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ES2982858T3 - Dimetilamino azetidinamidas como inhibidores de JAK - Google Patents

Dimetilamino azetidinamidas como inhibidores de JAK Download PDF

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ES2982858T3
ES2982858T3 ES19769674T ES19769674T ES2982858T3 ES 2982858 T3 ES2982858 T3 ES 2982858T3 ES 19769674 T ES19769674 T ES 19769674T ES 19769674 T ES19769674 T ES 19769674T ES 2982858 T3 ES2982858 T3 ES 2982858T3
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Daniel D Long
Cameron Smith
Corbin Thompson
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Theravance Biopharma R&D IP LLC
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Theravance Biopharma R&D IP LLC
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Abstract

La invención proporciona compuestos de fórmula (I): donde las variables se definen en la especificación, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, que son útiles como inhibidores de la quinasa JAK. La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden dichos compuestos y métodos de uso de dichos compuestos para tratar enfermedades respiratorias. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Dimetilamino azetidinamidas como inhibidores de JAK
Campo de la invención
La invención se dirige a compuestos útiles como inhibidores de la quinasa JAK. La invención también se dirige a composiciones farmacéuticas que comprenden dichos compuestos y compuestos para su uso en métodos mediante el uso de dichos compuestos para tratar enfermedades respiratorias.
Estado de la técnica
El asma es una enfermedad crónica de las vías respiratorias para la que no existen prevenciones ni cura. La enfermedad se caracteriza por inflamación, fibrosis, hiperreactividad y remodelación de las vías respiratorias, todo lo cual contribuye a la limitación del flujo de aire. Se estima que 300 millones de personas en todo el mundo padecen asma y se estima que el número de personas con asma aumentará en más de 100 millones para 2025. En los Estados Unidos, el asma afecta aproximadamente del 6 % al 8 % de la población, lo que la convierte en una de las enfermedades crónicas más comunes en el país. Aunque la mayoría de los pacientes pueden lograr el control de los síntomas del asma con el uso de corticosteroides inhalados que pueden combinarse con un modificador de leucotrienos y/o un agonista beta de acción prolongada, existe un subconjunto de pacientes con asma grave cuya enfermedad no se controla con terapias convencionales. El asma persistente grave se define como una enfermedad que no se controla con altas dosis de corticosteroides inhalados. Si bien se estima que los asmáticos graves representan aproximadamente el 5 % de todos los pacientes con asma, tienen un alto riesgo de morbilidad y mortalidad y son responsables de una parte desproporcionada de la utilización de recursos sanitarios entre los asmáticos. Existe la necesidad de nuevas terapias para tratar a estos pacientes.
Las citocinas son moléculas de señalización intercelular que incluyen quimiocinas, interferones, interleucinas, linfocinas y factor de necrosis tumoral. Las citocinas son fundamentales para el crecimiento celular normal y la inmunorregulación, pero también provocan enfermedades inmunomediadas y contribuyen al crecimiento de células malignas. Se han implicado niveles elevados de muchas citocinas en la patología de la inflamación del asma. Por ejemplo, se demostró que las terapias basadas en anticuerpos dirigidos a las interleucinas (IL)-5 y 13 proporcionan beneficios clínicos en subconjuntos de pacientes con asma grave. Entre las citocinas implicadas en la inflamación del asma, muchas actúan a través de vías de señalización dependiente de la familia Janus de tirosina quinasas (JAK), que envían señales a través de la familia de factores de transcripción transductores de señales y activadores de la transcripción (STAT). Las citocinas implicadas en la inflamación del asma que envían señales a través de la vía JAK-STAT incluyen IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-11, IL-13, IL-23, IL-31, IL-27, linfopoyetina del estroma tímico (TSLP), interferón-y (IFNy) y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF).
La familia JAK comprende cuatro miembros, JAK1, JAK2, JAK3 y tirosina quinasa 2 (TYK2). La unión de la citocina a un receptor de citocina dependiente de JAK induce la dimerización del receptor, lo que da como resultado la fosforilación de residuos de tirosina en la quinasa JAK, lo que afecta la activación de JAK. Las JAK fosforiladas, a su vez, se unen y fosforilan varias proteínas STAT que se dimerizan, se internalizan en el núcleo celular y modulan directamente la transcripción genética, lo que conduce, entre otros efectos, a los efectos aguas abajo asociados con la enfermedad inflamatoria. Las JAK usualmente se asocian con receptores de citocinas en pares como homodímeros o heterodímeros. Citocinas específicas están asociadas con pares JAK específicos. Cada uno de los cuatro miembros de la familia JAK está implicado en la señalización de al menos una de las citocinas asociadas con la inflamación del asma. En consecuencia, un inhibidor químico con actividad pan contra todos los miembros de la familia JAK podría modular un amplio intervalo de vías proinflamatorias que contribuyen al asma grave.
Sin embargo, el amplio efecto antiinflamatorio de dichos inhibidores podría suprimir la función normal de las células inmunitarias, lo que potencialmente podría conducir a un mayor riesgo de infección. Se observó evidencia de un mayor riesgo de infección con el inhibidor de JAK tofacitinib, que se dosifica por vía oral para el tratamiento de la artritis reumatoide. En el asma, la inflamación se localiza en el tracto respiratorio. La inflamación de las vías respiratorias es característica de otras enfermedades respiratorias además del asma. La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), la fibrosis quística (CF), la neumonitis, las enfermedades pulmonares intersticiales (que incluye la fibrosis pulmonar idiopática), la lesión pulmonar aguda, el síndrome de dificultad respiratoria aguda, la bronquitis, el enfisema y la sarcoidosis también son enfermedades del tracto respiratorio en las que se cree que la fisiopatología está relacionada con las citocinas de señalización JAK. La administración local de un inhibidor de JAK a los pulmones mediante inhalación ofrece el potencial de ser terapéuticamente eficaz al suministrar un potente agente anticitocina directamente al sitio de acción, limitando la exposición sistémica y, por lo tanto, limitando el potencial de inmunosupresión sistémica adversa. Existe la necesidad de un inhibidor de JAK potente adecuado para administración local en los pulmones para el tratamiento de enfermedades respiratorias.
Las citocinas de señalización JAK también desempeñan un papel importante en la activación de las células T, un subtipo de células inmunitarias que es fundamental para muchos procesos inmunitarios. La activación patológica de las células T es fundamental en la etiología de múltiples enfermedades respiratorias. Las células T autorreactivas desempeñan un papel en la bronquiolitis obliterante con neumonía organizada (también denominada COS). De manera similar a<c>O<s>, la etiología de los rechazos de trasplantes de pulmón está relacionada con una activación aberrante de las células T del receptor por parte del pulmón del donante trasplantado. Los rechazos de trasplantes de pulmón pueden ocurrir temprano como disfunción primaria del injerto (PGD), neumonía organizada (OP), rechazo agudo (A<r>) o bronquiolitis linfocítica (LB) o pueden ocurrir años después del trasplante de pulmón como disfunción crónica del aloinjerto pulmonar (CLAD). La CLAD se conocía anteriormente como bronquiolitis obliterante (BO), pero ahora se considera un síndrome que puede tener diferentes manifestaciones patológicas que incluyen BO, CLAD restrictiva (rCLAD o RAS) y disfunción del aloinjerto neutrofílico. La disfunción crónica del aloinjerto de pulmón (CLAD) es un desafío importante en el tratamiento a largo plazo de los receptores de trasplantes de pulmón, ya que hace que el pulmón trasplantado pierda progresivamente su funcionalidad (Gauthier y otros,Curr. Transplant. Rep.,2016, 3(3), 185-191). La CLAD responde mal al tratamiento y, por lo tanto, existe la necesidad de compuestos efectivos capaces de prevenir o tratar esta afección. Varias citocinas dependientes de JAK tales como el IFNy y la IL-5 están reguladas positivamente en la CLAD y en el rechazo de trasplante de pulmón (Berastegui y otros,Clin. Transplant.2017, 31, e12898). Además, los niveles pulmonares elevados de quimiocinas CXCR3, tales como CXCL9 y CXCL10, que se encuentran aguas abajo de la señalización de IFN dependiente de JAK, están relacionados con peores resultados en pacientes con trasplante de pulmón (Shino y otros,PLOS One,2017, 12 (7), e0180281). Se demostró que la inhibición sistémica de JAK es efectiva en el rechazo de trasplantes de riñón (Vicenti y otros,American Journal of Transplantation,2012, 12, 2446-56). Por lo tanto, los inhibidores de JAK tienen el potencial de ser efectivos para tratar o prevenir el rechazo de trasplante de pulmón y la CLAD. Eventos de activación de células T que se describen como la base del rechazo de trasplante de pulmón también se consideran el principal impulsor de la enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) de pulmón que puede ocurrir después de los trasplantes de células madre hematopoyéticas. Al igual que la CLAD, la GVH<d>de pulmón es una afección crónica progresiva con resultados extremadamente pobres y actualmente no hay tratamientos aprobados. Un estudio retrospectivo multicéntrico de 95 pacientes con GVHD aguda o crónica resistente a los esteroides que recibieron el inhibidor de JAK sistémico ruxolitinib como terapia de rescate demostró una respuesta completa o parcial al ruxolitinib en la mayoría de los pacientes, incluidos aquellos con GVHD de pulmón (Zeiser y otros,Leukemia,2015, 29, 10 , 2062-68). Como la inhibición sistémica de<j>A<k>se asocia con eventos adversos graves y un pequeño índice terapéutico, continúa la necesidad de un inhibidor de JAK no sistémico, dirigido a los pulmones, para prevenir y/o tratar el rechazo de trasplante de pulmón o la GVHD de pulmón.
Resumen de la invención
En un aspecto, la invención proporciona nuevos compuestos que tienen actividad como inhibidores de la quinasa JAK. Cualquier referencia a métodos de tratamiento en los párrafos siguientes de esta descripción se debe interpretar como referencia a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para el uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para el diagnóstico).
En consecuencia, la invención proporciona un compuesto de fórmula (I):
en donde:
n es 0, 1 o 2;
R1 es alquilo C1-3; y
cada R2 es independientemente alquilo C1-3;
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable.
La invención también proporciona compuestos para usar en un método para tratar enfermedades respiratorias, en particular, asma y la CLAD, en un mamífero, el método comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto o de una composición farmacéutica de la invención.
La invención también proporciona un compuesto de la invención como se describe en la presente descripción para usar en la terapia médica, así como también el uso de un compuesto de la invención en la fabricación de una formulación o medicamento para tratar enfermedades respiratorias en un mamífero.
Descripción detallada de la invención
En un aspecto, la invención proporciona compuestos que tienen actividad como inhibidor de la quinasa JAK. En consecuencia, la invención proporciona un compuesto de fórmula (I):
en donde:
n es 0, 1 o 2;
R1 es alquilo C1-3; y
cada R2 es independientemente alquilo C1-3;
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En algunas modalidades, el compuesto tiene la fórmula (II):
En algunas modalidades, el compuesto tiene la fórmula (III):
En algunas modalidades, R1 se selecciona del grupo que consiste en etilo, propilo e isopropilo. En algunas modalidades, n es 0. En algunas modalidades, n n es 1. En algunas modalidades, n es 1 y R2 es metilo.
En otra modalidad, la invención proporciona un compuesto de fórmula 1:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otra modalidad, la invención proporciona un compuesto de fórmula 1:
En otra modalidad, la invención proporciona un compuesto de fórmula 2
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otra modalidad, la invención proporciona un compuesto de fórmula 3
En otra modalidad, la invención proporciona un compuesto de fórmula 4
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otra modalidad, la invención proporciona un compuesto de fórmula 4
En otra modalidad, la invención proporciona un compuesto de fórmula 5
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otra modalidad, la invención proporciona un compuesto de fórmula 5
En otra modalidad, la invención proporciona un compuesto de fórmula 6
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otra modalidad, la invención proporciona un compuesto de fórmula 6
Las estructuras químicas se denominan en la presente descripción de acuerdo con las convenciones de la IUPAC implementadas en el software ChemDraw (PerkinElmer, Inc., Cambridge, MA). El compuesto 1 se designa como (S)-(3-(dimetilamino)azetidin-1 -il)(2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)- 1H-indazol-3-il)-5-isopropil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-il)metanona.
Además, la porción imidazo del resto tetrahidroimidazopiridina existe en formas tautoméricas, que se ilustran más abajo para un fragmento de los compuestos de la invención.
De acuerdo con la convención de la IUPAC, estas representaciones dan lugar a numeraciones diferentes de los átomos de la porción de imidazol: (1H-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro- 1 H-imidazo[4,5-c]piridina (estructura A) frente a (1H-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridina (estructura B). Se debe entender que aunque las estructuras se muestran o nombran de una forma particular, la invención también incluye el tautómero de las mismas.
Los compuestos de la invención pueden contener uno o más centros quirales y, por lo tanto, dichos compuestos (y sus intermediarios) pueden existir como mezclas racémicas; estereoisómeros puros (es decir, enantiómeros o diastereómeros); mezclas enriquecidas de estereoisómeros y similares. Los compuestos quirales que se muestran o nombran en la presente descripción sin una estereoquímica definida en un centro quiral pretenden incluir cualquiera o todas las posibles variaciones de estereoisómeros en el estereocentro indefinido a menos que se indique de otra forma. La representación o denominación de un estereoisómero particular significa que el estereocentro indicado tiene la estereoquímica designada en el entendido de que también pueden estar presentes cantidades menores de otros estereoisómeros a menos que se indique de otra forma, siempre y cuando la utilidad del compuesto que se representa o se nombra no se elimine por la presencia de otro estereoisómero.
Los compuestos de la invención también pueden contener varios grupos básicos (por ejemplo, grupos amino) y, por lo tanto, dichos compuestos pueden existir como base libre o en diversas formas de sal, tales como una forma de sal monoprotonada, una forma de sal diprotonada, una forma de sal triprotonada, o mezclas de las mismas. Todas estas formas se incluyen dentro del alcance de esta invención, a menos que se indique de otra forma.
Esta invención también incluye compuestos de fórmula (I), (II) y (III) marcados isotópicamente, es decir, compuestos de fórmula (I), (II) y (III) en los que uno o más átomos han sido reemplazados o enriquecidos con un átomo que tiene el mismo número atómico pero una masa atómica diferente de la masa atómica que predomina en la naturaleza. Ejemplos de isótopos que pueden incorporarse en un compuesto de fórmula (I), (II) y (III) incluyen, pero no se limita a, 2H, 3H, 11C, 13C, 14C, 13N, 15N, 15O, 17O, y 18O. Son de particular interés los compuestos de fórmula (I), (II) y (III) enriquecidos en tritio o carbono-14, cuyos compuestos pueden usarse, por ejemplo, en estudios de distribución en tejidos. También son de particular interés los compuestos de fórmula (I), (II) y (III) enriquecidos en deuterio, especialmente en un sitio del metabolismo, cuyos compuestos se espera que tengan una mayor estabilidad metabólica. Adicionalmente, son de particular interés los compuestos de fórmula (I), (II) y (III) enriquecidos en un isótopo emisor de positrones, tal como 11C, 15O y 13N, cuyos compuestos pueden usarse, por ejemplo, en estudios de tomografía por emisión de positrones (PET).
Definiciones
Cuando se describe esta invención que incluye sus diversos aspectos y modalidades, los siguientes términos tienen los siguientes significados, a menos que se indique de otra forma.
El término "alquilo" significa un grupo hidrocarburo saturado monovalente que puede ser lineal o ramificado o sus combinaciones. A menos que se defina de cualquier otra manera, dichos grupos alquilo contienen típicamente de 1 a 10 átomos de carbono. Los grupos alquilo representativos incluyen, a manera de ejemplo, metilo (Me), etilo (Et), npropilo (n-Pr) o (nPr), isopropilo (i-Pr) o (iPr), n-butilo (n- Bu) o (nBu), sec-butilo, isobutilo, terc-butilo (t-Bu) o (tBu), npentilo, n-hexilo, 2,2-dimetilpropilo, 2-metilbutilo, 3-metilbutilo, 2-etilbutilo, 2,2-dimetilpentilo, 2-propilpentilo y similares.
Cuando se refiere a un número específico de átomos de carbono para un término particular, el número de átomos de carbono se muestra antes del término. Por ejemplo, el término "alquilo C1-3 " significa un grupo alquilo que tiene de 1 a 3 átomos de carbono, en donde los átomos de carbono están en cualquier configuración químicamente aceptable, que incluye configuraciones lineales o ramificadas.
El término "cicloalquilo" significa un grupo carbocíclico saturado monovalente que puede ser monocíclico o multicíclico. A menos que se defina de cualquier otra manera, dichos grupos cicloalquilo contienen típicamente de 3 a 10 átomos de carbono. Los grupos cicloalquilo representativos incluyen, a manera de ejemplo, ciclopropilo (cPr), ciclobutilo (cBu), ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, ciclooctilo, adamantilo, y similares.
El término "heterociclilo", "heterociclo", "heterocíclico" o "anillo heterocíclico" significa un grupo no aromático cíclico monovalente, saturado o parcialmente insaturado, que tiene de 3 a 10 átomos totales en el anillo, en donde el anillo contiene de 2 a 9 átomos de carbono en el anillo y de 1 a 4 heteroátomos en el anillo que se seleccionan de nitrógeno, oxígeno y azufre. Los grupos heterocíclicos pueden ser monocíclicos o multicíclicos (es decir, fusionados o unidos por puentes). Los grupos heterociclilo representativos incluyen, a manera de ejemplo, pirrolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, imidazolidinilo, morfolinilo, tiomorfolilo, indolin-3-ilo, 2-imidazolinilo, tetrahidropiranilo, 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-2-ilo, quinuclidinilo, 7-azanorbornanilo, nortropanilo y similares, donde el punto de unión está en cualquier átomo de carbono o nitrógeno disponible en el anillo. Cuando el contexto hace evidente el punto de unión del grupo heterocíclico, dichos grupos pueden denominarse alternativamente como especies no valentes, es decir, pirrolidina, piperidina, piperazina, imidazol, tetrahidropirano, etc.
El término "halo" significa flúor, cloro, bromo o yodo.
El término "cantidad terapéuticamente efectiva" significa una cantidad suficiente para efectuar el tratamiento cuando se administra a un paciente que necesita tratamiento.
El término "tratar" o "tratamiento" significa prevenir, mejorar o suprimir la afección, enfermedad o trastorno médico que se está tratando (por ejemplo, una enfermedad respiratoria) en un paciente (particularmente un ser humano); o aliviar los síntomas de la afección, enfermedad o trastorno médico.
El término "sal farmacéuticamente aceptable" significa una sal que es aceptable para administración a un paciente o un mamífero, tal como un ser humano (por ejemplo, sales que tienen una seguridad aceptable para los mamíferos para un régimen de dosificación dado). Las sales farmacéuticamente aceptables representativas incluyen sales de ácido acético, ascórbico, bencenosulfónico, benzoico, alcanforsulfónico, cítrico, etanosulfónico, edisílico, fumárico, gentísico, glucónico, glucorónico, glutámico, hipúrico, bromhídrico, clorhídrico, isetiónico, láctico, lactobiónico, maleico, málico, mandélico, metanosulfónico, múcico, naftalenosulfónico, naftalen-1,5-disulfónico, naftalen-2,6-disulfónico, nicotínico, nítrico, orótico, pamoico, pantoténico, fosfórico, succínico, sulfúrico, tartárico, p-toluenosulfónico y xinafoico, y similares.
El término "sal del mismo' significa un compuesto que se forma cuando el hidrógeno de un ácido es reemplazado por un catión, tal como un catión metálico o un catión orgánico y similares. Por ejemplo, el catión puede ser una forma protonada de un compuesto de fórmula (I), (II) o (III), es decir, una forma donde uno o más grupos amino han sido protonados por un ácido. Típicamente, la sal es una sal farmacéuticamente aceptable, aunque esto no es necesario para las sales de compuestos intermediarios que no están destinados a la administración a un paciente.
Procedimientos sintéticos generales
Los compuestos de esta invención, y los intermediarios de los mismos, se pueden preparar de acuerdo con los siguientes métodos y procedimientos generales mediante el uso de materiales de partida y reactivos disponibles comercialmente o preparados de forma rutinaria. Los sustituyentes y variables (por ejemplo, R1, R2, n, etc.) que se usan en los siguientes esquemas tienen los mismos significados que los que se definen en otras partes en la presente descripción a menos que se indique de otra forma. Adicionalmente, pueden usarse o producir compuestos que tienen un átomo o grupo funcional ácido o básico como una sal a menos que se indique de otra forma (en algunos casos, el uso de una sal en una reacción particular requerirá la conversión de la sal en una forma que no sea sal, por ejemplo, una base libre, mediante el uso de procedimientos de rutina antes de realizar la reacción).
Aunque se puede mostrar o describir una modalidad particular de la presente invención en los siguientes procedimientos, los expertos en la técnica reconocerán que también se pueden preparar otras modalidades o aspectos de la presente invención mediante el uso de dichos procedimientos o mediante el uso de otros métodos, reactivos y materiales de partida que se conocen por los expertos en la técnica. En particular, se apreciará que los compuestos de la invención pueden prepararse mediante una variedad de rutas de proceso en las que los reactantes se combinan en diferentes órdenes para proporcionar diferentes intermediarios en la ruta hacia la producción de productos finales.
En el siguiente esquema se ilustra un método general para preparar compuestos finales de la invención.
El compuesto K-18 se hace reaccionar con una cetona o aldehido en presencia de un agente reductor para proporcionar el compuesto de fórmula K-19. Luego se hace reaccionar el compuesto K-19 con una azetidina sustituida bajo condiciones tipicas de formación de enlaces amida para dar el compuesto (I). Tipicamente, el ácido carboxilico se pone en contacto con aproximadamente entre 1 y aproximadamente 4 equivalentes de la azetidina sustituida en presencia de un exceso de base. La reacción de formación del enlace amida puede utilizar agentes de acoplamiento, tales como hexafluorofosfato de W,W,W'W-tetrametil-O-(7-azabenzotriazol-1-il)uronio (HATU) u otros agentes de acoplamiento de amida que se conocen en la técnica. Se puede añadir hidracina para eliminar subproductos no deseados. La reacción tipicamente se lleva a cabo a temperatura ambiente durante entre aproximadamente 5 minutos y aproximadamente 24 horas o hasta que la reacción se complete sustancialmente.
Composiciones Farmacéuticas
Los compuestos de la invención y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos se usan típicamente en forma de una composición farmacéutica o formulación. Estas composiciones farmacéuticas pueden administrarse ventajosamente a un paciente mediante inhalación. Además, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse mediante cualquier vía de administración aceptable que incluye, pero no se limita a, modos de administración oral, rectal, nasal, tópica (que incluye transdérmica) y parenteral.
En consecuencia, en uno de sus aspectos de composición, la invención se dirige a una composición farmacéutica que comprende un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable y un compuesto de fórmula (I), (II) o (III), donde, como se definió anteriormente, "compuesto de fórmula (I), (II) o (III)" significa un compuesto de fórmula (I), (II) o (III) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Opcionalmente, dichas composiciones farmacéuticas pueden contener otros agentes terapéuticos y/o de formulación si se desea. Cuando se analizan composiciones y usos de las mismas, el "compuesto de la invención" también puede denominarse en la presente descripción como el "agente activo". Como se usa en la presente descripción, se pretende que el término "compuesto de la invención" incluya todos los compuestos abarcados por la fórmula (I), así como también las especies que se incorporan en la fórmula (I) y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos
Las composiciones farmacéuticas de la invención típicamente contienen una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la presente invención. Los expertos en la técnica reconocerán, sin embargo, que una composición farmacéutica puede contener más que una cantidad terapéuticamente efectiva, es decir, composiciones en masa, o menos que una cantidad terapéuticamente efectiva, es decir, dosis unitarias individuales diseñadas para administración múltiple para lograr una cantidad terapéuticamente efectiva.
Típicamente, dichas composiciones farmacéuticas contendrán de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 95 % en peso del agente activo; que incluye, por ejemplo, de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 30 % en peso; y de aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 10 % en peso del agente activo.
En las composiciones farmacéuticas de la invención puede usarse cualquier portador o excipiente convencional. La elección de un portador o excipiente particular, o combinaciones de portadores o excipientes, dependerá del modo de administración que se use para tratar a un paciente particular o del tipo de afección médica o estado de la enfermedad. Con respecto a esto, la preparación de una composición farmacéutica adecuada para un modo particular de administración está dentro del alcance de los expertos en la técnica farmacéutica. Adicionalmente, los portadores o excipientes que se usan en las composiciones farmacéuticas de esta invención están disponibles comercialmente. Por medio de una ilustración adicional, las técnicas de formulación convencionales se describen en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (2000); y H.C. Ansel y otros, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7th Edition, Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (1999).
