietiin • · .·. : 25 avoimen hh-lukualueen N-päähän, joka käsitti myös H329A- • 1 · •1# ’ mutaation. Kuviossa 4C esitetään, että epitooppitarran • ·· *... insertointi yksinään ei häiritse autoproteolyysiä (vyöhyke • · · • 9), ja saadaan normaali C-fragmentti ja N-fragmentti, jonka suhteellinen massa on kasvanut (vertaa villityyppiin • · 30 vyöhykkeessä 12) . Kummatkin mutaatiot käsittävässä pro-teiinissa ei tapahdu proteolyysiä (vyöhyke 10) , ja koska epitooppitarralla varustettu N-fragmentti liikkuu eri ta- • · .···. valla kuin N, tämä kaksoismutantti on ihanteellinen subst- • · [·[ raatti molekyylien välisen pilkkomisen etsimiseksi seok- • · · *.1 1 35 sesta villityyppisekvenssin kanssa. Vyöhykkeestä 11 ilme- 57 nee, ettei tällaisesta seoksesta voida todeta tarralla varustettua N:ää, vaikka normaalia N:ää muodostuu. Täten tässä kokeessa ei tapahdu mainittavaa molekyylien välistä pilkkomista. Emme myöskään onnistuneet toteamaan molekyy-5 lien välistä pilkkomista seuraavissa kahdessa kokeessa: (i) villityyppi- ja 410 trunc -sekvenssien transfektointi yhdessä S2-soluihin (pilkotusta 410 trunc -proteiinista saataisiin pienempi ja siksi identifioitava C:n muoto); (ii) ylimäärän ei-leimattua, puhdistettua His6-U-proteiinia 10 sekoittaminen leimattuun, in vitro -translaation läpikäyneeseen H329A-mutanttiproteiiniin. Täten, vaikkakaan molekyylien välistä mekanismia autoproteolyysin säätelemiseksi tai muiden proteiinien pilkkomiseksi ei voidan sulkea pois, tämänhetkiset todisteet viittaavat siihen, että hh- 15 proteiinin pilkkominen tapahtuu pääasiassa solunsisäisellä mekanismilla.
hh-geeni on laajalti säilynyt evoluutiossa, ja sillä on yksittäisiä homologeja, joita ei ole identifioitu laajasssa valikoimassa ei-selkärankaislajeja, ja monia 20 erillisiä homologeja kussakin useassa selkärankaislajissa [Y. Echelard et ai. , Cell 75 (1993) 1417; S. Krauss et ai. . Cell 75 (1993) 1431; H. Roelink et ah, Cell. suora! . ·;··· Kuten nähdään kuviosta 2, kaikki nämä kooditussekvenssit ·*.*. sisältävät muuttumattoman histidiinin ja muita säilyviä • · .·. : 25 tähteitä asemassa, joka vastaa H329:ää Drosoohila-oroteii- *· * * ;·, nissa. Lisäksi ainakin yhden hiirigeeneistä koodittama • · · *... proteiini vaikuttaa tulevan prosessoiduksi in vivo kahdek- • · · • · · * si pienemmäksi lajiksi tavalla, joka muistuttaa in vivo -prosessointia Drosophila-proteiinissa. Sen määrittämisek- • · 30 si, esittääkö autoproteolyysi mahdollisesti jotain osaa ’***· selkärankaisissa, tutkimme proteiinien käytöstä, joita koodittaa kaksi erillistä hh-homologia seeprakalasta, twhh • · .···, ja shh. Kuviosta 4D ilmenee, että kun suoritetaan näiden • · ’·* sekvenssien translaatio in vitro, muodostuu pienempiä la- • · · * 35 jeja, joiden suhteellisten massojen summa on suunnilleen • · 58 täysimittaisen proteiinin suhteellinen massa (vyöhykkeet 1 ja 3). Kuten nähdään vyöhykkeistä 2 ja 4, tämän pilkkomis-reaktion salpaa Ala-kodonien sijoittaminen His-kodonien tilalle asemissa, jotka vastaavat H329:ää Drosophilassa 5 (katso kuvio 2) . Selkärankais-hh-proteiinit vaikuttavat täten tulevan prosessoiduiksi samalla mekanismilla kuin Drosophila-proteiini. Mutaatioiden ja pilkkomiskohtien (nuolet) sijainnit näissä proteiineissa esitetään kaaviol-lisesti kuviossa 4E.
10 Esimerkki 4
Autoproteolyysin osuus alkioissa hh-geenin lukuisia funktioita Drosophilassa on kuvattu. Morfologisella tasolla näitä ovat rooli toukan or-vaskesirakenteiden sekä täysikasvuisrakenteissa, kuten 15 silmä ja sivuelin kuvioituksessa [C. Nässlein-Volhard ja E. Wieschaus, Nature 287 (1980) 795; ja J. Mohler, Genetics 120 (1988) 1061]; mekanistinen perusta kolmelle morfologiselle vaikutukselle liittyy signalointiin geeni-ilmen-tymisen ylläpitämiseksi tai indusoimiseksi alkioissa ja 20 imaginaalilevyissä [J.J. Lee, supra: T. Tabata ja T.B.
Kornberg, Cell 76 (1994) 89; ja K. basler ja G. Struhl,
Nature 368 (1994) 208]. Autoproteolyysin merkityksen näil-·:··· le funktioille varmistamiseksi H329A-mutanttigeeni hsp 70 ·*·'. -promoottorin kontrollissa vietiin P-elementtivälittei- • · .·. : 25 sellä transformoinnilla Drosophila-pieneliöliniaan. hshh- • · ;·. H329A-rakenne valmistettiin identtisesti hshh-rakenteeseen • · · nähden käyttäen H329A-mutaation käsittävää hh-ORF-frag-’ menttia. Siirtogeenisiä kärpäsiä muodostettiin y1w1118-emä- kannasta käyttäen P-elementtivälitteisen transformoinnin • · *·♦·* 30 tavanomaisia menetelmiä [A.C. Spradling ja G.M. Rubin, ’ * Science 218 (1982) 341]. Linjaa HA3, joka käsitti hshh- H329A-P-elementin 2. kromosomissa, ylläpidettiin homotsy- • · .··*. goottisena varastona. wg-raitojen laajenemisen määrittämi- ··· seksi alkioihin, jotka oli kerätty talteen 4-6 tuntia • · · ’·* 35 muninnasta (AEL) 25 °C:ssa, kohdistettiin seuraavat lämpö- • · 59 sokkiprotokollat ennen kiinnittämistä. Alkioiden, joille annettiin yksittäiset sokit (10 tai 30 minuuttia 37 °C:n lämpötilassa), annettiin toipua 1 tunnin ajan 25 °C:ssa. Alkioiden, joille annettiin kaksoissokit (kaksi 10 minuu-5 tin tai kaksi 30 minuutin sokkia 37 °C:ssa), annettiin toipua 90 minuutin ajan ensimmäisen sokin jälkeen ja 40 minuutin ajan toisen sokin jälkeen (molemmat toipumiset lämpötilassa 25 °C. 30 minuutin kaksoisprotokolla oli, kuten on aiemmin kuvattu (S. Krauss, supra). In situ -hybridi-10 säätiöt suoritettiin, kuten on kuvattu [D. Tautz, Chromo-soma 98 (1989) 81], käyttäen wg-spesifistä koetinta (D.T. Chang et ai.. supra) . Alkioille, joille määritettiin orvaskesi fenotyyppi, tuotettiin lämpösokki 6-8 tuntia AEL 30 minuutin ajan 37 °C:n lämpötilassa, niiden annettiin 15 kehittyä 25 °C:ssa 36 tunnin ajan, minkä jälkeen ne käsiteltiin ja sijoitettiin levyille, kuten on kuvattu (M. Ashburner, "Drosophila: A Laboratory Manual", Cold Spring harbor Laboratory Press, New York, 1989). Immuunipaikan-nukset (yksinkertainen tai kaksinkertainen värjäys) suori-20 tettiin, kuten on kuvattu. Käyttämällä affiniteettipuhdis-tettua Abi:tä tai Ab2:ta primaarivasta-aineena ja alkali- * · *. *: seen fosfataasiin (AP) tai piparjuuriperoksidaasiin (HRP) konjugoitua kani- tai hiirivastaista IgGrtä (Jackson Immu- | noresearch) sekundaarivasta-aineena alkioita hh13B/TM3 ftz- :*·.· 25 IacZ (tasoittava kromosomi oli the Bloomington Stock cen- • · teristä, kanta 3218) -varastosta, joka oli homotsygootti-nen hh13E-alleelin suhteen, identifioitiin värjäyksen puut-tumisesta anti-S-galaktosidaasivasta-aineella (Promega) kaksoisvärjäyksessä Ab2:lla (kuvio 9, paneeli D) . Kuvion 9 • · **'. 30 värjäyksissä paneelit B ja C suoritettiin käyttäen formal- • · . dehydikiinnitettyjä Canton-S-alkioita ja AP-konjugoitua • · V.: anti-kani-IgG-sekundaaria. Vaikka yleensä käytettiin tail”: vanomaista formaldehydikiinnitystä, lämmöllä ja happo- formaldehydiköinnityksellä saatiin myös samankaltaisia • · · . 35 tuloksia. GST-fuusioproteiineja, jotka sisälsivät joko • · 60 tähteet 83 - 160 tai 300 - 391 Hh-proteiinista, ilmennettiin E^. colissa, puhdistettiin, kuten on suositeltu (F.M. Ausubel et ai. . supra), ja käytettiin kanien immunoimisek-si tavanomaisilla menetelmillä. Vasta-aineet affiniteetti-5 puhdistettiin His6-U-proteiinikolonnissa (Harlow ja Lane, supra), jossa proteiini oli kytketty Affi-Gel 10 -helmiin (Bio-Rad). Puhdistus suoritettiin, kuten on kuvattu (Harlow ja Lane, supra), lukuun ottamatta, että happo- ja emäseluoinnit sisälsivät 10 % dioksaania. Biotinyloituja 10 hh-vasta-aineita valmistettiin puhdistamalla kaniantisee- rumi proteiini A -kolonnissa, mitä seurasi biotinylointi käyttäen Immunoprobe-biotinylointipakkausta (Sigma). Immuuni saostukset suoritettiin, kuten on kuvattu (Harlow ja Lane, supra), käyttäen kylmää RIPA-lyysipuskuria, joka si-15 sälsi pitoisuudet 0,25 mM PMSF ja 5 mM EDTA, kudoshomoge-nisaatioon. Lysaatit esikirkastettiin kahdesti käyttäen esi -immuunikaniseerumia + proteiini A -helmiä (Gibco BRL) . Sitten lisättiin affinitettipuhdistettuja vasta-aineita tai esi-immuuniseerumia, ja immuunisaostaminen suoritet-20 tiin käyttäen proteiini A -helmiä ja NP-40-lyysipuskuria pesuihin.
• ·
Kuviot 5(A) ja (B) ovat blot-immuunisiirtokopioita, ·;··· jotka on kehitetty käyttämällä Abi- ja vastaavasti Ab2- !*.*. vasta-aineita. Vyöhykkeet 1 ja 6, indusoituja ei-transfek- • · : 25 toituja S2-soluja; vyöhykkeet 2 ja 7, transfektoituja S2- • ·· • · ··, soluja, jotka on indusoitu ilmentämään hh; vyöhykkeet 3 ja • · · *... 8, lämpösokilla käsiteltyjä villityypin alkioita; vyöhyk- • · · * keet 4 ja 9, lämpösokilla käsiteltyjä hshh-alkioita; vyöhykkeet 5 ja 10, lämpösokilla käsiteltyjä hshh-H329A-al- • · ’··.* 30 kioita. Lämpösokilla käsitellyissä hshh-alkioissa villi- ***** tyypin Hh-proteiini on sekä indusoitu että oikeaoppisesti prosessoitu U-, N-, C- ja C*-lajien muodostamiseksi, joita • »
.*··. tavataan muissa ilmentämisyhteyksissä. Sitä vastoin H329A
• · on indusoitu mutta ei merkittävästi prosessoitu H329A-al- • t · *·* * 35 kioissa (prosessoidun lajin matalat tasot vyöhykkeissä 5 « · 61 ja 10 ovat luultavasti peräisin endogeenisestä hh-ilmentymisestä, koska niitä tavataan identtisinä tasoina lämpöso-killa käsitellyissä villityypin alkioissa vyöhykkeissä 3 ja 8) .
5 Kuviosta 5 ilmenee, että lämpösokilla indusointi johtaa runsaan lajin muodostumiseen, joka vastaa U:ta liikkuvuutensa ja vuorovaikutuksensa Abl:n ja Ab2:n kanssa nojalla (vyöhykkeet 5 ja 10) . Sitä vastoin villityyppi-hh-proteiinin indusointi käyttäen samankaltaista rakennetta 10 johti N- ja C-prosessoitujen tuotteiden samankaltaisiin tasoihin (vyöhykket 4 ja 9) vain hyvin vähän ei-pilkottua U:ta ollessa läsnä. Täten, kuten todetaan in vitro ja S2-soluissa, H329A-mutaatio alkioissa vaikuttaa voimakkaasti laskevan hh-proteiinin autoproteolyyttisen pilkkomisen 15 t ehokkuut t a.
Kuviossa 6 "wingless" (wg) -RNA:n alkiojakauma osoitettuna in situ -hybridisaatiolla esitetään kuviossa 6(A) villityyppi- (homotsygoottinen yV118) , (B) hshh- ja (C) hshh-H329A-alkioille, joihin kohdistettiin kaksi 10 20 minuutin lämpösokkia, joita erotti toisistaan 90 minuutin toipumisjakso. Villityypin alkiot osoittivat vain vähäistä muutosta wg-ilmentymisessä, kun taas villityyppiproteiini ·;··· ja vähäisemmässä määrin H32 9A-proteiini kumpikin indusoi- vat ektooppisen wg-ilmentymisen (taulukko 1) . Paneeleissa • · : 25 (D) , (E) ja (F) esitetään y'w1118-, hshh- ja vastaavasti • · · * hshh-H329A-toukkien selkäpinnat 4. vatsanpuoleisen segmen- • ♦ · tin tasolla. Näille toukille aiheutettiin 30 minuutin sok- • « · • · · * ki alkioina ja niiden annettiin käydä alkiokehitys loppuun. Orvaskesi solutyyppejä (1°, 2°, 3° ja 4°) leimataan, ♦ · *···* 3 0 kuten on kuvattu [J. Heemskerk ja S. DiNardo, Cell 76 * ’ (1994) 449] . Huomaa 2°-solutyypin (paljas orvaskesi) laa- jentuminen 3°- ja joissain määrin 4°-tyypin kustannuksella * · hshh-alkiossa (E) olosuhteissa, joissa hshh-H329A-alkioi- • · · den fenotyyppi (F) on identtinen verrokkialkioihin nähden • · · • · · * . 35 (D).
• · 62
Mahdollisesti varhaisin tunnettu vaatimus Hh-pro-teiinille on viereisen raidan "wingless" (wg) -geeni-ilmentymistä ylläpito kussakin alkiosegmentissä [A. Martinez Arias et ai.. Development 103 (1988) 157; ja S. DiNardo et 5 ai.. Nature 332 (1988) 604] . Tämä vaatimus päätellään wg-ilmentymisen menetyksestä hh-funktion puuttuessa; lisäksi villityyppi-Hh-proteiinin yleinen ilmentyminen indusoi wg-geeni-ilmentymisen domeenin laajentumisen [P.W. Ingham, Nature 366 (1993) 560] . H32 9A-mutaation vaikutuksia wg- 10 laajentumiseen tarkasteltiin tuottamalla lämpösokki al kioille, jotka käsittivät H329A-mutanttirakenteen, rinnan alkioiden kanssa, jotka sisälsivät villityyppirakenteen. Vaikka H329A-mutanttiproteiini kykenee indusoimaan jonkin verran wg-domeenin laajentumista, tämän aktiivisuuden teho 15 on heikentynyt verrattuna villityyppiproteiiniin (kuvio 6, B ja C; taulukko 1). Ero tehokkuusalueissa on lähes kolminkertainen riippuen lämpösokkiohjelmasta, ja nämä tulokset viittaavat siihen, että Hh-proteiinin uto-proteolyysi on tärkeä optimaaliselle aktiivisuudelle alkiosignaloin-20 nissa wg-ilmentymisen indusoimiseksi.
• '·' Taulukko 1 • ·
Villityyppi- ja mutantti-hh-aktiivisuus wg-ilmentymisen alkioindusoin- .. . nissa* • · · • ·* 25 • · *a*·· Lämpösokki, minuuttia ;\a 10 30 10/10 30/30 • · · ♦ · · *·* * hshh 1,0±0,34(93) 1,5+0,6(120) 2,9±0,3(41) 2,8±0,4(54) 30 hshhH329A 0,7±0,5(190) 0,9±0,4(111) 1,1±0,4(145) 1,9±0,5(93) ··· • · • · ··· aaa>· * wg-ilmentymisen laajentaminen villityyppiverrokkien ulkopuolelle • · esitetään soluhalkaisijoiden ± standardipoikkeaman keskimääräisenä arvona mainiten alkioiden lukumäärä sulkeissa.
• · • · · 35 • φ *·* Hh-proteiinin vaikutukset orvaskesirakenteiden ku- • · · ^ # · · V * viointiin ovat selvimmin nähtävissä toukkien selkäpinnal- • · 63 la, jolla voidaan kussakin parasegmentissä identifioida neljä erillistä solutyyppiä. Nämä solutyypit on nimetty 1°, 2°, 3° ja 4° edestä taaksepäin, jolloin hh-transkriptio tapahtuu l°-solujen prekursoreissa (J. Heemskerk ja S.
5 DiNardo, supra). Kolmen ensimmäisen solutyypin differen-tiaation osoitettiin olevan riippuvainen hh-geenifunktios-ta, ja on ehdotettu, että näiden solujen kohtalon määrää Hh-proteiinin pitoisuus, jolloin korkeimmat pitoisuudet tuottavat l°-kohtalon, keskimääräiset pitoisuudet tuottavat 10 2°-kohtalon ja matalimmat pitoisuudet tuottavat 3°-kohtalon (J. Heemskerk ja S. DiNardo, supra). Tätä ehdotusta tukivat havainnot, että useimmat etusolutyypit osoittavat suurinta herkkyyttä hh-ilmentymisen laskuun, ja että kaikki 3°- ja jotkut 4°-harjakset korvautuvat enemmän edessä si-15 jaitsevan 2°-solutyypin paljailla orvaskesiominaisuuksilla hh:n ilmentyessä kaikkialla korkeina tasoina. Tuotimme 3°-ja joidenkin 4°-kohtaloiden suppression alkioiden lämpösok-ki-indusoinnilla, jotka käsittävät villityyppirakenteen (kuvio 6 E) , mutta totesimme, että H329A-mutantti ei kyke-20 ne muuttamaan solukohtaloita toukkien selän orvaskedessä (kuvio 6 F) . Autoproteolyysi, tai ehkä jokin muu H32 9A-mu- • · · *· taation salpaama funktio vaikuttaa siten olevan oleellinen ’***· Hh-proteiinin kuviointivaikutukselle selän orvasketeen.
• V Esimerkki 5 • · : 2 5 H32 9A-mutaation vaikutukset signalointiin imaginaa- ·*·.. lilevyissä H329A-mutanttiproteiinin tutkimukset laajennettiin täysikasvuisrakenteiden kuvioinnin funktioon ja signaloin- ,···. tiin imaginaalilevyissä. Silmässä imaginaalilevy-hh-funk- • · ***. 30 tiota tarvitaan kuvioinnin oikeanlaiseen kehittymiseen [J.
. Mohler, Genetics 120 (1988) 1061; J.J. Lee, supra; ja J.
• · V.J Mohler ja K. Vani, supra] , ja nyttemmin sen on osoitettu kontrolloivan differentiaatioaallon etenemistä decapen- .···, taplegic (dpp) -geenin indusoinnin välityksellä silmän • · · 35 morfogeneettisessä vaossa [U. Heberlein et ai. . Cell 75 • · 64 (1993) 913; ja C. Ma et ai,., Cell 75 (1993) 927]. Jalka-ja siipilevyissä hh:n ektooppisen ilmentymisen on myös osoitettu johtavan kuvoiden kahdentumiseen ja virheisiin ja liittyvän sellaisten muiden signalointimolekyylien ek-5 tooppisen ilmentymisen indusointiin, jotka normaalisti ilmentyvät vyöhykkeellä etu/takaosaston rajalla [T. Tabata ja T.B. Kornberg, Cell 76 (1994) 89; ja K. Basler ja G.
Struhl, Nature 368 (1994) 208] .
Signalointitutkimuksiin imaginaalilevyissä käytet-10 tiin lämpökierrätintä lämpösokki-indusoitavia hh-rakentei- ta käsittävien toukkien altistamiseksi peräkkäisille läm-pösokki/toipumiskierroksille. Lämpökierrätyksen vaikutuksia dpp:n ja wg:n ilmentymiseen imaginaalilevyissä tarkasteltiin tarkkailemalla β-galaktosidaasi-ilmentymistä re-15 portterigeenistä, joka käsittää dpp-promoottorisekvensse- jä, tai wg-geeniin insertoidusta tehostindetektori-P-ele-mentistä. Kuviossa 7 X-gal-värjäystä käytettiin wg-ilmen-tymisen (kuvio 7, A - C) tai dpp-ilmentymisen (kuvio 7, D - L) seuraamiseksi wg-lacZ- tai dpp-lacZ-reportterigee-20 nejä kantavien kolmannen vaiheen toukkien imaginaalilevyissä. Jalka-, (A - F), siipi- (G - I) ja silmäantenni • · ·.*·· (J - L) -levyjä verrokkitoukista (A, D, G, J) , hshh-siir- "**i togeenin käsittävistä toukista (B, E, H, K) ja hshh-H329A- siirtogeenin käsittävistä toukista (C, F, I, L) esitetään.
• · :\j 25 Kaikissa paneeleissa etupuoli on vasemmalla. Nuolet osoit- • · tavat seuraavia piirteitä: dpp-ilmentymisen ektooppinen ,···. täplä hshh-H32 9A-toukkien siipilevyjen etuosastossa (I) ; • · · ja dpp-ilmentymisen ektooppinen nauha silmäantennilevyn ... silmäosassa, joka on morfogeneettisen vaon etupuolella • · *··[ 30 (huomataan toinen dpp-ilmentymisnauha taempana) hshh-tou- kissa (K). wg-ilmentymisen laajentuminen etuosastoon jal- : kalevyissä ja dpp-ilmentyminen jalka- ja siipilevyissä :***; hshh-toukissa on samankaltainen kuin kuvattiin hh:n ek- .!. tooppiselle ilmentymiselle. Morfologisia muutoksia siipi- • · · • · · * 35 (B ja E) ja jalka (H) -levyjen etuosastossa kuvattiin myös • · 65 (K. Basler ja G. Struhl, supra). Sitä vastoin levyt hshh-H329A- ja verrokkitoukista osoittivat hyvin vähän muutosta wg- ja dpp-ilmentymisessä jopa ajallisesti pitkissä lämpö-sokkiolosuhteissa, eikä morfologisia muutoksia milloinkaan 5 havaittu (M - 0). Täysikasvuisten verrokki- (M), hshh- (N) ja hshh-H329A (0) -kärpästen silmäfenotyypeissä, joille aiheutettiin sokki toukkakehityksen aikana samalla tavalla kuin edellä imaginaalilevykokeissa. Kahdentuneita silmära-kenteita havaittiin hshh-kärpäsissä mutta ei milloinkaan 10 hshh-H329A-kärpäsissä. Nuoli (N):ssä osoittaa ohutta or-vaskesiliuskaa kyseisten kahden silmärakenteen välissä. Muitakin epämuodostumia havaittiin hshh-kärpäsissä (esimerkiksi vertaa rintakehää N:ssä M:ään).
Neitseellisiä naaraskärpäsiä homotsygoottisista 15 linjoista hshh [D.T. Chang et ai. , Development (1994), painossa] , hshh-H329A ja yV1118 risteytettiin uroksiin ho-motsygoottisesta BS3.0-linjasta (joka käsittää P-element-ti-dpp-reportterirakenteen nimeltä dpp-lacZ 2. kromosomissa [R.K. Blackman et ai., Development 111 (1991) 657] tai 20 linjasta y;Sco/CyO, enlacZll::wg (joka käsittää wg-report-teri-P-elementtitehostinansan nimeltä wg-lacZ 2. kromoso- • · :.*·· mitasapainoittajsssa) [J.A. Kassis et ai. . Proc. Natl.
·:**: Acad. Sei. USA 89 (1992) 1919] . Jälkeläisiä kasvatettiin ·*·*; 25 °C:ssa ilmastetuissa 0,5 ml:n mikrosentrifugiputkissa, • · •\j 25 jotka sisälsivät hiivatahnaa, toukkakehityksen myöhäiseen • · ;·. 2. vaiheeseen tai varhaiseen 3. vaiheeseen. Sitten toukkia • · · #·:·φ kierrätettiin jatkuvasti 37 °C:ssa 30 minuutin ajan, mitä • · · seurasi 25 °C:ssa 90 minuuttia Perkin-Elmer-lämpökierrätti- ... messä, kunnes ne saavuttivat myöhäisen 3. vaiheen. Sitten • · ’*··] 30 ne leikeltiin ja värjättiin X-gal:illa, kuten on kuvattu (M. Ashburner, supra) tai annettiin kasvaa täysikasvuisik-si fenotyyppianalyysiä varten.
• · ;***j Kuten esitetään kuviossa 7A, wg-ilmentyminen tapah- • · · .1. tuu normaalisti jalkalevyn vatsanpuoleisessa sektorissa • · · *·* [ 35 pitkin etu/takaosaston rajaa, kun taas dpp ilmentyy levyn • · 66 selänpuoleisessa osassa pitkin tätä rajaa (kuvio 7D) . Vaikka villityyppi-hh-geenin käsittävien toukkien lämpö-kierrätyksessä muodostui epänormaali jalkalevymorfologia ja kummankin kohdegeenin laaja ektooppinen ilmentyminen, 5 kuten aiemmin on raportoitu ektooppiselle hh-ilmentymiselle (kuvio 7B ja E) , H32 9A-rakenne tuotti vain vähän jos lainkaan todettavaa eroa näissä ilmentymiskuvioissa (kuvio 7C ja F). Ektooppinen hh-ilmentyminen siipilevyssä johtaa myös morfologisiin muutoksiin ja dpp:n laajentuneeseen 10 ilmentymiseen (vertaa kuvio 7, G ja H) , mutta H329A-raken-ne tuotti etupuolen ektooppisen ilmentymisen vain ajoittaisen pienen täplän (kuvio 71) .
Villityyppi-hh:n ilmentäminen kaikkialla johtaa myös dpp:n ektooppiseen ilmentymiseen silmäantennilevyssä 15 (vertaa kuvio 7J ja K). Tämän levyn antenniosassa dpp-ilmentymisen laajeneminen muistuttaa jalkalevyissä havaittua. Levyn silmäosassa dpp-ilmentyminen havaitaan sen normaalilla paikalla vaossa; kuitenkin ektooppinen ilmentyminen tapahtuu myös toisen selkä-mahanauhan muodossa kohdas-20 sa jonkin verran vaon etupuolella, jolloin saadaan silmä-levy, jossa on kaksi morfogeneettistä vakoa (kuvio 7K) .
• · ί/.i Itse asiassa täysikasvuisissa, jotka on saatu lämpökierrä- ·:**: tetyistä toukista, jotka käsittävät villityyppi-hh-raken- ·*·*· teen, voidaan havaita näennäisesti kahdentunut silmäraken- • · .·. : 25 ne, kuten kuviossa 7N, jolloin kahta silmärakennetta erot- • · · • · ··, taa ohut orvaskesiliuska (nuoli) . H329A-mutanttiproteiini • · · sitä vastoin ei indusoinut dpp-ilmentymisen laajenemista • · · * silmäantennilevyn kummassakaan osassa (kuvio 7L) , eikä indusoi silmän kahdentumisia tai orvaskesivirheitä täysi- • · *···* 30 kasvuisessa (kuvio 70) .
