ES2905957T3

ES2905957T3 - Expresión funcional de monooxigenasas y métodos de uso

Info

Publication number: ES2905957T3
Application number: ES16867180T
Authority: ES
Inventors: Elizabeth Clarke; Baolong Zhu; Derek Greenfield; Stephanie Jones; Noah Helman
Original assignee: Industrial Microbes Inc
Current assignee: Industrial Microbes Inc
Priority date: 2015-11-18
Filing date: 2016-11-17
Publication date: 2022-04-12
Anticipated expiration: 2036-11-17
Also published as: US20210254026A1; US20190032028A1; DK3377612T3; US20240043816A1; EP3377612A4; CN108779429A; AU2016358063B2; CN108779429B; EP3377612A1; EP3926038A3; AU2016358063A1; US11692177B2; WO2017087731A1; MY197415A; EP3926038A2; US10894951B2; EP3377612B1; CA3005460A1

Abstract

Un polinucleótido sintético para una enzima dihierro monooxigenasa soluble que puede expresarse en un microorganismo de interés, que comprende al menos una región codificante de monooxigenasa que codifica una enzima dihierro monooxigenasa, la al menos una región codificante de monooxigenasa unida a al menos un promotor que funcionará en el microorganismo de interés, que comprende además al menos una región codificante de chaperona de plegamiento de proteínas que codifica al menos una chaperona de plegamiento de proteínas, la al menos una región codificante de chaperona proteica unida a al menos un promotor que funcionará en el microorganismo de interés, en el que la al menos una chaperona de plegamiento de proteínas comprende groES/groEL.

Description

DESCRIPCIÓN

Expresión funcional de monooxigenasas y métodos de uso

Referencia cruzada a aplicaciones relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional estadounidense n.° 62/257.061 presentada el 18 de noviembre de 2015; la solicitud provisional n.° 62/270.039 presentada el 21 de diciembre de 2015; y la solicitud provisional n.° 62/320.725 presentada el 11 de abril de 2016.

Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno bajo la subvención de SBIR n.° 1520425 otorgada por la National Science Foundation. El gobierno tiene determinados derechos en esta invención.

Introducción

Las enzimas biológicas son catalizadores capaces de facilitar reacciones químicas, a menudo a temperatura y/o presión ambiente. Algunas reacciones químicas se catalizan o bien por catalizadores inorgánicos o bien por determinadas enzimas, mientras que otras pueden catalizarse por solo uno de estos. Para usos industriales, las enzimas son catalizadores ventajosos si el proceso alternativo requiere condiciones costosas o de consumo intensivo de energía, tal como alta temperatura o presión, o si el proceso completo va a integrarse con otras etapas catalizadas por enzimas. Las enzimas también pueden diseñarse para controlar la gama de materias primas o sustratos requeridos y/o la gama de productos formados.

Avances tecnológicos recientes en biología sintética han demostrado el poder y versatilidad de las rutas enzimáticas en células vivas para convertir moléculas orgánicas en productos industriales. Los procesos petroquímicos que actualmente fabrican estos productos industriales pueden reemplazarse por estos procesos biotecnológicos que a menudo pueden proporcionar los mismos productos a un coste más bajo y con un impacto ambiental más bajo. El descubrimiento de nuevas rutas y enzimas que pueden hacerse funcionar y diseñarse en microorganismos genéticamente tratables avanzará aún más la biología sintética.

El azúcar (incluyendo azúcares simples, almidones, carbohidratos, y alditoles) es a menudo una materia prima para fermentaciones biológicas. Pero el azúcar tiene un coste relativamente alto como materia prima que limita severamente la viabilidad económica del proceso de fermentación. Aunque la biología sintética podría expandirse para producir miles de productos que se obtienen actualmente del petróleo, las empresas a menudo deben limitarse a la producción de productos químicos nicho seleccionados debido al alto coste del azúcar.

Alcanos cortos, tales como metano y etano, son materias primas significativamente menos costosas en comparación con el azúcar. Dado el enorme suministro de gas natural y la aparición de tecnologías de producción de metano renovables, se espera que los alcanos cortos permanezcan económicos durante décadas. Por consiguiente, productos industriales fabricados por microorganismos diseñados a partir de alcanos cortos, tales como metano o etano, debe ser menos costosos de fabricar que los fabricados mediante azúcar y debe permanecer así durante décadas.

Cualquier sistema biológico capaz de convertir alcanos cortos en productos industriales debe incluir una enzima que pueda activar el alcano. Las bacterias de origen natural que pueden activar el metano usan dioxígeno para convertir el metano en metanol. Como ejemplo, una enzima capaz de realizar esta reacción pertenece a la clase conocida como dihierro monooxigenasas solubles.

Pero, las dihierro monooxigenasas solubles han sido difíciles de expresar funcionalmente en células hospedadoras industrialmente relevantes. La expresión funcional exitosa de dihierro monooxigenasas solubles en un hospedador industrialmente relevante sería una primera etapa crítica en un sistema capaz de convertir metano o etano económicos en metanol o etanol, respectivamente. El metanol o el etanol pueden separarse como producto industrial en sí mismo o usarse como producto intermedio metabólico y convertirse además en otros productos industriales a través de rutas mediadas por enzimas en una célula.

La invención proporcionada en el presente documento se refiere a la capacidad de expresar funcionalmente una enzima útil en un hospedador industrial.

Breve descripción de la invención

La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjuntas. En un primer aspecto, se da a conocer un polinucleótido sintético de monooxigenasa para una enzima dihierro monooxigenasa soluble que puede expresarse en un microorganismo de interés o su complemento, que comprende al menos una región codificante de monooxigenasa que codifica una enzima dihierro monooxigenasa soluble, la al menos una región codificante de monooxigenasa unida a al menos un promotor que funcionará en el microorganismo de interés. Según la invención, el polinucleótido sintético de monooxigenasa comprende además al menos una región codificante de chaperona de plegamiento de proteínas que codifica al menos una chaperona de plegamiento de proteínas, la al menos una región codificante de chaperona proteica unida a al menos un promotor que funcionará en el microorganismo de interés, en el que la al menos una chaperona de plegamiento de proteínas comprende groES/groEL.

Una realización proporciona un polinucleótido sintético de monooxigenasa que comprende un polinucleótido sintético que es al menos un 60 %, de manera preferiblemente aproximada un 65 %, de manera preferiblemente aproximada un 70 %, de manera preferiblemente aproximada un 75 %, de manera preferiblemente aproximada un 80 %, de manera preferiblemente aproximada un 85 %, de manera preferiblemente aproximada un 90 % o de manera preferiblemente aproximada un 95 % idéntico a una cualquiera o más de las secuencias de nucleótidos expuestas en SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 58 o SEQ ID NO: 60 o SEQ ID NO: 87 o SEQ ID NO: 89 o SEQ ID NO: 91 o SEQ ID NO: 93 o SEQ ID NO: 95 o SEQ ID NO: 97 o SEQ ID NO: 99 o SEQ ID NO: 101 o SEQ ID NO: 103 o SEQ ID NO: 105 o SEQ ID NO: 107 o SEQ ID NO: 109 o SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 113 o SEQ ID NO: 115 o SEQ ID NO: 117 o SEQ ID NO: 143 o SEQ ID NO: 145 o SEQ ID NO: 147 o SEQ ID NO: 149 o SEQ ID NO: 151 o SEQ ID NO: 153. Una realización proporciona un polinucleótido sintético de monooxigenasa que comprende un polinucleótido sintético que es al menos un 60 %, de manera preferiblemente aproximada un 65 %, de manera preferiblemente aproximada un 70 %, de manera preferiblemente aproximada un 75 %, de manera preferiblemente aproximada un 80 %, de manera preferiblemente aproximada un 85 %, de manera preferiblemente aproximada un 90 % o de manera preferiblemente aproximada un 95 % idéntico a las secuencias de nucleótidos expuestas en SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 60. Una realización adicional proporciona un polinucleótido sintético de monooxigenasa que comprende un polinucleótido sintético que es al menos un 60 %, de manera preferiblemente aproximada un 65 %, de manera preferiblemente aproximada un 70 %, de manera preferiblemente aproximada un 75 %, de manera preferiblemente aproximada un 80 %, de manera preferiblemente aproximada un 85 %, de manera preferiblemente aproximada un 90 % o de manera preferiblemente aproximada un 95 % idéntico al complemento de una cualquiera o más de las secuencias de nucleótidos expuestas en SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 9 o Se Q ID NO: 11 o SEQ Id NO: 13 o SEQ ID NO: 58 o SEQ ID NO: 60 o SEQ ID NO: 87 o SEQ ID NO: 89 o SEQ ID NO: 91 o SEQ ID NO: 93 o SEQ ID NO: 95 o SEQ ID NO: 97 o SEQ ID NO: 99 o SEQ ID NO: 101 o SEQ ID NO: 103 o SEQ ID NO: 105 o SEQ ID NO: 107 o SEQ ID NO: 109 o SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 113 o SEQ ID NO: 115 o SEQ ID NO: 117 o SEQ ID NO: 143 o SEQ ID NO: 145 o SEQ ID NO: 147 o SEQ ID NO: 149 o SEQ ID NO: 151 o SEQ ID NO: 153. Una realización adicional proporciona un polinucleótido sintético de monooxigenasa que comprende un polinucleótido sintético que es al menos un 60 %, de manera preferiblemente aproximada un 65 %, de manera preferiblemente aproximada un 70 %, de manera preferiblemente aproximada un 75 %, de manera preferiblemente aproximada un 80 %, de manera preferiblemente aproximada un 85 %, de manera preferiblemente aproximada un 90 % o de manera preferiblemente aproximada un 95 % idéntico al complemento de las secuencias de nucleótidos expuestas en SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 60.

La divulgación se pretende que abarque enzimas monooxigenasas como se da a conocer en el presente documento, así como subunidades en cualquier combinación y cantidad.

Una realización adicional proporciona un polinucleótido sintético de monooxigenasa que comprende un polinucleótido sintético que codifica un polipéptido que es al menos un 60 %, de manera preferiblemente aproximada un 65 %, de manera preferiblemente aproximada un 70 %, de manera preferiblemente aproximada un 75 %, de manera preferiblemente aproximada un 80 %, de manera preferiblemente aproximada un 85 %, de manera preferiblemente aproximada un 90 % o de manera preferiblemente aproximada un 95 % idéntico a una cualquiera o más de las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12 o ^sE^qID NO: 14 o SEQ ID NO: 59 o SEQ ID NO: 61 o SEQ ID NO: 88 o SEQ ID NO: 90 o SEQ ID NO: 92 o SEQ ID NO: 94 o SEQ ID NO: 96 o SEQ ID NO: 98 o SEQ ID NO: 100 o SEQ ID NO: 102 o SEQ ID NO: 104 o SEQ ID NO: 106 o SEQ ID NO: 108 o SEQ ID NO: 110 o SEQ ID NO: 112 o SEQ ID NO: 114 o SEQ ID NO: 116 o SEQ ID NO: 118 o SEQ ID NO: 144 o SEQ ID NO: 146 o SEQ ID NO: 148 o SEQ ID NO: 150 o SEQ ID NO: 152 o SEQ ID NO: 154. Una realización adicional proporciona un polinucleótido sintético de monooxigenasa que comprende un polinucleótido sintético que codifica un polipéptido que es al menos un 60 %, de manera preferiblemente aproximada un 65 %, de manera preferiblemente aproximada un 70 %, de manera preferiblemente aproximada un 75 %, de manera preferiblemente aproximada un 80 %, de manera preferiblemente aproximada un 85 %, de manera preferiblemente aproximada un 90 % o de manera preferiblemente aproximada un 95 % idéntico a las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 61. Una realización adicional proporciona un complemento a un polinucleótido sintético de monooxigenasa que comprende un polinucleótido sintético que codifica un polipéptido que es al menos un 60 %, de manera preferiblemente aproximada un 65 %, de manera preferiblemente aproximada un 70 %, de manera preferiblemente aproximada un 75 %, de manera preferiblemente aproximada un 80 %, de manera preferiblemente aproximada un 85 %, expuesta ende manera preferiblemente aproximada un 90 % o de manera preferiblemente aproximada un 95 % a una cualquiera o más de las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ⁱD NO: 8 o SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12 o ^sE^qID NO: 14 o SEQ ID NO: 59 o SEQ ID NO: 61 o SEQ ID NO: 88 o SEQ ID NO: 90 o SEQ ID NO: 92 o SEQ ID NO: 94 o SEQ ID NO: 96 o SEQ ID NO: 98 o SEQ ID NO: 100 o SEQ ID NO: 102 o SEQ ID NO: 104 o SEQ ID NO: 106 o SEQ ID NO: 108 o SEQ ID NO: 110 o SEQ ID NO: 112 o SEQ ID NO: 114 o SEQ ID NO: 116 o SEQ ID NO: 118 o SEQ ID NO: 144 o SEQ ID NO: 146 o SEQ ID NO: 148 o SEQ ID NO: 150 o SEQ ID NO: 152 o SEQ ID NO: 154. Una realización adicional proporciona un complemento a un polinucleótido sintético de monooxigenasa que comprende un complemento a un polinucleótido que codifica un polipéptido que es al menos un 60 %, de manera preferiblemente aproximada un 65 %, de manera preferiblemente aproximada un 70 %, de manera preferiblemente aproximada un 75 %, de manera preferiblemente aproximada un 80 %, de manera preferiblemente aproximada un 85 %, de manera preferiblemente aproximada un 90 % o de manera preferiblemente aproximada un 95 % con respecto a las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 61.

En un segundo aspecto, un polinucleótido sintético de monooxigenasa para una enzima dihierro monooxigenasa soluble que puede expresarse en un microorganismo de interés, o su complemento, se da a conocer, que comprende al menos una región codificante de monooxigenasa que codifica una enzima dihierro monooxigenasa soluble, la al menos una región codificante de monooxigenasa unida a al menos un promotor que funcionará en el microorganismo de interés, en el que el polinucleótido sintético de monooxigenasa comprende al menos una mutación en SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 29 o SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 31 o SEQ ID NO: 32 o SEQ ID NO: 33 o SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 35 o SEQ ID NO: 36 o SEQ ID NO: 37 o SEQ ID NO: 46, en el que la al menos una mutación aumenta la especificidad para un sustrato de monooxigenasa y/o aumenta la producción de un producto químico en comparación, respectivamente, con SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 29 o SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 31 o SEQ ID NO: 32 o SEQ ID NO: 33 o SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 35 o SEQ ID NO: 36 o SEQ ID NO: 37 o SEQ ID NO: 46. En una realización, el polinucleótido sintético de monooxigenasa comprende al menos una mutación en cualquiera de las secuencias dadas a conocer en el presente documento, en el que la al menos una mutación aumenta la especificidad para un sustrato de monooxigenasa y/o aumenta la producción de un producto químico en oposición a su secuencia de tipo silvestre respectiva. En una realización, la al menos una mutación comprende una o más mutaciones que son una o más de una sustitución de Y o S por K en la posición 61, una sustitución de N por E en la posición 240 y/o una sustitución de A o T por S en la posición 421 en SEQ ID NO: 10; una de M por L en la posición 67 en SEQ iD NO: 12; y de T por P en la posición 167 en SEQ ID NO: 14.

En una realización, el polinucleótido sintético de monooxigenasa comprende además al menos una proteína accesoria o región codificante de chaperona de plegamiento de proteínas que codifica al menos una chaperona de plegamiento de proteínas, la al menos una región codificante de chaperona de plegamiento de proteínas unida a al menos un promotor que funcionará en el microorganismo de interés.

El siguiente aspecto no es según la invención y está presente solo con fines ilustrativos, concretamente, se da a conocer un polinucleótido sintético de deshidrogenasa para al menos una alcohol deshidrogenasa y/o una acetaldehído deshidrogenasa que puede expresarse en un microorganismo de interés o su complemento, que comprende al menos una alcohol deshidrogenasa y/o una región codificante de acetaldehído deshidrogenasa que codifica una alcohol deshidrogenasa y/o una acetaldehído deshidrogenasa, la al menos una alcohol deshidrogenasa y/o una región codificante de acetaldehído deshidrogenasa unida a al menos un promotor que funcionará en el microorganismo de interés. En una realización, la alcohol deshidrogenasa y/o una acetaldehído deshidrogenasa es al menos uno, dos o la totalidad de mdh de Bacillus stearothermophilus (SEQ ID NO: 51), mhpF de Escherichia coli (SEQ ID NO: 53) o acdH de Clostridium kluyveri (SEQ ID NO: 55). En una realización, el polinucleótido sintético de deshidrogenasa comprende una mutación de una T por una A en la posición 267 y una K por una E en la posición 568 del gen adhE de Escherichia coli como se expone en SEQ NO: 49.

Otro aspecto que no es según la invención proporciona un polinucleótido sintético de deshidrogenasa que comprende un polinucleótido sintético que es al menos un 60 %, de manera preferiblemente aproximada un 65 %, de manera preferiblemente aproximada un 70 %, de manera preferiblemente aproximada un 75 %, de manera preferiblemente aproximada un 80 %, de manera preferiblemente aproximada un 85 %, de manera preferiblemente aproximada un 90 % o de manera preferiblemente aproximada un 95 % idéntico a la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 48 o SEQ ID No : 50 o SEQ ID NO: 52 o SEQ ID NO: 54. Un aspecto adicional que no es según la invención proporciona un polinucleótido sintético de deshidrogenasa que comprende un polinucleótido sintético que es al menos un 60 %, de manera preferiblemente aproximada un 65 %, de manera preferiblemente aproximada un 70 %, de manera preferiblemente aproximada un 75 %, de manera preferiblemente aproximada un 80 %, de manera preferiblemente aproximada un 85 %, de manera preferiblemente aproximada un 90 % o de manera preferiblemente aproximada un 95 % complementario a la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 48 o SEQ ID NO: 50 o SEQ ID NO: 52 o SEQ ID NO: 54.

Un aspecto adicional que no es según la invención proporciona un polinucleótido sintético de deshidrogenasa que comprende un polinucleótido sintético que codifica un polipéptido que es al menos un 60 %, de manera preferiblemente aproximada un 65 %, de manera preferiblemente aproximada un 70 %, de manera preferiblemente aproximada un 75 %, de manera preferiblemente aproximada un 80 %, de manera preferiblemente aproximada un 85 %, de manera preferiblemente aproximada un 90 % o de manera preferiblemente aproximada un 95 % idéntico a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 49 o SEQ ID NO: 51 o SeQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 55. Un aspecto adicional que no es según la invención proporciona un complemento a un polinucleótido sintético de deshidrogenasa que comprende un polinucleótido sintético complementario a un polinucleótido que codifica un polipéptido que es al menos un 60 %, de manera preferiblemente aproximada un 65 %, de manera preferiblemente aproximada un 70 %, de manera preferiblemente aproximada un 75 %, de manera preferiblemente aproximada un 80 %, de manera preferiblemente aproximada un 85 %, de manera preferiblemente aproximada un 90 % o de manera preferiblemente aproximada un 95 % con respecto a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 49 o s Eq ID NO: 51 o SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 55.

En una realización, el polinucleótido sintético de monooxigenasa y/o el polinucleótido sintético de deshidrogenasa es un polinucleótido sintético que comprende una cualquiera de las secuencias expuestas en el presente documento. En una realización, el polinucleótido sintético comprende adicionalmente al menos un promotor unido operativamente a uno cualquiera o más de los polinucleótidos sintéticos dados a conocer en el presente documento. En una realización, el promotor es al menos uno de pBAD, pTrc, ptac, pLac, pT5 y/o J23116. En una realización, el promotor es al menos uno de pADH1, pTEF1, pTEF2, pGAP y/o pGCW14. Cualquier promotor dado a conocer en el presente documento o conocido por un experto en la técnica también debe considerarse parte de la divulgación de esta solicitud. En una realización, se introducen mutaciones aleatorias en las regiones promotoras usando cebadores degenerados. En una realización, se incorporan uno o más terminadores en la construcción de expresión.

En una realización, el polinucleótido sintético comprende uno o más de los plásmidos pBZ13 (SEQ ID NO: 15), pBZ15 (SEQ ID NO: 16), pBZ21 (SEQ ID NO: 17), pBZ23 (SEQ ID NO: 18), pBZ4 (SEQ ID NO: 19), pDG5 (SEQ ID NO: 21), pDG6 (SEQ ID NO: 22), pLC100 (SEQ ID NO: 23), pLC12 (SEQ ID NO: 24), pLC37 (SEQ ID NO: 25), pLC39 (SEQ ID NO: 26), pLC99 (SEQ ID NO: 27), pNH100 (SEQ ID NO: 28), pNH104 (SEQ ID NO: 29), pNH132 (SEQ ID NO: 30), pNH157 (SEQ ID NO: 31), pNH158 (SEQ ID NO: 32), pNH160 (SEQ ID NO: 33), pNH166 (SEQ ID NO: 34), pNH167 (SEQ ID NO: 35), pNH172 (SEQ ID NO: 36), pNH173 (SEQ ID NO: 37), pNH177 (SEQ ID NO: 38), pNH178 (SEQ ID NO: 39), pNH180 (SEQ ID NO: 40), pNH181 (SEQ ID NO: 41), pNH185 (SEQ ID NO: 42), pNH187 (SEQ ID NO: 43), pNH188 (SEQ ID NO: 44), pNH225 (SEQ ID NO: 45) y/o pNH238 (SEQ ID NO: 46) o cualquier otro polinucleótido sintético o polipéptido sintético dado a conocer en el presente documento.

La divulgación se pretende que incluya cualquier secuencia complementaria a las secuencias expuestas en el presente documento. La divulgación también se pretende que abarque cualquier polipéptido o polipéptido sintético codificado por los polinucleótidos sintéticos de la presente invención. Donde se dan a conocer secuencias sintéticas de la invención, la invención se pretende que abarque cualquier secuencia que tenga una identidad con respecto a las secuencias, como se expone en el presente documento.

La divulgación también proporciona microorganismos sintéticos diseñados para expresar funcionalmente una enzima monooxigenasa y/o una enzima deshidrogenasa que convierte una amplia gama de sustratos orgánicos en una gama aún más amplia de productos. La divulgación proporciona microorganismos sintéticos diseñados para consumir moléculas que contienen carbono, tales como alcano u otras moléculas, tales moléculas como metano o metanol, etano o etanol. La invención también proporciona microorganismos diseñados para convertir metano y/o metanol o etano y/o etanol en productos industriales.

En un aspecto adicional, se da a conocer en el presente documento un microorganismo sintético que comprende al menos un polinucleótido sintético exógeno, en el que el polinucleótido sintético comprende al menos uno de los polinucleótidos sintéticos expuestos en el presente documento. En una realización, el polipéptido sintético es heterólogo. El microorganismo se pretende que abarque células procariotas o células eucariotas, tales como levaduras y hongos, y también se pretende que incluya arqueas. En una realización, el microorganismo es al menos uno de Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus methanolicus, Pseudomonas putida, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Salmonella entérica, Corynebacterium glutamicum, Klebsiella oxytoca, Anaerobiospirillum succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes, Mannheimia succiniciproducens, Rhizobium etli, Gluconobacter oxydans, Zymomonas mobilis, Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, Streptomyces coelicolor, Clostridium acetobutylicum, Pseudomonas fluorescens, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Aspergillus terreus, Aspergillus niger, y Candida utilis. En una realización, el microorganismo es al menos uno de Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Bacillus methanolicus, Bacillus subtilis o Corynebacterium glutamicum. En una realización, el microorganismo es Escherichia coli. En una realización, el microorganismo es Pichia pastoris. En una realización, el microorganismo es Saccharomyces cerevisiae. En una realización, el microorganismo es Corynebacterium glutamicum. En una realización, el microorganismo es Bacillus methanolicus.

En una realización, el microorganismo sintético tiene un crecimiento mejorado en o es capaz de crecer en un sustrato de monooxigenasa como una fuente de carbono única o principal, se describen además y no son según la invención sustratos de alcohol deshidrogenasa y/o un sustrato de acetaldehído deshidrogenasa. En una realización, el sustrato es al menos uno de metano, etano, propano, butano, pentano, hexano, heptano, octano, 2-metilpropano, 2,3-dimetilpentano, propeno (propileno), but-1 -eno, cis-but-2-eno, trans-but-2-eno, ciclohexano, ciclohexano de metileno, □-pineno, adamantano, cis-1,4-dimetilciclohexano, cis-1,3-dimetilciclohexano, tricloroeteno, cloruro de vinilo, 1,1-dicloroeteno, trifluoroetileno, clorotrifluoroetileno, tribromoetileno, benceno, tolueno, etilbenceno, estireno, piridina, naftaleno, bifenilo, 2-hidroxibifenilo, 2-metilbifenilo, 2-clorobifenilo, 2-bromobifenilo, 2-yodobifenilo, clorometano, diclorometano, bromometano, nitrometano, metanotiol, metanol, etanol, dietiléter, monóxido de carbono, ciclohexeno, dimetiléter, difluorometano, fluorobenceno, fluorometano, isopentano, metilamina, metilcianuro, nitrobenceno, fenilalanina o xileno. En una realización, el sustrato de monooxigenasa es metano, etano, propano, butano o naftaleno. En una realización, el sustrato es metanol o etanol. Pueden encontrarse otros sustratos, por ejemplo, sin limitación, en Vazquez-Dualt y Quintero-Ramirez, Petroleum Biotechnology, 2004; Green y Dalton, Substrate Specificity of Soluble Methane Monooxygenase, J.Biol.Chem., Vol. 264 No.30, págs. 17698-17703, 1989; base de datos en línea BRENDA http://www.brenda-enzvmes.ora/enzvme.php?ecno=1.14.13.25. En una realización, el sustrato es etano. En una realización, el sustrato es etano y la al menos una mutación aumenta la especificidad con respecto a etano.

En una realización, el microorganismo sintético produce un producto químico. En una realización, el producto químico es al menos uno de ácido dicarboxílico, ácido málico, ácido fumárico, ácido succínico, sal de ácido málico, sal de ácido fumárico, sal de ácido succínico, ácido L-málico, ácido D-málico, ácido maleico, ácido láctico, ácido adípico, 1,3-propanodiol, 2,3-butanodiol, 1,4-butanodiol, butadieno, derivados de ácidos grasos, alcoholes grasos, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, ésteres metílicos de ácidos grasos, ésteres etílicos de ácidos grasos, ácidos grasos ramificados, derivados de ácidos grasos ramificados, ácidos grasos omega-3, isoprenoides, isopreno, farneseno, farnesano, escualeno, escualano, carotenoides, cualquiera o todos de los aminoácidos, alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutámico, glutamato monosódico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptófano, valina, ornitina, prolina, selenocisteína, serina, tirosina, etanol, propanol, 1-butanol, 2-butanol, isobutanol (2-metilpropan-1-ol), alcoholes, alcanos, alquenos, olefinas, aditivos para productos alimenticios para animales, mezclas de aminoácidos, y proteínas. Otros ejemplos de productos químicos incluyen, pero no se limitan a, etanol, propanol, isopropanol, butanol, alcoholes grasos, ésteres de ácidos grasos, ésteres etílicos, ésteres de cera; hidrocarburos y alcanos tales como propano, octano, diésel, Jet Propellant 8 (JP8); tereftalato, 1,3-propanodiol, 1,4-butanodiol, acrilato, ácido adípico, g-caprolactona, isopreno, caprolactama, y polímeros de estos, más otros polímeros, tales como polioles, polihidroxialcanoatos (PHA), poli-beta-hidroxibutirato (PHB), caucho; productos químicos básicos tales como lactato, ácido docosahexaenoico (DHA), 3-hidroxipropionato, y-valerolactona, lisina, serina, aspartato, ácido aspártico, sorbitol, ascorbato, ácido ascórbico, isopentenol, lanosterol, DHA omega-3, licopeno, itaconato, 1,3-butadieno, etileno, propileno, succinato, citrato, ácido cítrico, glutamato, malato, ácido 3-hidroxipropiónico (HPA), ácido láctico, THF, gamma butirolactona, pirrolidonas, hidroxibutirato, ácido glutámico, ácido levulínico, ácido acrílico, ácido malónico; productos químicos especiales tales como carotenoides, isoprenoides, ácido itacónico; productos farmacéuticos e intermedios farmacéuticos tales como ácido 7-aminodesacetoxicefalosporánico (7-ADCA)/cefalosporina, eritromicina, policétidos, estatinas, paclitaxel, docetaxel, terpenos, péptidos, esteroides, ácidos grasos omega y otros productos de interés adecuados de este tipo. Tales productos son útiles en el contexto de biocombustibles, productos químicos industriales y especializados, como intermedios utilizados para fabricar productos adicionales, tales como suplementos nutricionales, nutracéuticos, polímeros, reemplazos de parafina, productos para el cuidado personal y productos farmacéuticos. Otros ejemplos de productos químicos incluyen, sin limitación, todos los compuestos que pueden producirse con los métodos expuestos en el presente documento. Se pretende que tales compuestos incluyan todas las moléculas que pueden construirse con los métodos expuestos en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, sin limitación, todas las moléculas orgánicas e inorgánicas que pueden prepararse con los métodos expuestos en el presente documento. El término producto químico pretende incluir compuestos naturales y no naturales. Ejemplos de moléculas naturales incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos, ácidos nucleicos, nucleótidos y polinucleótidos y todas las moléculas biológicas relacionadas. Compuestos no naturales incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos y nucleótidos que se modifican de manera diferente a la que normalmente se modifican en sistemas biológicos (tales como, por ejemplo, sin limitación, aminoácidos no naturales). En una realización, el producto químico es metanol, etanol, propanol, butanol, o naftol. En otra realización, el producto químico es succinato, malato, ácidos grasos, lisina, y/o glutamato. En una realización, el producto químico es 3-hidroxipropionato o un polímero de 3-hidroxipropionato.

En una realización, el microorganismo comprende Escherichia coli y el microorganismo sintético es Escherichia coli y el polinucleótido sintético de monooxigenasa codifica una enzima dihierro monooxigenasa soluble o una, algunas o cualquiera de sus subunidades. En una realización, la enzima dihierro monooxigenasa soluble comprende una metano monooxigenasa o una etano monooxigenasa. En una realización, el microorganismo sintético comprende Escherichia coli que se ha transformado con el polinucleótido sintético y el microorganismo sintético ha mejorado el crecimiento en etano o consume etano como única fuente de carbono o como una fuente de carbono principal en comparación con un microorganismo que no se ha transformado con el polinucleótido sintético de monooxigenasa. En una realización, el microorganismo sintético comprende Escherichia coli que se ha transformado con el polinucleótido sintético de monooxigenasa, el sustrato de monooxigenasa es etano y el producto químico es etanol. En una realización, el microorganismo sintético comprende Escherichia coli que se ha transformado con el polinucleótido sintético de monooxigenasa, el gen araBAD se ha eliminado, el sustrato comprende etano y el producto químico comprende etanol. En una realización, el microorganismo sintético comprende Escherichia coli que se ha transformado con el polinucleótido sintético de monooxigenasa, el sustrato de monooxigenasa comprende metano y el producto químico comprende metanol. En una realización, el microorganismo sintético comprende Escherichia coli que se ha transformado con el polinucleótido sintético de monooxigenasa, el gen araBAD se ha eliminado, el sustrato comprende metano y el producto químico comprende metanol. En una realización, el microorganismo sintético comprende Escherichia coli que se ha transformado con el polinucleótido sintético de monooxigenasa, el sustrato de monooxigenasa comprende naftaleno y el producto químico comprende 1-naftol. En una realización, el microorganismo sintético comprende Escherichia coli que se ha transformado con el polinucleótido sintético de monooxigenasa, el sustrato de monooxigenasa comprende etano y el producto químico comprende un ácido graso. En una realización, el microorganismo sintético comprende Escherichia coli que se ha transformado con el polinucleótido sintético de monooxigenasa, el sustrato de monooxigenasa comprende etano y el producto químico comprende succinato.

