ES2869890T3

ES2869890T3 - Proteínas de unión que tienen cadenas ligeras atadas

Info

Publication number: ES2869890T3
Application number: ES13784481T
Authority: ES
Inventors: Michael Hunter; Ronald Swanson
Original assignee: Janssen Biotech Inc
Current assignee: Janssen Biotech Inc
Priority date: 2012-05-02
Filing date: 2013-04-30
Publication date: 2021-10-26
Anticipated expiration: 2033-04-30
Also published as: WO2013166011A2; US9062120B2; WO2013166011A3; DK2844288T3; WO2013166011A9; EP2844288B1; CA2871909C; CA2871909A1; IL235291A0; IL235291B; US20130295084A1; EP2844288A2; EP2844288A4; JP6410711B2; JP2015517467A

Abstract

Una proteína de unión que comprende una cadena ligera atada de dentro afuera, una primera cadena pesada de inmunoglobulina de dentro afuera y una segunda cadena pesada de inmunoglobulina de dentro afuera que se une específicamente a por lo menos a un antígeno, en donde la cadena ligera atada de dentro afuera comprende VH1- CLconector-VH2-CL, la primera cadena pesada atada de dentro afuera comprende VL1-CH, y la segunda cadena pesada atada de dentro afuera comprende VL2-CH, en donde i. VL1 es una primera región variable de cadena ligera; ii. VL2 es una segunda región variable de cadena ligera; iii. CL es una región constante de cadena ligera; iv. VH1 es una primera región variable de cadena pesada; v. VH2 es una segunda región variable de cadena pesada; vi. CH es una región constante de cadena pesada; y vii. el conector es (G4S)4 (SEQ ID NO: 1), (G4S)6 (SEQ ID NO: 2), (G4S)8 (SEQ ID NO: 3) o (G4S)10 (SEQ ID NO: 4).

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas de unión que tienen cadenas ligeras atadas

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a proteínas de unión que tienen cadenas ligeras atadas y métodos para elaborarlas y usarlas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

En la actualidad, varias enfermedades humanas se tratan mediante anticuerpos monoclonales terapéuticos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales humanizados o completamente humanos. En 1975, Kohler y Milstein produjeron hibridomas murinos que secretaban anticuerpos monoclonales (mAb) de especificidad definida y marcaron el comienzo de la era moderna de los mAb terapéuticos que utilizan estas nuevas tecnologías de hibridomas (Kohler y Milstein, Nature 256: 495-97, 1975). Sin embargo, las principales limitaciones de estos agentes terapéuticos tempranos incluyeron la falta de función efectora, la reducción de la semivida en suero y la propensión aumentada a provocar una respuesta inmune no deseada. Las tecnologías de quimerización y humanización ayudaron a superar estas características no deseadas (Carson y Friemark, Adv. Immunol. 38:275-311, 1986; James et al., Scottish Med. J.29: 67-83, 1984; Morrison, Science 229:1202-1207, 1985).

Los anticuerpos biespecíficos de primera generación (BsmAb) que se produjeron fusionando dos líneas celulares de hibridoma establecidas juntas para formar un hibridoma o cuadroma híbrido (Milstein y Cuello, Nature 305:537-540, 1983) o mediante la reticulación química de dos fragmentos F(ab') (Karpovsky et al., J. Exp. Medicine 160: 1686-1701, 1984) permitieron la modulación simultánea de múltiples objetivos. Aunque estos estudios destacaron el potencial terapéutico de los BsmAb, estos enfoques, además de las respuestas adversas in vivo a los fragmentos de anticuerpos murinos, presentaron problemas logísticos con respecto a la producción de lotes grandes homogéneos de anticuerpos purificados. Por ejemplo, la asociación aleatoria de cadenas pesadas y ligeras secretadas por los hibridomas híbridos da como resultado la producción de 10 especies de anticuerpos diferentes de las que debería aislarse la molécula biespecífica deseada.

El primer BsmAb humanizado, MDX-447, (Curnow, Cancer Immunol. Immunother. 45:210-215, 1997) se generó mediante injerto de CDR seguido de acoplamiento químico de los dos dominios Fab' para crear una molécula F(ab')2 biespecífica. Sin embargo, el proceso de reducción, oxidación y posterior purificación subraya el obstáculo clave en la generación de moléculas BsmAb altamente puras a partir del empleo de estos métodos. El aislamiento y purificación de la especie heterodimérica a partir de una especie homodimérica no es posible a escala de producción (Karacay et al., Bioconjugate Chem. 11:842-854, 2000).

Se han desarrollado plataformas adicionales de BsmAb que incluyen diacuerpos (Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 6444-6448, 1993), diacuerpos de cadena sencilla (Brusselbach et al., Tumor Targeting 4:115-123, 1999; Nettlebeck et al., Molecular Therapy 3:882-891, 2001), fragmentos variables de cadena sencilla en tándem (scFv) (engagers de células T biespecíficas (BiTE)) (Mack et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92:7021-7025, 1995.), mAb de botón y agujero (Ridgeway et al., Protein Engineering 9:617-621, 1996.), y anticuerpos de dominio variable dual (WO2007/024715).

La WO 2010/112194 describe polipéptidos de unión a antígeno y anticuerpos multiespecíficos que los comprenden. La WO 2010/115553 describe anticuerpos anti-c-Met y anti-ErbB-2 biespecíficos. R. E. Kontermann, 2012, MABS, 4(2), 182-197, describe estrategias de direccionamiento dual con anticuerpos biespecíficos.

Hay una necesidad en la técnica de proteínas de unión mejoradas capaces de unirse por lo menos a un objetivo y proporcionar facilidad de fabricación y costes reducidos de los productos.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas y cualquier otro aspecto o realización expuestos en la presente que no entren dentro del alcance de las reivindicaciones son solamente por información. La invención proporciona una proteína de unión que comprende una cadena ligera atada de inmunoglobulina de dentro afuera, una primera cadena pesada de inmunoglobulina de dentro afuera y una segunda cadena pesada de inmunoglobulina de dentro afuera que se une específicamente a por lo menos un antígeno, en donde la cadena ligera atada de dentro afuera comprende VH1-CL-conector-VH2-CL, la primera cadena pesada atada de dentro afuera comprende VL1-CH, y la segunda cadena pesada atada de dentro afuera comprende VL2-CH, en donde:

i. VL1 es una primera región variable de cadena ligera;

ii. VL2 es una segunda región variable de cadena ligera;

iii. CL es una región constante de cadena ligera;

iv. VH1 es una primera región variable de cadena pesada;

v. VH2 es una segunda región variable de cadena pesada;

vi. CH es una región constante de cadena pesada; y

vii. el conector es (G4S)4 (SEQ ID NO: 1), (G4S)6 (SEQ ID NO: 2), (G4S)8 (SEQ ID NO: 3) o (G4S)10 (SEQ ID NO: 4).

Otro aspecto de la invención es un vector que comprende un polinucleótido aislado que codifica una proteína de unión de la invención.

Otro aspecto de la invención es una proteína de unión de la invención producida de acuerdo con un método que comprende cultivar una célula huésped en condiciones suficientes para producir la proteína de unión, en donde la célula huésped comprende por lo menos un vector, el por lo menos un vector que comprende un ácido nucleico que codifica la cadena ligera atada de dentro afuera, la primera cadena pesada de dentro afuera y la segunda cadena pesada de dentro afuera.

