ES2924282T3

ES2924282T3 - Moléculas de transporte a través de la barrera hematoencefálica y usos de las mismas

Info

Publication number: ES2924282T3
Application number: ES15816762T
Authority: ES
Inventors: Carl Webster; Albert Thom; Lutz Jermutus; Jonathan Hatcher
Original assignee: MedImmune Ltd
Current assignee: MedImmune Ltd
Priority date: 2014-12-19
Filing date: 2015-12-18
Publication date: 2022-10-05
Anticipated expiration: 2035-12-18
Also published as: WO2016097315A2; EP3233922A2; US20180057605A1; HK1245299A1; EP3233922B1; WO2016097315A3; JP6952827B2; JP2020124203A; JP2018505662A; US10184008B2

Abstract

La descripción proporciona moléculas transportadoras capaces de transportar agentes de interés a través de la barrera hematoencefálica. También se proporcionan polinucleótidos que codifican moléculas transportadoras, métodos para fabricar moléculas transportadoras y métodos para usar moléculas transportadoras, por ejemplo, para el diagnóstico, prevención o tratamiento de enfermedades, trastornos o lesiones del sistema nervioso central. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Moléculas de transporte a través de la barrera hematoencefálica y usos de las mismas

ANTECEDENTES

La barrera hematoencefálica (BHE) protege y regula la homeostasis del cerebro e impide el paso libre de moléculas a la mayor parte del cerebro, lo que limita el tratamiento de muchas enfermedades cerebrales. El transporte de moléculas esenciales, como los nutrientes, los factores de crecimiento y las hormonas, se realiza a través de una serie de transportadores y receptores específicos que regulan el paso por las células endoteliales del cerebro. Por lo tanto, la administración de productos biológicos y otros fármacos en el cerebro representa un reto importante. Además, parece que existen mecanismos de transporte que eliminan rápidamente los anticuerpos del cerebro, posiblemente para evitar las respuestas inflamatorias debidas al acoplamiento del fragmento Fc con los ligandos efectores que promueven una respuesta proinflamatoria.

En la última década han surgido informes sobre el transporte de anticuerpos a través de la barrera hematoencefálica donde la unión al dominio extracelular de las moléculas transportadoras facilita la transcitosis del complejo receptoranticuerpo a través de la capa de células endoteliales.

La barrera hematoencefálica está formada principalmente por células endoteliales de los capilares cerebrales (BCEC) (Rubin y Staddon, Ann. Rev. Neurosci. 1999; 22:11-28), aunque otros tipos de células, como los pericitos, los astrocitos y las células neuronales, también desempeñan un papel importante en la función de la b He . Las BCEC tienen características específicas, como uniones estrechas, que impiden el transporte paracelular de compuestos pequeños y grandes (solubles en agua) de la sangre al cerebro (Brightman y Reese, J. Cell Biol. 1969; 40(3):648-77; Reese y Karnovsky, J. Cell Biol. 1967; 34(1):207-17). La BHE funciona como una barrera física, metabólica e inmunológica (Gaillard et al., Microvasc. Res. 2003; 65(1 ):24-31).

En un laboratorio de investigación se identificó un anticuerpo de dominio único (Llama) denominado FC5 que es capaz de atravesar la BHE (Muruganandam et al., FASEB ^{2 0}O¹; Abulrob et al., J. Neurochemistry 2005; 95:1201-1214; publicación PCT n.° WO 02/057445 A1, patente de los Estados Unidos n.° 8.383.107) utilizando selecciones de la superficie de células endoteliales del cerebro humano. FC5 tiene una reacción cruzada entre especies y puede unirse a las células endoteliales del cerebro de rata, ratón, macaco y humano. El supuesto receptor de este anticuerpo es TMEM30a, también conocido como proteína transmembrana 30^a, cdc50a, FLJ10856 o C6orf67. Se trata de un receptor huérfano cuya función exacta se desconoce. Se cree que desempeña un papel en la translocación de aminofosfolípidos, donde el complejo está compuesto por al menos dos proteínas: una subunidad alfa de la subfamilia P4 de ATPasas de tipo P y una subunidad beta de la familia CDC50-Lemp3 que incluye TMEM30a (cdc50a) (Chen et al., J. Immunol. 2011; 186:3215-3225; Muñoz-Martínez et al., Biochemical Pharmacology 2010; 80:793-800).

SUMARIO BREVE

La presente divulgación proporciona moléculas de transporte a través de la barrera hematoencefálica con propiedades similares al anticuerpo de camélido de dominio único FC5 que han sido reformuladas como moléculas funcionales adecuadas para su uso en seres humanos.

En un aspecto, la divulgación proporciona una molécula transportadora aislada que incluye un polipéptido de inmunoglobulina, donde el polipéptido comprende una región determinante de la complementariedad de la cadena pesada de inmunoglobulina-1 (H-CDR1), una región determinante de la complementariedad de la cadena pesada de inmunoglobulina-2 (H-CDR2) una región determinante de la complementariedad de la cadena pesada de inmunoglobulina-3 (H-CDR3), una región determinante de la complementariedad de la cadena ligera de inmunoglobulina-1 (L-CDR1), una región determinante de la complementariedad de la cadena ligera de inmunoglobulina-2 (L-CDR2), y una región determinante de la complementariedad de la cadena ligera de inmunoglobulina-3 (L-CDR3); donde las H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 son, respectivamente: (a) SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14; (b) SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 230 y SEQ ID NO: 231; (c) SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 230 y SEQ ID NO: 231; (d) SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67 y SEQ ID NO: 68; (e) SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 230 y SEQ ID NO: 231; (f) SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 230 y SEQ ID NO: 231; (g) SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 230 y SEQ ID NO: 231; (h) SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139 y SEQ ID NO: 140; (i) SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157 y SEQ ID NO: 158; (j) SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175 y SEQ ID NO: 176; (k) SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193 y SEQ ID NO: 194; o (1) SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 220 y ^sE^qID NO: 220; y donde la molécula transportadora puede atravesar la barrera hematoencefálica.

En otro aspecto, la divulgación proporciona una molécula transportadora aislada que incluye un polipéptido de inmunoglobulina, donde el polipéptido comprende: (a) una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada (VH) de inmunoglobulina al menos un 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 2 y una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera (VL) de inmunoglobulina al menos un 90 %, 95 %, 96 %,

idéntica a la SEQ ID NO: 11 (b) una secuencia de aminoácidos de VH al menos un 90 %, 95 %, 96 %, idéntica a la SEQ ID NO: 20 y una secuencia de aminoácidos de VL al menos un 90 %, 95 %, 96 %, idéntica a la SEQ ID NO: 29 (c) una secuencia de aminoácidos de VH al menos un 90 %, 95 %, 96 %, idéntica a la SEQ ID NO: 38 y una secuencia de aminoácidos de VL al menos un 90 %, 95 %, 96 %, idéntica a la SEQ ID NO: 47 (d) una secuencia de aminoácidos de VH al menos un 90 %, 95 %, 96 %, idéntica a la SEQ ID NO: 56 y una secuencia de aminoácidos de VL al menos un 90 %, 95 %, 96 %, idéntica a la SEQ ID NO: 65 (e) una secuencia de aminoácidos de VH al menos un 90 %, 95 %, 96 %, idéntica a la SEQ ID NO: 74 y una secuencia de aminoácidos de VL al menos un 90 %, 95 %, 96 %, idéntica a la SEQ ID NO: 83 (f) una secuencia de aminoácidos de VH al menos un 90 %, 95 %, 96 %,

idéntica a la SEQ ID NO: 92 y una secuencia de aminoácidos de VL al menos un 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 101 (g) una secuencia de aminoácidos de VH al menos un 90 %, 95 %, 96 %,

97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 110 y una secuencia de aminoácidos de VL al menos un 90 %, 95 %, 96 %,

97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 119 (h) una secuencia de aminoácidos de VH al menos un 90 %, 95 %, 96 %,

95 %, 96 95 %, 96 95 %, 96 95 %, 96

95 %, 96 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 173 (k) una secuencia de aminoácidos de VH al menos un 90 %, 95 %, 96 %,

97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 182 y una secuencia de aminoácidos de VL al menos un 90 %, 95 %, 96 %,

97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 191 (1) una secuencia de aminoácidos de VH al menos un 90 %, 95 %, 96 %,

97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 209 y una secuencia de aminoácidos de VL al menos un 90 %, 95 %, 96 %,

97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 218; o (m) una secuencia de aminoácidos de VH al menos un 90 %, 95 %,

96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 226 y una secuencia de aminoácidos de VL al menos un 90 %, 95 %,

96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 227; y donde la molécula transportadora puede atravesar la barrera hematoencefálica.

En otro aspecto, la divulgación proporciona una molécula transportadora aislada que incluye un polipéptido de inmunoglobulina, donde el polipéptido comprende un único dominio VH con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:

200. En ciertos aspectos, la molécula transportadora puede atravesar las células endoteliales microvasculares cerebrales BMVEC con mayor eficacia que FC5 en un ensayo de transcitosis in vitro.

Una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento puede incluir además una región constante de cadena pesada, o un fragmento de la misma, por ejemplo, incluida una región Fc y/o una región bisagra. Además, el polipéptido de inmunoglobulina de una molécula transportadora, como se proporciona en el presente documento, puede incluir un anticuerpo o un fragmento que pueda penetrar la BHE del mismo. En ciertos aspectos, el anticuerpo o el fragmento que pueda penetrar la BHE puede incluir dos o más subunidades, por ejemplo, una cadena pesada y una cadena ligera asociadas mediante enlaces disulfuro. En ciertos aspectos, la región constante de cadena pesada o su fragmento puede ser una región constante de IgG o un fragmento de la misma. En ciertos aspectos, el anticuerpo o fragmento del mismo puede ser un anticuerpo murino, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo multiespecífico, cualquier combinación de los mismos, o cualquier fragmento de unión a antígeno del mismo. En ciertos aspectos, el anticuerpo o fragmento del mismo puede ser una inmunoglobulina IgG completa que incluye dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. En ciertos aspectos, el fragmento que puede penetrar la BHE puede ser un fragmento Fv, un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fab', un fragmento dsFv, un fragmento scFv o un fragmento sc(Fv)2. Por ejemplo, el fragmento puede incluir un fragmento scFv, donde el ScFv comprende una VH y una VL fusionadas a través de un enlazador, o un fragmento dsFv, donde el dsFv comprende una VH y una VL fusionadas a través de un enlazador. En ciertos aspectos, el scFv o dsFv puede incluir, desde el extremo amino terminal: VH-L-VL, donde L es el enlazador. En ciertos aspectos, el enlazador puede ser (Gly4Ser)n, donde n es un número entero positivo seleccionado entre el grupo que consiste en 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10

(SEQ ID NO: 232), Ser(Gly4Ser)n, donde n es un número entero positivo seleccionado entre el grupo que consiste en 1,

2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 (SEQ ID NO: 233), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 234), GGGGSGGGGSGGGG (SEQ

ID NO: 235), GGGGSGGGGSGGGGSAL (SEQ ID NO: 236) o GGGGSGGGGSGGGGSA (SEQ ID NO: 237).

En ciertos aspectos, el dominio constante de la IgG o un fragmento del mismo puede incluir una o más sustituciones de aminoácidos en relación con un dominio constante de la IgG de tipo silvestre, donde la IgG modificada tiene una semivida alterada y/o una afinidad de unión alterada para el FcRn en comparación con la semivida de una IgG que tiene el dominio constante de la IgG de tipo silvestre. En un ejemplo, la IgG modificada puede tener una mayor semivida y/o una mayor afinidad de unión al FcRn en comparación con la semivida de una IgG que tenga el dominio constante de la IgG de tipo silvestre. En otro ejemplo, la IgG modificada tiene una semivida disminuida y/o una afinidad de unión a FcRn disminuida en comparación con la semivida de una IgG que tiene el dominio constante de la IgG de tipo silvestre. En ciertos aspectos, el dominio constante de la IgG o un fragmento del mismo puede incluir una o más sustituciones de aminoácidos en relación con un dominio constante de la IgG de tipo silvestre, donde la IgG modificada tiene una función efectora reducida y/o una

unión reducida a al menos una molécula efectora en comparación con la semivida de una IgG que tiene el dominio constante de la IgG de tipo silvestre. En ciertos aspectos, el dominio constante de IgG o un fragmento del mismo puede tener una glicosilación alterada en relación con un dominio constante de IgG de tipo silvestre, donde la IgG modificada tiene una función efectora reducida y/o una unión reducida a al menos una molécula efectora en comparación con la semivida de una IgG que tiene el dominio constante de IgG de tipo silvestre. En ciertos aspectos, el dominio constante de cadena pesada o fragmento del mismo de una molécula transportadora proporcionada en el presente documento puede ser un dominio constante de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana o un fragmento del mismo.

En ciertos aspectos, una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento puede incluir además un dominio constante de cadena ligera o un fragmento del mismo. Por ejemplo, el dominio constante de la cadena ligera o el fragmento del mismo puede ser un dominio constante kappa humano o un fragmento del mismo, o una región constante lambda humana o un fragmento de la misma.

En ciertos aspectos, una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento puede incluir además una carga útil asociada, donde la molécula transportadora puede transportar la carga útil a través de la BHE. En ciertos aspectos, la carga útil se fusiona, mediante un enlace peptídico, con el polipéptido derivado de inmunoglobulina. En ciertos aspectos, la carga útil se conjuga químicamente con el polipéptido derivado de inmunoglobulina. En ciertos aspectos, la carga útil se asocia con el polipéptido derivado de inmunoglobulina mediante enlaces no covalentes.

Una carga útil puede incluir, por ejemplo, un agente antimicrobiano, un agente terapéutico, un profármaco, un péptido, una proteína, una enzima, un lípido, un modificador de la respuesta biológica, un agente farmacéutico, una linfocina, un anticuerpo heterólogo o un fragmento del mismo, un marcador detectable, una molécula de polietilenglicol (PEG) o una combinación de dos o más de los agentes. Por ejemplo, la carga útil puede incluir un polipéptido neuroactivo, por ejemplo, factores neurotróficos, factores endocrinos, factores de crecimiento, factores paracrinos, factores de liberación hipotalámica, polipéptidos neurotransmisores, polipéptidos agonistas para un receptor expresado por una célula del SNC, polipéptidos implicados en una enfermedad de almacenamiento lisosomal o cualquier combinación de los mismos. En otro ejemplo, la carga útil puede incluir un antagonista del receptor de IL-1 (IL-1Ra), dalargina, un interferón p, factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF), receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), neurotrofina-4/5, neurotrofina (NT)-3, una neurturina, neurregulina, una netrina, factor neurotrófico ciliar (CNTF), factor de células madre (SCF), una semaforina, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento transformante (TGF)-cx, TGF-B, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), herregulina, artemina, persefina, interleucinas, factor estimulante de colonias (CSF) de granulocitos, CSF de granulocitos y macrófagos, cardiotrofina-1, hedgehog, factor inhibidor de la leucemia (LIF), midcina, pleiotrofina, eritropoyetina (EpO), proteínas morfogenéticas óseas (BMP), netrinas, saposinas, cualquier fragmento de las mismas o cualquier combinación de los mismos. En un aspecto, una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento puede incluir una región constante de cadena pesada de IgG humana o un fragmento de la misma, y una región constante de cadena ligera humana, y donde el polipéptido IL-1Ra está fusionado al extremo C de la región constante de cadena pesada.

En ciertos aspectos, la carga útil puede incluir un anticuerpo heterólogo o un fragmento del mismo, por ejemplo, un anticuerpo heterólogo o un fragmento del mismo que se une específicamente a una o más de beta-secretasa 1 (BACE1), CD20, CD25, CD52, CD33, CTLA-4, tenascina, integrina alfa-4 (a4), IL-12, IL-23, la subunidad p40 de IL-12/IL-23, amiloide-13 (AI3), huntingtina, factor de crecimiento nervioso (NGF), receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR/HER1) receptor del factor de crecimiento epidérmico humano 2 (HER2/neu), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), TrkA, TNF-a, TNF-13, a-sinucleína Tau, apolipoproteína E4 (ApoE4), proteína priónica (PrP), cinasa 2 de repetición rica en leucina (LRRK2), parkina, presenilina 1, presenilina 2, gamma secretasa, receptor de muerte 6 (DR6), proteína precursora de amiloide (APP), receptor de neurotrofina p75 (p75NTR), caspasa 6, un factor neurotrófico y/o un receptor de factor neurotrófico. En ciertos aspectos, una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento puede unirse a células endoteliales microvasculares cerebrales (BMVEC), por ejemplo, BMVEC humanas, de macaco cangrejero, murinas, de rata o bovinas. En ciertos aspectos, las BMVEC son células endoteliales capilares cerebrales (BCEC). En ciertos aspectos, una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento puede pasar a través de una monocapa de BCEC en un ensayo de transcitosis in vitro.

En ciertos aspectos, una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento puede competir con el anticuerpo de dominio único FC5 o Bbbt0241 por la unión a las células endoteliales del cerebro. Algunos ejemplos de moléculas transportadoras de este tipo incluyen los dominios VH y VL de Bbbt0626, Bbbt0727, Bbbt0632, Bbbt0654, Bbbt0726, Bbbt0732 o Bbbt0754.

En ciertos aspectos, una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento no compite con el anticuerpo de dominio único FC5 o Bbbt0241 por la unión a las células endoteliales del cerebro. Algunos ejemplos de moléculas transportadoras de este tipo son los dominios VH y VL de Bbbt0643, Bbbt0674, Bbbt0755, Bbbt0351, Bbbt0579 o Bbbt0671.

En ciertos aspectos, una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento, cuando se conjuga con dinorfina y se administra periféricamente en un modelo de rata, puede atravesar la BHE induciendo así la diuresis. En ciertos aspectos, una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento, cuando se fusiona con IL-1 Ra y se administra periféricamente en un ensayo de ligadura parcial del nervio ciático de rata, puede atravesar la BHE reduciendo así el dolor neuropático. En ciertos aspectos, una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento, cuando se administra periféricamente en un modelo de ratón, se localiza en la corteza del cerebelo, la materia gris del cerebro, la materia gris de la médula espinal, el puente de Varolio, o una combinación de los mismos, como se mide mediante autorradiografía cuantitativa de cuerpo entero.

La divulgación proporciona además una composición que incluye una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento, y un portador.

La divulgación proporciona además un polinucleótido aislado que incluye una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento, o un fragmento o subunidad de la misma. En ciertos aspectos, la molécula de ácido nucleico puede codificar una VH, una VL, o una VH y una VL, donde la molécula de ácido nucleico comprende SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 29 o SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 47 o SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 47; SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 65 o SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 83 o SEQ ID NO: 74 y SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 101 o SEQ ID NO: 92 y SEQ ID NO: 101; SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 119 o SEQ ID NO: 110 y SEQ ID NO: 119; SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 137 o SEQ ID NO: 128 y SEQ ID NO: 137; SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 146 y SEQ ID NO: 155; SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 173 o SEQ ID NO: 164 y SEQ ID NO: 173; SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 191 o SEQ ID NO: 182 y SEQ ID NO: 191; SEQ ID NO: 200; SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 218 o SEQ ID NO: 209 y SEQ ID NO: 218; o SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 227 o SEQ ID NO: 226 y 227. En ciertos aspectos, el polinucleótido como se proporciona en el presente documento incluye además un ácido nucleico que codifica una carga útil, como las descritas anteriormente.

