ES2875772T3

ES2875772T3 - Método de producción de ADAMTS13 recombinante en cultivo celular

Info

Publication number: ES2875772T3
Application number: ES18175765T
Authority: ES
Inventors: Leopold Grillberger; Manfred Reiter; Daniel Fleischanderl; Gregor Bramberger
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2010-07-08
Filing date: 2011-07-08
Publication date: 2021-11-11
Anticipated expiration: 2031-07-08
Also published as: US9458222B2; KR102007773B1; IL273304B; EA202090220A2; EA202090067A3; SI3064508T1; HRP20181657T1; TWI670073B; SG186936A1; US20180044405A1; EP3392271B1; CA2805557A1; EA201792340A3; NZ605403A; EP2590998A1; WO2012006594A1; US20190085052A1; WO2012006591A1; MX2013000166A; IL255327B

Abstract

Método para producir una composición de ADAMTS13 recombinante (rA13), comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar un medio de cultivo de células basales; (b) complementar el medio de cultivo de células basales con cobre para proporcionar una concentración de cobre final de entre 1,0μg/l y 6 μg/l de cobre; (c) proporcionar una o más células de mamífero que comprenden un ácido nucleico que codifica una proteína rA13; (d) cultivar la una o más células de mamífero en el medio de cultivo celular complementado con cobre de tal manera que se expresa rA13 y se excreta desde las células a un sobrenadante de cultivo, en el que el cultivo comprende el cultivo continuo; y (e) recuperar al menos una porción del sobrenadante de cultivo, en el que el contenido de NH4+ del sobrenadante de cultivo celular se mantiene a una concentración inferior a5 mM, en el que la densidad celular se mantiene a menos de 4,0x106 células por ml durante la etapa de cultivo de la una o más células de mamífero; y en el que están presentes al menos 1500 unidades de actividad FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células basales complementado al día en el sobrenadante de cultivo recuperado.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodode producción deADAMTS13 recombinanteencultivo celular

Referencias cruzadas a solicitudes

Esta solicitudreivindica la prioridad de la solicitud de patente estadounidense provisional con n.° de serie 61/362.635, presentada el 8 de julio de 2010.

Antecedentes de la invención

La expresión recombinantedeproteínas terapéuticasencultivo celular (particularmentecultivos celulares a gran escala), incluyendocultivo de células eucariotas, ymásespecíficamentecultivo de células de mamífero, requiereel usodemedios de cultivo especialesque proporcionansustancias nutritivas para el crecimiento eficazdecélulas. Se complementan a menudo formulaciones de medios de cultivo celularcon una gamadeaditivos, incluyendosuero bovino fetal (FCS), proteínas derivadas de animalesy/ohidrolizados de proteínadeorigen bovino,así comohidrolizados de proteínaderivados deplantas olevaduras. Un retocontales cultivos esquela cantidaddeproteínayla actividad total y específicadela proteína producida son variables a menudo entrediferentescultivos celulares, inclusocuandola formulaciónpara losmedios de cultivo celularno se cambia. Esta variabilidadesespecialmenteevidenteenel casode procedimientos de fabricación a gran escala que utilizan volúmenes decultivo celularde 10 litros a más de 20.000litros. Los medios de cultivo celularque contienenhidrolizados sonparticularmentepropensos a variabilidadde uncultivo celularal siguiente, lo que conduce auna produccióndisminuida de laproteínatotal,así comounaa actividad total y específica disminuida.

Un posible motivo para la variabilidadobservada entrediferentescultivos celularesesque los contaminantes enaditivos tales comohidrolizados varían de un lote al siguiente. En general, el suero o lassustancias derivadas de suero, tales como, por ejemplo, albúmina, transferrinaoinsulina, pueden comprenderagentes no deseados quepueden contaminar loscultivos celularesylos productos biológicos obtenidos de los mismos. Además, los aditivos derivados de suero humanotienen que someterse a prueba para detectar todos los virus conocidos, incluyendovirus de la hepatitis yVIH, que pueden transmitirse a través del suero. Además, el suero bovinoyproductos derivados del mismoconllevan el riesgo decontaminación porEEB. Además, todos losproductos derivados de suero pueden estar contaminados por sustancias desconocidas. Cuandose usasuerooaditivos de proteína derivados de fuentes humanaso animalesencultivo celular, existen numerosos problemas (por ejemplo, la calidad variable en cuanto a composicióndediferentes lotes y el riesgode contaminacióncon micoplasmas, virusoEEB), particularmentesise usan las célulasenla fabricacióndefármacos ovacunas para administración a humanos. Por tanto, se han realizado muchos intentos para proporcionar sistemas huésped y condiciones de cultivo eficaces, queno requieransuerou otros compuestos proteicos de animales.

Se han desarrollado talesmedios sin suero basándose en extractosdeproteínaderivados deplantas olevaduras. Por ejemplo, se sabe que loshidrolizados de soja son útiles para procedimientos de fermentaciónypueden potenciar el crecimiento de muchos hongos, levaduras y organismosde cultivo exigente. El documento WO 96/26266 describeque los digestos papaínicos de harina de soja son una fuentedehidratos de carbonoynitrógenoypueden usarse muchosdelos componentesencultivo tisular. Franek et al. (Biotechnology Progress (2000) 16, 688-692) describen los efectos de fomento del crecimiento y laproductividadde fracciones peptídicas de hidrolizado de trigo y soja definidas.

El documento WO 96/15231 divulgaun medio sin sueroque se compone de un medio esencial mínimo sintéticoyun extracto delevadura para la propagacióndecélulasde vertebrado yun procedimiento de producción de virus. Se divulga una formulaciónde medio que se compone de unmedio de cultivode células basales que comprendeunpéptido de arrozyun extractodelevadurayun digesto enzimático del mismo, y/oun lípido vegetalpara el crecimientodecélulasanimales en el documento WO 98/15614. Se divulga un medioque comprendehidrolizado de soja purificadopara el cultivodecélulas recombinantesen el documento WO 01/23527. El documento WO 00/03000 divulgaun medioquecomprendeunhidrolizado de sojayun extracto de levadura, pero tambiénrequierela presenciadeformas recombinantesdeproteínas animales, tales comofactores de crecimiento.

El documento EP-A-0 481 791 describeunmedio de cultivodefinido a nivel bioquímico para cultivar células CHO modificadas por ingeniería, quecarece deproteínas, lípidose hidratos de carbono aislados de una fuente animal, que comprende ademásuna insulina o análogo de insulina recombinante, peptona de soja digerida con papaína a del 1% al 0,025% p/vy putrescina. El documento WO 98/08934 describeun cultivo de células eucariotas sin sueroque comprendepéptidosde soja hidrolizados (1-1000 mg/l), putrescina0,01 a 1 mg/l yuna variedaddecomponentes derivados de animales, incluyendoalbúmina, fetuína, diversashormonas yotrasproteínas. Eneste contexto, debe indicarse que también se sabe que la putrescina está comprendida en medios convencionales como DMEM/F12 de Ham enuna concentraciónde0,08 mg/l.

Sin embargo, los hidrolizados vegetales y/o de levadura, sonmezclas indefinidasde oligopéptidos yotroscomponentes y contaminantes desconocidos. Además, la calidaddelotes disponiblescomercialmente dehidrolizados varía de manera extrema. Como resultado, existen grandes variacionesenla produccióndeproteínasrecombinantes oproductos virales (una variacióndehasta un factor detres) enfuncióndelos lotesdehidrolizados usados (“variación entre lotes”). Este inconveniente afecta a la proliferacióndelas células,así como ala expresión de proteínasdecadacélula. El documento US 2007/0212770 describediversosmedios de cultivo definidos a nivel químico, sin oligopéptidos y libre de proteínas animalesquesonútilespara la producción a gran escalade productos biofarmacéuticos deproteínas recombinantes.

La hemostasiaimplicala interaccióndediversas rutas de reacción hemostáticasque conducenfinalmentea la formación de trombos. Los trombos son depósitos decomponentes sanguíneos en la superficie de la pared vascular que consisten principalmente en plaquetas sanguíneas agregadas y fibrina reticulada insoluble. La formaciónde fibrina esel resultadodela proteólisis restringida de fibrinógeno por trombina, unaenzima de la coagulación. La trombina es elproductofinal dela cascada de coagulación, una sucesión de activaciones de zimógeno que se producen en las superficies de plaquetas sanguíneas activadas y leucocitos, yuna variedaddecélulasvasculares (para un estudio, remítase a K. G. Mann et al., Blood, 1990, Vol. 76, págs. 1-16).

Una importantefunciónenla cascada de coagulaciónresideenla activacióndel factor X por el complejodefactor IX activado (factor IXa) yfactor VIII activado (factor VIIIa). Una deficiencia o una disfuncióndelos componentesdeeste complejo se asocia con la hemopatía conocida como hemofilia (J. E. Sadler & E. W. Davie: Hemophilia A, Hemophilia B, and von Willebrand's Disease, en G. Stamatoyannopoulos et al., (Eds.): The molecular basis of blood diseases. W.B. Saunders Co., Filadelfia, 1987, págs. 576-602). La hemofilia A se refiere auna deficienciade la actividad delfactor VIII, mientras quela hemofilia B se refiere auna deficiencia del factor IX. Eltratamientoactual consiste enunaterapiade sustitución usando preparacionesfarmacéuticas que se componen del factor de coagulaciónnormal. Deestas trombopatías, la hemofilia A se produce conmásfrecuencia, afectando aaproximadamenteuno de cada 10.000hombres. Laterapiade sustitución enpacientes con hemofilia A implicala administraciónrepetida de preparacionesque contienenfactor VIII normal medianteinfusión intravenosa. El intervaloentrelas infusiones esuna funcióndela degradacióndela actividad del factor VIII enla circulación sanguínea. La semivida de la actividad del factor VIII después de una infusión difiere de un individuo a otro, oscilando entre 10 y 30 horas. Por tanto, unaterapiaprofiláctica requiereuna infusióncada de dos atresdías. Esto constituye una pesada carga en la vida de lospacientes hemofílicos, en particular, sise ha vuelto difícil poner una vía venosa debido a cicatrización local tras punciones con aguja frecuentes para lasinfusiones intravenosas.

Seríaparticularmenteventajoso si pudiera reducirse la frecuencia de lasinfusiones usando factor VIII que tuviera semividas ampliadas. Se conoce bien en la técnica que la semivida del heterodímero de factor VIII no activado depende enormemente de la presencia de factor de von Willebrand, quepresenta una fuerte afinidadporel factor VIII (aunque no porel factor VIIIa) ysirve comoproteínatransportadora (J. E. Sadler y E. W. Davie: Hemophilia A, Hemophilia B and von Willebrand's disease, en G. Stamatoynnopoulos et al. (Eds.): The molecular basis of blood diseases. W.B. Saunders Co., Philadelphia, 1987, págs. 576-602). Se sabequelos pacientes que presentan la enfermedad de von Willebrand tipo 3, que no tienenfactor de von Willebrand detectable en su circulación sanguínea, también presentan una deficiencia secundaria defactor VIII. Además, la semividadefactor VIII administrado por vía intravenosa en esos pacientes esde 2 a 4 horas, lo quees considerablementemás corto que las 10 a 30 horas observadasenlos pacientes con hemofilia A. A partir de estos hallazgos, resultaqueel factor VIII tiende a un rápido aclaramiento de la circulaciónsanguínea yqueeste proceso está inhibido en cierta medida por la complejaciónconsutransportador natural, el factor de von Willebrand.

El factor de von Willebrand (vWF) esuna glicoproteína que circulaen plasma como una seriede multímeros con un tamaño que oscila normalmenteentreaproximadamente 500 y 20.000 kD (ode 2 a 40 dímeros de vWF). Los dímeros ylas formas multiméricasde vWF se componende subunidades polipeptídicas de 250 kD unidas entre sí mediante enlaces disulfuro. vWF media en la adhesión plaquetaria inicial al subendoteliodela pared del vaso dañado; sólolos multímeros más grandes muestran también actividad hemostática. ElvWFmultimerizado se une a la glicoproteína de la superficie de plaquetas Gp1ba, a través de una interacciónenel dominio A1 devWF, para facilitar la adhesión plaquetaria. Se supone que lascélulasendoteliales secretan grandes formaspoliméricasde vWF yqueaquellas formas de vWF quetienen un bajo peso molecular (vWF de bajo peso molecular) han surgido de escisión proteolítica. Los multímeros que tienen grandes masas moleculares se almacenan en los cuerpos de Weibel-Palade de lascélulasendotelialesyse liberan tras estimulación.

La reduccióndela actividad de unión a FVIII, debida o bien a niveles reducidos de proteína vWF o bien a una afinidad de unión a FVIII disminuida, da como resultadouno de los tres tipos de enfermedad de von Willebrand. Ademásde, oalternativamente, determinados tiposdeenfermedad de von Willebrandse caracterizan por un aumento o una disminución del niveldeasociación plaquetaria mediada por Gp1ba, concretamenteenlos tipos 2A, 2By 2M (resumidoen Castaman et al., Disorders of Hemostasis 88(1 ):94-108 (2003)). Como tal, la modulacióndelas interaccionesde vWF tanto con FVIII como con Gp1baesuna estrategia viable para tratamiento tanto dehemofilia como deenfermedad de von Willebrand.

Dada la importanciabiológica de vWF, existe una necesidad constante en la técnica de mejorar los modosdeproducir vWF para aplicaciones terapéuticas. Se conoce bienque puede aislarse vWF defuentes endógenas, tales comoplasma sanguíneo humano. El vWF aisladoesventajoso porquetiene altaactividadespecífica para llevar a cabosufunción biológica y, por tanto, puede usarse eficazmentecomo proteína terapéuticapara tratarenfermedades relacionadas, tales comoenfermedad de von Willebrand. Normalmente, el vWF en plasmatiene unaactividad de ristocetina específicadeaproximadamente 100 mU/pg, pero el aislamiento delplasma sanguíneo humanotiene desventajas porque, por ejemplo, el plasmapuede contener una variedadde virus, tales comoVIHy/ovirus de la hepatitis, quepueden transferirse alpaciente. Además, el plasma esun recurso limitadoy, por tanto, la escasezde plasma puede ser problemática paraproporcionarsuficiente vWF para el tratamiento. Como tal, los métodos recombinantes para producir vWF sonventajosos al abordar algunos de los problemas asociados con basarse en plasma como fuente para vWF. Para laproducción recombinante, se clonó la longitud completadeADNcde vWF; el propolipéptido corresponde a losresiduos de aminoácido 23 a 764 de prepro-vWF de longitud completa (Eikenboom et al. (1995) Haemophilia 1, 7790).

Desafortunadamente, vWF esuna moléculacon modificaciones postraduccionales complejas. Además,la multimerizacióndelos dímeros de vWFpara dar multímeros grandes y ultragrandes en el aparatode Golgi esun reto para laexpresiónencélulas de mamífero. Por ejemplo, vWF de alto peso molecular expresadoencultivo celularde, por ejemplo, células endoteliales humanas (primarias) depende del almacenamiento específico de moléculas de vWF ultragrandes encuerpos de Weibel-Palade. Talescultivos celularesno son adecuados para la produccióndeproteínas terapéuticas. Se han notificado otros métodos de cultivo celular, yse sabe que las condiciones decultivo celularpueden afectar a la producciónde vWF de una variedaddemodos. Por ejemplo, se ha mostrado que altasconcentracionesdeamonio (NH4+) perturban las modificaciones postraduccionales. Mayadas et al. (J. Biol. Chem., 264(23): 13497-13503, 1989) demostraronquenivelesdeamonio 25 mM daban como resultado una multimerización de vWF reducida encélulas endoteliales, loquetambiénafecta negativamentea laactividad de ristocetina específicadevWF recombinante. La reduccióndela multimerizaciónestá asociadageneralmenteconla reduccióndeactividad, particularmenteactividad de ristocetina específica, devWF recombinante.

Todavía sigue siendo difícil predecir quéparámetros pueden afectar positivao negativamentea la produccióndeuna proteína particular, especialmenteglicoproteínas complejas comoel factor VIII y vWF. Por ejemplo, se ha mostrado que determinadoscomponentes deun medio de cultivo celularafectan a la producción del factor VIII. Tal como se divulgaenla patente estadounidense n.° 5.804.420, la adicióndepoliol, cobreyotros oligometales puede afectar positivamenteal rendimiento de produccióndel factor VIII. Tal como se describe tambiénen el documento WO 2009/086309, se ha mostrado que en procedimientos de cultivo celularque usancobrese mejora la producción del factor VIII. También se ha notificado la expresiónde vWF encélulas CHOrecombinantes por Mignot et al. (1989). Sin embargo, ninguno de estosejemplos proporciona informaciónreferente ala actividad específicade vWF oa su distribución multimérica.

Lasproteínas ADAMTS (una disintegrinay metaloproteinasacon motivos de tipo I de trombospondina) sonuna familiademetaloproteinasas que contienenvarios dominios conservados, incluyendoun dominio catalítico dependiente de zinc, un dominio rico en cisteína, un dominio de tipo disintegrina, yal menosuna repetición, yenla mayoría de los casos múltiples repeticiones, de tipo I de trombospondina (para una revisión, véaseNicholson et al., BMC Evol Biol. 4 de feb. de 2005;5(1): 11). Estasproteínas, queestán relacionadas a nivel evolutivo con las familias de ADAM y MMP demetaloproteinasas (Jones GC, Curr Pharm Biotechnol. 2006 Feb;7(1):25-31), sonenzimas secretadas quese han vinculado con variasenfermedadesyafecciones, incluyendopúrpura trombocitopénica trombótica (PTT) (Moake JL, Semin Hematol. 2004 Ene;41(1):4-14), trastornos de tejidos conjuntivos, cánceres, inflamación (Nicholson et al.) ypaludismo por Plasmodium falciparum grave (Larkin et al., PLoS Pathog. 2009 Mar;5(3):e1000349). Debido a estas asociaciones, se han reconocido lasenzimas ADAMTS como posibles dianas terapéuticas para varias patologías (Jones GC, Curr Pharm Biotechnol. 2006 Feb;7(1):25-31). Por consiguiente, son necesarios métodos de producción degrandes rendimientosdeproteínasADAMTS que tengan altasactividades específicas, quecarezcan de contaminantes tales como virus, EEBypatógenos como bacteriasMycoplasma.

Un miembro de la familia de ADAMTS, ADAMTS13, escindeel factor de von Willebrand (vWF) entrelos residuos Tyr-1605 y Met-1606, unafunciónresponsable dela degradacióndegrandes multímeros de vWF in vivo. La pérdidadeactividad de ADAMTS13se ha vinculado con varias afecciones, tales comoPTT (Moake JL, Semin Hematol. 2004Ene;41(1):4-14), inflamaciónaguda y crónica (Chauhan et al., J Exp Med. 2008 Sep 1;205(9):2065-74) y,másrecientemente, paludismo por Plasmodium falciparum grave (Larkin et al., PLoS Pathog. 2009 Mar;5(3):e1000349).

La proteasaADAMTS13es una proteína glicosilada de 190 kDa producida predominantementepor el hígado (Levy et al., Nature. 2001; 413:488-494; Fujikawa et al., Blood. 2001; 98:1662-1666; Zheng et al., J Biol Chem. 2001; 276:41059-41063; Soejima et al., J Biochem (Tokyo). 2001; 130:475-480; y Gerritsen et al., Blood. 2001; 98:1654-1661). De manera muy similar a los multímeros de rVWF de orden superior, la expresión recombinantedeADAMTS13grande encultivo de células de mamífero presenta muchos retos.

Por tanto, existe la necesidad de proporcionarcondiciones de cultivo celular, particularmentecondiciones de cultivo para fabricación a gran escala, queproporcionenun rendimiento de proteína total sistemáticoy/ouna actividad total y específica sistemática delasproteínas producidasentrediferentescultivos celulares. La sistematicidad entre cultivos enprocedimientos de fabricación a gran escalaesde importanciaenla fabricacióndeproteínas terapéuticas. También existe la necesidad decondiciones de cultivo celularpara la producción a gran escalade rVWF conuna distribución multiméricayactividad de ristocetina específica comparables aomayores quevWFtal como está presenteenplasma humano normal. De manera similar, como se han implicado lasproteínas ADAMTS en variasenfermedadesyafecciones, existe la necesidad en la técnica demétodos deproducción a gran escaladeproteínas ADAMTS recombinantesque tengan altasactividades específicas, quesean adecuadas para formulacióny administración farmacéuticas. La presente invenciónsatisface estas y otras necesidades en la técnicapara la produccióndefactor de von Willebrand recombinanteyADAMTS13 recombinante.

El documento WO 2009/086309 se refiere a procedimientos para cultivar células de mamífero que secretan proteínas sanguíneas, tales como factor de coagulación sanguínea VIII, ADAMTS-13, furina o factor de coagulación VII.

El documento US 2007/0212770se refiere a medios de cultivo celular libres de oligopéptidos que comprenden al menos 0,5 mg/l de una poliamina y a métodos para cultivar células en dichos medios de cultivo celular libres de oligopéptidos que comprenden al menos 0,5 mg/l de una poliamina.

Breve sumario de invención

En determinados aspectos, la presente invención se basa en el hallazgo sorprendente de que la complementación de medios de cultivo celular usados para expresar ADAMTS13 recombinante (rA13) da como resultado una expresión de proteína y actividad enzimática mejoradas significativamente.

En un primer aspecto, la presente divulgación proporciona un método para producir una composición de factor de von Willebrand recombinante (rVWF), comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar un medio de cultivo de células basales; (b) complementar el medio de cultivo de células basales con cobre para proporcionar una concentración de cobre final de al menos 2,4 pg/l; (c) proporcionar una o más células que comprenden un ácido nucleico que codifica una proteína rVWF; (d) cultivar la una o más células en el medio de cultivo celular complementado con cobre de tal manera que se expresa rVWF y se excreta desde las células a un sobrenadante de cultivo; y (e) recuperar al menos una porción del sobrenadante de cultivo, en el que el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 30 mU/pg de rVWF.

En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, el método comprende además una etapa de complementación del medio de cultivo de células basales con un hidrolizado antes del cultivo de la una o más células.

En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, el hidrolizado es un hidrolizado vegetal. En una realización específica, el hidrolizado es un hidrolizado de soja.

En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, el medio de cultivo de células basales es un medio de cultivo libre de proteínas animales.

En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, el medio de cultivo de células basales es un medio de cultivo libre de proteínas.

En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, el medio de cultivo de células basales es un medio de cultivo definido químicamente.

En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, la concentración de cobre final del medio de cultivo de células basales complementado con cobre es de al menos 4 pg/l de cobre.

En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, la concentración de cobre final del medio de cultivo de células basales complementado con cobre es de entre 2,4 pg/l y 20 pg/l de cobre.

En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, la complementación con cobre del medio de cultivo de células basales se proporciona como una sal de cobre, un quelato de cobre o una combinación de los mismos.

En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, la sal de cobre se selecciona del grupo que consiste en sulfato de cobre, acetato de cobre, carbonato de cobre, cloruro de cobre, hidróxido de cobre, nitrato de cobre y óxido de cobre.

En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, la una o más células son células de mamífero. En una realización específica, las células de mamífero son células CHO.

En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, el cultivo de la una o más células comprende el cultivo discontinuo de las células.

