ES2884813T3

ES2884813T3 - Formulaciones de citoquina quimérica para administración ocular

Info

Publication number: ES2884813T3
Application number: ES14722435T
Authority: ES
Inventors: Gregory Zarbis-Papastoitsis; Patricia Lowden; Byeong Chang
Original assignee: Buzzard Pharmaceuticals AB
Current assignee: Buzzard Pharmaceuticals AB
Priority date: 2013-03-13
Filing date: 2014-03-13
Publication date: 2021-12-13
Anticipated expiration: 2034-03-13
Also published as: EP2968468A1; US20140308239A1; AU2014243839B2; RU2015143521A; US20180177877A1; DK2968468T3; CN107693781B; WO2014160371A1; JP2016521252A; HK1246692A1; CN107693781A; EP2968468B1; KR20150126688A; CA2903706A1; KR102236926B1; IL241171A0; BR112015022587A2; US10799589B2; AU2014243839A1; JP6450364B2

Abstract

Una formulación acuosa que comprende: citrato de sodio o fosfato de sodio en una concentración de 8 a 12 mM; sorbitol de un 4 % a un 6 % (p/v); poloxámero 188 en una concentración de un 0,08 % a un 0,12 % (p/v); y opcionalmente carboximetilcelulosa de sodio, en donde la formulación tiene un pH de 5,5 a 7,5 y en donde las formulación es eficaz para tratar un trastorno ocular, tal como un trastorno de ojo seco.

Description

DESCRIPCIÓN

Formulaciones de citoquina quimérica para administración ocular

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a composiciones y formulaciones terapéuticas, por ejemplo, para inhibidores de IL-1.

ANTECEDENTES

La interleuquina-1 alfa (IL-1a) y beta (IL-1p) son miembros de la familia de IL-1 de citoquinas inmunorreguladoras. Se han identificado al menos once miembros humanos de la familia de citoquinas interleuquina-1, nueve agonistas supuestos o demostrados (IL-1 a, IL-1 p, IL-18, IL-36a (IL-1F6), IL-36p (IL-1F8), IL-36 y (IL-1F9), IL-33, IL-1F7 e IL-1F10) y dos antagonistas naturales (IL-1 Ra e IL36Ra (IL-1 F5)).

IL-1a e IL-1p tienen funciones en la regulación del sistema inmunitario, y se han implicado en enfermedades oftálmicas inflamatorias, incluyendo trastornos oculares inflamatorios importantes. Por lo tanto, existe la necesidad de mejores métodos y materiales para la administración ocular de agentes inhibidores de IL-1.

La anakinra (Kineret®, Amgen, Thousand Oaks, CA), una molécula de IL1-Ra recombinante, está aprobada para uso en el tratamiento de artritis reumatoide y síndromes periódicos asociados a criopirina (CAPS) denominados enfermedad inflamatoria multisistémica de inicio neonatal (NOMID). Se suministra como una jeringa de vidrio de un solo uso con agujas de calibre 27 como una solución estéril, transparente, de incolora a blanca y sin conservantes para administración subcutánea diaria. Kineret® está formulado en 0,67 ml de solución con pH 6,5, que contiene 100 mg de anakinra, 1,29 mg de citrato de sodio, 5,48 mg de cloruro de sodio, 0,12 mg de EDTA disódico y 0,70 mg de polisorbato 80 en agua para inyección. Se recomienda su almacenamiento a 2-8 °C. Kineret® no está aprobado para administración ocular.

El documento de patente WO 2012/016203 describe dominios de citoquinas de origen no natural que se pueden usar para modular la señalización celular sensible al receptor I de interleuquina-1 (IL-1 RI), para tratar trastornos, y para detectar y/o unirse a receptores celulares, así como otros agentes.

El documento de patente WO 2005/097195 describe métodos para reducir la agregación de una IL-1 ra de agregación que comprende incubar IL-1 ra con al menos una molécula complementaria.

El documento de patente WO 2010/081091 describe métodos y composiciones para minimizar, prevenir o tratar el daño a los nervios corneales mediante la administración de una composición que bloquea la actividad de una citoquina IL-I y/o una citoquina IL-17 a un sujeto con tal daño o en riesgo de exposición a tal daño.

SUMARIO

En el presente documento se presentan formulaciones estables (por ejemplo, formulaciones acuosas estables) que contienen citoquinas quiméricas (por ejemplo, citoquinas quiméricas o dominios de citoquinas quiméricas tal como se describe en el documento de patente WO2012/016203 o en el documento de patente WO 2012/103240) que se pueden usar, entre otras cosas, para modular la señalización celular sensible a citoquinas de la familia de IL-1 y sus respectivos receptores, para tratar trastornos, y para detectar y/o unirse a receptores celulares, así como otros agentes. En el presente documento se describe una formulación farmacéutica que incluye de 1 mg/ml a 50 mg/ml de una proteína citoquina quimérica. En realizaciones, la formulación farmacéutica comprende de 1 mg/ml a 50 mg/ml de una proteína citoquina quimérica IL-1 p/IL-1 Ra; un tensioactivo; un agente de tonicidad; y un agente de tamponamiento.

En algunos aspectos, la proteína citoquina quimérica es P05 u otra citoquina quimérica tales como, por ejemplo, las que se describen en el documento de patente WO2012/016203 o en el documento de patente WO 2012/103240. En realizaciones, la formulación es para administración tópica. En realizaciones, la formulación es para administración ocular. En realizaciones, la formulación es para administración tópica ocular. En algunas realizaciones, la formulación tiene un pH de 5,5 a 7,5, por ejemplo un pH de 6,0 a 7,0.

En realizaciones, la formulación no contiene un agente viscoso. Ciertas realizaciones se refieren a una formulación que también contiene un agente de viscosidad. En realizaciones, el agente de viscosidad es una carboximetilcelulosa de sodio; una hidroxietilcelulosa; una hidroxipropilmetilcelulosa; un alcohol polivinílico; y/o una glicerina. En realizaciones, en la formulación se incluye carboximetilcelulosa de sodio en una concentración de un 0,1-6 % p/v.

La formulación tiene generalmente una pureza de al menos un 90 %, un 93 %, un 95 % o un 98 % después de su almacenamiento durante al menos 60 días a 25 °C. En algunos aspectos, la formulación tiene una pureza de al menos un 90 %, un 93 %, un 95 %, o un 98 % después de su almacenamiento durante al menos cuatro meses a 25 °C. En otros aspectos, la formulación tiene una pureza de al menos un 90 % después de su almacenamiento durante un periodo de al menos 2 semanas a 40 °C. En algunos casos, la formulación es estable durante al menos dos años cuando se almacena entre 2 °C y 8 °C. En algunos casos la formulación es estable durante al menos seis meses cuando se almacena a 25 °C. En algunos casos la formulación es estable durante al menos ocho meses cuando se almacena a 25 °C.

En algunas realizaciones, el tensioactivo es un tensioactivo no iónico, por ejemplo, ácido plurónico F -68 (poloxámero 188), polisorbato-20 o polisorbato-80. En realizaciones, el tensioactivo es ácido plurónico F-68 (poloxámero 188), y el tensioactivo está presente en una concentración de aproximadamente un 0,1 % p/v. En algunos casos, el tensioactivo es ácido plurónico F-68 (poloxámero 188), y el tensioactivo está presente en una concentración de un 0,1 % p/v.

El agente de tonicidad en una formulación puede ser, por ejemplo, cloruro de sodio, sorbitol, manitol, sacarosa, o trehalosa. En realizaciones, el agente de tonicidad es sorbitol, y el sorbitol está presente en una concentración de aproximadamente un 5 % p/v. En ciertas realizaciones, el agente de tonicidad es sorbitol, y el sorbitol está presente en una concentración de un 5 % p/v.

El agente de tamponamiento en la formulación es generalmente un agente de tamponamiento débil. En realizaciones, el agente de tamponamiento es un fosfato, un citrato, un acetato, un borato, y/o un succinato. El agente de tamponamiento puede ser una sal farmacéuticamente aceptable de un fosfato, un citrato, un acetato, un borato, o un succinato. En algunas realizaciones, el agente de tamponamiento está presente en una cantidad de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM. En realizaciones, el agente de tamponamiento está presente en una concentración de 20 mM o menor. En realizaciones, el agente de tamponamiento, por ejemplo, el citrato de sodio y/o fosfato de sodio, está presente en una concentración total de 5-15 mM. En algunas realizaciones, el agente de tamponamiento, por ejemplo, citrato de sodio, está presente en una concentración de 5-15 mM, 7-13 mM, 8 12 mM, o 9-11 mM

En algunos casos, el agente de tamponamiento es citrato de sodio y está presente en la formulación en una concentración de aproximadamente 10 mM. En algunos casos, el agente de tamponamiento es citrato de sodio y está presente en la formulación en una concentración de 10 mM.

En ciertas realizaciones, la formulación incluye una proteína citoquina quimérica IL-1 p/IL-1 Ra tal como P05; citrato de sodio 10 mM; sorbitol al 5 % p/v; y poloxámero 188 al 0,1 % p/v (poloxámero F-68), y el pH de la formulación es 6,0.

En algunas realizaciones, la formulación incluye además un aminoácido. Por ejemplo, el aminoácido es arginina, ácido glutámico, histidina, o metionina.

En un ejemplo, una citoquina quimérica (por ejemplo, un polipéptido de citoquina quimérica), por ejemplo, una citoquina quimérica que contiene secuencias derivadas de una Il-1p y una IL-IRa, se formula a concentraciones de 5 mg/ml a 20 mg/ml (por ejemplo, en una concentración de 1 mg/ml, 5 mg/ml, o 20 mg/ml) en citrato de sodio 10 mM, pH 6,0 que contiene sorbitol al 5 % p/v y poloxámero al 0,1 % p/v, por ejemplo, poloxámero 188 (también denominado, por ejemplo, Lutrol® F-68 (también denominado Lutrol® en el presente documento), Kolliphor® P 188, y poli(etilenglicol)-bloque-poli(etilenglicol)). En realizaciones, la citoquina quimérica se selecciona entre una o más de ^p01, P02, P03, P04, P05, P06, y P07. En realizaciones, la citoquina quimérica es P05.

En realizaciones, los componentes de una formulación que se describe en el presente documento están presentes en cantidades que pueden variar aproximadamente alrededor de los valores que se proporcionan en el presente documento hasta un 5 %, un 10 %, un 15 %, un 20 %, un 25 %, un 30 %, un 40 %, o un 50 %. En realizaciones los componentes de una formulación están presentes en cantidades que varían aproximadamente alrededor de los valores que se proporcionan en el presente documento en un 10 %. En realizaciones, la formulación comprende citrato de sodio 9,5-10,5 mM, 9-11 mM, 8,5-11,5 mM, 8-12 mM, 7,5-12,5 mM, 7-13 mM, 6-14 mM, o 5-15 mM. En realizaciones, la formulación comprende un 4,75-5,25 %, un 4,5-5,5 %, un 4,25-5,75 %, un 4-6 %, un 3,75-6,25 %, un 3,5-6,5 %, un 3-7 %, o un 2,5-7,5 % p/v de sorbitol. En realizaciones, la formulación comprende un 0,095 0,105 %, un 0,09-0,11 %, un 0,085-0,115 %, un 0,08-0,12 %, un 0,075-0,125 %, un 0,07-0,13 %, un 0,06-0,14 %, o un 0,05-0,15 % p/v de poloxámero 188. En realizaciones, la concentración de la proteína terapéutica (por ejemplo, la citoquina quimérica, por ejemplo, P05) en la formulación es 1-50 mg/ml, 1-25 mg/ml, o 1-20 mg/ml. En realizaciones, la concentración de la proteína terapéutica es 4,75-5,25 mg/ml, 4,5-5,5 mg/ml, 4,25-5,75 mg/ml, 4-6 mg/ml, 3,75 6,25 mg/ml, 3,5-6,5 mg/ml, 3-7 mg/ml, o 2,5-7,5 mg/ml. En realizaciones, el pH de la formulación es de 5,5 a 7,5, o de 5,5 a 6,5.

En realizaciones, la formulación comprende citrato de sodio 8-12 mM, sorbitol al 4-6 % p/v, poloxámero 188 al 0,08 0,12 % p/v, y 4-6 mg/ml de P05. En realizaciones, el pH de la formulación es de 5,5 a 7,5. En realizaciones, el pH es de 5,5 a 6,5. En realizaciones, el pH es de 6 a 7.

En realizaciones, la formulación comprende citrato de sodio 9-11 mM, sorbitol en un 4,5-5,5 % p/v, poloxámero 188 al 0,09-0,11 % p/v, y 4,5-5,5 mg/ml de P05. En realizaciones, el pH de la formulación es de 5,5 a 7,5. En realizaciones, el pH es de 5,5 a 6,5. En realizaciones, el pH es de 6 a 7.

En realizaciones, se formula un inhibidor de IL-1, por ejemplo, anakinra, en una concentración apropiada (por ejemplo, en una concentración de 5 mg/ml a 100, por ejemplo, de 5 a 50 mg/ml, por ejemplo, de 5 a 20 mg/ml) en citrato de sodio 10 mM, pH 6,0 que contiene sorbitol al 5 % p/v y poloxámero al 0,1 % p/v, por ejemplo, poloxámero 188. En realizaciones, las cantidades de los componentes de la formulación pueden variar alrededor de los valores que se proporcionan en el presente documento hasta un 5 %, un 10 %, un 15 %, un 20 %, un 25 %, un 30 %, un 40 %, o un 50 %. En realizaciones, el pH es de 5,5 a 7,5. En realizaciones, el pH es de 5,5 a 6,5. En realizaciones, el pH es de 6 a 7.

En realizaciones, una formulación que se describe en el presente documento comprende además un agente de viscosidad, por ejemplo, carboximetil celulosa de sodio (CMC). En realizaciones, la formulación comprende CMC, por ejemplo, CMC en una concentración de un 0,1-1 % p/v, un 0,1-0,5 % p/v, o un 0,2-0,3 % p/v.

En el presente documento también se proporciona un método para tratar a un sujeto que tiene un trastorno relacionado con IL-1. El método incluye administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende una formulación que se describe en el presente documento. En realizaciones, el método incluye identificar a un sujeto que tiene un trastorno relacionado con IL-1 tal como, por ejemplo, un trastorno de ojo seco; y administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende una formulación tal como se describe en el presente documento.

En el presente documento también se describe un método para inhibir la actividad de IL-1 en un sujeto. El método incluye administrar al sujeto una formulación tal como se describe en el presente documento. En realizaciones, el sujeto tiene un trastorno relacionado con IL-1, por ejemplo, un trastorno de ojo seco.

En algunas realizaciones, la invención se refiere a un dispositivo de administración de fármaco que comprende una formulación tal como se describe en el presente documento.

En el presente documento también se desvela el uso de una composición tal como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir un trastorno relacionado con IL-1 en un sujeto, por ejemplo, en la fabricación de un medicamento para administración tópica a un sujeto para tratar o prevenir un trastorno relacionado con IL-1 en el sujeto. En realizaciones, el medicamento es para administración en el ojo, por ejemplo, administración tópica en el ojo. En algunas realizaciones, el medicamento es una formulación de vehículo, por ejemplo, una formulación acuosa que comprende o que consiste en sorbitol, citrato de sodio, y poloxámero 188 tal como se describe en el presente documento. En realizaciones, la formulación de vehículo está básicamente exenta de (por ejemplo, no comprende) una proteína terapéutica.

En general, el sujeto tratado tal como se describe en el presente documento es un ser humano u otro mamífero tal como un perro o un gato.

En algunas realizaciones, la invención se refiere a un envase o dispositivo que comprende una formulación tal como se describe en el presente documento. En realizaciones, el envase es un envase preparado con la tecnología de soplado, llenado y sellado (blow, fill, seal).

Los solicitantes también han descubierto una formulación farmacéutica (por ejemplo, una formulación de vehículo) que comprende un tensioactivo, un agente de tonicidad, y un agente de tamponamiento, que puede ser útil para tratar el ojo seco. En algunas realizaciones, la formulación no contiene una proteína o péptido, por ejemplo, la formulación no contiene una proteína o péptido terapéuticos. En algunas realizaciones, el tensioactivo es Pluronic F68 (poloxámero 188), el agente de tamponamiento es citrato, y el agente de tonicidad es sorbitol. En algunas realizaciones, la formulación comprende una proteína citoquina quimérica, por ejemplo, una proteína citoquina quimérica tal como se describe en el presente documento o en el documento de patente WO 2012/103240, por ejemplo, P05. En algunas realizaciones, la formulación farmacéutica también incluye un agente de viscosidad, por ejemplo, CMC. En algunas realizaciones, la formulación farmacéutica es adecuada para uso en el ojo (es decir, es adecuada para administración ocular), por ejemplo, para tratar enfermedades oculares tales como signos y/o síntomas de ojo seco.

Las proteínas de origen natural que se mencionan en el presente documento incluyen de forma específica formas humanas de tales proteínas, así como formas de otras especies de mamíferos.

Las realizaciones que se describen en el presente documento incluyen las siguientes:

Realización 1. Una formulación acuosa que comprende citrato de sodio o fosfato de sodio en una concentración de 8 a 12 mM; sorbitol de un 4 % a un 6 % (p/v); poloxámero 188 en una concentración de un 0,08 % a un 0,12 % (p/v); y opcionalmente carboximetilcelulosa de sodio, en donde la formulación tiene un pH de 5,5 a 7,5 y en donde las formulación es eficaz para tratar un trastorno ocular.

Realización 2. La formulación de la realización 1, en donde la formulación tiene un pH de 5,5 a 6,5, Realización 3. La formulación de la realización 1 o la realización 2, en donde la formulación está básicamente exenta de una proteína terapéutica.

Realización 4. La formulación de una cualquiera de las realizaciones 1 a 3, en donde la formulación comprende citrato de sodio en una concentración de 8 a 11 mM; sorbitol de un 4,5 a un 5,5 % (p/v); y poloxámero 188 en una concentración de un 0,09 a un 0,11 %.

Realización 5. La formulación de la realización 4, en donde la formulación consiste en citrato de sodio en una concentración de 9 a 11 mM; sorbitol de un 4,5 a un 5,5 % (p/v); y poloxámero 188 en una concentración de un 0,09 a un 0,11 %.

Realización 6. La formulación de la realización 5, en donde la formulación consiste en citrato de sodio en una concentración de 9 a 11 mM; sorbitol de un 4,5 a un 5,5 % (p/v); y poloxámero 188 en una concentración de un 0,09 a un 0,11 %.

Realización 7. La formulación de una cualquiera de las realizaciones 1 a 6, que comprende carboximetilcelulosa de sodio en una concentración de un 0,1-1 % (p/v).

Realización 8. Una formulación acuosa que comprende citrato de sodio en una concentración de 9-11 mM; sorbitol en un 4,5-5,5 % (p/v); y poloxámero 188 en una concentración de un 0,09-0,11 %, en donde la formulación tiene un pH de 5,7 a 6,3, en donde la formulación está básicamente exenta de proteína terapéutica, y en donde las formulación es eficaz para tratar un trastorno ocular (por ejemplo, un trastorno ocular que se describe en el presente documento).

Realización 9. La formulación de una cualquiera de las realizaciones 1 a 8, en donde el trastorno ocular es enfermedad de ojo seco.

Realización 10. La formulación de una cualquiera de las realizaciones 1 a 9, en donde las formulación es eficaz para reducir el dolor o molestia ocular, puntuación OSDI, y/o puntuación de tinción corneal con fluoresceína (CFS).

Realización 11. La formulación de la realización 10, en donde el dolor o molestia ocular se evalúa usando una escala analógica visual o una pregunta del OSDI.

Realización 12. Una formulación acuosa que comprende 1-50 mg/ml de una proteína citoquina quimérica IL-1 p/IL-1 Ra (por ejemplo, P01, P02, P03, P04, P05, P06, o P07); un agente de tamponamiento seleccionado entre citrato de sodio y fosfato de sodio; sorbitol, por ejemplo, en una concentración de un 3,5-6,5 % (p/v); poloxámero 188, por ejemplo, en una concentración de un 0,07-0,13 % (p/v); y opcionalmente carboximetilcelulosa de sodio (CMC), en donde la formulación tiene un pH de 5,5 a 7,5.

Realización 13. La formulación de la realización 12, en donde la proteína citoquina quimérica es P05.

Realización 14. La formulación de la realización 13, en donde la formulación comprende 1-20 mg/ml de P05. Realización 15. La formulación de la realización 13, en donde la formulación comprende 3-7 mg/ml de P05. Realización 16. La formulación de la realización 13, en donde la formulación comprende 4-6 mg/ml de P05. Realización 17. La formulación de la realización 13, que comprende citrato de sodio y/o fosfato de sodio en una concentración total de 5 mM a 15 mM.

Realización 18. La formulación de una cualquiera de las realizaciones 12 a 17, en donde el citrato de sodio está presente en una concentración de 5 mM a 15 mM.

Realización 19. La formulación de la realización 18, en donde el citrato de sodio está presente en una concentración de 8 mM a 12 mM.

Realización 20. La formulación de la realización 18, en donde el citrato de sodio está presente en una concentración de 9 mM a 11 mM.

Realización 21. La formulación de una cualquiera de las realizaciones 12 a 20, en donde el poloxámero 188 está presente en una concentración de un 0,05 % a un 0,15 % p/v.

Realización 22. La formulación de la realización 20, en donde el poloxámero 188 está presente en una concentración de un 0,08 % a un 0,12 % p/v.

Realización 23. La formulación de la realización 20, en donde el poloxámero 188 está presente en una concentración de un 0,09 % a un 0,11 % p/v.

Realización 24. La formulación de una cualquiera de las realizaciones 12 a 23, en donde el sorbitol está presente en una concentración de un 2,5 % a un 7,5 % p/v.

Realización 25. La formulación de la realización 24, en donde el sorbitol está presente en una concentración de un 4 % a un 6 % p/v.

Realización 26. La formulación de la realización 24, en donde el sorbitol está presente en una concentración de un 4,5 a un 5,5 % p/v.

Realización 27. Una formulación acuosa que comprende 1-25 mg/ml de P05; citrato de sodio o fosfato de sodio en una concentración de 8 mM a 12 mM; sorbitol de un 4 % a un 6 % (p/v); poloxámero 188 en una concentración de un 0,08 % a un 0,12 % (p/v); y, opcionalmente, carboximetilcelulosa de sodio, en donde la formulación tiene un pH de 5,5 a 7,5.

Realización 28. Una formulación acuosa que comprende o que consiste en 1 mg/ml a 25 mg/ml de P05; citrato de sodio en una concentración de 8-12 mM; sorbitol de un 4 % a un 6 % (p/v); y poloxámero 188 en una concentración de un 0,08 % a un 0,12 % (p/v), en donde la formulación tiene un pH de 5,5 a 7,5.

Realización 29. Una formulación acuosa que comprende o que consiste en 1 mg/ml a 25 mg/ml de P05; citrato de sodio en una concentración de 9 mM a 11 mM; sorbitol de un 4,5 % a un 5,5 % (p/v); y poloxámero 188 en una concentración de un 0,09 % a un 0,11 % (p/v); en donde la formulación tiene un pH de 5,7 a 6,3.

Realización 30. Una formulación acuosa que comprende o que consiste en 4-6 mg/ml de P05; citrato de sodio en una concentración de 9-11 mM; sorbitol en un 4,5-5,5 % (p/v); y poloxámero 188 en una concentración de un 0,09-0,11 % (p/v); en donde la formulación tiene un pH de 5,7-6,3.