La divulgación proporciona además una composición que incluye dos o más moléculas de ácido nucleico que codifican una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento, o un fragmento o subunidad de la misma. En ciertos aspectos, las dos o más moléculas de ácido nucleico pueden incluir, respectivamente, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 47; SEQ ID NO: 56 y SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 74 y SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 92 y SEQ ID NO: 101; SEQ ID NO: 110 y SEQ ID NO: 119; SEQ ID NO: 128 y SEQ ID NO: 137; SEQ ID NO: 146 y SEQ ID NO: 155; SEQ ID NO: 164 y SEQ ID NO: 173; SEQ ID NO: 182 y SEQ ID NO: 191; SEQ ID NO: 209 y SEQ ID NO: 218; o SEQ ID NO: 226 y SEQ ID NO: 227. En ciertos aspectos, la composición puede incluir además una molécula de ácido nucleico que codifica una carga útil. En ciertos aspectos, las dos o más moléculas de ácido nucleico de la composición están situadas en el mismo vector. En ciertos aspectos, las dos o más moléculas de ácido nucleico están situadas en al menos dos vectores separados.

La divulgación proporciona además un vector que incluye un polinucleótido aislado como se proporciona en el presente documento, o las dos o más moléculas de ácido nucleico de una composición como se proporciona en el presente documento.

En ciertos aspectos, una molécula de ácido nucleico polinucleotídica como la proporcionada en el presente documento puede estar asociada de forma operativa con uno o más promotores.

En ciertos aspectos, la divulgación proporciona una célula hospedadora aislada que incluye un vector como se proporciona en el presente documento, o una composición de dos o más vectores como se proporciona en el presente documento. La divulgación proporciona además un método de fabricación de una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento, donde el método incluye (a) cultivar la célula hospedadora proporcionada; y (b) aislar la molécula transportadora o el fragmento o subunidad de la misma. En ciertos aspectos, el método incluye además (c) conjugar la molécula transportadora o el fragmento o subunidad de la misma con una carga útil.

En ciertos aspectos, la divulgación proporciona un reactivo de diagnóstico que incluye una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento, una composición como se proporciona en el presente documento, un polinucleótido como se proporciona en el presente documento, un vector como se proporciona en el presente documento o una célula hospedadora como se proporciona en el presente documento. En ciertos aspectos, la divulgación proporciona un kit que incluye una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento, una composición como se proporciona en el presente documento, un polinucleótido como se proporciona en el presente documento, un vector como se proporciona en el presente documento o una célula hospedadora como se proporciona en el presente documento.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un método para tratar una enfermedad, trastorno o lesión del sistema nervioso central (SNC), donde el método incluye administrar periféricamente a un sujeto que necesita tratamiento una composición que incluye una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento, donde la molécula transportadora comprende un agente terapéutico capaz de tratar la enfermedad, el trastorno o la lesión tras su exposición al SNC después de su transporte a través de la BHE, y donde una cantidad del agente terapéutico suficiente para tratar la enfermedad, el trastorno o la lesión se transporta a través de la BHE, tratando así la enfermedad, el trastorno o la lesión. En ciertos aspectos, el agente terapéutico se libera de la molécula transportadora tras su entrada en el SNC. En ciertos aspectos, la enfermedad, el trastorno o la lesión del SNC pueden ser, sin limitación, esclerosis múltiple (EM), esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, lesión medular, lesión cerebral traumática, accidente cerebrovascular, dolor neuropático, neurodegeneración, neuroinflamación, leucoencefalopatía multifocal progresiva (LMP), encefalomielitis (EPL), mielolisis pontina central (MPC), adrenoleucodistrofia, enfermedad de Alexander, Enfermedad de Pelizaeus Merzbacher (PMZ), leucodistrofia de células globoides (enfermedad de Krabbe), degeneración walleriana, neuritis óptica, mielitis transversa, lesión post radiación, complicaciones neurológicas de la quimioterapia, neuropatía óptica isquémica aguda, deficiencia de vitamina E, síndrome de deficiencia aislada de vitamina E, síndrome de Bassen-Kornzweig, síndrome de Marchiafava-Bignami, leucodistrofia metacromática, neuralgia del trigémino, parálisis de Bell, tumores primarios, metástasis secundarias o cualquier combinación de las mismas. En un aspecto, el agente terapéutico es el antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-IRa), y la enfermedad, el trastorno o la lesión es dolor neuropático.

La divulgación proporciona además un método para aumentar la exposición del SNC de un sujeto a un agente, donde el método incluye el acoplamiento del agente a una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento y la administración periférica del agente acoplado. La divulgación proporciona además un método de transporte de un agente a través de la BHE que incluye el acoplamiento del agente a una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento, de manera que la molécula transportadora transporta el agente acoplado a ella a través de la BHE.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS/FIGURAS

La FIGURA 1 muestra el grado de transcitosis de Bbbt0351 a través de una línea celular endotelial cerebral inmortalizada de rata, (SV-ARBEC) (panel A), y de células endoteliales cerebrales primarias de rata (panel B). Los resultados se muestran como permeabilidad aparente (en cm/min) en el eje Y. A: comparación de la transcitosis de Bbbt0351-Fc o FC5-Fc y de un anticuerpo VHH de control negativo a través de las células SV-ARBEC medida por espectrometría de masas nanoLC-SRM (Haqqani A. S., et al., Method. Mol. Pharmaceutics.

2013; 10, 1542-1556); B: comparación directa de la transcitosis de FC5-Fc y Bbbt0351-Fc a través de células endoteliales primarias de cerebro de rata medida por espectrometría de masas nanoLC-SRM. Tanto FC5 como Bbbt0351 se fusionaron genéticamente con la región bisagra de un Fc de IgG1 humana; C. Comparación de la exposición cerebral de FC5-Fc y Bbbt0351-Fc en el cerebro de ratón, durante un periodo de 24 horas, después de la inyección intravenosa a 10 mg/kg; los ratones se perfundieron con PBS, se extrajeron los cerebros y se homogeneizaron en presencia de un detergente suave para liberar la molécula dirigida a la BHE en la fracción soluble, después de la centrifugación. La exposición en el cerebro se midió mediante la tecnología de ensayo Mesoscale Discovery (MSD). MSD utiliza detección por electroquimioluminiscencia para detectar los eventos de unión en placas de matriz. Se utiliza un anticuerpo de captura Fc monoclonal de ratón anti-humano para capturar el analito, en este caso FC5-Fc o Bbbt0351-Fc, y este evento de captura se detecta posteriormente mediante la unión de una IgG de oveja anti-humano marcada con fluorescencia (H+L). D: Comparación de la proporción de FC5-Fc y Bbbt0351-Fc inyectados en el cerebro con respecto a los del plasma en distintos momentos durante las primeras 24 horas después de la dosis i.v.

La FIGURA 2A muestra un esquema de la construcción de Fv monocatenario (scFv) Bbbt0241, una versión humanizada de FC5, y la posterior adición de las regiones constantes de IgG1 y kappa humanas para formar una molécula IgG completa o una molécula Fab. La FIGURA 2B muestra la construcción de una biblioteca de scFv. El anticuerpo de dominio FC5 se clonó direccionalmente a través de los sitios de restricción de las endonucleasas S fil y Xhol en un vector aceptor de cadenas pesadas que contenía una biblioteca de cadenas ligeras descrita previamente durante la creación de la biblioteca CAT 2.0 (Lloyd C, et al., Protein Eng Des Sel 2009; 22 (3); 159-68).

La FIGURA 3A muestra un esquema del ensayo de tecnología de microvolumen de fluorescencia (FMAT) (Miraglia S, et al., J Biomol Screen 1999; 4 (4); 193-204). El scFv de interés se representa como un óvalo con un marcador de histidina, que se une a un anticuerpo monoclonal anti-his de ratón, que a su vez se une a un anticuerpo monoclonal anti-ratón marcado con AlexaFluor647. El complejo, cuando se une a las células endoteliales del cerebro a través del scFv, da lugar a zonas de fluorescencia en las células. Esta fluorescencia basada en células se clasifica y representa como unidades de fluorescencia (FL-1). La FIGURA 3B muestra la unión de diluciones crecientes de FC5 DAb y Bbbt0241 scFv a células B.End3 en el ensayo FMAT. Los resultados se expresan como unidades de fluorescencia (FL-1). La FIGURA 3C muestra fotografías de células a las que se une Dab FC5 en el ensayo de competición FMAT. Se incubó una cantidad constante de Dab FC5 con cantidades crecientes de Bbbt0241 o de hIgG1 de control. La FIGURA 3D es un resumen gráfico de los datos presentados en la FIGURA 3C.

La FIGURA 4A muestra un esquema de un solo pocillo del ensayo de transcitosis in vitro. La FIGURA 4B proporciona los valores de Papp que muestran el alcance del transporte in vitro de FC5-Fc, hIgG1 Bbbt0241 y hIgG1 NIP228, una IgG de control negativo de isotipo que se generó contra un hapteno (nitrofenol conjugado a BSA) a través de células SV-ARBEC en el ensayo de transcitosis in vitro.

La FIGURA 5A es un esquema de una molécula scFv conjugada con el agonista K-opioide dinorfina. La FIGURA 5B muestra el diseño del estudio para el modelo de diuresis descrito en los ejemplos. La FIGURA 5C muestra la producción de orina a lo largo del tiempo en ratas a las que se administra Bbbt0241 hIgG1TM conjugado a dinorfina o libre, en comparación con el control negativo NIP228 hIgG1TM conjugado con dinorfina o libre. n=6 para cada grupo. Se muestran los valores de P frente al vehículo y frente al control negativo. Los datos se analizaron mediante ANOVA bifactorial con el tiempo y el tratamiento como factores dependientes. La significación estadística posterior se obtuvo mediante la prueba post hoc de Bonferroni.

La FIGURA 6A muestra los resultados de la competición FMAT utilizando cantidades constantes de los scFv miméticos de FC5 con concentraciones crecientes de IgG Bbbt0241. La FIGURA 6B muestra los resultados de la competición FMAT utilizando cantidades constantes de los scFvs no miméticos similares a FC5 con concentraciones crecientes de IgG Bbbt0241.

La FIGURA 7A muestra los resultados de producción de orina tras la administración de conjugados seleccionados de miméticos y no miméticos de FC5 y dinorfina (formato IgG) a ratas. n = 6. Los datos se analizaron mediante ANOVA bifactorial con el tiempo y el tratamiento como factores dependientes. La significación estadística posterior se obtuvo mediante la prueba post hoc de Bonferroni. Se muestran los valores de P. La FIGURA 7B muestra las curvas de dosis-respuesta de producción de orina tras la administración de NIP228-IgG conjugada con dinorfina (barras negras) y Bbbt0626-IgG (barras grises) a ratas. n = 6. Debido al número de animales que se sometieron a la prueba, el experimento se llevó a cabo durante 2 días. Los resultados se presentan como los datos combinados de ambos estudios.

La FIGURA 8 es una viñeta que muestra una cirugía esquemática realizada en el ensayo de ligadura parcial del nervio ciático.

La FIGURA 9 muestra el efecto de las fusiones de mimético de FC5-ILIRa en la reversión de la hiperalgesia inducida por la ligadura parcial del nervio ciático en ratas. n = 9-10 por grupo. Los datos se analizaron mediante ANOVA bifactorial con el tiempo y el tratamiento como factores dependientes. La significación estadística posterior se obtuvo mediante la prueba post hoc de Tukey. Se muestran los valores de P.

La FIGURA 10 muestra el efecto de dosis crecientes de una fusión de Bbbt0626-IL1Ra sobre la hiperalgesia inducida por la ligadura parcial del nervio. n = 7-8 por grupo. Los datos se analizaron mediante ANOVA bifactorial con el tiempo y el tratamiento como factores dependientes. La significación estadística posterior se obtuvo mediante la prueba post hoc de Bonferroni. Se muestran los valores de P.

Las FIGURAS 11A y 11B comparan el efecto de la administración intravenosa frente a la subcutánea de una fusión de Bbbt0626-IL1Ra sobre la hiperalgesia inducida por la ligadura parcial del nervio. n = 7-8 por grupo. Los datos se analizaron mediante ANOVA bifactorial con el tiempo y el tratamiento como factores dependientes. La significación estadística posterior se obtuvo mediante la prueba post hoc de Bonferroni. Se muestran los valores de P.

Las FIGURAS 12A y 12B comparan la dosis única y repetida de una fusión de Bbbt0626-IL1Ra en la hiperalgesia inducida por la ligadura parcial del nervio. n = 8-10 por grupo. Los datos se analizaron mediante ANOVA bifactorial con el tiempo y el tratamiento como factores dependientes. La significación estadística posterior se obtuvo mediante la prueba post hoc de Bonferroni. Se muestran los valores de P.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Definiciones

Como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno", "una" y "el/la" incluyen referentes plurales salvo que el contexto claramente dicte lo contrario. En el presente documento los términos "un" (o "uno(a)"), así como los términos "uno(a) o más" y "al menos uno(a)" pueden usarse indistintamente.

Además, cuando en el presente documento se usa "y/o" debe interpretarse como la divulgación específica de cada una de las dos características o componentes especificados con o sin el otro. Por tanto, el término "y/o" como se usa en una expresión como "A y/o B" en el presente documento pretende incluir "A y B", "A o B", "A" (solo) y "B" (solo). Del mismo modo, el término "y/o" como se usa en una expresión como "A, B y/o C" pretende incluir cada uno de las siguientes realizaciones: A, B y C; A, B o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo); B (solo); y C (solo).

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto habitual en la materia a la que se refiere la presente divulgación. Por ejemplo, el Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2.a ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3.a ed., 1999, Academic Press; y el Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revisado, 2000, Oxford University Press, proporcionan a un experto un diccionario general de muchos de los términos utilizados en la presente divulgación.

Las unidades, prefijos y símbolos se indican en su forma aceptada en el Sistema Internacional de Unidades (SI). Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. A menos que se indique lo contrario, las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en orientación de amino a carboxilo.

Siempre que las realizaciones se describan con la expresión "que comprende", también se proporcionan realizaciones por lo demás análogas descritas en términos de "que consiste en" y/o "que consiste esencialmente en".

Los aminoácidos se citan en el presente documento por sus símbolos de tres letras convencionales o por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB. Asimismo, los nucleótidos se citan por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados.

Los términos "anticuerpo" o "inmunoglobulina", utilizados indistintamente en el presente documento, incluyen los anticuerpos enteros y cualquier fragmento de unión a antígeno o cadenas simples de los mismos.

Un anticuerpo típico comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Algunos anticuerpos de camélidos descritos en el presente documento comprenden dos cadenas H pero no cadenas L. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está compuesta por tres dominios: CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está compuesta por un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL está formada por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina a los tejidos del hospedador o factores, incluidas diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (C1q) del sistema del complemento clásico.

El término "retromutación a la línea germinal" significa que los aminoácidos en posiciones específicas de un anticuerpo se vuelven a mutar a los de la línea germinal.

El término "anticuerpo" puede hacer referencia a una molécula de inmunoglobulina que reconoce y se une específicamente a una diana, tal como una proteína, polipéptido, péptido, carbohidrato, polinucleótido, lípido o combinaciones de los anteriores por medio de al menos un sitio de reconocimiento de antígenos en la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" abarca anticuerpos policlonales intactos, anticuerpos monoclonales intactos, fragmentos de anticuerpos (Tales como fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv), mutantes de Fv monocatenario (scFv), anticuerpos multiespecíficos, tales como anticuerpos biespecíficos generados a partir de dos anticuerpos intactos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, proteínas de fusión que comprenden una porción de determinación antigénica de un anticuerpo y cualquier otra molécula de inmunoglobulina modificada que comprende un sitio de reconocimiento de antígenos, en tanto que los anticuerpos muestren una actividad biológica concreta. Un anticuerpo puede ser de cualquiera de las cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, o subclases (isotipos) de las mismas (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2), en función de la identidad de sus dominios constantes de cadena pesada denominados alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente. Las diferentes clases de inmunoglobulinas tienen estructuras de subunidades y configuraciones tridimensionales diferentes y bien conocidas. Los anticuerpos pueden estar desnudos o conjugados con otras moléculas como toxinas, radioisótopos, etc.

El término "fragmento de unión a antígeno" se refiere a una porción de un anticuerpo intacto y se refiere a las regiones variables que determinan la complementariedad de un anticuerpo intacto. Algunos ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero sin limitación, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, anticuerpos lineales, anticuerpos monocatenarios (por ejemplo, scFvs) y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

Un "anticuerpo monoclonal" se refiere a una población homogénea de anticuerpos que participan en el reconocimiento y la unión altamente específicos a un único determinante antigénico o epítopo. Esto contrasta con los anticuerpos policlonales que suelen incluir diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes antigénicos. El término "anticuerpo monoclonal" abarca tanto los anticuerpos monoclonales intactos y de longitud completa como los fragmentos de anticuerpos (como Fab, Fab', F(ab')2, Fv), los mutantes monocatenarios (scFv), las proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo y cualquier otra molécula de inmunoglobulina modificada que comprenda un sitio de reconocimiento de antígeno. Además, "anticuerpo monoclonal" se refiere a dichos anticuerpos fabricados de cualquier manera, incluyendo, pero sin limitación, por hibridoma, selección de fagos, expresión recombinante y animales transgénicos.

El término "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo derivado de una inmunoglobulina no humana (por ejemplo, murina), que ha sido diseñado para contener secuencias mínimas no humanas (por ejemplo, murinas). Normalmente, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas en las que los restos de la región determinante de la complementariedad (CDR) se sustituyen por restos de CDR de una especie no humana (por ejemplo, ratón, rata, conejo o hámster) que tienen una especificidad, una afinidad y/o una capacidad de interés (Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536). En algunos casos, los restos de la región marco (FR) de Fv de una inmunoglobulina humana se sustituyen por los restos correspondientes de un anticuerpo de una especie no humana que tiene una especificidad, una afinidad y/o una capacidad de interés.

Los anticuerpos humanizados pueden modificarse adicionalmente mediante la sustitución de restos adicionales, ya sea en la región marco de Fv y/o dentro de los restos no humanos sustituidos, para refinar y optimizar la especificidad, afinidad y/o capacidad del anticuerpo. En general, los anticuerpos humanizados comprenderán sustancialmente todos de al menos uno y normalmente dos o tres dominios variables que contienen todas o sustancialmente todas las regiones CDR que corresponden a la inmunoglobulina no humana, mientras que todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. Un anticuerpo humanizado también pueden comprender al menos una porción de una región constante o un dominio (Fc) de inmunoglobulina, normalmente de una inmunoglobulina humana. Algunos ejemplos de métodos utilizados para generar anticuerpos humanizados se describen en las patentes de los Estados Unidos n.° 5.225.539 o 5.639.641.

Una "región variable" de un anticuerpo se refiere a la región variable de cadena ligera del anticuerpo o la región variable de cadena pesada del anticuerpo, ya sea solo o en combinación. Cada una de las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera consisten en cuatro regiones marco (FR) conectadas por tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR), también conocidas como regiones hipervariables. Las CDR en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por las regiones FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos. Existen al menos dos técnicas para determinar las CDR: (1) una estrategia basada en la variabilidad de la secuencia entre especies (es decir, Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5.a ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.)); y (2) una estrategia basada en estudios cristalográficos de complejos antígeno-anticuerpo (Al-lazikani et al. (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)). Además, en la técnica se utilizan a veces combinaciones de estas dos estrategias para determinar las CDR.