’* ’* Tähän mennessä kuvatut kokeet käsittävät monta sar- jaa toukkia, joihin on kohdistettu kahden päivän lämpö- • · .···. kierrätys, jota seuraa välitön leikkely imaginaaliraken- • · · ^ teiden analyysiä varten tai jatkoinkubointi vakiolämpöti- • · · *·* 35 lassa täysikasvuisrakenteiden analysoimiseksi. Vaikka • · 67 H329A-proteiinilla vaikutti olevan vain vähän aktiivisuutta näissä kokeissa, siipilevyssä indusoidun ektooppisen dpp-ilmentymisen pieni täplä (kuvio 71, nuoli) viittaa siihen, että jonkin verran jäämäaktiivisuutta oli jäljel-5 lä. Tätä mahdollisuutta tuki samankaltainen koe, jossa oli 3 kierrätyspäivää ennen leikkelyä: H329A-proteiini osoitti selvästi jonkin verran dpp-indusointiaktiivisuutta tässä kokeessa, oletettavasti tuloksena korkeammista proteiini-määristä, jotka akkumuloituivat pitempänä kierrätysaikana. 10 Siipi erityisesti mutta myös muut imaginaalilevyt osoittivat matalia ja vaihtelevia ektooppisen dpp-ilmentymisen määriä. Tämä ilmentyminen oli kaikissa tapauksissa paljon vähemmän laajaa kuin se, joka havaittiin rinnan tarkastellulle villityyppirakenteelle; lisäksi imaginaalilevyjen 15 morfologiset epämuodostumat, vaikkakin varsin tavallisia villityyppiproteiinissa, olivat äärimmäisen harvinaisia H329A-proteiinilla. Vaikka sen teho on suuresti laskenut villityyppiin verrattuna, H329A-proteiinilla oli jäljellä ainakin jonkin verran aktiivisuutta wg- ja dpp-ilmentymi-20 sen varhaisessa alkio- ja imaginaalilevyindusoinnissa; sitä vastoin jopa lämpösokkiolosuhteissa, jotka olivat pal-J/.i jon ankarammat kuin olosuhteet, joita tarvittiin vaikutuk- *:·*: siin villityyppiproteiinilla, H329A-mutantti pysyi täysin inerttinä, mitä tulee solukohtaloiden toukkien selän or- • · .·. : 25 vaskedessä respesifikaatioon.
• ·· • · ··, Esimerkki 6 • ·· *... N:n ja C:n differentiaalinen vapautuminen soluvil- • · · * jelmäsupernatantteihin hh-funktion arvoituksellinen piirre on sen ilmeinen • · · *· • · *···* 3 0 lyhytaikainen vaikutus ympäristöissä, kuten alkio- ja ima- **”* ginaalilevysignalointi wg:hen ja dpp:hen, ja pitkäaikai- sempi vaikutus muissa ympäristöissä, kuten toukan selän • · .···. orvaskeden kuviointi. Nämä havainnot ja kahden pääasialli- • · • sen proteiinituotteen läsnäolo in vivo kannusti meitä et- ··· ·*- - - • · · *·* * 35 simään eroja S2-soluviljelmässä ilmennettyjen N:n ja C:n • · 68 liukoisuudessa ja diffundoituvuudessa. Kuviot 8(A) ja (B) ovat blot-immuunisiirtokopioita solupelleteistä (vyöhyke 1) tai supernatanteista (vyöhyke 2) transfektoiduista, Hh-proteiinin ilmentävistä S2-soluviljelmistä kehitettyinä 5 Ablrllä (A) ja Ab2:lla (B) . Näytteet kussakin vyöhykkeessä olivat samasta tilavuudesta uudelleensuspendoitua koko-nai sviljelmää . Kun N pysyi valtaosin yhdistyneenä solupel-lettiin (vertaa vyöhykkeitä 1 ja 2 A:ssa), C vapautui lähes kvantitatiivisesti supernatanttiin (vertaa vyöhykkeitä 10 1 ja 2 B:ssä). U osoitti N:n ja C:n (A ja B) välissä ole via jakautumisominaisuuksia. Kuviossa 8(C) esitetään he-pariinisitoutumisaktiivisuus eri Hh-proteiinilajeille, jotka on muodostettu in vitro -translaatioilla mikroso-meilla. Näytteet olivat: kokonaistranslaatioseos (vyöhyke 15 1); supernatantti inkuboinnin hepariiniagaroosi- tai aga- roosi (verrokki) -helmillä jälkeen (vyöhykkeet 2 ja 4) ,-ja pesun jälkeen hepariiniagaroosi- tai agaroosihelmistä eluoitu materiaali (vyöhykkeet 3 ja 5) . F-, U-, Nss- ja N-fragmentit on kulutettu loppuun hepariiniagaroosi- mutta 20 ei agaroosihelmillä inkuboiduista reaktioista (vertaa vyöhykkeitä 2 ja 4 l:een), ja samat lajit voidaan sittemmin • · *.**: eluoida hepariiniagaroosi- mutta ei agaroosihelmistä (ver-
***** taa vyöhykkeitä 3 ja 5 vyöhykkeeseen 1) . Kuvioista 8A ja B
·· · i 1: ilmenee itse asiassa, että nämä proteiinit käyttäytyvät :*·,· 25 eri tavoin suurimman osan N-fragmenttia pysyessä soluliit- • · ·’# teisenä ja kaiken, tai lähes kaiken, C:n vapautuessa vil- t jelmäsupernatanttiin.
*·1 *
Yksi mahdollinen selitys tälle erilaiselle käytök- ... selle saattaisi olla N-fragmentin liittyminen solunulkoi- • · *··. 30 sen matriisin proteiineihin S2-solujen pinnoilla. Täten tarkasteltiin näiden kahden proteiinin suhteellista affi-::1: niteettia hepariiniagaroosin suhteen, koska hepariiniin ;***· sitoutuminen on solunulkoiseen matriisiin liittyvien pro- • •t .1. teiinien yleinen ominaisuus.
• · · • · · · 69
Otettaessa huomioon ilmeinen vaikeus saada liukoista N:ää soluviljelmistä käytettiin in vitro -translaatiota mikrosomien läsnä ollessa liukoisen, leimatun N:n ja C:n muodostamiseksi. Kuten esitetään kuviossa 8 C, N loppuu 5 näistä translaatiouutteista mutta C ei käsiteltäessä hepa-riiniagaroosihelmillä, kun taas käsittely ei-modifioiduil-la agaroosihelmillä ei kuluttanut loppuun kumpaakaan fragmenttia. Lisäksi N pysyi sitoutuneena hepariiniagaroosi-helmiin mutta C ei pestäessä perusteellisesti liuoksella, 10 joka sisältää 0,1 % Triton X-100 -valmistetta ja pitoisuuden 150 mM NaCl; sitä vastoin kumpikaan fragmentti ei pysynyt sitoutuneena ei-modifioituun agaroosiin. N sitoutuu tiukasti hepariiniin mutta C ei, ja tämä käytös viittaa siihen, että viljelmäsupernatantteihin vapautuneen N:n 15 matala pitoisuus saattaa olla seurausta sitoutumisesta solunulkoiseen matriisiin. Toinen mekanismi, joka saattaisi myötävaikuttaa N:n ja C:n erilaiseen vapautumiseen vil-jelmäsupernatanttiin, olisi reseptorin N:lie mutta ei C:lle ilmentyminen S2-soluissa. Tämänhetkisillä tiedoil-20 lamme emme pysty erottamaan näitä mahdollisuuksia toisistaan .
Esimerkki 7 • · ·;··· N:n ja C:n erilliset paikannukset alkiossa N:n ja C:n erilainen vapautuminen soluviljelmäsu- • · ,·. : 25 pernatantteihin viittasi mahdollisuuteen, että nämä frag- • · · ’ mentit mahdollisesti myös sijaitsisivat eri kohdissa ai- • · · *... kioissa. Aiemmin raportoiduissa hh-proteiinipaikannuksissa • · · • käytettiin joko N-epitoopeille spesifisiä vasta-aineita tai vasta-aineita, jotka eivät kykene erottamaan N:ää ja
• M
30 C:tä toisistaan. Kuviossa 9 esitetään N:n ja C:n erilaiset *·*’· paikannukset alkioissa hh-transkriptin in situ -paikannuk- sella. Kuviossa 9(A) esitetään vertailuna Abl:llä ja • · · • · .···, Ab2:lla todettujen N- ja C-epitooppien jakaumaan panee- • · leissa 9(B) ja vastaavasti 9(C). Huomattakoon, että N- ja • · ♦ *.* * 35 C-epitooppien jakauma kattaa noin 1/3 ja vastaavasti 1/2 * • · 70 kustakin segmenttiyksiköstä, kun taas transkripti rajoittuu noin 1/4 kustakin yksiköstä. Kuviossa 9(D) todetaan C-epitooppien sijainti hh13E-alleelille homotsygoottisissa alkioissa Ab2:ta käyttäen. C-epitoopit tässä mutantissa, 5 joka osoittaa häiriintynyttä autoproteolyyttistä aktiivi suutta, ovat restriktoidumpia, ja muistuttavat N:n villi-tyyppisijaintia. Homotsygoottiset hh13E-alkiot identifioitiin merkityn tasapainoittajän menetyksestä heterotsygoottisesta kantavarastosta. Kaikki alkiot ovat keskivaiheesta 10 myöhäisvaiheeseen (laajennettu pieneliönauha).
Kuviossa 9B esitetään näiden raporttien mukaan, että Abi, joka on spesifinen N-epitoopeille, paljastaa segmentiaalisesti paikannetun jakauman, joka on hieman leveämpi kuin hh-transkriptin samassa vaiheessa (kuvio 15 9A) . Samoin yhtäpitävästi näihin raportteihin nähden ha vaitsimme, että N-epitoopit myöhäisemmissä vaiheissa ak-kumuloituvat suuriksi täplikkäiksi rakenteiksi. Analyysimme tässä keskittyy varhaisempaan vaiheeseen, kun vasta-ainevärjäys on heikompi mutta kuitenkin ennen painaumien 20 ja urien muodostumista, jotka myöhemmin rypyttävät orvaskeden ja siten mutkistavat tulkintaa. Ab2:ta käytettiin • · myös C-spesif isten epitooppien toteamiseksi lukuisilla ·:*·· erilaisilla kiinnitys- ja värjäysmnettelyillä. Vaikka ·'·*. taustan ylittävien C-epitooppien detektio on vaikeampi * · : 25 kuin N:lle, totesimme jatkuvasti segmentiaalisesti modu- • · · ;·. loidun kuvion tosin kuitenkin leveämmällä jakaumalla kuin • · · *... N (kuvio 9C) . Tämä sijainti on selkeä myös sikäli, ettei • · · • · · * C-epitooppeja varhaisissa tai myöhäisissä vaiheissa tavata N:lie karakteristisista täplikkäistä rakenteista.
• · *···* 30 hh13E-mutaatio koodittaa ennenaikaisesti typistynyttä ·*** proteiinia, josta puuttuu 15 normaalisti COOH-päässä si- jaitsevaa tähdettä. Koska tämä proteiini osoittaa huomat- • · .···. tavasti laskenutta tehoa autoproteolyysissä, tutkittiin • · · * • C:n jakaumaa tässä mutanttitaustasssa. Kuviossa 9D esite- • · · *·* * 35 tään, että C-epitoopit homotsygoottisessa hh13E-alkiossa • · 71 (identifiointi merkityn tasapainoittajan puuttumisesta) ovat jakautuneet paljon tiiviimmäksi segmentiaaliseksi kuvioksi kuin villityypissä. Tämä sijainti muistuttaa N:n sijaintia, joten päättelemme, että normaalisti esiintyvä 5 C-epitooppien leveä jakauma on muuttunut hh13E:ssä ei-pilko-tun prekursorin pitäytymisen johdosta lähellä synteesikoh-taa.
Esimerkki 8
Autoproteolyysin rooli aktiivisen siiliproteiinin 10 biogeneesissä
Signaalipilkkomisen lisäksi hh-proteiinissa tapahtuu autoproteolyysi sisäisessä kohdassa in vivo havaittujen vallitsevien proteiinilajien muodostamiseksi. Kaikki tähän autoproteolyysifunktioon tarvittavat aminohappotäh-15 teet tai suurin osa niistä sijoittuvat C:hen, joka on tämän sisäisen pilkkomisen karboksiterminaalinen tuote. Pyrittäessä määrittämään autoproteolyysin merkitys funktiolle teimme yhden tähteen mutaation (H329A), joka salpaa hh-proteiinin autoproteolyysin in vitro, ja osoitimme, että 20 tämän proteiinin sekä prosessointi että funktio on heiken tynyt in vivo. Koska samankaltaisia indusoidun proteiinin • · :#*.j tasoja todettiin villityyppirakenteen käsittävästä kannas- ·:*·· ta tai useista kannoista, jotka käsittivät mutanttiraken- teen riippumattomia insertioita (kuvio 5) , H32 9A-proteii- • · .·. : 25 nin heikentynyt funktio villityyppiin verrattuna ei ole • · · seurausta laskeneista ilmentymistasoista. Lisätodisteita • · · autoproteolyysin roolin tueksi saadaan hh13E-mutaation vai- • · · * kutuksesta, joka vähentää hh-proteiinin autoproteolyysiä in vitro mutta ei poista sitä (kvuio 4) . Vastaavasti hh13E- • · *···’ 30 mutaatio liittyy keskimääräisen voimakkaaseen fenotyyppiin * * in vivo (J. Mohler, suora).
Yllättäen H329A-Hh-proteiinilla vaikuttaa säilyvän * · .···. heikko aktiivisuus alkiosignaloinnissa ektooppisen wg-il- • · · .·. mentymisen indusoimiseksi ja se voi vähäisemmässä määrin • · · *·’ | 35 toimia imaginaalilevysignaloinnissa ektooppisen wg- ja • · 72 dpp-ilmentymisen indusoimiseksi. Vastoin sitä, että H329A-proteiini säilyttää ainakin jonkin verran signalointifunk-tioita alkio- ja imaginaalikudoksissa, se on täysin inert-ti määritettäessä sen kyky uudelleenohjelmoida solukohta-5 loita toukan selän orvaskedessä.
Määrityksiä, joissa H329A-proteiini on aktiivinen tai osittain aktiivinen, ovat lyhyen matkan signalointi, joka normaalisti tapahtuu poikki yhden tai enimmillään usean soluhalkaisijan; sitä vastoin H329A-proteiinilla ei 10 ole mitään vaikutusta selän orvaskeden kuviointiin, joka on pitkän matkan aktiivisuus, joka normaalisti toimii poikki valtaosan segmentistä. Aiemmat esitykset pitkän matkan kuviointiaktiivisuuksien selittämiseksi ovat viitanneet siihen, että hh:n ilmentyminen indusoi muita sig-15 nalointimolekyylejä, jotka ovat sitten vastuussa kuvioin-tifunktioiden suorituksesta (signaalinvälitysmalli; katso kuvio 10A) . Kuviossa 10 esitetään signaalinvälitys- ja duaalifunktlomailit hh-proteiinin vaikutukselle. Kuviossa 10(A) hh-signaloinnin pitkän matkan vaikutuksiin päästään 20 epäsuorasti toisen signalointimolekyylin lyhyen matkan in-dusoinnilla (X) . Sen biokemiallisten ominaisuuksien ja sen restriktoidun kudossijainnin perusteella N:n oletetaan ·;··· edustavan aktiivista lyhyen matkan signaalia, kun taas C:n Γ.·. rooli rajoittuisi sen katalyyttisen koneiston toimituk- • · : 25 seen, joka tarvitaan N:n biogeneesiin. Kuviossa 10(B) • · · * U-prekursorista sisäisellä autoproteolyysillä saadut N- ja • · · *... C-proteiinit tuottavat hh:n pitkän ja lyhyen matkan signa- • · · ** lointifunktiot. N liittyy lyhyen matkan signalointiin py- syessään lähellä solusynteesikohtaansa, kun taas C on vä- • · · • · *·..* 3 0 hemmän restriktoitu jakaumassaan ja toimittaisi pitkän ’·**· matkan signalointifunktioita. Kummassakin mallissa auto- proteolyysiä tarvitaan täysin aktiivisten signalointi- • · .···. proteiinien muodostamiseksi. Lisäkäsittelyn osalta katso • · *·* teksti.
• · · • · · • · · • · 73 Nämä esitykset pyrkivät ylläpitämään siilivaikutuksen yhtenäistä muotoa rationalisoidessaan hh-tuotteiden ilmeiset pitkän matkan aktiivisuudet epäsuoriksi seurauksiksi lyhyen matkan signaloinnista. Havaitun jakauman pe-5 rusteella aktiivinen molekyyli tässä mallissa saattaisi olla N, jolloin C:n rooli rajoittuisi N:n biogeneesiin tarvittavan katalyyttisen koneiston toimittamiseen.
Todisteemme viittaavat vaihtoehtoiseen malliin, duaalifunktiomalliin (kuvio 10B), jossa hh-proteiinin pit-10 kän ja lyhyen matkan aktiivisuuksia saattaisivat toimittaa N ja C, jotka ovat molekyylin in vivo todetut kaksi pääasiallista muotoa. C-fragmentin lähes kvantitatiivinen vapautuminen hh:n ilmentävien S2-solujen kasvualustaan ja sen leveä, joskin segmentiaalisesti moduloitu, jakauma al-15 kioissa viittaa siihen, että C saattaisi suorittaa pitkän matkan signalointifunktioita tai myötövaikuttaa niihin. N-fragmentti toisaalta pysyy pääasiassa liittyneenä ilmentäviin S2-soluihin ja myös sitoutuu hepariiniin, mikä viittaa mahdolliseen yhteyteen solunulkoiseen matriisiin. 20 N:n nämä ominaisuudet ja sen segmentiaalisesti restriktoi-tu alkiojakauma viittaavat rooliin lyhyen matkan hh-signa-:*·.· lointiaktiivisuuksien suoritukseen. Koska testaamamme sei- • φ ....j kärankais-Hh-proteiinit myös vaikuttivat tulevan autopro- sessoiduiksi ja myös käsittävät ennustettuja hepariinisi- • · .·/; 25 toutumiskohtia juuri karboksiterminaalisesti niiden sig- • · · .1 * naaliskevensseihin nähden (H. Roelink et ai., supra), mo- • · · net tässä Drosophilan kehityksen yhteydessä käsitellyn • · · *·* * duaalifunktiomallin näkökohdat saattavat myös päteä hh- proteiinifunktioon selkärankaiskehityksessä.
• · · *...· 30 Se, että N suorittaa lyhyen matkan funktioita, so- pisi havaintoon, että H329A-mutanttiproteiinilla on aina-kin osafunktio signaloinnissa wg:n ja dpp:n indusoimisek- • · ♦ #···φ si, koska tämä mutaatio ei muuta tähteitä, jotka sijaitse- • · *Γ vat proteiinin aminoterminaalisessa osassa, josta normaa- ··· ·.· * 35 listi syntyisi N. Ei-pilkottu H329A-proteiini täten käsit- « • · 74 täisi kaikki tähteet, jotka ovat normaalisti vuorovaikutuksessa N:n oletetun reseptorin kanssa, vaikka saattaisi esiintyä jonkin verran vaikutusta vuorovaikutuksen affiniteettiin karboksiterminaalisten sekvenssien läsnäolon joh-5 dosta, mikä selittäisi H329A-proteiinin laskeneen tehon. Vaihtoehtoisesti H329A-proteiinin osafunktio voi olla peräisin proteiinin äärimmäisen pienestä fraktiosta, joka vaikuttaa tulevan pilkotuksi, hyvin heikko nauha, jolla on C:hen nähden identtinen liikkuvuus, näkyy in vitro -trans-10 laatioissa H329A-proteiinilla (kuvio 4, vyöhyke 3). Pitkän matkan funktioiden suoritus C:n toimesta sopii myös havaintoihimme, koska pitkän matkan signalointi saattaisi vaatia C-fragmentin vapautumista tai muuten edellyttää H329-tähdettä johonkin muuhun funkioon kuin pilkkominen. 15 Syntetisoitaessa N natiivista rakenteesta (villi- tyyppi-hh) se pysyy pääasiassa liittyneenä soluun (kuvio IOC) , jolloin kuitenkin N, joka on muodostettu typistetystä rakenteesta soluviljelmässä, menee kasvualustaan (kuvio IOD) (rakenteiden osalta katso Porter et ai. , Nature 374 20 (1995) 363]. Nämä tulokset vahvistavat edelleen, että au- toprosessointi C-fragmentilla saattaa säädellä N:n liitty-misen solupintaan astetta ja tämän vuoksi sen vaikutusmat-kaa.
Esimerkki 9 • · ® · .·. : 25 Siilihomologien eristäminen • · · .1 ’ Hiiren ja ihmisen hh:n kaltaiset sekvenssit eris- • · · *... tettiin polymeraasiketjureaktiolla (PCR) käyttäen aluk- • · · *·* ’ keitä, jotka olivat degeneroituneet kaikkien mahdollis ten kooditusyhdistelmien suhteen kuviossa 1 alleviivatuis- ··· ·...* 30 ta sekvensseistä Changin et ai. mukaan (Development 120 (1994)] . PCR-monistamiset sisälsivät 100 ng - 2 μg genomi- DNA:ta (riippuen lajin genomin koosta), 2 μΜ kutakin alu- .·♦·. kettä, 200 μΜ dNTP:eitä (Pharmacia) , IX reaktiopuskuria • · 'V (Boehringer-Mannheim) ja 2,5 yksikköä Taq-polymeraasia • ·· *.* * 35 (Boehringer-Mannheim) 50 μ1:η reaktioissa. Monistamiset • · 75 suoritettiin seuraavasti: 94 °C:ssa 5 minuuttia, lisätään Taq-polymeraasi 75 °C:ssa, sitten 94 °C:ssa 1 minuutti, 52 °C:ssa 1,5 minuuttia ja 72 °C:ssa 1 minuutti 30 kierrosta ja lopullinen laajentaminen 72 °C:ssa 5 minuutin ajan.
5 Kaikki PCR-tuotteet kloonattiin pBluescriptiin (Stratage-ne) ennen sekvenssin määritystä.
Tällä tavalla saadut hiirikloonit sisälsivät 144 emäksen sekvenssin alukepäiden välissä ja ne leimattiin [a32P] dATP: llä ja käytettiin 8,5 dpc:stä alkio-RNA:ta ja 10 14,5 dpc:stä alkioaivoja XZAP-vektorissa (lahja A. Lana- hanilta) valmistettujen hiiri-cDNA-kirjastojen seulomiseksi hyvin ankarissa olosuhteissa. Useita Hhg-l:tä vastaavia klooneja eristettiin ja suurin, pituudeltaan 2 629 ep (pDTC8.0), valittiin sekvenssianalyysiin, jossa käytettiin 15 dideoksiketjupäämenetelmää (Sanger et ai. , 1977) ja Seque-nase v2.0 -valmistetta (US Biochemicals) . Kompressiot erotettiin käyttäen 7-deatsaguanosiinia (US Biochemicals). Sekvenssianalyysissä käytettiin Geneworks 2.0- (Intelli-Genetics) ja MacVector 3.5 (IBI) -ohjelmistoja.
20 Yhtä kolmesta hiirikloonista, Hhg-1, käytettiin koettimena, jolloin saatiin 2,0 ke:n klooni 8,5 dpc:n hii-:\j rialkio-cDNA-kir j astosta ja 2,7 ke:n klooni 14,5 dpc:n ·:··· alkio-cDNA-kirjastosta. 2,7 ke:n cDNA vaikuttaa edusta- van lähes täysimittaista mRNA:ta, koska se vastaa 2,7 • * .·. : 25 ke:n nauhaa, joka todettiin hybridisaatiossa Northern blot • · · •I * -siirtokopiolla. Suurin metioniinin aloittama avoin luku- • · · *... alue tässä cDNA:ssa käsittää 437 kodonia, ja sitä edeltää • · · • yksi alueella sijaitseva ylävirran stop-kodoni. Sekvenssi-vertailut osoittavat, että Hhg-1:n koodittama proteiini on ··· • · 3 0 identtinen riippumattomasti karakterisoituun hiiri-Shh:hon [Echelard et aL·, Cell 75 (1993) 1417 - 1430] nähden lu- kuun ottamatta arginiini -> lysiini -eroa tähteessä 122.
• · · • · .···. Hhg-1 vastaa myös likeisesti rotan vhh-l-geeniä [97 %:n • · ’·’ aminohappoidenttisyys; Roelink et ai.. Cell 76 (1994) • · · : 35 761 - 775], kananpojan "Sonic"-siiliä [81 %:n identtisyys; • · 76
Riddle et ai., Cell 75 (1993) 1401 - 1416] ja Shh:ta seep-rakalasta [68 %:n identtisyys; Krauss et ai. . Cell 75 (1993) 1431 - 1444; Roelink et aJ^., Cell 76 (1994) 761 -775] . PCRrllä muodostetut fragmentit Hhg-2 ja Hhg-3 vai-5 kuttavat vastaavan hiiren siiligeenien vastaavasti "Indian"- ja "Desert"-luokkia [Echelard et. ai. , Cell 75 (1993) 1417 - 1430].
Avoimen Hhg-1-lukualueen rinnanasettelu kahden Dro-sophila-hh-sekvenssin kanssa osoitti, että kaikki kolme 10 proteiinia sisältävät hydrofobisia aminohapposekvenssejä lähellä aminopäätään; hydrofobisten jaksojen D^_ melanoaas-ter -proteiinissa (tähteet 64 - 83) ja hiiriproteiinissa tiedetään toimivan tehokkaasti signaalisekvensseinä pilkkomiseen [Lee et ai., Cell 71 (1992) 33 - 50] . Kummankin 15 Drosophila-sianaalisekvenssin sisäinen sijainti on epätavallinen, kun taas hiirigeenin hydrofobinen jakso esiintyy äärimmäisessä aminopäässä, joka on tavanomaisempi sijainti pilkotuille signaalisekvensseille. Vaikka osia sekvenssistä N-terminaalisesti Drosophila-signaalisekvensseihin näh-20 den säilyy, mikä viittaa funktionaaliseen rooliin, hiiri-geenistä puuttuu tämä alue.
Aminohappoidentt isyyden Hhg-1 :n ja hh:n välillä ·;··· kaikenkaikkinen taso karboksiterminaalisesti signaalisek- vensseihin on 46 %. Tarkemmassa tarkastelussa ilmenee, • · • · .·. : 25 että aminoterminaalinen osa, tähteet 25 - 187, osoittaa • · · * 69 %:n identtisyyttä, kun taas loput tähteet karboksiter- • · · minaalisessa osassa osoittavat paljon matalampaa 31 %:n • · · *·’ ’ identtisyyttä. Kuten hh, Hhg-l-kooditussekvenssi on jaettu kolmeksi eksoniksi ja näiden eksonien rajat ovat samoissa • · · 3 0 asemissa kooditussekvenssissä kuin kolmen Drosophila-hh-eksonin. Yllättäen 2. ja 3. eksonin kooditussekvenssien välinen raja on lähellä siirtymäkohtaa kaikenkaikkisen • · · • · ,···. sekvenssikonservaation korkeista mataliin tasoihin. Näiden • · *1* kahden rajan yhteensattuminen viittaa funktionaalisten do- • · · ·.· * 35 meenien näissä proteiineissa mahdolliseen demarkaatioon.