En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, el cultivo de la una o más células comprende el cultivo continuo de las células. En una realización específica, el cultivo continuo de células se realiza en modo quimiostático. En otra realización específica, el cultivo continuo de células se realiza en modo de perfusión.

En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, la una o más células se cultiva en al menos 100 l del medio de cultivo de células basales complementado.

En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, la densidad celular se mantiene a menos de 2,5x106 células por ml durante la etapa de cultivo de la una o más células.

En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, la densidad celular se mantiene a menos de 2,0x106 células por ml durante la etapa de cultivo de la una o más células.

En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, la densidad celular se mantiene a menos de 1,5x106 células por ml durante la etapa de cultivo de la una o más células.

En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, la etapa de recuperación de al menos una porción del sobrenadante de cultivo comprende filtración o centrifugación para retirar células de la porción de sobrenadante de cultivo.

En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 40 mU/pg de rVWF. En una realización específica, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 50 mU/pg de rVWF. En una realización más específica, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 60 mU/pg de rVWF. En una realización más específica, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 70 mU/pg de rVWF. En una realización aún más específica, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 80 mU/pg de rVWF.

En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, al menos el 10% del rVWF en el sobrenadante está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En una realización específica, al menos el 15% del rVWF está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra realización específica, al menos el 20% del rVWF está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra realización específica, al menos el 25% del rVWF está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra realización específica, al menos el 30% del rVWF está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros.

En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, el sobrenadante contiene multímeros de vWF de alto peso molecular de 14 a 22 dímeros.

En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, el contenido de NH4+ del sobrenadante de cultivo se mantiene a una concentración inferior a 10 mM.

En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, el contenido de NH4+ del sobrenadante de cultivo se mantiene a una concentración inferior a 4 mM.

En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, se coexpresa rVWF con factor VIII recombinante (rFVIII). En una realización específica, el método comprende además una etapa de purificación de rVWF separándolo de al menos el 50% del rFVIII presente en el sobrenadante recuperado. En una realización, la razón de rVWF con respecto a rFVIII después de la etapa de purificación es de al menos 10:1.

En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, el método comprende además una etapa de enriquecimiento en rVWF.

En un segundo aspecto, la presente divulgación proporciona una composición de factor de von Willebrand recombinante (rVWF) preparada mediante un método proporcionado en el presente documento.

En una realización de las composiciones proporcionadas anteriormente, la composición comprende además factor VIII recombinante (rFVIII). En una realización específica, la razón de rVWF con respecto a rFVIII es de al menos 10:1.

En una realización de las composiciones proporcionadas anteriormente, la composición se formula para administración farmacéutica. En una realización específica, la composición se formula para administración intravenosa.

En un tercer aspecto, la presente divulgación proporciona un sobrenadante de cultivo celular que comprende factor de von Willebrand recombinante (rVWF), en el que se prepara el sobrenadante mediante un método proporcionado en el presente documento.

En un cuarto aspecto, la presente divulgación proporciona un sobrenadante de cultivo celular que comprende factor de von Willebrand recombinante (rVWF), en el que al menos el 10% del rVWF en el sobrenadante está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En una realización específica, al menos el 15% del rVWF en el sobrenadante está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra realización específica, al menos el 20% del rVWF en el sobrenadante está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra realización específica, al menos el 25% del rVWF en el sobrenadante está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra realización específica, al menos el 30% del rVWF en el sobrenadante está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En aún otra realización específica de los sobrenadantes proporcionados anteriormente, se prepara el sobrenadante según un método proporcionado en el presente documento.

En un quinto aspecto, la presente divulgación proporciona un sobrenadante de cultivo celular que comprende factor de von Willebrand recombinante (rVWF), en el que el sobrenadante contiene al menos 0,4 U.I. de actividad de cofactor de ristocetina por ml. En una realización específica, el sobrenadante contiene al menos 0,5 U.I. de actividad de cofactor de ristocetina por ml. En otra realización específica, el sobrenadante contiene al menos 0,6 U.I. de actividad de cofactor de ristocetina por ml. En otra realización específica, el sobrenadante contiene al menos 0,7 U.I. de actividad de cofactor de ristocetina por ml. En aún otra realización específica de los sobrenadantes proporcionados anteriormente, se prepara el sobrenadante según un método proporcionado en el presente documento.

En un sexto aspecto, la presente invención proporciona un método para producir una composición de ADAMTS13 recombinante (rA13), comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar un medio de cultivo de células basales; (b) complementar el medio de cultivo de células basales con cobre para proporcionar una concentración de cobre final entre1,0 pg/l y 6,0 pg/l de cobre; (c) proporcionar una o más células de mamífero que comprenden un ácido nucleico que codifica una proteína rA13; (d) cultivar la una o más células de mamífero en el medio de cultivo celular complementado con cobre de tal manera que se expresa rA13 y se excreta desde las células a un sobrenadante de cultivo, en el que el cultivo comprende cultivo continuo; y (e) recuperar al menos una porción del sobrenadante de cultivo, en el que el contenido de NH4+ del sobrenadante de cultivo celular se mantiene a una concentración inferior a 5 mM; en el que la densidad celular se mantiene a menos de 4,0x106 células por ml durante la etapa de cultivo de la una o más células de mamífero; y, en el que están presentes al menos 1500 unidades de actividad FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células basales complementado al día en el sobrenadante de cultivo recuperado.

En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, la concentración de cobre final del medio de cultivo de células basales complementado es de al menos 1 pg/l de cobre.

En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, la concentración de cobre final del medio de cultivo de células basales complementado es de al menos 2 pg/l de cobre.

En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, la concentración de cobre final del medio de cultivo de células basales complementado es de al menos 4 pg/l de cobre.

En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, la concentración de cobre final del medio de cultivo de células basales complementado es de entre 1 pg/l y 6 pg/l de cobre.

En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, la concentración de cobre final del medio de cultivo de células basales complementado es de entre 2 pg/l y 4 pg/l de cobre.

En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, la complementación con cobre del medio de cultivo de células basales se proporciona como una sal de cobre, un quelato de cobre o una combinación de los mismos. En una realización específica, la sal de cobre se selecciona del grupo que consiste en sulfato de cobre, acetato de cobre, carbonato de cobre, cloruro de cobre, hidróxido de cobre, nitrato de cobre y óxido de cobre.

En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, la densidad celular se mantiene a menos de 4,0x106 células por ml durante la etapa de cultivo de la una o más células.

En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, la densidad celular se mantiene a menos de 3,5x106 células por ml durante la etapa de cultivo de la una o más células.

En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, la densidad celular se mantiene a menos de 3,0x106 células por ml durante la etapa de cultivo de la una o más células.

En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, están presentes al menos 2000 unidades de actividad FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células basales complementado al día en el sobrenadante de cultivo recuperado.

En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, están presentes al menos 2500 unidades de actividad FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células basales complementado al día en el sobrenadante de cultivo recuperado.

En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, el sobrenadante recuperado tiene una actividadFRETS-VWF73 específica de rA13 de al menos 800 mU/pg.

En una realización preferida de los métodos proporcionados anteriormente, el sobrenadante recuperado tiene una actividad FRETS-VWF73 específica de rA13 de al menos 1200 mU/pg.

En una realización más preferida de los métodos proporcionados anteriormente, el sobrenadante recuperado tiene una actividad FRETS-VWF73 específica de rA13 de al menos 1600 mU/pg.

En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, el contenido de NH4+ del sobrenadante de cultivo se mantiene a una concentración inferior a 5 mM.

En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, el método comprende además una etapa de enriquecimiento en rA13.

En un séptimo aspecto, la presente invención proporciona un sobrenadante de cultivo celular que comprende ADAMTS13 recombinante (rA13), en el que se prepara el sobrenadante mediante un método proporcionado en el presente documento, en el que están presentes al menos 1500 unidades de actividad FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células basales complementado al día en el sobrenadante de cultivo recuperado, y en el que el sobrenadante contiene al menos 6 U de actividad FRETS-VWF73 por ml. En otra realización específica, el sobrenadante contiene al menos 7 U de actividad FRETS-VWF73 por ml. En otra realización específica, el sobrenadante contiene al menos 8 U de actividad FRETS-VWF73 por ml. En otra realización específica, el sobrenadante contiene al menos 9 U de actividad FRETS-VWF73 por ml. En otra realización específica, el sobrenadante contiene al menos 10 U de actividad FRETS-VWF73 por ml. En aún otra realización específica de los sobrenadantes proporcionados anteriormente, se prepara el sobrenadante según un método proporcionado en el presente documento.

En un noveno aspecto, la presente invención proporciona un sobrenadante de cultivo celular tal como se define mediante las reivindicaciones que comprende ADAMTS13 recombinante (rA13), en el que el sobrenadante contiene al menos 2 pg de rA13 por ml. En una realización específica, el sobrenadante contiene al menos 3 pg de rA13 por ml. En otra realización específica, el sobrenadante contiene al menos 4 pg de rA13 por ml. En otra realización específica, el sobrenadante contiene al menos 5 pg de rA13 por ml. En otra realización específica, el sobrenadante contiene al menos 6 pg de rA13 por ml. En aún otra realización específica de los sobrenadantes proporcionados anteriormente, se prepara el sobrenadante según un método proporcionado en el presente documento.

En un décimo aspecto, la presente divulgación proporciona una composición de ADAMTS13 recombinante (rA13) preparada mediante un método según uno cualquiera de los métodos descritos anteriormente.

A continuación en el presente documento se enumeran realizaciones preferidas adicionales.

Realizaciones preferidas

1. Método para producir una composición de ADAMTS13 recombinante (rA13), comprendiendo el método las etapas de:

(a) proporcionar un medio de cultivo de células basales;

(b) complementar el medio de cultivo de células basales con cobre para proporcionar una concentración de cobre final de entre 1,0pg/l y 6 pg/l de cobre;

(c) proporcionar una o más células de mamífero que comprenden un ácido nucleico que codifica una proteína rA13;

(d) cultivar la una o más células de mamífero en el medio de cultivo celular complementado con cobre de tal manera que se expresa rA13 y se excreta desde las células a un sobrenadante de cultivo, en el que el cultivo comprende el cultivo continuo; y

(e) recuperar al menos una porción del sobrenadante de cultivo,

en el que el contenido de NH4+ del sobrenadante de cultivo celular se mantiene a una concentración inferior a5 mM,

en el que la densidad celular se mantiene a menos de 4,0x106 células por ml durante la etapa de cultivo de la una o más células de mamífero; y

en el que están presentes al menos 1500 unidades de actividad FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células basales complementado al día en el sobrenadante de cultivo recuperado.

2. Método según el punto 1, en el que el medio de cultivo de células basales es un medio de cultivo libre de proteínas animales.

3. Método según el punto 1 ó 2, en el que el medio de cultivo de células basales esun medio de cultivo libre de proteínas.

4. Método según uno cualquiera de los puntos 1 a 3, en el que el medio de cultivo de células basales es un medio de cultivo definido químicamente.

5. Método según uno cualquiera de los puntos 1 a 4, en el que la concentración de cobre final del medio de cultivo de células basales complementado es de al menos 2 pg/l de cobre.

Método según uno cualquiera de los puntos 1 a 4, en el que la concentración de cobre final del medio de cultivo de células basales complementado es de entre 2 pg/l y 4 pg/l de cobre.

Método según uno cualquiera de los puntos 1 a 6, en el que la complementación con cobre del medio de cultivo de células basales se proporciona como una sal de cobre, un quelato de cobre o una combinación de los mismos.

Composición según el punto 7, en la que la sal de cobre se selecciona del grupo que consiste en sulfato de cobre, acetato de cobre, carbonato de cobre, cloruro de cobre, hidróxido de cobre, nitrato de cobre y óxido de cobre.

Método según uno cualquiera de los puntos 1 a 8, en el que la una o más células son células de mamífero. Método según el punto 9, en el que las células de mamífero son células CHO.

Método según los puntos 1-10, en el que el cultivo continuo de célulasse realiza en modo quimiostático. Método según los puntos 1-10, en el que el cultivo continuo de célulasse realiza en modo de perfusión. Método según uno cualquiera de los puntos 1 a 12, en el que la una o más células se cultivan en al menos 100 l del medio de cultivo de células basales complementado.

Método según los puntos 1-13, en el que la densidad celular se mantiene a menos de 3,5x106 células por ml durante la etapa de cultivo de la una o más células.

Método según los puntos 1-13, en el que la densidad celular se mantiene a menos de 3,0x106 células por ml durante la etapa de cultivo de la una o más células.

Método según los puntos 1-13, en el que la densidad celular se mantiene a menos de entre 3,0x106 células por ml y 4,0x106 células por ml durante la etapa de cultivo de la una o más células.

Método según uno cualquiera de los puntos 1 a 15, en el que la etapa de recuperación de al menos una porción del sobrenadante de cultivo comprende filtración o centrifugación para retirar células de la porción de sobrenadante de cultivo.

Método según uno cualquiera de los puntos 1 a 17, en el que están presentes al menos 2000 unidades de actividad FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células basales complementado al día en el sobrenadante de cultivo recuperado.

Método según el punto 18, en el queestán presentes al menos 2500 unidades de actividad FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células basales complementado al día en el sobrenadante de cultivo recuperado.

Método según uno cualquiera de los puntos 1 a 19, en el que el sobrenadante recuperado tiene una actividad FRETS-VWF73 específica de rA13 deal menos 800 mU/pg.

Método según uno cualquiera de los puntos 1 a 19, en el que el sobrenadante recuperado tiene una actividad FRETS-VWF73 específica de rA13 deal menos 1200 mU/pg.

Método según uno cualquiera de los puntos 1 a 19, en el que el sobrenadante recuperado tiene una actividad FRETS-VWF73 específica de rA13 deal menos 1600 mU/pg.

Método según uno cualquiera de los puntos 1 a 22, en el que el método comprende además una etapa de enriquecimiento en rA13.

Sobrenadante de cultivo celular que comprende ADAMTS13 recombinante (rA13), en el que se prepara el sobrenadante mediante un método según uno cualquiera de los puntos anteriores,

en el que están presentes al menos 1500 unidades de actividad FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células basales complementado al día en el sobrenadante de cultivo recuperado, y

en el que el sobrenadante contieneal menos 6 U de actividad FRETS-VWF73 por ml.

Sobrenadante de cultivo celular según el punto 24, en el que el sobrenadante contiene al menos 8 U de actividad FRETS-VWF73 por ml.

26. Sobrenadante de cultivo celular según el punto 24, en el que el sobrenadante contiene al menos 10 U de actividad FRETS-VWF73 por ml.

27. Sobrenadante de cultivo celular que comprende ADAMTS13 recombinante (rA13) según el punto 24, en el que el sobrenadante contiene al menos 3 pg de rA13 por ml.

28. Sobrenadante de cultivo celular según el punto 27, en el que el sobrenadante contiene al menos 4pg de rA13 por ml.

29. Sobrenadante de cultivo celular según el punto 27, en el que el sobrenadante contiene al menos 5pg de rA13 por ml.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. (1A) Electroforesis en gel de agarosa de baja resolución (1%) de rVWF expresado en cultivo de células de mamífero en presencia de baja (1,0 pg/l) y alta (4,3 pg/l) concentración de cobre, tal como se describe en el ejemplo 2. Obsérvese que el día 3 de cultivo es equivalente al día 1 en modo discontinuo de la tabla 7 y la tabla 8. (1B) Las cantidades relativas de multímeros de vWF que tienen de 1 a 10 dímeros (número de banda 1) y más de 10 dímeros (número de banda 2), tal como se indica mediante las bandas definidas en la figura 1A, se cuantificaron mediante análisis densitométrico.

Figura 2. (2A) Gráfica de intervalo de la actividad específica de rVWF promedio presente en sobrenadantes de cultivo celular de rVWF hechos crecer a densidades celulares alta y baja en presencia de niveles alto o bajo de cobre. (2B) Gráfica de intervalo de la concentración de NH4+ promedio hallada en sobrenadantes de cultivo celular de rVWF hechos crecer a densidades celulares alta y baja en presencia de niveles alto o bajo de cobre.

Figura 3. Se investigaron sobrenadantes de cultivos celulares que expresan ADAMTS13 recombinante en presencia de niveles crecientes de cobre mediante análisis de SDS-PAGE. Se visualizó rA13 después de SDS-PAGE mediante (3A) tinción con plata y (3B) inmunotransferencia de tipo Western con anticuerpo anti-A13.

Figura 4. Gráfica de datos de productividad volumétrica (P FRETS) frente a la concentración de cobre que muestra una extrapolación (línea continua) del efecto de la concentración óptima de cobre sobre la productividad de rA13. Figura 5A-K. Gráficos de barras de cultivos celulares en suspensión continua (quimiostato) que expresan rA13 a lo largo de un tiempo de cultivo de 8 semanas que comparan los efectos de niveles basales de cobre (0,66 pg/l) con los de cultivos complementados hasta una concentración final de 2 pg/l de cobre. Cada barra representa los datos medios de una semana de cultivo quimiostático. Las leyendas se refieren a la semana particular representada en los datos.

Figura 6. (6A) Electroforesis en gel de agarosa de baja resolución (1%) de rVWF expresado en cultivo de células de mamífero en presencia de baja (1,0 pg/l) y alta (4,3 pg/l) concentración de cobre a densidades celulares alta y baja tal como se describe en el ejemplo 3. Obsérvese que los días de cultivo 8 y 17 (“CST8” y “CST17”) son equivalentes al día 8 y al día 17 de la tabla 10 a la tabla 13. (6B) Las cantidades relativas de multímeros de vWF que tienen de 1 a 10 dímeros y más de 10 dímeros, tal como se indica mediante las bandas definidas en la figura 6A, se cuantificaron mediante análisis densitométrico.

Descripción detallada de invención

I. Introducción

Pueden producirse vWF recombinante (rVWF) y ADAMTS13 recombinante (rA13) mediante expresión en cultivos de células de mamífero a gran escala. Sin embargo, la actividad de estas proteínas cuando se producen usando condiciones de cultivo celular convencionales a menudo varía entrelos cultivos celulares, incluso cuando no se cambian las formulaciones generales de los medios y las actividades específicas de las proteínas recombinantes a menudo no son iguales a las de vWF y rA13 derivados de plasma sanguíneo. Además, rVWF expresado en cultivos de células de mamífero tiende a producir composiciones de proteína con porcentajes bajos (inferiores al 10%) de multímeros de orden superior (los multímeros de orden superior incluyen moléculas que contienen más de 10 dímeros de vWF). Estos inconvenientes en los métodos convencionales de producción de rVWF y rA13 son particularmente problemáticos cuando se desarrollan cultivos para la producción a gran escala (es decir, cultivos de desde 10 hasta más de 20.000 litros).

Una posible fuente de la variabilidad observada a menudo en diferentes lotes de cultivo celular es la presencia de contaminantes en componentes de los medios de cultivo celular. Estos contaminantes pueden estar presentes en diferentes cantidades en diferentes lotes, lo que conduce a resultados variables en la producción de rVWF y rA13. Después de investigar los diferentes contaminantes hallados en diversos aditivos de medios de cultivo celular, los presentes inventores hallaron que la presencia de hidrolizados conduce a variación en las concentraciones de cobre en los medios celulares. Una investigación adicional proporcionó el resultado sorprendente de que las concentraciones de cobre de complementación en medios celulares para producir una concentración de cobre total de al menos aproximadamente 1 pg/l a aproximadamente 20 pg/l aumentó sistemáticamente la actividad total y específica de rVWF y rA13 y/o también podía conducir a un rendimiento de proteína total aumentado. Por tanto, la presente invención proporciona métodos y composiciones para la producción con alto rendimiento de proteínas rA13 con alta actividad específica.

En un aspecto, la presente invención proporciona métodos de cultivo celular y composiciones para producir grandes cantidades de rA13 con actividad que es comparable a o mayor que la observada con ADAMTS13 derivado de plasma (pdA13). En aspectos adicionales, las proteínas rVWF y rA13 producidas según la presente invención muestran sistemáticamente mayor actividad que las proteínas producidas usando métodos de cultivo celular convencionales en medios que no se han complementado con cobre u otros complementos descritos con mayor detalle en el presente documento. Ventajosamente, en determinadas realizaciones de las composiciones y los métodos proporcionados en el presente documento, las proteínas rA13 producidas según la presente invención muestran sistemáticamente mayor actividad específica (es decir, U/mg de proteína) que las proteínas producidas usando métodos de cultivo celular convencionales en medios que no se han complementado con cobre u otros complementos descritos con mayor detalle en el presente documento. Asimismo, los métodos proporcionados en el presente documento para la producción de rA13 proporcionan mayores rendimientos de actividad por volumen de cultivo (es decir, U/L/D), en comparación con métodos de cultivo celular convencionales que utilizan medios que no se han complementado con cobre u otros complementos descritos con mayor detalle en el presente documento.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona métodos de cultivo celular en los que un medio de cultivo de células basales se complementa con cobre para dar como resultado una concentración total de 1 pg/l a 6 pg/l. En otras realizaciones, el medio de cultivo de células basales se complementa con cobre para dar como resultado una concentración total de al menos aproximadamente 2 pg/l. En algunas realizaciones, la concentración total de cobre es de aproximadamente 1,5 - 4,5 pg/l. En determinadas realizaciones, el medio de cultivo celular se complementa para dar como resultado aproximadamente 1, 1,2, 1,4, 1,6, 1,8, 2,0, 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4,2, 4,4, 4,6, 4,8, 5,0, 5,5, 6,0 pg/l de cobre, o más. Los medios de cultivo de células basales tienen generalmente una concentración traza de cobre inferior a 1 pg/l.

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona métodos de cultivo celular en los que un medio de cultivo de células basales se complementa con desde aproximadamente 1,0 hasta aproximadamente 20 pg/l de cobre para la producción de rVWF. En realizaciones adicionales, el medio de cultivo de células basales se complementa con aproximadamente 1,5-15, 2,0-10, 2,5-8, 3,0-6, 4,0 -5,0 pg/l de cobre para la producción de rVWF. En todavía realizaciones adicionales, el medio de cultivo de células basales también puede incluir, además del cobre complementado, uno o más hidrolizados.

En otras realizaciones, la presente invención proporciona métodos de cultivo celular en los que un medio de cultivo de células basales se complementa con desde aproximadamente 1,5 hasta aproximadamente 4 pg/l de cobre para la producción de rA13. En realizaciones adicionales, el medio de cultivo de células basales se complementa con aproximadamente 1,6 - 3,8, 1,7 - 3,6, 1,8 - 3,4, 1,9 - 3,2, 2,0 - 3,0,2,1 - 2,8, 2,2 - 2,6, 2,3 - 2,4 pg/l de cobre para la producción de rA13. En todavía realizaciones adicionales, el medio de cultivo de células basales también puede incluir, además del cobre complementado, uno o más hidrolizados. En aún realizaciones adicionales, el medio de cultivo de células basales incluye, además de cobre y/o uno o más hidrolizados, de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 30 pM de zinc. En todavía realizaciones adicionales, el medio de cultivo de células basales incluye adicionalmente, además de cobre y/o uno o más hidrolizados y/o zinc, entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 5,0 mM de calcio.