Realización 31. La formulación de una cualquiera de las realizaciones 12 a 30, en donde la formulación tiene una osmolalidad de 270-370 mOsm/kg.

Realización 32. La formulación de una cualquiera de las realizaciones 1 a 31, en donde la formulación es adecuada para administración en el ojo.

Realización 33. La formulación de la realización 30, en donde la formulación es adecuada para administración tópica en el ojo.

Realización 34. La formulación de una cualquiera de las realizaciones 1 a 4 y 8 a 33, en donde la formulación no comprende ningún agente de viscosidad, por ejemplo, no comprende CMC.

Realización 35. La formulación de una cualquiera de las realizaciones 12 a 34, en donde la formulación comprende además un aminoácido, por ejemplo, arginina, ácido glutámico, histidina, o metionina.

Realización 36. La formulación de una cualquiera de las realizaciones 12 a 34, en donde la formulación comprende además metionina.

Realización 37. La formulación de la realización 36, en donde la metionina está presente en la formulación en una concentración de 1 a 20 mM

Realización 38. La formulación de la realización 36 o 37, en donde la formulación presenta oxidación reducida, en comparación con una formulación correspondiente que no comprende metionina, cuando la formulación se somete a almacenamiento, por ejemplo, durante al menos 4 semanas a 25 °C).

Realización 39. La formulación de la realización 38, en donde la formulación presenta oxidación reducida, en comparación con una formulación correspondiente que no comprende metionina, cuando la formulación se somete a almacenamiento en un envase de múltiples dosis.

Realización 40. La formulación de la realización 38 o 39, en donde la oxidación de la formulación se evalúa usando RP-HPLC.

Realización 41. La formulación de una cualquiera de las realizaciones 12 a 40, en donde la formulación tiene una cantidad menor o igual que 50 partículas por ml para partículas >10 pm y menor o igual que 5 partículas por ml para partículas >25 pm, tal como se evalúa usando un ensayo de recuento de partículas por oscurecimiento de la luz.

Realización 42. La formulación de una cualquiera de las realizaciones 12 a 41, en donde la formulación es estable tal como se indica por la presencia de > 90 % de la forma monomérica de la proteína con respecto a una forma agregada después de someter la solución de proteína la agitación vorticial durante 4 horas a temperatura ambiente, por ejemplo, a 25 °C.

Realización 43. La formulación de la realización 42, en donde el porcentaje de la forma monomérica de la proteína con respecto a una forma agregada se evalúa usando SEC-HPLC.

Realización 44. La formulación de una cualquiera de las realizaciones 12 a 43, en donde la formulación es estable después de almacenamiento durante al menos 5 meses a 2-8 °C y un 60 % de humedad relativa.

Realización 45. La formulación de una cualquiera de las realizaciones 12 a 44, en donde la formulación es estable después de almacenamiento durante al menos 5 meses en condiciones ambientales, por ejemplo, a temperatura ambiente, por ejemplo, a 25 °C.

Realización 46. La formulación de una cualquiera de las realizaciones 12 a 45, en donde la formulación es estable después de almacenamiento durante al menos 4 meses a 2-8 °C y un 60 % de humedad relativa.

Realización 47. La formulación de una cualquiera de las realizaciones 12 a 46, en donde la formulación es estable después de almacenamiento durante al menos 4 meses en condiciones ambientales, por ejemplo, a temperatura ambiente, por ejemplo, a 25 °C.

Realización 48. La formulación de una cualquiera de las realizaciones 12 a 47, en donde la formulación es estable después de almacenamiento durante al menos 3 meses a 2 °C a 8 °C y un 60 % de humedad relativa. Realización 49. La formulación de una cualquiera de las realizaciones 12 a 48, en donde la formulación es estable después de almacenamiento durante al menos 3 meses en condiciones ambientales, por ejemplo, a temperatura ambiente, por ejemplo, a 25 °C.

Realización 50. La formulación de una cualquiera de las realizaciones 12 a 49, en donde la formulación es estable después de almacenamiento durante al menos 2 meses a 2-8 °C y un 60 % de humedad relativa.

Realización 51. La formulación de una cualquiera de las realizaciones 12 a 50, en donde la formulación es estable después de almacenamiento durante al menos 2 meses en condiciones ambientales, por ejemplo, a temperatura ambiente, por ejemplo, a 25 °C.

Realización 52. La formulación de una cualquiera de las realizaciones 12 a 51, en donde la formulación es estable después de almacenamiento durante al menos 1 mes a 2-8 °C y un 60 % de humedad relativa.

Realización 53. La formulación de una cualquiera de las realizaciones 12 a 52, en donde la formulación es estable después de almacenamiento durante al menos 1 mes en condiciones ambientales, por ejemplo, a temperatura ambiente, por ejemplo, a 25 °C.

Realización 54. La formulación de una cualquiera de las realizaciones 12 a 53, en donde la formulación es estable tal como se indica por la presencia de una cantidad menor o igual que 50 partículas por ml para partículas >10 pm, menor o igual que 5 partículas por ml para partículas >25 pm, y menor o igual que 2 partículas por ml para partículas >50 pm, por ejemplo, tal como se evalúa usando un ensayo de recuento de partículas microscópicas.

Realización 55. La formulación de una cualquiera de las realizaciones 12 a 54, en donde la formulación es estable tal como se indica por la presencia de > 90 % de la forma monomérica de la proteína con respecto a una forma agregada tal como se evalúa usando SEC-HPLC.

Realización 56. La formulación de una cualquiera de las realizaciones 12 a 55, en donde la formulación es estable tal como se indica mediante la conformidad de la banda principal con el estándar de referencia en una SDS-PAGE reducida.

Realización 57. La formulación de una cualquiera de las realizaciones 12 a 56, en donde la formulación es estable tal como se indica mediante la conformidad de la banda principal con el estándar de referencia en una SDS-PAGE no reducida.

Realización 58. La formulación de una cualquiera de las realizaciones 12 a 57, en donde la formulación es estable tal como se indica mediante un pico principal mayor o igual que un 85 % cuando la formulación se evalúa usando HPLC de intercambio catiónico débil (Wc Ex -Hp Lc ).

Realización 59. La formulación de la realización 58, en donde la formulación comprende P05 y es estable tal como se indica por la presencia de menos de un 10 % de la forma des-Ala de P05 tal como se evalúa usando WCEX-HPLC.

Realización 60. La formulación de una cualquiera de las realizaciones 12 a 59, en donde la formulación se envasa en un envase de soplado, llenado y sellado.

Realización 61. La formulación de una cualquiera de las realizaciones 44 to 53, en donde dicho almacenamiento es almacenamiento en un envase de soplado, llenado y sellado.

Realización 62. Un método de tratamiento, comprendiendo el método administrar a un sujeto que tiene un trastorno relacionado con IL-1 una formulación de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 61, tratando de ese modo el trastorno relacionado con IL-1.

Realización 63. El método de la realización 62, en donde el trastorno relacionado con IL-1 es un trastorno de ojo seco.

Realización 64. Un método para tratar un trastorno ocular, por ejemplo, un trastorno de ojo seco, comprendiendo el método administrar a un sujeto que tiene el trastorno ocular, por ejemplo, el trastorno de ojo seco, una formulación acuosa que comprende citrato de sodio o fosfato de sodio en una concentración de 8 mM a 12 mM; sorbitol de un 4 % a un 6 % (p/v); poloxámero 188 en una concentración de un 0,08 % a un 0,12 % (p/v); y opcionalmente carboximetilcelulosa de sodio; en donde la formulación tiene un pH de 5,5 a 7,5 y está básicamente exenta de proteína terapéutica, tratando de ese modo el trastorno de ojo seco.

Realización 65. El método de la realización 64, en donde la formulación acuosa comprende citrato de sodio en una concentración de 8 mM a 11 mM, sorbitol de un 4,5 % a un -5,5 % (p/v) y poloxámero 188 en una concentración de un 0,09 % a un 0,11 %.

Realización 66. El método de la realización 64, en donde la formulación acuosa consiste en citrato de sodio en una concentración de 8-11 mM, sorbitol en un 4,5-5,5 % (p/v) y poloxámero 188 en una concentración de un 0,09-0,11 %.

Realización 67. Un método para tratar un trastorno de ojo seco, comprendiendo el método administrar a un sujeto que tiene un trastorno de ojo seco una formulación acuosa que comprende de 1 a 25 mg/ml de P05; citrato de sodio o fosfato de sodio en una concentración de 8 mM a 12 mM; sorbitol de un 4 % a un 6 % (p/v); poloxámero 188 en una concentración de un 0,08 % a un 0,12 % (p/v); y opcionalmente carboximetilcelulosa de sodio, en donde la formulación tiene un pH de 5,5 a 7,5, tratando de ese modo el trastorno de ojo seco.

Realización 68. Un método para tratar un trastorno de ojo seco, comprendiendo el método administrar a un sujeto que tiene un trastorno de ojo seco una formulación acuosa que consiste en 1 mg/ml a 25 mg/ml de P05; citrato de sodio en una concentración de 8 mM a 12 mM; sorbitol de un 4 % a un 6 % (p/v); poloxámero 188 en una concentración de un 0,08 % a un 0,12 % (p/v), en donde la formulación tiene un pH de 5,5 a 7,5, tratando de ese modo el trastorno de ojo seco.

Realización 69. Un método para tratar un trastorno de ojo seco, comprendiendo el método administrar a un sujeto que tiene un trastorno de ojo seco una formulación acuosa que comprende o que consiste en 1 mg/ml a 25 mg/ml de P05; citrato de sodio en una concentración de 9 mM a 11 mM; sorbitol de un 4,5 % a un 5,5 % (p/v); y poloxámero 188 en una concentración de un 0,09 % a un 0,11 % (p/v), en donde la formulación tiene un pH de 5,7 a 6,3, tratando de ese modo el trastorno de ojo seco.

Realización 70. El método de una cualquiera de las realizaciones 62 a 69, en donde el método es eficaz para reducir dolor o molestia ocular, puntuación OSDI, y/o puntuación de tinción corneal con fluoresceína (CFS). Realización 71. El método de la realización 70, en donde el dolor o molestia ocular se evalúa usando una escala analógica visual o una pregunta del OSDI.

Realización 72. El método de una cualquiera de las realizaciones 62 a 70, en donde la formulación se administra de una a cinco veces al día.

Realización 73. El método de una cualquiera de las realizaciones 62 a 72, en donde la formulación se administra por vía tópica.

Realización 74. El método de la realización 73, en donde la formulación se administra por vía tópica en el ojo. Realización 75. El método de una cualquiera de las realizaciones 62 a 74, en donde la formulación se administra tres veces al día.

Realización 76. El método de una cualquiera de las realizaciones 62 a 71 o 73 a 74, en donde la formulación se administra a voluntad.

Realización 77. Un envase o dispositivo que comprende la formulación de una cualquiera de las realizaciones 1 a 61.

Realización 78. El envase o dispositivo de la realización 77, en donde el envase o dispositivo se ha almacenado a 25 °C durante al menos dos semanas, por ejemplo, durante al menos cuatro semanas, y está básicamente exento de materiales particulados.

Realización 79. Un envase de soplado, llenado y sellado que comprende la formulación de una cualquiera de las realizaciones 1 a 61.

Realización 80. Un envase de múltiples dosis que comprende la formulación de una cualquiera de las realizaciones 1 a 61.

Realización 81. Un envase de múltiples dosis que comprende la formulación de las realizaciones 35 a 40.

Realización 82. Un dispositivo de administración de fármaco que comprende una formulación de una cualquiera de las realizaciones 1 a 61.

Realización 83. El dispositivo de administración de fármaco de la realización 82, en donde el dispositivo de administración de fármaco es un envase de soplado, llenado y sellado.

Realización 84. El envase o dispositivo de una cualquiera de las realizaciones 77 a 83, en donde el envase o dispositivo está sellado en una bolsa, que contiene opcionalmente un gas inerte, por ejemplo, nitrógeno o argón. Realización 85. La formulación de una cualquiera de las realizaciones 1 a 61, para uso para tratar un trastorno relacionado con IL-1, por ejemplo, un trastorno de ojo seco.

Realización 86. Uso de una formulación de una cualquiera de las realizaciones 1 a 61 en la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno relacionado con IL-1 en un sujeto.

Realización 87. Un kit que comprende un envase o dispositivo que comprende la formulación de una cualquiera de las realizaciones 1 a 61, y opcionalmente, instrucciones de uso.

Las realizaciones mencionadas anteriormente no son necesariamente realizaciones independientes. En algunos casos, se pueden combinar entre sí y/o con otros aspectos y realizaciones que se desvelan en el presente documento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1 es una reproducción de un gel SDS-PAGE que presenta muestras a modo de ejemplo de proteína purificada a partir de agentes de unión a receptor que expresan E. coli. Los marcadores de peso molecular de 15 y 20 kDa se indican a la izquierda. Los carriles son los siguientes: marcador de peso molecular (carriles 1 y 6), extracto (carriles 2 y 7), material purificado mediante cromatografía de intercambio catiónico (carriles 3 y 8), material purificado aún más mediante cromatografía de intercambio aniónico (carriles 4 y 9), y muestras reducidas de tal material (carriles 5 y 10). Los carriles 2-5 son de purificación de P05 y los carriles 6-10 son de purificación de P04. Véase también el Ejemplo 2.

La figura 2A es una tabla y un gráfico de barras adjunto que ilustra los resultados de un experimento que somete a ensayo la capacidad de las proteínas P06, P07 y P01 para agonizar la señalización con respecto a IL-1 p y un control negativo, proteína p-glucuronidasa (GUS).

La figura 2B es un gráfico que representa los resultados de un experimento que somete a ensayo la capacidad de P01 para antagonizar la actividad de IL-1 p con diversas concentraciones de IL-1 p.

La figura 3A es un gráfico que representa los resultados de un experimento que somete a ensayo el antagonismo de IL-1 p por P03 (etiquetada con hexa-histidina (SEQ ID NO: 23)), P04 (etiquetada con hexa-histidina (SEQ ID NO: 23)), P05 (etiquetada con hexa-histidina (SEQ ID NO: 23)) e IL-IRa en presencia de 0,1 ng/ml de IL-1 p (humana).

La figura 3B es un gráfico que representa los resultados de un experimento que somete a ensayo el antagonismo de IL-1 p por lisados que contienen formas sin etiquetar de P01, P02, P03, P04, y P05, e IL-IRa en presencia de 0,1 ng/ml de IL-1 p (humana) y usando estimaciones de la concentración de proteína en los respectivos lisados. La figura 4A es un gráfico que muestra los resultados de dispersión dinámica de luz (DLS) para P05 en una formulación de fosfato (P05 a 20 mg/ml, fosfato 10 mM, sorbitol al 5 % p/v, poloxámero 188 al 0,1 % p/v, pH 6,5). La figura 4B es un gráfico que muestra los resultados de DLS para P05 en una formulación de citrato (P05 a 20 mg/ml, citrato 10 mM, sorbitol al 5 % p/v, poloxámero 188 al 0,1 % p/v, pH 6,0).

La figura 5A es un gráfico que representa la desnaturalización térmica de IL-IRa, IL-1 p, P03, P04, y P05 como se describe en el Ejemplo 8.

La figura 5B es un gráfico que representa la primera derivada negativa del gráfico de la figura 5A (la primera derivada negativa proporciona una visualización mejorada de la temperatura de fusión).

La figura 6A es un gráfico que representa la puntuación media de tinción corneal ± SEM tal como se somete a ensayo mediante tinción corneal con fluoresceína por ojo de dos estudios independientes, los días 0, 3, 7, 9 y 11 para ratones en un modelo de ojo seco. Los ratones no recibieron tratamiento (n = 18), 10 mg/ml de P05 (n = 19), o 1,25x de PBS, el vehículo (n = 20). Los asteriscos indican la significación estadística de P05 con respecto al vehículo como sigue a continuación: * (P < 0,05) y ** (P < 0,005).

La figura 6B es un gráfico que representa datos que muestran la puntuación media de tinción corneal ± SEM de la córnea por ojo, los días 0, 3, 7, 9, y 11 para ratones en un modelo de ojo seco. Los ratones no recibieron tratamiento (n = 8), 1,25x de vehículo de ^pB^s(n = 8), 10 mg/ml de albúmina de suero murino (MSA) (n = 8), o 10 mg/ml de P05 (n = 9). Los asteriscos indican la significación estadística de P05 con respecto a la albúmina de suero murino como sigue a continuación: * (P < 0,05) y *** (P < 0,0005).

La figura 6C es un gráfico de barras que representa datos para ratones que se trataron con Restasis® (emulsión de ciclosporina al 0,05 %) (n = 8) en el mismo experimento que en la figura 6B. Los asteriscos indican la significación estadística de P05 con respecto a la ciclosporina (Restasis®) como sigue a continuación: ** (P < 0,005) y *** (P < 0,0005).

La figura 7 representa el diseño del ensayo clínico que se describe en el Ejemplo 16.

La figura 8 es un gráfico que muestra el cambio medio desde el valor inicial en la puntuación OSDI para los grupos de sujetos que recibieron formulaciones de EBI-005 (datos combinados para los grupos que recibieron tratamientos de 5 mg/ml y 20 mg/ml) y formulación de vehículo.

La figura 9 es un gráfico que muestra el cambio medio desde el valor inicial del dolor para los grupos de sujetos que recibieron formulaciones de EBI-005 (datos combinados para los grupos que recibieron tratamientos de 5 mg/ml y 20 mg/ml) y formulación de vehículo.

La figura 10 es un gráfico que muestra el cambio medio desde el valor inicial en la puntuación de tinción corneal con fluoresceína (CFS) para los grupos de sujetos que recibieron formulaciones de EBI-005 (datos combinados para los grupos que recibieron tratamientos de 5 mg/ml y 20 mg/ml) y formulación de vehículo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Los solicitantes han logrado formulaciones que son útiles para proporcionar una proteína, por ejemplo, un polipéptido de citoquina quimérica tal como una quimera IL-1 p/IL-1 Ra a un sujeto que necesita tratamiento con tal formulación. Las formulaciones son generalmente útiles para la formulación de composiciones de proteínas que requieren estabilidad, por ejemplo, proteínas que son susceptibles de agitación, son susceptibles a la oxidación, por ejemplo, debido a restos de metionina, o son susceptibles a la desaminación, por ejemplo, debido a restos de asparagina o arginina. En el presente documento también se desvelan métodos para preparar y administrar tales formulaciones.

En algunas realizaciones, una formulación comprende un polipéptido de citoquina quimérica, por ejemplo, un polipéptido quimérico que contiene secuencias seleccionadas obtenidas a partir de una secuencia de IL-1 p y una secuencia de IL-IRa, que son adecuadas para uso farmacéutico, por ejemplo, para uso oftálmico, incluyendo tratamiento tópico eficaz para un trastorno relacionado con IL-1. En general, las formulaciones que se describen en el presente documento son sorprendentemente estables, incluso en concentraciones relativamente altas del polipéptido, por ejemplo, en concentraciones adecuadas para el almacenamiento de sustancia farmacéutica a granel así como en concentraciones adecuadas para tratar a un sujeto. Una ventaja de esta característica es que no es necesario retirar agentes indeseables de la sustancia farmacéutica a granel para formular el fármaco para uso del paciente.

En particular, los solicitantes han logrado con éxito una formulación acuosa eficaz de polipéptidos de citoquina quimérica que es adecuada para administración tópica, por ejemplo, en el ojo, por ejemplo, en la superficie frontal o corneal del ojo. De acuerdo con lo que conocen los solicitantes, en el punto en el tiempo de esta presentación no existen fármacos biológicos aprobados (productos biológicos) para administración oftálmica tópica aprobados por la FDA. Además, los solicitantes pudieron formular un polipéptido de este tipo a un pH compatible con la administración en el ojo (por ejemplo, un pH de 4,5 a 7,0, de 5,5 a 7,0, de 5,5 a 6,5, o 6,0 a 7,0), y contiene componentes que hacen que la formulación sea cómoda para los sujetos que están siendo tratados con el polipéptido. Es más probable que los pacientes cumplan con el tratamiento si la formulación es cómoda, por ejemplo, no causa irritación. En realizaciones, la formulación no provoca uno o más síntomas de irritación tales como, por ejemplo, enrojecimiento de los ojos, lagrimeo, secreción mucosa o malestar subjetivo.

Estabilidad

Generalmente los pacientes se autoadministran los fármacos oftálmicos tópicos. Dado que el paciente puede estar almacenando un fármaco durante un periodo de tiempo relativamente largo, la formulación puede estar sometida a temperaturas más altas y mayores niveles de estrés por agitación que una formulación que generalmente solo la almacenada un médico o farmacéutico antes de la administración. Como se conoce en la técnica, las proteínas son más sensibles a la agitación y la temperatura que las moléculas pequeñas. El estrés por agitación puede provocar precipitación y el estrés por calor puede provocar precipitación y degradación química. Además, durante la carga de un compuesto en un dispositivo de administración, puede haber exposición a estrés por calor. Los solicitantes han logrado una formulación que proporciona de forma satisfactoria una estabilidad excelente cuando se expone a estrés por agitación y calor.

Algunos procesos de fabricación requieren al menos una breve exposición de una formulación a temperaturas relativamente altas. Por ejemplo, la carga de una formulación en un envase de soplado, llenado y sellado (BFS) puede dar como resultado una exposición de la formulación a temperaturas elevadas, además de la agitación asociada al proceso de llenado. Los solicitantes han cargado una formulación en un dispositivo de ese tipo (un envase BFS) y han demostrado la estabilidad de la formulación inmediatamente después de la carga y durante un periodo de tiempo prolongado. En algunas realizaciones, una formulación como la que se proporciona en el presente documento es adecuada para su uso con BFS. En realizaciones, una formulación que es adecuada para usar con BFS muestra estabilidad inmediatamente después de la carga en un envase BFS y/o después de su almacenamiento en un envase BFS, por ejemplo, después de su almacenamiento durante periodos de tiempo y en las condiciones que se describen en el presente documento.

En realizaciones, una formulación que se describe en el presente documento es estable. En realizaciones, la formulación exhibe estabilidad en las condiciones (por ejemplo, almacenamiento a temperaturas particulares o estrés por agitación) que se describen en el presente documento. En realizaciones, la estabilidad se evalúa usando uno o más métodos que se describen en el presente documento (por ejemplo, basándose en el aspecto visual, contenido mediante espectrofotometría (A280), SDS-PAGE no reducida, SDS-PAGE reducida; HPLC de exclusión por tamaño (SE HPLC); HPLC de fase inversa (RP-HPLC); HPLC de intercambio catiónico débil (WCEX-HPLC); potencia; un ensayo de recuento de partículas por oscurecimiento de la luz (por ejemplo, un ensayo de recuento de partículas por oscurecimiento de la luz tal como se describe en la USP <788>); o un ensayo de recuento de partículas microscópicas (por ejemplo, un ensayo de recuento de partículas microscópicas tal como se describe en la USP <788>)) y/o métodos conocidos en la técnica.

La estabilidad se puede evaluar basándose en el aspecto visual. En realizaciones, una formulación es estable si es una solución incolora de transparente a ligeramente opalescente básicamente exenta de materiales particulados visibles.

En realizaciones, la formulación es estable de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 40 °C, por ejemplo, aproximadamente 27 °C, aproximadamente 28 °C, aproximadamente 29 °C, aproximadamente 30 °C, aproximadamente 31 °C, aproximadamente 32 °C, aproximadamente 33 °C, aproximadamente 34 °C, aproximadamente 35 °C, aproximadamente 36 °C, aproximadamente 37 °C, aproximadamente 38 °C, aproximadamente 39 °C, o aproximadamente 40 °C durante un periodo de tiempo de al menos dos días; tres días; cinco días; una semana; diez días, dos semanas, tres semanas, cuatro semanas, cinco semanas, seis semanas, ocho semanas, 16 semanas, 20 semanas, 25 semanas, 30 semanas, 35 semanas, 40 semanas, 45 semanas, un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses, siete meses, ocho meses, o más.