En una realización, el microorganismo comprende Escherichia coli y el microorganismo sintético es Escherichia coli y el polinucleótido sintético de monooxigenasa codifica una enzima dihierro monooxigenasa soluble que codifica un polipéptido que es al menos un 60 %, de manera preferiblemente aproximada un 65 %, de manera preferiblemente aproximada un 70 %, de manera preferiblemente aproximada un 75 %, de manera preferiblemente aproximada un 80 %, de manera preferiblemente aproximada un 85 %, de manera preferiblemente aproximada un 90 % o de manera preferiblemente aproximada un 95 % idéntico a las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 61. En una realización, el microorganismo comprende Escherichia coli y el microorganismo sintético es Escherichia coli y el polinucleótido sintético de monooxigenasa codifica una enzima dihierro monooxigenasa soluble que codifica un polipéptido que tiene las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 61 y la al menos una chaperona de plegamiento de proteínas tiene las secuencias de aminoácidos expuestas en Se Q ID NO: 63 y SEQ ID NO: 65 y SEQ ID NO: 67 y SEQ ID NO: 69.

Según la invención, la al menos una chaperona de plegamiento de proteínas comprende al menos groES y/o groEL heterólogas. En una realización, la al menos una chaperona de plegamiento de proteínas comprende al menos una proteína que es al menos un 60 %, de manera preferiblemente aproximada un 65 %, de manera preferiblemente aproximada un 70 %, de manera preferiblemente aproximada un 75 %, de manera preferiblemente aproximada un 80 %, de manera preferiblemente aproximada un 85 %, de manera preferiblemente aproximada un 90 % o de manera preferiblemente aproximada un 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 63 o SEQ ID NO: 65 o SEQ ID NO: 67 o SEQ ID NO: 69 o SEQ ID NO: 120 o SEQ ID NO: 122 o SEQ ID NO: 124 o SEQ ID NO: 126 o SEQ ID NO: 128 o SEQ ID NO: 130 o SEQ ID NO: 132 o SEQ ID NO: 134 o SEQ ID NO: 136 o SEQ ID NO: 138 o SEQ ID NO: 140 o SEQ ID NO: 142. En una realización, la al menos una chaperona de plegamiento de proteínas comprende al menos una proteína que es al menos un 60 %, de manera preferiblemente aproximada un 65 %, de manera preferiblemente aproximada un 70 %, de manera preferiblemente aproximada un 75 %, de manera preferiblemente aproximada un 80 %, de manera preferiblemente aproximada un 85 %, de manera preferiblemente aproximada un 90 % o de manera preferiblemente aproximada un 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de cualquier secuencia dada a conocer en el presente documento. En una realización para cualquier divulgación proporcionada en el presente documento, la al menos una chaperona de plegamiento de proteínas comprende al menos dos chaperonas de plegamiento de proteínas. En una realización para cualquier divulgación proporcionada en el presente documento, la al menos una chaperona de plegamiento de proteínas comprende una proteína que es GroES y/o GroEL de al menos una de Escherichia coli, Methylocaldum sp175, Methylococcus capsulatus o Solimonas aquatica DSM 25927. En una realización para cualquier divulgación proporcionada en el presente documento, la al menos una chaperona de plegamiento de proteínas comprende groES y/o GroEL de Escherichia coli, y GroES y/o GroEL-2 de Methylococcus capsulatus. En una realización para cualquier divulgación en el presente documento, las chaperonas de plegamiento de proteínas son cada una selectivamente, completamente o en particular combinaciones expresadas de manera conjunta para mejorar la actividad monooxigenasa. En una realización, las chaperonas de plegamiento de proteínas son cada una selectivamente, completamente o en particular combinaciones sobreexpresadas para mejorar la actividad monooxigenasa. En una realización de cualquier cosa dada a conocer en el presente documento, la enzima dihierro monooxigenasa soluble es una metano monooxigenasa o una etano monooxigenasa. En una realización para cualquier divulgación proporcionada en el presente documento, la monooxigenasa es una monooxigenasa de al menos uno de Solimonas aquatica DSM 25927, Methyloferula stellata, Methylocaldum sp 175, Methylococcus capsulatus, Methylocella silvestris y/o Methylosinus trichosporium. En una realización, la monooxigenasa es una cualquiera o más monooxigenasas de la tabla 16. En una realización para cualquier divulgación en el presente documento, la(s) monooxigenasa(s) son cada una selectivamente, completamente o en particular combinaciones elegidas y combinadas para mejorar la actividad monooxigenasa global. En una realización para cualquier divulgación proporcionada en el presente documento, la monooxigenasa y/o las chaperonas de plegamiento de proteínas son cualquier proteína lo suficientemente homóloga como para ser adecuada para la presente divulgación y que puede utilizarse en cualquier cantidad y combinación que sea adecuada para llevar a cabo la invención reivindicada.

En un aspecto no según la invención, el microorganismo comprende Escherichia coli, el microorganismo sintético comprende Escherichia coli y el polinucleótido sintético de deshidrogenasa codifica una alcohol deshidrogenasa y/o una acetaldehído deshidrogenasa. En una realización, la alcohol deshidrogenasa y/o una acetaldehído deshidrogenasa comprende al menos uno, dos o la totalidad de Mdh de Bacillus stearothermophilus (SEQ ID NO: 51), MhpF de Escherichia coli (SEQ ID NO: 53) o AcdH de Clostridium kluyveri (SEQ ID NO: 55). En un aspecto no según la invención, la proteína comprende una mutación de una T por una A en la posición 267 y una K por una E en la posición 568 de la proteína codificada por el gen adhE de Escherichia coli de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ NO: 49. En un aspecto no según la invención, el microorganismo sintético comprende una Escherichia coli que se ha transformado con el polinucleótido sintético de deshidrogenasa y el microorganismo sintético ha mejorado el crecimiento en etanol o consume etanol como única fuente de carbono o como fuente principal de carbono en comparación con un microorganismo que no se ha transformado con el polinucleótido sintético de deshidrogenasa. En un aspecto no según la invención, el microorganismo sintético comprende Escherichia coli que se ha transformado con el polinucleótido sintético de deshidrogenasa, el sustrato es etanol y el producto químico es un ácido graso. En una realización, el microorganismo sintético comprende Escherichia coli que se ha transformado con el polinucleótido sintético de deshidrogenasa, el gen araBAD se ha eliminado, el microorganismo sintético se ha transformado con el gen fatB1 de Umbellularia californica, el sustrato comprende etanol y el producto químico comprende un ácido graso. En un aspecto no según la invención, el microorganismo sintético comprende Escherichia coli que se ha transformado con el polinucleótido sintético de deshidrogenasa, el sustrato es etanol y el producto químico es succinato. En un aspecto no según la invención, el microorganismo sintético comprende Escherichia coli que se ha transformado con el polinucleótido sintético de deshidrogenasa y los genes araBAD, ic1R, y/o sdhAB se han eliminado y/o su expresión se ha reducido, el sustrato comprende etanol y el producto químico comprende succinato. En un aspecto no según la invención para cualquier divulgación en el presente documento, la(s) deshidrogenasa(s) son cada una selectivamente, completamente o en particular combinaciones elegidas y combinadas para mejorar la actividad deshidrogenasa global.

En una realización para cualquier divulgación proporcionada en el presente documento, el microorganismo comprende Corynebacterium glutamicum. En una realización, el microorganismo comprende Corynebacterium glutamicum, el microorganismo sintético comprende Corynebacterium glutamicum y el polinucleótido sintético de monooxigenasa codifica una enzima dihierro monooxigenasa soluble. En una realización, la enzima dihierro monooxigenasa soluble comprende una metano monooxigenasa o una etano monooxigenasa. En una realización, el microorganismo sintético comprende Corynebacterium glutamicum que se ha transformado con el polinucleótido sintético y el microorganismo sintético ha mejorado el crecimiento en metano o etano o consume metano o etano como única fuente de carbono o como fuente principal de carbono en comparación con un microorganismo que no se ha transformado con el polinucleótido sintético de monooxigenasa. En una realización, el microorganismo sintético comprende Corynebacterium glutamicum que se ha transformado con el polinucleótido sintético de monooxigenasa, el sustrato de monooxigenasa comprende etano y el producto químico comprende etanol. En una realización, el microorganismo sintético comprende Corynebacterium glutamicum que se ha transformado con el polinucleótido sintético de monooxigenasa, el sustrato de monooxigenasa comprende metano y el producto químico comprende metanol. En una realización, el microorganismo sintético comprende Corynebacterium glutamicum que se ha transformado con el polinucleótido sintético de monooxigenasa, el sustrato de monooxigenasa comprende naftaleno y el producto químico comprende 1-naftol. En una realización, el microorganismo sintético comprende Corynebacterium glutamicum que se ha transformado con el polinucleótido sintético de monooxigenasa, el sustrato de monooxigenasa comprende etano y el producto químico comprende un aminoácido, tal como glutamato, lisina, o metionina.

En una realización, el microorganismo comprende Corynebacterium glutamicum y el microorganismo sintético es Corynebacterium glutamicum y el polinucleótido sintético de monooxigenasa codifica una enzima dihierro monooxigenasa soluble que codifica un polipéptido que es al menos un 60 %, de manera preferiblemente aproximada un 65 %, de manera preferiblemente aproximada un 70 %, de manera preferiblemente aproximada un 75 %, de manera preferiblemente aproximada un 80 %, de manera preferiblemente aproximada un 85 %, de manera preferiblemente aproximada un 90 % o de manera preferiblemente aproximada un 95 % idéntico a las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 8 y SEQ ⁱD NO: 10 y SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 61. En una realización, el microorganismo comprende Corynebacterium glutamicum y el microorganismo sintético es Corynebacterium glutamicum y el polinucleótido sintético de monooxigenasa codifica una enzima dihierro monooxigenasa soluble que codifica un polipéptido que tiene las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 61 y la al menos una chaperona de plegamiento de proteínas tiene las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 65 y SEQ ID NO: 67 y SEQ ID NO: 69.

En un aspecto no según la invención, los polinucleótidos sintéticos codifican enzimas seleccionadas del grupo que consiste en metanol deshidrogenasa (EC 1.1.1.244 o 1.1.99.37 o 1.1.2.7), alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.1 o 1.1.1.2 o 1.1.2.8 o 1.1.3.13), aldehído deshidrogenasa (EC 1.2.1.3), acetaldehído deshidrogenasa (EC 1.2.1.10), acetil-CoA sintetasa (EC 6.2.1.1), isocitrato liasa (EC 4.1.3.1), malato sintasa (EC 2.3.3.9), isocitrato deshidrogenasa quinasa/fosfatasa (EC 2.7.11.5, EC 3.1.3). En una realización, la enzima o enzimas deshidrogenasas pueden ser una cualquiera o más de metanol deshidrogenasa (EC 1.1.1.244 o 1.1.99.37 o 1.1.2.7), alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.1 o 1.1.1.2 o 1.1.2.8 o 1.1.3.13), aldehído deshidrogenasa (EC 1.2.1.3), y/o acetaldehído deshidrogenasa (^eC 1.2.1.10).

En una realización, el microorganismo comprende Pichia pastoris. En una realización, el microorganismo sintético comprende Pichia pastoris y el polinucleótido sintético de monooxigenasa codifica una enzima dihierro monooxigenasa soluble. En una realización, la enzima dihierro monooxigenasa soluble comprende una metano monooxigenasa, una etano monooxigenasa o una tolueno-4-monooxigenasa. En una realización, el microorganismo sintético comprende Pichia pastoris que se ha transformado con el polinucleótido sintético de monooxigenasa y el microorganismo sintético ha mejorado el crecimiento en metano, etano o naftaleno o consume metano, etano o naftaleno como única fuente de carbono o como fuente de carbono principal en comparación con un microorganismo que no se ha transformado con el polinucleótido sintético de monooxigenasa. En una realización, el microorganismo sintético comprende Pichia pastoris que se ha transformado con el polinucleótido sintético de monooxigenasa que incorpora una monooxigenasa de Methylocystis sp. LW5 y/o Solimonas aquatica, polinucleótido sintético que codifica subunidades de chaperonina de groES y groEL, el sustrato de monooxigenasa comprende metano y el producto químico comprende metanol. En una realización, hay dos plásmidos implicados en la transformación de Pichia pastoris. En una realización, el microorganismo sintético comprende Pichia pastoris que se ha transformado con el polinucleótido sintético de monooxigenasa, el sustrato de monooxigenasa comprende etano y el producto químico comprende etanol. En una realización, el microorganismo sintético comprende Pichia pastoris que se ha transformado con el polinucleótido sintético de monooxigenasa, el sustrato de monooxigenasa comprende etano y el producto químico comprende malato. En una realización, el microorganismo sintético comprende Pichia pastoris que se ha transformado con un polinucleótido sintético adicional que codifica los genes PYC2, MDH3(DSKL) y MAE1, el sustrato de monooxigenasa comprende etano y el producto químico comprende malato. En una realización, el microorganismo sintético comprende Pichia pastoris que se ha transformado con el polinucleótido sintético de monooxigenasa, el gen araBAD se ha eliminado, el sustrato comprende metano y el producto químico comprende metanol. En una realización, el microorganismo sintético comprende Pichia pastoris que se ha transformado con el polinucleótido sintético de monooxigenasa, el sustrato de monooxigenasa es naftaleno y el producto químico es 1-naftol. En una realización, la monooxigenasa es tolueno-4-monooxigenasa de Pseudomonas mendocina KR1, el sustrato de monooxigenasa comprende naftaleno y el producto químico es 1-naftol. En una realización para cualquier divulgación en el presente documento, monooxigenasa(s) y/o chaperonas de plegamiento de proteínas son cada una selectivamente, completamente o en particular combinaciones elegidas y combinadas para mejorar la actividad monooxigenasa global.

En una realización para cualquier divulgación proporcionada en el presente documento, la monooxigenasa y/o las chaperonas de plegamiento de proteínas son cualquier proteína lo suficientemente homóloga como para ser adecuada para la presente divulgación y pueden utilizarse en cualquier cantidad y combinación que sea adecuada para llevar a cabo la invención reivindicada.

En una realización, el microorganismo comprende Pichia pastoris y el microorganismo sintético es Pichia pastoris y el polinucleótido sintético de monooxigenasa codifica una enzima dihierro monooxigenasa soluble que codifica un polipéptido que es al menos un 60 %, de manera preferiblemente aproximada un 65 %, de manera preferiblemente aproximada un 70 %, de manera preferiblemente aproximada un 75 %, de manera preferiblemente aproximada un 80 %, de manera preferiblemente aproximada un 85 %, de manera preferiblemente aproximada un 90 % o de manera preferiblemente aproximada un 95 % idéntico a las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 144 y SEQ ID NO: 146 y SEQ ID NO: 148 y SEQ ID NO: 150 y SEQ ID NO: 152 y SEQ ID NO: 154. En una realización, el microorganismo comprende Pichia pastoris y el microorganismo sintético es Pichia pastoris y el polinucleótido sintético de monooxigenasa codifica una enzima dihierro monooxigenasa soluble que codifica un polipéptido que tiene las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 144 y SEQ ID NO: 146 y SEQ ID n O: 148 y SEQ ID NO: 150 y SEQ ID NO: 152 y SEQ ID NO: 154 y la al menos una chaperona de plegamiento de proteínas tiene las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 120 y SEQ ID n O: 122.

En una realización preferida, se da a conocer un microorganismo que comprende uno cualquiera de los polinucleótidos sintéticos expuestos en el presente documento. En una realización, el polinucleótido sintético es un polinucleótido sintético de monooxigenasa y/o un polinucleótido sintético de deshidrogenasa que comprende uno o más de los plásmidos pBZ13 (SEQ ID NO: 15), pBZ15 (SEQ ID NO: 16), pBZ21 (SEQ ID NO: 17), pBZ23 (SEQ ID NO: 18), pBZ4 (SEQ ID NO: 19), pDG5 (SEQ ID NO: 21), pDG6 (SEQ ID NO: 22), pLC100 (SEQ ID NO: 23), pLC12 (SEQ ID NO:

24), pLC37 (SEQ ID NO: 25), pLC39 (SEQ ID NO: 26), pLC99 (SEQ ID NO: 27), pNH100 (SEQ ID NO: 28), pNH104 (SEQ ID NO: 29), pNH132 (SEQ ID NO: 30), pNH157 (SEQ ID NO: 31), pNH158 (SEQ ID NO: 32), pNH160 (SEQ ID NO: 33), pNH166 (SEQ ID NO: 34), pNH167 (SEQ ID NO: 35), pNH172 (SEQ ID NO: 36), pNH173 (SEQ ID NO: 37), pNH177 (SEQ ID NO: 38), pNH178 (SEQ ID NO: 39), pNH180 (SEQ ID NO: 40), pNH181 (SEQ ID NO: 41), pNH185 (SEQ ID NO: 42), pNH187 (SEQ ID NO: 43), pNH188 (SEQ ID NO: 44), pNH225 (SEQ ID NO: 45) y/o pNH238 (SEQ ID NO: 46) o cualquier otro polinucleótido sintético o polipéptido sintético dado a conocer en el presente documento.

En una realización preferida, el microorganismo es Escherichia coli que se ha transformado con plásmidos pBZ15 (SEQ ID NO: 16) y pNH225 (SEQ ID NO: 45).

En una realización para cualquier divulgación proporcionada en el presente documento, el microorganismo es Bacillus methanolicus. En una realización para cualquier divulgación proporcionada en el presente documento, el microorganismo es Saccharomyces cerevisiae.

Cualquiera de las realizaciones proporcionadas en el presente documento puede llevarse a cabo en un monocultivo o llevarse a cabo en un cocultivo. En una realización, una ruta de asimilación de metano se incorpora en un hospedador heterólogo. En una realización, una ruta de asimilación de metanol se incorpora en un hospedador heterólogo.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un método para producir un producto químico, que comprende cultivar cualquiera de los microorganismos sintéticos proporcionados en el presente documento en condiciones de cultivo adecuadas y durante un período de tiempo suficiente para producir el producto químico. En una realización, las condiciones de cultivo adecuadas comprenden medios de cultivo que contienen al menos uno de metano, metanol, etano, etanol, propano, butano o naftaleno como única fuente de carbono o como fuente principal de carbono. En una realización, el microorganismo sintético se cultiva en condiciones tales que el microorganismo sintético produce un producto químico que se convierte en un segundo producto químico por un segundo microorganismo o un segundo microorganismo sintético.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra dos rutas representativas de etano a acetil-CoA. Se conocen muchas enzimas o clases de enzimas que catalizan cada una de estas etapas de reacción. Dependiendo de las enzimas exactas presentes en una cepa particular, la ruta puede proceder a través de acetato o solo directamente de acetaldehído a acetil-CoA. El acetil-CoA es un nodo principal del metabolismo central a partir del cual se construyen otros metabolitos clave.

La figura 2 muestra la comparación de la cantidad de etanol generada en tres cepas: LC165 (control), BZ11 (sMMO inducible que convierte etano en etanol), y LC168 (sMMO inducible que convierte etano en etanol).

La figura 3 muestra la producción de metanol a partir de una materia prima de metano. Las cepas de E. coli BZ11 y LC168 expresan una monooxigenasa funcional cada una.

La figura 4 muestra la cantidad de metanol generado en LC160 (sMMO inducible que convierte metano en metanol). La cepa de E. coli LC160 expresa tanto una monooxigenasa funcional como la sobreexpresión de genes groES y groEL de E. coli.

La figura 5 muestra la producción mejorada de etanol a partir de una materia prima de etano. La cepa de E. coli LC160 expresa tanto una monooxigenasa funcional como la sobreexpresión de genes groES y groEL de E. coli.

La figura 6 muestra la producción de 1-naftol a partir de una materia prima de naftaleno. Las cepas de E. coli LC151 y LC168 expresan una monooxigenasa funcional cada una. La concentración de 1-naftol se mide mediante la adición de un colorante sensible a naftol y la posterior medición de la absorbancia óptica a 540 nm. El valor de absorbancia de una cepa de control (que carece de cualquier monooxigenasa) se resta como valor de referencia.

La figura 7 muestra el crecimiento de NH566 en una materia prima de etano. La cepa NH566 se selló en dos frascos de suero, donde a uno se le inyectó aire y al otro etano. Este gráfico muestra la densidad de cultivo en función del tiempo después de las inyecciones, lo que ilustra el aumento de la densidad de cultivo para el frasco inyectado con etano y una disminución de la densidad de cultivo para el frasco inyectado con aire.

La figura 8 muestra el succinato marcado con 13C producido a partir de una materia prima de etano marcado con 13C. La cepa NH606 se selló en dos frascos de suero, donde a uno se le inyectó aire y al otro etano marcado con 13C. El gráfico en (a) muestra la diferencia en succinato 13C detectado entre los dos frascos. El pico en (b) es el resultado de la detección del pico de succinato 13C del método LC/MS/MS descrito en otra parte de la memoria descriptiva.

La figura 9 muestra un mapa plasmídico representativo que ilustra las regiones codificantes para el plásmido pBZ13 (SEQ ID NO: 15). Este plásmido permite la expresión de dos conjuntos de proteínas chaperonas, groES/groEL de E. coli. y M. capsulatus (Bath).

La figura 10 muestra un mapa plasmídico representativo que ilustra las regiones codificantes para el plásmido pDG6 (SEQ ID NO: 22). Este plásmido permite la expresión del gen mmoXYBZCD de sMMO de M. capsulatus (Bath), unido al promotor pBAD. El mapa plasmídico para pDG5 (SEQ ID NO: 21) sería casi idéntico a la adición única del gen mmoG de M. capsulatus (Bath) en el extremo 3' del operón de MMO.

La figura 11 muestra un mapa plasmídico representativo que ilustra las regiones codificantes para el plásmido pLC99 (SEQ ID NO: 27). Este plásmido permite la expresión de una ruta de asimilación de etanol en E. coli. El mapa plasmídico para pLC100 (SEQ ID NO: 23) sería casi idéntico, ya que los únicos cambios son los nucleótidos alrededor de los sitios de unión al ribosoma con respecto al lado 5' de los dos genes de asimilación de etanol.

La figura 12 no según la invención y a modo de ilustración solo muestra un mapa plasmídico representativo que ilustra las regiones codificantes para plásmido pNH014 (SEQ ID NO: 57). Este plásmido permite la expresión de una ruta de producción de malato de 3 genes en Pichia pastoris.

La figura 13 muestra un mapa plasmídico representativo que ilustra las regiones codificantes para plásmido pNH160 (SEQ ID NO: 33). Este plásmido permite la expresión de dihierro monooxigenasa soluble de Solimonas aquatica en E. coli. Los plásmidos pNH157 (SEQ ID NO: 31), pNH158 (SEQ ID NO: 32), y pNH100 (SEQ ID NO: 28) son casi idénticos, con la excepción de la sustitución de las secuencias codificantes de la monooxigenasa de S. aquatica que se reemplazan con las de Methylocaldum sp. 175, Methyloferula stellata y Pseudonocardia TY7, respectivamente.

La figura 14 muestra un mapa plasmídico representativo que ilustra las regiones codificantes para plásmido pNH166 (SEQ ID NO: 34). Este plásmido permite la expresión de cuatro subunidades de mmoX, mmoY, mmoZ, y mmoC de metano monooxigenasa de Methylocystis de diferentes promotores para la expresión en Pichia pastoris. Este plásmido puede digerirse por restricción con enzima BsaI para generar un fragmento lineal para la integración en el cromosoma. El plásmido pNH167 (SEQ ID NO: 35) es casi idéntico, siendo la excepción la sustitución de las secuencias codificantes para las subunidades de MMO derivadas de Solimonas aquatica.

La figura 15 muestra un mapa plasmídico representativo que ilustra las regiones codificantes para plásmido pNH172 (SEQ ID NO: 36). Este plásmido permite la expresión de dos subunidades de mmoB y mmoD de metano monooxigenasa de Methylocystis, más groES and groEL de chaperona de Methylocystis a partir de diferentes promotores para la expresión en Pichia pastoris. Este plásmido puede digerirse por restricción con enzima BsaI para generar un fragmento lineal para la integración en el cromosoma. El plásmido pNH173 (SEQ ID NO: 37) es casi idéntico, siendo la excepción la sustitución de las secuencias codificantes para las subunidades y chaperonas de MMO derivadas de Solimonas aquatica.

La figura 16 muestra un mapa plasmídico representativo que ilustra las regiones codificantes para plásmido pNH180 (SEQ ID NO: 40). Este plásmido permite la expresión de groES y groEL-2 de chaperonas de M. capsulatus (Bath) para la expresión en E. coli. Los plásmidos pNH177 (SEQ ID NO: 38), pNH178 (SEQ ID NO: 39), pNH181 (SEQ ID NO: 41), pNH185 (SEQ ID NO: 42), pNH187 (SEQ ID NO: 43), y pNH188 (SEQ ID NO: 44) son casi idénticos al plásmido pNH180, con la excepción de la sustitución de las secuencias codificantes para los genes groES y groEL derivados de Pseudonocardia autotrófica, Thauera butanivora, Methylosinus trichosporium, Methylocaldum sp. 175, Methylocystis sp. LW5, y Solimonas aquatica, respectivamente.

La figura 17 muestra un mapa plasmídico representativo que ilustra las regiones codificantes para el plásmido pNH238 (SEQ ID NO: 46). Este plásmido permite la expresión de las subunidades sMMO y genes groES/groEL-2 de M. capsulatus (Bath), más los genes de chaperona groES/groEL de E. coli para la expresión en E. coli, C. glutamicum, y otras bacterias Gram-positivas. El plásmido pBZ21 (SEQ ID NO: 17) es casi idéntico, con la excepción del fragmento que contiene el origen de replicación C.glutamicum y el casete KanR.

La figura 18 muestra el alineamiento de múltiples secuencias entre tres subunidades de monooxigenasa: la subunidad prm1a de la propano monooxigenasa (en pNH100 (SEQ ID NO: 28), de Pseudonocardia TY-7), la subunidad mmoX de la etano monooxigenasa (en pNH160 (SEQ ID NO: 33), de Solimonas aquatica), y las subunidades mmoX de la metano monooxigenasa (en pDG5 (SEQ ID NO: 21), de Methylococcus capsulatus (Bath)). Las estrellas debajo de las secuencias indican posiciones en las que las tres secuencias tienen un residuo de aminoácido estrictamente conservado.

Descripción detallada de la invención

La divulgación proporciona proteínas y polipéptidos sintéticos. La divulgación también proporciona microorganismos diseñados para expresar funcionalmente una enzima monooxigenasa que convierte una amplia gama de sustratos orgánicos en una gama aún más amplia de productos. La divulgación también proporciona microorganismos diseñados para consumir moléculas que contienen carbono, tales como alcano o moléculas tales como metano o metanol, etano o etanol. La invención también proporciona microorganismos diseñados para convertir metano y/o metanol o etano y/o etanol en productos industriales.

Se proporcionan además composiciones y métodos que comprenden el uso de dichos microorganismos para producir productos químicos. Los métodos proporcionan una producción superior de bajo coste en comparación con la existente fermentación que consume azúcar.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el significado comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Los profesionales se dirigen particularmente a (M R Green y J Sambrook, eds, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012), (F M Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology (Suplemento 99), John Wiley & Sons, Nueva York, 2012), y (Bornscheuer, U. y R.J. Kazlauskas, Curr Protoc Protein Sci, 2011). Los métodos estándar también aparecen en (Bindereif, Schón, y Westhof, Handbook of RNA Biochemistry, Wiley-VCH, Weinheim, Alemania, 2005) que describe métodos detallados para la manipulación y análisis de ARN, y (SL Beaucage etal., Curr Protoc Nucleic Acid Chem, 2009) y (A Y Keel et al., Methods Enzymol 469:3-25, 2009) que describen métodos de síntesis química y purificación de ARN. Ejemplos de técnicas moleculares apropiadas para generar ácidos nucleicos, y se encuentran instrucciones suficientes para dirigir a los expertos a través de muchos ejercicios de clonación en (M R Green et al., Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Volumen 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1987); y (PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, CA, 1990).

Como se usa en el presente documento, los términos “proteína accesoria” y “proteína auxiliar” se pretende que signifiquen proteínas que permiten la función de una enzima separada, colección de enzimas, complejo enzimático formado por más de una proteína, o proteína no enzimática. Un ejemplo de la función de una proteína accesoria o auxiliar es una proteína que se sabe que ayuda al plegamiento de otras proteínas (las denominadas “chaperonas de plegamiento de proteínas” o “chaperoninas”). Otro ejemplo es una proteína que modifica otra proteína, incluyendo modificaciones postraduccionales tales como acetilación, metilación, acilación, farnesilación, etc., así como la desacetilación de reacciones inversas, desmetilación, etc., así como la eliminación de una fracción de una proteína. Otros ejemplos son proteínas que ayudan a una enzima o complejo enzimático a ensamblar correctamente un grupo protésico, o cargar un centro metálico, o permitir que la enzima o complejo se localice en la ubicación física adecuada en la célula, o permitir la transferencia de electrones u otros grupos químicos a la enzima. En algunos casos, las proteínas accesorias permiten la función de una enzima, aunque el mecanismo de acción exacto aún no se conoce.

Como se usa en el presente documento, el término “biomasa” se pretende que signifique la recogida de materia biológica, compuesto por células, que resulta del proceso de cultivo de un microorganismo en condiciones adecuadas para el crecimiento de ese organismo en cultivo. En algunos casos, la biomasa incluye simplemente las células y sus contenidos y, en algunos casos, la biomasa incluye adicionalmente cualquier macromolécula, tales como proteínas, que se secretan en el cultivo, fuera del límite de la membrana celular.

Como se usa en el presente documento, el término “fuente de carbono” se pretende que signifique una materia prima introducida en un proceso industrial que contiene átomos de carbono que pueden usarse por los microorganismos en un cultivo. Por ejemplo, los cultivos industriales de microorganismos pueden usar glucosa como fuente de átomos de carbono. Como se proporciona en el presente documento, además de fuentes de carbono típicas tales como azúcares y aminoácidos, la fuente de carbono puede ser adicionalmente metano, metanol, etano, etanol, o cualquiera de los compuestos en la columna A de la tabla 1. En algunos casos, un cultivo se hace crecer en un medio que contiene un único compuesto utilizable que contiene átomos de carbono. Como el carbono es un elemento que es esencial para la vida, el cultivo debe tener, en este ejemplo, rutas metabólicas para convertir el compuesto individual que contiene átomos de carbono en muchas otras moléculas biológicas necesarias para la supervivencia del organismo.

Como se usa en el presente documento, “fuente de carbono única” se pretende que signifique condiciones adecuadas que comprenden un medio de cultivo que contiene metano, metanol, etano, etanol, o cualquiera de los compuestos en la columna A de la tabla 1 como fuente de carbono de manera que, como una fracción del total de átomos de carbono utilizables en los medios, los compuestos citados anteriormente, respectivamente, representan aproximadamente el 100 % del total de átomos de carbono utilizables en los medios.

Como se usa en el presente documento, “fuente de carbono principal” se pretende que signifique que cuando las condiciones adecuadas comprenden un medio de cultivo que contiene metano, metanol, etano, o etanol, o cualquiera de los compuestos en la columna A de la tabla 1 como fuente de carbono como fracción de los átomos de carbono totales en los medios, los compuestos citados anteriormente representan, respectivamente, al menos aproximadamente el 10 % o más del total de átomos de carbono utilizables en los medios, aproximadamente el 20 % o más del total de átomos de carbono utilizables en los medios, aproximadamente el 30 % o más del total de átomos de carbono utilizables en los medios, aproximadamente el 40 % o más del total de átomos de carbono utilizables en los medios, aproximadamente el 50 % o más del total de átomos de carbono utilizables en los medios, aproximadamente el 60 % o más del total de átomos de carbono utilizables en los medios, aproximadamente el 70 % o más del total de átomos de carbono utilizables en los medios, aproximadamente el 80 % o más del total de átomos de carbono utilizables en los medios o aproximadamente el 90 % o más del total de átomos de carbono utilizables en los medios.

