ES2953184T3

ES2953184T3 - Mejoras en procesos de inmovilización de entidades biológicas

Info

Publication number: ES2953184T3
Application number: ES19708339T
Authority: ES
Inventors: Per Antoni; Malin Eriksson; Anna Gällhagen; Eva Koch; Daniel Nyström; Christian Porsch-Grahm; Helena Göransson
Original assignee: Carmeda AB
Current assignee: Carmeda AB
Priority date: 2018-03-09
Filing date: 2019-03-08
Publication date: 2023-11-08
Anticipated expiration: 2039-03-08
Also published as: CN116173297A; CN111867647B; AU2019232163A1; US20190275212A1; US20240299633A1; WO2019170858A1; EP3762055B1; JP7365371B2; JP2021514881A; US12016978B2; BR112020017412A2; CN111867647A; AU2019232163A2; SG11202008063YA; CA3093027A1; KR20200129114A; US20220378985A1; EP3762055A1

Abstract

Según la invención, se proporciona, entre otras cosas, un proceso para la fabricación de un objeto sólido que tiene una superficie que comprende un recubrimiento en capas de polímero catiónico y aniónico en el que la capa de recubrimiento exterior comprende una entidad anticoagulante, que comprende las etapas de: i) tratar una superficie del objeto sólido con un polímero catiónico; ii) tratar la superficie con un polímero aniónico; iii) opcionalmente repetir los pasos i) y ii) una o más veces; iv) tratar la superficie con un polímero catiónico; y v) tratar la capa más externa de polímero catiónico con una entidad anticoagulante, para unir de ese modo covalentemente la entidad anticoagulante a la capa más externa de polímero catiónico; en donde, el polímero aniónico se caracteriza por tener (a) un peso molecular total de 650 kDa - 0,000 kDa; y (b) una densidad de carga de solución de >4 μeq/g; y en donde, el paso ii) se lleva a cabo a una concentración de sal de 0,25 M-5,0 M. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Mejoras en procesos de inmovilización de entidades biológicas

Campo de la invención

La presente invención se refiere a procesos para preparar objetos sólidos que tienen recubrimientos superficiales que comprenden entidades biológicas. En particular, la presente invención se refiere a procesos para preparar recubrimientos superficiales mejorados que comprenden entidades anticoagulantes tales como heparina y ciertos productos obtenidos por aquellos.

Antecedentes de la invención

Cuando un dispositivo médico se implanta en el cuerpo o está en contacto con fluidos corporales, se ponen en marcha una serie de diferentes reacciones, algunas de las cuales originan inflamación y otras la coagulación de la sangre en contacto con la superficie del dispositivo. Para contrarrestar estos graves efectos adversos, el conocido compuesto anticoagulante heparina se ha administrado sistémicamente a los pacientes durante mucho tiempo antes de implantar el dispositivo médico en su cuerpo, o cuando está en contacto con sus fluidos corporales, con el fin de proporcionar un efecto antitrombótico.

La trombina es uno de varios factores de coagulación, los cuales trabajan todos juntos para dar como resultado la formación de trombos en una superficie en contacto con la sangre. La antitrombina (también conocida como antitrombina III) ("ATIII") es el inhibidor de la coagulación más destacado. Neutraliza la acción de la trombina y otros factores de coagulación y, por tanto, restringe o limita la coagulación de la sangre. La heparina aumenta drásticamente la velocidad a la que la antitrombina inhibe los factores de coagulación. El cofactor de heparina II ("HCll") es otro factor de coagulación que inhibe rápidamente la trombina en presencia de heparina.

Sin embargo, el tratamiento sistémico con altas dosis de heparina está asociado a menudo con graves efectos secundarios, de los cuales el sangrado es el predominante. Otra complicación rara pero grave del tratamiento con heparina es el desarrollo de una respuesta alérgica denominada trombocitopenia inducida por heparina (TIH) que puede provocar trombosis (tanto venosa como arterial). El tratamiento sistémico con heparina en dosis altas, por ejemplo, durante la cirugía también requiere un control frecuente del tiempo de coagulación activado (usado para monitoriza y guiar la terapia con heparina) y los ajustes de la dosis correspondientes según sea necesario.

Por tanto, se han buscado soluciones donde la necesidad de una heparinización sistémica del paciente sería innecesaria o podría ser limitada. Se pensó que esto podría lograrse mediante una modificación superficial de los dispositivos médicos utilizando las propiedades anticoagulantes de la heparina y otros anticoagulantes. Así, se han desarrollado una serie de tecnologías con más o menos éxito en las que una capa de heparina se adhiere a la superficie del dispositivo médico buscando así hacer la superficie tromboresistente. Para dispositivos en los que se requiere bioactividad a largo plazo, la heparina debe ser deseablemente resistente a la lixiviación y degradación.

La heparina es un polisacárido que porta grupos sulfato y ácido carboxílico cargados negativamente en las unidades de sacárido. Por tanto, se intentó la unión iónica de la heparina a las superficies policatiónicas, pero las modificaciones de la superficie adolecían de falta de estabilidad dando como resultado una falta de funcionalidad, ya que la heparina se lixiviaba de la superficie. Posteriormente, se prepararon diferentes modificaciones de la superficie en las que la heparina se ha unido covalentemente a grupos en la superficie.

Uno de los procesos más exitosos para hacer que dispositivo médico tromboresistente ha sido la unión covalente de un fragmento de heparina a una superficie modificada del dispositivo. El método general y las mejoras del mismo se describen en varios documentos de patente (véanse los documentos EP0086186A1, EP0086187A1, EP0495820B1 y US6,461,665B1).

Estos documentos describen la preparación de una superficie heparinizada mediante la reacción de heparina modificada para que porte un grupo aldehído terminal con una superficie en un dispositivo médico que ha sido modificada para portar grupos amino primarios. Se forma una base de Schiff intermedia que se reduce en el lugar para formar un enlazador de amina secundaria estable, inmovilizando así covalentemente la heparina.

Otros métodos para la unión covalente de la heparina a una superficie manteniendo su actividad se describen en los documentos WO2010/029189A2, WO2011/110684A1 y WO2012/123384A1.

La entidad anticoagulante se inmoviliza de forma típica sobre una superficie que ha sido tratada con una o más capas de polímero o un complejo, en lugar de inmovilizarse directamente sobre la superficie del objeto sólido.

El documento EP0086187A1 describe un sustrato de superficie modificada con un complejo absorbido en el mismo, donde el complejo es un tensioactivo catiónico polimérico que contiene una funcionalidad amino nitrogenada primaria así como una funcionalidad amino secundaria y/o terciaria, y un dialdehído que tiene de 1 a 4 átomos de carbono entre los dos grupos aldehído. Puede unirse adicionalmente un compuesto aniónico a dicho complejo y, opcionalmente, compuestos catiónicos y aniónicos alternos adicionales.

El documento EP0495820B1 describe un método para modificar la superficie de un sustrato, que comprende las etapas de: (a) adsorber una poliamina de un alto peso molecular promedio y reticular dicha poliamina con crotonaldehído; (b) seguidamente adsorber sobre la superficie de la poliamina reticulada una capa de un polisacárido aniónico; (c) opcionalmente repetir las etapas (a) y (b) una o más veces; y (d) adsorber sobre la capa de polisacárido aniónico, o sobre la capa más externa de polisacárido aniónico, una capa de poliamina no reticulada que proporciona grupos amino primarios libres. En una etapa posterior, puede unirse a la poliamina no reticulada una entidad química biológicamente activa, por ejemplo, heparina, que porta un grupo funcional reactivo con los grupos amino primarios libres.

Sin embargo, sigue existiendo la necesidad de recubrimientos superficiales mejorados que comprendan entidades anticoagulantes tales como heparina, en particular para recubrimientos en los que se mantenga o mejore la actividad biológica de la entidad anticoagulante. Dichos recubrimientos superficiales mejorados tienen utilidad potencial en dispositivos médicos y otros artículos que se beneficiarían de una superficie anticoagulante.

Los autores de la presente invención han descubierto que, sorprendentemente, la naturaleza de la superficie sobre la que se inmoviliza una entidad anticoagulante puede influir significativamente en las características del recubrimiento, en particular, en la actividad biológica resultante de la entidad anticoagulante. En particular, cuando una entidad anticoagulante se inmoviliza sobre la superficie de un objeto sólido que comprende un recubrimiento estratificado de polímero catiónico y aniónico, la cuidadosa modulación de la naturaleza y las condiciones de aplicación de la capa o capas de polímero aniónico pueden mejorar las características resultantes del recubrimiento del objeto sólido, incluidas, por ejemplo, las propiedades tromboresistentes que pueda tener.

El documento WO2010/029189 describe un dispositivo médico que tiene una superficie que comprende una capa de recubrimiento, siendo dicha capa de recubrimiento una composición biocompatible que comprende una entidad capaz de interactuar con la sangre de un mamífero para evitar la coagulación o la formación de trombos, entidad que se une covalentemente a dicha superficie a través de un enlace que comprende un 1,2,3-triazol.

Compendio de la invención

En un aspecto, la presente invención proporciona un proceso para la fabricación de un objeto sólido que tiene una superficie que comprende un recubrimiento estratificado de polímero catiónico y aniónico donde la capa de recubrimiento exterior comprende una entidad anticoagulante, que comprende las etapas de:

i) tratar una superficie del objeto sólido con un polímero catiónico;

ii) tratar la superficie con un polímero aniónico;

iii) opcionalmente repetir las etapas i) y ii) una o más veces;

iv) tratar la superficie con un polímero catiónico; y

v) tratar la capa más externa de polímero catiónico con una entidad anticoagulante, para unir de este modo covalentemente la entidad anticoagulante a la capa más externa de polímero catiónico;

donde,

el polímero aniónico está caracterizado por tener (a) un peso molecular total de 650 kDa-10000 kDa; y (b) un contenido de azufre entre 10 % y 25 % en peso del polímero aniónico;

el polímero aniónico es sulfato de dextrano;

la entidad anticoagulante es un resto de heparina;

y donde,

la etapa ii) se lleva a cabo a una concentración de sal de 0,25 M-5,0 M.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un objeto sólido que tiene una superficie que comprende un recubrimiento estratificado de polímero catiónico y aniónico, donde la capa de recubrimiento exterior es una capa que comprende un polímero catiónico al que está unida covalentemente una entidad anticoagulante; y donde el polímero aniónico está caracterizado por tener (a) un peso molecular total de 650 kDa-10000 kDa; y (b) un contenido de azufre entre 10 % y 25 % en peso del polímero aniónico;

donde el polímero aniónico es sulfato de dextrano;

donde la entidad anticoagulante es un resto de heparina y

donde el polímero aniónico se aplica a la superficie a una concentración de sal de 0,25 M-5,0 M.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un proceso para la fabricación de un objeto sólido que tiene una superficie que comprende un recubrimiento estratificado de polímero catiónico y aniónico, donde la capa de recubrimiento exterior es una capa que comprende polímero catiónico, que comprende las etapas de:

i) tratar una superficie del objeto sólido con un polímero catiónico;

ii) tratar la superficie con un polímero aniónico;

iii) opcionalmente repetir las etapas i) y ii) una o más veces; y

iv) tratar la superficie con un polímero catiónico;

donde,

el polímero aniónico es sulfato de dextrano,

y donde,

la etapa ii) se lleva a cabo a una concentración de sal de 0,25 M-5,0 M.

Breve descripción de las figuras.

Figura 1: muestra un ejemplo de recubrimiento de la invención con una única bicapa;

Figura 2 : muestra la actividad de heparina normalizada (HA) para tubos de PVC recubiertos con sulfatos de dextrano 4, 5, 6 y 7 a una concentración de NaCl de 0,25 M y 1,7 M;

Figura 3 : muestra la actividad de heparina normalizada (HA) para tubos de PVC recubiertos con sulfato de dextrano 5 usando diferentes sales a diferentes concentraciones;

Figura 4 : muestra la concentración de heparina (HC) para tubos de PVC recubiertos con sulfatos de dextrano 3, 4,

5, 6 y 7 a una concentración de NaCl 1,7 M;

Figura 5 : muestra la concentración de heparina (HC) para tubos de PVC recubiertos con sulfatos de dextrano 3, 4,

5, 6 y 7 a diversas concentraciones de NaCl;

Figura 6 : muestra la concentración de heparina (HC) para tubos de PVC recubiertos con sulfato de dextrano 5 usando diferentes sales a diferentes concentraciones;

Figura 7 : muestra el potencial zeta para tubos de PVC recubiertos con sulfatos de dextrano 3, 4 y 5 a una concentración de NaCl de 1,7 M;

Figura 8 : muestra el potencial zeta para tubos de PVC recubiertos con sulfatos de dextrano 3, 6 y 7 a una concentración de NaCl de 1,7 M;

Figura 9 : muestra el potencial zeta para tubos de PVC recubiertos con sulfatos de dextrano 3, 4 y 5 a una concentración de NaCl de 0,25 M;

Figura 10: muestra el potencial zeta para tubos de PVC recubiertos con sulfatos de dextrano 3, 6 y 7 a una concentración de NaCl de 0,25 M;

Figura 11: muestra el potencial zeta para tubos de PVC recubiertos con sulfato de dextrano 5 a diversas concentraciones de NaCl;

Figura 12: muestra el potencial zeta para tubos de PVC recubiertos con sulfato de dextrano 5 a diversas concentraciones de Na₂HPO₄;

Figura 13: muestra el potencial zeta para tubos de PVC recubiertos con sulfato de dextrano 5 a diversas concentraciones de Na2SO4;

Figura 14: muestra plaquetas conservadas (%) para tubos de PVC recubiertos con sulfatos de dextrano 2, 4, 5, 6 y 7 a una concentración de NaCl de 0,25 M;

Figura 15: muestra F1+2 (fragmento de protrombina) para tubos de PVC recubiertos con sulfatos de dextrano 2, 4,

5, 6 y 7 a una concentración de NaCl de 0,25 M;

Figura 16: muestra plaquetas conservadas (%) para tubos de PVC recubiertos con sulfatos de dextrano 4, 5, 6 y 7 a una concentración de NaCl de 1,7 M;

Figura 17: muestra F1+2 (fragmento de protrombina) para tubos de PVC recubiertos con sulfatos de dextrano 4, 5, 6 y 7 a una concentración de NaCl de 1,7 M;

Figura 18: muestra plaquetas conservadas (%) para tubos de PVC recubiertos con sulfato de dextrano 4 a una concentración de NaCl de 0,25 M, antes y después de la prueba de temperatura y humedad;

Figura 19: muestra F1 2 (fragmento de protrombina) para tubos de PVC recubiertos con sulfato de dextrano 4 a una concentración de NaCl 0,25 M, antes y después de la prueba de temperatura y humedad;

Figura 20: muestra plaquetas conservadas (%) para tubos de PVC recubiertos con sulfatos de dextrano 4, 5 y 7 a una concentración de NaCl de 1,7 M, antes y después de la prueba de temperatura y humedad;

Figura 21: muestra F1+2 (fragmento de protrombina) para tubos de PVC recubiertos con sulfatos de dextrano 4, 5 y 7 a una concentración de NaCl de 1,7 M, antes y después de la prueba de temperatura y humedad;

Figura 22: muestra un perfil de potencial zeta típico de un objeto sólido de la presente invención.

Figura 23: muestra la secuencia activa del pentasacárido de la heparina

Descripción detallada de la invención

Objeto sólido

Cualquier objeto sólido se puede recubrir potencialmente utilizando el proceso de la invención, aunque tales recubrimientos y procesos son particularmente útiles para dispositivos médicos, dispositivos analíticos, dispositivos de separación y otros artículos industriales, incluidas las membranas.

Los objetos sólidos pueden tener una superficie tromboresistente. En determinadas formas de realización de la invención, la superficie tromboresistente puede exhibir una inhibición farmacológica directa de la respuesta de coagulación mediante la inmovilización de una entidad anticoagulante. En ciertas formas de realización de la invención, la superficie tromboresistente no provoca ninguna reacción adversa clínicamente significativa apreciable, tal como trombosis, hemólisis, plaquetas, leucocitos y activación del complemento, y/u otro evento adverso asociado con la sangre cuando entra en contacto con la sangre.