Ejemplos de materiales representativos que pueden servir como portadores farmacéuticamente aceptables incluyen pero no se limitan a, los siguientes: azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, tales como almidón de maíz y almidón de papa; celulosa, tal como celulosa microcristalina y sus derivados, tales como carboximetil celulosa de sodio, etil celulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes, tales como mantequilla de cacao y ceras para supositorio; aceites, tales como aceite de cacahuate, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; glicoles, tal como propilenglicol; polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes tamponantes, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua libre de pirógenos; solución salina isotónica; solución de Ringer; alcohol etílico; soluciones tampón de fosfato; y otras sustancias compatibles no tóxicas que se emplean en composiciones farmacéuticas.
Las composiciones farmacéuticas típicamente se preparan mediante la combinación o la mezcla minuciosa e íntima del agente activo con un portador farmacéuticamente aceptable y uno o más ingredientes opcionales. A la mezcla uniformemente resultante se le puede dar forma o cargar en comprimidos, cápsulas, píldoras y similares mediante el uso de procedimientos y equipos convencionales.
En un aspecto, la composición farmacéutica es adecuada para la administración mediante inhalación. Las composiciones farmacéuticas para administración mediante inhalación se encuentran típicamente en forma de aerosol o polvo. Dichas composiciones generalmente se administran mediante el uso de dispositivos de suministro inhalador, tales como un inhalador de polvo seco (DPI), un inhalador de dosis medida (MDI), un inhalador nebulizador o un dispositivo de administración similar.
En una modalidad particular, la composición farmacéutica se administra por inhalación mediante el uso de un inhalador de polvo seco. Dichos inhaladores de polvo seco típicamente administran la composición farmacéutica como un polvo que fluye libremente y que se dispersa en la corriente de aire del paciente durante la inspiración. Para lograr una composición en polvo que fluya libremente, el agente terapéutico típicamente se formula con un excipiente adecuado tal como lactosa, almidón, manitol, dextrosa, ácido poliláctico (PLA), polilactida-co-glicólido (PLGA) o sus combinaciones. Típicamente, el agente terapéutico se microniza y se combina con un portador adecuado para formar una composición adecuada para inhalación.
Una composición farmacéutica representativa para usar en un inhalador de polvo seco comprende lactosa y un compuesto de la invención en forma micronizada. Dicha composición en polvo seco se puede preparar, por ejemplo, mediante la combinación de lactosa molida en seco con el agente terapéutico y luego mediante la mezcla en seco los componentes. Después, la composición típicamente se carga en un dispensador de polvo seco, o en cartuchos o cápsulas de inhalación para usar con un dispositivo de suministro de polvo seco.
En la técnica se describen dispositivos de suministro inhalador de polvo seco adecuados para administrar agentes terapéuticos mediante inhalación y hay ejemplos de dichos dispositivos disponibles comercialmente. Por ejemplo, los dispositivos de suministro inhalador o productos representativos incluyen Aeolizer (Novartis); Airmax (IVAX); ClickHaler (Innovata Biomed); Diskhaler (GlaxoSmithKline); Diskus/Accuhaler (GlaxoSmithKline); Ellipta (GlaxoSmithKline); Easyhaler (Orion Pharma); Eclipse (Aventis); Tapas de flujo (Hovione); Handihaler (Boehringer Ingelheim); Pulvinal (Chiesi); Rotahaler (GlaxoSmithKline); SkyeHaler/Certihaler (SkyePharma); Twisthaler (Schering-Plough); Turbuhaler (AstraZeneca); Ultrahaler (Aventis); y similares.
En otra modalidad particular, la composición farmacéutica se administra por inhalación mediante el uso de un inhalador de dosis medida. Dichos inhaladores de dosis medidas típicamente descargan una cantidad medida de un agente terapéutico mediante el uso de un gas propulsor comprimido. En consecuencia, las composiciones farmacéuticas que se administran mediante el uso de un inhalador de dosis medida típicamente comprenden una solución o suspensión del agente terapéutico en un propulsor licuado. Se puede emplear cualquier propulsor licuado adecuado, que incluye hidrofluoroalcanos (HFA), tales como 1,1,1,2-tetrafluoroetano (HFA 134a) y 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoro-n-propano, (h Fa 227); y clorofluorocarbonos, tales como CCbF.
En una modalidad particular, el propulsor es hidrofluoroalcanos. En algunas modalidades, la formulación de hidrofluoroalcano contiene un cosolvente, tal como etanol o pentano, y/o un surfactante, tal como trioleato de sorbitán, ácido oleico, lecitina y glicerina.
Una composición farmacéutica representativa para usar en un inhalador de dosis medida comprende de aproximadamente 0,01 % a aproximadamente 5 % en peso de un compuesto de la invención; de aproximadamente 0 % a aproximadamente 20 % en peso de etanol; y de aproximadamente 0 % a aproximadamente 5 % en peso de surfactante; y el resto es un propulsor HFA. Dichas composiciones típicamente se preparan mediante la adición de hidrofluoroalcano enfriado o presurizado a un recipiente adecuado que contiene el agente terapéutico, etanol (si está presente) y el surfactante (si está presente). Para preparar una suspensión, el agente terapéutico se microniza y luego se combina con el propulsor. Luego, la composición se carga en un bote de aerosol, que típicamente forma una porción de un dispositivo inhalador de dosis medida.
En la técnica se describen dispositivos inhaladores de dosis medida adecuados para administrar agentes terapéuticos por inhalación y ejemplos de dichos dispositivos están disponibles comercialmente. Por ejemplo, los dispositivos inhaladores de dosis medida productos representativos incluyen sistema inhalador AeroBid (Forest Pharmaceuticals); aerosol para inhalación Atrovent (Boehringer Ingelheim); Flovent (GlaxoSmithKline); inhalador Maxair (3M); inhalador Proventil (Schering); aerosol para inhalación Serevent (GlaxoSmithKline); y similares.
En otro aspecto particular, la composición farmacéutica se administra por inhalación mediante el uso de un inhalador nebulizador. Dichos dispositivos nebulizadores típicamente producen una corriente de aire a alta velocidad que hace que la composición farmacéutica se rocíe en forma de niebla que se transporta al tracto respiratorio del paciente. En consecuencia, cuando se formula para usar en un inhalador nebulizador, el agente terapéutico se puede disolver en un portador adecuado para formar una solución. Alternativamente, el agente terapéutico se puede micronizar o nanomoler y combinar con un portador adecuado para formar una suspensión.
Una composición farmacéutica representativa para usar en un inhalador nebulizador comprende una solución o suspensión que comprende de aproximadamente 0,05 pg/ml a aproximadamente 20 mg/ml de un compuesto de la invención y excipientes compatibles con formulaciones nebulizadas. En una modalidad, la solución tiene un pH de aproximadamente 3 a aproximadamente 8.
En la técnica se describen dispositivos nebulizadores adecuados para administrar agentes terapéuticos por inhalación y ejemplos de dichos dispositivos están disponibles comercialmente. Por ejemplo, los dispositivos nebulizadores o productos representativos incluyen inhalador Respimat Softmist (Boehringer Ingelheim); el sistema de suministro pulmonar AERx (Aradigm Corp.); el nebulizador reutilizable PARI LC Plus (Pari GmbH); y similares.
En otro aspecto más, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden prepararse alternativamente en una forma de dosificación que se destina a la administración oral. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para administración oral pueden estar en forma de cápsulas, comprimidos, píldoras, tabletas, pastillas, grageas, polvos, gránulos; o como una solución o una suspensión en un líquido acuoso o no acuoso; o como una emulsión líquida de aceite en agua o agua en aceite; o como un elixir o jarabe; y similares; cada uno de los cuales contiene una cantidad predeterminada de un compuesto de la presente invención como ingrediente activo.
Cuando están destinadas a la administración oral en una forma de dosificación sólida, las composiciones farmacéuticas de la invención típicamente comprenderán el agente activo y uno o más portadores farmacéuticamente aceptables, tales como citrato de sodio o fosfato dicálcico. Opcionalmente o alternativamente, dichas formas de dosificación sólidas también pueden comprender: rellenos o extensores, aglutinantes, humectantes, agentes retardadores de soluciones, aceleradores de absorción, agentes humectantes, absorbentes, lubricantes, agentes colorantes y agentes tamponantes. En las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden estar presentes agentes de liberación, agentes humectantes, agentes de recubrimiento, agentes edulcorantes, saborizantes y perfumantes, conservantes y antioxidantes.
Las formulaciones alternativas también pueden incluir formulaciones de liberación controlada, formas de dosificación líquidas para administración oral, parches transdérmicos y formulaciones parenterales. Los excipientes convencionales y los métodos de preparación de dichas formulaciones alternativas se describen, por ejemplo, en la referencia de Remington, supra.
Los siguientes ejemplos no limitantes ilustran composiciones farmacéuticas representativas de la presente invención.
Composición de polvo seco
Se mezcla un compuesto micronizado de fórmula (I) (1 g) con lactosa molida (25 g). Esta mezcla combinada se carga luego en blísteres individuales de un empaque tipo burbuja desprendible en una cantidad suficiente para proporcionar entre aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 4 mg del compuesto de fórmula (I) por dosis. El contenido de las burbujas se administra mediante el uso de un inhalador de polvo seco.
Composición de polvo seco
Se mezcla un compuesto micronizado de fórmula (I) (1 g) con lactosa molida (20 g) para formar una composición a granel que tiene una relación en peso de compuesto a lactosa molida de 1:20. La composición mezclada se empaca en un dispositivo de inhalación de polvo seco capaz de suministrar entre aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 4 mg del compuesto de fórmula (I) por dosis.
Composición del inhalador de dosis medida
Se dispersa un compuesto micronizado de fórmula (I) (10 g) en una solución que se prepara mediante la disolución de lecitina (0,2 g) en agua desmineralizada (200 ml). La suspensión resultante se seca por pulverización y luego se microniza para formar una composición micronizada que comprende partículas que tienen un diámetro medio inferior a aproximadamente 1,5 pm. La composición micronizada luego se carga en cartuchos para inhalador de dosis medidas que contienen 1 ,1 ,1 ,2-tetrafluoroetano presurizado en una cantidad suficiente para proporcionar de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 4 mg del compuesto de fórmula (I) por dosis cuando se administra por el inhalador de dosis medida.
Composición del nebulizador
Se disuelve un compuesto de fórmula (I) (25 mg) en una solución que contiene 1,5-2,5 equivalentes de ácido clorhídrico, seguido de la adición de hidróxido de sodio para ajustar el pH de 3,5 a 5,5 y 3 % en peso de glicerol. La solución se agita bien hasta que se disuelvan todos los componentes. La solución se administra mediante el uso de un dispositivo nebulizador que proporciona de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 4 mg del compuesto de fórmula (I) por dosis.
Utilidad
Los inhibidores de JAK de la invención se diseñaron para el tratamiento de enfermedades inflamatorias y fibróticas del tracto respiratorio. En particular, los compuestos se diseñaron para permitir el suministro de un potente agente anticitocina directamente al sitio de acción de la enfermedad respiratoria en el pulmón, limitando al mismo tiempo la exposición sistémica.
Se demostró que los compuestos de la invención son potentes inhibidores de la familia de enzimas JAK: JAK1, JAK2, JAK3 y TYK2. Además, los compuestos 1-6 demostraron una potente inhibición de las citocinas proinflamatorias y profibróticas. Se reconoció que el amplio efecto antiinflamatorio de los inhibidores de JAK podría suprimir la función normal de las células inmunitarias, lo que podría conducir a un mayor riesgo de infección. Por lo tanto, los presentes compuestos se optimizaron para limitar la absorción desde el pulmón al plasma, minimizando así el riesgo de inmunosupresión.
Como se describe en la sección experimental siguiente, la absorción y distribución de los compuestos 1-6 se perfilaron en ensayos preclínicos. Los compuestos 1-6 se probaron en ratones y mostraron una alta concentración en el tejido pulmonar 5 horas después de la dosificación y una baja absorción en plasma. Se demostró que los compuestos 1-6 inhiben un efecto de la citocina proinflamatoria IL-13 en el tejido pulmonar de ratón. Específicamente, los compuestos demostraron la inhibición de la fosforilación de STAT6 inducida por IL-13 en el tejido pulmonar, lo que proporciona evidencia del acoplamiento del objetivo JAK local en el pulmónin vivo.Este efecto se observó cuando la citocina proinflamatoria IL-13 se administró 4 horas después de la administración del compuesto de prueba, lo que proporciona evidencia adicional de una retención significativa en el pulmón.
Se demostró que los compuestos 1-6 exhiben una potente actividad inhibitoria a nivel celular y una retención significativa en el tejido pulmonar. Una extensa investigación realizada por los presentes inventores determinó que si bien es posible identificar compuestos que sean potentes a nivel celular o compuestos que muestren una retención significativa en el pulmón, es mucho más difícil descubrir compuestos que exhiban ambas características convenientes al mismo tiempo.
La actividad antiinflamatoria de los inhibidores de JAK se demostró sólidamente en modelos preclínicos de asma (Malaviya y otros,Ini. Immunopharmacol., 2010,10,829,-836; Matsunaga y otros,Biochem. and Biophys. Res. Commun.,2011,404,261-267; Kudlacz y otros,Eur. J. Pharmacol,2008,582,154-161). Las citocinas implicadas en la inflamación del asma que envían señales a través de la vía JAK-STAT incluyen IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-11, IL-13, IL-23, IL-31, IL-27, linfopoyetina del estroma tímico (TSLP), interferón-y (IFNy) y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF). En consecuencia, se espera que los compuestos de la invención sean útiles para el tratamiento de trastornos respiratorios inflamatorios, en particular, asma. La inflamación y la fibrosis del pulmón son características de otras enfermedades respiratorias además del asma, tales como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), la fibrosis quística (CF), la neumonitis, las enfermedades pulmonares intersticiales (que incluye la fibrosis pulmonar idiopática), la lesión pulmonar aguda, el síndrome de dificultad respiratoria aguda, la bronquitis, el enfisema, la bronquiolitis obliterante y la sarcoidosis. Por lo tanto, también se espera que los presentes compuestos sean útiles para el tratamiento de enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis quística, neumonitis, enfermedades pulmonares intersticiales (que incluye fibrosis pulmonar idiopática), lesión pulmonar aguda, síndrome de dificultad respiratoria aguda, bronquitis, enfisema, bronquiolitis obliterante y sarcoidosis.
Cuando se compara con su correspondiente análogo fluorado (compuesto C-1 a C-6), se demostró que los compuestos 1-6 tienen actividad JAK similar. Sin embargo, tienen la ventaja de dar lugar a un metabolismo de sulfatación significativamente menor, como se demostró en el Ensayo 5. Esto es significativo ya que el metabolismo de la sulfatación se produce en los pulmones, lo que podría provocar una rápida disminución de la exposición al compuesto original activo.
Los compuestos 1-6 de la invención demostraron inhibición de citocinas asociadas con la inflamación. Por lo tanto, es probable que los compuestos de la invención sean útiles para el tratamiento de ciertas enfermedades respiratorias específicas, como se detalla más abajo.
La inflamación eosinofílica de las vías respiratorias es un rasgo característico de las enfermedades denominadas colectivamente enfermedades pulmonares eosinofílicas (Cottin y otros,Clin. Chest. Med.,2016, 37(3), 535-56). Las enfermedades eosinofílicas se han asociado con la señalización de IL-4, IL-13 e IL-5. Las enfermedades pulmonares eosinofílicas que incluye infecciones (especialmente infecciones helmínticas), neumonitis inducida por fármacos (inducida, por ejemplo, por fármacos terapéuticos tales como antibióticos, fenitoína o 1 -triptófano), neumonitis inducida por hongos (por ejemplo, aspergilosis broncopulmonar alérgica), neumonitis por hipersensibilidad y granulomatosis eosinofílica con poliangeítis (anteriormente conocida como síndrome de Churg-Strauss). Las enfermedades pulmonares eosinofílicas de etiología desconocida incluyen neumonía eosinofílica aguda idiopática, neumonía eosinofílica crónica idiopática, síndrome hipereosinofílico y síndrome de Loffler.
Un polimorfismo en el gen IL-6 se ha asociado con niveles elevados de IL-6 y un mayor riesgo de desarrollar hipertensión arterial pulmonar (HAP) (Fang y otros,J. Am. Soc. Hypertens.,2017, 11(3), 171-177). Lo que corrobora el papel de la IL-6 en la HAP, la inhibición de la cadena del receptor de IL-6 gp130 mejoró la enfermedad en un modelo de HAP en ratas (Huang y otros,Can. J. Cardiol.,2016, 32(11), 1356.e1-1356.e10).
Citocinas tales como IFN<y>, IL-12 e IL-6 se han implicado en una variedad de enfermedades pulmonares no alérgicas tales como la sarcoidosis y la linfangioleiomiomatosis (El-Hashemite y otros,Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol,2005, 33, 227-230, y El-Hashemite y otros,Cancer Res.,2004, 64, 3436-3443). También se demostró que los compuestos de la invención inhiben la señalización de IL-6 e IFN<y>.
Las bronquiectasias y las enfermedades pulmonares infiltrativas son enfermedades asociadas con la inflamación neutrofílica crónica.
La activación patológica de las células T es fundamental en la etiología de múltiples enfermedades respiratorias. Las células T autorreactivas desempeñan un papel en la bronquiolitis obliterante con neumonía organizada (también denominada COS). De manera similar a la COS, la etiología de los rechazos de trasplantes de pulmón está relacionada con una activación aberrante de las células T del receptor por parte del pulmón del donante trasplantado. Los rechazos de trasplantes de pulmón pueden ocurrir temprano como disfunción primaria del injerto (PGD), neumonía organizada (OP), rechazo agudo (AR) o bronquiolitis linfocítica (LB) o pueden ocurrir años después del trasplante de pulmón como disfunción crónica del aloinjerto pulmonar (CLAD). La CLAD se conocía anteriormente como bronquiolitis obliterante (BO), pero ahora se considera un síndrome que puede tener diferentes manifestaciones patológicas que incluyen BO, CLAD restrictiva (rCLAD o RAS) y disfunción del aloinjerto neutrofílico. La disfunción crónica del aloinjerto de pulmón (CLAD) es un desafío importante en el tratamiento a largo plazo de los receptores de trasplantes de pulmón, ya que hace que el pulmón trasplantado pierda progresivamente su funcionalidad (Gauthier y otros, Curr Transplant Rep., 2016, 3(3), 185-191). La CLAD responde mal al tratamiento y, por lo tanto, existe la necesidad de compuestos efectivos capaces de prevenir o tratar esta afección. Varias citocinas dependientes de JAK, tales como IFN<y>y la IL-5 están reguladas positivamente en la CLAD y en el rechazo de trasplante de pulmón (Berastegui y otros,Clin. Trasplant.
2017, 31, e12898). Además, los niveles pulmonares elevados de quimiocinas CXCR3, tales como CXCL9 y CXCL10, que se encuentran aguas abajo de la señalización de IFN dependiente de JAK, están relacionados con peores resultados en pacientes con trasplante de pulmón (Shino y otros,PLOS One,2017, 12 (7), e0180281). Se demostró que la inhibición sistémica de JAK es efectiva en el rechazo de trasplantes de riñón (Vicenti y otros,American Journal of Transplantation,2012, 12, 2446-56). Por lo tanto, los inhibidores de JAK tienen el potencial de ser efectivos para tratar o prevenir el rechazo de trasplante de pulmón y la CLAD. Eventos de activación de células T que se describen como la base del rechazo de trasplante de pulmón también se consideran el principal impulsor de la enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) de pulmón que puede ocurrir después de los trasplantes de células madre hematopoyéticas. Al igual que la CLAD, la GVHD de pulmón es una afección crónica progresiva con resultados extremadamente pobres y actualmente no hay tratamientos aprobados. Un estudio retrospectivo multicéntrico de 95 pacientes con GVHD aguda o crónica resistente a los esteroides que recibieron el inhibidor de JAK sistémico ruxolitinib como terapia de rescate demostró una respuesta completa o parcial al ruxolitinib en la mayoría de los pacientes, incluidos aquellos con GVHD de pulmón (Zeiser y otros,Leukemia,2015, 29, 10, 2062-68). Como la inhibición sistémica de JAK se asocia con eventos adversos graves y un pequeño índice terapéutico, continúa la necesidad de un inhibidor de JAK no sistémico, dirigido al pulmón, inhalado, para prevenir y/o tratar el rechazo de trasplante de pulmón o la GVHD de pulmón. Los compuestos de la invención tienen las características requeridas para satisfacer esta necesidad. Más recientemente, la neumonitis inducida por inhibidores de puntos de control inmunitarios, otra enfermedad pulmonar mediada por células T, surgió con el mayor uso de inhibidores de puntos de control inmunitarios. En pacientes con cáncer tratados con estos agentes estimulantes de células T, se puede desarrollar una neumonitis fatal.
El ensayo de reacción de linfocitos mixtos es un ensayo in vitro que imita el rechazo de un trasplante. Se demostró que el compuesto 1 inhibe efectivamente la secreción de IFN<y>.
Por lo tanto, en un aspecto, la invención proporciona compuestos para usar en un método para tratar una enfermedad respiratoria en un mamífero (por ejemplo, un ser humano), el método comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o de una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y un compuesto de la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En un aspecto, la enfermedad respiratoria es asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis quística, neumonitis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), fibrosis quística (CF), neumonitis, enfermedades pulmonares intersticiales (que incluye fibrosis pulmonar idiopática), lesión pulmonar aguda, síndrome de dificultad respiratoria aguda, bronquitis, enfisema, bronquiolitis obliterante o sarcoidosis. En otro aspecto, la enfermedad respiratoria es asma o una enfermedad pulmonar obstructiva crónica.
En un aspecto, la enfermedad respiratoria es una infección pulmonar, una enfermedad eosinofílica, una infección helmíntica, hipertensión arterial pulmonar, sarcoidosis, linfangioleiomiomatosis, bronquiectasias, una enfermedad pulmonar infiltrativa, neumonitis inducida por fármacos, neumonitis inducida por hongos, aspergilosis broncopulmonar alérgica, neumonitis por hipersensibilidad, granulomatosis eosinofílica con poliangeítis, neumonía eosinofílica aguda idiopática, neumonía eosinofílica crónica idiopática, síndrome hipereosinofílico, síndrome de Loffler, bronquiolitis obliterante con neumonía organizada, rechazos agudos y crónicos de trasplantes de pulmón (que incluye PGD, OP, LB, AR y CLAD, BO, CLAD restrictivo y disfunción del aloinjerto neutrofílico), enfermedad de injerto contra huésped de pulmón, bronquiolitis obliterante con neumonía organizada, hipertensión arterial pulmonar, bronquiectasias o neumonitis inducida por inhibidores de puntos de control inmunitarios.
La invención proporciona además compuestos para usar en un método para tratar el asma en un mamífero, el método comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o de una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y un compuesto de la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Cuando se usan para tratar el asma, los compuestos de la invención típicamente se administrarán en una dosis diaria única o en dosis múltiples por día, aunque pueden usarse otras formas de administración. La cantidad del agente activo que se administra por dosis o la cantidad total que se administra por día se determinará típicamente por un médico, a la luz de las circunstancias pertinentes, que incluye la afección que se va a tratar, la vía de administración elegida, el compuesto real administrado y su actividad relativa, la edad, el peso, y la respuesta del paciente individual, la gravedad de los síntomas del paciente y similares.
La invención proporciona además compuestos para usar en un método para tratar una enfermedad respiratoria (que incluye, pero no se limita a la enfermedad que se describe en la presente descripción) en un mamífero, el método comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o de una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y un compuesto de la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Cuando se usan para tratar una enfermedad respiratoria (que incluye, pero no se limita a la enfermedad que se describe en la presente descripción), los compuestos de la invención típicamente se administrarán en una dosis diaria única o en dosis múltiples por día, aunque pueden usarse otras formas de administración. La cantidad del agente activo que se administra por dosis o la cantidad total que se administra por día se determinará típicamente por un médico, a la luz de las circunstancias pertinentes, que incluye la afección que se va a tratar, la vía de administración elegida, el compuesto real administrado y su actividad relativa, la edad, el peso, y la respuesta del paciente individual, la gravedad de los síntomas del paciente y similares.