• · 77 Tämä sijainti Hhg-l-kooditussekvenssissä samoin sattuu suunnilleen yhteen oletetun proteolyyttisen pilkkomisen kohtaa.
Esimerkki 10 5 Ihmisen hh-geenien kloonaaminen
Kahden ihmis-hh-geenin osasekvenssi on saatu DNA-sekventoimalla klooneja, jotka on saatu monistamalla PCR:llä genomi-DNA:ta käyttäen hh-spesifisiä degeneroituneita alukkeita, kuten kuvaavat Chang et ai. [Development 10 120 (1994) 3339] ja kuvataan esimerkissä 9 (kuviot 11A ja B) . Laajemmassa seulonnassa saman lähestymistavan mukaan joko samoilla alukkeilla tai muilla alukkeilla hh-koodi-tusalueelta tai ihmis-hh-fragmenteilla, jotka esitetään kuvioissa 11A ja B, odotetaan saatavan ainakin kolmas gee-15 ni, ja mahdollisesti useampia, koska hiiressä tavataan ainakin kolme geeniä. Näitä ihmis-hh-geenisegmenttejä voidaan käyttää kokonaisten kooditussekvenssien saamiseksi ihmisproteiineille seuraavalla kloonausmenetelmällä, jota alan ammattilaiset yleisesti käyttävät ja joita kuvataan 20 runsaasti kirjallisuudessa.
Esimerkiksi valmiita cDNA-kirjastoja tai RNA-sek- :*·.· venssejä erilaisista ihmislähteistä mukaan lukien eri si- • · ·;··· kiövaiheet ja -elimet (aborteista) ja spesifisistä lapsen tai täysikasvuisen elimistä (patologisista tai ruumiin- • · .·. : 25 avausnäytteistä) testataan hh-sekvenssien läsnäolon suh- • ·· .1^ teen PCR:llä tai RT-PCR:llä käyttäen alukkeita, joita ku- • ·· vataan julkaisussa Chang et ai. . supra, ja muita alukkei- • · · * ta, jotka saadaan suoraan ihmisfragmenttien sekvenssistä, hh-sekvenssejä sisältäviä valmiita kirjastoja seulotaan ··· *...· 30 suoraan ja tarvittaessa uusia kirjastoja rakennetaan ta- vanomaisilla menetelmillä hh-sekvenssejä sisältävistä RNA-lähteistä. Koetin näihin seulontoihin on seos kaikista • · · • · .···. erillisistä ihmis-hh-fragmenteista. cDNA-kloonien sekvens- sejä voidaan sitten määrittää. Useimmat koetinsekvenssejä ··· *.* * 35 sisältävät kloonit, jotka sijaitsevat N-alueella, sisältä- « • ♦ 78 vät myös täydellisen C-kooditusalueen, koska kirjaston rakentamisen tavanomaiset menetelmät johtavat cDNA-kloo-neihin, jotka ovat täydellisimpiä 3'-päissään. Kaikki täysimittaiset hh-kooditussekvenssit, jotka on saatu aiemmin 5 selkärankaisista ja selkärangattomista, sisältävät yksittäiseen RNA:han kooditettuja N- ja C-sekvenssejä. Seulomista jatketaan, kunnes saadaan täydellisiä avoimia luku-alueita, jotka vastaavat ihmis-hh-geenien kaikkia fragmentteja. Spesifisesti 1,2 x 106 kloonia ihmisen sikiöaivo-10 kirjastosta (Stratagene, La Jolla, CA) seulottiin käyttäen kahden ihmis-hh-fragmentin seosta (kuviot 11A ja B) koet-timina. 29 kloonin identifioitiin sepsifisesti hybridisoi-tuvan näihin koettimiin.
Toiseksi hh-sekvenssejä sisältäviksi identifioituja 15 RNA-lähteitä voidaan käyttää templaatteina ankkuroidussa PCR:ssä (kutsutaan kirjallisuudessa myös RACE:ksi, cDNA-päiden nopea monistaminen) . Lyhyesti, tämä menetelmä suo keinon 1isä-mRNA-sekvenssin eristämiseksi joko 5'- tai 3'-suuntaan, edellyttäen että tunnetaan sekvenssi sisäisestä 20 alkukohdasta. Ankkuroitua PCR:ää voidaan myös käyttää sekvenssien eristämiseksi cDNA-kirjastosta.
• ·
Kolmanneksi genomikirj astoj a voidaan seuloa ensim- *:·" mäisessä tekniikassa kuvatuilla koettimilla. Tarvittaessa ·'·*: ihmisen hh-eksoneja ja -kooditussekvenssejä identifioidaan • · .*.t! 25 hybridi soimalla aiemmin sekvenssimäärityksellä eristettyi- • · ;·. hin ihmis- ja hiirikooditussekvensseihin, ja eksonisiep- • · · #·... pausmenetelmillä hh-kooditussekvenssien identifioimiseksi • · · genomiklooneista; nämä kooditussekvenssit voidaan "tikoa" ... yhteen tavanomaisilla yhdistelmä-DNA-menetelmillä täydel- • · ’···* 30 listen avointen hh-lukualueiden muodostamiseksi.
* * Kuvioissa 12A ja B esitetään in vitro -pilkkomis- ;V: reaktioita Drosophila-hh-proteiinille. joka on tuotettu Eh_ • · colissa ja puhdistettu homogeeniseksi. Tästä proteiinista ·· · • on tähteet 89 - 254 deletoitu, mikä tekee siitä liukoisem- ··· ' • · · *·* * 35 man ja helpomman puhdistaa. Se sisältää myös His6-puhdis- • · 79 tustarran liitettynä N-päähän. Tämän proteiinin autopro-teolyysin käynnistää pelkistimien (DTT) lisääminen, ja saatava tuote vastaa in vivo identifioitua C-fragmenttia. Kuviossa 12 paneelissa A esitetään pilkkominen ajan funk-5 tiona käynnistyksen DTT:tä lisäämällä jälkeen. Paneelissa B esitetään inkuboinnit pitoisuuksille, jotka vaihtelevat kolme suuruusluokkaa, määrätylle ajalle (4 tuntia), jolloin ei havaita eroa konversion pilkotuksi muodoksi laajuudessa. Tämä pilkkomisen pitoisuudesta riippumaton no-10 peus viittaa pilkkomisen solunsisäiseen mekanismiin. Paneelissa C esitetään pilkkomiskohtaa ympäröivä sekvenssi määritettynä pilkotun fragmentin C aminoterminaalisesta sekvenssistä. Pilkkomiskohta on merkitty nuolella, ja C-fragmentin Edman-pilkkomisella sekventoidut tosiasialli-15 set tähteet on alleviivattu. Paneelissa C esitetään myös kaikkien julkistettujen selkärankais-hh-sekvenssien sekä joidenkin ei-julkistettujen sekvenssien kalasta ja Xeno-pus-organismista rinnanasettelu. Esitetyt sekvenssit vastaavat Drosophila hh:n sitä aluetta, jossa pilkkominen ta-20 pahtuu, ja tästä ilmenee Gly-Cys-Phe-sekvenssin absoluuttinen säilyminen pilkkomiskohdassa. Paneelissa D esitetään • · ·,**: SDS-PAGE-geeli, johon on panostettu in vitro -transkrip- ·:·*: tio/translaatioreaktioita, kuten on kuvattu edellisissä ;*·*: esimerkeissä, käyttäen eri hh-geenejä templaatteina. dhh •\j 25 on Drosophila, twhh ja zfshh ovat seeprakalan "twiggy- • · ;·. winkle"- ja "sonic"-hh-geenit, ja mshh on hiiren shh/Hgh- 1/vhh-I-geeni. Translaatioseos sisälsi 35S-leimattua kys- • · · teiiniä, jota käytettiin autoradiografiatulosten visuali- ,,, soimiseksi. Huomattakoon, että kukin geeni antoi suuremman • · ···* 3 0 tuotteen (prekursori tai U) ja kaksi pienempää pilkkomis- tuotetta (N ja C). Suurempi laji on C kullekin selkäran-kaisgeenille, kun taas Drosophila N on suurempi kuin C, • · ·***. mikä johtuu 60 tähteen läsnäolosta, jotka esiintyvät ami- ··· .1. noterminaalisesti signaalisekvenssiin nähden, joka esiin- • · · ’·* [ 35 tyy selkärankaisen avoimella lukualueella. Tästä paneelis- • · 80 ta ilmenee, että selkärankais-hh-proteiinit prosessoidaan samalla tavalla kuin Drosophila-proteiini. Paneelista E ilmenee, että C-fragmentin Edman-pilkkomisessa vapautuu 35S-tuikkeita ensimmäisellä kierroksella mutta ei seuraa-5 villa kierroksilla kaikille näille proteiineille, mikä osoittaa, että autoproteolyyttisen pilkkomisen kohta kaikille näille hh-proteiineille on amidisidos, joka sijaitsee sen Cys-tähteen aminoterminaalisella puolella, joka muodostaa paneelissa C esitetyn säilyvän Gly-Cys-Phe-sek-10 venssin keskuksen. Tämä on yleistettävissä oleva lähestymistapa proteiinitragmenttien mistä tahansa muusta hh-ryh-mäjäsenestä koostumuksen määrittämiseksi.
Esimerkki 11
Kahden hh-geenin differentiaalinen ilmentyminen 15 aksiaalisessa mesodermissä ja hermojen kantasoluissa
Osasekvenssejä, jotka vastaavat viittä erillistä seeprakalan hh:n kaltaista geeniä, eristettiin ja täydellinen kooditussekvenssi kahdelle näistä geeneistä saatiin alkio-cDNA-kirjastosta. Yksi näistä kahdesta sekvenssistä 20 on identtinen seeprakalan nhh-I-geenin sekvenssiin nähden [Roelink et ai, . Cell 76 (1994) 761], ja vaikuttaa vastaa-: van shh-geeniä, josta ovat raportoineet Krauss et ai.
·:··· rcell 75 (1993) 1431] (katso kuvion 13 selitys) ; toinen {1.1. geeni, "tiggy-winkle" (Potter, B., "The Tale of Mrs. Tig- • 1 : 25 gy-Winkle", The Penguin Group, Lontoo, 1905), edustaa uut- • · · ta selkärankais-hh:ta. Kooditussekvenssit molemmille esi- • · · *... tetään asetettuina sonic/vhh-l-luokan hiiri- ja kananpoi- • · · • kasekvenssien rinnalle (kuvio 13b). Kuten muut selkäran-kais-hh-homologit, twhh- ja shh-proteiinit sisältävät ami- • · *··.1 30 noterminaalisen jakson hydrofobisia tähteitä. Nämä tähteet *·**· toimivat signaalisekvensseinä, koska pilkkomista havai- ·1.1. taan, kun suoritetaan kooditussekvenssien translaatio mik- • · · • · .···. rosomien läsnä ollessa; selkärankais-hh-geenit täten vai- • · ·’ kuttavat koodittavan eritettyjä proteiineja, kuten aiemmin • · · ’·’ 1 35 on raportoitu Drosophila-hh: lie [Kimmel, C.B., ja Warga, · 81 R.M., Developmental Biology 124 (1987) 269 - 280; Warge, R.M., ja Kimmel, C.B., Development 108 (1990) 569 - 580].
Ensimmäiset neljä sekvenssiä eristettiin seepraka-lan genomi-DNA:sta (lahja J. Pellegrinolta) käyttäen dege-5 neroituneita alukkeita polymeraasiketjureaktioissa kuvatun mukaisesti (Chang et ai.. supra) . twhh- ja shh-kloonit eristettiin 20 - 28 tunnin cDNA-kirjastosta (lahja henkilöiltä R. Riggleman, K. Helde, D. Grunwald ja J. Pellegrino) käyttäen ensimmäisiä kolmea sekvenssiä koettimina. 10 Translaation lukualueet twhh:lie ja shh:lle olivat suljetut vastaavasti 12 ja 16 kodonia ylävirtaan oletetusta aloittavasta metioniinista.
Kuviossa 13 esitetään ennustetut aminohapposekvenssit yksikirjainkoodilla. Kuviossa 13(A) esitetään sekvens-15 sit, jotka ovat yhteiset viidelle eri hh:n kaltaiselle geenille, jolloin piste osoittaa identtisyyden seeprakalan "twiggy-winklen" vastaavaan tähteeseen nähden (twhh; Potter, supra, 1905). hh[zfB] ja hh[zfC] on divergoituneempi ja vaikuttaa edustavan uutta luokkaa. Kuviossa 13(B) esi-20 tetään twhh:n ja shh:n aminohapposekvenssit asetettuina sonic/vhh-1-luokan sekvenssien kananpojasta ja hiirestä rinnalle [Riddle et al^, Cell 75 (1993) 1401 - 1416; ·;··: Chang, D.T., et ai. , Development. supra; Echelard, Y., et ·’·*: ai. , Cell 75 (1993) 1431 - 1444] . Seeprakalan "sonic hed- • · .·. : 25 gehog" (shh) on sekvenssiltään identtinen z-vhh-l:een näh- • · · • · :·. den, josta ovat raportoineet Roelink et ai. , Cell 76 • · · \..φ (1994) 761 - 775. Ilmentymisen ja laajan sekvenssi-ident- • · · tisyyden kautta valtaosan kooditusalueesta perusteella tässä raportoidut vhh-1- ja sonic-sekvenssit mahdollisesti *···’ 30 vastaavat Kraussin shh:ta, Cell 75 (1993) 1431 - 1444, * * poiketen dramaattisesti kautta 26 tähteen jakson lähellä karboksipäätä. Rotan vhh-l/sonic-hh (Roelink et ai. , sup- • · .*··. ra) suljettiin pois tästä rinnanasettelusta sen 97 %:n • · · sekvenssi-identtisyyden johdosta ennustettuun hiiripro- • · · ’·* ’ 35 teiiniin nähden. Kaikissa neljässä sekvenssissä identti- • · 82 set tähteet on sijoitettu laatikoihin, jolloin katkoviiva osoittaa aukon rinnanasettelussa. Nuolet osoittavat ennustetun signaalisekvenssipilkkomiskohdan [von Heijne, G., Nucl. Acids Res. 14 (1986) 4683 - 4690] twhh:lle. Kaikille 5 neljälle hh-geenille yhteinen aminoterminaalinen hydrofobinen jakso on varjostettu. Kuviossa 13(C) esitetään hydrofobiseen alueeseen nähden karboksiterminaalisten tähteiden identtisyysprosentti.
Kuviossa 14 esitetään vertailu twhh:n, shh:n ja 10 pax-2:n ilmentymisestä seeprakalan alkiokehityksen aikana. Koko juotoksen in situ -hybridisaatiot 0-36 tunnin alkioille suoritettiin käyttäen muunnosta Tautzin ja Pfeif-len, Chronosoma 98 (1989) 81 - 85, menettelystä sekä anti-sense-koettimia. Transkriptin sijainnin paljastaa alkali-15 nen fosfataasientsyymin purppuran värinen reaktiotuote. Alkioiden asettelu on Westerfieldin, M., mukaan ("The Zebrafish Book", University of Oregon Press, Eugene, 1993) . Transkriptit visualisoitiin in situ -hybridisaa-tiolla kokonaisiin alkioihin. (A, B) twhh-ilmentyminen on 20 yksittäisessä myöhäisen kilpivaiheen alkiossa. (A) Kuva selän puolelta, eläimen napa on ylhäällä. Ilmentymisen : kolmiomuoto on karakteristinen alkion sisäkerroksen sen • · *:··· aksiaalisen keskimmäisen kerroksen muodostaville soluille {'·*. [Statchel, S.E., et ai. . Development 117 (1993) 1261 - • · : 2 5 12 74] . (B) Sivukuva: paksumpi kerros soluja alkion vasem- • · · ;·. maila (selän) puolella on alkiokilpi: kaksi nuolta osoit- • · · *... tavat twhh: n ilmentävät sisäkerrossolut ja ei-ilmentävät • · · # · · * ulkokerrossolut. Anterior on vasemmalla kaikissa seuraa-vissa alkioissa. Selkäpuoli on ylhäällä kaikissa sivuku- • · *···’ 3 0 vissa. (C, D) Yksittäinen alkio ontelo-alkion muodostumi- ·’*· sen päättyessä (100 % epiboly) twhh:n ilmentävillä soluil- la. (D) hännän/selänpuoleinen kuva. Huomaa laaja värjään- * · .*··. tyminen oletetussa häntänystyssä nuolin etupuolella. (E, • · · J) Varhaisen somitogeneesin (11,5 tuntia, 3-4 ruumiin- • · · *·* 35 jaoketta) alkioita; optiset rakkulvat eivät ole alkaneet • · 83 muodostua väliaivojen seinästä. (E, H, K) Sivukuvia kehittyvistä aivoista. (F, I, L) Selkäkuvia kehittyvistä aivoista. (E, F, G) twhh-ilmentymisen paikannus yksittäisessä rivissä soluja, jotka muodostavat pohjalevyn. Nuolenpää 5 osoittaa täplän twhh:n ilmentäviä soluja sivuun häntänys-tystä. (H, I, J) shh:n sijainti, shh ilmentyy myös voimakkaasti kyhmyssä. (I) Sivukuva kehittyvästä hännästä, shh ilmentyy myös voimakkaasti kyhmyssä. (J) Sivukuva kehittyvästä hännästä, shh ilmentyy soluissa, jotka muodostavat 10 pohjalevyn ja selkäjänteen. (K, L, M) pax-2:n sijainti varhaisen optinen rakkulamuodostuksen aikana; (M) esittää myös twhh:n ilmentymistä. (K) 12 tunnin (5-6 ruumiinjao-ketta) alkio. pax-2:n ilmentyminen kehittyvässä optisessa rakkulassa on gradientissa poispäin kyhmystä. Huomaa pax-15 2:n ilmentyminen (tähti) tulevalla keskiaivo-taka-aivora- jalla. (M) twhh:n (nuoli) ja pax-2:n ilmentyminen 6-7 ruumiinjaokevaiheen (13 tuntia) alkiossa. Huomaa twhh:n differentiaalinen ilmentyminen vatsanpuoleisella hermohar-janteella (joka vastaa alkion hermostoputkea muissa selkä-20 rankaisissa) . (N - S) Alkioita somitogeneesin päättyessä (22 - 24 tuntia) . (N, O, P) twhh:n sijainti. (N, O) Kehit- • · tyvät aivot. Huomaa värjääntyneiden solujen eristettyjä ·:1·· ryhmiä vällaivoissa (umpinaiset kolmiot) ja kyhmyssä (nuo- lenpää) , ja pohjalevyn ilmentyminen keski- ja taka-aivojen • · : 25 pohjalla. Pohjalevyn ilmentyminen jatkuu hännän suuntai- • · ;·. sesti akselia pitkin. (N) Sivukuva. (O) Kuva selänpuolel- • · · ta. (P) Sivukuva hännästä. Ilmentyminen on restriktoitu • · · * pohjalevyyn. (Q, R, S) shh:n sijainti. (Q, R) Kehittyvät aivot. (Q) Sivukuva. pax-2:n ilmentyminen korvarakkulassa • » *···1 3 0 on merkitty. (R) Kuva selkäpuolelta. Ilmentyminen kyhmyssä ***· (nuolenpää) ja hermoharjanteella. (S) Sivukuva hännästä.
Ilmentyminen on voimakkainta pohjalevyssä, mutta vastoin • · .1··. Kraussin et ai. , suora, raporttia, sitä on edelleen myös • · ^ selkäjänteessä. Lyhenteet: valkoinen e - alkion ulkoker- • · · *·1 1 35 ros; h - alkion sisäkerros; tb - häntänysty; p - kyhmy; · 84 c - silmä; ον - optinen rakkula; ot - korvarakkula; fp -pohjalevy; ne - selkäjänne; tähti - keskiaivojen ja taka-aivojen raja tai pax-2-leimattu tuleva keskiaivojen ja taka-aivojen raja; t - alkion pääteaivot.
5 Vertaamalla twhh:n ja shh:n ilmentymiskuvioita (Krauss et ai. , supra) ilmenee, että molemmat geenit ilmentyvät pääasiassa keskiviivarakenteissa, vaikkakin on huomattavia eroja mitä tulee ajoitukseen, suu-häntälaajuuteen ja kudosrestriktioon. twhh:n ilmentyminen todetaan 10 ensin ontelo-alkionmuodostuksen aikana selänpuoleisessa keskikerroksessa (kuvio 14A, B); tämä ilmentyminen esiintyy nauhassa, joka vastaa alkiokilven alaryhmää, joka rakenne on analoginen Spemannin "organizer"-rakenteeseen nähden Xenopus-organismissa [Stachel et ai. . Dev. 117 15 (1993) 1261 - 1274, sekä siinä mainitut viitteet; Ho, R., "Seminars in Developmental Biology", 1992, s. 3], Tahdissa supistumis- ja laajenemisliikkeiden kanssa tämä twhh-il-mentymisnauha lyhenee piktin ekvatoriaalista tasoa ja pi-tenee pitkin alkavaa alkioakselia, kunnes ontelo-alkion-20 muodostuksen päätyttyä ilmentyminen tapahtuu koko akselin mitalla (kuviot 14C, D) . Varhain somitogeneesissä twhh- • · ί/.| RNA:ta tavataan restriktoituna oletettuun vatsanpuoleiseen *:*·: hermokudokseen koko ruumiin mitalla (kuviot 14E, F, G) , ·*·*; jolloin ainoan poikkeuksen muodostavat solut häntänystyssä • · .·. : 25 ja lähellä sitä (kuvio 14G) . Vastakkaisesti twhh:n hermo- • · ;·. restriktiolle shh:ta on sekä oletetuissa hermo- että sei- • · · *... käjännesoluissa (kuvio 14J) .
• · · ^ • · · * Somitogeneesin edetessä shh:n ja twhh:n vatsanpuo-leinen keskiviivailmentyminen vähenee suurimmassa osassa • · ’···* 3 0 tulevia etuaivoja, mutta säilyy voimakkaana keskiviivaso- * * lujen etupuoleisessa täplässä tulevien väliaivojen pohjas- ;*:’j sa (kuviot 14E, F twhh: lie; kuviot H, I shh:lle) . Tästä * · .*·*. täplästä syntyy myöhemmin kyhmy [Schmitt, E. A., ja Dow- ling, J.D., J. Comp. Neur. 344 (1994) 532 - 542], joka on • · · *·" ’ 35 väliaivojen etupuolen jatke. Tämä rakenne, joka on keskel- • · 85 la ja juuri suun puoleisesti kehittyviin optisiin varsiin, on se kohta, jota esitämme varhaisen kuviointiaktiivisuu-den paikaksi kehittyville silmille (katso alla). Somitoge-neesin päättyessä sekä twhh että shh ilmentyvät voimak-5 kaasti pohjalevyssä (kuviot 14P, S), vaikkakin shh-trans-kriptit säilyvät todettavina selkäjänteessä tässä vaiheessa ja 36 tunnin kehityksen ajankohtana (kuviot 14S; myöhempää vaihetta ei ole esitetty). Ajankohtana 28 tuntia twhh-transkriptejä tavataan myös pienessä solurykelmässä 10 ensimmäisessä leukapussikaaressa (ei ole esitetty), kuten niinikään raportoidaan shh:lie 33 tunnin kehityksen ajankohtana (Krauss et ai., supra) .
Erot twhh- ja shh-ilmentymisessä ovat ilmeisiä on-telo-alkionmuodostuksen alusta asti, koska twhh-RNA:ta 15 voidaan todeta niinkin varhain kuin kilpivaiheessa, kun taas shh:ta todetaan ensimmäistä kertaa myöhemmin, noin 60 %:n epiboly-vaiheessa (ei ole esitetty; Krauss et ai., supra). Lisäksi twhh-transkriptit ovat restriktoituja hermokudoksiin varhain kehityksessä, ja niitä ei milloinkaan 20 tavata selkäjänteessä (vertaa kuviota 14G kuvioon 14J) . Myöhäisempiä eroja ilmentymisessä ovat erilainen suu-hän- • · i/.j tärestriktio väli- ja keskiaivoissa, ja twhh:n heikompi ja ·:··· enemmän restriktoitu ilmentyminen kyhmyssä (vertaa kuvioi- ·1·1; ta 14N ja 14Q) siten, että twhh-ilmentymisen jälkimmäinen • m : 2 5 domeeni aivoissa vaikuttaa muodostavan shh-domeenin ala- • · · • · ··, ryhmän. Lisäksi shh ilmentyy mutta twhh ei kehittyvässä • ·· [... käsinystyssä (Krauss et ai. . supra) . shh- ja twhh-ilmenty- • · · miskuvioita vertaamalla hh-homologeille seeprakalassa ja muissa selkärankaislajeissa aiemmin raportoituun ilmenee, • · *···1 30 että shh on sonic/vhh-I-luokan seeprakalahomologi, kun ’·’1· taas twhh edustaa uutta selkärankais-hh-luokkaa.
Esimerkki 12 • · · • · .···. Ektooppisen hh-ilmentymisen seeprakalan alkiokehi- • · tyksen aikana kehitykselliset seuraukset • · · '·1 1 35 Tiedon saamiseksi hh-tuotteiden mahdollisista roo- 1 leista kehityksessä ruiskutettiin synteettistä twhh- ja 86 shh-mRNA:ta 1-8 solun alkioihin. Tällä tekniikalla saadaan mosaiikkimainen mutta suhteellisen yhtenäinen ilmen-tymiskuvio, kuten määritettiin β-galaktosidaasia kooditta-valle mRNA:lle (ei ole esitetty). Ilmentymisen tasaisuus 5 on hyvin sopusoinnussa seeprakalan varhaisen alkion koh-talokartoitustutkimusten kanssa [Kimmel ja Warga, supra; Warga ja Kimmel, supra; Heide et ai. , Science 265 (1994) 517 - 520], mikä osoittaa, että blastomeerit läpikäyvät laajamittaista solusekoitusta pilkkomisten aikana ennen 10 ontelo-alkionmuodostusta. Huomaamme, että ilmentymisen mo-saiikkimaisuus aiheutti yllättävän vähän vaihtelua hh-ruiskeen saaneiden alkioiden fenotyypeissä, mikä johtui mahdollisesti hh-geenituotteiden erityksestä.
Alkiot, joihin oli ruiskutettu synteettistä twhh-15 tai shh-mRNA:ta (hh-RNA), osoittivat lukuisia joskin hyvin toistettavia epänormaaliuksia verrattuna verrokkialkioi-hin, joihin ruiskutettiin IacZ-mRNA:ta. Nämä epänormaaliudet, kuten alla esitetään, ovat pääasiassa vajeita aivoissa ja silmissä. Vaikka ektooppisen twhh- ja shh-ilmentymi-20 sen vaikutukset olivat kvalitatiivisesti samankaltaiset, esiintyminen ja voimakkuus olivat suurempia twhh-RNA:lla • · ·/·· (katso seuraava teksti, kuviot 15 ja 16) . Näiden kahden ·;·*: geenin koodittamien proteiinien biologiset aktiivisuudet ·*·*; ovat kvalitatiivisesti samankaltaiset, mutta ilmeisesti • · 25 niiden tehossa on eroja.