En la técnica, los términos "hemocompatible", "no trombogénico", "antitrombogénico" y similares pueden interpretarse de forma típica como equivalentes al término "tromboresistente".

En una forma de realización, el objeto sólido es un dispositivo médico. Cuando el objeto sólido es un dispositivo médico, es de forma adecuada un dispositivo médico tromboresistente. Así, en una forma de realización, el objeto sólido es un dispositivo médico tromboresistente. A los efectos de esta solicitud de patente, el término "dispositivo médico" se refiere a dispositivos intracorpóreos o extracorpóreos, pero más habitualmente a dispositivos médicos intracorpóreos.

Los dispositivos médicos intracorpóreos son dispositivos que se utilizan dentro de la anatomía, por ejemplo, dentro de la vasculatura u otra luz, espacio o cavidad corporal, normalmente para proporcionar un efecto terapéutico. Los dispositivos intracorpóreos pueden ser de uso a largo plazo o temporal. Los dispositivos de uso a largo plazo se dejan, en parte o en su totalidad, en la anatomía después del procedimiento quirúrgico inmediato para implantarlos, por ejemplo, estents o endoprótesis. Los dispositivos para uso temporal o a corto plazo incluyen aquellos que se insertan transitoriamente en una región de tratamiento (es decir, se insertan y luego se retiran en el mismo procedimiento quirúrgico), tales como un balón médico. En una forma de realización, el objeto sólido es un dispositivo médico intracorpóreo.

Ejemplos de dispositivos médicos intracorpóreos que pueden ser dispositivos médicos intracorpóreos permanentes o temporales incluyen estents que incluyen estents bifurcados, estents expandibles con balón, estents autoexpandibles, estents neurovasculares y estents desviadores de flujo, endoprótesis recubiertas que incluyen endoprótesis bifurcadas, prótesis que incluyen prótesis vasculares y prótesis bifurcadas, fundas que incluyen fundas retráctiles tales como fundas terapéuticas y de diagnóstico intervencionista, y fundas de administración endovascular de calibre estándar, fundas introductoras arteriales con y sin control hemostático y con o sin dirección, fundas microintroductoras, fundas de acceso para diálisis, fundas de guía y fundas percutáneas, dilatadores, oclusores tales como oclusores vasculares, filtros embólicos, dispositivos de embolectomía, catéteres, vasos sanguíneos artificiales, dispositivos de monitorización de sangre permanentes, válvulas que incluyen válvulas cardíacas artificiales, electrodos de marcapasos, cables guía, electrodos cardíacos, circuitos de derivación cardiopulmonar, cánulas, tapones, dispositivos de administración de fármacos, balones, dispositivos de parches de tejidos, bombas de sangre, parches, líneas tales como líneas de infusión crónica o líneas arteriales, cables de colocación, dispositivos para infusiones subaracnoideas continuas, tubos de alimentación, derivaciones del SNC como derivaciones ventriculopleurales, derivaciones ventriculoauriculares (VA), derivaciones ventriculoperitoneales (VP), derivaciones auriculares ventriculares, derivaciones portosistémicas y derivaciones para ascitis.

Ejemplos de catéteres incluyen, pero no sin estar limitados a, microcatéteres, catéteres venosos centrales, catéteres intravenosos periféricos, catéteres de hemodiálisis, catéteres tales como catéteres recubiertos incluyendo catéteres venosos implantables, catéteres venosos tunelizados, catéteres coronarios útiles para procedimientos de angiografía, angioplastia o ultrasonido en el corazón o en venas y arterias periféricas, catéteres que contienen capacidades de visualización o espectroscópicas, catéteres de infusión en la arteria hepática, CVC (catéteres venosos centrales), catéteres intravenosos periféricos, catéteres venosos centrales insertados periféricamente, (líneas PIC), catéteres de arteria pulmonar terminados en balón y flujo dirigido, catéteres de nutrición parenteral total, catéteres permanentes crónicos (por ejemplo, catéteres gastrointestinales permanentes crónicos y catéteres genitourinarios permanentes crónicos), catéteres de diálisis peritoneal, catéteres CEC (derivación cardiopulmonar), catéteres urinarios y microcatéteres (por ejemplo, para aplicación intracraneal).

En una forma de realización, el objeto sólido es un dispositivo médico intracorpóreo seleccionado del grupo que consiste en estents, endoprótesis, fundas, dilatadores, oclusores, válvulas, filtros embólicos, dispositivos de embolectomía, catéteres, vasos sanguíneos artificiales, dispositivos de monitorización de la sangre, válvulas, electrodos de marcapasos, cables guía, electrodos cardíacos, circuitos de derivación cardiopulmonar, cánulas, tapones, dispositivos de administración de fármacos, balones, dispositivos de parche de tejido, bombas de sangre, parches, líneas, cables de colocación, dispositivos para infusiones subaracnoideas continuas, sondas de alimentación y derivaciones. En una forma de realización específica, el objeto sólido es un estent o una endoprótesis.

En una forma de realización, dicho dispositivo médico intracorpóreo puede usarse en aplicaciones neurológicas, periféricas, cardíacas, ortopédicas, dérmicas o ginecológicas. En una forma de realización, dichos estents pueden usarse en aplicaciones cardíacas, periféricas o neurológicas. En una forma de realización, dichas endoprótesis pueden usarse en aplicaciones cardíacas, periféricas o neurológicas. En una forma de realización, dichas fundas pueden usarse en aplicaciones carotídeas, renales, transradiales, transeptales, pediátricas o microaplicaciones.

Ejemplos de dispositivos médicos extracorpóreos son dispositivos de tratamiento de sangre y dispositivos de transfusión. En una forma de realización, dicho dispositivo médico intracorpóreo puede usarse en aplicaciones neurológicas, periféricas, cardíacas, ortopédicas, dérmicas o ginecológicas. En una forma de realización, el dispositivo médico extracorpóreo es un oxigenador. En otra forma de realización, el dispositivo médico extracorpóreo es un filtro capaz de eliminar virus, bacterias, citoquinas proinflamatorias y toxinas que causan sepsis.

Una membrana puede ser, por ejemplo, una membrana de hemodiálisis.

Un dispositivo analítico puede ser, por ejemplo, un soporte sólido para llevar a cabo un proceso analítico tal como una cromatografía o un ensayo inmunológico, de química reactiva o de catálisis. Ejemplos de tales dispositivos incluyen portaobjetos, perlas, placas de pocillos y membranas.

Un dispositivo de separación puede ser, por ejemplo, un soporte sólido para llevar a cabo un proceso de separación tal como la purificación de proteínas, la cromatografía de afinidad o el intercambio iónico. Ejemplos de tales dispositivos incluyen filtros y columnas.

El objeto sólido puede comprender o estar formado por un metal, un polímero orgánico o inorgánico sintético o natural, un material cerámico, un material a base de proteínas o un material a base de polisacáridos, entre otros.

Metales adecuados incluyen, entre otros, metales biocompatibles como titanio, acero inoxidable, acero inoxidable con alto contenido de nitrógeno, cobalto, cromo, níquel, tantalio, niobio, oro, plata, rodio, zinc, platino, rubidio, cobre y magnesio, y combinaciones (aleaciones) de los mismos. Aleaciones adecuadas incluyen aleaciones de cobalto-cromo tales como L-605, MP35N, Elgiloy, aleaciones de titanio que incluyen aleaciones de níquel-titanio (como Nitinol), aleaciones de tantalio, aleaciones de niobio (por ejemplo, Nb-1 % Zr) y otras.

En una forma de realización, dicho metal biocompatible es una aleación de níquel-titanio, tal como Nitinol.

Polímeros orgánicos o inorgánicos sintéticos o naturales incluyen poliolefinas, poliésteres (por ejemplo, tereftalato de polietileno y tereftalato de polibutileno), éteres de poliéster, copolímeros de elastómeros de poliéster (por ejemplo, como los disponibles de DuPont en Wilmington, Delaware, con el nombre comercial HYTREL.RTM), polímeros que contienen flúor, polímeros que contienen cloro (por ejemplo, poli(cloruro de vinilo) (PVC)), elastómeros de copolímeros de bloque (por ejemplo, copolímeros de bloque (por ejemplo, copolímeros de bloque estirénicos tales como copolímeros de bloque de acrilonitrilo-estireno y acrilonitrilo-butadieno-estireno, o copolímeros de bloque en los que el copolímero de bloque particular elastómero termoplástico en el que el copolímero en bloque está formado por segmentos duros de un poliéster o poliamida y segmentos blandos de poliéter), poliuretanos, poliamidas (por ejemplo, nailon 12, nailon 11, nailon 9, nailon 6/9 y nailon 6/6), amidas de bloques de poliéter (por ejemplo, PEBAX®), poliéteresteramida, poliimidas, policarbonatos, sulfuros de polifenileno, óxidos de polifenileno, poliéteres, siliconas, policarbonatos, polihidroxietilmetacrilato, polivinilpirrolidona, poli(alcohol vinílico), caucho, caucho de silicona, polihidroxiácidos, polialilamina, poli(alcohol alílico), poliacrilamida, poli (ácido acrílico), poliestirenos, politetrafluoroetileno, poli(metil)metacrilatos, poliacrilo nitrilos, poli(acetados de vinilo), poli(alcoholes vinílicos), polioximetilenos, policarbonatos, fenoles, resinas amino-epoxi, plásticos a base de celulosa y plásticos similares al caucho, bioreabsorbibles (por ejemplo, poli(D,L-lactida) y poliglicolidas, y sus copolímeros y copolímeros de los mismos), derivados de los mismos y mezclas de los mismos. Pueden emplearse combinaciones de estos materiales con y sin reticulación. Algunas de estas clases están disponibles como polímeros termoestables y termoplásticos. Tal como se usa en este documento, el término "copolímero" se utilizará para referirse a cualquier polímero formado a partir de dos o más monómeros, por ejemplo, 2, 3, 4, 5 y así sucesivamente.

Polímeros fluorados (polímeros que contienen flúor) incluyen fluoropolímeros tales como politetrafluoroetileno expandido (ePTFE), politetrafluoroetileno (PTFE), etileno-propileno fluorado (FEP), copolímeros de perfluorocarbono (tales como copolímeros de tetrafluoroetileno perfluoroalquilvinil éter (TFE/PAVE) y copolímeros de tetrafluoroetileno (TFE) y perfluorometil vinil éter (PMVE)), y combinaciones de los anteriores con y sin reticulación entre cadenas de polímero.

En una forma de realización, el objeto sólido comprende una amida de bloque de poliéter, tal como PEBAX®. En otra forma de realización, el objeto sólido comprende un polímero que contiene cloro (por ejemplo, PVC) o un polímero que contiene flúor (por ejemplo, ePTFE).

Sustratos poliméricos se pueden mezclar opcionalmente con cargas y/o colorantes. Por tanto, sustratos adecuados incluyen materiales pigmentados tales como materiales poliméricos pigmentados.

Sustratos cerámicos pueden incluir, entre otros, óxidos de silicona, óxidos de aluminio, alúmina, sílice, hidroxiapapititas, vidrios, óxidos de calcio, polisilanoles y óxido de fósforo.

Materiales a base de proteínas incluyen seda y lana. Materiales a base de polisacáridos incluyen agarosa y alginato.

Entidad anticoagulante

Una entidad anticoagulante es una entidad capaz de interactuar con la sangre de mamífero para prevenir o aliviar la coagulación o la formación de trombos.

Entidades anticoagulantes incluyen fracciones de heparina, fracciones de sulfato de dermatán, fracciones de disulfato de dermatán, hirudina, eptifibatida, tirofibran, uroquinasa, clorometilcetona D-Phe-Pro-Arg, un compuesto que contiene un péptido RGD, AZX100 (un péptido celular que imita a HSP20, Capstone Therapeutics Corp., Estados Unidos), antagonistas del receptor de plaquetas, aspirina, inhibidores de prostaglandinas, inhibidores plaquetarios (por ejemplo, clopidogrel, óxido nítrico (NO), prostaglandinas y abciximab), péptidos antiplaquetarios, cumadinas (es decir, antagonistas de la vitamina K de la clase 4-hidroxicumarina, por ejemplo, warfarina), argatroban, trombomodulina, proteínas anticoagulantes, enzimas anticoagulantes (por ejemplo, apirasa).

El término "resto de heparina" se refiere a una molécula de heparina, un fragmento de una molécula de heparina, un derivado de una molécula de heparina o un análogo de una molécula de heparina.

Según la invención reivindicada, la entidad anticoagulante es un resto de heparina. Adecuadamente, el resto de heparina se selecciona del grupo que consiste en heparina de longitud completa (heparina nativa), una sal de metal alcalino o alcalinotérreo de heparina (por ejemplo, heparina de sodio (por ejemplo, Hepsal o Pularin), heparina de potasio (por ejemplo, Clarin), heparina de litio, heparina de calcio (por ejemplo, calciparina) o heparina de magnesio (por ejemplo, Cutheparine)), una heparina de bajo peso molecular (por ejemplo, ardeparina sódica, tinzaparina o dalteparina), heparán sulfato, un heparinoide, un compuesto a base de heparina, heparina que tiene un contraión hidrófobo, una composición de heparina sintética capaz de inhibir el factor Xa mediado por antitrombina (por ejemplo, una composición “Fundaparinux” (por ejemplo, Arixtra de GlaxoSmithKline) y un derivado sintético de la heparina que comprende al menos la secuencia de pentasacárido activa de la heparina (véase, por ejemplo Petitou etal., Biochimie, 2003, 85(1-2):83-9). Restos de heparina adicionales incluyen heparina modificada mediante, por ejemplo, degradación leve del ácido nitroso (documento US4,613,665A) u oxidación de peryodato (documento US6,653,457B1) y otras reacciones de modificación conocidas en la técnica en las que se conserva la actividad del resto de heparina. Los restos de heparina también incluyen dichos restos unidos a un enlazador o espaciador como se describe a continuación. En una forma de realización, el resto de heparina es heparina de longitud completa.

Heparinas de bajo peso molecular pueden prepararse, por ejemplo, mediante despolimerización oxidativa, degradación enzimática o escisión desaminativa.

En una forma de realización, el resto de heparina es un fragmento de heparina. Pueden producirse fragmentos de heparina utilizando técnicas conocidas en la técnica. Adecuadamente, los fragmentos son fragmentos de heparina nativa producidos mediante un proceso que comprende la degradación (por ejemplo, la fragmentación) de heparina nativa. Como se ilustra en el Ejemplo 2e a continuación, se pueden preparar fragmentos de heparina mediante la escisión parcial con ácido nitroso de heparina nativa, seguida opcionalmente por el fraccionamiento mediante cromatografía en gel. De forma alternativa, se pueden producir sintéticamente fragmentos de heparina. La producción sintética puede incluir métodos quimioenzimáticos y/o de química orgánica tradicional.

La actividad anticoagulante de la heparina depende principalmente de una secuencia de pentasacárido que se une a antitrombina (AT) (la "secuencia de pentasacárido activa " o "secuencia activa"; véase la Figura 23). De forma adecuada, el fragmento de heparina contiene la secuencia de pentasacárido activa.

Los fragmentos de heparina pueden, por ejemplo, tener una longitud de 5-30, por ejemplo, 5-20 por ejemplo, 5-18 por ejemplo, 5-17 por ejemplo, 5-10 por ejemplo, 6-10 residuos sacáridos. De forma alternativa, los fragmentos de heparina pueden tener, por ejemplo, una longitud de 6-30, por ejemplo, 6-20 por ejemplo, 6-18 por ejemplo, 6-17 residuos sacáridos.

El documento US6,461,665B1 (Scholander) describe la mejora de la actividad antitrombogénica de la heparina inmovilizada en la superficie mediante el tratamiento de la heparina antes de la inmovilización. La mejora se consigue tratando la heparina a temperatura elevada o a pH elevado, o poniendo en contacto la heparina con catalizadores nucleófilos tales como aminas, alcoholes, tioles o grupos amino, hidroxilo o tiol inmovilizados.

La entidad anticoagulante se inmoviliza covalentemente sobre la superficie del objeto sólido, por tanto, sustancialmente no eluye ni se filtra del objeto sólido. Como se analiza a continuación, la entidad anticoagulante se puede inmovilizar covalentemente mediante varios métodos.