Como inhibidores de JAK, los compuestos de la invención también pueden ser útiles para una variedad de otras enfermedades. Los compuestos pueden ser útiles para una variedad de indicaciones inflamatorias gastrointestinales que incluyen, pero no se limitan a, enfermedad inflamatoria intestinal, colitis ulcerativa (proctosigmoiditis, pancolitis, proctitis ulcerativa y colitis del lado izquierdo), enfermedad de Crohn, colitis colágena, colitis linfocítica, enfermedad de Behcet, enfermedad celíaca, colitis inducida por inhibidores de puntos de control inmunitarios, ileítis, esofagitis eosinofílica, colitis relacionada con la enfermedad de injerto contra huésped y colitis infecciosa. Colitis ulcerativa (Reimund y otros,J. Clin. Immunology,1996,16,144-150), enfermedad de Crohn (Woywodt y otros,Eur. J. Gastroenterology Hepatology,1999,11,267-276), colitis colágena (Kumawat y otros,Mol. Immunology,2013,55,355 364), colitis linfocítica (Kumawat y otros, 2013), esofagitis eosinofílica (Weinbrand-Goichberg y otros,Immunol. Res.,2013,56,249-260), colitis relacionada con la enfermedad de injerto contra huésped (Coghill y otros,Blood,2001,117,3268-3276), colitis infecciosa (Stallmach y otros,Ini. J. Colorectal Dis.,2004,19,308-315), enfermedad de Behcet (Zhou y otros,Autoimmun. Rev.,2012,11,699-704), enfermedad celíaca (de Nitto y otros,World J. Gastroenterol.,2009,15,4609-4614), colitis inducida por inhibidores de puntos de control inmunitarios (por ejemplo, colitis inducida por inhibidores de CTLA-4; (Yano y otros,J. Translation. Med.,2014,12,191), colitis inducida por inhibidores de PD-1 o PD-L1) e ileítis (Yamamoto y otros,Dig. Liver Dis.,2008,40,253-259) se caracterizan por la elevación de ciertos niveles de citocinas proinflamatorias. Como muchas citocinas proinflamatorias envían señales a través de la activación de JAK, los compuestos que se describen en esta solicitud pueden aliviar la inflamación y proporcionar alivio de los síntomas. En particular, los compuestos de la invención pueden ser útiles para la inducción y el mantenimiento de la remisión de la colitis ulcerativa y para el tratamiento de la enfermedad de Crohn, la colitis inducida por inhibidores de puntos de control inmunitarios y los efectos adversos gastrointestinales en la enfermedad de injerto contra huésped. Por lo tanto, la descripción proporciona compuestos para usar en un método para tratar una enfermedad inflamatoria gastrointestinal en un mamífero (por ejemplo, un ser humano), el método comprende administrar al mamífero un compuesto de la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y un compuesto de la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
La dermatitis atópica y otras enfermedades inflamatorias de la piel se han asociado con la elevación de citocinas proinflamatorias que dependen de la vía JAK-STAT. Por lo tanto, los compuestos de la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, pueden ser beneficiosos en una serie de afecciones dérmicas inflamatorias o pruriginosas que incluyen, pero no se limitan a, dermatitis atópica, alopecia areata, vitiligo, psoriasis, dermatomiositis, linfoma cutáneo de células T (Netchiporouk y otros,Cell Cycle2014; 73, 3331-3335) y subtipos (síndrome de Sézary, micosis fungoide, reticulosis pagetoide, piel laxa granulomatosa, papulosis linfomatoide, pitiriasis liquenoide crónica, pitiriasis liquenoide y varioliforme aguda, linfoma cutáneo de células T CD30+, linfoma cutáneo secundario de células grandes CD30+, micosis no fungoide, linfoma cutáneo de células T grandes CD30-, linfoma pleomórfico de células T, linfoma de Lennert, linfoma subcutáneo de células T, linfoma angiocéntrico, linfoma blástico de células NK), prurigo nodular, liquen plano, amiloidosis cutánea primaria localizada, penfigoide ampolloso, manifestaciones cutáneas de la enfermedad de injerto contra huésped, penfigoide, lupus discoide, granuloma anular, liquen simple crónico, prurito vulvar/escrotal/perianal, liquen escleroso, picazón de neuralgia posherpética, liquen planopilar y foliculitis decalvante. En particular, la dermatitis atópica (Bao y otros,JAK-STAT,2013,2,e24137), alopecia areata (Xing y otros,Nat. Med.2014,20,1043-1049), vitiligo (Craiglow y otros,JAMA Dermatol.2015, 757, 1110-1112), prurigo nodular (Sonkoly y otros,J. Allergy Clin. Immunol.2006,117,411-417), liquen plano (Welz-Kubiak y otros,J. Immunol. Res.2015, ID:854747), amiloidosis cutánea primaria localizada (Tanaka y otros,Br. J. Dermatol.
2009,161,1217-1224), penfigoide ampolloso (Feliciani y otros,Int. J. Immunopathol. Pharmacol.1999, 72, 55-61), y manifestaciones dérmicas de la enfermedad de injerto contra huésped (Okiyama y otros,J. Invest. Dermatol.2014,134,992-1000) se caracterizan por la elevación de ciertas citocinas que envían señales mediante la activación de JAK. En consecuencia, los compuestos de la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, pueden ser capaces de aliviar la inflamación o el prurito dérmico asociados provocados por estas citocinas. En particular, se puede esperar que los compuestos de la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, sean útiles para el tratamiento de la dermatitis atópica y otras enfermedades inflamatorias de la piel. Por lo tanto, la descripción proporciona un método para tratar una enfermedad inflamatoria de la piel en un mamífero (por ejemplo, un ser humano), el método comprende aplicar una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un portador farmacéutico a la piel del mamífero. Por ejemplo, la enfermedad inflamatoria de la piel es la dermatitis atópica.
Se ha demostrado que muchas enfermedades oculares están asociadas con elevaciones de citocinas proinflamatorias que dependen de la vía JAK-STAT. Por lo tanto, los compuestos de la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, pueden ser útiles para el tratamiento de una serie de enfermedades oculares que incluyen, pero no se limitan a, uveítis, retinopatía diabética, edema macular diabético, enfermedad del ojo seco, degeneración macular relacionada con la edad y queratoconjuntivitis atópica. En particular, la uveítis (Horai y Caspi,J. Interferon Cytokine Res.,2011,31,733-744), retinopatía diabética (Abcouwer,J. Clin. Cell. Immunol.,2013,Supl 1,1-12), edema macular diabético (Sohn y otros,American Journal of Opthamology,2011, 152, 686-694), enfermedad del ojo seco (Stevenson y otros,Arch. Ophthalmol., 2012,130,90-100) y degeneración macular relacionada con la edad (Knickelbein y otros,Ini. Ophthalmol. Clin.,2015,55(3),63-78) se caracterizan por la elevación de ciertas citocinas proinflamatorias que envían señales a través de la vía JAK-STAT. En consecuencia, los compuestos de la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, pueden aliviar la inflamación ocular asociada e invertir la progresión de la enfermedad o proporcionar alivio de los síntomas. Por lo tanto, la descripción proporciona compuestos para usar en un método para tratar una enfermedad ocular en un mamífero, el método comprende administrar una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un portador farmacéutico al ojo del mamífero. Por ejemplo, la enfermedad ocular es uveítis, retinopatía diabética, edema macular diabético, enfermedad del ojo seco, degeneración macular relacionada con la edad o queratoconjuntivitis atópica. Por ejemplo, el método comprende administrar el compuesto de la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, mediante inyección intravítrea. Los compuestos de la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, también se pueden usar en combinación con uno o más compuestos útiles para enfermedades oculares.
Los compuestos de la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, también pueden ser útiles para tratar otras enfermedades tales como otras enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias o cánceres. Los compuestos de la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, pueden ser útiles para tratar una o más de artritis, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, rechazo de trasplantes, xeroftalmia, artritis psoriásica, diabetes, diabetes insulinodependiente, enfermedad de la neurona motora, síndrome mielodisplásico, dolor, sarcopenia, caquexia, shock séptico, lupus eritematoso sistémico, leucemia, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielocítica crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda, espondilitis anquilosante, mielofibrosis, linfoma de células B, carcinoma hepatocelular, enfermedad de Hodgkins, cáncer de mama, mieloma múltiple, melanoma, linfoma no Hodgkin, cáncer de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de células claras de ovario, tumor de ovario, tumor de páncreas, policitemia vera, síndrome de Sjoegrens, sarcoma de tejidos blandos, sarcoma, esplenomegalia, linfoma de células T, y talasemia mayor.
Terapia de combinación
Los compuestos de la invención o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos pueden usarse en combinación con uno o más agentes que actúan mediante el mismo mecanismo o mediante diferentes mecanismos para tratar una enfermedad. Los diferentes agentes pueden administrarse secuencial o simultáneamente, en composiciones separadas o en la misma composición. Las clases útiles de agentes para la terapia combinada incluyen, pero no se limitan a, un agonista de los receptores adrenérgicos beta 2 , un antagonista de los receptores muscarínicos, un agonista de glucocorticoides, un antagonista del receptor 44 acoplado a proteína G, un antagonista de los leucotrienos D4, un antagonista de los receptores muscarínicos M3, un antagonista del receptor de histamina H1, un antagonista de la inmunoglobulina E, un inhibidor de la PDE 4, un antagonista de la IL-4, un antagonista del receptor muscarínico M1, un antagonista del receptor de histamina, un antagonista de la IL-13, un antagonista de la L-5, un inhibidor de la 5-lipoxigenasa, un agonista del adrenoceptor beta, un antagonista de quimiocina CCR3, un estimulador de CFTR, un modulador de inmunoglobulina, un inhibidor del ligando de interleucina 33, un inhibidor de la PDE 3, un inhibidor de la fosfoinositida-3 quinasa delta, un antagonista del tromboxano A2, un inhibidor de la elastasa, un inhibidor de la tirosina quinasa Kit, un antagonista de los leucotrienos E4, un antagonista de los leucotrienos, un antagonista de la PGD2, un inhibidor del ligando alfa del TNF, un agente aglutinante del TNF, un inhibidor de la cascada del complemento, un inhibidor del ligando de eotaxina, un inhibidor de la glutatión reductasa, un antagonista del receptor de histamina H4, un antagonista de la IL-6, un estimulador del gen de IL2, un modulador del receptor FcIIB de inmunoglobulina gamma, un ligando de interferón gamma, un inhibidor del ligando de la interleucina 13, un inhibidor de ligando de la interleucina 17, un antagonista de L-selectina, un inhibidor de la elastasa de leucocitos, un antagonista del leucotrieno C4, un inhibidor de la leucotrieno C4 sintasa, un inhibidor de amina oxidasa que contiene cobre de membrana, un inhibidor de la metaloproteasa-12, un inhibidor de la metaloproteasa-9, un modulador de alérgenos de ácaros, un modulador del receptor muscarínico, un agonista del receptor nicotínico de acetilcolina, un inhibidor del factor nuclear kappa B, un antagonista de la p-selectina, un inhibidor de la PDE 5, un antagonista del receptor de PDGF, un inhibidor de la fosfoinositida-3 quinasa gamma, un agonista de la TLR-7, un antagonista del TNF, un inhibidor de la tirosina quinasa Abl, un antagonista del receptor de acetilcolina, un inhibidor de la quitinasa ácida de mamíferos, un agonista del receptor de la ACTH, un modulador de la polimerización de actina, un antagonista del receptor de adenosina A1, un estimulador de adenilato ciclasa, un antagonista de los receptores adrenérgicos, un ligando de la hormona adrenocorticotrófica, un inhibidor de la alcohol deshidrogenasa 5, un estimulador de alfa 1 antitripsina, un inhibidor de la proteinasa alfa 1 , un modulador del receptor de andrógenos, un estimulador de la enzima convertidora de angiotensina 2, un agonista de la ANP, un inhibidor de la proteína Bcr, un antagonista de los receptores adrenérgicos beta 1 , un antagonista del receptor adrenérgico beta 2 , un modulador del receptor adrenérgico beta 2 , un modulador de la beta amiloide, un inhibidor del gen BMP10, un inhibidor del gen BMP15, un inhibidor del canal de calcio, un inhibidor de la catepsina G, un inhibidor del gen CCL26, un modulador de quimiocina CCR3, un antagonista de la quimiocina CCR4, un inhibidor de la molécula de adhesión celular, un estimulador de la chaperonina, un inhibidor de quitinasa, un antagonista del colágeno I, un inhibidor del complemento C3, un antagonista del CSF-1, un antagonista de la quimiocina CXCR2, un modulador de la cadena beta común del receptor de citocinas, un estimulador de la proteína 4 del linfocito T citotóxico, un estimulador de la desoxirribonucleasa I, un estimulador de la desoxirribonucleasa, un inhibidor de la dipeptidil peptidasa I, un inhibidor de la ADN girasa, un modulador del receptor de prostanoides DP, un antagonista de la selectina E, un inhibidor del receptor de tirosina quinasa de la familia EGFR, un modulador de la elastina, un antagonista de la endotelina ET-A, un antagonista de la endotelina ET-B, un inhibidor de la epóxido hidrolasa, un antagonista del receptor FGF3, un inhibidor de la tirosina quinasa Fyn, un inhibidor del factor de transcripción GATA 3, un modulador de la glucosilceramidasa, un modulador del receptor de glutamato, un inhibidor del ligando de GM-CSF, un estimulador de guanilato ciclasa, un inhibidor de H+ K+ ATPasa, un modulador de hemoglobina, un agonista de heparina, un inhibidor de histona desacetilasa, un estimulador de histona desacetilasa-2, un inhibidor de la HMG CoA reductasa, un inhibidor de la quinasa beta I-kappa B, un inhibidor del gen ICAM1, un antagonista de la IL-17, un modulador del receptor de la IL-17, un antagonista de la IL-23, un modulador del receptor de la IL-4, un modulador de inmunoglobulina G, un agonista de inmunoglobulina G1, un modulador de inmunoglobulina G1, un antagonista del receptor IA de Fc de inmunoglobulina épsilon, un antagonista del receptor IIB de Fc de inmunoglobulina gamma, un modulador de inmunoglobulina kappa, un sensibilizador de insulina, un ligando de interferón beta, un antagonista del receptor similar a la interleucina 1 , un inhibidor del ligando de la interleucina 18, un antagonista del receptor de la interleucina 17A, un inhibidor del ligando beta de la interleucina-1, un inhibidor del ligando de la interleucina-5, un inhibidor del ligando de la interleucina-6, un inhibidor del canal de potasio 3 dependiente de voltaje de KCNA, un inhibidor del ligando de Kit, un agonista de laminina-5, un antagonista del receptor del leucotrieno CysLT1, un antagonista del receptor del leucotrieno CysLT2, un inhibidor del gen LOXL2, un inhibidor de la tirosina quinasa Lyn, un inhibidor de la proteína MARCKS, un inhibidor de la proteína 4 asociada a NMR, un modulador de la metaloproteasa-2, un modulador de la metaloproteasa-9, un antagonista del receptor de mineralocorticoides, un antagonista del receptor muscarínico M2, un antagonista del receptor muscarínico M4, un antagonista del receptor muscarínico M5, un agonista del receptor A del péptido natriurético, un modulador del receptor de células asesinas naturales, un estimulador de la subunidad alfa 7 del receptor nicotínico de ACh, un modulador del receptor de células NK, un modulador del factor nuclear kappa B, un agonista del receptor del factor de crecimiento opioide, un inhibidor de la glicoproteína P, un antagonista del purinoceptor P2X3, un inhibidor de la quinasa MAP p38, un modulador de la peptidasa 1, un inhibidor de la fosfolipasa A2, un inhibidor de la fosfolipasa C, un inhibidor del activador del plasminógeno 1, un antagonista del receptor del factor activador de plaquetas, un agonista de la PPAR gamma, un agonista de la prostaciclina, un inhibidor de la proteína tirosina quinasa, un estimulador de inositol fosfatasa 1 del dominio SH2, un inhibidor de la transducción de señales, un inhibidor del canal de sodio, un modulador de STAT-3, un antígeno de células madre 1, un modulador de la superóxido dismutasa, un inhibidor de la glicoproteína CD28 de la superficie de las células T, un inhibidor de la glicoproteína CD8 de la superficie de las células T, un agonista del TGF beta, un antagonista del TGF beta, un inhibidor de la tromboxano sintetasa, un inhibidor del ligando de la linfoproteína del estroma tímico, un agonista de la timosina, un ligando de timosina beta 4, un agonista de la TLR-8, un agonista de la TLR-9, un estimulador del gen TLR9, un inhibidor de la topoisomerasa IV, un estimulador rápido del músculo esquelético con troponina I, un estimulador rápido del músculo esquelético con troponina T, un antagonista del receptor de la IL-1 tipo I, un modulador del receptor de TNF tipo II, un modulador de canales iónicos, un estimulador de úteroglobina y un agonista VIP.
Los agentes específicos que pueden usarse en combinación con los presentes compuestos inhibidores de JAK incluyen, pero no se limitan a, acetato de rosiptor, bromuro de umeclidinio, secukinumab, acetato de metenkefalina, acetato de tridecactida, propionato de fluticasona, sulforafano estabilizado con alfa-ciclodextrina, tezepelumab, furoato de mometasona, BI-1467335, dupilumab, aclidinio, formoterol, AZD-1419, HI-1640V, rivipansel, CMP-001, manitol, ANB-020, omalizumab, tregalizumab, Mitizax, benralizumab, golimumab, roflumilast, imatinib, REGN-3500, masitinib, apremilast, RPL- 554, actimmune, adalimumab, rupatadina, parogrelil, MK-1029, dipropionato de beclometasona, fumarato de formoterol, mogamulizumab, seratrodast, UCB-4144, nemiralisib, CK-2127107, fevipiprant, danirixin, bosentan, abatacept, EC-18, duvelisib, dociparstat, ciprofloxacina, salbutamol HFA, erdosteína, PrEP-001, nedocromil, CDX-0158, salbutamol, enobosarm, R-TPR-022, lenzilumab, furoato de fluticasona, trifenatato de vilanterol, propionato de fluticasona, salmeterol, PT-007, PRS-060, remestemcel-L, citrulina, RPC-4046, óxido nítrico, D<s>-102, gerilimzumab, actair, furoato de fluticasona, umeclidinio, vilanterol, AG-NPP709, gamunex, infliximab, ampion, acumapimod, canakinumab, INS-1007, CYP-001, sirukumab, propionato de fluticasona, mepolizumab, pitavastatina, solitromicina, etanercept, ivacaftor, anakinra, MPC-300-IV, bromuro de glicopirronio, bromuro de aclidinio, FP-025, risankizumab, glicopirronio, fumarato de formoterol, adipocell, YPL-001, bromuro de tiotropio, bromuro de glicopirronio, maleato de indacaterol, andecaliximab, olodaterol, esomeprazol, vacuna contra ácaros del polvo, vacuna contra alérgenos del polen de artemisa, vamorolona, gefapixant, revefenacina, gefitinib, ReJoin, tipelukast, bedoradrina, SCM-CGH, SHP-652, RNS-60, brodalumab, BIO-11006, bromuro de umeclidinio, trifenatato de vilanterol, bromuro de ipratropio, tralokinumab, PUR-1800, VX-561, VX-371, olopatadina, tulobuterol, fumarato de formoterol, acetónido de triamcinolona, reslizumab, xinafoato de salmeterol, propionato de fluticasona, dipropionato de beclometasona, fumarato de formoterol, bromuro de tiotropio, ligelizumab, RUTI, bertilimumab, omalizumab, bromuro de glicopirronio, SENS-111, dipropionato de beclometasona, CHF-5992, LT-4001, indacaterol, bromuro de glicopirronio, furoato de mometasona, fexofenadina, bromuro de glicopirronio, azitromicina, AZD-7594, formoterol, CHF-6001, batefenterol, OATD-01, olodaterol, CJM-112, rosiglitazona, salmeterol, setipiprant, interferón beta inhalado, AZD-8871, plecanatida, fluticasona, salmeterol, monoglicéridos del ácido eicosapentaenoico, lebrikizumab, RG-6149, QBKPN, mometasona, indacaterol, AZD-9898, piruvato de sodio, zileutón, c G-201, imidafenacina, CNTO-6785, CLBS-03, mometasona, RGN-137, procaterol, formoterol, CCI-15106, POL-6014, indacaterol, beclometasona, MV-130, GC-1112, allergovac depot, MEDI-3506, QBW-251, ZPL-389, udenafil, GSK-3772847, levocetirizina, AXP-1275, ADC-3680, timapiprant, abediterol, AZD-7594, bromuro de ipratropio, sulfato de salbutamol, tadekinig alfa, ACT-774312, dornasa alfa, iloprost, batefenterol, furoato de fluticasona, alicaforsen, ciclesonida, emeramida, arformoterol, SB-010, ozagrel, BTT-1023, dectrekumab, levalbuterol, pranlukast, ácido hialurónico, GSK-2292767, formoterol, NOV-14, lucinactant, salbutamol, prednisolona, ebastina, cipecilato de dexametasona, GSK-2586881, BI-443651, GSK-2256294, VR-179, VR-096, hdm-ASIT+, budesonida, G<s>K-2245035, VTX-1463, emedastina, dexpramipexol, levalbuterol, N-6022, fosfato sódico de dexametasona, PIN-201104, OPK-0018, TEV-48107, suplatast, BI-1060469, gemilukast, interferón gamma, dalazatida, bilastina, propionato de fluticasona, xinafoato de salmeterol, RP-3128, bromuro de bencicloquidio, reslizumab, PBF-680, antagonista de CRTH2, pranlukast, xinafoato de salmeterol, propionato de fluticasona, bromuro de tiotropio monohidratado, masilukast, RG-7990, doxofilina, abediterol, bromuro de glicopirronio, TEV-46017, ASM-024, propionato de fluticasona, bromuro de glicopirronio, xinafoato de salmeterol, salbutamol, TA-270, flunisolida, cromoglicato de sodio, epsi-gam, ZPL-521, salbutamol, aviptadil, TRN-157, zafirlukast, stempeucel, pemirolast de sodio, nadolol, propionato de fluticasona xinafoato de salmeterol, RV-1729, sulfato de salbutamol, dióxido de carbono bromuro de perfluorooctilo, APL-1, dectrekumab VAK-694, acetilsalicilato de lisina, zileutón, TR-4, terapia con células progenitoras mesenquimales derivadas del tejido adiposo alogénico humano, MEDI-9314, PL-3994, h MP-301, TD-5471, NKTT-120, pemirolast, dipropionato de beclometasona, trantinterol, alfa luminol monosódico, IMD-1041, AM-211, TBS-5, ARRY-502, seratrodast, midismasa recombinante, ASM-8, deflazacort, bambuterol, RBx-10017609, ipratropio fenoterol, fluticasona formoterol, epinastina, WIN-901X, VALERGEN-DS, OligoG-COPD-5/20, tulobuterol, oxis turbuhaler, DSP-3025, ASM-024, mizolastina, budesonida salmeterol, LH-011, AXP-E, histamina inmunoglobulina humana, YHD-001, teofilina, ambroxol erdosteína, ramatroban, montelukast, pranlukast, AG-1321001, tulobuterol, ipratropio salbutamol, tranilast, suleptanato de metilprednisolona, daropato de colforsina, repirinast y doxofilina.
También se describe en la presente descripción una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y uno o más agentes terapéuticos diferentes. El agente terapéutico puede seleccionarse de la clase de agentes que se especificaron anteriormente y de la lista de agentes específicos que se describieron anteriormente. La composición farmacéutica es adecuada para su administración a los pulmones. La composición farmacéutica es adecuada para la administración por inhalación o nebulización. Por ejemplo, la composición farmacéutica es un polvo seco o una composición líquida.
Además, la descripción proporciona un método para tratar una enfermedad o trastorno en un mamífero que comprende administrar al mamífero un compuesto de la invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y uno o más agentes terapéuticos diferentes.
Cuando se usan en terapia combinada, los agentes pueden formularse en una única composición farmacéutica, o los agentes pueden proporcionarse en composiciones separadas que se administran simultáneamente o en momentos separados, por la misma o por diferentes vías de administración. Dichas composiciones pueden empacarse por separado o pueden empacarse juntas como un kit. Los dos o más agentes terapéuticos del kit pueden administrarse por la misma vía de administración o por diferentes vías de administración.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos sintéticos y biológicos se ofrecen para ilustrar la invención y no deben interpretarse en modo alguno como limitantes del alcance de la invención. En los ejemplos más abajo, las siguientes abreviaturas tienen los siguientes significados a menos que se indique de otra forma. Las abreviaturas que no se definen más abajo tienen sus significados generalmente aceptados.
