FI109809B

FI109809B - Menetelmä uusien peptidien valmistamiseksi

Info

Publication number: FI109809B
Application number: FI941758A
Authority: FI
Inventors: Richard D Garman; Mei-Chang Kuo; Julia L Greenstein; Bruce L Rogers; Jay P Morgenstern; Julian F Bond; Malcolm Morville
Original assignee: Immulogic Pharma Corp
Priority date: 1991-10-16
Filing date: 1994-04-15
Publication date: 2002-10-15
Also published as: IL103456A0; CA2121498A1; JP4246794B2; HU9401109D0; NO941370L; AU682658B2; KR100271417B1; NZ299122A; PT100978A; NZ244782A; CA2121498C; EP0610335A1; DK0610335T3; FI941758A; AU2794092A; HU227959B1; NO316073B1; WO1993008280A1; NO941370D0; JPH07503362A

Description

1 109809

Menetelmä uusien peptidien valmistamiseksi Tämä hakemus on jatkoa US-patentille 662 276, joka on otsikoitu "Ihmisen T-solu-aktiivinen kissan proteiini, joka on 5 eristetty kodin pölystä ja sen käytöt", jätetty 28. helmikuuta, 1991, mikä on jatkoa US-patentille 431 565, joka on otsikoitu "Ihmisen T-solu-aktiivinen kissan proteiini, joka on eristetty kodin pölystä ja sen käytöt", jätetty 3. marraskuuta, 1989, jonka opetukset on liitetty tähän viitteeksi.

10 T-lymfosyytit voivat välittää ja säädellä sekä spesifisiä että ei-spesifisiä immuunivasteiden viejämekanismeja. CD4+ T-lymfosyytit tarjoavat avun vasta-aineen tuottoon ja erittävät syto-kinejä, jotka moduloivat muiden T-solujen kasvua ja muiden im-muunisolujen kasvua ja erilaistumista, kuten monosyytit ja 15 granulosyytit. Toiminnalliset ja biokemialliset tutkimukset ovat osoittaneet, että solun immuunivasteiden luominen riippuu antigeenireseptoreista T-soluissa, jotka tunnistavat vieraiden proteiinien peptidifragmentit, jotka liittyvät päähistokompa-tibiliteettikompleksin (MHC) tuotteisiin, joita ekspressoidaan 20 antigeenejä esittävissä avustavissa soluissa. Äskettäiset teknologian saavutukset ovat tehneet mahdolliseksi viljellä te- • · .1: hokkaasti antigeeni-spesifisiä ihmisen ja hiiren T-solulinjoja ja klooneja in vitro. Lisäksi nyt on mahdollista tuottaa suu- ria määriä proteiiniantigeenjä tai niiden fragmentteja käyttä-25 mällä rekombinantti-DNA-teknologiaa tai kiinteän faasin pepti-disynteesiä. Täten viime vuosina useat tutkijaryhmät ovat aloittaneet määrittää antigeenisten proteiinien lineaarisia ’ aminohapposekvenssejä, joita T-solut tunnistavat liittyneenä MHC:n (T-solu-epitoopit) kanssa.

> · · * · •'‘':30 Peptideistä, jotka on johdettu lukuisista proteiiniantigee-, neistä, bakteeri- ja viruspatogeenit, autoantigeenit, aller- geenit ja muut kokeelliset antigeenit, kuten kananmunan ly-‘ 1 sotsyymi (HEL), ovalbumiini (OVA) ja lambda-repressori (cl), : on tutkittu kyky stimuloida antigeeni-spesifisiä T-soluja.

;' 1 1»3 5 Laajan kokoskaalan peptidejä on ilmoitettu toimivan T-solu- 2 109809 epitooppeina. Esimerkiksi OVA-aminohappojäännöksien 324-339 (Shimonkevitz, R. et ai., J. Immunol., 133:2167 (1987), HEL-aminohappojäännöksien 74-96 (Shastri, N. et al., J. Exp. Med. 164:882-896 (1986); ja lambda-repressori (cl) aminohappojään-5 nöksien 12-26 (Lai, M.-Z et al., J. Immunol., 139:3973-3980 (1987) on osoitettu antavan sysäyksen kokonaisille T-soluille, jotka ovat proteiinialukkeisia. Peptidin, joka on johdettu Hepatitis B pinta-antigeenistä (HBsAg aminohappojäännökset 19-33), on äskettäin osoitettu stimuloivan T-soluvasteita pää-10 osassa ihmiskohteita, jotka on immunisoitu rekombinantti hepatitis B-rokotteella (Schad, V.C. et al., Seminars in Immunol., 3:217-224 (1991)). Mykobakteerin antigeeninen 65 kD pääprote-iini on myös epitooppikartoitettu (Lamb,J.R. et al., EMBO J., 6(5):1245-1249 (1987)). T-solu-epitooppeja on tunnistettu pep-15 tideissä, jotka koostuvat 65 kD:n proteiinin aminohappojäännöksistä 112-132 ja 437-459. Myeliinipohjainen proteiini (MBP), autoantigeeni, joka indusoi kokeellisen autoimmuunin aivojen ja selkäytimen tulehduksen (EAE) ja oletettu autoantigeeni multippeliskleroosissa (MS) on myös epitooppikartoitettu 20 sekä ihmisen (Ota, K. et al., Nature, 346:183-187 (1990)) että jyrsijän (Zamvil et al., Nature 324:258-260 (1986)) systeemeissä. Ota et al. ovat tunnistaneet T-solun pääepitoopin MS-potilaissa, MBP-aminohappojäännökset 84-102. Pienempiä epi-tooppeja (MBP aminohappo jäännökset 143-168, 61-82, 124-42 ja : ; : 25 31-50), joita T-solut tunnistavat MS-potilaista, kuvattiin myös. Zamvil et al. ovat osoittaneet, että MBP aminohappojään-nökset 1-11 sisältävät T-solun pääepitoopin (-epitoopit) , joka aiheuttaa EAE:tä epäiltävissä jyrsijäkannoissa. 1 ·;·' 35 T-soluepitoopit, joita on allergeenisissä proteiineissa, on 30 kuvattu hyvin äskettäin (O'Hehir, R. et al., Ann. Rev. Immu- /· nol., 9:67-95 (1991)). Lukuisien peptidien, jotka on johdettu pölypunkin allergeenistä Der p I, on osoitettu olevan T-solu- . reaktiivisiä (Thomas, W.R., et al. Teoksessa Epitopes of * · ·

Atopic Allergens proceedings of Workshop from XIV Congress 3 109809 of the European Academy of Allergy and Clinical Immunology, Berliini (Syyskuu 1989) ss. 77-82; O'Hehir, R.E. Annual Review Immunology 9:67-95 (1991); Stewart, G.A. et ai teoksessa: Epitopes of Atopic Allergens Proceedings of Workshop from 5 XIV Congress of the European Academy of Allergy and Clinical Immunology, Berliini (Syyskuu 1989) ss. 41-47; ja Yessel, H. et ai. teoksessa: T Cell Activation in Health and Disease: Discrimination Between Immunity and Tolerance, Conference 22-26 (syyskuu 1990) Trinity College, Oxford U.K.). T-solu-sti-10 muloituvasta peptidistä, joka on johdettu lyhyistä villakko allergeenisistä Amb a I aminohappojäännöksistä 54-65 on myös ilmoitettu (Rothbard, J.B. et al., Cell, 52:515-523 (1988). Käyttämällä T-solukloonien paneelia, joka on johdettu raihei-nä-allergisesta yksilöstä, osoittivat Perez et ai., että T-15 soluepitoopit ovat proteiiniallergeenin Loi p I (Perez, M. et ai., J. Biol. Chem., 265(27):16210-16215 (1990)) aminohappo-jäännösten 191-210 sisällä.

Tämä keksintö tarjoaa eristettyjä peptidejä, joilla on T- 20 solua stimuloivaa aktiivisuutta, ja joita kutsutaan rekombi- tooppi™ peptideiksi. Keksinnön rekombitooppipeptideillä on ·.·.· edullisesti ihmisen T-solua stimuloivaa aktiivisuutta. Lisäk- i.j : si keksinnön rekombitooppipeptidit koostuvat edullisesti : '· kahdesta T-solu-epitoopista, jotka on johdettu samoista tai :··25 erilaisista proteiiniantigeeneistä ja edullisemmin niissä on ·’;· ainakin kaksi aluetta, kummankin alueen koostuessa ainakin yhdestä T-solu-epitoopista, joka on johdettu proteiinianti- geenistä ja kummallakin alueella ollen edullisesti ihmisen T- solua stimuloivaa aktiivisuutta. Joissakin tapauksissa rekom- 30 bitooppipeptidit sisältävät kolme sellaista aluetta, jotka on johdettu samoista tai erilaisista proteiiniantigeeneistä.

...· Kuten tässä on käytetty, koostuu rekombitooppipeptidin alue • · · ·.· vähintään 5:stä ja edullisesti ainakin 7 aminohappojäännök- . sestä. Rekombinanttipeptidit koostuvat tyypillisesti alueis- .••35 ta, jotka on järjestetty konfiguraatioon, joka on erilainen ·’· kuin luonnostaan esuiintyvien alueiden konfiguraatio prote-: iiniantigeenissä, jotta eliminoidaan ei-toivottuja ominai- 4 109809 suuksia, jotka liittyvät proteiiniantigeenin sekundääriseen tai tertiääriseen rakenteeseen, pitäen samalla primäärinen rakenne ihmisen T-solua aktivoivasta aktiivisuudesta riippuvaisena. Alueet voidaan esimerkiksi johtaa samasta prote-5 iiniantigeenistä ja järjestää ei-viereiseen konfiguraatioon tai ei-viereiseen konfiguraatioon ja ei-perättäiseen järjestykseen.

Keksinnön rekombitooppipeptidit voidaan johtaa proteiinial-10 lergeeneistä. Näillä rekombitooppipeptideillä on edullisesti minimaalinen immunoglobuliini E:tä stimuloiva aktiivisuus ja sitovat immunoglobuliini E:tä olennaisesti vähemmässä määrin kuin proteiiniallergeenit, joista rekombitooppipeptidit on johdettu sitomaan immunoglobuliini E:tä. Edullisemmin, rekom-15 bitooppipeptidit, jotka on johdettu proteiiniallergeeneista, eivät sido immunoglobuliini E:tä, joka on spesifinen prote-iiniallergeeneille melkoisena prosenttiosuutena (vähintään noin 75 %) yksilöistä, jotka ovat sensitiivisiä proteiinial-lergeeneille, tai jos sellaista sitomista tapahtuu, ei sel-20 lainen sitominen johda välittäjän vapautumiseen, esim. histamiini, syöttösoluista tai basofiileistä. Lisäksi rekombitoop-pipeptidit voidaan johtaa autoantigeeneistä, kuten insuliini, myeliinipohjäinen proteiini ja asetyylikoliinireseptorit.

‘ Nämä rekombitooppipeptidit eivät edullisesti sido immunoglo-• 25 buliinia, joka on spesifinen autoantigeenille huomattavana ‘ ‘ prosenttiosuutena (vähintään noin 75 %) väestön yksilöistä, jotka ovat herkkiä autoantigeenille. Lisäksi rekombitooppi-: peptidit, jotka on johdettu proteiiniallergeeneista tai muis ta proteiiniantigeeneista, voidaan suunnitella siten, että 30 ei-toivottu natiivin proteiinin ominaisuus (esim. entsymaat-tinen aktiivisuus) voidaan eliminoida terapeuttisia tarkoi-tuksia varten. 1

Keksintö tarjoaa myös menetelmät diagnosoida herkkyys prote-:35 iiniallergeenille tai muille proteiiniantigeeneille yksilös-sä, menetelmät käsitellä sellaista herkkyyttä ja terapeutti-: ,· set koostumukset, joissa on yksi tai useampi rekombitooppi- 5 109809 peptidi. Esimerkiksi on esitetty menetelmät määrittää viivästyneen tyyppinen liiallinen ärsykeherkkyys ja/tai spesifinen välittömän tyyppinen liiallinen ärsykeherkkyys yksilössä ainakin yhtä proteiiniallergeenia tai muuta proteiiniantigee-5 nia vastaan. Erään menetelmän mukaisesti viivästyneen tyyppinen liiallinen ärsykeherkkyystesti, jossa käytetään keksinnön rekombitooppipeptidiä, voidaan antaa yksilölle ja laajuus, mihin spesifinen viivästyneen tyyppinen liiallinen ärsyke-herkkyysreaktio tapahtuu yksilössä, voidaan määrittää. Erääs-10 sä toisessa menetelmässä immunoglobuliini E:n, joka on spesifinen ainakin yhdelle proteiiniallergeenille, läsnäolo voidaan määrittää yksilössä ja yksilöm T-solujen kyky vastata proteiiniallergeenin T-solu-epitooppiin (-epitooppeihin) arvioida. Tässä suoritusmuodossa spesifinen välittömän tyyp-15 pinen liiallinen ärsykeherkkyystesti, joka käyttää proteiiniallergeenia tai sen osaa tai proteiiniallergeenin modifioitua muotoa tai sen osaa, joista jokainen sitoo immunoglobuliini E:n, joka on spesifinen proteiiniallergeenille, annetaan yksilöille. Lisäksi viivästyneen tyyppinen liiallinen ärsyke-20 herkkyystesti, joka käyttää proteiiniallergeenin modifioitua muotoa tai sen osaa, tai proteiiniallergeenia, joka on tuo-tettu rekombinanttisesti, tai rekombitooppipeptidiä, joka on : .1 johdettu proteiiniallergeenista, joilla kaikilla on ihmisen :·. T-solua stimuloivaa aktiivisuutta ja joista kumpikaan ei sido '25 immunoglobuliini E:tä (IgE), joka on spesifinen proteiinial lergeenille, tai jos sitomista tapahtuu, ei sellainen sitomi-·;·; nen johda välittäjän vapautumiseen, syöttösoluista tai baso- '·' ' fiileistä olennaisena prosenttiosuutena yksilöiden populaa tiosta, jotka ovat sensitiivisiä allergeenille (esim. vähin-30 tään noin 75 %), annetaan samoille yksilöille ennen, samanaikaisesti tai välittömän tyyppisen liiallisen ärsykeherkkyys-i testin kanssa. Niille yksilöille, jotka osoittavat sekä spe-sifisen välittömän tyyppisen liiallisen ärsykeherkkyysreakti-on että spesifisen viivästyneen tyyppisen liiallisen ärsyke-•35 herkkyysreaktion, annetaan terapeuttisesti tehokas määrä -·· terapeuttista koostumusta, joka koostuu proteiiniallergeenin • modifioidusta muodosta tai sen osasta, proteiiniallergeenis- 6 109809 ta, joka on tuotettu rekombinanttisesti, tai rekombitooppi-peptidistä, joka on johdettu proteiiniallergeenista, ja farmaseuttisesti hyväksyttävästä kantajasta tai laimentimesta, koska uskotaan, että yksilölle sellaisen terapeuttisen koos-5 tumuksen antaminen toimii poistamaan yksilöstä yliherkkyyden proteiiniallergeenille.

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa .

Rekombitooppipeptidejä, jotka on johdettu proteiiniantigee-10 neistä ja joissa on ihmisen T-solua stimuloivaa aktiivisuutta, voidaan myös käyttää muissa menetelmissä määrittämään yksilöissä immunoglobuliinin, joka on spesifinen proteiiniantigeenille, ja yksilöiden T-solujen kyky stimuloitua proteiiniantigeenin T-solu-epitoopin (-epitooppien) toimesta. Erääseen sellaiseen 15 menetelmään sisältyy yhdistää ensimmäinen verinäyte, joka on saatu yksilöltä, tai ainakin näytteen yksi osa proteiiniantigeenin, proteiiniantigeenin modifioidun muodon tai kummankin osan kanssa, joista kumpikin sitoo immunoglobuliinia, joka on spesifinen proteiiniantigeenille. Näyte ja antigeeni yhdiste-20 tään olosuhteissa, jotka ovat sopivat sitomaan veren komponentteja, esim. immunoglobuliini, näytteessä tai sen osassa, proteiiniantigeenin, modifioidun proteiiniantigeenin tai jom-, . mankumman antigeenin osan kanssa. Jos sitomista tapahtuu, toi- / ; nen verinäyte, joka on saatu yksilöltä, tai toinen osa alkupe- ·· £5 räistä näytettä yhdistetään rekombitooppipeptidin ' " kanssa, joka koostuu ainakin kahdesta alueesta, jotka on joh- dettu proteiiniantigeenistä, proteiiniantigeenin modifioidusta muodosta tai sen osasta tai proteiiniantigeenistä, joka on tuo-: : : tettu rekombinanttisesti, joissa kummassakin on ihmisen T-solua 30 stimuloivaa aktiivisuutta ja joista kumpikaan ei sido immuno-: globuliinia, joka on spesifinen proteiiniantigeenille olennai- ,···. sena prosenttiosuutena yksilöiden populaatiosta, jotka ovat sensitiivisiä antigeenille (esim. vähintään noin 75 %), jotta : määritetään, tapahtuuko T-solu-stimulaatiota. Jos T-solu- » » · ,..35 stimulaatiota tapahtuu, annetaan yksilölle edullisesti terä- . peuttisesti tehokas määrä terapeuttista koostumusta, jossa on « a · .···. proteiiniantigeenin tai sen osan, rekombinanttisesti tuotetun 7 109809 proteiiniantigeenin tai rekombitooppipeptidin modifioitu osa ja farmaseuttisesti hyväksyttävä kantaja tai laimennin, koska uskotaan, että sellaisen terapeuttisen koostumuksen antaminen yksilölle poistaa yksilön yliherkkyyden proteiiniantigeenil-5 le.

Annetaan myös menetelmät suunnitella keksinnön rekombitooppi-peptidit, missä proteiiniantigeenillä, jolle yksilö on yli-kerkkä, on tuntemattomat tai huonosti-kuvatut T-solu-epitoo-10 pit (esim. joitakin tai kaikkia proteiiniantigeenin peptidi-alueita, joilla on ihmisen T-solua stimuloivaa aktiivisuutta proteiiniantigeeniä vastaan, ei ole määritetty standardeilla T-solubiologian tekniikoilla, esim. Current Protocols in Immunology, toim. Coligan, J.E., osa 1, (1991), tai prote-15 iiniantigeenin tarkkoja ihmisen T-solu-epitooppeja ei ole määritetty hienokartoitustekniikoilla). Erään menetelmän mukaisesti allergeenista tai toisen proteiiniantigeenin tunnetusta proteiinirakenteesta on katsaus ja allergeeni tai toinen antigeeni jaetaan teoreettisesti ainakin kahteen toi-20 votun pituiseen peptidialueeseen. Teoreettisesti tarkoittaa jotakin, jota ei todella tapahdu, mutta on mieluummin ajatel-tu prosessi, esim. tapahtuu paperilla tai jonkun päässä. Tämä :·· jakaminen voi olla mielivaltainen, voidaan tehdä algoritmin ; ’* mukaisesti tai voi kokonaan tai osittain perustua prote- ‘"*25 iiniantigeenin alueisiin, jolla tiedetään olevan T-solua • stimuloivaa aktiivisuutta, edullisesti ihmisen T-solua stimu- • · · * ;y loivaa aktiivisuutta. Kun tunnetaan vain muutama proteiinian tigeenin alue, jolla on T-solua stimuloivaa aktiivisuutta tai kun kaikki proteiiniantigeenin alueet, joilla on ihmisen T-30 solua stimuloivaa aktiivisuutta, ovat tuntemattomat, edulli-. sesti ainakin 50 % tai edullisemmin koko proteiini jaetaan ;;; toivotun pituisiin peptidialueisiin. Peptidialueet järjeste- =' tään sitten teoreettisesti muodostamaan ainakin yksi rekombi- ; tooppipeptidi, jossa alueet järjestetään uudestaan ei-vierek- ."35 käiseen järjestykseen. Myöhemmin tuotetaan ainakin yksi re- , kombitooppipeptidi, jolla on uudelleen järjestetty konfigu- * * ·· raatio, ja rekombitooppipeptidin kyky stimuloida ihmisen T- δ 109809 soluja määritetään. Vielä eräässä suoritusmuodossa rekombitooppipeptidin, jolla havaittiin olevan ihmisen T-solua stimuloivaa aktiivisuutta, kyky testataan määrittämään sen kyky sitoa immunoglobuliinia, joka on spesifinen allergeenille tai 5 muulle antigeenille tai testataan toisen ei-toivotun ominaisuuden puuttuminen (esim. proteaasiaktiivisuus).

Kuvio 1 on nukleiinihapposekvenssi ja ihmisen T-solu reaktiivisen kissan proteiinin (TRFP) ketju l:n dedusoitu aminohap-10 posekvenssi, mukaanluettuna johtavat sekvenssit A (SEQ ID Nro: 1 ja 2) ja B (SEQ ID Nro: 3 ja 4).

Kuvio 2 on nukleiinihapposekvenssi ja TRFP:n ketju 2:n dedusoitu aminohapposekvenssi, mukaanluettuna johtava sekvenssi 15 (SEQ ID Nro: 5 ja 6).

Kuvio 3 on graafinen esitys kuvaten T-solujen, jotka on eristetty kissa-allergisista potilaista, vastetta ja joiden aluke on affiniteetti-puhdistettu TRFP, menemään päällekkäin TRFP-20 peptidien kanssa ja analysoitu peptidivasteiden luokitetulla summalla.

I · i * ! Kuvio 4 on TRFP:n peptidi X:n, (SEQ ID Nro: 7) peptidi Y:n,

(SEQ ID Nro: 8) peptidi Z:n, (SEQ ID Nro: 9) peptidi A:n (SEQ • *25 ID Nro: 10), peptidi B:n (SEQ ID Nro: 11) ja peptidi C:n (SEQ

» · a · ’ ID Nro: 77) aminohapposekvenssit, joissa jokaisessa on vähin- tään yksi TRFP:n T-solu-epitooppi.

I ·

» · l I

Kuvio 5 on rekombitooppipeptidin YZX:n rakenteen kaavamainen 30 esitys käyttämällä polymeraasiketjureaktio- (PCR) tekniikoi ta.

,·;· Kuvio 6 on rekombitooppipeptidin AYZXB:n rakenteen kaavamai- . nen esitys käyttämällä PCR-tekniikoita.

: .*35

Kuvio 7 on oligonukleotidien C (SEQ ID Nro: 12 ja 13), I * I · » · » t · · · 9 109809 D (SEQ ID Nro: 14 ja 15), E (SEQ ID Nro: 16 ja 17), F (SEQ ID Nro: 18 ja 19), G (SEQ ID Nro: 20 ja 21), H (SEQ ID Nro: 22 ja 23) ja I (SEQ ID Nro: 24 ja 25) nukleiinihapposekvenssit, joita on käytetty rakennettaessa rekombitooppipeptidiä YZX ja 5 oligonukleotidejä J (SEQ ID Nro: 26 ja 27), K (SEQ ID Nro: 28 ja 29), L (SEQ ID Nro: 30 ja 31), M (SEQ ID Nro: 32 ja 33), N (SEQ ID Nro: 34 ja 35) ja O (SEQ ID Nro: 36 ja 37), joita käytetään rakennettaessa rekombitooppipeptidiä AYZXB.

10 Kuvio 8 on nukleiinihapposekvenssi (käyttämällä E. coli eks-pressiokodoneita) ja dedusoitu aminohapposekvenssi, joka koostuu rekombitooppipeptidistä YZX (SEQ ID Nro 38 ja 39). Trombiinipilkkomiskohta nähdään.