El sistema de numeración de Kabat se utiliza generalmente cuando se hace referencia a un resto en el dominio variable (aproximadamente los restos 1-107 de la cadena ligera y los restos 1-113 de la cadena pesada) (por ejemplo, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)).

La numeración de la posición de los aminoácidos como en Kabat, se refiere al sistema de numeración utilizado para los dominios variables de la cadena pesada o los dominios variables de la cadena ligera de la compilación de anticuerpos en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991). Véase la tabla 1 a continuación. Usando este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos aminoácidos o más correspondientes a un acortamiento o inserción en una FR o CDR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de la cadena pesada puede incluir una única inserción de aminoácidos (resto 52a según Kabat) después del resto 52 de H2 y restos insertados (por ejemplo, los restos 82a, 82b y 82c, etc. según Kabat) después del resto 82 de la FR de cadena pesada.

TABLA 1

La numeración de Kabat de los restos puede determinarse para un anticuerpo dado mediante alineamiento en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada de Kabat "estándar". Chothia se refiere en cambio a la ubicación de los bucles estructurales (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). El final del bucle de CDR-H1 de Chothia cuando se numera utilizando la convención de numeración de Kabat varía entre H32 y H34 dependiendo de la longitud del bucle (esto se debe a que el esquema de numeración de Kabat sitúa las inserciones en H35A y H35B; si no están presentes ni 35A ni 35B, el bucle termina en 32; si solo está presente 35A, el bucle termina en 33; si están presentes tanto 35A como 35B, el bucle termina en 34). Las regiones hipervariables de AbM representan un compromiso entre las CDR de Kabat y los bucles estructurales de Chothia, y son utilizadas por el software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular.

IMGT (ImMunoGeneTics) también proporciona un sistema de numeración para las regiones variables de las inmunoglobulinas, incluidas las CDR. Véase, por ejemplo, Lefranc, M.P. et al., Dev. Comp. Immunol. 27: 55-77(2003. El sistema de numeración IMGT se basó en un alineamiento de más de 5.000 secuencias, datos estructurales y la caracterización de bucles hipervariables, y permite comparar fácilmente las regiones variables y las CDR de todas las especies. Según el esquema de numeración del IMGT, la H-CDR1 se encuentra en las posiciones 26 a 35, la H-CDR2 en las posiciones 51 a 57, la H-CDR3 en las posiciones 93 a 102, la L-CDR1 en las posiciones 27 a 32, la L-CDR2 en las posiciones 50 a 52 y la L-CDR3 en las posiciones 89 a 97.

Como se usa a lo largo de la memoria descriptiva, las secuencias de las CDR de VH descritas corresponden a las ubicaciones clásicas de numeración de Kabat, es decir, la H-CDR1 de Kabat está en las posiciones 31-35, la H-CDR2 está en las posiciones 50-65 y la H-CDR3 está en las posiciones 95-102. Las L-CDR2 y L-CDR3 también corresponden a las ubicaciones clásicas de la numeración de Kabat, a saber, las posiciones 50-56 y 89-97, respectivamente. Como se usan en el presente documento, los términos "L-CDR1" o "CDR1 de cadena ligera" corresponden a las secuencias situadas en las posiciones 23-34 de Kabat en la VL (en cambio, la ubicación clásica de la L-CDR1 según el esquema de numeración de Kabat corresponde a las posiciones 24-34).

Como se usa en el presente documento, el término "región Fc" incluye los polipéptidos que comprenden la región constante de un anticuerpo, excluyendo el primer dominio de inmunoglobulina de la región constante (por ejemplo, CH1), y fragmentos de los mismos. Por tanto, Fc se refiere a los dos últimos dominios constantes de IgA, IgD e IgG y los tres últimos dominios constantes de IgE e IgM y opcionalmente, la región bisagra flexible N-terminal de estos dominios. Para IgA e IgM, la región Fc puede incluir la cadena J. Para IgG, Fc comprende los dominios de inmunoglobulina Cgamma2 y Cgamma3 (Cy2 y Cy3) y opcionalmente, la región bisagra entre Cgamma1 (Cy1) y Cgamma2 (Cy2).

Aunque los límites de la región Fc pueden variar, la región Fc de la cadena pesada de IgG humana se define generalmente para comprender los restos C226 o P230 en su extremo carboxilo, en donde la numeración es según el índice de EU establecido en Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Fc puede referirse a esta región de forma aislada, o esta región en el contexto de un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o proteína de fusión de Fc.

Se han observado polimorfismos en diversas posiciones diferentes en las regiones constantes de anticuerpo (por ejemplo, las posiciones de Fc que incluyen, pero sin limitación, las posiciones 270, 272, 312, 315, 356 y 358, numeradas según el índice de EU expuesto en Kabat) y por tanto, pueden existir ligeras diferencias entre la secuencia presentada y las secuencias de la técnica anterior. Las formas polimórficas de las inmunoglobulinas humanas están bien caracterizadas. Actualmente se conocen 18 alotipos de Gm: G1m (1, 2, 3, 17) o G1m (a, x, f, z), G2m (23) o G2m (n), G3m (5, 6, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 21, 24, 26, 27, 28) o G3m (b1, c3, b3, b0, b3, b4, s, t, g1, c5, u, v, g5) (Lefranc, et al., The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Pergamon, Oxford, págs. 43-78 (1990); Lefranc, G. et al., 1979, Hum. Genet: 50, 199-211). Se contempla que los anticuerpos de la presente divulgación pueden incorporar cualquier alotipo, isoalotipo o haplotipo de cualquier gen de inmunoglobulina, y por lo tanto no están limitados al alotipo, isoalotipo o haplotipo de las secuencias proporcionadas en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, la expresión "proteína de fusión Fc" abarca proteínas (por ejemplo, compuestos conjugados de la presente divulgación) que comprenden un dominio Fc de longitud completa, así como proteínas que comprenden fragmentos de dominio Fc (por ejemplo, un dominio CH2 completo, un dominio CH3 completo, un fragmento CH2, un fragmento CH3 o combinaciones de los mismos). Una proteína de fusión de Fc también puede comprender la totalidad o una parte de la región bisagra.

La expresión "anticuerpo humano" significa un anticuerpo producido por un ser humano o un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a un anticuerpo producido por un ser humano realizado mediante cualquier técnica conocida en la técnica. Esta definición de anticuerpo humano incluye anticuerpos intactos o de longitud completa, fragmentos de los mismos, y/o anticuerpos que comprenden al menos un polipéptido humano de cadena pesada y/o ligera como, por ejemplo, un anticuerpo que comprenda polipéptidos murinos de cadena ligera y de cadena pesada humana.

La expresión "anticuerpos quiméricos" se refiere a los anticuerpos en donde la secuencia de aminoácidos de la molécula de inmunoglobulina procede de dos o más especies. Normalmente, la región variable de las cadenas ligeras y pesadas corresponde a la región variable de los anticuerpos derivados de una especie de mamífero (por ejemplo, ratón, rata, conejo, etc.) con una especificidad, una afinidad y/o una capacidad de interés, mientras que las regiones constantes son homólogas a las secuencias de los anticuerpos derivados de otra (generalmente humana) para evitar provocar una respuesta inmunitaria en esa especie.

La "afinidad de unión" se refiere generalmente a la fuerza de la suma total de las interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique lo contrario, como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre los miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su compañera Y puede representarse generalmente por la constante de disociación (Kd). La afinidad puede medirse por métodos comunes conocidos en la técnica, incluidos los descritos en el presente documento. Los anticuerpos de baja afinidad se unen generalmente al antígeno de forma lenta y tienden a disociarse con facilidad, mientras que los anticuerpos de alta afinidad se unen generalmente al antígeno de forma más rápida y tienden a permanecer unidos durante más tiempo. En la técnica se conocen diversos métodos para medir la afinidad de unión, cualquiera de los cuales puede utilizarse para los fines de la presente divulgación.

La "potencia" se expresa normalmente como un valor de CI⁵⁰, en nM o pM, a menos que se indique lo contrario. La CI⁵⁰es la concentración inhibidora media de una molécula de anticuerpo. En los ensayos funcionales, la CI⁵⁰es la concentración que reduce una respuesta biológica en un 50 % de su máximo. En los estudios de unión de ligandos, la CI⁵⁰es la concentración que reduce la unión del receptor en un 50 % del nivel de unión específico máximo. La CI⁵⁰puede calcularse por cualquier medio conocido en la técnica.

El factor de mejora de la potencia de los anticuerpos o polipéptidos de la divulgación en comparación con un anticuerpo de referencia puede ser de al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 6 veces, al menos aproximadamente 8 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 30 veces, al menos aproximadamente 40 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 60 veces, al menos aproximadamente 70 veces, al menos aproximadamente 80 veces, al menos aproximadamente 90 veces, al menos aproximadamente 100 veces, al menos aproximadamente 110 veces, al menos aproximadamente 120 veces, al menos aproximadamente 130 veces, al menos aproximadamente 140 veces, al menos aproximadamente 150 veces, al menos aproximadamente 160 veces, al menos aproximadamente 170 veces o al menos aproximadamente 180 veces o más.

Un polipéptido, anticuerpo, polinucleótido, vector, célula o composición que está "aislado" es un polipéptido, anticuerpo, polinucleótido, vector, célula o composición que está en una forma que no se encuentra en la naturaleza. Los polipéptidos, anticuerpos, polinucleótidos, vectores, células o composiciones aislados incluyen aquellos que han sido purificados hasta el punto de que ya no están en la forma en que se encuentran en la naturaleza. En algunas realizaciones, un anticuerpo, polinucleótido, vector, célula o composición que se aísla es sustancialmente puro.

Por "sujeto" o "individuo" o "animal" o "paciente" o "mamífero" se entiende cualquier sujeto, particularmente un sujeto mamífero, para el que está indicado un diagnóstico, pronóstico o terapia. Los sujetos mamíferos incluyen seres humanos, animales domésticos, animales de granja, animales de deporte y animales de zoológico, incluidos, por ejemplo, seres humanos, primates no humanos, perros, gatos, cobayas, conejos, ratas, ratones, caballos, ganado bovino, osos y similares.

La expresión "composición farmacéutica" se refiere a una preparación que se encuentra en una forma tal que permite que la actividad biológica del principio activo sea eficaz y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos a un sujeto al que se administraría la composición. Dicha composición puede ser estéril.

Una "cantidad eficaz" de un anticuerpo como se divulga en el presente documento es una cantidad suficiente para llevar a cabo un fin específicamente indicado. Una "cantidad eficaz" puede determinarse empíricamente y de una manera rutinaria, en relación con el fin indicado.

La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un anticuerpo u otro fármaco eficaz para "tratar" o "prevenir" una enfermedad o trastorno en un sujeto o mamífero.

El término "marcador", cuando se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto o composición que está conjugado directa o indirectamente al anticuerpo, a fin de generar un anticuerpo "marcado". El marcador puede ser detectable por sí mismo (por ejemplo, marcadores radioisotópicos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, pueden catalizar la alteración química de un compuesto o composición de sustrato que sea detectable.

Los términos como "tratando" o "tratamiento" o "tratar" o "aliviando" o "aliviar" se refieren tanto a (1) medidas terapéuticas que curan, frenan, alivian los síntomas de y/o que detienen la progresión de una patología o trastorno diagnosticado y a (2) medidas profilácticas o preventivas que previenen y/o frenan el desarrollo de una patología o trastorno concreto. Por lo tanto, aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya tienen el trastorno; aquellos propensos a tener el trastorno; y aquellos en quienes se debe prevenir un trastorno. Se "trata" con éxito a un sujeto para una enfermedad o trastorno inflamatorio o una enfermedad o trastorno autoinmunitario de acuerdo con los métodos proporcionados en el presente documento si el paciente muestra, por ejemplo, un alivio total, parcial o transitorio o la eliminación de los síntomas asociados con la enfermedad o el trastorno.

"Polinucleótido" o "ácido nucleico", como se usan indistintamente en el presente documento, se refieren a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud e incluyen ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos o bases modificadas, y/o sus análogos, o cualquier sustrato que pueda incorporarse a un polímero mediante una ADN o ARN polimerasa. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, como nucleótidos metilados y sus análogos. La descripción anterior se aplica a todos los polinucleótidos a los que se hace referencia en el presente documento, incluidos el ARN y el ADN.

El término "expresión", como se usa en el presente documento, se refiere a un proceso mediante el cual un gen produce un agente bioquímico, por ejemplo, una molécula transportadora proporcionada en el presente documento. El proceso incluye cualquier manifestación de la presencia funcional del gen dentro de la célula, incluyendo, sin limitación, la inactivación génica, así como tanto la expresión transitoria como la expresión estable. Este incluye, sin limitación, la transcripción del gen en uno o más ARNm y la traducción de dichos ARNm en uno o más polipéptidos. En caso de que el producto final sea un agente bioquímico, la expresión incluye la creación de dicho agente bioquímico y cualesquiera precursores.

Un "producto de expresión" puede ser o bien un ácido nucleico, por ejemplo, un ARN mensajero producido mediante la transcripción de un gen o un polipéptido. Los productos de expresión descritos en el presente documento incluyen además ácidos nucleicos con modificaciones postranscripcionales, por ejemplo, poliadenilación o polipéptidos con modificaciones postraduccionales, por ejemplo, metilación, glucosilación, la adición de lípidos, asociación con otras subunidades de proteína, escisión proteolítica y similares.

El término "vector" o la expresión "vector de expresión" se usa en el presente documento para hacer referencia a vectores usados como un vehículo para introducir y expresar un producto de expresión de interés en una célula hospedadora. Como saben los expertos en la materia, dichos vectores pueden seleccionarse fácilmente entre el grupo que consiste en plásmidos, fagos, virus y retrovirus. En general, los vectores pueden comprender un marcador de selección, sitios de restricción adecuados para facilitar la clonación de un ácido nucleico particular y la capacidad para entrar y/o replicarse en células eucariotas o procariotas. Los ejemplos de vectores incluyen, pero sin limitación, vectores víricos, vectores de expresión de ADN o a Rn desnudos, vectores de plásmidos, cósmidos o fagos, vectores de expresión de ADN o ARN asociados a agentes condensadores catiónicos, vectores de expresión de ADN o ARN encapsulados en liposomas y ciertas células eucariotas, tales como células productoras.

La expresión "célula hospedadora" se refiere a una célula que porta un vector construido utilizando técnicas de ADN recombinante y que codifica al menos un producto de expresión. En las descripciones de los procesos para el aislamiento de un producto de expresión a partir de hospedadores recombinantes, los términos "célula" y "cultivo celular" se usan indistintamente para indicar la fuente del producto de expresión, a menos que se especifique claramente otra cosa, es decir, la recuperación del producto de expresión de las "células" significa o bien la recuperación de células enteras centrifugadas o la recuperación del cultivo celular que contiene tanto el medio como las células suspendidas.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y no aminoácidos pueden interrumpirlo. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que ha sido modificado de forma natural o por intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, como la conjugación con un componente de marcado. También se incluyen en la definición, por ejemplo, los polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Se entiende que, dado que los polipéptidos de la presente divulgación se basan en anticuerpos, los polipéptidos pueden presentarse como cadenas individuales o cadenas asociadas.

Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad" en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de nucleótidos o restos de aminoácidos que son iguales, cuando se comparan y alinean (introduciendo huecos, si es necesario) para obtener la máxima correspondencia, sin considerar ninguna sustitución conservadora de aminoácidos como parte de la identidad de la secuencia. El porcentaje de identidad puede medirse utilizando software o algoritmos de comparación de secuencias o mediante inspección visual. Se conocen varios algoritmos y programas informáticos que pueden utilizarse para obtener alineaciones de secuencias de aminoácidos o nucleótidos.

Un ejemplo no limitante de un algoritmo de alineación de secuencias es el algoritmo descrito en Karlin et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci., 87:2264-2268, modificado en Karlin et al., 1993, Proc. Acad. Sci., 90:5873-5877, e incorporado en los programas NBLAST y XBLAST (Altschul et al., 1991, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402). Puede usarse Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. BLAST-2, WU-BLAST-2 (Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology, 266:460-480), ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, California) o Megalign (DNASTAR) son otros programas informáticos de acceso público que pueden utilizarse para alinear secuencias. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos puede determinarse utilizando el programa GAP en el paquete de software GCG (por ejemplo, utilizando una matriz NWSgapdna.CMP y una ponderación por hueco de 40, 50, 60, 70 o 90 y una ponderación por longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6). El programa GAP del paquete de software GCG, que incorpora el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) puede utilizarse para determinar el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos (por ejemplo, utilizando una matriz BLOSUM 62 o una matriz PAM250, y una ponderación por hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y una ponderación por longitud de 1, 2, 3, 4, 5). Como alternativa, el porcentaje de identidad entre las secuencias de nucleótidos o aminoácidos puede determinarse utilizando el algoritmo de Myers y Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)). Por ejemplo, el porcentaje de identidad se puede determinar utilizando el programa ALIGN (versión 2.0) y utilizando un PAM120 con tabla de restos, una penalización por longitud de hueco de 12 y una penalización por hueco de 4. Un experto en la materia puede determinar los parámetros adecuados para una alineación máxima mediante un software de alineación concreto. Se pueden utilizar los parámetros por defecto del software de alineación.

El porcentaje de identidad "X" de una primera secuencia de aminoácidos con respecto a una segunda secuencia de aminoácidos se calcula como 100 x (Y/Z), donde Y es el número de restos de aminoácidos calificados como coincidentes en la alineación de las secuencias primera y segunda (según la alineación por inspección visual o por un programa de alineación de secuencias concreto) y Z es el número total de restos de la segunda secuencia. Si la longitud de una primera secuencia es mayor que la de la segunda, el porcentaje de identidad de la primera secuencia con la segunda será mayor que el porcentaje de identidad de la segunda secuencia con la primera.

Una "sustitución de aminoácidos conservadora" es una en la que se sustituye un resto de aminoácido por otro resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Se han definido en la técnica familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares, que incluyen cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por ejemplo, la sustitución de una fenilalanina por una tirosina es una sustitución conservadora. En la presente divulgación, las sustituciones conservadoras en las secuencias de los polipéptidos y anticuerpos de la divulgación no suprimen la unión del polipéptido o del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos, a los uno o más antígenos, es decir, a la IL-21 a la que se une el polipéptido o el anticuerpo. Los métodos para identificar las sustituciones conservadoras de nucleótidos y aminoácidos que no suprimen la unión al antígeno son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); y Burks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:.412-417 (1997)).

La expresión "secuencia consenso", tal como se utiliza en el presente documento con respecto a las regiones variables de la cadena ligera (VL) y la cadena pesada (VH), se refiere a una secuencia compuesta o genérica de VL o VH definida en base a la información sobre qué restos de aminoácidos dentro de la cadena VL o VH son susceptibles de ser modificados sin detrimento de la unión al antígeno. Así, en una "secuencia consenso" para una cadena VL o VH, ciertas posiciones de aminoácidos están ocupadas por uno de los múltiples restos de aminoácidos posibles en esa posición. Por ejemplo, si una arginina (R) o una serina (S) aparecen en una posición concreta, esa posición concreta dentro de la secuencia consenso puede ser arginina o serina (R o S). Las secuencias consenso para las cadenas VH y VL pueden definirse, por ejemplo, mediante maduración por afinidad in vitro (por ejemplo, aleatorizando cada posición de aminoácidos en una determinada CDR utilizando cebadores de codificación degenerados), mediante mutagénesis de barrido (por ejemplo, mutagénesis de barrido de alanina) de restos de aminoácidos dentro de las CDR del anticuerpo, o cualquier otro método conocido en la técnica, seguido de la evaluación de la unión de los mutantes al antígeno para determinar si la posición de aminoácidos mutada afecta a la unión del antígeno. Se pueden introducir mutaciones en las regiones CDR. Se pueden introducir mutaciones en las regiones marco. La mutación puede introducirse en las regiones CDR y en las regiones marco.