ACN = acetonitrilo
DCM = diclorometano
DIPEA= N,N-diisopropiletilamina
DMF = N,N-dimetilformamida
EtOAc = acetato de etilo
h hora(s)
HATU= Hexafluorofosfato deN, N, N', N'-tetrametil-O-(7-azabenzotriazol-1-il)uronio
IPA = alcohol isopropílico
IPAc = acetato de isopropilo
MeOH= metanol
min = minuto(s)
Pd(PPh3)4 = tetraquis(trifenilfosfina)paladio (0)
RT temperatura ambiente
TFA = ácido trifluoroacético
THF = tetrahidrofurano
, . , . 4,4,5,5,4',4',5',5'-octametilbis(pinacolato)diboro = [2,2']bi[[1,3,2]dioxaborolanilo]
Los reactivos y solventes se adquirieron de proveedores comerciales (Aldrich, Fluka, Sigma, etc.) y se usaron sin purificación adicional. El progreso de las mezclas de reacción se monitoreó mediante cromatografía en capa fina (TLC), cromatografía líquida analítica de alta resolución (HPLC anal.) y espectrometría de masas. Las mezclas de reacción se elaboraron como se describe específicamente en cada reacción; comúnmente se purificaron mediante extracción y otros métodos de purificación, como cristalización y precipitación dependiente de la temperatura y del solvente. Además, las mezclas de reacción se purificaron de forma rutinaria mediante cromatografía en columna o mediante HPLC preparativa, típicamente mediante el uso de una columna C18 o BDS empaquetaduras y eluyentes convencionales. Las condiciones típicas de HPLC preparativa se describen más abajo.
La caracterización de los productos de reacción se llevó a cabo de forma rutinaria mediante espectrometría de masa y 1H-NMR. Para el análisis de NMR, las muestras se disolvieron en un solvente deuterado (tal como CD3OD, CDCb, o cfó-DMSO), y los espectros de 1H-PMN se adquirieron con un instrumento Varian Gemini 2000 (400 MHz) en condiciones de observación estándar. La identificación espectrométrica de masas de los compuestos se realizó mediante un método de ionización por electropulverización (ESMS) con un instrumento API 150 Ex modelo Applied Biosystems (Foster City, CA) o un instrumento Waters (Milford, MA) 3100, acoplado a sistemas de autopurificación. Condiciones de la HPLC preparativa
C18, 5 pm. 21,2 x 150 mm o C18, 5 pm 21 x 250 oC14, 5
pm 21 x 150 mm
Temperatura ambiente
20,0 ml/min
A = Agua 0,05 % de TFA
B = ACN 0,05 % de TFA,
(100-1500 pl)
214 nm
Los compuestos crudos se disolvieron en agua y ácido acético 1:1 a aproximadamente 50 mg/ml. Se llevó a cabo una prueba a escala analítica de 4 minutos mediante el uso de una columna C18 de 2,1 x 50 mm seguida de una prueba a escala preparativa de 15 o 20 minutos mediante el uso de la inyección de 100 pl con el gradiente basado en el % de retención de B de la prueba de escala analítica. Los gradientes exactos fueron dependientes de la muestra. Las muestras con impurezas de corrida muy cercanas se comprobaron con una columna C18 de 21 x 250 mm y/o una columna C14 de 21 x 150 mm para obtener una mejor separación. Las fracciones que contenían el producto que se desea se identificaron mediante análisis espectrométrico de masas.
Preparación1:4-(bencNoxi)-2-etNfeml)trifluoro-A4-borano, sal de potasio I-5
(a) 1-(benciloxi)-3-etilbenceno (I-2)
A una solución agitada de 3-etilfenol (1-1) (25,0 g, 204,0 mmol) en ACN (250 ml, 10 vol) se añadió carbonato de potasio (42,0 g, 306 mmol) a temperatura ambiente. La masa de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos, seguido de la adición gota a gota de bromuro de bencilo (24,0 ml, 204 mmol). La mezcla de reacción resultante se agitó durante 6 horas a temperatura ambiente. Después de la terminación de la reacción (monitoreo por TLC), la masa de reacción resultante se vertió en agua (1,0 l) seguido de la extracción del compuesto con EtOAc (2 x 2 l). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con agua fría y solución de salmuera y se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se evaporaron a presión reducida. Luego, el producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (100-200 M) mediante el uso de eluyentes EtOAc al 2 % en hexano para obtener el producto deseado (I-2) como un compuesto oleoso de color amarillo claro (35,0 g, 81 %). 1H NMR (400 MHz, cloroformo-d) ó 7,46-7,44 (m, 2H), 7,39(t, J = 7,6 Hz, 2H), 7,34-7,31 (m, 1H), 7,21 (t, J = 7,6 Hz), 6,86-6,80 (m, 3H), 5,07 (t, 2H), 2,64 (q, J = 7,6 Hz, 2H), 1,24 (t, J = 7,6 Hz, 3H).
(b) 4-(benciloxi)-1-bromo-2-etilbenceno (I-3)
A una solución agitada enfriada con hielo de 1-(benciloxi)-3-etilbenceno (I-2) (35,0 g, 164 mmol) en ACN (525 ml, 15 vol) se añadió N-bromosuccinimida (32,0 g 181 mmol) en porciones durante un período de 15 minutos. La mezcla de reacción resultante se agitó durante 1 hora siguiente a temperatura ambiente. Después de la terminación de la reacción (monitoreo por TLC), la masa de reacción resultante se vertió en agua enfriada con hielo (1,50 l) seguido de la extracción del compuesto con EtOAc (2 x 1 l). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con agua y se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se evaporaron a presión reducida para obtener el producto crudo. Se añadió nhexano (250 ml) al material crudo, dando como resultado una suspensión, seguido de filtración a través de un embudo sinterizado. El licor madre se evaporó bajo presión reducida para obtener el producto deseado I-3 como compuesto oleoso de color amarillo claro (42,0 gramos, 87 %). 1H NMR (400 MHz, cloroformo-d) ó 7,52-7,29 (m, 7H), 6,88 (s, 1H), 6,68 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 5,04 (s, 2H), 2,69 (q, J = 7,6 Hz, 2H), 1,20(t, J = 7,5 Hz, 3H).
(c) 2-(4-(benciloxi)-2-etilfenil)-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxoborolano (I-4)
Una solución agitada de 4-(benciloxi)-1-bromo-2-etilbenceno (I-3) (42,0 g, 144 mmol), bis(pinacolato)diboro (44,0 g, 173 mmol), y acetato de potasio (28 g, 288 mmol) en dioxano (440 ml) se desgasificó mediante purga de N2 (g) durante 15 minutos seguido de la adición del complejo PdCh(dppf).DCM (11,0 g, 15 mmol). La mezcla de reacción resultante se calentó hasta 80 °C durante las siguientes 16 h. Después de la terminación de la reacción (monitoreo por TLC), la masa de reacción se filtró a través de un lecho de celite y el licor madre se evaporó bajo presión reducida para obtener el producto crudo. El residuo crudo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (100-200 M) mediante el uso de eluyentes EtOAc al 1 % en hexano para obtener el producto deseado (I-4) como compuesto oleoso de color amarillo claro (32,0 g, 66 %). 1H NMR (400 MHz, cloroformo-d) ó 7,74 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,45-7,36 (m, 5H), 6,84-6,78 (m, 2H), 5,08 (t, 2H), 2,91(q, J = 7,6 Hz), 1,33 (s, 12H), 1, 19(t, J = 7,6 Hz, 3H).
(d) (4-(benciloxi)-2-etilfenil)trifluoro-A4-borano, sal de potasio (I-5)
A una solución agitada del compuesto 2-(4-(benciloxi)-2-etilfenil)-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano (I-4) (20 gramos, 59,0 mmol), en acetona:metanol (200 ml, relación 1:1, 10 vol), se añadió una solución 3 M de fluoruro de hidrógeno de potasio (23,0 g, 295 mmol, disuelto en 98,0 ml de agua). La mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. Después de la terminación de la reacción (monitoreo por TLC), la masa de reacción resultante se evaporó bajo presión reducida. El sólido que se obtuvo se recogió en agua (100 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. La masa de reacción resultante se filtró a través de un embudo sinterizado, se lavó con n-hexano y se secó bajo presión reducida para proporcionar el producto deseado (I-5) como un sólido blanco (14,0 g, 74 %). 1H NMR (400 MHz, cloroformo-d) ó 7,43(d, J = 7,2 Hz, 2H), 7,37(t, J = 7,5 Hz, 2H), 7,30 (t, J = 7,1 Hz, 1H), 7,22 (d, J = 8,0 Hz), 6,58 (s, 1H), 6,53 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 5,00 (s, 2H), 2,65 (q, J = 7,5 Hz, 2H), 1,07(t, J=7,4 Hz, 3H).
Preparación 2: 5-(terc-butil) (S)-3-bencil-3,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5,6-dicarboxilato de 6-bencilo (I-11)
(a) Sal de clorhidrato del ácido (S)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-carboxílico (I-7)
A una suspensión agitada y enfriada con hielo de L-histidina (I-6) (5,0 kg, 32,14 mol) en agua (40 l, 8 vol.) se añadió ácido clorhídrico concentrado (3,93 l, 33,75 mol), seguido de la adición gota a gota de formaldehído (5,50 l, 67,5 mol, 37 % solución ac.). La solución resultante se agitó durante 30 minutos a la misma temperatura y luego se calentó a 80 °C durante 8 horas. El progreso de la reacción se monitoreó mediante LCMS. Se eliminó el agua bajo presión reducida para obtener el producto crudo y el crudo resultante se agitó durante 2 horas en tolueno (20 l). Se eliminaron los compuestos orgánicos bajo presión reducida para eliminar el exceso de agua y el compuesto se secó azeotrópicamente. Luego, el material resultante se recogió en éter dietílico (20 l) y se agitó durante 2 horas. Luego se filtró el material sólido y se secó al aire para obtener el producto deseado (I-7) como un sólido blanquecino (6,50 kg, 85 %). 1H NMR (400 MHz, D2O) ó 8,69 (s, 1H), 4,56 (d, J = 15,4 Hz, 1H), 4,42 (d, J = 15,5 Hz, 1H), 4,20 (dd, J = 5,5, 5,2 Hz, 1H), 3,42 (dd, J = 5,0, 17,0 Hz, 1H), 3,11 (dd, J =10,2, 16,8 Hz, 1H).
(b) Ácido (S)-3,5-bis(terc-butoxicarbonil)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4, 5-c]piridin-6-carboxílico (I-8)
A una solución agitada enfriada con hielo de diclorhidrato del ácido (S)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-carboxílico (I-7) (6,10 kg, 25,40 mol) en 1,4-dioxano (48 l, 8 vol) y agua (48 l, 8 vol) se añadió gota a gota trietilamina (12,36 l, 89 mol) seguido de la adición de dicarbonato de di-terc-butilo (18,07 l, 78,74 mol, disueltos en 5 l de 1,4-dioxano) durante un período de 30 minutos. La mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante las siguientes 16 horas. Después de la terminación de la reacción (monitoreo por TLC y LCM<s>), la mezcla de reacción amarillenta se diluyó con agua (10 l) y se lavó sucesivamente con éter dietílico (2 x 10 l) y EtOAc (2 x 7,50 l). La fase orgánica se desechó. La capa acuosa se enfrió y se llevó a pH ~3 con una solución de HCl 6 N; la fase acuosa se extrajo con EtOAc (3 x 10 l). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con solución de salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio, y se concentraron bajo presión reducida. El residuo oleoso se cristalizó en EtOAc al 30 %:hexanos para proporcionar el producto deseado (I-8) como un sólido blanquecino (5,1 kg, 55 %). (m/z): [M+H]+ calculada para C17H25N3O6368,18 encontrada 368,21.
(c) 3,5-di-terc-butil (S)-6,7-dihidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-3,5,6(4H)-tricarboxilato de 6-bencilo (I-9)
A una solución enfriada con hielo de ácido(S)-3,5-bis(terc-butoxicarbonil)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-carboxílico (I-8) (5,1 kg, 13,88 mol) en DCM (51 l, 10 vol) se añadió secuencialmente bicarbonato de sodio acuoso saturado (41,0 l, 8 vol), yoduro de tetrabutilamonio (5,13 kg, 13,88 mol) y bromuro de bencilo (2,47 l, 20,82 mol). La mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante las siguientes 16 horas. Después de la terminación de la reacción (monitoreo por TLC y LCMS), se separó la solución bifásica. La capa acuosa se extrajo con DCM (3 x 10 l). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con solución de salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron bajo presión reducida para obtener el producto crudo, que se purificó mediante cromatografía en columna a través de gel de sílice (100-200 M) mediante el uso de eluyentes EtOAc al 40 % en hexano para obtener el producto deseado (1-9) como aceite viscoso (4,50 kg, 72 %). (m/z): [M+H]+ calculada para C24H31N3O6 458,22 encontrada 458,60.
(d) 5-(terc-butil) (S)-3,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5,6-dicarboxilato de 6-bencilo (I-10)
A una solución enfriada con hielo de 3,5-di-terc-butil (S)-6,7-dihidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-3,5,6(4H)-tricarboxilato de 6-bencilo (I-9) (4,50 kg, 9,84 mol) en IPA (45 l, 10 vol) se añadió gota a gota hidróxido de amonio (36 l, 8 vol). La mezcla de reacción resultante se agitó además a temperatura ambiente durante las siguientes 16 horas. Después de la terminación de la reacción (monitoreo por TLC y LCMS), la mezcla resultante se diluyó con agua (25 l) seguido de extracción con EtOAc (3 x 20 l). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con solución de salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron bajo presión reducida para producir el producto crudo que se purificó mediante cromatografía en columna a través de gel de sílice (100-200 M) mediante el uso de eluyentes MeOH al 2 % en DCM para obtener el producto deseado (I-10) como un aceite viscoso espeso (2,70 kg, 77 %). (m/z): [M+H]+ calculada para C19H23N3O4358,17 encontrada 358,33.
(e) 5-(terc-butil) (S)-3-bencil-3,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5,6-dicarboxilato de 6-bencilo (I-11)
A una solución enfriada con hielo de 5-(terc-butil) (S)-3,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5,6-dicarboxilato de 6-bencilo (I-10) (2,70 kg, 7,55 mol) en Dc M (32,4 l, 12 vol) se añadió hidróxido de sodio acuoso 1 N (24,3 l, 9 vol) seguido de la adición secuencial de yoduro de tetrabutilamonio (2,80 kg, 7,55 mol) y bromuro de bencilo (0,99 l, 8,31 mol). La mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante las siguientes 2 horas. Después de la terminación de la reacción (monitoreo por TLC y LCMS), se separó la solución bifásica. La capa acuosa se extrajo con DCM (3 x 10 l). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con solución de salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron bajo presión reducida para producir el producto crudo que se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (100-200 M) mediante el uso de eluyentes EtOAc al 40 % en hexano para obtener el producto deseado (I-11) como un aceite viscoso (1,70 kg, 63 %). (m/z): [M+H]+ calculada para C26H29N3O4448,22 encontrada 448,20.
Preparación 3: 5-(terc-butil) (S)-3-bencil-2-(6-(4-(benciloxi)-2-etilfenil)-1 H-indazol-3-il)-3,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5,6-dicarboxilato de 6-bencilo (I-16)
(a) Cloruro de 4-bromo-2-fluorobenzoilo (I-13)
A una solución agitada enfriada con hielo de ácido 4-bromo-2-fluorobenzoico (I-12) (1,25 kg, 5,71 mol) en DCM (12,5 l, 15 vol), se añadió gota a gota cloruro de oxalilo (0,98 l, 11,42 mol). La mezcla de reacción resultante se agitó durante 10 minutos a la misma a temperatura. Luego se añadió gota a gota DMF (150 ml) a la mezcla de reacción. La masa de reacción resultante se dejó calentar hasta la temperatura ambiente y se agitó durante 2 horas. Después de la terminación de la reacción (monitoreo por TLC), se eliminó el exceso de cloruro de oxalilo bajo presión reducida en una atmósfera de nitrógeno para obtener el producto crudo (I-13) (1,08 kg, 80 %), que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional.
(b) 5-(terc-butil) (S)-3-bencil-2-(4-bromo-2-fluorobenzoil)-3,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5,6 dicarboxilato de 6-bencilo (I-14)
A una solución agitada de 5-(terc-butil) (S)-3-bencil-3,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5,6-dicarboxilato de 6-bencilo (I-11) (1,70 kg, 3,80 mol) en a Cn (13,6 l, 8 vol) se añadió trietilamina (2,11 l, 15,2 mol) seguido de la adición de cloruro de 4-bromo-2-fluorobenzoilo (I-13) (1,08 kg, 4,56 mol en 3,4 l de ACN, 2 vol) a temperatura ambiente. Después de la terminación de la adición, el color de la mezcla de reacción resultante pasó de amarillo claro a marrón. La mezcla de reacción resultante se agitó a la misma temperatura durante 30 minutos y el progreso de la reacción se monitoreó mediante TLC. La mezcla de reacción resultante se inactivó con agua enfriada con hielo (10 l), seguido de extracción con EtOAc (3 x 5 l) y las fases orgánicas combinadas se lavaron con solución de salmuera. Las fases orgánicas se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron bajo presión reducida para producir el producto crudo que se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (100-200 M) mediante el uso de eluyentes EtOAc al 20 % en hexano para obtener el producto deseado (I-14) (1,74 kg, 71 %). %). (m/z): [M+H]+ calculada para C33H31BrFN3O5648,14 encontrada 648,20.
(c) 5-(terc-butil) (S)-3-bencil-2-(6-bromo-1H-indazol-3-il)-3,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5,6-dicarboxilato de 6-bencilo (I-15)
A una solución agitada de 5-(terc-butil) (S)-3-bencil-2-(4-bromo-2-fluorobenzoil)-3,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5,6-dicarboxilato de 6-bencilo (I-14) (1,74 kg, 2,68 mol) en THF (26,0 l, 15 vol) se añadió hidrato de hidrazina (0,705 l, 13,4 mol) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción resultante se calentó a 60 °C durante 3 horas. Después de la terminación de la reacción (monitoreo por TLC), la masa de reacción resultante se vertió en agua helada (10 l) seguido de la extracción del compuesto con EtOAc (3 x 10 l). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera y se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se evaporaron bajo presión reducida para producir el producto crudo, que se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (100-200 M) mediante el uso de eluyentes EtOAc al 20 % en hexano para obtener el producto deseado (I-15) como un sólido blanquecino (1,12 kg, 65 %). (m/z): [M+H]+ calculada para C33H32BrN5O4642,16 encontrada 642,21.
(d) 5-(terc-butil) (S)-3-bencil-2-(6-(4-(benciloxi)-2-etilfenil)-1H-indazol-3-il)-3,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5,6-dicarboxilato de 6-bencilo (I-16)
Se cargó bis(pinacolato)diboro (250 g, 984 mmol) en un matraz de pared simple de 3 cuellos y 5 l previamente grabado mediante el uso de química de fluoruro, junto con propan-2-ol (1882 ml, 2,46E+04 mmol) y la mezcla se agitó hasta su total disolución. La disolución fue endotérmica (-4 °C). En un matraz erlenmeyer de 4 l, previamente grabado mediante el uso de química de fluoruro, se disolvió fluorhidrato de fluoruro de potasio (538 g, 6891 mmol) en agua (2,306 l, 1,28E+05 mmol) para formar una solución 3 M. La disolución fue endotérmica (-12 °C). Luego la solución se filtró para eliminar una pequeña cantidad de material insoluble del fluorhidrato de fluoruro de potasio. Una vez que ambas soluciones se disolvieron completamente, el contenido del matraz erlenmeyer se cargó en el matraz de pared simple en porciones durante 15 minutos. Se observó una exotermia moderada (+10 °C). La solución se convirtió en una suspensión gris semiopaca espesa y translúcida durante la adición y se aumentó la agitación para mantener el contenido bien mezclado. La mezcla se agitó durante 1,5 h y luego se filtró a través de un embudo de vidrio poroso grueso (4 l, previamente grabado). La filtración requirió de 30-45 minutos para completarse. Se descartó el filtrado bifásico transparente. Los sólidos blancos se secaron durante 10 minutos sobre el filtro (se observó agrietamiento de la torta). Los sólidos se transfirieron posteriormente a un matraz de pared simple de 3 cuellos de 5 l limpio y se volvieron a suspender con agua (1,33 l, 7,38E+04 mmol). La suspensión se agitó durante 2 h, después de lo cual formó un hidrogel transparente y homogéneo. La solución se agitó durante 1 h más, con lo cual los sólidos/gel se filtraron mediante el uso de un embudo de vidrio grueso de 4 l (previamente grabado). Los sólidos se dejaron secar sobre el filtro durante 30 minutos. Los sólidos se transfirieron posteriormente a un matraz de pared simple de 3 cuellos de 5 l limpio y se volvieron a suspender en acetona (1,084 l, 1,48E 04 mmol). La suspensión blanca/gris se agitó durante 1 h y después se filtró en un embudo de vidrio grueso de 4 l (previamente grabado). La filtración requirió 20 minutos para completarse y luego se secó en el embudo durante 1 h más. Durante este tiempo, los sólidos se agitaron ocasionalmente para asegurar un secado homogéneo. Después del secado sobre el filtro quedó un polvo blanco claro. Los sólidos se secaron durante 20 h a 55 °C bajo vacío con una lenta purga de nitrógeno para dar un sólido blanco esponjoso (se recogieron 200,3 g).
A una solución agitada de 5-(terc-butil) (S)-3-bencil-2-(6-bromo-1H-indazol-3-il)-3,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5,6-dicarboxilato de 6-bencilo (I-15) (10,0 g, 16,0 mmol) en 2-metiltetrahidrofurano (100 ml, 10 vol) se añadió (4-(bencNoxi)-2-etNfeml)trifluoro-A4-borano, sal de potasio (I-5) (8,0 g, 20 mmol) y el sólido blanco esponjoso obtenido anteriormente (0,20 g). La mezcla de reacción resultante se desgasificó con gas nitrógeno durante 30 minutos. A esta solución, se añadió una solución acuosa preparada de carbonato de cesio (20,0 g, 62,0 mmol en 60 ml de agua, 6 vol). La mezcla de reacción resultante se desgasificó adicionalmente durante 15 minutos seguido de la adición de bis(di-terc-butil(4-dimetilaminofenil)fosfina)dicloropaladio(II) (0,66 g, 0,93 mmol), y la mezcla de reacción se evacuó al vacío y se purgó con nitrógeno. La mezcla de reacción resultante se calentó a 110 °C durante 20 horas. Después de la terminación de la reacción (monitoreo por TLC y LCMS), la mezcla de reacción resultante se enfrió a temperatura ambiente y se filtró a través de un lecho de celite, luego se lavó adicionalmente con EtOAc (3 x 0,5 l). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con solución de hidróxido de sodio 1 N (3 x 0,5 l). Luego, los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera y se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se evaporaron bajo presión reducida para producir el producto crudo, que se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (100 200 M) mediante el uso de eluyentes EtOAc al 20 % en hexano para obtener el producto deseado (I-16) (como mezcla de regioisómeros de N-bencilo) como un sólido amarillo claro (8,0 g, 66 %). (m/z): [M+H]+ calculada para C48H47N5O5 774,36 encontrada 774,59.
- - - - - - - - - - - , , , - - - , -c]piridin-6-carboxílico (I-18)
(a) Clorhidrato de (S)-3-bencil-2-(6-(4-(benciloxi)-2-etilfenil)-1H-indazol-3-il)- tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-carboxilato de bencilo, (I-17)
Se disolvió 5-(terc-butil) (S)-3-bencil-2-(6-(4-(benciloxi)-2-etilfenil)-1 H-indazol-3-il)-3,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5,6-dicarboxilato de 6-bencilo (I-16) (1,0 g, 1,292 mmol) en dioxano (8 ml) y agua (1,5 ml), luego se añadió una solución de cloruro de hidrógeno, 4 M en dioxano (7 ml, 28,0 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas (el progreso de la reacción se monitoreó mediante LCMS). Luego la mezcla de reacción se congeló y liofilizó, y el producto crudo (I-17) se usó directamente en la siguiente reacción (se asumió rendimiento cuantitativo). (m/z): [M+H]+ calculada para C43H39N5O3674,31 encontrada 674,3.