Como se usa en el presente documento, el término “producto químico” se pretende ampliamente que incluya cualquier sustancia usada en o resultante de una reacción que implica cambios en átomos o moléculas, especialmente uno derivado según cualquiera de los procesos expuestos en el presente documento. Como tal, un producto químico se pretende que signifique una sustancia obtenida por un proceso químico o una sustancia que tiene un efecto químico. Ejemplos de productos químicos contemplados por la invención, sin limitación, son ácido dicarboxílico, ácido málico, ácido fumárico, ácido succínico, sal de ácido málico, sal de ácido fumárico, sal de ácido succínico, ácido L-málico, ácido D-málico, ácido maleico, ácido láctico, ácido adípico, 1,3-propanodiol, 2,3-butanodiol, 1,4-butanodiol, butadieno, derivados de ácidos grasos, alcoholes grasos, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, ésteres metílicos de ácidos grasos, ésteres etílicos de ácidos grasos, ácidos grasos ramificados, derivados de ácidos grasos ramificados, ácidos grasos omega-3, isoprenoides, isopreno, farneseno, farnesano, escualeno, escualano, carotenoides, cualquiera o todos los aminoácidos, alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutámico, glutamato monosódico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptófano, valina, ornitina, prolina, selenocisteína, serina, tirosina, etanol, propanol, 1-butanol, 2-butanol, isobutanol (2-metilpropan-1-ol), alcoholes, alcanos, alquenos, olefinas, aditivos para productos alimenticios para animales, mezclas de aminoácidos, y proteínas. Otros ejemplos de productos químicos incluyen, pero no se limitan a, etanol, propanol, isopropanol, butanol, alcoholes grasos, ésteres de ácidos grasos, ésteres etílicos, ésteres de cera; hidrocarburos y alcanos tales como propano, octano, diésel, Jet Propellant 8 (JP8); tereftalato, 1,3-propanodiol, 1,4-butanodiol, acrilato, ácido adípico, g-caprolactona, isopreno, caprolactama, polioles, polihidroxialcanoatos (PHA), poli-beta-hidroxibutirato (PHB), caucho, y polímeros compuestos por tereftalato, 1,3-propanodiol, 1,4-butanodiol, acrilato, ácido adípico, gcaprolactona, isopreno, caprolactama; productos químicos básicos tales como lactato, ácido docosahexaenoico (DHA), 3-hidroxipropionato, y-valerolactona, lisina, serina, aspartato, ácido aspártico, sorbitol, ascorbato, ácido ascórbico, isopentenol, lanosterol, DHA omega-3, licopeno, itaconato, 1,3-butadieno, etileno, propileno, succinato, citrato, ácido cítrico, glutamato, malato, ácido 3-hidroxipropiónico (HPA), ácido láctico, THF, gamma butirolactona, pirrolidonas, hidroxibutirato, ácido glutámico, ácido levulínico, ácido acrílico, ácido malónico; productos químicos especializados tales como carotenoides, isoprenoides, ácido itacónico; productos farmacéuticos e intermedios farmacéuticos tales como ácido 7-aminodesacetoxicefalosporánico (7-ADCA)/cefalosporina, eritromicina, policétidos, estatinas, paclitaxel, docetaxel, terpenos, péptidos, esteroides, ácidos grasos omega y otros productos de interés adecuados de este tipo. Tales productos son útiles en el contexto de biocombustibles, productos químicos industriales y especializados, como intermedios usados para fabricar productos adicionales, tales como suplementos nutricionales, nutracéuticos, polímeros, reemplazos de parafina, productos para el cuidado personal y productos farmacéuticos. Otros ejemplos de productos químicos incluyen, sin limitación, todos los compuestos que pueden producirse con los métodos expuestos en el presente documento. Se pretende que tales compuestos incluyan todas las moléculas que pueden construirse con los métodos expuestos en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, sin limitación, todas las moléculas orgánicas e inorgánicas que pueden prepararse con los métodos expuestos en el presente documento. El término producto químico se pretende que incluya compuestos naturales y no naturales. Ejemplos de moléculas naturales incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos, ácidos nucleicos, nucleótidos y polinucleótidos y todas las moléculas biológicas relacionadas. Compuestos no naturales incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos y nucleótidos que se modifican de manera diferente a la que normalmente se modifican en sistemas biológicos, y compuestos que normalmente no se encuentran en la naturaleza.

Como se usa en el presente documento, el término “región codificante” o “secuencias codificantes” se pretende que signifique ADN o ARN que codifica una región de, por ejemplo, pero no se limita a, polipéptidos (es decir, proteínas) que usan el código genético. Una región codificante a menudo está limitada en el extremo 5' por un codón de inicio y más cerca del extremo 3' con un codón de terminación. Los codones de inicio y terminación tienen que estar necesariamente al principio y al final, respectivamente, de la región codificante.

Como se usa en el presente documento, el término “cultivo” se pretende que signifique el crecimiento o mantenimiento de microorganismos en condiciones de laboratorio o industriales. El cultivo de microorganismos es una práctica estándar en el campo de la microbiología. Pueden cultivarse microorganismos usando medios líquidos o sólidos como fuente de nutrientes para los microorganismos. Además, algunos microorganismos pueden cultivarse en medios definidos, en el que los medios líquidos o sólidos se generan por preparación usando componentes químicos purificados. La composición de los medios de cultivo puede ajustarse para adaptarse al microorganismo o al propósito industrial del cultivo.

Como se usa en el presente documento, el término “polinucleótidos endógenos” se pretende que signifique polinucleótidos derivados de polinucleótidos de origen natural en un organismo dado. El término “endógeno” se refiere a una molécula o actividad referenciada que está presente en el hospedador. De manera similar, el término cuando se usa en referencia a la expresión de un ácido nucleico o polinucleótido codificante se refiere a la expresión del ácido nucleico o polinucleótido codificante contenido dentro del organismo microbiano.

Como se usa en el presente documento, el término “polinucleótidos exógenos” se pretende que signifique polinucleótidos que no se derivan de polinucleótidos de origen natural en un organismo dado. Polinucleótidos exógenos pueden derivarse de polinucleótidos presentes en un organismo diferente. Los polinucleótidos exógenos pueden introducirse en el organismo mediante la introducción de un ácido nucleico codificante en el material genético del hospedador, tal como mediante la integración en un cromosoma hospedador o como material genético no cromosómico, tal como un plásmido. Por lo tanto, el término tal como se usa en referencia a la expresión de un ácido nucleico codificante se refiere a la introducción del ácido nucleico codificante en una forma expresable en el organismo microbiano. Cuando se usa en referencia a una actividad biosintética, el término se refiere a una actividad que se introduce en el organismo de referencia de hospedador. La fuente puede ser, por ejemplo, un ácido nucleico codificante homólogo o heterólogo que expresa la actividad referenciada después de la introducción en el organismo microbiano hospedador. El término “heterólogo” se refiere a una molécula o actividad derivada de una fuente distinta de la especie referenciada, mientras que “homólogo” se refiere a una molécula o actividad derivada del organismo microbiano hospedador. En consecuencia, la expresión exógena de un ácido nucleico codificante de la invención puede utilizar cualquiera o ambos de un ácido nucleico codificante heterólogo u homólogo. Como se expone en la invención, un ácido nucleico no es necesario que incluya todas sus regiones codificantes relevantes o incluso completas en un solo polímero y la invención proporcionada en el presente documento contempla tener regiones codificantes completas o parciales en diferentes polímeros.

Como se usa en el presente documento, el término “enzima” se pretende que se refiera a moléculas que aceleran o catalizan reacciones químicas. Casi todos los procesos metabólicos en la célula necesitan enzimas para que ocurra a velocidades lo suficientemente rápidas como para mantener la vida. Algunas de las enzimas útiles en la invención son, sin limitación, metanol deshidrogenasa (EC 1.1.1.244 o 1.1.99.37 o 1.1.2.7), alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.1 o 1.1.1.2 o 1.1.2.8 o 1.1.3.13), aldehído deshidrogenasa (EC 1.2.1.3), acetaldehído deshidrogenasa (EC 1.2.1.10), acetil-CoA sintetasa (EC 6.2.1.1), isocitrato liasa (EC 4.1.3.1), malato sintasa (EC 2.3.3.9), isocitrato deshidrogenasa quinasa/fosfatasa (EC 3.1.3.-), metano monooxigenasa soluble (EC 1.14.13.25) y metano monooxigenasa particulada (EC 1.14.18.3).

Como se usa en el presente documento, el término “especificidad enzimática” o “especificidad de una enzima” se pretende que signifique el grado en el que una enzima es capaz de catalizar una reacción química en más de una molécula de sustrato. Una enzima que puede catalizar una reacción en exactamente un sustrato molecular, pero no es capaz de catalizar una reacción en ningún otro sustrato, se dice que tiene una especificidad muy alta por su sustrato. Se dice que una enzima que puede catalizar reacciones químicas en muchos sustratos tiene baja especificidad. En algunos casos, la especificidad de una enzima se describe en relación con uno o más sustratos definidos. Con respecto a la invención descrita en el presente documento, la especificidad de una monooxigenasa para metano (como sustrato) puede compararse con la de otra monooxigenasa para metano comparando las actividades relativas de las monooxigenasas para metano frente a sus actividades relativas frente a otros sustratos, tal como etano. En algunos casos, las mutaciones a una monooxigenasa pueden cambiar la especificidad enzimática de preferir metano (es decir, que tiene una actividad más alta para metano con respecto a etano) a preferir etano (es decir, que tiene una actividad más alta para etano con respecto a metano).

Como se usa en el presente documento, los términos “organismo que consume etanol”, “etilotrofo”, “microorganismo etilotrófico”, “organismo etilotrófico”, y “etilotrófico” se pretende que signifique cualquier organismo que sea capaz de convertir etanol (es decir, “alcohol etílico”, CH3OH) en un producto químico o en biomasa o en moléculas que el organismo puede usar en sus rutas metabólicas que generan energía o reducen equivalentes para que el organismo pueda crecer usando etanol como única fuente de carbono o fuente principal de carbono y/o fuente de energía. Por ejemplo, se sabe que algunos microorganismos de origen natural consumen etanol al convertirlo primero en acetaldehído, y luego convertir posteriormente el acetaldehído en acetato. El acetato a menudo se convierte en acetil-CoA, un nodo central del metabolismo común a todos los organismos. Algunos microorganismos convierten el acetaldehído directamente en acetil-CoA en una sola etapa. También son posibles otras rutas que permiten a los organismos asimilar el etanol en el metabolismo y este ejemplo no se pretende que limite la invención a la ruta de asimilación mencionada anteriormente.

Como se usa en el presente documento, los términos “etanotrofo”, “organismo que consume etano”, “organismo etanotrófico”, “microorganismo etanotrófico”, y “etanotrófico” se pretende que signifique un microorganismo que puede consumir etano como su principal fuente de carbono y/o como su única energía y/o única fuente de carbono. Por el contrario, un “microorganismo no etanotrófico” es uno que es incapaz de sobrevivir en etano como única fuente de carbono o fuente principal de carbono.

Como se usa en el presente documento, el término “metanotrofo” se pretende que signifique un organismo que es capaz de crecer usando metano como la única o principal fuente de carbono.

Como se usa en el presente documento, el término “etilotrofo sintético” se pretende que signifique un microorganismo que no consume etanol que se ha modificado para ser capaz de consumir etanol como su única energía y/o fuente de carbono única y/o fuente de carbono principal. Algunos etilotrofos son de origen natural, mientras que otros, descritos aquí en esta invención, son sintéticos. Etilotrofos sintéticos son organismos que son capaces de sobrevivir en etanol como única fuente de carbono o fuente de carbono principal debido a la adición de una ruta que permite la asimilación de etanol. La modificación puede ser una modificación genética tal como una o más mutaciones en los ácidos nucleicos de los microorganismos, la introducción de un plásmido episomal, y/o la introducción de polinucleótidos exógenos.

Como se usa en el presente documento, el término “etanotrofo sintético” se pretende que signifique un microorganismo que no consume etano que se ha modificado para ser capaz de consumir etano como su única energía y/o fuente de carbono única y/o fuente de carbono principal. Algunos etanotrofos son de origen natural, mientras que otros, descritos en el presente documento, son sintéticos. Los etanotrofos sintéticos son organismos que son capaces de sobrevivir en etano como única fuente de carbono o fuente de carbono principal debido a la adición de una ruta que permite la asimilación de etano. La modificación puede ser una modificación genética tal como una o más mutaciones en los ácidos nucleicos de los microorganismos, la introducción de un plásmido episomal, y/o la introducción de polinucleótidos exógenos.

Como se usa en el presente documento, los términos “ruta de asimilación de etanol” y “ruta de utilización de etanol” se pretende que signifiquen al menos una enzima, o un grupo o conjunto de enzimas, que permiten que un organismo convierta etanol en metabolitos que el organismo puede usar como fuente de masa (átomos de carbono, oxígeno e hidrógeno) y energía.

Como se usa en el presente documento, el término “crecimiento mejorado” se pretende que signifique una situación en la que una cepa microbiana se ha modificado de alguna manera, generalmente a través de modificación genética, de modo que, en las condiciones prescritas y en relación con la cepa original, la cepa modificada crece a una velocidad más rápida o logra una densidad más alta de células. Puede hacerse una comparación directa de dos cepas cultivando las cepas en condiciones idénticas y midiendo la densidad óptica (por ejemplo, absorbancia a 600 nm, “DO600”) o tasa de duplicación en varios momentos en el crecimiento celular. Una cepa demostrará un crecimiento mejorado, en relación con la otra cepa, si está creciendo cuantitativamente más rápido (es decir, duplicando más a menudo) o a una densidad celular mediblemente más alta. Una medida cuantitativa en cada punto de tiempo, tal como la relación de los valores de DO600 de las dos cepas o la relación de las tasas de duplicación, pueden usarse para identificar y rastrear cepas con un crecimiento mejorado.

Como se usa en el presente documento, los términos “microbio”, “microbiano”, “organismo microbiano” o “microorganismo” se pretende que signifiquen cualquier organismo que existe como una célula microscópica que se incluye dentro de los dominios de arqueas, bacterias o eucariotas. Por lo tanto, el término se pretende que abarque células u organismos procariotas o eucariotas que tienen un tamaño microscópico e incluye bacterias, arqueas y eubacterias de todas las especies, así como microorganismos eucariotas tales como levaduras y hongos. El término también incluye cultivos celulares de cualquier especie que puedan cultivarse para la producción de un producto bioquímico.

Como se usa en el presente documento, el término “mutación” se pretende que signifique un cambio de un nucleótido a otro en una secuencia de ADN o en un polinucleótido o un cambio de un aminoácido a otro en una secuencia de proteínas o en un polipéptido.

Como se usa en el presente documento, el término “de origen natural” se pretende que signifique encontrado normalmente en la naturaleza.

Como se usa en el presente documento, el término “de origen no natural” cuando se usa en referencia a un organismo microbiano o microorganismo de la invención se pretende que signifique que el organismo microbiano tiene al menos una alteración o adición genética que normalmente no se encuentra en una cepa de origen natural de la especie referenciada, incluyendo cepas de tipo silvestre de la especie referenciada. Alteraciones genéticas incluyen, por ejemplo, modificaciones que introducen ácidos nucleicos expresables que codifican polipéptidos metabólicos, otras adiciones de ácido nucleico, eliminaciones de ácido nucleico, y/u otra interrupción funcional del material genético microbiano. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, regiones codificantes y fragmentos funcionales de las mismas, para polipéptidos heterólogos, homólogos o tanto heterólogos como homólogos para las especies referenciadas. Modificaciones adicionales incluyen, por ejemplo, regiones reguladoras no codificantes en las que las modificaciones alteran la expresión de un gen u operón. Polipéptidos metabólicos a modo de ejemplo incluyen enzimas capaces de oxidar hidrocarburos, tales como alcanos y compuestos aromáticos o enzimas dentro de una ruta que consume metanol o enzimas dentro de una ruta que consume etanol o que consume etano.

Como se usa en el presente documento, el término “proteína unicelular” se pretende que signifique una fuente de proteína mixta extraída de cultivos puros o mixtos de microorganismos. La proteína unicelular se usa como sustituto de alimentos ricos en proteínas en productos alimenticios para seres humanos y animales.

Como se usa en el presente documento, el término “dihierro monooxigenasa soluble” se pretende que signifique la clase de enzimas y complejos enzimáticos caracterizados por un núcleo catalítico de dos átomos de hierro y la capacidad de utilizar oxígeno molecular (O2) para catalizar la hidroxilación o epoxidación de enlaces de hidrocarburo. Estas enzimas normalmente requieren NADH o NADPH como donante de electrones. Las dihierro monooxigenasas solubles (SDIMO) están compuestas habitualmente de tres o cuatro componentes: una hidroxilasa (compuesta en sí misma por múltiples subunidades), una subunidad oxidorreductasa, una proteína de acoplamiento, y a veces una proteína ferredoxina. La clase contiene al menos enzimas que pertenecen a las subclases: metano monooxigenasas solubles, fenol hidroxilasas, tolueno monooxigenasas, y alqueno monooxigenasas (Leahy et al., Evolution of the Soluble Diiron Monoxygenases FEMS Microbiology Reviews, Vol. 27., págs.449-479, 2003). A pesar de sus diferentes nombres, cada SDIMO puede estar activa contra una gama de sustratos. Por ejemplo, se ha mostrado que la metano monooxigenasa soluble (sMMO) oxida docenas de diferentes sustratos de hidrocarburos.

Como se usa en el presente documento, el término “enzima metano monooxigenasa” se pretende que signifique la clase de enzimas y complejos enzimáticos capaces de oxidar un enlace carbono-hidrógeno de la molécula de metano para dar como resultado una molécula de metanol. Los microorganismos que consumen metano de origen natural han evolucionado al menos dos clases de enzimas metano monooxigenasa: soluble y particulada. Cualquier enzima o complejo enzimático de estas categorías, cualquier enzima o complejo mutado, o cualquier enzima o complejo enzimático diseñado por el investigador que convierta metano en metanol se consideraría una enzima metano monooxigenasa. Se sabe que muchas de estas enzimas también oxidan una amplia gama de sustratos, tal como metano a metanol o etano a etanol, y, por lo tanto, son relevantes para el propósito de esta invención.

Como se usa en el presente documento, el término “enzima etano monooxigenasa” se pretende que signifique la clase de enzimas y complejos enzimáticos capaces de oxidar un enlace carbono-hidrógeno de la molécula de etano para dar como resultado una molécula de etanol. Cualquier enzima o complejo enzimático de estas categorías, cualquier enzima o complejo mutado, o cualquier enzima o complejo enzimático diseñado por el investigador que convierta etano en etanol se consideraría una enzima etano monooxigenasa. Se sabe que muchas de estas enzimas también oxidan una amplia gama de sustratos, tal como metano a metanol o etano a etanol o propano a propanol, y, por lo tanto, son relevantes para el propósito de esta invención.

Como se usa en el presente documento, el término “monooxigenasa híbrida” o “SDIMO híbrida” se pretende que signifique un complejo enzimático compuesto por subunidades de al menos dos fuentes diferentes. Mientras que un complejo enzimático típico puede proceder de un solo microorganismo, puede ser posible intercambiar en una subunidad particular de un microorganismo diferente y mantener la actividad catalítica. Los microorganismos fuente pueden ser organismos estrechamente relacionados, o no. Si las subunidades son algo homólogas entre sí, pueden ser intercambiables en cierto grado. Esto puede conducir a descubrimientos útiles o propiedades enzimáticas. Por ejemplo, el mmoX de un complejo enzimático sMMO podría reemplazarse por mmoX de otra enzima sMMO homóloga.

Como se usa en el presente documento, el término “deshidrogenasa” se pretende que signifique una enzima que pertenece al grupo de oxidorreductasas que oxida un sustrato mediante una reacción de reducción que retira uno o más átomos de hidrógeno de un sustrato a un aceptor de electrones. Las acetaldehído deshidrogenasas son enzimas deshidrogenasa que catalizan la conversión de acetaldehído en ácido acético. Las alcohol deshidrogenasas son un grupo de enzimas deshidrogenasa que se producen en muchos organismos y facilitan la interconversión entre alcoholes y aldehídos o cetonas con la reducción del dinucleótido de nicotinamida adenina. Como es relevante en el presente documento, la alcohol deshidrogenasa oxida metanol a formaldehído y/o etanol a acetaldehído. Algunas enzimas, tales como adhE de E. coli, pueden catalizar las reacciones tanto de alcohol deshidrogenasa como de acetaldehído deshidrogenasa.

Como se usa en el presente documento, el término “ruta” se pretende que signifique un conjunto de enzimas que catalizan la conversión del/de los sustrato(s) químico(s) en producto(s) químico(s) usando una o más etapas enzimáticas. La glucólisis es un ejemplo de una ruta en muchas células vivas. En el contexto de esta invención, una ruta puede ser una ruta sintética (compuesta por enzimas exógenas) o una ruta parcialmente sintética (compuesta por enzimas tanto exógenas como endógenas).

Como se usa en el presente documento, el término “porcentaje de identidad”, ya que se refiere a un complejo proteico de múltiples subunidades, se pretende que signifique el valor máximo para el porcentaje de identidad entre cualquier combinación por pares de secuencias de aminoácidos, calculado entre todas las subunidades en un complejo medido frente a todas las subunidades en el segundo complejo. El porcentaje de identidad entre dos subunidades puede calcularse utilizando herramientas computacionales disponibles públicamente, tales como BLASTp de NCBI.

Los términos “polinucleótido”, “oligonucleótido”, “secuencia de nucleótidos”, y “secuencia de ácido nucleico” se pretende que signifique uno o más polímeros de ácidos nucleicos e incluyen, pero no se limitan a, regiones codificantes, que se transcriben o traducen en un polipéptido o chaperona, secuencias reguladoras o de control apropiadas, secuencias de control, por ejemplo, codones de inicio y terminación de traducción, secuencias promotoras, sitios de unión a ribosomas, señales de poliadenilación, sitios de unión de factor de transcripción, secuencias de terminación, dominios reguladores y potenciadores, entre otros. Un polinucleótido, como se usa en el presente documento, no necesita incluir todas sus regiones codificantes relevantes o incluso completas en un solo polímero y la invención proporcionada en el presente documento contempla tener una región codificante completa o parcial en diferentes polímeros.

Como se usa en el presente documento, el término “nucleótido complementario” se refiere a un nucleótido en el que, cuando las condiciones permiten la fusión o la hibridación de cadenas de ácido nucleico con un polinucleótido de interés, se fusiona o se hibrida con el polinucleótido de interés.

Como se usa en el presente documento, el término “homólogo” u “homólogos” se usa para describir una secuencia de nucleótidos o proteínas o parte de una secuencia de nucleótidos o proteínas que tiene una alta similitud o identidad con respecto a una secuencia de proteínas de nucleótidos respectiva dada a conocer en el presente documento. La homología a menudo se manifiesta por una similitud significativa en la secuencia de nucleótidos o aminoácidos y casi siempre se manifiesta en la estructura tridimensional. Diferentes organismos pueden tener proteínas que son homólogas y determinadas posiciones en las proteínas respectivas pueden tener una posición equivalente en proteínas homólogas. La homología y equivalencia y los residuos conservados entre diferentes organismos pueden identificarse mediante el uso de programas informáticos tales como BLAST, ClustalW o ClustalX, entre otros. Si se da a conocer un residuo específico en una secuencia de aminoácidos en el presente documento, la invención también se pretende que abarque residuos en proteínas homólogas en diferentes especies donde se determina que las proteínas son equivalentes en esa posición en esas especies diferentes.

Como se usa en el presente documento, el término “promotor” se pretende que signifique un fragmento de ADN que inicia el proceso de transcripción de cuando está funcionalmente unido u operativamente unido a uno o más gen(es), región/regiones codificante(s), o marco(s) de lectura abierto(s). En algunos casos, un promotor está funcionalmente unido a exactamente un gen, mientras que en otros casos un promotor puede estar funcionalmente unido a más de un gen.

Como se usa en el presente documento, “funcionalmente unido” u “operativamente unido” se referirá a una relación entre al menos dos fragmentos de ácido nucleico cuando se colocan en una disposición funcional entre sí. Por ejemplo, un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia o un sitio de unión al ribosoma está unido operativamente a una secuencia codificante si está posicionada para facilitar la traducción. Generalmente, “funcionalmente unido” u “operativamente unido” significa que las secuencias de ADN que están unidas son contiguas o están en una relación de disposición que hace que una u otra sea funcional. Las secuencias, sin embargo, no tienen que ser contiguas para estar operativamente unidas o funcionalmente unidas.

Como se usa en el presente documento, los términos “chaperona de plegamiento de proteínas” y “chaperona de plegamiento” y “chaperona” se pretende que signifiquen una o más proteínas que mejoran el plegamiento de cadenas de polipéptidos (aminoácidos) para dar estructuras tridimensionales. Las chaperonas de plegamiento de proteínas ayudan a sus sustratos, concretamente otras proteínas, a pasar a estar adecuadamente plegadas y a menudo más altamente solubles. Dado que la mayoría de las proteínas deben plegarse en una forma particular para ser funcionales, la expresión de chaperonas de plegamiento de proteínas puede ayudar en el ensamblaje adecuado de determinadas enzimas en una célula y, por lo tanto, puede dar como resultado un aumento en la actividad enzimática de las proteínas de sustrato.

Como se usa en el presente documento, el término “subunidad” significará una molécula de proteína que se ensambla o ensambla de manera conjunta con otras moléculas de proteína para formar un complejo proteico, o enzima. En el caso de la presente divulgación, por ejemplo, sin limitación, una enzima monooxigenasa puede estar compuesta por una o más de las siguientes subunidades: mmoB, mmoC, mmoD, mmoX, mmoY y/o mmoZ. La divulgación se pretende que incluya algunas o todas las subunidades de cualquier microorganismo o combinación de microorganismos, según lo determine un experto en la técnica.

Como se usa en el presente documento, el término “condiciones adecuadas” se pretende que signifique cualquier conjunto de parámetros de cultivo que proporcionen al microorganismo un entorno que permita que el cultivo consuma los nutrientes disponibles. Al hacerlo, el cultivo microbiológico puede crecer y/o producir productos químicos o subproductos. Los parámetros de cultivo pueden incluir, pero no se limitan a, tales características como la temperatura de los medios de cultivo, la concentración de oxígeno disuelto, la concentración de dióxido de carbono disuelto, la velocidad de agitación de los medios líquidos, la presión en el recipiente, etc.

Como se usa en el presente documento, el término “período de tiempo suficiente” se pretende que signifique al menos una cantidad mínima de tiempo requerida para permitir que microorganismos en el cultivo produzcan un producto químico de interés. Más allá del mínimo, un “período de tiempo suficiente” abarca cualquier cantidad de tiempo que permita que el cultivo produzca el producto químico a un nivel deseado. Un cultivo a escala industrial puede requerir tan solo 5 minutos para comenzar la producción de cantidades detectables de un producto químico y algunos cultivos pueden ser productivos durante varios meses.

Como se usa en el presente documento, el término “sintético” se pretende que signifique una molécula o microorganismo, por ejemplo, sin limitación, que se ha manipulado en una forma que normalmente no se encuentra en la naturaleza. Por ejemplo, un microorganismo sintético incluirá, sin limitación, un microorganismo que se ha manipulado para sobreexpresar un polipéptido o transformado para incluir y/o expresar un polinucleótido sintético de interés. Un polinucleótido sintético significará un polinucleótido que se ha manipulado, por ejemplo, moviendo segmentos, introduciendo o reorganizando segmentos o introduciendo una mutación. Un polipéptido sintético significará una secuencia de aminoácidos que se ha manipulado.

Como se usa en el presente documento, el término “transportador” se pretende que signifique un componente de la célula que regula el paso de un producto químico, molécula pequeña, o proteína a través de una membrana biológica.

Como se usa en el presente documento, “variante” significará una secuencia de aminoácidos o una secuencia de nucleótidos que se ha modificado en el que la secuencia de polipéptidos y/o nucleótidos modificada resultante todavía tiene sustancialmente la misma función, realiza su función sustancialmente de la misma manera y/o logra el mismo resultado. Variantes de los polipéptidos dados a conocer en el presente documento significarán, por ejemplo, sin limitación, una o más diferencias o variaciones entre los polipéptidos dados a conocer en el presente documento y el polipéptido de interés.

Las enzimas son catalizadores útiles para realizar reacciones químicas.

La química es fundamentalmente acerca de la reorganización de manera eficiente de átomos de una molécula en otra. Las enzimas biológicas que pueden realizar reacciones químicas son herramientas útiles para una variedad de aplicaciones, tal como la producción fermentativa de productos químicos, fabricación farmacéutica, y biorremediación ambiental de moléculas tóxicas. Algunas enzimas son capaces de catalizar reacciones que son difíciles (o costosas, o de consumo intensivo de energía, o peligroso, o usar catalizadores no favorables para el medio ambiente, etc.) para la química a granel tradicional. Un método de catálisis de bajo impacto, bajo coste y baja energía es un avance significativo.

Los enlaces carbono-hidrógeno son altamente estables.

El enlace entre un átomo de carbono y un átomo de hidrógeno en un compuesto orgánico es uno de los enlaces más estables y difíciles de romper. El enlace es no polar y tiene una energía de disociación de enlace alrededor de 100 kcal/mol, dependiendo de los otros átomos y enlaces en su entorno inmediato.

Los métodos químicos para oxidar enlaces carbono-hidrógeno hacen uso intensivo de y derrochan energía.

Con el fin de combinar compuestos orgánicos entre sí, los químicos han buscado durante mucho tiempo una técnica eficiente para activar el enlace carbono-hidrógeno para una gama de sustratos, desde alcanos simples tales como metano, etano y propano, hasta a través de compuestos aromáticos, como naftaleno. Algunos de estos tipos de reacciones pueden hacerse usando química de haluros, pero esos métodos hacen uso intensivo de y derrochan energía, y son inespecíficos. Otras reacciones químicas en hidrocarburostales como Fischer-Tropsch, también hacen uso muy intensivo de energía y deben funcionar a altas temperaturas.

La naturaleza ha desarrollado complejos enzimáticos de monooxigenasa para oxidar compuestos orgánicos.

Los hidrocarburos son ricos en energía y los microorganismos han evolucionado rutas para consumirlos como fuentes de átomos de carbono y energía. Las bacterias que pueden consumir metano como única fuente de carbono se denominan metanotrofos. Una gran cantidad de investigación científica se ha centrado en estas bacterias y las rutas que usan para asimilar el metano. Los complejos enzimáticos que activan el metano pertenecen a una de dos clases: metano monooxigenasa (pMMO) particulada (unida a membrana) o metano monooxigenasa soluble (sMMO). Ambas enzimas oxidan metano a metanol. En el curso del estudio de estas enzimas complicadas, los investigadores descubrieron que pMMO era capaz de oxidar algunos otros hidrocarburos cortos (tales como etano, propano, butano, etileno, propileno, etc.) mientras que sMMO era capaz de oxidar una amplia gama de hidrocarburos. (Vazquez-Dualt y Quintero-Ramirez, Petroleum Biotechnology, 2004).

Se han descubierto algunos microorganismos que no pueden consumir metano, pero en su lugar pueden asimilar otros hidrocarburos, tales como etano, propano, butano, y así sucesivamente. Aunque hay algunas variaciones, las enzimas activas frente a alcanos cortos aparecen frecuentemente relacionadas evolutivamente con la sMMO. Por lo tanto, algunos investigadores los han clasificado por su estructura como dihierro monooxigenasas solubles (SDIMO). Su estructura se caracteriza por una unidad de hidroxilasa (a menudo compuesta de 2 o 3 subunidades de polipéptidos), una reductasa, y a veces una ferredoxina y una proteína auxiliar.