Otro aspecto de la invención es un polinucleótido aislado que codifica la proteína de unión de la invención. Otro aspecto de la invención es un vector aislado que comprende un polinucleótido aislado que codifica la proteína de unión de la invención.

Otro aspecto de la invención es una célula huésped que comprende un vector de la invención.

Otro aspecto de la invención son métodos para elaborar una proteína de unión de la invención que comprenden cultivar una célula huésped de la invención en condiciones suficientes para producir la proteína de unión.

Otro aspecto de la invención es una proteína de unión biespecífica de la invención producida de acuerdo con un método que comprende cultivar una célula huésped eucariota en condiciones suficientes para producir la proteína de unión, en donde la célula huésped comprende por lo menos un vector, el pro lo menos un vector comprendiendo un ácido nucleico que codifica la cadena ligera atada de dentro afuera, la primera cadena pesada de dentro afuera y la segunda cadena pesada de dentro afuera.

Otro aspecto de la invención es un método para elaborar una proteína de unión biespecífica que une un primer antígeno y un segundo antígeno que comprende una cadena ligera atada de dentro afuera, una primera cadena pesada de dentro afuera y una segunda cadena pesada de dentro afuera, que comprende proporcionar ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo que se une al primer antígeno que tiene una primera cadena ligera que comprende una primera región variable de cadena ligera (VL1) y una primera región constante de cadena ligera (CL1), y una primera cadena pesada que comprende una primera región variable de cadena pesada (VH1) y una primera región constante de cadena pesada (CH1); proporcionar ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo que se une al segundo antígeno que tiene una segunda cadena ligera que comprende una segunda región variable de cadena ligera (VL2) y una segunda región constante de cadena ligera (CL2), y una segunda cadena pesada que comprende una segunda región variable de cadena pesada (VH2) y una segunda región constante de cadena pesada (CH2); proporcionar un ácido nucleico que codifica un conector; en donde el conector es (G4S)4 (SEQ ID NO: 1), (G4S)6 (SEQ ID NO: 2), (G4S)8 (SEQ ID NO: 3) o (G4S)10 (SEQ ID NO: 4); enlazar operativamente H1-CL1-conector-VH2-CL2 desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal para generar la cadena ligera atada de dentro afuera; enlazar operativamente VL1-CH1 desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal para generar la primera cadena pesada de dentro afuera; enlazar operativamente VL2- CH2 desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal para generar la segunda cadena pesada de dentro afuera; expresar la cadena ligera atada de dentro afuera, la primera cadena pesada de dentro afuera y la segunda cadena pesada de dentro afuera en una célula huésped; y recuperar la proteína de unión biespecífica.

Otro aspecto de la invención es una proteína de unión biespecífica producida mediante los métodos de la invención.

Otro aspecto de la invención es una composición farmacéutica que comprende la proteína de unión de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable.

BREVE DESCRIPCIÓN DEL DIBUJO

La Figura 1 muestra el diseño de proteínas de unión que tienen cadenas ligeras atadas. A) cadena ligera atada monoespecífica bivalente que contiene proteína de unión; B) cadena ligera atada biespecífica que contiene proteína de unión; C) cadena ligera atada de dentro afuera bivalente que contiene proteína de unión; D) cadena ligera atada de dentro afuera biespecífica que contiene proteína de unión.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas y cualquier otro aspecto o realización expuestas en la presente que no entren dentro del alcance de las reivindicaciones son solamente para información. El término "proteína de unión", como se usa en la presente, significa una proteína que se une específicamente a uno o más antígenos que tienen una cadena ligera de inmunoglobulina atada y dos cadenas pesadas de inmunoglobulina, o fragmentos de las mismas. Las estructuras de las cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulinas son bien conocidas.

"Cadena ligera de dentro afuera", como se usa en la presente, se refiere a una cadena ligera de inmunoglobulina sintética que tiene una región variable derivada de una región variable de cadena pesada enlazada operativamente a una región constante de cadena ligera. "Cadena pesada de dentro afuera", como se usa en la presente, se refiere a una cadena pesada de inmunoglobulina sintética que tiene una región variable derivada de una región variable de cadena ligera enlazada operativamente a una región constante de cadena pesada. "Cadena ligera atada de dentro afuera" como se usa en la presente se refiere a una cadena ligera atada que tiene una primera cadena ligera de dentro afuera enlazada operativamente desde su extremo C-terminal a un extremo N-terminal de una segunda cadena ligera de dentro afuera a través de un conector polipeptídico. Típicamente, las cadenas ligeras y pesadas "de dentro afuera" se generan mediante el intercambio de la región V de un anticuerpo existente que se une específicamente a un antígeno (Simon y Rajewsky, EMBO J.9: 1051 -1056, 1990).

El término "cadena ligera atada", como se usa en la presente, significa una cadena de anticuerpo sintético que tiene una primera cadena ligera enlazada operativamente desde su extremo C-terminal a un extremo N-terminal de una segunda cadena ligera mediante un conector polipeptídico. La primera y la segunda cadenas ligeras pueden ser de origen natural o sintéticas.

El término "región variable" como se usa en la presente significa una región variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) o región variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) que incluye secuencias de aminoácidos de sitios de unión de antígeno (por ejemplo, ^cDR1, CDR2, CDR3) y marcos (por ejemplo FR1, FR2, FR3, FR4). La región variable de cadena ligera (VL) puede ser kappa (^k) o lambda (A) y está codificada por genes IGVK o IGVL e IGJK o IGJL de anticuerpo, y la región variable de cadena pesada (VH) está codificada por genes IGVH, IGDH, y IGJH de anticuerpo. La organización genómica de los loci de genes de cadena pesada y ligera humana, estructuras de genes de anticuerpos, reordenamientos de genes y secuencias son bien conocidas en la técnica.

Una región variable de anticuerpo consiste de una región "marco" interrumpida por tres "sitios de unión al antígeno". Los sitios de unión al antígeno se definen usando varios términos: (i) Regiones determinantes de la complementariedad (CDR), tres en la VH (HCDR1, HCDR2, HCDR3) y tres en la Vl (LCDR1, LCDR2, LCDR3), se basan en la variabilidad de secuencia (Wu y Kabat, J. Exp. Med. 132:211-250, 1970; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991). (ii) "Regiones hipervariables", "HVR" o "HV", tres en la VH (H1, H2, H3) y tres en la VL (L1, L2, L3), se refieren a las regiones de los dominios variables de un anticuerpo que son hipervariables en estructura según lo definido por Chothia y Lesk (Chothia y Lesk, Mol. Biol.196: 901-917, 1987). Otros términos incluyen "IMGT-CDR" (Lefranc et al., Dev. Comparat. Immunol. 27:55-77, 2003) y "Especificidad determinante del uso de residuos" (SDRU) (Almagro, Mol. Recognit. 17:132-143, 2004). La base de datos International ImMunoGeneTics (IMGT) (http://www_imgt_org) proporciona una numeración y una definición estandarizadas de los sitios de unión a antígenos. La correspondencia entre las delimitaciones de ^cD^r, HV e IMGT se describe en Lefranc et al., Dev. Comparat. Immunol. 27:55-77, 2003.

"Marco" o "secuencias marco" son las secuencias restantes de una región variable distintas de las definidas como sitio de unión al antígeno. El marco se divide típicamente en cuatro regiones, FR1, FR2, FR3 y FR4, que forman un andamiaje para los tres sitios de unión al antígeno en cada región variable. Como el sitio de unión al antígeno puede definirse mediante varios términos como se ha descrito anteriormente, la secuencia de aminoácidos exacta de un marco depende de cómo se definió el sitio de unión al antígeno.