(b) Clorhidrato del ácido (S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-carboxílico (I-18)
Clorhidrato de (S)-3-bencil-2-(6-(4-(benciloxi)-2-etilfenil)-1H-indazol-3-il)-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-carboxilato de bencilo, (I-17) (0,918 g, 1,292 mmol) se disolvió en 2-propanol (15 ml), se añadió una solución de cloruro de hidrógeno, 5 M en agua (0,258 ml, 1,292 mmol) y agua (0,25 ml) a 50 °C, luego paladio, 10 % peso sobre carbón, 50 % agua (0,138 g, 0,065 mmol). Luego se purgó el matraz de reacción con nitrógeno, se conectó un balón de hidrógeno y la mezcla de reacción se agitó a 50 °C durante 4 días, se repuso el balón de hidrógeno según fuera necesario (el progreso de la reacción se monitoreó mediante LCMS). Luego se eliminaron todos los sólidos mediante filtración y la solución resultante se concentró. El residuo se disolvió en ACN/agua 1:1, se congeló y se liofilizó. El polvo resultante (I-18) se usó sin purificación adicional (se asumió rendimiento cuantitativo). (m/z): [M+H]+ calculada para C22H21N5O3404,17 encontrada 404,2.
Preparación 5: Ácido (S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1 H-indazol-3-il)-5-isopropil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-carboxílico (I-19)
El ácido (S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-carboxílico, HCl (I-18) (0,25 gramos, 0,568 mmol) se suspendió en DMF (2,5 ml) y acetona (2,5 ml), luego se añadieron ácido acético (0,098 ml, 1,705 mmol) y cianoborohidruro de sodio (0,179 g, 2,84 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas (el progreso de la reacción se monitoreó mediante LCMS). La mezcla de reacción se concentró, luego el producto crudo se purificó mediante cromatografía de fase inversa (gradiente de ACN/agua 5 - 70 %, 50 g de columna C18aq) para proporcionar la sal de TFA del compuesto del título (149 mg, rendimiento del 47 %). (m/z): [M+H]+ calculada para C25H27N5O3446,21 encontrada 446,3.
Ejemplo 1: (S)-(3-(dimetilamino)azetidin-1-il)(2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-isopropil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-il)metanona
El ácido (S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-isopropil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6carboxílico, TFA (I-19) (50 mg, 0,089 mmol), diclorhidrato de 3-(dimetilamino)azetidina (23,20 mg, 0,134 mmol) y DIPEA (0,078 ml, 0,447 mmol) se disolvieron en DMF (1,5 ml), luego se añadió HATU (51,0 mg, 0,134 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas (el progreso de la reacción se monitoreó mediante LCMS). Se añadió hidracina (0,014 ml, 0,447 mmol) para escindir los subproductos no deseados y la solución se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego se concentró la mezcla de reacción y se purificó el producto crudo mediante HPLC preparativa (gradiente de ACN/agua 5-70 %, columna C18) para proporcionar la sal de TFA del compuesto del título (25 mg, rendimiento del 37 %). (m/z): [M+H]+ calculada para C30H37N7O2528,30 encontrada 528,3. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 613,09 (s, 1H), 9,40 (s, 1H), 8,27 (d, J = 8,31, 1H), 7,30 (s, 1H), 7,04 (m, 2H), 6,71 (d, J = 2,54, 1H), 6,64 (dd, J = 2,53, 8,26, 1H), 4,26 (m, 1H), 4,06 (m, 2H), 3,82 (m, 2H), 3,64 (m, 2H), 3,03 (m, 2H), 2,74 (m, 2H), 2,47(q, J = 7,56, 2H), 2,07 (d, J = 3,69, 6H), 1,07 (m, 6H), 1,00 (t, J = 7,50, 3H).
Preparación 6: Ácido (S)-5-etil-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1 H-indazol-3-il)-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-carboxílico
El ácido (S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1 H-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-carboxílico, HCl (0,100 g, 0,227 mmol) (I-18) y acetaldehído (0,019 ml, 0,341 mmol) se disolvieron en metanol (3,0 ml), luego se añadió cianoborohidruro de sodio (0,057 g, 0,909 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas (el progreso de la reacción se monitoreó mediante LCMS). Se añadió borohidruro de sodio (9 mg, 0,227 mmol) para inactivar cualquier acetaldehído restante y luego se concentró la mezcla de reacción. Luego, el producto crudo se purificó mediante cromatografía de fase inversa (gradiente de ACN/agua 5-70 %, columna C18 de 40 g) para proporcionar la sal de TFA del compuesto del título (62 mg, rendimiento del 50 %). (m/z): [M+H]+ calculada para C24H25N5O3432,20 encontrada 432,1.
Ejemplo 2: (S)-(3-(dimetilamino)azetidin-1-il)(5-etil-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-il)metanona
El ácido (S)-5-etil-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-carboxílico, TFA (30 mg, 0,055 mmol), diclorhidrato de 3-(dimetilamino)azetidina (14,28 mg, 0,082 mmol) y D<i>P<e>A (0,048 ml, 0,275 mmol) se disolvieron en DMF (1,50 ml), luego se añadió HATU (31,4 mg, 0,082 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora (el progreso de la reacción se monitoreó mediante LCMS). Se añadió hidracina (5,18 |jl, 0,165 mmol) para escindir los subproductos no deseados y luego la solución se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego se concentró la mezcla de reacción y se purificó el producto crudo mediante HPLC preparativa (gradiente de ACN/agua 5-60 %, columna C18) para proporcionar la sal de TFA del compuesto del título (25 mg, rendimiento del 63 %). (m/ z): [M+H]+ calculada para C29H35N7O2514,29 encontrada 514,2.
Ejemplo 3: (S)-(3-(dimetilamino)-3-metilazetidin-1-il)(5-etil-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-il)metanona
El ácido (S)-5-etil-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-carboxílico, TFA (30 mg, 0,055 mmol), clorhidrato de N,N,3-trimetilazetidin-3-amina (12,43 mg, 0,082 mmol) y DIPEA (0,048 ml, 0,275 mmol) se disolvieron en DMF (1,50 ml), luego se añadió HATU (31,4 mg, 0,082 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora (el progreso de la reacción se monitoreó mediante LCMS). Se añadió hidracina (5,18 pl, 0,165 mmol) para escindir los subproductos no deseados y luego la solución se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego se concentró la mezcla de reacción y se purificó el producto crudo mediante HPLC preparativa (gradiente de ACN/agua 5 - 60 %, columna C18) para proporcionar la sal de TFA del compuesto del título (25 mg, rendimiento del 62 %). (m/z): [M+H]+ calculada para C30H37N7O2528,30 encontrada 528,2.
Ejemplo 4: (S)-(3-(dimetilamino)-3-metilazetidin-1-il)(2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-isopropil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-il)metanona
El ácido (S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-isopropil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-carboxílico (40 mg, 0,090 mmol) (I-19) clorhidrato de N,N,3-trimetilazetidin-3-amina (20,29 mg, 0,135 mmol) y DIPEA (0,047 ml, 0,269 mmol) se disolvieron en DMF (1,50 ml), luego se añadió HATU (51,2 mg, 0,135 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas (el progreso de la reacción se monitoreó mediante LCMS). Se añadió hidracina (8,45 pl, 0,269 mmol) para escindir los subproductos no deseados y luego la solución se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego se concentró la mezcla de reacción y se purificó el producto crudo mediante HPLC preparativa (gradiente de ACN/agua 5-60 %, columna C18) para proporcionar la sal de TFA del compuesto del título (26 mg, rendimiento del 38 %). (m/z): [M+H]+ calculada para C31H39N7O2542,32 encontrada 542,2.
Preparación 7: Ácido (S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1 H-indazol-3-il)-5-propil-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-carboxílico (I-20)
El ácido (S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-carboxilico, HCl (I-18) (0,160 g, 0,364 mmol) y propionaldehído (0,039 ml, 0,546 mmol) se disolvieron en metanol (3,0 ml), luego se añadió cianoborohidruro de sodio (0,069 g, 1,091 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas (el progreso de la reacción se monitoreó mediante LCMS). La mezcla de reacción se concentró y el producto crudo se purificó mediante cromatografía de fase inversa (gradiente de ACN/agua 5-70 %, columna C18 de 50 g) para proporcionar la sal de TFA del compuesto del título (78 mg, rendimiento del 38 %). (m/ z): [M+H]+ calculada para C25H27N5O3446,21 encontrada 446,3.
Ejemplo 5: (S)-(3-(dimetilamino)azetidin-1-il)(2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-propil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-il)metanona
El ácido (S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-propil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-carboxílico, TFA (30 mg, 0,054 mmol), (I-20) diclorhidrato de 3-(dimetilamino)azetidina (13,92 mg, 0,080 mmol) y DIPEA (0,047 ml, 0,268 mmol) se disolvieron en DMF (1,50 ml), luego se añadió HATU (30,6 mg, 0,080 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora (el progreso de la reacción se monitoreó mediante LCMS). Se añadió hidracina (5,05 pl, 0,161 mmol) para escindir los subproductos no deseados y luego la solución se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego se concentró la mezcla de reacción y se purificó el producto crudo mediante HPLC preparativa (gradiente de ACN/agua 5-60 %, columna C18) para proporcionar la sal de TFA del compuesto del título (26 mg, rendimiento del 63 %). (m/z): [M+H]+ calculada para C30H37N7O2528,30 encontrada 528,2.
Ejemplo 6: (S)-(3-(dimetilamino)-3-metilazetidin-1-il)(2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-propil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-il)metanona
El ácido (S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-propil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-carboxílico, TFA (30 mg, 0,054 mmol), (I-20) clorhidrato de N,N,3-trimetilazetidin-3-amina (12,12 mg, 0,080 mmol) y DIPEA (0,047 ml, 0,268 mmol) se disolvieron en DMF (1,50 ml), luego se añadió HATU (30,6 mg, 0,080 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora (el progreso de la reacción se monitoreó mediante LCMS). Se añadió hidracina (5,05 pl, 0,161 mmol) para escindir los subproductos no deseados y luego la solución se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego se concentró la mezcla de reacción y se purificó el producto crudo mediante HPLC preparativa (gradiente de ACN/agua 5-60 %, columna C18) para proporcionar la sal de TFA del compuesto del título (18 mg, rendimiento del 44 %). (m/z): [M+H]+ calculada para C31H39N7O2542,32 encontrada 542,2.
Preparación 8: 2-(4-(benciloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-4,4,5,5-tetrametil- 1,3,2-dioxaborolano
(a) 1 -(benciloxi)-4-bromo-5-etil-2-fluorobenceno
A una solución de 4-bromo-5-etil-2-fluorofenol (20 g, 910,32 mmol) en ACN (250 ml) se le añadió gota a gota K2CO3 (31,55 g, 228,3 mmol) seguido de bromuro de bencilo (13,10 ml, 109,58 mmol). La mezcla de reacción resultante se agitó a 80 °C durante 2 h. La capa acuosa se extrajo con EtOAc (tres veces), se combinó y se lavó con salmuera. La capa orgánica se secó sobre Na2SO4 y se evaporó bajo presión reducida para proporcionar el intermediario del título en forma de un líquido aceitoso de color amarillo pálido (25 g, rendimiento del 89 %). 1H NMR (400 MHz, cloroformo-d)67,48 - 7,30 (m, 5H), 7,27 (d,J =10,5 Hz, 1H), 6,87 (d,J =8,7 Hz, 1H), 5,12 (s, 2H), 2,66 (q,J =7,5 Hz, 2H), 1,16 (t,J =7,5 Hz, 3H).
(b) 2-(4-(Benciloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2- dioxaborolano
A una solución del producto de la etapa anterior (12,5 g, 40,45 mmol) en dioxano (100 ml) se añadió bis(pinacolato)diboro (15,40 g, 60,67 mmol) y KOAc (11,9 g, 121,35 mmol). La mezcla de reacción se purgó con nitrógeno durante 15 min seguido de adición de [1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno]dicloropaladio(N), complejo con diclorometano (1,65 g, 2,023 mmol). La mezcla de reacción resultante se agitó y se calentó a 110 °C durante 3 h, se filtró a través de Celite y el residuo se lavó con EtOAc. El filtrado se diluyó con exceso de EtOAc (200 ml) y se lavó con agua (100 ml) seguido de salmuera (100 ml), se secó sobre sulfato de sodio y se concentró al vacío para obtener el producto crudo que se purificó mediante cromatografía en columna sobre (100-200) gel de sílice, se eluyó con 3-5 % de EtOAc: Hexano para obtener el producto deseado como un sólido blanquecino (9,50 g, rendimiento del 66 %).
1H NMR (400 MHz, cloroformo-d) 67,54 - 7,27 (m, 6H), 6,81 (d,J= 7,9 Hz, 1H), 5,16 (s, 2H), 2,84 (q, J=7,5 Hz, 2H), 1,32 (s, 12H), 1,14 (t,J= 7,5 Hz, 3H).
Preparación 9: 6-(4-(benciloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-1-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-3-(trimetilestanil)-(1 H-indazol
(a) 6-(4-(benciloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-1-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-1 H-indazol
A una solución de 6-bromo-1-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-1,H-indazol (50 g, 178,57 mmol) y 2-(4-(benciloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano (76,3 g, 214,29 mmol) en DMF:H2O (480:120 ml) se añadió K3PO4 (94,64 g, 446,86 mmol). La mezcla de reacción se desgasificó con nitrógeno durante 15 minutos, luego se añadió el catalizador Pd(PPh3)2Cl2 (6,26 g, 8,93 mmol) y la mezcla se desgasificó nuevamente con nitrógeno durante 5 minutos, se agitó y se calentó a 100-110 °C durante 5 h. La mezcla de reacción se filtró a través de Celite y el residuo se lavó con EtOAc. El filtrado se diluyó con EtOAc, se lavó con agua fría y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró al vacío para proporcionar el producto crudo que se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en columna para proporcionar el intermediario del título como un sólido blanco (65 g, rendimiento del 86 %).(m/z):[M+H]+ calculada para C27H27FN2O2431,21 encontrada 431,46. 1H NMR (400 MHz, cloroformo-d) ó 8,06 - 7,98 (m, 2H), 7,70 (d,J =8,2 Hz, 1H), 7,51 - 7,32 (m, 5H), 7,08 (dd,J =809,6, 8,3 Hz, 1H), 7,03 (d,J =11,9 Hz, 1H), 6,95 (d,J =8,5 Hz, 1H), 5,76 5,64 (m, 1H), 5,20 (s, 2H), 4,04 (d,J =10,1 Hz, 1H), 3,72 (t,J= 9,7 Hz, 1H), 2,52 (q,J =7,5 Hz, 2H), 2,22 - 2,02 (m, 3H), 1,80 - 1,71 (m, 3H), 1,06 (t,J =7,5 Hz, 3H).
(b) 6-(4-(Benciloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-1 H-indazol
A una solución del producto de la etapa anterior (65 g, 151,16 mmol) en metanol (700 ml) se añadió HCl conc. (120 ml) y la solución resultante se calentó a 60 - 65 °C durante 3 h, se enfrió a temperatura ambiente y se concentró al vacío. El residuo se disolvió en EtOAc y se lavó con una solución acuosa saturada de NaHCO3 y agua. La capa orgánica se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró al vacío para proporcionar el intermediario del título en forma de un sólido blanco (52 g, 99 % (crudo)). 1H NMR (400 MHz, cloroformo-d) ó 8,13 (s, 1H), 7,77 (d,J =8,3 Hz, 1H), 7,59 - 7,30 (m, 6H), 7,10 (d,J =8,3 Hz, 1H), 7,01 (d,J =11,8 Hz, 1H), 6,96 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 5,21 (s, 2H), 2,53 (q, J = 7,5 Hz, 2H), 1,05 (t, J = 7,5 Hz, 3H).
(c) 6-(4-(benciloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-3-yodo-1 H-indazol
A una solución de 6-(4-(benciloxi)-2-etil 1-5-fluorofenil)-1 H-indazol (56 g, 161,18 mmol) en DMF (400 ml) se añadió KOH (36,2 g, 647,39 mmol) y la mezcla se agitó durante 5 minutos. Se añadió lentamente una solución de yodo (82,2 g, 323,69 mmol) en DMF (100 ml) a 0 °C y se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos, se diluyó con agua (3 x 150 ml) y se extrajo con EtOAc (3 x 200 ml). La capa orgánica se lavó con solución acuosa saturada de metabisulfito de sodio (3 x 200 ml) y agua (400 ml), se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró bajo presión reducida para obtener el producto crudo que se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida para proporcionar el intermediario del título como un semisólido parduzco (64 g, rendimiento del 84 %). 1H NMR (400 MHz, cloroformo-d) ó 10,49 (s, 1H), 7,57 - 7,32 (m, 7H), 7,16 (d,J =8,3 Hz, 1H), 7,04 - 6,91 (m, 2H), 5,20 (s, 2H), 2,51 (q,J =7,4 Hz, 2H), 1,04 (t,J=7,5 Hz, 3H).
(d) 6-(4-(benciloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-3-yodo-1-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-1 H-indazol
A una solución enfriada con hielo del producto de la etapa anterior (60 g, 127,12 mmol) en DCM (700 ml) se le añadió gota a gota ácido p-toluenosulfónico (4,84 g, 25,423 mmol) seguido de 3,4-dihidro-2H-pirano (17,43 ml, 190,68 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche, se diluyó con DCM y se lavó con una solución acuosa saturada de NaHCO3 y salmuera. La capa orgánica se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró bajo presión reducida para proporcionar el producto crudo que se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (gel de sílice) para proporcionar el intermediario del título como un sólido blanquecino (64 g, rendimiento del 91 %).(m/z):
[M+H]+ calculada para C27H26FIN2O2557,10 encontrada 557,30. 1H NMR (400 MHz, cloroformo-d) ó 7,56 - 7,31 (m, 7H), 7,14 (d,J =8,3 Hz, 1H), 7,01 (d,J =11,8 Hz, 1H), 6,95 (d,J =8,5 Hz, 1H), 5,68 (d,J =9,3 Hz, 1H), 5,20 (s, 2H), 4,08 - 3,99 (m, 1H), 3,77-3,64 (m, 1H), 2,50 (q,J =7,2 Hz, 2H), 2,23 - 1,97 (m, 3H), 1,81 - 1,68 (m, 3H), 1,06 (t,J= 7,4 Hz, 3H).
(e) 6-(4-(benc¡lox¡)-2-et¡l-5-fluorofen¡l)-1-(tetrah¡dro-2H-p¡ran-2-il)-3-(tr¡met¡lestan¡l)-1H-¡ndazol
A una soluc¡ón de 6-(4-(benc¡lox¡)-2-et¡l-5-fluorofenil)-3-yodo-1-(tetrah¡dro-2H-p¡ran-2-¡l)-1H-¡ndazol (20 g, 35,97 mmol) en tolueno (150 ml) se añad¡ó hexamet¡ld¡estaño (9,2 ml, 43,17 mmol). La mezcla de reacc¡ón se desgas¡f¡có con n¡trógeno durante 20 m¡nutos segu¡do de la ad¡c¡ón de tetraqu¡s (2,0 g, 1,80 mmol) y luego se agitó a 100 °C durante 2 h, se enfr¡ó a temperatura amb¡ente, se f¡ltró a través de Cel¡te y el res¡duo se lavó con EtOAc. El f¡ltrado se concentró y se pur¡f¡có med¡ante cromatografía en columna (sobre alúm¡na neutra), se eluyó con 2-5 %. EtOAc:Hexano para proporc¡onar el compuesto del título (17,50 g, rend¡m¡ento del 82 %).(m/z):[M+H]+ calculada para C30H35FN2O2Sn 595,17, 593,17 encontrada 595,49, 593,55. 1H NMR (400 MHz, cloroformo-d) 67,68 (d,J =8,0 Hz, 1H), 7,57 - 7,29 (m, 6H), 7,13 - 7,00 (m, 2H), 6,96 (d,J =8,4 Hz, 1H), 5,81-5,68 (m, 1H), 5,21 (s, 2H), 4,13 - 4,00 (m, 1H), 3,81-3,66 (m, 1H), 2,54 (q,J = 1,3Hz, 2H), 2,23 - 2,00 (m, 2H), 1,87 - 1,59 (m, 4H), 1,08 (t,J =7,5 Hz, 3H), 0,47 (s, 9H).
Preparac¡ón 10: (S)-2-yodo-3-((2-tr¡met¡ls¡l¡l)etox¡)met¡l)-3,4,6,7-tetrah¡dro-5H-¡m¡dazo[4,5-c ]p¡r¡d¡n-5,6-d¡carbox¡lato de 5-(terc-but¡l) 6-met¡lo
(a) Ác¡do (S)-4,5,6,7-tetrah¡dro-3H-¡m¡dazo[4,5-c]p¡rid¡n-6-carboxíl¡co
A una suspens¡ón ag¡tada de L-h¡st¡d¡na (50 g, 322,24 mmol) en agua (420 ml) se añad¡ó HCl conc. (29 ml) gota a gota a 0 °C segu¡do de formaldehído (55 ml, 676,72 mmol) en una porc¡ón a 0 °C. La mezcla de reacc¡ón resultante se agitó durante 30 m¡nutos y luego se calentó a 75 °C durante 6 h y se concentró. El crudo resultante se ag¡tó durante 2 h con éter d¡etíl¡co, se f¡ltró y se lavó con IPA:THF (100:300 ml) para proporc¡onar la sal de HCl del ¡ntermed¡ar¡o del título como un sól¡do blanquec¡no (75 g, rend¡m¡ento del 99 % (crudo)). (m/z): [M+H]+ calculada para C7H9N3O2168,07 encontrada 168,17.
(b) (S)-4,5,6,7-tetrah¡dro-3H-¡m¡dazo[4,5-c]p¡rid¡n-6-carbox¡lato de met¡lo
A una soluc¡ón ag¡tada del producto de la etapa anter¡or (75,0 g, 312,5 mmol) en metanol (1500 ml) se añad¡ó gota a gota SOCl2 (45,6 ml, 625 mmol) a 0 °C y se agitó a temperatura amb¡ente durante 16 h, luego se calentó hasta reflujo (70 °C) durante 1 h. El solvente se el¡m¡nó por dest¡lac¡ón y el producto crudo se trituró con metanol segu¡do de éter d¡etíl¡co para proporc¡onar la sal de HCl cruda del ¡ntermed¡ar¡o del título en forma de un sól¡do blanquec¡no (80 g crudo). 1H NMR (400 MHz, DMSO-de) 69,05 (s, 1H), 4,71 (dd,J =9,4, 5,2 Hz, 1H), 4,36 (d,J =15,5 Hz, 1H), 4,30 (d, J = 15,6 Hz, 1H), 3,82 (s, 3H), 3,44 - 3,21 (m, 2H).
(c) (S)-3,4,6,7-tetrah¡dro-5H-¡m¡dazo[4,5-c]p¡r¡d¡n-5,6-d¡carbox¡lato de 5-(terc-but¡l) 6-met¡lo
A una soluc¡ón ag¡tada del producto de la etapa anter¡or (80,0 g, 314,96 mmol) en metanol (1000 ml) se añad¡ó DIPEA (282 ml, 1574 mmol) segu¡do de d¡carbonato de d¡-terc-but¡lo (172 ml, 787,48 mmol) a 0 °C. La mezcla de reacc¡ón se ag¡tó a temperatura amb¡ente durante 16 h y luego se añad¡ó NH3 líqu¡do (150 ml, 25 % en agua) y la mezcla de reacc¡ón se agitó nuevamente durante 16 h a temperatura amb¡ente, se el¡m¡nó el metanol por dest¡lac¡ón y el res¡duo se extrajo en DCM (3 x 200 ml). Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se concentró y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (gel de sílice de malla 100-200), se eluyó con MeOH al 5 %:DCM para proporcionar el intermediario del título (41 g, rendimiento del 46 %).(m/z):[M+H]+calculada para C13H19N3O4 282,14 encontrada 282,21. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 611,85 (s, 1H), 7,50 (s, 1H), 5,18 (d, J = 49,3, 5,1 Hz, 1H), 4,51 (t,J =14,2 Hz, 1H), 4,09 (d, J =43,9, 16,1 Hz, 1H), 3,59 (s, 3H), 3,08 (d,J =15,5 Hz, 1H), 2,94 (d,J= 15,1 Hz, 1H), 1,45 (s, 9H).