En todavía un aspecto adicional y según cualquiera de los anteriores, la presente invención proporciona métodos de cultivo celular en los que los niveles de amonio de la disolución de cultivo celular son bajos (inferiores a 10mM). Los métodos de cultivo celular de la presente invención utilizan medios de cultivo celular que tienen de 1,0 a 6,0 pg/l de cobre en combinación con bajos niveles de amonio.

Una de las ventajas de los métodos y las composiciones de la presente invención es que son apropiados para la producción de cultivos celulares a gran escala. Estos cultivos celulares a gran escala son cultivos de al menos 10 l, 50 l, 100 l, 150 l, 200 l, 250 l, 500 l, 750 l, 1.000 l, 1.500 l, 2.000 l, 5.000 l, 10.000 l o 20.000 litros.

En determinados aspectos, los métodos de la invención no dan como resultado necesariamente una mayor cantidad de proteína recombinante de manera global, pero la proteína recombinante (rA13) que se produce muestra mayor actividad total y específica que la observada en proteínas producidas usando cultivos celulares convencionales, particularmente en comparación con proteínas producidas en cultivos celulares en los que el medio de cultivo celular no se ha complementado con cobre adicional. En aspectos adicionales, las proteínas rA13 producidas en células cultivadas en medios complementados con cobre muestran actividad por litro de cultivo celular aumentada sistemáticamente en comparación con células cultivadas en medios de cultivo de células basales que no se han complementado con cobre. En todavía aspectos adicionales, los medios complementados con cobre de la presente invención dan como resultado un rendimiento de proteína aumentado, un número aumentado de células en el cultivo y/o una actividad total por litro de cultivo aumentada en comparación con medios que no se han complementado con cobre.

Todavía ventajas adicionales de los métodos y sobrenadantes de la invención es que dan como resultado una población de proteínas que contienen un alto porcentaje (superior al 10%) de rVWF altamente multimerizado.

Aunque gran parte del análisis en el presente documento referente a proteínas ADAMTS es en cuanto a ADAMTS13 (A13), se apreciará que dado que todas las proteínas ADAMTS comparten una arquitectura de dominio de núcleo común y relaciones estructura-función comunes, las composiciones y los métodos descritos en el presente documento son aplicables para la producción de cualquier proteína ADAMTS, no sólo rA13.

II. Definiciones

Tal como se usa en el presente documento, “vWF recombinante” incluye vWF obtenido mediante tecnología de ADN recombinante. En determinadas realizaciones, las proteínas vWF de la divulgación pueden comprender un constructo, por ejemplo, preparado como en el documento WO 1986/06096 publicado el 23 de octubre de 1986 y la solicitud de patente estadounidense con n.° de serie 07/559.509, presentada el 23 de julio de 1990, a nombre de Ginsburg et al. El vWF dela presente divulgación puede incluir todas las posibles formas, incluyendo las formas monoméricas y multiméricas. También debe entenderse que la presente divulgación engloba diferentes formas de vWF que van a usarse en combinación. Por ejemplo, el vWF de la presente divulgación puede incluir diferentes multímeros, diferentes derivados y tanto derivados biológicamente activos como derivados no biológicamente activos.

El término “recombinante” cuando se usa con referencia, por ejemplo, a una célula, o un ácido nucleico, una proteína o un vector, indica que la célula, el ácido nucleico, la proteína o el vector se ha modificado mediante la introducción de una proteína o un ácido nucleico heterólogo o la alteración de una proteína o un ácido nucleico nativo, o que la célula deriva de una célula así modificada. Por tanto, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se hallan dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresan genes nativos que,de otro modo,se expresan de manera anómala, se subexpresan o no se expresan en absoluto.

En el contexto de la presente divulgación, el vWF recombinante abarca cualquier miembro de la familia de vWF de, por ejemplo, un mamífero tal como un primate, humano, mono, conejo, cerdo, roedor, ratón, rata, hámster, jerbo, canino, felino, y derivados biológicamente activos de los mismos. En una realización preferida, el vWF recombinante es vWF humano. También están abarcadas las proteínas vWF mutantes y variantes que tienen actividad, como lo son fragmentos funcionales y proteínas de fusión de las proteínas vWF. Además, el vWF de la divulgación puede comprender además etiquetas que facilitan la purificación, detección o ambas. El vWF descrito en el presente documento puede modificarse además con un resto terapéutico o un resto adecuado para obtención de imágenes in vitro o in vivo.

Los términos “vWF altamente multimérico”, “vWF de alto peso molecular” y “vWF HMW” pueden usarse indistintamente y se refieren a multímeros de vWF unidos covalentemente que contienen más de 10 dímeros de vWF. En determinadas realizaciones, vWF HMW contiene al menos 11 dímeros de vWF, o al menos 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 dímeros de vWF o más.

Tal como se usa en el presente documento, una “proteína ADAMTS” se refiere a un polipéptido de la familia de metaloproteinasas de desintegrina y metaloproteinasa con motivos de tipo I de trombospondina. Los miembros de esta familia incluyen las proteínas humanas ADAMTS1 (NM_006988), ADAMTS2 (N^m_014244; NM_021599), ADAMTS3 (NM_014243), ADAMTS4 (NM_005099), ADAMTS5 (NM_007038), ADAMTS6 (NM_014273), ADAMTS7 (NM_0142727), ADAMTS8 (NM_007037), ADAMTS9 (NM_182920; NM_182921; NM_020249), ADAMTS10 (NM_030957), ADAMTS 12 (NM_030955), ADAMTS13 (NM_139025; NM_139026; NM_139027; NM_139028), ADAMTS14 (NM_139155; NM_080722), ADAMTS 15 (NM_139055), ADAMTS16 (NM_139056), ADAMTS 17 (NM_139057), ADAMTS18 (NM_199355; NM_139054), ADAMTS19 (NM_133638) y ADAMTS20 (NM_025003, NM_175851). Las proteínas ADAMTS incluyen tanto proteínas de longitud completa como polipéptidos parciales que presentan actividad biológica al menos parcial, por ejemplo, al menos el 10%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 90% o más de la actividad demostrada por la proteína de longitud completa, en particular la actividad proteasa demostrada por la proteína de longitud completa. En determinados casos, una proteína ADAMTS se modificará de manera postraduccional o bien in vivo o bien in vitro, por ejemplo, mediante medios enzimáticos o químicos. Se entiende que las proteínas ADAMTS producidas en la presente invención incluyen alternativamente isoformas sometidas a corte y empalme, proteínas modificadas de manera conservativa, proteínas sustancialmente idénticas, homólogos y similares.

En el contexto de la presente invención, una proteína ADAMTS abarca cualquier miembro de la familia de ADAMTS de, por ejemplo, un mamífero tal como un primate, humano, mono, conejo, cerdo, roedor, ratón, rata, hámster, jerbo, canino, felino, y derivados biológicamente activos de los mismos. También están abarcadas las proteínas ADAMTS mutantes y variantes que tienen actividad, como lo son fragmentos funcionales y proteínas de fusión de las proteínas ADAMTS. Además, las proteínas ADAMTS producidas en la invención pueden comprender además etiquetas que facilitan la purificación, detección o ambas. Las proteínas ADAMTS descritas en el presente documento pueden modificarse además con un resto terapéutico o un resto adecuado para la obtención de imágenes in vitro o in vivo.

Tal como se usa en el presente documento, una “proteína ADAMTS13” se refiere a cualquier proteína o polipéptido con actividad de ADAMTS13, particularmente la capacidad para escindir el enlace peptídico entre los residuos Tyr-842 y Met-843 de vWF. En una realización a modo de ejemplo, una proteína ADAMTS13 se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es altamente similar a la de NP_620594 (isoforma 1 de ADAMTS13, preproproteína) o los aminoácidos 75 a 1427 de NP_620594 (isoforma 1 de ADAMTS13, polipéptido maduro). En otra realización, una proteína ADAMTS13 se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es altamente similar a la de NP_620596 (isoforma 2 de ADAMTS13, preproproteína) o los aminoácidos 75 a 1371 de NP_620594 (isoforma 2 de ADAMTS13, polipéptido maduro). En aún otra realización, las proteínas ADAMTS13 incluyen polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos altamente similar a la de NP_620595 (isoforma 3 de ADA^mT^s13, preproproteína) o los aminoácidos 75 a 1340 de NP_620595 (isoforma 1 de ADAMTS13, polipéptido maduro). Tal como se usa en el presente documento, una proteína ADAMTS13 incluye variantes naturales con actividad de escisión de vWF y constructos artificiales con actividad de escisión de vWF. Tal como se usa en la presente invención, ADAMTS13 engloba cualquier variante natural, secuencia alternativa, isoforma o proteína mutante que conserve cierta actividad basal. Los ejemplos de mutaciones de ADAMTS13 halladas en la población humana incluyen, sin limitación, R7W, V88M, H96D, R102C, R193W, T196I, H234Q, A250V, R268P, W390C, R398H, Q448E, Q456H, P457L, C508Y, R528G, P618A, R625H, I673F, R692C, A732V, S903L, C908Y, C951G, G982R, C1024G, A1033T, R1095W, R1123C, C1213Y, T1226I, G1239V, R1336W, muchas de las cuales se han hallado asociadas con la púrpura trombocitopénica trombótica (PTT). Las proteínas ADAMTS13 también incluyen polipéptidos que contienen modificaciones postraduccionales. Por ejemplo, se ha mostrado que ADAMTS13 se modifica por N-acetilglucosamina (GlcNAc) en los residuos 614, 667 y 1354, y se ha predicho que los residuos 142, 146, 552, 579, 707, 828 y 1235 también pueden modificarse de este modo.

Puede prepararse ADAMTS13 recombinante proteolíticamente activa mediante expresión en cultivos de células de mamífero, tal como se describe en Plaimauer et al., (2002, Blood. 15;100(10):3626-32) y el documento US 2005/0266528. Se divulgan métodos para la expresión de ADAMTS13 recombinante en cultivo celular en Plaimauer B, Scheiflinger F. (Semin Hematol. 2004Ene;41(1):24-33 y el documento US 2011/0086413.

Tal como se usa en el presente documento, el término “derivado biológicamente activo”, cuando se usa en el contexto de una proteína ADAMTS, también abarca polipéptidos obtenidos mediante tecnología de ADN recombinante. Esto puede incluir cualquier método conocido en la técnica para (i) la producción de ADN recombinante mediante ingeniería genética, por ejemplo, a través de transcripción inversa de ARN y/o amplificación de ADN, (ii) la introducción de ADN recombinante en células procariotas o eucariotas mediante transfección, es decir, a través de electroporación o microinyección, (iii) el cultivo de dichas células transformadas, por ejemplo, de manera continua o discontinua, (iv) la expresión de una proteína ADAMTS, por ejemplo, de manera constitutiva o con inducción, y (v) el aislamiento de dicha proteína ADAMTS, por ejemplo, del medio de cultivo o recogiendo las células transformadas para (vi) la obtención de proteína ADAMTS recombinante sustancialmente purificada, por ejemplo, a través de cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión molecular, cromatografía de afinidad, cromatografía de interacción hidrófoba y similares. El término “derivado biológicamente activo” incluye también moléculas quiméricas tales como, por ejemplo, una proteína ADAMTS, o un fragmento funcional de la misma, en combinación con un segundo polipéptido, por ejemplo, un dominio Fc de inmunoglobulina o un dominio de albúmina, para mejorar las propiedades biológicas/farmacológicas tales como,por ejemplo, la semivida de la proteína ADAMTS en el sistema circulatorio de un mamífero, particularmente un humano.

Los términos “aislado”, “purificado” o “biológicamente puro” se refieren a material que carece sustancial o esencialmente de componentes que lo acompañan normalmente tal como se encuentra en su estado nativo. La pureza y homogeneidad se determinan normalmente usando técnicas de la química analítica tales como electroforesis en gel de poliacrilamida o cromatografía de líquidos de alta resolución. En una realización, rVWF es la especie predominante presente en una preparación, está sustancialmente purificado. En otra realización, rA13 es la especie predominante presente en una preparación, está sustancialmente purificado. El término “purificado” en algunas realizaciones indica que un ácido nucleico o una proteína da lugar a esencialmente una banda en un gel electroforético. En otras realizaciones, significa que el ácido nucleico o la proteína es puro en al menos el 50%, más preferiblemente es puro en al menos el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o más. “Purificar” o “purificación” en otras realizaciones significan retirar al menos un contaminante de la composición que va a purificarse. En este sentido, la purificación no requiere que el compuesto purificado sea homogéneo, por ejemplo, puro en el 100%.

Puede medirse la actividad biológica de vWF mediante ensayos in vitro conocidos. Por ejemplo, el ensayo de cofactor de ristocetina se basa en la aglutinación de plaquetas frescas o fijadas con formalina inducida por el antibiótico ristocetina en presencia de vWF. El grado de aglutinación plaquetaria depende de la concentración de vWF y puede medirse mediante el método turbidimétrico, por ejemplo, mediante el uso de un agregómetro (Weiss et al., J. Clin. Invest. 52: 2708-2716, 1973; Macfarlane et al., Thromb. Diath. Haemorrh. 34: 306-308, 1975). Tal como se proporciona en el presente documento, la actividad de cofactor de ristocetina específica del vWF de la presente divulgación se describe en cuanto a mU/pg de vWF, tal como se mide usando ensayos in vitro.

Tal como se usa en el presente documento, “una unidad de actividad de ADAMTS” se define como la cantidad de actividad en 1 ml de plasma humano normal combinado, independientemente del ensayo que esté usándose. Por ejemplo, cuando la proteína ADAMTS es ADAMTS13, una unidad de actividad FRETS-VWF73 de ADAMTS13 es la cantidad de actividad necesaria para escindir la misma cantidad de sustrato FRETS-VWF73 (Kokame et al., Br J Haematol. 2005 Abr; 129(1):93-100) tal como se escinde por un ml de plasma humano normal combinado. Convenientemente, puede determinarse la actividad de ADAMTS13 mediante ensayos funcionales, tales como ensayos funcionales que emplean péptidos de factor de von Willebrand modificados como sustrato para ADAMTS13 (Tripodi et al. J Thromb Haemost.2008Sep;6(9): 1534-41). Un método preferido de determinación de actividad de ADAMTS13 humana recombinante se divulga en Gerritsen et al. (Assay of von Willebrand factor (vWF)-cleaving protease based on decreased collagen binding affinity of degraded vWF: a tool for the diagnosis of thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP). Thromb Haemost 1999; 82: 1386-1389). En una realización, para considerarse una proteína A^dA^mTS13 tal como se definió anteriormente, un polipéptido o una proteína debe tener al menos el 1% de la actividad de escisión de vWF de ADAMTS13 nativa. En otras realizaciones, una proteína ADAMTS13 contendrá al menos el 10% dela actividad de ADAMTS13 nativa. En aún otras realizaciones, una proteína ADAMTS13 contendrá al menos el 5%, el 10%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 90% o el 100% de la actividad de ADAMTS13 nativa. La cantidad de una proteína ADAMTS13 también puede determinarse mediante la medición de un antígeno de ADAMTS13, por ejemplo, usando el método ELISA divulgado en Rieger et al. (2006, Thromb Haemost. 200695(2):212-20). Una convención bien establecida en la técnica es que 1 ml de plasma humano normal combinado contiene 1 pg de ADAMTS13. Por tanto, la convención en la técnica es que 1 pg de ADAMTS13 derivado de plasma tiene una unidad de actividad de ADAMTS13.

Los términos “disolución de cultivo celular”, “medio o medios de cultivo celular” y “sobrenadante de cultivo celular” se refieren a aspectos de procedimientos de cultivo celular bien conocidos generalmente en la técnica. En el contexto de la presente invención, una disolución de cultivo celular puede incluir medios de cultivo celular y sobrenadante de cultivo celular. Los medios de cultivo celular se añaden externamente a la disolución de cultivo celular, opcionalmente junto con complementos, para proporcionar nutrientes y otros componentes para cultivar células que expresan rVWF o rA13. El sobrenadante de cultivo celular se refiere a una disolución de cultivo celular que comprende los nutrientes y otros componentes del medio de cultivo celular, así como productos liberados, metabolizados y/o excretados desde las células durante el cultivo, pero no las propias células. Por tanto, en un contexto, un sobrenadante de cultivo celular puede referirse a la fase líquida de una disolución de cultivo celular (es decir, la disolución de cultivo celular excluyendo las células). Por ejemplo, la concentración de amonio de un sobrenadante de cultivo generalmente se refiere a la concentración de amonio presente en la disolución de cultivo celular. En otros contextos, un sobrenadante de cultivo celular se refiere a una disolución de cultivo celular de la que se han retirado las células (es decir, un sobrenadante de cultivo celular recuperado).

Tal como se usa en el presente documento, los términos “vitamina B3”, “nicotinamida”, “niacinamida”, “niacina” y “ácido nicotínico” pueden usarse indistintamente para referirse a cualquier miembro de la familia B3 de vitaminas. Por consiguiente, puede usarse cualquier miembro de esta familia para complementar el medio usado en los métodos de la presente invención.

Tal como se usa en el presente documento, el término “medio definido químicamente” o “medios definidos químicamente” se refiere a un medio de crecimiento sintético en el que se conocen la identidad y concentración de todos los componentes. Los medios definidos químicamente no contienen extractos bacterianos, de levaduras, animales o vegetales, aunque pueden incluir o no componentes derivados de plantas o animales individuales (por ejemplo, proteínas, polipéptidos, etc.). Los ejemplos no limitativos de medios definidos químicamente disponibles comercialmente incluyen diversos medios de Eagle modificado por Dulbecco (DME) (Sigma-Aldrich Co; SAFC Biosciences, Inc), mezcla de nutrientes de Ham (Sigma-Aldrich Co; SAFC Biosciences, Inc), combinaciones de los mismos, y similares. Se conocen en la técnica métodos de preparación de medios de cultivo definidos químicamente, por ejemplo, en las patentes estadounidenses números 6.171.825 y 6.936.441, el documento WO 2007/077217 y las publicaciones de solicitud de patente estadounidense números 2008/0009040 y 2007/0212770.

Tal como se usa en el presente documento, el término “medio de cultivo libre de oligopéptidos” o “medios de cultivo libres de oligopéptidos” se refiere a un medio libre de proteína que no comprende oligopéptidos tales como, por ejemplo, oligopéptidos derivados de un hidrolizado de proteína. En una realización, el medio no comprende oligopéptidos que tienen veinte aminoácidos o más. En una realización de la presente invención, el medio no comprende oligopéptidos que tienen quince aminoácidos o más. En otra realización de la invención, el medio no comprende oligopéptidos que tienen diez aminoácidos o más. En una realización, el medio no comprende oligopéptidos que tienen siete aminoácidos o más. En otra realización, el medio no comprende oligopéptidos que tienen cinco aminoácidos o más. En todavía otra realización, el medio no comprende oligopéptidos que tienen tres aminoácidos o más. Según una realización adicional de la presente invención, el medio no comprende oligopéptidos que tienen dos aminoácidos o más. Se conocen en la técnica métodos de preparación de medio de cultivo libre de oligopéptidos, por ejemplo, en las patentes estadounidenses números 6.171.825 y 6.936.441, el documento WO 2007/077217 y las publicaciones de solicitud de patente estadounidense números 2008/0009040 y 2007/0212770.

Tal como se usa en el presente documento, el término “medio de cultivo libre de suero” o “medios de cultivo libres de suero” se refiere a un medio de cultivo que no se complementa con un suero animal. Aunque a menudolos medios libres de suero son medios definidos químicamente, los medios libres de suero pueden complementarse con proteínas o fracciones de proteína de animales o plantas diferenciadas. Se conocen en la técnica métodos de preparación de medio de cultivo libre de suero, por ejemplo, en las patentes estadounidenses números 6.171.825 y 6.936.441, el documento WO 2007/077217 y las publicaciones de solicitud de patente estadounidense números 2008/0009040 y 2007/0212770.

Tal como se usa en el presente documento, el término “medio de cultivo libre de proteínas animales” o “medios de cultivo libres de proteínas animales” se refiere a un medio de cultivo que no se complementa con un suero, una proteína o fracción de proteína animal. Aunque a menudolos medios de cultivo libres de proteínas animales son medios definidos químicamente, los medios de cultivo libres de proteínas animales pueden contener hidrolizados vegetales o de levaduras. Se conocen en la técnica métodos de preparación de medio de cultivo libre de proteínas animales, por ejemplo, en las patentes estadounidenses números 6.171.825 y 6.936.441, el documento WO 2007/077217 y las publicaciones de solicitud de patente estadounidense números 2008/0009040 y 2007/0212770.

Tal como se usa en el presente documento, el término “medio de cultivo de células basales” o “medios de cultivo de células basales” se refiere a un medio de cultivo definido químicamente, un medio de cultivo libre de oligopéptidos, un medio de cultivo libre de suero o un medio de cultivo libre de proteínas animales que no se ha complementado con un hidrolizado, por ejemplo, un hidrolizado vegetal o de levaduras. Se conocen bien en la técnica medios basales, por ejemplo, DMEM, F12 de Ham, DMEM/F12 de Ham, medio 199, McCoy o RPMI. El medio basal puede incluir varios componentes, incluyendo aminoácidos, vitaminas, sales orgánicas e inorgánicas y fuentes de hidratos de carbono. Cada componente puede estar presente en una cantidad que soporta el cultivo de una célula, conociendo generalmente tales cantidades un experto en la técnica. El medio puede incluir sustancias auxiliares, tales como sustancias tamponantes, por ejemplo, bicarbonato de sodio, antioxidantes, estabilizantes para contrarrestar estrés mecánico o inhibidores de proteasa. Si es necesario, puede añadirse un tensioactivo no iónico tal como copolímeros y/o mezclas de polietilenglicoles y polipropilenglicoles.

III. Medios de cultivo celular y sobrenadante de cultivo celular

Un aspecto de la presente invención se refiere a medios de cultivo celular para producir rA13 que tienen actividad aumentada en comparación con rVWF y rA13 producidos con los medios de cultivo de células basales. En un aspecto, la presente invención se refiere a medios de cultivo celular para producir rA13 en que los medios de cultivo de células basales se complementan con una o más sustancias adicionales. En realizaciones específicas, y tal como se analiza con mayor detalle a continuación, las condiciones de cultivo celular de la presente invención incluyen los medios de cultivo de células basales complementados para tener de 1,0 a 6,0 pg/l de cobre. Los medios de cultivo celular de uso y sobrenadantes derivados de los procedimientos dela presente invención también comprenden bajos niveles (inferiores a 5 mM) de amonio. Las condiciones de cultivo celular usadas para expresar rA13 se controlan de tal manera que el sobrenadante de cultivo celular mantiene un bajo nivel de amonio, es decir, menor de 5 mM.

Los medios de cultivo de la presente invención pueden basarse en un medio basal adecuado bien conocido en la técnica, por ejemplo, DMEM, F12 de Ham, DMEM/F12 de Ham, medio 199, McCoy o RPMI. El medio basal puede incluir varios componentes, incluyendo aminoácidos, vitaminas, sales orgánicas e inorgánicas y fuentes de hidratos de carbono. Cada componente puede estar presente en una cantidad que soporta el cultivo de una célula, conociendo generalmente tales cantidades un experto en la técnica. El medio puede incluir sustancias auxiliares, tales como sustancias tamponantes, por ejemplo, bicarbonato de sodio, antioxidantes, estabilizantes para contrarrestar estrés mecánico o inhibidores de proteasa. Si es necesario, puede añadirse un tensioactivo no iónico tal como copolímeros y/o mezclas de polietilenglicoles y polipropilenglicoles.