El término "región constante" como se usa en la presente significa una región constante de cadena ligera de anticuerpo (CL) o una región constante de cadena pesada de anticuerpo (CH). Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadenas pesadas, los anticuerpos pueden asignarse a cinco clases principales, concretamente, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. IgA e IgG se subclasifican además como los isotipos IgA¹, IgA², IgG¹, IgG², IgG3 e IgG4. Las secuencias de regiones constantes de anticuerpos son bien conocidas.

El término "biespecífico", como se usa en la presente, significa una proteína de unión que está diseñada para comprender dos sitios de unión al antígeno, cada uno de los cuales se une específicamente a un antígeno diferente o un epítopo diferente.

El término "monoespecífico", como se usa en la presente, significa que una proteína de unión tiene uno o más sitios de unión al antígeno, cada uno de los cuales se une al mismo antígeno o epítopo.

El término "conector" o "conector polipeptídico" como se usa en la presente significa un conector polipeptídico que comprende dos o más residuos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos. Tales polipéptidos conectores son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Holliger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993; Poljak, et al., Structure 2:1121-1123, 1994). Los conectores ejemplares contienen glicina (G) y serina (S), por ejemplo (GxS)n (x=3-4, y=4-10), como (G4S)6(SEQ ID NO: 2). Cualquier conector conocido en la técnica puede seleccionarse y usarse opcionalmente siempre que pueda enlazar operativamente las dos cadenas ligeras juntas para generar una cadena ligera atada. El conector peptídico puede tener aproximadamente 2-70 aminoácidos, aproximadamente 5-50 aminoácidos, aproximadamente 10-40 aminoácidos o aproximadamente 20 aminoácidos de longitud. El término "operativamente enlazado" como se usa en la presente se refiere a un posicionamiento de componentes tal que funcionen de la manera pretendida. La longitud del conector puede determinarse experimentalmente probando una serie de cadenas ligeras atadas enlazadas operativamente por conectores de diferentes longitudes expresadas con cadenas pesadas para determinar la capacidad de las proteínas de unión formadas para unirse por lo menos a un antígeno predeterminado.

El término "se une específicamente" o "unión específica", como se usa en la presente, se refiere a la unión de una proteína de unión a un antígeno predeterminado. La afinidad de la unión se define en términos de una constante de disociación (K^d). La proteína de unión se une específicamente a un antígeno cuando la K^des menor de aproximadamente 10-7 M, como aproximadamente 10-8 M o menos, como aproximadamente 10-9 M o menos, aproximadamente 10-10 M o menos; aproximadamente 10-11 M o menos, aproximadamente 10-12 M o menos, o incluso menos, y se une al antígeno predeterminado con una afinidad correspondiente a una K^dque sea por lo menos diez veces menor que su afinidad para unirse a un antígeno no específico (como BSA o caseína), como por lo menos 100 veces menor, por ejemplo, por lo menos 1.000 veces menor, como por lo menos 10.000 veces menor. Una proteína de unión biespecífica se une específicamente a dos antígenos o epítopos diferentes. La afinidad puede medirse usando métodos bien conocidos, por ejemplo, en un ensayo in vitro usando resonancia de plasmones (BIAcore, GE-Healthcare Uppsala, Suecia).

El término "antígeno", como se usa en la presente, se refiere a un epítopo que es reconocido por la proteína de unión de la invención. Los antígenos pueden ser porciones de una proteína, un péptido, carbohidrato, lípido y similares.

El término "K^d", como se usa en la presente, se refiere a la constante de disociación de una interacción proteína de unión-antígeno particular como se conoce en la técnica.

El término "Kon", como se usa en la presente, se refiere a la constante de tasa para la asociación de una proteína de unión al antígeno para formar el complejo anticuerpo/antígeno como se conoce en la técnica.

El término "Koff", como se usa en la presente, se refiere a la constante de tasa para la disociación de una proteína de unión del complejo de proteína de unión/antígeno como se conoce en la técnica.

El término "epítopo", como se usa en la presente, significa una porción de un antígeno a la que se une específicamente una proteína de unión. Los epítopos habitualmente consisten de agrupaciones superficiales químicamente activas (como polares, no polares o hidrófobas) de fracciones como cadenas laterales de aminoácidos o polisacáridos y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Un epítopo puede ser de naturaleza lineal o puede ser un epítopo discontinuo, por ejemplo, un epítopo conformacional, que está formado por una relación espacial entre aminoácidos no contiguos de un antígeno en lugar de una serie lineal de aminoácidos. Un epítopo conformacional incluye epítopos que resultan del plegamiento de un antígeno, donde los aminoácidos de diferentes porciones de la secuencia lineal del antígeno se encuentran muy próximos en el espacio tridimensional.

El término "sustancialmente idéntico" como se usa en la presente significa que las dos secuencias de polipéptidos que se comparan son idénticas o tienen sustituciones que no dan como resultado alteraciones en las propiedades de unión del polipéptido. Típicamente, esto implica una o más sustituciones de aminoácidos con un aminoácido que tiene una carga similar, características hidrófobas o estereoquímicas, o con alanina. Los expertos en la técnica pueden determinar y probar las sustituciones de aminoácidos que retienen la función. En la Tabla 1 se muestran sustituciones de aminoácidos ejemplares.

La presente invención proporciona proteínas de unión que se unen específicamente a por lo menos un antígeno y, por tanto, pueden usarse ampliamente en aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico. La invención se basa en un descubrimiento de que las cadenas ligeras atadas modificadas genéticamente pueden coexpresarse con cadenas pesadas para formar proteínas de unión funcionales que se unen a por lo menos un antígeno predeterminado con alta afinidad. Las proteínas de unión de la invención pueden modificarse para que sean biespecíficas, facilitando los protocolos de expresión y purificación y mejorando los rendimientos a la vez que se retienen las funciones efectoras de Fc.

La presente invención proporciona polinucleótidos que codifican las proteínas de unión de la invención o ácidos nucleicos complementarios de las mismas, vectores, células huésped y métodos para elaborarlos y usarlos.

Tabla 1.

Proteínas de unión que comprenden cadenas ligeras atadas

La Figura 1 muestra varios diseños de proteínas de unión que comprenden cadenas ligeras atadas.

Los dominios de anticuerpos se denominan en la memoria descriptiva como:

i. VL1: una primera región variable de cadena ligera

ii. VL2: una segunda región variable de cadena ligera;

iii. CL: una región constante de cadena ligera;

iv. VH1: una primera región variable de cadena pesada;

v. VH2: una segunda región variable de cadena pesada;

vi. CH: una región constante de cadena pesada.

El conector al que se hace referencia es un conector polipeptídico.

Los sitios de unión a antígenos en las proteínas de unión de la invención están formados por pares VL1/VH1 y VL2/VH2. Los dos pares pueden unirse al mismo antígeno o uno diferente, dando como resultado proteínas de unión monoespecíficas o biespecíficas.

En una realización, la proteína de unión de la invención comprende una cadena ligera atada, una primera cadena pesada y una segunda cadena pesada, en donde la proteína de unión se une específicamente a por lo menos un antígeno.

En otra realización, la proteína de unión comprende una cadena ligera atada que comprende VLI-CL-conector-VL2-CL, una primera cadena pesada que comprende VH1-CH y una segunda cadena pesada que comprende VH2-CH.