Moléculas transportadoras a través de la barrera hematoencefálica

La presente divulgación proporciona composiciones para el suministro de una sustancia de interés, por ejemplo, un agente terapéutico o de diagnóstico o "carga útil" a través de la barrera hematoencefálica (BHE) utilizando una molécula transportadora que puede atravesar las células endoteliales del cerebro mientras está asociada con la carga útil, por ejemplo, mientras está fusionada o conjugada con la carga útil. Como se usa en el presente documento, la expresión "carga útil" se utiliza como abreviatura de cualquier sustancia cuyo transporte a través de la BHE puede ser facilitado por una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento. Una carga útil puede formar parte de una molécula transportadora, por ejemplo, como un polipéptido de fusión, o unirse al polipéptido mediante enlaces disulfuro u otros enlaces covalentes. Como alternativa, la carga útil puede asociarse con la molécula transportadora de cualquier manera que permita a la molécula transportadora facilitar su transporte a través de la BHE, como se describe más adelante. En ciertos aspectos, la carga útil sigue siendo parte de la molécula transportadora tras el transporte a través de la BHE, y conserva la actividad en el sistema nervioso central (SNC) en esa forma. Como alternativa, la carga útil puede estar asociada a la molécula transportadora durante el transporte a través de la BHE, pero de forma que pueda disociarse de la molécula transportadora tras el transporte a través de la BHE. En el presente documento se proporcionan ejemplos no limitantes de restos de carga útil. La divulgación proporciona además métodos para el tratamiento o diagnóstico de una enfermedad o trastorno del SNC, que comprenden el uso de dichas moléculas transportadoras.

En ciertos aspectos, la presente divulgación proporciona una molécula transportadora aislada que comprende un polipéptido derivado de inmunoglobulina. En ciertos aspectos, el polipéptido es una versión humanizada del anticuerpo FC5 de camélidos, identificado y aislado mediante la tecnología de ensayo de microvolumen de fluorescencia (FMAT) para detectar la unión a células endoteliales microvasculares cerebrales (BMVEC), por ejemplo, células B.End3 de ratón. En ciertos aspectos, el polipéptido comprende una VH de anticuerpo y una VL de anticuerpo aisladas a partir de una biblioteca de fagos de scFv vírgenes, o una biblioteca de fagos scFv que comprende dos regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada de FC5, de nuevo identificadas y aisladas utilizando FMAT para detectar la unión a BMVEC. En ciertos aspectos, el polipéptido derivado de inmunoglobulina es un anticuerpo o un fragmento activo del mismo, donde "activo" significa que la molécula transportadora puede, por ejemplo, unirse a BMVEC en una o más especies, por ejemplo, BMVEC de ratón, BMVEC de rata, BMVEC de macaco cangrejero o BMVEC humanas, internalizarse en BMVEC de una o más especies, y/o atravesar la barrera hematoencefálica solo o asociado a una carga útil. En ciertos aspectos, la molécula transportadora comprende una o más de Bbbt0241, Bbbt0351, Bbbt0626, Bbbt0632, Bbbt0654, Bbbt0726, Bbbt0727, Bbbt0732, Bbbt0754, Bbbt0674, Bbbt0755, Bbbt0643, Bbbt0579 o Bbbt0671.

En ciertos aspectos, la molécula transportadora no se une a las BMVEC pero sigue siendo capaz de transportar a través de la BHE, como se indica en el ensayo de transcitosis in vitro. En ciertos aspectos, esta molécula transportadora atraviesa la BHE con mayor eficacia que FC5. En ciertos aspectos, esta molécula transportadora es idéntica a la secuencia de aminoácidos de FC5 excepto por dos sustituciones de aminoácidos, una sustitución T97A en la posición 97 de Kabat, y una sustitución T100aD en la posición 100a de Kabat, y tiene la secuencia de aminoácidos de Bbbt0351 (SEQ ID NO: 200).

En ciertos aspectos, el polipéptido derivado de inmunoglobulina comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada de la inmunoglobulina. Por ejemplo, el polipéptido derivado de inmunoglobulina puede incluir una región determinante de la complementariedad de cadena pesada de inmunoglobulina-1 (H-CDR1), una región determinante de la complementariedad de cadena pesada de inmunoglobulina-2 (H-CDR2), una región determinante de la complementariedad de cadena pesada de inmunoglobulina-3 (H-CDR3). En ciertos aspectos, el polipéptido derivado de inmunoglobulina puede comprender además, o como alternativa, CDR de cadena ligera de inmunoglobulina. Por ejemplo, el polipéptido derivado de inmunoglobulina puede incluir una región determinante de la complementariedad-1 (L-CDR1), una región determinante de la complementariedad de cadena ligera de inmunoglobulina-2 (L-CDR2) y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera de inmunoglobulina-3 (L-CDR3). En ciertos aspectos, el polipéptido derivado de inmunoglobulina puede contener una H-CDR1, una H-CDR2, una H-CDR3, una L-CDR1, una L-CDR2 y una L-CDR3 con las siguientes secuencias de aminoácidos, respectivamente:

(a) SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14, las CDR de Bbbt0241;

(b) SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, Q G D S L X²X³Y Y X⁴Xs, donde X²=T o R; Xa=S, R, o T; X4=A o T; y X5=N o S (SEQ ID NO: 229), G X8 X⁹N R P S, donde X8=K o E y Xg=N o D (SEQ ID NO: 230), y N S R D X¹³X¹⁴G X¹⁵X¹⁶X¹⁷V, donde X13=S o N; X14=S o T; X15=N, K o H; X¹⁶=H o P; y X17=V o W, (SEQ ID NO: 231), CDR similares a las de Bbbt0626;

(c) SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 230 y SEQ ID NO: 231, CDR similares a las de Bbbt0632;

(d) SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67 y SEQ ID NO: 68, las CDR de Bbbt0654;

(e) SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 230 y SEQ ID NO: 231, CDR similares a las de Bbbt0726;

(f) SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 230 y SEQ ID NO: 231, CDR similares a las de Bbbt0727;

(g) SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 230 y SEQ ID NO: 231, CDR similares a las de Bbbt0732;

(h) SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139 y SEQ ID NO: 140, las CDR de Bbbt0754;

(i) SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157 y SEQ ID NO: 158, las CDR de Bbbt0674;

G) SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175 y SEQ ID NO: 176, las CDR de Bbbt0755;

(k) SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193 y SEQ ID NO: 194, las CDR de Bbbt0643; o

(l) SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221, las CDR de Bbbt0579.

También se divulga en el presente documento, una o más CDR como se han descrito anteriormente son idénticos a las CDR citadas, excepto, por ejemplo, por 1,2, 3, 4, o 5 supresiones, sustituciones o inserciones de aminoácidos individuales. Además, la molécula transportadora, tal y como se ha descrito anteriormente, puede atravesar la barrera hematoencefálica.

En el presente documento también se divulga la H-CDR3 de variante de Bbbt0241, Bbbt0241m, que comprende dos sustituciones, una sustitución T97A en la posición 97 de Kabat y una sustitución T100aD en la posición 100a de Kabat. En ciertos aspectos, el polipéptido derivado de inmunoglobulina puede contener una H-CDR1, una H-CDR2, una H-CDR3, una L-CDR1, una L-CDR2 y una L-CDR3 con las siguientes secuencias de aminoácidos, respectivamente:

(b) SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32, las CDR de Bbbt0626;

(c) SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 y SEQ ID NO: 50, las CDR de Bbbt0632;

(e) SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85 y SEQ ID NO: 86, las CDR de Bbbt0726;

(f) SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103 y SEQ ID NO: 104, las CDR de Bbbt0727; o

(g) SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121 y SEQ ID NO: 122, las CDR de Bbbt0732.

También se divulga en el presente documento, una o más CDR como se han descrito anteriormente son idénticos a las CDR citadas, excepto, por ejemplo, por 1,2, 3, 4, o 5 supresiones, sustituciones o inserciones de aminoácidos individuales. Además, la molécula transportadora, tal y como se ha descrito anteriormente, puede atravesar la barrera hematoencefálica. En ciertos aspectos, la H-CDR1, la H-CDR2, la H-CDR3, la L-CDR1, la L-CDR2 y la L-CDR3 pueden situarse en regiones marco de inmunoglobulina para producir una VH de anticuerpo y una VL de anticuerpo. En ciertos aspectos, las regiones marco pueden ser regiones marco procedentes de ser humano. En ciertos aspectos, la VH de anticuerpo y la VL de anticuerpo se fusionan, por ejemplo, a través de un enlazador peptídico flexible, para formar una molécula scFv. En ciertos aspectos, la VH y la VL comprenden además uno o más dominios constantes de inmunoglobulina, por ejemplo, un dominio CH1, una región bisagra, un dominio CH3, un dominio CH3, un dominio CL-kappa, y/o un dominio CL lambda. En ciertos aspectos, los uno o más dominios constantes de inmunoglobulina proceden de una inmunoglobulina humana, por ejemplo, una inmunoglobulina IgG1 humana. En ciertos aspectos, los dominios VH, VL y/o constantes pueden comprender mutaciones para facilitar, por ejemplo, una semivida más larga o más corta, funciones efectoras mayores o menores, o la capacidad de acoplar una molécula de carga útil, ya sea a través de la fusión peptídica, un enlace disulfuro o una conjugación química.

En ciertos aspectos, la presente divulgación proporciona una molécula transportadora aislada que comprende un polipéptido derivado de inmunoglobulina, donde el polipéptido comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina (VH), una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (VL) o una región VH de inmunoglobulina y una región VL de inmunoglobulina. En ciertos aspectos, el polipéptido derivado de inmunoglobulina comprende:

(a) una secuencia de aminoácidos de VH al menos un 80 %, 84 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 2 y una secuencia de aminoácidos de VL al menos un 80 %, 84 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 11, donde SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 11 codifican las regiones VH y VL de Bbbt0241;

(b) una secuencia de aminoácidos de VH al menos un 80 %, 84 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 20 y una secuencia de aminoácidos de VL al menos un 80 %, 84 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 29, donde SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 29 codifican las regiones VH y VL de Bbbt0626;

(c) una secuencia de aminoácidos de VH al menos un 80 %, 84 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 38 y una secuencia de aminoácidos de VL al menos un 80 %, 84 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 47, donde SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 47 codifican las regiones VH y VL de Bbbt0632;

(d) una secuencia de aminoácidos de VH al menos un 80 %, 84 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 56 y una secuencia de aminoácidos de VL al menos un 80 %, 84 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 65, donde SEQ ID NO: 56 y SEQ ID NO: 65 codifican las regiones VH y VL de Bbbt0654;

(e) una secuencia de aminoácidos de VH al menos un 80 %, 84 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 74 y una secuencia de aminoácidos de VL al menos un 80 %, 84 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 83, donde SEQ ID NO: 74 y SEQ ID NO: 83 codifican las regiones VH y VL de Bbbt0726;

(f) una secuencia de aminoácidos de VH al menos un 80 %, 84 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 92 y una secuencia de aminoácidos de VL al menos un 80 %, 84 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 101, donde SEQ ID NO: 92 y SEQ ID NO: 101 codifican las regiones VH y VL de Bbbt0727;

(g) una secuencia de aminoácidos de VH al menos un 80 %, 84 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 110 y una secuencia de aminoácidos de VL al menos un 80 %, 84 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 119 donde SEQ ID NO: 110 y SEQ ID NO: 119 codifican las regiones VH y VL de Bbbt0732;

(h) una secuencia de aminoácidos de VH al menos un 80 %, 84 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 128 y una secuencia de aminoácidos de VL al menos un 80 %, 84 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 137, donde SEQ ID NO: 128 y SEQ ID NO: 137 codifican las regiones VH y VL de Bbbt0754;

(i) una secuencia de aminoácidos de VH al menos un 80 %, 84 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 146 y una secuencia de aminoácidos de VL al menos un 80 %, 84 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 155, donde SEQ ID NO: 146 y SEQ ID NO: 155 codifican las regiones VH y VL de Bbbt0674;

(j) una secuencia de aminoácidos de VH al menos un 80 %, 84 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 164 y una secuencia de aminoácidos de VL al menos un 80 %, 84 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 173, donde SEQ ID NO: 164 y SEQ ID NO: 173 codifican las regiones VH y VL de Bbbt0755;

(k) una secuencia de aminoácidos de VH al menos un 80 %, 84 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 182 y una secuencia de aminoácidos de VL al menos un 80 %, 84 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 191, donde SEQ ID NO: 182 y SEQ ID NO: 191 codifican las regiones VH y VL de Bbbt0643;

(l) una secuencia de aminoácidos de VH al menos un 80 %, 84 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 209 y una secuencia de aminoácidos de VL al menos un 80 %, 84 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 218, donde SEQ ID NO: 209 y SEQ ID NO: 218 codifican las regiones VH y VL de Bbbt0579; o

(m) una secuencia de aminoácidos de VH al menos un 80 %, 84 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 226 y una secuencia de aminoácidos de VL al menos un 80 %, 84 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 227, donde SEQ ID NO: 226 y SEQ ID NO: 227 codifican las regiones VH y VL de Bbbt0671;

En ciertos aspectos, la molécula transportadora proporcionada anteriormente tiene actividad transportadora, por ejemplo, puede unirse a BMVEC de una o más especies, por ejemplo, ratón, rata, macaco cangrejero o BMVEC humana, puede internalizarse en BMVEC de una o más especies, o puede atravesar la barrera hematoencefálica.

En ciertos aspectos, la presente divulgación proporciona una molécula transportadora aislada que comprende un polipéptido derivado de inmunoglobulina, donde el polipéptido comprende una región VH y una región VL, donde:

(a) la VH comprende la SEQ ID NO: 2 y la VL comprende la SEQ ID NO: 11;

(b) la VH comprende la SEQ ID NO: 20 y la VL comprende S S E L T Q D P A V S V A L X¹Q T V R I T C Q G D S L X²X³Y Y X⁴X⁵W Y Q X6 K P G Q A P V L V X⁷Y G Xa X⁹N R P S G X¹⁰P D R F S G S X¹¹S G X¹²T A S L T I T G A Q A E D E A D Y Y C N S R D X¹³X¹⁴G X¹⁵X¹⁶X¹⁷V F G G G T K L T V L; donde X¹=R o G; X²=T o R; X3=S, R o T; X4=A o T; Xa=N o S; X6=H o Q; X7=M o I; X8=K o E; Xg=N o D; X¹⁰=V o I; Xn=S o R; X¹²=N o T; X13=S o N; X14=S o T; X15=N, K o H; X¹⁶=H o P; y X17=V o W (SEQ ID NO: 228) o SEQ ID NO: 29;

(c) la VH comprende la SEQ ID NO: 38 y la VL comprende la SEQ ID NO: 228 o la SEQ ID NO: 47;

(d) la VH comprende la SEQ ID NO: 56 y la VL comprende la SEQ ID NO: 65;

(e) la VH comprende la SEQ ID NO: 74 y la VL comprende la SEQ ID NO: 228 o la SEQ ID NO: 83;

(f) la VH comprende la SEQ ID NO: 92 y la VL comprende la SEQ ID NO: 228 o la SEQ ID NO: 101;

(g) la VH comprende la SEQ ID NO: 110 y la VL comprende la SEQ ID NO: 228 o la SEQ ID NO: 119;

(h) la VH comprende la SEQ ID NO: 128 y la VL comprende la SEQ ID NO: 137;

(i) la VH comprende la SEQ ID NO: 146 y la VL comprende la SEQ ID NO: 155;

(j) la VH comprende la SEQ ID NO: 164 y la VL comprende la SEQ ID NO: 173; o

(k) la VH comprende la SEQ ID NO: 182 y la VL comprende la SEQ ID NO: 191.

En ciertos aspectos, una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento comprende un polipéptido derivado de inmunoglobulina, donde el polipéptido derivado de inmunoglobulina comprende un anticuerpo o un fragmento que puede penetrar la BHE del mismo. Un "fragmento que pueda penetrar la BHE", como se describe en el presente documento, es un fragmento de la molécula transportadora que puede unirse específicamente a la BMVEC de una o más especies y atravesar la BMVEC in vitro o in vivo desde la vasculatura periférica hasta la vasculatura del SNC. El hecho de que un fragmento dado sea un fragmento que pueda penetrar la BHE puede comprobarse mediante una variedad de ensayos in vitro o in vivo conocidos por los expertos habituales en la materia. Por ejemplo, la molécula transportadora puede probarse en el ensayo de transcitosis in vitro descrito en el presente documento, o en un ensayo in vivo como el ensayo de diuresis descrito en el presente documento. Otros ensayos que podrían utilizarse para medir el suministro in vivo de cargas útiles a través de la BHE incluyen, sin limitación, la lesión por constricción crónica (CCI); el modelo de lesión del nervio preservado (SNI) o la ligadura del nervio espinal (SNL), todos los cuales pueden medirse a través del movimiento de la pata, o el método de Hargreaves (Hargreaves K, et al., Pain; 1988; 32; 77-88).

En ciertos aspectos, una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento comprende un anticuerpo o un fragmento que puede penetrar la BHE que comprende o consiste en dos o más subunidades, por ejemplo, una cadena pesada o un fragmento de la misma y una cadena ligera o un fragmento de la misma, donde la cadena pesada y la cadena ligera están asociadas, por ejemplo, como una única proteína de fusión (por ejemplo, un scFv), o como dos subunidades mantenidas juntas por uno o más enlaces disulfuro. En ciertos aspectos, la cadena pesada comprende un dominio o región VH y la cadena ligera comprende un dominio o región VL.

En ciertos aspectos, la cadena pesada comprende además un dominio constante de cadena pesada, por ejemplo, un dominio CH1, una bisagra, un dominio CH2 y/o un dominio CH3, o un fragmento de los mismos. En ciertos aspectos, el dominio constante de cadena pesada es un dominio constante de IgG o un fragmento del mismo, por ejemplo, un dominio constante de IgG humana, por ejemplo, un dominio constante de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana. En ciertos aspectos, el dominio constante de IgG o un fragmento del mismo comprende una glicosilación alterada y/o una o más sustituciones de aminoácidos en relación con un dominio constante de IgG de tipo silvestre, donde la IgG modificada tiene una propiedad particular, por ejemplo, una semivida aumentada o disminuida en comparación con la semivida de una IgG que tenga el dominio constante de IgG de tipo silvestre, funciones efectoras aumentadas o disminuidas en relación con un dominio constante de IgG de tipo silvestre, o la capacidad de unir elementos heterólogos mediante, por ejemplo, un enlace peptídico, un enlace disulfuro o una conjugación química. En ciertos aspectos, el dominio constante de IgG o un fragmento del mismo tiene una glicosilación alterada en relación con un dominio constante de IgG de tipo silvestre, donde la IgG modificada tiene una propiedad particular, por ejemplo, una semivida aumentada o disminuida en comparación con la semivida de una IgG que tiene el dominio constante de IgG de tipo silvestre, o funciones efectoras aumentadas o disminuidas en relación con un dominio constante de IgG de tipo silvestre.

Los dominios constantes de las inmunoglobulinas pueden facilitar varias funciones efectoras, entre las que se incluyen, sin limitación, la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP).