En realizaciones, las formulaciones son estables durante periodos de tiempo largos durante su almacenamiento a temperaturas de aproximadamente 2 °C a aproximadamente 8 °C, tal como a aproximadamente 4 °C, aproximadamente 5 °C, aproximadamente 6 °C, de 2 °C a 8 °C, a 4 °C, a 5 °C, o a 6 °C. Por ejemplo, las formulaciones son estables a tales temperaturas de almacenamiento durante un periodo de tiempo de al menos dos semanas; cuatro semanas; seis semanas; dos meses; tres meses; seis meses, un año, dos años, tres años, o cuatro años.

La estabilidad de una formulación se puede evaluar, por ejemplo, después de su almacenamiento durante al menos 2, 4, 6, 8, 12, o 18 meses, por ejemplo, a 2-8 °C, o después de su almacenamiento en condiciones ambientales, por ejemplo, a temperatura ambiente (RT), por ejemplo, a aproximadamente 25 °C durante, por ejemplo, al menos 2 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses 5 meses, 6 meses, 12 meses, o 18 meses. En realizaciones, la formulación es estable después de almacenamiento a 2-8 °C durante al menos 8 meses. En realizaciones, la formulación es estable después de su exposición a temperatura ambiente durante al menos 5 meses. En algunas de tales realizaciones, la formulación es estable después de almacenamiento, por ejemplo, durante al menos 5 meses, en un envase de BFS. La estabilidad se puede evaluar, por ejemplo, basándose en métodos y criterios que se describen en el presente documento o que se conocen en la técnica. Por ejemplo, la estabilidad se puede evaluar basándose en la pureza física (por ejemplo, falta de agregación, por ejemplo, tal como se evalúa usando HPLC de exclusión por tamaño, también denominada exclusión por tamaño, SE HPLC o SEC HPLC en el presente documento), pureza química (por ejemplo, tal como se evalúa usando HPLC de intercambio catiónico débil, HPLC de fase inversa y/o SDS PAGE (por ejemplo, SDS PAGE reducida o no reducida)), y/o los niveles de materiales particulados (por ejemplo, tal como se evalúa de forma visual o mediante recuento de partículas usando un aparato de recuento de partículas líquidas HIAC (Beckman Coulter, Brea, CA)).

En realizaciones, la estabilidad se demuestra basándose en el cumplimiento de las directrices para material particulado en soluciones oftálmicas, por ejemplo, tal como se establece en la USP <789> (U.S. Pharmacopeia, material particulado en soluciones oftálmicas).

En realizaciones, la formulación tiene una cantidad menor o igual que 50 partículas por ml para partículas >10 pm y/o menor o igual que 5 partículas por ml para partículas >25 pm, por ejemplo, tal como se evalúa usando un ensayo de recuento de partículas por oscurecimiento de la luz (por ejemplo, un ensayo de recuento de partículas por oscurecimiento de la luz tal como se describe en la USP <788>).

En realizaciones, la formulación tiene una cantidad menor o igual que 50 partículas por ml para partículas >10 pm, menor o igual que 5 partículas por ml para partículas >25 pm, y/o menor o igual que 2 partículas por ml para partículas >50 pm, por ejemplo, tal como se evalúa usando un ensayo de recuento de partículas microscópicas (por ejemplo, un ensayo de recuento de partículas microscópicas tal como se describe en la USP <788>).

En realizaciones, la estabilidad se demuestra basándose en el cumplimiento de las directrices para material particulado en inyecciones, por ejemplo, tal como se establece en la USP <788> (U.S. Pharmacopeia, material particulado en inyecciones).

En realizaciones, la formulación tiene una cantidad menor o igual que 6000 partículas por envase (para envases con un volumen de 100 ml o menor) para partículas >10 pm, y/o menor o igual que 600 partículas por envase (para envases con un volumen de 100 ml o menor) para partículas >25 um, por ejemplo, tal como se evalúa usando un ensayo de recuento de partículas por oscurecimiento de la luz (por ejemplo, un ensayo de recuento de partículas por oscurecimiento de la luz tal como se describe en la USP <788>).

En realizaciones, la formulación tiene una cantidad menor o igual que 3000 partículas por 5 ml para partículas >10 pm y/o menor o igual que 300 partículas por 5 ml para partículas >25 um, por ejemplo, tal como se evalúa usando un ensayo de recuento de partículas microscópicas (por ejemplo, un ensayo de recuento de partículas microscópicas tal como se describe en la USP <788>).

En realizaciones, la proteína en una formulación se protege del estrés por agitación tal como se demuestra, por ejemplo, mediante la falta de agregación (la falta de agregación se puede demostrar, por ejemplo, si la formulación contiene > 90 %, > 91 %, > 92 %, > 93 %, > 94 %, > 95 %, > 96 %, > 97 %, > 98 %, o > 99 % de la forma monomérica de la proteína con respecto a una forma agregada) después de someter la solución de proteína agitación vorticial, por ejemplo, durante 1-8 horas a temperatura ambiente (RT), por ejemplo, durante 4 horas a RT. La agregación se puede evaluar, por ejemplo, usando métodos que se describen en el presente documento o métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la agregación se puede evaluar mediante ultracentrifugación, cromatografía de exclusión por tamaño, electroforesis en gel, dispersión dinámica de luz y/o mediciones de turbidez. En algunos aspectos, la estabilidad se evalúa mediante métodos físicos o químicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la pureza física o la falta de agregación se puede determinar usando HPLC de exclusión por tamaño u otros métodos que determinan la cantidad relativa de polipéptido monomérico en una formulación. Generalmente, una formulación con una estabilidad aceptable contiene > 90 % de la forma monomérica de la proteína terapéutica (por ejemplo, la citoquina quimérica, por ejemplo, P05) con respecto a formas agregadas de la proteína. En realizaciones, la formulación contiene > 90 % (por ejemplo, > 91 %, > 92 %, > 93 %, > 94 %, > 95 %, > 96 %, > 97 %, > 98 %, o > 99 %) de la forma monomérica de la proteína terapéutica (por ejemplo, la citoquina quimérica, por ejemplo, P05), con respecto a formas agregadas de la proteína.

La pureza química se puede determinar, por ejemplo, usando HPLC de intercambio catiónico débil o HPLC de fase inversa. Generalmente, una formulación con una estabilidad aceptable contiene > 80 % de la molécula nativa, con respecto a formas químicamente modificadas de la molécula, por ejemplo, tal como se evalúa usando HPLC de intercambio catiónico débil. En realizaciones, la formulación contiene > 80 % (por ejemplo, > 85 %, > 87 %, > 90 %, o > 95 %) de la molécula nativa, con respecto a formas químicamente modificadas de la molécula (por ejemplo, formas oxidadas o acetiladas).

Los materiales particulados se pueden identificar de forma visual. En realizaciones, la formulación es una que está básicamente exenta de partículas que se pueden identificar de forma visual.

Los solicitantes señalan que la información sobre anakinra, una IL-IRa, formulada para administración mediante inyección, indica que el producto tiene una vida útil de tres años, que se debe almacenar a 3-8 °C, y "Con la finalidad de uso ambulatorio, Kineret® se puede sacar del frigorífico durante 12 horas a una temperatura no superior a 25 °C, sin superar la fecha de caducidad. Al final de este periodo, el producto no se debe guardar de nuevo en el frigorífico y se debe desechar". (Véase: medicines.org.uk/EMC/medicine/23104/SPC/Kineret+100+mg+solution+for+injection+in+a+prefilled+syinge#SHELF_ LIFE). Esto proporciona un contraste con la estabilidad sorprendente de, por ejemplo, la formulación de P05 que se proporciona en el presente documento.

La administración de los tratamientos biológicos puede ser problemática porque pueden tener una vida útil relativamente corta o pueden requerir condiciones de almacenamiento especiales que pueden crear obstáculos para el almacenamiento, transporte y uso del paciente, así como asegurar un suministro suficiente del producto biológico. Una ventaja de ciertas formulaciones que se proporcionan en el presente documento es que las formulaciones son sorprendentemente estables no solo en condiciones de refrigeración, sino también a temperaturas que están de acuerdo con la temperatura ambiente (por ejemplo, 25 °C) y superiores (por ejemplo, 40 °C). Por lo tanto, las formulaciones de proteína o polipéptido citoquina (por ejemplo, formulaciones de proteína o polipéptido de citoquina heteróloga), por ejemplo, las formulaciones que se describen en el presente documento se proporcionan, en algunas realizaciones, en una forma líquida que es estable RT (por ejemplo, a 25 °C) durante un periodo de al menos tres días, cinco días, una semana, diez días, dos semanas, tres semanas, seis semanas, ocho semanas, 16 semanas, 20 semanas, 25 semanas, 30 semanas, 35 semanas, 40 semanas, 45 semanas, un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses, siete meses, ocho meses, doce meses, o más. En realizaciones, un mes se determina en una base de fecha a fecha, por ejemplo, desde el primer día del mes hasta el primer día del segundo mes.

En otros aspectos las formulaciones son estables de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 40 °C, por ejemplo, aproximadamente 27 °C, aproximadamente 28 °C, aproximadamente 29 °C, aproximadamente 30 °C, aproximadamente 31 °C, aproximadamente 32 °C, aproximadamente 33 °C, aproximadamente 34 °C, aproximadamente 35 °C, aproximadamente 36 °C, aproximadamente 37 °C, aproximadamente 38 °C, aproximadamente 39 °C, o aproximadamente 40 °C durante un periodo de tiempo de al menos dos días; tres días; cinco días; una semana; diez días, dos semanas, tres semanas, cuatro semanas, cinco semanas, seis semanas, ocho semanas, 16 semanas, 20 semanas, 25 semanas, 30 semanas, 35 semanas, 40 semanas, 45 semanas, un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses, siete meses, ocho meses, o más.

En un ejemplo, una formulación es estable durante un mes a 25 °C y 1 semana a 40 °C cuando el componente proteico de la formulación, por ejemplo, P05, está en una concentración de 20 mg/ml. En otra realización específica, la formulación, cargada en un vial de soplado, llenado y sellado o dispositivo de administración de soplado y llenado, es estable a 25 °C durante al menos tres meses para una formulación que comprenda proteína, por ejemplo, P05, en una concentración de 1 mg/ml, 5 mg/ml, o 10 mg/ml. En algunas realizaciones, esta formulación es estable durante al menos ocho meses.

En realizaciones, una formación que comprende 4,5-5,5 mg/ml de P05, citrato de sodio 9-11 mM; sorbitol al 4,5 5,5 % p/v, y poloxámero 188 al 0,09-0,11 % p/v es estable durante al menos cinco meses de 2 °C a 8 °C y/o a temperatura ambiente, por ejemplo, a 25 °C. En algunas realizaciones, una formulación que consiste en citrato Na 10 mM, pH 6,0, sorbitol al 5 %, poloxámero al 0,1 %, y 5 mg/ml o 20 mg/ml de P05 es estable durante al menos cinco meses de 2 °C a 8 °C y/o a temperatura ambiente, por ejemplo, a 25 °C durante al menos 5 meses.

Concentración

Otro problema en la administración de productos biológicos es proporcionar una concentración suficiente del producto biológico. Este es un problema particular en aplicaciones oftálmicas en las que es deseable proporcionar una concentración relativamente alta del producto biológico para lograr un efecto terapéutico con un número mínimo de dosis. Los solicitantes han podido lograr una formulación que puede administrar una dosis eficaz de una formulación de una citoquina quimérica que contiene una concentración alta, o una concentración terapéuticamente eficaz, del polipéptido que no se agrega, precipita ni pierde pureza química apreciablemente cuando se almacena en condiciones tales como los que se han descrito anteriormente y en otros sitios dentro de la presente memoria descriptiva. Además, los solicitantes han demostrado la estabilidad de una formulación de citoquina en concentraciones de proteína de hasta 80 mg/ml, por ejemplo, 50 mg/ml en una formulación que comprende un agente de tonicidad, un tensioactivo, y un agente de tamponamiento. Por lo tanto, en un aspecto, una formulación presentada en la invención contiene un polipéptido de citoquina quimérica presente de forma estable en la formulación en una concentración 0,1 mg/ml 100 mg/ml, 0,1-80 mg/ml, de 0,1 a 50 mg/ml, de 0,1 mg/ml a 20 mg/ml, de 0,1 mg/ml a 5 mg/ml, de 0,1 mg/ml a 1 mg/ml, de 1 mg/ml a 100 mg/ml; de 5 mg/ml a 100 mg/ml; de 5 mg/ml a 30 mg/ml; de 10 mg/ml a 100 mg/ml; de 10 mg/ml a 30 mg/ml; de 20 mg/ml a 100 mg/ml; de 30 mg/ml a 100 mg/ml; de 40 mg/ml a 100 mg/ml; de 50 mg/ml a 100 mg/ml; de 60 mg/ml a 100 mg/ml; de 1 mg/ml a 80 mg/ml; de 5 mg/ml a 80 mg/ml; de 10 mg/ml a 80 mg/ml; de 20 mg/ml a 80 mg/ml; de 40 mg/ml a 80 mg/ml; de 50 mg/ml a 80 mg/ml; de 60 mg/ml a 80 mg/ml; de 1 mg/ml a 60 mg/ml; de 5 mg/ml a 60 mg/ml; de 10 mg/ml a 60 mg/ml; de 20 mg/ml a 60 mg/ml; de 30 mg/ml a 60 mg/ml; de 40 mg/ml a 60 mg/ml; o de 50 mg/l a 60 mg/ml. Por ejemplo, la formulación contiene 0,1 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 5 mg/ml a 20 mg/ml, por ejemplo, 5 mg/ml o 20 mg/ml.

Los agentes de viscosidad se usan con frecuencia en formulaciones, por ejemplo, para uso oftálmico. Tales agentes se incluyen generalmente para aumentar el tiempo de permanencia de un tratamiento oftálmico que de otro modo se podría eliminar rápidamente al parpadear y se podría drenar a través del saco conjuntival. Sin embargo, tales agentes pueden tener efectos perjudiciales, por ejemplo, síntomas alérgicos, dañar los componentes proteicos de una formulación o causar visión borrosa. Aunque tales agentes se pueden usar en ciertas formulaciones que se describen en el presente documento, en algunas realizaciones los solicitantes han logrado formulaciones que no requieren agente de viscosidad para el componente activo, es decir, una citoquina quimérica, a usar como un agente terapéutico eficaz.

En otro aspecto las formulaciones que se presentan en la invención contienen uno o más tensioactivos. Aunque el uso de un tensioactivo puede ser útil, por ejemplo, para reducir la adhesión de una molécula a un envase, para reducir la agregación de una proteína en particular en condiciones de agitación, la adición de un tensioactivo también puede hacer que un agente terapéutico no se pueda usar debido a la formación de espuma, rotura de membranas naturales y otras barreras, y malestar inaceptable causado por el tratamiento. Los solicitantes han logrado proporcionar una formulación que incluye un tensioactivo, pero que no presenta tales desventajas. Generalmente, el tensioactivo es un tensioactivo no iónico. Los tensioactivos adecuados para su uso en las formulaciones que se desvelan pueden incluir, pero no se limitan a: poloxámeros, tales como poloxámero 188. En algunas realizaciones, un tensioactivo es un polisorbato, tal como polisorbato-20 y polisorbato-80. Otros tensioactivos que pueden ser útiles incluyen Cremophor® EL, tiloxapol, octoxinol 40 (Triton® X405, y estearato de polioxilo 40. En ciertas realizaciones, una formulación contiene un tensioactivo (por ejemplo, poloxámero 188) en una concentración de aproximadamente un 0,05 %, un 0,06 %, de un 0,1 % a un 1,0 %, de un 0,1 % a un 0,5 %, de un 0,2 % a un 0,5 %, o de un 0,1 % a un 0,2 % p/v, por ejemplo, poloxámero 188 al 0,1 % p/v. Los tensioactivos adecuados y las concentraciones de tales tensioactivos se pueden determinar sometiendo a ensayo si el tensioactivo previene la agregación en estudios de agitación. En la técnica se conocen métodos para realizar tales estudios. Por ejemplo, se puede determinar si se necesita tensioactivo para evitar la precipitación de estrés de agitación. En tales experimentos, generalmente, se realiza un cribado usando agitación y análisis. Algunos ejemplos de concentraciones usadas para tales estudios son un 0,01 %, un 0,02 %, un 0,06 %, y un 0,1 % p/v de tensioactivo, por ejemplo, poloxámero 188. En realizaciones, la agregación y/o la precipitación se evalúan usando análisis mediante espectrofotometría (A280), inspección visual, cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), oscurecimiento de luz (por ejemplo, usando un dispositivo HIAC) o Imaging™ de micro flujo (m F i, ProteinSimple, Santa Clara, CA). Generalmente se selecciona un tensioactivo para su uso en una formulación que está asociada a la menor cantidad de precipitación, por ejemplo, sin precipitación visible, o recuento de partículas que satisface las directrices para material particulado en inyecciones (véase, por ejemplo, USP <788>) o las directrices para material particulado en soluciones oftálmicas (véase, por ejemplo, USP <789>). En otro aspecto, las formulaciones que se presentan en la invención contienen uno o más agentes de tonicidad. Los agentes de tonicidad adecuados incluyen, pero no se limitan a: cloruro de sodio, sorbitol; manitol, sacarosa, trehalosa u otros azúcares. Sin comprometerse con teoría alguna, tales agentes pueden contribuir a la sorprendente estabilidad de un polipéptido de citoquina quimérica. En realizaciones, un agente de tonicidad, por ejemplo, un azúcar tal como, por ejemplo, sorbitol, proporciona o contribuye a la estabilidad térmica. En ciertas realizaciones, las formulaciones que se presentan en la invención son isotónicas para el ojo (por ejemplo, tienen una osmolalidad de aproximadamente 270-330 mOsm por kg). En algunas realizaciones, la formulación tiene una osmolalidad de aproximadamente 250 a aproximadamente 450 mOsm por kg, de 300 a 400 mOsm por kg, de 350 a 400 mOsm por kg, de 200 a 375 mOsm por kg, o de 350 a 375 mOsm por kg. En realizaciones, la formulación tiene una osmolalidad de 270 - 330 mOsm por kg, por ejemplo, aproximadamente 320 mOsm por kg. Dependiendo del agente de tonicidad, ciertas realizaciones que se presentan en la invención contienen de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 15 % p/v; de un 2 % a un 12 % p/v; de un 5 % a un 12 % p/v; o de un 5 % a un 10 % p/v. Para sorbitol o manitol, un ejemplo de concentración es aproximadamente un 5 % p/v, por ejemplo, la concentración es un 5 % p/v. Para sacarosa o trehalosa, un ejemplo de concentración es aproximadamente un 9 % p/v.

Agentes de tamponamiento

En otro aspecto, una formulación presentada en el presente documento contiene uno o más agentes de tamponamiento. Los agentes de tamponamiento adecuados incluyen, pero no se limitan a, fosfatos; citratos; acetatos; boratos; succinatos; y TRIS. En algunos casos, una sal de los agentes de tamponamiento es una sal de sodio o una sal de potasio. En ciertas realizaciones que se presentan en la invención, el agente de tamponamiento está presente en una cantidad de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM, por ejemplo de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 40 mM, para proporcionar un efecto de tamponamiento débil. Esto permite que la formulación la formulación se neutralice rápidamente en el sitio de administración, por ejemplo, en la superficie del ojo, en caso de escozor o malestar. En algunas realizaciones, el agente de tamponamiento está presente en una cantidad de aproximadamente 10 mM, aproximadamente 15 mM, aproximadamente 20 mM, aproximadamente 25 mM, aproximadamente 30 mM, aproximadamente 35 mM, aproximadamente 40 mM, aproximadamente 45 mM o aproximadamente 50 mM. En algunas formulaciones, el agente de tamponamiento es un citrato, por ejemplo, citrato de sodio. En otras formulaciones, el agente de tamponamiento es citrato presente a 10 mM. En general, el agente de tamponamiento es un agente de tamponamiento débil.

En general, se selecciona un tampón adecuado mediante la realización de un estudio de estabilidad en el que el polipéptido de interés se expone a diversos tampones a diversos pH, concentraciones, temperaturas y durante diversos periodos de tiempo. Se pueden seleccionar tampones, por ejemplo, colocando el polipéptido de interés en el tampón y sometiendo las muestras a temperaturas elevadas (ensayo de estabilidad acelerada) y a continuación sometiendo a ensayo la estabilidad física (precipitación mediante inspección visual) o la estabilidad química, por ejemplo, monitorizando la desamidación mediante cromatografía de intercambio catiónico débil u oxidación mediante cromatografía de fase inversa. Algunos ensayos adicionales pueden incluir la monitorización de A280, SDS-PAGE, pH y osmolalidad. Se selecciona un tampón que proporcione la mejor estabilidad física y química.

Aminoácidos

En otro aspecto, una formulación que se presenta en la invención contiene uno o más aminoácidos. Los aminoácidos adecuados incluyen, pero no se limitan a: arginina, ácido glutámico, histidina, o metionina. El aminoácido se selecciona generalmente para aumentar la estabilidad y/o la solubilidad de la proteína. En la técnica se conocen métodos para identificar tales aminoácidos. En algunas realizaciones, una formulación tal como una formulación de P05 contiene histidina o metionina.

En algunas realizaciones una formulación contiene un neutralizador de oxígeno, por ejemplo metionina. En algunas realizaciones, la formulación está en un envase de plástico. En realizaciones, el envase de plástico se esteriliza usando un método que genera radicales libres, por ejemplo, el envase se esteriliza usando radiación gamma u óxido de etileno. En algunas de tales realizaciones, la formulación incluye metionina, por ejemplo, metionina en una concentración de 1-20 mM. En realizaciones, la metionina está presente en una concentración de 1-5 mM, 5-10 mM, 10-15 mM, 15-20 mM, o 5-15 mM. En realizaciones, metionina está presente a aproximadamente 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15, mM, o 20 mM. En realizaciones, la formulación comprende metionina en una concentración de aproximadamente 5 mM, por ejemplo, en una concentración de 2,5-7,5 mM, 3-7 mM, o 4-6 mM. En algunas realizaciones una formulación comprende metionina en un envase de plástico esterilizado y la cantidad de oxidación es menor que la de una formulación correspondiente que no contiene metionina.

Agentes de v iscosidad

En otro aspecto, las formulaciones que se presentan en la invención pueden contener uno o más agentes de viscosidad. Los agentes de viscosidad adecuados incluyen, pero no se limitan a, metilcelulosas, incluyendo carboximetilcelulosa de sodio (también denominada carboximetilcelulosa o CMC en el presente documento); hidroxicelulosas, incluyendo etilcelulosa; hidroxipropilmetilcelulosa (hipromelosa); carbómeros, tales como 934P, 971P y 974P; alcohol polivinílico; goma de xantano; goma guar; goma gelana; y glicerina.