La entidad anticoagulante se une covalentemente a la capa más externa de polímero catiónico.

La entidad anticoagulante se une adecuadamente en un extremo al polímero catiónico. Por tanto, en una forma de realización, la entidad anticoagulante es un resto anticoagulante unido a un extremo. En su caso, la entidad anticoagulante se conecta preferentemente a través de su extremo reductor. Así, en una forma de realización, la entidad anticoagulante se conecta a través de su extremo reductor. En una forma de realización particular, la entidad anticoagulante es un resto de heparina unido en un extremo conectado a través de su extremo reductor (a veces denominado posición C1 del terminal reductor). La ventaja de la unión en un extremo, especialmente la reducción de la unión en un extremo, es que la actividad biológica de la entidad anticoagulante (por ejemplo, el resto heparina) se maximiza debido a la disponibilidad mejorada, por ejemplo, los sitios de interacción de la antitrombina en comparación con la unión en cualquier otro lugar de la entidad anticoagulante (por ejemplo, resto de heparina).

Un proceso de unión en un extremo representativo se describe en el documento EP0086186B1 (Larm) que describe un proceso para la unión covalente de sustancias orgánicas oligoméricas o poliméricas a sustratos de diferentes tipos que contienen grupos amino primarios. La sustancia a acoplar, que puede ser heparina, se somete a degradación por diazotación para formar un fragmento de sustancia que tiene un grupo aldehído terminal libre. Seguidamente, el fragmento de sustancia se hace reaccionar a través de su grupo aldehído con el grupo amino del sustrato para formar una base de Schiff, que luego se convierte (mediante reducción) en una amina secundaria. La ventaja de la unión en un extremo de la heparina, especialmente la reducción de la unión en un extremo (como se describe anteriormente en el documento EP0086186B1), es que la actividad biológica del resto de heparina se maximiza debido a la mayor disponibilidad de los sitios de interacción de antitrombina en comparación con la unión en cualquier otro lugar del resto de heparina.

La entidad anticoagulante se puede unir covalentemente a la capa más exterior del polímero catiónico a través de un conector. Por tanto, en una forma de realización, la entidad anticoagulante se une covalentemente a través de un conector.

En el documento EP0086186B1 se describe una forma de realización, el enlazador comprende una amina secundaria. Un procedimiento representativo para la unión covalente de un resto de heparina a un polímero a través de una amina secundaria.

En una forma de realización, el enlazador comprende una amida secundaria. Un procedimiento representativo para unir covalentemente un resto de heparina a un polímero a través de una reacción de amidación que implica 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP) o 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) se expone en el documento WO2012/123384A1.

En una forma de realización, el enlazador comprende un 1,2,3-triazol. En el documento WO2010/029189A2 (Carmeda AB) se describe un procedimiento representativo para la unión covalente de un resto de heparina a un polímero a través de un enlace 1,2,3-triazol. El documento describe la funcionalización con azida o alquino de una poliimina; la preparación de heparina funcionalizada con alquino y azida (tanto heparina nativa como degradada con ácido nitroso); y reacciones para unir la heparina derivatizada al polímero derivatizado a través de un enlazador de 1,2,3-triazol.

En una forma de realización, el enlazador comprende un tioéter. Un procedimiento representativo para la unión covalente de un resto de heparina a un polímero a través de un enlace tioéter se describe en el documento WO2011/110684A1 (Carmeda AB et al.).

Polímero catiónico

El polímero catiónico puede ser un polímero de cadena lineal, pero normalmente es un polímero de cadena ramificada tal como un polímero hiperamificado. En una forma de realización, el polímero catiónico es un polímero catiónico ramificado. El polímero catiónico está opcionalmente reticulado. En una forma de realización, el polímero catiónico comprende grupos amina primaria/secundaria. En una forma de realización, el polímero catiónico es una poliamina, que está opcionalmente reticulada. El polímero catiónico (por ejemplo, poliamina), tiene un peso molecular adecuado de 5 kDa a 3000 kDa, tal como 5 kDa a 2000 kDa, 5 kDa a 1500 kDa, 5 kDa a 1000 kDa, 5 kDa a 800 kDa, 5 kDa a 500 kDa, 5 kDa a 300 kDa o 5 kDa a 200 kDa o 800 kDa Da-3000 kDa. Cuando el polímero catiónico (por ejemplo, poliamina) se reticula, se reticula adecuadamente utilizando un reticulante de aldehído tal como crotonaldehído y/o glutaraldehído. En una forma de realización, el polímero catiónico es una polialquilenimina, por ejemplo, polietilenimina.

El polímero catiónico forma parte de un recubrimiento capa por capa de polímero catiónico y polímero aniónico, que se forma alternando el tratamiento de la superficie del objeto sólido con capas de polímero catiónico y aniónico. Una bicapa se define aquí como una capa de polímero catiónico y polímero aniónico. En el recubrimiento capa por capa, el polímero catiónico se aplica de forma típica antes que el polímero aniónico, es decir, una superficie del objeto sólido generalmente se trata primero con una primera capa de polímero catiónico (etapa i) en la reivindicación 1), sobre la cual se aplica una primera capa de polímero aniónico (etapa ii) en la reivindicación 1). Dependiendo del número de bicapas requeridas, se pueden aplicar capas adicionales de polímero catiónico y polímero aniónico (etapa iii) en la reivindicación 1). Cuando se completa la bicapa final (que puede ser también la primera) de polímero catiónico y aniónico, se aplica entonces una capa de polímero catiónico (correspondiente al etapa iv) de la reivindicación 1). Esta capa (es decir, la capa más externa) de polímero catiónico se trata luego con una entidad anticoagulante, para unir covalentemente la entidad anticoagulante a la capa de polímero catiónico. Por tanto, se puede decir que la capa de recubrimiento exterior de polímero catiónico "comprende" una entidad anticoagulante. En el recubrimiento capa por capa, la capa más interna es una capa de polímero catiónico y la capa más externa es una capa de recubrimiento externa de polímero catiónico a la que se une covalentemente la entidad anticoagulante (véase la Figura 1).

En una forma de realización, el polímero catiónico de la etapa i) es una poliamina, que está opcionalmente reticulada. En una forma de realización, el polímero catiónico de la etapa iv) es una poliamina, que está opcionalmente reticulada. En una forma de realización, el polímero catiónico de la etapa i) es el mismo que el polímero catiónico de la etapa iv).

El documento WO2012/123384A1 (Gore Enterprise Holdings, Inc. et al.) describe un dispositivo con un recubrimiento que comprende una pluralidad de moléculas de polímero hiperamificadas que portan entidades anticoagulantes, en particular heparina. Tales moléculas de polímeros hiperamificados se pueden utilizar en la capa más externa del polímero catiónico, es decir, dichos polímeros hiperamificados se pueden usar como el polímero catiónico de la etapa iv) y luego se pueden modificar para que porten entidades anticoagulantes en la etapa v).

Polímero aniónico

Según la invención reivindicada, el polímero aniónico es sulfato de dextrano. El sulfato de dextrano es un polímero sulfatado de anhidroglucosa. El grado de sulfatación y, en consecuencia, el contenido de azufre del sulfato de dextrano puede variar.

El contenido de azufre está entre el 10 % y el 25 % en peso, por ejemplo, el contenido de azufre está entre 15 % y 20 % en peso.

En una forma de realización, el polímero aniónico está caracterizado por tener un peso molecular total de 750 kDa-10 000 kDa, tal como 1000 kDa-10000 kDa. En una forma de realización, el polímero aniónico está caracterizado por tener un peso molecular total de 650 kDa-1 000 kDa, por ejemplo, 750 kDa-1 000 kDa. En una forma de realización, el polímero aniónico está caracterizado por tener un peso molecular total de 1000 kDa-4500 kDa, por ejemplo, 2000 kDa-4500 kDa. En una forma de realización, el polímero aniónico está caracterizado por tener un peso molecular total de 4500 kDa a 7000 kDa. En una forma de realización, el polímero aniónico está caracterizado por tener un peso molecular total de 7000 kDa-10000 kDa. Adecuadamente, el peso molecular total del polímero aniónico se mide de acuerdo con el Método de evaluación G.

En una forma de realización, el polímero aniónico está caracterizado por tener una densidad de carga en solución de entre >4 peq/g y 7 peq/g, tal como entre >5 peq/g y 7 peq/g. Adecuadamente, la densidad de carga de la solución del polímero aniónico se mide de acuerdo con el Método de evaluación H.

Bicapa(s) de recubrimiento de polímero catiónico y aniónico

El proceso de la invención conlleva formar un objeto sólido que tiene una superficie que comprende un recubrimiento estratificado de polímero catiónico y aniónico. Como se explicó anteriormente, una bicapa se define aquí como una capa de polímero catiónico y aniónico (véase la Figura 1).

El recubrimiento estratificado comprende una o más bicapas de recubrimiento, por ejemplo, 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más o 10 o más bicapas de recubrimiento. Cuando se aplica más de una bicapa de recubrimiento, se repiten las etapas i) y ii), es decir, la etapa iii) no es opcional. En una forma de realización del proceso de la invención, la etapa iii) no es opcional. En esta forma de realización, la etapa iii) se repite tantas veces como sea necesario para alcanzar el número requerido de bicapas de recubrimiento, por ejemplo, 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces o 9 veces. En una forma de realización del proceso de la invención, en la etapa iii), las etapas i) y ii) se repiten entre 1 y 10 veces, es decir 1, 2, 3, 4, 5 o 6 veces.

Cuando la etapa iii) no es opcional (es decir, cuando las etapas i) y ii) se repiten una o más veces), las condiciones precisas del proceso de cada repetición no necesitan ser idénticas (por ejemplo, el tipo de sal y/o la concentración utilizada en el tratamiento de la superficie con un polímero aniónico en la etapa ii) no necesita ser idénticas en cada repetición). En una forma de realización, las condiciones del proceso (por ejemplo, el tipo de sal y/o la concentración utilizada en el tratamiento de la superficie con un polímero aniónico en la etapa ii)) son idénticas en cada repetición.

Etapas del proceso

Cabe señalar que las etapas i)-v) se llevan a cabo secuencialmente en el orden dado, es decir, cada una de las etapas i) -iv) va seguida implícitamente de "y, a continuación". Esto no impide que se lleven a cabo una o más etapas adicionales entre cada una de las etapas i)-v) especificadas. Así, en una forma de realización, el proceso de la invención comprende adicionalmente una etapa entre la etapa i) y la etapa ii), entre la etapa ii) y la etapa iii), entre la etapa iii) y la etapa iv) o entre la etapa iv) y la etapa v).

Debe entenderse, por ejemplo, que las etapas de lavado pueden llevarse a cabo entre las etapas de proceso especificadas.

Los autores de la presente invención han descubierto que, de forma sorprendente, la concentración de sal de la etapa ii) (es decir, la concentración de sal presente cuando se aplica(n) la(s) capa(s) de recubrimiento de polímero aniónico) influye en las características resultantes del recubrimiento del objeto sólido, en particular las propiedades de resistencia a la trombosis del objeto sólido final. Los autores de la presente invención han encontrado que cuando la etapa ii) se lleva a cabo a una concentración de sal de 0,25 M-5,0 M, las características resultantes del recubrimiento del objeto sólido, en particular las propiedades de resistencia a la trombosis del objeto sólido final, pueden mejorarse, como se muestra en los Ejemplos 2a y 3a.

En una forma de realización, la etapa ii) se lleva a cabo a una concentración de sal de 0,25 M-4,0 M, como 0,25 M-3,0 M, 0,5 M-3,0 M, 1,0 M-3,0 M, 1,5 M-3,0 M, 0,25 M-1,5 M, 0,5 M-1,5 M, 0,75 M-1,5 M o 1,0 M-2,0 M, en particular, a una concentración de sal de 1,0 M-3,0 M, tal como 1,0 M-2,0 M o 0,75 M-1,5 M o 1,5 M-3,0 M.

En una forma de realización, la sal es una sal inorgánica. De forma adecuada, la sal se selecciona del grupo que consiste en una sal de sodio, una sal de potasio, una sal de magnesio, una sal de calcio, una sal de litio, una sal de amonio, una sal de bario y una sal de estroncio.

En una forma de realización, la sal es una sal de sodio inorgánica.

En una forma de realización, la sal se selecciona del grupo que consiste en cloruro de sodio, sulfato de sodio, hidrógeno fosfato de sodio y fosfato de sodio.

En una forma de realización, la sal es cloruro de sodio.

En una forma de realización, la sal no es cloruro de sodio.

En una forma de realización, la sal es cloruro de sodio a una concentración de 0,25 M-3,0 M, por ejemplo, 0,5 M-3,0 M, por ejemplo, 1,0 M-3,0 M, por ejemplo, 1,5 M-3,0 M.

En una forma de realización, la sal es sulfato de sodio a una concentración de 0,25 M-1,5 M, por ejemplo, 0,5 M-1,5 M, por ejemplo, 0,75 M-1,5 M.

En una forma de realización, la sal es hidrógeno fosfato de sodio a una concentración de 0,25 M-3,0 M, por ejemplo, 0,5 M-3,0 M, por ejemplo, 1,0 M-3,0 M, por ejemplo, 1,0 M-2,0 M.

En una forma de realización, la sal es fosfato de sodio a una concentración de 0,25 M-3,0 M, por ejemplo, 0,5 M-3,0 M p. 1,0 M-3,0 M, por ejemplo, 1,0 M-2,0 M.

Antes de la etapa i) (tratar la superficie del objeto sólido con un polímero catiónico) la superficie del objeto sólido puede someterse opcionalmente a una etapa de pretratamiento.

La etapa de pretratamiento puede ser una etapa de limpieza para mejorar la adhesión y la cobertura de la superficie del recubrimiento subsiguiente. Agentes de limpieza adecuados incluyen disolventes tales como alcoholes, soluciones con pH alto como soluciones que comprenden una mezcla de un alcohol y una solución acuosa de un compuesto de hidróxido (por ejemplo, hidróxido de sodio), solución de hidróxido de sodio como tal, soluciones que contienen hidróxido de tetrametilamonio (TMAH), soluciones ácidas como Piranha (una mezcla de ácido sulfúrico y peróxido de hidrógeno), solución básica de Piranha y otros agentes oxidantes que incluyen combinaciones de ácido sulfúrico y permanganato de potasio o diferentes tipos de soluciones de ácido peroxisulfúrico o ácido peroxidisulfúrico (también como sales de amonio, sodio y potasio), o sometiendo el objeto sólido a plasma en aire, atmósfera de argón o nitrógeno o combinaciones de los mismos.

Así, en una forma de realización, el proceso de la invención comprende adicionalmente una etapa de pretratamiento antes de la etapa i). De forma adecuada, la etapa de pretratamiento es una etapa de limpieza.

De forma alternativa, una etapa de pretratamiento puede suponer la superposición de la superficie del objeto sólido a recubrir de acuerdo con las etapas i)-v) con un material tal como un polímero o una capa de recubrimiento de imprimación, antes de la aplicación de las etapas i)-v). Esta capa de recubrimiento "preparativa" podría, por ejemplo, permitir que la superficie del objeto sólido a recubrir sea "esculpida" o modificada para crear una topografía o textura superficial deseada para optimizar el posterior proceso de recubrimiento estratificado. La capa de recubrimiento adicional también podría mejorar la adherencia del recubrimiento estratificado posterior, en particular ayudando a mantener su integridad durante el procesamiento. Un ejemplo de una capa de recubrimiento de imprimación de este tipo sobre un objeto sólido es una capa de recubrimiento aplicada mediante deposición química de vapor (CVD). Otro ejemplo de tal capa de recubrimiento de imprimación sobre un objeto sólido es un recubrimiento de polidopamina o un análogo de la misma.