Se conocen numerosas sustituciones específicas del dominio constante de IgG capaces de aumentar o disminuir la semivida. Por ejemplo, se ha demostrado que las sustituciones 252Y, 254T, 256E y sus combinaciones, numeradas según el índice de EU como se establece en Kabat, aumentan la semivida (véase, por ejemplo, el documento US 7.083.784). También se ha informado de que las sustituciones en los restos 250, 252, 254, 256, 257, 309, 311, 428, 433, 434 y combinaciones de los mismos alteran la semivida (véanse, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos n.° 6.277.375, 7.083.784; 7.217.797, 8.088.376; US2002/0147311; US2007/0148164; WO9823289 y WO09058492). Del mismo modo, se han descrito en la técnica sustituciones del dominio constante de IgG capaces de aumentar o disminuir las funciones efectoras. Por ejemplo, se ha demostrado que las sustituciones 239S y/o 332E, según el índice de EU establecido en Kabat, aumentan la actividad de ADCC (véanse, por ejemplo, los documentos WO2004099249 y US7.317.091), mientras que las sustituciones 234F, 235E, 235F, 235Q, 235Y, 239A, 332Q, 331S, 332Q y sus combinaciones, según el índice de Eu establecido en Kabat, han demostrado disminuir la ADCC. Pueden utilizarse otras numerosas sustituciones que alteran la función efectora (aumento o disminución), por ejemplo, véanse las mutaciones descritas en los documentos WO8807089, WO9958572, WO9951642, WO2012175751, WO2011149999, WO2011066501, WO2000042072, WO2011120134.

Las funciones efectoras (por ejemplo, ADCC) provocadas por moléculas que comprenden dominios constantes de IgG o fragmentos de los mismos dependen en gran medida del resto de carbohidrato unido a la región CH2 del dominio constante de IgG (Claudia Ferrara et al., 2006, Biotechnology and Bioengineering 93:851-861). Por tanto, la glicosilación del dominio CH2 de la región constante de IgG puede modificarse para aumentar o reducir la función efectora (véase, por ejemplo, Umana et al, 1999, Nat. Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473; patentes de los Estados Unidos n.° 6.602.684; 6.946.292; 7.064.191; 7.214.775; 7.393.683; 7.425.446; 7.504.256; las publicaciones de los Estados Unidos n.° 2003/0157108; 2003/0003097; 2009/0010921; la tecnología POTILLEGENT™ (Biowa, Inc); la tecnología de ingeniería de glicosilación GLYCOMAB™ (Roche)). En particular, las regiones constantes de las IgG que tienen una fucosilación reducida tienen una mayor unión a F^cyRIIIA y una mayor actividad ADCC. Se han descrito métodos para generar regiones constantes de IgG con fucosilación reducida o nula (véase, por ejemplo, el documento US2005/0226867; Mori et al., 2004, Biotechnol Bioeng 88:901-908; Cox et al., 2006, Nat Biotechnol., 24:1591-7, y las referencias proporcionadas anteriormente). Como alternativa, se ha demostrado que las regiones constantes de las IgG que carecen de glicosilación tienen una función efectora reducida (Walker et al., 1989, Biochem. J. 259:347-353) y pueden generarse, por ejemplo, utilizando células hospedadoras bacterianas (véase, por ejemplo, Simmons et al. 2002, J. Immunol. Methods, 263:133-147).

En ciertos aspectos, una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento comprende un dominio constante de IgG o un fragmento del mismo que comprende una glicosilación alterada y/o una o más sustituciones de aminoácidos en relación con un dominio constante de IgG de tipo silvestre en donde se reduce o elimina al menos una función efectora (por ejemplo, ADCC) de la molécula transportadora. En un aspecto específico, la actividad de ADCC, la actividad de CDC, o ambas, se reducen o eliminan.

En ciertos aspectos, la cadena ligera comprende además un dominio constante de cadena ligera o un fragmento del mismo, por ejemplo, un dominio Ckappa o un dominio Clambda, por ejemplo, un dominio constante kappa humano o un fragmento del mismo, o una región constante lambda humana o un fragmento de la misma.

En ciertos aspectos, una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento comprende un anticuerpo o un fragmento que pueda penetrar la BHE que comprende o consiste en un anticuerpo murino, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo multiespecífico, cualquier combinación de los mismos, o cualquier fragmento de unión a antígeno de los mismos. En ciertos aspectos, el anticuerpo o fragmento del mismo es una inmunoglobulina IgG completa, por ejemplo, una inmunoglobulina humana IgG1, que comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. En ciertos aspectos, la molécula transportadora comprende o consiste en un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un fragmento Fv, un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fab', un fragmento dsFv, un fragmento scFv o un fragmento sc(Fv)2.

También se divulga en el presente documento una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento que comprende un fragmento de scFv de anticuerpo, donde el scFv comprende un dominio o región VH y un dominio o región VL, fusionados entre sí directamente o a través de un enlazador, por ejemplo, un enlazador flexible. La VH y la VL en un scFv pueden disponerse de manera que la VH esté en el extremo N y la VL en el extremo C, o viceversa. Cuando la VH y la VL se fusionan a través de un enlazador, la scFv puede comprender, desde el extremo amino: VH-L-VL, donde L es el enlazador, o VL-L-VH, donde L es el enlazador.

Un experto habitual en la materia conocerá diversos enlazadores adecuados para preparar scFv. Algunos ejemplos no limitantes incluyen el enlazador (Gly4Ser)n, donde n es un número entero positivo seleccionado entre el grupo que consiste en 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 (SEQ ID NO: 232), Ser(Gly4Ser)n, donde n es un número entero positivo seleccionado entre el grupo que consiste en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 (SEQ ID NO: 233), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 234), GGGGSGGGGSGGGG (SEQ ID NO: 235), GGGGSGGGGSGGGGSAL (SEQ ID NO: 236) o GGGGSGGGGSGGGGSA (SEQ ID NO: 237).

En ciertos aspectos, la molécula transportadora proporcionada en el presente documento comprende un scFv, donde el scFv comprende la VH y la VL de Bbbt0241, Bbbt0626, Bbbt0632, Bbbt0654, Bbbt0726, Bbbt0727, Bbbt0732, Bbbt0754, Bbbt0674, Bbbt0755, Bbbt0643, Bbbt0579 o Bbbt0671.

En ciertos aspectos, una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento se asocia con una carga útil, de manera que la molécula transportadora puede facilitar el transporte de la carga útil a través de la BHE. En ciertos aspectos, la carga útil es un péptido o polipéptido, y se fusiona, mediante un enlace peptídico, con el polipéptido derivado de inmunoglobulina. La fusión puede ser, por ejemplo, al extremo N de la cadena pesada o de la cadena ligera, al extremo C de la cadena pesada o de la cadena ligera, o cualquier combinación de las mismas. En ciertos aspectos, la carga útil es un péptido o polipéptido unido a uno o más sitios del polipéptido derivado de inmunoglobulina mediante enlaces disulfuro. En ciertos aspectos, el polipéptido derivado de inmunoglobulina puede diseñarse para que contenga más o menos restos de cisteína para facilitar la unión precisa y/o densa de una o más copias de la carga útil al polipéptido derivado de inmunoglobulina. En ciertos aspectos, la carga útil se conjuga químicamente con el polipéptido derivado de inmunoglobulina, por ejemplo, mediante el acoplamiento de CMK (clorometilcetona) a través de las cisteínas libres; el acoplamiento de maleimida a través de las cisteínas libres; el acoplamiento de NHS a grupos de amina libres; la química "Click" (alquino azida); la "ligadura de oxima" (hidrazida o hidroxilamina aldehído) o la "ligadura de Kent" (tioéster cisteína nativa). Los restos de cisteína nativos o modificados son especialmente útiles, ya que permiten la conjugación a través de un grupo reactivo tiol, como maleimida o haloacetilo.

En ciertos aspectos, la carga útil se asocia con el polipéptido derivado de inmunoglobulina mediante enlaces no covalentes.

Cualquier tipo de carga útil que deba transportarse al SNC puede asociarse a una molécula transportadora como se indica en el presente documento. Por ejemplo, la carga útil puede ser un péptido o polipéptido, por ejemplo, un marcador peptídico, una hormona o un derivado de la misma, una enzima, una citocina, una linfocina o un anticuerpo heterólogo o un fragmento del mismo; un polinucleótido, por ejemplo, un microARN, un inhibidor de microARN, una molécula antisentido, una molécula de ARNi, un ADNc o un agente de terapia génica; un hidrato de carbono, un polímero como el polietilenglicol, un fármaco de molécula pequeña como un agente quimioterapéutico o un agente antimicrobiano o antivírico, un profármaco, un lípido, un modificador de la respuesta biológica, un marcador detectable o una combinación de dos o más de los agentes.

En ciertos aspectos, la carga útil comprende el antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-IRa) o un fragmento activo del mismo. Como se describe en el presente documento, el IL-IRa, al entrar en el SNC, puede conferir un efecto analgésico a un sujeto que experimenta dolor neuropático (Gabay E1, et al., Eur J Pain. marzo de 2011; 15(3):242-8). Sin embargo, el antagonista debe llegar al SNC antes de que se observe algún efecto. El acoplamiento de IL-1Ra a un transportador a través de la BHE es una forma de facilitar el suministro de IL-1Ra al SNC en lugar del suministro intratecal. Por consiguiente, la presente divulgación proporciona moléculas transportadoras que comprenden un polipéptido derivado de inmunoglobulina fusionado, o asociado de otro modo a IL-1Ra o a un fragmento activo del mismo. IL-1Ra puede unirse a una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento por cualquier medio adecuado, por ejemplo, el polipéptido de IL-IRa puede fusionarse con el polipéptido derivado de inmunoglobulina como se proporciona en el presente documento, en el extremo N o en el extremo C de la cadena pesada o de la cadena ligera. Por ejemplo, la presente divulgación proporciona una molécula transportadora fusionada a IL-1Ra, que comprende una VH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 (Bbbt0632) fusionada a IL-1Ra (SEQ ID NO: 223) fusionado al extremo C de SEQ ID NO: 38 por medio de un enlazador que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 222 y una VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 o una VH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (Bbbt0241) fusionada a IL-1Ra (SEQ ID NO: 223) fusionado al extremo C de SEQ ID NO: 2 por medio de un enlazador que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 222 y una VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11. Basándose en la presente divulgación, un experto habitual en la materia podría contemplar múltiples moléculas transportadoras diferentes que comprendan un polipéptido derivado de inmunoglobulina proporcionado en el presente documento fusionado con ⁱL-1 Ra, de tal manera que la molécula transportadora conserve la actividad, por ejemplo, la molécula transportadora puede unirse específicamente a BMVEC, puede internalizarse en BMVEC, o puede transportarse a través de BMVEC ya sea in vivo o in vitro.

Las encefalinas son péptidos naturales liberados por las neuronas del SNC que tienen potentes efectos analgésicos. Se han descrito análogos de la encefalina, como la dalargina, que pueden conferir un efecto analgésico a un sujeto que experimenta dolor neuropático, pero deben llegar al SNC, antes de que se observe algún efecto (Rousselle et al. (2003) J. Pharm. Exper. Ther. 306:371-376). El acoplamiento de encefalinas y análogos a un transportador a través de la BHE es una forma de facilitar el suministro de encefalinas y análogos a través de la BHE. Por consiguiente, la presente divulgación proporciona moléculas transportadoras que comprenden un polipéptido derivado de inmunoglobulina fusionado o asociado de otro modo con encefalina o un análogo de encefalina.

En ciertos aspectos, la carga útil comprende un inhibidor del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a). Se ha demostrado que los inhibidores del TNF-a administrados a través de la BHE son neuroprotectores y pueden utilizarse para tratar la enfermedad de Alzheimer (Zhou et al. (2011) J. Pharm. Exp. Ther. 339:618-23; Tobinck y Gross (2008) J.NeuroInflam 5:2). El acoplamiento de un inhibidor del TNF-a a un transportador a través de la BHE es una forma de facilitar el suministro de dichos inhibidores a través de la BHE. Por consiguiente, la presente divulgación proporciona moléculas transportadoras que comprenden un polipéptido derivado de inmunoglobulina fusionado, o asociado de otro modo, con un inhibidor de TNF-a. Un inhibidor de TNF-a puede unirse a una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento por cualquier medio adecuado, por ejemplo, un polipéptido inhibidor de TNF-a puede fusionarse al polipéptido derivado de inmunoglobulina como el proporcionado en el presente documento, en el extremo N o en el extremo C de la cadena pesada o de la cadena ligera. Se han descrito en la técnica varios inhibidores del TNF-a adecuados, que incluyen, entre otros, la porción de unión al ligando del receptor de TNF (TNFR), por ejemplo, etanercept (ENBREL®); y anticuerpos que se unen al TNF-a, por ejemplo, adalimumab (HUMIRA®), infliximab (REMlCADE®), golimumab (SIMPONI®).

En ciertos aspectos, la carga útil comprende un interferón p, factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF), receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), neurotrofina-4/5, neurotrofina (NT)-3, una neurturina, neurregulina, una netrina, factor neurotrófico ciliar (CNTF), factor de células madre (SCF), una semaforina, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento transformante (TGF)-cx, TGF-B, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), herregulina, artemina, persefina, interleucinas, factor estimulante de colonias (CSF) de granulocitos, CSF de granulocitos y macrófagos, cardiotrofina-1, hedgehog, factor inhibidor de la leucemia (LIF), midcina, pleiotrofina, eritropoyetina (EPO), proteínas morfogenéticas óseas (BMP), netrinas, saposinas o cualquier combinación de los mismos.

Actividad de la molécula transportadora

Ciertas moléculas transportadoras como las que se proporcionan en el presente documento poseen la capacidad de transporte a través de la BHE, ya sea solas o asociadas con una molécula de carga útil heteróloga. La actividad puede demostrarse mediante una serie de ensayos. Por ejemplo, en ciertos aspectos, una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento puede unirse a BMVEC de una o más especies, por ejemplo, BMVEC humana, de macaco cangrejero, murina, de rata o bovina. La unión puede demostrarse de varias maneras conocidas por los expertos habituales en la materia, por ejemplo, el ensayo FMAT descrito en otra parte del presente documento. En ciertos aspectos, las BMVEC son células endoteliales capilares cerebrales (BCEC). En ciertos aspectos, una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento puede atravesar una monocapa de BCEC en un ensayo de transcitosis in vitro. Además, en ciertos aspectos, una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento puede competir con el anticuerpo de dominio único FC5 (véase, por ejemplo, la publicación PCT WO02/057445) o Bbbt0241 para la unión a BMVEC en el ensayo de competición FMAT, explicado en detalle en otra parte del presente documento. Algunos ejemplos de moléculas transportadoras que compiten por la unión de BMVEC a FC5 o Bbbt0241 incluyen aquellas moléculas transportadoras que comprenden los dominios Vh y VL de Bbbt0626, Bbbt0727, Bbbt0632, Bbbt0654, Bbbt0726, Bbbt0732 o Bbbt0754. En ciertos aspectos alternativos, una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento se une a BMVEC, pero no compite con el anticuerpo de dominio único FC5 o Bbbt0241 para unirse a BMVEC en el ensayo de competición FMAT. Algunos ejemplos de moléculas transportadoras que no compiten por la unión de BMVEC con FC5 o Bbbt0241 incluyen aquellas moléculas transportadoras que comprenden los dominios VH y VL de Bbbt0643, Bbbt0674, Bbbt0755, Bbbt0579 o Bbbt0671.

En ciertos aspectos, la actividad de la molécula transportadora puede demostrarse in vivo. Por ejemplo, el péptido ^k-opioide dinorfina, puede provocar diuresis en un modelo animal, pero solo si llega al SNC. Por consiguiente, una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento puede conjugarse con una o más moléculas de dinorfina y administrarse periféricamente, por ejemplo, por vía intravenosa, a un sujeto, por ejemplo, en un modelo de rata, y la actividad puede demostrarse por el aumento de la producción de orina en los animales.

En otro ejemplo, IL-IRa puede reducir la hiperalgesia provocada por el dolor neuropático, pero solo si llega al SNC. Por consiguiente, una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento puede fusionarse con IL-1Ra y administrarse periféricamente, por ejemplo, por vía intravenosa o subcutánea, en un modelo de dolor neuropático, por ejemplo, en un ensayo de ligadura parcial del nervio ciático en ratas. Un efecto analgésico demuestra que la molécula transportadora puede atravesar la BHE, reduciendo así el dolor neuropático.

En ciertos aspectos, la actividad de la molécula transportadora puede demostrarse mediante la visualización de la molécula transportadora en el SNC. Por ejemplo, una molécula transportadora marcada con tritio puede administrarse a un sujeto, por ejemplo, un ratón de forma periférica, por ejemplo, por vía intravenosa, y luego visualizarse en el SNC mediante radiografía cuantitativa de cuerpo entero. En ciertos aspectos, la molécula transportadora se localiza en regiones específicas del SNC, por ejemplo, la corteza del cerebelo, la materia gris del cerebro, la materia gris de la médula espinal, el puente de Varolio o una combinación de los mismos.

Polinucleótidos

La presente divulgación proporciona polinucleótidos que codifican cualquier molécula transportadora proporcionada en el presente documento. En ciertos aspectos se proporciona un polinucleótido aislado o una composición de polinucleótidos que comprende dos o más polinucleótidos, que individualmente o colectivamente codifica una molécula transportadora puede codificar el polipéptido derivado de inmunoglobulina, así como la carga útil que debe transportarse a través de la BHE. En ciertos aspectos, se proporciona un polinucleótido aislado, o una composición de polinucleótidos que comprende dos o más polinucleótidos aislados, donde el polinucleótido o los polinucleótidos comprenden una o más moléculas de ácido nucleico que codifican individual o colectivamente un polipéptido derivado de inmunoglobulina que comprende uno o más de Bbbt0241 Bbbt0351, Bbbt0626, Bbbt0632, Bbbt0654, Bbbt0726, Bbbt0727, Bbbt0732, Bbbt0754, Bbbt0674, Bbbt0755, Bbbt0643, Bbbt0579 o Bbbt0671.

En ciertos aspectos, se proporciona un polinucleótido aislado, donde el polinucleótido comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula transportadora de polipéptidos derivados de inmunoglobulina o un fragmento o subunidad de los mismos, donde la molécula transportadora comprende una VH, una VL, o una VH y una VL, y donde la molécula de ácido nucleico codifica SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 29 o SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 47 o SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 47; SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 65 o SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 83 o SEQ ID NO: 74 y SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 101 o SEQ ID NO: 92 y SEQ ID NO: 101; SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 119 o SEQ ID NO: 110 y SEQ ID NO: 119; SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 137 o SEQ ID NO: 128 y SEQ ID NO: 137; SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 146 y SEQ ID NO: 155; SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 173 o SEQ ID NO: 164 y SEQ ID NO: 173; SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 191 o SEQ ID NO: 182 y SEQ ID NO: 191; SEQ ID NO: 200; SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 218 o SEQ ID NO: 209 y SEQ ID NO: 218; o SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 227 o SEQ ID NO: 226 y 227.