15 Kuvio 9 on rekombitooppipeptidin YZX:n rakenteen kaavamainen esitys käyttämällä PCR-tekniikoita cDNA:n kanssa, joka on eristetty TRFP:stä mallisäikeeksi.

Kuvio 10 on alukkeiden, joita käytettiin rekombitooppipepti-20 dien XZY (SEQ ID Nro: 40-51), YXZ (SEQ ID Nro: 52-63) ja ZXY (SEQ ID Nro: 64-71) rakentamisessa, nukleiinihapposekvenssit.

» • ,· Kuvio 11 on graafinen kuvaus yksilön alukkeiden, joita käy- tettiin rekombitooppipeptidien XZY, YXZ ja ZXY rakentamises-·:··25 sa, aminohapposekvenssistä.

(Ml

Kuvio 12 on rekombitooppipeptidin, joka on johdettu fosfoli- > · paasi A2:sta, jolla on huonosti kuvatut T-solu-epitoopit, rakenteen kaavamainen esitys.

30

Kuvio 13 on SDS/PAGE Western immunoblotanalyysin, joka mää- : rittää ihmisen lgE:n, jota saatiin kissa-allergisesta yksi- .· löstä, erilaisiin proteiininäytteisiin, rekombitooppipeptidit : .* XYZ, XZY, YXZ, YZX, ZXY ja ZYX mukaanluettuina.

/’•35 ·*· Kuvio 14 on graafinen esitys ELISA-analyysin tuloksista kuva- I » ten ihmisen IgE:n, joka on saatu kissa-allergisesta yksilös- 10 109809 tä, erilaisiin proteiininäytteisiin, rekombitooppipeptidit XYZ, XZY, YXZ, YZX, ZXY ja ZYX mukaanluettuina.

Kuviot 15a, 15b ja 15c ovat graafisia esityksiä kuvaten T-5 solulinjojen vasteita kolmesta potilaasta, jotka oli alukkei-na in vitro TRFP:hen, rekombitooppipeptidiin YXZ tai rekombi-tooppipeptidiin YZX ja vasteet erilaisiin peptideihin analysoitiin.

10 Kuvio 16 on graafinen esitys kuvaten hiiren T-solujen, jotka on immunisoitu rekombitooppipeptidillä YZX ja joista on analysoitu vasteet in vitro viljelmään, jossa on rekombitooppi-peptidi YZX, mitattuna IL-2-tuotteena, vasteita.

15 Tämä keksintö koskee eristettyjä peptidejä, joita kutsutaan rekombitooppipeptideiksi, joilla on T-solua stimuloivaa aktiivisuutta, kuten T-solulisääntymisen induktio, lymfokiini-eritys ja/tai T-solun vastustuskyvyttömyys/vastustuskyky. Keksinnön rekombitooppipeptideillä on edullisesti ihmisen T-20 solua stimuloiva aktiivisuus ja ovat hyödyllisiä diagnosoimaan ja hoitamaan herkkyyttä proteiiniallergeeniä, autoanti- > « geeniä tai muuta proteiiniantigeeniä vastaan yksilössä.

« ;,j Yleensä edulliset rekombitooppipeptidit keksinnön piirissä koostuvat ainakin kahdesta alueesta, jotka on johdettu samas-•:>*25 ta tai erilaisesta proteiiniallergeenistä tai muista prote-iiniantigeeneistä, jokaisessa alueessa ollen edullisesti » » ( * ihmisen T-solua stimuloivaa aktiivisuutta määritettynä standardilla T-solubiologian tekniikoilla ja täten sisältäen ainakin yhden T-solu-epitoopin. Jotta määritetään tarkat T-30 solu-epitoopit, esimerkiksi hienokartoitustekniikoilla, voidaan peptidialueita, jotka koostuvat ainakin yhdestä T-solu- > » > epitoopista, joka on määritetty standardeilla T-solubiologian tekniikoilla, modifioida aminohappojäännösten lisäämisellä I ( . tai deleetiolla joko peptidialueiden amino- tai karboksipää- • ? t ,*35 hän ja testataan, jotta määritetään muutos T-solureaktiivi-syydessä modifioitua peptidiä vastaan. Lisäksi jos kahdella t t : tai useammalla peptidialueella, joilla on sama päällekkäisyy- itä· 11 109809 den alue, havaitaan olevan ihmisen T-solua stimuloivaa aktiivisuutta määritettynä standardeilla T-solubiologian tekniikoilla, voidaan tuottaa lisäpeptidejä, joissa on kaikki tai osa sellaisista peptidialueista ja nämä lisäpeptidit voidaan 5 testata edellä olleella hienokartoitusmenetelmällä. Hienokar-toituksen seurauksena voidaan tuottaa sarja ihmisen T-solu-epitooppeja, jotka koostuvat aminohappojäännöksistä, jotka ovat olennaisia T-solu-tunnistukselle.

10 Keksinnön rekombitooppipeptidejä voidaan tuottaa rekombinant-ti-DNA-tekniikoilla isäntäsolussa, joka on transformoitu nukleiinihapposekvenssillä, joka koodaa sellaista rekombi-tooppipeptidiä, tai kemiallisella synteesillä tai tietyissä rajoitetuissa tilanteissa proteiiniallergeenin tai muun pro-15 teiiniantigeenin kemiallisella pilkkomisella. Kun tuotettu rekombinanttitekniikoilla, viljellään isäntäsoluja, jotka on transformoitu rekombinanttipeptidiä koodaavalla nukleiinihapolla, alustassa joka on sopiva soluille, ja rekombitooppi-peptidit voidaan puhdistaa soluviljelmäalustasta, isäntäso-20 luista tai molemmista käyttämällä tekniikoita, jotka ovat tunnettuja peptidien tai proteiinien puhdistusalalla, mukaanluettuna ioninvaihtokromatografia, isolektrinen fokusointi, geelisuodatuskromatografia, ultrasuodatus, elektroforeesi tai : .·. immunopuhdistus vasta-aineilla, jotka ovat spesifisiä rekom- ••.25 bitooppipeptidille, proteiiniallergeenille tai muulle anti- geenille, josta rekombitooppipeptidi on johdettu tai sen osa. Täten tämän keksinnön eräs näkökohta tarjoaa rekombitooppi-;;; peptidin, joka on tuotettu isäntäsolussa, joka on transfor- ' moitu rekombitooppipeptidiä koodaavalla nukleiinihapposek- 30 venssillä tai nukleiinihapposekvenssin toiminnallisella vas tineella. Keksinnön rekombitooppipeptidejä eristetään siten, että rekombitooppipeptidissä ei olennaisesti ole solumateri-·;· aalia tai kasvatusalustaa, kun tuotetaan rekombinantti-DNA- tekniikoilla, tai ei olennaisesti ole kemiallisia prekurso-‘.35 reita tai muita kemikaaleja, kun syntetisoidaan kemiallises- ;;; ti, tai saadaan proteiiniallergeenin tai muun proteiinianti- ’··· geenin kemiallisella pilkkomisella.

12 109809

Jotta saadaan tämän keksinnön edullisia rekombitooppipeptide-jä, joissa on ainakin kaksi proteiiniallergeenin tai muun proteiiniantigeenin T-solu-epitooppia tai ainakin kaksi aluetta, jokaisen alueen koostuessa ainakin yhdestä proteiini-5 allergeenin tai muun antigeenin T-solu-epitoopista, T-solu- epitoopit tai alueet, joissa on T-solu-epitooppi (-epitooppe-ja) järjestäytyneenä (järjestäytyneinä) erilaiseen konfiguraatioon kuin luonnostaan esiintyvä T-solu-epitooppien tai allergeenin tai antigeenin alueiden konfiguraatio. T-solu-10 epitoopit tai alueet, joissa on T-solu-epitooppi (epitoopit) voidaan esimerkiksi järjestää ei-viereiseen konfiguraatioon ja voidaan edullisesti johtaa samasta proteiiniallergeenista tai muusta antigeenistä. Ei-viereinen määritetään aminohappojen järjestykseksi, joissa on T-solu-epitoopit tai alueet, 15 joissa on T-solu-epitooppi (epitoopit), joka on erilainen kuin proteiiniallergeenissa tai muussa proteiiniantigeenissa oleva aminohapposekvenssi, joista epitoopit tai alueet on johdettu. Lisäksi ei-vierekkäiset T-solu-epitoopit tai alueet, joissa on T-solu-epitooppeja, voidaan järjestää ei-pe-20 räkkäiseen järjestykseen (esim. erilaiseen järjestykseen kuin aminohappojen järjestys natiivissa allergeenissa tai muussa proteiiniantigeenissa, josta T-solu-epitoopit tai alue, jossa on T-solu-epitooppi (epitoopit), on johdettu, missä aminoha-: pot on järjestetty aminoterminuksesta karboksiterminukseen).

·’ 25 Edullinen rekombitooppipeptidi sisältää vähintään 15 %, edul- ‘ lisemmin vähintään 30 %, jopa edullisemmin vähintään 50 % ja edullisimmin 100 %:iin asti proteiiniallergeenin tai muun ·;·; proteiiniantigeenin T-solu-epitooppeja.

30 Tilanteessa, missä proteiiniallergeenin tai muun proteiinian tigeenin T-solu-epitoopit ovat tuntemattomat tai huonosti-kuvatut (esim. joitakin tai kaikkia proteiiniantigeenin pep-··· tidialueita, joilla on ihmisen T-solua stimuloivaa aktiivi- suutta, ei ole määritetty standardeilla T-solubiologian tek-,35 nilkoilla tai proteiiniantigeenin tarkkoja ihmisen T-solu- epitooppeja ei ole kuvattu hienokartoitustekniikoilla) , voi-daan rekombitooppipeptidi saada tarkastelemalla uudestaan 13 109809 allergeenin tai muun antigeenin tunnettua proteiinirakennetta ja jakamalla teoreettisesti allergeeni tai antigeeni ainakin kahteen halutun pituiseen peptidialueeseen. Esimerkiksi allergeenin tai muun antigeenin proteiinisekvenssi voidaan 5 systemaattisesti jakaa ainakin kahteen ei-päällekkäin menevään halutun pituiseen peptidialueeseen tai ainakin kahteen päällekkäin menevään halutun pituiseen peptidialueeseen ja teoreettisesti järjestää muodostamaan ainakin yksi rekombi-tooppipeptidi, jossa ainakin kaksi aluetta järjestetään 10 uudestaan ei-vierekkäin ja edullisesti ei-peräkkäiseen järjestykseen. Tämä jakaminen peptidialueisiin voi olla mielivaltainen, voidaan tehdä algoritmin mukaisesti tai voi kokonaan tai osittain perustua proteiiniantigeenin alueisiin, joilla tiedetään olevan ainakin yksi T-solu-epitooppi.

15

Kun tunnetaan peptidialueiden vain muutamia proteiinisiler-geenin tai muun proteiiniantigeenin, joka koostuu ainakin yhdestä T-solu-epitoopista, tai kun kaikki proteiiniallergee-nin tai muun proteiiniantigeenin alueet, joilla on ihmisen T-20 solua stimuloivaa aktiivisuutta, ovat tuntemattomat edullisesti vähintään 50 % proteiiniallergeenin tai muun proteiiniantigeenin koko proteiinisekvenssistä ja edullisemmin proteiiniallergeenin tai muun proteiiniantigeenin koko prote-; * iinisekvenssi jaetaan ja järjestetään uudestaan yhteen tai !!'25 useampaan rekombitooppipeptidiin. Tarkoitus sen takana, että ‘ käytetään niin suurta proteiiniantigeenin proteiinisekvenssin prosenttiosuutta muodostettaessa rekombitooppipeptidiä on, että tuloksena oleva rekombitooppipeptidi sisältää vähintään ·.· · 15 %, edullisemmin vähintään 30 %, jopa edullisemmin vähin- 30 tään 50 % ja edullisimmin 100 % proteiiniantigeenin T-solu- epitooppeja. Tietenkin jos proteiiniantigeenin muutamat pep-tidialueet, joista jokaisen tiedetään koostuvan ainakin yh-destä T-soluepitoopista, muodostavat edellä esitetyn prote-.·;· iiniantigeenin T-solu-epitooppien prosenttiosuuden ja sellai- •35 set peptidialueet eivät muodosta vähintään 50 % proteiinian-tigeenin koko proteiinisekvenssistä, ei ole välttämätöntä käyttää sellaista suurta prosenttiosuutta koko proteiinisek- • I ’ 14 109809 venssistä muodostettaessa rekombitooppipeptidiä. Tämän menetelmän mukaisesti rekombitooppipeptidit voidaan sitten tuottaa rekombinanttisesti tai synteettisesti ja rekombitooppi-peptidin kyky stimuloida ihmisen T-soluja voidaan määrittää.

5 Kun rekombitooppipeptidissä on alueita, jotka on johdettu pproteiiniallergeenista, voidaan yksittäiset peptidialueet tuottaa ja testata määrittämään, mitkä alueet sitovat immu-noglobuliini E:tä, joka on spesifinen allergeenille ja mikä sellaisista alueista aiheuttaisi välittäjien vapautumisen 10 (esim. histamiini) syöttösoluista tai basofiileistä. Niitä peptidialueita, joiden havaittiin sitovan immunoglobuliini E:tä ja aiheuttavan välittäjien vapautumisen syöttösoluista tai basofiileistä suuremmassa kuin noin 10-15 % testatuista allergisista seerumeista, ei edullisesti liitetä peptidialu-15 eisiin, jotka on järjestetty muodostamaan rekombitooppipeptidit.

Rakennettaessa rekombitooppipeptidiä, joka on johdettu fosfo-lipaasi A2:sta, voidaan pää-allergeeniä mehiläisen myrkystä 20 käyttää valaisevana esimerkkinä rekombitooppipeptidin rakentamisesta, kun proteiiniantigeenin proteiinirakenne tunnetaan, mutta T-soluepitooppeja ei tunneta tai huonosti kuvat-. . tuja. Fosfolipaasi A2 koostuu 134:stä aminohaposta, kuten on I määritetty cDNA-kloonauksella (Kuchler, K. et ai. Eur. J.

:;:25 Biochem. 184:249-254). Tämä aminohapposekvenssi voidaan jakaa : ‘ alueisiin, joissa jokaisessa on edullisesti 20-35 aminohappo- jäännöstä, jokaisen alueen edullisesti mennen päällekkäin toisen alueen kanssa noin 10 aminohapolla (katso kuvio 12) .

: : Vaikka kuvio 12 osoittaa proteiinin koko proteiinisekvenssin 30 jaettuna alueisiin, koko sekvenssi, joka on käytetty muodos tamaan ainakin yksi rekombitooppipeptidi, voi olla olennaisesti vähemmän kuin koko proteiinisekvenssi. Jotta maksimoi-daan mahdollisuus liittää T-soluepitoopit rakennettuun rekom-bitooppipeptidiin, voidaan päällekkäin menevät alueet ja ’.35 jokaisen alueen pituus suunnitella ylläpitämään ennustettu T-solu-epitooppien läsnäolo käyttämällä algoritmeja (Rothbard, J. ja Taylor, W.R. EMBO J. 7:93-100 (1988); Berzofsky, J.A.

• » · · 15 109809

Philos Trans R. Soc. Lond. 323:535-544 (1989). Ihmisen T-solu-epitooppeja proteiiniallergeenissa voidaan edullisesti ennustaa käyttämällä HLA luokka II spesifisiä sitomisspesifi-siä aminohappojäännöksiä. Lisäksi jotta minimoidaan todennä-5 köisyys, että rakennettu rekombitooppipeptidi sitoo ihmisen allergisen IgE:n, voidaan tuloksena olevan rekombitooppipep-tidin aminohapposekvenssi tehdä erilaiseksi kuin fosfolipaasi A2:n natiivin rakenteen muuntamalla alueet ja/tai kuljettamalla aminoterminaalialueet tai karboksiterminaalialueet 10 molekyylin vastakkaiseen päähän (s.o. aminohappojäännökset, jotka sijaitsevat natiivin proteiinin aminoterminuksessa, voidaan laittaa rekombitooppipeptidin karboksiterminukseen). Samanlaista menetelmää voidaan käyttää rakentamaan rekombitooppipeptidi, joka on johdettu autoantigeenistä, jolla on 15 tunnettu proteiinirakenne, mutta määrittelemättömät T-solu-epitoopit, kuten glutamiinihappodekarboksylaasi (esim. Samana, J.P. ja Mallet, J. Journal of Neurochemistry 54:703-705 (1990)), insuliini (Joslin's Diabetes Mellitus, 12. toimitus., toim. A. Marble et ai., Lea & Febiger, Philadelphia, s. 20 67 (1985)), jne. Tässä tilanteessa peptidialueet järjestetään konfiguraatioon, joka on erilainen kuin luonnostaan, autoantigeenissä esiintyvien alueiden konfiguraatio eliminoimaan autoantigeenin ei-toivottu ominaisuus, kuten immunoglobulii-: t· nin sitominen tai entsymaattinen aktiivisuus.

::;25

Rekombitooppipeptidit, jotka koostuvat ainakin kahdesta alueesta, jotka on johdettu allergeenistä tai muusta antigeenis-tä, testataan jotta määritetään ne rekombitooppipeptidit, ’.· · joilla on T-solua stimuloivaa aktiivisuutta (s.o. lisääntymi-30 nen, lymfokiinieritys ja/tai T-solu vastustuskyvyttömyys/sietokyky) ja täten sisältävät ainakin yhden T-solu-epitoopin. Esimerkiksi ihmisen T-solua stimuloiva aktiivisuus voidaan testata viljelemällä T-soluja, jotka saatiin yksilöstä, joka ;· on herkkä proteiiniallergeenille tai proteiiniantigeenille •35 (s.o. yksilö, jolla on immuunivaste proteiiniallergeenille tai proteiiniantigeenille) rekombitooppipeptidin kanssa, joka on johdettu proteiiniallergeenistä tai antigeenistä ja määri- I i 16 109809 tetään lisääntyminen T-soluilla vasteena rekombitooppipepti-diin.

Kuten esimerkeissä on kuvattu yksityiskohtaisesti, stimulaa-5 tioindeksit T-solujen vasteille rekombitooppipeptideihin voidaan laskea maksimaalisena CPM:nä vasteena rekombitooppi-peptidiin jaettuna keskiarvokontrollilla CPM. Kuten käytetty läpi tämän hakemuksen, ihmisen T-solua stimuloiva aktiivisuus määritetään stimulaatioindeksinä ainakin 2,0:ksi. Stimulaati-10 oindeksiä, joka on ainakin 2,0, pidetään positiivisena tarkoituksiin, joissa määritetään rekombitooppipeptidit, jotka ovat hyödyllisiä immunoterapeuttisina aineina. Edullisilla rekombitooppipeptideillä on stimulaatioindeksi vähintään 2,5, edullisemmin vähintään 3,5 ja edullisimmin ainakin 5,0.

15

Lisäksi keksinnön edulliset rekombitooppipeptidit, jotka on johdettu proteiiniallergeeneista, eivät sido immunoglobu-liini E:tä (IgE) tai sitovat IgE:tä olennaisesti pienemmässä määrin kuin proteiiniallergeeni(t), jo(i)sta peptidit on 20 johdettu, sitoo IgE:tä. Standardi immunoterapian pääasialliset komplikaatiot ovat systeemiset vasteet, kuten anafylak-sia. Immunoglobuliini E on anafylaktisten reaktioiden välit-täjä, mikä on tulos antigeenin sitomisesta ja ristiinliitty-: .· misestä IgErhen syöttösoluissa tai basofiileissä ja välittä- *·* 25 jien vapautumisesta (esim. histamiini, serotoniini, eosino- fiili kemotaktiset tekijät). Täten anafylaktia voitaisiin

«IM

välttää käyttämällä rekombitooppipeptidiä, joka ei sido IgE:-tä tai jos rekombitooppipeptidi sitoo IgE:tä, sellainen sito-v minen ei johda välittäjien vapautumiseen (esim. histamiini 30 jne.) syöttösoluista tai basofiileistä. Lisäksi rekombitoop pipeptidit, joilla on minimaalinen IgE:tä stimuloiva aktiivisuus, ovat erityisen toivottavia terapeuttiseen tehokkuu-;· teen. Minimaalinen IgE:tä stimuloiva aktiivisuus viittaa IgE-tuottoon, joka on vähemmän kuin IgE-tuoton määrä ja/tai IL-4-*35 tuotto, jota stimuloi koko proteiiniallergeenin.

• * * 17 109809

Keksinnön rekombitooppipeptidi, joka on johdettu proteiinial-lergeenista, annettuna yksilölle, joka on herkkä proteiinial-lergeenille, kykenee modifioimaan yksilön allergisia vasteita allergeenille. Erityisesti rekombitooppipeptidit, jotka koos-5 tuvat ainakin kahdesta proteiiniallergeenin T-solu-epitoopis- ta tai ainakin kahdesta alueesta, jotka on johdettu prote-iiniallergeenista, jokaisen alueen edullisesti koostuessa ainakin yhdestä T-solu-epitoopista annettuna yksilölle, joka on herkkä allergeenille, kykenevät modifoimaan yksilön T-10 solu-vastetta allergeenille. Kuten tässä on käytetty, voidaan proteiiniallergeenille herkän yksilön allergisen vasteen modifiointi kuvata ei-vasteellisina tai oireiden pienenemisenä allergeenille, määritettynä standardi kliinisillä menetelmillä (katso esim. Varney et ai., British Medical Journal 15 302: 265-269 (1990)).

Tässä kuvatun työn tuloksena on tuotettu rekombitooppipepti-dejä, jotka on johdettu proteiiniallergeeneista tai muista proteiiniantigeeneistä ja joilla on T-solua stimuloivaa ak-20 tiivisuutta tai edullisesti sisältävät kaksi a- luetta, joissa kummassakin on ainakin yksi T-solu-epitooppi. T-solu-epi-tooppien uskotaan olevan mukana aloittamassa ja säilyttämässä immuunivastetta proteiiniallergeenille tai muulle proteiini- ,* I antigeenille, joka on vastuussa vastaavasti allergian tai • * ;:25 muiden sairauksien kliinisistä oireista. Näiden T-solu-epi-: * tooppien ajatellaan antavan sysäyksen aikaisille tapahtumille ’ T-auttajasolun tasolla sitoutumalla sopivaan HLA-molekyyliin solua edustavan antigeenin pinnalla ja stimuloivan merkityk- * · · sellistä T-solun alapopulaatiota. Nämä tapahtumat johtavat 30 T-solun lisääntymiseen, lymfokiinieritykseen, paikallisiin tulehduksellisiin reaktioihin, lisäksi tulevien immuunisolu-jen kierrättämistä paikalle ja B-solutoiminnan portaittaisen tapahtumisen aktivointia johtaen vasta-aineiden tuottamiseen. Eräs näiden vasta-aineiden isotyyppi, IgE on pohjimmiltaan .35 tärkeä allergisten oireiden kehittymiselle ja sen tuottoon vaikutetaan aikaisin toisiaan seuraavissa tapahtumissa, T-’ auttajasolutasolla, eritettyjen lymfokiinien luonteella. T- III* 18 109809 solu-epitooppi on peruselementti tai T-solureseptorin pienin tunnistusyksikkö, missä epitooppi koostuu aminohapoista, jotka ovat olennaisia reseptorin tunnistukselle ja voivat olla vierekkäisiä ja/tai ei-vierekkäisiä proteiinin aminohap-5 posekvenssissä. T-solu-epitoopilla, kuten tässä on käytetty, on stimulaatioindeksi, joka on vähintään 2,0, edullisemmin vähintään 2,5, vielä edullisemmin ainakin 3,5 ja edullisimmin ainakin 5,0. Aminohapposekvenssit, jotka matkivat T-soluepi-tooppien aminohapposekvenssejä ja jotka modifioivat allergis-10 ta vastetta proteiiniallergeeneille, ovat tämän keksinnön piirissä.