La expresión heteróloga funcional de enzimas monooxigenasas en hospedadores industriales es una herramienta importante para la biotecnología.

Las SDIMO son una clase de enzimas importante para la biotecnología porque catalizan una reacción química difícil: la oxidación de un enlace carbono-hidrógeno o de un doble enlace carbono-carbono. La mayoría de los procesos biotecnológicos industrialmente útiles se llevan a cabo en organismos modelo genéticamente tratables, tales como Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, y otros. Ninguno de estos organismos tiene enzimas para oxidar alcanos cortos o muchos otros hidrocarburos. La expresión heteróloga funcional de una SDIMO en estos organismos permitiría una variedad de aplicaciones. En particular, la amplia gama de aceptación de sustratos de SDIMO proporcionará nuevas conexiones para la ingeniería metabólica de estos organismos valiosos. Por ejemplo, la sMMO de bacterias metanotróficas, hasta ahora, ha demostrado que acepta al menos 50 sustratos únicos, que se resumen en la tabla 1. Dada la amplia gama de sustratos que se ha encontrado que se hidroxilan por esta enzima, es probable que la lista esté incompleta. A medida que se sometan a prueba sustratos adicionales, esta lista probablemente crecerá y, como tal, la tabla 1 no se pretende que sea limitante, pero en lugar de ello, sea a modo de ejemplo de los muchos sustratos de esta clase de enzimas.

Tabla 1. Lista de sustratos y productos que se han identificado positivamente como que se catalizan por sMMO (Vazquez-Duhalt y Quintero-Ramirez, Petroleum Biotechnology, 2004; Green y Dalton, Substrate Specificity of Soluble Methane Monooxygenase, J.Biol.Chem., Vol. 264 No.30, págs. 17698-17703,1989; Base de datos en línea BRENDA http: //www.brenda-enzymes.org/enzyme.php?ecno=1.14.13.25):

-2-ol;

Las monooxigenasas permitirán que la biotecnología industrial use materias primas menos costosas para la fabricación de muchos productos químicos disponibles comercialmente.

Una aplicación particularmente valiosa de la expresión de SDIMO en biotecnología industrial es la utilización de materias primas de bajo coste para la producción de productos básicos y productos químicos especiales. Los recientes avances en las tecnologías para la extracción de gas natural han inundado el mercado con alcanos gaseosos cortos de bajo coste. Estos gases (metano, etano, etc.) podrían usarse como materia prima para una amplia gama de productos químicos derivados de la fermentación. La expresión funcional de SDIMO en hospedadores industriales, tales como E. coli y levadura, proporciona una etapa catalítica clave que permitirá una ruta completa a partir de la materia prima económica (es decir, metano, etano, etc.) en el metabolismo central, a partir de la cual puede producirse una infinidad de productos químicos industriales a menor coste. Otra aplicación puede ser la reposición de fracciones de petróleo de bajo valor. Las SDIMO pueden realizar la difícil primera etapa de añadir un asa química útil en el hidrocarburo que puede usarse por enzimas posteriores o puede pasarse a un reactor químico o puede ser un producto en sí mismo.

Las metano monooxigenasas solubles y otras SDIMO son enzimas altamente prolíficas que pueden catalizar muchas reacciones químicas.

Una de las SDIMO mejor estudiadas es la sMMO de Methylococcus capsulatus (Bath). Los estudios de sMMO in vitro han identificado muchos aspectos clave de su estructura, mecanismo bioquímico, y especificidad del sustrato. Sorprendentemente, esta enzima es capaz de hidroxilar una gran cantidad de sustratos. Como se resume en Petroleum Biotechnology de Vasquez-Duhalt y Quintero-Romero en 2004, el sMMO es capaz de hidroxilar docenas de sustratos para dar un número aún mayor de productos, cuando se ensaya in vitro. Otras SDIMO han desarrollado diferentes especificidades de sustrato. Por ejemplo, la butano monooxigenasa de Thauera butanivorans es la más activa en butano, y mantiene cierta actividad frente a alcanos más cortos. Otro ejemplo es tolueno-4-monooxigenasa de Pseudomonas mendocina KR1. Esta enzima está relacionada evolutivamente con sMMO, pero tiene una actividad significativamente mayor frente a sustratos de hidrocarburos aromáticos.

La expresión heteróloga de enzimas monooxigenasas ha sido limitada.

Varios intentos en los últimos 25 años para expresar la sMMO completa en E. coli., principalmente con la intención de facilitar el procedimiento de purificación de la enzima, no han tenido éxito. Aunque las proteínas B y C se han purificado a partir de E. coli y se demostró que eran funcionales (West et al., Functional Expression in Escherichia coli of Proteins B and C from Soluble Methane Monooxygenase of Methylococcus capsulatus (Bath), J. General Microbiology, Vol.

138, págs. 1301-1307, 1992), las subunidades restantes han sido notoriamente difíciles de expresar (Lloyd et al., Heterologous expression of soluble monooxygenase genes in methanotrophs containing on particulate methane monooxygenase, Arch. Microbiol., Vol. 171, págs. 364-370, 1999; Smith et al., Improved system forprotein engineering of the hydroxylase component of soluble methane monooxygenase, Appl. Env. Micro., Vol. 68 No. 11, págs.5265-73, 2002; Nichol et al., Controlling the activities of the diiron centre in bacterial monooxygenases: lessons from mutagenesis andbiodiversity, Eur. J. Inorg. Chem., págs.. 3419-31, 2015). De hecho, los investigadores que desean aislar la enzima sMMO para estudios in vitro o mecanicistas han ideado métodos complicados para expresar mutantes en el hospedador nativo, para eludir específicamente la expresión problemática de la enzima funcional en un hospedador heterólogo (Ali y Murrell, Development and validation of promoter-probe vectors for the study of methane monooxygenase gene expression in Methylococcus capsulatus Bath, Microbiology, vol. 155, págs. 761-71, 2009; Smith et al., Improved system fot protein engineering of the hydroxylase component of soluble methane monooxygenase, Appl. Env. Micro., Vol. 68 No. 11, págs. 5265-73, 2002; Nichol et al., Controlling the activities of the diiron centre in bacterial monooxygenases: lessons from mutagenesis and biodiversity, Eur. J. Inorg. Chem., págs.. 3419-31,2015).

La invención descrita a continuación es la primera expresión heteróloga funcional informada de la metano monooxigenasa soluble en un microorganismo industrialmente relevante.

Los ejemplos a continuación describen la primera demostración exitosa de la sMMO expresada en microorganismos que se usan comúnmente en biotecnología industrial. La invención se refiere a la expresión de una enzima SDIMO en un microorganismo hospedador heterólogo. En una realización, el microorganismo hospedador es al menos uno de Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus methanolicus, Pseudomonas putida, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Salmonella enterica, Corynebacterium glutamicum, Klebsiella oxytoca, Anaerobiospirillum succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes, Mannheimia succiniciproducens, Rhizobium etli, Gluconobacter oxydans, Zymomonas mobilis, Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, Streptomyces coelicolor, Clostridium acetobutylicum, Pseudomonas fluorescens, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Aspergillus terreus, Aspergillus niger, y Candida utilis. En una realización, el microorganismo es Escherichia coli. En una realización, el microorganismo es Pichia pastoris. En una realización, el microorganismo es Saccharomyces cerevisiae. En una realización, el microorganismo es Corynebacterium glutamicum. En una realización, el microorganismo es Bacillus methanolicus. En otra realización, la enzima SDIMO es más de aproximadamente un 80 % homóloga (a nivel de secuencia de aminoácidos) con respecto a las SDIMO encontradas en los microorganismos Pseudomonas mendocina KR1, Methylosinus trichosporium OB3b, Methylomonas methanica, Methylococcus capsulatus (Bath), Methylocella silvestris, Methylocaldum sp.175, Methyloferula stellata, Methylocystis LW5, Solimonas aquatica (DSM 25927), Methylovulum miyakonense, Mycobacterium chubuense n BB4, Mycobacterium smegmatis mc2-155, Thauera butanivorans, Pseudonocardia TY-7, Pseudonocardia autotrophica, Amycolatopsis methanolica, Rhodococcus ruber IGEM 231, y Conexibacter woesei. En una realización, la SDIMO es una metano monooxigenasa soluble. En una realización, la SDIMO es una etano monooxigenasa, propano o butano. En una realización, la SDIMO es una metano monooxigenasa soluble expresada en un microorganismo que es al menos uno de Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Bacillus methanolicus, y Corynebacterium glutamicum. En una realización, la SDIMO no es mimABCD de Mycobacterium smegmatis mc2-155 ni la tolueno-4-monooxigenasa de Pseudomonas mendocina KR1 expresada en el microorganismo Escherichia coli. En una realización, la SDIMO es la sMMO de Methylococcus capsulatus (Bath) expresada en el microorganismo Escherichia coli. En una realización, la SDIMO se expresa en el microorganismo junto con la expresión de al menos una proteína que mejora el plegamiento o la solubilidad de las subunidades de SDIMO o el complejo SDIMO. En una realización, la SDIMO es una enzima híbrida en la que cada subunidad polipeptídica puede no derivarse de un único complejo enzimático SDIMO de un único microorganismo.

Este es un avance importante para la biotecnología, ya que abre la puerta a ingeniería metabólica adicional para la producción de productos químicos a partir de materias primas económicas de una manera respetuosa con el medio ambiente.

El etano es una materia prima ideal para la producción química.

Un microorganismo industrial que consume etano puede producir combustibles y productos químicos básicos que son imposibles de generar de manera rentable usando azúcar. El etano es una materia prima ideal para la producción de combustible y productos químicos debido a su bajo coste, alta densidad de energía, abundancia en los EE. UU., y disponibilidad todo el año. Basándose en el carbono, el etano es significativamente más barato que el azúcar. El etano es una materia prima útil en la industria química ya, y, por lo tanto, existe una infraestructura y experiencia industrial establecidas con etano como materia prima.

Ventajas de etano con respecto a metano como materia prima

El metano es una materia prima excelente, también, para fermentaciones industriales, por muchas de las mismas razones anteriores. Recientemente, su coste ha sido aproximadamente el mismo. Sin embargo, existen ventajas significativas para el etano con respecto al metano, en muchos casos. En primer lugar, el etano se asimila en el metabolismo central en acetil-CoA directamente, mientras que el metano se asimila a través de la ruta de pentosafosfato generando finalmente un producto intermedio de glucólisis (por ejemplo, DHAP) para cada 3 moléculas de metano. Por lo tanto, algunos productos que están hechos a partir de DHAP, por ejemplo, puede ser más eficiente de fabricar a partir de metano; sin embargo, muchos productos se fabrican a través del nodo acetil-CoA, y estos serían candidatos perfectos para una fermentación alimentada con etano. Esto también evita la pérdida de una molécula de CO2 entre piruvato y acetil-CoA, conservando los átomos de carbono y mejorando el perfil de emisiones de carbono de la fermentación. En segundo lugar, es más eficiente que el carbono se asimile en unidades de 2 carbonos, en lugar de unidades de 1 carbono, ya que la construcción de enlaces carbono-carbono es difícil y requiere uso intensivo de energía. En tercer lugar, más de los microorganismos estándar de la biotecnología industrial ya (sin modificación adicional) pueden consumir etanol de manera aeróbica, mientras que solo un subconjunto de organismos, tales como Pichia pastoris y el Bacillus methanolimus de menor uso, puede consumir metanol.

Ventajas del desarrollo de microorganismos etanotróficos sintéticos

Varios microorganismos han recibido la mayoría de los estudios de microbiólogos e ingenieros metabólicos en las últimas décadas. Estos organismos modelo, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Clostridium acetobutylicum, Corynebacterium glutamicum, Pichia pastoris, Bacillus subtilis, Psuedomonas putida y Chlorella protothecoides, son las células hospedadoras que proporcionan los puntos de partida genéticamente manejables, bien entendidos y más flexibles para ingeniería adicional. Se ha desarrollado una variedad de herramientas y técnicas para construir iterativamente y evaluar derivados modificados de estas cepas. La invención de cualquier nueva funcionalidad principal, tal como la capacidad de consumir etano, en cualquiera de estas cepas es un logro significativo. Un componente genético modular, o conjunto de componentes, para consumir etano puede combinarse con cepas diseñadas existentes para producir una gama de productos industriales. Varias de estas cepas son naturalmente capaces de consumir etanol como una fuente única o principal de carbono y energía, como se ha observado. Tales microorganismos ya están en uso industrial como biocatalizadores diseñados, convirtiendo los carbohidratos en una variedad de productos biológicos y químicos. La capacidad de diseñar estas cepas además para ampliar más sus opciones de materia prima para incluir etano será un producto valioso en sí mismo. Dado que el etano es una de las materias primas a base de carbono menos costosas, productores químicos, por ejemplo, sería preferible alimentar etano a sus fermentaciones.

Rutas para asimilación de etano

El etano puede utilizarse por algunos microorganismos de origen natural como la única fuente de carbono y energía. Hasta ahora, todos los microorganismos etanotróficos conocidos oxidan primero el etano a etanol. La enzima que realiza esta química pertenece a una de unas pocas clases de enzimas monooxigenasas (descritas en el presente documento). Por lo tanto, para la mayoría de los organismos (que pueden asimilar etanol), la tarea de diseñar la asimilación de etano se centra principalmente (aunque no exclusivamente) en lograr la expresión heteróloga funcional de al menos una de las enzimas monooxigenasa.

Enzimas que transforman etano

En condiciones aeróbicas, los etanotrofos fijan etano en el metabolismo central oxidando primero el etano a etanol, y luego convirtiendo etanol en acetil-CoA, a través de acetaldehído. La bioquímica de la primera etapa (etano a etanol) se lleva a cabo mediante uno de un conjunto de enzimas monooxigenasa. Algunos utilizan un complejo enzimático soluble, mientras que otros utilizan una monooxigenasa “particulada” unida a membrana (N V Coleman et al., Hydrocarbon monooxygenase in Mycobacterium: recombinant expression of a member of the ammonia monooxygenase superfamily, 6 The ISME Journal 171-182, 2012). Para metanotrofos naturales, los científicos han mostrado (J Green y H Dalton, Substrate specificity of soluble methane monooxygenase. Mechanistic implications., 264 Journal of Biological Chemistry 17698-17703, 1989) que sus enzimas metano monooxigenasa (MMO) también oxidarán etano (además de metano). Mientras tanto, algunos microorganismos no metanotróficos son capaces de crecer en etano, propano y butano, pero no metano (M C Redmond et al., Identification of novel methane-, ethane-, and propane-oxidizing bacteria at marine hydrocarbon seeps by stable isotope probing, 76 Applied and Environmental Microbiology 6412-6422, 2010). Estos dos tipos de enzimas están generalmente bastante relacionados por la evolución, a pesar de sus diferencias en la especificidad del sustrato. Se han descubierto algunas de tales bacterias de oxidación de propano u oxidación de butano, tal como Mycobacterium smegmatis mc2-155, Gordonia TY-7 y Thauera butanivorans. Otra clase más de monooxigenasas son las enzimas P450. Algunos de estos se han diseñado usando evolución dirigida para oxidar etano, aunque la especificidad del sustrato natural fue bastante diferente (F Xu et al., The Heme Monooxygenase Cytochrome P450, 4029-4032, 2005); (P Meinhold et al., Direct Conversion of Ethane to Ethanol by Engineered Cytochrome, 0017 171765-1768, 2005).

Trabajo previo de expresión de monooxigenasas en E. coli. y S. cerevisiae

No hay informes de oxidación exitosa de etano in vivo en los organismos modelo E. coli. y S. cerevisiae. Aunque algunos de los componentes de MMO se han expresado en E. coli, estos componentes no se ensamblaron en un complejo enzimático MMO funcional (C A West et al., Functional expression in Escherichia coli of proteins B and C from soluble methane monooxygenase of Methylococcus capsulatus (Bath), 138 Journal of general microbiology 1301 1307, 1992). La expresión heteróloga de monooxigenasas de alcano con mayor especificidad de cadena ha fallado en su mayoría, con algunas excepciones en las que el organismo fuente está estrechamente relacionado con el hospedador de expresión. Se informó de que una tolueno 4-monooxigenasa (T4MO) se había expresado funcionalmente en E. coli. (K Canada et al., Directed Evolution of Tolueno ortho-Monooxygenase for Enhanced 1-Napthol Synthesis and Chlorinated Ethene Degradation Directed Evolution of Toluene ortho-Monooxygenase for Enhanced 1-Napthol Synthesis and Chlorinated Ethene Degradation, 184 344-349, 2002). El tolueno es un sustrato bastante diferente del etano, pero la estructura genómica del operón T4MO sugiere la conservación evolutiva entre T4MO y sMMO, por lo que cabe destacarlo. Un segundo informe interesante de una monooxigenasa expresada en un nuevo hospedador proviene de un experimento en el que una enzima pMMO se expresó aparentemente en Rhodococcus erythropolis en 2006 y funcional a una velocidad muy lenta (Z Gou et al., Functional expression of the particulate methane monooxygenase gene in recombinant Rhodococcus erythropolis, 263 FEMS Microbiology Letters 136-141, 2006). R. erythropolis es una cepa notable con una gama muy amplia de monooxigenasas endógenas (C de Carvalho, The remarkable Rhodococcus erythropolis, 715-726, 2005). Ningún informe adicional ha confirmado esta publicación original. Se factorizó de nuevo una enzima fenol hidroxilasa y su chaperonina y se expresó con éxito en E. coli. (T Furuya et al.., Reconstitution of active mycobacterial binuclear iron monooxygenase complex in escherichia coli, 79 Applied and Environmental Microbiology 6033-6039, 2013). A pesar de todo este trabajo, ningún grupo ha informado de un microorganismo industrial estándar que se ha diseñado para consumir metano o etano o para convertir metano, etano o etanol en un producto comercial.

Muchas clases de productos químicos industriales son posibles productos comerciales

Durante las últimas décadas, varias empresas han comercializado o desarrollado con éxito microorganismos capaces de producir productos químicos industriales a partir de materias primas de azúcar. Estos proyectos se beneficiarían de los costes de materia prima reducidos, tal como poder usar etano en lugar de azúcar. Productos actualmente desarrollados incluyen, pero no se limitan a, ácido málico, ácido fumárico, ácido succínico, sal de ácido málico, sal de ácido fumárico, sal de ácido succínico, ácido L-málico, ácido D-málico, ácido maleico, ácido láctico, ácido adípico, 1,3-propanodiol, 2,3-butanodiol, 1,4-butanodiol, butadieno, derivados de ácidos grasos, alcoholes grasos, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, ésteres metílicos de ácidos grasos, ésteres etílicos de ácidos grasos, ácidos grasos ramificados, derivados de ácidos grasos ramificados, ácidos grasos omega-3, isoprenoides, farneseno, farnesano, escualeno, escualano, carotenoides, aminoácidos, alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutámico, glutamato monosódico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptófano, valina, ornitina, prolina, selenocisteína, serina, tirosina, etanol, propanol, 1 -butanol, 2-butanol, isobutanol (2-metilpropan-1-ol), alcoholes, alcanos, alquenos, olefinas, aditivos para productos alimenticios para animales, mezclas de aminoácidos, y otros.

En una realización, la monooxigenasa no es una tolueno 4-monooxigenasa cuando el microorganismo es Escherichia coli. En una realización, la metano monooxigenasa no es de Methylococcus capsulatus cuando el microorganismo es Escherichia coli. En una realización, la monooxigenasa no es una metano monooxigenasa de Methylococcus capsulatus cuando las subunidades MMOC, MMOB, MMOX, MMOY y MMOZ se expresan en Escherichia coli. En una realización, la monooxigenasa no es una metano monooxigenasa de Methylococcus capsulatus cuando las subunidades MMOC, MMOB, MMOX, MMOY y MMOZ se expresan en Escherichia coli cuando se sobreexpresan las chaperonas GroEL y GroES de Escherichia coli. En una realización, la monooxigenasa no es una metano monooxigenasa de Methylococcus capsulatus cuando las subunidades MMOC, MMOB, MMOX, MMOY y MMOZ se expresan en Escherichia coli cuando las chaperonas GroEL y GroES de Escherichia coli se sobreexpresan a partir de un plásmido. En una realización, la monooxigenasa no es una metano monooxigenasa de Methylococcus capsulatus cuando las subunidades MMOC, MMOB, MMOX, MMOY y MMOZ se expresan en Escherichia coli cuando las chaperonas GroEL y GroES de Escherichia coli se sobreexpresan a partir de un plásmido para su uso en una atmósfera anaeróbica. En una realización, la monooxigenasa no es una metano monooxigenasa a partir de Methylococcus capsulatus cuando las subunidades MMOC, MMOB, MMOX, MMOY y MMOZ se expresan en Escherichia coli cuando las chaperonas GroEL y GroES de Escherichia coli se sobreexpresan a partir de un plásmido para su uso en el rumen de vaca. En una realización, la monooxigenasa no es los genes de monooxigenasa de Methylococcus capsulatus cuando se transfiere al vector pSBA1A3.

En una realización, la monooxigenasa no es la metano monooxigenasa de Methylococcus capsulatus o Methylosinus trichosporium OB3b cuando se expresa en Methylocystis Parvus OBBP o Methylomicrobium album BG8. En una realización, la monooxigenasa no es la metano monooxigenasa soluble de Methylosinus trichosporium OB3b cuando se expresa en Methylocystis Parvus OBBP. En una realización, la monooxigenasa no es la monooxigenasa de Methylococcus capsulatus o Methylosinus trichosporium OB3b cuando se expresa en Methylomicrobium album BG8 en bajas relaciones de cobre con respecto a biomasa.

En una realización, el microorganismo sintético no es una Escherichia coli con una mutación en la posición 267 del gen adhE como se expone en SEQ ID NO: 49. En una realización, el microorganismo sintético no es Escherichia coli con una mutación de una T por una A en la posición 267 y una K por una E en la posición 568 del gen adhE como se expone en SEQ ID NO: 49.

En una realización, la monooxigenasa no es una actinomiceto monooxigenasa cuando se expresa en Escherichia coli, especialmente cuando se expresa con la proteína MimG similar a GroEL. En una realización, la monooxigenasa no es la metano monooxigenasa de Mycobacterium smegmatis o Mycobacterium goodii cuando se expresa en Escherichia coli con la proteína MimG similar a GroEL. En una realización, la monooxigenasa no es la metano monooxigenasa de Mycobacterium smegmatis o Mycobacterium goodii cuando se expresa en Escherichia coli con la proteína MimG similar a GroEL; en la que el gen mimB y/o mimD se ha o se han optimizado para la expresión en Escherichia coli.

Ejemplos

Ejemplo 1. Dihierro monooxigenasa soluble activa convierte etano en etanol

Este ejemplo describe una cepa y un método para cultivar una cepa para producir etanol a partir de una materia prima de etano.

Se han usado cepas de levadura para producir etanol en fermentaciones de azúcar durante miles de años. Como tal, existen numerosas cepas de levadura que se ha identificado que toleran altos niveles de etanol. El etanol es un producto comercialmente útil para una gama de aplicaciones que incluyen productos de limpieza y combustibles de transporte.

Las técnicas para construir una cepa de levadura que expresa una enzima heteróloga, complejo enzimático, o múltiples enzimas o complejos enzimáticos se han descrito en otra parte del presente documento. En resumen, cada gen se expresa a partir de un promotor único. El gen puede expresarse a partir de un plásmido o de un locus cromosómico. En algunos casos, proteínas adicionales pueden ayudar en el plegamiento o ensamblaje de la enzima o complejo enzimático.

La etano monooxigenasa puede seleccionarse de la tabla 16. Cualquier elemento genético adicional puede identificarse como se describe en el presente documento y expresarse de manera similar. Una cepa de levadura que expresa una etano monooxigenasa funcional es capaz de convertir etano a etanol. Mientras está en determinadas condiciones, la cepa de levadura puede consumir el etanol como fuente de carbono o energía; en otras condiciones, la cepa de levadura puede sobreproducir el etanol y secretarlo al medio de cultivo.

Esta cepa puede cultivarse en un medio mínimo que contiene glucosa (u otros azúcares o almidones), glicerol, etanol o etano como fuente de carbono y energía. Después de que la cepa haya alcanzado una densidad celular suficiente en el cultivo, el cultivo puede cambiarse a un medio mínimo que no contiene fuente de carbono y estas células pueden usarse para realizar una bioconversión de etano en etanol proporcionando etano en el espacio libre superior. Alternativamente, la cepa puede cultivarse en un biorreactor en el que el etano (y otros gases, tal como oxígeno) puede hacerse burbujear o rociarse continuamente.

Una vez que el etanol se produce en cantidad suficiente, puede separarse por lotes o continuamente por métodos tales como destilación o evaporación.

Aunque este ejemplo describe un ejemplo de producción de etanol a partir de etano en una cepa de levadura, tales como Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris, no hay mucha diferencia, en principio, con respecto al uso de otra cepa, tal como una cepa bacteriana como Escherichia coli o Bacillus subtilis, para producir etanol. En cualquier caso, un factor importante es la tolerancia al etanol de la cepa. Diversas cepas, tales como E. coli, se han diseñado o adaptado a niveles más altos de tolerancia al etanol (H Chong et al., Improving Ethanol Tolerance of Escherichia coli by Rewiring Its Global Regulator cAMP Receptor Protein (CRP), 8 PLoS ONE 1-9, 2013); (L H Luo et al., Improved ethanol tolerance in Escherichia coli by changing the cellular fatty acids composition through genetic manipulation., 31 Biotechnology letters 1867-1871, 2009), y estos procedimientos generales también pueden aplicarse a otras cepas microbiológicas.

Esta parte del ejemplo describe el trabajo realizado realmente que describe una cepa y un método para cultivar una cepa para producir etanol a partir de una materia prima de etano.

Las técnicas para construir una cepa de E. coli que expresa una enzima heteróloga, complejo enzimático, o múltiples enzimas o complejos enzimáticos se han descrito anteriormente y en otras partes. En este ejemplo, se expresó una enzima capaz de oxidar etano a etanol a partir de un promotor inducible en un plásmido en una cepa de E. coli. y se demostró que convierte etano en etanol.

La cepa NH283 se construyó mediante la eliminación de una región de ADN del genoma E. coli. que contiene los genes araBAD usando el método de Datsenko y Wanner (K. Datsenko y B. Wanner, One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR Products, Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol 97, Número 12, págs. 6640-5, 2000). Se amplificaron secuencias de homología a partir de ADN genómico de E. coli. usando los cebadores LC95/LC96 (SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4) y LC97/LC98 (SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6). El gen de resistencia a antibióticos cat se amplificó a partir de pKD3 usando LC93/LC94 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2).

Estos fragmentos se combinaron en un solo tubo y se ensamblaron usando PCR de extensión por solapamiento (“SOEing”) con los cebadores exteriores LC96/LC98. Los transformantes se aislaron en placas de agar que contenían 17 pg/ml de cloranfenicol y se confirmaron por PCR de colonias. NH283 se eligió como uno de estos clones para su uso en experimentos posteriores.

Se prepararon dos plásmidos, cada uno de los cuales contiene los genes para la sMMO de M. capsulatus (Bath). La región genómica que contiene el operón que expresa mmoX, mmoY, mmoB, mmoZ, mmoD, mmoC, proteína hipotética, mmoG, se amplificó por PCR a partir de ADN genómico de M. capsulatus (Bath). Esta región se clonó mediante Gibson (D. Gibson et al., Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases, NATURE METHODS Vol 6, Tema 5, págs.. 343-345, 2009) detrás de o bien el promotor pBAD inducible por arabinosa o bien el promotor pTRC inducible por IPTG en un plásmido con un origen p15A y también un gen para la resistencia a kanamicina. Los plásmidos se confirmaron en secuencia mediante secuenciación de Sanger para contener la secuencia de ADN esperada (enumerada en SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO:26 a continuación). Los plásmidos se transformaron por separado en la cepa NH283 (tabla 2).

Tabla 2: Cepas y plásmidos

A continuación se describe el método para cultivar las cepas y medir la bioconversión de etano en etanol. Todas las cepas se inocularon en 1 ml de LB Miller suplementado con kanamicina (50 pg/ml) y se cultivaron a 37°C durante 18 horas con agitación a 280 rpm. Los cultivos crecieron hasta la fase estacionaria y luego se usó 0,1 ml de estos cultivos para inocular dos matraces que contenían 10 ml de LB estéril kanamicina (50 pg/ml) IPTG 1 mM o arabinosa 1 mM. Los cultivos se crecieron con agitación a 37°C hasta DO600 ~ 1,2 (aproximadamente 4,0 - 4,5 horas). Las células se centrifugaron durante 5 minutos a 4000 rpm, y se suspendieron de nuevo en 10 ml de disolución tampón de fosfato (PBS). Estos 10 ml se dividieron por igual en dos frascos de suero de vidrio, 5 ml en cada uno. Los frascos se sellaron luego con tapones de caucho de butilo. Un volumen de 60 ml o bien de etano o bien de aire se midió en jeringas y se inyectó a través del tapón y en cada uno de los dos frascos. Los frascos se agitaron a 37°C durante 7 días, momento en el que se tomaron muestras del sobrenadante para medir la concentración de etanol.

El etanol se midió usando un ensayo colorimétrico (Cell Biolabs número de catálogo STA-620). En resumen, mide etanol usando una reacción enzimática que produce peróxido de hidrógeno, que reacciona con una sonda colorimétrica. Se combinaron 90 |il de una mezcla de reacción con 10 |il de muestra, y se incubaron a 37°C durante 30 minutos. La composición de la mezcla de ensayo se describe en la tabla 3. La absorbancia a 570 nm se comparó con una curva estándar, y se cuantificó el etanol en cada muestra. La figura 2 compara la conversión de etano en etanol en tres cepas de E. coli. La cepa de control (izquierda) no tenía enzima de oxidación de etano, y esta cepa no convierte etano en etanol. Las otras dos cepas tenían enzimas oxidantes de etano y convirtieron etano en etanol.

Tabla 3: Composición de la mezcla de reacción para el ensayo de etanol

Después de recopilar los datos de absorbancia sin procesar, los datos se procesaron de la siguiente manera: La absorbancia de fondo (solo medios) se restó de todas las muestras, incluyendo las muestras de calibración. Cada cepa se había sometido a prueba o bien con aire inyectado o bien con etano inyectado. La absorbancia de la muestra inyectada con aire se restó de la absorbancia de la muestra inyectada con etano. Este valor de absorbancia se comparó con la curva de calibración para determinar la cantidad de etanol. Los datos mostrados en la figura 2 demuestran la producción de etanol en condiciones en las que la cepa está expresando la enzima monooxigenasa.

Ejemplo 2. Dihierro monooxigenasa soluble activa en E. coli. convierte metano en metanol

Este ejemplo describe una cepa y un método para cultivar una cepa para producir metanol a partir de una materia prima de metano.

En este ejemplo, se mostró que la misma enzima dihierro monooxigenasa soluble capaz de oxidar etano a etanol en el ejemplo 1 anterior convierte metano en metanol. Las cepas y plásmidos, así como sus métodos de construcción, son idénticos a los del ejemplo 1. El método de análisis también es casi idéntico, con las siguientes modificaciones.

El espacio libre superior por encima del cultivo en los frascos de suero de vidrio con tapón se inyectaron con metano, en lugar de etano. Posteriormente, el análisis colorimétrico mide la concentración de metanol en la muestra tomada del frasco de suero, usando el mismo método para determinar primero una curva estándar, ajustar las muestras a su control de muestra inyectada con aire correspondiente y luego comparar esta absorbancia (la diferencia de absorbancias inyectadas con metano menos las inyectadas con aire) con esa curva estándar. El valor de fondo para la cepa de control se resta y esos valores se representan gráficamente para las cepas BZ11 y LC168 en la figura 3.