En ciertos aspectos, se proporciona un polinucleótido aislado, donde el polinucleótido comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula transportadora de polipéptidos derivados de inmunoglobulina o un fragmento o subunidad de los mismos, donde la molécula transportadora comprende una VH, una VL, o una VH y una VL, y donde la molécula de ácido nucleico comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 10; s Eq ID NO: 19, SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46 o SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64 o SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82 o SEQ ID NO: 73 y SEQ ID NO: 82; SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 o SEQ ID NO: 91 y SEQ ID NO: 100; SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 118 o SEQ ID NO: 109 y SEQ ID NO: 118; SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 136 o SEQ ID NO: 127 y SEQ ID NO: 136; SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 154 o SEQ ID NO: 145 y SEQ ID NO: 154; SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 172 o SEQ ID NO: 163 y SEQ ID NO: 172; SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 190 o SEQ ID NO: 181 y SEQ ID NO: 190; SEQ ID NO: 199; o SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 217 o SEQ ID NO: 208 y SEQ ID NO: 217.

En ciertos aspectos, el polinucleótido aislado comprende además una molécula de ácido nucleico que codifica una carga útil heteróloga, por ejemplo, una carga útil polipeptídica o polinucleotídica. En el presente documento se ofrecen ejemplos de cargas útiles.

En ciertos aspectos, se proporciona una composición de polinucleótidos que comprende dos o más polinucleótidos aislados, donde los polinucleótidos comprenden dos o más moléculas de ácido nucleico que codifican una molécula transportadora de polipéptidos derivados de inmunoglobulina o un fragmento o subunidad de la misma, donde la molécula transportadora comprende una VH y una VL, y donde las moléculas de ácido nucleico codifican, respectivamente, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 47; SEQ ID NO: 56 y SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 74 y SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 92 y SEQ ID NO: 101; SEQ ID NO: 110 y SEQ ID NO: 119; SEQ ID NO: 128 y SEQ ID NO: 137; SEQ ID NO: 146 y SEQ ID NO: 155; SEQ ID NO: 164 y SEQ ID NO: 173; SEQ ID NO: 182 y SEQ ID NO: 191; SEQ ID NO: 209 y SEQ ID NO: 218; o SEQ ID NO: 226 y SEQ ID NO: 227.

En ciertos aspectos, se proporciona una composición de polinucleótidos que comprende dos o más polinucleótidos aislados, donde los polinucleótidos comprenden dos o más moléculas de ácido nucleico que codifican una molécula transportadora de polipéptidos derivados de inmunoglobulina o un fragmento o subunidad de los mismos, donde la molécula transportadora comprende una VH y una VL, y donde las moléculas de ácido nucleico comprenden, respectivamente, SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO: 73 y SEQ ID NO: 82; SEQ ID NO: 91 y SEQ ID NO: 100; SEQ ID NO: 109 y SEQ ID NO: 118; SEQ ID NO: 127 y SEQ ID NO: 136; SEQ ID NO: 145 y SEQ ID NO: 154; SEQ ID NO: 163 y SEQ ID NO: 172; SEQ ID NO: 181 y SEQ ID NO: 190; o SEQ ID NO: 208 y SEQ ID NO: 217.

En ciertos aspectos, la composición de polinucleótidos que comprende dos o más polinucleótidos aislados comprende además una molécula de ácido nucleico que codifica una carga útil heteróloga, por ejemplo, una carga útil polipeptídica o polinucleotídica. En el presente documento se ofrecen ejemplos de cargas útiles.

En ciertos aspectos, se proporciona un vector, o dos o más vectores, para facilitar la visualización, el cribado, el aislamiento, la clonación y/o la expresión de una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento. En ciertos aspectos, el vector o los vectores son vectores de expresión.

En ciertos aspectos, dos o más moléculas de ácido nucleico de una composición polinucleotídica pueden estar situadas en el mismo vector. En ciertos aspectos, las dos o más moléculas de ácido nucleico de la composición polinucleotídica pueden estar situadas en al menos dos vectores separados.

Los vectores de expresión se utilizan para expresar polinucleótidos aislados que codifican una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento. Los vectores de expresión recombinantes son construcciones de ADN replicables que tienen fragmentos de ADN sintéticos o derivados del ADNc que codifican una cadena polipeptídica de una molécula transportadora, unidos operativamente a elementos reguladores transcripcionales o traslacionales adecuados derivados de genes de mamíferos, microbios, virus o insectos. Una unidad transcripcional generalmente comprende un conjunto de (1) uno o más elementos genéticos que tienen un papel regulador en la expresión génica, por ejemplo, promotores o potenciadores transcripcionales, (2) una secuencia estructural o codificante que se transcribe en ARNm y se traduce en proteína, y (3) secuencias apropiadas de iniciación y terminación de la transcripción y la traducción, como se describe en detalle más adelante. Estos elementos reguladores pueden incluir una secuencia operadora para controlar la transcripción. Además, se puede incorporar la capacidad de replicación en un hospedador, generalmente conferida por un origen de replicación, y un gen de selección para facilitar el reconocimiento de los transformantes.

En ciertos aspectos se proporciona un polinucleótido aislado o una composición que comprende dos o más polinucleótidos aislados, en donde la molécula de ácido nucleico está asociada de forma operativa con un promotor, o las dos o más moléculas de ácido nucleico están asociadas de forma operativa con dos o más promotores, donde los promotores pueden ser iguales o diferentes.

Las regiones de ADN están "asociadas operativamente" cuando están funcionalmente relacionadas entre sí. Por ejemplo, el ADN de un péptido señal (líder de secreción) está operativamente asociado con el ADN de un polipéptido si se expresa como un precursor que participa en la secreción del polipéptido; un promotor está operativamente asociado con una secuencia codificante si controla la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosomas está operativamente asociado con una secuencia codificante si se posiciona de manera que permita la traducción. Los elementos estructurales pensados para su uso en sistemas de expresión de levadura incluyen una secuencia líder que permite la secreción extracelular de la proteína traducida por una célula hospedadora. Como alternativa, cuando una proteína recombinante se expresa sin una secuencia líder o de transporte, la proteína puede incluir un resto de metionina N-terminal. Este resto puede escindirse opcionalmente de la proteína recombinante expresada para proporcionar un producto final.

La elección de la secuencia de control de expresión y del vector de expresión dependerá de la elección del hospedador. Se puede emplear una amplia variedad de combinaciones de hospedadores/vectores de expresión. Los vectores de expresión útiles para hospedadores eucariotas incluyen, por ejemplo, vectores que comprenden secuencias de control de la expresión de SV40, virus del papiloma bovino, adenovirus y citomegalovirus. Los vectores de expresión útiles para hospedadores bacterianos incluyen plásmidos bacterianos conocidos, como los plásmidos de E. coli, incluidos pCR 1, pBR322, pMB9 y sus derivados, plásmidos de rango de hospedador más amplio, como M13 y fagos filamentosos de ADN monocatenario.

En ciertos aspectos, se proporciona una célula hospedadora aislada que comprende un polinucleótido como se proporciona en el presente documento. En ciertos aspectos se proporcionan una o más células hospedadoras aisladas que comprenden los dos o más polinucleótidos de la composición polinucleotídica proporcionada en el presente documento.

Las células hospedadoras adecuadas para la expresión de las moléculas transportadoras proporcionadas en el presente documento incluyen células procariotas, de levadura, de insecto o eucariotas superiores bajo el control de promotores adecuados. Los procariotas incluyen organismos gramnegativos o grampositivos, por ejemplo E. coli o bacilos. Las células eucariotas superiores incluyen líneas celulares establecidas de origen mamífero como se describe a continuación. También podrían emplearse sistemas de traducción sin células. Se puede encontrar información adicional sobre los métodos de producción de proteínas, incluida la producción de anticuerpos, por ejemplo, en la publicación de patente de los Estados Unidos n.° 2008/0187954, en las patentes de Estados Unidos n.° 6.413.746 y 6.660.501, y en la publicación de patente internacional n.° WO 04009823.

También pueden emplearse diversos sistemas de cultivo de células de mamíferos o de insectos para expresar moléculas transportadoras. La expresión de proteínas recombinantes en células de mamíferos puede realizarse porque dichas proteínas suelen estar correctamente plegadas, adecuadamente modificadas y son completamente funcionales. Algunos ejemplos de líneas celulares de mamíferos adecuadas incluyen HEK-293 y HEK-293T, las líneas COS-7 de células de riñón de mono, descritas por Gluzman (Cell 23:175, 1981), y otras líneas celulares, que incluyen, por ejemplo, células L, C127, 3T3, de ovario de hámster chino (CHO), HeLa y líneas celulares BHK. Los vectores de expresión de mamíferos pueden comprender elementos no transcritos, como un origen de replicación, un promotor y un potenciador adecuados asociados de forma operativa con el gen que se va a expresar, y otras secuencias no transcritas flanqueantes 5' o 3', y secuencias no traducidas 5' o 3', como sitios de unión a ribosomas, un sitio de poliadenilación, sitios donantes y aceptores de corte y empalme, y secuencias de terminación transcripcional. Los sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células de insectos se han revisado por Luckow y Summers, BioTechnology 6:47 (1988).

Las células hospedadoras proporcionadas en el presente documento pueden utilizarse en un método de fabricación de una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento, donde el método incluye (a) el cultivo de la célula hospedadora y (b) el aislamiento de la molécula transportadora expresada a partir de la célula hospedadora. En ciertos aspectos, un resto de carga útil se expresa como parte de la molécula transportadora. En ciertos aspectos, el método comprende además asociar la molécula transportadora con una fracción de carga útil, por ejemplo, mediante conjugación química.

Composiciones farmacéuticas y de diagnóstico

En otro aspecto, la divulgación proporciona una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que contiene una o una combinación de moléculas transportadoras como se proporciona en el presente documento, donde las una o más moléculas transportadoras comprenden una o más moléculas de carga útil para el transporte a través de la BHE, formuladas junto con un portador farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones pueden incluir una o dos o más moléculas transportadoras diferentes, como se proporciona en el presente documento.

Las composiciones farmacéuticas también pueden administrarse en terapia combinada y/o combinarse con otros agentes. Por ejemplo, la terapia combinada puede incluir una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento combinada con al menos otra terapia en la que la terapia puede ser, por ejemplo, inmunoterapia, quimioterapia, radioterapia o farmacoterapia.

Los compuestos farmacéuticos proporcionados en el presente documento pueden incluir una o más sales farmacéuticamente aceptables. Algunos ejemplos de estas sales son las sales de adición de ácidos y las sales de adición de bases.

Una composición farmacéutica proporcionada en el presente documento también puede incluir un antioxidante farmacéuticamente aceptable. Algunos ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes hidrosolubles, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; (2) antioxidantes liposolubles, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y similares; y (3) agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y similares.

Algunos ejemplos de portadores acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento incluyen agua, etanol, polioles (como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares) y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, como oleato de etilo. Puede mantenerse una fluidez adecuada, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, manteniendo un tamaño de partícula determinado en el caso de las dispersiones y mediante el uso de tensioactivos.

Estas composiciones también pueden contener adyuvantes, tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes de dispersión. Puede garantizarse la prevención de la presencia de microorganismos tanto mediante procedimientos de esterilización como mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. También pueden añadirse a las composiciones agentes isotónicos, como azúcares, cloruro de sodio y similares. Además, puede lograrse la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable mediante la inclusión de agentes que retrasan la absorción, tales como monoestearato de aluminio y gelatina.

Pueden encontrarse composiciones y formulaciones adecuadas e ilustrativas, así como métodos de preparación de dichas composiciones y formulaciones, por ejemplo, en la publicación PCT n.°: WO 2009/058379, en la publicación PCT n.°: WO 2011/130324, y en la publicación PCT n.°: WO 2011/130328.

Una composición como la proporcionada en el presente documento también puede ser una composición de diagnóstico, por ejemplo, una composición para suministrar una carga útil para la formación de imágenes al SNC. Por consiguiente, se proporciona una composición de diagnóstico que comprende una molécula transportadora, un polinucleótido o polinucleótidos que codifican una molécula transportadora, un vector que comprende el o los polinucleótidos, o una célula hospedadora que comprende el o los vectores.

Métodos de utilización de las moléculas transportadoras

Las moléculas transportadoras que se proporcionan en el presente documento tienen utilidades diagnósticas y terapéuticas in vitro e in vivo. Por ejemplo, estas moléculas pueden administrarse a células en cultivo, por ejemplo, in vitro o ex vivo, o en un sujeto, por ejemplo, in vivo, para tratar, prevenir o diagnosticar diversas enfermedades o trastornos del SNC.

Por consiguiente, la presente divulgación proporciona un método para tratar, diagnosticar o prevenir una enfermedad, trastorno o lesión del SNC, en donde el método comprende administrar periféricamente a un sujeto que necesita tratamiento una composición que comprende una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento, en donde la molécula transportadora comprende un resto de carga útil terapéutica o de diagnóstico capaz de diagnosticar, prevenir o tratar la enfermedad, el trastorno o la lesión tras su exposición en el SNC después de su transporte a través de la BHE, y en donde una cantidad del resto de carga útil terapéutica o de diagnóstico es suficiente para diagnosticar, prevenir o tratar la enfermedad, el trastorno o la lesión que se transporta a través de la BHE, tratando así la enfermedad, el trastorno o la lesión.

La divulgación abarca el uso de una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento conjugada o fusionada con un resto de carga útil (por ejemplo, un agente terapéutico o un fármaco) para el transporte del resto a través de la BHE para la prevención, el control, el tratamiento o la mejora de uno o más síntomas asociados con la enfermedad, el trastorno o la lesión del SNC, ya sea solo o en combinación con otras terapias.

En ciertos aspectos, el resto de carga útil se libera de la molécula transportadora tras su entrada en el SNC. En ciertos aspectos, el resto de carga útil permanece asociado a la molécula transportadora sin comprometer su actividad.

Se puede emplear cualquier número de moléculas de carga útil para diagnosticar, prevenir o tratar una enfermedad, un trastorno o una lesión del SNC, donde la enfermedad, el trastorno o la lesión comprende esclerosis múltiple (EM), esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson, lesión medular, lesión cerebral traumática, accidente cerebrovascular, dolor neuropático, neurodegeneración, neuroinflamación, demencia, leucoencefalopatía multifocal progresiva (LMP), encefalomielitis mielolisis pontina central (MPC), adrenoleucodistrofia, enfermedad de Alexander, enfermedad de Pelizaeus Merzbacher (PMZ), leucodistrofia de células globoides (enfermedad de Krabbe), degeneración walleriana, neuritis óptica, mielitis transversa, lesión post radiación, complicaciones neurológicas de la quimioterapia, neuropatía óptica isquémica aguda, deficiencia de vitamina E, síndrome de deficiencia aislada de vitamina E, síndrome de Bassen-Kornzweig, síndrome de Marchiafava-Bignami, leucodistrofia metacromática, neuralgia del trigémino, parálisis de Bell, tumores primarios (por ejemplo, glioblastoma) o metástasis secundarias o cualquier combinación de los mismos.

En ciertos aspectos, el agente terapéutico es un antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-1Ra), y la enfermedad, el trastorno o la lesión es dolor neuropático.

La divulgación también proporciona métodos de diagnóstico de enfermedades. Las moléculas transportadoras, como se proporcionan en el presente documento, que transportan sustancias como agentes para la formación de imágenes, pueden implementarse en un método utilizado para diagnosticar la enfermedad.

La divulgación proporciona además métodos de obtención de imágenes de objetivos específicos. Una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento puede fusionarse o conjugarse con cargas útiles que son agentes de formación de imágenes, como proteínas fluorescentes verdes, otros marcadores fluorescentes (Cy3, Cy5, Rodamina y otras), biotina o radionúclidos, con el fin de transportar estas cargas útiles a través de la BHE en métodos para obtener imágenes de la presencia, la ubicación o la progresión de una diana específica en el SNC. El método de obtención de imágenes de una diana a través de la utilización de una molécula transportadora, tal y como se proporciona en el presente documento, puede llevarse a cabo mediante resonancia magnética, exploración PET, radiografía, detección por fluorescencia o mediante otros métodos de detección conocidos en la técnica.

La divulgación también proporciona un método para controlar la progresión de la enfermedad, la recaída, el tratamiento o la mejora utilizando una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento. Los métodos de seguimiento de la progresión de la enfermedad, la recaída, el tratamiento o la mejora pueden llevarse a cabo mediante los métodos de obtención de imágenes, diagnóstico o contacto con un compuesto/diana en el SNC mediante el uso de una molécula transportadora como se proporciona en el presente documento.

Kits

También se encuentran dentro del alcance de la divulgación kits que comprenden composiciones como las proporcionadas en el presente documento (por ejemplo, moléculas transportadoras capaces de suministrar sustancias a través de la BHE) e instrucciones de uso. El kit puede contener además al menos un reactivo adicional, o una o más moléculas transportadoras adicionales. Los kits suelen incluir una etiqueta que indica el uso previsto del contenido del kit. El término etiqueta incluye cualquier material escrito o registrado sobre o con el kit o que acompaña de otro modo al kit.

Equivalentes

Los expertos en la materia reconocerán o podrán determinar, utilizando tan solo experimentación rutinaria, diversos equivalentes de las realizaciones descritas en el presente documento. Se pretende que dichos equivalentes estén abarcados por las siguientes reivindicaciones.

La práctica de las reivindicaciones adjuntas empleará, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que se encuentran dentro de la habilidad de la técnica. Dichas técnicas se explican con detalle en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2.a ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volúmenes I y II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis et al. patente de los Estados Unidos n.° 4.683.195; Hames y Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames y Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller y Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et al., eds., Methods In Enzymology, volúmenes 154 y 155; Mayer y Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London); Weir y Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, volúmenes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); y en Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.).

Los principios generales de ingeniería de anticuerpos se exponen en Borrebaeck, ed. (1995) Antibody Engineering (2.a ed.; Oxford Univ. Press). Los principios generales de ingeniería de proteínas se exponen en Rickwood et al., eds. (1995) Protein Engineering, A Practical Approach (IRL Press en Oxford Univ. Press, Oxford, Inglaterra). Los principios generales de los anticuerpos y de la unión anticuerpo-hapteno se exponen en: Nisonoff (1984) Molecular Immunology (2.a ed.; Sinauer Associates, Sunderland, Mass.); y Steward (1984) Antibodies, Their Structure and Function (Chapman y Hall, Nueva York, N.Y.). Además, se siguen métodos estándar de inmunología conocidos en la técnica y no descritos específicamente, como en Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Nueva York; Stites et al., eds. (1994) Basic and Clinical Immunology (8.a ed; Appleton y Lange, Norwalk, Conn.) y Mishell y Shiigi (eds) (1980) Selected Methods in Cellular Immunology (W.H. Freeman and Co., NY).

Los trabajos de referencia convencionales que exponen los principios generales de la inmunología incluyen Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Nueva York; Klein (1982) J. Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination (John Wiley & Sons, NY); Kennett et al., eds. (1980) Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses (Plenum Press, NY); Campbell (1984) "Monoclonal Antibody Technology" en Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, ed. Burden et al., (Elsevier, Ámsterdam); Goldsby et al., eds. (2000) Kuby Immunology (4.a ed.; H. Freemand & Co.); Roitt et al. (2001) Immunology (6.a ed.; Londres: Mosby); Abbas et al. (2005) Cellular and Molecular Immunology (5.a ed.; Elsevier Health Sciences Division); Kontermann y Dubel (2001) Antibody Engineering (Springer Verlag); Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Lewin (2003) Genes VIII (Prentice Hall 2003); Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Dieffenbach y Dveksler (2003) PCR Primer (Cold Spring Harbor Press).