Las formulaciones que se presentan en la invención también puede contener otros excipientes farmacéuticamente aceptables. Véase, por ejemplo, Gennaro (ed.), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a ed., Lippincott, Williams & Wilkins (2000) (ISBN: 0683306472); Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7a Ed., Lippincott Williams & Wilkins Publishers (1999) (ISBN: 0683305727); Kibbe (ed.), Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a ed. (2000) (ISBN: 091733096X); Protein Formulation and Delivery, McNally and Hastedt (eds.), Informa Health Care (ISBN: 0849379490) (2007). Entre los excipientes que se pueden añadir se encuentran conservantes, potenciadores de la penetración y bioadhesivos. Los potenciadores de la penetración y los bioadhesivos pueden incluir, por ejemplo, quitosano, citocalasina B, gelatina aminada, poli-ecaprolectona (carbopol 941P); poli(cianoacrilato de butilo); poli-L-arginina; ciclodextrinas; gelano; poli(ácido acrílico); ácido hialurónico; mucina; alginato; un carbófilo, y poloxámeros (por ejemplo, véase Nagarwal et al., J Controlled Release, 136: 2-13 (2009); Ding, PSTT 1: 328-35 (1998); y Sahoo et al., Drug Discovery Today, 13: 144-51(2008). Otros excipientes pueden ser útiles como estabilizadores y pueden incluir, por ejemplo, glicerina, cloruro de potasio, fosfato de potasio, propilenglicol, acetato de sodio, bisulfito de sodio, borato de sodio, borato de sodio decahidratado, cloruro de sodio, citrato de sodio, fosfato de sodio, fosfato de sodio (incluyendo fosfato de sodio monobásico y dibásico); cloruro de cinc, fenol, benzoato, derivados de aceite de ricino y óxidos de etileno y Cremophor® (BASF Corp., Alemania).

Las composiciones farmacéuticas que se presentan en la invención se pueden formular en una diversidad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semisólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infusibles), dispersiones o suspensiones, incluyendo nanopartículas y liposomas. La forma dependerá generalmente del modo de administración y aplicación terapéutica previstos. Las composiciones para los agentes que se describen en el presente documento se encuentran generalmente en forma de soluciones inyectables o infusibles, o se formulan para administración tópica, por ejemplo, administración ocular tópica.

En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que se describe en el presente documento es estéril y estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento. Una composición farmacéutica también se puede someter a ensayo para garantizar que cumpla con los estándares reguladores y de la industria para su administración. La composición se puede formular como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para concentraciones elevadas de fármaco (por ejemplo, un producto biológico). Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando un agente que se describe en el presente documento en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando un agente que se describe en el presente documento en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, algunos métodos de preparación a modo de ejemplo incluyen secado al vacío y liofilización que proporciona un polvo de un agente que se describe en el presente documento más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución previamente esterilizada filtrada del mismo. La fluidez apropiada de una solución se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La absorción prolongada de composiciones inyectables se puede diseñar por ingeniería mediante la inclusión de un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. Un agente de ese tipo puede ser particularmente útil en una formulación de dosis baja. En una realización, la formulación comprende < 1 mg/ml de una proteína terapéutica (por ejemplo, una citoquina quimérica, por ejemplo, P05) y la gelatina está incluida en la formulación.

En ciertas realizaciones, se prepara una formulación con un vehículo, por ejemplo, para extender la farmacocinética (PK) de un polipéptido de citoquina quimérica (por ejemplo, tal como se evalúa basándose en su vida media en el cuerpo, por ejemplo, en el ojo, por ejemplo, en la córnea). En tales realizaciones, el polipéptido de citoquina quimérica se puede administrar, por ejemplo, como una formulación de liberación controlada, administrada mediante un implante o un sistema de administración microencapsulado. Se pueden usar polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como etileno acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.

Una característica de las formulaciones que se describen en el presente documento es que no contienen conservantes. En general, los conservantes pueden afectar al polipéptido de citoquina quimérica, por ejemplo, provocando cambios en la estructura del polipéptido. Además, los conservantes pueden provocar en un sujeto, por ejemplo, una respuesta inflamatoria, que es antitética al efecto del tratamiento deseado. Las formulaciones se esterilizan, se almacenan y se envasan en sus envases finales en condiciones estériles.

Formulaciones de vehículo

Los solicitantes también han descubierto de forma inesperada que una formulación tal como se describe en el presente documento que no contiene una proteína terapéutica (por ejemplo, una formulación solo de vehículo) es útil para tratar uno o más signos o síntomas de enfermedad ocular, por ejemplo, enfermedad de ojo seco, por ejemplo, signos o síntomas de la enfermedad del ojo seco que se describen en el presente documento. En algunas realizaciones, una formulación de un vehículo comprende un tensioactivo, un agente de tonicidad y un agente de tamponamiento. En algunas de tales realizaciones, la formulación es eficaz para disminuir el dolor (por ejemplo, dolor tal como se evalúa usando la puntuación de pregunta de dolor o una escala analógica visual), el OSDI o una subescala del OSDI. En algunas realizaciones, la formulación disminuye la tinción corneal con fluoresceína (CFS). Como se usa en el presente documento, la expresión "formulación solo de vehículo" se refiere específicamente a una formulación que se describe en el presente documento que está básicamente exenta de componentes proteicos o peptídicos, por ejemplo, no contiene una proteína terapéutica. Se debe entender que una formulación de vehículo que se describe en el presente documento puede contener cualquier proteína terapéutica, por ejemplo, un polipéptido terapéutico.

En algunas realizaciones, la formulación de vehículo, por ejemplo, la formulación solo de vehículo, comprende básicamente un tensioactivo (por ejemplo, poloxámero 188), un agente de tonicidad (por ejemplo, sorbitol), y un agente de tamponamiento (por ejemplo, citrato de sodio). En realizaciones, la formulación de vehículo está básicamente exenta de proteína. En realizaciones, la formulación de vehículo está básicamente exenta de proteína o péptido terapéuticos. En realizaciones, la formulación de vehículo no contiene un agente de viscosidad.

Los tensioactivos, agentes de tonicidad y agentes de tamponamiento útiles incluyen los que se desvelan en el presente documento. En algunas realizaciones, el tensioactivo es poloxámero 188, el agente de tonicidad es sorbitol y el agente de tamponamiento es citrato de sodio y/o fosfato de sodio.

En realizaciones, el agente de tamponamiento está presente en una concentración de 20 mM o menor.

En algunas realizaciones, la formulación de vehículo comprende poloxámero 188 aproximadamente al 0,1 % p/v, sorbitol aproximadamente al 5 % p/v, y citrato de sodio p/v aproximadamente 10 mM. En realizaciones, los componentes de una formulación de vehículo descrita en el presente documento están presentes en cantidades que pueden variar alrededor de los valores que se proporcionan en el presente documento hasta un 5 %, un 10 %, un 15 %, un 20 %, un 25 %, un 30 %, un 40 %, o un 50 %. En realizaciones, los componentes de una formulación de vehículo están presentes en cantidades que pueden variar alrededor de los valores que se proporcionan en el presente documento en un 10 %. En algunas realizaciones, la formulación de vehículo es una formulación acuosa que consiste en citrato de sodio 10 mM, pH 6,0, sorbitol al 5 % (p/v), y poloxámero 188 al 0,1 %.

En realizaciones, la formulación de vehículo comprende fosfato de sodio o citrato de sodio 9,5-10,5 mM, 9-11 mM, 8,5-11,5 mM, 8-12 mM, 7,5-12,5 mM, 7-13 mM, 6-14 mM, o 5-15 mM. En realizaciones, la formulación de vehículo comprende citrato de sodio 9,5-10,5 mM, 9-11 mM, 8,5-11,5 mM, 8-12 mM, 7,5-12,5 mM, 7-13 mM, 6-14 mM, o 5 15 mM. En realizaciones, la formulación de vehículo comprende un 4,75-5,25 %, un 4,5-5,5 %, un 4,25-5,75 %, un 4 6 %, un 3,75-6,25 %, un 3,5-6,5 %, un 3-7 %, o un 2,5-7,5 % p/v de sorbitol. En realizaciones, la formulación de vehículo comprende un 0,095-0,105 %, un 0,09-0,11 %, un 0,085-0,115 %, un 0,08-0,12 %, un 0,075-0,125 %, un 0,07-0,13 %, un 0,06-0,14 %, o un 0,05-0,15 % p/v de poloxámero 188.

En realizaciones, el pH de la formulación de vehículo es de 5,5 a 7,5, En realizaciones, el pH es de 5,5 a 6,5. En realizaciones, el pH es de 6 a 7. En realizaciones, la formulación comprende citrato de sodio 8-12 mM, sorbitol al 4 6 % p/v, poloxámero 188 al 0,08-0,12 % p/v, y tiene un pH de 5,5 a 7,5, por ejemplo, un pH de 5,5 a 6,5.

En realizaciones, la formulación de vehículo comprende citrato de sodio 9-11 mM, sorbitol al 4,5-5,5 % p/v, poloxámero 188 al 0,09-0,11 % p/v, y tiene un pH de 5,5, la 7,5, por ejemplo, un pH de 5,5 a 6,5. En realizaciones, la formulación de vehículo comprende citrato de sodio 7-13 mM, sorbitol al 3,5-5,5 % p/v, poloxámero 188 al 0,07 0,13 % p/v, y tiene un pH de 5,5, a 7,5, por ejemplo, un pH de 5,5 a 6,5.

En realizaciones, la formulación de vehículo no contiene un agente de viscosidad.

En realizaciones, la formulación de vehículo comprende un agente de viscosidad, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio (CMC). En realizaciones, la formulación de vehículo comprende c Mc , por ejemplo, CMC en una concentración de un 0,1-1 % p/v, un 0,1-0,5 % p/v, o un 0,2-0,3 % p/v.

En algunas realizaciones, la formulación de vehículo comprende poloxámero 188 al 0,1 % p/v, sorbitol al 5 % p/v, carboximetilcelulosa de sodio al 0,25 % p/v y fosfato de sodio 10 mM. En realizaciones, la formulación de vehículo tiene un pH de aproximadamente 6,5. En realizaciones, los componentes de la formulación están presentes en cantidades que pueden variar alrededor de los valores proporcionados hasta un 5 %, un 10 %, un 15 %, un 20 %, un 25 %, o un 30 %. En algunas realizaciones, la formulación de vehículo consiste en poloxámero 188 al 0,1 % p/v, sorbitol al 5 % p/v, carboximetilcelulosa de sodio al 0,25 % p/v y fosfato de sodio 10 mM.

En realizaciones, la formulación comprende poloxámero 188 al 0,08-0,12 % p/v, sorbitol al 4-6 % p/v, carboximetilcelulosa de sodio al 0,2-0,3 % p/v y fosfato de sodio 8-10 mM. En realizaciones, la formulación tiene un pH de 5,5-7,5, por ejemplo, un pH de 5,5-6,5.

Administración

En algunas realizaciones, una formulación presentada en el presente documento, por ejemplo, una formulación que contiene una proteína terapéutica tal como un inhibidor de IL-1 quimérica o una formulación de vehículo, se administra por vía tópica a un sujeto, por ejemplo, un ser humano u otro mamífero tal como un perro, gato o caballo, y, por ejemplo, se administra en el ojo. En general, una formulación que se describe en el presente documento se puede administrar a un sujeto, mediante cualquier método adecuado, tal como administración intravenosa como un bolo o mediante infusión continua durante un periodo de tiempo, por vía intramuscular, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, intrasinovial, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, inyección epidural, inyección intraesternal e infusión. Otros modos de administración adecuados incluyen las vías tópica (por ejemplo, dérmica o mucosa) o inhalatoria (por ejemplo, intranasal o intrapulmonar). Para determinadas aplicaciones, la vía de administración es una de: inyección o infusión intravenosa, inyección subcutánea o inyección intramuscular. Para la administración en el ojo, en algunas realizaciones, el modo de administración de una formulación presentada en el presente documento (por ejemplo, la formulación de una citoquina quimérica que se describe en el presente documento) es la administración tópica en el ojo, por ejemplo, en forma de gotas. Algunos ejemplos de dispositivos que pueden contener la formulación y/o se pueden usar para la administración de la formulación incluyen cuentagotas simples, frascos exprimibles con o sin función dosificadora y dispositivos de soplado/llenado/sellado (blow/fill/seal) (BFS) tales como los fabricados por Catalent (Somerset, NJ), dispositivos de múltiples usos que usan, por ejemplo tecnología tip-seal (sellado con punta), tecnología de plata/oligodinámica, filtros estériles, envases primarios colapsantes, y similares.

Otra consideración para una formulación es minimizar la adherencia al dispositivo de administración o al envase. Por ejemplo, la adición de tensioactivo, por ejemplo, poloxámero 188 puede minimizar la adherencia de P05 a un envase.

Una consideración adicional para un envase es que proporciona una vida útil aceptable una vez que se llena, por ejemplo, hay un nivel aceptablemente bajo de evaporación y/o la formulación satisface las especificaciones del ensayo de liberación, por ejemplo, especificaciones tal como se describen en el presente documento. En realizaciones, el envase es adecuado para proporcionar una vida útil de al menos dos años, por ejemplo, al menos 3 años, al menos 4 años, o al menos 5 años, por ejemplo, a 5 °C. En realizaciones, el envase es adecuado para proporcionar una vida útil de al menos 3 años a 5 °C. En realizaciones, el envase es adecuado para proporcionar una vida útil de al menos 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 8 meses, 10 meses, o 12 meses a RT. En realizaciones, el envase es adecuado para proporcionar una vida útil de al menos 5 meses a RT. En la técnica se conocen diversos materiales de envase adecuados, por ejemplo, ciertos plásticos, por ejemplo, polietileno de baja densidad (LDPE), polietileno de alta densidad (HDPE) o polipropileno.

La formulación se puede preparar para una aplicación de un solo uso en un envase o se puede preparar para su uso en un envase de múltiples usos.

Una formulación presentada en el presente documento se puede administrar por vía intravítrea, por ejemplo, para tratar trastornos que están asociados, por ejemplo, al segmento posterior del ojo. En la técnica se conocen métodos de administración intravítrea e incluyen, por ejemplo, inyección intraocular, dispositivos implantables.

En realizaciones, la formulación se administra por vía intravítrea usando un dispositivo implantable. En realizaciones, la formulación comprende un estabilizador térmico, por ejemplo, sorbitol. En realizaciones, el sorbitol está presente en una concentración de >5 % p/v.

Algunos dispositivos implantables pueden ser, por ejemplo, dispositivos no biodegradables tales como polímeros de alcohol polivinílico-etileno acetato de vinilo y fibras capilares de polisulfona, dispositivos biodegradables tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico y ácido poliláctico-co-glicólico, policaprolactonas y polianhídridos. Algunos dispositivos se pueden administrar en formas tales como nanopartículas, liposomas o microesferas.

Una formulación que se presenta en la invención se puede administrar como una dosis fija, como una dosis determinada por el peso (por ejemplo, mg/kg), o como una dosis determinada por la edad. Las formulaciones, por ejemplo, una formulación de vehículo o una formulación terapéutica (una formulación que incluye un agente terapéutico tal como una proteína terapéutica) se pueden administrar, por ejemplo, cuatro veces al día; tres veces al día; dos veces al día; una vez al día; cada dos días; cada tres, cuatro o cinco días; cada semana; cada dos semanas; cada tres semanas; cada cuatro semanas; cada cinco semanas; de forma mensual; cada dos meses; cada tres meses; cada cuatro meses; cada seis meses; o según sea necesario (una voluntad).

En realizaciones, la formulación se administra una, dos o tres veces al día. En algunas de tales realizaciones, la formulación se administra por vía tópica, por ejemplo, en la superficie del ojo. Una composición farmacéutica puede incluir una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente se describe en el presente documento. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del compuesto para provocar una respuesta deseada en el individuo, por ejemplo, una mejora de al menos un parámetro del trastorno (por ejemplo, signo), o mejora de al menos un síntoma del trastorno (y opcionalmente el efecto de cualquier agente adicional que se esté administrando). Una cantidad terapéuticamente eficaz también es una en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial de la composición se ve compensado por los efectos terapéuticamente beneficiosos. En algunas realizaciones, se determina una "cantidad terapéuticamente eficaz" en una población de individuos y la cantidad es eficaz para mejorar al menos un síntoma o indicación de un trastorno relacionado con citoquinas, por ejemplo, un trastorno relacionado con IL-1 en al menos un 5 %, un 10 %, un 25 %, un 50 %, un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, o un 100 % de una población afectada. Generalmente, una formulación se administra en una cantidad terapéuticamente eficaz. En algunos casos, una formulación terapéuticamente eficaz es una formulación de vehículo. En algunos casos, una formulación terapéuticamente eficaz comprende una proteína terapéutica.

En algunas realizaciones, la formulación se administra a un sujeto que tiene un trastorno relacionado con IL-1 y el polipéptido de citoquina quimérica comprende fragmentos de secuencias de IL-1 p e Il-1Ra. Una formulación de ese tipo contiene, por ejemplo, 5 mg/ml a 20 mg/ml, 5 mg/ml o 20 mg/ml del polipéptido. En realizaciones, la formulación se administra por vía tópica en el ojo una vez, dos veces, tres, cuatro, cinco o seis veces al día. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar usando dispositivos médicos tal como se describe en el presente documento y como se conoce en la técnica, por ejemplo, implantes, bombas de infusión, agujas hipodérmicas y dispositivos de inyección hipodérmica sin aguja. Un dispositivo puede incluir, por ejemplo, una o más carcasas para almacenar composiciones farmacéuticas y se puede configurar para administrar dosis unitarias del polipéptido de citoquina quimérica y, opcionalmente, un segundo agente. Las dosis pueden ser dosis fijas, es decir, unidades físicamente separadas adecuadas como canciones unitarias para los sujetos a tratar; cada unidad puede contener una cantidad determinada previamente de polipéptido de citoquina quimérica calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con un vehículo farmacéutico y opcionalmente en asociación con otro agente, por ejemplo, Restasis® o lágrimas artificiales tales como las disponibles como productos sin receta médica o con receta médica.

En algunas realizaciones, para tratar un trastorno que se describe en el presente documento, tal como un trastorno relacionado con Il-1, la formulación se administra a un sujeto que padece el trastorno en una cantidad y durante un periodo de tiempo suficientes para inducir una mejora sostenida en al menos un signo o síntoma del trastorno. Se considera que una mejora es "sostenida" si el sujeto exhibe la mejora durante un periodo de tiempo prolongado, por ejemplo, en al menos dos ocasiones separadas por una a cuatro semanas. El grado de mejoría se puede determinar basándose en signos o síntomas, y también se pueden emplear cuestionarios que se proporcionan al sujeto, tales como cuestionarios de calidad de vida. En un ejemplo no limitante, el polipéptido de citoquina quimérica comprende fragmentos de una IL-1p y una IL-IRa y se administra por vía tópica al menos una vez a la semana, por ejemplo, al menos una vez al día, al menos dos veces al día, o al menos tres veces al día.

Una mejora se puede inducir administrando repetidamente una dosis de la formulación hasta que el sujeto manifieste una mejora con respecto al valor inicial para los signos y/o síntomas seleccionados. En el tratamiento de afecciones crónicas, la cantidad de mejora se puede evaluar mediante la administración repetida durante un periodo de tiempo de al menos un mes o más, por ejemplo, durante uno, dos o tres meses o más, o de forma indefinida. En el tratamiento de una afección aguda, el agente se puede administrar durante un periodo de tiempo de una a seis semanas o incluso como una dosis única.

Aunque pueda parecer que el alcance del trastorno después de un tratamiento inicial o intermitente ha mejorado de acuerdo con uno o más signos o síntomas, el tratamiento puede continuar indefinidamente al mismo nivel o con una dosis o frecuencia reducida. El tratamiento también se puede interrumpir, por ejemplo, tras la mejoría o desaparición de los signos o síntomas. Una vez que se ha reducido o interrumpido el tratamiento, se puede reanudar si los síntomas reaparecen.

Tratamientos

Las formulaciones presentadas en presente documento comprenden una proteína terapéutica. En realizaciones, las formulaciones comprenden un agente de unión a receptor quimérico (por ejemplo, una citoquina quimérica) tal como uno que se puede unir a una IL-1R y que puede antagonizar la señalización de IL-1, y por lo tanto se puede usar para tratar un "trastorno relacionado con IL-1", que incluye cualquier enfermedad o afección médica que (i) sea causada al menos en parte por el agonismo de IL-1, (ii) esté asociada a niveles o actividad elevados de un componente de señalización de IL-1 (tal como IL -1a, IL-1 p o IL-1RI) o señalización elevada de IL-1, y/o (iii) mejora disminuyendo la actividad de IL-1. Algunos trastornos relacionados con IL-1 incluyen trastornos agudos y crónicos, incluyendo trastornos autoinmunitarios y trastornos inflamatorios. Algunos trastornos relacionados con IL-1 incluyen trastornos sistémicos y no sistémicos. Está bien establecido que IL-1a e IL-1p son citoquinas proinflamatorias potentes implicadas en respuestas infecciosas así como en enfermedades inflamatorias, que incluyen, por ejemplo, artritis reumatoide. En pacientes con ciertos trastornos autoinmunitarios, isquemia y diversos cánceres se ha observado un aumento de la producción de IL-1, implicando por lo tanto a IL-1 en estas y otras enfermedades relacionadas (por ejemplo, véase Sims y Smith, Nature Rev Immunol, 10: 89-102 (2010)).

Como se usa en el presente documento, el término "tratar" se refiere a la administración de un agente que se describe en el presente documento a un sujeto, por ejemplo, un paciente, en una cantidad, manera y/o modo eficaz para mejorar una afección, síntoma o parámetro asociado a un trastorno, por ejemplo, un trastorno que se describe en el presente documento, o para prevenir la aparición o progresión de un trastorno, en un grado estadísticamente significativo o en un grado detectable por un experto en la materia. El tratamiento puede ser curar, sanar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, mejorar, paliar, favorecer o influir en el trastorno, los síntomas del trastorno o la predisposición al trastorno. Una cantidad, manera o modo eficaz puede variar dependiendo del sujeto y se puede adaptar al sujeto. Los sujetos a modo de ejemplo incluyen seres humanos, primates y otros mamíferos no humanos. Una formulación que se presenta en la invención también se puede administrar de forma profiláctica para reducir el riesgo de aparición de un trastorno o síntoma o signo del mismo.

El trastorno relacionado con IL-1 puede ser un trastorno autoinmunitario. Algunos ejemplos de trastornos autoinmunitarios relacionados con IL-1 incluyen artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, síndrome de Behget, enfermedades inflamatorias intestinales (incluyendo la enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa), asma, psoriasis, diabetes de tipo I, algunas formas de acné y otros trastornos identificados en el presente documento. Las formulaciones que se describen en el presente documento se pueden administrar a un sujeto que tenga o esté en riesgo de padecer tales trastornos autoinmunitarios mediados por IL-1. El trastorno mediado por IL-1 puede ser un trastorno inflamatorio tal como se describe a continuación. Las formulaciones que se describen en el presente documento se pueden administrar a un sujeto que tenga o esté en riesgo de padecer tales trastornos inflamatorios mediados por IL-1.

Las formulaciones que se presentan en la invención son particularmente adecuadas para uso en trastornos oculares, por ejemplo, trastornos oculares en los que se desea administrar el receptor de citoquina quimérica directamente en el ojo, o localmente en el área del ojo. Algunos trastornos oculares relacionados con IL-1 a modo de ejemplo incluyen el síndrome de Sjogren (por ejemplo, queratoconjuntivitis seca asociada al síndrome de Sjogren), trastornos de ojo seco que incluyen queratoconjuntivitis seca (asociada a Sjogren o no asociada a Sjogren), queratitis seca, síndrome sicca, xeroftalmia, trastorno de la película lagrimal, disminución de la producción de lágrimas, deficiencia de la lágrima acuosa, ojo seco asociado a la enfermedad de injerto contra huésped y disfunción de la glándula de Meibomio. Los sujetos que tienen un trastorno de ojo seco pueden presentar inflamación del ojo y pueden experimentar sensaciones de picor, escozor, prurito, quemazón o presión, irritación, dolor y enrojecimiento. Los trastornos del ojo seco pueden estar asociados a lagrimeo excesivo y una producción insuficiente de lágrimas. Una formulación que se presenta en la invención se puede administrar a tal sujeto para mejorar o prevenir la aparición o empeoramiento de uno o más de tales síntomas. Una formulación que se presenta en la invención también se puede usa para mitigar el dolor, por ejemplo, dolor ocular, tal como el dolor debido a neuroinflamación, en un sujeto.