En una forma de realización, la etapa de pretratamiento comprende tratar una superficie del objeto sólido con un polímero seleccionado del grupo que consiste en una poliolefina, poliisobutileno, copolímeros de etileno-a-olefina, un polímero acrílico, un copolímero acrílico, poli(cloruro de vinilo), polivinil metil éter, poli(fluoruro de vinilideno), poli(cloruro de vinilideno), un fluoropolímero (por ejemplo, politetrafluoroetileno expandido (ePTFE), politetrafluoroetileno (PTFE), etileno-propileno fluorado (FEP), copolímeros de perfluorocarbono, por ejemplo, copolímeros de tetrafluoroetileno perfluoroalquilvinil éter (TFE/PAVE), copolímeros de tetrafluoroetileno (TFE) y perfluorometil vinil éter (PMVE), copolímeros de TFE con monómeros funcionales que comprenden acetato, alcohol, amina, amida, sulfonato, grupos funcionales y similares como se describe en la patente estadounidense n° 8,658,707 (W.L. Gore and Associates, así como sus combinaciones), poliacrilonitrilo, una polivinilcetona, poliestireno, poli(acetato de vinilo), un copolímero de etileno-metacrilato de metilo, un copolímero de acrilonitrilo-estireno, una resina ABS, nailon 12, un copolímero en bloque de nailon 12, policaprolactona, un polioximetileno, un poliéter, una resina epoxi, un poliuretano, rayón-triacetato, celulosa, acetato de celulosa, butirato de celulosa, celofán, nitrato de celulosa, propionato de celulosa, éter de celulosa, carboximetilcelulosa, quitina, poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), un copolímero de poli(ácido láctico)-poli(óxido de etileno), polietilenglicol, polipropilenglicol, poli(alcohol vinílico), un polímero elastomérico como la silicona (por ejemplo, polisiloxano o un polisiloxano sustituido), un poliuretano, un elastómero termoplástico, un copolímero de etileno-acetato de vinilo, un elastómero de poliolefina, un caucho EPDM y mezclas de los mismos.

En una forma de realización, se proporciona un proceso para la fabricación de un objeto sólido como se describe en este documento, que consta de las etapas i)-v) como se define en este documento, es decir, el objeto sólido no tiene capas de recubrimiento adicionales más allá de las resultantes de las etapas i)-v).

Un objeto sólido recubierto según el proceso de la invención puede esterilizarse. Procesos de esterilización adecuados incluyen, entre otros, esterilización con óxido de etileno, peróxido de hidrógeno en forma de vapor, peróxido de hidrógeno en fase de plasma, calor seco, esterilización con vapor en autoclave, esterilización con dióxido de cloro, esterilización con rayos gamma o esterilización con haz de electrones.

Como se muestra en el Ejemplo 7, objetos sólidos recubiertos según el proceso de la invención se sometieron a mayores condiciones de temperatura y humedad y conservaron sus propiedades de resistencia a la trombosis. Condiciones de mayor temperatura y humedad pueden actuar como una imitación de las rigurosas condiciones de esterilización, en particular esterilización con óxido de etileno. Por tanto, se espera que un objeto sólido recubierto según el proceso de la invención sea estable a la esterilización.

Propiedades de recubrimiento

De forma típica, la capa de recubrimiento tendrá un grosor total promedio de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 1000 nm, por ejemplo, aproximadamente 10 nm a aproximadamente 800 nm, por ejemplo, aproximadamente 10 nm a aproximadamente 500 nm, aproximadamente 10 nm a aproximadamente 400 nm, aproximadamente 10 nm a aproximadamente 300 nm, aproximadamente 10 nm a aproximadamente 200 nm o aproximadamente 10 nm a aproximadamente 100 nm. El grosor del recubrimiento se puede medir con un analizador o calibre medidor de grosor de recubrimiento adecuado, mediante espectroscopía de fotoelectrones de rayos X con perfiles de profundidad (véase el Método de evaluación J) o mediante el uso de una microbalanza de cristal de cuarzo con disipación (véase el Método de evaluación O). Adecuadamente, el grosor del recubrimiento se mide utilizando el Método de evaluación O.

En una forma de realización, el objeto sólido recubierto según el proceso de la invención tiene actividad de entidad anticoagulante (en particular actividad de heparina) de al menos 1 pmol/cm2 de superficie, por ejemplo, al menos 2 pmol/cm2 de superficie, al menos 3 pmol/cm2 de superficie, al menos 4 pmol/cm2 de superficie, o al menos 5 pmol/cm2 de superficie para la unión de ATIII, medida adecuadamente de acuerdo con el Método de evaluación B.

En una forma de realización, una superficie tromboresistente del objeto sólido tiene actividad de entidad anticoagulante (en particular actividad de heparina) de al menos 1 pmol/cm2 de superficie, por ejemplo, al menos 2 pmol/cm2 de superficie, al menos 3 pmol/cm2 de superficie, al menos 4 pmol/cm2 de superficie, o al menos 5 pmol/cm2 de superficie para la unión de ATIII, medida adecuadamente de acuerdo con el Método de evaluación B.

En una forma de realización, el objeto sólido recubierto según el proceso de la invención tiene actividad de entidad anticoagulante (en particular actividad de heparina) de al menos 5 pmol/cm2 de superficie, por ejemplo, al menos 12 pmol/cm2 de superficie, al menos 20 pmol/cm2 de superficie, al menos 50 pmol/cm2 de superficie para la unión de HCll, medida adecuadamente según el Método de evaluación M.

En una forma de realización, una superficie tromboresistente del objeto sólido tiene actividad de entidad anticoagulante (en particular, actividad de heparina) de al menos 5 pmol/cm2 de superficie, por ejemplo, al menos 12 pmol/cm2 de superficie, al menos 20 pmol/cm2 de superficie, al menos 50 pmol/cm2 de superficie para la unión de HCll, medida adecuadamente según el Método de evaluación M.

En una forma de realización, el objeto sólido recubierto según el proceso de la invención tiene un rendimiento de contacto con la sangre de al menos un 80 % de plaquetas conservadas, por ejemplo, al menos un 85 % de plaquetas conservadas, por ejemplo, al menos un 90 % de plaquetas conservadas, medidas adecuadamente de acuerdo con el Método de evaluación E.

En una forma de realización, una superficie tromboresistente de un objeto sólido tiene un rendimiento de contacto con la sangre de al menos un 80 % de plaquetas conservadas, por ejemplo, al menos un 85 % de plaquetas conservadas, por ejemplo, al menos un 90 % de plaquetas conservadas, medidas adecuadamente de acuerdo con el Método de evaluación E.

En una forma de realización, el objeto sólido recubierto según el proceso de la invención tiene un valor F1+2 de <10 000 pmol/l, por ejemplo, menos de 7500 pmol/l, menos de 5000 pmol/l o menos de 4000 pmol/l, adecuadamente medido de acuerdo con el Método de evaluación F.

En una forma de realización, una superficie tromboresistente de un objeto sólido tiene un valor F1+2 de <10000 pmol/l, menos de 7500 pmol/l, menos de 5000 pmol/l o menos de 4000 pmol/l, adecuadamente medido de acuerdo con el Método de evaluación F.

En una forma de realización, la entidad anticoagulante es un resto de heparina, donde el objeto sólido tiene una concentración de heparina de al menos 1 gg/cm2, por ejemplo, al menos 2 gg/cm2, al menos 4 gg/cm2, al menos 5 gg/cm2, o al menos 6 gg/cm2, adecuadamente medido de acuerdo con el Método de evaluación A.

Se pueden medir adecuadamente los perfiles de potencial zeta de los objetos sólidos recubiertos según el proceso de la invención utilizando el Método de evaluación D. En la Figura 22 se muestra un perfil de potencial zeta típico de un objeto sólido recubierto según el proceso de la invención, que indica los diversos parámetros que pueden utilizarse para calificar y definir un perfil de potencial zeta, en particular el punto isoeléctrico (IEP) (1A) que corresponde a un valor de pH particular en el que el potencial zeta es 0 mV; el mínimo global de la curva correspondiente al pH (2A) en el que el potencial zeta (2B) es mínimo; y el valor delta (A) que corresponde a la diferencia entre el potencial zeta en el mínimo global (3A) y el potencial zeta a pH 9 (3B).

Se han obtenido perfiles de potencial zeta (Z) similares para objetos sólidos recubiertos según el proceso de la invención con sulfatos de dextrano 4-7 como puede apreciarse en las Figuras 7-13 (Ejemplos 4a y 4b). Por tanto, el perfil de potencial zeta puede verse como una posible huella para objetos sólidos recubiertos según el proceso de la invención, al menos en sus aspectos preferidos. De acuerdo con esta huella potencial, preferiblemente el IEP (1A) está por debajo de pH 3, el mínimo global de la curva (2A) está por debajo de pH 5 y el valor delta, es decir, la diferencia entre el potencial zeta en el mínimo global (3A) y el potencial zeta a pH 9 (3B), es de al menos 20 mV. Estos parámetros se miden adecuadamente según el Método de evaluación D.

Los objetos sólidos recubiertos según el proceso de la invención tienen adecuadamente un perfil de potencial zeta con un punto isoeléctrico (IEP) por debajo de pH 3 porque la naturaleza ácida de la heparina domina en la superficie revestida. Por el contrario, los materiales poliméricos inertes tendrán un IEP de aproximadamente pH 4. Las propiedades de hinchamiento de las muestras que tienen grupos ácidos se observan hacia la región alcalina. El hinchamiento forzará el plano de corte en la dirección del volumen y se obtendrán valores de potencial zeta absolutos más bajos (más cercanos a 0 mV). Un alto valor delta del potencial zeta se correlaciona con altas propiedades tromboresistentes, por ejemplo, cuando se evalúa de acuerdo con los Métodos de evaluación B, M, E o F. Adicionalmente, la concentración de sal más alta utilizada en el proceso de la invención da valores de potencial zeta absolutos más bajos en las regiones alcalinas independientemente de la sal probada, una vez más en correlación con los valores de unión de antitrombina. Sin quedar limitado por la teoría, esto puede explicarse potencialmente con un mayor acceso de la antitrombina a las moléculas de heparina en un recubrimiento que puede hincharse.

Métodos terapéuticos

Los objetos sólidos, en particular los dispositivos médicos recubiertos de acuerdo con el proceso de la invención como se ha descrito anteriormente, son útiles en la terapia médica.

En un aspecto de la invención, se proporciona un objeto sólido (en particular, un dispositivo médico) recubierto de acuerdo con el proceso de la invención descrito anteriormente para su uso en el tratamiento de tejidos en el cuerpo humano o animal. El tejido a tratar incluye cualquier cavidad corporal, espacio o vías de paso de órganos huecos tales como vasos sanguíneos, tracto urinario, tracto intestinal, cavidad nasal, vaina neural, regiones intervertebrales, cavidades óseas, esófago, espacios intrauterinos, vías pancreáticas y biliares, recto y aquellos espacios corporales previamente intervenidos que tengan implantados endoprótesis, estents, prótesis u otro tipo de injertos médicos. En otro aspecto más de la invención, un objeto sólido (por ejemplo, un dispositivo médico) recubierto de acuerdo con un proceso de la invención como se describe anteriormente en el presente documento puede desplegarse para tratar aneurismas en el cerebro.

El objeto sólido recubierto (en particular, un dispositivo médico) como se describe en este documento puede ser útil para eliminar obstrucciones tales como émbolos y trombos de los vasos sanguíneos, como un dispositivo de dilatación para restaurar la permeabilidad de una vía de paso corporal ocluida, tal como un dispositivo de oclusión para administrar selectivamente un medio para obstruir o llenar una vía de paso o espacio, y como un mecanismo de centrado para instrumentos transluminales como catéteres.

En una forma de realización, se proporciona un objeto sólido (en particular, un dispositivo médico tal como un estent, injerto o endoprótesis) recubierto de acuerdo con el proceso de la invención como se describe anteriormente para su uso en la prevención o tratamiento de estenosis o restenosis en un vaso sanguíneo del cuerpo humano. En otra forma de realización, se proporciona un objeto sólido (en particular, un dispositivo médico tal como estent, injerto o endoprótesis) recubierto de acuerdo con el proceso de la invención como se describió anteriormente para su uso en la prevención o tratamiento de estenosis o restenosis en un vaso sanguíneo del cuerpo humano, donde han fallado las construcciones de elución colocadas previamente. En otra forma de realización, un objeto sólido (en particular, un dispositivo médico tal como un estent, injerto o endoprótesis) recubierto de acuerdo con el proceso de la invención como se describe anteriormente puede usarse para establecer o mantener sitios de acceso arteriovenoso, por ejemplo, los utilizados durante la diálisis renal. En una forma de realización adicional, un objeto sólido (en particular, un dispositivo médico como un estent, injerto o endoprótesis, por ejemplo, un injerto vascular) recubierto de acuerdo con el proceso de la invención descrito anteriormente puede usarse para redirigir el flujo aproximadamente de un área de bloqueo o estrechamiento del vaso. En otra forma de realización, un objeto sólido (en particular, un dispositivo médico tal como un estent, injerto o endoprótesis) recubierto de acuerdo con el proceso de la invención como se describió anteriormente en el presente documento puede desplegarse para restaurar la permeabilidad a un área del vaso enfermo o para excluir un aneurisma. En otra forma de realización más, un objeto sólido (en particular un dispositivo médico tal como un estent, injerto o endoprótesis) recubierto según el proceso de la invención como se describe anteriormente puede desplegarse para reforzar un vaso enfermo después de la angioplastia. En aún otra forma de realización, un objeto sólido (en particular un dispositivo médico tal como un estent, injerto o endoprótesis) recubierto según el proceso de la invención como se describe anteriormente puede desplegarse en el cerebro usando procedimientos asistidos por balón o asistidos por bobina.

En una forma de realización, un objeto sólido (en particular un dispositivo médico) recubierto según el proceso de la invención como se describe anteriormente puede usarse para angioplastia percutánea transluminal (PTA) en pacientes con enfermedad obstructiva de las arterias periféricas.

Ventajas

Se espera que los objetos sólidos recubiertos según el proceso de la invención, al menos en algunas formas de realización, tengan uno o más de los siguientes méritos o ventajas:

• Se puede conseguir un recubrimiento de la entidad anticoagulante que tiene una distribución uniforme y que es comparativamente suave, por ejemplo, según se determina utilizando el Método de evaluación C (ensayo de tinción con azul de toluidina) o el Método de evaluación I (SEM);

• Se puede obtener un recubrimiento uniforme que enmascare las propiedades intrínsecas del objeto sólido, por ejemplo para mejorar las propiedades tromboresistentes de un dispositivo independientemente del material de su fabricación;

• Se puede obtener un recubrimiento con buena actividad de entidad anticoagulante tal como actividad de heparina, por ejemplo, según se determina utilizando el Método de evaluación B o M;

• Se puede obtener un recubrimiento tromboresistente que no lixivie la entidad anticoagulante, por ejemplo, heparina, debido a su unión covalente y por tanto tiene un tiempo de vida prolongado;

• Se puede obtener un recubrimiento cuyas propiedades se conservan tras la esterilización (por ejemplo, con EO);

• Se puede obtener un recubrimiento autorreparable debido a la posibilidad de formación reversible de interacciones iónicas entre las capas;

• Se puede obtener un recubrimiento con buena biocompatibilidad, por ejemplo, según se determina usando el Método de evaluación N;

• Un recubrimiento que puede reducir la necesidad de administración sistémica de anticoagulantes, por ejemplo, heparina y reducir la probabilidad de activación por contacto, por ejemplo, según se determina utilizando el Método de evaluación E (plaquetas) y/o el Método de evaluación F (bucle de sangre);

• Se puede obtener un objeto sólido que tenga una combinación de propiedades antiinflamatorias según se determina mediante el Método de evaluación N y tromboresistencia, lo que puede ser beneficioso en ciertas aplicaciones, por ejemplo, aplicaciones cardiovasculares;

• Se puede obtener un dispositivo analítico o de separación con buena capacidad de unión a biomoléculas; y • Se puede obtener un dispositivo analítico o de separación con una larga vida útil de la actividad de la heparina.