Ejemplo 3. Mejoras de cepa para aumentar la conversión de metano y etano en metanol y etanol mediante un E.coli diseñado

Este ejemplo describe una cepa mejorada y un método para cultivar una cepa para producir metanol a partir de una materia prima de metano o etanol a partir de una materia prima de etano.

Pueden construirse cepas mejoradas usando una variedad de técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Algunas de esas técnicas incluyen: cambiar el número de copias de plásmido, cambiar la fuerza del promotor, variar la concentración de inductor, variar la temperatura de cultivo, integrar genes en el cromosoma, combinar múltiples genes en un plásmido, separar genes en múltiples plásmidos.

LC160 es similar a la cepa LC168, excepto por el origen de replicación (cloDF13 en lugar de p15A) y también tiene un segundo operón, que expresa constitutivamente los genes groES y groEL de E. coli. La secuencia de ADN para el operón de groES/groEL se amplificó a partir de ADN genómico de E. coli. (tabla 2). La secuencia para el plásmido en LC160 se proporciona como SEQ ID NO:25.

Se cultivaron células y se midió metanol como se describe en el presente documento. La figura 4 ilustra la conversión de metano en metanol en E. coli. La cepa de control LC165 no tiene enzima de oxidación de metano, y esta cepa no convierte metano en metanol. La cepa LC160 (figura 4) expresó sMMO de M. capsulatus y groESL de E. coli. coli. Se midió más de 400 |iM de metanol resultante de la bioconversión de metano en metanol en LC160.

Se cultivaron células y se midió etanol como se describe en el presente documento. La figura 5 compara la conversión de etano en etanol en dos cepas de E. coli. La cepa de control LC165 (figura 5, izquierda) no tiene enzima de oxidación de etano, y esta cepa no convierte etano en etanol. La cepa LC160 (figura 5, derecha) expresó sMMO de M. capsulatus y groESL de E. coli.

Ejemplo 4. Bioconversión de naftaleno en 1-naftol en E. coli.

A continuación, se describe el método de alto rendimiento para cultivar las cepas y medir la bioconversión de naftaleno en 1-naftol por sMMO en microplacas de múltiples pocillos. El plásmido pDG5 (s Eq ID NO: 21) se construyó mediante amplificación de la sección relevante de ADN genómico de Methylococcus capsulatus (Bath) que contiene el operón MMO de genes mmoXYBZCDG y mediante clonación de este fragmento de ADN en un vector pACYC que contiene un origen de replicación p15a, un gen de resistencia a kanamicina, y un promotor pBAD. Este plásmido pDG5 es casi idéntico al plásmido pDG6 (SEQ ID NO: 22, figura 10), excepto por la presencia de mmoG (groEL-2) en el extremo 3' del operón. La cepa LC151 se construyó transformando la cepa NH283 con el plásmido pDG5 y seleccionando transformantes en placas de agar LB suplementadas con kanamicina a 50 |ig/ml. Todas las cepas se inocularon en placas de 96 pocillos de 2 ml con cada pocillo que contenía 0,4 |il de medio LB suplementado con antibióticos según sea apropiado (kanamicina a 50 |ig/ml y espectinomicina a 100 |ig/ml) y se cultivaron a 37°C durante la noche con agitación. Para la inducción de sMMO, se inocularon alícuotas de 40 |il/pocillo de cultivos de semillas durante la noche en placas de 96 pocillos nuevas conteniendo cada pocillo 400 |il de medio de cultivo LB suplementados con antibióticos y L-arabinosa 1,0 mM. Los cultivos se crecieron con agitación a 37°C durante de 4 a 5 horas. Las células se centrifugaron durante 10 minutos a 3700x g, y el medio LB gastado se retiró mediante un aspirador de 96 pocillos conectado a una bomba de vacío. Las células se suspendieron de nuevo en 1,0 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se centrifugaron de nuevo durante 10 minutos a 3700x g, el tampón de lavado de PBS se retiró de nuevo por aspiración. Los sedimentos celulares lavados se suspendieron de nuevo en 0,25 ml de tampón de ensayo PBS que contiene 0,4 % de glicerol (v/v), L-arabinosa 1 mM, y FeSO480 |iM.

La placa de ensayo de naftaleno se preparó añadiendo 10 |il/pocillo de naftaleno 0,5 M disuelto en alcohol etílico puro. Se formaron pequeños cristales de naftaleno en el fondo de cada pocillo después de que todo el alcohol se evaporase, aproximadamente 2 horas. Se transfirieron alícuotas de 200 |il/pocillo de las células suspendidas de nuevo en tampón de ensayo a la placa de naftaleno y se mezclaron con cristales de naftaleno. La placa de ensayo de naftaleno entonces se selló y se incubó a 37°C durante la noche con agitación. El sobrenadante que contenía 1-naftol se separó de los sedimentos celulares centrifugando la placa de ensayo durante 10 minutos a 3700x g, y se transfirió sobrenadante de 150 |il/pocillo a una placa de microvaloración de fondo plano transparente de 96 pocillos.

El 1-naftol se midió usando un ensayo colorimétrico. El 1-naftol en el sobrenadante de 150 |il se hizo reaccionar con 50 |il de solución recién preparada al 2 % (p/p) disolviendo Fast Blue B (o-dianisidina tetrazotizada) en agua desionizada. El complejo diazo coloreado se midió en un lector de placas a 540 nM. La concentración del complejo diazo es proporcional a la concentración del producto de 1 -naftol.

La actividad sMMO se expresó como absorbancia relativa (A540) después de restar el blanco de tampón y la absorbancia en la cepa de control de vector vacío LC165. Como se muestra en la figura 6, ambas cepas (LC151 y LC168) que expresaron el operón sMMO de M. capsulatus mostraron actividades significativamente más altas que LC165 que expresó el control de vector vacío.

Este es el primer ejemplo para la expresión exitosa de sMMOs de M.capsulatus activa en cepas de E. coli. diseñadas que pueden detectarse mediante el ensayo colorimétrico de naftaleno. El método de alto rendimiento descrito en el presente documento puede usarse para mejorar la cepa optimizando y equilibrando los sMMO y sus homólogos en E. coli. y otros hospedadores heterólogos.

Ejemplo 5. La expresión de chaperona mejora la actividad MMO: naftaleno a naftol

En un ejemplo, se mostró que el MMOG de M. capsulatus, un homólogo de chaperona groEL-2, es crítico para la actividad m Mo en cepas de E. coli que expresan un operón de MMO de M. capsulatus nativo en plásmidos individuales (pDG5 (SEQ ID NO: 21), pLC39 (SEQ ID NO: 26)). En otro ejemplo, se demostró además que un operón de groES-EL2 de M. capsulatus factorizado de nuevo en un plásmido compatible (pNH180 (SEQ ID NO: 40)) mejoró en gran medida la actividad MMO en cepas de E. coli que albergan un plásmido menos mmoG (pDG6 (SEQ ID NO: 22)).

Este ejemplo describe un método que mejora la actividad MMO en más de un orden de magnitud. Este enfoque novedoso implica la sobreexpresión tanto de groES-groEL de E. coli como de groES-EL2 de M. capsulatus en pNH180. El fragmento de groES-groEL de E. coli se amplificó por PCR a partir de ADN genómico de E. coli. BW25113, se purificó en gel, y se clonó para dar un vector frente a una secuencia de terminación. Después de la verificación de secuencia, el fragmento de terminación de groES-groEL se amplificó por PCR usando cebadores BZ111 (SEQ ID NO:70) y LC166 (SEQ ID NO:71), se purificó en gel, y se clonó detrás de groES-EL2 de M. capsulatus en pNH180 mediante un método de megacebado (Ulrich et al., Exponential Megapriming PCR (EMP) Cloning-Seamless DNA Insertion into Any Target Plasmid without Sequence Constraints, PLoS One, 7(12), e53360, 2012). Después de la digestión con DpnI para retirar el ADN plasmídico de pNH180, la mezcla de reacción se transformó en NH283 que porta el plásmido pDG6 de MMO. Los transformantes se crecieron en una placa de agar LB suplementada con kanamicina a 50 |ig/ml para la selección de pDG6 y espectinomicina a 100 |ig/ml para la selección del plásmido recombinante deseado (pBZ13 (SEQ ID NO: 15)). Se cribaron varias colonias mediante ensayo de naftaleno, dando lugar a una nueva cepa de MMO (BZ25) que porta plásmidos tanto pDG6 como pBZ13. Como se muestra en la tabla 4, la actividad MMO en BZ25 es una mejora significativa con respecto a la de DG80. El plásmido pBZ13 se separó después de pDG6, se purificó, y se verificó la secuencia. Se preparó una cepa de base (BZ26) transformando el plásmido pBZ13 en NH283. El plásmido pDG6 se introdujo luego en BZ26 para confirmar que la cepa resultante es equivalente al BZ25 original.

Tabla 4. Mejora de la actividad MMO por expresión conjunta de proteínas de chaperona de M. capsulatus y E. coli.

Ejemplo 6. La expresión de chaperona mejora la actividad MMO: metano a metanol

Este ejemplo describe la evaluación de la cepa de MMO mejorada (BZ25) para la oxidación directa de metano mediante un método de bioconversión detallado en el ejemplo 3. Ambas cepas se crecieron en caldo LB suplementado con kanamicina a 50 |ig/ml y espectinomicina a 100 |ig/ml. El método para la inducción de MMO y la bioconversión de metano en metanol se realizó como se describe en otra parte del presente documento. La valoración de metanol se midió 20 horas después de la inyección de gas metano. La actividad MMO para DG80 y BZ25 se muestra en la tabla 5.

Tabla 5. Oxidación de metano por DG80 y BZ25

Ejemplo 7. Homólogos de metano monooxigenasa en E. coli.

Los homólogos de sMMO de Methylococcus capsulatus (Bath) pueden determinarse usando bases de datos y algoritmos de búsqueda disponibles públicamente, tales como BLASTp de NCBI. Puede descubrirse una amplia gama de secuencias de esta manera y estas secuencias pueden someterse a prueba en el proceso descrito en el presente documento. Las secuencias de ADN que codifican estos homólogos pueden extraerse de aislados de ADN genómico, amplificarse por PCR a partir de lisados de las cepas relevantes, o pueden diseñarse, optimizarse mediante codones para la expresión en el organismo hospedador deseado y sintetizarse usando servicios de síntesis de ADN disponibles comercialmente.

En un ejemplo, la secuencia de ADN que codifica homólogos de sMMO de metanotrofos tales como Methylocella silvestris y Methylosinus trichosporium se sinterizó por un proveedor comercial. La secuencia se clonó para dar el mismo vector que el descrito en el presente documento, usando técnicas estándar tales como digestión de restricción y ensamblaje isotérmico (D. Gibson et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases, NATURE METHODS Vol. 6, Tema 5, págs. 343-345, 2009). El ADN ensamblado se transformó en la cepa NH283 y se verificó mediante PCR de colonias y secuenciación de Sanger.

Estas cepas pueden someterse a prueba usando el mismo proceso que se describe en el presente documento.

Se identificaron organismos que contienen homólogos de la sMMO de M. capsulatus. Las secuencias de los genes mmoXYBZDC de estos organismos se optimizaron mediante codones y se sintetizaron en un operón usando conectores sintéticos que contenían sitios de unión a ribosoma fuertes entre los genes. Los genes groESL de estos mismos organismos se optimizaron mediante codones de manera similar y se sintetizaron en un operón. Se proporcionó ADN sintético por un proveedor comercial (Gen9, Inc.). Cada operón se clonó en un plásmido diferente. Los operones de mmoXYBZDC se clonaron en la cadena principal de plásmido pDG6 (SEQ ID NO: 22), que contiene un origen pACYC, gen de resistencia a kanamicina, gen represor de araC, y un promotor pBAD que impulsa la expresión del operón. Los operones de groESL se transformaron en la cadena principal de plásmido pDG11, que contiene un origen cloDF13, gen de resistencia a espectinomicina, y el promotor sintético J23116 que impulsa la expresión del operón.

Para cada organismo, ambos plásmidos se transformaron en serie en la cepa NH283 y se seleccionaron con antibióticos apropiados. Los organismos fuente para las enzimas sMMO y groESL se enumeran en la tabla 6, junto con nombres de cepas y plásmidos.

Plásmidos pNH157 (SEQ ID NO: 31), pNH160 (SEQ ID NO: 33), y pDG6 (SEQ ID NO: 22) contienen cada uno 6 genes (mmoX, mmoY, mmoZ, mmoB, mmoC, mmoD) que codifican un complejo enzimático de sMMO de un organismo diferente. Plásmidos pNH185 (SEQ ID NO: 42), pNH188 (SEQ ID NO: 44), y pNH180 (SEQ ID NO: 40) contienen cada uno 2 genes (groES, groEL) que codifican un complejo enzimático groESL de un organismo diferente.

A continuación se describe el método para cultivar las cepas y medir la bioconversión de metano en metanol o de etano en etanol. Todas las cepas se inocularon en 1 ml de LB Miller suplementado con kanamicina (50 pg/ml) y espectinomicina (100 pg/ml) y se crecieron a 37°C durante 18 horas con agitación. Los cultivos se crecieron hasta la fase estacionaria y 0,2 ml de estos cultivos se usaron luego para inocular matraces que contenían 20 ml de LB Miller estéril, kanamicina (50 pg/ml), espectinomicina (100 pg/ml), arabinosa 1 mM, y FeSO480 pM. Los cultivos se crecieron con agitación a 37°C durante 5 horas. Las células se centrifugaron durante 10 minutos a 4000 rpm, y se lavaron en un volumen igual de solución de tampón de fosfato pH 7,5 (PBS). Las células se centrifugaron nuevamente y se suspendieron de nuevo en un volumen igual de PBS que contenía arabinosa 1 mM, FeSO480 pM, y glicerol al 0,4 %. Se transfirieron tres alícuotas de 5 ml cada una a frascos de suero de vidrio idénticos. Los frascos se sellaron luego con tapones de caucho de butilo. Un volumen de 60 ml o bien de metano, o bien de etano, o bien de aire se midió en una jeringa y se inyectó a través del tapón y en cada uno de los frascos. Los frascos se agitaron a 37°C durante 43 horas, punto en el que se centrifugó la suspensión celular y se tomaron muestras del sobrenadante para medir las concentraciones de metanol y etanol.

Los alcoholes se midieron usando un ensayo colorimétrico descrito en otra parte del presente documento (Cell Biolabs STA-620).

La tabla 6 muestra las mediciones de alcohol. Estos datos demuestran que las cepas DG68, DG72 y DG80 que contienen diversos genes sMMO/groESL tienen todos actividad para oxidar metano a metanol, y también actividad para oxidar etano a etanol. El porcentaje de homologías entre enzimas se tabula en la tabla 8.

Tabla 6. Actividad de oxidación de metano y etano de cepas que contienen diversos homólogos de sMMO y sus enzimas groESL afines.

Ejemplo 8. Los homólogos enzimáticos de MMO son activos cuando se expresan de manera conjunta con una chaperona heteróloga.

Se identificaron organismos que contienen homólogos de la sMMO de M. capsulatus. Se identificaron los genes mmoXYBZDC y groESL, se optimizaron mediante codones, se sintetizaron, se clonaron en vectores, y se transformaron en la cepa NH283 como se describe en otra parte del presente documento.

Los organismos fuente para las enzimas sMMO y groESL se enumeran en la tabla 7, junto con nombres de cepas y plásmidos. El porcentaje de homologías entre homólogos se tabula en la tabla 8. Plásmidos pNH157 (SEQ ID NO: 31), pNH158 (SEQ ID NO: 32), pNH160 (SEQ ID NO: 33) y pDG6 (SEQ ID NO: 22) contienen cada uno 6 genes (mmoX, mmoY, mmoZ, mmoB, mmoC, mmoD) que codifican un complejo enzimático sMMO de un organismo diferente. Plásmidos pNH185 (SEQ ID NO: 42), pNH188 (SEQ ID NO: 44) y pNH180 (SEQ ID NO: 40) contienen cada uno 2 genes (groES, groEL) que codifican un complejo enzimático groESL de un organismo diferente.

El método para cultivar las cepas y medir la bioconversión de metano en metanol o etano en etanol se realizó como se describe en el presente documento. La medición de concentraciones de alcohol, incluyendo el uso de controles de aire y técnica para el procesamiento de datos, se realizó como anteriormente.

La tabla 7 muestra las mediciones de alcohol. Estos datos demuestran que las cepas DG68, DG69, DG71, DG72, DG73 y DG80 que contienen diversas combinaciones de genes sMMO y groESL tienen todos actividad para oxidar metano a metanol, y también actividad para oxidar etano a etanol.

Tabla 7. Actividad de oxidación de metano y etano de cepas que contienen diversas enzimas sMMO expresadas de manera conjunta con la chaperona groES/groEL de M. capsulatus (Bath).

Tabla 8. Porcentaje de identidad entre enzimas sMMO de diferentes organismos. Valores calculados usando Clustal Omega para enzimas sMMO usando secuencias de mmoX, usando la definición de porcentaje de identidad para enzimas de múltiples genes, así como groEL y groES.

Las secuencias de aminoácidos para estas enzimas se compararon entre sí usando el software en línea Clustal Omega y los resultados se muestran a continuación en la tabla 8. Las enzimas funcionales demostradas en la tabla 7 muestran una baja rigurosidad de identidad de secuencia entre los homólogos de mmoXYZCBD, o entre los componentes de groESL.

El alcance de la invención se pretende que abarque variantes de los nucleótidos sintéticos y/o secuencias de aminoácidos dadas a conocer en el presente documento. Como se describe en la bibliografía científica, en bases de datos, en la presente divulgación o como se conoce por el experto en la técnica en la fecha de presentación de la solicitud, determinadas posiciones de una secuencia polipeptídica son normalmente residuos conservados, que pueden determinarse según propiedades polares, electrofísicas, hidrófobas y espaciales del polipéptido. Un experto en la técnica podría modificar las secuencias de aminoácidos de la presente divulgación, mantener residuos conservados y/o aplicar sustituciones conservativas en esos residuos conservados y determinar si esas variantes aún mantienen la funcionalidad. La figura 18 muestra un alineamiento de múltiples secuencias de la subunidad alfa de la enzima monooxigenasa hidroxilasa de tres microorganismos diferentes y es ilustrativa del grado en que las secuencias de aminoácidos de monooxigenasa pueden variarse y mantener la función observada. Cualquier mutación en una secuencia que confiera propiedades enzimáticas mejoradas (por ejemplo, actividad y/o especificidad) puede sustituirse en otra secuencia homóloga usando un alineamiento de secuencias de este tipo, usando software disponible públicamente tal como BLASTp, por ejemplo, para identificar la posición equivalente en el homólogo. Está claro para un experto en la técnica cómo identificaría y construiría la mutación equivalente en la secuencia homóloga.

Las características de las enzimas dihierro monooxigenasa solubles se han estudiado en el mundo académico durante años para comprender su estructura, función y mecanismo. Un artículo de Coufal et al. del 2000 (Coufal et al., Sequencing and analysis of the Methylococcus capsulatus (Bath) soluble methane monooxygenase genes, Eur. J. Biochem., vol. 267., págs.. 2174-2185, 2000) describió residuos conservados de las subunidades de MMO.

En la subunidad MMOX de la enzima MMOH, el patrón de secuencia de residuo de ligando de hierro E...EX2H se ha indicado como un sello distintivo de proteínas que contienen centros de dihierro no hemo con puentes de carboxilato y es la única secuencia conservada a través de las familias de estearoil-ACP desaturasa, sMMO y R2. Como tal, a menudo hay residuos conservados en las siguientes posiciones de la SEQ ID NO:10: E114, E144, H147, E209, E243 y H246. Además, la mitad inferior del sitio activo tiene un conjunto de residuos implicados en enlaces de hidrógeno entre las hélices C y F (D143, R146, S238, D242 y R245) y están absolutamente conservados entre proteínas. Estos residuos podrían formar parte de un armazón para mantener el centro de hierro en su lugar o posiblemente para administrar protones al sitio activo. Se conservan dos residuos por razones estéricas; tanto A117 como G250 están ubicados en posiciones donde el empaquetamiento es muy compacto. Finalmente, hay una tríada de residuos accesibles en superficie, que comprende A224, G228 y D229, ubicada en el giro entre las hélices E y F.

Residuos conservados en otras partes de la subunidad ase muestran en la figura 6 de Coufal. W371 es disolvente expuesto en un borde del anillo de indol. Dos residuos de Tyr están enterrados en el interior de la proteína. Además, un residuo de prolina, P377, está completamente conservado y puede ser importante estructuralmente. Un modelo para la interacción de unión hidroxilasa-reductasa coloca el sitio de unión a reductasa en esta región, lo que sugiere que todo este grupo de residuos puede servir como un sitio de acoplamiento para otra proteína o como parte de una ruta de transferencia de electrones. Además, T213, N214 pueden ayudar en la transferencia de protones. Otro conjunto de residuos conservados comprende P424, G443, P461 e Y464 y está ubicado en el segundo dominio de la subunidad a de hidroxilasa. Estos aminoácidos se posicionan ligeramente por debajo de la superficie de la proteína cerca de la interfaz de subunidad y.

Finalmente, a menudo se conserva un conjunto de residuos encontrados en la superficie de la proteína en el área del “cañón” en el sitio activo. Estos residuos son Y67, K74, L321, G325 y P329, que se indican en amarillo en la figura 6 de Coufal. Se ha planteado la hipótesis de que el cañón puede ser un sitio de acoplamiento para la proteína B o posiblemente la reductasa. Por lo tanto, estos residuos conservados pueden ser importantes para mediar las interacciones entre dos proteínas. En particular, K74 e Y67 están muy cerca de la superficie y están ubicados en el cañón. Combinados con el “asa” de hélice E/F 'descrita anteriormente, estos residuos podrían ser puntos de interacción clave entre la proteína de acoplamiento B y la hidroxilasa MMOH.

Adicionalmente, en la subunidad p de mmoY (SEQ ID NO:12), la interfaz entre las subunidades a y p que comprende D100, P101 y D185 se conserva como se ve en la figura 7 de Coufal. Estos residuos pueden estar implicados en interacciones entre subunidades, aunque no hay enlaces de hidrógeno conservados o socios de puentes salinos en la subunidad a. Un segundo grupo de residuos, W218, R228 y A331, puede encontrarse debajo de la superficie de la subunidad p y un tercer conjunto de aminoácidos que contienen principalmente residuos polares (D240, E243, Q313 y W320) está muy cerca de la superficie de la proteína. Además, se han identificado 24 residuos altamente conservados en el alineamiento de los análogos de subunidades p como se ve en la figura 4A de Coufal. De manera más notable, dos aminoácidos cargados, K44 y E48, se conservan en el cañón de hidroxilasa, donde podrían participar en interacciones de proteína-proteína. Los ocho residuos aromáticos conservados pueden formar parte de una ruta de transferencia de electrones desde un supuesto sitio de unión de reductasa en la subunidad p al sitio activo de dihierro. Cabe señalar que ningún residuo cerca de la interfaz p-p está altamente conservado en este grupo de enzimas. La proteína B (SEQ ID NO:8) también tiene ciertos residuos conservados. El alineamiento de secuencias de las proteínas de acoplamiento (véase Coufal, figura 4B) reveló cinco residuos completamente conservados (V38, E53, I79, G97 y G114), ocho residuos altamente conservados (I52, V70, I85, E94, R98, Vl07, D108 y S111) y ocho residuos moderadamente conservados (V41, I55, V68, G83, V87, I92, L96 y F100). La superficie de la proteína B es en gran medida hidrófoba, haciéndola muy adecuada para la unión del cañón hidrófobo en la hidroxilasa. El modelo de acoplamiento de MMOH-proteína B derivado de estudios de unión de RMN es consistente con la sugerencia de que las interacciones hidrófobas dominan la unión de hidroxilasa-proteína B y con estudios de reticulación del sistema de sMMO de M. tricosporium OB3b, en el que se demostró que la proteína B se une a la subunidad a de la hidroxilasa. El hallazgo de que muchos de estos residuos conservados, incluyendo L96, G97, F100, V107, D108 y G114, se ven afectados por la unión de hidroxilasa, sugiere que el modo de unión a proteínas de acoplamiento de hidroxilasa es similar para todos los sistemas enzimáticos examinados. Por lo tanto, usando alineamientos de homologías de secuencia para identificar sitios de unión proteína-proteína parece ser válido para este grupo de proteínas. Residuos complementarios en la hidroxilasa presumiblemente ubicados en la región de cañón, es probable que también se conserven. La proteína C (SEQ ID NO:59) también tiene residuos conservados. La sMMO reductasa es un miembro de la familia f Nr de oxidorreductasas que contienen sitios cofactores [Fe-2S] y FAD bien caracterizados y bolsillos de unión a NADH. Los residuos conservados en los componentes de reductasa se han comentado previamente.

Si un residuo no está conservado, puede retirarse, modificarse y/o reemplazarse por otro aminoácido cuya incorporación no afecta sustancialmente al funcionamiento de la proteína dada a conocer. Por lo tanto, los péptidos originales dados a conocer en el presente documento pueden modificarse mediante la sustitución de uno o más residuos en diferentes, posiblemente selectivos, sitios dentro del péptido. Tales sustituciones pueden ser una sustitución conservativa, tal como el reemplazo de un residuo hidrófobo por otro residuo hidrófobo, o puede ser sustituciones menos conservativas en el caso en el que un residuo particular no sea un residuo conservado. Algunas sustituciones se toleran mejor que otras en función de la ubicación del residuo. Sin embargo, sustituciones no conservativas o incluso radicales pueden incluso tolerarse basándose en la ubicación del residuo, como puede demostrar un experto en la técnica.

También se pretende que las sustituciones abarquen aquellas que no sean los L-aminoácidos comunes, tales como D-aminoácidos u otros aminoácidos con grupos R no estándar. Cada una de estas sustituciones está destinada a estar dentro de la divulgación de la solicitud.

Ejemplo 9. Varias chaperonas heterólogas mejoran la conversión de metano en metanol por sMMO

Este ejemplo describe la capacidad de la sMMO de M. capsulatus (Bath) para tener una actividad mejorada frente al metano como sustrato con la expresión conjunta de un panel de chaperonas groES/groEL.

La cepa NH283, descrita en otra parte del presente documento, se transformó con dos plásmidos simultáneamente: pDG6 (SEQ ID NO:22, que contiene las regiones codificantes correspondientes a los genes mmoX, mmoY, mmoZ, mmoC, mmoB y mmoD de M. capsulatus (Bath)) y un plásmido seleccionado del conjunto de plásmidos que contienen pNH178 (SEQ ID NO:39), pNH180 (SEQ ID NO:40), pNH181 (SEQ ID NO:41), pNH185 (SEQ ID NO:42), pNH187 (SEQ ID No :43) y pCDF1b (SEQ ID NO:20) (que contienen genes groES/groEL optimizados mediante codones de los microorganismos T. butanivorans, M. capsulatus, M. trichosporíum, Methylocaldum sp.175, Methylocystis sp. LW5, respectivamente y un vector de control pCDF1b). Estos transformantes se seleccionaron en placas de agar LB suplementadas con kanamicina (50 pg/ml) y espectinomicina (100 pg/ml).

Se seleccionó una colonia de cada una de estas transformaciones para el crecimiento en 2 ml de medio LB líquido suplementado con antibióticos, como anteriormente y se incubaron a 37°C, agitando a 280 rpm. Después de 16 horas, se añadió 1 ml del cultivo a 10 ml de LB suplementado con kanamicina (50 pg/ml) y espectinomicina (100 pg/ml) y arabinosa (1 mM) y FeSO4 (80 pM) para inducir la expresión de la monooxigenasa. Cada cultivo de 10 ml se incubó a 37°C, agitando a 280 rpm. Después de 4 horas, cada cultivo se centrifugó y se suspendió de nuevo en 10 ml de PBS para lavar las células. Cada uno de ellos se centrifugó nuevamente y se suspendió de nuevo en 10 ml de PBS suplementado con arabinosa (1 mM), FeSO4 (80 pM) y glicerol (0,4 % de concentración final). Este volumen de 10 ml se dividió por igual entre dos frascos de suero y se selló con tapones de caucho de butilo. Se inyectó un volumen de 60 ml de aire a través del tapón de un frasco de suero, mientras que se inyectaron 60 ml de metano a través del tapón del otro frasco de suero. Todos los frascos de suero se colocaron a 37°C, agitando a 280 rpm. Después de 44 horas, los frascos se abrieron y se tomaron muestras para detectar la presencia de metanol, usando la técnica descrita en el presente documento. En comparación con una curva estándar, las cepas produjeron la siguiente concentración de metanol como se muestra en la tabla a continuación.

Tabla 9: La sMMO de M. capsulatus es funcional en E. coli. cuando se expresa de manera conjunta con muchos homólogos de chaperona groES/groEL

Ejemplo 10. Varias chaperonas heterólogas mejoran la conversión de etano en etanol por sMMO

Este ejemplo describe la capacidad del sMMO de Solimonas aquatica de tener una actividad mejorada frente al etano como sustrato con la expresión conjunta de un panel de chaperonas groES/groEL.

La cepa NH283, descrita en otra parte del presente documento, se transformó con dos plásmidos simultáneamente: pNH160 (SEQ ID NO: 33,que contiene las regiones codificantes correspondientes a los genes mmoX, mmoY, mmoZ, mmoB, mmoC y mmoD de S. aquatica) y un plásmido seleccionado del conjunto de plásmidos que contienen pNH188 (SEQ ID NO:44), pNH180 (SEQ ID NO:40), pNH185 (SEQ ID NO:42), pNH187 (SEQ ID NO:43) y pCDF1b (SEQ ID NO:20) (que contienen genes groES/groEL optimizados mediante codones de los microorganismos S. aquatica, M. capsulatus, Methylocaldum sp.175, Methylocystis sp. LW5, respectivamente y un vector de control pCDF1b). Estos transformantes se seleccionaron en placas de agar LB suplementadas con kanamicina (50 pg/ml) y espectinomicina (100 pg/ml).

Se seleccionó una colonia de cada una de estas transformaciones para el crecimiento en 2 ml de medio LB líquido suplementado con antibióticos, como anteriormente y se incubaron a 37°C, agitando a 280 rpm. Después de 16 horas, se añadió 1 ml del cultivo a 10 ml de LB suplementado con kanamicina (50 pg/ml) y espectinomicina (100 pg/ml) y arabinosa (1 mM) y FeSO4 (80 pM) para inducir la expresión de la monooxigenasa. Cada cultivo de 10 ml se incubó a 37°C, agitando a 280 rpm. Después de 4 horas, cada cultivo se centrifugó y se suspendió de nuevo en 10 ml de PBS para lavar las células. Cada uno de ellos se centrifugó nuevamente y se suspendió de nuevo en 10 ml de PBS suplementado con arabinosa (1 mM), FeSO4 (80 pM) y glicerol (0,4 % de concentración final). Este volumen de 10 ml se dividió por igual entre dos frascos de suero y se selló con tapones de caucho de butilo. Se inyectó un volumen de 60 ml de aire a través del tapón de un frasco de suero, mientras que se inyectaron 60 ml de etano a través del tapón del otro frasco de suero. Todos los frascos de suero se colocaron a 37°C, agitando a 280 rpm. Después de 24 horas, se abrieron los frascos y se tomaron muestras para detectar la presencia de etanol, usando la técnica descrita en el presente documento. En comparación con una curva estándar, las cepas produjeron la siguiente concentración de etanol como se muestra en la tabla a continuación.

Tabla 10: Etano monooxigenasa de S. aquatica es funcional en E. coli. con muchos pares de groES/groEL

Estos resultados demuestran la amplia gama de secuencias de groES/groEL capaces de mejorar la funcionalidad del sMMO, incluso cuando las sMMO y groES/groEL de microorganismos están relacionadas de manera distante.