Las realizaciones que se describen en el presente documento incluyen métodos para tratar animales que tienen trastornos relacionados con IL-1, por ejemplo, trastornos de ojo seco. El ojo seco puede ser un trastorno grave en, por ejemplo, caninos. Algunos ejemplos no limitantes de trastornos en perros asociados al ojo seco incluyen trastornos congénitos, infecciones (por ejemplo, virus del moquillo canino), inducción por fármacos (por ejemplo, por antibióticos sulfa) y extirpación de la glándula lagrimal del tercer párpado ("ojo de cereza"). Algunos trastornos de ojo seco también se observan comúnmente en ciertas razas de perros, por ejemplo, Cocker Spaniel, Shih Tzu, Lhasa Apso, Bulldog, Schnauzer y West Highland White Terrier. Otros ejemplos no limitantes de animales que se pueden tratar incluyen gatos y caballos.

Las formulaciones presentadas en el presente documento también se pueden usar para tratar otros trastornos que afectan a la superficie del ojo, tal como la córnea. Tales trastornos incluyen afecciones inflamatorias de la superficie ocular corneal, neovascularización corneal, queratitis, incluyendo queratitis ulcerosa periférica y queratitis microbiana. Las formulaciones se pueden usar para tratar a un sujeto que experimenta la curación de una herida en la córnea (por ejemplo, un sujeto que tiene una herida en la córnea). La formulación se puede administrar a un sujeto que está a punto de recibir, se va a someter o se está recuperando de un procedimiento que implica al ojo, por ejemplo, trasplante/queratoplastia corneal, cirugía de queratoprótesis, trasplante laminar, trasplante endotelial selectivo. Véase, por ejemplo, Dana (2007) Trans Am Ophthalmol Soc 105: 330-43; Dekaris et al. (1999) Curr Eye Res 19(5): 456-9; y Dana et al. (1997) Transplantation 63:1501-7.

La formulación se puede usar para tratar trastornos que afectan a la conjuntiva, incluyendo trastornos de cicatrización conjuntival y conjuntivitis, por ejemplo, conjuntivitis alérgica, por ejemplo, conjuntivitis alérgica grave. La formulación se puede usar para tratar otros trastornos tales como el síndrome penfigoide y el síndrome de Stevens-Johnson. Las formulaciones que se presentan en la invención se pueden administrar a un sujeto para modular la neovascularización dentro o alrededor del ojo. Véase, por ejemplo, Dana (2007) T rans Am Ophthalmol Soc 105: 33043 .

Las formulaciones de la presente invención se pueden administrar a un sujeto que tiene una reacción alérgica que afecta al ojo, por ejemplo, un sujeto que experimenta una enfermedad ocular alérgica (atópica) grave tal como, por ejemplo, conjuntivitis alérgica. Por ejemplo, la formulación se puede administrar por vía tópica. Véase también, por ejemplo, Keane-Myers et al. (1999) Invest Ophthalmol Vis Sci, 40(12): 3041-6.

Las formulaciones que se presentan en la invención se puede administrar a un sujeto que tiene un trastorno autoinmunitario que afecta al ojo. Algunos trastornos oculares autoinmunitarios a modo de ejemplo incluyen oftalmia simpática, síndrome de Vogt-Koyanagi Harada (VKH), retinocoriodopatía en perdigonada, penfigoide cicatricial ocular, iridociclitis heterocrónica de Fuchs y diversas formas de uveítis. Las formulaciones se pueden administrar a un sujeto para tratar cualquiera de los trastornos mencionados anteriormente.

Las formulaciones que se presentan en la invención se pueden administrar a un sujeto que tiene o que presenta riesgo de tener retinopatía diabética. Véanse, por ejemplo, Demircan et al. (2006) Eye 20: 1366-1369 y Doganay et al. (2006) Eye, 16: 163-170.

Uveítis. La uveítis incluye formas agudas y crónicas e incluye inflamación de uno o más del iris, el cuerpo ciliar y la coroides. Las formas crónicas pueden estar asociadas a enfermedad autoinmunitaria sistémica, por ejemplo, síndrome de Behqet, espondilitis anquilosante, artritis reumatoide juvenil, síndrome de Reiter y enfermedad inflamatoria intestinal. En la uveítis anterior, la inflamación se encuentra principalmente en el iris (también iritis). La uveítis anterior puede afectar a sujetos que tengan una enfermedad autoinmunitaria sistémica, pero también a sujetos que no tengan una enfermedad autoinmunitaria sistémica. La uveítis intermedia implica la inflamación del vítreo anterior, la retina periférica y el cuerpo ciliar, a menudo con poca inflamación anterior o coriorretiniana. La pars planitis es el resultado de la inflamación de la pars plana entre el iris y la coroides. La uveítis posterior afecta el tracto uveal y principalmente a la coroides, y también se conoce como coroiditis. La uveítis posterior puede estar asociada a una infección sistémica o una enfermedad autoinmunitaria. Puede persistir durante meses e incluso años. Las formulaciones que se presentan en la invención se pueden administrar a un sujeto para tratar cualquiera de las formas de uveítis mencionadas anteriormente. Véanse también, por ejemplo, Tsai et al. (2009) Mol Vis 15: 1542 1552 y Trittibach et al. (2008) Gene Ther. 15(22): 1478-88.

En algunas realizaciones, las formulaciones que se presentan en la invención se usan para tratar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de padecer degeneración macular relacionada con la edad (AMD). Las formulaciones se pueden aplicar por vía tópica en el ojo, inyectadas (por ejemplo, por vía intravítrea) o por día sistémica. Véase, por ejemplo, Olson et al. (2009) Ocul Immunol Inflamm 17(3): 195-200.

Una formulación que se describe en el presente documento se puede administrar mediante cualquier modo para tratar una enfermedad ocular. El agente se puede administrar por vía parenteral. Alternativamente o además, la formulación se puede administrar directamente en el ojo o en las proximidades del ojo. Por ejemplo, la formulación se puede administrar por vía tópica o por vía intraocular, por ejemplo, tal como se describe en el presente documento.

Formulaciones y métodos para administración ocular

Las formulaciones oftálmicas que se presentan en la invención se pueden suministrar para administración tópica, por ejemplo, para administración en forma de gota líquida, pomada, o un gel, o para implante, por ejemplo, en una cámara anterior del ojo o el saco conjuntival. Las gotas, tal como gotas líquidas, se pueden administrar con un cuentagotas ocular. Los geles y pomadas también se pueden administrar con un cuentagotas. Cuando se formula para administración ocular, un agente activo (por ejemplo, la proteína citoquina quimérica o agente de unión a receptor) puede estar presente en una concentración de un 0,0001 % a un 0,1 %, de un 0,001 % a un 5 %, por ejemplo, de un 0,005 % a un 0,5 %, de un a un 0,05 % a un 0,5 %, de un 0,01 % a un 5 %, de un 0,1 % a un 2 % o de un 1 % a u n 5 %. En algunas realizaciones, la concentración es un 2 %, por ejemplo, de P05. En otras realizaciones, la concentración es un 0,5 %, por ejemplo, de P05.

En algunas realizaciones, el agente de unión a receptor, por ejemplo, P05 se formula sobre una base de mg/ml, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, el agente activo, por ejemplo, el agente de unión a receptor, es un inhibidor de IL-1 y está presente en una concentración de 1-50 mg/ml, 1-25 mg/ml, 1-20 mg/ml, 1 10 mg/ml, 2-8 mg/ml, 3-7 mg/ml, o 4-6 mg/ml. En realizaciones, el agente activo está presente en una concentración de 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 8 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, o 50 mg/ml. En realizaciones, el agente activo, por ejemplo, el inhibidor de IL-1, está presente en una concentración de hasta 100 mg/ml.

En general, la formulación oftálmica se aplica directamente en el ojo incluso sobre la córnea, el párpado o mediante instilación en el espacio (fondo de saco) entre el globo ocular y los párpados. La formulación oftálmica se puede diseñar para que se mezcle fácilmente con los fluidos lagrimales y se extienda sobre las superficies de la córnea y la conjuntiva. Con la técnica de administración habitual, la mayor parte del fármaco se deposita generalmente en el fórnix inferior. La capilaridad, las fuerzas de difusión y el reflejo del parpadeo impulsan la incorporación del fármaco en la película precorneal desde la que penetra en la córnea y la atraviesa.

Las formulaciones oftálmicas que se presentan en la invención también pueden incluir uno o más agentes, por ejemplo, un esteroide antiinflamatorio tal como rimexolona, loteprednol, medrisona e hidrocortisona, o un antiinflamatorio no esteroideo. Por ejemplo, el esteroide puede estar presente en una concentración de un 0,001 % a un 1 %. En algunas realizaciones, no hay esteroides. Por ejemplo, el agente de unión a receptor es el único agente activo en la formulación.

La formulación también puede incluir uno o más de los siguientes componentes tal como se describe en el presente documento: tensioactivos, agentes de tonicidad, tampones, conservantes, codisolventes y agentes de formación de viscosidad. Se pueden usar agentes de tonicidad para ajustar la tonicidad de la composición, por ejemplo, a la de las lágrimas naturales. Algunos agentes de tonicidad, en particular azúcares, también pueden funcionar como estabilizadores térmicos. En realizaciones, se pueden añadir cloruro de potasio, cloruro de sodio, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, dextrosa y/o manitol para lograr una tonicidad adecuada, por ejemplo, tonicidad fisiológica. Los agentes de tonicidad se pueden añadir en una cantidad suficiente para proporcionar una osmolalidad apropiada tal como se describe en el presente documento. En realizaciones, se añade un agente de tonicidad para proporcionar una osmolalidad de aproximadamente 150 mOsm por kg a 450 mOsm por kg o de 250 mOsm por kg a 350 mOsm por kg. En realizaciones, se añade un agente de tonicidad para proporcionar una osmolalidad que es isotónica en el ojo. En realizaciones, se añade un agente de tonicidad, por ejemplo, sorbitol, para proporcionar una osmolalidad de 270-330 mOsm por kg.

La formulación también puede incluir tamponamiento adecuado para administración oftálmica y tal como se describe en el presente documento. El tampón puede incluir uno o más componentes de tamponamiento tales como citrato, fosfato, borato, ácido bórico, succinato, acetato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo (por ejemplo, fosfato de sodio, acetato de sodio, citrato de sodio, borato de sodio, succinato de sodio, o acetato de sodio), a cambios en el pH. El componente de tamponamiento se puede usar especialmente en condiciones de almacenamiento, por ejemplo, cuando la formulación se someterá a un almacenamiento prolongado. Por ejemplo, el tampón se puede seleccionar para proporcionar un pH objetivo dentro del intervalo de pH 5,5-6,5, pH 5,5-6,0, pH 6,0 a 7,5, o pH 6,5 a 7,5, Generalmente, el agente de tamponamiento es un agente de tamponamiento débil, en donde la concentración de los componentes de tamponamiento es inferior a 20 mM. En realizaciones, la concentración de los componentes de tamponamiento está entre aproximadamente 5 y 20 mM, por ejemplo, de 5 a 15 mM, por ejemplo, de 5 a 10 mM.

La formulación que comprende una proteína terapéutica puede incluir un vehículo acuoso o fosfolipídico. En particular para el tratamiento de trastornos de ojo seco, la formulación puede incluir agentes para proporcionar alivio a corto plazo, por ejemplo, compuestos que lubrican el ojo y ayudan a la formación de lágrimas. Por ejemplo, para proporcionar alivio a corto plazo se pueden usar vehículos fosfolipídicos (que incluyen uno o más fosfolípidos). Algunos ejemplos o composiciones de lágrimas artificiales útiles como vehículos de lágrimas artificiales incluyen productos comerciales tales como Tears Naturale® (Alcon Labs, Inc., TX EE. UU.). Por ejemplo, por ml, la formulación puede incluir: 1 mg de dextrano, 70 y 3 mg de hidroxipropilmetilcelulosa y, opcionalmente, un conservante tal como POLYQUAD® (policuaternio-1) al 0,001 % (m/v). Algunos ejemplos de formulaciones de vehículos de fosfolipídicos incluyen las que se desvelan en los documentos de patente de Estados Unidos U.S.

4.804.539, U.S. 4.883.658, U.S. 5.075.104, U.S. 5.278.151 y U.S. 5.578.586.

La formulación también puede incluir otros compuestos que actúen como agente lubricante o humectante. Estos incluyen agentes de viscosidad tales como: polioles monoméricos, tales como, glicerol, propilenglicol, etilenglicol; polioles poliméricos, tal como polietilenglicol, diversos polímeros de la familia de la celulosa: hidroxipropilmetilcelulosa ("HPMC"), carboximetilcelulosa de sodio, hidroxipropilcelulosa ("HPC"), dextranos, tal como dextrano 70; proteínas solubles en agua, tal como gelatina; y polímeros vinílicos, tales como alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, povidona y carbómeros, tales como carbómero 934P, carbómero 941; carbómero 940, carbómero 974P. Otros ejemplos adicionales incluyen polisacáridos, tales como ácido hialurónico y sus sales y sulfato de condroitina y sus sales, y polímeros de ácido acrílico. En ciertas realizaciones, la formulación tiene una viscosidad entre 1 cP y 400 cP.

La formulación, por ejemplo, una formulación de vehículo, se puede envasar para uso de una sola dosis o de múltiples dosis, por ejemplo, en un frasco con un gotero asociado o como un conjunto de goteros de un solo uso. La formulación puede incluir uno o más conservantes, por ejemplo, para evitar la contaminación microbiana y fúngica durante su uso, y/o uno o más detergentes, o tensioactivos, por ejemplo, para solubilizar proteínas. Algunos conservantes a modo de ejemplo incluyen: cloruro de benzalconio, clorobutanol, bromuro de benzododecinio, metilparabeno, propilparabeno, alcohol feniletílico, edetato disódico, ácido sórbico y policuaternio-1, y se pueden incluir en una concentración de un 0,001 p/v a un 1,0 % p/v. Generalmente, Generalmente, una formulación que contiene una proteína terapéutica tal como se describe en el presente documento es estéril pero sin conservantes. Algunos detergentes/tensioactivos a modo de ejemplo incluyen Pluronics®, tal como F-68; tensioactivos Triton®, tal como Tritón X-100, polisorbatos, tales como Tween-20 y Tween-80, Elugent™, y aceite de ricino polietoxilado Cremophor®, así como tiloxapol, octoxinol 40 y estearato de polioxilo 40.

En general, se pueden incluir detergentes y/o tensioactivos en una concentración de un 0,001 % p/v a un 1,0 % p/v. En algunos aspectos, la formulación está exenta de detergentes.

Se pueden usar masas compactas oftálmicas para proporcionar un contacto prolongado de una formulación oftálmica con el ojo. Una compresa de algodón se satura con la formulación y a continuación se inserta en el fórnix superior o inferior. La formulación también se puede administrar mediante iontoforesis. Este procedimiento mantiene la solución en contacto con la córnea en un lavaojos que lleva un electrodo. La difusión del fármaco se efectúa por diferencia de potencial eléctrico. Algunos sistemas iontoforéticos que se han usado incluyen Ocuphor®1 (Iomed Inc., EE. UU.); sistema 1 de administración Eyegate® II (EyeGate Pharma, EE. UU.); y Visulex®1 (Aciont Inc., EE. UU.). Véase Amo y Urtti, Drug Discovery Today, 13: 143 (2008).

Otra estrategia para la administración ocular sostenida es el uso de agentes gelificantes. Estos materiales se pueden administrar en forma líquida, como una gota ocular o inyección intraocular. Después de la instilación, el polímero sufre un cambio de fase y forma una matriz semisólida o sólida que libera el fármaco durante un periodo de tiempo prolongado. La transición de fase puede ser inducida por cambios en la temperatura, concentración iónica o pH. Para uso ocular tópico, las soluciones formadoras de gel, tal como Timoptic®-XE1 (Merck and Co. Inc., EE. UU.), que contiene Gelrite® (heteropolisacárido aniónico purificado de goma gelana); las gotas oculares Pilogel®1 (Alcon, Inc., Suiza) contienen poli(ácido acrílico); y Azasite®1 (Insite Vision, EE. UU.) se han sometido a ensayo clínico. Estos materiales mejoran la retención del fármaco en comparación con las gotas oculares convencionales y conducen a una mayor absorción del fármaco en el ojo y a una frecuencia de dosificación reducida. Véase Amo y Urtti, Drug Discovery Today, 13: 135-143 (2008).

Una formulación que se presenta en la invención se puede administrar mediante inyección, por ejemplo, inyección intravítrea, periocular o subconjuntival. La formulación se puede inyectar debajo de la conjuntiva facilitando el paso a través de la esclerótica y el interior del ojo por simple difusión. La formulación también se puede inyectar debajo de la conjuntiva y la cápsula de Tenon subyacente en la parte más posterior del ojo para administrar el agente al cuerpo ciliar, la coroides y la retina. La formulación también se puede administrar mediante inyección retrobulbar.

En realizaciones, una formulación que se proporciona en el presente documento se administra por vía intravítrea. En realizaciones, la formulación no comprende CMC.

Evaluación

Con respecto al ojo seco y otros trastornos de la superficie, los sujetos se pueden evaluar usando uno o más de los enfoques conocidos en la técnica, por ejemplo, el índice de enfermedad de la superficie ocular (OSDI), tinción corneal y conjuntival y la prueba de Schirmer. Cuando se usa el OSDI, un cambio negativo del valor inicial indica una mejora en la función relacionada con la visión y los trastornos inflamatorios oculares.

Para la tinción corneal con fluoresceína, se usan tiras de fluoresceína humedecidas con solución salina o una solución de fluoresceína de sodio al 1 % para teñir la película lagrimal. Por lo general, a continuación se examina toda la córnea usando una evaluación con lámpara de hendidura con un filtro de barrera amarillo (N.° 12 Wratten) e iluminación azul cobalto. La tinción se puede clasificar, por ejemplo, de acuerdo con la escala NEI, el esquema de Oxford o un esquema de Oxford modificado. Generalmente, la tinción se clasifica de acuerdo con la escala NEI, que es una escala de 15 puntos en la que la córnea se divide en 5 secciones (una sección circular central y 4 cuadrantes que rodean la sección central de la córnea que se denominan cuadrantes inferior, superior, nasal y temporal) cada uno de los cuales se puntúa de 0 a 3 para que la tinción punteada produzca una puntuación máxima posible de 15. La tinción conjuntival es también una medida de enfermedad epitelial o rotura de la barrera epitelial de la superficie ocular. La tinción conjuntival se realiza bajo la lámpara de hendidura usando verde de lisamina. Para teñir la película lagrimal se usa una tira humedecida con solución salina o una solución de verde de lisamina al 1 %, y la tinción conjuntival interpalpebral se evalúa más de 30 segundos pero menos de dos minutos después. Usando luz blanca de intensidad moderada, solo se clasifica la región interpalpebral de la tinción conjuntival nasal y temporal, por ejemplo, usando el esquema de Oxford.

La prueba de Schirmer se realiza en presencia o ausencia de anestesia colocando una tira estrecha de papel de filtro (tira de papel de filtro Whatman n.° 41 de 5 x 3 5 mm) en el fondo de saco inferior. Esta prueba se realiza en una habitación con poca luz. El paciente cierra suavemente los ojos hasta que hayan transcurrido cinco minutos y se retiren las tiras. Dado que el frente de lágrima continuará avanzando unos milímetros después de haberse retirado de los ojos, el frente de lágrima se marca con un bolígrafo exactamente a los cinco minutos. La producción de lágrimas acuosas se mide por la longitud en milímetros que moja la tira durante 5 minutos. Los resultados de 10 mm o menos para la prueba de Schirmer sin anestesia y de 5 mm o menos para la prueba de Schirmer con anestesia se consideran anómalos. Un cambio positivo del valor inicial indica la mejora de uno o más síntomas de un trastorno inflamatorio ocular que se describe en el presente documento.

Modelos de enfermedad de ojo seco. La eficacia de las formulaciones que se presentan en la invención se puede evaluar en un modelo de ratón para la enfermedad de ojo seco. En ratones, el ojo seco puede inducir se mediante inyección subcutánea de escopolamina y a continuación colocando a los ratones en cámaras de ambiente controlado. A modo de ejemplo específico, el ojo seco se puede inducir en ratones C57BL/6 hembra normales sanos de 6 a 10 semanas de edad mediante exposición continua a un ambiente seco en una cámara ambiental controlada. La cámara tiene una humedad relativa baja inferior a un 30 % (generalmente aproximadamente un 19 %), flujo de aire alto (15 litros/ minuto) y temperatura constante (aproximadamente 22 °C). Los ratones colocados en la cámara también se tratan con escopolamina para inhibir la secreción de lágrimas. Los parches de escopolamina transdérmica de liberación sostenida se pueden obtener en Novartis Novartis (Summit, N.J.). En la cola media depilada de los ratones se aplica una cuarta parte de un parche cada 48 horas. La combinación de la cámara ambiental controlada y la escopolamina produce un ojo seco severo en un periodo de tiempo relativamente corto (aproximadamente 2-4 días). La cámara ambiental controlada se puede preparar como se describe en Barbino et al. (Invest Ophthal Vis Sci, 46: 2766-2711 (2005)), y permite controlar el flujo de aire, la humedad y la temperatura. Los ratones se pueden monitorizar para detectar signos de ojo seco, por ejemplo, realizando: a) prueba de hilo de algodón para medir la producción de lágrimas acuosas, que generalmente está disminuida en pacientes con ojo seco; b) tinción corneal con fluoresceína, que es un marcador de daño en la superficie corneal; y examen oftálmico general.

Prueba de hilo de algodón: La producción de lágrimas se puede medir con una prueba de hilo de algodón, impregnado con rojo fenol (Zone-Quick, Lacrimedics, Eastsound, Wash.). Bajo una lámpara fluorescente de aumento, el hilo se sujeta con pinzas de joyero y se coloca en el canto lateral del fórnix conjuntival del ojo derecho durante 30 o 60 segundos. La distancia de la lágrima en mm se lee al microscopio usando la escala de un hemacitómetro.

Tinción corneal con fluoresceína: La tinción corneal con fluoresceína se puede evaluar aplicando 1,0 ml de fluoresceína al 5 % con una micropipeta en el saco conjuntival inferior del ojo. La córnea se examina con un biomicroscopio de lámpara de hendidura usando luz azul cobalto 3 minutos después de la instilación de fluoresceína. La tinción punteada se registra de forma enmascarada Usando un sistema de clasificación estandarizado del National Eye Institute (NEI) de 0-3 para cada una de las cinco áreas en las que se ha dividido la superficie corneal. Los siguientes ejemplos no limitantes ilustran además realizaciones de las invenciones que se describen en el presente documento.