En otra realización, la proteína de unión comprende una cadena ligera atada de dentro afuera, una primera cadena pesada de dentro afuera y una segunda cadena pesada de dentro afuera, en donde la proteína de unión se une específicamente a por lo menos a un antígeno.

En otra realización, la proteína de unión comprende una cadena ligera atada de dentro afuera que comprende VH1-CL-conector-VH2-CL, una primera cadena pesada de dentro afuera que comprende VL1-CH, y una segunda cadena pesada de dentro afuera que comprende VL2-CH.

Las cadenas ligeras atadas de dentro afuera y las cadenas pesadas de dentro afuera de las proteínas de unión de la invención pueden generarse usando un intercambio de dominio variable en donde los dominios variables se originan típicamente a partir de un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno (ver Simon y Rajewsky, EMBO J 9: 1051-1056, 1990).

En otra realización, la proteína de unión de la invención comprende una cadena ligera atada de dentro afuera que comprende VH1-CL-conector-VH2-CL, una primera cadena pesada de dentro afuera que comprende VL1-CH, y una segunda cadena pesada de dentro afuera que comprende VL2-CH, en donde la proteína de unión es biespecífica.

Las cadenas ligeras atadas de dentro afuera y las cadenas pesadas de dentro afuera de las proteínas de unión biespecíficas de la invención pueden generarse usando un intercambio de dominio variable en donde los dominios variables se originan típicamente a partir de dos anticuerpos, cada uno de los cuales se une específicamente a un antígeno diferente (ver Simon y Rajewsky, E.VBO J9:1051 -1056, 1990). La generación de moléculas de unión biespecíficas usando intercambio de dominios variables para crear cadenas ligeras atadas de dentro afuera presenta un nuevo enfoque para generar moléculas de cadena ligera de alta especificidad donde pueden añadirse diferentes especificidades de antígeno en tándem y expresarse como una única proteína recombinante. En una proteína de unión biespecífica ejemplar, la VL1 y la VH1 se derivan de un anticuerpo que se une específicamente a un primer antígeno y la VL2 y la VH2 se derivan de un anticuerpo que se une específicamente a un segundo antígeno. En otra proteína de unión biespecífica ejemplar, la cadena ligera atada de dentro afuera comprende VH1 y VH2 derivadas del primer y el segundo anticuerpo, cada uno de los cuales se une específicamente a un antígeno diferente, mientras que los dominios VL1 y VL2 en la primera y la segunda cadena pesada de dentro afuera tienen secuencias de aminoácidos idénticas o sustancialmente idénticas, es decir, VL1 y VL2 se derivan del primer anticuerpo que se une específicamente al primer antígeno. Muchos anticuerpos, por ejemplo Herceptin® (trastuzumab) (Bostrom et al., Science 323:1610-1614, 2009) se unen a antígenos predominantemente a través de sus cadenas pesadas. La creación de cadenas ligeras atadas de dentro afuera permite que la especificidad de la región variable de la cadena pesada del primer anticuerpo que se une específicamente a un primer antígeno y el segundo anticuerpo que se une específicamente a un segundo antígeno se transfiera a la cadena ligera atada de dentro afuera, y permite la expresión y purificación de proteínas de unión biespecíficas de la invención de una manera similar a los anticuerpos convencionales, ya que solo se requiere una cadena pesada de dentro afuera para la coexpresión y retención de la especificidad de unión.

Los conectores ejemplares que pueden usarse para unir dos cadenas ligeras son conectores que contienen poliglicina o glicina y serina. El uso de conectores peptídicos de origen natural y artificiales para conectar polipéptidos en nuevos polipéptidos de fusión enlazados es bien conocido en la técnica (Hallewell et al., J Biol Chem 264:5260-5268, 1989; Alfthan et al., Protein Eng. 8:725-731, 1995; Robinson & Sauer, Biochemistry 35:109-116, 1996; Patente de Estados Unidos N° 5.856.456). Los conectores ejemplares son (G4S)4 (SEQ ID NO: 1), (G4S)6 (SEQ ID NO: 2), (G4S)^b(SEQ ID NO: 3) y (G⁴S⁾¹⁰(SEQ ID NO: 4).

Las regiones variables de las proteínas de unión de la invención pueden ser cualquier región variable de mamífero o roedor, como humano, conejo, ratón o rata, de regiones variables quiméricas, humanizadas, adaptadas a humanos o humanas.

Las regiones constantes de cadena ligera atadas (CL) pueden ser cualquier región constante de mamífero o roedor, como humano, conejo, ratón o rata. Las regiones constantes de cadena ligera ejemplares son C^k(SEQ ID NO: 5) y CA (SEQ ID NO: 6) humanas.

Las cadenas pesadas en las proteínas de unión ejemplares de la invención pueden ser de los isotipos IgG, IgD, IgE, IgA o IgM. Las regiones constantes de cadena pesada (CH) ejemplares pueden derivarse de cualquier región constante de mamífero o roedor, como humano, conejo, ratón o rata. Por ejemplo, una región constante de cadena pesada humana útil es de tipo IgG1 (SEQ ID nO: 7), IgG2 (SEQ ID NO: 8) o IgG4 (SEQ ID NO: 9).

Las proteínas de unión de la invención pueden modificarse postraduccionalmente mediante procesos como glicosilación, isomerización, desglicosilación o modificación covalente de origen no natural como la adición de fraccione de polietilenglicol (PEG) (pegilación) y lipidación. Tales modificaciones pueden producirse in vivo o in vitro. Por ejemplo, las proteínas de unión de la invención pueden conjugarse con polietilenglicol (PEGilado) para mejorar sus perfiles farmacocinéticos. La conjugación puede llevarse a cabo mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Se ha demostrado que la conjugación de, por ejemplo, anticuerpos terapéuticos con PEG mejora la farmacodinámica a la vez que no interfiere con la función ((Deckert et al., Int. J. Cancer 87:382-390, 2000; Knight et al., Platelets 15:409-418, 2004; Leong et al., Cytokine 16:106-119, 2001; Yang et al., Protein Eng. 16:761-770, 2003).

Las proteínas de unión de la invención pueden optimizarse para sus funciones efectoras mediadas por Fc como citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica. "Fc" es un término bien conocido y se define sobre la base de la escisión de anticuerpos con papaína. Las sustituciones adecuadas en los residuos de la cadena pesada para la modificación de Fc son bien conocidas en la técnica (para una revisión, ver Strohl, Curr Opin Biotechnol. 20:685-91,2009).

Métodos para elaborar proteínas de unión de la invención

Las proteínas de unión de la invención pueden generarse mediante ingeniería usando técnicas de biología molecular estándar usando anticuerpos existentes que se unen a un antígeno deseado como plantillas. Pueden usarse métodos de PCR seguido de clonación estándar para generar las cadenas ligeras y las cadenas pesadas atadas. Los ácidos nucleicos que codifican cadenas ligeras y cadenas pesadas atadas se insertan en el mismo vector de expresión o en uno diferente y están operativamente enlazados a secuencias de control como una secuencia señal, un promotor, un potenciador y una secuencia de terminación de la transcripción (ver Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10032, 1989; WO 90/07861; Co et al., J. Immunol. 148, 1149, 1992).