• · ;·. Kuviossa 15 esitetään ektooppisen hh:n vaikutukset • · · [... seeprakalan kehitykseen. Villityypin seeprakalaa, Danio • · · * rerio (Ekkwill Waterlife Resources) pidettiin 28,5 °C:ssa, minkä jälkeen joitakin alkioita kasvatettiin yön yli huo- • · ’···* 30 neenlämpötliassa. Seeprakala-alkioihin ruiskutettiin 1-8 * * solun vaiheessa twhh-, shh- tai lacZ-RNA:ta, ja niitä tar- ;V. kasteltiin 28 tunnin kehityksen ajankohtana, (a - c) Sei- * « .·**. käpuolen kuva keskiaivo-taka-aivoalueesta; etupuoli on vasemmalla. (A) IacZ. (B) twhh. (C) shh. (D - F) Frontaa- • · · 35 linen optinen sektio etuaivoalueesta; etupuoli on ylhääl- • « 87 lä. (D) IacZ. (H) twhh. (F) shh. (G - L) Sivukuva silmän alueesta; etupuoli on vasemmalla. (G) IacZ. (H) twhh. (I) twhh. Tasoilla, jotka ovat hännänpuoleisesti tuleviin aivoihin, selkäjänne, ruumiinjaokkeet ja hermoharjänne, jot-5 ka useimmat hh-ruiskeen saaneet alkiot muodostivat, vaikuttivat suurinpiirtein normaaleilta lukuun ottamatta akselin kaikenkaikkista lyhenemistä ja selänmuotoon käyristymistä. Vähäinen osa hh-ruiskeen saaneista alkioista (15 %, ei ole esitetty) osoittivat osittain kahtia haarau-10 tuneita akseleita, jotka sisälsivät kahdentuneen aksiaalisen keskimmäisen kerroksen ja rinnakkaiset hermoharjänteet, jolloin kumpikin hermoharjanne käsitti vatsanpuolei-sia keskiviivasoluja ja joitakin bilateraalisesti symmetrisiä lateraalisia soluja (ei ole esitetty). Vaikka emme 15 ole määrittäneet näiden aksiaalisten defektien pääasiallista syytä, myöhäisen ontelo-alkionmuodostusvaiheen alkioiden analyysi viittaa siihen, että kahtia haarautuminen saattaa olla tulos vaikeuksista epiboly-muodostuksessa ja konvergenssissä. Lyhenteet: mv - keskiaivorakkula; rv -20 ruutuaivorakkula; tähti - keskiaivo-taka-aivoraja; ot -korvarakkula; tv - kolmas (väliaivo-) rakkula; r - verkko- • · :.*·· kalvo tai verkkokalvon kaltainen rakenne; 1 - linssi tai *:**: linssin kaltainen rakenne; pe - pigmentoitu verkkokalvo- ·'·*: epiteeli.
• · ·*..! 25 Morfologisia defektejä aivoissa ja muissa suun ym- • · päryksen hermojohdannaisissa esiintyy korkealla taajuudel- ♦ ·· .·;·. la hh-ruiskeen saaneissa alkioissa. Kala-aivojen kolme • · · rakkulaa, jotka ovat normaalisti läsnä 28 tunnin kehityk- ... sen ajankohtana - ruutuaivo-, keskiaivo- (kuvio 15A) ja • · *···* 30 väliaivo- (kolmas rakkula, kuvio 15D) - eivät muodostu hh- * * ruiskeen saaneiden aivoissa (kuviot 15B, C; kuviot 15E, F) huolimatta putkimaisen rakenteen ontelon ilmeisestä läsnä- • · .··*. olosta.
• · • · · .;. Hallitseva rakenne, joka normaalisti esiintyy kes- • · ·
’·* * 35 kiaivo-taka-aivorajalla, puuttuu myös (vertaa kuviota 15A
• · 88 kuvioihin 15B, C). Tämän rakenteen muodostuminen edellyttää pax-2-funktiota [Krauss et ai. . Nature 353 (1991) 267 - 270; Krauss et ai. . Nature 360 (1992) 87 - 89] , joka normaalisti ilmentyy nauhassa keskiaivo-taka-aivorajalla 5 [Krauss et ai., supra; Krauss et ai., Development 113 (1991) 1193 - 1206]. pax-2-ilmentymistä tällä rajalla ei kuitenkaan häiritse hh-RNA-ruiske, mikä osoittaa, että tämä fenotyyppi ei ole seurausta suu-häntäinformaation häirinnästä.
10 Defektejä silmän kehityksessä esiintyy niinikään korkealla taajuudella alkioissa, joihin on ruiskutettu hh-RNA:ta. Täten, kun ajankohtana 28 tuntia normaalissa seep-rakalan silmässä on linssi ja verkkokalvo pigmentoiduin epiteelein (kuviot 15D, G), hh-ruiskeen saaneet alkiot 15 eivät tavallisesti onnistu kehittämään linssejä ja verkkokalvon pigmentaatiota (kuviot 15E, H). Silmän kahdentumisia havaitaan myös matalilla taajuuksilla (kuvio 151) . Heikosti kehittyneet silmät eivät vaikuta olevan seurausta yksinkertaisesta viivästymisestä kehityksessä, koska pig-20 mentaatio muualla ruiskeen saaneissa alkioissa ilmaantuu normaalilla ajallaan. Kolmen päivän kehityksen ajankohtana • · ·,'·· hh-RNA-ruiskeen seurauksia ovat defektit, jotka vaihtele- *:··: vat silmien täydellisestä puuttumisesta osittain muodostu- ·*·*; neisiin silmiin, joita peittää verkkokalvon vatsanpuolei- • · : 25 nen osa.
• ·· • · hh-RNA-ruiskeen aiheuttamat silmäfenotyypit muis- • ·· tuttavat fenotyypejä, joita saadaan käsittelemällä seepra- • · · kalan ja Xenopus laeviksen alkioita retiniinihapolla. Xe-nopus-organismissa fenotyypit vaihtelevat silmän pienene- • · *···* 30 misestä ja linssin puuttumisesta silmiin, joissa on verk- * * kokalvon laskoksia (muistuttaa kahdentuneita silmiä), ja •V. useita pieniä linssejä [Manns, M., ja Fritzsch, B., Neu- • ♦ .**·. rosci. Lett. 127 (1991) 150 - 154] . Seeprakalassa altis- ··· 4·# taminen retiniinihapolle ontelo-alkiomuodostuksen aikana • · · *·* 35 häiritsee silmän muodostumista [Holder, N., ja Hill, J., • * 89
Development 113 (1991) 1159 - 1170] , kun taas altistus silmäsolukertymän muodostumisen aikana indusoi kahdentuneiden verkkokalvojen ja ylimääräisten linssien muodostumista [Hyatt et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 (1992) 5 8293 - 8297] . Retiniinihapon kuviointivaikutuksia kehitty vään kananpojan raajaan vaikuttaa välittävän endogeenisen "sonic"-hh-geenin ektooppinen aktivaatio (Riddle et ai. , supra), nämä tulokset ektooppisella hh-ilmentymisellä viittaavat mahdollisuuteen, että samankaltainen mekanismi 10 on retiniinihappokäsittelyn kuviointivaikutusten selkäran-kaissilmään pohjana.
Esimerkki 13 hh-ilmentyminen optisessa rakkulassa spesifioi proksimaaliset kohtalot distaalisten kohtaloiden kustan-15 nuksella hh:n roolin silmän kehityksessä edelleen selvittämiseksi käytimme pax-2:ta ja pax-6:ta [Krauss et ai. . EMBO J. 10 (1991) 3609 - 3619; Pitischel et ai. . Development 114 (1992) 643 - 651] asemamerkkeinä ektooppisen hh-ilmen-20 tymisen vaikutusten optiseen rakkulaan tarkastelemiseksi.
Optisen rakkulan muodostuessa seeprakalan etuaivojen late- • · raalisista seinistä [Schmitt, E.A., ja Dowling, J.D., Jk. ·:·1: Comp. Neur. 344 (1994) 532 - 542] pax-2 ilmentyy gradientin1: tina siten, että korkeimmat RNA-tasot ovat optisen rakku- ♦ · ;\j 25 lan etu- ja vatsanpuoleisilla alueilla (Krauss et ai. , • · supra; kuviot 14K, L, M) . Välittömästi tämän pax-2-ilmen- .···. tymisgradientin maksimin vieressä on väliaivojen kyhmyksi • · · kutsuttu alue (Schmitt ja Dowling, supra), jolla sekä twhh ... että shh ilmentyvät voimakkaasti mutta pax-2 ei (kuviot • · *···[ 30 14E, F, H, I, M), pax-2-ilmentymisen pitoisuusgradientti optisessa rakkulassa vaikuttaa siten taipuvan alaspäin :V: maksimistaan kohdassa, joka on twhh- ja shh-ilmentymiskoh- • · ·1". dan vieressä kyhmyssä. Kehityksellisen kohtalon optisessa • · · .;. rakkulassa kerrostaminen (Schmitt et ai. , supra) pax-2-il- • · · • · · · 90 mentymiskuvion päälle viittaa siihen, että pax-2-RNA-gra-dientti kuvaa silmän tulevaa proksimaali/distaaliakselia.
Ektooppinen hh muuttaa pax-2:n, pax-6:n ja F-spon-dinin ilmentymistä. Seeprakala-alkioihin ruiskutettiin 1 -5 8 solun vaiheessa twhh- tai shh-RNA:ta, ja pax-2:n, pax- 6:n tai F-spondinin ilmentymiskuviota tarkasteltiin täys-juotos-in situ -hybridisaatiolla. Kussakin tapauksessa otettiin mukaan verrokkialkioita, joihin oli ruiskutettu lacZ-RNA:ta niiden osoittaessa villityypin ilmentymisku-10 vioita. Alkiovaiheessa optisen rakkulan etu-taka-akseli vastaa silmän tulevaa proksimaali-distaaliakselia. Seuraa-van kehitystunnin aikana optisen rakkulan takareuna eroaa väliaivoista [Schmitt ja Dowling, Comp. Neur. 344 (1994) 532 - 542] .
15 Kumman tahansa hh-RNA.-n ruiskuttaminen aiheuttaa pax-2-ilmentymisen yhtenäisen käynnistymisen optisen rakkulan sekä proksimaali-distaaliakselia että selkä-vatsa-akselia pitkin ensin mainitun alkaessa muodostua. Ektooppinen pax-2-ilmentyminen ilmaantuu samaan aikaan kuin nor-20 maali pax-2-ilmentyminen käynnistyy silmässä, ja joissakin tapauksissa se nähdään myös väliaivoissa optisten rakku- • · ·.*·· loiden välissä. Somitogeneesin päättyessä, jona ajankohta- ·:·*: na pax-2 normaalisti olisi restriktoitu optiseen varteen, ·*·*: pax-2-RNA:ta hh-ruiskeen saaneissa alkioissa todetaan op- • · ;\j 25 tisen rakkulan kaikissa muissa paitsi distaalisimmassa • · osassa.
• · · ,···, Tutkittiin myös ektooppisen hh:n vaikutuksia pax- • · · 6:n ilmentymiseen, joka koodittaa transkriptiotekijää, ,,, joka on kriittinen silmän kehitykselle. Seeprakalan kehi- • · ’···] 30 tyksen 22 tunnin ajankohtana pax-6 ilmentyy normaalisti * * linssissä, ja valtaosassa optisen kupin distaalista osaa [Krauss et ai. , supra; Puschel et ai. . Development 114 • · (1992) 643 - 651] . hh-ruiskeen saaneissa alkioissa pax-6 M· ilmentyy optisessa rakkulassa, vaikka monilla alkioilla on • · · *·* 35 tallella pax-6-ilmentyminen distaalisimmissa soluissa . Mi- • · 91 tä tulee pax-2:een ja pax-6:een asemaidentiteetin merkkeinä, hh-ilmentymisen optisessa rakkulassa voidaan karakterisoida indusoivan proksimaalisia kohtaloita ja repressoi-van distaalisia kohtaloita.
5 Optisen rakkulan distaalinen osa vastustaa eniten hh-indusoituja muutoksia sekä pax-2- että pax-6-geeni-ilmentymisessä . Myöhemmän rotaation johdosta tämä optisen rakkulan distaalinen osa synnyttää kypsän silmän selänpuoleisen osan (Schmitt et ai.. suora); kiinnostavasti tämä 10 on silmän se osa, joka säilyy 3 päivän ikäisissä ruiskeen saaneissa alkioissa, joilla on välifenotyyppi (katso edellä) .
Vauriot pax-6-geenissä on osoitettu syyksi Aniridia- [Ton et ai. , Cell 67 (1991) 1059 - 1074; Glaser et 15 ai.. Nat. Genetics 2 (1992) 232 - 239], Small eve- [Hill et ai., Nature 354 (1992) 522 - 525] ja eyeless [Quiring et ai. , Science 265 (1994) 785 - 789] -mutaatioihin vastaavasti ihmisissä, hiirissä ja Drosoohilassa; pax-6-funk-tio täten vaikuttaa keskeisen tarpeelliselta silmän kehi-20 tykselle Drosoohilassa ja nisäkkäissä. Kuten väitämme tässä, hh-kooditetut aktiivisuudet vaikuttavat myös esittävän • · \*·· osaa selkärankaisen silmän kehityksessä, ja tämä viittaa *:·*: edelleen molekulaariseen samankaltaisuuteen selkärankais- :*·*: ten ja hyönteisten välillä, koska hh:n osuus Drosoohilan • · ;*·.· 25 silmäkehityksessä on perusteellisesti selvitetty (Mohler • · et ai. , suora; Ma et ai. , suora; Heberlein et ai. , suora; .···. Lee et ai. , suora) . hh- ja pax-6-ilmentymisen vastavuoroi- • · · set ja ei-limittyvät kuviot kehittyvässä Drosoohila-si1-... mässä [Ma et ai, . suora; Quiring et ai. . Science 265 ···] 30 (1994) 785 - 789] viittaavat pax-6-repression hh:n toimes ta mahdollisuuteen, mutta se, toimiiko hh samankaltaisilla :V: mekanismeilla selkärankais- ja Drosophila-silmässä, on ky- ;***· symys, joka vaatii lisätutkimuksia.
·«· .1. Hiirissä pax-6-proteiinin annostus on keskeistä • · i * * 35 silmän normaalille kehittymiselle (Hill et ai. . suora) .
• · 92
Small eve -heterotsygootit kehittävät epänormaalin pienen linssin [Hogan et ai. . J. Embryo1. Exp. Moroh. 97 (1986) 95 - 110; Hogan et ai.. Development 103 liite (1988) 115 -119], kuten tekevät myös hh-ruiskeen saaneet alkiot, joil-5 la on heikommat fenotyypit (kuvio 14f). Small eve -homo-tsygootteja, joilta puuttuu linssit, muodostuu lopulta, ja eläimiltä syntyessään puuttuvat silmät (Hogan et ai.. supra; Hogan et ai.. supra), kuten monilta hh-ruiskeen saaneilta alkioilta kolmen päivän kehityksen ajankohtana. Nä-10 mä paralleelit viittavat siihen, että monia myöhempiä sil-mädefektejä, joita havaitaan hh-ruiskeen saaneissa seepra-kaloissa, voi aiheuttaa pax-6:n osittainen tai täydellinen repressio silmän kehityksen aikana.
Esimerkki 14 15 hh:n etuaivoilmentymisen geneettinen puuttuminen aiheuttaa proksimaalisten kohtaloiden menetystä optisessa rakkulassa twhh- ja shh-ilmentymisen kuviot (kuvio 14) ja ek-tooppisen hh-ilmentymisen vaikutukset (kuvio 15) sopivat 20 yhteen shh:n ja twhh:n normaalin roolin silmän kehityksessä kanssa. Mikäli hh-aktiivisuudet todella esittävät nor- • · maalia osaa proksimaalisten kohtaloiden edistämiseksi ke- ·:··· hittyvässä silmässä, hh-aktiivi suuksi en poistamisen voisi ·*·*. odottaa johtavan proksimaalisten kohtaloiden menetykseen.
• · .·. : 25 Alkioissa, jotka ovat homotsygoottisia cvclops-mutaation • · ;·. suhteen, vatsanpuoleiset hermorakenteet eivät onnistu muo- • ·· dostumaan, ja kehittyvät silmät fuusioituvat keskiviivaa • · · • pitkin, jolloin saadaan yksisilmäinen alkio [Hatta et ai.,
Nature 350 (1991) 339 - 341] . Puuttuvia vatsanpuoleisia • · *···* 30 rakenteita cvclops-mutanteissa ovat alueet, joilla havait- • * semme twhh- ja shh-ilmentymistä, minkä vuoksi tarkastelim- me cvclops-mutaation vaikutuksia hh-ilmentymiseen.
.*··. cvcbi6 [Hatta et al^, Nature 350 (1991) 339 - 341], • · · heterotsygoottisia täysikasvuisia (ystävällinen lahja R.
• · · ’·* * 35 Rigglemanilta) synnytettiin, ja niiden jälkeläisiä analy- • · 93 soitiin täysjuotos-in situ -hybridisaatiolla. pax-2- ja joko twhh- tai shh-RNA-sekvenssien toteaminen cyc-mutaation suhteen homotsygoottisissä alkioissa tai niiden vil-lityypin sisaruksissa. twhh-RNA ilmentyy vain cvc-alkioi-5 den oletetussa häntänystyssä (caret). Kuten raportoivat Krauss et ai. . Cell. suora. shh:n hermosolu!lmentyminen on tuhottu cyc-alkioissa. Voimakasta pax-2-ilmentymistä havaittiin villityyppialkioiden optisissa rakkuloissa tämän ollessa merkittävästi vähentynyt cvc-mutanttialkioissa.
10 twhh-RNA:ta cvcloos-alkioissa tavataan vain pienel lä solutäplällä oletetussa häntänystyssä, ja hermosoluil-mentymistä ei todettu missään tarkastellussa myöhäisemmässä vaiheessa. shh:n hermosoluilmentyminen on myös menetetty eve-mutanteissa, vaikkakin ilmentymistä selkäjänteessä 15 on (Krauss et ai., suora; tulostietoja ei ole esitetty).
Koska eve-mutaatio vaikuttaa tuhoavan hh:n ilmentävät solut kehittyvissä aivoissa, tätä mutaatiota voidaan käyttää geneettisenä työkaluna hh-funktion tarpeellisuuden silmän kehitykselle tarkastelemiseksi. Iatta et ai. ; Hatta 20 et al_i., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91 (1994) 2061 - 2065] osoittivat vastikään, että pax-6-ilmentyminen on fuusioi- • · ·.**: tunut keskiviivan kohdalla vatsanpuoleisten keskiviivaso- *:·*: lujen menetyksen johdosta, jotka normaalisti eivät ilmennä pax-6:ta, ja lisäksi pax-2-ilmentyminen eve-mutanttial - • · ;\j 25 kioiden fuusioidussa silmässä on vähentynyt. Laajensimme • · nämä havainnot varhaisempaan vaiheeseen, jossa optiset • ·· .*2«. rakkulat ensiksi muodostuvat, ja totesimme, että pax-2-il- • · · mentyminen on heikkoa, eikä onnistu jatkumaan eye-mutant- ... tien rakkuloissa. Yhdistettyinä ektooppisen hh-ilmentymi- • · *···* 30 sen tuloksiin nämä havainnot viittaavat siihen, että ak- ' * tiivisuuden edistämää hh-signalointia tarvitaan proksimaa- listen kohtaloiden indusoimiseksi silmärakkulassa. Tässä • · .*·*. mallissa ehdotamme, että kyhmy toimii proksimaalisena ku- • · · /mm viointikeskuksena kehittyvälle seeprakalasilmälle tuot- • · · *·* ’ 35 taessaan paikallisen hh-aktiivisuuslähteen.
• · 94
Esimerkki 15 hh-aktiivisuus onteloittaa kehittyvät aivot
Aiemmissa tutkimuksissa on selvitetty signaalien pohjalevystä ja selkäjanteesta tärkeä rooli alkion hermos-5 toputken vatsanpuoleisessa kuvioissa [Jessell, T.M., ja Dodd, J., Cell 69 (1992) 95 - 110]. Esimerkiksi Goulding et ai. , Development 117 (1993) 1001 - 1016, vastikään osoittivat, että selkäjanne- ja pohjalevysiirteet voivat tukahduttaa pax-6:n normaalin lateraalisen ilmentymisen 10 alkion hermostoputkessa. Muissa tuoreissa töissä on osoitettu hh-aktiivisuutta vatsanpuoleisen hermostoputken kuvioinnin ainakin joissakin näkökohdissa [Echelard et ai., Cell 75 (1993) 1417 - 1430; Krauss et ai.. supra; Roelink et ai., supra) ; siten tarkastelimme hh-ruiskeen saaneissa 15 alkioissa pax-6-ilmentymisen vaikutuksia aivoissa.
Seeprakalassa 22 tunnin kehityksen ajankohtana pax-6 ilmentyy väliaivojen selkä-lateraalisilla alueilla sekä taka-aivojen ja selkäytimen vatsa-lateraalisessa domeenis-sa, mikä sulkee pois pohjalevyn ja viereiset solut (Krauss 20 et ai., supra; Puschel et ai., supra). Tämä ilmentymisku-vio on vastavuoroinen sekä twhh:n että shh:n ilmentymisel- • · ·.*·· le väliaivoissa (vertaa kuvioita 14q ja 14i) ja taka-ai- ’!*” voissa. hh-RNA-ruiske aiheutti pax-6:n repression väliai- vojen enemmän vatsanpuoleisessa domeenissa, kun taas se-25 länpuoleisempi ilmentyminen oli ennallaan. Lisäksi pax-6- • · ilmentyminen väheni merkittävsti vatsanpuoleisesti rombo- .·;·. meereissä 1, 2 ja 4, ja joissakin tapauksissa puuttui täy- • · · sin näistä rombomeereistä. Ektooppisesti ilmennettyjen ... hh:n ja pax-6:n repressoiva vaikutus normaaleissa alkiois- • · **·. 30 sa johtuu pax-6 :n repressiosta hh:n ilmentävien likeisten solujen toimesta.
ly: Koska pax-6-ilmentymisen puuttuminen on vatsanpuo- leisen keskiviivan ominaispiirre, pax-6 :n repressio late- • · · .;. raalisissa asemissa viittaa ontelonmuodostukseen. Siten • · · • · · * . 35 twhh:ta ruiskutettiin alkioihin pohjalevymerkin, F-spondin • · 95 (Riddle et ai. , supra), indusoinnin analysoimiseksi. Kuten edellä kuvattiin, ektooppinen twhh indusoi F-spondin-il-mentymistä selänpuoleisemmilla tasoilla keskiaivoissa ja taka-aivojen etuosassa. hh:n vaikutukset sekä pax-6:n että 5 F-spondinin ilmentymiseen viittaavat aivojen ontelonmuo-dostukseen. Vatsanpuoleisten solujen identiteetin ottaminen lateraalisten solujen toimesta saattaisi selittää epäonnistumisen rakkuloiden muodostuksessa (kuviot 15a - f).
twhh:n onteloittavat aktiivisuudet vahvistavat ja 10 laajentavat aktiivisuuksia, jotka on aiemmin raportoitu kananpojan, seeprakalan ja rotan shh/vhh-I-luokan geeneille (Echelard et ai.. supra; Krauss et ai.. supra; Roelink et ai. , supra) . twhh:n varhainen restriktio keskiviivan hermokantasoluihin kuitenkin viittaa siihen, että se saat-15 taa esittää spesifistä osaa pohjalevyn ylläpidon ja laajentumisen homogeneettisissä mekanismeissa [Placzek et ai., Dev. 117 (1993) 205 - 218]. Seeprakalassa villityyp-pisolut cvclops-isännissä voivat myötävaikuttaa ja indusoida viereisiä soluja muodostamaan pohjalevyn, mutta vain 20 kun siirretyt solut muodostavat populaation hermolevyssä eikä selkäjänteessä [Hatta et ai. , Nature 350 (1991) 339 - • · :/·· 341]. Olemme osoittaneet, että cvclops-mutanteissa twhh:n *:·*: keskiviivan ilmentyminen menetetään, kun taas shh-ilmenty- ·*·*: minen säilyy selkäjänteessä (kuvio 18; Krauss et ai. . sup- • · .\j 25 ra shh:lle); yhdessä tarkasteltuina nämä tulokset viittaa- • · vat siihen, että twhh-geeni saattaa koodittaa cvclops-mu- • · · .♦j·. tantissa menetettyä homogeneettistä pohjalevysignaalia.
• · ·
Kananpojassa ja rotassa pohjalevyllä on tallella autoin- ... duktiivinen potentiaali pitkään sen jälkeen, kun selkäjän- • · *···[ 3 0 ne on menettänyt pohjalevyä indusoivat ominaisuutensa huo- * * limatta shh/vhh-l:n jatkuvasta ilmentymisestä selkäjän- teessä [Roelink et ai. . supra; Placzek et ai. , supra; • · .*·*. Yamada et ai. , Cell 73 (1993) 673 - 686] . Vaikka twhh-luo- • · · kan homologeja ei ole raportoitu muissa selkärankaisissa, • · · *·* ’ 35 muiden hh-homologien ilmentyminen enemmän twhh: ta muistut- • · 96 tavissa kuvioissa saattaisi auttaa selittämään nämä ristiriitaisuudet .
Esimerkki 16
Kaksi erillistä signalointiproteiinia on peräisin 5 twhh-kooditetusta prekursorista
Endogeeninen hh-proteiini Drosophilassa esiintyy pääasiassa amino- ja karboksiterminaalisena fragmenttina (N ja vastaavasti C), jotka ovat peräisin suuremman pre-kursorin (U, ei pilkottu) sisäisestä autoproteolyyttisestä 10 pilkkomisesta, jolloin mainittua prekursoria myös esiintyy in vivo mutta matalampina tasoina (Lee et ai. . supra) . Määreet aminoterminaalisessa domeenissa eivät vaikuta välttämättömiltä autoproteolyyttiselle aktiivisuudelle, kun taas karboksiterminaaliseen domeeniin vaikuttavat mu-15 taatiot voivat salvata autoproteolyysin ja laskea aktiivi suutta in vivo (Lee et ai.. supra) . Autoproteolyysin salpaa normaalisti asemassa 329 esiintyvän histidiinin korvaaminen alaniinilla. Tämä histidiini on absoluuttisen muuttumaton kaikkien tunnettujen hh-geenien rinnanasette-20 luissa, ja sen sekvenssikonteksti viittaa katalyyttiseen rooliin autoproteolyysissä (Lee et ai., supra) .