Generalmente, los medios basales contienen menos de 1 pg/l de cobre, por ejemplo, DMEM/F12 de Ham tiene una concentración de cobre de aproximadamente 0,3 pg/l. Tales concentraciones de cobre no proporcionan suficientes iones de cobre como para soportar la producción de proteínas rA13 producidas en la presente invención, que muestran alta actividad específica.

Puede proporcionarse cobre a los medios de cultivo celular usados en la presente invención a través de una variedad de modos, tales como a través de la adición de un complemento de medio. En algunas realizaciones, el complemento de medio puede contener hidrolizado, que puede proporcionarse para aumentar la concentración de cobre en los medios. Los hidrolizados pueden incluir cualquier hidrolizado bien conocido en la técnica, tal como hidrolizados vegetales, hidrolizados de soja e hidrolizado de gluten de trigo. En determinadas realizaciones, la adición de hidrolizado puede contribuir a una concentración aumentada de cobre de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 10 pg/l de Cu2+. En algunas realizaciones, la cantidad de cobre proporcionada por el hidrolizado puede depender de la cantidad de cobre en el hidrolizado, así como de la cantidad de hidrolizado añadido. El contenido de cobre de un hidrolizado puede determinarse mediante análisis elemental, por ejemplo, métodos de espectroscopía de adsorción atómica (GFAA: adsorción atómica en horno de grafito) o de espectrometría de masas (por ejemplo, ICP-EM).

En determinadas realizaciones, puede proporcionarse cobre a los medios de cultivo solo o además de hidrolizado proporcionando un complemento de medio que incluye una sal de cobre o un quelato de cobre adecuado. Las sales de cobre adecuadas pueden incluir, pero no se limitan a, sulfato de cobre, acetato de cobre, carbonato de cobre, cloruro de cobre, hidróxido de cobre, nitrato de cobre y óxido de cobre. Los agentes de quelación de cobre adecuados pueden incluir, pero no se limitan a, albúmina, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), agentes quelantes de poliamina, etilendiamina, dietilentriamina, trietilentetramina, trietilendiamina, tetraetilenpentamina, aminoetiletanolamina, aminoetilpiperazina, pentaetilenhexamina, clorhidrato de trietilentetramina, clorhidrato de tetraetilenpentamina, clorhidrato de pentaetilenhexamina, tetraetilpentamina, captoprilo, penicilamina, N,N'-bis(3-aminopropil)-1,3-propanodiamina, N,N'-bis(2-aminoetil)-1,3-propanodiamina, 1,7-dioxa-4,10-diazaciclododecano, 1,4,8,11-tetraazaciclotetradecan-5,7-diona, triclorhidrato de 1,4,7-triazaciclononano, 1-oxa-4,7,10-triazaciclododecano, 1,4,8,12-tetraazaciclopentadecano y 1,4,7,10-tetraazaciclododecano.

En determinadas realizaciones, el medio de cultivo de células basales se complementa para dar como resultado una concentración de cobre final de aproximadamente 1,0 - 5,0, 1,2 - 4,0, 1,3 - 3,0, 1,4 - 2,9, 1,5 - 2,8, 1,6 - 2,7, 1,7 - 2,6, 1,8 - 2,5, 1,9 - 2,4, 2,0 - 2,3, 2,1 - 2,2 pg/l de cobre. En realizaciones adicionales, los medios de cultivo de células basales usados en los métodos de la presente invención se complementan para dar como resultado aproximadamente 2,6 - 6,0, 2,8 - 5,5, 3,0 - 5,0, 3,2 - 4,5, 3,4 - 4 y 2 - 4 pg/l de cobre. En aún otras realizaciones, los medios de cultivo de células basales usados en los métodos de la presente invención se complementan para dar como resultado aproximadamente 1-6, 2-5, 3-4 pg/l de cobre. En una realización, el medio de cultivo de células basales se complementa con cobre para dar como resultado una concentración de cobre total de al menos 1 pg/l. En otra realización, el medio de cultivo de células basales se complementa con cobre para dar como resultado una concentración de cobre total de al menos 2 pg/l. En aún otra realización, el medio de cultivo de células basales se complementa con cobre para dar como resultado una concentración de cobre total de al menos 4 pg/l. En determinadas realizaciones, el medio de cultivo de células basales se complementa con cobre para dar como resultado una concentración de cobre total de al menos 1 pg/l, o al menos 2, 3, 4, 5, 6 pg/l de cobre. En determinadas realizaciones, y tal como se analiza con mayor detalle en el presente documento, los cultivos para producir rA13 pueden contener aproximadamente 2 - 4 pg/l de cobre, mientras que los cultivos para producir rVWF pueden contener al menos 2 pg/l de cobre.

Las concentraciones indicadas anteriormente son las concentraciones respectivas de cobre puro, en forma cúprica (Cu2+). Si se usa un derivado de cobre, por ejemplo, una sal hidratada, o un compuesto que comprende cobre, por ejemplo, un agente de quelación de cobre, la cantidad de derivado o agente de quelación se añade de tal manera que la concentración final del cobre está en los intervalos descritos en el presente documento. Por ejemplo, 2 pg/l de CuSO4'5H2O es equivalente a una concentración de cobre de aproximadamente 0,51 pg/l (sin sulfato y 5H2O).

Ventajosamente, se ha hallado que el uso de medio de cultivo celular en procedimientos de cultivo celular que da como resultado bajas concentraciones de amonio (NH4+) en la disolución de cultivo celular (es decir, en el sobrenadante de cultivo) da como resultado la expresión de rA13 y/o vWF recombinante con mayores actividades específicas. Por consiguiente, en determinadas realizaciones, la concentración de NH4+ del sobrenadante no es mayor de 10 mM. En una realización preferida, la concentración de NH4+ del sobrenadante no es mayor de 5 mM. En una realización preferida, la concentración de NH4+ del sobrenadante no es mayor de 4 mM. En aún otras realizaciones, la concentración de NH4+ del sobrenadante no es mayor de 10 mM, 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM o menos.

Por consiguiente, en determinadas realizaciones, las composiciones y los métodos proporcionados en el presente documento se basan en el uso de los medios de cultivo de células basales complementados con cobre (por ejemplo, hasta una concentración final de al menos 2 pg/l) usados en un procedimiento que da como resultado una concentración de NH4+ no mayor de 10 mM en el sobrenadante. En aún otras realizaciones, el medio de cultivo de células basales se complementa para proporcionar una concentración final de cobre y amonio según una cualquiera de las variaciones 1 a 440, tal como se proporciona en la tabla 1.

Tabla 1. Realizaciones a modo de ejemplo de concentraciones de cobre y amonio presentes en medios de cultivo y sobrenadantes útiles para la expresión de una proteína recombinante tal como se proporciona en el presente documento.

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*N.D. = no definido

*NMT = no más de

*AL = al menos

En algunas realizaciones, los medios complementados con cobre usados en la presente invención se producen complementando medios basales que son libres de proteínas animales y/o definidos químicamente. Se conocen en la técnica métodos de preparación de medios de cultivo libres de proteínas animales y definidos químicamente, por ejemplo, en las patentes estadounidenses números 6.171.825 y 6.936.441, el documento WO 2007/077217 y las publicaciones de solicitud de patente estadounidense números 2008/0009040 y 2007/0212770. En una realización, el medio de cultivo basal usado en los métodos descritos en el presente documento es un medio libre de proteínas animales o libre de oligopéptidos. En determinadas realizaciones, el medio de cultivo puede estar definido químicamente. En determinadas realizaciones, los medios de cultivo pueden contener al menos una poliamina a una concentración de aproximadamente 0,5 mg/l a aproximadamente 10 mg/l.

En realizaciones adicionales, y además de cualquiera de la descripción proporcionada anteriormente, se proporcionan medios de cultivo usados en la invención en los que un medio basal se complementa con cobre y al menos uno de calcio, zinc y/o vitamina B3. En determinadas realizaciones, el medio puede ser un medio libre de proteínas animales, libre de oligopéptidos o definido químicamente. En determinadas realizaciones, el medio libre de proteínas animales o libre de oligopéptidos se prepara tal como se enseña en las patentes estadounidenses números 6.171.825 y 6.936.441, el documento w O 2007/077217 y las publicaciones de solicitud de patente estadounidense números 2008/0009040 y 2007/0212770, y se complementa con cobre adicional y opcionalmente uno o más de calcio, zinc, y vitamina B3. En una realización específica, el medio de cultivo definido químicamente puede ser similar a una mezcla 1:1 de medio de Eagle modificado por Dulbecco / F12 de Ham (DMEM/F12 de Ham), que se ha complementado con cobre adicional y opcionalmente calcio, zinc y/o vitamina B3 para aumentar la actividad específica de rVWF o rA13 expresado en una célula cultivada en el medio. En aún otras realizaciones, el medio de cultivo está libre de componentes animales. En otra realización, el medio de cultivo contiene proteína, por ejemplo, proteínas animales del suero tal como suero bovino fetal. En otra realización, el cultivo tiene proteínas recombinantes añadidas de manera exógena. En otra realización, las proteínas proceden de un animal libre de patógenos certificado.

En determinadas realizaciones, los medios de cultivo contienen al menos una poliamina a una concentración de o aproximadamente entre 0,5 mg/l y 30 mg/l. En otra realización, el medio de cultivo contiene al menos una poliamina a o aproximadamente entre 0,5 mg/l y 10 mg/l. En una realización, el medio de cultivo contiene al menos una poliamina a o aproximadamente entre 2 mg/l y 8 mg/l. En determinadas realizaciones, la poliamina es del grupo de ornitina, putrescina, espermina o espermidina, o similar. En una realización preferida, la poliamina es putrescina. En una realización específica, el medio de cultivo contiene putrescina a o aproximadamente entre 2 mg/l y 8 mg/l.

En una realización, los medios de cultivo contienen al menos una poliamina a una concentración de o aproximadamente entre 0,5 mg/l y 30 mg/l y una combinación de cobre y amonio según las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 1. En otra realización, el medio de cultivo contiene al menos una poliamina a o aproximadamente entre 0,5 mg/l y 10 mg/l y una combinación de cobre y amonio según una cualquiera de las variaciones 1 a 440, tal como se expone en la tabla 1. En una realización, el medio de cultivo contiene al menos una poliamina a o aproximadamente entre 2 mg/l y 8 mg/l y una combinación de cobre y amonio según las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 1. En determinadas realizaciones, la poliamina es del grupo de ornitina, putrescina, espermina o espermidina, o similar. En una realización preferida, la poliamina es putrescina. En una realización específica, el medio de cultivo contiene putrescina a o aproximadamente entre 2 mg/l y 8 mg/l y una combinación de cobre y amonio según las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 1.

En aspectos adicionales, además de cobre, los medios de cultivo celular de uso en la presente invención pueden incluir adicionalmente uno o más de una cantidad adicional de calcio, zinc, una o más vitaminas, y cualquier combinación de los mismos.

Generalmente, puede usarse cualquier sal de calcio para complementar los medios usados en la invención, los ejemplos no limitativos de sales aceptables incluyen CaCl2, CaCh, CaFPO3-2H2O, CaÍ2, CaBr2, (C2H3O2)2Ca, (CHO2)2Ca, (C6HyO6)2Ca, (C6H5Oy)2Ca3-2H2O y similares. En determinadas realizaciones se usa una sal de calcio farmacéuticamente aceptable para complementar los medios de cultivos usados en la invención.

Generalmente, puede usarse cualquier sal de zinc para complementar los medios usados en la invención, los ejemplos no limitativos de sales aceptables incluyen, ZnSO4'7H2O, ZnSO3-2H2O, (C6H5Oy)2Zn3-2H2O, ZnBr2, ZnBr2'2H2O, ZnCh, Zn(NO3)2'6H2O, Zn(H2PO4)2H2O, (C2H3O2^Zn-2H2O y similares. En determinadas realizaciones se usa una sal de zinc farmacéuticamente aceptable para complementar los medios de cultivos usados en la invención. En otras realizaciones puede usarse una preparación de péptido o proteína que contiene zinc, por ejemplo insulina, para complementar el cultivo proporcionado en el presente documento.

En todavía aspectos adicionales, los medios de células basales complementados con cobre y uno o más de los materiales adicionales analizados anteriormente pueden usarse además en cultivos con bajos niveles de amonio en el sobrenadante. En determinadas realizaciones, los medios de cultivo celular complementados de uso en la presente invención dan como resultado niveles de amonio en la disolución de cultivo celular inferiores a 10 mM. En realizaciones adicionales se usan los medios de cultivo celular complementados usados en la presente invención con niveles de amonio de cultivo celular de aproximadamente 0,5 - 9,5, 1,0 - 9,0, 1,5 - 8,5, 2,0 - 8,0, 2,5 - 7,5, 3,0 -7,0, 3,5 - 6,5, 4,0 - 6,0, 4,5 - 5,5 mM.

En una realización, las concentraciones de cobre y amonio de un medio de cultivo celular y un sobrenadante de cultivo celular se mantienen durante un periodo de tiempo prolongado durante el procedimiento de fabricación. En una realización específica, las concentraciones de cobre y amonio de un cultivo celular se mantienen durantela duración de un procedimiento de fabricación, es decir, durante el tiempo en el que se expresa rVWF o rA13 y se recupera de un cultivo celular a gran escala. En determinadas realizaciones, las concentraciones de cobre y amonio se mantienen en la disolución de cultivo a un nivel según las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 1. En una realización preferida, las concentraciones de cobre y amonio se mantienen durante todo el tiempo de tal procedimiento de producción.

En algunas realizaciones, el medio de cultivo usado en la invención puede proporcionarse en una forma líquida o seca o de polvo. Pueden tomarse previamente alícuotas del medio en una cantidad adecuada para un único uso o proporcionarse en una mayor cantidad que puede usarse para más de un cultivo celular. Generalmente, el medio usado en la invención se proporcionará de modo estéril.

Se analizan a continuación detalles específicos de los medios de cultivo celular de uso para producir rVWF o rA13. A. Medios de cultivo celular de vWF recombinante

Un aspecto de la presente divulgación se refiere a una disolución de cultivo celular para producir vWF recombinante, más específicamente, vWF de alto peso molecular que tiene una alta actividad específica, que se describe adicionalmente en el presente documento. En una realización, la presente divulgación proporciona una disolución de cultivo celular para producir vWF de alto peso molecular, recombinante, que comprende un medio de cultivo celular que comprende una concentración de cobre de al menos aproximadamente 2,4 pg/l y una pluralidad de células que expresan vWF altamente multimérico que comprende de aproximadamente 14 a aproximadamente 22 dímeros y una actividad de cofactor de ristocetina específica de al menos aproximadamente 30 mü/pg.

En una realización, la disolución de cultivo celular comprende además una concentración de amonio de menos de 10 mM. En una realización preferida, el cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 5 mM. En aún otras realizaciones, el cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 10 mM, o no más de 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM o menos. En aún otras realizaciones, el cultivo celular tiene una concentración de cobre y amonio según una cualquiera de las variaciones 1 a 440, tal como se expone en la tabla 1. En determinadas realizaciones, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene durante un periodo prolongado a una concentración tal como se proporcionó anteriormente. Por ejemplo, en una realización, la concentración de amonio se mantiene a una baja concentración durante al menos 3 días, o al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 días o más. En una realización específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 5 mM durante al menos 7 días. En otra realización específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 4 mM durante al menos 7 días. En una realización específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 5 mM durante al menos 14 días. En otra realización específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 4 mM durante al menos 14 días. En aún otra realización, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a un bajo nivel durantela duración del procedimiento (es decir, durante todo el tiempo que está usándose el cultivo para producir rVWF).

En una realización de la divulgación, los medios de cultivo celular pueden comprender una concentración de cobre de al menos aproximadamente 2,4 pg/l, en otra realización al menos aproximadamente 3 pg/l, en aún otra realización al menos aproximadamente 4 pg/l, en aún otra realización al menos aproximadamente 8 pg/l, en aún otra realización al menos aproximadamente 10 pg/l, en aún otra realización al menos aproximadamente 15 pg/l y en una realización adicional al menos aproximadamente 20 pg/l.

En otras realizaciones, la concentración de cobre en los medios de cultivo celular de la presente divulgación puede oscilar entre aproximadamente 2,4 pg/l y aproximadamente 20 pg/l, en otra realización entre aproximadamente 2,4 pg/l y aproximadamente 15 pg/l, en aún otra realización entre aproximadamente 2,4 pg/l y aproximadamente 10 pg/l, en aún otra realización entre aproximadamente 2,4 pg/l y aproximadamente 8 pg/l, en aún otra realización entre aproximadamente 2,4 pg/l y aproximadamente 6 pg/l, en aún otra realización entre aproximadamente 2,4 pg/l y aproximadamente 4 pg/l, en aún otra realización entre aproximadamente 4 pg/l y aproximadamente 20 pg/l, en aún otra realización entre aproximadamente 4 pg/l y aproximadamente 15 pg/l, en aún otra realización entre aproximadamente 4 pg/l y aproximadamente 10 pg/l, en aún otra realización entre aproximadamente 4 pg/l y aproximadamente 8 pg/l, y en una realización adicional entre aproximadamente 4 pg/l y aproximadamente 6 pg/l.

La presente divulgación también proporciona kits para la expresión o producción de rVWF, comprendiendo los kits un medio de cultivo adecuado para la expresión de rVWF que tiene alta actividad específica.

B. Medios de cultivo celular de ADAMTS13(A13)

En un aspecto, la presente invención usa medios de cultivo que son útiles para la expresión de proteínas ADAMTS que tienen altas actividades específicas. Ventajosamente, se ha hallado que, complementando un medio de cultivo con cobre, las actividades de enzimas ADAMTS recombinantes (por ejemplo, rADAMTS13) expresadas en células cultivadas en el medio complementado se potencian enormemente, mientras que se expresan las enzimas a niveles tan altos como, si no mayores que, las células cultivadas en medios no complementados.

En un aspecto, la presente invención usa medios de cultivo celular complementados con cobre para la expresión de proteína ADAMTS13 recombinante con alta actividad específica. En una realización, los medios se complementan para dar como resultado una concentración de cobre total de desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 4 pg/l. En realizaciones adicionales, los medios se complementan para dar como resultado una concentración de cobre total de aproximadamente 1 - 3, 2 - 3, 3 - 4 pg/l. En una realización, el medio contiene una concentración de cobre de al menos 1 pg/l. En otra realización, el medio contiene al menos 2 pg/l de cobre. En otra realización, el medio contiene al menos 4 pg/l de cobre. En otra realización, el medio contiene entre 1 pg/l y 6 pg/l de cobre. En otra realización, el medio contiene entre 2 pg/l y 5 pg/l de cobre. En otra realización, el medio contiene entre 3 pg/l y 4 pg/l de cobre. En aún otras realizaciones, el medio contiene al menos 1 pg/l de cobre, o al menos 2 pg/l, 3 pg/l, 4 pg/l, 5 pg/l, 6 pg/l.

En una realización, la disolución de cultivo celular comprende además una concentración de amonio de menos de 5mM. La disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 5 mM. En aún otras realizaciones, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio inferior a 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM o menos. En aún otras realizaciones, la disolución de cultivo celular tiene una concentración de cobre y amonio según las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 1. En determinadas realizaciones, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene durante un periodo prolongado a una concentración tal como se proporcionó anteriormente. Por ejemplo, en una realización, la concentración de amonio se mantiene a una baja concentración durante al menos 3 días, o al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 días o más. En una realización específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 5 mM durante al menos 7 días. En otra realización específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 4 mM durante al menos 7 días. En una realización específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 5 mM durante al menos 14 días. En otra realización específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 4 mM durante al menos 14 días. En aún otra realización, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a un bajo nivel durantela duración del procedimiento (es decir, durante todo el tiempo que está usándose el cultivo para producir rA13).

En una realización se proporciona un medio de cultivo para la expresión de una proteína ADAMTS recombinante (por ejemplo, rADAMTS13) que contiene al menos 1 ^g/l de cobre y al menos 2 ^M de zinc. En otras realizaciones, el medio contiene al menos 2 ^g/l de cobre o al menos 4 ^g/l de cobre. En otra realización en la que el medio se complementa con cobre, el medio de cultivo también contiene al menos o aproximadamente 5 ^M de zinc. En una realización, el medio de cultivo también contiene zinc a o aproximadamente entre 2 ^M y 12 ^M. En otra realización, el medio de cultivo también contiene zinc a o aproximadamente entre 5 ^M y 12 ^M. En aún otras realizaciones, el medio de cultivo también pueden contener al menos o aproximadamente 2 ^M, o al menos o aproximadamente 3 p,M, 4 p,M, 5 p,M, 6 p,M, 7 p,M, 8 p,M, 9 p,M, 10 p,M, 11 p,M, 12 p,M, 13 p,M, 14 p,M, 15 p,M, 20 p,M, 25 p,M, 30 p,M o más de zinc. En una realización, el medio de cultivo contiene una concentración de cobre y zinc de acuerdo con las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 2.

Tabla 2. Realizaciones a modo de ejemplo de concentraciones de cobre y zincpresentes en medios de cultivo útiles para la expresión de una proteína ADAMTS13 recombinante.

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*AL = al menos

La disolución de cultivo celular comprende además una baja concentración de amonio. En una realización, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de menos de 5 mM y una concentración de cobre y zinc de acuerdo con las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 2. En una realización específica se mantiene el amonio a una concentración inferior a 5 mM durante al menos 7 días. En una realización preferida, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 6 mM y una concentración de cobre y zinc de acuerdo con las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 2. En una realización específica, se mantiene el amonio a una concentración inferior a 5 mM durante al menos 7 días. En otra realización preferida, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 5 mM y una concentración de cobre y zinc de acuerdo con las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 2. En una realización específica se mantiene el amonio a una concentración inferior a 5 mM durante al menos 7 días. En otra realización preferida, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 4 mM y una concentración de cobre y zinc de acuerdo con las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 2. En una realización específica, se mantiene el amonio a una concentración de no más de 4 mM durante al menos 7 días. En aún otras realizaciones, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio inferior a 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM o menos y una concentración de cobre y zinc de acuerdo con las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla2. En aún otra realización específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a un bajo nivel durantela duración del procedimiento (es decir, durante todo el tiempo que está usándose el cultivo para producir rA13).

En una realización se proporciona un medio de cultivo para la expresión de una proteína ADAMTS recombinante (por ejemplo, rADAMTS13) que contiene al menos 1 ^g/l de cobre y al menos o aproximadamente 0,5 mM de calcio. En otras realizaciones, el medio contiene al menos 2 ^g/l de cobre o al menos 4 ^g/l de cobre. En otra realización en la que el medio se complementa con cobre, el medio de cultivo también contiene al menos 1,5 mM de calcio. En una realización, el medio de cultivo contiene calcio a o aproximadamente entre 0,5 mM y 1,5 mM. En aún otras realizaciones, el medio de cultivo pueden contener al menos o aproximadamente 0,5 mM, o al menos o aproximadamente 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM o más de calcio. En una realización, el medio de cultivo contiene una concentración de cobre y calcio de acuerdo con las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 3.