Ejemplo 11. Las dihierro monooxigenasas relacionadas de manera distante son capaces de convertir etano en etanol.

Este ejemplo describe dihierro monooxigenasas funcionales expresadas en E. coli., convirtiendo etano en etanol. prm1A de Pseudonocardia sp. TY-7 y mmoX de Solimonas aquatica son un 31 % idénticos a nivel de aminoácidos.

La cepa NH283, descrita en otra parte del presente documento, se transformó con dos plásmidos simultáneamente: pNH100 (SEQ ID NO:28, que contiene las regiones codificantes correspondientes a los genes de propano monooxigenasa de Pseudonocardia sp. TY-7) y pNH177 (SEQ ID NO:38, que contiene genes groEL/groES optimizados mediante codones del microorganismo Pseudonocardia autotrophica). La cepa que contiene la monooxigenasa de S. aquatica y groES/groEL de S. aquatica se construyó como se describe en otra parte del presente documento. Estos transformantes se seleccionaron en placas de agar LB suplementadas con kanamicina (50 pg/ml) y espectinomicina (100 pg/ml).

El método para cultivar estas cepas y para medir la concentración de etanol se ha descrito en el ejemplo anterior. Los resultados de esta medición se muestran en la tabla 11.

Tabla 11: Comparación de la conversión de etano en etanol con enzimas etano monooxigenasa relacionadas de manera distante

Ejemplo 12. Mutaciones en metano monooxigenasa soluble que mejoran la función en E. coli.

Este ejemplo describe el hallazgo de mutaciones que mejoran la función de sMMO en E. coli. El proceso para mejorar sMMO implica tres etapas: generar diversidad genética, cribado de la biblioteca diversificada de clones para identificar mutaciones beneficiosas o neutras y recombinar estas mutaciones en una nueva biblioteca. Este proceso es iterativo y puede comenzar con cualquier secuencia enzimática funcional para la que existe un cribado.

La diversidad genética puede generarse mediante técnicas bien conocidas, tal como PCR propensa a errores y mutagénesis de saturación de sitio. Cribar estos clones mutados para determinar la función mejorada, usando, por ejemplo, los cribados descritos en los ejemplos anteriores, separa clones que tienen una función mejorada o neutra. (Otros cribados también pueden ser útiles para identificar, tal vez indirectamente, enzimas mejoradas.) Estos clones pueden secuenciarse para identificar la(s) mutación(es) conectada(s) con la función mejorada. La recombinación de mutaciones puede hacerse usando uno de varios métodos posibles, tal como T-PCR, PCR SOEing, barajado de genes y kits disponibles comercialmente como Quikchange Multisite Mutagenesis. Estas bibliotecas recombinadas pueden someterse a prueba para variantes mejoradas usando una gama de cribados o selecciones vinculadas a características de la enzima que está intentándose alterar, tal como actividad o especificidad de sustrato.

Ejemplo 13. Mutaciones de MMO que mejoran la actividad y especificidad en E. coli.

Este ejemplo describe la evolución dirigida de MMO y la identificación de sitios y mutaciones que son importantes para la actividad MMO y la especificidad de sustrato para etano y metano. La especificidad, solubilidad, plegamiento y actividad de enzima pueden mejorarse todas alterando la estructura de la proteína usando mutagénesis dirigida al sitio o aleatoria. Se construyeron diversas bibliotecas de MMO mediante PCR propensa a errores aleatoria y mutagénesis dirigida al sitio. Las bibliotecas se cribaron en primer lugar en placas de 96 pocillos usando sustratos sustitutos para identificar los resultados positivos primarios. Los resultados positivos más altos de cada placa se validaron para la conversión de etano en etanol en frascos de vidrio de 125 ml. Aproximadamente un tercio de los resultados positivos del cribado primario mostraron una oxidación mejorada de etano a etanol durante la validación. Se identificó una mutación de mmoX que confiere especificidad de etano; hubo una sustitución de aminoácido de N por E en la posición de aminoácido 240 en mmoX (SEQ ID NO: 10) en este plásmido, que posteriormente se denominó pBZ15 (SEQ ID NO:16). La cepa mutante (BZ27) y la cepa de tipo silvestre (BZ25) se analizaron para determinar la oxidación de etano y metano como se describe en otra parte del presente documento.

Tabla 12: Oxidación de metano y etano mediante BZ25 y BZ27. La mutación de mmoX (E240N) mejora la actividad frente al etano en comparación con el tipo silvestre.

Este ejemplo también demuestra una evolución dirigida generando y cribando la diversidad enzimática en rondas iterativas, similar a cómo funciona la selección natural en la evolución. Se mutaron y combinaron adicionalmente mutaciones beneficiosas en las posiciones de aminoácido 61 y 421 en mmoX. Las variantes de mmoX identificadas que muestran una mejora en la actividad de oxidación de etano con respecto a E240N (BZ27) se muestran en la tabla 13. La combinación de pBZ13 (SEQ ID NO:15) y la mutación E240N en mmoX dieron como resultado casi un orden de magnitud de mejora con respecto DG80 que expresaba mmoX de tipo silvestre en presencia de pNH180 (SEQ ID NO:40).

Tabla 13: Las mutaciones en mmoX mejoran la conversión de etano en etanol

El plásmido de MMO en BZ46 que porta tres mutaciones en mmoX (K61S, E240N, S421T) se sometió a otra ronda de mutagénesis y selección, dando como resultado una mejora adicional en la actividad MMO (tabla 14). Se ha demostrado que las mutaciones en mmoY (L67M) y mmoC (P167T) son beneficiosas, apuntando a la importancia de ambas posiciones. El plásmido de MMO en BZ67, posteriormente denominado pBZ23 (SEQ ID NO: 18), se usa como molde para más rondas iterativas de mutagénesis y selección.

Tabla 14: Las mutaciones en múltiples subunidades de MMO mejoran la conversión de etano en etanol

Ejemplo 14. Monooxigenasas híbridas en E. coli.

Las secuencias de dihierro monooxigenasas solubles (SDIMO) estrechamente relacionadas pueden ser una fuente de diversidad genética que pueden recombinarse para identificar enzimas mejoradas. En el caso de una enzima de múltiples subunidades, tales como las SDIMO, un método para mejorar el complejo enzimático es combinar subunidades de una SDIMO con las de otra. En el ejemplo más simple, una única subunidad de una SDIMO reemplazaría la subunidad homóloga de la segunda. Un esquema más complicado intercambiaría más de una subunidad. Un esquema aún más complicado, en una sola biblioteca, clonaría todas las subunidades de múltiples SDIMO homólogas de una manera que permita todas las combinaciones posibles que permitan exactamente una de cada subunidad. Métodos para clonar una biblioteca de este tipo se han descrito en la bibliografía, tal como ensamblaje Golden Gate (Engler y Marillonnet, Combinational DNA assembly using Golden Gate cloning, Methods Molecular Biology, vol 1073, págs. 141-156, 2013) y el ensamblaje Gibson (D. Gibson et al., Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases, NATURE METHODS Vol. 6, Tema 5, págs.343-345, 2009). Entonces, estas construcciones pueden cribarse usando, por ejemplo, los ensayos descritos en el presente documento.

Ejemplo 15. Conectar el producto de monooxigenasa a otras rutas metabólicas: en una única célula

Este ejemplo describe la expresión de una enzima monooxigenasa en una célula que comprende adicionalmente rutas metabólicas para consumir el producto de la reacción de monooxigenasa y/o para producir el sustrato de la reacción de monooxigenasa, conectando de ese modo la enzima monooxigenasa en una ruta metabólica en la célula.

Las células y los métodos para construir esas células que contienen una enzima monooxigenasa se han descrito en el presente documento. Estas enzimas monooxigenasas y los ácidos nucleicos a partir de los cuales se expresan son componentes modulares que pueden añadirse a células con rutas metabólicas, por ejemplo, consumir el producto de la reacción de monooxigenasa. Estas rutas metabólicas pueden ser endógenas a la cepa de origen natural o pueden expresarse heterólogamente a partir de ácidos nucleicos modificados que se han añadido a la célula.

En un ejemplo, la enzima sMMO se expresa en P. pastoris. Esta cepa se cultiva en medio mínimo con metano como la única fuente de carbono. La monooxigenasa puede oxidar el metano a metanol. P. pastoris contiene endógenamente una ruta para consumir metanol. El resultado neto es una cepa capaz de convertir metano en metanol a través de sMMO expresado heterólogamente y posteriormente metanol en otros metabolitos, usando rutas enzimáticas endógenas a P. pastoris.

En un ejemplo similar, la enzima sMMO se expresa en una cepa de E. coli diseñada. E. coli no consume naturalmente metanol, pero si esta cepa de E. coli diseñada está expresando una ruta para consumir metanol, entonces una ruta metabólica similar funcionará. Esta cepa se cultiva en medio mínimo que contiene metano y una ruta similar es operativa en esta cepa de E. coli.

Dados los muchos sustratos y productos de sMMO (en la tabla 1), no es difícil imaginar muchas otras rutas metabólicas que podrían estar conectadas con/por la enzima sMMO. Identificar todas las rutas metabólicas posibles que podrían construirse usando sMMO como una posible reacción química (es decir, un “enlace entre nodos” de metabolitos) es una tarea adecuada para un ordenador.

Ejemplo 16. Conectar el producto de monooxigenasa a otras rutas metabólicas: más de una célula

Este ejemplo describe la expresión de una enzima monooxigenasa en un sistema biológico de múltiples tipos de célula que comprende adicionalmente rutas metabólicas para consumir el producto de la reacción de monooxigenasa y/o para producir el sustrato de la reacción de monooxigenasa, conectando de ese modo la enzima monooxigenasa en una ruta metabólica en el sistema biológico.

Las células y los métodos para construir esas células que contienen una enzima monooxigenasa se han descrito en el presente documento. De manera conceptualmente similar al ejemplo que establece la conexión de una ruta metabólica en una sola célula, los metabolitos implicados en una ruta metabólica pueden convertirse por enzimas en una sola célula o en múltiples tipos de células en un cultivo (es decir, un “cocultivo”) o en un cocultivo en el que algunas de las etapas enzimáticas se producen fuera de cualquier célula, en el caldo de fermentación.

El método de cocultivo de múltiples cepas en una única fermentación es sencillo. Las cepas pueden crecerse por separado y combinarse en un único recipiente de fermentación. En un caso, una cepa de E. coli que expresa la sMMO se cocultiva con una cepa metilotrófica, tal como P. pastoris. Esta fermentación puede realizarse en medio mínimo que carece de una fuente de carbono. Cuando las cepas se sellan en un recipiente de fermentación, puede añadirse metano al recipiente. La sMMO en E. coli. convertirá el metano en metanol, que puede difundirse fuera de las célula de E. coli y entrar en la célula de P. pastoris donde puede consumirse y convertirse en metabolitos intracelulares y/o usarse como fuente de carbono para el crecimiento. Si la cepa de P. pastoris está diseñada para producir un producto químico, la cepa de E. coli simplemente convierte biológicamente el metano en metanol para su uso como sustrato en una ruta metabólica dentro de la cepa de levadura cultivada de manera conjunta.

Este ejemplo no se pretende que sea limitante a las fermentaciones alimentadas con metano, ya que el concepto es extensible a la conversión biológica de muchos sustratos (por ejemplo, los que se muestran en la tabla 1) en muchos productos que pueden usarse por microorganismos naturales o diseñados de una especie similar o diferente. No hay motivo, en principio, por el que toda la ruta metabólica de la materia prima al producto deba residir en una sola célula siempre que el/los metabolito(s) que se intercambian puedan difundirse de una célula a otra. Si el/los metabolito(s) no puede(n) difundirse naturalmente al interior o al exterior de una célula, la expresión de un transportador o proteína porina puede permitir el transporte activo o pasivo del metabolito al interior o al exterior de una célula. Se conocen muchos ejemplos de transportadores o porinas específicos de metabolitos o generales.

Ejemplo 17. El crecim iento aeróbico mejorado en etanol como una fuente de carbono principal o única en E. coli.

Previamente se han notificado cepas de E. coli. con capacidad de crecimiento aeróbico en etanol (D Clark & J E Cronan, Escherichia coli mutants with dehydrogenase and nitrate Escherichia coli Mutants with Altered Control of Alcohol Deehydrogenase and Nitrate Reductase, 141 177-183, 1980); (J Membrillo-Hernández et al., Evolution of the adhE gene product of Escherichia coli from a functional reductase to a dehydrogenase: Genetic and boichemical studies of the mutant proteins, 275 Journal of Biological Chemistry 33869-33875, 2000).

La tasa de crecimiento de E. coli. en medio mínimo de etanol depende de la tasa de asimilación de etanol (figura 1). Por lo tanto, las cepas pueden diseñarse o desarrollarse para aumentar la tasa de crecimiento en medio mínimo de etanol. Pueden emplearse muchas estrategias para mejorar la tasa de crecimiento en etanol, tales como (pero sin limitarse a) mutagénesis química, sobreexpresión de genes seleccionados como diana en la ruta (por ejemplo, alcoholaldehído deshidrogenasa, enzimas de derivación de glioxilato), bibliotecas de sobreexpresión/transducción de cepas con cultivo más rápido en etanol o acetato.

Con el fin de mejorar la tasa de crecimiento de E. coli. en etanol como fuente principal o única de carbono, se construyó una biblioteca de expresión del adhE (A267T, E568K) (SEQ ID NO:49) mutante.

La biblioteca de expresión basada en plásmidos del adhE (A267T, E568K) mutante se construyó generando primero pNH045 (SEQ ID NO:73), usando métodos estándar de biología molecular. El gen adhE se amplificó por PCR de colonias a partir de ADN genómico preparado a partir de E. coli. NEB Turbo. Se diseñaron cebadores para introducir las dos mutaciones deseadas y las partes se ensamblaron usando la técnica de ensamblaje de Gibson (D G Gibson et al., Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases, 6 Nature methods 343-345, 2009) en el plásmido pMAL-c5x de New England Biolabs. Este plásmido contiene un promotor Ptac inducible por IPTG. Los transformantes exitosos se cribaron mediante PCR de colonias y se secuenciaron usando secuenciación de Sanger. Un clon, con la secuencia correcta a través del promotor, un marco de lectura abierto y terminador, se denominó pNH045.

Con el fin de variar la fuerza de promotor, se realizó una PCR usando pNH045 como molde. Se usaron cebadores degenerados con bases degeneradas y bases no estándar (véase, por ejemplo, https://www.idtdna.com/pages/docs/quick-looks/quick-look—degenerate-sequences-and-non-standardbases.pdf?sfvrsn=1). Los dos cebadores que se usaron para introducir variación en los nucleótidos de promotor clave en la secuencia se muestran a continuación:

^{Biblioteca de Ptac directo =}gctgttSaMaattaatcatcggctcgKaHRatgtgtggaattgtgagcggataac

^{Biblioteca Ptac inverso =}catYDtMcgagccgatgattaattKtSaacagctcatttcagaatatttgccagaacc

Esta PCR se realizó de tal manera que la reacción generó un fragmento de ADN que podría autoligarse usando el protocolo de Gibson. Esta reacción se purificó y se transformó en la cepa deseada de E. coli., NEB Turbo. Se verificó que varios de estos clones contenían una secuencia variable en la región promotora. Las colonias se rasparon de la placa de agar y se combinaron en una única biblioteca de ADN mediante extracción miniprep y se denominó pNH069L.

La identificación de un nivel de expresión óptimo de adhE (A267T, E568K) para el crecimiento en etanol como una fuente principal o única de carbono y energía es una competencia de crecimiento sencilla. La biblioteca de plásmidos pNH069L se transformó en una cepa de E. coli de interés (por ejemplo, BL21) por electroporación. Estas células se rasparon de la placa de agar al día siguiente y se crecieron en un medio mínimo con etanol como única fuente de carbono a la temperatura deseada (por ejemplo, 37°C) en condiciones de inducción (por ejemplo, con IPTG a una concentración final de saturación de 1 mM). El medio mínimo de etanol puede contener la fórmula de sales M9 estándar más tiamina y etanol a una concentración final del 1 %, aunque también se han descrito otras fórmulas de medio mínimo (J Tamarit, Identification of the Major Oxidatively Damaged Proteins in Escherichia coli Cells Exposed to Oxidative Stress, 273 Journal of Biological Chemistry 3027-3032, 1998). El paso de estas células a través de este medio permitió que las cepas de crecimiento más rápido dominasen la población del cultivo. Este cultivo se sembró después en estrías en medios ricos (LB antibiótico carbenicilina a 100 |ig/ml) para aislar clones individuales. Cada uno de estos se creció luego en medio mínimo de etanol para comparar la tasa de crecimiento frente al crecimiento en medio mínimo de glucosa y frente a una cepa de control (por ejemplo, DC272) (J Membrillo-Hernández et al., Evolution of the adhE gene product of Escherichia coli from a functional reductase to a dehydrogenase: Genetic and biochemical studies of the mutant proteins, 275 Journal of Biological Chemistry 33869-33875, 2000)

Ejemplo 18. Mejora de crecim iento en etanol en E. coli.

Este ejemplo describe una serie de sobreexpresiones génicas que permiten que E. coli. crezca de manera robusta a través de muchas concentraciones de etanol. Estos genes son o bien de organismos heterólogos o bien de E. coli.

El trabajo previo ha mostrado que la introducción de dos mutaciones puntuales en adhE de E. coli, A267T y E568K (SEQ ID NO:49), es suficiente para permitir que crezca E. coli en etanol. AdhE es una enzima bifuncional que puede actuar tanto como alcohol deshidrogenasa (ADH) como acetaldehído deshidrogenasa (ACDH). Basándose en nuestro propio trabajo y también en la caracterización publicada de esta enzima, se determinó que la actividad de ADH de adhE (A267T, E568K) podría ser limitante para aplicaciones en las que la concentración de etanol es baja, porque tiene un alto Km para etanol.

Se buscaron nuevas rutas enzimáticas que tuvieran una alta actividad a bajas concentraciones de etanol. Se identificó un panel de enzimas ADH y ACDH de organismos que crecen naturalmente en etanol y se sintetizaron versiones optimizadas mediante codones de los genes relevantes. También se incluyeron genes de E. coli que se ha demostrado que realizan las químicas deseadas. Se construyeron perones de todas las combinaciones posibles de dos genes usando el ensamblaje de Gibson en un plásmido de origen pBR322 bajo el control de un promotor Ptac y los niveles de expresión de estos genes se variaron simultáneamente usando bases degeneradas en los sitios de unión a ribosoma. Algunas cepas combinaron adhE (A267T, E568K) expresado a partir del genoma con genes ADH individuales sobreexpresados a partir del plásmido. Las colonias resultantes se cribaron para el crecimiento en un amplio intervalo de concentraciones de etanol. La densidad óptica se midió 20 horas después de inocular las células en medio mínimo de etanol. La tabla 15 muestra los resultados. El E. coli de tipo silvestre no crece en etanol a ninguna concentración, y diferentes combinaciones de ADH y ACDH confieren diferentes magnitudes de beneficio de crecimiento.

A continuación se describe el método para cultivar las cepas y medir el crecimiento de las cepas en etanol. Las cepas se cultivaron en caldo LB suplementado con carbenicilina (100 pg/ml) para un crecimiento durante la noche a 37°C, y después se lavó centrifugando el cultivo y lavando dos veces en medio salino tamponado con fosfato (PBS). El medio mínimo BEM0 se formuló de la siguiente manera. Primero se mezcló una disolución de metales 1000x que contenía los siguientes compuestos en las concentraciones proporcionadas: FeCl3*6H2O 0,1 M, CaCl21 M, MnCl2*4H2O 1 M, ZnSO4*7H2O 1 M, CoCl2*6H2O 0,2 M, NiCl2*H2O 0,2 M, NaMoO4*2 H2O 0,1 M, Na2SeO3*5 H2O 0,1 M, H3BO30,1 M. El medio mínimo denominado BEM0 contiene (en ddH2O): (N H ^S O 425 mM, KH2PO450 mM, Na2HPO450 mM, MgSO41 mM, LB al 0,15 %, IPTG 1 mM y 0,1 % de la disolución de metales 1000x, más una concentración deseada de etanol. Las células se suspendieron de nuevo entonces en medio mínimo BEM0 con diferentes concentraciones de etanol a una DO600 inicial de 0,1. Estos cultivos se dividieron en alícuotas en placas de 96 pocillos, se sellaron y se agitaron durante la noche a 37°C durante 20 horas. Se tomaron muestras de 100 pl de medio y se tomó una absorbancia a 600 nm.

Tabla 15: Las rutas mejoradas de asimilación de etanol permiten un crecimiento más rápido en una amplia gama de concentraciones de etanol. Los datos son promedios de mediciones realizadas a partir de dos cultivos independientes.

Se aisló plásmido pLC99 (SEQ ID NO:27) por miniprep de LC292. Se aisló otro clon con un fenotipo de crecimiento similar y su plásmido se denominó pLC100 (SEQ ID NO:23). Ambos plásmidos se usaron posteriormente en experimentos de seguimiento para conferir propiedades de asimilación de etanol mejoradas en cepas de E. coli.

Ejemplo 19. Etanotrofo sintético en E. coli.

Este ejemplo proporciona una descripción de una cepa de E. coli capaz de crecer en etano como una fuente de carbono principal o única.

Dado que las cepas de E. coli se han descrito en el presente documento y en otro lugar (D Clark & J E Cronan, Escherichia coli mutants with dehydrogenase and nitrate Escherichia coli Mutants with Altered Control of Alcohol Dehydrogenase and Nitrate Reductase, 141 177-183, 1980) y (J Membrillo-Hernández et al., Evolution of the adhE gene product of Escherichia coli from a functional reductase to a dehydrogenase: Genetic and biochemical studies of the mutant proteins, 275 Journal of Biological Chemistry 33869-33875, 2000) que son capaces de crecer en etanol como una fuente principal o única de carbono y energía, estas cepas pueden ser la base de una cepa capaz de crecer en etano, siempre que pueda expresarse una enzima funcional o complejo enzimático que pueda convertir etano en etanol.

Existen enzimas que son capaces de convertir un hidrocarburo o un alcano en un alcohol. Estas clases de enzimas incluyen las metano monooxigenasas solubles (sMMO), metano monooxigenasas particuladas, metano monooxigenasas híbridas, alcano/alqueno monooxigenasas, tolueno monooxigenasas, algunas amonio monooxigenasas y algunas monooxigenasas P450. Hasta la fecha, sin embargo, no hay informes de ningún grupo que describa la expresión funcional con éxito de una enzima monooxigenasa en E. coli capaz de oxidar etano a etanol.

Estas enzimas pueden expresarse, junto con cualquier proteína accesoria, chaperonas de plegamiento de proteínas y/o mediadores/reductasas de donación de electrones, usando técnicas estándar de biología molecular. Los genes pueden expresarse a partir de ADN extraído del organismo nativo y clonarse en vectores de expresión adecuados para E. coli. Estos vectores pueden transformarse en E. coli, usando técnicas estándar, tal como electroporación. Alternativamente, puede diseñarse y construirse ADN para permitir la integración de los genes en el cromosoma de E. coli, de modo que la expresión de los genes produciría los componentes de proteínas deseados. Otra opción es sintetizar los genes, usando proveedores tales como IDT o DNA2.0, y expresar los genes de o bien un plásmido o bien un locus cromosómico. El a Dn sintetizado permite al investigador elegir el codón deseado en cada posición a lo largo del gen y puede usarse para optimizar la secuencia de ácido nucleico para su expresión. El ADN sintetizado también permite la elección de secuencias de ácido nucleico entre genes en un operón policistrónico. Estos genes u operones pueden expresarse a partir de cualquier promotor que sea funcional en E. coli, incluyendo los promotores más estudiados, tales como Ptac, Plac, Ptrc, Pbad (que son inducibles) y PT5 (que es constitutivo).

Estos complejos enzimáticos de monooxigenasa pueden expresarse en E. coli. Ejemplos de monooxigenasas que pueden oxidar etano a etanol se dan en la tabla 1. Este conjunto de monooxigenasas no se pretende que sea limitante, sino solo un ejemplo de un conjunto que podría oxidar etano a etanol. Está claro que mediante una simple búsqueda BLAST (S Altschul et al., Basic Local Alignment Search Tool, 215 J Mol Biol. 403-410, 1990), podrían identificarse monooxigenasas alternativas que están estrechamente relacionadas con el conjunto enumerado en la tabla 16.

Tabla 16. Ejemplos de enzimas monooxigenasas que pueden oxidar etano

La monooxigenasa de fusión spmoB (R Balasubramanian et al., Oxidation of methane by a biological dicopper center., 465 Nature 115-119, 2010) contiene dos dominios fusionados del complejo pMMO de Methylococcus capsulatus (Bath). Se demostró que spmoB no era soluble al expresarse en E. coli, pero que pudo extraerse y solubilizarse de nuevo in vitro en un método que demostró cierta funcionalidad en la oxidación de metano. Esta enzima spmoB puede expresarse en cepas de E. coli que están expresando simultáneamente chaperonas de plegamiento de proteínas, tales como groES/groEL de E. coli o del organismo nativo M. capsulatus. spmoB también puede expresarse a partir de una construcción que selecciona como diana la enzima al espacio periplásmico, entre las membranas plasmáticas interna y externa de E. coli. Dado que la enzima spmoB es una fusión de dominios que se tomaron ambos de la parte periplásmica de la proteína pmoB, spmoB puede funcionar de manera apropiada en el periplasma. Las secuencias de selección como diana el periplasma se han descrito previamente.

La metano monooxigenasa particulada (pMMO) también puede oxidar etano a etanol en E. coli. Este complejo proteico está compuesto por tres subunidades y reside en la membrana interna del organismo nativo. Para expresar con éxito la pMMO en E. coli, las secuencias líder de extremo N-terminal correctas deben fusionarse adecuadamente con cada una de las tres subunidades.

El ensayo para la expresión exitosa de una monooxigenasa que convierte etano en etanol puede ser el crecimiento de la cepa de E. coli en etano como fuente de carbono principal o única. La cepa hospedadora de E. coli puede elegirse para que sea una que pueda crecer en etanol como fuente de carbono principal o única, de modo que cualquier etano monooxigenasa funcional que convierta etano en etanol podrá proporcionar un sustrato a base de carbono para que la bacteria crezca y se reproduzca. El medio mínimo de sales proporciona los nutrientes necesarios, aparte de la fuente de carbono, para dar sustento a la bacteria. Medio mínimo de sales para E. coli. puede basarse en la fórmula de M9, ampliamente usada en microbiología, junto con los minerales necesarios, tales como hierro o cobre, que pueden requerirse para la funcionalidad de la monooxigenasa. Los medios y la cepa que contiene la monooxigenasa, o una biblioteca de monooxigenasas, pueden inocularse en un frasco estéril y sellarse usando, por ejemplo, un tapón de caucho de butilo. A continuación, usando una jeringa y una aguja, puede inyectarse gas etano en el espacio libre superior por encima del cultivo. Este frasco sellado puede incubarse durante un período prolongado para permitir que el etano se disuelva en el medio y para que las células consuman el etano y crezcan. El crecimiento puede medirse mediante un aumento en la densidad óptica del cultivo, en relación con un control en el que no se ha inyectado etano, o contando las unidades formadoras de colonias tanto para el experimento como para el control.

En algunos casos, la tasa de producción de etanol a través de la oxidación de etano será demasiado lenta para que crezca la cepa. Las cepas pueden hacerse crecer en un medio que contiene una concentración limitante de etanol para una velocidad de crecimiento moderada, todavía limitada por la cantidad de carbono disponible. Cualquier célula que contenga una monooxigenasa funcional que esté haciendo incluso pequeñas cantidades de etanol tendrá una ventaja de crecimiento, ya que el carbono es el elemento limitante para el crecimiento en este diseño experimental. Estos cultivos pueden hacerse crecer de manera continua, como en biorreactores, turbidostatos, o quimiostatos, o pueden pasarse en serie de un frasco al siguiente, para permitir el crecimiento durante un período de tiempo más largo. La tasa exponencial del crecimiento de células microbianas es una ventaja clave de esta estrategia.

A continuación, se describe el trabajo real realizado para demostrar un etanotrofo sintético en E. coli. Específicamente, esta parte del ejemplo describe la construcción y el sometimiento a prueba de una cepa que contiene una sMMO funcional y una ruta de asimilación de etanol, capaz de crecer en etano como una fuente de carbono principal o única.

Construcción de cepa de NH566

La cepa NH566 se construyó en la siguiente serie de etapas. El plásmido pBZ15 (SEQ ID NO: 16) se construyó como se describe en otra parte en el presente documento. El plásmido pNH225 (SEQ ID NO: 45) se clonó añadiendo un fragmento de ADN de pLC99 (Se Q ID NO: 27) que codifica lacI-Ptrc-adh(B. estearotermophilus)-acdH(C. kluyveri) para la ruta de asimilación de etanol en pBZ13, que contiene casetes de expresión para las groES/groEL de E. coli y para las groES/groEL de M. capsulatus. Se construyó la cepa NH283, como se describió anteriormente. NH566 se seleccionó de transformantes de NH283 transformados tanto con plásmidos pBZ15 (SEQ ID NO: 16) como pNH225 (SEQ ID NO: 45).

Cultivo de NH566 con etano frente a aire

NH566 se sembró en estrías en placas de agar LB suplementadas con espectinomicina (100 |ig/ml) y kanamicina (50 |ig/ml) y se incubó a temperatura ambiente durante 3 días. Se recogió una sola colonia en 1 ml de caldo LB líquido suplementado con espectinomicina (100 |ig/ml) y kanamicina (50 |ig/ml) y se creció a 37°C, agitando a 280 rpm. Después de 4 horas, se añadió el 1 ml a 9 ml del mismo medio y se crecieron a 37°C, 280 rpm durante otras 2 horas. Este cultivo de 10 ml se centrifugó y se lavó en 10 ml de PBS una vez. A partir de esto, se centrifugó de nuevo 1 ml del PBS y se suspendió de nuevo en 10 ml de medio BEM4 suplementado con etanol hasta una concentración final del 0,5 % (v/v). Este cultivo se colocó a 37°C, agitando a 280 rpm durante 23 horas. A partir de este cultivo, se centrifugaron 5 ml y se desechó el sobrenadante. El sedimento se suspendió de nuevo en 10 ml de PBS para lavarse. La resuspensión se centrifugó nuevamente, el sobrenadante se desechó y el sedimento se suspendió de nuevo en 10 ml de medio base BEM4 que carecía de etanol. (El medio mínimo denominado BEM4 contiene (en ddH2O): KH2PO4 50 mM, Na2HPO4*7 H2O 50 mM, MgSO41 mM, LB al 0,15 %, glutamina 6,25 mM, FeSO480 |iM, CaCh 0,1 mM, IPTG 1 mM, 0,1 % de la solución de metales 1000x y arabinosa 1 mM (cuando se requiera para la inducción del promotor pBAD), más una concentración deseada de etanol.) A partir de este cultivo, se pipetearon 4,5 ml en cada uno de los dos frascos de suero y se sellaron con tapones de caucho de butilo. La densidad celular inicial se midió por DO600 y se encontró que era de aproximadamente 0,5 según se desee. En un frasco de suero, se usó una jeringa para inyectar 60 ml de aire, mientras en el otro frasco de suero, se usó una jeringa para inyectar 60 ml de etano. Los frascos de suero se incubaron a 37°C, agitando a 280 rpm. Después de 20 h, 46 h y 64 h de incubación, se tomaron muestras de ambos frascos de suero a través de los tapones de caucho usando una pequeña jeringa. La densidad celular de ambas muestras se midió por DO600 y por siembra en placas de agar LB durante la noche para el recuento de colonias. La figura 7 muestra un transcurso temporal de las mediciones de DO600 para los dos frascos de suero que demuestra que el cultivo alimentado con etano crece a una DO600 más alta que su densidad inicial, mientras que el cultivo alimentado con aire cae en densidad, debido a una pérdida en la viabilidad celular. El aumento en la densidad celular debido a la presencia del etano en el frasco de suero confirma que las células son capaces de metabolizar el etano. Los aumentos de la viabilidad celular debidos al etano se confirmaron contando las unidades formadoras de colonias en las placas de agar a partir de los puntos temporales de 46 h y 64 h. A las 46 h, había 1,44x más colonias del cultivo alimentado con etano con respecto al cultivo alimentado al aire. A las 64 horas, esta relación había aumentado a 1,75x.