Una realización de la invención es un método para elaborar una proteína de unión biespecífica que se une un primer antígeno y un segundo antígeno que comprende una cadena ligera atada de dentro afuera, una primera cadena pesada de dentro afuera y una segunda cadena pesada de dentro afuera, que comprende

a) proporcionar un anticuerpo que se une al primer antígeno que tiene una primera cadena ligera que comprende una primera región variable de cadena ligera (VL1) y una primera región constante de cadena ligera (CL1), y una primera cadena pesada que comprende una primera región variable de cadena pesada (VH1)) y una primera región constante de cadena pesada (CH1);

b) proporcionar un anticuerpo que se une al segundo antígeno que tiene una segunda cadena ligera que comprende una segunda región variable de cadena ligera (VL2) y una segunda región constante de cadena ligera (CL2), y una segunda cadena pesada que comprende una segunda región variable de cadena pesada (VH2) y una segunda región constante de cadena pesada (CH2);

c) proporcionar un conector;

d) enlazar operativamente VH1-CL1-conector-VH2-CL2 desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal para generar la cadena ligera atada de dentro afuera;

e) enlazar operativamente VL1-CH1 desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal para generar la primera cadena pesada de dentro afuera;

f) enlazar operativamente VL2-CH2 desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal para generar la segunda cadena pesada de dentro afuera;

g) expresar la cadena ligera atada de dentro afuera, la primera cadena pesada de dentro afuera y la segunda cadena pesada de dentro afuera; y

h) recuperar la proteína de unión biespecífica.

Las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada atadas de las proteínas de unión de la invención pueden derivarse de anticuerpos elaborados mediante el método de hibridoma de Kohler et al., Nature 256: 495-497, 1975. Pueden prepararse regiones variables derivadas de mAbs adaptados a humanos que tienen CDR derivadas de una inmunoglobulina de un donante no humano y marcos derivados de una o más inmunoglobulinas humanas mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica como la divulgada en la Patente de Estados Unidos N° 5.225.539. Los expertos en la técnica pueden seleccionar secuencias marco humanas útiles para la adaptación a humanos a partir de bases de datos relevantes. Opcionalmente, los mAb adaptados a humanos pueden modificarse adicionalmente incorporando residuos de soporte de marco alterados para preservar la afinidad de unión mediante técnicas como las divulgadas en Queen et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86:10029-10032, 1989 y Hodgson et al., Bio/Technology 9:421, 1991.

Pueden prepararse regiones variables derivadas de anticuerpos completamente humanos a partir de ratones transgénicos de inmunoglobulina humana mediante técnicas a las que se hace referencia, por ejemplo, en Lonberg et al., Nature 368:856-859, 1994; Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-851, 1996; y Méndez et al., Nature Genetics 15:146-156, 1997. También pueden prepararse y optimizarse anticuerpos completamente humanos a partir de bibliotecas de presentación de fagos mediante técnicas a las que se hace referencia, por ejemplo, en Knappik et al., J. Mol. Biol. 296:57-86, 2000; y Krebs et al., J. Immunol. Meth. 254:67-842001; Shi et al., J Mol Biol.

397:385-96, 2010.

Las regiones variables de las proteínas de unión de la invención también pueden derivarse de bibliotecas de anticuerpos usando presentación de ribosomas (Mattheakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022-6, 1994) y presentaciones bacterianas (Chen y Georgiou, Biotechnol Bioeng, 79:496-503, 2002).

Las proteínas de unión de la invención pueden purificarse mediante metodologías estándar usadas para purificar moléculas de inmunoglobulina, por ejemplo, mediante cromatografía (por ejemplo, cromatografía en columna de intercambio iónico, afinidad y dimensionamiento). Las proteínas de unión de la presente invención o fragmentos de las mismas pueden fusionarse con secuencias de polipéptidos heterólogos descritas en la presente o conocidas de otro modo en la técnica, para facilitar la purificación.

La afinidad de una proteína de unión de la invención por un antígeno puede determinarse experimentalmente usando cualquier método adecuado. (Ver, por ejemplo, Berzofsky, et al., "Antibody-Antigen Interactions", en Fundamental Immunology, Paul, W.E., Ed., Raven Press: Nueva York, NY (1984); Kuby, Janis Immunology, W.H. Freeman and Company: Nueva York, NY (1992); y métodos descritos en la presente). La afinidad medida de una interacción proteína de unión-antígeno particular puede variar si se mide en diferentes condiciones (por ejemplo, osmolaridad, pH). Por tanto, las mediciones de afinidad y otros parámetros de unión a antígenos (por ejemplo, Kd, Kon, Koff) se elaboran preferiblemente con soluciones estandarizadas de proteína de unión y antígeno, y un tampón estandarizado, como el tampón descrito en la presente.

Polinucleótidos, vectores y células huésped

La invención proporciona ácidos nucleicos que codifican las proteínas de unión de la invención como polinucleótidos aislados o como porciones de vectores de expresión o como porciones de secuencias de ADN lineal, incluyendo secuencias de ADN lineal usadas para la transcripción/traducción in vitro, vectores compatibles con expresión de fagos procariotas, eucariotas o filamentosas, secreción y/o presentación de las composiciones de los mismos. En la presente se divulgan ciertos polinucleótidos ejemplares, sin embargo, otros polinucleótidos que, dada la degeneración del código genético o las preferencias de codones en un sistema de expresión dado, codifican las proteínas de unión de la invención también están dentro del alcance de la invención.

Los polinucleótidos de la invención pueden producirse mediante síntesis química como síntesis de polinucleótidos en fase sólida en un sintetizador de polinucleótidos automatizado y ensamblarse en moléculas completas de cadena sencilla o doble. Alternativamente, los polinucleótidos de la invención pueden producirse mediante otras técnicas como PCR seguido de clonación rutinaria. Las técnicas para producir u obtener polinucleótidos de una secuencia conocida dada son bien conocidas en la técnica.

Los polinucleótidos de la invención pueden comprender por lo menos una secuencia no codificante, como una secuencia promotora o potenciadora, intrón, señal de poliadenilación y similares. Las secuencias de polinucleótidos también pueden comprender secuencias adicionales que codifican aminoácidos adicionales que codifican, por ejemplo, un marcador o una secuencia de etiqueta como una hexahistidina o una etiqueta HA para facilitar la purificación o detección de la proteína o una secuencia señal.

Un polinucleótido ejemplar comprende secuencias para un promotor de CMV, una secuencia señal y secuencias que codifican una cadena ligera atada de dentro afuera o una cadena pesada de dentro afuera de la proteína de unión de la invención, un sitio de poliadenización de SV40 y un origen de replicación bacteriano (ori).

Otra realización de la invención es un vector que comprende por lo menos un polinucleótido de la invención. Tales vectores pueden ser vectores plasmídicos, vectores virales, vectores para la expresión de baculovirus, vectores basados en transposones o cualquier otro vector adecuado para la introducción de los polinucleótidos de la invención en un organismo o antecedente genético dado mediante cualquier medio. Tales vectores pueden ser vectores de expresión que comprenden elementos de secuencias de ácidos nucleicos que pueden controlar, regular, provocar o permitir la expresión de un polipéptido codificado por dicho vector. Tales elementos pueden comprender sitios de unión de potenciadores transcripcionales, sitios de iniciación de ARN polimerasa, sitios de unión de ribosomas y otros sitios que facilitan la expresión de polipéptidos codificados en un sistema de expresión dado. Tales sistemas de expresión pueden ser sistemas basados en células o libres de células bien conocidos en la técnica.