Tabla 3. Realizaciones a modo de ejemplo de concentraciones de cobre y calcio presentes en medios de cultivo útiles para la expresión de una proteína ADAMTS13 recombinante.

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*AL = al menos

La disolución de cultivo celular comprende además una baja concentración de amonio. En una realización, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de menos de 5 mM y una concentración de cobre y calcio de acuerdo con las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 3. En una realización específica se mantiene el amonio a una concentración inferior a 5 mM durante al menos 7 días. En una realización preferida, el medio de cultivo celular comprende una concentración de amonio inferior a 5 mM y una concentración de cobre y calcio de acuerdo con las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 3. En una realización específica se mantiene el amonio a una concentración inferior a 5 mM durante al menos 7 días. En otra realización preferida, el medio de cultivo celular comprende una concentración de amonio inferior a 5 mM t una concentración de cobre y calcio de acuerdo con las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 3. En una realización específica, se mantiene el amonio a una concentración inferior a 5 mM durante al menos 7 días. En otra realización preferida, el medio de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 4 mM y una concentración de cobre y calcio de acuerdo con las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 3. En una realización específica se mantiene el amonio a una concentración de no más de 4 mM durante al menos 7 días. En aún otras realizaciones, el medio de cultivo celular comprende una concentración de amonio inferior a 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM o menos y una concentración de cobre y calcio de acuerdo con las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 3. En aún otra realización específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a un bajo nivel durantela duración del procedimiento (es decir, durante todo el tiempo que está usándose el cultivo para producir rA13).

En una realización, el medio de cultivo celular se complementa con cobre, zinc y calcio. En una realización específica, el medio de cultivo tiene una concentración de calcio de al menos 0,5 mM y una concentración de cobre y zinc de acuerdo con las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 2. En otra realización específica, el medio de cultivo tiene una concentración de calcio de al menos 1,5 mM y una concentración de cobre y zinc de acuerdo con las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 2. En otra realización específica, el medio de cultivo tiene una concentración de calcio entre 0,5 mM y 1,5 mM y una concentración de cobre y zinc de acuerdo con las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 2. En aún otras realizaciones, el medio de cultivo tiene una concentración de calcio de al menos 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM o más, y una concentración de cobre y zinc de acuerdo con las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 2.

En una realización se proporciona un medio de cultivo para la expresión de una proteína ADAMTS recombinante (por ejemplo, rADAMTS13) que contiene al menos 1 ^g/l de cobre y al menos 2 mg/l de nicotinamida (vitamina B3). En otras realizaciones, el medio contiene al menos 2 ^g/l de cobre o al menos 4 ^g/l de cobre. En otra realización en la que el medio se complementa con cobre, el medio de cultivo también contiene al menos 7 mg/l de nicotinamida (vitamina B3). En una realización, el medio de cultivo contiene nicotinamida (vitamina B3) a o aproximadamente entre 2 mg/l y 10 mg/l. En aún otras realizaciones, el medio de cultivo puede contener al menos o aproximadamente 2 mg/l, 3 mg/l, 4 mg/l, 5 mg/l, 6 mg/l, 7 mg/l, 8 mg/l, 9 mg/l, 10 mg/l, 15 mg/l, 20 mg/l o concentraciones mayores de nicotinamida (vitamina B3). En una realización, el medio de cultivo contiene una concentración de cobre y nicotinamida de acuerdo con las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 4.

Tabla 4. Realizaciones a modo de ejemplo de concentraciones de cobre y nicotinamida presentes en medios de cultivo útiles para la expresión de una proteína ADAMTS13 recombinante.

*AL = al menos

La disolución de cultivo celular comprende además una baja concentración de amonio. En una realización, el medio de cultivo comprende una concentración de amonio de menos de 5 mM y una concentración de cobre y nicotinamida de acuerdo con las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 4. En una realización específica se mantiene el amonio a una concentración inferior a 5 mM durante al menos 7 días. En una realización preferida, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio inferior a 5 mM y una concentración de cobre y nicotinamida de acuerdo con las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 4. En una realización específica, se mantiene el amonio a una concentración inferior a 5 mM durante al menos 7 días. En otrarealización específica, ladisolución de cultivo celular comprende una concentración de amoniono inferior a5 mM y una concentración de cobre y nicotinamida de acuerdo con las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 4. En una realización específica se mantiene el amonio a una concentración inferior a 5 mM durante al menos 7 días. En otra realización preferida, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 4 mM y una concentración de cobre y nicotinamida de acuerdo con las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 4. En una realización específica se mantiene el amonio a una concentración de no más de 4 mM durante al menos 7 días. En aún otras realizaciones, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio inferior a 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM o menos y una concentración de cobre y nicotinamida de acuerdo con las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 4. En aún otra realización específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a un bajo nivel durantela duración del procedimiento (es decir, durante todo el tiempo que está usándose el cultivo para producir rA13).

En una realización, el medio de cultivo celular se complementa con cobre, zinc y nicotinamida. En una realización específica, el medio de cultivo tiene una concentración de nicotinamida de al menos 2 mg/ml y una concentración de cobre y zinc de acuerdo con las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 2. En otra realización específica, el medio de cultivo tiene una concentración de nicotinamida de al menos 7 mg/ml y una concentración de cobre y zinc de acuerdo con las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 2. En otra realización específica, el medio de cultivo tiene una concentración de nicotinamida de entre 2 mg/ml y 10 mg/ml y una concentración de cobre y zinc de acuerdo con las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 2. En aún otras realizaciones, el medio de cultivo tiene una concentración de nicotinamida de al menos 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml, 10 mg/ml, 11 mg/ml, 12 mg/ml, 13 mg/ml, 14 mg/ml, 15 mg/ml o más y una concentración de cobre y zinc de acuerdo con las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 2.

En una realización, el medio de cultivo celular se complementa con cobre, calcio y nicotinamida. En una realización específica, el medio de cultivo tiene una concentración de nicotinamida de al menos 2 mg/ml y una concentración de cobre y calcio de acuerdo con las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 3. En otra realización específica, el medio de cultivo tiene una concentración de nicotinamida de al menos 7 mg/ml y una concentración de cobre y calcio de acuerdo con las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 3. En otra realización específica, el medio de cultivo tiene una concentración de nicotinamida de entre 2 mg/ acuerdo con las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 3. En aún otras realizaciones, el medio de cultivo tiene una concentración de nicotinamida de al menos 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml, 10 mg/ml, 11 mg/ml, 12 mg/ml, 13 mg/ml, 14 mg/ml, 15 mg/ml o más y una concentración de cobre y calcio de acuerdo con las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 3.

IV. Métodos para la producción de factores sanguíneos que tienen alta actividad específica

A. Métodos de cultivo celular

La presente invención proporciona métodos para la producción a gran escala de proteínas recombinantes (rA13). En determinadas realizaciones, tales métodos de producción a gran escala utilizan reactores de tanque con agitación para la fabricación de estas proteínas recombinantes terapéuticas.

En determinadas realizaciones, los métodos de la presente divulgaciónpueden comprender el uso de un sistema de cultivo celular que se hace funcionar en un modo de funcionamiento discontinuo o continuo. Por ejemplo, cuando se utilizan cultivos celulares discontinuos, pueden hacerse funcionar en modo de único lote, semicontinuo o lotes repetidos. Asimismo, los cultivos celulares continuos pueden hacerse funcionar en modo, por ejemplo, de perfusión, turbidostático o quimiostático. El cultivo celular discontinuo y continuo puede realizarse en condiciones o bien de suspensión o bien de adherencia. Cuando se hace funcionar en condiciones de suspensión, las células estarán en suspensión libremente y se mezclarán dentro del medio de cultivo. Alternativamente, en condiciones de adherencia, las células se unirán a una fase sólida, por ejemplo, un microportador, un microportador poroso, portador de disco, cartucho de cerámica, fibra hueca, lámina plana, matriz de gel y similares.

Un cultivo discontinuo es normalmente un cultivo celular a gran escala en el que se cultiva un inóculo celular hasta una densidad máxima en un tanque o fermentador, y se recoge y procesa como un único lote. Un cultivo semicontinuo es normalmente un cultivo discontinuo al que se le suministran nutrientes frescos (por ejemplo, sustratos limitantes del crecimiento) o aditivos (por ejemplo, precursores de productos). La disolución de alimentación habitualmente está altamente concentrada para evitar la dilución del biorreactor. En un cultivo en lotes repetidos, las células se colocan en un medio de cultivo y se hacen crecer hasta una densidad celular deseada. Para evitar la aparición de una fase de decadencia y muerte celular, el cultivo se diluye entonces con medio de crecimiento completo antes de que las células alcancen su concentración máxima. La cantidad y frecuencia de dilución varían ampliamente y dependen de las características de crecimiento de la línea celular y la conveniencia del procedimiento de cultivo. El procedimiento puede repetirse tantas veces como se requiera y, a menos que se desechen células y medio en subcultivo, el volumen de cultivo aumentará gradualmente a medida que se realiza cada dilución. Puede manejarse el volumen creciente teniendo un reactor de tamaño suficiente como para permitir diluciones dentro del recipiente o dividiendo el cultivo diluido en varios recipientes. La justificación de este tipo de cultivo es mantener las células en un estado de crecimiento exponencial. El subcultivo en serie se caracteriza porque el volumen de cultivo siempre está aumentando gradualmente, puede haber múltiples recogidas, las células continúan creciendo y el procedimiento puede continuar tanto tiempo como se desee. En determinadas realizaciones puede recuperarse una proteína ADAMTS recombinante (por ejemplo, rADAMTS13) después de recoger el sobrenadante de un cultivo discontinuo. En otras realizaciones puede recuperarse un vWF recombinante después de recoger el sobrenadante de un cultivo discontinuo.

Un cultivo continuo puede ser un cultivo en suspensión al que se le suministran de manera continua nutrientes mediante el flujo de entrada del medio recién preparado, en el que el volumen de cultivo se mantiene constante habitualmente mediante la retirada concomitante del medio gastado. En métodos quimiostáticos y turbidostáticos, el medio extraído contiene células. Por tanto, las células que quedan en el recipiente de cultivo celular deben crecer para mantener un estado estacionario. En el método quimiostático, la tasa de crecimiento se controla normalmente controlando la tasa de dilución, es decir, la tasa a la que se añade el medio recién preparado. La tasa de crecimiento de las células en el cultivo puede controlarse, por ejemplo, a una tasa de crecimiento submáxima, mediante la alteración de la tasa de dilución. En cambio, en el método turbidostático, la tasa de dilución se establece para permitir la tasa de crecimiento máxima que las células pueden lograr en las condiciones operativas dadas, tales como pH y temperatura. En determinadas realizaciones, se recupera el rVWF o rA13 después de recoger el sobrenadante de un cultivo continuo. Se describe un método a modo de ejemplo para el cultivo celular continuo en el documento WO/2011/012725 (Grillberger et al.).

En un cultivo de perfusión, el medio extraído está agotado en células, que se retienen en el recipiente de cultivo, por ejemplo, mediante filtración o mediante métodos centrífugos que conducen a la reintroducción de las células en el cultivo. Sin embargo, normalmente las membranas usadas para filtración no retienen el 100% de las células, y así se retira una proporción cuando se extrae el medio. Puede no ser crucial funcionar con cultivos de perfusión a tasas de crecimiento muy altas, ya que la mayoría de las células quedan retenidas en el recipiente de cultivo. En determinadas realizaciones, el rVWF o rA13 se recupera después de recoger el sobrenadante de un cultivo de perfusión.

Puede usarse el sistema de reactor de tanque con agitaciónpara cultivos celulares discontinuos y continuos que se hacen funcionar en modos de suspensión o adherente. Generalmente, el sistema de reactor de tanque con agitaciónpuede hacerse funcionar como cualquier reactor de tanque con agitaciónconvencional con cualquier tipo de agitador tal como uno Rushton, de hidroala, de aleta inclinada o marino.

En determinadas realizaciones, los métodos de cultivo celular de la invención pueden comprender el uso de un microportador. En algunas realizaciones, los cultivos celulares de las realizaciones pueden realizarse en grandes biorreactores en condiciones adecuadas para proporcionar altas áreas de superficie de cultivo específicas de volumen para lograr altas densidades celulares y expresión de proteína. Un medio para proporcionar tales condiciones de crecimiento es usar microportadores para cultivo celular en biorreactores de tanque con agitación. El concepto de crecimiento celular sobre microportadores lo describieron por primera vez van Wezel (van Wezel, A.L., Nature 216:64-5 (1967)) y permite la unión celular sobre la superficie de pequeñas partículas sólidas suspendidas en el medio de crecimiento. Estos métodos proporcionan altas razones de superficie con respecto a volumen y, por tanto, permiten una utilización eficaz de los nutrientes. Además, para la expresión de proteínas secretadas en líneas celulares eucariotas, la razón aumentada de superficie con respecto a volumen permite mayores niveles de secreción y, por tanto, mayores rendimientos de proteína en el sobrenadante del cultivo. Finalmente, estos métodos permiten una fácil ampliación de escala de cultivos de expresión eucariotas.

Las células que expresan vWF y/o rA13 pueden unirse a un microportador esférico o uno poroso durante el crecimiento del cultivo celular. El microportador puede ser un microportador seleccionado del grupo de microportadores basados en dextrano, colágeno, plástico, gelatina y celulosa y otros tal como se describe en Butler (1988. En: Spier & Griffiths, Animal Cell Biotechnology 3:283-303). También es posible hacer crecer las células hasta una biomasa sobre microportadores esféricos y subcultivar las células cuando han alcanzado la biomasa de fermentador final y antes de la producción de la proteína expresada sobre un microportador poroso o viceversa. Los microportadores esféricos adecuados pueden incluir microportadores de superficie lisa, tales como Cytodex™ 1, Cytodex™ 2 y Cytodex™ 3 (GE Healthcare) y microportadores macroporosos tales como Cytopore™ 1, Cytopore™ 2, Cytoline™ 1 y Cytoline™ 2 (GE Healthcare).

Tal como se describió anteriormente, la presente invención incluye medios de cultivo celular que tienen una concentración aumentada de cobre tal como se reivindica. Se entiende que todas las realizaciones y concentraciones descritas en la sección “Medios de cultivo celular” anteriormente pueden aplicarse a los métodos de la presente invención descritos en el presente documento.

En determinadas realizaciones, el cultivo puede mantenerse durante al menos aproximadamente 7 días, o al menos aproximadamente 14 días, 21 días, 28 días, o al menos aproximadamente 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, o al menos aproximadamente 2 meses, o 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses o más tiempo. La densidad celular a la que se mantiene un cultivo celular para la producción de una proteína rA13 recombinante dependerá del medio y las condiciones de cultivo usados para la expresión de proteína. Un experto en la técnica podrá determinar fácilmente la densidad celular óptima para un cultivo celular que produce rA13. En otras realizaciones, la densidad celular se mantiene a una concentración de entre aproximadamente 1,0x106 y aproximadamente 4,0x106 células/ml durante un periodo de tiempo prolongado. En otras realizaciones, la densidad celular se mantiene a una concentración de entre aproximadamente 1,0x106 y aproximadamente 4,0x106 células/ml durante un periodo de tiempo prolongado. En aún otras realizaciones, la densidad celular puede mantenerse a una concentración entre aproximadamente 2,0x106 y aproximadamente 4,0x106 células/ml, o entre aproximadamente 1,0x106 y aproximadamente 2,5x106 células/ml, o entre aproximadamente 1,5x106 y aproximadamente 3,5x106células/ml, o cualquier otro intervalo similar, durante un periodo de tiempo prolongado.

En una realización, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 4,0x106 células/ml durante al menos 7 días. En una realización específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 4,0x106 células/ml durante al menos 14 días. En una realización más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 4,0x106 células/ml durante al menos 21 días. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 4,0x106 células/ml durante al menos 28 días. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 4,0x106 células/ml durante al menos 5 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 4,0x106 células/ml durante al menos 6 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 4,0x106 células/ml durante al menos 7 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 4,0x106 células/ml durante al menos 8 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 4,0x106 células/ml durante al menos 9 semanas.

En una realización, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 3,5x106 células/ml durante al menos 7 días. En una realización específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 3,5x106 células/ml durante al menos 14 días. En una realización más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 3,5x106 células/ml durante al menos 21 días. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 3,5x106 células/ml durante al menos 28 días. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 3,5x106 células/ml durante al menos 5 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 3,5x106 células/ml durante al menos 6 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 3,5x106 células/ml durante al menos 7 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 3,5x106 células/ml durante al menos 8 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 3,5x106 células/ml durante al menos 9 semanas.

En una realización, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 3,0x106 células/ml durante al menos 7 días. En una realización específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 3,0x106 células/ml durante al menos 14 días. En una realización más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 3,0x106 células/ml durante al menos 21 días. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 3,0x106 células/ml durante al menos 28 días. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 3,0x106 células/ml durante al menos 5 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 3,0x106 células/ml durante al menos 6 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 3,0x106 células/ml durante al menos 7 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 3,0x106 células/ml durante al menos 8 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 3,0x106 células/ml durante al menos 9 semanas.

En una realización, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 2,5x106 células/ml durante al menos 7 días. En una realización específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 2,5x106 células/ml durante al menos 14 días. En una realización más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 2,5x106 células/ml durante al menos 21 días. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 2,5x106 células/ml durante al menos 28 días. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 2,5x106 células/ml durante al menos 5 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 2,5x106 células/ml durante al menos 6 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 2,5x106 células/ml durante al menos 7 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 2,5x106 células/ml durante al menos 8 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 2,5x106 células/ml durante al menos 9 semanas.

En otra realización, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 2,0x106 células/ml durante al menos 7 días. En una realización específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 2,0x106 células/ml durante al menos 14 días. En una realización más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 2,0x106 células/ml durante al menos 21 días. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 2,0x106 células/ml durante al menos 28 días. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 2,0x106 células/ml durante al menos 5 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 2,0x106 células/ml durante al menos 6 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 2,0x106 células/ml durante al menos 7 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 2,0x106 células/ml durante al menos 8 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 2,0x106 células/ml durante al menos 9 semanas.

En una realización, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 1,5x106 células/ml durante al menos 7 días. En una realización específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 1,5x106 células/ml durante al menos 14 días. En una realización más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 1,5x106 células/ml durante al menos 21 días. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 1,5x106 células/ml durante al menos 28 días. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 1,5x106 células/ml durante al menos 5 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 1,5x106 células/ml durante al menos 6 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 1,5x106 células/ml durante al menos 7 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 1,5x106 células/ml durante al menos 8 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 1,5x106 células/ml durante al menos 9 semanas.

Lo siguiente proporciona detalles específicos sobre métodos para producir rVWF y rA13. Tal como se apreciará, aunque se presentan las condiciones específicamente para rVWF o rA13, las condiciones para rVWF pueden usarse para producir rA13 y viceversa.

B. Métodos de producción de vWF recombinante de alto peso molecular

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere además a métodos para producir vWF en condiciones de cultivo celular que comprenden un medio de cultivo celular que tiene una concentración aumentada de cobre. En determinadas realizaciones, el cultivo también comprende una baja concentración de amonio. Tal como se usa en el presente documento, el término “cultivo celular” y “disolución de cultivo celular” se usan indistintamente.

En una realización, la presente divulgación proporciona un método de producción de un vWF de alto peso molecular, recombinante, que comprende: a) proporcionar un cultivo de células; b) introducir una secuencia de ácido nucleico que codifica vWF; c) seleccionar las células que portan la secuencia de ácido nucleico; y, d) expresar vWF en las células en condiciones de cultivo celular que comprenden un medio de cultivo celular que comprende una concentración de cobre de al menos aproximadamente 2,4 pg/l y un sobrenadante de cultivo celular que comprende una concentración de amonio de menos de aproximadamente 10 mM, en el que el vWF es vWF altamente multimérico que comprende de aproximadamente 14 a aproximadamente 22 dímeros y una actividad de ristocetina específica de al menos aproximadamente 30 mU/pg. En realizaciones adicionales, el rVWF multimérico producido usando métodos de la presente divulgación comprende aproximadamente 10-30, 12-28, 14-26, 16-24, 18-22, 20-21 dímeros. En todavía realizaciones adicionales, el rVWF producido según la presente divulgación tiene una actividad específica de al menos aproximadamente 20, 22,5, 25, 27,5, 30, 32,5, 35, 37,5,40, 42,5, 45, 47,5, 50, 52,5, 55, 57,5, 60, 62,5, 65, 67,5, 70, 72,5, 75, 77,5, 80 mU/pg o más. En una realización específica, la densidad celular del cultivo celular continuo para la producción de rVWF se mantiene a una concentración de no más de 2,5x106 células/ml durante un periodo prolongado. En otras realizaciones específicas, la densidad celular se mantiene a no más de 2,0x106 células/ml, 1,5x106 células/ml, 1,0x106 células/ml, 0,5x106 células/ml o menos. En una realización, la densidad celular se mantiene a entre 1,5x106 células/ml y 2,5x106 células/ml.

En una realización, la presente divulgación proporciona un método para producir una composición de factor de von Willebrand recombinante (rVWF), comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar un medio de cultivo de células basales; (b) complementar el medio de cultivo de células basales con cobre para proporcionar una concentración de cobre final de al menos 2,0 pg/l; (c) proporcionar una o más células que comprenden un ácido nucleico que codifica una proteína rVWF; (d) cultivar la uno o más células en el medio de cultivo celular complementado con cobre de tal manera que se expresa rVWF y se excreta desde las células a un sobrenadante de cultivo; y (e) recuperar al menos una porción del sobrenadante de cultivo, en el que el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 30 mU/pg de rVWF. En una realización, la disolución de cultivo celular comprende además una concentración de amonio de menos de 10 mM. En otra realización específica, la concentración de amonio de la disolución de cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 10 mM durante al menos 7 días. En una realización preferida, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 5 mM. En otra realización específica, la concentración de amonio de la disolución de cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 5 mM durante al menos 7 días. En una realización preferida, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 4 mM. En otra realización específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 4 mM durante al menos 7 días. En aún otras realizaciones, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 10 mM, o no más de 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM o menos. En aún otra realización, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a un bajo nivel durantela duración del procedimiento (es decir, durante todo el tiempo que está usándose el cultivo para producir rVWF). En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 50 mU/pg de rVWF. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 70 mU/pg de rVWF.

En una realización del método descrito anteriormente, el medio de cultivo de células basales se complementa con cobre para proporcionar una concentración de cobre final de al menos 2,4 pg/l. En una realización, la disolución de cultivo celular comprende además una concentración de amonio de menos de 10 mM. En otra realización específica, la concentración de amonio de la disolución de cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 10 mM durante al menos 7 días. En una realización preferida, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 5 mM. En otra realización específica, la concentración de amonio de la disolución de cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 5 mM durante al menos 7 días. En una realización preferida, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 4 mM. En otra realización específica, la concentración de amonio de la disolución de cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 4 mM durante al menos 7 días. En aún otras realizaciones, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 10 mM, o no más de 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM o menos. En aún otra realización, la concentración de amonio de la disolución de cultivo celular se mantiene a un bajo nivel durantela duración del procedimiento (es decir, durante todo el tiempo que está usándose el cultivo para producir rVWF). En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 50 mU/pg de rVWF. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 70 mU/pg de rVWF.