Ejemplo 20. Bioconversión de etanol a ácidos grasos libres en E. coli.

Este ejemplo describe rutas potenciales para aumentar la producción de ácidos grasos en E. coli a partir de etanol como materia prima. Este ejemplo también describe el trabajo realizado que aumentó la producción de ácidos grasos en E. coli a partir de etanol.

El trabajo previo ha demostrado la capacidad de sobreproducir ácidos grasos y derivados a partir de E. coli, usando glucosa u otras mezclas de azúcares como materia prima (H Cho & J.E. Cronan, Defective Export Of A Periplasmic Enzymne Disrupts Regulation Of Fatty Acid Synthesis, Journal of Biological Chemistry 2704216-4219). Los azúcares se metabolizan en acetil-CoA como un nodo central del metabolismo, y la célula usa acetil-CoA para producir ácidos grasos usando la ruta de biosíntesis de ácidos grasos.

El trabajo previo también ha mostrado que los mutantes de E. coli pueden aislarse con la capacidad de consumir etanol como fuente principal o única de carbono y energía, en condiciones aeróbicas (D Clark & J E Cronan, Escherichia coli mutants with dehydrogenase and nitrate Escherichia coli Mutants with Altered Control of Alcohol Dehydrogenase and Nitrate Reductase, 141 177-183, 1980). En algunos casos, esta capacidad se seguirse hasta la sobreexpresión del gen adhE de E.coli nativo, mientras, en otros casos, se descubrieron mutaciones en el gen adhE que parecían potenciar aún más la tasa de crecimiento de E. coli en etanol (J Membrillo-Hernández et al., Evolution of the adhE gene product of Escherichia coli from a functional reductase to a dehydrogenase: Genetic and boichemical studies of the mutant proteins, 275 Journal of Biological Chemistry 33869-33875, 2000) El gen adhE codifica aldehídoalcohol deshidrogenasa, que tiene actividad tanto de alcohol deshidrogenasa como de acetaldehído deshidrogenasa dependiente de coenzima A.

Con el fin de generar una cepa de E. coli que puede convertir etanol en ácidos grasos en condiciones de cultivo aeróbico, el gen adhE (o un mutante del mismo, tal como adhE (A267T, E568K)) puede sobreexpresarse a partir de un locus plasmídico o cromosómico. Se han descrito métodos estándar para bibliotecas de expresión en E. coli., que implican la clonación del gen con un oligonucleótido degenerado para aleatorizar los pares de base en ubicaciones críticas, en el interior de, por ejemplo, el sitio de unión ribosómico o el promotor. Una biblioteca de este tipo puede usarse para crear un conjunto diverso de cepas de E. coli que varían en sus niveles de expresión de adhE. Dado que el objetivo es identificar la cepa que puede crecer más rápido en etanol como fuente de carbono principal o única, esta biblioteca de E. coli. puede someterse a prueba en tales condiciones, en un único cultivo. Las cepas de cultivo más rápido superarán a otras cepas, se convertirán en el genotipo más común en la población mixta y pueden aislarse mediante métodos de microbiología convencionales y vuelven a someterse a prueba como poblaciones clonales entre sí. Usando esta técnica, se han identificado niveles óptimos de adhE (A267T, E568K) en cepas de E. coli tales como NEB Turbo, BL21(DE3) y EPI300.

La producción de ácidos grasos a partir de glucosa u otras mezclas de azúcares en E. coli se ha mostrado en otra parte (H Cho & J E Cronan, Defective Export Of A Periplasmic Enzyme Disrupts Regulation Of Fatty Acid Synthesis, Journal of Biological Chemistry 2704216-4219). Una tioesterasa, tal como E. coli ‘tesA o U. californica ‘fatB1 (L Yuan et al., Modificaron of the substrate specificity of an acyl-acyl carrier protein thioesterase by protein engineering., 92 Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 10639-10643, 1995), se expresa en E. coli a partir de un locus cromosómico o plasmídico. Esta tioesterasa hidroliza el enlace acil-ACP y libera un ácido graso. Una biblioteca de expresión, similar a la descrita en el párrafo anterior, puede usarse para ajustar la expresión de la tioesterasa a un nivel óptimo en las condiciones de cultivo deseadas.

Con el fin de generar una cepa de E. coli. capaz de producir ácidos grasos a partir de etanol, puede usarse una cepa que consume etanol como hospedadora para un plásmido que expresa la biblioteca de tioesterasa. Cribar un número moderado de clones, por ejemplo, menos de 100, sería suficiente para encontrar un clon con un nivel óptimo de expresión de tioesterasa, en las condiciones de cultivo dadas.

El método analítico para identificar ácidos grasos del caldo de cultivo se ha descrito previamente (S Del Cardayre, patente estadounidense n.° 20100257778, 2010). En resumen, el cultivo se mezcla con un volumen igual de un disolvente orgánico, tales como acetato de butilo, y se agita para permitir que los ácidos grasos se separen en la capa orgánica. La muestra se centrifuga para separar la capa orgánica de la capa acuosa. Puede hacerse discurrir un pequeño volumen de la capa orgánica en un cromatógrafo de gases para identificar los picos de ácidos grasos.

Esta parte del ejemplo describe el trabajo realizado realmente que aumentó la producción de ácidos grasos en E. coli. a partir de etanol. La cepa DC272 se recibió del E. coli del Genetic Stock Center de la Universidad de Yale. El operón araBAD se eliminó usando el método de Datsenko y Wanner para crear la cepa LC55 (DC272 araBAD::cat). El ADN sintético que codifica fatB1 de Umbellularia californica se optimizó mediante codones, se adquirió de un proveedor comercial (Integrated DNA Technologies), y se clonó para dar un plásmido en un operón detrás del gen bla (que confiere resistencia a ampicilina) en un vector de clonación estándar que contiene un origen de replicación p15a. Después de que se ha verificado la secuencia de ADN, el plásmido (denominado pBZ22, SEQ ID NO: 56) se transformó en LC55, generando la cepa NH671. Como control, se transformó LC55 con un plásmido diferente que contenía la misma resistencia a antibióticos (bla).

El ensayo de Nile Red fluorescente se usó para medir la producción de ácidos grasos libres de NH671 de la siguiente manera. Ambas cepas (NH671 y control) se inocularon en caldo LB suplementado con carbenicilina (100 |ig/ml) durante la noche a 37°C, 280 rpm. Después de 16 horas, se transfirieron 10 |il del cultivo durante la noche a 2 ml de medio BEM0 (composición descrita en otra parte del presente documento más el 0,5 % de concentración final de etanol) y se tapó herméticamente. Después de dos días, se tomaron muestras de los cultivos y se normalizaron las densidades celulares. De cada cultivo, se tomó una muestra de 100 |il y se mezcló con 0,5 |il de disolución madre de Nile Red (250 mg/ml en DMSO) como se describe por Hoovers (Hoovers et al., Bacterial production of free fatty acids from freshwater magroalgal cellulose, Appl. Microbiol. Biotechnology, Vol. 91(2), 2011). La fluorescencia se midió usando una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 590 nm.

Se usó un control de medios en blanco para medir la fluorescencia de fondo y se midieron 296 recuentos. La cepa NH671 midió 5950 recuentos, mientras que la cepa de control (que no contenía el gen fatB1) midió 2151. Esto corresponde a una fluorescencia 2,77 veces mayor debido a los ácidos grasos libres en la muestra.

Ejemplo 21. Bioconversión de etanol a succinato en E. coli.

Para construir cepas capaces de convertir etanol en succinato, cepas de E. coli se modificaron mediante la deleción de iclR y mediante la reducción o eliminación de la expresión de sdhAB, que codifica la enzima succinato deshidrogenasa. Este ejemplo describe la construcción de dos cepas con la capacidad de convertir etanol en succinato, junto con el método para realizar la conversión con las cepas.

Construcción de cepa de NH533 y NH610

Se generó una cepa capaz de producir succinato mediante la deleción de tres loci genéticos en la cepa de E. coli NEB Express (New England Biolabs), un derivado de BL21. Los tres loci (araBAD, iclR y sdhAB) se eliminaron secuencialmente usando el método de Datsenko y Wanner (2000). En resumen, se amplificó un casete de deleción a partir de los plásmidos pKD3 o pKD13 usando cebadores con homología con el locus diana. La cepa se hizo eléctricamente competente y se transformó con el casete de deleción. Se verificaron cepas con la deleción por PCR de colonias y los marcadores se eliminaron usando pCP20, como se describe en otra parte, dejando una cicatriz de FRT. La cepa resultante (NEB Express AaraBAD::FRT AiclR::FRT AsdhAB::FRT) se denominó LC344. Esta cepa se transformó luego con un plásmido que confiere una mejor asimilación de etanol, pLC100 (SEQ ID NO: 23) y se denominó NH533.

La cepa NH610 se construyó por deleción secuencial de araBAD e iclR a partir de NEB Express, como anteriormente. Para reducir la expresión de los genes sdhAB, sin eliminarlos completamente, se construyó un fragmento de ADN con homología con el extremo 3' del operón sdhAB más un promotor Ptrc y un marcador de resistencia a cloranfenicol para dirigir el promotor Ptrc en la dirección opuesta a la transcripción de los genes sdhAB (SEQ ID NO: 47). Este casete de ADN se integró en la cepa, usando pKD46 como el sistema rojo lambda, como se describió anteriormente y en otra parte. Se seleccionaron transformantes en placas de agar LB suplementadas con cloranfenicol (17 |ig/ml). Las cepas resultantes se transformaron luego con pLC100 (SEQ ID NO: 23) para mejorar la capacidad de asimilar el etanol al metabolismo central. NH610 se seleccionó de esta transformación como un solo clon.

Bioconversión de etanol en succinato con NH533

NH533 se inoculó en 1 ml de caldo LB suplementado con carbenicilina (100 |ig/ml) directamente de una solución madre de glicerol y se colocó en una incubadora con agitación a 37°C, 280 rpm durante la noche. A la mañana siguiente, la cepa se diluyó 1:100 en 2 ml de caldo LB suplementado con carbenicilina, y se cultivaron a 37°C, 280 rpm durante 4 horas. Después de 4 horas, la cepa se lavó una vez en 2 ml de PBS y se suspendió de nuevo en 1 ml de PBS glicerol (0,8 % de concentración final) FeSO4 (80 |iM) IPTG (1 mM) etanol (0,5 % v/v). El tubo se tapó herméticamente y se colocó a 37°C, 280 rpm durante 48 horas.

Cuando la bioconversión se completó a las 48 horas, el cultivo se centrifugó a 16 krpm durante 2 min y se tomaron muestras del sobrenadante en un tubo independiente. Esta muestra se usó para el análisis por HPLC de succinato usando un Shimadzu 10 AVP equipado con una columna Phenomenex Synergy Hydro RP de 5 |im, fase móvil de KH2PO420 mM (pH 3), en un gradiente isocrático. El ácido succínico se detectó usando un detector UV a 200 nm. La HPLC se calibró con ácido succínico en agua a diferentes concentraciones conocidas. Usando estas lecturas como una curva estándar, se determinó que NH533 convirtió etanol en 0,5 mg/ml de succinato.

Conversión de etanol en succinato con NH610

La cepa NH610 se inoculó en 2 ml de caldo LB suplementado con carbenicilina (100 |ig/ml) directamente a partir de una solución madre de glicerol y se colocó en una incubadora con agitación a 37°C, 280 rpm durante la noche. A la mañana siguiente, la cepa se diluyó 1:100 en 2 ml de caldo LB suplementado con carbenicilina, y se cultivaron a 37°C, 280 rpm durante 4 horas. Después de 4 horas, la cepa se lavó una vez en 2 ml de PBS y se inoculó con 25 |il en 1 ml de medio BEMO (descrito en otra parte en el presente documento) que contenía un 0,5 % de concentración final de etanol. El tubo se tapó herméticamente y se colocó a 37°C, 280 rpm durante 48 horas. Después de 48 horas, el cultivo se centrifugó a 16 krpm durante 2 min y se tomaron muestras del sobrenadante en un tubo independiente. Esta muestra se usó para el análisis por HPLC de succinato usando el método descrito anteriormente. Usando una curva estándar, se determinó que NH610 convirtió etanol en 0,41 mg/ml de succinato.

Ejemplo 22. Bioconversión de etano a succinato en E. coli. usando un monocultivo

Este ejemplo describe la conversión de etano en succinato en un cultivo de una cepa diseñada de E. coli. Para demostrar de manera concluyente que el succinato que se produce se deriva del etano, el experimento se realizó con etano marcado con 13C y se observó que una fracción significativa del succinato medido estaba marcada con 13C.

Construcción de cepa de NH606

La cepa NH606 se construyó mediante las siguientes etapas. En primer lugar, usando el método de Datsenko y Wanner (2000), los genes iclR, sdhAB y araBAD se eliminaron secuencialmente de la cepa de E. coli NEB Express usando casetes flanqueados por FRT que proporcionan resistencia a kanamicina. El casete de resistencia a antibióticos se retiró usando pCP20, como se describe en otra parte, dejando solo cicatrices de FRT en los tres loci. Esta cepa, NH558, después se hizo eléctricamente competente y se transformó con los plásmidos pBZ15 (SEQ ID NO: 16) y pBZ13 (SEQ ID NO: 15), como se describe en el presente documento, y los transformantes se seleccionaron en placas de agar LB suplementadas con kanamicina (50 |ig/ml) y espectinomicina (100 |ig/ml). Se creció una única colonia de NH558 en LB suplementado con los antibióticos, se hizo eléctricamente competente, y se transformó con pLC99 (SEQ ID NO: 27), un plásmido que confiere una mejor asimilación de etanol, como se describe en el presente documento. Estos transformantes se seleccionaron en placas de agar LB suplementadas con kanamicina (25 |ig/ml), espectinomicina (50 |ig/ml) y carbenicilina (50 |ig/ml). Una de estas colonias se seleccionó para un estudio adicional y se le dio el nombre NH606.

Bioconversión de etano 13C en succinato

La cepa NH606 se inoculó en 1 ml de LB suplementado con carbenicilina (50 |ig/ml), kanamicina (25 |ig/ml) y espectinomicina (50 |ig/ml) durante 16 horas. Se transfirió un volumen de 0,2 ml del cultivo a 1,8 ml de medio LB suplementado con los antibióticos anteriores más L-arabinosa 1 mM, IPTG 1 mM, citrato férrico 50 |iM y L-cisteína 200 |iM. Después de 4 horas, los cultivos se centrifugaron a 4000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se desechó y el sedimento se suspendió de nuevo en un volumen igual de PBS. Las muestras se centrifugaron nuevamente y se resuspendieron en medio BEM6 a una DO600 de 2,0. (El medio mínimo denominado BEM6 contiene (en ddH2O): KH2PO450 mM, Na2HPO4*7 H2O 50 mM, MgSO41 mM, LB al 0,15 %, glutamina 1,5625 mM, FeSO480 |iM, CaCh 0,1 mM, IPTG 1 mM, 0,1 % de la solución de metales 1000x y L-arabinosa 1 mM (cuando se requiere para la inducción del promotor pBAD), más una concentración deseada de etanol.) A partir de este cultivo, se pipetearon 500 |il en cada uno de los dos viales de vidrio estériles, conteniendo cada uno una sola perla de vidrio para evitar la aglomeración celular. Estos viales se sellaron con tapones de caucho. Usando una jeringa, se inyectó 1 ml de etano marcado con 13C en el espacio libre superior por encima del líquido en uno de los viales, mientras se inyectaba 1 ml de aire en el otro vial. Todos los viales se colocaron a 37°C, 280 rpm. Después de incubarse a 37°C durante 46 horas, las muestras se centrifugaron a 16,1 krpm durante 2 min. Cada muestra se analizó para determinar el ácido succínico marcado con 13C mediante LC/MS/MS y se comparó con un estándar analítico. Se mezclaron 60 |il de metanol con 20 |il de muestras y se centrifugaron. Se diluyeron veinte |il de sobrenadante 5X con metanol al 12,5 % ácido fórmico al 0,1 %. Se prepararon estándares de calibración por dilución en serie de solución madre de succinato en metanol al 12,5 % ácido fórmico al 0,1 %. Se mezclaron sesenta |il de la muestra anterior con 60 |il de la disolución estándar interna (2-HG-d3 en metanol al 12,5 % ácido fórmico al 0,1 %) antes de la inyección a la Lc /MS/MS. La HPLC fue un Shimadzu LC-20AD con una columna Agilent Zorbax SB-C18 (3x100 mm, 3,5 |im). Las fases móviles fueron ácido fórmico al 0,005 %, acetato de amonio 0,5 mM en agua y una mezcla de metanol:agua (95:5) con acetato de amonio 0,5 mM. El caudal fue de 0,5 ml/min y la columna se mantuvo a temperatura ambiente. La espectrometría de masas se realizó usando un sistema AB Sciex API4000 usando turbopulverización de iones e ionización negativa. El ácido succínico se detectó midiendo las alturas de picos a valores m/z de 117,0 (para ácido succínico 12C), 118,0 (para ácido succínico marcado con 13C individualmente) y 119,0 (para ácido succínico doblemente marcado con 13C2).

Los resultados de este análisis se muestran en la figura 8. El vial que recibió una inyección de aire no produjo ácido succínico 13C detectable, mientras que el vial que recibió una inyección de etano 13C produjo 1,14 mg/l de ácido succínico 13C. Este resultado muestra de manera concluyente la funcionalidad de toda la ruta desde etano hasta ácido succínico. Este es el primer informe de una dihierro monooxigenasa soluble funcional en E. coli. usada en una ruta para generar un producto industrial a partir de una materia prima de hidrocarburo.

Ejemplo 23. Etano a succinato en cocultivo de E. co li

Este ejemplo describe la conversión de etano en succinato en un cultivo que contiene dos microorganismos diseñados. Un microorganismo era una cepa de E. coli. diseñada para convertir etano en etanol. El otro microorganismo era una cepa de E. coli. diseñada para convertir etanol en succinato.

Construcción de cepas de BZ55 y NH585.

La cepa BZ55 se construyó en las siguientes etapas. En primer lugar, la cepa NH283 se construyó como se describe en otra parte del presente documento. A continuación, el plásmido pBZ13 (SEQ ID NO: 15) se transformó en NH283 por electroporación. El plásmido pBZ23 (SEQ ID NO: 18) contiene la sMMO de M. capsulatus (Bath) más mutaciones a los siguientes genes: mmoX (K61S, E240N, S421T), mmoY (L67M). La cepa NH283 con el plásmido pBZ13 se transformó posteriormente con este segundo plásmido, pBZ23, por electroporación, y se seleccionó en LB suplementado con kanamicina (50 |ig/ml) y espectinomicina (100 |ig/ml).

Bioconversión de etano 13C en succinato

Se inoculó BZ55 en 2 ml de LB suplementado con espectinomicina (100 |ig/ml) y kanamicina (50 |ig/ml) y se inoculó NH585 en 2 ml de LB suplementado con carbenicilina (100 |ig/ml). Ambos cultivos se incubaron a 37°C, 280 rpm durante la noche. Después de 16 horas, se transfirió 1 ml de cultivo de BZ55 a 9 ml de LB espectinomicina kanamicina Fe(III)-citrato (50 |iM) L-cisteína (200 |iM) L-arabinosa (1 mM) y se transfirieron 200 |il de cultivo de NH585 a 10 ml de LB IPt G (1 mM). Ambos cultivos de 10 ml se incubaron a 37°C, 280 rpm durante 4 horas. Después de 4 horas, ambos cultivos se centrifugaron durante 5 min a 3 krpm. Los sedimentos se resuspendieron en 30 ml de PBS para lavarlos y centrifugarlos nuevamente. Después, el sedimento de NH585 se suspendió de nuevo en 5 ml de PBS glicerol (0,4 %) IPTG arabinosa Fe(III)-citrato L-cisteína. Esta resuspensión se usó para suspender de nuevo el sedimento de BZ55, dando como resultado una mezcla de 5 ml de las dos cepas. A partir de esta mezcla, se pipeteó 1 ml en cada uno de los dos viales y se selló con un tapón de caucho. Se usó una jeringa para inyectar 1,5 ml de aire en el espacio libre superior por encima de uno de los cultivos, mientras que se usó otra jeringa para inyectar 1,5 ml de etano marcado con 13C (Cambridge Isotope Laboratories) en el espacio libre superior por encima del otro. Ambos viales se incubaron a 37°C, 280 rpm. Después de 48 horas, se centrifugaron muestras durante 3 minutos a 16,1 krpm y el sobrenadante se retiró y se filtró. Estos filtrados se analizaron por LC/MS/MS, como se describe en el ejemplo 22 anterior. Las concentraciones (en mg/l) de succinato en la muestra inyectada con aire y la muestra inyectada con etano se comparan en la tabla 17.

Tabla 17: Comparación de la producción de succinato en cocultivo debido a la alimentación de etano 13C

La mayor cantidad de succinato 13C es evidencia de que el etano 13C se convirtió a través de las rutas metabólicas de las células en succinato 13C. Vale la pena señalar que los niveles de succinato de fondo más altos derivan del glicerol (que está ausente en el ejemplo 22), y que el aumento significativo porcentual en succinato 13C en la condición alimentada con etano 13C puede verse en relación con el pequeño cambio en la producción de succinato 12C. Este gran aumento porcentual en succinato 13C no puede provocarse por fluctuaciones de fondo, pero en cambio debe derivarse de la alimentación de etano 13C.

Ejemplo 24. Etano a productos quím icos en E. coli: etano a ácidos grasos

Este ejemplo describe una cepa de E. coli capaz de convertir etano en un producto químico.

Las cepas de E. coli descritas en el presente documento pueden combinarse para generar una única cepa de E. coli. capaz de convertir etano en un ácido graso. En principio, puede emplearse una estrategia similar para construir cepas capaces de convertir etano en otros productos químicos, que parten de una cepa que ya es capaz de elaborar un producto químico y que añaden las enzimas responsables de convertir etano en etanol y, en última instancia, en acetil-CoA.

Se conocen bien por un experto en la técnica métodos para combinar las dos cepas. En el caso más simple, los genes responsables de funciones clave, tales como la asimilación de etano, se localizan en un plásmido, que puede transformarse en la cepa de E. coli que ya comprende una ruta hacia el producto de ácido graso. Alternativamente, los genes de la ruta del producto pueden localizarse en un plásmido que puede transformarse en una cepa de E. coli que consume etano.

Otra posible realización puede estar compuesta por dos cepas de E. coli que tienen cada una los elementos genéticos integrados en el cromosoma. En este caso, los elementos genéticos individuales pueden amplificarse por PCR y transformarse en la otra cepa. Otra opción es utilizar la transducción para mover elementos genéticos entre cepas. Otra opción más es utilizar elementos genéticos móviles mediante conjugación. Otra opción más es sintetizar parte o la totalidad de un cromosoma sintético que contiene los elementos genéticos apropiados de ambas cepas e introducir el ADN en una cepa donante.

El método para cultivar una cepa que puede consumir etano y producir un ácido graso es sencillo como se expone en el presente documento. En resumen, la cepa de E. coli puede crecer en medios ricos o medio mínimo de etanol y luego transferirse a medio mínimo sin una fuente de carbono. Ese cultivo puede transferirse a un frasco tapado e inyectarse con etano en el espacio libre superior. Alternativamente, el cultivo puede hacerse crecer en un biorreactor con alimentación continua de etano mediante rociado. Los ácidos grasos pueden recogerse mediante o bien extracción con disolvente orgánico o bien centrifugación o bien sedimentación o bien una combinación de estos métodos.

Ejemplo 25. Identificación de elementos genéticos que mejoran la función de monooxigenasa

Este ejemplo describe la construcción de una célula hospedadora diseñada genéticamente en la que la expresión de genes exógenos que codifican proteínas o ARN de función desconocida en la célula hospedadora diseñada da como resultado una célula diseñada mejorada para el crecimiento en etano. Este ejemplo describe además un organismo que consume hidrocarburos naturales que se ha modificado para consumir etano a una velocidad diferente, con el fin de identificar genes o enzimas necesarios para el consumo de etano.

Pueden buscarse bibliotecas de complementación para chaperonas o socios de proteínas que faltan de la cepa hospedadora, y cuya expresión aumenta la tasa de crecimiento en etano. En este caso, las bibliotecas se construirán clonando plásmidos que contienen fragmentos de ADN genómico aleatorio de microorganismos naturales con actividad de oxidación de hidrocarburo o monooxigenasa. El ADN se aislará a partir de una o más de tales cepas, se digerirá o se cortará en fragmentos, y se clonará para dar un plásmido adecuado para la cepa hospedadora. En algunos casos, para la expresión en una cepa hospedadora de levadura, un cromosoma artificial de levadura puede ser apropiado. En algunos casos, para la expresión en una cepa hospedadora bacteriana, un cósmido, o un cromosoma artificial bacteriano puede ser apropiado. En algunos casos, el ADN genómico digerido está unido a un marcador selectivo, e integrarse directamente en un cromosoma de la célula hospedadora. Pueden medirse mejoras en la velocidad de crecimiento o la formación de producto, como se describe en el presente documento. El análisis a escala genómica puede reducir el tamaño de tales bibliotecas, y técnicas de intersección genómica pueden identificar genes comunes a organismos que expresan monooxigenasa y ausentes en el hospedador modificado diseñado (M G Kalyuzhnaya et al., Functional netagenomics of methylotrophs, 495 Methods in Enzymology 81-98, 2011).

Las bibliotecas de cepas con pérdida de función pueden usarse para identificar genes esenciales para la oxidación de etano a etanol. En este caso, puede generarse una colección de cepas con cambios genéticos aleatorios (“una biblioteca”) en un microorganismo natural que puede consumir hidrocarburos, y la reducción (o pérdida) de su capacidad para crecer en etano se usa para identificar genes clave. Estos genes pueden expresarse entonces en la célula hospedadora diseñada y someterse a prueba para mejoras en el crecimiento de la célula hospedadora usando etano como la fuente de carbono.

Un ejemplo de este tipo de biblioteca es una biblioteca de transposones. Puede generarse una gran biblioteca en un organismo que consume hidrocarburos naturales. Esta biblioteca se sembraría en placas de agar que contienen etanol y luego se replicaría en placas de agar sin etanol, pero que crecen en presencia de etano gaseoso. Los mutantes con actividad de oxidación de etano disminuida serán capaces de crecer en etanol, pero habrá disminuido la tasa de crecimiento en etano. Las mutaciones pueden identificarse usando métodos de PCR cebada arbitrariamente o mediante secuenciación de ADN usando cebadores comunes al ADN de transposón. Este método identifica elementos genéticos que se someten a prueba en nuestros etanotrofos sintéticos para mejorar el crecimiento en una fermentación alimentada con etano. Este ejemplo de mutagénesis de transposones es a modo de ejemplo y no pretende ser limitante. El método de cribado de un organismo que consume hidrocarburos mutado se aplica igualmente bien a otros métodos de mutagénesis, tales como, pero no limitados a, mutagénesis química, mutagénesis inducida por luz ultravioleta, mutagénesis dirigida, y otros. En estos casos, puede ser más útil identificar mutaciones relevantes mediante secuenciación de genoma completo.

Otro método para mejorar la función de monooxigenasa es el diseño de proteínas. Existen muchas técnicas para realizar el diseño de proteínas. En un método, se descubren mutaciones por PCR propensa a errores y se criban en cuanto a una función mejorada. Estas mutaciones se identifican mediante secuenciación de ADN y puede construirse una biblioteca de recombinación en la que las mutaciones (o bien beneficiosas o bien neutras) pueden combinarse aleatoriamente. El método de construcción de la biblioteca de recombinación puede elegirse de una gama de métodos descritos anteriormente, tal como tPCR (A Erijman et al., Transfer-PCR (TPCR): A highway for DNA cloning and protein engineering, 175 Journal of Structural Biology 171-177, 2011). La biblioteca de recombinación puede cribarse en cuanto a la función mejorada. Las enzimas más mejoradas pueden secuenciarse, y también pueden usarse como moldes para su posterior diseño.

Todos los métodos anteriores pueden aplicarse igualmente bien a los metanotrofos. Pueden construirse bibliotecas de complementación y sobreexpresión a partir del ADN genómico de metanotrofos naturales para la expresión en hospedadores heterólogos. Las bibliotecas mutagénicas de pérdida de función y las bibliotecas de transposones pueden construirse en bacterias metanotróficas para buscar elementos genéticos críticos. El diseño de proteínas de monooxigenasas para mejorar la actividad frente una gama de sustratos (por ejemplo, metano, etano, propano, butano, naftaleno, etc.) puede llevarse a cabo como se ha descrito anteriormente, siempre que pueda emplearse una técnica de medición adecuada (tal como un ensayo colorimétrico o el ensayo de alcohol descrito en otra parte en el presente documento) con un rendimiento moderado.

Ejemplo 26. Cribado de bibliotecas de ADN ambiental en cuanto a la función de etano monooxigenasa o la función de monooxigenasa mejorada

Este ejemplo describe la construcción y el cribado de bibliotecas de muestras de ADN ambiental para encontrar enzimas etano monooxigenasa funcionales o para encontrar componentes que mejoren la función de una monooxigenasa.

Como se describe en el ejemplo anterior, puede construirse una biblioteca de ADN genómico y cribar esa biblioteca en cuanto a funciones deseables. De manera similar, pueden construirse y cribarse bibliotecas de ADN ambiental. Métodos para la construcción de tales bibliotecas se describen en la bibliografía académica y en otros lugares (A Henne et al., Construction of environmental DNA libraries in Escherichia coli and screening for the presence of genes conferring utilization of 4-hydroxybutyrate, 65 Applied and Environmental Microbiology 3901-3907, 1999); (S F Brady, Construction of soil environmental DNA cosmid libraries and screening for clones that produce biologically active small molecules., 2 Nature protocols 1297-1305, 2007). En resumen, se toma una muestra ambiental de una ubicación de interés. En un caso relevante, esa ubicación puede ser un área donde se sabe que crecen microbios capaces de oxidar hidrocarburos. Luego, el ADN de toda la muestra se separa de todo lo demás y se purifica. Este ADN contiene una mezcla del ADN de muchos organismos diferentes. Este ADN ambiental extraído puede clonarse en un plásmido (a veces conocido como cósmido o fásmido) de tal manera que sea susceptible de inserción en un microorganismo transformable, tal como E. coli. Recientes avances en el protocolo de construcción de biblioteca han permitido construir bibliotecas extremadamente grandes y diversas. Estas bibliotecas pueden cribarse en una infinidad de condiciones para identificar características interesantes, después de lo cual los genes responsables pueden extraerse y estudiarse adicionalmente. En este caso particular, estas bibliotecas pueden someterse a prueba para determinar la actividad etano monooxigenasa usando los métodos de selección descritos anteriormente. Adicionalmente, puede añadirse a la cepa de cribado un plásmido o elemento genético cromosómico o una serie de elementos genéticos que expresan un complejo enzimático de oxidación de etano conocido. Entonces, la biblioteca de ADN ambiental puede cribarse en esta cepa para identificar elementos genéticos que puedan permitir o mejorar la actividad deseada, en este caso, la de una etano monooxigenasa. Un ejemplo de un elemento codificado genéticamente que podría mejorar la función puede ser una chaperona de plegamiento de proteínas (T Furuya et al., The mycobacterial binuclear iron monooxygenases require a specific chaperonin-like protein for functional expression in a heterologous host, 280 FEBS Journal 817-826, 2013) o una proteína que ayuda a ensamblar adecuadamente los centros metálicos en una metaloenzima.