Ejemplos

Ejemplo 1: ejemplos de proteínas terapéuticas, por ejemplo, proteínas quiméricas

Los ácidos nucleicos que codifican las proteínas con las secuencias de aminoácidos que se enumeran en la Tabla 1 (que sigue a continuación) se construyeron en un vector pET que contenía un promotor T7 y genes de resistencia a ampicilina (serie pET31) o kanamicina (serie pET28) (EMD Chemicals, Gibbstown, NJ, EE. UU.), y se expresaron. En la Tabla 2 se proporcionan ejemplos de secuencias codificantes que se pueden usar para expresión.

Tabla 1

En la Tabla 2 se enumeran secuencias de ácidos nucleicos a modo de ejemplo que codifican las proteínas mencionadas anteriormente. En algunas realizaciones, la secuencia de ácidos nucleicos incluye además un ATG antes del primer nucleótido que se enumera a continuación. En algunas realizaciones, la secuencia de ácidos nucleicos incluye además un codón de parada (tal como TAA, TAG, o TGA) después del último nucleótido que se enumera a continuación.

Tabla 2

Las proteínas pueden incluir una gama de restos diferentes de IL-1p e IL-IRa tal como se ilustra a continuación. Entre los ejemplos P01, P02, P03, P04 y P05, los dominios de citoquina pueden tener un 48-70 % de restos de IL-1p y un 55-78 % de restos de IL-IRa. Dado que se conservan diversos restos de aminoácidos entre las dos proteínas, la suma del porcentaje de identidad con respecto a IL-1 p y con respecto a IL-1Ra puede ser superior a un 100 %.

Tabla 6

Otros ejemplos de proteínas terapéuticas incluyen IL-1Ra (por ejemplo, anakinra), canakinumab, gevokizumab, rilanacept, o un anticuerpo anti-IL-1 R (por ejemplo, tal como el producido por Amgen).

Ejemplo 2: expresión y purificación de proteínas quiméricas

Las proteínas que contienen una etiqueta de hexa-histidina (SEQ ID NO: 23) se expresaron en la cepa BL21 (DES) de células de E. coli por inducción con isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) 1 mM a 37 °C durante 3 horas en medio de caldo de cultivo LB. Las células se sometieron a lisis en Tris 20-50 mM, NaCl 0,5 M, EDTA 2,5 mM, Triton X-100 al 0,1 %, pH 8,0. El lisado se sometido a diálisis frente a 1,25x PBS que contenía polisorbato 80 al 0,1 %, a continuación se filtró de forma estéril a través de un filtro de 0,8/0,2 pm antes de someterlo a cromatografía de afinidad de iones inmovilizados (IMAC) usando una columna IIisTrap IIP® (GE Healthcare, Piscataway NJ, EE. UU.) empaquetada previamente. La columna se equilibró en fosfato 50 mM, NaCl 500 mM, pH 7,1, se cargó y se lavó con el mismo tampón. Se eluyó previamente con imidazol 25 mM y se eluyó con imidazol 125 mM en el mismo tampón. La proteína eluida se sometió a diálisis ampliamente frente a 1,25x PBS, polisorbato 80 al 0,1 %, pH 7,4.

La proteína se cargó en fosfato de sodio 20 mM, NaCl 0,5 M imidazol 10 mM, tampón a pH 7,4. Se eluyó con imidazol 200 mM, fosfato de sodio 20 mM, NaCl 0,5 M tampón a pH 7,4. La proteína eluida se sometió a diálisis ampliamente frente a PBS, polisorbato 80 al 0,1 %, pH 7,4, se concentró usando un filtro Amicon Ultra® (10 K), y se almacenó a 4° o -80 °C.

Las proteínas que carecen de una etiqueta de hexa-histidina (SEQ ID NO: 23) se purificaron mediante cromatografía de intercambio iónico. La proteína P05 se purificó mediante cromatografía de intercambio iónico. El lisado de las células que expresan se aplicó a una columna GigaCapS™ (Tosoh Bioscience LLC, King of Prussia, PA, EE. UU.) a pH bajo (pH 5,5 aproximadamente) en ausencia de sal (conductividad aproximadamente 1 mS/cm). A continuación, la columna se eluyó mediante un gradiente de pH (Tampón A = ácido acético 10 mM, pH 5,5; Tampón B = Tris 20 mM pH 8). Una fracción de 5 ml que contenía la proteína eluida se diluyó a continuación con 5 ml de H2O y 5 ml de Tris 20 mM pH 8) y a continuación se aplicó a la resina Capto™ Q (GE Healthcare, Piscataway NJ, EE. UU.) y se eluyó con un Gradiente de NaCl de 0 mM a 250 mM en Tris 20 mM pH 8,0. La proteína eluida se sometido a diálisis ampliamente frente a 1,25 X PBS TWEEN® 80 al 0,1 % o 1,25X PBS que carecía de TWEEN® y se almacena. Véase la figura 1. Las proteínas P03 y P04 se purificaron usando métodos similares.

Las células que expresan P05 también se cultivaron en el caldo de cultivo Terrific Broth de TEKNOVA™ con digestión enzimática de soja soytone sin sustancia animal (n.° T7660) suplementado con 10 g/l de glucosa, MgSO4 10 mM, elementos traza (1 mg/ml de elementos traza 1000X de T e KNOVA™, n.° T1001), y antibiótico en un Sartorius 2L BIOSTAT™ A+ y se sometieron a inducción a una OD 35-40 con IPTG 1 mM durante aproximadamente 6 horas. Las células se cultivaron a 37 °C con oxígeno disuelto al 30 % a pH 7,0, y agitación a 200-800 rpm con burbujeo de oxígeno a 2 l/min. Las células se alimentaron con 9 g de glucosa/l/h cuando se agotó la glucosa, tal como se detecta por un aumento del pH. La alimentación se redujo a 6 g de glucosa/l/h cuando el pH disminuyó (aproximadamente 2,5 h después de la inducción).

Las células se recogieron y se sometieron a lisis en tampón de lisis (Tris 20 mM, EDTA 10 mM, Triton al 0,1 %, pH 8,0; Tris 20 mM, EDTA 10 mM, Triton al 0,1 %, pH 7,0; MOPS 50 mM, EDTA 10 mM, Triton al 0,1 %, pH 6,5; o MOPS 50 mM, EDTA 10 mM, Triton al 0,1 %, pH 6,0). El lisado se carga en medio de intercambio iónico catiónico Poros® XS (Life Technologies Corp., Carlsbad CA EE. UU.) a pH 5,3 y 3 mS/cm (35 mg de producto por ml de resina de columna).

En un procedimiento a modo de ejemplo, la proteína P05 se eluye mediante una etapa a pH 7,0 usando tampón que contiene MOPS 100 mM, NaCl 25 mM, pH 7,0. El primer pico de elución se descartó y el segundo pico de elución se recogió en grupos y contenía proteína P05. Los grupos iniciales están enriquecidos con la proteína P05 intacta con respecto a una especie de des-Ala. A continuación este material eluido se hace fluir sobre resina de intercambio aniónico Capto®Q. Se recoge la fracción no retenida, que contiene la proteína P05 intacta.

En otro procedimiento a modo de ejemplo, el medio se lava con MOPS 100 mM NaCl 20 mM pH 6,0. La proteína P05 se eluye mediante una etapa a pH 6,0 usando tampón que contiene MOPS 100 mM NaCl 50-58 mM pH 6,0. El primer pico de elución se separó de los picos posteriores y contenía la proteína P05 intacta. A continuación este material eluido se hace fluir sobre resina de intercambio aniónico Capto®Q. Se recoge la fracción no retenida, que contiene la proteína P05 intacta.

Ejemplo 3: ensayos basados en células

Las proteínas o sobrenadantes que contienen las proteínas se evaluaron en un ensayo celular para determinar la actividad de IL-1. Se usaron células sensibles a IL-1 p HEK-Blue™ para controlar la actividad de lL-1 p (disponible de InvivoGen Inc., San Diego CA, EE. UU.). Estas células incluyen un gen indicador de fosfatasa alcalina embrionaria secretada (SEAP) bajo el control del promotor mínimo de IFN-p fusionado a cinco sitios de unión de NF-kB y cinco sitios de unión de AP-1. El acoplamiento de IL-1 p de receptores de IL-1 en la superficie celular condujo a la activación de NF-kB y a la producción de SEAP. El indicador de SEAP se puede detectar, por ejemplo, usando QUANTI-Blue™ (InvivoGen Inc., San Diego CA, EE. UU.) y análisis espectrofotométrico. Se preparó una suspensión de células IL-1 p HEK-Blue a partir de células cultivadas hasta una confluencia de un 70-80 %. Las células resuspendidas se ajustaron a ~330.000 células/ml en medio de crecimiento recién preparado (DMEM, 4,5 g/l de glucosa, L-glutamina 2 mM, suero bovino fetal inactivado por calor al 10 % (v/ v) (30 minutos a 56 °C), 50 U/ml de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina, 100 mg/ml de Normocin®T).

Los reactivos se añadieron a los pocillos de una placa de cultivo celular de 96 pocillos de fondo plano: 10 pl de IL-1 p a 20 ng/ml, 10 pl del agente de interés y 30 pl de medio de cultivo celular hasta un volumen final de 50 pl. Las muestras de control positivo y negativo se prepararon en paralelo. A continuación se añadieron 150 pl de suspensión de células IL-1 p HEK-Blue (~50.000 células) a cada pocillo y la placa se cultivó durante la noche a 37 °C en una incubadora de cultivo tisular con CO2 al 5 %. Generalmente, la concentración final de IL-1 p (en el volumen final de 200 pl) fue 0,1 ng/ml. La actividad de IL-1p se evaluó al día siguiente (12-15 horas después). Antes de la cuantificación, el reactivo QUANTI-Blue™ se preparó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se preparó una placa de ensayo de 96 pocillos de fondo plano en la que se añadieron 150 |jl de solución QUANTI-Blue™ a cada pocillo. Se añadieron 50 j l de medio acondicionado de los pocillos de la placa de cultivo tisular de 96 pocillos a cada pocillo de la placa de ensayo. La placa se incubó a 37 °C durante aproximadamente 15-20 minutos. A continuación, se midieron los niveles de SEAP usando un espectrofotómetro a 620-655 nm.

Resultados. Como se muestra en la figura 2A, en este ensayo, la proteína P06 se comportó como un agonista de IL-1RI, la proteína P07 se comportó como un agonista parcial y la proteína P01 no logró agonizar. De hecho, la proteína P01 se comportó como un antagonista cuando se sometió a ensayo en presencia de IL-1p. La figura 2B muestra el antagonismo de la actividad de IL-1p por P01 en un intervalo de concentraciones de proteína IL-1 p usando el ensayo de células HEKBlue™ descrito en el presente documento. El antagonismo aumentó con cantidades crecientes de P01 (el eje x refleja los microlitros de sobrenadante que contienen P01).

Cada una de las proteínas P01, P02, P03, P04, y P05 antagonizaron la actividad de IL-1 p. Véase la figura 3A y la figura 3B, por ejemplo. La IC50 de P05 fue inferior a aproximadamente 5 ng/ml. P05 se sometió a ensayo para determinar la capacidad de agonizar IL-1RI en este ensayo y no se observó que tuviera ninguna actividad agonista detectable incluso a las concentraciones más altas sometidas a ensayo, 1 mg/ml. P01, P02, P03, P04 y P05 también inhibieron la expresión de IL-6 inducida por IL-1 p en células MG-63, una línea celular de osteosarcoma humano que es sensible a IL-1 p. En un modelo murino de enfermedad del ojo seco, se observó que P05 etiquetada con hexahistidina (SEQ ID NO: 23) tenía actividad biológica. Véase también el Ejemplo 9 que sigue a continuación con respecto a P05 sin etiquetar.

Ejemplo 4: propiedades de unión de proteínas quiméricas

Las propiedades de unión de proteínas para IL-1RI humana recombinante soluble (correspondiente al dominio extracelular de IL-1RI) se evaluaron usando resonancia de plasmones superficiales con un sistema SPR de doble canal Reichert SR7000DC. La unión se evaluó en solución salina tamponada con fosfato con Tween 20 al 0,005 %. Se observó que la IL-1 p tenía una Kd entre 8-9 nM y una constante de disociación (Kd) entre 2-3 x 10'3 s-1, y en otro experimento una Kd de aproximadamente 2 nM, una constante de asociación de 1,3-1,5 x 106 M -V , y una constante de disociación (Kd) de aproximadamente 2,9-3,0 x 10'3 s-1. La proteína P01 se unió con una cinética de asociación similar a la de IL-1 p, pero no se disoció durante la fase de disociación del experimento de unión (aproximadamente 180 segundos). Por lo tanto, la proteína P01 se unió a IL-1RI con mayor afinidad que la IL-1p en condiciones similares.

Se observó que la unión de IL-1Ra tiene una Kd de aproximadamente 0,33 nM, una constante de asociación (Ka) de aproximadamente 2 x 105 M -V , y una constante de disociación (Kd) de aproximadamente 6,6 x 10'5 s-1. Se observó que los dominios de citoquina quimérica P01, P02, P03, P04 y P05 tenían una Kd que variaba en aproximadamente 12-1700 pM, una constante de asociación (Ka) que variaba de aproximadamente 3 x 104 M 'V a 3 x 106 M 'V , y una constante de disociación (Kd) que varía de aproximadamente 2 x 10'5 a 13 10'3 s -1. Véase la Tabla 3 que sigue a continuación.

Tabla 3

Ejemplo 5: ejemplos adicionales de proteínas quiméricas

Algunas proteínas adicionales de la familia de IL-1 quimérica a modo de ejemplo también incluyen las siguientes:

P08 APVRSLAFRIW DVNQKXFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKFSMSFVQGEESND SEQID NO: 15

K IPVALG LKEKN LYLSCVLKD D KPTLQ LESVD PKN YPKKKM EKRFVFN K IE IN

NKLEFESAQFPNW FLCTAMEADQFVSLTNMPDEGVMVTKFYMQFVSS

P09 APVRSQ AFR I W DVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKFSMSF VQGEESND SEQ ID NO: 16

K IPVA LG LK EK N LYLS C V LK D D K P ILQ LESV D PK N YPK K K M EK R FV FN K IE IN

NKLEFESAQFPNW FLCXAMEADQPVSLXNMPDEGVMVTKFYMQFVSS

P10 APVRSLAFRIW DVNQKXFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVSFVQGEESND SEQ ID NO: 17

K IPVALG LKEKN LYLSCVLKD D KPXLQ LESVD PKN YPKKKM EKRFVFN K IE IN

N K LEFES AQFPNW FLCXAMEADQPVSLXNMPDEGVMVTKFYMQFVSS

P11 APVRSLNCRIW DVNQKXFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVSFVQGEESND SEQID NO: 18

K IPVA LG LK EK N LYLS CV LK D D K PX LQ LESV D PK N YPKK K M EK R FV FN K IE IN

N K LEFES AQFPNW FLCTAMF.ADQPVSI.TNMPDEGVMVTKFYMQFVSS

P12 APVRSLNCRIW DVNQKXFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKFSMSFVQGEESND SEQID NO: 19

N K LEFES AQFPNW F LC TAMEADQPV S L XNMP DE GVMVTKF TMQFV S S

P13 APVRSLAFRIW DVNQKIFYLRNNQLVAGYLQG PNVNLEEKFSM SFVQGEESND SEQID NO: 20

N KLEFES AQFPNW FLC XAMEADQPVSLXNMPDEGVMVTK FYFQ ED

P14 APVRSLNCRIW DVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKFSM SFVQGEESND SEQID NO: 21

K IP V A LG LK EK N LYLS C V LK D D K P ILQ LES V D PK N YPK K K M EK R FV FN K IE IN

NKLEFESAQ FPN W FLCIAM EADQ PVSLINM PDEGVM VTKFYFQ ED

El polipéptido que sigue a continuación es un dominio quimérico que incluye al menos dos segmentos de IL-1 a y al menos dos segmentos de IL-1Ra.

SAPFSFLSNVKYNFM RIIKYEFRIW DVNQKXFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKF SEQ ID NO: 22

DM GAYKSSKDDAKIIVILRISKXQLYVXAQ DEDQPVLLKEM PEIPKXIXG SEXNL LFFW EXHGXKNYFXSVAHPNLFLCTAMEADQPVSLXNMPDEGVMVXKFYILENQA

Ejemplo 6: ejemplo de formulación

Una formulación a modo de ejemplo de acuerdo con la presente invención es como se describe a continuación: Una formulación que tiene proteína P05 presente en una concentración de 25 g/l; la carboximetilcelulosa está presente en una concentración de un 0,25 % p/v; el poloxámero 188 está presente en una concentración de un 0,1 % p/v; el sorbitol está presente en una concentración de un 5 % p/v; el fosfato de sodio está presente en una concentración de 10 mM; la arginina y/o el ácido glutámico están presentes en una concentración de 100 mM. La formulación tiene un pH de 6,5. La estabilidad de la formulación se somete a ensayo a las dos semanas a temperatura ambiente y hasta al menos doce meses de estabilidad durante el almacenamiento a 2-8 °C tal como se mide usando uno o más de HPLC de fase inversa (RP-HPLC); HPLC de intercambio catiónico débil (WCEX-HPLC); espectrofotometría (A280); y pruebas visuales.

Ejemplo 7: ejemplo de formulación y estudios de estabilidad

Las formulaciones de P05 (también conocidas como EBI-005) usadas en estudios clínicos en fase 1 eran formulaciones acuosas que contenían carboximetilcelulosa de sodio en una concentración de un 0,25 % p/v; poloxámero 188 en una concentración de un 0,1 % p/v; sorbitol en una concentración de un 5 % p/v; fosfato de sodio en una concentración de 10 mM, y P05 en una concentración cualquiera de 5 o 20 mg/ml. La formulación tiene un pH de aproximadamente 6,5. La estabilidad de estas formulaciones se sometió a ensayo con las siguientes mediciones: aspecto, pH, osmolalidad, contenido mediante espectrofotometría (A280), SDS-PAGE no reducida, SDS-PAGE reducida; Hp LC de exclusión por tamaño (SE HPLC); HPLC de fase inversa (RP-HPLC); WCEX-HPLC; potencia; e integridad del envase (CIT). Estos ensayos se realizaron (1) en el momento de la liberación (0 meses); (2) después de almacenamiento a 5 ± 3 °C durante 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, y 6 meses; (3) después de almacenamiento a 25 °C y un 60 % de humedad relativa (un experimento a temperatura ambiente) durante 1 mes o 3 meses. Las especificaciones para estas medidas y los resultados de los lotes representativos de las formulaciones de 5 mg/ml y 20 mg/ml se muestran en la Tabla 14A-E que sigue a continuación. Estos resultados demuestran que las formulaciones tenían una estabilidad excelente; las formulaciones seguían satisfaciendo las especificaciones incluso después de almacenamiento durante 6 meses a 2-8 °C y después de almacenamiento a temperatura ambiente durante 3 meses.

Tabla 14B: Producto farmacológico de GMP de fase 1 de EBI-005 (20 mg/ml, Lote X1) a 25 °C / 60 % de humedad relativa

Resultados del punto en el tiempo de estabilidad Análisis Especificación ~

1 Mes 3 Meses Ensayos fisicoquímicos

Solución incolora de Solución incolora de Solución incolora de transparente a ligeramente transparente a ligeramente transparente a ligeramente Aspecto opalescente básicamente opalescente básicamente exenta opalescente básicamente exenta de materiales de materiales particulados exenta de materiales particulados visibles visibles particulados visibles PH 6,2 a 6,8 6,6 6,6 Osmolalidad 270 a 370 mOsm/kg NS NS Contenido

Contenido de

_A28020 ± 2,0 mg/ml 18,4 mg/ml 19,5 mg/ml Identidad

SDS-PAGE

La banda principal se ajusta al La banda principal se ajusta al La banda principal se ajusta al no

estándar de referencia estándar de referencia estándar de referencia reducida

SDS-PAGE La banda principal se ajusta al La banda principal se ajusta al La banda principal se ajusta al reducida estándar de referencia estándar de referencia estándar de referencia Pureza

SE-HPLC >90 % (a/a) de monómero 99 % (a/a) de monómero 99 % (a/a) de monómero RP-HPLC >75 % (a/a) de pico principal 94 % (a/a) de pico principal 90 % (a/a) de pico principal >85 % (a/a) de pico principal 92 % (a/a) de pico principal 86 % (a/a) de pico principal WCEX- <10 % (a/a) de des-Ala-EBI-005 4 % (a/a) de des-Ala-EBI-005 4 % (a/a) de des-Ala-EBI-005 HPLC Resultado del informe de met. Metioninado al 0,1 % (a/a) Metioninado al 0,1 % (a/a)

Resultado del informe de acet. Acetilado al 0,0 % Acetilado al 0,0 %

Actividad

Potencia

Eleven QC- IC5050-200 % de IC50 de 100 % 94 %

estándar de referencia

007

Esterilidad

Endotoxina <5,6 EU/ml NS NS Ensayo de integridad

CIT Sin entrada de colorante NS NS

NS = No

muestreado

Tabla 14C: Producto farmacológico de GMP de fase 1 de EBI-005 (20 mg/ml, Lote X2) a 5 ± 3 °C . . ... Resultados del punto en el tiempo de _{Datos de liberación} _{r ..... . ^}

estabilidad

Análisis Especificación 3

0 Meses; 1 Mes 2 Meses* .. 4 Meses Meses

Solución incolora Solución incolora Solución incolora de Solución incolora de transparente a de transparente transparente a de transparente a Aspecto ligeramente a ligeramente NS ligeramente NS ligeramente opalescente opalescente opalescente opalescente básicamente exenta básicamente básicamente exenta básicamente de materiales exenta de de materiales exenta de particulados visibles materiales particulados visibles materiales particulados particulados visibles visibles PH 6,2 a 6,8 6,6 NS 6,6 NS 6,4

270 a

Osmolalidad _{370 mOsm/kg}326 mOsm/kg NS NS NS NS Contenido de

_A28020 ± 2,0 mg/ml 18,5 mg/ml NS 18,9 mg/ml NS 18,7 mg/ml La banda

La banda principal La banda principal La banda principal SDS-PAGE principal

se ajusta al se ajusta al se ajusta al no se ajusta al NS NS

estándar de estándar de estándar de reducida estándar de

referencia referencia referencia referencia

La banda

La banda principal La banda principal La banda principal principal

SDS-PAGE se ajusta al se ajusta al se ajusta al se ajusta al NS NS

reducida estándar de estándar de estándar de estándar de

referencia referencia referencia referencia

>90 % (a/a) de 100 % (a/a) de 100 % (a/a) de 100 % (a/a) de SE-HPLC

monómero monómero ^NSmonómero ^NSmonómero 93 % 91 %

>75 % (a/a) de pico 92 % (a/a) de (a/a) de 93 % (a/a) de pico (a/a) de 92 % (a/a) de pico _RP-HPLC

principal pico principal pico principal pico principal principal principal

>85 % (a/a) de pico 94 % (a/a) de

principal <10 % pico principal 94 % (a/a) de pico 94 % (a/a) de pico (a/a) de des-Ala- 4 % (a/a) de principal 4 % (a/a) principal 4 % (a/a) WCEX- EBI-005 des-Ala-EBI-005 de des-Ala-EBI-005 de des-Ala-EBI-NS NS HPLC Resultado del Metioninado al Metioninado al 005 Metioninado informe de Met. 0,2 % (a/a) 0,4 % (a/a) al 0,2 % (a/a) Resultado del Acetilado al Acetilado al 0,0 % Acetilado al 0,0 % informe de Acet. 0,0 %

100,0 % 100,0 %

Potencia IC5050-200 % de (usó 100,0 (usó

% (usó datos

Eleven QC- IC50 de estándar de 83,0 % datos datos

de 4 meses) 100,0 % 007 referencia de 4 de 4

meses) meses)