Potilaiden altistaminen tämän keksinnön peptideille, jotka on johdettu proteiiniallergeeneista tai muista proteiinianti-15 geeneistä, saattaa sietää sopivia T-solu-alapopulaatioita tai niihin tulee vastustuskyvyttömyys siten, että heillä ei ole vastetta proteiiniallergeenille tai muille antigeeneille ja eivät ota osaa immuunivasteen stimulointiin sellaisen kokeen jälkeen. Lisäksi tämän keksinnön peptidin, jotka on johdettu 20 proteiiniallergeeneista, antaminen voi modifioida lymfo-kiinieritysprofiilia verrattuna altistamiseen luonnostaan esiintyvälle proteiiniallergeenille tai sen osalle (esim.

V johtaa IL-4:n laskuun tai IL-2:n kasvuun). Lisäksi rekombi- * i ; ,· tooppipeptidille altistaminen saattaa vaikuttaa T-solu-alapo- * · i*25 pulaatioihin, jotka normaalisti ottavat osaa allergeenia vastaan olevaan vasteeseen siten, että nämä T-solut ajetaan i » · · pois normaalin allergeenille altistamisen kohdasta (kohdista) I · "«! (esim. nenän limakalvo, iho ja keuhkot) kohti rekombitooppi-

* I

peptidin terapeuttisia antaraiskohtia. Tämä T-solu-alapopulaa-30 tion uudelleen jakaminen saattaa parantaa tai vähentää yksilön immuunisysteemin kykyä stimuloida tavallista immuunivastetta normaalin allergeenille altistamisen kohdassa johtaen i allergisten oireiden pienenemiseen.

’li* * * » •35 Keksinnön rekombitooppipeptidit koostuvat edullisesti ainakin kahdesta T-solu-epitoopista (esim. rekombitooppipeptidi koostuu ainakin noin kahdeksasta aminohappojäännöksestä ja edul- » 19 109809 lisesti ainakin 15 aminohappojäännöksestä). Keksinnön muut rekombitooppipeptidit koostuvat ainakin kahdesta alueesta, jotka on johdettu samoista tai erilaisista proteiiniallergee-neista tai muista proteiiniantigeeneista, mainituilla rekom-5 bitooppipeptideillä ollen T-solua stimuloivaa aktiivisuutta ja jokaisella alueella ollen edullisesti ihmisen T-solua stimuloivaa aktiivisuutta ja sen mukaisesti koostuen ainakin yhdestä proteiiniallergeenin tai muun proteiiniantigeenin T-solu-epitoopista. Yleensä rekombitooppipeptidin jokainen sello lainen alue koostuu ainakin noin seitsemästä, vähintään yhden proteiiniallergeenin aminohappojäännöksestä. Rekombitooppipeptidin jokainen sellainen alue koostuu ainakin kahdesta T-solu-epitoopista (esim. rekombitooppipeptidi koostuu edullisesti ainakin likimäärin kahdeksasta aminohappojäännöksestä 15 ja edullisesti ainakin 15 aminohappojäännöksestä). Keksinnön rekombitooppipeptidit voivat koostua niin monesta aminohappo-jäännöksestä kuin toivotaan ja edullisesti niissä on ainakin noin 7, edullisemmin ainakin noin 15, vielä edullisemmin ainakin noin 30 ja edullisimmin ainakin noin 40 proteiinial-20 lergeenin tai muun proteiiniantigeenin aminohappojäännöstä. Rekombitooppipeptidin alue sisältää edullisesti 45 asti aminohappojäännöksiä pituudeltaan, edullisemmin 40 asti *·'·' aminohappo jäännöksiä pituudeltaan ja edullisimmin 30 asti : aminohappojäännöksiä pituudeltaan, sillä rekombitooppipepti- •2*5· din alueen pituuden kasvu saattaa johtaa vaikeuksiin pepti-*:·*: disynteesissä samoin kuin ei-toivottun ominaisuuden säilyttä- ··· miseen (esim. immunoglobuliinisitominen tai entsymaattinen aktiivisuus) johtuen konformationaalisen samankaltaisuuden ylläpitäminen alueen ja proteiiniallergeenin tai muun prote-30 iiniantigeenin välillä, mistä se on johdettu. Jos toivottua, voidaan alueiden aminohappojäännökset tuottaa ja liittää linkkerillä lisäämään herkkyyttä antigeeniä esittävien solu-;; jen prosessointiin. Sellainen linkkeri voi olla mikä tahansa ‘ ei-epitooppiaminohapposekvenssi tai muu sopiva kytkevä tai :35; liittävä aine.

20 109809

Kun rekombitooppipeptidit johdetaan proteiiniallergeeneista, niissä voi olla ainakin kaksi aluetta, jotka on johdettu erilaisista proteiiniallergeeneista samasta suvusta, kuten: suku Dermatophaaoides: suku Felis; suku Ambrosia: suku Lo-5 lium; suku Crvotomeria: suku Alternaria: suku Alder: suku

Betula; suku Ouercus; suku Olea: suku Artemisia: suku Planta-go; suku Parietaria: suku Canine; suku Blattella, suku Apis; ja suku Periplaneta. Lisäksi rekombitooppipeptideissä voi olla ainakin kaksi aluetta, jotka on johdettu ristiin-10 reagoivista lajeista, esimerkiksi yksi alue, joka on johdettu Dermatophaaoides pteronvssinuksesta ja toinen alue johdettu Dermatophaaoides farinaesta. Eräässä toisessa suoritusmuodossa alueet voidaan johtaa samasta lajista (esim. yksi alue johdettu Der p I:stä ja yksi alue johdettu Der p II:sta: yksi 15 alue johdettu Der f I:stä ja yksi alue johdettu Der f II:sta; yksi alue johdettu Amb a I:stä ja yksi alue johdettu Amb a II:stä; yksi alue johdettu Loi p I:stä ja yksi alue johdettu Loi p IX:stä: yksi alue johdettu Crv i I:stä ja yksi alue johdettu Crv i ll:sta). Lisäksi rekombitooppipeptideissä voi 20 olla ainakin kaksi aluetta, jotka on johdettu eri proteiiniallergeeneista samasta ryhmästä, kuten että yksi alue johdettu Dermatophaaoides pteronvssinuksen ryhmä I prote-iiniallergeenista (s.o. Der p I) ja yksi alue johdettu Derma -: tophaaoides farinaen ryhmä I proteiiniallergeenista (s.o. Der 25- f I). Vaihtoehtoisesti, alueet voidaan johtaa erilaisista *:·*: proteiiniallergeeneista samasta perheestä (esim. Amb a 1.1, • |* Amb a 1.2, Amb a 1.3 ja Amb a 1.4). Erityisen edullisia re-• · · · . kombitooppipeptidejä käsittelemään Felis domesticus-herkkyyt- tä johdetaan suvusta Felis ja niihin sisältyvät alueet, jotka 30 on valittu TRFP:n peptideistä X, Y, Z, A ja B, jokaisen peptidin aminohapposekvenssit ovat kuten kuviossa 4 (SEQ ID Nro: 7-11) nähdään, ja niiden modifikaatiot, kuten peptidi C (SEQ ·.: ID Nro: 12) , joka on yksi aminohappolisäys peptidi A:han ja ' nähdään kuviossa 4. Edullisissa rekombitooppipeptideissä on 35. peptidi YZX ja peptidi AYZXB. Läpi hakemuksen viittaavat ,···. kirjaimet X, Y, Z, A, B ja C vastaavasti peptidiin X, pepti-·’· diin Y, peptidiin A, peptidiin B ja peptidiin C ja kun kir- 21 109809 jäimiä käytetään yhdessä (esim. YZX), viitataan rekombitoop-pipeptidiin, jossa on peptidi Y, peptidi Z ja peptidi X perättäisessä tarkoin määrätyssä järjestyksessä (s.o. YZX viittaa rekombitooppipeptidiin, jossa on peptidin Y aminohap-5 posekvenssi, jonka jälkeen on välittömästi, ilman yhtään välissä olevia aminohappojäännöksiä, peptidin Z aminohapposekvenssi, jonka jälkeen on välittömästi, ilman yhtään välissä olevia aminohappojäännöksiä, peptidin X aminohapposekvenssi). Keksinnön rekombitooppipeptidit, esim. YZX, voivat sisältää 10 lisäksi rekombitooppipeptidin joko amino- tai karboksiter-minuksen aminohappojäännöksiä.

Keksinnön rekombitooppipeptidit voidaan johtaa proteiinian-tigeeneistä, jotka ovat muita kuin proteiiniallergeeneja, 15 milloin toivotaan antigeeni-spesifisen immuunivasteen vahvistumista tai depressiota. Esimerkiksi alueet, joissa on tunnetun autoantigeenin, joka on mukana tunnetun autoantigeenin autoimmuunisairauden tai T-solu-epitooppien patogeenisyydes-sä, ihmisen T-solua stimuloivaa aktiivisuutta, voidaan tun-20 nistaa ja yhdistää rekombitooppipeptidiin vähentämään vasta-aine-vastetta autoantigeeniin, sekaantumaan tehokkuuteen ja/tai vähentämään immuunikompleksiin kuuluvia sivuvaikutuk-v.: siä. Jotta säilytetään autoantigeenin T-solu-reaktiivisyys, : voitaisiin autoantigeenialueet, joissa on T-solua stimuloivaa • · 25. aktiivisuutta, määrittää standardeilla T-solubiologian tek- ·:··· niikoilla, tai jos toivottua, tarkat T-solu-epitoopit voidaan .j. kuvata hienokartoitustekniikoilla ja rekombitooppipeptidi, • · · · joka koostuu ainakin kahdesta alueesta, joista kummallakin on ihmisen T-solua stimuloivaa aktiivisuutta ja sisältäen aina-30 kin yhden tuotetun T-solu-epitoopin. Esimerkiksi, jos autoantigeenissä löydetään kolme aluetta, joissa on ihmisen T-solua stimuloivaa aktiivisuutta tai kolme T-solu-epitooppia, peräksi käisessä ja vierekkäisessä järjestyksessä 1, 2, 3 aminoter-·.· minuksesta karboksiterminukseen, voitaisiin tuottaa 6 mahdol- 35. lista rekombitooppipeptidiä käyttäen jokaista aluetta tai • * * ,··. jokaista T-solu-epitooppia kerran, missä olisi kolme aluetta ’’· tai T-solu-epitooppia erilaisissa järjestyksissä (esim. 213, 22 109809 312, 132, 321, 123, 231). Näistä kuudesta rekombitooppipepti-distä voitaisiin testata kyky stimuloida T-solu-aktiivisuutta ja ei-toivotun ominaisuuden, joka on autoantigeenissä, puuttuminen, esim. rekombitooppipeptidi(e)n kyvyttömyys sitoa 5 auto-vasta-aineita. Vaihtoehtoisesti, kuten aikaisemmin kuvattiin, voidaan rekombitooppipeptidit rakentaa autoantigeenistä tietämättä, millä alueilla on T-solua stimuloivaa aktiivisuutta tai mitkä ovat tarkat T-solu-epitoopit. Rekombitooppipeptidit, jotka stimuloivat T-soluja ja joilla ei ole 10 autoantigeenin ei-toivottuja ominaisuuksia (esim. eivät sido autoantigeenille herkkien yksilöiden auto-vasta-aineita huomattavana prosenttiosuutena), valitaan käytettäväksi im-muuniterapeuttisina tai diagnostisina aineina. Terapeuttisen koostumuksen muodossa rekombitooppipeptidiä voitaisiin jakaa 15 fysiologisesti hyväksyttävässä väliaineessa adjuvantin puuttuessa sallimaan rekombitooppipeptidin indusoida antigeeni-spesifisen autoantigeenin, josta rekombitooppi on johdettu, sietämisen ja säädellä mitä tahansa mahdollisesti tuhoavaa vastetta. Autoantigeenien joukossa, jotka ovat hyödyllisiä 20 tuotettaessa rekombitooppipeptideitä, ovat insuliini, gluta-miinihappodekarboksylaasi (64K), PM-1 ja karboksipeptidaasi sokeritaudissa; myeliini-pohjäinen proteiini multippeliskle-ί.ν roosissa; rh-tekijä vastasyntyneen varhaispunasolujen liika-tuotanto; asetyylikoliinireseptorit ankarassa lihasheikkouk-J25,, sessa; kilpirauhasreseptorit struumassa (Graceve's Disease) ; tyvikalvoproteiinit Goodpasturen syndrooma; kilpirauhasprote-iinit kilpirauhastulehduksessa. Esimerkiksi alueet, joissa on V! emäksisen myeliiniproteiinin (MBP) ihmisen T-solua stimu- > · i loivaa aktiivisuutta; esim. alue, jossa on kaikki tai osa 30 ihmisen MBP:n aminohappojäännöksiä 84-106 ja edullisemmin 84-102 ja edullisemmin 80-101 ja alue, jossa on kaikki tai osa ihmisen MBP:n aminohappojäännöksiä 140-172 ja edullisemmin 143-168, voi sisältää keksinnön rekombitooppipeptidin käytet-:: täväksi hoidettaessa multippeliskleroosia.

35*

Keksinnön piirissä olevia rekombitooppipeptidejä voidaan käyttää menetelmissä hoitaa ja diagnosoida herkkyyttä yksi- I I * * · 23 109809 lössä proteiiniallergeenia tai muita proteiiniantigeenejä vastaan. Täten keksinnön eräs näkökohta tarjoaa terapeuttisia koostumuksia, jotka koostuvat rekombitooppipeptidistä ha farmaseuttisesti hyväksyttävästä kantajasta tai laimentimes-5 ta. Tämän keksinnön terapeuttisten koostumusten antaminen yksilön yliherkkyyden poistamiseksi proteiiniallergeenille tai muulle proteiiniantigeenille voidaan suorittaa käyttämällä tunnettuja tekniikoita. Esimerkiksi rekombitooppipeptidiä voidaan antaa yhdessä sopivan laimentimen, kantajan ja/tai 10 adjuvantin kanssa, kun sopivaa. Farmaseuttisesti hyväksyttäviin laimentimiin kuuluvat suolaliuos ja vesiliukoiset puskuriliuokset. Farmaseuttisesti hyväksyttäviin kantajiin kuuluvat polyetyleeniglykoli (Wie et ai., International Archives of Allergy and Applied immunology 64: 84-99 (1981) ja li-15 posomit (Strejan et ai., Journal of Neuroimmunology 7: 27 (1984). Farmaseuttisesti hyväksyttäviin adjuvantteihin kuuluvat aluna. Sellaisia koostumuksia annetaan yleensä ruiskeella (ihonalaisesti, laskimonsisäisesti, jne), suun kautta annettuna (esim. kapselin muodossa), sisäänhengitys, ihon läpi 20 käytettynä tai peräsuoneen annettuna. Keksinnön terapeuttisia koostumuksia annetaan yksilöille, jotka ovat herkkiä allergeenille tai muille proteiiniantigeeneille, josta rekombi- * · \V tooppipeptidi on johdettu, annoksina ja ajanpituuksina, jotka 4 * ·,· , ovat tehokkaita vähentämään yksilön herkkyyttä allergeenille 25» ja muulle antigeenille. Terapeuttisesti tehokas määrä yhtä ·:·· tai useampaa samaa tai erilaista terapeuttista koostumusta I voidaan antaa samanaikaisesti tai peräkkäin yksilölle, joka * · « ♦ on herkkä allergeenille tai muulle proteiiniantigeenille.

• >

Terapeuttisten koostumusten tehokkaat määrät vaihtelevat 30 tekijöiden mukaan, kuten yksilön herkkyyden aste, yksilön ikä, sukupuoli ja paino ja peptidien kyky stimuloida T-solu-vaste yksilössä. Vielä eräässä tämän keksinnön näkökohdassa • i « *>.·’ annetaan koostumus, joka koostuu ainakin kahdesta rekombi-» « » v tooppipeptidistä (esim. ainakin kahden rekombitooppipeptidin f 4 3E? fysikaalinen seos) , jokaisen koostuessa ainakin kahdesta T- • · 4 ,··· solu-epitoopista, jotka on johdettu samoista tai erilaisista proteiiniallergeeneista tai muista proteiiniantigeeneista.

* 1 4 » » | 14*1 24 109809 Tämä keksintö antaa myös menetelmät määrittää herkkyyttä proteiiniantigeeniä vastaan yksilöissä ja menetelmät määrittää immunoglobuliinin, joka on spesifinen proteiinianti-geenille, läsnäolon ja yksilöiden T-solujen kyvyn vastata 5 antigeeniin. Jotta herkkyys määritetään, verinäyte, joka saatiin yksilöstä tai ainakin yksi osa näytteestä, yhdistetään proteiiniantigeenin kanssa, joka on modifioitu prote-iiniantigeenistä tai osa jompaakumpaa antigeeniä, joista jokainen sitoo immunoglobuliininä, joka on spesifinen anti-10 geenille olosuhteissa, jotka ovat sopivat sitomaan veren komponentteja antigeenin, modifioidun antigeenin tai sen osan kanssa. Toinen verinäyte, joka saatiin yksilöstä, jolla havaittiin olevan verikomponenttien sitomista proteiinianti-geeniin, modifioituun antigeeniin tai sen osaan tai yksilön 15 ensimmäisen verinäytteen toinen osa, jolla havaittiin olevan verikomponenttien sitomista proteiiniantigeeniin, modifioituun antigeeniin tai sen osaan, yhdistetään rekombitooppipep-tidin kanssa, joka koostuu ainakin kahdesta alueesta, jotka on johdettu proteiiniantigeenistä, mainitulla rekombitoop-20 pieptidillä ollen T-solua stimuloivaa aktiivisuutta; tai rekombitooppipeptidi, joka koostuu ainakin kahdesta alueesta, jotka on johdettu proteiiniantigeenistä, joista kummallakin alueella on ihmisen T-solua stimuloivaa aktiivisuutta; tai ! proteiiniantigeenin tai sen osan modifioitu osa; tai rekom-;;25 binanttisesti tuotettu proteiiniantigeeni, joista mikään ei • ' sido immunoglobuliiniä, joka on spesifinen proteiinianti-* ' geenille olennaisena prosenttiosuutena yksilöiden populaa- tiossa, jotka ovat herkkiä proteiiniantigeenille (esim. aina-· kin noin 75 %), jotta määritetään, tapahtuuko T-solu-stimu-30 laatiota. Jos proteiiniantigeeni on proteiiniallergeeni, ei proteiiniallergeenin tai sen osan modifioitu muoto, rekom-binanttisesti tuotettu proteiiniallergeeni tai rekombitooppi-peptidi, joka on johdettu proteiiniallergeenista, sido IgE:-.*!_ tä, joka on spesifinen proteiiniallergeenille tai jos IgE:n '35 sitomista tapahtuu, ei sellainen sitominen johda välittäjäai-:.i.: neiden vapauttamiseen syöttösoluista tai basofiileistä olen- naisena prosenttiosuutena yksilöiden populaatiossa, jotka 25 109809 ovat herkkiä allergeenille. Jos yksilöllä havaitaan olevan verikomponenttien sitomista antigeeniin, modifioituun antigeeniin tai sen osaan ja T-solu-stimulaatiota suhteessa re-kombitooppipeptidiin, modifioituun proteiiniantigeeniin tai 5 sen osaan tai rekombinanttisesti tuotettuun proteiiniantigeeniin, sitten yksilölle voidaan antaa terapeuttisesti tehokas määrä terapeuttista koostumusta, joka koostuu rekombi-tooppipeptidistä, rekombinanttisesti tuotetusta proteiinian-tigeenistä tai proteiiniantigeenin tai sen osan modifioidusta 10 osasta ja farmaseuttisesti hyväksyttävästä kantajasta tai laimentimesta poistamaan yksilön yliherkkyys proteiinianti-geenille.

Tämä keksintö tarjoaa myös menetelmän määrittää spesifinen 15 viivästyneen tyyppinen yliherkkyys yksilössä ainakin yhdelle proteiiniallergeenille. Menetelmän mukaisesti yksilölle annetaan viivästyneen tyyppinen yliherkkyystesti (katso esim. Immunology (1985) Roitt, I.M., Brostoff, J., Male, D.K. (toim.), C.V. Mosby Co., Gower Medical Publishing, London, 20 NY, ss. 19.2-19.18; ss. 22.1-22.10) käyttämällä proteiinial-lergeenin tai muun proteiiniantigeenin tai sen osan modifioitua muotoa tai proteiiniallergeenia tai muuta proteiinianti-geeniä, joka on tuotettu rekombinanttisesti, tai rekombitoop-: pipeptidiä, joka on johdettu mainitusta ainakin yhdestä pro- :*25 teiiniallergeenistä tai muusta proteiiniantigeenista, joista kullakin on ihmisen T-solua stimuloivaa aktiivisuutta ja . joista kumpikaan ei sido immunoglobuliinia, joka on spesifi-*!" nen proteiiniallergeenille tai muulle proteiiniantigeenille ·’ olennaisena prosenttiosuutena (esim. ainakin noin 75 %) yks-30 liöistä, jotka ovat herkkiä mainitulle proteiiniallergeenille tai muulle proteiiniantigeenille. Jos proteiiniantigeeni on proteiiniallergeeni, ei proteiiniallergeenin tai sen osan modifioitu muoto, rekombinanttisesti tuotettu proteiiniallergeeni tai rekombitooppipeptidi, joka on johdettu proteiinial-35 lergeenistä, sido IgE:tä, joka on spesifinen proteiinialler-;;; geenille tai jos IgE:n sitomista tapahtuu, ei sellainen sito-'·* minen johda välittäjäaineiden vapauttamiseen syöttösoluista 26 109809 tai basofiileistä olennaisena prosenttiosuutena yksilöiden populaatiossa, jotka ovat herkkiä allergeenille. On havaittu, että TRFP:n rekombinanttiketjulla 1 dimeerisessä muodossa on merkittävästi alentunut IgE-sitominen, mutta ylläpitää T-5 solu-reaktiivisyyden (s.o. rekombinanttisessa dimeerisessä ketju l:ssä on peptidit X ja Y, joista molempien tiedetään sisältävän ainakin yhden T-solu-epitoopin) ja että laimealla alkalilla käsitellyllä TRFP:llä on merkittävästi vähentynyt sitominen, mutta ylläpitää T-solu-reaktiivisyyttä. Sen mukaili) sesti TRFP:n rekombinanttiketju l:tä dimeerisessä muodossa tai alkalilla käsiteltyä TRFPrtä voitiin käyttää edellä kuvatussa viivästyneen tyyppisessä yliherkkyystestissä tai muissa diagnostisissa määrityksissä määrittämään yksilön herkkyyttä TRFP:n T-solu-epitooppiin (-epitooppeihin) ja/tai niitä voi-15 daan käyttää terapeuttisissa koostumuksissa poistamaan yksilöiden yliherkkyys TRFP:lie. Sen jälkeen, kun on annettu viivästyneen tyyppinen yliherkkyystesti, määritetään laajuus missä spesifinen viivästyneen tyyppinen yliherkkyysreaktio tapahtuu yksilössä proteiiniallergeenille tai muulle prote-20 iiniantigeenille osoittaen yksilössä T-solujen, jotka ovat spesifisiä proteiiniallergeenin tai muun proteiiniantigeenin T-solu-epitoop(e)ille, läsnäolon.

j Tämä keksintö tarjoaa lisäksi menetelmät määrittää ja käsikö teliä herkkyyttä yksilössä ainakin yhtä proteiiniallergeenia , vastaan. IgE:n, joka on spesifinen ainakin yhtä proteiinial- , lergeenia vastaan, läsnäolo yksilöissä ja yksilöiden T-solu-jen kyky vastata proteiiniallergeenin T-solu-epitooppiin ’·’ (-epitooppeihin), voidaan määrittää antamalla yksilöille 30 välittömän tyyppinen yliherkkyystesti ja viivästyneen tyyppinen yliherkkyystesti. Yksilöille annetaan välittömän tyyppinen yliherkkyystesti (katso esim., Immunology (1985) Roitt, ; I.M., Brostoff, J., Male, D.K. (toim.), C.V. Mosby Co., Gower

Medical Publishing, London, NY, ss. 19.2-19.18; ss. 22.1-3J3 22.10) käyttämällä proteiiniallergeenia tai sen osaa tai ;;; proteiiniallergeenin tai sen osan modifioitua muotoa, joista '·;·[ jokainen sitoo IgE:tä, joka on spesifinen allergeenille.