• · *.*·· Kuviossa 17 esitetään seeprakalan 11 twiggy-winkle"- *:··; siilijohdannaisia. Kuviossa 17(A) on kuvia erilaisista ·*·'· avoimista twhh-lukualueista. SS (varjostettu) on ennustet- • · .*. : 25 tu N-terminaalinen signaalisekvenssi näiden proteiinien • · :·. eritykselle, ja se käsittää ensimmäiset 2 7 aminohappoa • * * ....^ kustakin avoimesta lukualueesta. Nuoli osoittaa autopro- • · · teolyyttisen pilkkomisen ennustetun sisäisen kohdan. Ami-... nohappotähdenumerot ovat kuvion 13B mukaiset. Umpinainen • t ’···* 3 0 kolmio merkitsee normaalia päätöskodonia avoimelle twhh- * * lukualueelle. Rakenne UHA sisältää mutaation, joka salpaa autoproteolyysin (histidiini tähteenä 273 on vaihdettu • · .*··. alaniiniksi; katso Lee, J.J., et ai. . supra) . Rakenne • · · U356ha s isältää stop-kodonin aminohappotähteen 357 tilalla • · · *·* 35 sekä H273A-mutaation UHA:ssa. Rakenne N koodittaa twhh:n • · 97 juuri ensimmäisiä 200 aminohappoa. Rakenteesta C on tähteiden 31 - 197 kodonit deletoitu. Kuviossa 17(B) esitetään kaaviollisesti osassa a esitettyjen ilmentämisraken-teiden in vitro -translaatio. Rakenteiden translaatio in 5 vitro suoritettiin 35S-metioniinin läsnä ollessa ja analysoitiin autoradiografisesti SDS-PAGE:n jälkeen. Proteiinituotteet esitetään kaaviollisesti vasemmalla. Vyöhykkeet 1 ja 6: täysimittaisen (Uss) proteiinin autoproteolyysissä syntyy kaksi fragmenttia, N-terminaalinen fragmentti (Nss) 10 ja C-terminaalinen fragmentti (C). Vyöhyke 2: rakenteesta UHa tulee vain twhh-proteiinin ei-pilkottu muoto, joka kulkee yhdessä Uss-twhh:n kanssa autopilkkomisen välityksellä. Vyöhyke 5: rakenne C koodittaa prosessoituja ja ei-proses-soituja muotoja, jotka voidaan nähdä kahtena, lähellä toi-15 siaan kulkevana nauhana. Alimmainen nauha on Uss:n (Δ31-197) autoproteolyysissä syntynyt C-proteiini. Kaikki rakenteet valmistettiin ilmentämisrakenteen T7TStwhh (katso kuvio 15) in vitro -mutagenisoinnilla RPCR-menetelmää käyttäen. Kaikkien rakenteiden sekvenssi vahvistettiin 20 dideoksisekventoinnilla. In vitro -translaatiot suoritettiin valmistajan (Promega) ohjeiden mukaan.
# · ·.**: shh:n, twhh:n ja hiiri-shh/Hhg-1 :n koodittamissa selkärankais-hh-proteiineissa tapahtuu myös autoproteolyy- ·· · { 1 : si, jossa syntyy kaksi pienempää lajia yhdestä suuresta :*·.· 2 5 prekursorista (Lee et ai. . supra; Chang et ai. , supra; • · j\# katso vyöhykkeet 1 ja 6 kuviossa 17B). Muuttumaton histi- diini h. alaniini -mutaatio rakenteen muodostamiseksi, joka • · · koodittaa twhh-proteiinimuotoa, joka ei tule autoproteo- ... lyyttisesti pilkotuksi (UHA) . Olemme myös vieneet mukaan • · ***. 30 nonsense-kodonin ja deletoineet kooditussekvenssisegmentin rakenteiden muodostamiseksi, jotka tuottavat twhh:n joko • ·
ί : : amino- tai karboksiterminaalisen domeenin (vastaavasti N
• · :***; ja C; katso vyöhykkeet 4 ja 5 kuviossa 17B) ; rakenteet • · · Λ. esitetään kaaviollisesti kuviossa 17A. Näiden proteiinien • · · • · · · 98 kohdentamiseksi eritysreitille kaikissa rakenteissa oli tallella normaali twhh-signaalisekvenssi.
Näistä rakenteista transkriptiolla saatuja synteettisiä mRNA-sekvenssejä ruiskutettiin prosessoinnin roolin 5 tarkastelemiseksi ja yksittäisten proteiinitragmenttien aktiivisuuksien määrittämiseksi; tuloksista esitetään yhteenveto taulukossa I ja ne perustuvat kuviossa 15 esitettyihin aktiivisuuksiin. Silmäänpistävin johtopäätös näistä kokeista on, että sekä N että C osoittaa aktiivisuutta, ja 10 että nämä aktiivisuudet ovat erotettavissa. Täten, vaikka sekä N että C kykenevät ektooppisesti aktivoimaan pax-2:n kehittyvässä silmässä tuottaen siten sisäisen ruiskeverro-kin, vain N kykeni tehokkaasti repressoimaan pax-6:n (kuvio 16). Myöhemmät vaikutukset linssin kehittymiseen oli-15 vat myös rajumpia N:lie, mikä sopii yhteen pax-6:n roolin kanssa linssikehityksessä, johon viittaavat sen mutantti-fenotyypit hiirissä (katso Ton, C.C., et ai. , Cell 67 (1991) 1059 - 1074; Glaser, T. , et ai. . Nat. Genetics 2 (1992) 232 - 239; Hill, R.E., et aL·, Nature 354 (1991) 20 522 - 525; Hogan, B.L., et ai., J. Embrvol. Exp. Morph. 97 (1986) 95 - 110; ja Hogan, B.L., et ai., Development 103 :.··! liite (1988) 115 - 119] .
*!**ϊ Tarkasteltaessa delta-N-C:n aktiivisuutta on tär- :***: keää huomata endogeenisten hh-geenien aktiivisuus näissä • · ;\j 25 kokeissa, joita geenejä inhiboi delta-N-C ja sen fragmen- • · tit (lisäkäsittelyn osalta katso esimerkki 18 ja kuvio 18) .
• · · w t * • · ·
Ei-pilkottu UHA-proteiini on vain jonkin verran vä- ... hemmän aktiivinen kuin C pax-2:n indusoinnissa, mutta se • · *·\ 30 ei myöskään kyennyt tukahduttamaan pax-6:ta tehokkaasti (kuvio 16) . Viimeksi mainittu on erityisen merkittävää, koska UHA-proteiinilla (U356HA; katso kuvio 17A, B) on ak- • · ·*’*· tiivisuuksia, jotka eivät merkittävästi poikkea N:stä (ku- ··· .;. vio 16). Täten sen lisäksi, että C-pää käsittää autopro- * · · **[ 35 teolyysille ja pax-2-induktiolle tärkeitä määreitä, se si- • · 99 sältää myös N-terminaalista funkiota inhiboivan domeenin ollessaan ei-pilkotun hh-proteiinin yhteydessä. C-pää voi myös inhiboida N:n vaikutusta molekyylien välisellä mekanismilla (Lai et ai., supra) . Tällaisen inhibitiodomeenin 5 esiintyminen C:ssä viittaa siihen, että autoproteolyysiä voidaan moduloida, jolloin tällainen modulointi saattaisi säädellä hh:n aktiivisuutta in vivo. Tämä mahdollisuus korostaa jossain nimenomaisessa kuviointikeskuksessa ilmennettyjen hh-proteiinien prosessoidusta tilasta varmistumi-10 sen merkitystä mahdollisesti muodostuneiden hh-aktiivi-suuksien ymmärtämiseksi.
Esimerkki 17 hh-signalointiproteiinien kahtaisroolit varhaisessa silmän ja aivojen kuvioinnissa 15 N:n ja C:n normaalien roolien silmän ja aivojen ku vioinnissa ymmärtämiseen Drosophila-hh-geenin N- ja C-johdannaiset voivat tarjota jonkin verran näkemystä. Drosop-hilan N-johdannainen pitäytyy lähellä synteesikohtaansa alkiossa segmentiaalisesti juovitetussa kuviossa [Tabata 20 ja Kornberg, Cell 76 (1994) 89 - 102; Taylor et ai., Mech. Dev. 42 (1993) 89 - 96], se on soluliitteinen soluviljel- • · !.*·· mässä ilmennettynä ja hepariiniagaroosi sitoo sitä tehok- *:*·: kaasti in vitro, mikä viittaa solunulkoiseen matriisiin ·*·*. liittymisen mahdollisuuteen. C-terminaalista fragmenttia • · : 25 sitä vastoin ei hepariiniagaroosi tehokkasti sido, se va- • · ;·. pautuu lähes kvantitatiivisesti ilmentävän soluviljelmän • · · viljelmäsupernatanttiin ja sijaitsee vain diffuusisti ai- • · · kioissa. Vaikka yksittäisten fragmenttien aktiivisuuksia ei ole määritetty, Drosonhilan N:n ja C:n biokemialliset • · *···* 3 0 erot ja kudosjakaumat mahdollisesti selittävät hh:hon Dro- * * soohilan kehityksen aikana liittyvien funktioiden lyhyen ja pitkän matkan luonteen.
• · .*·*. Vaikka seeprakalan N:n ja C:n kudosjakaumia ei tun- • · · /tm neta, niiden aktiivisuudet ektooppisen ilmentymisen määri- • · · *·* * 35 tyksissä viittaavat myös lyhyen ja pitkän matkan funktioi- • · 100 hin tarkasteltuina hh:n, pax-2:n ja pax-6:n normaalien ilmentymiskuvioiden yhteydessä, pax-2-ilmentymisen normaali gradientti optisessa rakkulassa jatkuu huomattavan matkan maksimistaan hh-ilmentymiskohdan vieressä kyhmyssä; 5 ektooppisen C:n kyky aktivoida pax-2 viittaa tämän vuoksi siihen, että yhtäpitävästi C:n jakauman Drosophilassa kanssa seeprakalan C mahdollisesti suorittaa pitkän matkan funktion. Endogeenisen pax-6-ilmentymisen repressio sitä vastoin vaikuttaa olevan lyhyen matkan funktio, koska pax-10 6-ilmentyminen tapahtuu lähellä endogeenistä hh-ilmenty- mistä. pax-6:n tehokas repressio on N:ää tuottavien rakenteiden ominaisuus, ja N:n lyhyen matkan funktio sopisi N:n jakaumaan Drosophilassa.
hh-transfektoiduille soluviljelmille on raportoitu 15 kahdentyyppistä hh-riippuvaista aktiivisuutta. Yksi on ilmeinen pohjalevymerkkien kosketusriippuvainen induktio [Roelink, H., et aJL·, Cell 76 (1994) 761 - 775]; toinen on sklerotomimerkkien induktio alkion presomiittisessä keskikerroksessa, joka induktio on diffuusi ja vaikuttaa pit-20 källä matkalla.
Esimerkki 18 • ·
Xenopus - hh: n karakterisointi ·;·*: 1. Materiaalit ja menetelmät £*.*. cDNA-sekvenssien, jotka koodittavat täysimittaisia • · .·. : 25 Xenopus-siilejä tai koodittavat aminoterminaalisia tai • · · ;·. karboksiterminaalisia domeeneja kytkettyinä eritys johto- • · · *... sekvensseihin, transkriptio suoritettiin in vitro trans- • · · * laatiokelpoisen lähetti-RNA:n saamiseksi. Synteettisiä lähetti -RNA- sekvenssejä ja verrokki mRNA-sekvenssejä mikro- *···* 3 0 ruiskutettiin pilkkomisvaiheen Xenopus - alkioiden eläinna- * * * poihin, minkä jälkeen alkioiden annettiin kehittyä rakku- j*;’j lavaiheeseen, jonka ajankohtana valmistettiin eläinvaippa- * · .*·*. siirteitä alkion ylimmästä 1/4. Näitä rakkulavaippasiir- • · · teitä viljeltiin sitten in vitro fysiologisessa suola- • · ♦ *·* * 35 liuoksessa transformoivan kasvutekijöiden β-ryhmän jäsenen • · 101 yhdistelmä-DNA-ihmisaktiviini-A läsnä ollessa tai puuttuessa. Kaikkien siirteiden annettiin kehittyä, kunnes verrokkialkiot olivat kasvaneet neurula-vaiheeseen tai sammakonpoikasvaiheeseen. Mikä merkittävää, käsittelemättä 5 jätetyt rakkulavaipat differentioituvat alkion ulkokerroksesta epätyypilliseksi orvaskedeksi. Aktiviinilla käsitellyt rakkulavaipat differentioituvat keskikerros- ja hermo-solutyypeiksi. Täten kysymyksenä oli, muuttaisivatko siili tai sen proteolyyttiset johdannaiset solujen differentiaa-10 tiota pois kehittymästä orvaskedeksi ja toiseksi solutyypiksi. Toinen kysymys oli, voiko siili työskennellä aktiviinin kanssa kudoksen normaalin vasteen muuttamiseksi kummalle tahansa tekijälle sinänsä.
Siirteitä uutettiin sitten mRNArn saamiseksi alan 15 ammattilaisten tavanomaisesti käyttämillä menetelmillä, minkä jälkeen mRNArta käytettiin templaattina käänteisko-piojaentsyymin kanssa cDNA:n saamiseksi. cDNArta käytettiin sitten templaattina eri PCR-alukesarjojen kanssa spesifisille geeneille, käänteiskopioijaentsyymi-polymeraasi-20 ketjureaktio eli RT-PCR. Tämä johtaa radioaktiivisten tuotteiden spesifiseen monistukseen, jotka ovat diagnosti-siä siirteissä esiintyneiden lähetti-RNA-sekvenssien läs-·:··· näololle ja tasolle. Näytteet erotettiin polyakryyliamidi- geeleissä, jotka valotettiin röntgenf ilmille kuvioissa • · : 25 esitettyjen nauhojen saamiseksi. Täten tummemmat nauhat • · · .·# 1 vastaavat spesifisen mRNA:n korkeampaa tasoa.
• · · *... Kuvioista 18A ja B ilmenee, että siili indusoi ai- • · · • · · • volisäke- ja etuaivogeenejä, ja voi olla yhteistoiminnassa aktiviinin tai hermoindusorien, kuten noggiinin ja f oi- • · *···1 30 listatiinin, kanssa, jotka aktiviini indusoi kohottamaan *·’1· näiden geenien ilmentymistä siirretyssä alkiokudoksessa.
Kaikista parittomasti numeroiduista vyöhykkeistä puuttuu • i .···. käänteiskopioijaentsyymi RT-PCR-reaktiossa ja ne ovat ne- • · gatiivisia verrokkeja. Kaikissa parillisesti numeroiduissa • · · *·1 1 35 vyöhykkeissä on tämä entsyymi, jolloin saadaan mRNA: Ile · 102 spesifisiä nauhoja. Paneelissa A vyöhykkeet 1-2 ovat verrokkirakkulavaippoja, vyöhykkeet 3-4 ovat Xenopus-siilin ilmentäviä rakkulavaippoja, vyöhykkeet 5-6 ovat aktiviinilla käsiteltyjä verrokkirakkulavaippoja, vyöhyk-5 keet 7-8 ovat siilin ilmentäviä, aktiviinilla käsiteltyjä rakkulavaippoja, ja 9 - 10 ovat prolaktiinin ilmentäviä, aktiviinilla käsiteltyjä rakkulavaippoja verrokeiksi yksinkertaisesti eritetyn proteiinin ilmentämiseksi rakku-lavaipassa. Määritykseen käytetyt alukkeet esitetään kun-10 kin paneelin vasemmanpuoleisessa osassa, eli XAG 1 on se-menttirauhasmerkki, XANF1B on aivolisäkemerkki, otx-A on etuaivomerkki, en-2 on keskiaivo-taka-aivorajan merkki, krox 20 rombomeerispesifinen taka-aivomerkki, HIHbox 6 on taimmaisten taka-aivojen merkki, NCAM on yleinen hermo-15 merkki, aktiviini on verrokki keskikerroksen induktiolle, ja pidennystekijä on positiivinen verrokki sen osoittamiseksi, että kaikissa parillisesta numeroiduissa vyöhykkeissä todella esiintyi cDNA:ta.
XANFlB:ksi merkitty paneeli toteaa aivolisäkegee-20 nin. Vyöhykkeestä 4 (paneeli A) ilmenee, että siili indusoi tämän aivolisäkemerkin, ja siten todennäköisesti ai- • · !.’·· volisäkesolutyyppejä, rakkulavaippasiirteissä (katso myös *:**: kuvio 20, vyöhyke 6, tämän osoittavan voimakkaamman sig- ·*·*: naalin osalta) verrattuna verrokkisiirteisiin siilin puut- • · .'.J 25 tuessa (vyöhyke 2), jotka eivät ilmennä tätä geeniä. Vyö- • · ;·, hykkeestä 6 ilmenee, että aktiviinilla siilin puuttuessa • · · käsitellyt siirteet myös ilmentävät aivolisäkegeenin. Vyö- • · · hykkeestä 8 ilmenee, että sekä siilillä että aktiviinilla ... käsitellyt siirteet tuottavat aivolisäkegeenin korkeimmat • · *···] 30 tasot. Vyöhyke 10 todistaa, että siilin tämä vaikutus on spesifinen, koska prolaktiini, toinen erittyvä proteiini, ei johda tähän aivolisäkegeenin kohonneeseen tasoon.
• * OTX-A-merkitty paneeli toteaa tämän etuaivogeenin.
• · ·
Vyöhykkeestä 4 (ja 6 kuviossa 20) ilmenee, että siili voi • · · *·* ] 35 indusoida tämän hermospesifisen geenin. Vyöhykkeestä 8 • · 103 ilmenee, että tämän hermogeenin taso on korkein sekä ak-tiviinilla että siilillä käsitellyssä kudoksessa suhteessa siiliin yksinään (vyöhyke 4) tai aktiviiniin yksinään (vyöhyke 6) , ja että verrokkisiirteet eivät ilmennä tätä 5 geeniä (vyöhyke 2). Jälleen tämä vaikutus on spesifinen siilille, koska prolaktiini (vyöhyke 10) ei johtanut tämän geenin kohonneeseen ilmentymiseen. XAG-l:llä merkitty paneeli toteaa sementtirauhasspesifisen geenin, ja vyöhykkeestä 4 ilmenee, että siili indusoi tätä geeniä korkealla 10 tasolla.
Paneelissa 18B alkioihin ruiskutettiin N: ää tai AN-C:tä, ja joitakin eläinvaippasiirteitä käsiteltiin ak-tiviinilla ennen viljelyä, kunnes sisarusalkiot saavuttivat häntänystyvaiheen. Vyöhykkeet 1, 2: verrokkieläinvaip-15 poja ruisketta ei saaneista alkioista. Vyöhykkeet 3, 4: verrokkieläinvaippoja ruisketta ei saaneista alkioista, joita oli käsitelty aktiviinilla. Vyöhykkeet 5, 6: eläin-vaippoja alkioista, joihin oli ruiskutettu N:ää ja joita oli käsitelty aktiviinilla. Vyöhykkeet 7, 8: eläinvaippoja 20 alkioista, joihin oli ruiskutettu AN-C:tä ja joita oli käsitelty aktiviinilla. Kun N osoittaa aktiviinilla käsitel- • · lyissä siirteissä samankaltaisia aktiivisuuksia kuin X-bhh *:**: (katso B) , ΔΝ-C tuottaa vastakkaisen vaikutuksen laskien etupuolen ja lisäten takapuolen hermomerkki-ilmentymistä.
• · ;1·.· 25 Kuten esitetään kuviossa 18B, N käyttäytyy kuten X-bhh • · sikäli, että se indusoi XANF-2:n ja Otx-A:n (vyöhyke 6) kohonneita tasoja suhteessa aktiviinilla käsiteltyihin • · · verrokkieläinvaippoihin (vyöhyke 4) . Lisäksi N johtaa myös ... laskuun taempien merkkien, kuten krox-20 ja X/Hbox-6, il- • · *··] 30 mentymisessä, kuten havaitaan X-bhh-ruiskeen jälkeen. N:n aktiivisuudelle (kuvio 4C, vyöhyke 6) vastakkaisesti ΔΝ-C laskee etuhermogeenien XANF-2 tai Otx-A ilmentymistä (ku- ♦ · ·***; vio 4C, vyöhyke 8) aktiviinilla käsitellyissä eläinvai- • · · .;. poissa verrattuna ruisketta ei saaneisiin verrokeihin • · · • · · · 104 (vyöhyke 4) . Lisäksi ΔΝ-C johtaa myös nousuun taempien merkkien ilmentymisessä, kuten En-2 ja X/lhbox-6.
Kuviossa 19 esitetään, että X-bhh modifioi hermo-geeni -ilmentymisen etu-takakuviota siirteissä endogeenis-5 ten hermoinduktorien vaikutuksen alaisena. (A) Selkäpuolen siirteiden eristäminen ruiskeen saaneista alkioista Keller- "sandwichien" (Keller ja Danilchik, 1988; Doniach et ai. . 1992; uudelleenpiirretty lähteestä Doniach, 1993) valmistamiseksi. (B) Keller-"sandwichejä" valmistettiin 10 ruisketta ei saaneista (vyöhykkeet 1 ja 2) ja X-bhh-ruis-keen saaneista (vyöhykkeet 3 ja 4) alkioista, kokonais-RNA eristettiin verrokkialkioiden saavuttaessa vaiheen 20, ja RT~PCR:llä analysoitiin XAG-l:n ja hermomerkkien ilmentymistä. XAG-1 on sementtirauhasmerkki, XANF-2 on etuaivoli-15 säkemerkki, Otx-A on etuaivomerkki, En-2 osoittaa keskiaivo -taka-aivorajän, Krox-20 osoittaa taka-aivojen rornbomee-rit 3 ja 5 ja X/Hbox-β on selkäydinmerkki. N-CAM on yleinen hermomerkki, jonka ilmentyminen ei rajoitu etu-taka-akselille. EF-la-verrokki osoittaa, että verrattava määrä 20 RNArta määritettiin kussakin sarjassa. Huomaa, että X-bhh-käsittely stimuloi XAG-1:n ja etuhermomerkkien ilmentymis- • · tä, kun taas takahermomerkkien ilmentyminen suppressoituu. *:*·: Kuviossa 20B esitetään siiliproteiinien N- ja C-do- meenien erilaiset aktiivisuudet. Kuten edellä kuviossa 18, • · ;*.J 2 5 parittomasti numeroidut vyöhykkeet ovat negatiivisia ver- • · ;·. rokki vyöhykkeitä ja positiivisesti numeroiduissa vyöhyk- • · · .···. keissä esitetään spesifinen geeni-ilmentyminen edellä ku- • · · vatuille merkeille. Siilin N-domeeni on kooditettu raken- ... teeseen nimeltä Xhhl208 (vyöhyke 8) ja C-domeeni on koo- • * '···[ 30 ditettu rakenteeseen nimeltä Xhhldelta27-2G8 (vyöhyke 19) .
Rakennetta Xhhll-1270A (vyöhyke 12) on spesifisesti muta- :V: genisoitu siten, ettei se kykene autoprosessointiin. N- ja • · ;***; C-domeenien kykyä indusoida edellä kuvattuja geenejä ver- ··· .1. rataan verrokkirakkulavaippasiirteisiin (vyöhyke 4) , koko- • · · *·* [ 35 naisiin alkioihin positiivisena verrokkina (vyöhyke 2) , • · 105 mutagenisoidun siilin ilmentäviin rakkulavaippasiirteisiin negatiivisena verrokkina (vyöhyke 14), täyden siili-l:n ilmentäviin rakkulavaippoihin (vyöhyke 6) ja rakkulavaippasiirteisiin, joita on käsitelty riippumattomalla hermo-5 indusorilla, noggiinilla (vyöhyke 16) (löytäjä Richard Harland, University of California, Berkeley).
Tarkastelemalla ensimmäistä paneelia sementtirau-hasmerkin XAG-1 osalta huomataan selvästi, että ehyt siili (vyöhyke 6) ja N-domeeni (vyöhyke 8) ja prosessoinnin suh-10 teen defektiivinen siili (vyöhyke 12) ovat paljon parempia sementtirauhasen indusoimiseksi kuin C-domeeni (vyöhyke 1). Tarkastelemalla toista paneelia havaitaan, että C-do-meeni (vyöhyke 10) on parempi aivolisäkegeenin XANF1B indusoimiseksi kuin N-domeeni (vyöhyke 8). Koska N-domeeni 15 indusoi XAG-1-merkkiä paremmin, kuten kuvattiin kohdassa A edellä, nämä kaksi tulosta yhdessä osoittavat selvästi, että N- ja C-domeenilla on erilaiset aktiivisuudet. Tarkastelemalla loppuja paneeleja ilmenee, että kaikki normaalin siilin kuvatut aktiivisuudet (vyöhyke 6) voidaan 20 määritellä N- ja C-domeenin aktiivisuuksina.
Tarkasteltaessa 3. paneelia, etuaivogeeni otx-A, ilmenee, että sekä N-domeeni (vyöhyke 8) että C-domeeni ·;··· (vyöhyke 10) indusoi tämän geenin samankaltaisia tasoja, f1.'· mutta että prosessoinnin suhteen def ektiivinen siili (vyö- • · : 2 5 hyke 12) on parempi kuin kumpikaan tämän geenin indusoimi- • · · ·· seksi.
• · • · · *... Tarkasteltaessa tämän kuvion 4. paneelia (NCAM) • · · • · · * (sekä kuvion 18 paneeleja EN-2, krox20, XIHboxö ja NCAM) ilmenee, että siili ei indusoi näitä taempia hermogeenejä.
*···’ 30 Huomattakoon, että noggiini (vyöhyke 16) kykenee indusoi- maan aivolisäkegeenin ja etuaivogeenin, mutta se indusoi myös yleisen hermogeenin NCAM, mitä siili ei tee. Tämä • · .1··. osoittaa selvästi, että siili on hermoindusorista noggiini erillinen aktiivisuus, ja että sillä on rajallisempi kyky • · · *·’ ' 3 5 indusoida hermogeene j ä .
· 106
Suoritettiin kokeita Xenoous-alkiossa ruiskuttamalla täysimittaista siili-RNA:ta ja immuunisaostaminen C-do-meenispesifisellä vasta-aineella todisti, että täysimittainen siili tulee itse asiassa prosessoiduksi in vivo 5 selkärankaisissa, mikä sopii aiemmin esimerkeissä Droso-ohilasta esitettyihin tulostietoihin. Täten ajatukset siilin N- ja C-domeenin toteamisen käyttökelpoisuudelle perustuvat sen tietämiseen, että tällaisia domeeneja todella esiintyy kautta siiliprosessoinnin selkärankaisissa. Li-10 säksi sen tietäminen, että siiliprosessointia todella tapahtuu in vivo, luonnollisesti herätti kysymyksen, onko saaduilla N- ja C-domeeneilla riippumatonta aktiivisuutta.
Tulokset kuviossa 18 ovat uusia sikäli kuin ne osoittavat, että siilin aktiivisuutta aivolisäkegeenin ja 15 etuaivogeenin indusoinnissa voidaan tehostaa kasvutekijöiden TGFfe-ryhmällä. Tämän tehostaminen todennäköisesti pätee kuviossa 20A kuvatuille N- ja C-domeeneille, koska analysoidut geenit ovat samat. Tämä tehostuminen johtuu hhm synergistisestä vaikutuksesta hermoja indusoivien 20 tekijöiden kanssa, joita sinänsä indusoivat TGF-S-ryhmä-jäsenet, mukaan lukien, mainittuihin kuitenkaan rajoittu- • · ·.*·· matta, noggiinin ja follistatiinin kaltaiset molekyylit.