(d) (S)-2-yodo-3,4,6,7-tetrah¡dro-5H-¡m¡dazo[4,5-c]p¡rid¡na-5,6-d¡carbox¡lato de 5-(terc-butil) 6-met¡lo
A una solución del producto de la etapa anterior (41,0 g, 145,9 mmol) en THF (500 ml) se añadió W-yodosuccinimida (66,0 g, 291,8 mmol) a 0 °C y la solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 4 h, se diluyó con agua y se extrajo con acetato de etilo. La porción orgánica se lavó con 10 % de solución de tiosulfato de sodio (3 x 200 ml). La capa orgánica combinada se secó sobre sulfato de sodio anhidro, y se concentró para proporcionar el compuesto del título 60 g (crudo), que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional,(m/z):[M+H]+calculada para C13H18IN3O4408,03 encontrada 408,31. 1H NMR (400 MHz, DMSO-de) ó 12,48 (s, 1H), 5,34 - 4,97 (m, 1H), 4,67 -4,35 (m, 1H), 4,12 - 3,95 (m, 1H), 3,60 (s, 3H), 3,14 - 2,82 (m, 2H), 1,44 (s, 9H).
(e) (S)-2-yodo-3-((2-trimetilsilil)etoxi)metil)-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5,6-dicarboxilato de 5-(terc-butil) 6-metilo
A una solución agitada de (S)-2-yodo-3,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5,6-dicarboxilato de 5-(terc-butil) 6-metilo (40 g, 0,098 mol) en D<m>F (150 ml) se añadió DIPEA (35,1 ml, 0,19 mol) a 0 °C. La mezcla de reacción se agitó durante 10 minutos y luego se añadió gota a gota cloruro de 2-(trimetilsilil)-etoximetilo (19,1 ml, 0,10 mol) a 0 °C. La mezcla de reacción resultante se agitó durante 3 h a temperatura ambiente. Después de 4 h, se añadió agua fría y la mezcla de reacción se extrajo con EtOAc (2 x 200 ml). La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se concentró y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en columna, se eluyó con EtOAc:Hexano 20 - 35 %, para dar el producto del título en forma de un líquido viscoso de color amarillo pálido (27 g).(m/z):[M+H]+ calculada para C19H32lNaO5S¡ 538,12 encontrada 538,42. 1H NMR (400 MHz, DMSO-de) ó 5,33 - 5,04 (m, 3H), 4,79 - 4,56 (m, 1H), 4,54 -4,14 (m, 1H), 3,60 (s, 3H), 3,47 (t,J =7,8 Hz, 2H), 3,31 - 3,16 (m, 1H), 2,97 (t,J =18,9 Hz, 1H), 1,44 (s, 9H), 0,92 - 0,74 (m, 2H), -0,03 (s, 9H).
Preparación 11: Ácido (6S)-5-(terc-butoxicarbonil)-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-1H-indazol-3-il)-3-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5c] piridin-6-carboxílico
(a) (6S)-2-(6-(4-(benciloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-1-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-1H-indazol-3-il)-3-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-tetrahidro-SH-imidazo[4,5-c]piridin-5,6-dicarboxilato de 5-(terc-butil) 6-metilo
A una solución agitada de (S)-2-yodo-3-((2-trimetilsilil)etoxi)metil)-3,4,6,7-tetrahidro -5H-imidazo[4,5-c]piridin-5,6-dicarboxilato de 5-(terc-butil) 6-metilo (17,0 g, 31,65 mmol) en tolueno (500 ml) se añadió 6-(4-(benciloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-1-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-3-(metilestannil)-1H-indazol (20 g, 34,82 mmol). La mezcla de reacción se purgó con argón durante 15 min, se añadieron Pd(PPh3)4 (3,6 g, 3,16 mmol) y yoduro de cobre (1,20 g, 6,33 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a 120 °C durante 16 h. La mezcla de reacción se filtró a través de Celite, el filtrado se concentró bajo presión reducida y se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (columna Redisep de 80 g, se eluyó con DCM durante 10 min y luego EtOAc al 15-20 % en hexano para proporcionar el intermediario del título en forma de un sólido amarillo (15,10 g, rendimiento del 58 %).(m/z):[M+H]+ calculada para C46H5sFN5O7S¡ 840,41 encontrada 840,54. 1H NMR (400 MHz, cloroformo-de) ó 8,43 (s, 1H), 7,54 - 7,33 (m, 6H), 7,20 (s, 1H), 7,05 (d,J =11,4 Hz, 1H), 6,95 (d,J =8,5 Hz, 1H), 6,09 - 5,69 (m, 3H), 5,59 - 5,36 (m, 1H), 5,20 (s, 2H), 4,97 - 4,80 (m, 1H), 4,12 - 3,90 (m, 1H), 3,68 (s, 3H), 3,57 - 3,47 (m, 2H), 3,40 (d, 1H), 3,21 - 3,05 (m, 1H), 2,74 - 2,34 (m, 4H), 2,25 - 2,07 (m, 2H), 1,94 - 1,65 (m, 4H), 1,54 (s, 9H), 1,12 - 0,99 (m, 3H), 0,91 - 0,75 (m, 2H), -0,12 (s, 9H).
(b) 5-(terc-butil) (6S)-2-(6-(4-(benciloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-1-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-1H-indazol-3-il)-3-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-tetrahidro-5H-imidazo[4,5c]piridin-5,6-dicarboxilato de 6-bencilo
A un matraz de parte inferior redonda se le añadió el producto de la etapa anterior (15,0 g, 17,85 mmol) en tolueno (400 ml), alcohol bencílico (46,3 ml) y Ti(OEt)4 (7,15 ml, 35,70 mmol) y la mezcla de reacción se sometió a reflujo vigorosamente (140 °C) durante 48 h, se diluyó con agua y se extrajo con DCM. La suspensión se filtró, el filtrado se secó sobre Na2SO4, se concentró bajo presión reducida y se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (columna Redisep de 80 g, 0 - 5 % de EtOAc en hexanos) durante 20 minutos para eliminar el exceso de alcohol bencílico, luego se eluyó con 10-15 % de EtOAc en hexano) para proporcionar el intermediario del título. 1H NMR consistente con la estructura,(m/z):[M+H]+ calculada para Cs2H62FNsO7Si 916,44 encontrada 916,86.
(c) ácido (6S)-5-(terc-butoxicarbonil)-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1-(tetrahidro-2H-piran-2-il(-1H-indazol-3-il(-3-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-4,5,6,7 tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-carboxílico
A una solución agitada del producto de la etapa anterior (21,0 g, 22,92 mmol) en 1:1 de IPA:THF (400 ml)) se añadió Pd(OH)2 (5,0 g). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 h bajo un globo de hidrógeno, se filtró a través de Celite, se concentró bajo presión reducida y se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (columna Redisep de 80 g, se eluyó con 25 - 40 % de EtOAc en hexano) para proporcionar el compuesto del título (6,1 g, 8,29 mmol) en forma de un sólido blanquecino).(m/z):[M+H]+ calculada para C3sH50FN5O7Si 736,35 encontrada 736,5. 1H Nm R consistente con la estructura,(m/z):[M+H]+calculada para C3sH50FN5O7Si 736,35 encontrada 736,5. 1H NMR (400 MHz, DMSO-de) 612,94 (s, 1H), 9,86 (s, 1H), 8,34 (t, J =7,6 Hz, 1H), 7,66 (s, 1H), 7,20 (d,J =8,7 Hz, 1H), 7,03 (d,J =11,8 Hz, 1H), 6,93 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 6,11-5,77 (m, 3H), 5,33 -5,06 (m, 1H), 4,87 4,56 (m, 1H), 4,52- 4,14 (m, 1H), 3,97 - 3,69 (m, 2H), 3,53 - 3,40 (m, 2H), 3,23 - 3,11 (m, 1H), 3,11 - 2,93 (m, 1H), 2,47 - 2,44 (m, 2H), 2,13 - 1,96 (m, 2H), 1,68 (d,J =70,9 Hz, 4H), 1,48 (s, 9H), 1,02 (t,J= 7,5 Hz, 3H), 0,86 - 0,68 (m, 2H), -0,17 (s, 9H).
Preparación 12: Ácido (S)-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo [4,5c]piridin-6-carboxílico
A una solución agitada de ácido (6S)-5-(terc-butoxicarbonil)-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-1H-indazol-3-il)-3-((2-(trimetilsilil)etoxi)-metil)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5c]piridin-6-carboxílico (5,7 g, 7,75 mmol) en 5:1 de dioxano:agua (60 ml) se añadió gota a gota HCl conc. (20 ml) a 0 °C. La mezcla de reacción se calentó y se agitó a 90 °C durante 16 h y se destiló bajo vacío para proporcionar el residuo crudo, que se trituró secuencialmente con éter dietílico frío y acetonitrilo para proporcionar la sal de HCl del compuesto del título (3,6 g, rendimiento del 95 %) como un sólido de color marrón claro. (m/z): [M+H]+ calculada para C22H20FN5O3422,16 encontrada 422,24. 1H NMR (400 MHz, D2O/DMSO-cfe) 68,22 (d,J =8,4 Hz, 1H), 7,49 (s, 1H), 7,19 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 6,99 (d,J =11,9 Hz, 1 H), 6,91 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 4,56- 4,51 (m, 1H), 4,36 (d, J = 15,5 Hz, 1H), 4,30 (d,J =15,5 Hz, 1H), 3,35 -3,25 (m, 1H), 3,15 - 3,05 (m, 1H), 2,4 - 2,55 (m, 2H), 0,97 (t,J =7,5 Hz, 3H).
Preparación 13: Ácido (S)-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-isopropil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-carboxílico
A una solución de ácido (S)-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-carboxílico, HCl (400 mg, 0,874 mmol), acetona (0,192 ml, 2,62 mmol), y ácido acético (0,150 ml, 2,62 mmol) en DMF (7 ml), se añadió cianoborohidruro de sodio (274 mg, 4,37 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Se añadió borohidruro de sodio (33 mg, 0,874 mmol), la solución se concentró y se purificó mediante HPLC preparativa para proporcionar la sal de TFA del compuesto del título (115 mg, rendimiento del 23 %). (m /z): [M+H]+ calculada para C25H26FN5O3464,20 encontrada 464,5.
empo : - - me amno aze n- - - - -e - - uoro- - rox en - -n azo- - - -soprop - , , , -tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-il)metanona C-1
A una solución de ácido (S)-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-isopropil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-carboxílico, TFA (179 mg, 0,310 mmol), W,W-dimetilazetidin-3-amina, 2 HCl (107 mg, 0,465 mmol) y DIPeA (0,162 ml 0,930 mmol) en DMF (4 ml), se añadió HATU (177 mg, 0,465 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Se añadió hidracina (5 eq), la mezcla de reacción se concentró y se purificó mediante HPLC preparativa para proporcionar la sal de TFA del compuesto del título (63 mg, rendimiento del 26 %).(m/z):[M+H]+ calculada para C30H36FN7O2546,29 encontrada 546,7. 1H NMR (400 MHz, DMSO-de) 69,90 (s, 1H), 8,29 (d, 1H), 7,34 (s, 1H), 7,07 (d, 1H), 7,01 (d, 1H), 6,89 (d, 1H), 4,35-4,18 (m, 1H), 4,11-3,94 (m, 1H), 3,94 - 3,73 (m, 3H), 3,70 - 3,57 (m, 2H), 3,06 - 2,94 (m, 2H), 2,87 - 2,66 (m, 2H), 2,48 - 2,40 (m, 2H), 2,13 - 2,00 (m, 6H), 1,07 (t, 3H), 1,03 - 0,93 (m, 6H).
Ejemplo 8: (S)-(3-(dimetilamino)-3-metilazetidin-1-il)(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-isopropil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-il)metanona
El ácido (S)-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-isopropil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-carboxílico, t Fa (30 mg, 0,052 mmol), N,N,3-trimetilazetidin-3-amina, 2 HCl (29,2 mg, 0,156 mmol) y DlPEA (0,045 ml, 0,260 mmol) se disolvieron en DMF (1,0 ml), luego se añadió HATU (29,6 mg, 0,078 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 20 horas (el progreso de la reacción se monitoreó mediante LCMS). Se añadió hidracina (4,90 pl, 0,156 mmol) para escindir los subproductos no deseados y luego la solución se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego se concentró la mezcla de reacción y se purificó el producto crudo mediante HPLC preparativa (gradiente de ACN/agua 2 - 70 %, columna C18) para proporcionar la sal de TFA del compuesto del título (13 mg, rendimiento del 33 %). (m/z): [M+H]+ calculada para C31H38FN7O2560,31 encontrada 560,2.
Preparación 14: Ácido (S)-5-etil-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-carboxílico
El ácido(S)-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-carboxílico, HCl (450 mg, 0,983 mmol) y acetaldehído (0,083 ml, 1,474 mmol) se disolvieron en DMF (7 ml), luego se añadió cianoborohidruro de sodio (247 mg, 3,93 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas (el progreso de la reacción se monitoreó mediante LCMS). Se añadió borohidruro de sodio (112 mg, 2,95 mmol) para inactivar cualquier acetaldehído restante y después se concentró la mezcla de reacción. Luego, el producto crudo se purificó mediante cromatografía de fase inversa (gradiente de ACN/agua 5-65 %, columna C18aq de 100 g) para proporcionar la sal de TFA del compuesto del título (165 mg, rendimiento del 30 %). (m/z): [M+H]+ calculada para C24H24FN5O3450,19 encontrada 450,2.
Ejemplo 9: (S)-(3-(dimetilamino)azetidin-1-il)(5-etil-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-il)metanona
El ácido (S)-5-etil-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-carboxílico, t Fa (30 mg, 0,053 mmol) y HATU (30,4 mg, 0,080 mmol) se combinaron en DMF (1,0 ml). Se añadieron a la solución, N,N-dimetilazetidin-3-amina (16 mg, 0,160 mmol) y DiPEA (0,037 ml, 0,213 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 6 horas (el progreso de la reacción se monitoreó mediante LCMS). Se añadió hidracina (4,92 pl, 0,160 mmol) para escindir los subproductos no deseados y luego la solución se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego se concentró la mezcla de reacción y se purificó el producto crudo mediante HPLC preparativa (gradiente de ACN/agua 10 - 70 %, columna Zorbax Bonus-RP) para proporcionar la sal de TFA del compuesto del título (27 mg, rendimiento del 67 %). (m/z): [M+H]+ calculada para C29H34FN7O2532,28 encontrada 532,2.
Ejemplo 10: (S)-(3-(dimetilamino)-3-metilazetidin-1-il)(5-etil-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-il)metanona
El ácido (S)-5-etil-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-carboxílico,<t>F<a>(30 mg, 0,053 mmol) y HATU (30,4 mg, 0,080 mmol) se combinaron en DMF (1,0 ml). Se añadieron a la solución, N,N,3-trimetilazetidin-3-amina (18 mg, 0,160 mmol) y DIPEA (0,037 ml, 0,213 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 6 horas (el progreso de la reacción se monitoreó mediante LCMS). Se añadió hidracina (4,92 pl, 0,160 mmol) para escindir los subproductos no deseados y luego la solución se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego, la mezcla de reacción se concentró y el producto crudo se purificó mediante HPLC preparativa (gradiente de ACN/agua 10-70 %, columna Zorbax Bonus-RP) para proporcionar la sal TFA del compuesto del título (28 mg, rendimiento del 68 %). (m/z): [M+H]+ calculada para C30H36FN7O2546,29 encontrada 546,2.
Preparación 15: Ácido (S)-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-propil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-carboxílico
El ácido (S)-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-carboxílico, HCl (300 mg, 0,655 mmol) y propionaldehído (0,071 ml, 0,983 mmol) se disolvieron en DMF (7 ml), luego se añadió cianoborohidruro de sodio (124 mg, 1,966 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 72 horas (el progreso de la reacción se monitoreó mediante LCMS). Se añadió borohidruro de sodio (26 mg, 0,655 mmol) para inactivar cualquier aldehído restante y después se concentró la mezcla de reacción. Luego, el producto crudo se purificó mediante HPLC preparativa (gradiente de ACN/agua 2 - 70 %, columna C18) para proporcionar la sal de TFA del compuesto del título (117 mg, rendimiento del 31 %). (m/z): [M+H]+ calculada para C25H26FN5O3464,21 encontrada 464,2.
Ejemplo 11: (S)-(3-(dimetilamino)azetidin-1-il)(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-propil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-il)metanona
El ácido (S)-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-propil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-carboxílico, TFA (33 mg, 0,057 mmol),N,N-dimetilazetidin-3-amina, 2 HCl (29,7 mg, 0,171 mmol) y DiPeA (0,060 ml, 0,343 mmol) se disolvieron en DMF (2,0 ml), luego se añadió HATU (28,2 mg, 0,074 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas (el progreso de la reacción se monitoreó mediante LCMS). Se añadió hidracina (8,97 pl, 0,286 mmol) para escindir los subproductos no deseados y luego la solución se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego se concentró la mezcla de reacción y se purificó el producto crudo mediante HPLC preparativa (gradiente de ACN/agua 2 - 70 %, columna C18) para proporcionar la sal de TFA del compuesto del título (27 mg, rendimiento del 61 %). (m/z): [M+H]+ calculada para C30H36FN7O2546,29 encontrada 546,5.
Ejemplo 12: (S)-(3-(dimetilamino)-3-metilazetidin-1-il)(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-propil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-il)metanona
El ácido (S)-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-propil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-carboxílico, TFA (30 mg, 0,052 mmol), N,N,3-trimetilazetidin-3-amina, 2 HCl (29,2 mg, 0,156 mmol) y DIPEA (0,045 ml, 0,260 mmol) se disolvieron en DMF (1,0 ml), luego se añadió HATU (29,6 mg, 0,078 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 20 horas (el progreso de la reacción se monitoreó mediante LCMS). Se añadió hidracina (8,89 pl, 0,260 mmol) para escindir los subproductos no deseados y luego la solución se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego se concentró la mezcla de reacción y se purificó el producto crudo mediante HPLC preparativa (gradiente de ACN/agua 2-70 %, columna C18) para proporcionar la sal de TFA del compuesto del título (15 mg, rendimiento del 37 %). (m/z): [M+H]+ calculada para C31H38FN7O2560,31 encontrada 560,5.
Ensayos biológicos
Los compuestos de la invención se caracterizaron en uno o más de los siguientes ensayos biológicos.
Ensayo 1: Ensayos bioquímicos de quinasa JAK
Se realizó un panel de cuatro ensayos bioquímicos LanthaScreen JAK (JAK1, 2, 3 y Tyk2) en un tampón de reacción de quinasa común (HEPES 50 mM, pH 7,5, Brij-35 al 0,01 %, MgCh 10 mM, y EGTA 1 mM). Las enzimas JAK recombinantes marcadas con GST y un sustrato peptídico STAT1 marcado con GFP se obtuvieron de Life Technologies.
Los compuestos diluidos en serie se preincubaron con cada una de las cuatro enzimas JAK y el sustrato en microplacas blancas de 384 pocillos (Corning) a temperatura ambiente durante 1 h. Subsecuentemente se añadió ATP para iniciar las reacciones de las quinasa en un volumen total de 10 pl, con DMSO al 1 %. Las concentraciones finales de enzimas para JAK1,2, 3 y Tyk2 son 4,2 nM, 0,1 nM, 1 nM y 0,25 nM respectivamente; las concentraciones de ATP Km correspondientes usadas son 25 pM, 3 pm, 1,6 pM y 10 pM; mientras que la concentración del sustrato es de 200 nM para los cuatro ensayos. Se dejó que las reacciones de las quinasa procedieran durante 1 hora a temperatura ambiente antes añadir la preparación de 10 pl de EDTA (concentración final10 mM) y Tb-anti-pSTAT 1 (pTyr701) (Life Technologies, concentración final 2 nM) en tampón de dilución TR-FRET (Life Technologies). Las placas se dejaron incubar a temperatura ambiente durante 1 h antes de leer en el lector EnVision (Perkin Elmer). Se registraron las señales de relación de emisión (520 nm/495 nm) y se utilizaron para calcular los valores de por ciento de inhibición basados en DMSO y controles de fondo.
Para el análisis de dosis-respuesta, se representaron los datos de por ciento de inhibición frente a las concentraciones del compuesto y se determinaron los valores de IC50 a partir de un modelo de ajuste robusto de 4 parámetros con el software Prism (GraphPad Software). Los resultados se expresaron como pIC50 (logaritmo negativo de IC50) y subsecuentemente se convirtieron a pKi (logaritmo negativo de la constante de disociación, Ki) mediante el uso de la ecuación de Cheng-Prusoff.
Los compuestos de prueba que tienen un valor de Ki más bajo o un valor de pKi mayor en los cuatro ensayos JAK muestra una mayor inhibición de la actividad JAK.
Ensayo 2: Inhibición de pSTAT5 estimulada por IL-2 en células T Tall-1
La potencia de los compuestos de prueba para la inhibición de la fosforilación de STATS estimulada por interleucina-2 (IL-2) se midió en la línea de células T humanas Tall-1 (DSMZ) mediante el uso de AlphaLisa. Debido a que la IL-2 envía señales a través de JAK1/3, este ensayo proporciona una medida de la potencia celular de JAK1/3.
El STAT5 fosforilado se midió mediante el kit AlphaLISA SureFire Ultra pSTAT5 (Tyr694/699) (PerkinElmer).
Se cultivaron células T humanas de la línea celular Tall-1 en una incubadora humidificada a 37 °C y CO2 al 5 % en RPMI (Life Technologies) suplementada con suero bovino fetal al 15 % inactivado por calor (FBS, Life Technologies), Glutamax 2 mM (Life Technologies), HEPES 25 mM (Life Technologies) y 1X Pen/Strep (Life Technologies). Los compuestos se diluyeron en serie en DMSO y se dispensaron acústicamente en los pocillos vacíos. Se dispensó medio de ensayo (DMEM libre de rojo fenol (Life Technologies) suplementado con FBS al 10 % (ATCC)) (4 pl/pocillo) y las placas se agitaron a 900 rpm durante 10 minutos. Las células se sembraron a razón de 45000 células/pocillo en medio de ensayo (4 pl/pocillo), y se incubó a 37 °C, CO2 al 5 % durante 1 hora, seguido de la adición de IL-2 (R&D Systems; concentración final de 300 ng/ml) en medio de ensayo precalentado (4 pl) durante 30 minutos. Después de la estimulación con citocinas, las células se lisaron con 6 pl de tampón de lisis AlphaLisa 3x (PerkinElmer) que contiene 1x PhosStop y comprimidos Complete (Roche). El lisado se agitó a 900 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT). El STATS fosforilado se midió mediante el kit pSTAT5 AlphaLisa (PerkinElmer). La mezcla de perlas aceptoras recién preparada se distribuyó sobre el lisado (5 pl) bajo luz verde filtrada <100 lux. Las placas se agitaron a 900 rpm durante 2 minutos, se centrifugaron brevemente y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente en la oscuridad. Se dispensaron perlas donantes (5 pl) bajo luz verde filtrada <100 lux. Las placas se agitaron a 900 rpm durante 2 minutos, se centrifugaron brevemente y se incubaron durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad. La luminiscencia se midió con excitación a 689 nm y emisión a 570 nm mediante el uso de un lector de placas EnVision (PerkinElmer) bajo luz verde filtrada <100 lux.
Para determinar la potencia inhibitoria de los compuestos de prueba en respuesta a IL-2, se midió la intensidad de emisión promedio de las perlas unidas a pSTAT5 en una línea de células T humanas. Los valores de IC50 se determinaron a partir del análisis de las curvas de inhibición de la intensidad de la señal frente a la concentración del compuesto. Los datos se expresan como valores de pIC50 (logaritmo decimal negativo de IC50) (media ± desviación estándar).
Resultados del ensayo in vitro
Tabla 1
Ensayo 3: Modelo murino (ratón) de inducción de pSTAT6 inducida por IL-13 en tejido pulmonar
La IL-13 es una citocina importante que subyace a la fisiopatología del asma (Kudlacz y otros.Eur. J. Pharmacol,2008, 582,154-161). La IL-13 se une a los receptores de la superficie celular activando miembros de la familia de quinasas Janus (JAK), que luego fosforilan STAT6 y subsecuentemente activan otras vías de transcripción. En el modelo que se describió, se suministró localmente una dosis de IL-13 en los pulmones de ratones para inducir la fosforilación de STAT6 (pSTAT6), que luego se midió como criterio de valoración.