Endotoxina <5,6 EU/ml 0,3 EU/ml NS NS NS NS Sin entrada de

CIT _coloranteAprobado NS NS NS NS NS = No muestreado

*El punto en el tiempo opcional a los 12 meses cambió a un punto en el tiempo de 2 meses

Tabla 14E: Producto farmacológico de GMP de fase 1 de EBI-005 (5 mg/ml, X3) a 25 °C / 60 % de humedad relativa

Especificación Resultados del punto en el tiempo de estabilidad Análisis

1 Mes 3 Meses Ensayos fisicoquím icos

Solución incolora de Solución incolora de Solución incolora de transparente

transparente a ligeramente transparente a ligeramente a ligeramente opalescente

Aspecto opalescente básicamente opalescente básicamente exenta básicamente exenta de

exenta de materiales de materiales particulados materiales particulados visibles

particulados visibles visibles pH Fujifilm

_AM00016,2 a 6,8 6,6 6,5 Osmolalidad 270 a 370 mOsm/kg NS NS Contenido

Contenido de

_A2805 ± 0,5 mg/ml 4,6 mg/ml 4,8 mg/ml Identidad

SDS-PAGE

SDS-PAGE La banda principal se ajusta al La banda principal se ajusta al La banda principal se ajusta al reducida estándar de referencia estándar de referencia estándar de referencia Pureza

SE-HPLC >90 % (a/a) de monómero 99 % (a/a) de monómero 100 % (a/a) de monómero RP-HPLC >75 % (a/a) de pico principal 81 % (a/a) de pico principal 81 % (a/a) de pico principal >85 % (a/a) de pico principal 93 % (a/a) de pico principal 4 % 88 % (a/a) de pico principal 4 % <10 % (a/a) de des-Ala-EBI-005 (a/a) de des-Ala-EBI-005 (a/a) de des-Ala-EBI-005 WCEX-HPLC

Resultado del informe de Met. Metioninado al 0,2 % (a/a) Metioninado al 0,2 % (a/a) Resultado del informe de Acet. Acetilado al 0,0 % Acetilado al 0,0 %

Actividad

IC5050-200 % of estándar de

Potencia

referencia IC50 ^{182 % 90 %}

Esterilidad

Endotoxina <5,6 EU/ml NS NS

Ensayo de integridad

CIT Sin entrada de colorante NS NS

NS = No

muestreado

Ejemplo 8: perfiles de fusión

Las proteínas P03, P04, P05, mlL-IRa (metionil IL-IRa) e IL-1p se prepararon en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4, a 0,5 mg/ml. Las proteínas se combinaron con colorante naranja SYPRO® (Invitrogen, CA) a una dilución de 1:500 de la concentración de solución de reserva y se sometieron a fluorimetría diferencial de barrido. Véase, por ejemplo, He et al. (2010) J Pharm Sciences, 99 1707-1720. Las mediciones de fluorescencia se monitorizaron usando una máquina de QPCR Agilent Mx3005 a medida que la temperatura aumentaba de 25 °C a 95 °C a una tasa de 1 °C por minuto. Los valores de la temperatura de fusión (Tm) se obtuvieron a partir del valor máximo de la primera derivada de la transición de fluorescencia. Se observó que las proteínas P03, P04, y P05 tenían un inicio de desplegamiento superior a 50 °C y tan alto como 59 °C, y una Tm superior a 59, 60, 62, y 64 °C. Los resultados se muestran en la Tabla 4 que sigue a continuación y en la figura 5A y en la figura 5B:

Tabla 4

Proteína Tm (°C) Inicio del desplegamiento (°C)

mIL-IRa 56 48

IL-ip 56 41

P03 65 59

P04 60 51

P05 65 59

P04 tiene una Tm que es aproximadamente cuatro grados más elevada que la de mIL-1Ra a la de IL-1p y exhibe un inicio de desplegamiento aproximadamente tres grados mayor que la de mIL-IRa y aproximadamente diez grados mayor que la de IL-1p. P03 y P05 tienen una Tm que es aproximadamente nueve grados más elevada que la de mIL-1Ra e IL-1p exhibe un inicio del desplegamiento aproximadamente 11 grados mayor que mIL-IRa y aproximadamente 18 grados mayor que IL-1p. Estos datos demuestran métodos para determinar la temperatura de fusión de un inhibidor de IL-1, por ejemplo, en una formulación que se describe en el presente documento.

Ejemplo 9: tratamiento de ojo seco en un modelo animal

Se preparó P05 purificada (que carece de una etiqueta de hexa-histidina (SEQ ID NO: 23)) en 1,25x PBS y se sometió a ensayo en un modelo de murino de enfermedad de ojo seco. En este modelo, se cribaron previamente ratones C57BL/6 de 6 a 10 semanas de edad de Jackson Laboratories (aclimatados de 1 a 2 semanas en una habitación de mantenimiento de animales con >30 % de humedad relativa, suplemento alimentario de hidrogel, y enriquecimiento de entorno Enviro-dri™) para tinción con fluoresceína el día 0. Para la tinción con fluoresceína, se administró fluoresceína recién preparada diluida en H2O WFI a 10 mg/ml a 0,4 pl a cada ojo. Aproximadamente 8-13 minutos después de la administración, se realizó la puntuación de los ojos usando un microscopio de disección fluorescente Olympus. La tinción punteada se registró usando el sistema de clasificación estandarizado del National Eye Institute (NEI) de 0-3 para cada una de las cinco áreas en las que se ha dividido la superficie corneal (intervalo de puntuaciones 0-15/ojo). Usando un puente de enseñanza, dos anotadores enmascarados evaluaron ratones al mismo tiempo para dar una puntuación colectiva única para cada ojo.

Los ratones con puntuaciones < 7 para cada ojo (de una puntuación máxima de 15) se colocaron en una cámara de ojo seco (20 % ± 2 % de humedad y flujo de aire constante ~21 l/min/jaula) el día 1 y se mantuvieron en esta cámara durante el transcurso del experimento (excepto para el examen). El día 3, los ratones se puntuaron de nuevo y se distribuyeron de forma aleatoria en grupos de tratamiento con 8 a 10 ratones/grupo. Los ratones se distribuyeron de forma aleatoria de manera que cada jaula de 4 a 5 ratones tuviera aproximadamente la misma puntuación media de enfermedad. A partir del día 3 y después de la distribución aleatoria, a los ratones se les administró P05 o vehículo (1,25X PBS) por vía tópica en una gota ocular a 3 pl/ojo BID. Los ratones se examinaron y se realizó su puntuación los días 7, 9 y 11 para la tinción corneal con fluoresceína tal como se ha descrito anteriormente. Los anotadores presentaban ocultación en cuanto a los grupos de tratamiento durante el transcurso del experimento.

La figura 6A es un gráfico de barras de la puntuación media de tinción corneal ± SEM los días 0, 3, 7, 9, y 11 para ratones de dos experimentos idénticos bajo los siguientes tratamientos bid: sin tratamiento, vehículo (1,25X PBS) y 10 mg/ml (1 %) de P05. 10 mg/ml de P05 redujeron de forma significativa la tinción corneal los días 7, 9 y 11 del experimento. La eficacia evaluada mediante una reducción de la tinción corneal también se observó con dosis tan bajas como 0,1 mg/ml de P05. La IL-1Ra recombinante producida en E. coli también redujo de forma moderada la tinción corneal en el modelo animal.

Como se muestra en la figura 6B, el efecto de 10 mg/ml de P05 se basó de forma específica en una comparación con 10 mg/ml de albúmina de suero murino en el mismo vehículo. No se observó ningún efecto con 10 mg/ml de albúmina de suero murino (MSA) con respecto al vehículo, y el efecto de 10 mg/ml de P05 fue estadísticamente significativo con respecto a 10 mg/ml de albúmina de suero murino. Como se muestra en la figura 6C, también se compararon 10 mg/ml de P05 con ciclosporina al 0,05 % en una emulsión oftálmica (Restasis®). Mientras que el P05 redujo la tinción corneal, no se observó ningún efecto para la emulsión oftálmica de ciclosporina al 0,05 % después de aproximadamente 1 semana de dosificación b.i.d.. Estos experimentos demuestran métodos para someter a ensayo la eficacia de un inhibidor de IL-1 en una formulación que se describe en el presente documento.

Ejemplo 10: Estudios de agitación

Para identificar un tensioactivo adecuado para su uso, se preparó P05 a 1 mg/ml y a 50 mg/ml en soluciones de cualquiera de (i) PBS, CMC al 0,5 % p/v, pH 7,4 o (ii) citrato de sodio 10 mM, pH 6,0 que contenía diversos tensioactivos. La agitación se realizó sometiendo la proteína a agitación vorticial a temperatura ambiente durante cuatro horas. Las muestras se analizaron mediante formación de imágenes de microfluidos (MGI), SEC, A280, e inspección visual. Se encontró que el uso de poloxámero 188 al 0,1 % p/v, c en comparación con otros tensioactivos (incluyendo, por ejemplo, polisorbato 20, polisorbato 80 o ningún tensioactivo) protegía a la proteína de la precipitación (evaluada mediante inspección visual) y acumulación significativa de partículas subvisibles durante la agitación. Por ejemplo, el poloxámero al 0,1 % p/v redujo los recuentos de partículas para partículas con un tamaño > 10 micrómetros y para partículas con un tamaño >25 micrómetros.

Este resultado demuestra que el poloxámero 188 es un tensioactivo adecuado para formular un polipéptido tal como P05. Además, demuestra que tan solo un 0,1 % p/v de tensioactivo puede ser eficaz para limitar e incluso disminuir la cantidad de precipitación. Estos experimentos también demuestran un método para determinar la idoneidad de una formulación que se describe en el presente documento.

Ejemplo 11: Preparación de una formulación

Se prepararon formulaciones de P05. En resumen, P05 se proporcionó como un líquido congelado que contenía 52,8 mg/ml de P05 en IX PBS, pH 6,5. El polipéptido se sometió a diálisis frente a un tampón que contenía citrato de sodio 10 mM y sorbitol al 5 % p/v a pH 6,0 usando casetes de diálisis de límite de peso molecular 3500 en un intercambio de aproximadamente 10.000 veces durante aproximadamente 24 horas a 2-8 °C. Después de la diálisis, la concentración se determinó midiendo A280/A320.

Después de la diálisis, se prepararon formulaciones con diversas concentraciones de P05 como sigue a continuación, se añadió 100x tensioactivo poloxámero 188 a una concentración 1x a una solución de reserva de P05 dializada. Las concentraciones de proteína se ajustaron a aproximadamente 1 mg/ml, 5 mg/ml y 20 mg/ml añadiendo tampón de formulación (citrato Na 10 mM, sorbitol al 5 % p/v, pH 6,0). La concentración final de los componentes de la formulación fue citrato de sodio aproximadamente 10 mM, sorbitol al 5 % p/v, y poloxámero 188 al 0,1 % p/v. A continuación, las muestras se mezclaron y se esterilizaron mediante filtración en condiciones asépticas y a continuación se llenaron (a 250 pl) en viales de vidrio de 2 cc en condiciones asépticas. Después de la preparación, las muestras se colocaron en estudios de estabilidad para confirmar la estabilidad de la formulación preparada en las condiciones mencionadas anteriormente.

Esto demuestra un método para preparar un inhibidor de IL-1, por ejemplo, una formulación de proteína quimérica IL-1beta/IL-1Ra.

Ejemplo 12: Estabilidad de P05 en fosfato frente a tampón citrato

La dispersión dinámica de luz o DLS (también conocida como dispersión de luz casi elástica o QELS) mide la difusión de un analito (por ejemplo, P05) en una placa de pocillos enfocando luz láser en la muestra y monitorizando la tasa de fluctuación de la luz dispersa tal como se mide mediante un contador de fotones rápido. Para cuantificar la tasa de fluctuación para determinar el coeficiente de difusión se usa una técnica matemática, conocida como función de correlación. El coeficiente de difusión se usa para obtener el radio de hidratación (Rh) mediante la ecuación de Stokes-Einstein.

El radio de P05 se midió como función del aumento de temperatura en un lector de placas DLS (Wyatt DynaPro ™, Wyatt Technologies, Santa Barbara, CA). El tiempo de adquisición fue de 5 segundos y se realizaron 5 barridos para cada medición. La velocidad de rampa fue de 0,17 °C/min. A medida que la proteína se desplegaba, el radio aumentaba. La temperatura a la que aumentó el radio se denomina Tinicio (temperatura de inicio para el desplegamiento).

Este experimento se realizó para P05 a 20 mg/ml en dos formulaciones: (i) fosfato 10 mM, sorbitol al 5 % p/v, poloxámero 188 al 0,1 % p/v, pH 6,5 y (ii) citrato de sodio 10 mM, sorbitol al 5 % p/v, poloxámero 188 al 0,1 % p/v, pH 6,0. Los resultados, representados en la figura 4A y en la figura 4B, mostraron que la Tinicio se produjo a una temperatura mucho más alta en el tampón citrato con respecto al tampón fosfato. La Tinicio fue 48,2 °C para P05 en tampón citrato, y 35,2 °C para P05 en tampón fosfato. Esta gran diferencia en Tinicio fue sorprendente e indicó que P05 es mucho más estable en el tampón citrato en comparación con el tampón fosfato. Por lo tanto, en algunas realizaciones una formulación que comprende un inhibidor de IL-1, por ejemplo, P05, contiene tampón citrato.

Ejemplo 13: Estudios de estabilidad

Para someter a ensayo la estabilidad de las formulaciones que se describen en el Ejemplo 11, se prepararon formulaciones con diversas concentraciones de P05 (como se describe en el Ejemplo 11, mencionado anteriormente) y se analizaron para mediciones de valor inicial. Los viales del polipéptido formulado se incubaron a 25 °C durante 0 días, 3 días, 1 semana, 2 semanas, y 4 semanas y a 40 °C durante 3 días, 1 semana, y 2 semanas. Se prepararon al menos 2 viales por punto en el tiempo. Tras la incubación, las muestras se analizaron mediante Hp Lc de exclusión por tamaño (SE-HPLC), HPLC de intercambio catiónico débil (WCX-HPLC), HPLC de fase inversa (RP-HPLC), concentración (A280 - A320), aspecto visual, inspección formal realizada con fotografías. El pH se analizó a T = 0 y T = 4 semanas. La osmolalidad se analizó solo a T = 0. La inspección visual y la concentración se evaluaron a las 2 semanas y a las 4 semanas tanto a 25 °C como a 40 °C. Todas las formulaciones eran transparentes e incoloras sin partículas visibles después de 2 semanas. Las muestras a 25 °C eran transparentes e incoloras después de 4 semanas. En la Tabla 5 se ilustran los resultados de estos estudios de concentración.

Tabla 5

El pH de las muestras a 25 °C se determinó a las 4 semanas. En todos los casos, el pH en T = 0 fue 6,00-6,01 y el pH a las 4 semanas fue 6,03-6,07. Estos datos demuestran la estabilidad de las formulaciones en un intervalo de concentraciones en las formulaciones a 25 °C durante al menos 4 semanas y a 40 °C durante al menos 2 semanas. SEC-HPLC

La pureza se evaluó usando un método de HPLC de exclusión por tamaño que usa detección de absorbancia y fluorescencia. En resumen, se usaron columnas Sepax Zenix® s EC-150 de 7,8 mm x 20 cm (PN 213150-7820). La fase móvil fue 1x PBS. Las evaluaciones se realizaron usando un sistema de HPLC Agilent 1100 en modo isocrático con un caudal de 1 ml/minuto, un tiempo de ejecución total de 18 minutos, a temperatura ambiente. La detección de absorbancia fue de 280 nm con detección de fluorescencia a una longitud de onda de excitación de 280 nm y una longitud de onda de detección de emisión de 350 nm. Para los experimentos que emplean la detección de fluorescencia de muestras de 1 y 5 mg/ml, se cargaron 10 pg de formulación de polipéptido y para la detección de absorbancia de muestras de 20 mg/ml, se cargaron 50 pg de formulación de polipéptido.

Después de 2 semanas de almacenamiento, el estándar de referencia para las formulaciones de P05 de 1 mg/ml y 5 mg/ml tenía una pureza sometida a ensayo de un 99,1 % y la pureza de las muestras de 1 mg/ml y 5 mg/ml de la formulación de P05 fue de un 99,1 % - 99,2 %, respectivamente, independientemente de si se almacenaron a 25 °C o 40 °C. Para la muestra de 20 mg/ml, la referencia tenía una pureza de un 99,2 %. Después de dos semanas de almacenamiento, las muestras de 20 mg/ml tenían una pureza de un 99,2 %, independientemente de si se almacenaron a 25 °C o 40 °C. Después de 4 semanas de almacenamiento a 25 °C, la formulación de P05 de 20 mg/ml tenía una pureza de un 99,2 %.

wCEX-HPLC

En estudios adicionales, se usó un método HPLC de intercambio catiónico débil para evaluar las formulaciones. En este método, se usó una columna Dionex ProPac® WCX-10, 4 x 250 mm (PN 054993). La fase móvil A era acetato de Na 10 mM, pH 5,5 y la fase móvil B era la fase móvil A NaCl 0,25 M. El ensayo se realizó usando un sistema HPLC Agilent 1100 con un caudal de 1,2 ml/minuto y un tiempo de ejecución total de 35 minutos a temperatura ambiente. La detección se realizó realizando el ensayo a 214 nm y 280 nm. El tamaño de la muestra fue de 25 pg/inyección. En la Tabla 6 se muestra un resumen de los resultados después del almacenamiento durante 2 semanas a 25 °C, en la Tabla 7 después de almacenamiento durante 2 semanas a 40 °C, y en la Tabla 8 después de almacenamiento durante 4 semanas a 25 °C.

El ensayo de intercambio catiónico débil es otro método para evaluar la pureza mediante el seguimiento de la heterogeneidad de la carga. El análisis de las muestras de la formulación de P05 resuelve el pico del producto principal de varias impurezas relacionadas con el producto basándose en la carga. Una preparación habitual de P05 consiste en aproximadamente > 85 % de pico principal y varios picos previos y posteriores. El pico previo 1 se desconoce, el pico previo 2 es una forma de P05 desamidada, el pico previo 3 es una forma de P05 con una metionina N-terminal. El pico posterior 1 es una forma de P05 a la que le falta la alanina N-terminal, el pico posterior 2 es una forma de P05 a la que le falta tanto la alanina N-terminal como la prolina, el pico posterior 3 se desconoce. Tabla 6: almacenamiento a 25 °C/2 semanas

Tabla 7: almacenamiento a 40 °C/2 semanas

Tabla 8: almacenamiento a 25 °C/4 semanas

Después de 2 semanas de almacenamiento a 25 °C, el porcentaje del pico principal permaneció similar al de la referencia para la formulación de 5 mg/ml (C2), pureza de aproximadamente un 91 %, mientras que se produjo una ligera disminución de la pureza para C3 (20 mg/ml) y C1 (1 mg/ml) tal como se determina usando este método. Para todas las muestras se observaron disminuciones en el pico principal y aumentos en el pico previo 2, el pico posterior 1, y el pico posterior 2 después de almacenamiento a 40 °C. Se observaron disminuciones en la pureza del pico principal y se produjo un aumento en el pico previo 2 y en el pico posterior 1 después de almacenamiento durante cuatro semanas.

HPLC de fase inversa (RP-HPLC)

Las formulaciones también se evaluaron usando RP-HPLC. El ensayo de RP-HPLC es otro método para evaluar la pureza mediante la monitorización de la heterogeneidad del producto basándose en la hidrofobia. El método es capaz de separar la molécula nativa de las impurezas relacionadas del producto que contienen metioninas oxidadas. Los picos anteriores 2 y 3 son formas oxidadas de la P05, y los picos posteriores 1 y 2 son formas acetiladas de la molécula.

En este método, se usó Symmetry® C4 de Waters (4,6 x 150 mm; 3,5 pm; PN 186000283) con una fase móvil A de ácido trifluoroacético al 0,05 % (TFA) en agua y la fase móvil B fue TFA al 0,05 % en acetonitrilo al 95 % (ACN). Los ensayos se ejecutaron usando un sistema de HPLC Agilent 1200 con un caudal de 1 ml/minuto para un tiempo de ejecución total de 35 minutos y una temperatura de la columna de 55 °C. La detección se realizó a 280 nm. La cantidad de muestra cargada para las muestras de 1 mg/ml y 5 mg/ml fue de 25 pg y la cantidad de muestra cargada fue de 50 pg. En la Tabla 9 se muestra un resumen de los resultados después de almacenamiento durante 2 semanas a 25 °C, en la Tabla 10 después de almacenamiento durante 2 semanas a 40 °C, y en la Tabla 11 después de almacenamiento durante 4 semanas a 25 °C para las formulaciones de 1 mg/ml y 5 mg/ml. Los datos para la formulación de 20 mg/ml después de dos semanas de almacenamiento a 25 °C y 40 °C se muestran en las Tablas 12 y 13, respectivamente.

Tabla 9: almacenamiento a 25 °C durante 2 semanas

T l 1 lm n mi n 4 ° r n 2 m n f rm l i n 1 m ml m ml

C2 0,0

0,2

4,1

1,2

92,3

1,8

0,4

1591

T l 11 lm n mi n 2 ° r n 4 m n f rm l i n 1 m ml m ml

T l 12 lm n mi n 2 ° r n 2 m n f rm l i n 2 m ml

Tabla 13: almacenamiento a 40 °C durante 2 semanas formulación de 20 m /ml

Después de dos semanas de almacenamiento a 25 °C o 40 °C, se observó una disminución en la pureza del pico principal y un aumento en el pico previo 3 (P05 oxidada) para las formulaciones de 1 mg/ml y 5 mg/ml. Este efecto fue más destacado para la muestra de 1 mg/ml (C1) a alta temperatura. Después de cuatro semanas de almacenamiento a 25 °C, se observó una disminución en la pureza del pico principal y un aumento en el pico previo 3 (P05 oxidada) para estas formulaciones y este efecto fue más prominente para la muestra de 1 mg/ml. De forma interesante, después de dos semanas de almacenamiento a 25 °C, la formulación de 20 mg/ml tenía un porcentaje del pico principal similar a T = 0 (pureza de un 96,1 %). Para esta muestra se observó una disminución en el porcentaje del pico principal y un aumento en el pico previo 3 (P05 oxidada) después de dos semanas de almacenamiento a 40 °C. Después de cuatro semanas de almacenamiento a 25 °C, la formulación de 20 mg/ml mostró una ligera disminución en la pureza del pico principal y un aumento en el pico previo 3 (P05 oxidada).

Estos datos analíticos demuestran métodos para analizar la estabilidad de una formulación de citoquina quimérica y, en particular, demuestran la sorprendente estabilidad de una preparación de citoquina quimérica que comprende el polipéptido P05. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la invención se refiere a una formulación almacenada durante al menos 2 semanas, por ejemplo, al menos 4 semanas a 25 °C, por ejemplo, 40 °C en una concentración de al menos 1 mg/ml, al menos 5 mg/ml, o al menos 20 mg/ml y tiene una pureza de al menos un 92 %, por ejemplo, al menos un 94 %, o al menos un 96 %.

Ejemplo 14: Estabilidad de formulaciones en envases de soplado, llenado y sellado

El proceso de envasado de formulaciones en envases de soplado, llenado y sellado (BFS) implica extrusión, moldeado, llenado aséptico y sellado de plástico en secuencia. Véase, por ejemplo, Liu, W. et al. 2011 Biopharm International, 24(7): 22-29. En la etapa de extrusión, los gránulos de plástico se funden a temperaturas superiores a 160 °C. Posteriormente, el plástico se moldea en la forma de envase deseada, se llena con la solución de formulación y se sella herméticamente.