Otra realización de la invención es una célula huésped que comprende un vector de la invención. Tales células huésped pueden ser células eucariotas, células bacterianas, células vegetales o células arqueales. Las células eucariotas ejemplares pueden ser de origen mamífero, insecto, aviar u otro animal. Las células eucariotas de mamífero incluyen líneas celulares inmortalizadas como hibridomas o líneas celulares de mieloma como SP2/0 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, CRL-1581), NS0 (European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Wiltshire, Reino Unido, ECACC N° 85110503), líneas celulares murinas FO (ATCC CRL-1646) y Ag653 (ATCC CRL-1580). Una línea celular de mieloma humano ejemplar es U266 (ATTC CRL-TIB-196). Otras líneas celulares útiles incluyen las derivadas de células de ovario de hámster chino (CHO) como líneas celulares CHO-K1SV (Lonza Biologics, Walkersville, MD), CHO-K1 (ATCC CRL-61) o DG44, o Hek293.

Usos de las proteínas de unión de la invención.

Las composiciones de las proteínas de unión descritas en la presente y generadas por cualquiera de los métodos descritos anteriormente pueden usarse para diagnosticar, monitorizar, modular, tratar, aliviar, ayudar a prevenir la incidencia o reducir los síntomas de enfermedades humanas o patologías específicas en las células, tejidos, órganos, fluido o, en general, un huésped. Puede usarse una proteína de unión diseñada para un propósito específico para tratar una enfermedad inmunomediada o de inmunodeficiencia, una enfermedad metabólica, un trastorno o enfermedad cardiovascular; una enfermedad maligna; un trastorno o enfermedad neurológica; una infección como una infección bacteriana, viral o parasitaria; u otra afección relacionada conocida o especificada que incluye hinchazón, dolor y necrosis o fibrosis tisular.

Dicho método puede comprender administrar una cantidad eficaz de una composición o una composición farmacéutica que comprende por lo menos una proteína de unión que une específicamente un antígeno a una célula, tejido, órgano, animal o paciente con necesidad de dicha modulación, tratamiento, alivio, prevención o reducción de síntomas, efectos o mecanismos. La cantidad eficaz puede comprender una cantidad de aproximadamente 0,001 a 500 mg/kg por administración única (por ejemplo, bolo), múltiple o continua, o para lograr una concentración sérica de 0,01-5000 gg/ml de concentración sérica por administración única, múltiple o continua, o cualquier intervalo o valor efectivo en el mismo, como se hace y se determina usando métodos conocidos, como se describe en la presente o se conocen en las técnicas relevantes.

Composiciones farmacéuticas que comprenden proteínas de unión de la invención

Para uso terapéutico, las proteínas de unión que se unen específicamente a un antígeno pueden prepararse como composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad eficaz de la proteína de unión como ingrediente activo en un portador farmacéuticamente aceptable. El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el compuesto activo. Tales vehículos pueden ser líquidos, como agua y aceites, incluyendo los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Por ejemplo, puede usarse solución salina al 0,4% y glicina al 0,3%. Estas soluciones son estériles y están generalmente libres de partículas. Pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas (por ejemplo, filtración). Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximar las condiciones fisiológicas como agentes reguladores del pH y tampones, agentes estabilizantes, espesantes, lubricantes y colorantes, etc. La concentración de la proteína de unión de la invención en tal formulación farmacéutica puede variar ampliamente, es decir, de menos de aproximadamente un 0,5%, habitualmente de o por lo menos aproximadamente el 1% hasta tanto como 1 el 5 o 20% en peso y se seleccionará principalmente en base a la dosis requerida, volúmenes de fluido, viscosidades, etc., de acuerdo con el modo particular de administración seleccionada. Los vehículos y formulaciones adecuados, incluyendo otras proteínas humanas, por ejemplo, albúmina de suero humano, se describen, por ejemplo, en, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a Edición, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Filadelfia, PA 2006, Parte 5, Pharmaceutical Manufacturing págs. 691-1092, ver especialmente págs. 958-989.

El modo de administración para uso terapéutico de la proteína de unión de la invención puede ser cualquier vía adecuada que administre el agente al huésped, como administración parenteral, por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa o subcutánea, pulmonar; transmucosal (oral, intranasal, intravaginal, rectal); usando una formulación en un comprimido, cápsula, solución, polvo, gel, partícula; y contenido en una jeringuilla, un dispositivo implantado, bomba osmótica, cartucho, microbomba; u otros medios apreciados por el experto en la técnica, bien conocidos en la técnica. La administración específica del sitio puede lograrse, por ejemplo, por administración intrarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitaria, intracelial, intracerebelosa, intracerebroventricular, intracólica, intracervical, intragástrica, intrahepática, intracardiaca, intraósea, intrapélvica, intrapericárdica, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretinniana, intraespinal, intrasinovial, intratorácica, intrauterina, intravascular, intravesical, intralesional, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal o transdérmica.

Aunque se ha descrito la invención en términos generales, las realizaciones de la invención se divulgarán adicionalmente en los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como limitantes del alcance de las reivindicaciones.

Materiales y métodos

Clonación y expresión

Las cadenas pesadas y ligeras se clonaron usando métodos estándar. Para generar una cadena ligera atada de dentro afuera, se enlazó operativamente una región variable de cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno a la región constante de IgK. Para generar una cadena pesada de dentro afuera, se enlazó operativamente una región variable de cadena ligera de un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno a la región constante de IgG1 humana. Se generaron cadenas ligeras de dentro afuera atadas enlazando operativamente dos cadenas ligeras de dentro afuera a través de un conector (G⁴S) de varias longitudes para generar un polipéptido VH-IgK-conector-VH-IgK. Los anticuerpos usados como plantillas para los dominios VH y VL fueron anticuerpos anti-oncostatina M humana OSMM55 y OSMM69 (descritos en la Solicitud de patente publicada de Estados Unidos N° 2012-0093833 A1), anticuerpos anti-factor tisular humano TF7M16 y TF7M58 (descritos en la. Solicitud de Estados Unidos Número de serie 13/398881) y anticuerpo anti-factor tisular de ratón MTFM27.

Se transfectaron transitoriamente células HEK93-F con los constructos generados usando reactivo de transfección Freestyle™ Max (Invitrogen N° de cat. 16447), y los anticuerpos expresados se purificaron del medio después de 4 días de cultivo usando proteínas A y columnas de exclusión por tamaño Superdex 200. Se recogieron y combinaron las fracciones correspondientes al pico de monómero. La calidad de las proteínas purificadas se evaluó mediante SDS-PAGE y HPLC de exclusión por tamaño analítica (sistema Dionex HPLC). Las proteínas purificadas se almacenaron a 4° C hasta que se realizaron los ensayos.