*:·*: Kuvion 20 tulostiedoista ilmenee monia tärkeitä ·*·': seikkoja. Ensinnäkin tulostiedot osoittavat, että N- ja • · 25 C-domeenilla on erilainen joskin jonkin verran limittyvä • · ;·. aktiivisuus, ja että N- ja C-aktiivisuudet summattuina • · · selittävät ehyen siiliproteiinin kaiken havaitun aktiivi- • · · suuden. Täten siilin mitä tahansa kliinisiä tai diagnos- ... tisia käyttöjä voitaisiin parantaa käyttämällä N- tai • · *···[ 30 C-domeenia, koska kliiniseen työhön yleensä on toivottavaa käyttää pienintä mahdollista proteiinia, jolla on aktiivi-suutta, koska se vähemmän todennäköisesti synnyttää hai- • · .***. tallisia immuunivasteita, tai muita haitallisia sivuvaiku- • · · .;. tuksia. Toiseksi tulostiedot osoittavat, että C-domeeni on • · · ’·* | 35 parempi kuin N-domeeni aivolisäkegeeni-ilmentymisen indu- • · 107 soimiseksi ja koska se indusoi vähemmän sementtirauhasgee-nejä kuin ehyt siili tai N-domeeni, tämä viittaa siihen, että C-domeeni saattaisi olla käyttökelpoinen kliinisissä tilanteissa, joissa halutaan tehostaa aivolisäkkeen kehi-5 tystä tai ilmentymistä niin spesifisesti kuin mahdollista. Koska aivolisäke on lukuisten hormonien lähde, millä tahansa käsittelyllä aivolisäkesolukasvun ja -aktiivisuuden tehostamiseksi olisi ihanteellisesti niin harvoja sivuvaikutuksia kuin mahdollista, jolloin C-domeeni on varteen 10 otettava ehdokas terapioihin, joissa pyritään tehostuneeseen aivolisäkesolukasvuun ja -funktioon. Kolmanneksi, koskien noggiinia koskevia tutkimuksia, kuviosta 20 ilmenee selvästi, että vaikka sekä siili että noggiini voivat indusoida aivolisäkegeeni-ilmentymistä, siili on spesifi-15 sempi, koska siili ei indusoi yleistä hermomerkkiä NCAM, kun taas noggiini indusoi NCAM:ia sekä aivolisäkettä. Neljänneksi siili, jota mutagenisoitiin prosessoinnin estämiseksi (vyöhyke 12), on yhtä aktiivinen kuin täysimittainen ja villityypin siili (vyöhyke) aivolisäkegeeni-ilmentymi-20 sen indusoimiseksi, mutta prosessoinnin suhteen defektii-vinen siili on parempi etuaivomerkin otx-A indusoimiseksi.
• · ϊ#1.ί Täten siilin joihinkin kliinisiin käyttöihin spesifisten ·;··· solutyyppien indusoimiseksi on mahdollista, että proses- ·’·1. soinnin suhteen defektiivinen siili on parempi kuin nor- • · : 25 maali siili.
• ·« ··. Kuviossa 21 esitetään, miten ΔΝ-C häiritsee X-bhh- • ·· ja N-aktiivisuutta eläinvaippasiirteissä. Alkioihin ruis- • · · * kutettiin eri RNA-sekvenssejä, eläinvaippasiirteitä viljeltiin, kunnes sisarusalkiot saavuttivat häntänystyvai- • · *···1 30 heen (25), jona ajankohtana RT-PCR:llä analysoitiin se- menttirauhasmerkin XAG-1 ja verrokki-RNA:n EF-lcv ilmenty-minen. Vyöhykkeet 1, 2: verrokkieläinvaippoj a ruisketta ei • · .···. saaneista alkioista. Vyöhykkeet 3, 4: eläinvaippoja ai- • m kioista, joihin on ruiskutettu sekä X-bhh- että prolaktii- • · ♦ *·1 1 35 ni-RNA:ta. Vyöhykkeet 5, 6: eläinvaippoja alkioista, joi- ♦ 108 hin on ruiskutettu box-X-bhh:ta ja AN-C:tä. Vyöhykkeet 7, 8: eläinvaippoja alkioista, joihin on ruiskutettu sekä N-että prolaktiini-RNA:ta. Vyöhykkeet 9, 10: eläinvaippoja alkioista, joihin on ruiskutettu sekä N:ää että ÄN-C:tä. 5 N- ja X-bhh-kokeet suoritettiin riippumattomasti, joten absoluuttisia tasoja vyöhykkeissä 3 - 6 ei tulisi verrata absoluuttisiin tasoihin vyöhykkeissä 7-10. Huomaa, että XAG-l:n ilmentymisen induktio X-bhh:lla tai N:llä laskee ruiskutettaessa myös AN-C:tä.
10 X-bhh:n (ÄN-C:n) sisäinen deleetio salpasi X-bhh- ja N-aktiivisuuden siirteissä ja vähensi etuselkärakentei-ta alkioissa. Koska kohonnut hh-aktiivisuus lisää etuher-mogeenien ilmentymistä, ja koska ΔΝ-C vähentää etuselkära-kenteita, nämä toisiaan täydentävät tulostiedot tukevat 15 hh:n roolia hermoindusoinnissa ja etu-takakuvioinnissa.
ΔΝ-C deletoi aminohapot 28 - 194 X-bhh:sta. Primaarisen translaatiotuotteen ennustetaan läpikäyvän signaali-sekvenssipilkkomisen, jossa poistuvat aminohapot 1 - 23, ja läpikäyvän autoproteolyysin. Pilkkomiskohdan Drosophi-20 la-hh:ssa perusteella [Porter et ai. , Nature 374 81995) 363] autoproteolyysissä muodostuisi C-domeeni X-bhh-amino- • · ·.*·· hapoista 198 - 409, sekä ennustettu 7 aminohapon polypep- tidi, joka edustaa aminohappoja 24 - 27 ja 195 - 195 [Lai :***: et ai. . Development 121 (1995) 2349] . AN-C:n vaikutuksen :*·.· 25 hermomerkkeihin analyysi suoritettiin tavanomaisin mene- • * telmin mukaan lukien Northern blot -analyysi ja in situ -hybridisaatio (Lai et ai. . supra, sisällytetään tähän • ♦ · viitteeksi).
... Vaikka ΔΝ-C ei indusoi sementtirauhasmerkkiä XAG-1, • · ·*·] 3 0 se laskee etumaisten ektodermaalisten ja hermomerkkien il
mentymistä aktiviinilla käsitellyissä eläinvaipoissa. Tä-:V: ten AN-C:llä on kyky vaikuttaa hermokuviointiin. ΔΝ-C
·*’*· niinikään edistää nousua takahermomerkeissä aktiviinilla • · • · · käsitellyissä· eläinvaipoissa. ΔΝ-Crn sekoittaminen N:ään • · · ’·* ] 35 tai täysimittaiseen X-bhh:hon suhteessa 1:1 johti sement- • · 109 tirauhasen induktion dramaattiseen inhibitioon eläinvaip-pamäärityksissä, mikä tukee olettamusta, että ΔΝ-C häiritsi X-hh:ta.
Edeltävä julkistus kuvaa yleisesti esillä olevaa 5 keksintöä. Täydellisempi ymmärtäminen voidaan saavuttaa tutustumalla esitettyihin spesifisiin esimerkkeihin, jotka annetaan tässä vain havainnollistamistarkoituksessa tarkoittamatta rajoittaa keksinnön suojapiiriä.
• · • · · • · · • · • · • · · • · · • · • · • · • · · • · · • · ·· t · t · · • • · · • · · • · · 9 999 • · • · ··· • · 9 • · • · 1 • · 1 • · • · · • 1 • 1 ··· • ·· • · · • · · · (1) YLEISET TIEDOT: 110
Sekvenssilistaus (i) HAKIJA: The Johns Hopkins University School of
Medicine, et ai.
(ii) KEKSINNÖN NIMITYS: Uusia siiliperäisiä poly peptide j ä (iii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 20 (iv) KIRJEENVAIHTO-OSOITE: (A) VASTAANOTTAJA: Fish & Richardson P.C.
(B) KATU: 4225 Executive Square, Suite 1400 (C) KAUPUNKI: La Jolla
(D) OSAVALTIO TAI LÄÄNI: CA
(E) MAA: USA
(F) POSTINUMERO: 92037 (v) KONE KOODIMUOTO: (A) VÄLINETYYPPI: Levyke (B) TIETOKONE: IBM PC -yhteensopiva
(C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: PC-DOS/MS-DOS
(D) OHJELMISTO: Patentin Release #1.0, Versio #1.30 (vi) NYKYISEN HAKEMUKSEN TIEDOT: (A) HAKEMUSNUMERO: PCT/US95 (B) JÄTTÖPÄIVÄMÄÄRÄ: 4.12.1995 (C) LUOKITUS: (viii) ASIAMIESTÄ KOSKEVAT TIEDOT: (A) NIMI: Haile, Lisa A.
(B) REKISTERINUMERO: 38 347 (C) VIITE/LUETTELONUMERO: 07265/043WO1 (ix) TIETOLIIKENNEYHTEYSTIEDOT: (A) PUHELIN: 619/678-5070 (B) TELEFAX: 619/5099 (2) SEKVENSSIN NRO 1 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 144 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: kumpikin (D) TOPOLOGIA: kumpikin
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(ix) OMINAISPIIRTEET:
(A) NIMI/SELITYS : CDS
(B) ASEMA: 1 - 142
Ill (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 1: GTG AAA CTG CGG GTG ACC GAG CCC TGG GAC GAA GAT GGC CAC CAC TCA 48
Vai Lys Leu Arg Vai Thr Glu Pro Trp Asp Glu Asp Gly His His Ser 15 10 15 CAG GAG TCT CTG CAC TAC GAG GGC CGC GCA GTG GAC ATC ACC ACG TCT 96
Gin Glu Ser Leu His Tyr Glu Gly Arg Ala Vai Asp Ile Thr Thr Ser 20 25 30 GAC CGC GAC CGC AGC AAG TAC GGC ATG CTG GCC CGC CTG GCG GTG G 142
Asp Arg Asp Arg Ser Lys Tyr Gly Met Leu Ala Arg Leu Ala Vai 35 40 45
AG
144 (2) SEKVENSSIN NRO 2 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 144 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: kumpikin (D) TOPOLOGIA: kumpikin
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(ix) OMINAISPIIRTEET:
(A) NIMI/SELITYS : CDS
(B) ASEMA: 1 - 142 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 2: GTG AAG CTG CGG GTG ACC GAG GGC TGG GAC GAG GAC GGC CAC CAC TCA 48
Vai Lys Leu Arg Vai Thr Glu Gly Trp Asp Glu Asp Gly His His Ser 50 55 60 GAG GAG TCC CTG CAT TAT GAG GGC CGC GCG GTG GAC ATC ACC ACA TCA 96
Glu Glu Ser Leu His Tyr Glu Gly Arg Ala Vai Asp Ile Thr Thr Ser 65 70 75 GAC CGC GAC CGC AAT AAG TAT GGA CTG CTG GCG CGC TTG GCA GTG G 142
Asp Arg Asp Arg Asn Lys Tyr Gly Leu Leu Ala Arg Leu Ala Vai 80 85 90
AG
144 (2) SEKVENSSIN NRO 3 TIEDOT: 112 (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 14 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: ei relevantti (D) TOPOLOGIA: kumpikin (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 3:
Ile Ser Ser His Vai His Gly Cys Phe Thr Pro Glu Ser Thr 15 10 (2) SEKVENSSIN NRO 4 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 14 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: ei relevantti (D) TOPOLOGIA: kumpikin (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 4:
Ser Ile Ser His Met His Gly Cys Phe Thr Pro Glu Ser Thr 15 10 (2) SEKVENSSIN NRO 5 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 14 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: ei relevantti (D) TOPOLOGIA: kumpikin (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 5:
Vai Ala Ala Lys Ser Gly Gly Cys Phe Pro Gly Ser Ala Thr 15 10 (2) SEKVENSSIN NRO 6 TIEDOT: 113 (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 14 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: ei relevantti (D) TOPOLOGIA: kumpikin (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 6:
Vai Ala Ala Lys Ser Asp Gly Cys Phe Pro Gly Ser Ala Thr 15 10 (2) SEKVENSSIN NRO 7 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 14 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: ei relevantti (D) TOPOLOGIA: kumpikin (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 7:
Vai Ala Ala Lys Ser Gly Gly Cys Phe Pro Gly Ser Ala Leu 15 10 (2) SEKVENSSIN NRO 8 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 14 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: ei relevantti (D) TOPOLOGIA: kumpikin (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 8:
Vai Ala Ala Lys Ser Gly Gly Cys Phe Pro Gly Ser Gly Thr 15 10 (2) SEKVENSSIN NRO 9 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 15 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: ei relevantti (D) TOPOLOGIA: kumpikin 114 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 9:
Vai Ala Ala Lys Ser Gly Gly Cys Phe Pro Ala Gly Ala Arg Thr 15 10 15 (2) SEKVENSSIN NRO 10 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 14 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: ei relevantti (D) TOPOLOGIA: kumpikin (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 10:
Vai Ala Ala Lys Thr Gly Gly Cys Phe Pro Ala Gly Ala Gin 15 10 (2) SEKVENSSIN NRO 11 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 14 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: ei relevantti (D) TOPOLOGIA: kumpikin (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 11:
Vai Ala Ala Lys Thr Gly Gly Cys Phe Pro Gly Glu Ala Leu 15 10 (2) SEKVENSSIN NRO 12 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 14 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: ei relevantti (D) TOPOLOGIA: kumpikin (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 12:
Leu Gly Vai Arg Ser Gly Gly Cys Phe Pro Gly Thr Ala Met 15 10 (2) SEKVENSSIN NRO 13 TIEDOT: 115 (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 14 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: ei relevantti (D) TOPOLOGIA: kumpikin (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 13:
Leu Ala Vai Arg Ala Gly Gly Cys Phe Pro Gly Asn Ala Thr 15 10 (2) SEKVENSSIN NRO 14 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 8 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: ei relevantti (D) TOPOLOGIA: kumpikin (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 14:
His Gly His Gly Cys Phe Thr Pro 1 5 (2) SEKVENSSIN NRO 15 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 8 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: ei relevantti (D) TOPOLOGIA: kumpikin (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 15:
His Gly His Gly Cys Phe Thr Pro 1 5 (2) SEKVENSSIN NRO 16 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 8 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: ei relevantti (D) TOPOLOGIA: kumpikin 116 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 16:
Lys Ser Gly Gly Cys Phe Pro Gly 1 5 (2) SEKVENSSIN NRO 17 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 416 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 17:
Met Asp Vai Arg Leu His Leu Lys Gin Phe Ala Leu Leu Cys Phe Ile 15 10 15
Ser Leu Leu Leu Thr Pro Cys Gly Leu Ala Cys Gly Pro Gly Arg Gly 20 25 30
Tyr Gly Lys Arg Arg His Pro Lys Lys Leu Thr Pro Leu Ala Tyr Lys 35 40 45
Gin Phe Ile Pro Asn Vai Ala Glu Lys Thr Leu Gly Ala Ser Gly Lys 50 55 60
Tyr Glu Gly Lys Ile Thr Arg Asn Ser Glu Arg Phe Lys Glu Leu Ile 65 70 75 80
Pro Asn Tyr Asn Pro Asp Ile Ile Phe Lys Asp Glu Glu Asn Thr Asn 85 90 95
Ala Asp Arg Leu Met Thr Lys Arg Cys Lys Asp Lys Leu Asn Ser Leu 100 105 110
Ala Ile Ser Vai Met Asn His Trp Pro Gly Vai Lys Leu Arg Vai Thr 115 120 125
Glu Gly Trp Asp Glu Asp Gly His His Leu Glu Glu Ser Leu His Tyr 130 135 140
Glu Gly Arg Ala Vai Asp Ile Thr Thr Ser Asp Arg Asp Lys Ser Lys 145 150 155 160
Tyr Gly Met Leu Ser Arg Leu Ala Vai Glu Ala Gly Phe Asp Trp Vai 165 170 175
Tyr Tyr Glu Ser Lys Ala His Ile His Cys Ser Vai Lys Ala Glu Asn 180 185 190
Ser Vai Ala Ala Lys Ser Gly Gly Cys Phe Pro Gly Ser Gly Thr Vai 195 200 205
Thr Leu Gly Asp Gly Thr Arg Lys Pro Ile Lys Asp Leu Lys Vai Gly 210 215 220 117
Asp Arg Vai Leu Ala Ala Asp Glu Lys Gly Asn Vai Leu Ile Ser Asp 225 230 235 240
Phe Ile Met Phe Ile Asp His Asp Pro Thr Thr Arg Arg Gin Phe Ile 245 250 255
Vai Ile Glu Thr Ser Glu Pro Phe Thr Lys Leu Thr Leu Thr Ala Ala 260 265 270
His Leu Vai Phe Vai Gly Asn Ser Ser Ala Ala Ser Gly Ile Thr Ala 275 280 285
Thr Phe Ala Ser Asn Vai Lys Pro Gly Asp Thr Vai Leu Vai Trp Glu 290 295 300
Asp Thr Cys Glu Ser Leu Lys Ser Vai Thr Vai Lys Arg Ile Tyr Thr 305 310 315 320
Glu Glu His Glu Gly Ser Phe Ala Pro Vai Thr Ala His Gly Thr Ile 325 330 335
Ile Vai Asp Gin Vai Leu Ala Ser Cys Tyr Ala Vai Ile Glu Asn His 340 345 350
Lys Trp Ala His Trp Ala Phe Ala Pro Vai Arg Leu Cys His Lys Leu 355 360 365
Met Thr Trp Leu Phe Pro Ala Arg Glu Ser Asn Vai Asn Phe Gin Glu 370 375 380
Asp Gly Ile His Trp Tyr Ser Asn Met Leu Phe His Ile Gly Ser Trp 385 390 395 400
Leu Leu Asp Arg Asp Ser Phe His Pro Leu Gly Ile Leu His Leu Ser 405 410 415 (2) SEKVENSSIN NRO 18 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 418 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 18:
Met Arg Leu Leu Thr Arg Vai Leu Leu Vai Ser Leu Leu Thr Leu Ser 15 10 15
Leu Vai Vai Ser Gly Leu Ala Cys Gly Pro Gly Arg Gly Tyr Gly Arg 20 25 30
Arg Arg His Pro Lys Lys Leu Thr Pro Leu Ala Tyr Lys Gin Phe Ile 35 40 45
Pro Asn Vai Ala Glu Lys Thr Leu Gly Ala Ser Gly Arg Tyr Glu Gly 50 55 60 118
Lys Ile Thr Arg Asn Ser Glu Arg Phe Lys Glu Leu Thr Pro Asn Tyr 65 70 75 80
Asn Pro Asp lie lie Phe Lys Asp Glu Glu Asn Thr Gly Ala Asp Arg 85 90 95
Leu Met Thr Gin Arg Cys Lys Asp Lys Leu Asn Ser Leu Ala lie Ser 100 105 110
Val Met Asn His Trp Pro Gly Val Lys Leu Arg Val Thr Glu Gly Trp 115 120 125
Asp Glu Asp Gly His His Phe Glu Glu Ser Leu His Tyr Glu Gly Arg 130 135 140
Ala Val Asp lie Thr Thr Ser Asp Arg Asp Lys Ser Lys Tyr Gly Thr 145 150 155 160
Leu Ser Arg Leu Ala Val Glu Ala Gly Phe Asp Trp Val Tyr Tyr Glu 165 170 175
Ser Lys Ala His lie His Cys Ser Val Lys Ala Glu Asn Ser Val Ala 180 185 190
Ala Lys Ser Gly Gly Cys Phe Pro Gly Ser Ala Leu Val Ser Leu Gin 195 200 205
Asp Gly Gly Gin Lys Ala Val Lys Asp Leu Asn Pro Gly Asp Lys Val 210 215 220
Leu Ala Ala Asp Ser Ala Gly Asn Leu Val Phe Ser Asp Phe lie Met 225 230 235 240
Phe Thr Asp Arg Asp Ser Thr Thr Arg Arg Val Phe Tyr Val lie Glu 245 250 255
Thr Gin Glu Pro Val Glu Lys lie Thr Leu Thr Ala Ala His Leu Leu 260 265 270
Phe Val Leu Asp Asn Ser Thr Glu Asp Leu His Thr Met Thr Ala Ala 275 280 285
Tyr Ala Ser Ser Val Arg Ala Gly Gin Lys Val Met Val Val Asp Asp 290 295 300
Ser Gly Gin Leu Lys Ser Val lie Val Gin Arg lie Tyr Thr Glu Glu 305 310 315 320
Gin Arg Gly Ser Phe Ala Pro Val Thr Ala His Gly Thr lie Val Val 325 330 335
Asp Arg lie Leu Ala Ser Cys Tyr Ala Val lie Glu Asp Gin Gly Leu 340 345 350
Ala His Leu Ala Phe Ala Pro Ala Arg Leu Tyr Tyr Tyr Val Ser Ser 355 360 365
Phe Leu Phe Pro Gin Asn Ser Ser Ser Arg Ser Asn Ala Thr Leu Gin 370 375 380
Gin Glu Gly Val His Trp Tyr Ser Arg Leu Leu Tyr Gin Met Gly Thr 385 390 395 400 119
Trp Leu Leu Asp Ser Asn Met Leu His Pro Leu Gly Met Ser Val Asn 405 410 415 (2) SEKVENSSIN NRO 19 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 425 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: ei relevantti (D) TOPOLOGIA: kumpikin (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 19:
Met Vai Glu Met Leu Leu Leu Thr Arg lie Leu Leu Val Gly Phe lie 15 10 15
Cys Ala Leu Leu Val Ser Ser Gly Leu Thr Cys Gly Pro Gly Arg Gly 20 25 30 lie Gly His Arg Arg His Pro Lys Lys Leu Thr Pro Leu Ala Tyr Lys 35 40 45
Gin Phe lie Pro Asn Val Ala Glu Lys Thr Leu Gly Ala Ser Gly Arg 50 55 60
Tyr Glu Gly Lys lie Thr Arg Asn Ser Glu Arg Phe Lys Glu Leu lie 65 70 75 80
Pro Asn Tyr Asn Pro Asp lie lie Phe Lys Asp Glu Glu Asn Thr Gly 85 90 95
Ala Asp Arg Leu Met Thr Cys Arg Cys Lys Asp Lys Leu Asn Ala Leu 100 105 110
Ala lie Ser Val Met Asn Cys Trp Pro Gly Val Met Leu Arg Val Thr 115 120 125
Glu Gly Trp Asp Glu Asp Gly His His Ser Lys Glu Ser Leu His Tyr 130 135 140
Glu Gly Arg Ala Val Asp lie Thr Thr Ser Asp Arg Asp Arg Ser Lys 145 150 155 160
Tyr Gly Met Leu Ala Arg Leu Ala Val Glu Ala Gly Phe Asp Trp Val 165 170 175
Tyr Tyr Glu Ser Lys Ala His lie Cys Ser Val Lys Ala Glu Asn Ser 180 185 190
Val Ala Ala Lys Ser Gly Gly Cys Phe Pro Gly Ser Ala Thr Val His 195 200 205
Leu Glu His Gly Gly Thr Lys Leu Val Lys Asp Leu Ser His Gly Asp 210 215 220
Arg Val Leu Ala Ala Asp Ala Asp Gly Arg Leu Leu Val Ser Asp Phe 225 230 235 240 120
Leu Leu Thr Phe Leu Asp Arg Met Asp Ser Ser Arg Lys Leu Phe Tyr 245 250 255
Val lie Glu Thr Arg Gin Pro Arg Ala Arg Leu Leu Leu Thr Ala Ala 260 265 270
His Leu Leu Phe Val Ala Pro Gin His Asn Gin Ser Glu Ala Thr Gly 275 280 285
Ser Thr Ser Gly Gin Ala Leu Phe Ala Ser Asn Val Lys Pro Gly Gin 290 295 300
Pro Val Val Val Leu Gly Glu Gly Gly Gin Gin Leu Leu Pro Ala Ser 305 310 315 320
Val His Ser Val Ser Leu Arg Glu Glu Ala Ser Gly Ala Tyr Ala Pro 325 330 335
Thr Thr Ala Cys Gly Thr lie Leu lie Asn Arg Val Leu Ala Ser Cys 340 345 350
Tyr Ala Val lie Glu Glu His Ser Trp Ala His Ala Ala Phe Ala Pro 355 360 365
His Arg Leu Ala Gin Gly Leu Leu Ala Ala Leu Cys Pro Asp Gly Ala 370 375 380 lie Pro Thr Ala Ala Thr Thr Thr Thr Gly lie His Trp Tyr Ser Arg 385 390 395 400
Leu Leu Tyr Arg lie Gly Ser Trp Val Leu Asp Gly Asp Ala Leu His 405 410 415
Pro Leu Gly Met Val Ala Pro Ala Ser 420 425 (2) SEKVENSSIN NRO 20 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 437 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 20:
Met Leu Leu Leu Leu Ala Arg Cys Phe Leu Val lie Leu Ala Ser Ser 15 10 15
Leu Leu Val Cys Pro Gly Leu Ala Cys Gly Pro Gly Arg Gly Phe Gly 20 25 30
Lys Arg Arg His Pro Lys Lys Leu Thr Pro Leu Ala Tyr Lys Gin Phe 35 40 45 lie Pro Asn Val Ala Glu Lys Thr Leu Gly Ala Ser Gly Arg Tyr Glu 50 55 60 121
Gly Lys Ile Thr Arg Asn Ser Glu Arg Phe Lys Glu Leu Thr Pro Asn 65 70 75 80
Tyr Asn Pro Asp lie lie Phe Lys Asp Glu Glu Asn Thr Gly Ala Asp 85 90 95
Arg Leu Met Thr Gin Arg Cys Lys Asp Lys Leu Asn Ala Leu Ala lie 100 105 110
Ser Val Met Asn Gin Trp Pro Gly Val Lys Leu Arg Val Thr Glu Gly 115 120 125
Trp Asp Glu Asp Gly His His Ser Glu Glu Ser Leu His Tyr Glu Gly 130 135 140
Arg Ala Val Asp lie Thr Thr Ser Asp Arg Asp Arg Ser Lys Tyr Gly 145 150 155 160
Met Leu Ala Arg Leu Ala Val Glu Ala Gly Phe Asp Trp Val Tyr Tyr 165 170 175
Glu Ser Lys Ala His lie His Cys Ser Val Lys Ala Glu Asn Ser Val 180 185 190
Ala Ala Lys Ser Gly Gly Cys Phe Pro Gly Ser Ala Thr Val His Leu 195 200 205
Glu Gin Gly Gly Thr Lys Leu Val Lys Asp Leu Arg Pro Gly Asp Arg 210 215 220
Val Leu Ala Ala Asp Asp Gin Gly Arg Leu Leu Tyr Ser Asp Phe Leu 225 230 235 240
Thr Phe Leu Asp Arg Asp Glu Gly Ala Lys Lys Val Phe Tyr Val lie 245 250 255
Glu Thr Leu Glu Pro Arg Glu Arg Leu Leu Leu Thr Ala Ala His Leu 260 265 270
Leu Phe Val Ala Pro His Asn Asp Ser Gly Pro Thr Pro Gly Pro Ser 275 280 285
Ala Leu Phe Ala Ser Arg Val Arg Pro Gly Gin Arg Val Tyr Val Val 290 295 300
Ala Glu Arg Gly Gly Asp Arg Arg Leu Leu Pro Ala Ala Val His Ser 305 310 315 320
Val Thr Leu Arg Glu Glu Glu Ala Gly Ala Tyr Ala Pro Leu Thr Ala 325 330 335
His Gly Thr lie Leu lie Asn Arg Val Leu Ala Ser Cys Tyr Ala Val 340 345 350 lie Glu Glu His Ser Trp Ala His Arg Ala Phe Ala Pro Phe Arg Leu 355 360 365
Ala His Ala Leu Leu Ala Ala Leu Ala Pro Ala Arg Thr Asp Gly Gly 370 375 380
Gly Gly Gly Ser He Pro Ala Ala Gin Ser Ala Thr Glu Ala Arg Gly 385 390 395 400 122
Ala Glu Pro Thr Ala Gly Ile His Trp Tyr Ser Gin Leu Leu Tyr His 405 410 415
Ile Gly Thr Trp Leu Leu Asp Ser Glu Thr Met His Pro Leu Gly Met 420 425 430
Ala Vai Lys Ser Ser 435