27 109809

Samoille yksilöille annetaan viivästyneen tyyppinen yliherk-kyystesti ennen, samanaikaisesti tai sen jälkeen kun on annettu välittömän tyyppinen yliherkkyystesti. Tietenkin jos välittömän tyyppinen yliherkkyystesti annetaan ennen viiväs-5 tyneen tyyppistä yliherkkyystestiä, voitaisiin viivästyneen tyyppinen yliherkkyystesti antaa niille yksilöille, joilla on spesifinen välittömän tyyppinen yliherkkyystesti. Viivästyneen tyyppinen yliherkkyystesti käyttää proteiiniallergeeniä tai sen osaa, proteiiniallergeeniä, joka on tuotettu rekom-10 binanttisesti, tai rekombitooppipeptidiä, joka on johdettu proteiiniallergeenistä, joista kullakin on ihmisen T-solua stimuloivaa aktiivisuutta ja joista kumpikaan ei sido IgE:tä, joka on spesifinen allergeenille olennaisena prosenttiosuutena (esim. ainakin noin 75 %) yksilöiden populaatiossa, jotka 15 ovat herkkiä allergeenille. Niille henkilöille, joilla havaitaan sekä spesifinen välittömän tyyppinen hypersensitiivi-syysreaktio että viivästyneen tyyppinen hypersensitiivisyys-reaktio, annetaan terapeuttisesti tehokas määrä terapeuttista koostumusta. Terapeuttinen koostumus koostuu proteiinin tai 20 sen osan modifoidusta muodosta, rekombinanttisesti tuotetusta proteiiniallergeenistä tai rekombinanttipeptidistä, jokaista kuten käytettiin viivästyneen tyyppisessä hypersensitiivi-:Y: syystestissä, ja farmaseuttisesti hyväksyttävästä kantajasta j tai laimentimesta.

:25

On myös mahdollista modifioida rekombitooppipeptidien raken-. netta sellaisiin tarkoituksiin nostamalla liukoisuutta, li- säämällä terapeuttista tai estävää tehokkuutta tai stabiili-' suutta (esim. se aika, joka voidaan säilyttää pilaantumatta 30 ex vivo ja resistenssi proteolyyttistä hajostusta vastaan in vivo). Voidaan tuottaa modifioitu rekombitooppipeptidi, jossa aminohapposekvenssi on muutettu, kuten aminohapposubstituu-“.· tiolla, deleetiolla tai additiolla modifioimaan immunogeeni-syyttä ja/tai vähentämään allergeenisyyttä, tai johon kom-3‘5‘ ponentti on lisätty samaa tarkoitusta varten. Esimerkiksi aminohappojäännökset, jotka ovat olennaisia T-solu-epitooppi-toiminnalle, voidaan määrittää käyttämällä tunnettuja teknii-

i I

28 109809 koita (esim. jokaisen jäännöksen substituutio ja T-solureak-tiivisyyden läsnäolon tai puuttumisen määrittäminen). Ne jäännökset, jotka on osoitettu olevan olennaisia, voidaan modifioida (esim. korvata toisella aminohapolla, jonka läsnä-5 olon on osoitettu lisäävän T-solu-reaktiivisyyttä), kuten voidaan ne, joita ei vaadita T-solu-reaktiivisuuteen (esim. korvaamalla toisella aminohapolla, jonka mukaanliittäminen lisää T-solu-reaktiivisyyttä, mutta ei vähennä sitomista merkitykselliseen MHC:hen). Toinen esimerkki rekombintooppi-10 peptidien modifikaatiosta on kysteiinijäännösten substituutio, edullisesti alaniinilla tai glutamiinihapolla tai vaihtoehtoisesti seriinillä tai treoniinillä minimoimaan dime-risaatiota disulfidiliitosten kautta. Jotta lisätään stabii-lisuutta ja/tai reaktiivisyyttä, voidaan rekombitooppipepti-15 dejä myös modifioida liittämään yksi tai useampi polymorfi- suus proteiiniallergeenin, joka on seurausta luonnon alleeli-muunnelmasta, aminohapposekvenssiin. Lisäksi D-aminohapot, ei-luonnolliset aminohapot tai ei-aminohappo-analogit voidaan substituoida tai lisätä tuottamaan modifoitu peptidi tämän 20 keksinnön piirissä. Lisäksi rekombitooppipeptidit voidaan modifioida käyttämällä polyetyleeniglykoli- (PEG) menetelmää, A. Sehon ja avustajat (Wie et ai, supra) tuottamaan peptidi, joka on konjugoitu PEG:n kanssa. Rekombitooppipeptidien modi- ;.· fikaatioihin voi sisältyä myös pelkistys/alkylaatio (Tarr « · j25’ teoksessa: Methods of Protein Microcharacterization, J.E.

Silver toim. Humana Press, Clifton NJ, ss. 155-194 (1986)); asylaatio (Tarr, supra); esteröinti (Tarr, supra); kemialli- ·;·: nen kytkentä sopivaan kantajaan (Mishell ja Shiigi, toim.,

Selected Methods in Cellular Immunology, WH Freeman, San 30 Francisco, CA (1980); U.S. patentti 4 939 239); tai laimea formaliinihoito (Marsh International Archives of Allergy and Applied Immunology 41: 199-215 (1971)).

.:· Jotta helpotetaan puhdistusta ja mahdollisesti lisätään 3& rekombitooppipeptidien liukoisuutta, on mahdollista lisätä

> I

reportteriryhmä (-ryhmiä) peptidirunkoon. Esimerkiksi poly-histidiiniä voidaan lisätä rekombitooppipeptidiin puhdista- > t · 29 109809 maan rekombitooppipeptidi immobilisoidussa metalli-ioniaf-finiteettikromatografiässä (Hochuli, E. et ai., Bio/Technolo-gy, 6:1321-1235 (1988)). Lisäksi voidaan tuoda erityisiä endoproteaasipilkkomiskohtia, jos toivottua, reportteriryhmän 5 ja rekombitooppipeptidin aminohapposekvenssien väliin helpottamaan rekombitooppipeptidien, joissa ei ole asiaankuulumattomia sekvenssejä, eristystä. Jotta poistetaan yliherkkyys proteiiniantigeeniin onnistuneesti yksilöstä, saattaa olla tarpeellista lisätä rekombitooppipetidin liukoisuutta lisää-10 mällä toiminnallisia ryhmiä peptidiin tai ei liittämällä mukaan hydrofobisia T-soluepitooppeja tai alueita, joissa on hydrofobisia epitooppeja rekombitooppipeptideissä.

Jotta mahdollisesti autetaan T-solu-epitooppien oikeata anti-15 geeniprosessointia rekombitooppipeptidissä, voidaan kanoni set proteaasiherkät kohdat manipuloida rekombinanttisesti tai synteettisesti alueiden väliin, jokaisen koostuessa ainakin yhdestä T-solu-epitoopista. Varautuneet aminohappoparit, kuten KK tai RR voidaan esimerkiksi viedä alueiden väliin 20 rekombitooppipeptidissä rekombitooppipeptidin rekombinantti- rakenteen aikana. Saatu rekombitooppipeptidi voidaan tehdä herkäksi katepsiinille ja/tai muille trypsiinin kaltaisille entsyymeille synnyttämään rekombitooppipeptidin osia, joissa : on yksi tai useampi T-solu-epitooppi. Lisäksi sellaiset va- :*25 rautuneet aminohappo jäännökset voivat johtaa rekombitooppi- ] peptidin liukoisuuden kasvuun.

* · ·;·; DNA:n, joka koodaa rekombitooppipeptidiä, kohdistettua muta-• · geneesiä voidaan käyttää modifioimaan rekombitooppipeptidin 30 rakennetta. Sellaisiin menetelmiin saattaa sisältyä PCR (Ho et ai., Gene 77:51-59 (1989)) tai mutatoitujen geenien koko-naissynteesi (Hostomsky, Z., et ai., Biochem. Biophys. Res. Comm. 161:1056-1063 (1989)). Jotta lisätään bakteerieksprβει '·' siota, voidaan edellä mainittuja menetelmiä käyttää muiden 3β menetelmien yhteydessä muuttamaan eukaryoottisia kodoneita • » ;;; DNA-rakenteissa, jotka koodaavat rekombitooppipeptidejä sel-'··· laisiksi, joita edullisesti käytetään JL_ colissa.

>11» 30 109809 Tähän keksintöön sisältyy myös nukleiinihapposekvenssit, jotka koodaavat keksinnön rekombitooppipeptidejä. Nukleiinihapposekvenssit, joita käytetään missä tahansa tämän keksinnön suoritusmuodossa, voivat olla cDNA, kuten tässä on kuvat-5 tu, tai vaihtoehtoisesti voivat olla mikä tahansa oligodesok-sinukleotidisekvenssi, jolla on kaikki tai osa tässä esitetystä sekvenssistä, tai niiden toiminnallisia ekvivalentteja. Sellaisia oligodesoksinukleotidisekvenssejä voidaan tuottaa kemiallisesti tai mekaanisesti käyttämällä tunnettuja teknii-10 koita. Oligonukleotidisekvenssin toiminnallinen ekvivalentti on sellainen, joka on 1) sekvenssi, joka kykenee hybridisoi-tumaan komplementaariseen oligonukleotidiin, johon oligonuk-leotidisekvenssi (tai vastaavat sekvenssiosat) tai sen fragmentit hybridisoituvat, tai 2) sekvenssi (tai vastaava sek-15 venssiosa), joka on komplementaarinen oligonukleotidisekvenssin kanssa ja/tai 3) sekvenssi joka koodaa tuotetta (esim. proteiini, polypeptidi tai peptidi), jolla on oligonukleotidisekvenssin (tai vastaavan sekvenssiosan) koodaaman tuotteen samat toiminnalliset luonteenominaisuudet. Täytyykö toimin-20 nallisen ekvivalentin täyttää yksi tai useampi kriteeri, riippuu sen käytöstä (esim. jos sitä on tarkoitus käyttää vain hybridisaation koettimena, sen täytyy täyttää vain en-;V simmäinen tai toinen kriteeri, ja jos sitä on tarkoitus käyt- t · f .* tää tuottamaan tämän keksinnön peptidiä, sen täytyy täyttää :*25 vain kolmas kriteeri) .

i · e

MM

. Kuten seuraavissa esimerkeissä on kuvattu, on ihmisen T-solu- »i reaktiivisen feliiniproteiinin (TRFP) (kuviot 1 (SEQ ID Nro: • · 1-4) ja 2 (SEQ ID Nro: 5-6) ketjut 1 ja 2 ekspressoitu rekom-30 binanttisesti EL colissa ja puhdistettu. T-solu-epitooppitut-kimuksia, joissa käytetään päällekkäinmeneviä peptidialueita, jotka on johdettu TRFP-aminohapposekvenssistä, käytettiin ;* tunnistamaan moninkertaisia T-solu-epitooppeja jokaisessa TRFP:n ketjussa. Kuten on kuvattu yksityiskohtaisesti esimer-33 kissä 2, koottiin DNA-rakenteet, joissa kolme aluetta (mer-

f I

;;; kitty peptidi X, peptidi Y ja peptidi Z) , jokaisessa ollen '·;·# ainakin yksi tärkeä TRFP:n ihmisen T-solu-epitooppi, yhdis- f I I I * * » » ( · 31 109809 tettiin kuutena mahdollisena yhdistelmänä tuottamaan kuusi DNA-rakennetta, jotka koodaavat rekombitooppipeptidejä, joissa on kolme aluetta kuudessa eri konfiguraatiossa.

5 Koska peptidi X jakaa 5 aminohappoa sen karboksipäässä peptidi Y:n aminopään 5 aminohapon kanssa, rekombitooppipeptidit XYZ ja ZXY olisi voitu rakentaa mainittujen 5 aminohapon duplikaatioiden kanssa tai ilman (katso kuvio 11, missä ZXY on rakennettu ilman 5 aminohapposekvenssin duplikaatiota).

10 Seuraavissa esimerkeissä rekombitooppipeptidit koottiin vierekkäin, ilman 5 aminohapposekvenssin duplikaatiota. Kolmen alueen X, Y ja Z lisäksi voitiin myös muita alueita, jokaisessa ollen ainakin yksi ihmisen T-solu-epitooppi, liittää rekombitooppipeptideihin ja tuotettiin DNA-rakenteita, joissa 15 oli 4 tai useampia alueita (N!-konfiguraatioita, missä N= alueiden lukumäärä). Vaihtoehtoisesti voidaan yksi tai useampi alue substituoida peptidille X, peptidille Y tai peptidille Z, kuten peptidi A tai B, kuten nähdään kuviossa 4, tuottamaan esimerkiksi rekombitooppipeptidi AXY.

20

Yksityiskohtaisia protokollia on kuvattu vieraiden sekvenssien, jotka on liitetty rekombitooppipeptideihin puhdistuksen avuksi, pilkkomiseksi ja poistamiseksi. Puhdistettuja rekom-: bitooppipeptidejä on tutkittu ihmisen kissa-allergisten poti- :-25 laiden IgE:n sitomiseksi Western blotteihin ja verrattu . TRFP:n rekombinanttiketjujen 1 ja 2 IgE-sitomiseen. Suoritettiin ELISA tutkimaan allergista IgE-sitomista rekombitooppi-·;;; peptideihin suhteessa natiiviin TRFPrhen, rekombinanttiketju '·’ l:een ja rekombinanttiket ju 2 reen. Tässä kuvattu työ osoit- 30 taa, että tämän keksinnön rekombitooppipeptideillä on T-solua stimuloivaa aktiivisuutta jopa vaikka niiden epitooppi-konfi-guraatio yleensä eroaa siitä, mitä havaittiin natiivissa · TRFP-proteiinisekvenssissä. Lisäksi rekombitooppipeptidien käyttö ehkäisevinä aineina on osoitettu tekevän hiiren vas- 3.5 teettömäksi antigeenihaastetta vastaan natiivin TRFPrn, tl· TRFPrn rekombinanttiketjun 1 tai ketjun 2, tai käytetyn re-kombitooppipeptidin kanssa.

I I I

32 109809 Tätä keksintöä kuvataan lisää seuraavilla ei-rajoittavilla esimerkeillä.

Esimerkki 1 5 T-solu-eoitooppitutkimukset päällekkäin menevien TRFP-peptidien kanssa

Perifeeriset veren yksitumaiset solut (PBMC) puhdistettiin sentrifugoimalla, Ficoll-Hypaque, 60 ml:sta kissa-allergisten potilaiden, joilla oli kliinisiä kissa-allergian oireita ja 10 joiden ihotesti oli positiivinen kissauutteella, perifeerisellä verellä, jota oli käsitelty hepariinilla veren hyyty-misajan lisäämiseksi. 10 miljoonaa PBMC:tä yksittäisestä potilaasta viljeltiin 10 mlrssa RPMI-1640:ssa (Gibco), jossa oli 5 % kerättyä ihmisen AB-seerumia ja johon oli lisätty 15 glutamiinia, penisilliiniä, streptomysiiniä ja HEPES-puskuria (täydellinen RPMI-1640) 20 μg:n natiivia affiniteettipuhdis-tettua TRFP/ml viljelmää läsnäollessa 37°C:ssa 7 d. Elävät solut puhdistettiin sitten Ficoll-Hypaque sentrifuugauksella ja viljeltiin 2 lisäviikkoa täydellisessä RPMI-1640:ssä, 20 jossa oli 5 yksikköä ihmisen rekombinantti IL-2/ml ja 5 yksikköä ihmisen rekombinantti IL-4/ml. Lepäävät T-solut, jotka oli saatu viljelmästä, testattiin sitten sekundäärisessä li-:Y; sääntymismäärityksessä käyttämällä 96-kaivon mikrotiitteri- : maljaa arvioimaan T-soluvasteet erilaisille TRFP-peptideille :·25 tai proteiineille (TRFP-antigeenit), kuten kuviossa 3 näh- * ; dään. Määritystä varten viljeltiin 2 x 104 lepäävää T-solua . täydellisessä RPMI-1640:ssa 3 d 37°C:ssa 5 x 104 autolologous ·;;; PBMC:n (3500 rads) läsnäollessa antigeeniä esittävinä soluina • « ♦ ' erilaisina pitoisuuksina, yhtä TR- FP-antigeeniä jokaisessa 30 kaivossa 200 μΐ määränä/kaivo. Jokaiseen kaivoon laitettiin sitten 1 μΟϊ tritioitua tymidiiniä 16 h:ksi. Mukaan laitetut luvut kerättiin lasikuitusuodattimille ja prosessoitiin nes-··· tetuikelaskemista varten. Ärsytys indeksit jokaisen peptidin :1j’ vasteelle laskettiin sitten maksimaalisena CPM:nä suhteessa 3.5 antigeeniin jaettuna keskimääräisellä kontrollilla CPM. 2,5 ’··; stimulaatioindeksin katsottiin olevan positiivinen T-solu- vaste. (Kuten on käytetty läpi tämän hakemuksen, ihmisen T-

I · I

33 109809 solua stimuloiva aktiivisuus kuvataan stimulaatioindeksiksi vähintään 2,0. Kuitenkin T-solu-epitooppien tai alueiden, joita on tarkoitus käyttää tuottamaan keksinnön rekombitoop-pia, on vähintään 2,0, edullisesti vähintään 2,5, edullisem-5 min vähintään 3,5 ja edullisimmin vähintään 5,0). Kuviossa 3 nähdään 34 sellaisen kokeen tulosten tiivistelmä. Ylimmät 5 peptidivastetta TRFP-peptidien päällekkäin menevään sarjaan, jotka peittävät TRFP:n ketjun 1 ja ketjun 2 T-solulinjalla, joka on johdettu kustakin potilaasta, laitettiin järjestyk-10 seen, antaen korkeimmalle positiiviselle vasteelle 5, seu-raavaksi korkeammalle positiiviselle 4, ja niin edelleen. Jokaiselle peptille saatujen arvojen summa laskettiin sitten ja nähdään histogrämmissä kuviossa 3. Tämän tyyppinen analyysi tähdentää TRFP-molekyylin eri alueiden suhteellista tär-15 keyttä T-soluvasteessa koskemattomaan proteiiniin. Tulokset osoittavat, että T-solureaktiivisyyden pääalueet tässä potilaiden paneelissa sisältyvät (tärkeysjärjestyksessä) Fel-14.2:een (ketju 1, aminohappojäännökset 29-42), Fel-3.1:een (ketju 1, aminohappojäännökset 18-32), Fel-2:een (ketju 1, 20 aminohappojäännökset 9-25), Fel-21:een (ketju l, aminohappo-jäännökset 56-70), Fel-29:ään (ketju 1, aminohappojäännökset 56-70), Fel-1.2:een (ketju 1, aminohappojäännökset 1-17), Fel-4:ään (ketju 1, aminohappo jäännökset 37-55), Fel-18:aan ; ' (ketju 2, aminohappojäännökset 23-48), Fel-25:een (ketju 2, !.“25 aminohappo jäännökset 49-68), Fel-16:een (ketju 2, aminohap- * pojäännökset 1-22) ja Fel-23:een (ketju 1, aminohappojäännökset 51-66) . Sitten suunniteltiin peptidien sarja, joka peit-tää nämä alueet. Fel-1.2:n, Fel-2:n, Fel-3.1:n ja Fel-14.2:n *'.· osat käsittävät peptidin X (ketju 1, aminohappo jäännökset 7- 30 33). Fel-3.1:n, Fel-14.2:n ja Fel-4:n osat käsittävät pepti din Y (ketju l, aminohappojäännökset 29-55). Fel-16:n, Fel-17:n ja Fel-18:n osat käsittävät peptidin Z (ketju 2, amino-happo jäännökset 14-39). Fel-4:n, Fel-21:n ja Fel-23:n osat ,·;· käsittävät peptidin A. Fel-29:n osat käsittävät peptidin B.

•35 Peptidit X, Y, Z, A ja B nähdään kuviossa 4. 1 · · 34 109809

Esimerkki 2

Rekombitooppjpeptidien rakenne ia ekspressio Käytettiin PCR-menetelmää (Polymerase Chain reaction), joissa käytetään synteettisiä oligonukleotidejä, rakentamaan DNA:ta, 5 jotka koodaavat peptidien X, Y ja Z sekvenssejä. Päämääränä lisätä ekspressiota E^. colissa. valittiin oligonukleotidien kodonit taulukosta, jossa on laajalle levinneitä runsaasti ekspressoivissa E^ coli proteiineissa. Sharp, P.M., et ai., Nucl. Acids Res. 16:8207 (1988). Oligonukleotidit ja PCR-10 menetelmät, joita käytettiin rakentamaan rekombitooppipepti-dejä, on kuvattu yksityiskohtaisesti alla.

Suunniteltiin oligonukleotidit, joissa oli E^ colille edulliset kodonit, kuten on kaavamaisesti esitetty kuvioissa 5 ja 15 6. Näitä oligonukleotidejä (C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M, N ja O nähdään kuviossa 7) (SEQ ID Nro: 12-37) amplifioitiin käyttämällä Perkin Elmer/Cetus GeneAmp testipakkausta kahdessa erillisessä PCR-reaktiossa (PCR#1 ja PCR#2, vastaavasti missä PCR#1 johti DNA-molkyylin, joka koodaa rekombitooppi-20 peptidiä, 5'-osan synteesiin ja PCR#2 johti DNA-molkyylin, joka koodaa rekombitooppipeptidiä, 3'-osan synteesiin). Tämän lähestymistavan katsottiin johtuvan sekvenssin (KALPV (SEQ ID Nro: 8:n aminohappo jäännökset 1-5)) läsnäolosta sekä pepti-: .* dissä X että peptidissä Y, jonka havaittiin ottavan osaa ;·,25 oikeaan rekombitooppi YZX:n PCR synnyttämiseen, kun yksittäi- ' . nen PCR-reaktio suoritettiin oligonukleotidien (C-I) kanssa.