Purificación de proteínas

Las purificaciones se realizaron usando los sistemas de cromatografía AKTA FPLC. Los sobrenadantes celulares de las células HEK293-F transfectadas transitoriamente se recogieron 4 días después de la transfección, se aclararon mediante centrifugación (30 min, 6000 rpm) y se filtraron (membrana PES de 0,2 pm, Corning, Acton, MA). Las muestras transfectadas a escala de 1 a 2 l se concentraron 10 veces usando un concentrador Centramate (Pall Corporation, Port Washington, NY). Luego, las muestras concentradas se diluyeron con 10x PBS a una concentración final de 1x PBS y se filtraron de nuevo 0,2 pM. Los sobrenadantes diluidos se cargaron en una columna de Proteína A HiTrap MabSelect Sure equilibrada (PBS, pH 7) (GE Healthcare, Waukesha, WI) a una concentración relativa de ~10 mg de proteína por ml de resina. Después de la carga, la columna se lavó con PBS, pH 7 y la proteína se eluyó con 10 volúmenes de columna de acetato de sodio 0,1 M, pH 3,5. Las fracciones de proteína se neutralizaron mediante la adición de tris-HCl 1 M, pH 8,0. Las fracciones de los picos se agruparon, se concentraron y se cargaron en una columna de exclusión por tamaño Superdex 200 preequilibrada con PBS, pH 7,2. Se recogieron y agruparon las fracciones correspondientes al pico de monómero. La calidad de las proteínas purificadas se evaluó mediante SDS-PAGE (Fig. 3) y HPLC de exclusión por tamaño analítico (sistema Dionex HPLC). Las proteínas purificadas se almacenaron a 4° C hasta que se realizaron los ensayos.

Análisis Biacore

Las mediciones de afinidad usando resonancia de plasmones de superficie (SPR) se realizaron usando un biosensor óptico Biacore 3000 (Biacore). Los datos recopilados se procesaron usando el software BIAevaluation, versión 3.2 (Biacore). Luego, se realizó el análisis cinético de los datos usando un modelo de unión 1:1 con ajuste global. El resultado para cada mAb se informó en el formato de Ka (tasa de asociación), Kd (tasa de disociación) y K^d(constante de afinidad).

Anticuerpos anti-OSM. Se inmovilizaron aproximadamente 9.000 RU (unidades de respuesta)/pocillo de Fc anti-IgG humana (Jackson N° de cat. 109-005-098) en la superficie de dextrano carboximetilado de un chip CM-5 (Biacore, N° de cat. BR-1000-14) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los experimentos cinéticos se realizaron a 25° C en tampón de ejecución (DPBS P20 al 0,005% EDTA 3 mM 100 pg/ml BSA). Se prepararon diluciones en serie de OSM ECD humana (SEQ ID NO: 10) de 25 nM a 0,391 nM en tampón de ejecución. Se capturaron aproximadamente 50-70 RU de mAb en la celda de flujo 2 a 4 del chip sensor. La celda de flujo 1 se utilizó como superficie de referencia. La captura de mAb fue seguida por una inyección de tres minutos (fase de asociación) de antígeno a 50 pl/min, seguido de 20 o 120 minutos de flujo de tampón (fase de disociación). La superficie del chip se regeneró mediante dos pulsos de inyecciones de 18 segundos de 100 mM de H³PO⁴(Sigma, N° de cat. 7961) a 50 pl/min.

Anticuerpos anti-factor tisular. Se inmovilizaron aproximadamente 19.000 RU (unidades de respuesta) de anticuerpos anti-IgG Fc (mezcla de anti-ratón (Jackson N° de cat. 315-005-046) y anti-humanos (Jackson N° de cat.

109-005-098)) en la superficie de dextrano carboximetilado de un chip CM-5 (Biacore, N° de cat. BR-1000-14). Los experimentos cinéticos se realizaron a 37° C en tampón de ejecución (DPBS P20 al 0,005% EDTA 3 mM 100 pg/ml BSA). Se prepararon diluciones en serie de TF ECD humano (^sE^qID NO: 11) y TF ECD murino (SEQ ID NO: 12) de 900 nM a 0,412 nM en tampón de ejecución. Se capturaron aproximadamente 200-300 RU de mAb en la celda de flujo 2 a 4 del chip sensor. La celda de flujo 1 se usó como superficie de referencia. La captura de mAb fue seguida por una inyección de tres minutos (fase de asociación) de antígeno a 50 pl/min, seguido de 10 minutos de flujo de tampón (fase de disociación).

Las funciones biespecíficas de los anticuerpos se probaron usando una inyección en serie de TF ECD humano 300 nM y TF ECD de ratón durante 5 minutos cada una. La superficie del chip se regeneró como se ha descrito anteriormente. Alternativamente, los ensayos se realizaron usando un sensor de estreptavidina (Biacore, N° de cat. BR-1000-32) sobre el que se capturaron aproximadamente 900 RU de TF ECD humano biotinilado. La captura del antígeno fue seguida por una inyección de cinco minutos de mAb (300 nM) y una inyección de cinco minutos de TF ECD de ratón. La superficie del chip se regeneró como se ha descrito anteriormente.

Para las mediciones de afinidad, se usaron un polipéptido de oncostatina M humana madura (hOSM) (SEQ ID NO: 10), un polipéptido del factor tisular humano (hTF) (SEQ ID NO: 11) o un polipéptido del factor tisular de ratón (mTF) (SEQ ID NO: 12).

Ejemplo 1. Proteínas de unión a cadenas ligeras atadas

Se ataron juntas dos cadenas ligeras de OSML186 derivadas de un anticuerpo anti-oncostatina M OSMM55 mediante un conector no estructurado extendido para coexpresarse y ensamblarse con una cadena pesada OSMH14 derivada del mismo anticuerpo para formar proteínas de unión funcionales. De manera similar, dos cadenas ligeras OSML178 de un anticuerpo anti-oncostatina M OSMM69 se ataron juntas y se coexpresaron con una cadena pesada OSMH17 derivada del mismo anticuerpo). Se probaron cuatro longitudes diferentes de conectores para cada cadena ligera atada: (G4S)4 (SEQ ID NO: 1), (G4S)6 (SEQ ID NO: 2), (G4S)8 (SEQ ID NO: 3) y (G4S)10 (SEQ ID NO: 4), por su capacidad para promover el ensamblaje óptimo de anticuerpos (falta de "polímeros" de orden superior), unión y función en comparación con los anticuerpos originales con cadenas ligeras no atadas. La Tabla 2 muestra las proteínas de unión elaboradas y sus orígenes de cadena ligera y pesada. Las cadenas ligeras atadas eran de Igk humana y las cadenas pesadas de tipo IgG1 humana. Las proteínas de unión resultantes se purificaron y analizaron usando SDS-PAGE y sus afinidades de unión se evaluaron usando Biacore.

Tabla 2.

La mayoría de las proteínas de unión a cadenas ligeras atadas expresadas que se unen específicamente a OSM estaban en forma monomérica. La longitud del conector influyó en la propensión para formar monómeros sobre oligómeros, donde la cadena ligera atada con el conector (G4S)6 dio como resultado el grado más alto de anticuerpo monoclonal monomérico. Las proteínas de unión a OSM de cadena ligera atadas retuvieron afinidades similares en comparación con los anticuerpos de los que se derivaron las regiones variables (Tabla 3).

Tabl a 3.

Ejemplo 2. Cadena ligera de dentro afuera y atada de dentro afuera que contiene proteínas de unión

Se generaron cadenas ligeras y pesadas de dentro afuera y cadenas ligeras atadas de dentro afuera para evaluar su ensamblaje en proteínas de unión funcionales y la retención de sus características en comparación con los anticuerpos originales a partir de los cuales se originaron las regiones variables.

Los anticuerpos de dentro afuera se generaron mediante el intercambio de la región V, por ejemplo, el intercambio de las regiones VL y VH entre las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo original.

Por ejemplo, la proteína de unión BISM7 se generó reemplazando la región VH de la cadena pesada del anticuerpo original (TF7H16VH) con la región VL de la cadena ligera del anticuerpo original (TF7L2VL) para generar una cadena pesada de dentro afuera, y la región VL de la cadena ligera del anticuerpo original (TF7L2VL) se reemplazó con la región VH del anticuerpo original (TF7H16VH) para generar cadenas ligeras de dentro afuera.