Ejemplo 27. Expresión funcional de la metano monooxigenasa en C. glutamicum

Este ejemplo describe la expresión de una monooxigenasa funcional en Corynebacterium glutamicum.

Construcción del plásmido pNH238

El plásmido pBZ21 (SEQ ID NO: 17) se construyó de la siguiente manera. Se generaron dos fragmentos usando PCR para amplificar un fragmento de 6,4 kb de pBZ13 (SEQ ID NO: 15) con cebadores oBZ095 (SEQ ID NO: 74) y oBZ096 (SEQ ID NO: 75) y un segundo fragmento (6,8 kb) de pDG6 (SEQ ID NO: 22) con cebadores oBZ090 (SEQ ID NO: 76) y oBZ094 (SEQ ID NO:77). Estos fragmentos se aislaron y combinaron usando el ensamblaje de Gibson. El ADN resultante se transformó en E. coli eléctricamente competente y se seleccionaron transformantes en agar LB suplementado con espectinomicina (100 |ig/ml). Las colonias correctas se identificaron por PCR de colonias y se sometieron a prueba para confirmar la actividad monooxigenasa. Este plásmido se aisló y se usó como molde para la amplificación por Pc R con cebadores oNH600b (SEQ ID NO: 78) y oNH601s (SEQ ID n O: 79). La reacción resultante se trató con enzima de restricción DpnI para retirar el molde de plásmido. Se usó amplificación por PCR para generar un segundo fragmento de ADN, con pDG6 (SEQ ID NO: 22) como el molde, y usando cebadores oNH602b (SEQ ID NO: 80) y oNH603 (SEQ ID NO: 81). Ambos fragmentos se aislaron, ensamblaron con ensamblaje de Gibson, y se transformaron en E. coli eléctricamente competente. Se seleccionaron transformantes en placas de agar LB suplementadas con espectinomicina (100 |ig/ml) y kanamicina (50 |ig/ml). Se identificaron colonias correctas por PCR de colonias. Los plásmidos se aislaron y se transformaron en cepa de E. coli ER2925, una cepa dam- dcm-. Estas colonias se usaron para aislar ADN de pNH238 (SEQ ID NO: 46) sin metilación de dam o dcm para una transformación eficiente en C. glutamicum. La cepa de C. glutamicum NRRL B-3330 se hizo eléctricamente competente según el método de Van der Rest (Van der Rest et al., A heat shock following electroporation induces highly efficient transformaron of Corynebacterium glutamicum with xenogeneic plasmid DNA, Appl. Microbiol. Biotechnol., Vol 52(4), 1999). Se seleccionaron transformantes en placas de agar LBHIS suplementadas con kanamicina (20 |ig/ml).

Una sola colonia (denominada NH686) se inoculó en LB suplementado con sorbitol (20 mM) y kanamicina (20 |ig/ml). La cepa de control, C. glutamicum NRRL B-3330, se inoculó en LB suplementado con sorbitol (20 mM). Ambas cepas se colocaron a 30°C, agitando a 220 rpm. Después de 16 horas, se añadió 1 ml del cultivo a 9 ml de LB suplementado con sorbitol (20 mM), L-arabinosa (1 M) y FeSO4 (80 |iM). La cepa NH687 que contenía el plásmido pNH238 también se complementó con kanamicina. Estas cepas se colocaron a 30°C, 220 rpm, durante 6 horas. Los cultivos se centrifugaron después a 4 krpm durante 5 min. Los cultivos se lavaron una vez en 10 ml de PBS y se pipetearon 800 |il en un tubo de microcentrífuga y se sedimentaron. Estos sedimentos se suspendieron de nuevo en 250 |il de PBS suplementado con cumarina (11 mM), sorbitol (0,1 M), L-arabinosa (1 M) y FeSO4 (80 |iM). Todos los tubos se incubaron a 30°C, agitando a 220 rpm. Una monooxigenasa funcional hidroxilará cumarina a umbeliferona, que puede medirse por fluorescencia. Después de 42 horas, los tubos se retiraron y se centrifugaron. Se pipetearon 150 |il del sobrenadante en una placa de fondo transparente y se leyó la fluorescencia en un lector de placas. La longitud de onda de excitación fue de 360 nm y la longitud de onda de emisión fue de 460 nm. La fluorescencia de fondo del medio (que carecía de células) se restó tanto de la cepa de control como de NH687. Se encontró que la fluorescencia de NRRL B-3330 fue de 151, mientras que la fluorescencia de la cepa que expresa monooxigenasa NH687 fue de 664. Este aumento significativo en la fluorescencia demuestra la hidroxilación del sustrato por una monooxigenasa activa en NH687.

Ejemplo 28. Bioconversión de etanol a aminoácidos en C. glutamicum

Se ha mostrado que las cepas de Corynebacterium glutamicum sobreproducen glutamato (NRRL B-2784) o lisina (NRRL B-3330). Estas cepas se han sometido a prueba en nuestro laboratorio y se ha mostrado que consumen etanol como única fuente de carbono y energía. El crecimiento en un medio mínimo modificado con etanol como la única fuente de carbono puede dar como resultado la acumulación de glutamato y/o lisina a partir de estas cepas. Pueden cultivarse células en un medio rico estándar, tales como BHIS (A Vertes et al., MINIREVIEW Manipulating Corynebacteria, from Individual Genes to Chromosomes, 71 7633-7642, 2005), y luego transferirse a una formulación de medio mínimo, tal como CGXII, pero con etanol sustituido por glucosa como fuente de carbono (A Vertes et al., MINIREVIEW Manipulating Corynebacteria, from Individual Genes to Chromosomes, 71 7633-7642, 2005). En otra formulación de medios, se hicieron crecer cepas de C. glutamicum en un medio M9 modificado que contenía sales M9, MgSO42 mM, CaCh 0,2 mM, FeSO410 |iM, oligoelementos R5, 4 mg/l de biotina y un 1 % (v/v) de etanol. Las cepas se inocularon en este medio al incubarse a 30°C, agitando a 200 rpm. Después de 24 horas, las cepas crecieron hasta una DO600 de 1,5. Las células pueden separarse del caldo por centrifugación y la cantidad de glutamato o lisina producida en el caldo puede analizarse usando métodos estándar conocidos por un experto en la técnica.

Ejemplo 29. Bioconversión de etano a aminoácidos en C. glutamicum

Este ejemplo describe una cepa y un método para cultivar una cepa para producir aminoácidos a partir de una materia prima de etano en Corynebacterium glutamicum.

La cepa anterior es capaz de crecer en etanol como una fuente de carbono principal o única. Al expresar una enzima de oxidación de etano en esta cepa, puede construirse una cepa capaz de convertir etano en aminoácidos, tales como glutamato o lisina. Enzimas que pueden oxidar etano en Corynebacterium glutamicum pueden seleccionarse de la tabla 1 y expresarse a partir de plásmido(s) o de un locus cromosómico.

Esta cepa puede cultivarse en un medio rico, tales como BHIS, y luego transferirse a un frasco de suero sellada que contenía un medio mínimo sin fuente de carbono, tal como CGXII que carece de glucosa. El frasco sellado puede inyectarse con etano en el espacio libre superior por encima de los medios para proporcionar una fuente de carbono. Alternativamente, puede incluirse una cantidad limitante de etanol en el medio mínimo para acondicionar las células para el crecimiento a través de la ruta de asimilación de etanol o para proporcionar algo de carbono para el caso en el que la oxidación de etano es funcional pero no suficiente para soportar el crecimiento. Adicionalmente, la cepa puede cultivarse continuamente en un biorreactor, quimiostato, o turbidostato para mantener condiciones de crecimiento constantes.

Las cepas NH686 y NH687 pueden someterse a prueba como anteriormente con etano como materia prima, inyectado en el espacio libre superior por encima del cultivo en un frasco de suero sellado, como se describe en otra parte del presente documento.

Ejemplo 30. Expresión funcional de tolueno-4-monooxigenasa en Pichia pastoris

Las monooxigenasas descritas anteriormente pueden expresarse en levadura a partir de plásmidos o mediante integraciones cromosómicas. Las construcciones genéticas pueden ensamblarse usando promotores y terminadores estándar para dirigir la transcripción y traducción de los polipéptidos deseados. Algunos promotores a modo de ejemplo que se usan comúnmente incluyen los promotores PADH1, PTEF1, PTEF2, PGAP. Algunos terminadores a modo de ejemplo incluyen TCYC1, TTEF1, TILV5, TGAP, TAOX1. Estas construcciones genéticas pueden transformarse en las células de levadura usando métodos estándar tales como electroporación y transformación química, descritos en otra parte (J M Cregg et al., Recombinant protein expression in Pichia pastoris., 16 MOLECULAR BIOTECHNOLOGY 23-52, 2000). Pueden verificarse colonias para detectar firmas genéticas correctas usando métodos de PCR de colonias.

Un método para someter a prueba una cepa de levadura para enzimas monooxigenasas funcionales es similar al método para E. coli descrito anteriormente. En resumen, las células de levadura se cultivan en un medio rico, tales como YPD, hasta que el cultivo alcanza una DO600 igual a aproximadamente 1,5 y después se lava en medio mínimo o PBS. Para someter a prueba la cepa en cuanto a actividad con naftaleno como sustrato, como ejemplo, las células de levadura se suspenden de nuevo en 1 ml de PBS con naftaleno añadido. Después, el cultivo se incuba a 30°C, agitando a 220 rpm, durante 16 h. A continuación, el cultivo se centrifuga para separar las células y el sobrenadante y el sedimento celular se ensayan con sal Fast Blue B disuelta en agua. Si el cultivo cambia de color, entonces se ha producido 1-naftol. El cambio de color puede leerse usando un espectrofotómetro a 540 nm, y compararse con una cepa de control que no oxida naftaleno. El método para someter a prueba la oxidación de metano o etano es similar, excepto porque se omite el naftaleno, el cultivo se inocula en un frasco de suero sellado estéril y el gas metano o etano se inyecta en el espacio libre superior por encima del cultivo. El ensayo para metanol o etanol es similar al descrito en el presente documento.

En un ejemplo específico, la cepa NH393 de Pichia pastoris se construyó de la siguiente manera y se observó que oxidaba naftaleno a 1-naftol al ensayarse como anteriormente. Se diseñaron dos plásmidos para contener los seis genes de tolueno-4-monooxigenasa de Pseudomonas mendocina KR1, cada uno expresado a partir de su propio par de promotor y terminador. Estos dos plásmidos (pNH104 que expresan tmoA, tmoB, tmoC es SEQ ID NO: 29 y pNH132 que expresan tmoD, tmoE, tmoF es SEQ ID NO: 30) se construyeron clonando un vector estándar y un fragmento que se sintetizó mediante técnicas de síntesis de ADN estándar por un proveedor externo. Estos plásmidos se digirieron con la enzima de restricción BsaI y se transformaron en P. pastoris (NRRL Y-11430) usando técnicas de electroporación estándar (J. Lin-Cereghino et al., Condensed protocol for competent cell preparation and transformaron of the methylotrophic yeast Pichia pastoris, Biotechniques, vol. 38.1, págs.44-48, 2005). Los transformantes se seleccionaron en YPD suplementado con antibióticos (G418 (Geneticin) a 250 |ig/ml, nourseotricina a 25 |ig/ml). Estos se sembraron en estrías para colonias individuales en el mismo YPD medios antibióticos y se comprobaron por PCR de colonias para la integración adecuada del ADN deseado en el locus apropiado. La cepa NH393 se aisló de esta manera con integraciones confirmadas del ADN que expresa la tolueno-4-monooxigenasa. Esta cepa se sometió a prueba en cuanto a oxidación de naftaleno, como se describió anteriormente. Cuando el reactivo Fast Blue B se mezcló con el sedimento celular y se mezcló, un cambio de color a púrpura acompañó solo a la cepa que expresó la monooxigenasa (NH393), pero no en la cepa de control (Y-11430). Esto indica la expresión funcional de esta dihierro monooxigenasa soluble en P. pastoris. Hasta donde se sabe, este es el primer caso de una enzima dihierro monooxigenasa soluble heteróloga que se expresa funcionalmente en una célula de levadura.

Ejemplo 31. Expresión funcional de metano monooxigenasa en Pichia pastoris

Este ejemplo describe la expresión funcional de dos monooxigenasas en la levadura metilotrófica Pichia pastoris (también conocida como Komagataella phaffii).

Construcción de plásmidos

Los plásmidos pNH166 (SEQ ID NO: 34), pNH167 (SEQ ID NO: 35), pNH172 (SEQ ID NO: 36), pNH173 (SEQ ID NO: 37) se construyeron de la siguiente manera. El ADN sintético se diseñó para expresar las seis subunidades de la monooxigenasa y las subunidades chaperoninas de groES y groEL. Los plásmidos pNH166 y pNH172 codifican la monooxigenasa de la cepa bacteriana Methylocystis sp LW5 y los plásmidos pNH167 y pNH173 codifican la monooxigenasa de la cepa bacteriana Solimonas aquatica (DSM 25927). El ADN se sintetizó a partir de un proveedor comercial (Gen9). Estas secuencias se digirieron con la enzima de restricción XhoI. Se amplificaron por PCR vectores de clonación para proporcionar secuencias en los extremos del amplicón lineal correspondiente a una secuencia homóloga en el extremo del ADN deseado que va a insertarse. La mezcla de reacción resultante se trató con la enzima de restricción DpnI para eliminar el plásmido de fondo, dejando solo el ADN amplificado. Tanto los vectores de clonación como el a Dn digerido con XhoI para la inserción se purificaron usando columnas de ADN (Zymo Research). Los insertos se ligaron a los vectores de clonación usando el ensamblaje de Gibson (New England Biolabs). La reacción de Gibson se purificó con una columna de ADN y se transformó en células de E. coli eléctricamente competentes. Se aislaron colonias individuales de la transformación y se confirmó que eran correctas por PCR de colonias. Los plásmidos resultantes contenían el inserto deseado flanqueado por secuencias que son homólogas a una región cromosómica en el hospedador (para la integración por recombinación homóloga). Adicionalmente, los plásmidos contienen un marcador de selección de antibiótico que puede usarse para aislar clones de la cepa hospedadora que han integrado con éxito el fragmento de ADN deseado en la ubicación prevista.

Construcción de cepa

La cepa MC100-3 (en la que se eliminaron ambos genes de alcohol oxidasa, impidiendo la degradación de metanol) se hizo crecer en 5 ml de medio YPD, agitando a 220 rpm y 30°C, a una DO de aproximadamente 1,5. Los plásmidos se digirieron con la enzima de restricción BsaI para generar un fragmento lineal para integración. La reacción resultante se purificó por columna de ADN, como anteriormente, y se eluyó en 10 |il. La cepa se transformó usando técnicas estándar (J. Lin-Cereghino et al., Condensed protocolo for competent cell preparation and transformaron of the methylotrophic yeast Pichia pastoris, Biotechniques, vol. 38.1, págs.. 44-48, 2005). En resumen, el cultivo se centrifugó y se lavó en sorbitol (1 M) dos veces y se concentró en 100 |il. A partir de la elución de ADN purificado, se usaron 3 |il en una cubeta de electroporación, junto con las células lavadas. Los cultivos se recuperaron a 30°C y 220 rpm durante 2 horas antes de sembrarlos en placas de agar antibiótico YPD. Para casetes de integración que contenían un gen de resistencia para noureotricina, las placas de YPD contenían noureotricina a una concentración de 25 |ig/ml. Para casetes que contenían un gen de resistencia a geneticina (G418), la concentración de G418 en las placas de YPD fue de 500 |ig/ml.

Específicamente, la cepa NH461 es MC100-3, que es Komagataella phaffii con mutaciones que inactivan ambas enzimas alcohol oxidasa tanto Aox1p como Aox2p, haciendo que esta cepa sea incapaz de degradar o consumir metanol. La cepa NH509 se construyó integrando secuencialmente los casetes de ADN de pNH172 y pNH166. Esta cepa se aisló como una sola colonia y se confirmó por PCR de colonias que había integrado los casetes de ADN deseados en las ubicaciones cromosómicas previstas. Se usó un procedimiento similar para generar la cepa NH510 a partir de pNH173 y pNH167.

Ensayo de oxidación de metano

Cepas NH461, NH509 y NH510 se analizaron en cuanto a la oxidación de metano, como se describe en el presente documento. En resumen, las cepas se inocularon por separado en 1 ml de YPD y se colocaron a 30°C y 220 rpm durante la noche. Al día siguiente, cada cepa se subcultivó usando 500 |il de cultivo en 25 ml de YPD FeSO4 (80 |iM) a 30°C y 220 rpm durante 6 horas. Los cultivos se centrifugaron a 4 krpm durante 5 min y se suspendieron de nuevo en 10 ml de solución salina tamponada con fosfato más glicerol al 0,8 % y FeSO4 (80 |iM). Estas células se pipetearon en frascos de suero, 5 ml en cada frasco, y se taparon y sellaron con tapones de caucho de butilo. Se inyectó un frasco con 60 ml de aire en el espacio libre superior usando una jeringa mientras que el otro frasco se inyectó con 60 ml de gas metano. Estos frascos sellados se incubaron en posición vertical a 30°C, 220 rpm. Después de 72 horas de incubación, los frascos se retiraron de la incubadora y se tomaron muestras de metanol. El método de detección de metanol se describió en otra parte del presente documento. Un kit disponible comercialmente que usa un ensayo enzimático genera una lectura colorimétrica que puede calibrarse usando una curva estándar de concentraciones de metanol conocidas. Este ensayo se realizó según las instrucciones del fabricante. La concentración de metanol en las muestras se calculó como se describió anteriormente, usando las muestras inyectadas con aire como controles. Usando este método, se observó que las cepas producían las siguientes concentraciones de metanol. La cepa NH509 produjo 20 |iM de metanol y NH510 produjo 55 |iM de metanol, mientras que la cepa de control NH461 casi no produjo metanol (menos de 3 |iM, dentro del ruido del ensayo).

Tabla 18: Bioconversión de metano a metanol en Pichia pastoris

La expresión funcional de la monooxigenasa se evidencia por la conversión de metano en metanol en estas cepas.

Ejemplo 32. Chaperonas de plegamiento de proteínas mejoran la función de sMMO en P. pastoris

Este ejemplo describe la mejora en la actividad monooxigenasa en P. pastoris debido a la coexpresión de una chaperona de plegamiento de proteína.

La expresión de un complejo enzimático de monooxigenasa se ha descrito en el presente documento. En resumen, las diferentes subunidades enzimáticas se expresan individualmente a partir de promotores y se siguen de terminadores. Adicionalmente, pueden expresarse otros marcos de lectura abiertos a partir de promotores y terminadores de la misma manera. Uno de tales complejos proteicos adicionales es la chaperonina de plegamiento de proteína groES/groEL bacteriana. De la misma manera que esta chaperonina ayuda en la actividad del complejo de monooxigenasa en bacterias, añadir los marcos de lectura abiertos de groES/groEL a una cepa de levadura también mejorará la funcionalidad de la monooxigenasa en una célula de levadura.

Ejemplo 33. Etanol a malato en P. pastoris

Este ejemplo describe la conversión de etanol en malato en una cepa diseñada de Pichia pastoris.

La cepa NH038 se construyó para expresar constitutivamente una ruta de piruvato a malato junto con un transportador de malato para exportar malato desde la célula. El plásmido pNH001 (SEQ ID NO: 82) se construyó con una homología de 750 pb con respecto al locus HSP82 que flanquea a cada lado de un casete del gen KanMX que proporciona resistencia al antibiótico G418/Geneticina. Fragmentos de ADN que contienen las secuencias que codifican el promotor PTEF2 de Pichia pastoris, la secuencia de codificación del transportador de malato de Schizosaccharomyces pombe, y el terminador TCYC1 de Saccharoymyces cerevisiae se amplificaron a partir de ADN genómico preparado a partir de sus respectivas cepas. Estos tres fragmentos se añadieron a la cadena principal de pNH001 usando clonación de Gibson para generar pNH010 (SEQ ID NO: 85). Por separado, se amplificaron por PCR tres fragmentos de ADN para construir un casete que contenía el promotor PGAP de Pichia pastoris, la malato deshidrogenasa (que carece de los últimos tres aminoácidos que sirven como secuencia de selección de diana de peroxisoma) de Saccharomyces cerevisiae, y el terminador TGCW14 de Pichia pastoris. Estos tres fragmentos se añadieron a la cadena principal de pNH001 usando clonación de Gibson para generar pNH009 (SEQ ID NO: 84). De manera similar, tres fragmentos de ADN se amplificaron por PCR para construir un casete que contenía el promotor PGCW14 de Pichia pastoris, la secuencia de codificación de PYC2 de Saccharomyces cerevisiae, y el terminador TAOX1 de Pichia pastoris. Estos tres fragmentos se combinaron en la cadena principal de pNH001 usando clonación de Gibson y se denominaron pNH003 (SEQ ID NO: 83). La combinación de estos casetes también se realizó usando clonación de Gibson. La cadena principal del plásmido de pNH010 (SEQ ID NO: 85) se amplificó y un inserto hecho mediante amplificación pNH009 (que contenía el fragmento PGAP-MDH3( □ SKL)-TGCW14 deseado). El plásmido posterior, pNH011 (SEQ ID NO: 86), después se digirió con la enzima de restricción NotI. El fragmento de ADN que codifica PGCW14-PYC2-TAOX1 se amplificó a partir de pNH003 y Gibson se clonó en la cadena principal digerida con NotI pNH011. El plásmido resultante, pNH014 (SEQ ID NO: 57), contenía los tres casetes para expresar los tres genes en Pichia pastoris: PYC2, MDH3(ASKL) y MAE1. Estos tres genes convierten el piruvato en oxaloacetato y luego en malato antes de exportarlo de la célula. Este plásmido se digirió con BsaI para linealizar el fragmento que contenía la homología de 750 pb con el locus HSP82 que rodea los tres casetes de expresión génica y un marcador KanMX. La cepa Y-11430 (Pichia pastoris) se transformó usando métodos estándar y las células recuperadas se sembraron en placas en YPD Geneticina (250 |ig/ml) durante 2 días. Las colonias se verificaron por PCR para contener el ADN deseado en el locus deseado. Se seleccionó una única colonia de los transformantes para la fermentación y se denominó NH038.

La cepa NH038 se fermentó usando un medio mínimo que contenía etanol como única fuente de carbono. Primero, la cepa se hizo crecer hasta la fase estacionaria durante la noche en 1 ml de medio YPD agitando a 200 rpm a 30°C. A partir de este cultivo nocturno, se subcultivaron 20 |il en 1 ml de medio mínimo tamponado que contenía etanol (13,4 g/l de YNB metales (Biobasic), KH2PO4100 mM pH 6,0, biotina al 0,00004 %, etanol al 2 %). El cultivo se colocó a 30°C, 200 rpm de agitación. Después de 44 horas, el cultivo se centrifugó a 16,1 krpm durante 2 min y se tomaron muestras del sobrenadante para análisis por HPLC. El análisis por HPLC se realizó como se describió anteriormente (ejemplo 21), excepto porque se generó una curva estándar de muestras de malato (en lugar de succinato) a partir de ácido málico purificado disponible comercialmente (Sigma Aldrich). El análisis por HPLC detectó 90 mg/l de ácido málico en la muestra. La misma cepa se cultivó en medio mínimo tamponado que contenía glucosa y el análisis por HPLC detectó 440 mg/l, mientras que en medios que no contenían fuente de carbono añadida, el cultivo no pudo crecer.

Ejemplo 34. Etanol a proteína secretada en P. pastoris

Pichia pastoris ha sido durante mucho tiempo un organismo modelo para la producción de proteínas secretadas para una variedad de aplicaciones, incluyendo agentes terapéuticos. P. pastoris tiene la capacidad de crecer en etanol, como se demuestra en nuestro laboratorio. Las cepas de P. pastoris capaces de producir proteínas pueden crecer en etanol como única fuente de carbono y las proteínas pueden separarse de las células y los medios para aplicaciones relevantes. Las construcciones genéticas para proteínas secretadas se comprenden bien, donde la secuencia de ADN que codifica la proteína de interés se adjunta a una señal de secreción. Una señal de secreción común es la del péptido de factor alfa. Una cepa de P. pastoris puede construirse clonando primero el gen de factor alfa fusionado a otro gen de interés (la proteína que va a secretarse). Esta construcción puede usarse para modificar el genoma de P. pastoris por técnicas de transformación de eléctricamente competentes descritas en otra parte (J L Cereghino & J M Cregg, Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris., 24 FEMS microbiology reviews 45-66, 2000). Los transformantes se seleccionan usando selecciones de antibióticos, tales como zeocina, nourseotricina, o G418. Las colonias se purifican mediante siembra en estrías en placas de agar de medios ricos que contienen el antibiótico, y la construcción genética correcta se confirma mediante amplificación por PCR de colonias y secuenciación. Estas cepas pueden cultivarse en medio mínimo que contiene etanol como la fuente principal o única de carbono y energía. Una de tales formulaciones de medios contiene base de nitrógeno de levadura (disponible comercialmente de muchas fuentes, tales como Difco o Sigma Aldrich), biotina (concentración final de 0,4 mg/l), y etanol (concentración final del 1 % v/v). En una formulación alternativa, puede añadirse un tampón para estabilizar el pH, tal como KH2PO4 (pH 6,0) a una concentración final de 100 mM. La cepa Y-11430 se inoculó en medios YPD y se incubó a 30°C, agitando a 200 rpm. Después de 16 horas, se transfirieron 10 |il de este cultivo a 2 ml del medio mínimo tamponado con etanol al 1 %, descrito anteriormente. Después de 24 horas, este cultivo había crecido hasta una DO600 de 2,0.

Ejemplo 35. El crecim iento aeróbico mejorado en etanol como fuente de carbono principal o única en S. cerevisiae

El crecimiento de S. cerevisiae en etanol como única fuente de carbono también es posible usando una ruta enzimática que convierte etanol en acetil-CoA, a través de acetaldehído. De manera análoga a los métodos descritos anteriormente para E. coli, la expresión y regulación de las enzimas en esta ruta puede alterarse sintéticamente usando estrategias dirigidas o aleatorias. Las bibliotecas de variantes genéticas pueden someterse a ensayo en una competición de crecimiento de la misma manera, usando medios apropiados y condiciones de crecimiento para la levadura S. cerevisiae. Por ejemplo, la expresión y regulación del gen de levadura ADH2 puede alterarse para aumentar la tasa de crecimiento en etanol como una fuente de carbono principal o única. ADH2 es el gen que codifica la alcohol deshidrogenasa que es responsable de la conversión de etanol en acetaldehído. Del mismo modo, los genes ALD4 y ALD6 son necesarios para la conversión de acetaldehído en acetato y se activan durante el crecimiento en etanol. Alterar la expresión de cualquiera o todos estos puede mejorar el crecimiento en medio mínimo de etanol. Además, como se describió anteriormente, estrategias aleatorias, tal como mutagénesis química, también puede mejorar el crecimiento en medio de etanol y puede utilizarse para identificar genes para mejoras adicionales.

Ejemplo 36. Etanotrofo sintético en levadura

Varias cepas de levadura, que incluyen las más comúnmente usadas Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris, son capaces de crecer en etanol en condiciones aeróbicas.

El procedimiento para convertir estas cepas en etanotrofos sintéticos es conceptualmente similar al método para convertir una cepa bacteriana, aunque difiere en algunos detalles, como se describe a continuación. Las monooxigenasas mostradas anteriormente en la tabla 1 pueden expresarse en levadura a partir de plásmidos o mediante integraciones cromosómicas. Las construcciones genéticas pueden ensamblarse usando promotores y terminadores convencionales para dirigir la transcripción y traducción de los polipéptidos deseados. Algunos promotores a modo de ejemplo que se usan comúnmente incluyen los promotores PADH1 , PTEF1, PTEF2, PGAP. Algunos terminadores a modo de ejemplo incluyen TCYC1, TTEF1, TILV5, TGAP, TAOX1. Estas construcciones genéticas pueden transformarse en las células de levadura usando métodos estándar tales como electroporación y transformación química, descritos en otra parte (J M Cregg et al., Recombinant protein expression in Pichia pastoris., 16 Molecular biotechnology 23-52, 2000). Las colonias pueden verificarse para detectar firmas genéticas correctas usando métodos de PCR de colonias.

Claims

REIVINDICACIONES

i . Un polinucleótido sintético para una enzima dihierro monooxigenasa soluble que puede expresarse en un microorganismo de interés, que comprende al menos una región codificante de monooxigenasa que codifica una enzima dihierro monooxigenasa, la al menos una región codificante de monooxigenasa unida a al menos un promotor que funcionará en el microorganismo de interés,

que comprende además al menos una región codificante de chaperona de plegamiento de proteínas que codifica al menos una chaperona de plegamiento de proteínas, la al menos una región codificante de chaperona proteica unida a al menos un promotor que funcionará en el microorganismo de interés,

en el que la al menos una chaperona de plegamiento de proteínas comprende groES/groEL.
2. El polinucleótido sintético según la reivindicación 1, en el que la enzima dihierro monooxigenasa soluble es al menos un 60% idéntica a SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 58 o SEQ ID NO: 60 o SEQ ID NO: 87 o SEQ ID NO: 89 o SEQ ID NO: 91 o SEQ ID NO: 93 o SEQ ID NO: 95 o SEQ ID NO: 97 o SEQ ID NO: 99 o SEQ ID NO: 101 o SEQ ID NO: 103 o SEQ ID NO: 105 o SEQ ID NO: 107 o SEQ ID NO: 109 o SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 113 o SEQ ID NO: 115 o SEQ ID NO: 117 o SEQ ID NO: 143 o SEQ ID NO: 145 o SEQ ID NO: 147 o SEQ ID NO: 149 o SEQ ID NO: 151 o SEQ ID NO: 153.
3. Un microorganismo sintético que comprende al menos un polinucleótido sintético exógeno según las reivindicaciones 1 o 2.
4. El microorganismo sintético según la reivindicación 3, en el que el microorganismo se selecciona del grupo que consiste en Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Bacillus methanolicus, Bacillus subtilis, y Corynebacterium glutamicum.
5. El microorganismo sintético según la reivindicación 3, en el que la enzima dihierro monooxigenasa soluble es una metano monooxigenasa o una etano monooxigenasa.
6. El microorganismo sintético según la reivindicación 3, en el que el microorganismo sintético es capaz de crecer en un sustrato de monooxigenasa como fuente de carbono única o principal.
7. El microorganismo sintético según la reivindicación 6, en el que el sustrato de monooxigenasa es etano y el microorganismo es Escherichia coli.
8. El microorganismo sintético según la reivindicación 3, en el que el microorganismo produce un producto químico.
9. El microorganismo sintético según la reivindicación 8, en el que el producto químico es metanol, etanol, propanol, butanol, o naftol.
10. Un método para producir un producto químico, que comprende cultivar el microorganismo sintético según la reivindicación 3 en condiciones de cultivo adecuadas y durante un período de tiempo suficiente para producir el producto químico.
11. El método según la reivindicación 10, en el que las condiciones de cultivo adecuadas comprenden un medio de cultivo que contiene al menos uno de metano, etano, propano, butano, o naftaleno como fuente de carbono única o como fuente principal de carbono.
12. El método según la reivindicación 10, en el que el microorganismo sintético según la reivindicación 3 se cultiva en condiciones de manera que el microorganismo sintético produce un producto químico que se convierte en un segundo producto químico por un segundo microorganismo o un segundo microorganismo sintético.