En una realización del método descrito anteriormente, el medio de cultivo de células basales se complementa con cobre para proporcionar una concentración de cobre final de al menos 3 pg/l. En una realización, la disolución de cultivo celular comprende además una concentración de amonio de menos de 10 mM. En otra realización específica, la concentración de amonio de la disolución de cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 10 mM durante al menos 7 días. En una realización preferida, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 5 mM. En otra realización específica, la concentración de amonio de la disolución de cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 5 mM durante al menos 7 días. En una realización preferida, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 4 mM. En otra realización específica, la concentración de amonio de la disolución de cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 4 mM durante al menos 7 días. En aún otras realizaciones, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 10 mM, o no más de 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM o menos. En aún otra realización, la concentración de amonio de la disolución de cultivo celular se mantiene a un bajo nivel durantela duración del procedimiento (es decir, durante todo el tiempo que está usándose el cultivo para producir rVWF). En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 50 mU/|ig de rVWF. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 70 mU/|ig de rVWF.

En una realización del método descrito anteriormente, el medio de cultivo de células basales se complementa con cobre para proporcionar una concentración de cobre final de al menos 4 |ig/l. En una realización, la disolución de cultivo celular comprende además una concentración de amonio de menos de 10 mM. En otra realización específica, la concentración de amonio de la disolución de cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 10 mM durante al menos 7 días. En una realización preferida, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 5 mM. En otra realización específica, la concentración de amonio de la disolución de cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 5 mM durante al menos 7 días. En una realización preferida, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 4 mM. En otra realización específica, la concentración de amonio de la disolución de cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 4 mM durante al menos 7 días. En aún otras realizaciones, los medios de cultivo celular comprenden una concentración de amonio de no más de 10 mM, o no más de 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM o menos. En aún otra realización, la concentración de amonio de la disolución de cultivo celular se mantiene a un bajo nivel durantela duración del procedimiento (es decir, durante todo el tiempo que está usándose el cultivo para producir rVWF). En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 50 mU/|ig de rVWF. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 70 mU/|ig de rVWF.

En una realización del método descrito anteriormente, el medio de cultivo de células basales se complementa con cobre para proporcionar una concentración de cobre final de aproximadamente 4,3 |ig/l. En una realización, la disolución de cultivo celular comprende además una concentración de amonio de menos de 10 mM. En otra realización específica, la concentración de amonio de la disolución de cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 10 mM durante al menos 7 días. En una realización preferida, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 5 mM. En otra realización específica, la concentración de amonio de la disolución de cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 5 mM durante al menos 7 días. En una realización preferida, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 4 mM. En otra realización específica, la concentración de amonio de la disolución de cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 4 mM durante al menos 7 días. En aún otras realizaciones, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 10 mM, o no más de 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM o menos. En aún otra realización, la concentración de amonio de la disolución de cultivo celular se mantiene a un bajo nivel durantela duración del procedimiento (es decir, durante todo el tiempo que está usándose el cultivo para producir rVWF). En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 50 mU/|ig de rVWF. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 70 mU/|ig de rVWF.

En una realización del método descrito anteriormente, el medio de cultivo de células basales se complementa con cobre para proporcionar una concentración de cobre final de entre 2 |ig/l y 20 |ig/l. En una realización, la disolución de cultivo celular comprende además una concentración de amonio de menos de 10 mM. En otra realización específica, la concentración de amonio de la disolución de cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 10 mM durante al menos 7 días. En una realización preferida, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 5 mM. En otra realización específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 5 mM durante al menos 7 días. En una realización preferida, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 4 mM. En otra realización específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 4 mM durante al menos 7 días. En aún otras realizaciones, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 10 mM, o no más de 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM o menos. En aún otra realización, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a un bajo nivel durantela duración del procedimiento (es decir, durante todo el tiempo que está usándose el cultivo para producir rVWF). En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 50 mU/|ig de rVWF. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 70 mU/|ig de rVWF.

En una realización del método descrito anteriormente, el medio de cultivo de células basales se complementa con cobre para proporcionar una concentración de cobre final de entre 3 |ig/l y 10 |ig/l. En una realización, la disolución de cultivo celular comprende además una concentración de amonio de menos de 10 mM. En otra realización específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 10 mM durante al menos 7 días. En una realización preferida, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 5 mM. En otra realización específica, la concentración de amonio de la disolución de cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 5 mM durante al menos 7 días. En una realización preferida, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 4 mM. En otra realización específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 4 mM durante al menos 7 días. En aún otras realizaciones, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 10 mM, o no más de 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM o menos. En aún otra realización, la concentración de amonio de la disolución de cultivo celular se mantiene a un bajo nivel durantela duración del procedimiento (es decir, durante todo el tiempo que está usándose el cultivo para producir rVWF). En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 50 mU/pg de rVWF. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 70 mU/pg de rVWF.

En una realización del método descrito anteriormente, el medio de cultivo de células basales se complementa con cobre para proporcionar una concentración de cobre final de entre 4 pg/l y 7,5 pg/l. En una realización, la disolución de cultivo celular comprende además una concentración de amonio de menos de 10 mM. En otra realización específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 10 mM durante al menos 7 días. En una realización preferida, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 5 mM. En otra realización específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 5 mM durante al menos 7 días. En una realización preferida, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 4 mM. En otra realización específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 4 mM durante al menos 7 días. En aún otras realizaciones, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 10 mM, o no más de 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM o menos. En aún otra realización, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a un bajo nivel durantela duración del procedimiento (es decir, durante todo el tiempo que está usándose el cultivo para producir rVWF). En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 50 mU/pg de rVWF. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 70 mU/pg de rVWF.

En una realización, la presente divulgación proporciona un método para producir una composición de factor de von Willebrand recombinante (rVWF), comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar un medio de cultivo de células basales; (b) complementar el medio de cultivo de células basales con cobre; (c) proporcionar una o más células que comprenden un ácido nucleico que codifica una proteína rVWF; (d) cultivar la una o más células en el medio de cultivo celular complementado con cobre de tal manera que se expresa rVWF y se excreta desde las células a un sobrenadante de cultivo; y (e) recuperar al menos una porción del sobrenadante de cultivo, en el que la concentración de NH4+ del sobrenadante se mantiene a un bajo nivel durante al menos 7 días, y además en el que el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 30 mU/pg de rVWF. En una realización específica, la concentración de cobre y la concentración de NH4+ de la disolución de cultivo celular se mantiene a una concentración según una cualquiera de las variaciones 1 a 440, tal como se expone en la tabla 1. En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 50 mU/pg de rVWF. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 70 mU/pg de rVWF.

En una realización del método descrito anteriormente, la concentración de cobre y la concentración de NH4+ del cultivo celular se mantienen a una concentración según una cualquiera de las variaciones 1 a 440, tal como se expone en la tabla 1 durante al menos 14 días. En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 50 mU/pg de rVWF. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 70 mU/pg de rVWF.

En una realización del método descrito anteriormente, la concentración de cobre y la concentración de NH4+ del cultivo celular se mantienen a una concentración según una cualquiera de las variaciones 1 a 440, tal como se expone en la tabla 1 durante al menos 21 días. En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 50 mU/pg de rVWF. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 70 mU/pg de rVWF.

En una realización del método descrito anteriormente, la concentración de cobre y la concentración de NH4+ del cultivo celular se mantienen a una concentración según una cualquiera de las variaciones 1 a 440, tal como se expone en la tabla 1 durante al menos 28 días. En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 50 mU/pg de rVWF. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 70 mU/pg de rVWF.

En una realización del método descrito anteriormente, la concentración de cobre y la concentración de NH4+ del cultivo celular se mantienen a una concentración según una cualquiera de las variaciones 1 a 440, tal como se expone en la tabla 1 durante al menos 5 semanas. En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 50 mU/pg de rVWF. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 70 mU/pg de rVWF.

En una realización del método descrito anteriormente, la concentración de cobre y la concentración de NH4+ del cultivo celular se mantienen a una concentración según una cualquiera de las variaciones 1 a 440, tal como se expone en la tabla 1 durante al menos 6 semanas. En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 50 mU/pg de rVWF. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 70 mU/pg de rVWF.

En una realización del método descrito anteriormente, la concentración de cobre y la concentración de NH4+ del cultivo celular se mantienen a una concentración según una cualquiera de las variaciones 1 a 440, tal como se expone en la tabla 1 durante al menos 7 semanas. En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 50 mU/pg de rVWF. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 70 mU/pg de rVWF.

En una realización del método descrito anteriormente, la concentración de cobre y la concentración de NH4+ del cultivo celular se mantienen a una concentración según una cualquiera de las variaciones 1 a 440, tal como se expone en la tabla 1 durante al menos 8 semanas. En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 50 mU/pg de rVWF. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 70 mU/pg de rVWF.

En una realización del método descrito anteriormente, la concentración de cobre y la concentración de NH4+ del cultivo celular se mantienen a una concentración según una cualquiera de las variaciones 1 a 440, tal como se expone en la tabla 1 durante al menos 9 semanas. En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 50 mU/pg de rVWF. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 70 mU/pg de rVWF.

En una realización, la presente divulgación proporciona un método para producir una composición de factor de von Willebrand recombinante (rVWF), comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar un medio de cultivo de células basales; (b) complementar el medio de cultivo de células basales con cobre para proporcionar una concentración de cobre final de al menos 2,0 pg/l; (c) proporcionar una o más células que comprenden un ácido nucleico que codifica una proteína rVWF; (d) cultivar la una o más células en el medio de cultivo celular complementado con cobre de tal manera que se expresa rVWF y se excreta desde las células a un sobrenadante de cultivo; (e) monitorizar la concentración de amonio del sobrenadante de cultivo; y (f) recuperar al menos una porción del sobrenadante de cultivo, en el que no se usa el sobrenadante de cultivo que comprende una concentración de amonio de más de 10 mM para producir la composición de rVWF, y además en el que el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 30 mU/pg de rVWF. En determinadas realizaciones, la concentración de cobre final del medio de cultivo basal complementado es de al menos 2,4 pg/l, 3 pg/l, 4 pg/l, 5 pg/l, 6 pg/l, 7 pg/l, 8 pg/l, 9 pg/l, 10 pg/l, 15 pg/l, 20 pg/l o mayor. En otras realizaciones, la concentración de cobre final del medio de cultivo basal complementado es de 2-20 pg/l, 2-10 pg/l, 3-8 pg/l o 4-6 pg/l. En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 50 mU/pg de rVWF. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 70 mU/pg de rVWF.

En una realización del método descrito anteriormente no se usa el sobrenadante de cultivo que comprende una concentración de amonio de más de 6 mM para producir la composición de rVWF. En determinadas realizaciones, la concentración de cobre final del medio de cultivo basal complementado es de al menos 2,4 pg/l, 3 pg/l, 4 pg/l, 5 pg/l, 6 pg/l, 7 pg/l, 8 pg/l, 9 pg/l, 10 pg/l, 15 pg/l, 20 pg/l, o mayor. En otras realizaciones, la concentración de cobre final del medio de cultivo basal complementado es de 2-20 pg/l, 2-10 pg/l, 3-8 pg/l o 4-6 pg/l. En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 50 mU/pg de rVWF. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 70 mU/pg de rVWF.

En una realización del método descrito anteriormente no se usa el sobrenadante de cultivo que comprende una concentración de amonio de más de 5 mM para producir la composición de rVWF. En determinadas realizaciones, la concentración de cobre final del medio de cultivo basal complementado es de al menos 2,4 pg/l, 3 pg/l, 4 pg/l, 5 pg/l, 6 pg/l, 7 pg/l, 8 pg/l, 9 pg/l, 10 pg/l, 15 pg/l, 20 pg/l o mayor. En otras realizaciones, la concentración de cobre final del medio de cultivo basal complementado es de 2-20 pg/l, 2-10 pg/l, 3-8 pg/l o 4-6 pg/l. En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 50 mU/pg de rVWF. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 70 mU/pg de rVWF.

En una realización del método descrito anteriormente no se usa el sobrenadante de cultivo que comprende una concentración de amonio de más de 4 mM para producir la composición de rVWF. En determinadas realizaciones, la concentración de cobre final del medio de cultivo basal complementado es de al menos 2,4 pg/l, 3 pg/l, 4 pg/l, 5 pg/l, 6 pg/l, 7 pg/l, 8 pg/l, 9 pg/l, 10 pg/l, 15 pg/l, 20 pg/l o mayor. En otras realizaciones, la concentración de cobre final del medio de cultivo basal complementado es de 2-20 pg/l, 2-10 pg/l, 3-8 pg/l, o 4-6 pg/l. En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 50 mU/pg de rVWF. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de rVWF de al menos 70 mU/pg de rVWF.

Puede producirse vWF recombinante mediante expresión en un sistema de huésped eucariota adecuado. Los ejemplos de células eucariotas incluyen, sin limitación, células de mamífero, tales como CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep y HepG2; células de insecto, por ejemplo, células SF9, células SF21, células S2 y células High Five; y células de levaduras, por ejemplo, células de Saccharomyces o Schizosaccharomyces. En una realización, el vWF puede expresarse en células de levaduras, células de insecto, células aviares, células de mamífero y similares. Por ejemplo, en una línea celular humana, una línea celular de hámster o una línea celular murina. En una realización particular, la línea celular es una línea celular CHO, BHK o HEK. Normalmente pueden usarse células de mamífero, por ejemplo, células CHO de una línea celular continua, para expresar el vWF de la presente divulgación.

En determinadas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica vWF puede ser un vector. El vector puede suministrarse mediante un virus o puede ser un plásmido. La secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína puede ser un gen específico o una parte biológicamente funcional del mismo. En una realización, la proteína es al menos una parte biológicamente activa de vWF.

Puede usarse una amplia variedad de vectores para la expresión de vWF y pueden seleccionarse de vectores de expresión eucariotas. Los ejemplos de vectores para expresión eucariota incluyen: (i) para la expresión en levaduras, vectores tales como pAO, pPIC, pYES, pMET, que usan promotores tales como AOX1, GAP, GAL1, AUG1, etc.; (ii) para la expresión en células de insecto, vectores tales como pMT, pAc5, pIB, pMIB, pBAC, etc., que usan promotores tales como PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, polh, etc., y (iii) para la expresión en células de mamífero, vectores tales como pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, pBPV, etc., y vectores derivados de sistemas virales tales como virus vaccinia, virus adenoasociados, herpesvirus, retrovirus, etc., que usan promotores tales como CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV y p-actina. Kaufman et al. (Mol Cell Biol. 1989 Mar;9(3):1233-42) describen un vector a modo de ejemplo para expresar rVWF.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, la secuencia de ácido nucleico comprende además otras secuencias adecuadas para una expresión controlada de una proteína tales como secuencias promotoras, potenciadores, cajas TATA, sitios de iniciación de la transcripción, policonectores, sitios de restricción, secuencias de poli-A, secuencias de procesamiento de proteínas, marcadores de selección y similares que conoce generalmente un experto habitual en la técnica.

Además de medios de cultivo celular que comprenden una concentración aumentada de cobre, las condiciones de cultivo celular de la presente divulgación pueden incluir una concentración de amonio de menos de aproximadamente 25 mM en la totalidad de un procedimiento posterior completo en sistemas de cultivo. En una realización, las condiciones de cultivo celular incluyen una concentración de amonio de menos de aproximadamente 25 mM, en otra realización de menos de aproximadamente 20 mM, en aún otra realización de menos de aproximadamente 15 mM, en aún otra realización de menos de aproximadamente 10 mM y en una realización adicional de menos de aproximadamente 5 mM.

En algunas realizaciones, las concentraciones de amonio de la presente divulgación se mantienen constantes en la totalidad del procedimiento posterior completo del sistema de cultivo celular. Las células usadas según la presente divulgación pueden cultivarse, por ejemplo, mediante métodos que se modifican en comparación con el cultivo discontinuo y el cultivo semicontinuo convencionales, cada uno de los cuales se conoce generalmente en el campo. Sin embargo, tales técnicas convencionales pueden producir altas concentraciones de amonio al final del cultivo. Los métodos de la presente invención superan este problema empleando sistemas de producción que pueden proporcionar un suministro continuo de medios de cultivo a través de técnicas tales como, por ejemplo, cultivos de perfusión o quimiostáticos. Tras el cultivo de las células huésped, el vWF puede recuperarse del medio gastado usando metodologías convencionales, tales como ultrafiltración o centrifugación. Si se desea, el vWF puede purificarse mediante, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico y/o de exclusión molecular y similares.

Un cultivo continuo (por ejemplo, un cultivo de perfusión o quimiostático) puede ser un cultivo ensuspensión al que se suministran de manera continua nutrientes mediante el flujo de entrada de medio recién preparado, en el que el volumen de cultivo es habitualmente constante. De manera similar, la fermentación continua puede referirse a un procedimiento en el que se mantienen en cultivo células o microorganismos en la fase de crecimiento exponencial mediante la adición continua de medio recién preparadoque se equilibra exactamente mediante la retirada de suspensión celular del biorreactor. Además, puede usarse un sistema de tanque con agitaciónpara los cultivos ensuspensión, de perfusión, quimiostáticos y/o conmicroportadores. Generalmente, el sistema de reactor de tanque con agitaciónpuede hacerse funcionar como cualquier reactor de tanque con agitaciónconvencional con cualquier tipo de agitador tal como uno Rushton, de hidroala, de aleta inclinada o marino.

C. Métodos de producción de ADAMTS13 recombinante (A13)

En otro aspecto, la presente invención se refiere además a métodos para producir rA13 en condiciones de cultivo celular que comprenden un medio de cultivo celular que tiene una concentración de cobre aumentada. El cultivo también comprende una baja concentración de amonio.

En una realización, la presente invención proporciona un método para producir una composición de ADAMTS13 recombinante (rA13), comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar un medio de cultivo de células basales; (b) complementar el medio de cultivo de células basales con cobre para proporcionar una concentración de cobre final de entre 1,0 pg/l y 6 pg/l; (c) proporcionar una o más células de mamífero que comprenden un ácido nucleico que codifica una proteína rA13; (d) cultivar la una o más células de mamífero en el medio de cultivo celular complementado con cobre de tal manera que se expresa rA13 y se excreta desde las células a un sobrenadante de cultivo; en el que el cultivo comprende cultivo continuo; y (e) recuperar al menos una porción del sobrenadante de cultivo, en el que el contenido de NH4+ del sobrenadante de cultivo celular se mantiene a una concentración de no más de 5 mM; en el que la densidad celular se mantiene a menos de 4,0x106 células por ml durante la etapa de cultivo de la una o más células de mamífero; y en el que están presentes al menos 1500 unidades de actividad FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células basales complementado al día (es decir, 1500 unidades de actividad FRETS-VWF73 al día por litro de cultivo celular; P FRETS) en el sobrenadante de cultivo recuperado. En determinadas realizaciones, la concentración de cobre final del medio de cultivo basal complementado es de al menos 2 pg/l, 3 pg/l, 4 pg/l, 5 pg/l, 6 pg/l. En otras realizaciones, la concentración de cobre final del medio de cultivo basal complementado es de 1-6 pg/l, 2-5 pg/l, 2-4 pg/l o 3-4 pg/l. En una realización preferida están presentes al menos 2000 unidades de actividad FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células basales complementado al día en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una realización más preferida están presentes al menos 2500 unidades de actividad FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células basales complementado al día en el sobrenadante de cultivo recuperado. En la realización más preferida están presentes al menos 3000 unidades de actividad FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células basales complementado al día en el sobrenadante de cultivo recuperado. En determinadas realizaciones, los métodos proporcionan productividad de FRETS-VWF73 volumétrica mejorada de manera sostenible (P FRETS). Por ejemplo, en determinadas realizaciones se recuperan al menos 1500 unidades de actividad FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células basales complementado diariamente durante al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 o más días. En una realización preferida se recuperan al menos 2000 unidades de actividad FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células basales complementado diariamente durante al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 o más días. En una realización más preferida se recuperan al menos 2500 unidades de actividad FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células basales complementado diariamente durante al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 o más días. En la realización más preferida se recuperan al menos 3000 unidades de actividad enFRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células basales complementado diariamente durante al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 o más días. En una realización específica, la densidad celular del cultivo celular continuo para la producción de rA13 se mantiene a una concentración de no más de 4,0x106 células/ml durante un periodo prolongado. En otras realizaciones específicas, la densidad celular se mantiene a no más de 3,5x106 células/ml, 3,0x106 células/ml, 2,5x106 células/ml, 2,0x106 células/ml, 1,5x106 células/ml, 1,0x106 células/ml o menos. En una realización, la densidad celular se mantiene a entre 3,0x106 células/ml y 4,0x106 células/ml.

En una realización de los métodos descritos anteriormente, el sobrenadante recuperado tiene al menos 4 unidades de actividad FRETS-VWF73 por ml de sobrenadante (FRETS). En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene al menos 6 unidades de actividad FRETS-VWF73 por ml de sobrenadante. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene al menos 8 unidades de actividad FRETS-VWF73 por ml de sobrenadante. En la realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene al menos 10 unidades de actividad FRETS-VWF73 por ml de sobrenadante. En determinadas realizaciones, los métodos proporcionan producción de FRETS mejorada de manera sostenible. Por ejemplo, en determinadas realizaciones se recupera sobrenadante que tiene al menos 4 unidades de actividad FRETS-VWF73 por ml diariamente durante al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 o más días. En una realización preferida se recupera sobrenadante que tiene al menos 6 unidades de actividad FRETS-VWF73 por ml diariamente durante al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 o más días. En una realización más preferida se recupera sobrenadante que tiene al menos 8 unidades de actividad FRETS-VWF73 por ml diariamente durante al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 o más días. En la realización más preferida se recupera sobrenadante que tiene al menos 10 unidades de actividad FRETS-VWF73 por ml diariamente durante al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 o más días.

En una realización de los métodos descritos anteriormente, el cultivo celular da como resultado la producción de al menos 800 mU de actividad FRETS-VWF73 por 106 células presentes en el cultivo al día (es decir, q FRETS). En una realización preferida, el cultivo celular da como resultado la producción de al menos 1 U de actividad FRETS-VWF73 por 106 células presentes en el cultivo al día. En una realización más preferida, el cultivo celular da como resultado la producción de al menos 1,2 U de actividad FRETS-VWF73 por 106 células presentes en el cultivo al día. En la realización más preferida, el cultivo celular da como resultado la producción de al menos 1,4 U de actividad FRETS-VWF73 por 106 células presentes en el cultivo al día. En determinadas realizaciones, los métodos proporcionan productividad de FRETS-VWF73 específica de célula mejorada de manera sostenible (q FRETS). Por ejemplo, en determinadas realizaciones, el cultivo celular da como resultado la producción de al menos 800 mU de actividad FRETS-VWF73 por 106 células presentes en el cultivo diariamente durante al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 o más días. En una realización preferida, el cultivo celular da como resultado la producción de al menos 1 U de actividad FRETS-VWF73 por 106 células presentes en el cultivo diariamente durante al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 o más días. En una realización más preferida, el cultivo celular da como resultado la producción de al menos 1,2 U de actividad FRETS-VWF73 por 106 células presentes en el cultivo diariamente durante al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 o más días. En la realización más preferida, el cultivo celular da como resultado la producción de al menos 1,4 U de actividad FRETS-VWF73 por 106 células presentes en el cultivo diariamente durante al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 o más días.