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no de limitación.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Construcción y caracterización de una variante mejorada de FC5, Bbbt0351

Este ejemplo describe la construcción de una molécula transportadora a través de la BHE procedente de camélido derivada de FC5, un anticuerpo de un solo dominio de camélido que atraviesa la barrera hematoencefálica. Stanimirovic, et al., J. Neurochem. 95:1201 (2005). FC5 reconoce las células endoteliales del cerebro tanto de roedores como de seres humanos. Se ha notificado que la diana de unión de FC5 es TMEM30a, un receptor huérfano glicosilado con dos dominios transmembrana. TMEM30a tiene tres isoformas y se expresa de manera ubicua en la mayoría de tipos de células.

FC5 se sometió a mutagénesis de alanina y parsimoniosa de CDR3 y se crearon diversos mutantes en formato DAb y se analizó su capacidad para expresarse y unirse a células endoteliales de cerebro de ratón. Además, se evaluaron aquellas variantes que expresaron y produjeron proteína purificada tras la purificación sobre una columna de trampa de HIS, pero que no proporcionan una señal de unión en el ensayo de unión de FMAT en células endoteliales de cerebro de ratón. La variante Bbbt0351 comprende dos sustituciones de aminoácidos en relación con la región variable de FC5, una sustitución T97A en la posición 97 de Kabat, y una sustitución T100aD en la posición 100a de Kabat. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de Bbbt0351 se presentan como las SEQ ID NO: 199-207 (tabla 2). Bbbt0351, cuando se expresa con un dominio Fc, se fusiona genéticamente con el extremo N-terminal de la región bisagra de hIgG1.

Bbbt0351 es una forma mutante de FC5 que no se une a células endoteliales del cerebro, pero que tiene una mayor velocidad de transporte en comparación con FC5 in vitro e in vivo. Se comparó el transporte de Bbbt0351-Fc a través de células endoteliales del cerebro con FC5-Fc en dos modelos de BHE in vitro de rata. Se ha descrito el modelo de BHE de células endoteliales primarias de cerebro de rata (Watson P. M. D. et al., BMC Neuroscience 2013: 14, 59-79) y el método utilizado para medir la transcitosis a través de esta barrera modelo es el siguiente: se retiró el medio de cultivo celular de los compartimentos superior e inferior de las RBEC cultivadas por triplicado en insertos de cultivo celular y se sustituyó por tampón HEPES de Ringer (sin BSA). Las moléculas de interés se añadieron a los compartimentos superiores para obtener la concentración final deseada en cada pocillo. Los cultivos se incubaron a 37 °C con agitación y se transfirieron a otro pocillo con tampón fresco en el compartimento inferior después de 30, 60 y 90 minutos. Se recogieron muestras del compartimento inferior y se analizaron mediante espectrometría de masas nano-LC SRM. Se ha descrito el método para medir la transcitosis de moléculas a través de un modelo de línea celular de rata de BHE (Haqqani A. S. et al., Method. Mol. Pharmaceutics. 2013; 10, 1542-1556). El transporte de grandes moléculas a través de células endoteliales primarias de cerebro de rata o de una línea celular endotelial inmortalizada de cerebro de rata puede detectarse mediante la técnica de espectrometría de masas nano-LC SRM.

La comparación del transporte in vivo de Bbbt0351-Fc y FC5-Fc se muestra en la Figura 1 A y B. Los resultados se muestran como permeabilidad aparente (P^app), que se calcula mediante la ecuación (dQr/dT)/(A * C⁰) donde dQr/dT es la cantidad acumulada de molécula en el compartimento inferior frente al tiempo, A es la superficie del inserto de cultivo celular y C⁰es la concentración inicial de la molécula en el compartimento superior. Estos resultados demuestran que, a pesar de no mostrar ninguna señal en el ensayo de unión FMAT, Bbbt0351-Fc muestra un mejor transporte que FC5-Fc a través de ambos modelos de BHE in vitro.

Ejemplo 2: Construcción y caracterización de Bbbt0241

Este ejemplo describe la construcción de Bbbt0241, una molécula transportadora a través de la BHE humanizada a partir de FC5.

FC5 se humanizó mediante la adición de una cadena ligera, de acuerdo con los siguientes métodos (FIG. 2A). El fragmento Fv monocatenario basado en FC5 (FC5-scFv) se basó en la biblioteca CAT 2.0 anteriormente descrita (Lloyd C. et al., Protein Eng Des Sel 2009; 22 (3); 159-68).

Brevemente, se amplificaron segmentos del gen VL utilizando cebadores específicos de la línea germinal (Hutchings C. Antibody Engineering. Springer Laboratory Manuals. 2001; 93-108) y posteriormente se clonaron en un vector pCANTAB6 modificado (McCafferty J. et al., J. Appl. Biochem. Biotechnol. 1994; 47; 157-171). Este vector contiene un enlazador [Gly4Ser]3 con un sitio Xhol y ApaLI flanqueante para permitir la clonación independiente de la cadena pesada y ligera. Una biblioteca de cadenas ligeras ya clonada actuó como vector aceptor para la inserción del VH^hde FC5 aguas arriba de la [Gly4Ser]3 mediante clonación direccional S fíIy Xhol, creando bibliotecas FC5-scFv (108 en diversidad). Se demostró que FC5 se une a la proteína A mediante ELISA (los clones de la familia Vh3 son capaces de unirse a la proteína A) y, por lo tanto, las bibliotecas se seleccionaron sobre proteína A para enriquecer solo los clones que formaban scFv completos y que todavía eran capaces de unirse a la proteína A.

Tras la selección con proteína A, se permitió que las partículas de fago infectaran a E. coli y se recogieron colonias individuales en placas de 96 pocillos para el cribado.

El cribado inicial de las variantes FC5-scFv humanizadas se realizó mediante un cribado con tecnología de ensayo de microvolumen fluorométrico (FMAT) utilizando extractos periplásmicos en bruto (periprep) de células de E. coli que expresan scFv solubles (FIG. 3A). Estos scFv se dejaron incubar con anticuerpos de detección, a saber, un anticuerpo anti-HIS de ratón que se uniría al marcador 6xHIS en el extremo C-terminal del scFv, seguido de una IgG anti-ratón marcada con Alexafluor647 que detectaría el anticuerpo anti-HIS. A continuación, este complejo terciario se añadió a una línea celular de endotelio microvascular cerebral (BMVEC) de ratón (B.End3) en solución homogénea y se incubó. Los scFv que se unieron a los receptores en la superficie de las células se leyeron como una concentración de señal fluorescente alrededor de la célula que resultaba en un evento de unión positiva. Los resultados del ensayo FMAT para Bbbt0241 se muestran en la FIG. 3B.

Los scFv positivos se denominaron "aciertos primarios" y posteriormente se expresaron y purificaron como se describe (Dobson et al., MAbs 2009; 1 (6); 552-562). Brevemente, los plásmidos scFv se cultivaron en células E. coli TG1, la expresión se indujo con isopropil p-D-1-tiogalactósido (IPTG) 1 mM, y las proteínas scFv se aislaron del periplasma por choque osmótico utilizando un tampón Tris-HCl 50 mM, EDTA 0,5 mM, sacarosa 500 mM (TES) a pH 7,4 y por captura del marcador de His C-terminal en cromatografía con Ni2_-ácido nitrilotriacético. A continuación, los plásmidos aislados se reexpresaron y se purificaron mediante procedimientos estándar de purificación de HIS sobre columnas de níquel. La unión de los "aciertos primarios" se confirmó en el ensayo FMAT utilizando la línea celular B.End3 de ratón con concentraciones conocidas de scFv purificado. Además, se comprobó la capacidad de las hIgG de FC5 humanizadas para competir con los DAb de FC5 en la unión a las células B.End3 en un ensayo FMAT de competición. La FIG. 3C muestra fotomicrografías de las células B.End3 en un ensayo de competición FMAT utilizando una concentración constante de DAb de FC5 y una concentración creciente de la hIgGI competidora, por ejemplo, Bbbt0241. CEA6 es una hIgGI de control negativo. La FIG. 3D es una gráfica que muestra cuantitativamente la competición. A continuación, se probó la unión de los "aciertos primarios" a las BMVEC de otras especies, por ejemplo, de rata y macaco cangrejero. A partir de la selección original de variantes humanizadas de FC5, se identificó el scFv Bbbt0241 como candidato principal. Las secuencias de Bbbt0241 se presentan como las SEQ ID NO 1-18 y 199 (tabla 2).

La localización del Bbbt0241 administrado a las ratas se analizó mediante una autorradiografía cuantitativa de cuerpo entero (QWBA) de la siguiente manera. La hIgG1TM Bbbt0241 se marcó con N-succinimidil propionato (NSP) tritiado. Se dispensó en un vial una sola alícuota de NSP que contenía 1,6 mCi. El disolvente se evaporó bajo una suave corriente de nitrógeno gaseoso a temperatura ambiente. El resto se resuspendió en DMSO (Hybri-Max - Sigma) y se mezcló para asegurar la completa disolución del material radiomarcado. Se dispensó una sola alícuota (1 ml) de solución de anticuerpos en el vial. A continuación, la solución se dejó reposar a 4 °C durante aproximadamente 16 horas (durante una noche). A continuación, la solución de [3H]-anticuerpo se purificó por filtración en gel utilizando columnas de desalación de Zebraspin de 40000 MWCO (Pierce). La actividad específica del material se determinó tras la purificación, basándose en la respuesta UV de Bbbt0241 purificado en la solución tras el análisis por cromatografía de exclusión por tamaño molecular, y en la radiactividad presente. [3H]-Bbbt0241 se formuló como una solución intravenosa en solución salina tamponada con fosfato a pH 7,4.

Se administró a ratas macho Sprague Dawley una dosis única de Bbbt0241 tritiado por vía intravenosa a 30 mg/kg. Se analizaron los niveles de Bbbt0241 en el tejido cerebral en relación con la cantidad en el plasma en tres animales a las 24 horas después de la dosis. A las 24 horas después de la dosis, se anestesió a los animales con isofluorano y se recogió aproximadamente 1 ml de sangre por punción cardíaca. A continuación, se sacrificó a los animales mediante desangramiento a través del ventrículo izquierdo del corazón utilizando aproximadamente 50 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía 10 UI/ml de heparina litiada.

Se extrajeron los cerebros y se congelaron en isopentano enfriado a entre -20 y -30 °C. Las muestras de cerebro se almacenaron a menos de -70 °C antes del análisis. La sangre se procesó, obteniéndose el suero y los niveles de radiactividad se analizaron mediante LSC. Se evaluó el grado de perfusión de los cerebros de rata enteros y después se pesaron. Se añadieron aproximadamente 5 volúmenes de PBS frío (aproximadamente a 4 °C) que contenía el inhibidor de proteasa Complete® (Roche Diagnostics) a la muestra de cerebro entero y luego se homogeneizó en un homogeneizador de vidrio tipo mortero Potter-Elvehjem de 10 ml con una mano de mortero de PTFE, empleando 2x 10 golpes en sentido horario con un tiempo de reposo de 5 segundos. Se quemaron alícuotas de homogeneizado cerebral sin procesar en un quemador de muestras Packard 306 y los niveles de radiactividad medidos se utilizaron para calcular la recuperación de radiactividad tras el procesamiento de la muestra.

El homogeneizado se transfirió a tubos LoBind (Eppendorf) y se procesó el fragmento soluble que contiene las proteínas intracelulares y extracelulares, mediante centrifugación a 16000g durante 1 hora a 4 °C. Tras la eliminación de la fracción soluble, el sedimento resultante se homogeneizó en 5 volúmenes de PBS Complete® frío que contenía un 0,5 % de Tween 20 (aproximadamente a 4 °C), dando 1x 10 golpes en sentido horario en el homogeneizador de vidrio. El homogeneizado se transfirió a tubos LoBind y se centrifugó a 16000g a 4 °C durante 1 hora. La fracción de sedimentos resultante contenía la radiactividad unida a las proteínas de membrana y a los receptores diana unidos a la membrana del parénquima y del endotelio de la BHE. Por último, cualquier resto de radiactividad que estuviera débilmente unida a la fracción de sedimentos se extrajo con 5 volúmenes de PBS Complete® que contenían un 1 % de SDS a temperatura ambiente y tras la homogeneización y centrifugación en un tubo LoBind, como se ha descrito anteriormente. Se registraron los pesos totales de las fracciones de todas las muestras y se midieron los niveles de radiactividad en alícuotas pesadas de las fracciones recogidas. A continuación, estas muestras se analizaron mediante recuento de centelleo líquido (LSC). Las muestras se mantuvieron en hielo durante todas las etapas del procesamiento de los tejidos.

Se examinó a cuatro animales para comprobar la exposición de todo el cuerpo y del cerebro a los 5 minutos, 4 horas, 24 horas y 72 horas después de la dosis. Se sacrificó a los animales mediante inmersión en hexano/CO²sólido (aproximadamente a -70 °C) anestesiados con isoflurano, a los 5 minutos, 4, 24 y 72 horas después de la dosis. Antes del sacrificio, se tomaron muestras de sangre (aproximadamente 0,5 ml) de una vena periférica de la cola y se procesaron para obtener suero. Una vez retiradas las extremidades y la cola, el cuerpo se incluyó, con el lado lateral izquierdo hacia arriba, en una solución acuosa de carboximetilcelulosa al 1 % y se congeló durante al menos 30 minutos en hexano enfriado a -70 °C con CO²sólido. Los bloques de animales se almacenaron a -20 °C hasta que se requirió su seccionamiento. En el momento de la sección, cada bloque se montó en un criomacrótomo Leica CM3600 (Leica Microsystems GmbH, Alemania) mantenido a aproximadamente -20 °C. Se prepararon secciones sagitales de todo el cuerpo (30 |jm) hasta en cinco niveles diferentes del cuerpo de la rata para incluir tantos tejidos como fuera posible:

Nivel 1: Glándula lacrimal exorbital

Nivel 2: Glándula lacrimal intraorbital

Nivel 3: Glándula harderiana/glándula suprarrenal

Nivel 4: Glándula tiroidea

Nivel 5: Cerebro y médula espinal

Las secciones se montaron en cinta de seccionamiento (T410, TAAB) y se etiquetaron. Todas las secciones se liofilizaron durante aproximadamente 1 hora (liofilizador LyoPro 3000) antes de la exposición en placas de formación de imágenes de fósforo. Se eligieron secciones para la obtención de imágenes de fósforo que representaran mejor los tejidos y órganos de interés. Junto con los patrones de calibración, las secciones se colocaron sobre placas de formación de imágenes de fósforo previamente borradas. Las placas de formación de imágenes se expusieron durante 14 días a temperatura ambiente encerradas en casetes herméticos a la luz en una caja de blindaje de plomo para protegerlas de la radiación ambiental. Tras la exposición, las placas de formación de imágenes se escanearon con un tamaño de píxel de 50 mm utilizando un analizador de imágenes Fuji FLA-5100 (Raytek, Reino Unido). Los tejidos y órganos de interés se cuantificaron con la versión 2 de Seescan (LabLogic, Reino Unido).

El estudio de autorradiografía cuantitativa de cuerpo entero (QWBA) indicó que la hIgG1TM Bbbt0241 se transportó específicamente a regiones específicas del cerebro y la médula espinal, a saber, la corteza del cerebelo, la materia gris del cerebro, la materia gris de la médula espinal y el puente de Varolio. Los estudios de exposición demostraron una relación cerebro:plasma de 1-1,5 % de Bbbt0241 a las 24 horas después de la dosis intravenosa (i.v.). (También se ha demostrado un nivel de exposición similar con hIgG1TM Bbbt0626 en ratones).

Bbbt0241 también se probó en el ensayo de transcitosis in vitro (FIG. 4A) junto con una IgG de control negativo (NIP228 IgG) utilizando el método descrito en (Haqqani A. S., Caram-Salas N., Ding W., Brunette E., Delaney C. E., Baumann E., Boileau E., Stanimirovic D. Multiplexed Evaluation of Serum and CSF Pharmacokinetics of Brain-Targeting Single-Domain Antibodies Using a Nano - LC s Rm -ILIS Method. Mol. Pharmaceutics. 2013; 10, 1542-1556). Los resultados de muestran en la FIG. 4B.

Las mutaciones identificadas en el ejemplo 1 como mejora de la actividad transportadora de Bbbt0351, una sustitución T97A en la posición 97 de Kabat, y una sustitución T100aD en la posición 100a de Kabat se introducen en Bbbt0241, dando lugar a una versión mutada Bbbt0241m. Las versiones modificadas de scFv o IgG de Bbbt0241m se someten a pruebas para comprobar la mejora de la actividad transportadora mediante el ensayo de transcitosis in vitro descrito en el ejemplo 1.

Ejemplo 3: Cribado adicional de bibliotecas de moléculas transportadoras a través de la BHE

Se llevaron a cabo selecciones por competición de la superficie celular utilizando células endoteliales de cerebro de ratón (B.End3) para identificar scFv visualizados por fagos de bibliotecas de visualización de fagos adicionales que compiten con Bbbt0241 y FC5 o poseen propiedades de unión similares. Se examinaron tres bibliotecas no expuestas previamente. Las células B.End3 se perforaron con detergente, por ejemplo, formaldehído al 2 % durante 15 minutos a temperatura ambiente, seguido de la adición de Triton al 0,2 % en PBS, y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos antes de girar las células y lavarlas con PBS, lo que permitió acceder a una mayor reserva de antígeno FC5/Bbbt0241, creando así mejores condiciones para el enriquecimiento de scFv que se unen al antígeno diana FC5/Bbbt0241. Tras perforar las células, se incubaron con las bibliotecas de fagos previamente mencionadas durante 1-2 horas a temperatura ambiente. Posteriormente, las células se lavaron hasta 10 veces en PBS para eliminar todas las partículas de fago no unidas o débilmente unidas de las células. Posteriormente, se añadió hIgG Bbbt0241 a las células lavadas y se incubó de nuevo durante 1-2 horas para permitir que esta IgG se uniera a las células y compitiera con los scFv unidos de la selección. Las células se centrifugaron a 2000 rpm y se extrajo el sobrenadante que se utilizó para infectar las células TG1 en crecimiento. Se realizaron varias rondas iterativas de selecciones de elución competitiva para enriquecer los scFv que se unen al mismo epítopo o a uno similar al de Bbbt0241.

El cribado inicial de las bibliotecas se realizó utilizando peripreps de E. co licomo se describe en el ejemplo 1 en el ensayo FMAT en células B.End3 para indicar la unión de clones individuales. Los resultados de este cribado inicial se seleccionaron y secuenciaron antes de enviar los scFv únicos para la preparación de proteínas purificadas (HIS-prep) y utilizarlos en un ensayo FMAT de confirmación de la unión.

Bbbt0241, y todos los scFv derivados de FC5 (miméticos y no miméticos) que se ensayaron, poseían un perfil de unión único por el que se observó que solo se unían a una subpoblación de células (normalmente aproximadamente un 25 30 %) en una unión puntual bastante discreta en la superficie celular.

Si la hIgG1 Bbbt0241 o el FC5-Fc podían competir, la señal fluorescente proporcionada por los complejos de scFv unidos disminuía, lo que indicaba que ese scFv particular competía por la unión celular con Bbbt0241/FC5 (denominado mimético de FC5, FIG. 6A). Inicialmente, se identificaron diez scFv miméticos de FC5 únicos. Sin embargo, varios fueron descartados para su caracterización posterior debido a su reducida estabilidad, que los hacía inadecuados, al igual que la falta de reactividad cruzada entre especies cuando se probó en el ensayo de unión a FMAT con otras células, por ejemplo, células endoteliales cerebrales macrovasculares de rata o macaco primarias y células endoteliales de cerebro humano D3. Los siete scFv restantes, denominados miméticos de FC5, se caracterizaron con más detalle: Bbbt0626, Bbbt0727, Bbbt0632, Bbbt0654, Bbbt0726, Bbbt0732 y Bbbt0754. Los scFvs principales se convirtieron en formato IgG1 utilizando IgG1-TM humana - L234F/L235E/P331S (Oganesyan V et al., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2008: 64 (6); 700-704.), y se realizó la FMAT de competición para determinar si las versiones IgG de estos scFv eran capaces de competir por la unión a la superficie de la célula con todos los demás miméticos de FC5 probados. Los siete miméticos de FC5 se clasificaron en tres grupos de competición: el primero, que incluía Bbbt0626 y Bbbt0727, el segundo, que incluía Bbbt0632 y Bbbt0654, y el tercero, que incluía Bbbt0726, Bbbt0732 y Bbbt0754, en función de la forma en que podían competir entre sí.