Tuotettaessa rekombitooppipeptidiä AYZXB, kuten kuviossa 6, ·;ί olivat käytetyt oligonukleotidit PCR #l:ssä N, J, K ja C-I ja ' käytetyt oligonukleotidit PCR #2:ssä olivat C-I ja L, M, O.

30 Tuotettaessa rekombitooppipeptidiä YZX, kuten kuviossa 5, olivat käytetyt oligonukleotidit PCR #l:ssä C, D, E ja F, kun taas käytetyt oligonukleotidit PCR #2:ssä olivat F, G, H ja :· I. Jokainen reaktioseos (10 μg) synnytti tarkoitetun YZX- rakenteen 5'-puolikkaan ja 3'-puolikkaan, vastaavasti (kuvio •35 5). PCR-seokset altistettiin Taq-polymeraasilisäyksen jälkeen seuraavalle ohjelmalle, jossa oli denaturointi, hybridisaatio ja polymerisaatio: 35 109809

Vaihe# Lämpötila Aika 1 94°C 1 min 2 50°C 1,5 min 3 75°C 2 min 5 4 Toista vaiheet 1-3 (4 kertaa) 5 94°C 1 min 6 60°C 1,5 min 7 75°C 2 min 8 Toista vaiheet 5-7 (20 kertaa) 10 9 Pidä 4°C:ssa

Sen jälkeen kun on lopetettu PCR#1- ja PCR#2-reaktiot YZX-rakenteen muodostamisessa, lisättiin erät kummastakin (100 pmol 10 μg kokonaisreaktiosta; 1/100 tilavuutta) kolmanteen 15 PCR-reaktioseokseen, jossa oli 5'- ja 3'-alukkeiden sarja (100 pmol aluketta C ja I). Kolmas PCR-reaktio (PCR#3) suoritettiin käyttämällä tätä kolmatta PCR-reaktioseosta, kuten edellä kuvattiin PCR-reaktioille #1 ja #2, paitsi että hybri-disaatiolämpötila vaiheessa 6 nostettiin 65°C:een. PCR#3:n 20 lopetus tuotti DNA:n, joka koodaa rekombitooppipeptidiä YZX. PCR#3 reaktiomenetelmä on samanlainen kuin on kuvattu, Horton, R.M., et ai. Gene 77:61 (1989). Koko reaktioseos, jota käytettiin PCR#3:ssa, fraktioitiin 2 %:ssa agaroosigeelissä * · j ja sopiva kokojuova (230 bp) elektroeluoitiin geelisiivusta * * · :*,25 ja saostettiin. Eristetty DNA, joka koodaa rekombitooppipeptidiä YZX, altistettiin toiselle PCR-reaktiolle käyttämällä . ylimäärin 5'- ja 3'-amplifikaatioalukkeita (C ja I). Tämä ·;·; lopullinen tuote pilkottiin restriktioentsyymeillä BamHI ja * t sitten kloonattiin vektoriin pETlld faagi T7 gn 10 lac 0 30 fuusiopromoottorin transkriptionaalisen kontrollinalaisena.

Studier, F.W., et ai. Methods in Enzymol. 185: 60 (1990).

·· Polylinkkeri, joka koodaa kuutta peräkkäistä histidiiniä (CAC)6, kloonattiin lukuraamissa DNA:n, joka koodaa rekom-•?5 bitooppipeptidiä YZX, 5'-päähän. Kuuden histidiinin (H6 tai

His6) johtava sekvenssi salli ekspressoituneen rekombitooppi-peptidin puhdistuksen käyttämällä QIAGEN NTA-agaroosia (Dia- > M I i 36 109809 gen Gmbh, Diisseldorf, Saksa) , Ni2+-kelatoiva kannattaja. Hochuli, E., et ai., BioTechnology 6:1321 (1988). DNA:ta koodaavat kohdistetut entsymaattiset pilkkomiskohdat (esim. trombiini, tekijä Xa, jne.) voidaan insertoida käyttämällä 5 PCR-menetelmiä polyhistidiiniä koodaavan (H6) sekvenssin ja DNA:ta koodaavan rekombitooppipeptidin väliin. Rekombitooppi-peptidin YZX tapauksessa insertoitiin trombiinin tunnistus-kohta (LVPRGS) (SEQ ID Nro: 72). Uhlen, M., ja Moks, T. Methods in Enzymol. 185:129 (1990), Chang, J.-Y. Eur. J. Bio-10 chem. 151:217 (1985).

Samanlaista menetelmää kuin kuvattiin edellä rakentamaan DNA, joka koodaa rekombitooppipeptidiä YZX, käytettiin rakentamaan DNA, joka koodaa rekombitooppipeptidejä XYZ ja 15 ZYX. Lisäksi muita peptidejä, joissa on T-solu-epitooppeja, voidaan lisätä olemassa olevaan rekombitooppirunkorakentee- seen, kuten YZX (kuten edellä tuotettu), kuten tapaus oli rekombitooppipeptidin AYZXB rakentamisessa (katso kuviot 6 ja 7). Vaihtoehtoisesti peptidit, joissa on T-solu-epitooppeja, 20 voidaan tuottaa ilman olemassa olevan rekombitooppirunkora- kenteen käyttöä käyttämällä tässä hahmoteltuja menetelmiä.

Jotta tuotetaan rekombitooppipeptidi AYZXB, tuotettiin oli- i *: * - gonukleotidialukkeet (J-M), joilla on päällekkäinmenevät • » ί ;*t alueet rekombitooppipeptidin YZX kummankin pään kanssa ja 5'- i # * » ;\25 ja 3'-amplifikaatioaluke (N ja O) tuotettiin. (Kuten kuviossa * t ttft· 6 nähdään, molekyylin tummennettu osa on päällekkäin menevä . sekvenssi). PCR-reaktiot suoritettiin kuten edellä kuvattiin.

i · ·;; Tuloksena oleva AYZXB-fragmentti eristettiin ja subkloonat- « i tiin pET llDH6TH-vektoriin.

30

Vaihtoehtoista menetelmää käytettiin rakentamaan DNA, joka koodaa rekombitooppipeptidejä XZY, YXZ ja ZXY. Jokainen DNA-i rakenteista, joka koodaa rekombitooppipeptidejä XZY, YXZ ja

* » i I

ZXY, ligoitiin kodoniin, joka koodaa rekombitooppipeptidin N-*,35 terminaalisinta aminohappoa, DNA:n kanssa, joka koodaa johta-;;; vaa sekvenssiä MGHHHHHHEF jota kuvaa (SEQ ID Nro: 73) (missä

Eco Rl restriktiokohta GAATTC koodaa aminohapot EF, jota » » < · » · 37 109809 kuvaa SEQ ID Nro: 74). DNA-segmentit, jotka koodaavat kolmea rekombitooppipeptidiä, koottiin perättäisellä PCRrllä olennaisesti kuten Horton et ai., (1989) Gene 77:61-68, ovat kuvanneet. DNA-segmentit, jotka koodaavat peptidejä X, Y ja Z 5 (nähdään kuviossa 4), amplifioitiin Fel d I cDNA:sta, joka on kuvattu Morgenstern et ai., (1991) Proc. Natl. Acad. Sei.

U.S.A. 88:9690-9694. Kuten kuviossa 9, joka osoittaa spesifisenä esimerkkinä rekombitooppipeptidin XZY koodaussekvens-sin rakentamisen, nähdään, syntetisoitiin oligonukleotidia-10 lukkeet DNAS-sekvenssin kanssa, joka ei vain amplifioi spesifistä DNA-segmenttiä, joka koodaa peptidiä X, Y tai Z, mutta liittäisi myös kovalenttisesti pienen segmentin (9-18 emäspa-ria) DNA-segmenttiä, joka koodaa vierekkäistä peptidiä X, Y tai Z. PCR suoritettiin käyttämällä Vent™-polymeraasia New 15 England Biolabs' ohjeita amplifikaatio-ohjelmalla 30 X[94°C 1 min/60°C 1 min 30 sek/72°C 1 min]. Alukkeet, joita käytettiin PCR-amplifikaatioihin, nähdään kuviossa 10. Yksittäiset rekombitooppipeptidiä koodaavat/linkkeri-DNA-fragmentit PCR-amplif ikaatioista puhdistettiin preparatiivisellä geelielekt-20 roforeesilla 3 %:ssa (w/v) NuSieve (FMC) agaroosissa. Sitten nämä yksittäiset PCR-fragmentit liitettiin toisessa PCR-reak-tiossa muodostamaan DNA-rakenne, joka koodaa XZY:tä, kuten .V kuvioissa 9 ja 11 nähdään. Jotta liitetään nämä PCR-fragmen- f · ; ,· tit, sulatettiin 3 % NuSieve geelisiivut, joissa oli ensim- i · <**25 mäiset PCR-tuotteet, 70°C:ssa jokaista lisättiin 1 μΐ Vent™ « » ] PCR-polymeraasireaktioon, jossa käytettiin 5' Rl (NH2-ter- » , minaali)- ja 3' Bam (COOH-terminaali)-alukkeita.

• i • * 1 t · I »

Ekspressiovektorissa pETlld läsnäolevien restriktiokohtien 30 takia (Studier et ai, 1990), oli kaikilla äärimmäisillä 5'-

alukkeilla EcoRI koodauskohdat [GAATTC], jota kuvaa SEQ ID

Nro: 74, lukuraamissa DNA:n kanssa, joka koodaa erityisen • rekombitoopin NH2-terminaalisia aminohappoja, kun taas äärim- mäisten 3'-alukkeiden päissä oli BamHI koodauskohdat *315 [GGATCC], jota kuvaa SEQ ID Nro: 75. DNA-rakenteet, jotka ( | koodasivat rekombitooppipeptidejä XZY, YXZ ja ZXY, jotka oli ... tuotettu sekundäärisestä PCR:stä, pilkottiin EcoRI/BamHI:llä i ♦ » 38 109809 ja elektroforesoitiin 0,5 (w/v) SeaPlaque (FMC) agaroosigee-lin läpi. Geelisiivut, joissa oli DNA-rakenteet, sulatettiin 70°C:ssa ja lisättiin ligaatioreaktioon EcoRI/BamHI-pilkotun Bluescript KS-palsmidin (Strategene) kanssa. Ligaatio trans-5 formoitiin kompetentteihin XL-1 Blue bakteereihin ja rekom-binanttiplasmidit, joissa oli insertit, tunnistettiin diagnostisilla restriktiopilkkomisilla eristyksen jälkeen käyttämällä Qiatop testipakkausta (Diagen GmbH). Inserttien sekvenssi varmistettiin didesoksi ketjun terminaatiosekvens-10 sianalyysillä käyttämällä Sequenase II testipakkausta (United States Biochemicals).

Bluescript KS-palsmidit, joissa oli DNA-rakenteet, jotka koodaavat rekombitooppipeptidejä XZY, YXZ ja ZXY, insertit 15 joissa oli oikea nukleotidisekvenssi, olivat EcoRI/BamHI- pilkottuja ja DNA-rakenteet, jotka oli eristetty 0,6 % SeaP-laque-geelistä subkloonaamista varten ekspressiovektoriin pETll dl lukuraamissa DNA:n kanssa, joka koodaa NH2-terminaalista johtajaa MGHHHHHHEF, jota kuvaa SEQ ID Nro: 73, kuten 20 edellä mainittiin. Rakenteet subkloonattiin EcoRI/BamHI-pilkottuun pET 11 d His6 Amb a 1.1 HR:ään. Tämä ligaatio toimi vaihtamaan DNA-rakenteen inserttiin, tässä tapauksessa tär-.. keimmän villakkoallergeenin cDNA, Amb a 1.1 (Rafnar et ai., (1991) J. Biol. Chem. 226:1229-1236). pETl Id His Amb al.l ::25 AHR johdettiin pET lld:stä kahdessa vaiheessa. Ensimmäinen : *· pETl Id oli Eco RI/HinD III pilkottu, tehty tylpäksi EL. coli DNA polymeraasin Klenowin fragmentilla ja ligoitu takaisin itseensä luomaan pETl Id AHR: pETl ld-plasmidi, josta puuttuu Hind III- ja Eco Rl-kohdat. Sitten pETl Id His6Amb a 1.1 AHR 30 muodostettiin leikkaamalla H6Amb al.l kasetti ekspressiovek-torista pETl Id His6Amb al.l Neo I/BamH I-fragmenttina ja ligoitiin Neo I/BamH I-pilkottuun pETl Id AHR:ään. Rekom-binanttiplasmidit tunnistettiin diagnostisilla restrik-tiopilkkomisilla sen jälkeen kun oli eristetty Qiatip testi-•35 pakkauksen avulla ja positiiviset plasmidit transformoitiin kompetentteihin BL21 [DE3] bakteereihin ekspressiota varten. BL21 [DE3] sisältää rekombinanttifaagi 1 lysogeenin, DE3, 39 109809 faagi T7 RNA-polymeraasigeenin kanssa lac UV5 promoottorin transkriptionaalisen kontrolin alaisena. T7 RNA polymeraasi-ekspressio indusoidaan lisäämällä IPTG:tä, joka puolestaan johtaa runsaaseen rekombinattigeenin, joka on subkloonattu 3' 5 pET-vektorin T7 gn 10 lac 0 fuusiopromoottoriin, ekspres-sioon.

PCR-johdetut DNA-fragmentit, jotka koodaavat TRFP:n, joka on subkloonattu pSEM:iin (U.S.S.N. 662 276, jätetty helmikuun 10 28, 1991), valmiiden ketjujen 1 ja 2 (H6)-fuusiot, pilkottiin ja ligoitiin pETlldrhen. Tämä saavutettiin kiinnittämällä Bcl I-linkkerit Pst I-kohtiin kahden ketjun 3'-päihin, ketjujen 5'-päät pilkottiin Neo I:llä ja insertoitiin 5' Neo 1/3' Bcl I fragmentti 5' Neo 1/3' BamH I pilkottuun pETlldrhen.

15 TRFP:n rekombinanttipeptidiketjut 1 ja 2, samoin kuin rekom-bitooppipeptidit XYZ, XZY, YZX, ZYX, ZXY ja YXZ ekspressoi-tiin Έλ_ colissa ja puhdistettiin olennaisesti kuten alla on hahmoteltu. BL21 DE3 isäntäbakteerit, joilla on pETlld eks-20 pressio DNA-rakenteet, levitettiin tuoreeltaan BHI-agarimal-jalle (3,7 % w/v, Difco Brain Heart Infusion; 1,5 % w/v,

Difco agar), johon oli liitetty mukaan 200 Mg/ml ampisil-. . liiniä ja inkuboitiin yön yli 37°C:ssa. Yksittäinen pesäke .· ; ympättiin 2 ml:aan 200 Mg/ml ampisilliini/BHI-alustaa (3,7 % [•25 w/v, Difco Brain Heart Infusion) ja ravisteltiin 300 rpm:ssä : 37°C:ssa kunnes oli samea mutta ei kyllästetty. Sitten 2 ml '·”· viljelmä lisättiin 100 ml:aan 200 /xg/ml ampisilliini/BHI- alustaa ja ravisteltiin 300 rpm:ssä 37°C:ssa kunnes oli samea mutta ei kyllästetty, missä pisteessä viljelmä jaettiin 18 x 30 250 ml (4,5 1) 200 Mg/ml:aan ampisilliini/BHI-alustaa ja ravisteltiin 300 rpm:ssä 37°C:ssa. Kun viljelmän OD595 saavutti 1,0, indusoitiin rekombinanttipeptidien ekspressio ; (His)6-fuusiopeptideinä lisäämällä IPTG:tä 400 μΜ:ϋη asti ja· ;;; annettiin jatkua 2 h.

\ 3.5

Bakteerit kerättiin sentrifugoimalla 10 000 x g 15 min ja suspendoitiin uudestaan 1/50 tilavuuteen 6 M guanidiini 40 109809 HCl:ää, 100 mM 2-merkaptoetanolia, 100 mM NaP04:ää, 10 mM Tris pH:ssa 8,0. Rekombinanttiketju 1 ja ketju 2 ja rekombi-tooppipeptidit (rekombinanttipeptidit) uutettiin ravistelemalla voimakkaasti uudelleen suspendoituja bakteereita 1 h 5 25°C. Tämä suspensio sentrifugoitiin 15 000 x g, supernatant-

ti poistettiin, säädettiin pH 8,0:ksi 10 N:11a NaOH;lla ja laitettiin NTA-agaroosipylvääseen, joka oli tasapainotettu 6 M:ssa guanidiini HCl:ssä, 100 mM NaP04:ssä, 10 mM Trisissä pH

8,0, kunnes OD280 ulosvirtaava neste saavutti taustan. Pyl-10 vään puskuri vaihdettiin sitten 8 M ureaan, 100 mM NaP04:ään, 10 mM Tris:iin pH 8,0. Tasapainotuksen jälkeen suoritettiin vaativampi pesu 8 M ureassa, 100 mM NaOAc:ssä, 10 mM Tris:ssä pH 6,3, kunnes OD280 ulosvirtaava neste saavutti taustan. Jokainen rekombinanttipeptidi (His6 fuusiona) eluoitiin sit- 15 ten 8 M ureassa 100 mM NaOAcrssä, 10 mM Tris:ssä pH 4,5 ja kerättiin annoksina, joiden OD280-profiilia tarkkailtiin. Peptidipiikki dialysoitiin 3 kertaa PBSrään (Phosphate Buffe-rede Saline) 500 tilavuuteen analyysiä varten. Tuotto vaihte- 11 25 mg:sta rekombinanttipeptidiä (His6) fuusio/1 puhtaudes-20 sa yltäen 90 %:iin.

Edellä hahmotelluilla rekombinanttipeptideillä (TRFP ketju 1, .. TRFP ketju 2, XYZ, YZX ja ZYX) on kaikilla N-terminaalinen sekvenssi lisättynä puhdistuksen ja ekspression avuksi (esim. —25 MGHHHHHHL VPRGS-), jota kuvaa SEQ ID Nro 76. Tämä asiaankuu- t · : ·' lumaton N-terminaalinen sekvenssi voidaan poistaa proteolyyt-tisellä pilkkomisella, koska sekvenssissä on trombiini tun-nistuskohta (L VPRGS) , jota kuvaa SEQ ID Nro 72, insertoituna polyhistidiinisekvenssin ja rekombitooppisekvenssin väliin.

30 (Katso kuvio 8, nuoli osoittaa trombiinin pilkkomiskohdan). Trombiinia käytettiin pilkkomaan asiaankuulumaton sekvenssi jättäen vain kaksi ylimääräistä aminohappojäännöstä, GS, . TRFP-ketjujen 1 ja 2 N-terminukseen ja rekombitooppipeptidit *::: XYZ, YZX ja ZYX (Chang, J.-Y. Eur. Biochem. 151:217-224 ’•’35 (1985)). Fuusioproteiinin tehokas pilkkominen voidaan saavut ti/ taa käyttämällä proteiini:trombiini-suhdetta 1000:1 2 h 41 109809 25°C:ssa. Pilkkomis- ja puhdistuskaavio, jota käytettiin rakentamaan rekombitooppipeptidi YZX, on hahmoteltu alla:

1) rekombitooopipeptidi MGHHHHHHL VPRGS - YZX

2) dialysoi PBS:ään, pH 8,0 5 3) trombiinipilkkominen peptidi:trombiini=1000:l 25°C, 2 h 4) pelkistäminen 100 mM ditiotreitolilla 5 M guanidiini-HCl:ssä 10 37°C, 30 min 5) C4 käänteisfaasi HPLC, pH 2,0 6) lyofilisaatio

Analyyttinen käänteisfaasi HPLC suoritettiin VYDAC 214 TP54-15 pylväässä 42 ml:n alustatilavuus. Pylvääseen laitettiin 340 μg rekombitooppipeptidiä YZX. Suoritettiin puolipreparatiivi-nen HPLC käyttämällä VYDAC 214 TP1022-pylvästä, jossa oli 95 ml:n alustatilavuus, johon oli laitettu 90 mg proteiinia. Gradientti alkoi 0 % - 30 % asetonitriili, jossa oli 0,1 % 20 trifluorietikkahappoa ensimmäiset 10 min, jonka jälkeen 30 % - 43 % asetonitriili yli 15 min. Liikkuvaa faasia pidettiin sitten 43 % asetonitriilissä 10 min. Puhdistettu rekom-• t. bitooppipeptidi YZX eluoitiin 43 % asetonitriilissä. Pilkko- ! mistä ja puhdistusta tarkkailtiin SDS-PAGE:11a. Rekombitoop- ;;:25 pipeptidin YZX tunnistus ja puhtaus määritettiin proteiini-: * sekvenssianalyysillä käyttämällä Applied Biosystem Inc. Pro- ’ ‘ tein Sequenator Model 477A:ta.

•. Esimerkki 3 30 ΙσΕ:η suora sitomismääritvs TRFP-proteiineihin ia rekombi-tooppeihin

Suoritettiin esimerkissä 2 tuotetuille rekombitooppipepti-deille Western immunoblot-analyysi. Kaikkien proteiininäyt-’.'j’ teiden konsentraatio (esim. TRFP, TRFP:n rekombinattiketju 1, "35 TRFP:n rekombinattiketju 2, rekombitooppipeptidi XYZ, rekom- :,i, bitooppipeptidi XZY, rekombitooppipeptidi YXZ, rekombitoop-: pipeptidi YZX, rekombitooppipeptidi ZXY ja rekombitooppipep- I » 42 109809 tidi ZYX) elektroforeesia varten määritettiin BCA-menetelmäl-lä (Pierce Co.)· Kaikki proteiininäytteet laitettiin geeliin 5 ^g/linja, paitsi TRFP:tä 10 Mg/linja. Proteiinin erotus suoritettiin 15 % akryyliamidigeelissä ja siirto suoritettiin 5 elektroblottauksella 1,5 A, 1,5 h nitroselluloosapaperille (Schleicher ja Schuell, 0,1 μ) Hoeffer-laitteessa Towbin, H., T. Stachlin ja J. Gordon protokollan mukaisesti, PNAS 76: 4350 (1979). Proteiinit huuhdeltiin blottiliuoksessa (25 mM Tris-HCl 7,5, 0,171 M NaCl ja 0,5 ml/1 Tween 20). Sitten 10 blotti pysäytettiin 1 h blokkausliuokseen (1 % maitoa blottiliuoksessa) . Potilaan #417 plasmaa, käytettiin primäärisenä vasta-ainelähteenä, laimennettiin blokkausliuoksessa 10 %:ksi ja esiabsorboitiin 1,5 h käyttämättömällä nitroselluloosalla (2 cm x 15 cm). Sitten valmistettua ihmisen plasmaa inkuboi-15 tiin yön yli kehäravistelijassa kiinnostuksen kohteena olevan proteiini-blotti-kappaleen kanssa. Ensimmäisen vasta-ainein-kubaation jälkeen blottileike pestiin 3 kertaa, jokaiseen pesuun sisältyi 15 min inkubaatio blottiliuoksessa. Toinen vasta-aine, joka on spesifinen ihmisen IgErlle (biotinyloitu 20 vuohi-ihminen IgE, KPL Inc.) laimennettiin 1:2500 blottiliuoksessa ja inkubaatio jatkui 2 h. Ylimäärä toista vasta-ainetta poistettiin myöhemmin kolmella 15 min inkubaatiolla . . blottiliuoksessa. 125I jodinoitu streptavidiini (Amersham) ; laimennettiin 1:2500 blottiliuoksessa ja inkuboitiin t * ;;:2‘5 blottien kanssa 1 h 2 μΟί 50 ml:n tilavuudessa. Sitten blot-• ‘ tikappaleet pestiin blottiliuoksella, kunnes määritettävä radioaktiivisuus jäteliuoksessa väheni taustatasoille. Sitten blottikappale käärittiin saran-kääreeseen ja altistettiin : : : filmille yön yli cronex vahventavalla varjostimella 30 -80°C:ssa. IgE sitomiskuvio, joka nähdään kuviossa 13, osoit taa reaktiivisyyden affiniteettipuhdistettuun TRFP:hen (linja 1) ketju 1, 6 kD molekyylipainoltaan ja ketju 2, >16 kD. Rekombinanttiketju 1 osoittaa vahvan IgE-sitomisen (linja 2) , kun taas rekombinantti ketju 2 reaktiivisyys on vähentynyt ’.35 verrattuna ketjuun 1 (linja 3) . Rekombitooppipeptidit, jotka :.i, osoittavat IgE-sitomista, ovat rekombitooppipeptidit XYZ ja : - ZXY (linjat 4 ja 8 vastaavsti). Kaikki muut rekombitooppipep- 43 109809 tidit ovat negatiivisiä IgE-sitomiselle tällä analyysimenetelmällä.