En el ensayo se usaron ratones Balb/c adultos de Harlan. El día del estudio, los animales se anestesiaron ligeramente con isoflurano y se les administró vehículo o el compuesto de prueba (1 mg/ml, 50 pl de volumen total en varias respiraciones) mediante aspiración oral. Los animales se colocaron en decúbito lateral después de la dosis y se monitoreó su recuperación completa de la anestesia antes de regresarlos a su jaula de origen. Cuatro horas más tarde, los animales fueron nuevamente anestesiados brevemente y expuestos a vehículo o IL-13 (dosis total suministrada de 0,03 pg, volumen total de 50 pl) mediante aspiración oral antes de monitorear su recuperación de la anestesia y regresar a su jaula. Una hora después de la administración del vehículo o de IL-13, se colectaron sangre completa y pulmones para la detección de pSTAT6 en homogeneizados de pulmón mediante el uso del kit de ensayo Perkin Elmer AlphaLISA®.SureFire® Ultra™ HVp-STAT6 (Tyr641) y para análisis de la concentración total de fármaco tanto en pulmón como en plasma. Las muestras de sangre se centrifugaron (centrífuga Eppendorf, 5804R) durante 4 minutos a aproximadamente 12 000 rpm a 4 °C para colectar el plasma. Los pulmones se enjuagaron en DPBS (solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco), se secaron con almohadillas, se congelaron instantáneamente, se pesaron y se homogeneizaron a una dilución de 1:3 en 0,1 % de ácido fórmico en agua para HPLC. Los niveles en plasma y pulmón del compuesto de prueba se determinaron mediante análisis LC-MS frente a estándares analíticos construidos en una curva estándar en la matriz de prueba. Se determinó una relación pulmón/plasma como la relación entre la concentración pulmonar en ng/g y la concentración plasmática en ng/ml a las 5 horas.
La actividad en el modelo se evidencia por una disminución en el nivel de pSTAT6 presente en los pulmones de los animales tratados a las 5 horas en comparación con los animales de control tratados con vehículo y expuestos a IL-13. La diferencia entre los animales de control tratados con vehículo y expuestos a IL-13 y los animales de control tratados con vehículo y expuestos a vehículo dictó el efecto inhibidor del 0 % y del 100 %, respectivamente, en cualquier experimento dado. Los compuestos que se probaron en el ensayo mostraron inhibición de la fosforilación de STAT65 horas después de la exposición a IL-13 como se documenta a más abajo.
T l 2: Inhi i i n TAT x i i n l m lm n rv
La observación de una concentración significativa del compuesto en el pulmón del ratón confirmó que la inhibición observada de la inducción de pSTAT6 inducida por IL-13 fue un resultado de la actividad del compuesto de prueba. La relación pulmón a plasma a las 5 horas mostró que el compuesto 1 presentó una exposición significativamente mayor en el pulmón que la exposición en plasma en ratones.
Ensayo 4: Inhibición de la liberación de TARC provocada por TSLP en células mononucleares de sangre periférica humana
La linfopoyetina del estroma tímico (TSLP) y la quimiocina regulada por activación del timo (TARC) se sobreexpresan en las vías respiratorias del asmático y se correlacionan con la gravedad de la enfermedad. En los pulmones, las células epiteliales bronquiales pueden liberar TSLP en respuesta a alérgenos e infecciones virales. Las señales de TSLP a través de un IL-7Ra/heterodímero TSLPR se encuentran en un amplio intervalo de tejidos y tipos de células, que incluye células epiteliales, células endoteliales, neutrófilos, macrófagos y mastocitos. La unión de TSLP a su receptor induce un cambio conformacional que activa JAK1 y JAK2 para fosforilar varios factores de transcripción, que incluye a STATS y STATS. En las células inmunitarias, esto desencadena una cascada de eventos intracelulares que resultan en la proliferación celular, antiapoptosis, migración de células dendríticas y producción de citocinas y quimiocinas Th2. En las células mononucleares de sangre periférica (PBMC), la TSLP tiene un efecto proinflamatorio al activar las células dendríticas mieloides para atraer y estimular las células T, un proceso mediado por el quimioatrayente TARC.
En este ensayo, se demostró que la estimulación con TSLP induce la liberación de TARC de las PBMC y que esta respuesta se atenúa de manera dependiente de la dosis tras el tratamiento con el compuesto. Se midieron las potencias de los compuestos de prueba para determinar la inhibición de la liberación de TARC.
Se descongelaron alícuotas de PBMC (previamente aisladas de sangre completa y congeladas en alícuotas a -80 °C) de 3 a 5 donantes a 37 °C y se añadieron gota a gota a 40 ml de medio RPMI completo, pre-calentado, y filtrado de forma estéril en tubos Falcon de 50 ml. Las células se sedimentaron y se resuspendieron en medio completo a 2,24 x 106 células/ml. Las células se sembraron a 85 pl (190000 células) por pocillo en una microplaca de cultivo de tejidos de 96 pocillos de fondo plano tratados. Las células se dejaron reposar durante 1 hora a 37 °C con CO2 al 5 %.
Los compuestos se recibieron como soluciones madres 10 mM en DMSO. Se realizaron diluciones en serie de 3,7 veces para generar 9 concentraciones del compuesto de prueba en DMSO a 300X la concentración final de prueba del ensayo. Se realizaron diluciones intermedias de 150 veces en medio completos para generar el compuesto a 2X la concentración final de prueba del ensayo con DMSO al 0,2 %. Después del período de reposo de 1 hora, Se añadió 95 pl de compuesto 2X a cada pocillo de PBMC, para un intervalo de concentración final del ensayo de 33,33 pM a 0,95 pM. Se añadió 95 pl de DMSO al 0,2 % en medio completo a los pocillos de control no tratados. Las células se trataron previamente con el compuesto durante 1 hora a 37 °C con CO2 al 5 % antes de la estimulación.
La proteína recombinante TSLP humana se reconstituyó a 10 pg/ml en DPBS estéril con BSA al 0,1 % y se almacenó en alícuotas a -20 °C. Inmediatamente antes de su uso, se descongeló y preparó una alícuota a 20X la concentración final del ensayo en medio completo. Se añadió 10 pl de TSLP 20X a cada pocillo de PBMC, para una concentración final de ensayo de 10 ng/ml. Se añadió 10 pl de medio completo a los pocillos de control no estimulados. Las células se estimularon en presencia del compuesto durante 48 horas a 37 °C con CO2 al 5 %.
Seguido de la estimulación, se cosecharon los sobrenadantes del cultivo celular y se detectaron los niveles de TARC mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), mediante el uso del kit Human CCL17/TARC Quantikine ELISA (R&D Systems #DDN00) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Para el análisis de dosis respuesta, se representó el log [compuesto de prueba (M)] frente a los valores de por ciento de respuesta para cada donante, y se determinaron los valores de IC50 mediante el uso de un análisis de regresión no lineal con el software GraphPad Prism mediante el uso del algoritmo dosis-respuesta sigmoideo de 4 parámetros con pendiente variable. Los datos se expresan como valores medios de pIC50 (logaritmo decimal negativo de IC50) calculados a partir de los valores de pIC50 de los donantes individuales y redondeado a un decimal. Los valores de potencia para la inhibición por compuestos originales y sus análogos modificados con desfluoro se resumen en la Tabla 3.
Tabla 3: Valores de potencia (pIC50) de los compuestos de prueba para la inhibición de la liberación de TARC provocada por TSLP en células mononucleares de sangre periférica humana
Ensayo 5: Metabolismo pulmonar S9
La estabilidad metabólica in vitro de los compuestos 1 y C-1 se evaluó en la fracción S9 de pulmón humano (compuesto 1 pM; proteína S91 mg/ml). Se analizaron muestras de 0, 15, 30 y 60 minutos para determinar el compuesto original mediante LC-MS/MS de alta resolución. Las fracciones S9 de pulmón humano (lote 1410245) se adquirieron de XenoTech LLC (Lenexa, KS). El NADPH (Sigma Aldrich, N1630) y el 5-fosfosulfato de 3-fosfoadenosina (PAPS) (Sigma Aldrich, A1651) se adquirieron de Sigma Aldrich (St. Louis, MO). El acetonitrilo y el agua se obtuvieron de VWR (Radnor, PA) y fueron de calidad HPLC o mejor. El raloxifeno y el ácido fórmico se adquirieron de Sigma Aldrich (St. Louis, MO). Las incubaciones de S9 de pulmón se realizaron en un baño de agua a 37 °C en una placa de polipropileno de 96 pocillos. Las soluciones de S9 de pulmón consistieron de fosfato de potasio 100 mM tamponado a pH 7,4 (BD Biosciences, Woburn, MA) suplementado con NADPH 1 mM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), cloruro de magnesio 3 mM (Sigma Aldrich, M1028) y en presencia de cofactor PAPS 100 pM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), con concentraciones finales de incubación de proteína de 1 mg/ml. Soluciones madres de raloxifeno (n=1) y del compuesto (n=1) en DMSO 10 mM se diluyeron en tampón y se puntearon en las incubaciones para producir concentraciones de sustrato de1 pM (DMSO al 0,001 % v/v). Los volúmenes de incubación consistieron de 400 pl y los puntos de tiempo se tomaron a los 0, 15, 30 y 60 minutos mediante la eliminación de alícuotas de 70 pl y dilución en 140 pl de acetonitrilo (0 % de ácido fórmico). Todas las muestras se centrifugaron a 2250 g durante 10 minutos a 5 °C. Se tomó el sobrenadante (50 |jl) de las muestras centrifugadas y se diluyó en 100 |jl de agua para HPLC que contiene el estándar interno. Las muestras se procesaron en un muestreador automático Dionex Ultimate 3000 y se analizaron mediante el uso de un espectrómetro de masas de alta resolución Thermo Q-Exactive (Thermo, Waltham, MA) en modo de escaneo completo junto con una columna Atlantis T3 de 3 jM - 2,1 x 50 mm (Waters Inc., 186003717). La fase móvil A consistió de agua ± 0,2 % de ácido fórmico y la fase móvil B consistió de acetonitrilo 0,2 % de ácido fórmico. La integración del pico se logró mediante el uso del software Gubbs GMSU (Gubbs Inc., Alpharetta, GA). Para cada muestra, las relaciones del área del pico se calcularon dividiendo el área del pico del analito entre el área del pico del estándar interno. Para cada incubación, las relaciones del área del pico de los analitos en cada t0 se estableció en 100 % y las relaciones del área del pico de las muestras de 60 minutos se convirtieron en porcentajes restantes con relación a al t0 correspondiente. La determinación de la formación de metabolitos de sulfato se realizó cualitativamente mediante la observación del pico de elución temprana en el canal iónico original que, según datos internos históricos, corresponden al metabolito O-sulfato de cada compuesto original. Los resultados del ensayo se resumen en la Tabla 4 (n=2 réplicas).
Cuando se compara con su correspondiente análogo fluorado (compuestos C-1 a C-6), los compuestos 1-6 dieron lugar a un metabolismo de sulfatación significativamente menor.
BD Biosciences) se usa para detectar la fosforilación de STATS.
Ensayo 6: Farmacocinética en plasma y pulmón en ratón.
Las concentraciones en plasma y pulmón de los compuestos de prueba y las relaciones de los mismos se determinaron de la siguiente manera. En el ensayo se usaron ratones BALB/c de Charles River Laboratories. Los compuestos de prueba se formularon individualmente en propilenglicol al 20 % en tampón citrato a pH 4 a una concentración de 0,2 mg/ml y se introdujeron 50 j l de la solución dosificada en la tráquea de un ratón mediante aspiración oral. En varios putos de tiempo (típicamente 0,167, 2, 6, 24 h) después de la dosificación, se extrajeron muestras de sangre mediante punción cardíaca y se extirparon los pulmones intactos de los ratones. Las muestras de sangre se centrifugaron (centrífuga Eppendorf, 5804R) durante 4 minutos a aproximadamente 12000 rpm a 4 °C para colectar el plasma. Los pulmones se secaron con almohadillas, se pesaron y se homogeneizaron a una dilución de 1:3 en agua estéril. Las concentraciones en plasma y pulmón del compuesto de prueba se determinaron mediante análisis LC-MS frente a estándares analíticos que se construyeron en una curva estándar en la matriz de prueba. Se determinó una relación pulmón-plasma como la relación del AUC del pulmón en jg h/g al AUC plasmática en jg h/ml, donde el AUC se define convencionalmente como el área bajo la curva de concentración del compuesto de prueba frente al tiempo.
Tabla 5: Exposición al plasma y al tejido pulmonar seguido de una única administración por aspiración oral de m r
Ensayo 7: Ensayo de supervivencia de eosinófilos mediado por IL-5
La potencia de los compuestos de prueba para la supervivencia de eosinófilos mediada por IL-5 se puede medir en eosinófilos humanos aislados de sangre completa humana (AllCells). Debido a que la IL-5 envía señales a través de JAK, este ensayo proporciona una medida de la potencia celular de JAK.
Los eosinófilos humanos se aíslan de sangre completa humana fresca (AllCells) de donantes sanos. La sangre se mezcla con dextrano al 4,5 % (Sigma-Aldrich) en una solución de cloruro de sodio al 0,9 % (Sigma-Aldrich). Los glóbulos rojos se dejan sedimentar durante 35 minutos. La capa superior rica en leucocitos se elimina y se coloca sobre Ficoll-Paque (GE Healthcare) y se centrifuga a 600 g durante 30 minutos. Las capas de plasma y células mononucleares se eliminan antes de lisar la capa de granulocitos con agua para eliminar los glóbulos rojos contaminantes. Los eosinófilos se purifican adicionalmente mediante el uso de un kit de aislamiento de eosinófilos humanos (Miltenyi Biotec). Una fracción de los eosinófilos purificados se incuba con FITC anti-CD16 (Miltenyi Biotec) durante 10 minutos a 4 °C en la oscuridad. La pureza se analiza mediante el uso de un citómetro de flujo LSRII (BD Biosciences).
Las células se cultivan en una incubadora humidificada a 37 °C y CO2 al 5 % en RPMI 1640 (Life Technologies) suplementada con suero bovino fetal al 10 % inactivado por calor (FBS, Life Technologies), Glutamax 2 mM (Life Technologies), HEPES 25 mM (Life Technologies) y 1X Pen/Strep (Life Technologies). Las células se siembran a razón de 10000 células/pocillo en medio (50 pl). La placa se centrifuga a 300 g durante 5 minutos y los sobrenadantes se eliminan. Los compuestos se diluyeron en serie en DMSO y luego se diluyeron otras 500 veces hasta una concentración final de ensayo de 2x en el medio. Los compuestos de prueba (50 pl/pocillo) se añaden a las células y se incuban a 37 °C, CO2 al 5 % durante 1 hora, seguido de la adición de IL-5 (R&D Systems; concentraciones finales de 1 ng/ml y 10 pg/ml) en medio de ensayo precalentados (50 pl) durante 72 horas.
Después de la estimulación con citocinas, las células se centrifugan a 300 g durante 5 minutos y se lavan dos veces con DPBS frío (Life Technologies). Para acceder a la viabilidad y la apoptosis, las células se incuban con yoduro de propidio (Thermo Fisher Scientific) y APC Anexina V (BD Biosciences) y se analizan mediante el uso de un citómetro de flujo LSRII (BD Biosciences). Los valores de IC50 se determinan a partir del análisis de las curvas de viabilidad del por ciento de viabilidad celular frente a la concentración del compuesto. Los datos se expresaron como valores de pIC50 (logaritmo decimal negativo IC50).
Ensayo 8: Inhibición de IFNy y quimiocinas CXCL9 y CXCL10 inducidas por IL-27 en cultivos de vías respiratorias 3D humanas
Los cultivos de tejido EpiAirway se obtuvieron de Mattek (AIR-100). Los cultivos se derivaron de donantes asmáticos. En un inserto de cultivo celular, se cultivaron y diferenciaron células epiteliales traqueales/bronquiales de origen humano sobre un soporte de membrana porosa, lo que permitió una interfaz aire-líquido con un medio de cultivo calentado debajo de las células y una atmósfera de prueba gaseosa arriba. Los tejidos se cultivaron en medio de mantenimiento (Mattek, AIR-100-MM) en una incubadora humidificada a 37 °C y CO2 al 5 %. Se hicieron pruebas a cuatro donantes. El día 0, los cultivos de tejidos se trataron con los compuestos de prueba en una interfaz líquida a 10 pM, 1 pM y/o 0,1 pM. Los compuestos se diluyeron en dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma) hasta una concentración final del 0,1 %. Se usó DMSO al 0,1 % como control de vehículo. Los compuestos de prueba se incubaron con cultivos durante 1 hora a 37 °C, CO2 al 5 %, seguido de la adición de medio precalentados que contienen IFN<y>(R&D Systems) o IL-27 (R&D Systems) en una concentración final de 100 ng/ml. Los cultivos de tejido se mantuvieron durante 8 días. El medio se reemplazó cada 2 días con medio fresco que contiene compuestos e IFNy o IL-27. El día 8, se colectaron los cultivos de tejidos y sobrenadantes para su análisis. Se analizaron muestras de sobrenadante para determinar CXCL10 (IP-10) y CXCL9 (MIG) mediante el uso de análisis luminex (EMD Millipore). Los datos se expresaron como % de inhibición /- desviación estándar (±STDV). El por ciento de inhibición se determinó mediante la potencia inhibitoria del compuesto contra IFNy o secreción de CXCL10 o CXCL9 inducida por IL-27 en comparación con células tratadas con vehículo. Los datos son el promedio de 4 donantes. El compuesto 1 fue capaz de inhibir la secreción de CXCL10 inducida por IFNy en un 100 % ± 1,0 (a 10 pM), 76 % ± 13 (a 1 pM) y 18 % ± 22 (a 0,1 pM) en comparación con el control de vehículo. El compuesto 1 fue capaz de inhibir la secreción de CXCL9 inducida por IFNy en un 100 % ± 0,1 (a 10 pM), 93 % ± 6,9 (a 1 pM) y 16 % ± 41 (a 0,1 pM) en comparación con el vehículo. El compuesto 1 fue capaz de inhibir la secreción de c Xc L10 inducida por IL-27 en un 100 % ± 0,0 (a 10 pM), 98 % ± 1,0 (a 1 pM) y 25 % ± 26 (a 0,1 pM) en comparación con el control de vehículo. El compuesto 1 fue capaz de inhibir la secreción de CXCL9 inducida por<i>L-27 en un 100 % ± 0,0 (a 10 pM), 97 % ± 2,0 (a 1 pM) y 52 % ± 18 (a 0,1 pM) en comparación con el control de vehículo.
Ensayo 9: Ensayo de potencia celular JAK: Inhibición IL-2/anti-CD3
Estimulación de IFNy en PBMC humanas
La potencia de los compuestos de prueba para la inhibición del interferón gamma (IFNy) estimulado por interleucina-2 (IL-2)/anti-CD3 se puede medir en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas aisladas de sangre completa humana (Stanford Blood Center). Debido a que la IL-2 envía señales a través de JAK, este ensayo proporciona una medida de la potencia celular de JAK.
(1) Las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) se aislaron de sangre completa humana de donantes sanos mediante el uso de un gradiente de ficoll. Las células se cultivaron en una incubadora humidificada a 37 °C y CO2 al 5 % en RPMI (Life Technologies) suplementada con suero bovino fetal al 10 % inactivado por calor (FBS, Life Technologies), Glutamax 2 mM (Life Technologies), HEPES 25 mM (Life Technologies) y Pen/Strep 1X (Life Technologies). Las células se sembraron a razón de 200000 células/pocillo en medio (50 pl) y se cultivaron durante 1 h. Los compuestos se diluyeron en serie en DMSO y luego se diluyeron otras 500 veces (hasta una concentración final de ensayo 2x) en medio. Se añadieron los compuestos de prueba (100 pl/pocillo) a las células y se incubaron a 37 °C, CO2 al 5 % durante 1 h, seguido de la adición de IL-2 (R&D Systems; concentración final 100 ng/ml) y anti-CD3 (BD Biosciences; concentración final 1 pg/ml) en medio de ensayo precalentado (50 pl) durante 24 h.
(2) Después de la estimulación con citocinas, las células se centrifugaron a 500 g durante 5 minutos y los sobrenadantes se eliminaron y se congelaron a -80 °C. Para determinar la potencia inhibitoria del compuesto de prueba en respuesta a IL-2/anti-CD3, se midieron las concentraciones de IFNy en el sobrenadante mediante ELISA (R&D Systems). Los valores de IC50 se determinaron a partir del análisis de las curvas de inhibición de la concentración de IFNy frente a la concentración del compuesto. Los datos se expresaron como valores de pIC50 (logaritmo decimal negativo IC50).
Ensayo 10: Ensayo de potencia celular JAK: Inhibición de pSTATS estimulada por IL-2 en células T CD4+
La potencia de los compuestos de prueba para la inhibición de la fosforilación de STATS estimulada por interleucina-2 (IL-2)/anti-CD3 se puede medir en células T CD4 positivas (CD4+) en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas aisladas de sangre completa humana (Stanford Blood Center) mediante el uso de citometría de flujo. Debido a que la IL-2 envía señales a través de JAK, este ensayo proporciona una medida de la potencia celular de JAK.
Las células T CD4+ se identificaron mediante el uso de un anticuerpo anti-CD4 conjugado con ficoeritrobilina (PE) (clon RPA-T4, BD Biosciences), mientras que un anticuerpo anti-pSTAT5 conjugado con Alexa Fluor 647 (pY694, clon 47, BD Biosciences) se usó para detectar la fosforilación de STATS.
(1) Se siguió el protocolo del ensayo 9, párrafo (1), con la excepción de que la estimulación de citocinas con anti-CD3 se realizó durante 30 minutos en lugar de 24 h.
(2) Después de la estimulación con citocinas, las células se fijaron con una solución de fijación precalentada (200 pl; BD Biosciences) durante 10 minutos a 37 °C, CO2 al 5 %, se lavaron dos veces con tampón DPBS (1 ml, Life Technologies) y se resuspendieron en tampón Perm III frío (1000 pl, BD Biosciences) durante 30 minutos a 4 °C. Las células se lavaron dos veces con FBS al 2 % en DPBS (tampón FACS) y luego se resuspendieron en tampón FACS (100 pl) que contiene PE anti-CD4 (dilución 1:50) y anti-CD3 anti-CD3Alexa Fluor 647 (dilución 1:5) durante 60 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de la incubación, las células se lavaron dos veces en tampón FACS antes de analizarlas mediante el uso de un citómetro de flujo LSRII (BD Biosciences). Para determinar la potencia inhibitoria de los compuestos de prueba en respuesta a IL-2/anti-CD3, se midió la intensidad fluorescente media (MFI) de pSTAT5 en células T CD4+. Los valores de IC50 se determinaron a partir del análisis de las curvas de inhibición de MFI frente a la concentración del compuesto. Los datos se expresaron como valores de pIC50 (logaritmo decimal negativo IC50).
Ensayo 11: Ensayo de potencia celular JAK: Inhibición de pSTAT6 estimulada por IL-4 en células T CD3+
La potencia de los compuestos de prueba para la inhibición de la fosforilación de STAT6 estimulada por interleucina-4 (IL-4) se puede medir en células T CD3 positivas (CD3+) en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas aisladas de sangre completa humana (Stanford Blood Center) mediante el uso de citometría de flujo. Debido a que la IL-4 envía señales a través de JAK, este ensayo proporciona una medida de la potencia celular de JAK.
Las células T CD3+ se identificaron mediante el uso de un anticuerpo anti-CD3 conjugado con ficoeritrobilina (PE) (clon UCHT1, BD Biosciences), mientras que un anticuerpo anti-pSTAT6 conjugado con Alexa Fluor 647 (pY641, clon 18/P, BD Biosciences) se usó para detectar la fosforilación de STAT6.
Las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) se aislaron de sangre completa humana de donantes sanos como en los ensayos 9 y 10. Las células se sembraron a razón de 250000 células/pocillo en medio (200 pl), se cultivaron durante 1 h y luego se resuspendieron en medio de ensayo (50 pl) (RPMI suplementado con albúmina sérica bovina al 0,1 % (Sigma), Glutamax 2 mM, HEPES 25 mM y Penstrep 1X) que contiene diversas concentraciones de compuestos de prueba. Los compuestos se diluyeron en serie en DMSO y luego se diluyeron otras 500 veces (hasta una concentración final de ensayo 2x) en medio de ensayo. Los compuestos de prueba (50 pl) se incubaron con células a 37 °C, CO2 al 5 % durante 1 h, seguido de la adición de IL-4 (50 pl) (R&D Systems; concentración final 20 ng/ml) en medios de ensayo precalentados durante 30 minutos. Después de la estimulación con citocinas, las células se fijaron con solución fijadora precalentada (100 pl) (BD Biosciences) durante 10 minutos a 37 °C, CO2 al 5 %, se lavaron dos veces con tampón FACS (1 ml) (FBS al 2 % en DPBS), y se resuspendieron en tampón Perm III frío (1000 pl) (BD Biosciences) durante 30 minutos a 4 °C. Las células se lavaron dos veces con tampón FACS y luego se resuspendieron en tampón FACS (100 pl) que contiene PE anti-CD3 (dilución 1:50) y Alexa Fluor 647 anti-pSTAT6 (dilución 1:5) durante 60 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de la incubación, las células se lavaron dos veces en tampón FACS antes de analizarlas mediante el uso de un citómetro de flujo LSRII (BD Biosciences).