Las cadenas ligeras de dentro afuera atadas se generaron enlazando operativamente dos cadenas ligeras de dentro afuera idénticas a través de un conector (G4S)6. Las cadenas ligeras de dentro afuera generadas o las cadenas ligeras atadas de dentro afuera y las cadenas pesadas de dentro afuera se coexpresaron como pares que se muestran en la Tabla 4, y la afinidad de las proteínas de unión purificadas por el factor tisular humano (hTF) se midió usando Biacore (Tabla 5). Tanto las proteínas de unión con cadenas de dentro afuera como las cadenas ligeras atadas de dentro afuera se expresaron bien, se aislaron en una forma monomérica y retuvieron afinidades similares en comparación con los anticuerpos originales.

Tabla 4.

Tabla 5.

Ejemplo 3. Proteínas de unión a cadenas ligeras atadas de dentro afuera biespecíficas

Se generaron proteínas de unión biespecíficas coexpresando una cadena ligera de dentro afuera atada que tiene dos regiones variables de dentro afuera con diferente especificidad de antígeno con una cadena pesada de dentro afuera. El anticuerpo anti-factor tisular de ratón MTFM27 se une específicamente al factor tisular de ratón pero no reacciona de forma cruzada con el ortólogo humano, y un anticuerpo anti-TF humano TF7M58 se une específicamente al TF humano pero no muestra unión al TF de ratón. Se generó una cadena ligera biespecífica de dentro afuera atada enlazando operativamente el dominio VH de MTFM27 a C^khumano y el dominio VH de TF7M58 a C^khumano, y las dos cadenas ligeras de dentro afuera se enlazaron operativamente usando un conector (G4S)6. Los anticuerpos originales MTFM27 y TF7M58 comparten una cadena ligera idéntica (TF7L2) y, por lo tanto, solo se generó una cadena pesada de dentro afuera uniendo la VL del anticuerpo TF7M58 a la región constante de IgG1 humana. Las cadenas ligeras y pesadas generadas se coexpresaron y la proteína de unión biespecífica resultante (TF7M1668, Tabla 4) se analizó para determinar sus afinidades de unión al factor tisular humano y de ratón usando Biacore. La Tabla 5 muestra la afinidad de la proteína de unión al TF humano y de ratón.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una proteína de unión que comprende una cadena ligera atada de dentro afuera, una primera cadena pesada de inmunoglobulina de dentro afuera y una segunda cadena pesada de inmunoglobulina de dentro afuera que se une específicamente a por lo menos a un antígeno, en donde la cadena ligera atada de dentro afuera comprende VH1-CL-conector-VH2-CL, la primera cadena pesada atada de dentro afuera comprende VL1-CH, y la segunda cadena pesada atada de dentro afuera comprende VL2-CH, en donde

i. VL1 es una primera región variable de cadena ligera;

ii. VL2 es una segunda región variable de cadena ligera;

iii. CL es una región constante de cadena ligera;

iv. VH1 es una primera región variable de cadena pesada;

v. VH2 es una segunda región variable de cadena pesada;

vi. CH es una región constante de cadena pesada; y

2. La proteína de unión de la reivindicación 1, en donde

i. la VL1 y la VL2 comprenden secuencias de aminoácidos idénticas o sustancialmente idénticas;

ii. la VL1, la VL2, la VH1 y la VH2 comprenden secuencias de polipéptidos humanas, humanizadas, adaptadas a humanos o murinas;

iii. la CL es del tipo kappa (^k) o lambda (A) y la CH es del tipo IgG1, IgG2, IgG3, o IgG4; o

iv. la CL y la CH son de origen humano.

3. La proteína de unión de la reivindicación 1, que es biespecífica.

4. La proteína de unión de la reivindicación 1, en donde la proteína de unión se une a por lo menos un antígeno con i. una constante de disociación (Kd) de como máximo 10-9 M, como máximo 10-10 M, como máximo 10-11 M, como máximo 10-12 M, o como máximo 10-13 M.

ii. una constante de tasa de asociación (Kon) de por lo menos 104M-1s-1, por lo menos 105M-1s-1, o por lo menos 104M-1s-1; o

iii. una constante de tasa de disociación (Koff) de como máximo 104s-1, como máximo 10-5s-1, o como máximo 10-6s-1; en donde K^d, Kon y Koff se miden por resonancia de plasmones de superficie.

5. Una proteína de unión de la reivindicación 1 producida de acuerdo con un método que comprende cultivar una célula huésped eucariota en condiciones suficientes para producir la proteína de unión, en donde la célula huésped comprende por lo menos un vector, el por lo menos un vector comprendiendo un ácido nucleico que codifica la cadena ligera atada de dentro afuera, la primera cadena pesada de dentro afuera y la segunda cadena pesada de dentro afuera.

6. Una proteína de unión biespecífica de la reivindicación 3 producida de acuerdo con un método que comprende cultivar una célula huésped eucariota en condiciones suficientes para producir la proteína de unión, en donde la célula huésped comprende por lo menos un vector, el por lo menos un vector comprendiendo un ácido nucleico que codifica la cadena ligera atada de dentro afuera, la primera cadena pesada de dentro afuera y la segunda cadena pesada de dentro afuera.

7. Un polinucleótido aislado que codifica la proteína de unión de la reivindicación 1 o la reivindicación 3.

8. Un vector que comprende un polinucleótido aislado de la reivindicación 7.

9. Una célula huésped que comprende un vector de la reivindicación 8.

10. Un método para elaborar la proteína de unión de la reivindicación 1 o la reivindicación 3 que comprende cultivar una célula huésped de la reivindicación 9 en condiciones suficientes para producir la proteína de unión.

11. Un método para elaborar una proteína de unión biespecífica que se une a un primer antígeno y un segundo antígeno que comprende una cadena ligera atada de dentro afuera, una primera cadena pesada de dentro afuera y una segunda cadena pesada de dentro afuera, que comprende

a) proporcionar ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo que se une al primer antígeno que tiene una primera cadena ligera que comprende una primera región variable de cadena ligera (VL1) y una primera región constante de cadena ligera (CL1), y una primera cadena pesada que comprende una primera región variable de cadena pesada (VH1) y una primera región constante de cadena pesada (CH1);

b) proporcionar ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo que se une al segundo antígeno que tiene una segunda cadena ligera que comprende una segunda región variable de cadena ligera (VL2) y una segunda región constante de cadena ligera (CL2), y una segunda cadena pesada que comprende una segunda región variable de cadena pesada (VH2) y una segunda región constante de cadena pesada (CH2);

c) proporcionar un ácido nucleico que codifica un conector, en donde el conector es (G⁴S⁾⁴(SEQ ID NO: 1), (G4S)6 (SEQ ID NO: 2), (G4S)8 (SEQ ID NO: 3) o (G4S)10 (SEQ ID NO: 4).

h) recuperar la proteína de unión biespecífica.

12. El método de la reivindicación 11, en donde la VL1 y la VL2 comprenden secuencias de aminoácidos idénticas o sustancialmente idénticas.

13. Una proteína de unión biespecífica producida mediante un método de la reivindicación 11.

14. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de unión de la reivindicación 1 o la reivindicación 3 y un portador farmacéuticamente aceptable.