IgE:n spesifistä sitomista rekombitooppipeptideihin osoitet-5 tiin myös ELISA-määrityksissä. Corning määritysmaljät (#25882-96) peitettiin 10 μg/ml:lla jokaista peittävää antigeeniä (s.o. TRFP, ketju 1 (TRFP:n rekombinanttiketju 1), ketju 2 (TRFP:n rekombinanttiketju 2), rekombitooppipeptidi XYZ, rekombitooppipeptidi XZY, rekombitooppipeptidi YXZ, 10 rekombitooppipeptidi YZX, rekombitooppipeptidi ZXY ja rekombitooppipeptidi ZYX), jotka on luetteloitu kuviossa 14, 50 μ/kaivo ja inkuboitiin yön yli 4°C:ssa. Peittävät antigeenit poistettiin ja kaivot blokattiin 0,5 %:lla gelatiinilla PBS:ssä, 200 μΐ/kaivo 2 h huoneenlämpötilassa. Potilaan #669 15 plasmalle tehtiin sarjalaimennus PBS-Tween 20:llä (PBS 0,05 % ei-ioninen detergentti Tween-20 Sigma, St. Louis MO) ja 100 μΐ/kaivo lisättiin ja inkuboitiin yön yli 4°C:ssa (plasmalai-mennukset testattiin kaksoiskappaleina). Lisättiin toinen vasta-aine (biotinyloitu vuohi-anti-ihminen IgE, 1:1000, 20 Kirkegaard & Perry Laboratories Inc. Gaithersburg, MD) 100 μΐ/kaivo 1 h huoneenlämpötilassa. Tämä liuos poistettiin ja sitten lisättiin streptavidiini-HRPO, 1:1000 (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL) 100 μΐ/kaivo 1 h v. huoneenlämpötilassa (kaikki kaivot pestiin kolme kertaa PBS- :,:25 Tween:llä jokaisen inkubaatiovaiheen välillä). TMB Membrane • ’· Peroxidase Substrate systeemi (Kirkegaard & Perry Laborato- ·:*· ries) sekoitettiin tuoreeltaan ja lisättiin 100 μΐ/kaivo.

··· Värin annettiin kehittyä 2-5 min. Reaktio pysäytettiin lisää- » » · · ,·,· mällä 100 μΐ/kaivo 1 M fosforihappoa. Maljat luettiin Micro- 30 plate EL 310 Autoreader (Biotek Instruments, Winooski, VT) 450 nm suodattimena. Kaksoiskappalekaivojen absorbanssi-tasoista laskettiin keskiarvo. ELISA-määritysten graafiset tulokset (laimennus vs absorbanssi log) nähdään kuviossa 14.

I » I t t I * « · V35 Kuviossa 14 nähdyt ELISA-tulokset osoittavat korkean tason » · . IgE:n sitoutumisesta TRFP:hen jonkinverran alhaisemman sito- .*·· misella rekombinantti TRFP ketju l:een (ketju 1) ja ketju I · i · I » · » 44 109809 2:een. Kaksi rekombinanttiketjua osoittavat samanlaisen sitomisen tämän erityisen potilaan IgE:llä. Vain rekombitooppi-peptidi ZXY osoittaa selvää reaktiivisyyttä IgE:n kanssa. Muiden rekombitooppipeptidien sitominen on taustatasolla tai 5 melkein, jossa on vähäinen signaali rekombitooppipeptidistä XYZ. Jotta osoitetaan, että rekombitooppipeptidejä oli läsnä yhtä suurina määrinä sekä ELISA:ssa ja Western määrityksessä, käytettiin anti-peptidi antiseerumia positiivisenä kontrollina ja se antoi selvästi samanarvoiset signaalit kaikille 10 linjoille ja kaivoille rekombitooppipeptideillä.

Esimerkki 4

Ihmisen T-solu-epitooppivaste rekombitooppipeptideihin Ihmisen kissa-allergista T-soluvastetta rekombitooppipepti-15 deihin tutkittiin. Perifeeriset veren yksitumaiset solut (PBMC) puhdistettiin sentrifugoimalla, Ficoll-Hypaque, 60 ml:sta kissa-allergisten potilaiden, joilla oli kliinisiä kissa-allergian oireita ja joiden ihotesti oli positiivinen kissauutteella, perifeerisellä verellä, jota oli käsitelty 20 hepariinilla veren hyytymisajan lisäämiseksi. 10 miljoonaa PBMC:tä yksittäisestä potilaasta viljeltiin 10 ml:ssa RPMI-1640:ssa, jossa oli 5 % kerättyä ihmisen AB-seerumia ja johon oli lisätty glutamiinia, penisilliiniä, streptomysiiniä ja ‘.V HEPES-puskuria 10 ^g natiivia affiniteettipuhdistettua ;,25 TRFP/ml viljelmää tai 25 μg puhdistettua pilkkomatonta rekom- j ’» bitooppipeptidiä YXZ/ml viljelmää tai 25 yq puhdistettua pil-:*·· kottua rekombitooppipeptidiä YZX/ml viljelmää 37°C:ssa 7 d.

·· Rekombitooppipeptidi YZX pilkottiin trombiinilla, kuten esi-,.· merkissä 2 kuvattiin. Elävät solut puhdistettiin sitten Fi- 30 coll-Hypaque sentrifuugauksella ja viljeltiin 2 lisäviikkoa täydellisessä RPMI-1640/5 % AB-seerumissa, jossa oli 5 yksikköä ihmisen rekombinantti IL-2/ml ja 5 yksikköä ihmisen rekombinantti IL-4/ml. Lepäävät T-solut, jotka oli saatu » » ··· viljelmästä, testattiin sitten sekundäärisessä lisääntymis- - » * ‘.35 määrityksessä käyttämällä 96-kaivon mikrotiitterimaljaa arvi-» « ·, oimaan T-soluvasteet erilaisille TRFP-proteiineille tai pep- ,"· tideille (TRFP-antigeenit). Määritystä varten viljeltiin 2 x » * > ! 45 109809 104 lepäävää T-solua 3 d 37°C:ssa 2 x 104 autologisella Ep-stein-Barr-viruksella transformoitujen B-solujen (25 000 rads) läsnäollessa antigeeniä esittävinä soluina erilaisina pitoisuuksina antigeeniä jokaisessa kaivossa 200 μΐ/kaivo.

5 Jokaiseen kaivoon laitettiin sitten 1 μΟΐ tritioitua tymi-diiniä 16 h:ksi. Mukaan laitetut luvut kerättiin lasikui-tusuodattimille ja prosessoitiin nestetuikelaskemista varten. Ärsytysindeksit jokaisen antigeenin vasteelle laskettiin sitten maksimaalisena CPM:nä suhteessa antigeeniin jaettuna 10 keskimääräisellä kontrollilla CPM. 2,5 stimulaatioindeksin katsottiin olevan positiivinen T-soluvaste. Kuviossa 3 nähdään sellaisten kokeiden tulosten tiivistelmä (potilaat 522, 519 ja 386 nähdään kuviossa 15a, kuviossa 15b ja kuviossa 15c. Verrattuna kuvioissa 15a ja 15 b nähtyihin kokeisiin, 15 kokeessa joka nähdään kuviossa 15c, substituoitiin Fel-1.2 (ketju 1, aminohappojäännökset 1-17) Fel-1.4:ään (ketju 1, aminohappojäännökset 6-17) ja Fel-18 (ketju 2, aminohappo-jäännökset 23-48) substituoitiin Fel-33.3 (ketju 2, aminohappo jäännökset 26-40), jotta muistutettaisiin tarkemmin pepti-20 dien X ja Z ainesosa aminohappoja. Lisäksi tässä kokeessa syntetisoitiin ja testattiin peptidi, joka on johdettu rekom-bitooppipeptidin YZX Y-Z yhtymiskohdasta (aminohappojäännökset 55-55 TRFP:n ketjusta 1 ja aminohappojäännökset 14-19 I t * TRFP:n ketjusta 2) ja peptidi, joka on johdettu rekombitoop- i · ;;fc5 pipeptidin YZX Z-X yhtymiskohdasta (aminohappojäännökset 34- I * i · 39 TRFP:n ketjusta 2 ja aminohappojäännökset 7-12 TRFP:n ”·" ketjusta 1) . Nämä yhtymäkohtapeptidit tuotettiin, jotta mää-,,11 ritetään, tuottavatko nämä rekombitooppipeptidin YZX alueet :Y ei-natiivin epitoopin, kun muodostetaan rekombitooppipepti- 30 dissä.

Tulokset osoittavat, että potilaan 522 T-solut, joiden aluke t. oli natiivi TRFP, vastasivat positiivisesti natiiviin ‘,'ϋ TRFP:hen, rekombitooppipeptidiin YZX, peptidiin Y, Fel- 14.2:een ja Fel-17:ään. Päinvastoin, T-soluilla, joiden aluke » ·,·, oli rekombitooppi YXZ, oli vähemmän vastetta natiiviin : TRFPthen, mutta vastetta oli samalla tasolla tai paremmin > i t I * i « f » • » » • 11« 46 109809 lukuisille synteettisille peptideille, vastaten TRFP-mole-kyylin osia, peptidi X, peptidi Y, peptidi Z, Fel-4, Fel-3.1, Fel-2, Fel-14.2, Fel-17 ja Fel-18 mukaanluettuina. Samanlaiset tulokset kokeesta potilaan 519 T-solujen kanssa nähdään 5 kuviossa 15b. Potilaan 519 T-solujen kokeiden samanlaiset tulokset nähdään kuviossa 15b. Tämän potilaan natiiveilla T-soluilla, joiden aluke on TRFP, on vaste natiiviin puhdistettuun TRFP:hen, rekombitooppipeptidiin YZX ja peptidiin Y. Kun saman potilaan solujen aluke oli rekombitooppipeptidi YZX, 10 osoitettiin positiiviset vasteet natiiville TRFP:lie, rekom-bitooppipeptidille YZX, peptidille X, peptidille Y, peptidille Z, Fel-3.1:lie, Fel-4:lie ja Fel-17:lie. Kuvio 15 c osoittaa smanalaisen kokeen, johon sisältyy puhdistettu pilkottu rekombitooppi YZX alukeantigeeninä. Tulokset osoittavat, että 15 potilaan 386 T-solut, joiden aluke oli natiivi TRFP, vastasivat positiivisesti natiiviin TRFP:hen, rekombitooppipeptidiin YZX, peptidiin Y, Fel-3.1:een ja Fel-14.2:een. Päinvastoin, T-soluilla, joiden aluke oli rekombitooppi YXZ, oli sama vastetaso tai parempi natiiviin TRFP:hen, rekombitooppipepti-20 diin YZX, peptidiin X, peptidiin Y, peptidiin Z, Fel-2:een,

Fel-3.1:een, Fel-14.2 ja Fel-17:ään. Nämä tiedot osoittavat, että ainakin näissä kolmessa potilaassa voivat T-solut tun-'V nistaa tehokkaasti TRFP T-solu-epitoopit, kun esitetään re-: kombitooppipeptidinä. Natiivi TRFP-molekyyli, joka on tutkit-

; 2.5 tu näissä kokeissa, jossa ei ole epitooppeja, tuhotaan YXZ-·:··· rekombitooppipeptidin yhteydessä. Rekombitooppipeptidien YXZ

·’;· tai YZX kyky esittää TRFP-epitooppeja näissä kokeissa, näyt-tää olevan suurempi verrattuna natiivin molekyylin kanssa. Tulokset potilaasta 386 osoittavat, että T-solut eivät tun-30 nista peptidejä, jotka on johdettu rekombitoopin YZX liittymäalueista (YZ liittymäkohtapeptidi ja ZX liittymäkohtapepti-di), kun niitä on rekombitooppipeptidissä; siksi liittymäkoh-·· ta-alueisiin ei luoda ei-natiiveja epitooppeja.

47 109809

Esimerkki 5

Hiiren T-soluvaste rekombitooppjpeptideihin

Hiiret immunisoitiin rekombitooppipeptidillä YZX, jotta määritetään, kykenevätkö T-solu-epitoopit, joita oli rekombi-5 tooppipeptidissä, joka oli johdettu TRFPrstä, stimuloimaan T- soluvasteen. Määrityksessä määritettiin imusolmukesolujen kyky vastata yksilön rekombitooppipeptideihin samoin kuin immunisoiviin aineisiin.

10 10 B6CBAF1 hiirtä immunisoitiin ihonalaisesti hännän tyveen ja reisialueeseen 100 μg:lla rekombitooppipeptidiä YZX Freun-din täydellisessä adjuvantissa. 10 d kuluttua poistettiin immunisoitujen hiirten nivuskanava-, aortan viereiset ja polvitaipeen solmukkeet ja kerättiin. Imusolmukesilmut sus-15 pendoitiin kylmään RPMI 1640:een, jossa oli 1 % vasikan sikiön seerumia (FBS) ruostumattoman teräsverkon läpi. Solut pestiin 2 kertaa kylmällä RPMI-1640:11a, jossa oli 1 % FBS:ää ja pidettiin 4°C:ssa.

20 Imusolmukesolut maljättiin 4 x 106 solua/ml RPMI 1640: aan, jossa oli 10 % FBS:ää, 250 ^g/ml penisilliini G:tä, 100

Mg/ml streptomysiiniä ja 5 x 10-5 M 2-merkaptoetanolia. Solu- V,: ja viljeltiin antigeenin kanssa (s.o. rekombitooppipeptidi : Γ: YZX, rekombitooppipeptidi ZYX, rekombitooppipeptidi XZY, • · · * j'2,5 peptidi X, peptidi Y, peptidi Z, peptidit X, Y ja Z ja Amb a ....: I) , kuten on osoitettu (kuvio 16). 24 h kuluttua jokaisesta viljelmästä poistettiin 50 μΐ supernatanttia ja jäädytettiin "1!! yön yli poistamaan elävän solun kuljetus. Supernatantti läm mitettiin 37°C:een ja pestiin. CTLL-2 indikaattorisolut (ATCC 30 # T1B214) lisättiin (5 x 103 solua/kaivo). Indikaattorisolu- linja vaatii IL-2:ta jatkuvaan kasvuun. 24 h kuluttua lisättiin H3-tymidiiniä (1 μΟί^3Ϊνο) ja soluja inkuboitiin lisää 4 h. Maljat jäädytettiin ja sulatettiin, kerättiin Tomtec 96 : i : kaivokerääjällä (Tomtec, Orange, Conn.) ja laskettiin Beta- 35 plate beta-laskimella (Pharmacia, Gaithersburg, MD).

48 109809

Kerätyt imusolmukesolut vastaavat hyvin in vitro vasteessa viljelmään rekombitooppipeptidin YZX kanssa, mitattuna IL-2-tuotolla (kuvio 16). Alustat ainoana taustana antoivat keskimäärin 1500 cpm. T-soluvaste rekombitooppipeptidiin YZX saat-5 taa johtua yhdestä tai vasteiden yhdistelmästä yksittäiseen peptidiin, jossa on epitooppeja, joita on käytetty rakentamaan rekombitooppipeptidi (s.o. peptidit X, Y ja Z). Muita rekombitooppipeptidejä samoin kuin yksittäisiä peptidejä X, Y ja Z viljeltiin imusolmukkeiden kanssa ja T-soluvaste määri-10 tettiin. Oli merkittävää vastetta jokaiseen peptideistä X, Y ja Z, olennaiset peptidit. Oli voimakkaita T-solu-vasteita lukuisille muille rekombitooppipeptideille ZYX ja XZY. Oli pieni mutta merkittävä T-solu-vaste rekombinantti Amb a I-valmisteelle, jolla on samat aminoterminaaliset sekvenssit 15 kuin rekombitooppipeptideillä.

Esimerkki 6

Rekombitooppien sovellutus allergisen sairauden diagnoosiin Rekombitooppipeptidit voivat olla hyödyllisiä uutena 20 diagnoosin muotona herkkyydelle proteiiniallergeenille tai proteiiniantigeenille. Esimerkiksi vaikka keksinnön edulliset rekombitooppipeptidit eivät sido IgE:tä, tietyt rekombitoop-*··' pipeptidit, jotka on johdettu proteiiniallergeeneista, saat- : tavat kyetä sitomaan allergisen potilaan IgE:tä. Näitä rekom- • &5 bitooppipeptidejä voitaisiin käyttää ihotestauksessa tarkkana *:··: määrityksenä spesifiselle välittömän tyyppiselle yliherkkyy- ··· delle (ITH) yksilössä proteiiniallergeenille, josta rekombi- tooppipeptidi on johdettu. Allergeenit, jotka saavat esiin ITH-vasteen, voisivat myös olla rekombinanttisesti tuotettuja 30 allergeeneja, biokemiallisesti puhdistettuja allergeeneja luonnonlähteistä rekombitooppipeptidien lisäksi ainoan vaati-, muksen ollessa suuri spesifisen IgE-reaktiivisyyden aste.

·;;; Rekombitooppipeptidit, joilla ei ole lainkaan, tai hyvin al-v hainen reaktiivisyys ihmisen IgE:n kanssa, mutta sisältävät : ;35 T-solu-epitooppeja, jotka ovat reaktiivisiä proteiinialler- • I » geenin kanssa, voidaan käyttää houkuttamaan esiin viivästy-. ·,· neen tyyppinen yliherkkyys- (DTH) reaktio yksilössä, joka on 49 109809 herkkä allergeenille, josta epitoopit on johdettu. Aller-geenimuodot synnyttämään DTH-vastetta voivat olla eristettyjä rekombitooppipeptidejä, rekombinanttiallergeenejä tai kemiallisesti modifioituja luonnon tai rekombinanttiallergeenejä 5 (esim. KOH:lla käsitelty TRFP). Jälleen, pääasiallisin vaatimus DTH:ta ärsyttävälle allergeenille/antigeenille on IgE-sitomisreaktiivisyyden puute tai jos sellaista sitomista tapahtuu, välittäjän vapautumisen puuttuminen syöttösoluista tai basofiileistä ja kyky stimuloida T-soluja yksilössä lääk-10 keen antamisen jälkeen. Positiivinen DTH on osoitus yksilön T-soluista, jotka ovat spesifisiä epitoopeille rekombitoop-pipeptidissä. Yleisesti, rekombitooppipeptidit ovat suurempia molekyylejä kuin peptidit, joissa on yksilöllinen T-solu-epi-tooppi ja ovat täten edullisia DTH-testaukselle. Koska rekom-15 bitooppipeptidit ovat suurempia molekyylejä, uskotaan että niiden pitäisi olla ihossa (injektiokohta) sallien T-lym-fosyyttien sisäänvirtaamisen ja muiden solujen, jotka myötävaikuttavat DTH ihovasteeseen.

20 ITH-reaktiota, joka tapahtuu 15-30 minuutissa ihotestissä, voidaan käyttää DTH-reaktion kanssa yhdistelmänä DTH-reaktion ilmestyessä 48-72 h myöhemmin. Näiden määritysten yhdistelmä, • · · kahdelle eri tyyppiselle allergisen sairauden kaltaiselle : reaktiivisyyksille, edustaa uutta diagnostista formulaatiota.

• · '2-5 Käyttö iholle testattaessa iholle rekombitooppipeptidillä saattaa vaatia erilaisen kaavan saamaan esiin yhden vasteen .:. versus toinen (ITH vs DTH) . Esimerkiksi iTH-reaktio voidaan ; saada esille yksilössä pistotestaamalla hyvin pienellä mää rällä terapeuttista koostumusta, joka koostuu rekombitooppi-30 peptidistä (tässä tapauksessa IgE-reaktiivinen rekombitooppi-peptidi) ja farmaseuttisesti hyväksyttävästä kantajasta tai laimentimesta. Jotta saadaan aikaan DTH-reaktio, käytetään

t t I

·;; suuri määrä terapeuttista koostumusta, jossa on rekombitoop- pipeptidi (tässä tapauksessa ei-IgE-reaktiivinen rekombitoop- ; ;'35 pipeptidi) ja farmaseuttisesti hyväksyttävä kantaja tai lai-mennin, ihonsisäisenä injektiona tai piikkitestimuodossa (molempia käytetään TB-testaukseen DTH:11a). Katso Immunology 50 109809 (1985) Roitt, I.M., Brostoff, J., Male, D.K. (toim.), C.V. Mosby Co., Gower Medical Publishing, Lontoo, NY, ss. 19.2-19.18; ss. 22.1-22.10. Seuraamalla diagnoosia keksinnön rekombitooppipeptideillä, voidaan yksilöt valita spesifiseen 5 herkkyyden poistamisterapiaan määrittämällä yhdessä testisarjassa IgE-reaktiivisyyttä ja T-epitooppireaktiivisyyttä.

• · • « • · a ♦ · » · » « * • · » » · * * t » » .

• f * · f · » · • # lltl • I » I ,

MM

51 109809

SEKVENSSILUETTELO

(1) Yleistä tietoa: (i) Hakija: IinmuLogic Pharmaceutical Co., Inc.