Claims (28)

1. Oleellisesti puhdas polypeptidi, tunnettu siitä, että se on selkärankaisten siiliproteiinin biologi- 5 sesti aktiivinen fragmentti, joka saadaan (a) selkärankaisten siiliproteiinin aminoterminaa-lisista aminohapoista ja sen karboksipäässä on G'CF-pilkko-miskohta, jonka spesifisesti tunnistaa natiivin siilipoly-peptidin karboksiterminaalisen fragmentin proteolyyttinen 10 aktiivisuus, ja sillä on sekvenssin tunnusnumero SEQ ID NO: 1 tai sekvenssin tunnusnumero SEQ ID NO: 2 mukainen aminohapposekvenssi tai sekvenssin tunnusnumero SEQ ID NO: 17 aminohappojen 27 - 200, sekvenssin tunnusnumero SEQ ID NO: 18 aminohappojen 1 - 197, sekvenssin tunnusnumero SEQ ID 15 NO: 18 aminohappojen 25 - 197, sekvenssin tunnusnumero SEQ ID NO: 19 aminohappojen 1 - 200, sekvenssin tunnusnumero SEQ ID NO: 19 aminohappojen 27 - 200, sekvenssin tunnusnumero SEQ ID NO: 20 aminohappojen 1 - 198 tai sekvenssin tunnusnumero SEQ ID NO: 20 aminohappojen 25 - 198 mukainen 20 aminohapposekvenssi; tai (b) selkärankaisten siiliproteiinin karboksitermi-naalisista aminohapoista ja sen aminopäässä on G'CF-pilkko-miskohta, jonka spesifisesti tunnistaa natiivin siilipoly-peptidin karboksiterminaalisen fragmentin proteolyyttinen 25 aktiivisuus, ja sillä on sekvenssin tunnusnumero SEQ ID NO: 17 aminohappojen 201 - 416, sekvenssin tunnusnumero SEQ ID NO: 18 aminohappojen 198 - 418, sekvenssin tunnusnumero SEQ ID NO: 19 aminohappojen 201 - 425 tai sekvenssin tunnusnu mero SEQ ID NO: 20 aminohappojen 199 - 437 mukainen amino-30 happosekvenssi, jolloin polypeptidi ektopikaalisesti aktivoi pax-2:n kehittyvissä aivoissa.
2. Patenttivaatimuksen 1 kohdan (a) mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että se lisäksi käsittää ami- 35 noterminaalisen pään lipofiilisen modifikaation.
3. Patenttivaatimuksen 1 kohdan (a) mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että se koostuu sekvenssin tunnusnumero SEQ ID NO: 17 aminohappojen 1 - 200, sekvens sin tunnusnumero SEQ ID NO: 17 aminohappojen 27 - 200, sek-5 venssin tunnusnumero SEQ ID NO: 18 aminohappojen 1 - 197, sekvenssin tunnusnumero SEQ ID NO: 18 aminohappojen 25 - 197, sekvenssin tunnusnumero SEQ ID NO: 19 aminohappojen 1 - 200, sekvenssin tunnusnumero SEQ ID NO: 19 aminohappo jen 27 - 200, sekvenssin tunnusnumero SEQ ID NO: 20 amino-10 happojen 1 - 198 tai sekvenssin tunnusnumero SEQ ID NO: 20 aminohappojen 25 - 198 mukaisten aminohapposekvenssien konservatiivisesta variantista, jolloin polypeptidi käsittää konservatiivisen variaation ainakin yhdessä aminohappotähteessä .
4. Patenttivaatimuksen 1 kohdan (a) mukainen poly peptidi, tunnettu siitä, että polypeptidi käsittää sekvenssin tunnusnumero 1 tai 2.
5. Patenttivaatimuksen 1 kohdan (a) mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että polypeptidi käsittää ami-20 nohapot, jotka ovat konservoituneita sekvenssin tunnusnumero SEQ ID NO: 17 aminohappojen 1 - 200, sekvenssin tunnusnumero SEQ ID NO: 17 aminohappojen 27 - 200, sekvenssin tunnusnumero SEQ ID NO: 18 aminohappojen 1 - 197, sekvenssin tunnusnumero SEQ ID NO: 18 aminohappojen 25 - 197, sek-25 venssin tunnusnumero 19 aminohappojen 1 - 200, sekvenssin tunnusnumero SEQ ID NO: 19 aminohappojen 27 - 200, sekvenssin tunnusnumero SEQ ID NO: 20 aminohappojen 1 - 198 tai sekvenssin tunnusnumero SEQ ID NO: 20 aminohappojen 25 -198 välillä.
6. Patenttivaatimuksen 1 kohdan (a) mukainen poly peptidi, tunnettu siitä, että polypeptidi koostuu sekvenssin tunnusnumero SEQ ID NO: 17 aminohapoista 1 - 200, sekvenssin tunnusnumero SEQ ID NO: 17 aminohapoista 27 - 200, sekvenssin tunnusnumero SEQ ID NO: 18 aminohapoista 35 1 - 197, sekvenssin tunnusnumero SEQ ID NO: 18 aminohapois ta 25 - 197, sekvenssin tunnusnumero SEQ ID NO: 19 aminoha- poista 1 - 200, sekvenssin tunnusnumero SEQ ID NO: 19 aminohapoista 27 - 200, sekvenssin tunnusnumero SEQ ID NO: 20 aminohapoista 1 - 198 tai sekvenssin tunnusnumero SEQ ID NO: 20 aminohapoista 25 - 198.
7. Patenttivaatimuksen 1 kohdan (b) mukainen poly- peptidi, jolloin polypeptidi koostuu sekvenssin tunnusnumero SEQ ID NO: 17 aminohappojen 201 - 416, sekvenssin tun nusnumero SEQ ID NO: 18 aminohappojen 198 - 418, sekvenssin tunnusnumero 19 aminohappojen 201 - 425 tai sekvenssin tun- 10 nusnumero SEQ ID NO: 20 aminohappojen 199 - 437 konserva tiivisesta variantista, jolloin polypeptidi käsittää konservatiivisen variaation ainakin yhdessä aminohappotähteessä .
8. Patenttivaatimuksen 1 kohdan (b) mukainen poly- 15 peptidi, jolloin polypeptidi koostuu sekvenssin tunnusnumero SEQ ID NO: 17 aminohappojen 201 - 416, sekvenssin tun nusnumero SEQ ID NO: 18 aminohappojen 198 - 418, sekvenssin tunnusnumero SEQ ID NO: 19 aminohappojen 201 - 425 tai sekvenssin tunnusnumero SEQ ID NO: 20 aminohappojen 199 - 437 20 konservatiivisesta variantista.
9. Patenttivaatimuksen 1 kohdan (b) mukainen poly peptidi, jolloin polypeptidi koostuu sekvenssin tunnusnumero SEQ ID NO: 17 aminohapoista 201 - 416, sekvenssin tun nusnumero SEQ ID NO: 18 aminohapoista 198 - 418, sekvenssin 25 tunnusnumero SEQ ID NO: 19 aminohapoista 201 - 425 tai sekvenssin tunnusnumero SEQ ID NO: 20 aminohapoista 199 - 437.
10. Eristetty polynukleotidisekvenssi, tunnettu siitä, että se koodittaa patenttivaatimuksen 1 mukaista po-lypeptidiä.
11. Yhdistelmä-DNA-ilmentämisvektori, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 10 mukaisen po-lynukleotidisekvenssin.
12. Isäntäsolu, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 11 mukaisen ilmentämisvektorin.
13. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen polypeptidin käyttö menetelmässä polypeptidiin sitoutuvan vasta-aineen puhdistamiseksi.
14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen käyttö, tun- 5 nettu siitä, että vasta-aine on polyklonaalinen.
15. Patenttivaatimuksen 13 mukainen käyttö, tun nettu siitä, että vasta-aine on monoklonaalinen.
16. Farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että se käsittää jonkin patenttivaatimuksen 1-9 mukaisen 10 polypeptidin ja farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan käytettäväksi hermosolujen lisääntymisen tai erilaistumisen moduloimiseksi.
17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että modulointi on lisääntymisen tai eri- 15 laistumisen indusointi.
18. Patenttivaatimuksen 16 tai 17 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että hermosolut saadaan hermosolujen pöhjalevystä.
19. Jonkin patenttivaatimuksen 16 - 18 mukainen 20 koostumus, tunnettu siitä, että hermosolut ovat liikehermosolu j a.
20. Jonkin patenttivaatimuksen 16 - 18 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että hermosolut ovat selkärankaisen hermosoluja.
21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen koostumus, tun nettu siitä, että selkärankainen on ihminen.
22. Patenttivaatimuksen 16 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että solu lisäksi saatetaan kosketuksiin TGF-p-ryhmän jäsenen kanssa.
23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen koostumus, tun nettu siitä, että TGF-β on aktiviini.
24. Patenttivaatimuksen 16 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että solu lisäksi saatetaan kosketuksiin hermoinduktioaineen kanssa.
25. Patenttivaatimuksen 24 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että hermoinduktioaine valitaan ryhmästä, jonka muodostavat noggiini, follistatiini ja neurotrofiini.
26. Autoproteolyyttinen fuusioproteiini, tunnet -5 t u siitä, että se käsittää ensimmäisen polypeptidin, joka sisältää proteolyyt-tisen domeenin polypeptidistä, joka käsittää sekvenssin tunnusnumero SEQ ID NO: 17 aminohappojen 201 - 416, sek venssin tunnusnumero SEQ ID NO: 18 aminohappojen 198 - 418, 10 sekvenssin tunnusnumero SEQ ID NO: 19 aminohappojen 201 - 425 tai sekvenssin tunnusnumero SEQ ID NO: 20 aminohappojen 199 - 437 mukaisen aminohapposekvenssin, jolloin mainittu ensimmäinen polypeptidi ektopikaalisesti aktivoi pax-2:n kehittyvissä aivoissa, 15 ensimmäisen polypeptidin tunnistaman katkaisukohdan ja toisen polypeptidin.
27. Polynukleotidi, tunnettu siitä, että se koo-dittaa patenttivaatimuksen 26 mukaista fuusioproteiinia.
28. Menetelmä autoproteolyyttisen fuusioproteiinin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että kytketään operatiivisesti ensimmäinen polynukleotidi, joka koodittaa ensim mäistä polypeptidiä, joka sisältää proteolyyttisen domeenin polypeptidistä, joka käsittää sekvenssin tunnusnumero SEQ 25 ID NO: 17 aminohappojen 201 - 416, sekvenssin tunnusnumero SEQ ID NO: 18 aminohappojen 198 - 418, sekvenssin tunnusnumero SEQ ID NO: 19 aminohappojen 201 - 425 tai sekvenssin tunnusnumero SEQ ID NO: 20 aminohappojen 199 - 437 mukaisen aminohapposekvenssin, jolloin mainittu ensimmäinen polypep-30 tidi ektopikaalisesti aktivoi pax-2:n kehittyvissä aivoissa, ja ensimmäisen polypeptidin tunnistaman katkaisukohdan, toiseen polynukleotidiin, joka koodaa toista polypeptidiä.
FI972312A 1994-12-02 1997-05-30 Uusia siiliperäisiä polypeptidejä FI121366B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/349,498 US6281332B1 (en) 1994-12-02 1994-12-02 Hedgehog-derived polypeptides
US34949894 1994-12-02
US9515463 1995-12-04
PCT/US1995/015463 WO1996017924A2 (en) 1994-12-02 1995-12-04 Novel hedgehog-derived polypeptides