Abreviaturas

Ac acetilo

ABS acrilonitrilo butadieno estireno

AT III antitrombina III

CNS sistema nervioso central

CPB derivación cardiopulmonar

CVC catéter venoso central

CVD deposición química de vapor

Da dalton

DI desionizado

EDC 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida

EO óxido de etileno

EPDM monómero de etileno propileno dieno (clase M)

ePTFE politetrafluoroetileno expandido

FEP etileno-propileno fluorado

GPC cromatografía de exclusión molecular

HCll cofactor de heparina II

HIT trombocitopenia inducida por heparina

IEP punto isoeléctrico

M concentración molar

MBTH hidrocloruro de 3-metil-2-benzotiazolinona hidrazona

PAVE perfluoroalquilvinil éter

PES-Na polietileno sulfato de sodio

PTA angioplastia percutánea transluminal

PIC catéter central insertado periféricamente

PMVE perfluorometil vinil éter

PTFE politetrafluoroetileno

PUR poliuretano

PVP poli(cloruro de vinilo)

RGD ácido arginilglicilaspártico

SEM microscopía electrónica de barrido/microscopio

SPDP 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo

TFE tetrafluoroetileno

TMAH hidróxido de tetrametilamonio

TMB 3,3',5,5'-tetrametilbencidina

VA ventriculoauricular

VP ventriculoperitoneal

XPS espectroscopía de fotoelectrones de rayos X

EJEMPLOS

PROCEDIMIENTOS GENERALES

Productos químicos

El isopropanol, dihidrógeno fosfato de sodio dihidrato, sulfato de sodio y cloruro de sodio están disponibles en Sigma Aldrich y VWR Chemicals y se pueden usar tal como se reciben. La heparina de calidad de farmacopea se trató con ácido nitroso, esencialmente como se describe en el documento EP0086186A1 y se usó en los Ejemplos. Las poliaminas están disponibles a través de proveedores como se describe en el documento US9,101,696B2. Los sulfatos de dextrano se adquirieron de varios proveedores como se indica en la Tabla 1 del Ejemplo 1. Se usó agua desionizada (DI) en los Ejemplos a continuación.

Materiales

Los tubos flexibles de PVC se adquirieron de Flex Tubing Products. Los tubos flexibles de PUR se adquirieron de NewAge Industries. Las muestras para ensayo de acero inoxidable se adquirieron de Helab Mekano AB.

Métodos de evaluación

El parámetro evaluado por cada método se indica entre paréntesis.

Método de evaluación A: prueba de concentración de heparina (fijación cuantitativa de heparina)

La cuantificación de la heparina inmovilizada en la superficie se puede llevar a cabo mediante la degradación completa de heparina seguida de determinación colorimétrica de los productos de reacción liberados en la solución. La degradación se logra haciendo reaccionar la superficie de la heparina con un exceso de nitrito de sodio en condiciones ácidas. Los productos de degradación, principalmente disacáridos, se cuantifican colorimétricamente en una reacción con MBTH (clorhidrato de 3-metil-2-benzotiazolinona hidrazona), esencialmente como se describe en Smith RL and Gilkerson E (1979), Anal Biochem 98, 478-480.

Método de evaluación B: prueba de actividad de heparina (función de heparina cuantitativa usando ATIII)

Para objetos sólidos recubiertos de acuerdo con el proceso de la invención que comprende un recubrimiento de heparina, la actividad de heparina del dispositivo se puede medir midiendo la capacidad de la heparina para unirse a antitrombina III (ATIII) como se describe por Pasche, et al. en "A bind of antithrombin to immobilized heparin under varing flow conditions” (Un enlace de antitrombina a heparina inmovilizada bajo condiciones de flujo variable) (Artif. Organs 1991; 15:281-491 y Larsen ML, et al. en “ Assay of plasma heparin using thrombin and the chromogenic substrate H-D-Phe-Pip-Arg-pNA” (Ensayo de heparina en plasma usando trombina y el sustrato cromogénico H-D-Phe-Pip-Arg-pNA) (S-2238) (Thromb. Res. 1978; 13:285-288), y se puede utilizar para evaluar las propiedades tromboresistentes de un objeto sólido. Se incuban muestras lavadas con un exceso de antitrombina en solución para saturar todos los sitios de unión de antitrombina disponibles de la superficie de heparina. La antitrombina adsorbida no específicamente se enjuaga con una solución salina. Posteriormente, la antitrombina unida específicamente a la heparina unida a la superficie se libera incubando con una solución de heparina a alta concentración. Finalmente, la antitrombina liberada de la superficie de la heparina se mide en un ensayo de inhibición de trombina, basado en un sustrato de trombina cromogénico. Los resultados se expresan como picomoles de antitrombina III (ATIII) unida por centímetro cuadrado aparente de dispositivo (pmol ATIII/cm2 superficie del objeto sólido). El área de la superficie aparente del objeto sólido no tiene en cuenta las múltiples superficies cubiertas ni las consideraciones de porosidad de un objeto sólido compuesto de un material poroso. Si la superficie del objeto sólido es porosa, el efecto de la porosidad en el área de la superficie no se considera para estos cálculos. Por ejemplo, el área de la superficie aparente de un injerto vascular de ePTFE tubular cilíndrico (que está realizado en de un material poroso) con heparina inmovilizada en el material del sustrato que comprende la superficie interna del injerto tubular se calcula como para cualquier geometría cilíndrica como 2prL: donde r es el radio interno del injerto; L es la longitud axial; y p es el número pi. Este método se puede utilizar para medir la actividad de cualquier entidad anticoagulante con actividad de unión a ATI 11.

Método de evaluación C: prueba de tinción con azul de toluidina (distribución de heparina)

La distribución de heparina se evalúa utilizando una solución de tinción con azul de toluidina. La solución se prepara disolviendo 200 mg de azul de toluidina en 1 l de agua. Las muestras se someten a la solución de tinción durante 2 minutos antes de un enjuague abundante con agua. Una tinción azul/violeta indica que las moléculas de heparina cargadas negativamente están homogéneamente distribuidas en la capa de recubrimiento exterior.

Método de evaluación D: medición del potencial zeta (indicador de carga superficial)

El potencial zeta, como indicador de la carga superficial, del recubrimiento se determina en un instrumento SurPASS. La medición se lleva a cabo haciendo circular un electrolito sobre la superficie, que es convencionalmente una solución 1 mM de un electrolito simple como KCl o NaCl. El potencial de transmisión resultante se mide y se utiliza para determinar el potencial zeta. El potencial zeta del recubrimiento se determina en el intervalo de pH de 3 a 9 mediante la adición de ácido o base a la solución, respectivamente. El potencial zeta se calcula utilizando la ecuación 1 siguiente, como se describe en T. Luxbacher, The ZETA guide, Principles of the streaming potential technique (Principios de la técnica del potencial de transmisión), primera edición, publicada por Anton Paar GMBH, ISBN 978-3-200-03553-9.

dU/dP = pendiente del potencial de transmisión frente a la presión diferencial,

kB = conductividad del electrolito

r| = viscosidad del electrolito

£ = coeficiente dieléctrico del electrolito

£0 = permitividad del vacío.

Método de evaluación E: prueba de evaluación del bucle de sangre (medición de la pérdida de plaquetas)

La evaluación del contacto con la sangre se puede llevar a cabo en un objeto recubierto para evaluar sus propiedades tromboresistentes. Un procedimiento que puede usarse cuando el objeto sólido es un dispositivo tubular tal como un trozo de tubo de PVC es el siguiente. En primer lugar, el lado luminal del tubo recubierto se lava con solución salina 0,15 M durante 15 horas a un caudal de 1 ml/min para garantizar la humectación completa y la eliminación de cualquier entidad anticoagulante suelta, de modo que quede una superficie estable. A continuación, el tubo lavado se incuba en un modelo de bucle de Chandler realizado esencialmente de acuerdo con Andersson et al. (Anderson, J.; Sánchez, J.; Ekdahl, K. N.; Elgue, G.; Nilsson, B.; Larsson, R. J Biomed Mater Res A 2003, 67(2), 458-466 a 20 rpm. Las plaquetas de sangre fresca y de la sangre extraída de los bucles se cuentan en un contador de células para medir la pérdida de plaquetas. Una gran pérdida de plaquetas indica un bajo rendimiento tromboresistente de la superficie. Por el contrario, una pérdida mínima de plaquetas indica una superficie tromboresistente.

Método de evaluación F: prueba de evaluación del bucle de sangre (para la medición de F1+2)

La determinación de F1+2 (fragmento de protrombina) se utiliza como marcador de activación de la coagulación (es decir, como medida indirecta de trombina). F1+2 es directamente proporcional a la formación de trombina y se interpreta como una medida indirecta de la generación de trombina, y se puede utilizar para evaluar las propiedades tromboresistentes de un objeto sólido. La determinación cuantitativa de F1+2 en plasma se realiza con un inmunoanálisis enzimático, utilizando un kit ELISA estándar (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) (Enzygnost F1+2 ELISA, OPBDG03, Siemens). El antígeno F1+2 en la muestra se acopla a los anticuerpos atrapados en la superficie recubierta de la placa de microvaloración de 96 pocillos y posteriormente se detecta por un anticuerpo anti-F1+2 conjugado con peroxidasa. La cantidad de peroxidasa acoplada se mide mediante la adición de un sustrato específico, 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB). La conversión enzimática del sustrato en cromógeno se detiene mediante la adición de ácido sulfúrico diluido. La absorbancia a 450 nm en los pozos es proporcional a la concentración de F1+2 en la muestra. La concentración de las muestras se determina por comparación con una curva patrón con concentraciones conocidas de F1+2.

Método de evaluación G: peso molecular de polímeros aniónicos tales como sulfato de dextrano en solución

La determinación del peso molecular de una muestra de sulfato de dextrano se realiza en un instrumento de cromatografía de exclusión molecular (GPC). Las muestras de sulfato de dextrano se disuelven en un medio de elución basado en agua y se analizan en un instrumento GPC adecuado para el intervalo de peso molecular de 1000 Da-100000 Da (columna Superose) o 100000 Da-2000000 Da (columna Sephacryl). Se utiliza un patrón de sulfato de dextrano de un peso molecular apropiado para verificar la precisión de la curva de calibración. Polímeros como el sulfato de dextrano son moléculas dispersas, es decir, tienen una distribución de pesos moleculares que puede describirse con diferentes promedios de pesos moleculares. El valor informado comúnmente es el peso molecular promedio en peso (Mw). Véase Odian G., Principles of Polymerization (Principios de polimerización), Tercera edición, Sección 1.4 Peso molecular, pág. 24 que explica la teoría sobre la determinación de pesos moleculares de polímeros mediante técnicas de GPC. El peso molecular de los polímeros aniónicos distintos del sulfato de dextrano también se puede determinar mediante este método.

Método de evaluación H: Densidad de carga de la solución de polímeros aniónicos tales como sulfato de dextrano en solución

La determinación cuantitativa de la densidad de carga se realiza en un detector de carga de partículas Mütek mediante la valoración de soluciones de polielectrolitos (0,001 M) (cloruro de polidialildimetilamonio (Poly-Dadmac) y polietilen sulfato de sodio (PES-Na)). Las muestras se disuelven en agua (viscosidad máxima permitida 6000 mPas) a una concentración de 0,06 g/l. El pH se ajusta a 3 para todas las soluciones de muestra. Se agregan 10 ml por solución de muestra en cada medición, seguido de la valoración de la solución de polielectrolito adecuada a un intervalo de 1 unidad cada 3 segundos. Véase S. Farris et al., Charge Density Quantification of Polyelectrolyte Polysaccharides by Conductometric Titration: An Analtical Chemistry Experiment (Cuantificación de densidad de carga de polisacáridos de polielectrólitos mediante valoración conductimétrica: un experimento de química analítica), J. Chem. Educ., 2012, 89 (1), págs. 121-124. La densidad de carga de la solución de polímeros aniónicos distintos del sulfato de dextrano también se puede determinar utilizando este método.

Método de evaluación I: Microscopía electrónica de barrido con espectroscopía de rayos X de dispersión de energía (cobertura y uniformidad del recubrimiento)

TM3000 es un microscopio electrónico de barrido de sobremesa (SEM) fabricado por Hitachi que se utiliza para obtener información sobre, por ejemplo, una muestra de grosor, topografía (estructura de la superficie) y cobertura de la superficie. Se puede lograr un mayor aumento con SEM de sobremesa en comparación con los microscopios ópticos tradicionales, ya que se utilizan electrones para crear la imagen. El TM3000 también está equipado con Quantax70. Se trata de un espectrómetro de rayos X de dispersión de energía (EDS) que se utiliza para determinar la composición química de la muestra. Además, se dispone de una mesa de rotación/inclinación como accesorio para facilitar el análisis de diferentes partes de la muestra. La muestra se monta en un soporte con cinta de carbono (también actúa como conexión a tierra) y luego se coloca en la cámara de prueba. Se realiza vacío en la cámara a una presión más baja antes de que pueda comenzar la evaluación de la muestra. La tecnología SEM se basa en el barrido de un haz de electrones a través de la muestra, algunos de los electrones son electrones retrodispersados reflejados, mientras que otros ejecutan electrones secundarios. Se utiliza un detector para medir la corriente generada por los electrones retrodispersados reflejados. La corriente se muestra en una pantalla donde cada píxel corresponde a la posición de la muestra. Se obtiene un píxel brillante si se reflejan muchos electrones (densidad electrónica alta) y se obtiene un píxel más oscuro si se reflejan pocos electrones (densidad electrónica baja).

Método de evaluación J: Espectroscopia de fotoelectrones de rayos X con perfiles de profundidad (XPS) (grosor del recubrimiento)

La espectroscopia de fotoelectrones de rayos X (XPS o ESCA) es la técnica de caracterización de superficies más utilizada que proporciona análisis químicos no destructivos de materiales sólidos. Las muestras se irradian con rayos X monoenergéticos que hacen que se emitan fotoelectrones desde los 1 nm a 10 nm superiores de la superficie de la muestra. Un analizador de energía de electrones determina la energía de enlace de los fotoelectrones. Es posible el análisis cualitativo y cuantitativo de todos los elementos, excepto hidrógeno y helio, en límites de detección de ~ 0,1 -0,2 por ciento atómico. Los tamaños de los puntos de análisis oscilan entre 10 μm y 1,4 mm. También es posible generar imágenes superficiales de las características mediante el mapeo de estados químicos y elementales. El perfilado de la profundidad es posible utilizando mediciones dependientes del ángulo para obtener análisis no destructivos dentro de los 10 nm superiores de una superficie, o en toda la profundidad del recubrimiento utilizando análisis destructivos como el grabado iónico.

Método de evaluación K: Prueba de aumento de temperatura y humedad (modelo general para la estabilidad de la esterilización)

El objeto sólido recubierto según el proceso de la invención se coloca en una bolsa de polietileno transpirable (por ejemplo, una bolsa Tyvek). La bolsa se coloca en una cámara climática (por ejemplo, Climacell) a 40 °C y 50 % de humedad relativa durante 1 semana, seguido de 2 horas de secado en una cámara de vacío. Después de realizar este modelo general para la estabilidad a la esterilización, se evalúan las propiedades tromboresistentes/activación del objeto recubierto, por ejemplo, utilizando el Método de evaluación E o F.

Método de evaluación L: Estabilidad al óxido de etileno

El objeto sólido recubierto según el proceso de la invención se coloca en una bolsa de polietileno transpirable (por ejemplo, una bolsa Tyvek) y se somete a un preacondicionamiento de al menos 12 horas a 50 °C y 60 % de humedad relativa, seguido de 2 horas de exposición a óxido de etileno a una presión de 366 mbar y 50 °C. A continuación, la cámara se desgasifica a 50 °C durante al menos 10 horas. La esterilización por óxido de etileno se puede llevar a cabo en Synergy Health Ireland Ltd. Después de la esterilización, se evalúan las propiedades tromboresistentes/activación del objeto recubierto, por ejemplo, utilizando el Método de evaluación E o F.