Para determinar la potencia inhibitoria del compuesto de prueba en respuesta a IL-4, se midió la intensidad fluorescente media (MFI) de pSTAT6 en células T CD3+. Los valores de IC50 se determinaron a partir del análisis de las curvas de inhibición de MFI frente a la concentración del compuesto. Los datos se expresaron como pIC50 (logaritmo decimal negativo IC50).
Ensayo 12: Ensayo de potencia celular JAK: Inhibición de pSTAT3 estimulada por IL-6 en células T CD3+
Puede usarse un protocolo análogo al del ensayo 11 para determinar la potencia del compuesto de prueba para la inhibición de la fosforilación de STAT3 estimulada por interleucina-6 (IL-6). Se usó un anticuerpo anti-pSTAT3 conjugado con Alexa Fluor 647 (pY705, clon 4/P, BD Biosciences) para detectar la fosforilación de STAT3.
Ensayo 13: Modelo murino de inflamación eosinofílica del pulmón inducida por Alternaria alternata
La eosinofilia de las vías respiratorias es un sello distintivo del asma humana.Alternaría alternataes un aeroalérgeno fúngico que puede exacerbar el asma en humanos e induce inflamación eosinofílica en los pulmones de ratones (Havaux y otros.Clin Exp Inmunol.2005 Feb;139(2): 179-88). En ratones, se ha demostrado que la alternaria activa indirectamente las células linfoides innatas tipo 2 residentes en el tejido del pulmón, que responden a (por ejemplo, IL-2 e IL-7) y liberan citocinas dependientes de JAK (por ejemplo, IL-5 e IL-13) y coordinan la inflamación eosinofílica (Bartemes y otros.J Inmunol.2012 Feb 1; 188(3): 1503-13).
En el estudio pueden usarse ratones macho C57 de Taconic de siete a nueve semanas de edad. El día del estudio, los animales se anestesiaron ligeramente con isoflurano y se les administró vehículo o el compuesto de prueba (0,03 - 1,0 mg/ml, 50 pl de volumen total en varias respiraciones) mediante aspiración orofaríngea. Los animales se colocaron en decúbito lateral después de la dosis y se monitorearon para que se recuperaran por completo de la anestesia antes de regresarlos a su jaula de origen. Una hora más tarde, los animales se volvieron a anestesiar brevemente y se exponen a vehículo o extracto de alternaria (200 pg de extracto total suministrado, 50 pl de volumen total) mediante aspiración orofaríngea antes de monitorear su recuperación de la anestesia y devolverlos a su jaula. Cuarenta y ocho horas después de la administración de alternaria, se colectó líquido de lavado broncoalveolar (BALF) y se contaron los eosinófilos en el BALF mediante el uso del sistema de hematología Advia 120 (Siemens). La actividad en el modelo se evidenció por una disminución en el nivel de eosinófilos presentes en el BALF de los animales tratados a las cuarenta y ocho horas en comparación con los animales de control tratados con vehículo y expuestos a alternaria. Los datos se expresaron como por ciento de inhibición de los tratados con vehículo, respuesta de eosinófilos BALF expuestos a alternaria. Para calcular el por ciento de inhibición, la cantidad de eosinófilos BALF para cada condición se convirtió en por ciento promedio de los tratados con vehículo, los eosinófilos BALF expuestos con alternaria y se restó del cien por ciento.
Ensayo 14: Ensayo de potencia celular JAK: Inhibición de pSTATI inducida por IFNy
La potencia de los compuestos de prueba para la inhibición de la fosforilación de STAT1 estimulada por interferón gamma (IFN<y>) se midió en monocitos CD14 positivos (CD14+) derivados de sangre completa humana (Stanford Blood Center) mediante el uso de citometría de flujo. Debido a que el IFNy envía señales a través de JAK, este ensayo proporciona una medida de la potencia celular de JAK.
Los monocitos se identificaron mediante el uso de un anticuerpo anti-CD14 conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (clon RM052, Beckman Coulter), y se usó un anticuerpo anti-pSTAT1 conjugado con Alexa Fluor 647 (pY701, clon 4a, BD Biosciences) para detectar la fosforilación de STAT1.
Se aislaron células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) a partir de sangre completa humana de donantes sanos mediante el uso de un gradiente de ficoll. Las células se cultivaron en una incubadora humidificada a 37 ° C y CO2 al 5 % en RPMI (Life Technologies) suplementada con suero bovino fetal al 10 % (FBS, Life Technologies), Glutamax 2 mM (Life Technologies), HEPES 25 mM (Life Technologies) y Pen/Strep 1X (Life Technologies). Las células se sembraron a razón de 250000 células/pocillo en medio (200 pl), se cultivaron durante 2 h y se resuspendieron en medio de ensayo (50 pl) (RPMI suplementado con albúmina sérica bovina al 0,1 % (Sigma), Glutamax 2 mM, 25 mM HEPES y Penstrep 1X) que contienen diversas concentraciones del compuesto de prueba. El compuesto se diluyó en serie en DMSO y luego se diluyó otras 1000 veces en medio para llevar la concentración final de DMSO al 0,1 %. Las diluciones del compuesto de prueba se incubaron con células a 37 °C, de CO2 al 5 % durante 1 h, seguido de la adición de IFN<y>precalentado (R&D Systems) en medio (50 pl) a una concentración final de 0,6 ng/ml durante 30 minutos. Después de la estimulación con citocinas, las células se fijaron con solución fijadora precalentada (100 pl) (BD Biosciences) durante 10 minutos a 37 °C, CO2 al 5 %, se lavó dos veces con tampón FACS (1 ml) (BSA al 1 % en PBS), se resuspendió en tampón FITCFACS anti-CD14 1:10 (100 pl) y se incubó a 4 °C durante 15 minutos. Las células se lavaron una vez y luego se resuspendieron en tampón Perm III enfriado con hielo (BD Biosciences) (100 |jl) durante 30 minutos a 4 °C. Las células se lavaron dos veces con tampón FACS y luego se resuspendieron en tampón anti-pSTAT1 Alexa Fluor 647:FACS 1:10 (100 j l ) durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad, se lavaron dos veces en tampón FACS y se analizaron mediante el uso de un citómetro de flujo MACSQuant (Miltenyi).
Para determinar la potencia inhibitoria del compuesto de prueba, se midió la intensidad fluorescente media (MFI) de pSTAT1 en monocitos CD14+. Los valores de IC50 se determinaron a partir del análisis de las curvas de inhibición de MFI frente a la concentración del compuesto. Los datos se expresaron como valores de pIC50 (logaritmo decimal negativo IC50). El compuesto 1 mostró un valor de pIC50 de 7,5 en este ensayo.
Ensayo 15: Ensayo de potencia celular JAK: Inhibición de pSTAT5 inducida por GM-CSF
La potencia de los compuestos de prueba para la inhibición de la fosforilación de STATS estimulada por el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) se midió en monocitos CD14 positivos (CD14+) derivados de sangre completa humana (Stanford Blood Center) mediante el uso de citometría de flujo. Debido a que el GM-CSF envía señales a través de JAK, este ensayo proporciona una medida de la potencia celular de JAK.
Los monocitos se identificaron mediante el uso de un anticuerpo anti-CD14 conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (clon RM052, Beckman Coulter), y se usó un anticuerpo anti-pSTAT5 conjugado con Alexa Fluor 647 (pY694, BD Biosciences) para detectar la fosforilación de STATS.
Se aislaron células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) a partir de sangre completa humana de donantes sanos mediante el uso de un gradiente de ficoll. Las células se cultivaron en una incubadora humidificada a 37 ° C y CO2 al 5 % en RPMI (Life Technologies) suplementada con de suero bovino fetal al 10 % (FBS, Life Technologies), Glutamax 2 mM (Life Technologies), HEPES 25 mM (Life Technologies) y Pen/Strep 1X (Life Technologies). Las células se sembraron a razón de 250000 células/pocillo en medio (200 jl), se cultivaron durante 2 h y se resuspendieron en medio de ensayo (50 j l) (RPMI suplementado con albúmina sérica bovina al 0,1 % (Sigma), Glutamax 2 mM, 25 mM HEPES y Penstrep 1X) que contienen diversas concentraciones de compuestos de prueba. El compuesto se diluyó en serie en DMSO y luego se diluyó otras 1000 veces en medio para llevar la concentración final de DMSO al 0,1 %. Las diluciones del compuesto de prueba se incubaron con células a 37 °C, CO2 al 5 % durante 1 h, seguido de la adición de GM-CSF (R&D Systems) precalentado en medio (50 j l ) a una concentración final de 0,3 ng/ml durante 15 minutos. Después de la estimulación con citocinas, las células se fijaron con solución fijadora precalentada (100 j l) (BD Biosciences) durante 10 minutos a 37 °C, CO2 al 5 %, se lavó dos veces con tampón FACS (1 ml) (BSA al 1 % en PBS), se resuspendió en tampón FITCFACS anti-CD14 1:10 (100 j l ) y se incubó a 4 °C durante 15 minutos. Las células se lavaron una vez y luego se resuspendieron en tampón Perm III enfriado con hielo (BD Biosciences) (100 j l) durante 30 minutos a 4 °C. Las células se lavaron dos veces con tampón FACS y luego se resuspendieron en tampón anti-pSTAT1 Alexa Fluor 647:FACS (100 j l) durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad, se lavaron dos veces en tampón FACS y se analizaron mediante el uso de un citómetro de flujo MACSQuant (Miltenyi).
Para determinar la potencia inhibitoria del compuesto de prueba, se midió la intensidad fluorescente media (MFI) de pSTAT5 en monocitos CD14+. Los valores de IC50 se determinaron a partir del análisis de las curvas de inhibición de MFI frente a la concentración del compuesto. Los datos se expresaron como valores de pIC50 (logaritmo decimal negativo IC50). El compuesto 1 exhibió un valor de pIC50 de 6,9 en este ensayo.
Ensayo 16: Ensayo de potencia celular JAK: Inhibición de pSTAT4 inducida por IL-12
La potencia de los compuestos de prueba para la inhibición de la fosforilación de STAT4 estimulada por interleucina-12 (IL-12) se midió en células T CD3 positivas (CD3+) derivadas de sangre completa humana (Stanford Blood Center) mediante el uso de citometría de flujo. Debido a que la IL-12 envía señales a través de JAK, este ensayo proporciona una medida de la potencia celular de JAK.
Las células T CD3+ se identificaron mediante el uso de un anticuerpo anti-CD3 conjugado con ficoeritrina (PE) (clon UCHT1, BD Biosciences) y se usó un anticuerpo anti-pSTAT4 conjugado con Alexa Fluor 647 (clon 38/p-Stat4, BD Biosciences) para detectar la fosforilación de STAT4.
Se aislaron células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) a partir de sangre completa humana de donantes sanos mediante el uso de un gradiente de ficoll. Las células se cultivaron en RPMI (Life Technologies) suplementado con suero bovino fetal al 10 % (FBS, Life Technologies), Glutamax 2 mM (Life Technologies), HEPES 25 mM (Life Technologies), Pen/Strep 1X (Life Technologies), anticuerpo anti-CD3 purificado unidos a placa (5 jg/ml, clon UCHT1, BD Biosciences) y anticuerpo anti-CD28 soluble (1 jg/ml, clon CD28,2, BD Biosciences) durante 3 días en una incubadora humidificada a 37 °C y CO2 al 5 %. Las células se cosecharon, se lavaron con medio y luego se resuspendieron en medio que contiene interleucina-2 (IL-2, 10 ng/ml, R&D Systems). Las células se cultivaron durante 3 días en una incubadora humidificada a 37 ° C y CO2 al 5 %. Las células se cosecharon, se lavaron con RPMI y se sembraron a razón de 250 000 células/pocillo en medio (200 jl), se cultivaron durante 2 h y se resuspendieron en medio de ensayo (50 j l) (RPMI suplementado con albúmina sérica bovina al 0,1 % (Sigma), Glutamax 2 mM, HEPES 25 mM y Penstrep 1X) que contienen diversas concentraciones de compuestos de prueba. El compuesto se diluyó en serie en DMSO y luego se diluyó otras 1000 veces en medio para llevar la concentración final de DMSO al 0,1 %. Las diluciones del compuesto de prueba se incubaron con células a 37 °C, CO2 al 5 % durante 1 h, seguido de la adición de IL-12 precalentada (R&D Systems) en medio (50 pl) a una concentración final de 10 ng/ml durante 30 minutos. Después de la estimulación con citocinas, las células se fijaron con solución fijadora precalentada (100 pl) (BD Biosciences) durante 10 minutos a 37 °C, CO2 al 5 %, se lavó dos veces con tampón FACS (1 ml) (BSA al 1 % en PBS) y se resuspendió en tampón Perm III enfriado con hielo (1000 pl) (BD Biosciences) durante 30 minutos a 4 °C. Las células se lavaron dos veces con tampón FACS y luego se resuspendieron en tampón FACS (100 pl) que contiene anti-CD3 PE (dilución 1:50) y anti-pSTAT4 Alexa Fluor 647 (dilución 1:10) durante 45 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de la incubación, las células se lavaron dos veces en tampón FACS antes de analizarlas mediante el uso de un citómetro de flujo MACSQuant (Miltenyi). Para determinar la potencia inhibitoria del compuesto de prueba, se midió la intensidad fluorescente media (MFI) de pSTAT4 en células T CD3+. Los valores de IC50 se determinaron a partir del análisis de las curvas de inhibición de MFI frente a la concentración del compuesto. Los datos se expresaron como valores de pIC50 (logaritmo decimal negativo IC50). El compuesto 1 exhibió un valor de pIC50 de 6,0 en este ensayo.
Ensayo 17: Inhibición de la secreción de IFN<y>en un ensayo de reacción de linfocitos mixtos
El ensayo de reacción de linfocitos mixtos es un ensayo in vitro que imita el rechazo de un trasplante. Las células T de un donante se cultivan con células dendríticas alogénicas de otro donante. Esta reacción induce una respuesta inmune celular tal como secreción de IFN<y>.
Se aislaron monocitos CD14+ de sangre completa humana (centro de sangre de Stanford) del donante A mediante el uso de un gradiente de ficoll y separación magnética (microperlas CD14, Miltenyi). Los monocitos se diferenciaron en células dendríticas mediante el cultivo de células en RPMI (Life Technologies) suplementado con suero bovino fetal al 10 % (FBS, Life Technologies), Glutamax 2 mM (Life Technologies), Pen/Strep 1X (Life Technologies), interleucina-4 (IL- 4, 50 ng/ml, R&D Systems) y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF, 50 ng/ml, R&D Systems) durante 6 días en una incubadora humidificada a 37 °C y CO2 al 5 %. Las células dendríticas se cosecharon, se lavaron con medio y luego se activaron mediante cultivo de células en medio que contiene lipopolisacárido deEscherichia coli(<l>P<s>, 100 ng/ml, Sigma) durante 24 horas en una incubadora humidificada a 37 °C y CO2 al 5 %. Las células se cosecharon, se lavaron con medio, se resuspendieron a 400000 células/ml en medio y se sembraron en placas a 10 000 células/pocillo/25 pl. Las células T CD4+ se aislaron recientemente de sangre completa humana (centro de sangre de Stanford) del donante B mediante el uso de un gradiente de ficoll y separación magnética (kit de aislamiento de células T CD4+, Miltenyi). Las células T se resuspendieron a 4000000 células/ml en RPMI (Life Technologies) suplementado con suero bovino fetal al 10 % (FBS, Life Technologies), Glutamax 2 mM (Life Technologies), HEPES 25 mM (Life Technologies) y Pen/Strep 1X (Life Technologies). Las células T CD4+ se mezclaron con las células dendríticas a razón de 100 000 células/pocillo/25 pl. Las células se trataron con los compuestos de prueba (50 pl a 20 pM, 2 pM y/o 0,2 pM) hasta una concentración final de 10 pM, 1 pM y/o 0,1 pM. Los compuestos se diluyeron en dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma) hasta una concentración final del 0,1 %. Se usó DMSO al 0,1 % como control de vehículo. Las células se mantuvieron durante 5 días en una incubadora humidificada a 37 °C y CO2 al 5 %. El día 5, se colectaron los sobrenadantes y se midió el interferón gamma (INFy) mediante el uso de un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). El por ciento de inhibición se determinó mediante la potencia inhibitoria del compuesto contra la secreción de IFNy en comparación con las células tratadas con vehículo. Los datos son el promedio de 4 donantes. El compuesto 1 fue capaz de inhibir la secreción de IFNy en 99 % ± 0,4 (a 10 pM), 76 % ± 10 (a pM) y 43 % ± 12 (a 0,1 pM) en comparación con el control de vehículo.
Ensayo 18: Inhibición de la secreción espontánea de periostina e IL-6 en cultivos de vías respiratorias 3D humanas derivados de donantes asmáticos
Los cultivos de tejido EpiAirway se obtuvieron de Mattek (AIR-100). Las células se derivaron de donantes asmáticos que secretan espontáneamente periostina, una proteína matricelular asociada con el asma mediada por Th2 (eosinófila), e interleucina-6 (IL-6), una citocina inflamatoria que desempeña un papel tanto en el asma Th2 como en el no relacionado con Th2. En un inserto de cultivo celular, se cultivaron y diferenciaron células epiteliales traqueales/bronquiales de origen humano sobre un soporte de membrana porosa, lo que permitió una interfaz airelíquido con un medio de cultivo calentado debajo de las células y una atmósfera de prueba gaseosa arriba. Los tejidos se cultivaron en medio de mantenimiento (Mattek, AIR-100-MM) en una incubadora humidificada a 37 °C y CO2 al 5 %. Se hicieron pruebas a cuatro donantes. El día 0, los cultivos de tejidos se trataron con los compuestos de prueba en la interfaz líquida a 10 pM, 1 pM y/o 0,1 pM. Los compuestos se diluyeron en dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma) hasta una concentración final del 0,1 %. Se usó DMSO al 0,1 % como control de vehículo. Los cultivos de tejido se mantuvieron durante 8 días. El medio se reemplazó cada 2 días con medio fresco que contiene los compuestos. El día 8, se colectaron los sobrenadantes para su análisis. Se analizaron muestras de sobrenadante para detectar periostina e interleucina-6 (IL-6) mediante el uso de un análisis luminex (EMD Millipore). Los datos se expresaron como % de inhibición /- desviación estándar (± STDV). El por ciento de inhibición se determinó mediante la potencia inhibitoria del compuesto contra la secreción espontánea de periostina e IL-6 en comparación con las células tratadas con vehículo. Los datos son el promedio de 3 o 4 donantes. El compuesto 1 fue capaz de inhibir la secreción espontánea de periostina en un 62 % ± 25 (a 10 pM) y un 40 % ± 28 (a 1 pM) en comparación con el control de vehículo. El compuesto 1 fue capaz de inhibir la secreción espontánea de IL-6 en un 91 % ± 9,0 (a 10 pM), un 70 % ± 33 (a 1|jM) y un 10 % ± 40 (a 0,1|jM) en comparación con el vehículo.
Estructura cristalina
Se obtuvo una estructura cocristalina del compuesto C-1 unido a JAK1 humana con una resolución de 2,28 A. Se observó que el ligando se unía en el sitio de unión de ATP. Se identificaron siete interacciones específicas de enlaces de hidrógeno en base a una distancia de 3,5 A o menos entre los átomos donantes y aceptores. De particular interés, se identificó una interacción de enlace de hidrógeno entre el carbonilo de la amida exocíclica del compuesto de C-1 y la cadena lateral de Arg879 de JAK1. Se puede esperar una interacción similar para los compuestos de la invención. En estudios de modelado anteriores, esta interacción se propuso como una forma para proporcionar selectividad para JAK1 sobre otras tirosina quinasas, ya que de cualquier otra manera las quinasas estrechamente relacionadas (por ejemplo, TRKA, VEGFR, ABL1) no poseen un residuo de arginina en la ubicación equivalente. Los resultados observados de la interacción del enlace de hidrógeno en la estructura cristalina y la selectividad del cinoma mejorada en comparación con las series que no poseen la amida exocíclica validan esta hipótesis de diseño.

Claims (25)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un compuesto de fórmula (I):
  2. en donde: n es 0, 1 o 2; R1 es alquilo C1-3; y cada R2 es independientemente alquilo C1-3; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 2. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que tiene la fórmula (II):
  3. 3. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que tiene la fórmula (III):
  4. 4. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde R1 se selecciona del grupo que consiste en etilo, propilo e isopropilo.
  5. 5. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde n es 0.
  6. 6. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde n es 1.
  7. 7. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde n es 1 y R2 es metilo.
  8. 8. Un compuesto de fórmula 1, como se reivindicó en la reivindicación 1:
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
  9. 9. Un compuesto de fórmula 1, como se reivindicó en la reivindicación 1:
  10. 10. Un compuesto de fórmula 2, como se reivindicó en la reivindicación 1:
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
  11. 11. Un compuesto de fórmula 3, como se reivindicó en la reivindicación 1:
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
  12. 12. Un compuesto de fórmula 4, como se reivindicó en la reivindicación 1:
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
  13. 13. Un compuesto de fórmula 5, como se reivindicó en la reivindicación 1:
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
  14. 14. Un compuesto de fórmula 6, como se reivindicó en la reivindicación 1:
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
  15. 15. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un portador farmacéuticamente aceptable.
  16. 16. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 15 en donde la composición es adecuada para la administración por inhalación, por ejemplo, administración por inhalación mediante el uso de un dispositivo de suministro inhalador, tal como un inhalador de polvo seco (DPI), un inhalador de dosis medida (MDI) o un inhalador nebulizador.
  17. 17. Un compuesto, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para usar en el tratamiento de una enfermedad respiratoria en un mamífero.
  18. 18. El compuesto para usar, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, de acuerdo con la reivindicación 17, en donde la enfermedad respiratoria se selecciona del grupo que consiste en asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis quística, neumonitis, fibrosis pulmonar idiopática, lesión pulmonar aguda, síndrome de dificultad respiratoria aguda, bronquitis, enfisema, bronquiolitis obliterante, sarcoidosis, una enfermedad eosinofílica, una infección helmíntica, hipertensión arterial pulmonar, linfangioleiomiomatosis, bronquiectasias, enfermedad pulmonar infiltrativa, neumonitis inducida por fármacos, neumonitis inducida por hongos, aspergilosis broncopulmonar alérgica, neumonitis por hipersensibilidad, granulomatosis eosinofílica con poliangeítis, neumonía eosinofílica aguda idiopática, neumonía eosinofílica crónica idiopática, síndrome hipereosinofílico, síndrome de Loffler, bronquiolitis obliterante con neumonía organizada, enfermedad de injerto contra huésped de pulmón y neumonitis inducida por inhibidores de puntos de control inmunitario.
  19. 19. El compuesto para usar, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, de acuerdo con la reivindicación 17, en donde la enfermedad respiratoria es asma o enfermedad pulmonar obstructiva crónica.
  20. 20. Un compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para usar en el tratamiento del rechazo de trasplante de pulmón en un mamífero.
  21. 21. El compuesto para usar, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, de acuerdo con la reivindicación 20, en donde el rechazo de trasplante de pulmón se selecciona del grupo que consiste en disfunción primaria del injerto, neumonía organizada, rechazo agudo, bronquiolitis linfocítica y disfunción crónica del aloinjerto de pulmón.
  22. 22. El compuesto para usar, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, de acuerdo con la reivindicación 20, en donde el rechazo de trasplante de pulmón es un rechazo agudo del trasplante de pulmón.
  23. 23. El compuesto para usar, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, de acuerdo con la reivindicación 20, en donde el rechazo de trasplante de pulmón es una disfunción crónica del aloinjerto de pulmón.
  24. 24. El compuesto para usar, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, de acuerdo con la reivindicación 20, en donde el rechazo de trasplante de pulmón se selecciona del grupo que consiste en bronquiolitis obliterante, disfunción restrictiva crónica del aloinjerto de pulmón y disfunción del aloinjerto neutrofílico.
  25. 25. El compuesto para usar, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, de acuerdo con la reivindicación 17, en donde la enfermedad respiratoria es una lesión pulmonar aguda o la enfermedad respiratoria es el síndrome de dificultad respiratoria aguda
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