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI972312A0 FI972312A0 (fi) 1997-05-30
FI972312A FI972312A (fi) 1997-12-30
FI121366B true FI121366B (fi) 2010-10-29

Family

ID=23372653

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI972312A FI121366B (fi) 1994-12-02 1997-05-30 Uusia siiliperäisiä polypeptidejä

Country Status (9)

Country Link
US (2) US6281332B1 (fi)
EP (1) EP0793502A4 (fi)
JP (2) JPH11500605A (fi)
KR (2) KR20040064700A (fi)
AU (2) AU4370596A (fi)
CA (1) CA2206509C (fi)
FI (1) FI121366B (fi)
NO (1) NO323079B1 (fi)
WO (2) WO1996017924A2 (fi)

Families Citing this family (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6165747A (en) * 1993-12-30 2000-12-26 President & Fellows Of Harvard College Nucleic acids encoding hedgehog proteins
CA2184092A1 (en) * 1994-02-25 1995-08-31 Thomas M. Jessell Dna encoding the vertebrate homolog of hedgehog, vhh-1, expressed by the notochord, and uses thereof
US6911528B1 (en) 1994-12-02 2005-06-28 The Johns Hopkins University School Of Medicine Hedgehog-derived polypeptides
WO1998012326A1 (en) 1996-09-20 1998-03-26 President And Fellows Of Harvard College Hedgehog interacting proteins and uses related thereto
IL129295A0 (en) * 1996-10-07 2000-02-17 Univ Johns Hopkins Med Novel hedgehog-derived polypeptides
JP4669968B2 (ja) 1997-02-10 2011-04-13 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 造血及び血管生成の調節方法
AU8173098A (en) 1997-06-27 1999-01-19 Ontogeny, Inc. Neuroprotective methods and reagents
US7144997B2 (en) 1997-07-24 2006-12-05 Curis, Inc. Vertebrate embryonic patterning-inducing proteins, compositions and uses related therto
WO1999010004A2 (en) * 1997-08-29 1999-03-04 Ontogeny, Inc. Regulation of muscle tissues by hedgehog-like polypeptides, and formulations and uses related thereto
US7361336B1 (en) 1997-09-18 2008-04-22 Ivan Bergstein Methods of cancer therapy targeted against a cancer stem line
US6639051B2 (en) * 1997-10-20 2003-10-28 Curis, Inc. Regulation of epithelial tissue by hedgehog-like polypeptides, and formulations and uses related thereto
AU752816B2 (en) * 1997-11-28 2002-10-03 Curis, Inc. An active hedgehog-protein-mutant, a process for its preparation and its use for pharmaceutical purposes
EP0919618A1 (de) * 1997-11-28 1999-06-02 Boehringer Mannheim Gmbh Aktive Hedgehog-Protein-Mutante, Verfahren zur Herstellung und Verwendung
EP1577321A1 (en) * 1997-12-03 2005-09-21 Biogen, Inc. Hydrophobically-modified protein compositions and methods
US6897297B1 (en) 1997-12-03 2005-05-24 Curis, Inc. Hydrophobically-modified protein compositions and methods
CA2309806A1 (en) * 1997-12-03 1999-06-10 Biogen, Inc. Hydrophobically-modified protein compositions and methods
US6004937A (en) * 1998-03-09 1999-12-21 Genetics Institute, Inc. Use of follistatin to modulate growth and differentiation factor 8 [GDF-8] and bone morphogenic protein 11 [BMP-11]
EP0953576B1 (en) 1998-04-30 2005-11-02 Curis, Inc. Active hedgehog protein conjugate, process for its production and use
AU761298C (en) 1998-09-11 2005-04-21 President And Fellows Of Harvard College Regulation of lung tissue by hedgehog-like polypeptides, and formulations and uses related thereto
ATE458497T1 (de) * 1998-09-11 2010-03-15 Curis Inc Antagonisten von 'hedgehog' und 'patched' zur inhibierung des wachstums und der differenzierung von zellen und geweben, als auch deren verwendungen
US6159950A (en) * 1998-10-16 2000-12-12 Cornell Research Foundation, Inc. Method of modulating hair growth
US6884770B1 (en) 1998-11-06 2005-04-26 Curis, Inc. Methods and compositions for treating or preventing peripheral neuropathies
EP1135411B1 (en) * 1998-12-03 2006-05-17 Curis, Inc. Methods and compositions for treating disorders involving excitotoxicity
US6951839B1 (en) 1999-11-30 2005-10-04 Curis, Inc. Methods and compositions for regulating lymphocyte activity
US8168178B2 (en) 1999-11-30 2012-05-01 Curis, Inc. Methods and compositions for regulating lymphocyte activity
US7115653B2 (en) 2000-03-30 2006-10-03 Curis, Inc. Small organic molecule regulators of cell proliferation
US8852937B2 (en) 2000-03-30 2014-10-07 Curis, Inc. Small organic molecule regulators of cell proliferation
US6683108B1 (en) 2000-03-30 2004-01-27 Curis, Inc. Agonists of hedgehog signaling pathways and uses related thereto
US6683192B2 (en) * 2000-03-30 2004-01-27 Curis, Inc. Small organic molecule regulators of cell proliferation
US6613798B1 (en) 2000-03-30 2003-09-02 Curis, Inc. Small organic molecule regulators of cell proliferation
AU2001275495B2 (en) * 2000-06-16 2006-08-17 Curis, Inc. Angiogenesis-modulating compositions and uses
AU2001296965A1 (en) * 2000-09-22 2002-04-02 The Johns Hopkins University School Of Medicine A method of use of sonic hedgehog protein as a ligand for patched
US6902881B2 (en) 2000-10-13 2005-06-07 President And Fellows Of Harvard College Compounds and methods for regulating cell differentiation
US7708998B2 (en) 2000-10-13 2010-05-04 Curis, Inc. Methods of inhibiting unwanted cell proliferation using hedgehog antagonists
CA2425356C (en) 2000-10-13 2015-10-06 Curis, Inc. Hedgehog antagonists, methods and uses related thereto
US6908732B2 (en) 2000-10-13 2005-06-21 President & Fellows Of Harvard College Compounds and methods for regulating cell differentiation
TWI267378B (en) 2001-06-08 2006-12-01 Wyeth Corp Calcium phosphate delivery vehicles for osteoinductive proteins
US20040091857A1 (en) * 2001-07-20 2004-05-13 Nallur Girish N. Gene expression profiling
US7160725B2 (en) * 2001-11-13 2007-01-09 Curis, Inc. Hedgehog signaling promotes the formation of three dimensional cartilage matrices
DE60322869D1 (de) 2002-04-22 2008-09-25 Univ Johns Hopkins Modulatoren von hedgehog signalpfaden, zusammensetzungen und verwandte verwendungen
ES2400181T3 (es) * 2002-08-19 2013-04-08 Merck Patent Gmbh Variantes del alérgeno mayor PHI P 1 de hierba timotea
US9487823B2 (en) 2002-12-20 2016-11-08 Qiagen Gmbh Nucleic acid amplification
WO2004087870A2 (en) * 2003-03-25 2004-10-14 The Johns Hopkins University Neuronal cell lineages and methods of production thereof
US8043834B2 (en) 2003-03-31 2011-10-25 Qiagen Gmbh Universal reagents for rolling circle amplification and methods of use
CA2521623C (en) 2003-04-11 2015-03-17 Etex Corporation Osteoinductive bone material
US20040248103A1 (en) * 2003-06-04 2004-12-09 Feaver William John Proximity-mediated rolling circle amplification
DE602004005477T2 (de) 2003-09-12 2007-12-13 Wyeth Injizierbare feste Calciumphosphat-Stäbe zur Abgabe von osteogenen Proteinen
EP1730280B1 (en) 2004-03-26 2018-10-24 Curis, Inc. Rna interference modulators of hedgehog signaling and uses thereof
AU2005265098B2 (en) 2004-06-17 2012-02-23 Thrasos Innovation, Inc. TDF-related compounds and analogs thereof
JP5204486B2 (ja) 2004-08-27 2013-06-05 インフィニティ ファーマスーティカルズ、インク． シクロパミンアナログ及びその使用方法
US7473678B2 (en) 2004-10-14 2009-01-06 Biomimetic Therapeutics, Inc. Platelet-derived growth factor compositions and methods of use thereof
US7517870B2 (en) 2004-12-03 2009-04-14 Fondazione Telethon Use of compounds that interfere with the hedgehog signaling pathway for the manufacture of a medicament for preventing, inhibiting, and/or reversing ocular diseases related with ocular neovascularization
US7850960B2 (en) 2004-12-30 2010-12-14 University Of Washington Methods for regulation of stem cells
US8309303B2 (en) 2005-04-01 2012-11-13 Qiagen Gmbh Reverse transcription and amplification of RNA with simultaneous degradation of DNA
WO2007014162A2 (en) * 2005-07-21 2007-02-01 Abbott Laboratories Multiple gene expression including sorf constructs and methods with polyproteins, pro-proteins, and proteolysis
ES2403006T3 (es) 2005-08-22 2013-05-13 The Johns Hopkins University Antagonistas de la vía Hedgehog para tratar enfermedades
EP1762627A1 (de) 2005-09-09 2007-03-14 Qiagen GmbH Verfahren zur Aktivierung einer Nukleinsäure für eine Polymerase-Reaktion
CA2623415A1 (en) 2005-09-20 2007-03-29 Thrasos, Inc. Tdf-related compounds and analogs thereof
WO2007054623A2 (en) * 2005-11-11 2007-05-18 Licentia Oy Mammalian hedgehog signaling inhiabitors
WO2007067514A2 (en) * 2005-12-05 2007-06-14 Boston Biomedical Research Institute Methods for identifying modulators of hedgehog autoprocessing
US8147860B2 (en) 2005-12-06 2012-04-03 Etex Corporation Porous calcium phosphate bone material
US7625759B2 (en) 2005-12-19 2009-12-01 Genentech, Inc. Method for using BOC/CDO to modulate hedgehog signaling
CA2641860C (en) 2006-02-09 2015-07-14 Biomimetic Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating bone
EP2614839A3 (en) 2006-04-05 2015-01-28 Genentech, Inc. Method for using BOC/CDO to modulate hedgehog signaling
US9161967B2 (en) 2006-06-30 2015-10-20 Biomimetic Therapeutics, Llc Compositions and methods for treating the vertebral column
JP5484047B2 (ja) 2006-06-30 2014-05-07 バイオミメティック セラピューティクス， エルエルシー 回旋筋腱板傷害を処置するためのｐｄｇｆ−生体マトリックス組成物および方法
US20110218176A1 (en) 2006-11-01 2011-09-08 Barbara Brooke Jennings-Spring Compounds, methods, and treatments for abnormal signaling pathways for prenatal and postnatal development
TWI433674B (zh) 2006-12-28 2014-04-11 Infinity Discovery Inc 環杷明（ｃｙｃｌｏｐａｍｉｎｅ）類似物類
JP2010520295A (ja) 2007-03-07 2010-06-10 インフィニティ・ディスカバリー・インコーポレイテッド へテロ環状シクロパミン類似体及びその使用方法
CN101675054B (zh) 2007-03-07 2014-05-14 无限发现股份有限公司 环杷明内酰胺类似物及其使用方法
US20090061002A1 (en) 2007-09-05 2009-03-05 Venbrocks Rudolf A Calcium phospate based delivery of growth and differentiation factors to compromised bone
CN101917853B (zh) 2007-12-27 2014-03-19 无限药品股份有限公司 立体选择性还原的方法
WO2010030714A2 (en) 2008-09-09 2010-03-18 Biomimetic Therapeutics, Inc. Platelet-derived growth factor compositions and methods for the treatment of tendon and ligament injuries
WO2011017551A1 (en) 2009-08-05 2011-02-10 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Enzymatic transamination of cyclopamine analogs
WO2011027249A2 (en) 2009-09-01 2011-03-10 Pfizer Inc. Benzimidazole derivatives
CN107080834A (zh) 2010-02-22 2017-08-22 生物模拟治疗有限责任公司 用于治疗腱病的血小板衍生生长因子组合物和方法
US9376447B2 (en) 2010-09-14 2016-06-28 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Transfer hydrogenation of cyclopamine analogs
ES2543151T3 (es) 2010-10-20 2015-08-17 Pfizer Inc Derivados de 2-piridina como moduladores del receptor Smoothened
WO2014012101A1 (en) 2012-07-13 2014-01-16 Trustees Of Tufts College Silk powder compaction for production of constructs with high mechanical strength and stiffness
JP6796638B2 (ja) 2015-06-04 2020-12-09 ペレファーム, インク.Pellepharm, Inc. ヘッジホッグ阻害性化合物の送達のための局所的製剤及びその使用
EP3821880A1 (en) 2015-10-26 2021-05-19 President and Fellows of Harvard College Oxidized polysaccharides and methods of use thereof

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8611832D0 (en) * 1986-05-15 1986-06-25 Holland I B Polypeptide
US5789543A (en) * 1993-12-30 1998-08-04 President And Fellows Of Harvard College Vertebrate embryonic pattern-inducing proteins and uses related thereto
CA2179029C (en) 1993-12-30 2009-02-24 Philip W. Ingham Vertebrate embryonic pattern-inducing hedgehog-like proteins

Also Published As

Publication number Publication date
JP2006151989A (ja) 2006-06-15
CA2206509C (en) 2011-05-03
EP0793502A1 (en) 1997-09-10
WO1996017924A2 (en) 1996-06-13
KR100453096B1 (ko) 2005-04-06
NO323079B1 (no) 2006-12-27
JPH11500605A (ja) 1999-01-19
EP0793502A4 (en) 1999-10-13
CA2206509A1 (en) 1996-06-06
NO972494L (no) 1997-07-30
US6132728A (en) 2000-10-17
AU712346B2 (en) 1999-11-04
KR987000085A (ko) 1998-03-30
FI972312A0 (fi) 1997-05-30
KR20040064700A (ko) 2004-07-19
AU4370596A (en) 1996-06-26
WO1996016668A1 (en) 1996-06-06
AU4418396A (en) 1996-06-19
US6281332B1 (en) 2001-08-28
FI972312A (fi) 1997-12-30
NO972494D0 (no) 1997-05-30
WO1996017924A3 (en) 1996-09-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI121366B (fi) Uusia siiliperäisiä polypeptidejä
AU728541B2 (en) Novel hedgehog-derived polypeptides
US8604162B2 (en) Collectin
US8362216B2 (en) Method of detection using antibodies that specifically bind hedgehog-derived polypeptides
US6057091A (en) Method of identifying compounds affecting hedgehog cholesterol transfer
US6492139B1 (en) Vertebrate smoothened proteins
JP4671371B2 (ja) 脊椎動物Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄタンパク質
JP2002520007A (ja) Ｄｅｌｔａ切断産物およびそれに基づく方法
US6214794B1 (en) Method of using hedgehog polypeptides to regulate neuronal cell growth
US6225086B1 (en) Polynucleotides encoding ankyrin proteins
ES2201547T3 (es) Icam-4 y usos diagnosticos de las mismas.
JP2004519218A (ja) 単離ヒトトランスポータータンパク、ヒトトランスポータータンパクをコード化する核酸分子、及びその使用
Klaassen Gastric H+, K+-ATPase: functional synthesis in vitro using recombinant baculovirus mediated expression
JP2005500001A (ja) 単離ヒトトランスポータータンパク、ヒトトランスポータータンパクをコード化する核酸分子、及びその使用
JPH05219959A (ja) 新規なｄｎａおよびそれによってコードされる蛋白質
JP2005519637A (ja) 新規なｇタンパク質共役レセプターである、ｍｉｄ２４１レセプター
JP2003116564A (ja) 新規タンパク質およびそれをコードするｄｎａ

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 121366

Country of ref document: FI

MA Patent expired