A partir de los periprep de fagos examinados, se identificaron otros 15 scFv únicos con perfiles de unión similares a los de Bbbt0241, pero su unión a las células B.End3 no se inhibió competitivamente por la hIgG1 Bbbt0241 o FC5-Fc (FIG.

6B). De ellos, tres resultaron tener propiedades aceptables de estabilidad, secuencia y reactividad cruzada. Estos scFv, Bbbt0643, Bbbt0674 y Bbbt0755, se denominaron no miméticos similares a FC5.

Las secuencias de ADN de las regiones VH y VL de estas construcciones, así como las secuencias de aminoácidos de los scFv, VH, VL, y las diversas CDR y estructuras se presentan como las SEQ ID NO mostradas en la tabla 2.

Los candidatos miméticos y no miméticos de FC5 se convirtieron al formato hIgGITM y hIgGITM+ADC. Tres restos (T289C, A339C y S442C) del dominio Fc se convirtieron en cisteínas para permitir la fijación de la carga útil (Dimasi N. et al., J. Mol. Biol. 2009; 393; 672-692

En el formato hIgGITM, los péptidos con grupos reactivos de clorometilcetona (CMK) se unieron por medio de la química de tiol a los restos de cisteína en los enlaces disulfuro inter-cadena e intra-cadena en las regiones bisagra y CH1-CL1 del hIgGITM.

Ejemplo 4: Caracterización in vitro de los miméticos de FC5 y de los no miméticos de FC5

Los miméticos de FC5 y los no miméticos de FC5 se caracterizaron mediante ensayos adicionales in vitro e in vivo. Se analizó la estabilidad térmica de los aciertos primarios mediante métodos estándar de Sypro orange (Ericsson et al., 2006 Analytical Biochemistry 357 p289-298), y los posibles riesgos de secuencia, tales como sitios de posible N u O glucosilación o de desamidación. Además de las pruebas de unión de los scFv a la línea de células endoteliales de cerebro de ratón B.end3, como se describe en el ejemplo 3, se probó la internalización de los scFv en las células B.end3 mediante el siguiente método FMAT. La internalización de FMAT se realizó de forma similar al ensayo de FMAT de unión, como se ha descrito anteriormente, con las siguientes alteraciones en el protocolo: La FMAT se realizó a 37 °C y el anticuerpo de detección anti-ratón está marcado con CypHer5E y se realizó en tampón Ringer HEPES con 0,1 % de ^bS^a. Los miméticos de FC5 y los no miméticos de FC5 se probaron en formato hIgG para su unión a células endoteliales cerebrales primarias de rata (RBEC), células endoteliales cerebrales primarias de macaco cangrejero y para su unión a células humanas D3. Los resultados de estos ensayos se muestran en las tablas 3 y 4.

TABLA 3 Moléculas principales de miméticos de FC5

TABLA 4 Moléculas principales de no miméticos de FC5

A continuación, se analizaron todos los clones principales (denominados Bbbt) en ensayos de transcitosis en ratas, ratones y bovinos como se ha descrito (Watson P. M. D. et al., BMC Neuroscience 2013: 14, 59-79; Coisne C. et al., Lab Invest. 2005: 85, 734-746; Dehouck M-P. et al., J. Neurochem. 1990: 54, 1798-1801) como scFv purificados biotinilados de transporte. Los scFv se biotinilaron específicamente en el resto de cisteína libre entre los marcadores FLAG y 10xHIS en el extremo C-terminal del scFv. El transporte de scFv se detectó mediante ELISA, mediante el cual el scFv transportado se capturó en una placa de Ni-NTA de 96 pocillos a través del marcador de HIS y la biotina se detectó con estreptavidina marcada con europio.

Ejemplo 5: Caracterización in vivo de miméticos de FC5 y no miméticos similares a FC5

Modelo de diuresis en ratas

Se demostró la eficacia de los polipéptidos transportadores de la divulgación en el transporte de una carga útil que comprende un agente analgésico a través de la BHE utilizando un modelo de diuresis de rata como se indica a continuación.

Las dinorfinas son una clase de péptidos opioides endógenos que surgen de la proteína precursora prodinorfina. Muestran una potencia 6-10 veces mayor que la morfina por mol, ejerciendo sus efectos principalmente a través del receptor kopioide (KOR). Se ha demostrado que las dinorfinas son moduladoras de la respuesta al dolor: la inyección de péptidos de dinorfina en el espacio subaracnoideo de la médula espinal de la rata produjo una analgesia dependiente de la dosis, que fue parcialmente eliminada por el tratamiento con naloxona (Han JS et al., Sci. Sin., Ser. B, Chem. Biol. Agric. Med. Earth Sci. 27(2):169-77. (1984)). Los péptidos de dinorfina están restringidos periféricamente en los animales y no pueden atravesar la BHE. Sin embargo, un péptido de dinorfina acoplado a un resto dirigido a la BHE podría suministrarse a través de la BHE después de la administración i.v. y proporcionar alivio del dolor.

Con ese fin, se expresó, purificó y acopló Bbbt0241 (tanto en formato scFv como IgG) a un péptido K-opioide (dinorfina) (FIG. 5A) acoplando el péptido de dinorfina usando un grupo activo de clorometilcetona a un resto de cisteína en el scFv o hIgG de Bbbt0241. Los conjugados scFv-dinorfina se inyectaron (i.v.) en ratas y la diuresis se midió cada hora durante un período de 4 horas. El diseño del estudio se muestra en la FIG. 5B. Si la dinorfina se transporta a través de la BHE, se observa un aumento en la diuresis. La administración periférica de dinorfina sola no muestra ningún efecto. La FIG. 5C muestra un aumento significativo en la producción de orina observado sobre la administración de Bbbt0241 conjugado con dinorfina a ratas.

Los formatos tanto de scFv como de IgG de los miméticos y no miméticos de FC5 se analizaron en el modelo de diuresis de rata. La FIG. 7A muestra un aumento significativo de la producción de orina tras la administración de las versiones IgG de Bbbt0643, Bbbt0674, Bbbt0754 y Bbbt0654 con respecto al vehículo. Los compuestos de IgG se administraron a razón de 4 ml por 1 kg de peso corporal. Las FIG. 7B, FIG. 7C y FIG.7D muestran el efecto de diferentes dosis de hIgG Bbbt0626 en comparación con el control (las dosis se muestran en los gráficos en mg/ml). Los resultados muestran que el efecto aumenta con la dosis de Bbbt0626 conjugado con dinorfina. Los ensayos posteriores demostraron que todos los miméticos de FC5 de la tabla 3 y todos los no miméticos de FC5 de la tabla 4 fueron positivos en el modelo de diuresis (datos no mostrados).

Modelo de ligadura parcial del nervio ciático de ratones

El dolor neuropático está mediado por el sistema nervioso central y por tanto, para posibilitar el alivio del dolor es necesario que un fármaco alcance al SNC. Se ha descrito un modelo de dolor neuropático (Seltzer Z et al., Pain 43: 205-218 (1990)), en el que se liga parcialmente el nervio ciático de una pata de un ratón, lo que hace que se reduzca el umbral de dolor por presión en la pata lesionada. Un fármaco analgésico reducirá el dolor si es capaz de llegar al SNC y la relación de presión de la pata se igualará. En la FIG. 8 se muestra un esquema del modelo.

Se ha demostrado el uso del antagonismo del receptor de IL-1 como estrategia para aliviar el dolor neuropático (Gabay et al, Eur J Pain. marzo de 2011;15(3):242-8 (2011). IL-IRa es un antagonista natural del receptor de IL-1. La proteína no atraviesa la BHE, y debe administrarse por vía intratecal para lograr la reducción del dolor medida por el modelo Seltzer. Sin embargo, IL-IRa acoplado a una molécula dirigida a la BHE podría atravesar la BHE tras su administración i.v. y dar lugar a un alivio del dolor.

Para ello, se expresaron Bbbt0241, Bbbt0632, Bbbt0626 y Bbbt0726 (y la IgG de control NIP228) como construcciones de fusión con IL-IRa fusionado al extremo C de las regiones constantes de la cadena pesada mediante un enlazador. La construcción de cualquiera de estas proteínas de fusión a partir de estos o similares bloques de construcción está bien dentro del conocimiento de una persona de habilidad ordinaria en la técnica. Las construcciones de fusión se expresaron en células CHO-EBNA (Daramola et al., Biotechnol Prog. 2014 30:132-41) según métodos estándar, y las proteínas resultantes se purificaron por afinidad con proteína A y por filtración en gel. Se demostró que las construcciones conservan la actividad de ILIRa en un ensayo in vitro (datos no mostrados).

Se sometió a cirugía a los animales en el día 0 y se evaluó la hiperalgesia mecánica en el día 7 en el día 10 después de la operación. Tras la administración de las proteínas de fusión IL-IRa o de los controles en el día 13 postoperatorio, los animales volvieron a someterse a pruebas de hiperalgesia mecánica a las 2 horas (en algunos experimentos), 4 horas, 1 día, 2 días y 4 días después de la dosis.

La hiperalgesia mecánica se determinó utilizando un analgésico (Randall LO et al., Arch Int Pharmacodyn Ther. 111:409-19 (1957)) (Ugo Basile). Se aplicó una fuerza creciente a la superficie dorsal de cada pata trasera por turnos hasta que se observó una respuesta de retirada. La aplicación de la fuerza se detuvo en este punto y se registró el peso en gramos. Los datos se expresaron como umbral de retirada en gramos para las patas ipsilaterales y contralaterales. Tras el establecimiento de las lecturas de referencia, los ratones se dividieron en 2 grupos con proporciones ipsilaterales/contralaterales aproximadamente iguales y se sometieron a cirugía. Los ratones fueron anestesiados con isoflurano al 3 %. A continuación, se expuso aproximadamente 1 cm del nervio ciático izquierdo mediante una disección roma a través de una incisión a la altura de la mitad del muslo. A continuación se pasó una sutura (Virgin Silk 10/0: Ethicon) a través del tercio dorsal del nervio y se ató firmemente. La incisión se cerró con pegamento y se dejó que los ratones se recuperaran durante al menos siete días antes de comenzar las pruebas. Los ratones operados de forma simulada se sometieron al mismo protocolo, pero tras la exposición del nervio se pegó la herida y se dejó que se recuperara.

Los estudios preliminares de dosis-respuesta en ratones mostraron que la administración intravenosa (i.v.) de 40 mg/kg o 100 mg/kg de las fusiones Bbbt0241 y Bbbt0632-IL-1Ra mostraron un sistema modelo de analgesia significativa (datos no mostrados). La FIG. 9 muestra que se observó una analgesia significativa tras la administración i.v. de 100 mg/kg de las fusiones de Bbbt0632, Bbbt0626 y Bbbt0726 con IL-1 Ra, con un efecto que duró más de dos días después de la dosis. Se realizaron estudios adicionales in vivo con la proteína de fusión Bbbt0626 IL-1Ra. La proteína de fusión administrada i.v. a 25 mg/kg, 50 mg/kg y 100 mg/kg demostró un efecto estadísticamente significativo relacionado con la dosis (FIG.

10). Además, una comparación de la administración i.v. con la subcutánea (s.c.) no mostró diferencias en el efecto entre las dos vías de administración (FIG. 11A y 11B).

Por último, se estudió el efecto de las administraciones repetidas. En este estudio, los animales fueron operados el día 0 y se comprobó la hiperalgesia mecánica el día 7 y el día 10 después de la operación. A todos los animales se les administró una dosis de Bbbt0626-IL-1Ra o de NIP228-IL-1Ra el día 13, y se comprobó la hiperalgesia mecánica a las 4 horas y 1 día después de la dosis. A algunos animales se les volvió a administrar Bbbt0626-IL-1Ra o NIP228-IL-1Ra el día 14 y se les volvió a examinar 4 horas después. El estudio se realizó en dos mitades idénticas debido al gran número de animales. Los animales fueron examinados hasta 4 días después de la dosis.

Los resultados (de los estudios combinados) se muestran en las FIG. 12A y 12B. En los animales que recibieron una sola dosis, el efecto analgésico máximo se produjo entre las 4 horas y 1 día después de la dosis, como en los estudios anteriores. En los animales que recibieron dos dosis, los niveles de analgesia aumentaron aún más mostrando un pico de analgesia a las 4 horas después de la segunda dosis. El efecto siguió siendo estadísticamente significativo hasta 4 días

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo humanizado aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en donde la VH comprende la SEQ ID NO: 20 y la VL comprende la SEQ ID NO: 29 y en donde el anticuerpo se une a células endoteliales de la microvasculatura cerebral.

2. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o el fragmento del mismo comprende un dominio constante de IgG o un fragmento del mismo que comprende una o más sustituciones de aminoácidos en relación con un dominio constante de IgG de tipo silvestre, en donde la IgG modificada tiene una semivida aumentada y/o una afinidad de unión aumentada por FcRn en comparación con la semivida de una IgG que tiene el dominio constante de IgG de tipo silvestre.

3. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 2, en donde el dominio constante de la IgG o el fragmento del mismo comprende una o más sustituciones de aminoácidos en relación con un dominio constante de la IgG de tipo silvestre, y en donde la IgG modificada tiene una función efectora reducida y/o una unión reducida a al menos una molécula efectora en comparación con la semivida de una IgG que tiene el dominio constante de la IgG de tipo silvestre.

4. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o el fragmento del mismo es un anticuerpo multiespecífico, un fragmento Fv, un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fab', un fragmento dsFv, un fragmento scFv, un fragmento sc(Fv)2.

5. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que además comprende una carga útil asociada, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo puede transportar la carga útil a través de la barrera hematoencefálica, opcionalmente en donde la carga útil se fusiona, mediante un enlace peptídico, al anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo o en donde la carga útil se conjuga químicamente al anticuerpo o al fragmento de antígeno del mismo. Z

6. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 5, en donde la carga útil comprende un agente antimicrobiano, un agente terapéutico, un profármaco, un péptido, una proteína, una enzima, un lípido, un modificador de la respuesta biológica, un agente farmacéutico, una linfocina, un anticuerpo heterólogo o un fragmento del mismo, un marcador detectable, una molécula de polietilenglicol (PEG) o una combinación de dos o más de los agentes.

7. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 6, en donde la carga útil comprende un polipéptido neuroactivo seleccionado entre el grupo que consiste en: factores neurotróficos, factores endocrinos, factores de crecimiento, factores paracrinos, factores de liberación hipotalámica, polipéptidos neurotransmisores, polipéptidos agonistas de un receptor expresado por una célula del SNC y polipéptidos implicados en la enfermedad de almacenamiento lisosomal, opcionalmente, en donde la carga útil comprende un antagonista del receptor de IL-1, dalargina, un interferón-p, un factor neurotrófico derivado de la glía, un receptor del factor de necrosis tumoral, un factor de crecimiento nervioso, un factor neurotrófico derivado del cerebro, una neurotrofina-4/5, una neurotrofina-3, una neurturina, neurregulina, una netrina, factor neurotrófico ciliar, factor de células madre, una semaforina, factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento transformante-cx, TGF-p, factor de crecimiento endotelial vascular, factor de crecimiento derivado de plaquetas, herregulina, artemina, persefina, interleucinas, factor estimulante de colonias de granulocitos, CSF de granulocitos y macrófagos, cardiotrofina-1, hedgehog, factor inhibidor de la leucemia, midcina, pleiotrofina, eritropoyetina, proteínas morfogenéticas óseas, netrinas, saposinas o cualquier combinación de los mismos.

8. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 7, en donde la carga útil comprende un anticuerpo heterólogo o un fragmento del mismo, opcionalmente en donde el anticuerpo heterólogo o el fragmento del mismo se une específicamente a uno o más de betasecretasa 1, CD20, CD25, CD52, c D33, CTLA-4, tenascina, integrina alfa-4, IL-12, IL-23, la subunidad p40 de IL12/IL-23, amiloide-13, huntingtina, factor de crecimiento nervioso, receptor del factor de crecimiento epidérmico, receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano, factor de crecimiento endotelial vascular, TrkA, TNF-a, TNF-13, a-sinucleína Tau, apolipoproteína E4, proteína priónica, cinasa 2 de repetición rica en leucina, parkina, presenilina 1, presenilina 2, gamma secretasa, receptor de muerte 6, proteína precursora de amiloide, receptor de neurotrofina p75, caspasa 6, un factor neurotrófico y/o un receptor de factor neurotrófico.

9. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde las células endoteliales microvasculares cerebrales Z son células endoteliales microvasculares cerebrales humanas, de macaco cangrejero, murinas, de rata o bovinas.

10. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 9, en donde las células endoteliales microvasculares cerebrales son células endoteliales capilares cerebrales.

11. Una composición que comprende el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y un portador.

12. Un polinucleótido aislado que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

13. Un vector que comprende el polinucleótido aislado de la reivindicación 12.

14. Una célula hospedadora aislada que comprende el vector de la reivindicación 13.

15. Un método para producir el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende (a) cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 14; y (b) aislar el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo, que opcionalmente comprende además (c) conjugar el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo a una carga útil.

16. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad, trastorno o lesión del sistema nervioso central (SNC), en donde el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo se administra periféricamente a un sujeto que necesita tratamiento, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un agente terapéutico capaz de tratar la enfermedad, trastorno o lesión tras la exposición en el SNC después del transporte a través de la barrera hematoencefálica, y en donde se transporta a través de la barrera hematoencefálica una cantidad del agente terapéutico suficiente para tratar la enfermedad, el trastorno o la lesión, tratando de este modo la enfermedad, el trastorno o la lesión, opcionalmente en donde la enfermedad, el trastorno o la lesión del SNC comprende esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, lesión de la médula espinal, lesión cerebral traumática, ictus, dolor neuropático, neurodegeneración, neuroinflamación, leucoencefalopatía multifocal progresiva, encefalomielitis, mielolisis pontina central, adrenoleucodistrofia, enfermedad de Alexander, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, leucodistrofia de células globoides, degeneración walleriana, neuritis óptica, mielitis transversa, lesión posterior a la radiación, complicaciones neurológicas de la quimioterapia, neuropatía óptica isquémica aguda, deficiencia de vitamina E, síndrome de deficiencia de vitamina E aislada, síndrome de Bassen-Kornzweig, síndrome de Marchiafava-Bignami, leucodistrofia metacromática, neuralgia de trigémino, parálisis de Bell, tumores primarios, metástasis secundarias o cualquier combinación de las mismas.

17. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo para el uso de la reivindicación 16, en donde el agente terapéutico se libera de la molécula transportadora tras su entrada en el SNC.

18. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para el uso en un método de prevención o tratamiento de una enfermedad, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo se acopla a un agente terapéutico, y en donde el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo transporta el agente acoplado al mismo a través de la barrera hematoencefálica.