Método de evaluación M: prueba de actividad de heparina (función cuantitativa de heparina usando HCll)

Para objetos sólidos recubiertos de acuerdo con el proceso de la invención que comprende un recubrimiento de heparina, la actividad de heparina del dispositivo se puede determinar midiendo la capacidad de la heparina para unirse al cofactor de heparina II (HCll) como se describe en el documento WO2009/064372A2 (Gore Enterprise Holdings, Inc.) midiendo la habilidad, o capacidad, de la heparina para unirse a una cantidad conocida de cofactor II de heparina (HCll), utilizando un ensayo como el descrito por Larsen M.L., et al., en "Assay of plasma heparin using thrombin and the chromogenic substrate H-D-Phe-Pip-Arg-pNA (S-2238)" (Ensayo de heparina en plasma usando trombina y el sustrato cromogénico H-D-Phe-Pip-Arg-pNA (S-2238). Tromb Res 13:285-288 (1978) y Pasche B., et al., en “A binding of antithrombin to immobilized heparin under varying flow conditions" (Una unión de antitrombina a heparina inmovilizada bajo condiciones de flujo variable). Artif. Organs 1991; 15:281-491), y se puede utilizar para evaluar las propiedades tromboresistentes de un objeto sólido. Los resultados se expresan como picomoles de cofactor de heparina II (HCll) unidos por centímetro cuadrado aparente de superficie de objeto sólido (pmol HCll/cm2 superficie de objeto sólido). El área de la superficie aparente del objeto sólido no tiene en cuenta las múltiples superficies cubiertas ni las consideraciones de porosidad de un dispositivo compuesto de un material poroso. Si la superficie del dispositivo es porosa, el efecto de la porosidad en el área de la superficie no se considera para estos cálculos. Por ejemplo, el área de la superficie aparente de un injerto vascular de ePTFE tubular cilíndrico (que está realizado en un material poroso) con heparina inmovilizada en el material del sustrato que comprende la superficie interna del injerto tubular se calcula como para cualquier geometría cilíndrica como 2prL: donde r es el radio interno del injerto; L es la longitud axial; y p es el número pi. Este método se puede utilizar para medir la actividad de cualquier entidad anticoagulante con actividad de unión a HCll.

Método de evaluación N - Biocompatibilidad superficial

La biocompatibilidad de una superficie de un objeto sólido recubierto según un proceso de la invención se puede evaluar como se describe en Lappegard, K. T 2008, J. Biomed. Mate. Res. Vol. 87, 129-135. Un procedimiento que se puede usar para evaluar la respuesta inflamatoria es el siguiente. En primer lugar, el objeto sólido recubierto se lava con solución salina 0,15 M durante 15 min. El objeto sólido recubierto humectado se coloca en un tubo de PVC heparinizado que contiene sangre completa y se deja circular en un bucle circulante a 20 rpm (ver Ekdahl K. N., Advances in Experimental Medicine and Biology (Avances en Medicina Experimental y Biología), 2013, 735, 257-270 para un procedimiento representativo). Después de la incubación, la sangre se centrifuga durante 15 min, 3220 g a 4 °C. El plasma se congela en alícuotas a -70 °C para su posterior análisis de citocinas. Las muestras de plasma se analizan usando un ensayo de citoquinas multiplex (Bio-Plex Human Cytokine 27-Plex Panel, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) de acuerdo con el método descrito por Lappegard et al. (arriba).

El control negativo es un bucle vacío de PVC heparinizado sin ningún dispositivo. Esto representa un control no inflamatorio para el cual la sangre incubada debe mostrar una cantidad mínima o nula de marcadores inflamatorios. El control positivo es un bucle vacío de PVC no heparinizado sin ningún dispositivo. Esto representa un control inflamatorio para el cual se debe observar una mayor cantidad de marcadores inflamatorios. Se incluyen los controles para asegurar la calidad del experimento y de la sangre.

Método de evaluación O - Microbalanza de cristal de cuarzo con disipación (grosor del recubrimiento)

Q-sense E4 es una microbalanza de cristal con instrumento de monitorización de disipación (QCM-D). QCM-D es una técnica para medir tanto la masa como las propiedades estructurales de capas moleculares y puede verse como un dispositivo de pesado ultrasensible.

Un sensor QCM consiste en un disco delgado de cuarzo donde cristales de corte AT son los más utilizados. El disco de cuarzo se coloca entre dos electrodos y al aplicar un voltaje al cristal de cuarzo se puede hacer que oscile a su frecuencia de resonancia. Los cambios de masa en la superficie del cuarzo inducen un cambio en la frecuencia del cristal oscilante relacionado a través de la relación de Sauerbrey (ver Rodahl, M., et al., Quartz crystal microbalance setup for frequency and Q factor measurements in gaseous and liquid environments. Review of scientific environments (Configuración de microbalanza de cristal de cuarzo para mediciones de frecuencia y factor Q en entornos gaseosos y líquidos. Revisión de entornos científicos), 1995. 66(7): páginas 3924-3930. El grosor del recubrimiento de los objetos sólidos recubiertos según el proceso de la invención se indica como grosor del recubrimiento en seco.

Método de evaluación P - Determinación del peso molecular de las fracciones de fragmentos de heparina

El peso molecular de las fracciones de fragmentos de heparina se determina mediante cromatografía analítica de exclusión molecular (GPC) en un sistema que consiste en dos columnas Superdex en serie (S-75 y S-200) esencialmente de acuerdo con USP<209> Determinaciones de peso molecular de heparina de bajo peso molecular. Las posiciones de los picos se identifican según el perfil de elución del 2° patrón internacional para la heparina de bajo peso molecular para la calibración del peso molecular (NIBSC, Reino Unido), donde el pico menos retrasado del patrón es un disacárido.

Método de evaluación Q - Determinación de la concentración de fragmentos de heparina

Las cantidades de fragmento de heparina aislado en solución se estiman analizando el contenido de ácido urónico mediante el ensayo de carbazol (Bitter, T.; Muir, HM, Anal.Biochem., 1962, (4), 330-334), relacionado con una curva patrón de heparina.

En los siguientes ejemplos, solo los ejemplos que utilizan sulfato de dextrano con un peso molecular de 650 kDa-10 000 kDa, un contenido de azufre entre 10-25 % en peso, y en los que el tratamiento de la superficie del objeto sólido con sulfato de dextrano se lleva a cabo a una concentración de sal de 0,25 M-5,0 M, están de acuerdo con la invención reivindicada. Los ejemplos que utilizan sulfato de dextrano con un peso molecular, contenido de azufre diferentes o que hacen uso de una concentración de sal diferente, se deben considerar como ejemplos de referencia.

Ejemplo 1: Procesos para recubrir un objeto sólido (recubrimiento estratificado de polímero catiónico y aniónico, con capa de recubrimiento exterior de entidad anticoagulante)

Proceso general de recubrimiento - tubo

La superficie luminal de una sección de tubo (por ejemplo, tubo de PVC o PUR) se recubre con un recubrimiento capa por capa de polímero catiónico y polímero aniónico usando esencialmente el método descrito por Larm et al. en los documentos EP0086186A1, EP0495820B1 y EP0086187A1.

Específicamente, la superficie luminal del tubo se limpia primero con isopropanol y un agente oxidante. Las bicapas de recubrimiento se construyen mediante la adsorción alternada de un polímero catiónico (poliamina, 0,05 g/l en agua) y un polímero aniónico (sulfato de dextrano, 0,1 g/l en agua). La poliamina se reticula con un aldehído difuncional (crotonaldehído). El sulfato de dextrano materia prima varía como se especifica en cada uno de los Ejemplos a continuación, y se aplica en presencia de varias sales de sodio a varias concentraciones, de nuevo como se especifica en cada Ejemplo a continuación. Cada par de poliamina y polisacárido sulfatado se denomina una bicapa, es decir, una bicapa se define como una capa de polímero catiónico y aniónico y se usan las mismas condiciones para la construcción de cada bicapa. La superficie luminal del tubo está recubierta con tres bicapas (véase la Figura 1 para un objeto sólido recubierto con una sola bicapa). A continuación, se adsorbe una capa final, la más externa, de poliamina.

A continuación, se inmoviliza la heparina en la capa más externa de poliamina mediante aminación reductora, esencialmente como se describe en Larm et al. en los documentos EP0086186A1 y EP0495820B1.

Proceso general de recubrimiento - muestras de acero para ensayo

Se puede recubrir cualquier objeto sólido mediante el proceso de recubrimiento general descrito anteriormente para los tubos. En los Ejemplos siguientes en los que se utilizó una muestra de acero para ensayos, se revistió toda la superficie de la muestra para ensayos.

Sulfatos de dextrano usados en los Ejemplos 1.1-1.56

Los sulfatos de dextrano evaluados se adquirieron de diferentes proveedores como se presenta en la Tabla 1.

Tabla 1 - Sulfatos de dextrano evaluados en los Ejemplos

Ejemplo 1.1: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 1 y una concentración de NaCl de 0,25 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 1, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 0,25 M.

Ejemplo 1.2: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 1 y una concentración de NaCl de 1,7 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 1, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 1,7 M.

Ejemplo 1.3: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 2 y una concentración de NaCl de 0,25 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 2, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 0,25 M.

Ejemplo 1.4: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 3 y una concentración de NaCl de 0,05 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 3, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 0,05 M.

Ejemplo 1.5: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 3 y una concentración de NaCl de 0,1 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 3, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 0,1 M.

Ejemplo 1.6: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 3 y una concentración de NaCl de 0,25 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 3, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 0,25 M.

Ejemplo 1.7: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 3 y una concentración de NaCl de 1,0 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 3, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 1,0 M.

Ejemplo 1.8: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 3 y una concentración de NaCl de 1,7 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 3, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 1,7 M.

Ejemplo 1.9: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 3 y una concentración de NaCl de 2,6 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 3, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 2,6 M.

Ejemplo 1.10: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 3 y una concentración de NaCl de 3,0 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 3, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 3,0 M.

Ejemplo 1.11: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 4 y una concentración de NaCl de 0,05 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 4, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 0,05 M.

Ejemplo 1.12: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 4 y una concentración de NaCl de 0,1 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 4, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 0,1 M.

Ejemplo 1.13: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 4 y una concentración de NaCl de 0,25 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 4, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 0,25 M.

Ejemplo 1.14: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 4 y una concentración de NaCl de 1,0 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 4, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 1,0 M.

Ejemplo 1.15: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 4 y una concentración de NaCl de 1,7 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 4, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 1,7 M.

Ejemplo 1.16: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 4 y una concentración de NaCl de 3,0 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 4, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 3,0 M.

Ejemplo 1.17: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 5 y una concentración de NaCl de 0,05 M

Se recubrieron tubos de PVC de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 5, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 0,05 M.

Ejemplo 1.18: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 5 y una concentración de NaCl de 0,25 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 5, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 0,25 M.

Ejemplo 1.19: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 5 y una concentración de NaCl de 0,5 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 5, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 0,5 M.

Ejemplo 1.20: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 5 y una concentración de NaCl de 0,85 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 5, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 0,85 M.

Ejemplo 1.21: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 5 y una concentración de NaCl de 1,0 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 5, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 1,0 M.

Ejemplo 1.22: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 5 y una concentración de NaCl de 1,7 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 5, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 1,7 M.

Ejemplo 1.23: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 5 y una concentración de NaCl de 3,0 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 5, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 3,0 M.

Ejemplo 1.24: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 6 y una concentración de NaCl de 0,05 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 6, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 0,05 M

Ejemplo 1.25: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 6 y una concentración de NaCl de 0,25 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 6, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 0,25 M.

Ejemplo 1.26: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 6 y una concentración de NaCl de 0,5 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 6, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 0,5 M.

Ejemplo 1.27: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 6 y una concentración de NaCl de 1,7 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 6, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 1,7 M.

Ejemplo 1.28: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 6 y una concentración de NaCl de 3,0 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 6, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 3,0 M.

Ejemplo 1.29: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 7 y una concentración de NaCl de 0,05 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 7, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 0,05 M.

Ejemplo 1.30: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 7 y una concentración de NaCl de 0,1 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 7, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 0,1 M.

Ejemplo 1.31: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 7 y una concentración de NaCl de 0,25 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 7, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 0,25 M.

Ejemplo 1.32: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 7 y una concentración de NaCl de 0,5 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 7, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 0,5 M.

Ejemplo 1.33: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 7 y una concentración de NaCl de 0,85 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 7, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 0,85 M.

Ejemplo 1.34: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 7 y una concentración de NaCl de 1,0 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 7, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 1,0 M.

Ejemplo 1.35: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 7 y una concentración de NaCl de 1,7 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 7, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 1,7 M.

Ejemplo 1.36: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 7 y una concentración de NaCl de 2,6 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 7, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 2,6 M.

Ejemplo 1.37: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 7 y una concentración de NaCl de 3,0 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 7, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 3,0 M.

Ejemplo 1.38: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 7 y una concentración de NaCl de 3,4 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 7, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 3,4 M.

Ejemplo 1.39: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 5 y una concentración de Na₂HPO₄de 0,05 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 5, véase la Tabla 1, a una concentración de Na₂HPO₄de 0,05 M.

Ejemplo 1.40: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 5 y una concentración de Na₂HPO₄de 0,25 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 5, véase la Tabla 1, a una concentración de Na₂HPO₄de 0,25 M.

Ejemplo 1.41: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 5 y una concentración de Na₂HPO₄de 0,85 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 5, véase la Tabla 1, a una concentración de Na₂HPO₄de 0,85 M.

Ejemplo 1.42: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 5 y una concentración de Na₂HPO₄de 1,7 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 5, véase la Tabla 1, a una concentración de Na₂HPO₄de 1,7 M.

Ejemplo 1.43: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 5 y una concentración de Na2SO₄de 0,05 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 5, véase la Tabla 1, a una concentración de Na2SO₄de 0,05 M.

Ejemplo 1.44: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 5 y una concentración de Na2SO₄de 0,25 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 5, véase la Tabla 1, a una concentración de Na2SO₄de 0,25 M.

Ejemplo 1.45: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 5 y una concentración de Na2SO₄de 0,85 M.

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 5, véase la Tabla 1, a una concentración de Na2SO₄de 0,85 M.

Ejemplo 1.46: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 7 y una concentración de Na₂HPO₄de 0,85 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 7, véase la Tabla 1, a una concentración de Na₂HPO₄de 0,85 M.

Ejemplo 1.47: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 7 y una concentración de Na₂SÜ4 de 0,85 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 7, véase la Tabla 1, a una concentración de Na2SÜ4 de 0,85 M.

Ejemplo 1.48: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PUR utilizando sulfato de dextrano 7 y una concentración de NaCl de 0,05 M

Se recubrieron tubos de PUR (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 7, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 0,05 M.

Ejemplo 1.49: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PUR utilizando sulfato de dextrano 7 y una concentración de NaCl de 0,25 M

Se recubrieron tubos de PUR (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 7, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 0,25 M.

Ejemplo 1.50: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PUR utilizando sulfato de dextrano 7 y una concentración de NaCl de 1,7 M

Se recubrieron tubos de PUR (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 7, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 1,7 M.

Ejemplo 1.51: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PUR utilizando sulfato de dextrano 7 y una concentración de NaCl de 3,0 M

Se recubrieron tubos de PUR (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 7, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 3,0 M.

Ejemplo 1.52: Preparación de recubrimiento sobre muestra de acero para ensayos utilizando sulfato de dextrano 7 y una concentración de NaCl de 0,05 M

Se revistió una muestra de acero para ensayos (15,0 mm x 3,35 mm) según el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 7, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 0,05 M.

Ejemplo 1.53: Preparación de recubrimiento sobre muestra de acero para ensayos utilizando sulfato de dextrano 7 y una concentración de NaCl de 0,25 M

Se revistió una muestra de acero para ensayos (15,0 mm x 3,35 mm) según el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 7, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 0,25 M.

Ejemplo 1.54: Preparación de recubrimiento sobre muestra de acero para ensayos utilizando sulfato de dextrano 7 y una concentración de NaCl de 1,7 M

Se revistió una muestra de acero para ensayos (15,0 mm x 3,35 mm) según el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 7, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 1,7 M.

Ejemplo 1.55: Preparación de recubrimiento sobre muestra de acero para ensayos utilizando sulfato de dextrano 7 y una concentración de NaCl de 3,0 M

Se revistió una muestra de acero para ensayos (15,0 mm x 3,35 mm) según el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 7, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 3,0 M.

Ejemplo 1.56: Preparación de recubrimiento sobre tubo de PVC usando sulfato de dextrano 2 y una concentración de NaCl de 1,7 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente. Se aplicó sulfato de dextrano 2, véase la Tabla 1, a una concentración de NaCl de 1,7 M.