Dado que los materiales plásticos usados para formar los envases son permeables a los gases hasta cierto punto, la estabilidad de la formulación se puede ver afectada durante el almacenamiento a largo plazo (por ejemplo, debido a la evaporación del agua del envase y/o la oxidación de proteínas). El sellado de tales envases en una bolsa de papel de aluminio u otro paquete adecuado puede proteger la formulación de la degradación inducida por la luz. El sellado de los envases en tales bolsas de papel de aluminio con un gas inerte, por ejemplo, nitrógeno o argón puede proteger frente a la oxidación. Por lo tanto, se realizaron experimentos para investigar los efectos del envasado y el posterior almacenamiento de P05 en envases de soplado, llenado y sellado (BFS), con o sin bolsas de papel de aluminio con un revestimiento de gas inerte.

El ensayo se realizó para formulaciones que contenían agente farmacéutico activo, P05. La sustancia farmacológica a granel se formuló en una solución acuosa que contenía citrato de sodio 10 mM, sorbitol al 5 % p/v, poloxámero 188 al 0,1 % p/v, a pH 6,0 para procesamiento de soplado y llenado. La concentración objetivo para P05 fue 5,0 mg/ml. La formulación se enfrió a aproximadamente 2 °C-8 °C y se llenó en envases. Se llenaron aproximadamente 1000 envases y el volumen de llenado objetivo de los envases fue de 0,32 ml. Una parte de los envases se embolsó en paquetes de papel de aluminio con un revestimiento de nitrógeno. Se realizó una caracterización inicial después del envasado en envases de BFS y se realizaron evaluaciones de estabilidad adicionales después de almacenamiento a dos temperaturas (2 °C a 8 °C y 25 °C), con o sin embolsado.

El análisis de caracterización inicial incluyó: concentración por A 280, SDS-PAGE, SEC-HPLC, wCEX-HPLC, RP-HPLC, osmolalidad y análisis de partículas por oscurecimiento de la luz. La estabilidad de P05 sé monitor hizo mensualmente mediante SEC-HPLC, wCEX-HPLC y RP-HPLC, con la evaluación de A280 realizada en los meses 4 y 5, y el pH y la osmolalidad en el 5 meses.

La caracterización inicial de la formulación de P05 después del procesamiento de soplado y llenado mostró retención de estabilidad

Los análisis iniciales de P05 después del procesamiento de soplado y llenado demostraron que la proteína conservaba su estabilidad química y física a pesar del proceso de soplado y llenado. Los resultados de una formulación de P05 no expuesta al proceso de BFS (formulación acuosa que contiene P05 en una concentración de 50 mg/ml, poloxámero 188 al 0,01 % p/v, sorbitol al 5 % p/v, fosfato de sodio 10 mM, a pH 6,5) se compararon con una formulación de P05 que se sometió al proceso de soplado y llenado (formulación acuosa que contiene P05 en una concentración de 5 mg/ml, poloxámero 188 al 0,1 % p/v; sorbitol al 5 % p/v; citrato de sodio 10 mM, a pH 6,0). Estas formulaciones se prepararon con P05 del mismo lote de producción.

Los resultados muestran que en el momento cero después del envasado de soplado y llenado, la formulación de soplado y llenado retuvo una estabilidad excelente incluso después de la exposición al proceso de soplado y llenado potencialmente perjudicial, tal como lo indican los análisis que usan cromatografía de exclusión por tamaño, RP-HPLC, wCEX, y SDS-PAGE (véase la Tabla 15).

Tabla 15: Com aración de estabilidades

Además de los ensayos anteriores, se realizó un análisis de partículas en la formulación envasada en envases de BFS, usando oscurecimiento de la luz de acuerdo con el método USP <789>. Los recuentos de partículas subvisibles estuvieron dentro de las especificaciones de la USP para productos oftálmicos tópicos (que tengan una cantidad menor o igual que 50 partículas por ml para partículas >10 pm y menor o igual que 5 partículas por ml para partículas >25 pm), 50 partículas por ml para partículas >10 pm y menor o igual que 5 partículas por ml para partículas >25 pm), coherente con la falta de precipitación visible en los envases de BFS (los datos no se muestran). Estos datos demuestran que P05 era tanto físicamente estable (de acuerdo con las mediciones de SEC-HPLC, oscurecimiento de la luz y observación visible) como químicamente estable (de acuerdo con las mediciones de wCEX-HPLC, RP-HPLC, SDS-PAGE) inmediatamente después del procesamiento de soplado y llenado.

Como parte de la caracterización inicial, se midió la osmolalidad y la concentración mediante A280. La medida de osmolalidad promedio fue de 317 mOsm, y la concentración promedio mediante A280 fue de 5,0 mg/ml.

La formulación de P05 almacenada en envases de soplado y llenado retuvo la estabilidad

La formulación de P05 en envases de BFS se almacenó en una incubadora a 25 °C con una humedad relativa de un 60 % o de 2 a 8 °C. A intervalos mensuales, las muestras se analizaron mediante SEC, RP-HPLC y wCEX-HPLC. En los meses 4 y 5, la concentración se midió mediante A280. En el mes 5 también se midieron osmolalidad (para evaluar la evaporación), pH y concentración mediante A280.

Tabla 16: resultados de estabilidad de SEC-HPLC (% de pico principal) para la formulación de P05 almacenada en envases de BFS

Los resultados de SEC-HPLC (véase la Tabla 16) indican que la formulación de P05 almacenada en envases de BFS no formaba agregados a temperatura ambiente o de 2 a 8 °C durante al menos cinco meses. El embolsado de los viales después del lavado con nitrógeno no afectó a la estabilidad física del producto a ninguna temperatura. Los resultados de estabilidad de wCEX-HPLC para la formulación de P05 se muestran en la Tabla 17 y en la Tabla 18 (% de pico principal y % de picos desamidados, respectivamente).

Tabla 17: resultados de estabilidad de wCEX-HPLC (% de pico principal) para la formulación de P05 almacenada en envases de BFS

Tabla 18: resultados de estabilidad de wCEX-HPLC (% de picos desamidados) para la formulación de P05 almacenada en envases de BFS

Los resultados de wCEX-HPLC indican que la formulación de P05 en envases de soplado, llenado y sellado permanecía estable a temperatura ambiente hasta cinco meses. P05 también retuvo la estabilidad durante al menos 5 meses a 2 a 8 °C. El embolsado de los envases después del lavado con nitrógeno no afectó a la estabilidad del producto a ninguna temperatura...

Los resultados de estabilidad de RP-HPLC para el producto farmacológico desarrollado por ingeniería de P05 se muestran en la Tabla 19 y en la Tabla 20 (% de pico principal y % picos de proteína oxidada, respectivamente).

Tabla 19: resultados de estabilidad mediante RP-HPLC (% de pico principal) para

la formulación de P05 almacenada en envases de BFS

Mes 25 °C / 60 % de RII 2 a 8 °C

Tabla 20: resultados de estabilidad mediante RP-HPLC (% de pico oxidado) para

la formulación de P05 almacenada en envases de BFS

Los resultados de RP-HPLC indican que la formulación de P05 almacenada en envases de BFS era estable a temperatura ambiente y de 2 a 8 °C durante al menos cinco meses.

Además, las mediciones de osmolalidad y pH indicaron que no se produjeron cambios significativos en osmolalidad o pH a lo largo del tiempo, para muestras a 25 °C (véase la Tabla). Esto demuestra que se produjo poca o ninguna evaporación y que el pH de la solución permaneció estable. La concentración de proteína tal como se evalúa usando A 280 también era coherente con las mediciones previas (véase la Tabla 21). En general, EBI-005 mostró una excelente estabilidad física después de un almacenamiento prolongado en viales soplado, llenado y sellado a una temperatura de 2 a 8 °C y a temperatura ambiente (RT).

Tabla 21: osmolalidad, pH, y concentración para la formulación de P05 después de cinco meses de almacenamiento

Ejemplo 15: formulaciones que contienen metionina

En algunas realizaciones, la invención se refiere a una formulación tal como se describe en el presente documento que contiene metionina.

Se estudió el uso de antioxidante para P05 formulada en citrato de sodio 10 mM, sorbitol al 5 % p/v, poloxámero 188 al 0,1 % p/v, pH 6,0 usando dos condiciones de estrés diferentes: temperatura (almacenamiento a 40 °C) y oxidación forzada usando peróxido de hidrógeno. El peróxido de hidrógeno es un factor de estrés que causa la oxidación por radicales libres y, por lo tanto, se usó para imitar el efecto de oxidación que puede ocurrir después del almacenamiento en envases de múltiples dosis que se han irradiado con rayos gamma (véase a continuación). P05 exhibe aumentos en los niveles de oxidación cuando se almacena a altas temperaturas durante periodos de tiempo prolongados. El uso de metionina 10 mM metionina o bisulfato 7 mM añadido a la formulación se sometió a ensayo para la formulación de P05 almacenada 3 semanas a 40 °C. Además, la misma formulación se sometió a ensayo usando oxidación forzada, donde se añadió un 10 % v/v de peróxido de hidrógeno al 0,02 % a las muestras. Las muestras sometieron a ensayo mediante RP-HPLC para evaluar los niveles de oxidación. La Tabla 22 proporciona un resumen de datos.

Tabla 22: análisis de RP-HPLC de muestras estresadas con sin antioxidante

Estos datos demuestran que la metionina, pero no el bisulfato, reduce el nivel de proteína oxidada, en particular a bajas concentraciones para la proteína almacenada a alta temperatura o con la adición de peróxido.

Se estudió el efecto de ambos sistemas de cierre de envases (soplado y llenado y múltiples dosis) y el uso de antioxidante en la formulación para viales de múltiples dosis para comprobar su efecto en los niveles de oxidación de P05. Se esterilizaron envases de múltiples dosis (viales) mediante irradiación gamma. La irradiación gamma puede dar como resultado la generación de radicales libres en el envase que pueden ser perjudiciales para la estabilidad química de la proteína, específicamente al oxidar restos de metionina en la molécula. Por lo tanto, el presente experimento investigó si la adición de metionina a P05 formulada en citrato de sodio 10 mM, sorbitol al 5 % p/v, poloxámero 188 al 0,1 % p/v, pH 6,0 podría mejorar la oxidación de P05. Se usó metionina 10 mM para P05 a 1 mg/ml en viales de múltiples dosis o de llenado y soplado. La proteína se almacenó a 2-8 °C o a temperatura ambiente hasta 4 semanas. La proteína se analizó mediante RP-HPLC para determinar niveles de P05 oxidada. La Tabla 23 muestra un resumen de resultados.

Tabla 23: análisis de RP-HPLC para P05 almacenada en envases de soplado y llenado o de múltiples dosis ± metionina

La adición de metionina a la formulación redujo la oxidación en el envase de múltiples dosis. Por ejemplo, después de 4 semanas de almacenamiento en envases de múltiples dosis a temperatura ambiente, el % de pico oxidado en la formulación sin metionina fue un 7,5 % y el % de pico oxidado en la formulación con metionina fue solo un 4,7 %.

Ejemplo 16: Efectos terapéuticos de la formulación de EBI-005 y la formulación de vehículo

Se completó un ensayo clínico multicéntrico, con doble enmascaramiento, con distribución aleatoria y controlado con placebo para evaluar la seguridad y la actividad biológica de una formulación acuosa de EBI-005 en pacientes con enfermedad de ojo seco de moderada a grave. La formulación empleada en este estudio contenía EBI-005 (también denominada P05 en el presente documento) en una concentración de 20 mg/ml o 5 mg/ml (véase a continuación), carboximetilcelulosa de sodio en una concentración de un 0,25 % p/v; poloxámero 188 en una concentración de un 0,1 % p/v; sorbitol en una concentración de un 5 % p/v; y fosfato de sodio en una concentración de 10 mM. El ensayo se realizó en 74 pacientes en ocho centros de Estados Unidos. El ensayo se realizó en un entorno natural (no se usó cámara de entorno adverso controlado).

Los pacientes se cribaron en función de los criterios de idoneidad en una primera visita. Los pacientes declarados aptos para la inscripción recibieron la administración tópica de vehículo en cada ojo tres veces al día durante una semana. Al final del periodo de preinclusión de una semana, los pacientes se volvieron a reevaluar en función de los criterios de idoneidad. Los pacientes declarados aptos de acuerdo con estos criterios adicionales se distribuyeron de forma aleatoria a uno de los tres grupos de tratamiento. En el presente documento, la puntuación de tinción corneal con fluoresceína (CFS), la puntuación del índice de enfermedad de la superficie ocular (OSDI) y otras medidas tomadas en el momento de la distribución aleatoria se denominan medidas de valor inicial.

Los sujetos idóneos tenían al menos 18 años de edad, con enfermedad de ojo seco de moderada a grave. Los criterios de idoneidad adicionales incluyeron los siguientes: (i) puntuación OSDI mayor o igual que 23 y menor que 90 en el momento del cribado; (ii) puntuación OSDI mayor o igual que 19 en el momento de la distribución aleatoria; (iii) puntuación CFS mayor o igual que seis y menor que 15 en la escala NEI en el momento del cribado; y (iv) puntuación CFS mayor o igual que cinco en el momento de la distribución aleatoria.

Los pacientes distribuidos de forma aleatoria en un grupo de tratamiento se trataron en ambos ojos tres veces al día durante seis semanas comenzando con en el momento de la distribución aleatoria. Los tratamientos para los tres grupos en este ensayo fueron los siguientes: (i) en el primer grupo, 22 pacientes recibieron administración tópica en cada ojo tres veces al día de la formulación de EBI-005 que contenía e BI-005 en una concentración de 20 mg/ml, (ii) en el segundo grupo, 22 pacientes recibieron administración tópica en cada ojo tres veces al día de formulación de EBI-005, que contenía EBI-005 en una concentración de 5 mg/ml, (iii) en el tercer grupo, 30 pacientes recibieron administración tópica en cada ojo tres veces al día de la formulación de vehículo (la formulación de vehículo era una formulación acuosa que contenía los mismos componentes que la formulación EBI-005, excepto porque EBI-005 no estaba en la formulación de vehículo).

Los pacientes se evaluaron en el momento del cribado; en la distribución aleatoria; en las visitas de evaluación en las semanas dos, cuatro y seis después de la distribución aleatoria; y en una visita de revisión una semana después de finalizar el tratamiento. El cronograma de este ensayo clínico y el número de pacientes distribuidos de forma aleatoria en el tratamiento con EBI-005 y a los grupos de control de vehículo se representan en la figura 7. El dolor se evaluó basándose en el análisis de una sola pregunta de las 12 preguntas del OSDI que preguntaban a los pacientes sobre ojos con dolor o irritación.

Los resultados se muestran en las figuras 8 a 10. Estos resultados muestran que los signos y los síntomas de la enfermedad de ojo seco, tal como se evalúa usando puntuación OSDI (figura 8), dolor (figura 9), y puntuación de tinción corneal con fluoresceína (CFS) (figura 10), mejoraron durante el transcurso del tratamiento con las formulaciones de EBI-005. Sorprendentemente, el tratamiento con la formulación que sólo contiene vehículo también dio como resultado mejoras notables en la puntuación OSDI, el dolor y puntuación CFS.

Ejemplo 17: estudio con doble enmascaramiento, aleatorizado y controlado de solución oftálmica tópica de EBI-005 (5 mg/ml) y vehículo en sujetos con enfermedad de ojo seco (DED) de moderada a grave

Se realiza un estudio que determina la eficacia de una formulación de vehículo (citrato de sodio 10 mM, pH 6,0, sorbitol al 5 % (p/v), y poloxámero 188 al 0,1 % (p/v)) y una formulación terapéutica (citrato de sodio 10 mM, pH 6,0, sorbitol al 5 % (p/v), y poloxámero 188 al 0,1 % (p/v) que contiene 5 mg/ml de P05) administrada como una solución oftálmica tópica en cada ojo a sujetos con enfermedad de ojo seco (DED) de moderada a grave tres veces al día durante 12 semanas.

Los sujetos se evalúan para DED y los criterios de inclusión incluyen tener antecedentes de enfermedad de ojo seco (DED) en ambos ojos respaldados por un diagnóstico clínico previo o tener antecedentes autoinformados de quejas subjetivas durante al menos 6 meses antes del cribado (Visita 1), tener DED en curso, en el mismo ojo o en ambos ojos, de acuerdo con lo definido por los criterios que siguen a continuación en la Visita 1: una puntuación OSDI >23 y <75 y haber puntuado la pregunta de ojo con dolor o irritación del OSDI y una puntuación total de tinción corneal con fluoresceína de >6 (escala NEI) y <15. Los sujetos examinados se someten a un tratamiento de cinco a ocho días con una formulación de vehículo enmascarado, y a continuación se vuelven a cribar (Visita 2) para confirmar que cumplen con los criterios de la distribución aleatoria en esta visita. Los criterios de distribución aleatoria incluyen tener una puntuación total de OSDI >19 y <50, tener una puntuación total de tinción corneal con fluoresceína >5 (escala NEI) en el mismo ojo considerado apto que en la Visita 1 y CFS < 15 en al menos un ojo, y haber cumplido el periodo de formulación de vehículo enmascarado de cinco a ocho días. El cumplimiento se define como la administración de al menos un 80 % de las dosis.

A continuación los sujetos se distribuyen de forma aleatoria para el tratamiento con una formulación de vehículo o una formulación terapéutica y se les proporciona suficiente formulación de vehículo o formulación terapéutica para

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una formulación acuosa que comprende:

citrato de sodio o fosfato de sodio en una concentración de 8 a 12 mM;

sorbitol de un 4 % a un 6 % (p/v);

poloxámero 188 en una concentración de un 0,08 % a un 0,12 % (p/v);

y opcionalmente carboximetilcelulosa de sodio,

en donde la formulación tiene un pH de 5,5 a 7,5 y

en donde las formulación es eficaz para tratar un trastorno ocular, tal como un trastorno de ojo seco.

2. La formulación de la reivindicación 1, en donde la formulación comprende:

citrato de sodio en una concentración de 8 a 12 mM;

sorbitol de un 4,5 a un 5,5 % (p/v); y

poloxámero 188 en una concentración de un 0,09 a un 0,11 %;

tal como en donde la formulación consiste en

citrato de sodio en una concentración de 8 a 12 mM, tal como en una concentración de 9 a 11 mM; sorbitol de un 4,5 a un 5,5 % (p/v); y

poloxámero 188 en una concentración de un 0,09 a un 0,11 %.

3. La formulación de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende carboximetilcelulosa de sodio en una concentración de un 0,1-1 %.

4. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la formulación está básicamente exenta de proteína terapéutica.

5. Una formulación acuosa que comprende:

1-100 mg/ml de una proteína citoquina quimérica IL-1 p/IL-1 Ra seleccionada entre el grupo que consiste en P01, P02, P03, P04, P05, P06, y P07; preferentemente P05;

un agente de tamponamiento seleccionado entre citrato de sodio y fosfato de sodio;

sorbitol;

poloxámero 188;

y opcionalmente carboximetilcelulosa de sodio (CMC),

en donde la formulación tiene un pH de 5,5 a 7,5.

6. La formulación de la reivindicación 5, que comprende:

citrato de sodio y/o fosfato de sodio en una concentración total de 5 mM a 15 mM,

sorbitol en una concentración de un 3,5 a un 6,5 % (p/v), y

poloxámero 188 en una concentración de un 0,07 a un 0,13 % (p/v).

7. La formulación de la reivindicación 5 o 6, en donde:

el citrato de sodio está presente en una concentración de 5 mM a 15 mM;

la formulación comprende carboximetilcelulosa de sodio en una concentración de un 0,1-1 % (p/v);

el poloxámero 188 está presente en una concentración de un 0,08 % a un 0,12 % p/v;

el sorbitol está presente en una concentración de un 4 % a un 6 % p/v; y/o

la formulación tiene una osmolalidad de 270-370 mOsm/kg.

8. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en donde la formulación comprende además un aminoácido;

opcionalmente en donde el aminoácido es metionina en una concentración de 1 a 20 mM, opcionalmente en donde la formulación presenta oxidación reducida, en comparación con una formulación correspondiente que no comprende metionina, cuando la formulación se somete a almacenamiento durante al menos 4 semanas a 25 °C.

9. Una formulación acuosa de acuerdo con la reivindicación 5 o 6, en donde la formulación comprende:

1-50 mg/ml de P05;

citrato de sodio en una concentración de 9-11 mM;

sorbitol en un 4,5-5,5 % (p/v); y

poloxámero 188 en una concentración de un 0,09-0,11 % (p/v);

en donde la formulación tiene un pH de 5,7-6,3.

10. La formulación de cualquier reivindicación precedente, en donde la formulación no comprende ningún agente de viscosidad.

11. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la formulación se envasa en un envase de soplado, llenado y sellado.

12. Una formulación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes para uso en el tratamiento de un trastorno relacionado con IL-1, tal como en donde el trastorno relacionado con IL-1 es un trastorno de ojo seco, un trastorno autoinmunitario, un trastorno inflamatorio, o cáncer.

13. Una formulación para uso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde la formulación es:

(i) una formulación acuosa que comprende:

citrato de sodio o fosfato de sodio en una concentración de 8 mM a 12 mM;

sorbitol de un 4 % a un 6 % (p/v);

poloxámero 188 en una concentración de un 0,08 % a un 0,12 % (p/v);

y opcionalmente carboximetilcelulosa de sodio;

en donde la formulación tiene un pH de 5,5 a 7,5 y está básicamente exenta de proteína terapéutica;

0 en donde la formulación es:

(ii) una formulación acuosa que comprende:

1 a 50 mg/ml de P05;

citrato de sodio o fosfato de sodio en una concentración de 8 mM a 12 mM; sorbitol de un 4 % a un 6 % (p/v); poloxámero 188 en una concentración de un 0,05 % a un 0,15 % (p/v);

y opcionalmente carboximetilcelulosa de sodio;

en donde la formulación tiene un pH de 5,5 a 7,5 o en donde la formulación es:

(iii) una formulación acuosa que comprende:

1 mg/ml a 50 mg/ml de P05;

citrato de sodio en una concentración de 9 mM a 11 mM;

sorbitol de un 4,5 % a un 5,5 % (p/v); y

poloxámero 188 en una concentración de un 0,09 % a un 0,11 % (p/v);

en donde la formulación tiene un pH de 5,7 a 6,3.

14. Un envase o dispositivo de administración de fármaco que comprende la formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11; opcionalmente en donde el envase o dispositivo de administración de fármaco es un envase de soplado, llenado y sellado, o en donde el envase o dispositivo de administración de fármaco es un envase de múltiples dosis, o en donde el envase o dispositivo está sellado en una bolsa que contiene un gas inerte.

15. Un kit que comprende un envase o dispositivo de acuerdo con la reivindicación 14 y, opcionalmente, instrucciones de uso.

16. Uso de una formulación acuosa para estabilizar una proteína citoquina quimérica IL-1 p/IL-1 Ra seleccionada entre el grupo que consiste en P01, P02, P03, P04, P05, P06, y P07; en donde la formulación es tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10.

17. El uso de la reivindicación 16, en donde la formulación es estable durante al menos 1 mes o 2 meses o 3 meses o 4 meses o 5 meses, después de almacenamiento a 2-8 °C y un 60 % de humedad relativa,

opcionalmente en donde la formulación es estable después de almacenamiento durante al menos 2 meses o 2 meses o 3 meses o 5 meses, después de almacenamiento en condiciones ambientales, tal como a 25 °C.