(ii) Keksinnön otsikko: Rekambitooppipeptidit (iii) Sekvenssien lukumäärä: 77 (iv) Kirjeenvaihto-osoite:

(A) Vastaanottaja: IAHIVE & OOCKFIEUD

(B) Katu: 60 State Street, suite 510 (C) Kaupunki: Boston (D) Valtio: Massachusetts

(E) Maa: USA

(F) Postinumero: 02109 (v) Tietokoneen lukema muoto: (A) Välinetyyppi: Floppy disk (B) Tietokone: IBM PC yhteensopiva

(C) Toimiva systeemi: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFIWARE: ASCII teksti (vi) Tämänhetkiset hakemustiedot: (A) Hakemusnumero:PCT/US92/08694 (B) Jättöpäivä: 16-Oct-1992 (C) Luokitus: (vii) Aikaisemmat hakemustiedot: (A) Hakemusnumero: US 777,859 ;Y (B) Jättöpäivä: 16-Oct-1991 (C) Luokitus: » · ;·. (vii) Aikaisemmat hakemustiedot: ·' ' (A) Hakemusnumero: US 807,529 *:··! (B) Jättöpäivä: 13-Dec-1991 . (C) Luokitus: .1.· (viii) Asiamies/välittäjätiedot : (A) Nimi: Amy E. Mandragouras (B) Rekisteröintinumero: 36,207 (C) Viite/asiarekisterinumero: 027.0 PCT(IMI- 015PC) (ix) Tietoliikenneinformaatio: i (A) Puhelin: (617) 227-7400 (B) Telefax: (617) 227-5941 i t » » * » i » I · (2) INFORMAATIO SBQ ID Nro:l: 52 109809 (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 418 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juoste: yksi (D) Topologia: lineaarinen

(ii) Molekyylityyppi: cDNA

(ix) Piirre:

(A) Nimi/avain: CDS

(B) Sijainti: 8..283 (xi) Sekvenssikuvaus: SBQ ID Nro:l: CIGCATC ATG AAG GGG GCT CGT GTT CTC GTG CTT CIC TGG GCT GCC 46

Met Lys Gly Ala Arg Vai Leu Vai Leu Leu Trp Ala Ala -20 -15 -10 TIG CTC TTG ATC TGG GGT GGA AAT TGT GAA ATT TGC CCA GCC GIG AAG 94

Leu Leu Leu Ile Trp Gly Gly Asn Cys Glu Ile Cys Pro Ala Vai Lys -5 15 AGG GAT GTT GAC CIA TIC CIG AOG GGA AOC CCC GAC GAA TAT GTT GAG 142

Arg Asp Vai Asp Leu Fhe Leu Ihr Gly Ihr Pro Asp Glu Tyr Vai Glu 10 15 20 CAA GIG GCA CAA TAC AAA GCA CIA CCT GTA GTA TTG GAA AAT GCC AGA 190

Gin Vai Ala Gin Tyr Lys Ala Leu Pro Vai Vai Leu Glu Asn Ala Arg 25 30 35 ATA CIG AAG AAC TGC GTT GAT GCA AAA ATG ACA GAA GAG GAT AAG GAG 238

Ile Leu Lys Asn Cys Vai Asp Ala Lys Met Ihr Glu Glu Asp Lys Glu 40 45 50 55 : '·· AAT GCT CIC AGC TTG CIG GAC AAA ATA TAC ACA AGT CCT CIG TGT 283 ···.: Asn Ala Leu Ser Leu Leu Asp Lys Ile Tyr Ihr Ser Pro Leu Cys 60 65 70 ; TAAAGGAGOC ATCACIGCCA GGAGCCCIAA GGAAGCCAd GAACIGATCA CEAAGTAGTC 343 TCAGCAGCCT GOCATGfKXA GGTGTCITAC TAGAGGAITC CAGCAATAAA AGOCIGGCAA 403 TTCAAACAAA AAAAA 418 53 (2) INFORMAATIO SEQ ID Nro:2: 109809 (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 92 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: proteiini (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID Nro:2:

Met Lys Gly Ala Arg Vai Leu Vai Leu Leu Trp Ala Ala Leu -20 -15 -10

Leu Leu Ile Trp Gly Gly Asn Cys Glu Ile Cys Pro Ala Vai Lys Arg -5 15

Asp Vai Asp Leu Phe Leu Thr Gly Thr Pro Asp Glu Tyr Vai Glu Gin 10 15 20

Vai Ala Gin Tyr Lys Ala Leu Pro Vai Vai Leu Glu Asn Ala Arg Ile 25 30 35 40

Leu Lys Asn cys Vai Asp Ala Lys Met Thr Glu Glu Asp Lys Glu Asn 45 50 55

Ala Leu Ser Leu Leu Asp Lys Ile Tyr Thr Ser Pro Leu Cys 60 65 70 (2) INFORMAATIO SEQ ID Nro:3: : : : (i) Sekvenssin ominaisuudet: · · (A) Pituus: 420 emäsparia : (B) Tyyppi: nucleiinihappo ·'. (C) Juoste: yksi ’ (D) Topologia: lineaarinen

(ii) Molekyylityyppi: cDNA

’ (ix) Piirre:

(A) Nimi/avain: CDS

(B) Sijainti: 26..289 (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID Nro: 3: .*·:·. GGCCTGGOGG TGCTCCIGGA AAAGG ATG TEA GAC GCA GCC CTC CCA 46

Met Leu Asp Ala Ala Leu Pro . .’·! -15 54 109809 CCC TGC OCT ACT GTT GOG GOC ACA GCA GAT TGT GAA ATT TGC CCA GCC 94

Pro Cys Pro Ihr Vai Ala Ala Ihr Ala Asp Cys Glu Ile Cys Pro Ala -10 -5 15 GTG AAG AGG GAT GTT GAC CIA TTC CTG AOG GGA AOC CCC GAC GAA TAT 142

Vai Lys Arg Asp Vai Asp Leu Phe Leu Ihr Gly Ihr Pro Asp Glu Tyr 10 15 20 GIT GAG CAA GTG GCA CAA TAC AAA GCA CIA OCT CTA GTA TIG GAA AAT 190

Vai Glu Gin Vai Ala Gin Tyr Lys Ala Leu Pro Vai Vai Leu Glu Asn 25 30 35 GOC AGA ATA CTG AAG AAC TGC GTT GAT GCA AAA ATG ACA GAA GAG GAT 238

Ala Arg Ile Leu Lys Asn Cys Vai Asp Ala Lys Met Ihr Glu Glu Asp 40 45 50 AAG GAG AAT GCT CTC AGC TTG CTG GAC AAA ATA TAC ACA AGT CCT CTG 286

Lys Glu Asn Ala Leu Ser Leu Leu Asp Lys Ile Tyr Ihr Ser Pro Leu 55 60 65 TGT TAAAGGAGOC ATCACTGGCA GGAGOOCTAA GGAAGOCACT GAACTGATCA 339

Cys 70 CTAACTAGTC TCAGCAGCCT GCCATGTOCA GGTGTCITAC TAGAGGAITC CAGCAATAAA 399 AGCCITGCAA TTCAAACAAA A 420 (2) ΙΝΪΌΡΜΑΑΠΟ SBQ ID Nro:4: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 88 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo (D) Teologia: lineaarinen ! (ii) Molekyylityyppi: proteiini (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID Nro:4: ': · ·: Met Leu Asp Ala Ala Leu Pro Pro . -15 . v. cys Pro Thr Vai Ala Ala Thr Ala Asp cys Glu Ile Cys Pro Ala Vai ’ -10 -5 15

Lys Arg Asp Vai Asp Leu Phe Leu Ihr Gly Ihr Pro Asp Glu Tyr Vai 10 15 20 , Glu Gin Vai Ala Gin Tyr Lys Ala Leu Pro Vai Vai Leu Glu Asn Ala 25 30 35

Arg Ile Leu Lys Asn Cys Vai Asp Ala Lys Met Ihr Glu Glu Asp Lys V 40 45 50 ·"*. Glu Asn Ala Leu Ser Leu Leu Asp Lys Ile Tyr Ihr Ser Pro Leu Cys ·;·; 55 60 65 70 (2) INFORMAATIO SEQ ID Nro:5: 109809 55 (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 476 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juoste: yksi (D) Topologia: lineaarinen

(ii) Molekyylityyppi: cDNA

(ix) Piirre:

(A) Nimi/avain: CDS

(B) Sijainti: 8..334 (xi) Sekvenssin kuvaus: SBQ ID Nro:5: TGACAOG ATG AGG GGG GCA CIG CTT GTG CTG GCA TTG CTG GTG ACC 46

Met Arg Gly Ala Leu Leu Vai Leu Ala Leu Leu Vai Thr -15 -10 -5 CAA GOG CTG GGC CTC AAG ATG GOG GAA ACT TGC OCC ATT TTT TAT GAC 94

Gin Ala Leu Gly Vai Lys Met Ala Glu Thr Cys Pro Ile Phe Tyr Asp 15 10 CTC TTT TTT GOG GTG GCC AAT GGA AAT GAA ΊΤΑ CTG TTG GAC TTG TCC 142

Vai Fhe Phe Ala Vai Ala Asn Gly Asn Glu Leu Leu Leu Asp Leu Ser 15 20 25 CTC ACA AAA CTC AAT GCT ACT GAA CCA GAG AGA ACA GCC ATG AAA AAA 190

Leu Thr Lys Vai Asn Ala Thr Glu Pro Glu Arg Thr Ala Met Lys Lys 30 35 40 : ATC CAG GAT TGC TAC CTG GAG AAC GGA CTC ΑΓΑ TCC AGG GTC TTG GAT 238 • ·: : Ile Gin Asp Cys Tyr Vai Glu Asn Gly Leu Ile Ser Arg Vai Leu Asp ·'·. 45 50 55 60 GGA CIA CTC ATG ACA ACC ATC AGC TCC AGC AAA GAT TGC ATG GCT GAA 286

Gly Leu Vai Met Thr Thr Ile Ser Ser Ser Lys Asp Cys Met Gly Glu ·;·: 65 70 80 GCA CTT CAG AAC ACC GTA GAA GAT CTC AAG CTG AAC ACT TTG GGG AGA 334

Ala Vai Gin Asn Thr Vai Glu Asp Leu Lys Leu Asn Thr Leu Gly Arg 85 90 95 TGAATCTTTG CCACTGATGC CCCITCTGAG CXXCATOCTC CTGCOCTCTT CTTTACACCT 394 AAAGCTGGAA TCCAGACACC TGTCCTCACC TAATTCACTC TCAATCAGGC TGACTAGAAT 454 '·' t AAAATAACIG CATCITAAAA AA 476 56 (2) INFORMAATIO SEQ ID Nro:6: 109809 (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 109 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: proteiini (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID Nro: 6:

Met Arg Gly Ala Leu Leu Vai Leu Ala Leu Leu Vai Ihr Gin -15 -10 -5

Ala Leu Gly Vai Lys Met Ala Glu Ihr Cys Pro Ile Phe Tyr Asp Vai 15 10

Phe Rae Ala Vai Ala Asn Gly Asn Glu Leu Leu Leu Asp Leu Ser Leu 15 20 25

Ihr Lys Vai Asn Ala Ihr Glu Pro Glu Arg Ihr Ala Met Lys Lys Ile 30 35 40 45

Gin Asp Cys Tyr Vai Glu Asn Gly Leu Ile Ser Arg Vai Leu Asp Gly 50 55 60

Leu Vai Met Ihr Ihr Ile Ser Ser Ser Lys Asp Cys Met Gly Glu Ala 65 70 75

Vai Gin Asn Ihr Vai Glu Asp Leu Lys Leu Asn Ihr Leu Gly Arg 80 85 90 : V: (2) INFORMAATIO SEQ ID Nro:7: · (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 27 aminohappoa • ' (B) Tyyppi: aminohappo *:··: (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: peptidi (v) Fragmenttityyppi: sisäinen (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID Nro:7:

Lys Arg Asp Vai Asp Leu Phe Leu Ihr Gly Ihr Pro Asp Glu Tyr Vai 15 10 15

Glu Gin Vai Ala Gin iyr Lys Ala Leu Pro Vai 20 25 (2) INFORMAATIO SEQ ID Nro:8: 57 109809 (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 27 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: peptidi (v) Fragmenttityyppi: sisäinen (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID Nro:8:

Lys Ala Leu Pro Vai Vai Leu Glu Asn Ala Arg Ile Leu Lys Asn cys 1 5 10 15

Vai Asp Ala Lys Met Thr Glu Glu Asp Lys Glu 20 25 (2) INFORMAATIO SEQ ID Nro:9: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 26 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: peptidi (v) Fragmenttityyppi: sisäinen (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID Nro: 9: . . Phe Phe Ala Vai Ala Asn Gly Asn Glu Leu Leu Leu Asp Leu Ser Leu 15 10 15

Thr Lys Vai Asn Ala Thr Glu Pro Glu Arg •\ 20 25 "*·’ (2) INFORMAATIO SEQ ID Nro:10: ··: (i) Sekvenssin ominaisuudet: ; (A) Pituus: 19 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: peptidi (v) Fragmenttityyppi: sisäinen ,*:* (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID Nro: 10: , ,·* Glu Glu Asp Lys Glu Asn Ala Leu Ser Leu Leu Asp Lys Ile Tyr Thr 1 5 10 15

Ser Pro Leu 109809 58 (2) INFORMAATIO SBQ ID Nro: 11: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 19 aminohappoa (B) Tyyppiä aminohappo (D) Topologia: lineaarinen (ii) Mblekyylityyppi: peptidi (v) Fragmenttityyppi: sisäinen (xi) Sekvenssin kuvaus: SBQ ID Nro: 11:

Met Gly Glu Ala Vai Gin Asn Ihr Vai Glu Asp Leu Lys Leu Asn Ihr 15 10 15

Leu Gly Arg (2) INFORMAATIO SBQ ID Nro: 12: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 27 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juoste: yksi (D) Topologia: lineaarinen

(ii) Molekyylityyppi: cDNA

(ix) Piirre:

(A) Nimi/avain: CDS

(B) Sijainti: 10..27 ’ i (xi) Sekvenssin kuvaus: SBQ ID Nro: 12: : ' GGGGGATCC AAA GCT CIG OOG GIT GTT 27

Lys Ala Leu Pro Vai Vai 1 5 (2) INFORMAATIO SBQ ID Nro:13: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 6 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo (D) Tcpologia: lineaarinen ·;· (ii) Molekyylityyppi: proteiini (xi) Sekvenssin kuvaus: SBQ ID Nro: 13: t I » 59 109809

Lys Ala Leu Pro Vai Vai 1 5 (2) INFORMAATIO SEQ ID Nro: 14: (1) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 90 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juoste: yksi (D) Topologia: lineaarinen

(ii) Molekyylityyppi: cDNA

(ix) Piirre:

(A) Nimi/avain: CDS

(B) Sijainti: 10..90 (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ id Nro: 14: GGGGGATCC AAA GCT CTG COG GIT GTT CTG GAA AAC GCT OGT ATC CTG 48

Lys Ala Leu Pro Vai Vai Leu Glu Asn Ala Arg Ile Leu 15 10 AAA AAC TGC GTT GAC GCT AAA ATG ACC GAA GAA GAC AAA GAA 90

Lys Asn Cys Vai Asp Ala Lys Met Ihr Glu Glu Asp Lys Glu 15 20 25 (2) INFORMAATIO SEQ ID Nro: 15: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 27 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo v. (D) Topologia: lineaarinen » i ;;· (ii) Molekyylityyppi: proteiini I « I · ’<f> (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID Nro:15: • · ;·; Lys Ala Leu Pro Vai Vai Leu Glu Asn Ala Arg Ile Leu Lys Asn Cys :/ 1 5 10 15

Vai Asp Ala Lys Met Thr Glu Glu Asp Lys Glu 20 25 (2) INFORMAATIO SEQ ID Nro: 16: (i) Sekvenssin ominaisuudet: . (A) Pituus: 63 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo ;;; (C) Juoste: yksi (D) Topologia: lineaarinen 60 109809 (ii) Molekyylityyppi: cDNA (iv) Anti-sense: kyllä (xi) Sekvenssin kuvaus: SBQ Π) Nro: 16: CAGAGACAGG TCCAGCAGCA GTKXJITAOC GTTAGCAACA GOGAAGAATT CnTCTOITC 60 TTC 63 (2) INFORMAATION SBQ ID Nro:17: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 21 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: peptidi (v) Fragmenttityyppi: sisäinen (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID Nro: 17:

Glu Glu Asp Lys Glu Fhe Phe Ala Vai Ala Asn Gly Asn Glu Leu Leu 15 10 15

Leu Asp Leu Ser Leu 20 (2) INFORMAATIO SEQ ID Nro: 18: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 45 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juoste: yksi 1 (D) Topologia: lineaarinen

(ii) Molekyylityyppi: cENA

*:'· (ix) Piirre:

_; (A) Nimi/avain: CDS

(B) Sijainti: 1..45 ·’ (xi) Sekvenssin kuvaus: SBQ ID Nro: 18: CTG GAC CIG TCT CIG ACC AAA GTT AAC GCT AOC GAA COG GAA OGT 45

Leu Asp Leu Ser Leu Hir Lys Vai Asn Ala Ihr Glu Pro Glu Arg 15 10 15 • - % V (2) INFORMAATIO SBQ ID Nro:19: • · * (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 15 aminohappoa ;·. (B) Tyyppi: aminohappo * i I i i 61 109809 (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: proteiini (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID Nro: 19:

Leu Asp Leu Ser Leu Thr Lys Vai Asn Ala Thr Glu Pro Glu Arg 15 10 15 (2) INFORMAATIO SEQ ID Nro:20: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 54 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juos te: yksi (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: cDNA (iv) Anti-sense: kyllä (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID Nro: 20: GTOOGGGGTA CCGGTCAGGA ACAGGTCAAC GTCAOGTTTA OGTTOOGGTT OGGT 54 (2) INFORMAATIO SEQ ID Nto:21: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 18 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: peptidi • · ! (v) Fragmenttityyppi: sisäinen • · • · · : . (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID Nro:21: • · . Thr Glu Pro Glu Arg Lys Arg Asp Vai Asp Leu Phe Leu Thr Gly Thr 1 5 10 15 • · * ·

Pro Asp (2) INFORMAATIO SEQ ID Nro: 22: ί (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 89 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juoste: yksi (D) Tcpologia: lineaarinen (ii) Ifolekyylityyppi: pqptidi 62 109809 (ix) Piirre:

(A) Nimi/avain: CDS

(B) Sijainti: 1..63 (xi) Sekvenssin kuvaus: SBQ ID Nro:22: ACC GGT ACC COG GAC GAA TAC G?TT GAA CAG GTT GCT CAG TAC AAA GCT 48

Thr Gly Ihr Pro Asp Glu Tyr Vai Glu Gin Val Ala Gin Tyr Lys Ala 15 10 15 CIG COG GTT TAG TAGTCTAGAC TGCAGAAGCT TGGATCCCC 89

Leu Pro Val * 20 (2) INFORMAATION SBQ ID Nro:23: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 19 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: proteiini (xi) Sekvenssin kuvaus: SBQ ID Nro:23:

Thr Gly Hir Pro Asp Glu Tyr Vai Glu Gin Vai Ala Gin Tyr Lys Ala 15 1 15

Leu Pro Vai » » t · » * * · • · (2) INFORMAATIO SBQ ID Nro:24: * « .... (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 44 emäsparia (i‘| (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juoste: yksi (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: cDNA (iv) Anti-sense: kyllä (xi) Sekvenssin kuvaus: SBQ ID Nro:24: t V* GGGGATCCAA GCITCDGCAG TCTAGACEAC TAAACCGGCA GAGC 44 » · (2) INFORMAATIO SBQ ID Nro:25: • » (i) Sekvenssin ominaisuudet: , Y (A) Pituus: 4 aminohappoa ‘ » t » 63 109809 (B) Tyyppi: aminohappo (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: peptidi (v) Fragmenttityyppi: sisäinen (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID Nro: 25:

Ala Leu Pro Vai 1 (2) INFORMAATIO SEQ ID NO:26: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 41 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juoste: yksi (D) Tcpologia: lineaarinen

(ii) Molekyylityyppi: cDNA

(ix) Piirre:

(A) Nimi/avain: CDS

(B) Sijainti: 9..41 (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID Nro:26: GGGGATCC GAA GAA GAC AAA GAA AAC GCT CIG TCT CIG CIG 41

Glu Glu Asp Lys Glu Asn Ala Leu Ser Leu Leu 15 10 : (2) INFORMAATIO SEQ ID Nro: 27: (i) Sekvenssin ominaisuudet: : " (A) Pituus: 11 aminohappoa ·:·· (B) Tyyppi: aminohappo . (D) Tcpologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: proteiini (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID Nro:27:

Glu Glu Asp Lys Glu Asn Ala Leu Ser Leu Leu 15 10 (2) INFORMAATIO SEQ ID Nro:28: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 60 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juoste: yksi 64 109809 (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: cDNA (iv) Anti-sense: kyllä (xi) Sekvenssin kuvaus: SBQ ID Nro:28: TTCCAGAACA ACOGGCAGAG CTITCAGOGG AGAGGTGTAG ATITTGTCCA GGAGAGACAG 60 (2) INFORMAATIO SBQ ID Nro:29: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 20 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: peptidi (v) Fragmenttityyppi: sisäinen (xi) Sekvenssin kuvaus: SBQ ID Nro: 29:

Leu Ser Leu Leu Asp Lys Ile Tyr Thr Ser Pro Leu Lys Ala Leu Pro 15 10 15

Vai Vai Leu Glu 20 (2) INFORMAATIO SBQ ID Nro:30: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 54 emäsparia . . (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juoste: yksi : .·. (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: cDNA (iv) Anti-sense: kyllä ’ (xi) Sekvenssin kuvaus: SBQ ID Nro: 30: TTCAAOGCTG TTCTGAACAG CTTCACCCAT AACXDGGCAGA GCnTGTACT GAGC 54 (2) INFORMAATIO SBQ ID Nro:31: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 18 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo , (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: peptidi . (v) Fragmenttityyppi: sisäinen (xi) Sekvenssin kuvaus: SBQ ID Nro:31: 65 109809

Ala Gin Tyr Lys Ala Leu Pro Vai Met Gly Glu Ala Vai Gin Asn ihr 15 10 15

Vai Glu (2) INFORMAATIO SEQ ID NO:32: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 65 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juoste: yksi (D) Topologia: lineaarinen

(ii) Molekyylityyppi: cDNA

(ix) Piirre:

(A) Nimi/avain: CDS

(B) Sijainti: 1..45 (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID Nro:32 CAG AAC ACC GTT GAA GAC CTG AAA CTG AAC ACC CIG GGT OGT TGAATGTAAC 52 Gin Asn Ihr Vai Glu Asp Leu Lys Leu Asn Thr Leu Gly Arg 15 10 15 TGCAGAAITC OOC 65 (2) INFORMAATIO SEQ ID Nro: 33: :Y: (i) Sekvenssin ominaisuudet: . Y (A) Pituus: 14 aminohappoa : (B) Tyyppi: aminohappo (D) Topologia: lineaarinen ·;··: (ii) Molekyylityyppi: proteiini (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID Nro:33: I · · * · · »

Gin Asn Ihr Vai Glu Asp Leu Lys Leu Asn Ihr Leu Gly Arg 15 10 (2) INFORMAATIO SEQ ID Nro:34: II· » ,'·«· (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 20 emäsparia Y (B) Tyyppi: nukleiinihappo YY (C) Juoste: yksi (D) Topologia: lineaarinen • » I ·

(ii) Molekyylityyppi: cDNA

66 109809 (ix) Piirre:

(A) Nimi/avain: CDS

(B) Sijainti: 9..20 (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID Nro:34: GGGGATCC GAA GAA GAC AAA 20

Glu Glu Asp Lys 1 (2) INFORMAATIO SEQ ID Nro:35: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 4 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: proteiini (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID Nro:35:

Glu Glu Asp Lys 1 (2) INFORMAATIO SEQ ID Nro:36: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 35 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juos te: yksi , . (D) Topologia: lineaarinen • *

; .·. (ii) Molekyylityyppi: cDNA

(iv) Anti-sense: kyllä (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID Nro:36: »tl GGGGAATTCT GCAGTIACAT TCATCTCCCC AAAGT 35 M * « :‘; (2) INFORMAATIO SEQ ID Nro:37: t (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 4 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo (D) Topologia: lineaarinen . I** (ii) Molekyylityyppi: peptidi > t » ’ ’ (v) Fragmenttityyppi: sisäinen ' (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID Nro:37:

Ihr Leu Gly Arg r. i * · » * · * »

( « M

67 109809 (2) INFORMAATIO SBQ ID NO: 38: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 288 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juoste: yksi (D) Topologia: lineaarinen

(ii) Molekyylityyppi: cENA

(ix) Piirre:

(A) Nimi/avain: CDS

(B) Sijainti: 1..288 (xi) Sekvenssin kuvaus: SBQ ID Nro:38: ATG GGT CAC CAC CAC CAC CAC CAC GAA TTC CTG GTT COG OGT GGA TCC 48

Met Gly His His His His His His Glu Phe Leu Vai Pro Arg Gly Ser 1 5 10 15 AAA GCT CTG CCG GTT GTT CTG GAA AAC GCT OGT ATC CTG AAA AAC TGC 96

Lys Ala Leu Pro Vai Vai Leu Glu Asn Ala Arg Ile Leu Lys Asn Cys 20 25 30 GTT GAC GCT AAA ATG ACC GAA GAA GAC AAA GAA TTC TTC GCT GTT GCT 144

Vai Asp Ala Lys Met Ihr Glu Glu Asp Lys Glu Phe Phe Ala Vai Ala 35 40 45 AAC GGT AAC GAA CTG CTG CTG GAC CTG TCT CTG ACC AAA GTT AAC GCT 192

Asn Gly Asn Glu Leu Leu Leu Asp Leu Ser Leu Ihr Lys Vai Asn Ala 50 55 60 ACC GAA CCG GAA OGT AAA OGT GAC GTT GAC CTG TTC CTG ACC GGT ACC 240

Ihr Glu Pro Glu Arg Lys Arg Asp Vai Asp Leu Phe Leu Thr Gly Thr :Y: 65 70 75 80 : COG GAC GAA TAC GTT GAA CAG GTT GCT CAG TAC AAA GCT CTG CCG GTT 288

Pro Asp Glu Tyr Vai Glu Gin Vai Ala Gin Tyr Lys Ala Leu Pro Vai : 85 90 95 (2) INFORMAATIO SBQ ID Nro:39: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 96 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: proteiini Y·. (xi) Sekvenssin kuvaus: SBQ ID Nro:39: Y.: Met Gly His His His His His His Glu Phe Leu Vai Pro Arg Gly Ser .' ”. 1 5 10 15 68 109809

Lys Ala Leu Pro Vai Vai Leu Glu Asn Ala Arg lie Leu Lys Asn Cys 20 25 30

Val Asp Ala Lys Met Thr Glu Glu Asp Lys Glu Hie Hie Ala Val Ala 35 40 45

Asn Gly Asn Glu Leu Leu Leu Asp Leu Ser Leu Dir Lys Val Asn Ala 50 55 60

Ihr Glu Pro Glu Arg Lys Arg Asp Val Asp Leu Hie Leu Ihr Gly Ihr 65 70 75 80

Pro Asp Glu Tyr Val Glu Gin Val Ala Gin Tyr Lys Ala Leu Pro Val 85 90 95 (2) INFORMAATIO SEQ ID NO:40: (1) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 27 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juoste: yksi (D) Topologia: lineaarinen

(ii) Molekyylityyppi: cDNA

(xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID Nro:40: GGGGAATTCA AGAGGGATGT TGAOCIA 27 (2) INFORMAATIO SEQ ID Nro:41: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 6 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo : (D) Topologia: lineaarinen : '· (ii) Molekyylityyppi: peptidi (v) Fragmenttityyppi: sisäinen (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID Nro:41:

Lys Arg Asp Vai Asp Leu 1 5 (2) INFORMAATIO SEQ ID Nro: 42: • · · ·;;; (i) Sekvenssin ominaisuudet: ‘ (A) Pituus: 27 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo : (C) Juoste: yksi .1.’ (D) Topologia: lineaarinen 109809 69

(ii) Molekyylityyppi: cDNA

(xi) Sekvenssin kuvaus: SBQ ID Nro:42: CTACCTGTAT TmTGOGGT GGCCAAT 27 (2) INFORMAATIO SBQ ID Nro: 43: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: peptidi (v) Fragmenttityyppi: sisäinen (xi) Sekvenssin kuvaus: SBQ ID Nro:43:

Leu Pro Vai Phe Phe Ala Vai Ala Asn 1 5 (2) INFORMAATIO SBQ ID Nro:44: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 27 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juoste: yksi (D) Topologia: lineaarinen

(ii) Molekyylityyppi: cDNA

(xi) Sekvenssin kuvaus: SBQ ID Nro:44: ;·’ ' CCAGAGAGAA AAGCACTACC TGTAGTA 27 ·:···; (2) INFORMAATIO SBQ ID Nro:45: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: peptidi (v) Fragmenttityyppi: sisäinen (xi) Sekvenssin kuvaus: SBQ ID Nro:45: · :Pro Glu Arg Lys Ala Leu Pro Vai Vai 1 5 70 109809 (2) INFORMAATIO SEQ Π) Nro:46: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 36 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juoste: yksi (D) Tcpologia: lineaarinen

(ii) Molekyylityyppi: cöNA

(xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID Nro:46: AITGGCCACC GCAAAAAATA CAGGTAGTGC TTTGTA 36 (2) INFORMAATIO SEQ ID Nro:47: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 12 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo (D) Tcpologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: peptidi (v) Fragmenttityyppi: sisäinen (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID Nro:47:

Asn Ala Vai Ala Phe Phe Vai Pro Leu Ala Lys Tyr 15 10 (2) INFORMAATIO SEQ ID Nro:48: (i) Sekvenssin ominaisuudet: / ; (A) Pituus: 27 emäsparia ·.{ · (B) Tyyppi: nukleiinihappo :·, (C) Juoste: yksi : " (D) Tcpologia: lineaarinen

. (ii) Molekyylityyppi: cDNA

(xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID Nro:48: TAGTGCTTTT CTCTCIGGIT CAGTAGC 27 (2) INFORMAATIO SEQ ID NO: 49: *:· (i) Sekvenssin ominaisuudet: "!! (A) Pituus: 9 aminohappoa ·.· (B) Tyyppi: aminohappo ·.’ (D) Tcpologia: lineaarinen ,···. (ii) Molekyylityyppi: peptidi 71 109809 (v) Fragmenttityyppi: sisäinen (xi) Sekvenssin kuvaus: SBQ ID Nro: 49:

Leu Ala Lys Arg Glu Pro Glu Ihr Ala 1 5 (2) INFORMAATIO SBQ ID Nro: 50: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 29 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juoste: yksi (D) Topologia: lineaarinen

(ii) Molekyylityyppi: cDNA

(xi) Sekvenssin kuvaus: SBQ ID Nro:50: GGGGATCeiT ACTCCTTATC CTCTTCTGT 29 (2) INFORMAATIO SBQ ID Nro: 51: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 6 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: jpeptidi (v) Fragmenttityyppi: sisäinen . . (xi) Sekvenssin kuvaus: SBQ ID Nro:51: : .· Glu Lys Asp Glu Glu Ihr · l 5 (2) INFORMAATIO SBQ ID NO:52: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 27 emäsparia ; : : (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juoste: yksi (D) Tcpologia: lineaarinen

(ii) Molekyylityyppi: cDNA

(xi) Sekvenssin kuvaus: SBQ ID Nro:52: . GGGGAATTCA AAGGACTACC TGTAGTA 27 (2) INFORMAATIO SBQ ID Nro:53: 72 109809 (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 6 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: peptidi (v) Fragmenttityyppi: sisäinen (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID Nro:53:

Lys Ala Leu Pro Vai Vai 1 5 (2) INFORMAATIO SEQ ID NO:54: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 27 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juoste: yksi (D) Topologia: lineaarinen

(ii) Molekyylityyppi: cDNA

(xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID Nro:54: GATAAGGAGA AGAGGGATGT TGACCTA 27 (2) INFORMAATIO SEQ ID Nro:55: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 aminohappoa .* ; (B) Tyyppi: aminohappo I l (D) Topologia: lineaarinen > * '· ‘ (ii) Molekyylityyppi: peptidi . (v) Fragmenttityyppi: sisäinen * » · · ,·.· (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID Nro:55:

Asp Lys Glu Lys Arg Asp Vai Asp Leu 1 5 (2) INFORMAATIO SEQ ID NO:56: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 27 emäsparia Y (B) Tyyppi: nukleiinihappo Y_ (C) Juoste: yksi (D) Topologia: lineaarinen » » * 73 1 0 9 8 0 9

(ii) Molekyylityyppi: cDNA

(xi) Sekvenssin kuvaus: SBQ ID Nro:56: CTACCTGTAT TTTTTGOGGT GGOCAAT 27 (2) ΙΝΡΟΕΜΆΑΠΟ SEQ ID Nro:57: (i) Sekvenssin caninaisuudet: (A) Pituus: 9 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo (D) Teologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: peptidi (v) Fragmenttityyppi: sisäinen (xi) Sekvenssin kuvaus: SBQ ID Nro:57:

Leu Pro Vai Phe Phe Ala Vai Ala Asn 1 5 (2) INFORMAATIO SBQ ID Nro:58: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 36 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juoste: yksi (D) Topologia: lineaarinen

(ii) Molekyylityyppi: cDNA

, V (xi) Sekvenssin kuvaus: SBQ ID Nro:58: • · • · » t TAGGTCAACA TCCXTrCITCT CCTIATCCTC TTCTGT 36 t · t · ..... (2) ΙΝΡΟΡΜΑΑΠΟ SBQ ID Nro:59: •i (i) Sekvenssin oandnaisuudet:

Tt (A) Pituus: 12 aminohappoa ’.· (B) Tyyppi: aminohappo (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: peptidi (v) Fragmenttityyppi: sisäinen > · (xi) Sekvenssin kuvaus: SBQ ID Nro:59: ; Leu Asp Vai Asp Arg Lys Glu Lys Asp Glu Glu Thr ::: i 5 10 i »

MM

74 109809 (2) INPORMAaTIO SEQ ID NO:60: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 27 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juoste: yksi (D) Topologia: lineaarinen

(ii) Molekyylityyppi: cDNA

(xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID Nro:60: OGCAAAAAAT ACAGGTAGTG CTTTGTA 27 (2) INPOHYIAATIO SEQ ID Nro: 61: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 aminohappo» (B) Tyyppi: aminohappo (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: peptidi (v) Fragmenttityyppi: sisäinen (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID Nro:61:

Ala Phe Phe Vai Pro Leu Ala Lys Tyr 1 5 (2) INFORMAATIO SEQ ID Nro:62: (i) Sekvenssin ominaisuudet: ’ ·*; (A) Pituus: 29 emäsparia : : (B) Tyyppi: nukleiinihappo j'.' (C) Juoste: yksi ’* (D) Topologia: lineaarinen II··

(ii) Molekyylityyppi: cCWA

• · '·'! (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID Nro:62: « · GGGGATCCIT ATCTCTCIGG TTCAGTAGC 29 (2) INFORMAATIO SEQ ID Nro:63: i » (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 6 aminohappoa > · (B) Tyyppi: aminohappo ; (D) Tcpologia: lineaarinen tl» (ii) Molekyylityyppi: peptidi t · » · (v) Fragmenttityyppi: sisäinen 75 109809 (xi) Sekvenssin kuvaus: SBQ ID Nro:63:

Arg Glu Pro Glu Ihr Ala 1 5 (2) INFORMAATIO SBQ ID Nro:64: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 27 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juoste: yksi (D) Topologia: lineaarinen

(ii) Molekyylityyppi: cDNA

(xi) Sekvenssin kuvaus: SBQ ID Nro:64: GGGGAAITCT TIGCGGTGGC CAATGGA 27 (2) INFORMAATIO SBQ ID Nro: 65: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 7 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: peptidi (v) Fragmenttityyppi: sisäinen .·'.· (xi) Sekvenssin kuvaus: SBQ ID Nro:65: : ·.. Phe Phe Ala Vai Ala Asn Gly ‘ ; 1 5 (2) INFORMAATIO SBQ ID Nro:66: : : : (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 21 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juoste: yksi (D) Topologia: lineaarinen

(ii) Molekyylityyppi: cDNA

(xi) Sekvenssin kuvaus: SBQ ID Nro:66: AAGAGGGATG TTGACCIATT C 21 (2) INFORMAATIO SBQ ID Nro:67: 76 109809 (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 7 aminohappoa (B) Tyyppiä aminohappo (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: peptidi (v) Fragmenttityyppi: sisäinen (xi) Sekvenssin kuvaus: SBQ ID Nro:67:

Lys Arg Asp Vai Asp Leu Pro 1 5 (2) INFORMAATIO SBQ ID Nro:68: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 39 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juoste: yksi (D) Topologia: lineaarinen

(ii) Molekyylityyppi: cDNA

(xi) Sekvenssin kuvaus: SBQ ID Nro:68: TAGGTCAACA TCCCTCTITC TCTCTGGITC AGTAGGATT 39 (2) INFORMAATIO SBQ ID Nro:69: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 13 aminohappoa ! (B) Tyyppi: aminohappo : (D) Tcpologia: lineaarinen * *’ (ii) Moleikyylityyppi: peptidi . (v) Fragmenttityyppi: sisäinen (xi) Sekvenssin kuvaus: SBQ ID Nro:69:

Leu Asp Vai Asp Arg Lys Arg Glu Pro Glu Thr Ala Asn 15 10 (2) INFORMAATIO SBQ ID Nro:70: ’•|· (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 32 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo :,i." (C) Juoste: yksi .··*. (D) Tcpologia: lineaarinen

(ii) Molekyylityyppi: cDNA

„ 109809 (xi) Sekvenssin kuvaus: SBQ ID Nro: 70: GGGGATCCTC ACTCCITATC CTCITCICTC AT 32 (2) INFORMAATIO SBQ ID NO:71: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 7 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: peptidi (v) Fragmenttityyppi: sisäinen (xi) Sekvenssin kuvaus: SBQ ID Nro:71:

Glu Lys Asp Glu Glu Thr Met 1 5 (2) INFORMAATIO SBQ ID Nro: 72: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 6 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: peptidi (v) Fragmenttityyppi: sisäinen • (xi) Sekvenssin kuvaus: SBQ ID Nro:72: ____; Leu Vai Pro Arg Gly Ser * ' 1 5 '“i (2) INFORMAATIO SBQ ID Nro:73: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 10 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: peptidi : : (v) Fragmenttityyppi: sisäinen : (xi) Sekvenssin kuvaus: SBQ ID Nro:73: 78 109809

Met Gly His His His His His His Glu Phe 15 10 (2) INFORMAATIO SEQ ID Nro:74: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 6 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juosteisuus: yksisäikeinen (D) Tcpologia: lineaarinen

(ii) Molekyylityyppi: cDNA

(xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID Nro: 74:

GAATTC

(2) INFORMAATIO SEQ ID Nro:75: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 6 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juosteisuus: yksisäikeinen (D) Topologia: lineaarinen

(ii) Molekyylityyppi: cDNA

(xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID Nro:75:

GGATCC

* * t « · V;’ (2) INFORMAATIO SEQ ID NO:76: - · · < i i (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 14 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo (D) Tcpologia: lineaarinen I · V : (ii) Molekyylityyppi: peptidi (v) Fragmenttityyppi: sisäinen (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID Nro:76: • ( i , Met Gly His His His His His His Leu Vai Pro Arg Gly Ser % * ·: l 5 ίο

Hill I * i < f 79 109809 (2) INFORMAATIO SEQ ID NO:77: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 20 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: poptidi (v) Fragmenttityyppi: sisäinen (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID Nro:77:

Thr Glu Glu Asp Lys Glu Asn Ala Leu Ser Leu Leu Asp Lys Ile Tyr 15 10 15

Thr Ser Pro Leu

Claims

80 109809

1. Menetelmä peptidin valmistamiseksi, jossa peptidissä on ainakin kaksi aluetta, jotka on johdettu erilaisista proteii-niallergeeneista, joissa molemmissa alueissa on ainakin yksi 5 proteiiniallergeenin T-soluepitooppi, joka on valittu seuraa-vien ryhmästä: Dermatophaaoides proteiiniallergeenit, Ambrosia proteiiniallergeenit, Lolium proteiiniallergeenit, Cryptomeria proteiiniallergeenit, Alternaria proteiiniallergeenit, Alder proteiiniallergeenit, Betula proteiiniallergeenit, Ouercus 10 proteiiniallergeenit, Olea proteiiniallergeenit, Artemisia proteiiniallergeenit, Plantaao proteiiniallergeenit, Parieta-ria proteiiniallergeenit, Canine proteiiniallergeenit, Blat-tella proteiiniallergeenit, Apis proteiiniallergeenit tai Pe-riplaneta proteiiniallergeenit, tunnettu siitä, että menetelmä 15 käsittää: a) peptidiä koodaavan nukleiinihapon viemisen isäntäsoluun; b) isäntäsolun kasvattamisen olosuhteissa, jotka ovat sopivia· nukleiinihapon ilmentämiseksi ja peptidin tuottamiseksi; ja c) peptidin eristämisen isäntäsolusta. » : 20

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, ; ’·· että peptidi koostuu ainakin kolmesta alueesta. »

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, < että peptidin alueet järjestetään konfiguraatioon, joka on eri lainen kuin luonnostaan proteiiniallergeenissa esiintyvä konfi-25 guraatio.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, , että ainakin kaksi peptidin alueista johdetaan saman suvun eri ' ; proteiiniallergeeneistä.

,*·. 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, ,·/; 30 että ainakin kaksi peptidin aluetta on johdettu ristiinreagoi-vista lajeista, peptidin käsittäessä edullisesti ainakin yhden 81 109809 alueen johdettuna Dermatoohaaoides pteronvssinuksesta ja yhden alueen johdettuna Dermatophacroides farinaesta.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ainakin kaksi aluetta on johdettu saman lajin eri prote- 5 iiniallergeeneistä, peptidin ollessa edullisesti sellainen, jossa a) yksi alue johdettu Der p I:stä ja yksi alue johdettu Der p IIrsta; b) yksi alue johdettu Der f I:stä ja yksi alue johdettu Der f IIrsta; c) yksi alue johdettu Amb a I:stä ja yksi alue johdettu Amb a IIrsta; 10 d) yksi alue johdettu Loi p I:stä ja yksi alue johdettu Loi p IX:stä; tai e) yksi alue johdettu Cry j I:stä ja yksi alue johdettu Cry j IIrsta.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ainakin kaksi peptidin aluetta on johdettu saman ryhmän 15 eri proteiiniallergeeneista, peptidin käsittäessä edullisesti ainakin yhden alueen johdettuna Der p Irstä ja yhden alueen johdettuna Der f Irstä.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ainakin kaksi peptidin aluetta on johdettu saman perheen :: 20 eri proteiiniallergeeneistä, edullisesti ryhmästä, joka koos-; ’·· tuu seuraavista: Amb a I.Irstä, Amb a I.2:sta, Amb a I.3rsta tai Amb a I.4:stä.

• · · ’’!! 9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, • * · • · ' että peptidillä on minimaalinen immunoglobuliini Ertä stimu- 25 loiva aktiivisuus. » ·

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, .* . että peptidi sitoo immunoglobuliini Ertä olennaisesti vähem- • · · ’* mässä määrin kuin proteiiniallergeenit, joista alueet on joh dettu, sitovat mainittua immunoglobuliini Ertä.

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, » · ‘ * että peptidi ei sido immunoglobuliini Ertä, joka on spesifinen proteiiniallergeenille, tai jos peptidin sitomista mainittuun 82 109809 immunoglobuliini E:hen tapahtuu, ei sellainen sitominen johda välittäjäaineiden vapautumiseen syöttösoluista tai basofii-leistä olennaisena prosenttina yksilöistä, jotka ovat herkkiä mainitulle proteiiniallergeenille.

12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peptidiin sisältyy proteolyyttinen kohta insertoituna ainakin kahden mainitun alueen väliin.

13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peptidin alueista kukin sisältää ainakin kaksi proteiini- 10 allergeenin T-soluepitooppia.

14. Menetelmä eristetyn peptidin valmistamiseksi, jossa peptidissä on ainakin kaksi aluetta, joissa kummassakin on ihmisen T-solua stimuloivaa aktiivisuutta, mainittujen alueiden kunkin sisältäessä ainakin yhden proteiiniallergeenin T-soluepitoo- 15 pin, kaikkien alueiden ollessa valittu ryhmästä, joka koostuu peptidistä X, peptidistä Y, peptidistä Z, peptidistä A, peptidistä B ja peptidistä C, jokainen kuten kuviossa 4 osoitettu, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää: ·,·. a) peptidiä koodaavan nukleiinihapon viemisen isäntäsoluun; : 20 b) isäntäsolun kasvattamisen olosuhteissa, jotka ovat sopivia : ’·· nukleiinihapon ilmentämiseksi ja peptidin tuottamiseksi; ja • * · * · c) peptidin eristämisen isäntäsolusta. » ♦ i i V

· 15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peptidin alueet koostuvat peptidistä X, peptidistä Y ja ·;··: 25 peptidistä Z, jokainen kuten kuviossa 4 osoitettu, tai pepti-distä X, peptidistä Y, peptidistä Z, peptidistä A ja peptidis-. tä B, jokainen kuten kuviossa 4 osoitettu.

16. Menetelmä eristetyn peptidin YZX valmistamiseksi, joka ,···, peptidi koostuu peptidistä Y, peptidistä Z ja peptidistä X, 30 perättäisessä järjestyksessä, jokainen kuten kuviossa 4 osoi-’ ' tettu, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää: 109809 a) peptidiä YZX koodaavan nukleiinihapon viemisen isäntäso-luun; b) isäntäsolun kasvattamisen olosuhteissa, jotka ovat sopivia nukleiinihapon ilmentämiseksi ja peptidin YZX tuottamiseksi; 5 ja c) peptidin YZX eristämisen isäntäsolusta.

17. Menetelmä eristetyn peptidin AYZXB valmistamiseksi, joka peptidi koostuu peptidistä A, peptidistä Y, peptidistä Z, peptidistä Y ja peptidistä B, perättäisessä järjestyksessä, jo- 10 kainen kuten kuviossa 4 osoitettu, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää: a) peptidiä AYZXB koodaavan nukleiinihapon viemisen isäntäso-luun; b) isäntäsolun kasvattamisen olosuhteissa, jotka ovat sopivia 15 nukleiinihapon ilmentämiseksi ja peptidin AYZXB tuottamiseksi; ja c) peptidin AYZXB eristämisen isäntäsolusta.

18. Menetelmä terapeuttisen koostumuksen valmistamiseksi, tun- , . nettu siitä, että patenttivaatimuksen 1 peptidi stabiloidaan ; 20 farmaseuttisesti hyväksyttävässä kantajassa. I I I .

19. Menetelmä terapeuttisen koostumuksen valmistamiseksi, tun- ·;··: nettu siitä, että menetelmä koostuu ainakin yhden peptidin, jossa on vähintään kaksi aluetta kunkin omatessa ihmisen T- • * « · solua stimuloivaa aktiivisuutta, stabiloinnista farmaseutti- • ♦ · 25 sesti hyväksyttävässä kantajassa, mainittujen alueiden ollessa , . peptidi X, peptidi Y, peptidi Z, peptidi A, peptidi B tai pep tidi C, jokainen kuten kuviossa 4 osoitettu.

: 20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu peptidi käsittää peptidin X ja peptidin Y. * · * · · • · · 84 109809