Ejemplo 2a: Actividad de heparina normalizada de tubos de PVC recubiertos utilizando diferentes sulfatos de dextrano a concentraciones variables de NaCl

Se midió la actividad de heparina del tubo de PVC recubierto según los Ejemplos 1.11-1.19, 1.21-1.32, 1.34-1.38 (correspondientes a los sulfatos de dextrano 4, 5, 6 y 7) a concentraciones variables de NaCl como se establece en el Método de evaluación B (ensayo de actividad de heparina).

Todos los objetos sólidos recubiertos probados exhibieron una actividad de heparina de al menos 1 pmol/cm2 cuando se determina mediante el Método de evaluación B. Los valores de actividad de heparina que se muestran en la Tabla 2 a continuación se normalizan al valor de actividad de heparina más alto observado para tubos de PVC recubiertos con sulfato de dextrano 5 a NaCl 1,7 M (Ejemplo 1.22).

Tabla 2 - Actividad de heparina normalizada (%) de tubos de PVC recubiertos con sulfatos de dextrano 4, 5, 6 y 7 a concentraciones variables de NaCl

Los valores de actividad de heparina normalizados para tubos de PVC recubiertos con sulfatos de dextrano 4, 5, 6 y 7 a NaCl 0,25 M y 1,7 M se muestran en la Figura 2. En la Figura 2 puede apreciarse que, aunque ambas concentraciones de sal condujeron a recubrimientos con propiedades tromboresistentes aceptables, el uso de la concentración de sal más alta (1,7 M) en la etapa de añadir la capa de sulfato de dextrano condujo a una actividad de heparina más alta que el uso de la concentración de sal más baja (0,25 M). En la Tabla 2 puede apreciarse que el uso de concentraciones de sal de menos de 0,25 M dio como resultado actividades de heparina más bajas. Las actividades de heparina más altas se obtuvieron utilizando los sulfatos de dextrano con una densidad de carga superior a 6 peq/g (sulfatos de dextrano 4, 5, 7).

Ejemplo 2b: Actividad de heparina normalizada de tubos de PVC recubiertos utilizando sulfato de dextrano 5, con diferentes sales a varias concentraciones

La actividad de heparina de tubos de PVC recubiertos según los ejemplos 1.17, 1.18, 1.20, 1.22 y 1.39-1.45 (correspondiente al sulfato de dextrano 5) usando NaCl, Na₂HPÜ4 o Na2SÜ4, a varias concentraciones se midió como se establece en el Método de evaluación B (ensayo de actividad de heparina).

Todos los objetos sólidos recubiertos probados exhibieron una actividad de heparina de al menos 1 pmol/cm2. Los valores de actividad de heparina que se muestran en la Tabla 3 a continuación están normalizados a la actividad de heparina más alta observada para tubos de PVC recubiertos con sulfato de dextrano 5 a NaCl 1,70 M (Ejemplo 1.22)

Tabla 3 - Actividad de heparina normalizada (%) de tubos de PVC recubiertos (sulfato de dextrano 5) usando diferentes sales a varias concentraciones

Los valores de actividad de heparina normalizados de la Tabla 3 se muestran en la Figura 3. En la Figura 3 se puede apreciar que el efecto beneficioso sobre la actividad de heparina de usar una concentración de sal más alta en la etapa de añadir la capa de sulfato de dextrano se muestra mediante una gama de sales. Los valores más altos de actividad de heparina se obtuvieron utilizando cloruro de sodio.

Ejemplo 2c: Actividad de heparina normalizada de tubos de PVC recubiertos utilizando sulfatos de dextrano 5 y 7, con diferentes sales a una concentración de 0,85 M

Actividad de heparina del tubo de PVC recubierto según los Ejemplos 1.20, 1.33, 1.41 y 1.45-1.47 (correspondiente al sulfato de dextrano 5 y 7 usando NaCl, Na₂HPO₄o Na2SO₄a 0,85 M se midió como se establece en el Método de evaluación B (ensayo de actividad de heparina).

Todos los objetos sólidos recubiertos probados exhibieron una actividad de heparina de al menos 1 pmol/cm2. Los valores de actividad de heparina que se muestran en la Tabla 4 a continuación se normalizan al valor de actividad de heparina más alto observado para el Ejemplo 1.22.

Tabla 4 - Actividad de heparina normalizada (%) de tubos de PVC recubiertos (sulfato de dextrano 5 y 7) utilizando diferentes sales a una concentración de 0,85 M

Se puede apreciar que el uso de diversas sales, por ejemplo, NaCl, Na₂HPO₄y Na2SO4, no afecta significativamente los valores de actividad de la heparina. La concentración de sal afectará la actividad de la heparina independientemente de la sal utilizada.

Ejemplo 2d: Actividad de heparina normalizada de varios objetos sólidos recubiertos utilizando sulfato de dextrano 7, con NaCl a varias concentraciones

Se midió la actividad de heparina de diversos objetos sólidos recubiertos según los Ejemplos 1.29, 1.31, 1.35, 1.37 y 1.48-1.55 (correspondientes al sulfato de dextrano 7) utilizando NaCl a varias concentraciones como se establece en el Método de evaluación B (ensayo de actividad de heparina).

Todos los objetos sólidos recubiertos probados exhibieron una actividad de heparina de al menos 1 pmol/cm2. Los valores de actividad de heparina que se muestran en la Tabla 5 a continuación se normalizan al valor de actividad de heparina más alto observado para el Ejemplo 1.22.

Tabla 5 - Actividad de heparina normalizada (%) de diversos objetos sólidos recubiertos (sulfato de dextrano 7) con NaCl a varias concentraciones

Es evidente a partir de la Tabla 5 que la concentración de sal afectará a la actividad de la heparina independientemente del material del objeto sólido que se haya recubierto. Se recubrieron tubos realizados en poliuretano (PUR) y muestras de acero para ensayo con sulfato de dextrano 7 a varias concentraciones de sal y los valores de actividad de heparina normalizados resultantes muestran que existe una clara dependencia de la sal.

Ejemplo 2e: Actividad de heparina normalizada de tubos de PVC recubiertos con fragmentos de heparina (octasacáridos) utilizando sulfato de dextrano 5 y una concentración de NaCl de 1,7 M

Se recubrieron tubos de PVC (D.I. 3 mm) con fragmentos de heparina (un octasacárido) de acuerdo con el procedimiento general descrito anteriormente con sulfato de dextrano 5, véase la Tabla 1, aplicado a una concentración de NaCl de 1,7 M.

Fracciones de fragmentos de heparina preparadas por despolimerización de heparina seguida de fraccionamiento

Los oligosacáridos, predominantemente del tamaño de ocho unidades de azúcar (octa), se prepararon mediante escisión parcial con ácido nitroso de heparina nativa seguida de fraccionamiento mediante cromatografía en gel. Un octasacárido producido por escisión nitrosa es el fragmento más corto que puede contener una secuencia activa funcional (Thunberg L. et al, FEBS Letters 117 (1980), 203-206).

Despolimerización de heparina: Se disolvieron 10 g de heparina sódica en 36 ml de agua agitando durante la noche. Se añadieron 0,30 g de NaNO₂a la solución de heparina y se dejó disolver. La solución se acidificó a pH 2,5 mediante la adición de HCl 4M. Después de un tiempo de reacción total de 2 horas a temperatura ambiente, la solución se neutralizó mediante la adición de NaOH 4M.

La mezcla de degradación se separó en función del tamaño molecular mediante cromatografía de exclusión molecular (GPC), donde se aplicaron porciones de 3 ml a la columna (HiLoad 26/600 Superdex 30 μg, fase móvil NaCl 0,15 M) a un caudal de 2,5 ml/min. Las fracciones recogidas (3 ml) se analizaron en busca de aldehído mediante la reacción MBTH, esencialmente como se describe en Smith RL y Gilkerson E (1979), Anal Biochem 98, 478-480. Se recogió un pico ancho centrado en la posición de elución del octasacárido. Las fracciones de elución de oligosacáridos combinadas de varios procesos preparativos se concentraron por evaporación hasta un volumen de 18 ml y se volvieron a cromatografiar en la misma columna. Para todos los ciclos de recromatografía, se recogieron y agruparon tres fracciones, que representaban fragmentos deca-, octa- y hexasacáridos.

Las fracciones recogidas se analizaron mediante el Método de evaluación P. La fracción ''hexa'' consta de un pico principal que representa el hexasacárido y un hombro que representa el octasacárido. La fracción "octa" consta de un pico principal que representa el octasacárido con un hombro que representa el hexasacárido y un hombro menor que representa el decasacárido. La fracción "deca" consta de un pico principal que representa decasacárido con un hombro que representa octasacárido y un hombro menor que representa dodecasacárido.

La concentración de las fracciones de fragmentos de heparina se determinó mediante el Método de evaluación Q (ver la tabla a continuación).

Inmovilización de octasacáridos

El tubo de PVC se recubrió con dieciséis ml de la fracción "octa" diluida con 84 ml de NaCl 0,05 M, la fracción octa se inmovilizó luego en la capa más externa de poliamina mediante aminación reductora, esencialmente como se describe en Larm et al. en los documentos EP0086186A1 y EP0495820B1.

Evaluación mediante tinción con toluidina de tubos de PVC recubiertos con fragmentos de heparina

La superficie recubierta de oligosacárido se sometió a una prueba de tinción con azul de toluidina como se establece en el Método de evaluación C. Se observó un color azul/violeta intenso en la superficie luminal del tubo que indica una extensa unión covalente de los fragmentos de heparina. La tinción homogénea obtenida para los tubos probados indica la formación de un recubrimiento uniforme.

Evaluación de la densidad de heparina de tubos de PVC recubiertos con fragmentos de heparina

La densidad de heparina de la superficie se determinó mediante el Método de evaluación A y los resultados se muestran en la siguiente tabla.

Evaluación de la actividad de heparina de tubos de PVC recubiertos con fragmentos de heparina

La actividad de heparina de la superficie recubierta de octasacárido (Ejemplo 2e) se determinó mediante el Método de evaluación B. Los valores de actividad de heparina que se muestran en la siguiente tabla están normalizados a la actividad de heparina más alta observada para tubos de PVC recubiertos con sulfato de dextrano 5 a NaCl 1,70 M (Ejemplo 1.22).

Aunque el valor de densidad de heparina del recubrimiento de octasacárido (Ejemplo 2e) y el recubrimiento de heparina (Ejemplo 1.22) fueron similares, la capacidad de unión de AT (actividad de heparina; 'HA') de los recubrimientos de octasacárido fue baja en comparación con el recubrimiento de heparina. Sin embargo, esto es de esperar considerando la actividad anti-FXa relativamente baja exhibida por la fracción de octasacárido en solución (datos no mostrados). Por tanto, los fragmentos de octasacáridos parecen retener sustancialmente su capacidad de unión a AT después de la inmovilización.

Ejemplo 3a: Concentración de heparina de tubos de PVC recubiertos utilizando diferentes sulfatos de dextrano a varias concentraciones de NaCl

Se midió la concentración de heparina de objetos sólidos (tubos de PVC) recubiertos según los Ejemplos 1.4-1.19, 1.21 -1.32 y 1.34-1.38 (correspondientes a los sulfatos de dextrano 3, 4, 5, 6 y 7) a concentraciones variables de NaCl como se establece en el Método de evaluación A.

Todos los objetos sólidos recubiertos probados exhibieron una concentración de heparina de al menos 1 μg/cm2. Los valores de concentración de heparina se muestran en la Tabla 6 a continuación.

Tabla 6 - Concentración de heparina (ug/cm2) de tubos de PVC recubiertos con sulfatos de dextrano 3, 4, 5, 6 y 7 a varias concentraciones de NaCl

La concentración de heparina para tubos de PVC recubiertos con sulfatos de dextrano 3, 4, 5, 6 y 7 en NaCl 1,7 M se muestra en la Figura 4. En la Figura 4 se puede apreciar que hay una tendencia a una mayor concentración de heparina al usar un sulfato de dextrano de mayor peso molecular en la etapa de añadir la capa de sulfato de dextrano en estas condiciones. El sulfato de dextrano 3 es un sulfato de dextrano de referencia en este ejemplo.

La concentración de heparina para tubos de PVC recubiertos con sulfatos de dextrano 3, 4, 5, 6 y 7 a varias concentraciones de NaCl se muestra en la Figura 5. En la Figura 5 se puede apreciar que los sulfatos de dextrano 4, 5, 6 y 7 muestran una tendencia a una mayor concentración de heparina con una mayor concentración de sal (al menos hasta 1,7 M) en la etapa de añadir la capa de sulfato de dextrano. Puede apreciarse que el uso de concentraciones de sal de menos de 0,25 M generalmente da como resultado actividades de heparina más bajas. El sulfato de dextrano 3 no sigue esta tendencia y cuando se usa, la concentración de heparina disminuye a medida que aumenta la concentración de sal en esta etapa. El sulfato de dextrano 3 es un sulfato de dextrano de referencia en este ejemplo. Sin quedar limitado por la teoría, los autores de la invención atribuyen esta diferencia de tendencia al hecho de que el sulfato de dextrano 3 tiene una densidad de carga mucho más baja que los sulfatos de dextrano 4, 5, 6 y 7.

Ejemplo 3b: Concentración de heparina de un tubo de PVC recubierto usando sulfato de dextrano 5, con diferentes sales a varias concentraciones

La concentración de heparina del tubo de PVC recubierto según los Ejemplos 1.17, 1.18, 1.20, 1.22 y 1.39-1.45 (correspondiente al sulfato de dextrano 5 usando NaCl, Na₂HPO4 o na2SO4, a concentraciones variables se midió como se establece en el Método de evaluación A.

Todos los objetos sólidos recubiertos probados exhibieron una concentración de heparina de al menos 1 ug/cm2. Los valores de concentración de heparina se muestran en la Tabla 7 a continuación.

Tabla 7 - Concentración de heparina (ug/cm2) de tubos de PVC recubiertos (sulfato de dextrano 5) usando diferentes sales a varias concentraciones

Los valores de concentración de heparina de la Tabla 7 se muestran en la Figura 6. Puede apreciarse en la Figura 6 que el sulfato de dextrano 5 muestra una tendencia a aumentar la concentración de heparina con el aumento de la concentración de sal en la etapa de añadir la capa de sulfato de dextrano, para una gama de sales diferentes. Ejemplo 3c: Concentración de heparina de tubos de PVC recubiertos utilizando sulfatos de dextrano 5 y 7, con diferentes sales a una concentración de 0,85 M

La concentración de heparina del tubo de PVC recubierto según los Ejemplos 1.20, 1.33, 1.41, 1.45, 1.46 y 1.47 (correspondiente al sulfato de dextrano 5 y 7 usando NaCl, Na₂HPO₄o N₂SO₄a 0,85 M se midió como se establece en el Método de evaluación A.

Todos los objetos sólidos recubiertos probados exhibieron una concentración de heparina de al menos 1 ug/cm2. Los valores de concentración de heparina se muestran en la Tabla 8 a continuación.

Tabla 8 - Concentración de heparina (ug/cm2) de tubos de PVC recubiertos (sulfatos de dextrano 5 y 7) utilizando diferentes sales a una concentración de 0,85 M

Puede apreciarse que el uso de diversas sales, por ejemplo, NaCl, Na₂HPO₄y Na₂SO₄, no afecta significativamente los valores de concentración de heparina.

Ejemplo 3d: Concentración de heparina de varios objetos sólidos recubiertos utilizando sulfato de dextrano 7, con NaCl a varias concentraciones

La concentración de heparina de varios objetos sólidos según los Ejemplos 1.29, 1.31, 1.35, 1.37 y 1.48-1.55. (correspondiente al sulfato de dextrano 7 (12)) recubierto con NaCl a varias concentraciones se midió como se establece en el Método de evaluación A.

Todos los objetos sólidos recubiertos probados exhibieron una concentración de heparina de al menos 1 ug/cm2. Los valores de concentración de heparina se muestran en la Tabla 9 a continuación.

Tabla 9 - Concentración de heparina (ug/cm2) de varios objetos sólidos recubiertos (sulfato de dextrano 7 con NaCl a varias concentraciones

A partir de la Tabla 9 resulta evidente que la concentración de sal afectará a la concentración de heparina independientemente del material del objeto sólido que se haya recubierto. Se recubrieron tubos realizados en poliuretano (PUR) y muestras de acero para ensayo con sulfato de dextrano 7 a varias concentraciones de sal y los valores de concentración de heparina resultantes muestran que existe una clara dependencia de la sal.