En una realización de los métodos descritos anteriormente, el cultivo celular da como resultado la producción de al menos 1 mg de rA13, según se mide mediante ELISA, por litro de cultivo al día (P ELISA). En una realización preferida, el cultivo celular da como resultado la producción de al menos 1,5 mg de rA13, según se mide mediante ELISA, por litro de cultivo al día. En una realización más preferida, el cultivo celular da como resultado la producción de al menos 2 mg de rA13, según se mide mediante ELISA, por litro de cultivo al día. En determinadas realizaciones, los métodos proporcionan la producción de rA13 mejorada de manera sostenible. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, el cultivo celular da como resultado la producción de al menos 1 mg de rA13, según se mide mediante ELISA, por litro de cultivo diariamente durante al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 o más días. En una realización preferida, el cultivo celular da como resultado la producción de al menos 1,5 mg de rA13, según se mide mediante ELISA, por litro de cultivo diariamente durante al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 o más días. En una realización más preferida, el cultivo celular da como resultado la producción de al menos 2 mg de rA13, según se mide mediante ELISA, por litro de cultivo diariamente durante al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 o más días.

En una realización de los métodos descritos anteriormente, el cultivo celular da como resultado la producción de al menos 0,5 pg de rA13, según se mide mediante ELISA, por 106 células presentes en el cultivo al día (es decir, q ELISA). En una realización preferida, el cultivo celular da como resultado la producción de al menos 0,7 pg de rA13, según se mide mediante ELISA, por 106 células presentes en el cultivo al día. En una realización más preferida, el cultivo celular da como resultado la producción de al menos 0,9 pg de rA13, según se mide mediante ELISA, por 106 células presentes en el cultivo al día. En determinadas realizaciones, los métodos proporcionan una producción de q ELISA mejorada de manera sostenible. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, el cultivo celular da como resultado la producción de al menos 0,5 pg de rA13, según se mide mediante ELISA, por 106 células presentes en el cultivo diariamente durante al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 o más días. En una realización preferida, el cultivo celular da como resultado la producción de al menos 0,7 pg de rA13, según se mide mediante ELISA, por 106 células presentes en el cultivo diariamente durante al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 o más días. En una realización más preferida, el cultivo celular da como resultado la producción de al menos 0,9 pg de rA13, según se mide mediante ELISA, por 106 células presentes en el cultivo diariamente durante al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 o más días.

En una realización de los métodos descritos anteriormente, el sobrenadante recuperado tiene al menos 3 pg de rA13, según se mide mediante ELISA, por ml de sobrenadante. En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene al menos 4 pg de rA13, según se mide mediante ELISA, por ml de sobrenadante. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene al menos 5 pg de rA13, según se mide mediante ELISA, por ml de sobrenadante. En la realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene al menos 6 pg de rA13, según se mide mediante ELISA, por ml de sobrenadante. En determinadas realizaciones, los métodos proporcionan una producción de rA13 mejorada de manera sostenible. Por ejemplo, en determinadas realizaciones se recupera sobrenadante que tiene al menos 3 pg de rA13 por ml diariamente durante al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 o más días. En una realización preferida se recupera sobrenadante que tiene al menos 4 pg de rA13 por ml diariamente durante al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 o más días. En una realización más preferida se recupera sobrenadante que tiene al menos 5 pg de rA13 por ml diariamente durante al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 o más días. En la realización más preferida se recupera sobrenadante que tiene al menos 6 pg de rA13 por ml diariamente durante al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 o más días.

En una realización preferida, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio inferior a 5 mM. En otra realización específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio inferior a 5 mM durante al menos 7 días. En una realización preferida, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 4 mM. En otra realización específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 4 mM durante al menos 7 días. En aún otras realizaciones, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio inferior a 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM o menos. En aún otra realización, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a un nivel bajo durante la duración del procedimiento (es decir, durante todo el tiempo en el que se usa el cultivo para producir rA13). En una realización particular, la disolución de cultivo tiene una concentración de cobre y amonio de acuerdo con las reivindicaciones y tal como se proporciona en la tabla 1.

En una realización, la presente invención proporciona un método tal como se reivindica para producir una composición de ADAMTS13 recombinante (rA13), comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar un medio de cultivo de células basales; (b) complementar el medio de cultivo de células basales con cobre y zinc; (c) proporcionar una o más células que comprenden un ácido nucleico que codifica una proteína rA13; (d) cultivar la una o más células en el medio de cultivo celular complementado con cobre de tal manera que se expresa rA13 y se excreta desde las células a un sobrenadante de cultivo; y (e) recuperar al menos una porción del sobrenadante de cultivo, en el que están presentes al menos 1500 unidades de actividad FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células basales complementado al día en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una realización, el medio de cultivo contiene al menos 1 pg/l de cobre y zinc a al menos 2 pM. En otras realizaciones, el medio contiene al menos 2 pg/l de cobre o al menos 4 pg/l de cobre. En una realización en la que el medio está complementado con cobre, el medio de cultivo también contiene zinc a al menos o aproximadamente 5 pM. En una realización, el medio de cultivo también contiene zinc a o a aproximadamente entre 2 pM y 12 pM. En otra realización, el medio de cultivo también contiene zinc a o a aproximadamente entre 5 pM y 12 pM. En aún otras realizaciones, el medio de cultivo también puede contener zinc a al menos o a aproximadamente 2 pM, o a al menos o a aproximadamente 3 pM, 4 pM, 5 pM, 6 pM, 7 pM, 8 pM, 9 pM, 10 pM, 11 pM, 12 pM, 13 pM, 14 pM, 15 pM, 20 pM, 25 pM, 30 pM o más. En una realización, el medio de cultivo contiene una concentración de cobre y zinc según las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 2. En una realización preferida están presentes al menos 2000 unidades de actividad FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células basales complementado al día en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una realización más preferida están presentes al menos 2500 unidades de actividad FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células basales complementado al día en el sobrenadante de cultivo recuperado. En la realización más preferida están presentes al menos 3000 unidades de actividad FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células basales complementado al día en el sobrenadante de cultivo recuperado.

En una realización, la presente invención proporciona un método tal como se reivindica para producir una composición de ADAMTS13 recombinante (rA13), comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar un medio de cultivo de células basales; (b) complementar el medio de cultivo de células basales con cobre y calcio; (c) proporcionar una o más células que comprenden un ácido nucleico que codifica una proteína rA13; (d) cultivar la una o más células en el medio de cultivo celular complementado con cobre de tal manera que se expresa rA13 y se excreta desde las células a un sobrenadante de cultivo; y (e) recuperar al menos una porción del sobrenadante de cultivo, en el que están presentes al menos 1500 unidades de actividad FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células basales complementado al día en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una realización, el medio de cultivo contiene al menos 1 pg/l de cobre y calcio a al menos 0,5 mM. En otras realizaciones, el medio contiene al menos 2 pg/l de cobre o al menos 4 pg/l de cobre. En otra realización en la que el medio se complementa con cobre, el medio de cultivo también contiene calcio a al menos 1,5 mM. En una realización, el medio de cultivo contiene calcio a o a aproximadamente entre 0,5 mM y 1,5 mM. En aún otras realizaciones, el medio de cultivo puede contener calcio a al menos o a aproximadamente 0,5 mM, o a al menos o a aproximadamente 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM o más. En una realización, el medio de cultivo contiene una concentración de cobre y calcio según las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 3. En una realización preferida están presentes al menos 2000 unidades de actividad FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células basales complementado al día en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una realización más preferida están presentes al menos 2500 unidades de actividad FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células basales complementado al día en el sobrenadante de cultivo recuperado. En la realización más preferida están presentes al menos 3000 unidades de actividad FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células basales complementado al día en el sobrenadante de cultivo recuperado.

En una realización, la presente invención proporciona un método tal como se reivindica para producir una composición de ADAMTS13 recombinante (rA13), comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar un medio de cultivo de células basales; (b) complementar el medio de cultivo de células basales con cobre, zinc y calcio; (c) proporcionar una o más células que comprenden un ácido nucleico que codifica una proteína rA13; (d) cultivar la una o más células en el medio de cultivo celular complementado con cobre de tal manera que se expresa rA13 y se excreta desde las células a un sobrenadante de cultivo; y (e) recuperar al menos una porción del sobrenadante de cultivo, en el que están presentes al menos 1500 unidades de actividad FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células basales complementado al día en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una realización, el medio de cultivo tiene una concentración de calcio de al menos 0,5 mM y una concentración de cobre y zinc según las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 2. En otra realización específica, el medio de cultivo tiene una concentración de calcio de al menos 1,5 mM y una concentración de cobre y zinc según las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 2. En otra realización específica, el medio de cultivo tiene una concentración de calcio de entre 0,5 mM y 1,5 mM y una concentración de cobre y zinc según las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 2. En aún otras realizaciones, el medio de cultivo tiene una concentración de calcio de al menos 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM o más, y una concentración de cobre y zinc según las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 2. En una realización preferida están presentes al menos 2000 unidades de actividad FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células basales complementado al día en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una realización más preferida están presentes al menos 2500 unidades de actividad FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células basales complementado al día en el sobrenadante de cultivo recuperado. En la realización más preferida están presentes al menos 3000 unidades de actividad FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células basales complementado al día en el sobrenadante de cultivo recuperado.

En una realización, la presente invención proporciona un método tal como se reivindica para producir una composición de ADAMTS13 recombinante (rA13), comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar un medio de cultivo de células basales; (b) complementar el medio de cultivo de células basales con cobre y nicotinamida; (c) proporcionar una o más células que comprenden un ácido nucleico que codifica una proteína rA13; (d) cultivar la una o más células en el medio de cultivo celular complementado con cobre de tal manera que se expresa rA13 y se excreta desde las células a un sobrenadante de cultivo; y (e) recuperar al menos una porción del sobrenadante de cultivo, en el que están presentes al menos 1500 unidades de actividad FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células basales complementado al día en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una realización, el medio de cultivo contiene al menos 1 pg/l de cobre y al menos 2 mg/l de nicotinamida (vitamina B3). En otras realizaciones, el medio contiene al menos 2 pg/l de cobre o al menos 4 pg/l de cobre. En otra realización en la que el medio se complementa con cobre, el medio de cultivo también contiene al menos 7 mg/l de nicotinamida (vitamina B3). En una realización, el medio de cultivo contiene nicotinamida (vitamina B3) a o a aproximadamente entre 2 mg/l y 10 mg/l. En aún otras realizaciones, el medio de cultivo puede contener concentraciones de al menos o aproximadamente 2 mg/l, 3 mg/l, 4 mg/l, 5 mg/l, 6 mg/l, 7 mg/l, 8 mg/l, 9 mg/l, 10 mg/l, 15 mg/l, 20 mg/l o superiores de nicotinamida (vitamina B3). En una realización, el medio de cultivo contiene una concentración de cobre y nicotinamida según las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 4. En una realización preferida están presentes al menos 2000 unidades de actividad FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células basales complementado al día en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una realización más preferida están presentes al menos 2500 unidades de actividad FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células basales complementado al día en el sobrenadante de cultivo recuperado. En la realización más preferida están presentes al menos 3000 unidades de actividad FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células basales complementado al día en el sobrenadante de cultivo recuperado.

En una realización, la presente invención proporciona un método tal como se reivindica para producir una composición de ADAMTS13 recombinante (rA13), comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar un medio de cultivo de células basales; (b) complementar el medio de cultivo de células basales con cobre, zinc y nicotinamida; (c) proporcionar una o más células que comprenden un ácido nucleico que codifica una proteína rA13; (d) cultivar la una o más células en el medio de cultivo celular complementado con cobre de tal manera que se expresa rA13 y se excreta desde las células a un sobrenadante de cultivo; y (e) recuperar al menos una porción del sobrenadante de cultivo, en el que están presentes al menos 1500 unidades de actividad FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células basales complementado al día en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una realización, el medio de cultivo celular tiene una concentración de nicotinamida de al menos 2 mg/ml y una concentración de cobre y zinc según las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 2. En otra realización específica, el medio de cultivo tiene una concentración de nicotinamida de al menos 7 mg/ml y una concentración de cobre y zinc según las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 2. En otra realización específica, el medio de cultivo tiene una concentración de nicotinamida de entre 2 mg/ml y 10 mg/ml y una concentración de cobre y zinc según las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 2. En aún otras realizaciones, el medio de cultivo tiene una concentración de nicotinamida de al menos 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml, 10 mg/ml, 11 mg/ml, 12 mg/ml, 13 mg/ml, 14 mg/ml, 15 mg/ml o más, y una concentración de cobre y zinc según las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 2. En una realización preferida están presentes al menos 2000 unidades de actividad FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células basales complementado al día en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una realización más preferida están presentes al menos 2500 unidades de actividad FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células basales complementado al día en el sobrenadante de cultivo recuperado. En la realización más preferida están presentes al menos 3000 unidades de actividad FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células basales complementado al día en el sobrenadante de cultivo recuperado.

En una realización, la presente invención proporciona un método tal como se reivindica para producir una composición de ADAMTS13 recombinante (rA13), comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar un medio de cultivo de células basales; (b) complementar el medio de cultivo de células basales con cobre, calcio y nicotinamida; (c) proporcionar una o más células que comprenden un ácido nucleico que codifica una proteína rA13; (d) cultivar la una o más células en el medio de cultivo celular complementado con cobre de tal manera que se expresa rA13 y se excreta desde las células a un sobrenadante de cultivo; y (e) recuperar al menos una porción del sobrenadante de cultivo, en el que están presentes al menos 1500 unidades de actividad FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células basales complementado al día en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una realización, el medio de cultivo celular tiene una concentración de nicotinamida de al menos 2 mg/ml y una concentración de cobre y calcio según las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 3. En otra realización específica, el medio de cultivo tiene una concentración de nicotinamida de al menos 7 mg/ml y una concentración de cobre y calcio según las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 3. En otra realización específica, el medio de cultivo tiene una concentración de nicotinamida de entre 2 mg/ml y 10 mg/ml y una concentración de cobre y calcio según las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 3. En aún otras realizaciones, el medio de cultivo tiene una concentración de nicotinamida de al menos 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml, 10 mg/ml, 11 mg/ml, 12 mg/ml, 13 mg/ml, 14 mg/ml, 15 mg/ml o más, y una concentración de cobre y calcio según las reivindicaciones y tal como se expone en la tabla 3. En una realización preferida están presentes al menos 2000 unidades de actividad FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células basales complementado al día en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una realización más preferida están presentes al menos 2500 unidades de actividad FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células basales complementado al día en el sobrenadante de cultivo recuperado. En la realización más preferida están presentes al menos 3000 unidades de actividad FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células basales complementado al día en el sobrenadante de cultivo recuperado.

Pueden producirse proteínas ADAMTS recombinantes mediante expresión en cualquier sistema huésped procariota o eucariota adecuado. Los ejemplos de células eucariotas incluyen, sin limitación, células de mamífero, tales como CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep, y HepG2; células de insecto, por ejemplo células SF9, células SF21, células S2 y células High Five; y células de levadura, por ejemplo células de Saccharomyces o Schizosaccharomyces. En una realización, las proteínas ADAMTS pueden expresarse en células bacterianas, células de levadura, células de insecto, células de ave, células de mamífero y similares. Por ejemplo, en una línea celular humana, una línea celular de hámster o una línea celular murina. En una realización particular, la línea celular es una línea celular de CHO, BHK o HEK. En una realización preferida, la línea celular es una línea celular de CHO. En una realización específica se preparan clones de CHO capaces de expresar de manera estable rA13 mediante transfección conjunta de una célula CHO con secuencias codificantes para rA13 y una dihidrofolato reductasa (por ejemplo, un gen de dhfr murino) y selección paracrecimiento en presencia de niveles crecientes de metotrexato.

En una realización, las células pueden ser cualquier célula de mamífero que puede cultivarse, preferiblemente en un procedimiento de fabricación (es decir, al menos 10 litros, preferiblemente al menos 100 litros), para producir una proteína ADAMTS deseada tal como ADAMTS13. Los ejemplos incluyen la línea CV1 de riñón de mono transformada mediante SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humana (293 o células 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR, tales como el subclon DUKX-B11 (CHO, Uriaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); células Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod, 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono(CV1, ATCC ^cC^l70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma de cuello uterino humanas (HeLa, ATCC CCL 2); células de riñón caninas (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humanas (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humanas (Hep G2, HB 8065); tumor de mama de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y la línea de hepatoma humana (Hep G2). Preferiblemente, la línea celular es una línea celular de roedor, especialmente una línea celular de hámster tal como CHO o BHK.

Puede usarse una amplia variedad de vectores para la expresión de una proteína ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) y pueden seleccionarse de vectores de expresión eucariotas y procariotas. En determinadas realizaciones se contempla un vector de plásmido para su uso en la expresión de una proteína ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13). En general, se usan vectores de plásmido que contienen secuencias de replicón y de control que se derivan de especies compatibles con la célula huésped en relación con estos huéspedes. El vector puede portar un sitio de replicación, así como secuencias de marcaje que son capaces de proporcionar selección fenotípica en células transformadas. El plásmido comprenderá una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) unida de manera operativa a una o más secuencias de control, por ejemplo, un promotor.

Un método preferido de preparación de clones de células CHO estables que expresan una proteína ADAMTS recombinante es de la siguiente manera. Se transfecta una línea celular de CHO deficiente en DHFR, DUKX-B11, con un vector de expresión de DHFR para permitir la expresión de la proteína recombinante relevante. Un método a modo de ejemplo se describe por Plaimauer et al. (Blood. 2002 Nov 15;100(10):3626-32. Epub 12 de julio de 2002). Se lleva a cabo la selección mediante crecimiento en medio libre de hipoxantina/timidina (HT) y amplificación de la región relevante que codifica la expresión de la proteína ADAMTS recombinante y se logra el gen de DHFR mediante propagación de las células en concentraciones crecientes de metotrexato. Cuando sea apropiado, las líneas celulares de CHO pueden adaptarse para el crecimiento en medio libre de suero y/o proteína, esencialmente tal como se describe en el documento US 6.100.061 (Reiter et al., Immuno Aktiengesellschaft).

En otra realización preferida se preparan células HEK293 estables mediante transfección con un constructo que contiene un marcador seleccionable por higromicina y selección de transformantes mediante resistencia a antibióticos.

La capacidad de determinados virus deinfectar células o entrar en células mediante endocitosis mediada por receptor, y para integrarse en el genoma de célula huésped y expresar genes virales de manera estable y eficaz hace que sean candidatos atractivos para la transferencia de ácidos nucleicos foráneos al interior de células (por ejemplo, células de mamífero). Por consiguiente, en determinadas realizaciones se usa un vector viral para introducir una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en elinterior de una célula huésped para su expresión. El vector viral comprenderá una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) unida operativamente a una o más secuencias de control, por ejemplo, un promotor. Alternativamente, el vector viral puede no contener una secuencia de control y en su lugar se basará en una secuencia de control dentro de la célula huésped para impulsar la expresión de la proteína ADAMTS. Los ejemplos no limitativos de vectores virales que pueden usarse para suministrar un ácido nucleico incluyen vectores adenovirales, vectores de AAV y vectores retrovirales.

En una realización, un vector de expresión de adenovirus incluye los constructos que contienen secuencias de adenovirus suficientes para soportar el empaquetamiento del constructo y para expresar en última instancia un constructo de ADAMTS que se ha clonado en el mismo. Los vectores adenovirales permiten la introducción de secuencias foráneas de hasta 7 kb (Grunhaus et al., Seminar in Virology, 200(2):535-546, 1992)).

En otra realización puede usarse un virus adenoasociado (AAV) para introducir una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en elinterior de una célula huésped para su expresión. Se han descrito anteriormente sistemas de AAV y se conocen generalmente bien en la técnica (Kelleher y Vos, Biotechniques, 17(6): 1110-7, 1994; Cotten et al., Proc Natl Acad Sci USA, 89(13):6094-6098, 1992; Curiel, Nat Immun, 13(2-3): 141-64, 1994; Muzyczka, Curr Top Microbiol Immunol, 158:97-129, 1992). Se describen detalles referentes a la generación y al uso de vectores de rAAV, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.os 5.139.941 y 4.797.368.

En una realización puede usarse un vector de expresión retroviral para introducir una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en elinterior de una célula huésped para su expresión. Estos sistemas se han descrito anteriormente y se conocen generalmente bien en la técnica (Mann et al., Cell, 33:153-159, 1983; Nicolas y Rubinstein, En: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt, eds., Stoneham: Butterworth, págs. 494-513, 1988; Temin, En: Gene Transfer, Kucherlapati (ed.), Nueva York: Plenum Press, págs. 149-188, 1986). En una realización específica, el vector retroviral es un vector lentiviral (véase, por ejemplo, Naldini et al., Science, 272(5259):263-267, 1996; Zufferey et al., Nat Biotechnol, 15(9):871-875, 1997; Blomer et al., J Virol., 71(9):6641-6649, 1997; patentes estadounidenses n.os 6.013.516 y 5.994.136).

Los ejemplos no limitativos de vectores para la expresión procariota incluyen plásmidos tales como pRSET, pET, pBAD, etc., en los que los promotores usados en vectores de expresión procariotas incluyen lac, trc, trp, recA, araBAD, etc. Los ejemplos de vectores para la expresión eucariota incluyen: (i) para expresión en levaduras, vectores tales como pAO, pPIC, pYES, pMET, usando promotores tales como ^aOX1, GAP, GAL1, AUG1, etc.; (ii) para expresión en células de insecto, vectores tales como pMT, pAc5, pIB, pMIB, pBAC, etc., usando promotores tales como PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, polh, etc., y (iii) para expresión en células de mamífero, vectores tales como pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, pBPV, etc., y vectores derivados de sistemas virales tales como virus vaccinia, virus adenoasociados, virus del herpes, retrovirus, etc., usando promotores tales como CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV y p-actina. Un vector a modo de ejemplo para expresar rA13 se describe por Plaimauer et al. (Blood. 2002 Nov 15;100(10):3626-32. Epub 12 de julio de 2002).