Ejemplo 4a: Medición del potencial zeta de tubos de PVC recubiertos utilizando diferentes sulfatos de dextrano a una concentración de NaCl de 1,7 M y 0,25 M

La carga superficial del tubo de PVC recubierto según los ejemplos 1.1, 1.2, 1.3, 1.6, 1.8, 1.13, 1.15, 1.18, 1.22, 1.25, 1.27, 1.31, 1.35 y 1.56 (correspondiente a los sulfatos de dextrano 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7) a varias concentraciones de NaCl) se midió como se establece en el Método de evaluación D.

Los valores de potencial zeta para tubo de PVC recubierto con sulfatos de dextrano 1 a 7 en NaCl 1,7 M se muestran en la Tabla 10.

Tabla 10 - Potencial zeta para tubo recubiertos de PVC con sulfatos de dextrano 1 a 7 a NaCl 1,7 M

Todos los sulfatos de dextrano 1 a 7 tienen un IEP por debajo de pH 3. Sin embargo, los sulfatos de dextrano de menor peso molecular (Ejemplo de referencia sulfatos de dextrano 1-3) no cumplen con todas las características preferidas (es decir, la posible huella digital para objetos sólidos recubiertos según el proceso de la invención, descrito anteriormente). Los sulfatos de dextrano 1 y 2 tienen un mínimo global que se produce a un pH superior a 5 y el sulfato de dextrano 3 tiene un valor delta inferior a 20 mV. Los objetos sólidos de la invención recubiertos con sulfatos de dextrano 4 a 7 cumplen estos criterios.

El potencial zeta para tubo de PVC recubierto con sulfatos de dextrano 3, 4 y 5 en NaCl 1,7 M (correspondiente a los Ejemplos 1.8, 1.15 y 1.22) se muestra en la Figura 7.

El potencial zeta para tubo de PVC recubierto con sulfatos de dextrano 3, 6 y 7 en NaCl 1,7 M (correspondiente a los ejemplos 1.8, 1.27 y 1.35) se muestra en la Figura 8.

Los valores de potencial zeta para tubo de PVC recubierto con sulfatos de dextrano 1 a 7 en NaCl 0,25 M se muestran en la Tabla 11.

Tabla 11 - El potencial zeta para tubo de PVC recubierto con sulfatos de dextrano 1 a 7 a NaCl 0,25 M

Todos los sulfatos de dextrano 1 a 7 tienen un IEP por debajo de pH 3. Sin embargo, los sulfatos de dextrano de menor peso molecular (Ejemplo de referencia sulfatos de dextrano 1-3) no cumplen con todas las características preferidas (es decir, la posible huella digital para objetos sólidos recubiertos según el proceso de la invención, descrito anteriormente). El sulfato de dextrano 2 tiene un mínimo global que se produce a un pH superior a 5 y los sulfatos de dextrano 1 y 3 tienen un valor delta inferior a 20 mV. Los objetos sólidos de la invención recubiertos con sulfatos de dextrano 4 a 7 cumplen estos criterios.

El potencial zeta para tubo de PVC recubierto con sulfatos de dextrano 3, 4 y 5 en NaCl 0,25 M (correspondiente a los ejemplos 1.6, 1.13 y 1.18) se muestra en la figura 9.

El potencial zeta para tubo de PVC recubierto con sulfatos de dextrano 3, 6 y 7 en NaCl 0,25 M (correspondiente a los ejemplos 1.6, 1.25 y 1.31) se muestra en la figura 10.

Ejemplo 4b: Medición del potencial zeta de tubos de PVC recubiertos usando sulfato de dextrano 5 con diferentes sales a varias concentraciones

La carga superficial del tubo de PVC recubierto según los Ejemplos 1.18, 1.22, 1.39-1.42 y 1.44-1.45 (todo sulfato de dextrano 5) usando NaCl, Na₂HPO₄o Na2SO4, a concentraciones variables se midió como se establece en el Método de evaluación D.

Los valores de potencial zeta para tubo de PVC recubierto con sulfato de dextrano 5 a diferentes concentraciones de NaCl se muestran en la Tabla 12.

Tabla 12 - Potencial zeta para tubo de PVC recubierto con sulfato de dextrano 5 a diferentes concentraciones de

NaCl

Los perfiles de potencial zeta para tubo de PVC recubierto con sulfato de dextrano 5 a concentraciones de NaCl de 0,25 M y 1,7 M (correspondientes a los Ejemplos 1.18 y 1.22) se muestran en la Figura 11, donde es evidente el efecto de la sal sobre el potencial zeta. Las características preferidas (es decir, la posible huella para objetos sólidos recubiertos según el proceso de la invención, descrito anteriormente) se cumplen a una concentración de NaCl de 0,25 y 1,7 M.

Los valores de potencial zeta para tubo de PVC recubierto con sulfato de dextrano 5 a diferentes valores de Na₂HPÜ4 las concentraciones se muestran en la Tabla 13.

Tabla 13 - Potencial zeta para tubo de PVC recubierto con sulfato de dextrano 5 a diferentes concentraciones de

Na?HPO₄

Los perfiles de potencial zeta para tubo de PVC recubierto con sulfato de dextrano 5 en concentraciones de Na?HPO₄de 0,25 M, 0,85 M y 1,7 M (correspondientes a los Ejemplos 1.40, 1.41 y 1.42) se muestran en la Figura 12, donde se puede apreciar que todas las características preferidas (es decir, la potencial huella para objetos sólidos recubiertos según el proceso de la invención, descrito anteriormente) se cumplen utilizando Na₂HPO₄a diferentes concentraciones.

Los valores de potencial zeta para tubo de PVC recubierto con sulfato de dextrano 5 a diferentes valores de concentraciones Na2SO4 se muestran en la Tabla 14.

Tabla 14 - Potencial zeta para tubo de PVC recubierto con sulfato de dextrano 5 a diferentes concentraciones de

Na2SO4

Los perfiles de potencial zeta para tubo de PVC recubierto con sulfato de dextrano 5 en concentraciones de Na2SO₄de 0,25 M y 0,85 M (correspondientes a los Ejemplos 1.44 y 1.45) se muestran en la Figura 13, donde se puede apreciar que todas las características preferidas (es decir, la posible huella para objetos sólidos recubiertos según el proceso de la invención, descrito anteriormente) se cumplen usando concentraciones de Na2SO4 a diferentes concentraciones. Es evidente a partir de las Tablas 12, 13 y 14 que el uso de diferentes tipos de sal a diferentes concentraciones no afectará significativamente al perfil de potencial zeta. También está claro que existe una dependencia de la sal para los diferentes tipos de sal.

Ejemplo 5: Activación por contacto con la sangre (pérdida de plaquetas y F1+2) de tubos de PVC recubiertos utilizando diferentes sulfatos de dextrano a varias concentraciones de NaCl

Se midió el porcentaje de plaquetas preservadas y el F1+2 (fragmento de protrombina) después de la exposición a la sangre del tubo de PVC recubierto según los Ejemplos 1.1, 1.3, 1.13, 1.18, 1.25 y 1.31 (correspondientes a los sulfatos de dextrano 1, 2, 4, 5, 6 y 7) a varias concentraciones de NaCl como se establece en los Métodos de Evaluación E y F, respectivamente.

Los resultados se muestran en la Tabla 15 y las Figuras 14 y 15 (concentración de NaCl 0,25 M) y en la Tabla 16 y las Figuras 16 y 17 (concentración de NaCl 1,7 M).

Como se aprecia en las Tablas y Figuras, no se observó pérdida significativa de plaquetas (pérdida de plaquetas indicadora de trombosis) para objetos sólidos recubiertos según el proceso de la invención con sulfatos de dextrano 4, 5, 6 y 7 a concentraciones de NaCl 0,25 M y 1,7 M. Las propiedades tromboresistentes de los recubrimientos se confirmaron además por los bajos valores de F1+2 (fragmento de protrombina) observados para los mismos sulfatos de dextrano. El tubo recubierto con sulfato de dextrano comparativo 1 con peso molecular de 50 kDa y con sulfato de dextrano comparativo 2 con peso molecular de 100 kDa también mostró trombosis significativa y alta generación de fragmentos de protrombina en comparación con objetos sólidos de la invención recubiertos con sulfatos de dextrano 4-7.

El tubo de PVC sin recubrimiento y el ejemplo de coagulación muestran una trombosis significativa en este experimento.

Tabla 15 - Plaquetas conservadas (%) y F1+2 (pmol/l) de tubos de PVC recubiertos con sulfatos de dextrano 1,2, 4,

5, 6 y 7 a una concentración de NaCl 0,25 M

Tabla 16 - Plaquetas conservadas (%) y F1+2 (pmol/l) de tubos de PVC recubiertos con sulfatos de dextrano 1, 4, 5,

6 y 7 a una concentración de NaCl 1,7 M

Ejemplo 6: Tinción con azul de toluidina de tubos recubiertos de PVC y PUR y muestras de acero para ensayo usando diferentes sulfatos de dextrano a varias concentraciones de sal

Se sometieron tubos de PVC y PUR y muestras de acero para ensayo recubiertas de acuerdo con los Ejemplos 1.1 1.55 a una prueba de tinción con azul de toluidina como se establece en el Método de evaluación C.

Se observó un color azul/violeta en la superficie luminal del tubo y en las muestras de acero para ensayo, lo que indica la unión covalente de la heparina funcionalizada en un extremo. La tinción homogénea obtenida para los objetos sólidos recubiertos probados según el proceso de la invención indica la formación de un recubrimiento uniforme (en particular, una distribución uniforme de heparina) que puede obtenerse usando diferentes sulfatos de dextrano a diferentes concentraciones de sal, en diferentes objetos sólidos.

Ejemplo 7: Activación por contacto con la sangre (pérdida de plaquetas y F1+2) de tubos de PVC recubiertos: prueba después de exposición a temperatura y humedad

Se expusieron tubos de PVC recubiertos según los Ejemplos 1.13, 1.15, 1.22 y 1.35 (correspondientes a los sulfatos de dextrano 4, 5 y 7) a varias concentraciones de NaCl a una mayor temperatura y humedad relativa (40 °C, 50 % de HR, 1 semana, según el Método de evaluación K) antes de la evaluación según los Métodos de evaluación E (plaquetas conservadas) y F (F1+2). Los resultados se muestran en la Tabla 17 y las Figuras 18 y 19, y en la Tabla 18 y las Figuras 20 y 21.

Como se aprecia en las Tablas y Figuras, para objetos sólidos recubiertos de acuerdo con el proceso de la invención usando sulfatos de dextrano 4, 5 y 7, no hay cambios significativos en los valores de F1+2 y plaquetas conservadas después de la exposición a temperatura y humedad aumentadas. Se obtuvieron resultados similares para objetos sólidos recubiertos según el proceso de la invención utilizando sulfatos de dextrano 4, 5 y 7 preparados a una concentración de NaCl 0,25 M y 1,7 M.

Estos resultados demuestran que las propiedades tromboresistentes de los objetos sólidos recubiertos preparados según el proceso de la invención se conservan a pesar de la exposición a condiciones rigurosas como temperatura y humedad elevadas.

Tabla 17 - Plaquetas conservadas (%) y F1+2 (pmol/l) de tubos de PVC recubiertos con sulfato de dextrano 4 a una concentración de NaCl de 0,25 M - antes y después de la exposición a temperatura y humedad elevadas

Tabla 18 - Plaquetas conservadas (%) y F1+2 (pmol/l) de tubos de PVC recubiertos con sulfatos de dextrano 4, 5 y 7 a una concentración de NaCl de 1,7 M - antes y después de la exposición a temperatura y humedad elevadas

A lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, la palabra 'comprende', y variaciones como 'comprende' y 'que comprende', se entenderá que implica la inclusión de un número entero, etapa, grupo de números enteros o grupo de etapas indicado, pero no con exclusión de cualquier otro número entero, etapa, grupo de números enteros o grupo de etapas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un proceso para la fabricación de un objeto sólido que tiene una superficie que comprende un recubrimiento estratificado de polímero catiónico y aniónico donde la capa de recubrimiento exterior comprende una entidad anticoagulante, que comprende las etapas de:

i) tratar una superficie del objeto sólido con un polímero catiónico;

ii) tratar la superficie con un polímero aniónico;

iii) opcionalmente repetir las etapas i) y ii) una o más veces;

iv) tratar la superficie con un polímero catiónico; y

en donde,

el polímero aniónico es sulfato de dextrano;

la entidad anticoagulante es un resto de heparina;

y en donde,

la etapa ii) se lleva a cabo a una concentración de sal de 0,25 M-5,0 M.

2. Un proceso para la fabricación de un objeto sólido de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polímero aniónico está caracterizado por tener un peso molecular total de 750 kDa-10000 kDa, tal como 1000 kDa-10000 kDa.

3. Un proceso para la fabricación de un objeto sólido de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la etapa ii) se lleva a cabo a una concentración de sal de 0,25 M-4,0 M.

4. Un proceso para la fabricación de un objeto sólido de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la etapa ii) se lleva a cabo a una concentración de sal de 0,25 M-3,0 M.

5. Un proceso para la fabricación de un objeto sólido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la sal se selecciona del grupo que consiste en cloruro de sodio, sulfato de sodio, hidrógeno fosfato de sodio y fosfato de sodio.

6. Un proceso para la fabricación de un objeto sólido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el polímero catiónico de la etapa i) es una poliamina, que está opcionalmente reticulada.

7. Un proceso para la fabricación de un objeto sólido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende adicionalmente una etapa de pretratamiento antes de la etapa i).

8. Un proceso para la fabricación de un objeto sólido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el resto de heparina es un resto de heparina unido en un extremo.

9. Un proceso para la fabricación de un objeto sólido de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el resto de heparina unido en un extremo está conectado a través de su extremo reductor.

10. Un proceso para la fabricación de un objeto sólido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el objeto sólido tiene una actividad de entidad anticoagulante de al menos 1 pmol/cm2 de superficie, por ejemplo, al menos 2 pmol/cm2 de superficie, al menos 3 pmol/cm2 de superficie, al menos 4 pmol/cm2 de superficie, o al menos 5 pmol/cm2 de superficie para la unión de ATIII.

11. Un proceso para la fabricación de un objeto sólido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el contenido de azufre del polímero aniónico está entre el 15 % y el 20 % en peso del polímero aniónico.

12. Un objeto sólido que tiene una superficie que comprende un recubrimiento estratificado de polímero catiónico y aniónico, en donde la capa de recubrimiento exterior es una capa que comprende un polímero catiónico al que se une covalentemente una entidad anticoagulante;

y en donde el polímero aniónico está caracterizado por tener (a) un peso molecular total de 650 kDa-10000 kDa; y (b) un contenido de azufre entre 10 % y 25 % en peso del polímero aniónico;

en donde el polímero aniónico es sulfato de dextrano;

en donde la entidad anticoagulante es un resto de heparina y

en donde el polímero aniónico se aplica a la superficie a una concentración de sal de 0,25 M-5,0 M.

13. Un objeto sólido según la reivindicación 12, en donde el polímero aniónico se aplica a la superficie a una concentración de sal de 0,25 M-4,0 M o 0,25 M-3,0 M.

14. Un objeto sólido según la reivindicación 12 o la reivindicación 13, en donde el polímero aniónico está caracterizado por tener un peso molecular total de 650 kDa-1 000 kDa.

15. Un objeto sólido según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en donde el contenido de azufre del polímero aniónico está entre el 15 % y el 20 % en peso del polímero aniónico.

16. Un proceso para la fabricación de un objeto sólido que tiene una superficie que comprende un recubrimiento estratificado de polímero catiónico y aniónico en donde la capa de recubrimiento exterior es una capa que comprende un polímero catiónico, que comprende las etapas de:

i) tratar una superficie del objeto sólido con un polímero catiónico;

ii) tratar la superficie con un polímero aniónico;

iii) opcionalmente repetir las etapas i) y ii) una o más veces; y

iv) tratar la superficie con un polímero catiónico;

en donde,

el polímero aniónico es sulfato de dextrano,

y en donde,

la etapa ii) se lleva a cabo a una concentración de sal de 0,25 M-5,0 M.