En determinadas realizaciones, los métodos de cultivo celular de la invención pueden comprender el uso de un microportador. La presente invención proporciona, entre otros aspectos, métodos de expresión de proteína ADAMTS a gran escala. En algunas realizaciones, los cultivos celulares de las realizaciones pueden realizarse en biorreactores grandes en condiciones adecuadas para proporcionar altas áreas de superficie de cultivo específicas de volumen para lograr altas densidades celulares y expresión de proteína. Un medio para proporcionar tales condiciones de crecimiento es usar microportadores para el cultivo celular en biorreactores de tanque con agitación. En otra realización, estos requisitos de crecimiento se cumplen mediante el uso de un cultivo celular en suspensión. V. Realizaciones específicas

A. Factor de von Willebrand recombinante (rVWF)

Puede expresarse vWF recombinante en células de mamífero, pero la actividad específica de vWF puede variar ampliamente dependiendo de las condiciones de cultivo celular y no se ha mostrado que sea comparable o igual a la de vWF aislado de plasma sanguíneo. La presente divulgación se basa en parte en el resultado sorprendente de que medios de cultivo celular que tienen al menos 2,4 pg/l de cobre proporcionan un efecto ventajoso de fomentar la expresión de vWF de alto peso molecular que tiene una alta actividad específica. En particular, el vWF recombinante de alto peso molecular de la presente divulgación puede incluir una forma altamente multimérica que comprende de aproximadamente 14 a aproximadamente 22 dímeros y una actividad de ristocetina específica de al menos aproximadamente 30 mU/pg. Los procedimientos de cultivo celular según la presente divulgación también permiten mantener bajos niveles de NH4+ (por ejemplo, menos de 10 mM) durante el procedimiento posterior en sistemas de cultivo celular, reduciendo así los efectos perjudiciales sobremodificaciones tras la traducción. Se cree que la presente divulgación proporciona por primera vez condiciones de cultivo celular que comprenden un medio que tiene una concentración de cobre adecuada en combinación con niveles apropiados de amonio en el sobrenadante para expresar un vWF altamente multimérico con una alta actividad específica.

En un aspecto, la presente divulgación se refiere a condiciones de cultivo celular para producir vWF de alto peso molecular recombinante con una alta actividad específica. Las condiciones de cultivo celular de la presente divulgación pueden incluir, por ejemplo, un medio de cultivo celular con una concentración de cobre aumentada y/o sobrenadante de cultivo celular con una baja concentración de amonio (NH4+). La presente divulgación también proporciona métodos para cultivar células en condiciones de cultivo celular para expresar un vWF de alto peso molecular con una alta actividad específica.

En un aspecto, la presente divulgación proporciona una disolución de cultivo celular para producir proteína vWF recombinante de alto peso molecular, comprendiendo la disolución de cultivo celular: un medio de cultivo celular que comprende una concentración de cobre de al menos aproximadamente 2,4 pg/l; un sobrenadante de cultivo celular que comprende una concentración de amonio de menos de 10 mM; y una pluralidad de células que expresan proteína vWF altamente multimérica, en la que la proteína vWF comprende una actividad de ristocetina específica de al menos aproximadamente 30 mU/pg.

En una realización específica de los cultivos celulares descritos anteriormente, la disolución de cultivo celular comprende un complemento de medio que comprende cobre.

En una realización específica de los cultivos celulares descritos anteriormente, el complemento de medio comprende un hidrolizado, opcionalmente un hidrolizado de soja.

En una realización específica de los cultivos celulares descritos anteriormente, el complemento de medio comprende una sal de cobre, un quelato de cobre o una combinación de los mismos.

En una realización específica de los cultivos celulares descritos anteriormente, la sal de cobre se selecciona del grupo que consiste en sulfato de cobre, acetato de cobre, carbonato de cobre, cloruro de cobre, hidróxido de cobre, nitrato de cobre y óxido de cobre.

En una realización específica de los cultivos celulares descritos anteriormente, la concentración de cobre es de al menos aproximadamente 4 pg/l.

En una realización específica de los cultivos celulares descritos anteriormente, la concentración de cobre es de desde aproximadamente 2,4 pg/l hasta aproximadamente 20 pg/l.

En una realización específica de los cultivos celulares descritos anteriormente, la proteína vWF comprende de aproximadamente 14 a aproximadamente 22 dímeros.

En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método de producción de una proteína vWF recombinante de alto peso molecular, comprendiendo el método las etapas de: a) proporcionar un cultivo de células que comprenden un ácido nucleico que codifica proteína vWF recombinante; b) expresar proteína vWF en las células en condiciones de cultivo celular que comprenden un medio de cultivo celular que comprende una concentración de cobre de al menos aproximadamente 2,4 pg/l y un sobrenadante de cultivo celular que comprende una concentración de amonio de menos de aproximadamente 10 mM, en el que la proteína vWF es proteína vWF altamente multimérica y comprende una actividad de ristocetina específica de al menos aproximadamente 30 mU/pg.

En una realización específica de los métodos descritos anteriormente, las células son células de mamífero.

En una realización específica de los métodos descritos anteriormente, las células son de una línea celular continua. En una realización específica de los métodos descritos anteriormente, las células son células CHO.

En una realización específica de los métodos descritos anteriormente, la concentración de cobre es de al menos aproximadamente 4 pg/l.

En una realización específica de los métodos descritos anteriormente, la concentración de cobre es de desde aproximadamente 2,4 pg/l hasta aproximadamente 20 pg/l.

En una realización específica de los métodos descritos anteriormente, la proteína vWF recombinante tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de al menos aproximadamente 50 mU/pg.

En una realización específica de los métodos descritos anteriormente, la proteína vWF recombinante tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de desde aproximadamente 30 mU/pg hasta aproximadamente 100 mU/pg.

En una realización específica de los métodos descritos anteriormente, la proteína vWF recombinante comprende de aproximadamente 14 a aproximadamente 22 dímeros.

En un aspecto, la presente divulgación proporciona una proteína vWF recombinante de alto peso molecular producida mediante un procedimiento, comprendiendo el procedimiento las etapas de: a) proporcionar un cultivo de células que comprenden un ácido nucleico que codifica proteína vWF recombinante; y b) expresar proteína vWF en las células en condiciones de cultivo celular que comprenden un medio de cultivo celular que comprende una concentración de cobre de al menos 2,4 pg/l y un sobrenadante de cultivo celular que comprende una concentración de amonio de menos de 10 mM, en el que la proteína vWF es proteína vWF altamente multimérica y comprende una actividad de ristocetina específica de al menos aproximadamente 30 mU/pg.

En una realización específica de las composiciones de rVWF descritas anteriormente, la proteína vWF recombinante tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de al menos aproximadamente 50 mU/pg.

En una realización específica de las composiciones de rVWF descritas anteriormente, la proteína vWF recombinante tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de desde aproximadamente 30 mU/pg hasta aproximadamente 100 mU/pg.

En una realización específica de las composiciones de rVWF descritas anteriormente, la proteína vWF recombinante comprende de aproximadamente 14 a aproximadamente 22 dímeros.

En un aspecto, la presente divulgación proporciona una disolución de cultivo celular para producir proteína vWF recombinante de alto peso molecular, comprendiendo la disolución de cultivo celular: un medio de cultivo celular que comprende una concentración de cobre de al menos aproximadamente 2,4 pg/l; un sobrenadante de cultivo celular que comprende una concentración de amonio de menos de 10 mM; y una pluralidad de células que expresan proteína vWF altamente multimérico, en la que la proteína vWF comprende de aproximadamente 14 a aproximadamente 22 dímeros y una actividad de ristocetina específica de al menos aproximadamente 30 mU/pg.

En un aspecto, la presente divulgación se refiere a condiciones de cultivo celular para producir vWF recombinante de alto peso molecular que está en una forma altamente multimérica con una alta actividad específica. Las condiciones de cultivo celular de la presente divulgación pueden incluir, por ejemplo, un medio de cultivo celular con una concentración de cobre aumentada y sobrenadante de cultivo celular con una baja concentración de amonio (NH4+). La presente divulgación también proporciona métodos para cultivar células en condiciones de cultivo celular para expresar un vWF de alto peso molecular con una alta actividad específica.

En un aspecto, la presente divulgación incluye una disolución de cultivo celular para producir vWF recombinante de alto peso molecular, que comprende un medio de cultivo celular que comprende una concentración de cobre de al menos aproximadamente 2,4 pg/l; un sobrenadante de cultivo celular que comprende una concentración de amonio de menos de 10 mM; y una pluralidad de células que expresan vWF altamente multimérico que comprende de aproximadamente 14 a aproximadamente 22 dímeros y una actividad de ristocetina específica de al menos aproximadamente 30 mU/pg. En una realización de las disoluciones de cultivo celular descritas anteriormente, al menos el 10% del rVWF está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En una realización específica, al menos el 15% del rVWF está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra realización específica, al menos el 20% del rVWF está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra realización específica, al menos el 25% del rVWF está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra realización específica, al menos el 30% del rVWF está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En determinadas realizaciones, la concentración de cobre puede ser de al menos aproximadamente 4 pg/l o la concentración de cobre puede oscilar entre aproximadamente 2,4 pg/l y aproximadamente 20 pg/l. En algunas realizaciones, los medios de cultivo celular comprenden un complemento de medio que comprende cobre. En determinadas realizaciones, el complemento de medio puede comprender un hidrolizado o una sal de cobre, quelato de cobre o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la sal de cobre puede incluir sulfato de cobre, acetato de cobre, carbonato de cobre, cloruro de cobre, hidróxido de cobre, nitrato de cobre u óxido de cobre. En determinadas realizaciones, las células pueden proceder de una línea celular continua y pueden incluir células de mamífero, tales como células CHO. En algunas realizaciones, el vWF recombinante tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de al menos aproximadamente 50 mU/|ig, o la actividad de cofactor de ristocetina específica puede oscilar entre aproximadamente 30 mU/|ig y aproximadamente 100 mU/|ig.

En otro aspecto, la presente divulgación incluye un método de producción de un vWF recombinante de alto peso molecular, que comprende a) proporcionar un cultivo de células; b) introducir una secuencia de ácido nucleico que codifica vWF; c) seleccionar las células que portan la secuencia de ácido nucleico; y, d) expresar vWF en las células en condiciones de cultivo celular que comprenden un medio de cultivo celular que comprende una concentración de cobre de al menos aproximadamente 2,4 |ig/l y un sobrenadante de cultivo celular que comprende una concentración de amonio de menos de aproximadamente 10 mM, en el que el vWF es vWF altamente multimérico que comprende de aproximadamente 14 a aproximadamente 22 dímeros y una actividad de ristocetina específica de al menos aproximadamente 30 mU/|ig. En una realización del sobrenadante de cultivo celular descrito anteriormente, al menos el 10% del rVWF está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En una realización específica, al menos el 15% del rVWF está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra realización específica, al menos el 20% del rVWF está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra realización específica, al menos el 25% del rVWF está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra realización específica, al menos el 30% del rVWF está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En algunas realizaciones, las células pueden proceder de una línea celular continua y pueden incluir células de mamífero, tales como células CHO. En determinadas realizaciones, la concentración de cobre puede ser de al menos aproximadamente 4 |ig/l o la concentración de cobre puede oscilar entre aproximadamente 2,4 |ig/l y aproximadamente 20 |ig/l. En algunas realizaciones, los medios de cultivo celular comprenden un complemento de medio que comprende cobre. En determinadas realizaciones, el complemento de medio puede comprender un hidrolizado o una sal de cobre, quelato de cobre o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la sal de cobre puede incluir sulfato de cobre, acetato de cobre, carbonato de cobre, cloruro de cobre, hidróxido de cobre, nitrato de cobre u óxido de cobre. En algunas realizaciones, el vWF recombinante tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de al menos aproximadamente 50 mU/|ig, o la actividad de cofactor de ristocetina específica puede oscilar entre aproximadamente 30 mU/|ig y aproximadamente 100 mU/|ig.

En aún otro aspecto, la presente divulgación incluye un vWF recombinante de alto peso molecular producido mediante un procedimiento, que comprende las etapas de: a) proporcionar un cultivo de células; b) introducir una secuencia de ácido nucleico que codifica vWF; c) seleccionar las células que portan la secuencia de ácido nucleico; y, d) expresar vWF en las células en condiciones de cultivo celular que comprenden un medio de cultivo celular que comprende una concentración de cobre de al menos 2,4 |ig/l y un sobrenadante de cultivo celular que comprende una concentración de amonio de menos de 10 mM, en el que el vWF es vWF altamente multimérico que comprende de aproximadamente 14 a aproximadamente 22 dímeros y una actividad de ristocetina específica de al menos aproximadamente 30 mU/|ig. En una realización del sobrenadante de cultivo celular descrito anteriormente, al menos el 10% del rVWF está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En una realización específica, al menos el 15% del rVWF está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra realización específica, al menos el 20% del rVWF está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra realización específica, al menos el 25% del rVWF está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra realización específica, al menos el 30% del rVWF está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En algunas realizaciones, las células pueden proceder de una línea celular continua y pueden incluir células de mamífero, tales como células CHO. En determinadas realizaciones, la concentración de cobre puede ser de al menos aproximadamente 4 |ig/l o la concentración de cobre puede oscilar entre aproximadamente 2,4 |ig/l y aproximadamente 20 |ig/l. En algunas realizaciones, los medios de cultivo celular comprenden un complemento de medio que comprende cobre. En determinadas realizaciones, el complemento de medio puede comprender un hidrolizado o una sal de cobre, quelato de cobre o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la sal de cobre puede incluir sulfato de cobre, acetato de cobre, carbonato de cobre, cloruro de cobre, hidróxido de cobre, nitrato de cobre u óxido de cobre. En algunas realizaciones, el vWF recombinante tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de al menos aproximadamente 50 mU/|ig, o la actividad de cofactor de ristocetina específica puede oscilar entre aproximadamente 30 mU/|ig y aproximadamente 100 mU/|ig.

En un aspecto, la presente divulgación proporciona una composición que comprende factor de von Willebrand recombinante (rVWF) que tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de al menos 30 mU/|ig. En una realización preferida, la composición tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de al menos 40 mU/|ig. En una realización más preferida, la composición tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de al menos 50 mU/|ig. En una realización más preferida, la composición tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de al menos 60 mU/|ig. En una realización más preferida, la composición tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de al menos 70 mU/|ig. En aún una realización más preferida, la composición tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de al menos 80 mU/|ig.

En una realización de las composiciones descritas anteriormente, al menos el 10% del rVWF en la composición está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En una realización específica, al menos el 15% del rVWF está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra realización específica, al menos el 20% del rVWF está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra realización específica, al menos el 25% del rVWF está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra realización específica, al menos el 30% del rVWF está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros.

En una realización de las composiciones descritas anteriormente, la composición comprende un sobrenadante de cultivo. En una realización específica, el sobrenadante de cultivo es un sobrenadante de cultivo de células de mamífero. En una realización más específica, el sobrenadante de cultivo de células de mamífero es un sobrenadante de células CHO.

En una realización de las composiciones descritas anteriormente, el rVWF se expresa en un cultivo celular que comprende al menos 2,4 pg/l de cobre. En una realización específica, el cultivo celular comprende al menos 4 pg/l de cobre. En una realización más específica, el cultivo comprende entre 2,4 pg/l y 20 pg/l de cobre. En una realización, el cobre se proporciona como una sal de cobre, un quelato de cobre o una combinación de los mismos. En una realización específica, la sal de cobre se selecciona del grupo que consiste en sulfato de cobre, acetato de cobre, carbonato de cobre, cloruro de cobre, hidróxido de cobre, nitrato de cobre y óxido de cobre.

En una realización de las composiciones descritas anteriormente, el cultivo celular es un cultivo discontinuo.

En una realización de las composiciones descritas anteriormente, el cultivo celular es un cultivo continuo. En una realización específica, el cultivo continuo se realiza en modo quimostático. En otra realización específica, el cultivo continuo se realiza en modo de perfusión.

En una realización de las composiciones descritas anteriormente, el nivel de NH4+ en el cultivo se mantiene a una concentración inferior a 4 mM.

En una realización de las composiciones descritas anteriormente, la densidad celular del cultivo se mantiene a menos de 2,5x106 células por ml.

En una realización de las composiciones descritas anteriormente, la densidad celular del cultivo se mantiene a menos de 2,0x106 células por ml.

En una realización de las composiciones descritas anteriormente, el cultivo se mantiene a menos de 1,5x106 células por ml.

En una realización de las composiciones descritas anteriormente, el rVWF se coexpresa con factor VIII recombinante (rFVIII). En una realización específica se retira la mayoría del rFVIII coexpresado. En una realización más específica, la razón de rVWF con respecto a rFVIII en la composición es de al menos 10:1.

En una realización de las composiciones descritas anteriormente, la composición se formula para su administración farmacéutica. En una realización específica, la composición se formula para administración intravenosa, subcutánea o intramuscular.

En una realización de las composiciones descritas anteriormente, la composición se liofiliza.

En aún otro aspecto, la presente divulgación incluye un vWF recombinante de alto peso molecular producido mediante un procedimiento que comprende las etapas de: a) proporcionar un cultivo de células; b) introducir una secuencia de ácido nucleico que codifica vWF; c) seleccionar las células que portan la secuencia de ácido nucleico; y, d) expresar vWF en las células en condiciones de cultivo celular que comprenden un medio de cultivo celular que comprende una concentración de cobre de al menos 2,4 pg/l y un sobrenadante de cultivo celular que comprende una concentración de amonio de menos de 10 mM, en el que el vWF es vWF altamente multimérico que comprende de aproximadamente 14 a aproximadamente 22 dímeros y una actividad de ristocetina específica de al menos aproximadamente 30 mU/pg. Se entiende que todas las realizaciones y concentraciones descritas en las secciones de “Medios de cultivo celular” y “Métodos de producción de vWF recombinante” anteriores pueden aplicarse en este caso.

El vWF recombinante de la presente divulgación puede incluir una proteína vWF recombinante de alto peso molecular que tiene una alta actividad específica. En una realización, el vWF de la presente divulgación es una forma altamente multimérica de vWF. En algunas realizaciones, la forma altamente multimérica de vWF incluye al menos hasta aproximadamente 14 dímeros y en otras realizaciones al menos hasta aproximadamente 22 dímeros. En aún otras realizaciones, la forma altamente multimérica de vWF puede oscilar entre aproximadamente 10 y aproximadamente 20 dímeros, o entre aproximadamente 15 y aproximadamente 25 dímeros, o entre aproximadamente 20 y aproximadamente 40 dímeros. En determinadas realizaciones, el vWF recombinante es comparable con vWF plasmático.

Tal como se describe en el presente documento, la presente divulgación proporciona el resultado sorprendente de que una concentración de cobre aumentada en medios de cultivo celular puede producir vWF de alto peso molecular con alta actividad específica. Los medios de cultivo celular que comprenden una concentración de cobre, por ejemplo, de más de aproximadamente 2,4 pg/l, pueden aumentar el rendimiento de vWF recombinante multimérico, en comparación con medios sin cobre. En determinadas realizaciones, el porcentaje de vWF multimérico (es decir, rVWF que comprende al menos 2 dímeros) puede ser de más de aproximadamente el 50%, o más de aproximadamente el 75%, o más de aproximadamente el 90%. La distribución multimérica del vWF puede analizarse usando técnicas convencionales tales como, por ejemplo, electroforesis en agarosa en condiciones no reductoras. Tal como se proporciona en el presente documento, el vWF recombinante producido mediante los métodos de la presente divulgación puede tener una alta actividad específica, por ejemplo, una alta actividad de cofactor de ristocetina específica. En una realización, el vWF recombinante producido mediante los métodos de la presente divulgación puede incluir una actividad de cofactor de ristocetina específica de al menos 30 mU/pg y en otra realización de al menos 50 mU/pg. En otras realizaciones, la actividad de cofactor de ristocetina específica puede oscilar entre aproximadamente 30 mU/pg y aproximadamente 100 mU/pg o entre aproximadamente 50 mU/pg y aproximadamente 100 mU/pg.

B. ADAMTS13 recombinante (rA13)

Las proteínas ADAMTS (es decir, de ADAMTS-1 a ADAMTS-20) son una familia de metaloproteinasas de zinc secretadas que comparten una organización de dominios modular común (para una revisión, véaseFlannery C.R., Front Biosci. 2006 Ene 1;11:544-69). Todas las proteínas ADAMTS comparten una arquitectura de dominio de núcleo común, que consiste en un péptido señal, seguido por un prodominio, un dominio catalítico de metaloproteinasa dependiente de zinc, un dominio de tipo desintegrina, una repetición de tipo I de trombospondina, un dominio rico en cisteína y un dominio espaciador (Apte S.S., J Biol Chem. 2009 Nov 13;284(46):31493-7). Adicionalmente, todas menos ADAMTS-4 contienen al menos un dominio más de repetición de tipo I de trombospondina, y muchas de las proteínas ADAMTS contienen uno o más dominios auxiliares adicionales. De manera notable, se ha notificado que todas las proteínas ADAMTS parecen contener al menos un sitio de unión a calcio y al menos un sitio de unión a zinc ubicado dentro del dominio catalítico de metaloproteinasa (Andreini et al., J. Proteome Res., 2005, 4 (3), págs. 881-888).

Se han notificado funciones biológicas para proteínas ADAMTS para diversas enfermedades y afecciones, incluyendo antiangiogénesis, fibrosis intersticial renal, remodelación ósea, foliculogénesis de ovarios, aterosclerosis, desarrollo urogenital y crecimiento/remodelación tumoral (ADAMTS-1); síndrome de Ehler-Danlos tipo 7C y dermatoparaxis bovina (ADAMTS-2); artritis, aterosclerosis y tendinopatía (ADAMTS-4); artritis y glioblastoma (ADAMTS-5); artritis (ADAMTS-7); antiangiogénesis, tumor maligno cerebral, artritis y aterosclerosis (ADAMTS-8); artritis (ADAMTS-9 y 12); púrpura trombocitopénica trombótica (ADAMTS-13); y antitrombosis/accidente cerebrovascular (ADAMTS-18) (para una revisión, véaseLin y Liu, Open Access Rheumatology Research and Reviews 2009:1, 121-131).

Anteriormente se ha expresado ADAMTS13 recombinante (A13) en células de mamífero; sin embargo, la actividad específica varía ampliamente dependiendo de las condiciones de cultivo celular. Se ha encontrado que muchos medios de cultivo comercialmente disponibles no son suficientes para la expresión de rA13 con altas actividades específicas, expresadas como la razón de actividad, medida mediante ensayo de FRETS-VWF73, con respecto a contenido de antígeno, según se determina mediante ELISA. En un aspecto, los métodos proporcionados en el presente documento se basan en varios hallazgos ventajosos que permiten la expresión en cultivo celular de rA13 que tiene niveles aumentados de actividad total y específica.

Por consiguiente, debido a relación estructura-función compartida entre la familia de ADAMTS de metaloproteinasas secretadas, los métodos proporcionados por la presente invención permiten la expresión de todas las proteínas ADAMTS en cultivo celular y la recuperación del medio celular.

En un aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende ADAMTS13 recombinante (rA13) que tiene una actividad FRETS-VWF específica de al menos 1600 mU/pg.

En una realización de las composiciones descritas anteriormente, la rA13 tiene una actividad FRETS-VWF específica de al menos 800 mU/pg.

En una realización de las composiciones descritas anteriormente, la rA13 se expresa en un cultivo celular que comprende al menos 1 pg/l de cobre. En una realización específica, el cultivo celular comprende al menos 2 pg/l de cobre.

En una realización de las composiciones descritas anteriormente, el cobre se proporciona como una sal de cobre, un quelato de cobre o una combinación de los mismos. En una realización específica, la sal de cobre se selecciona del grupo que consiste en sulfato de cobre, acetato de cobre, carbonato de cobre, cloruro de cobre, hidróxido de cobre, nitrato de cobre y óxido de cobre.

En una realización de las composiciones descritas anteriormente, el nivel de NH4+ en el cultivo se mantiene a una concentración inferior a 5 mM.

En una realización de las composiciones descritas anteriormente, la densidad celular del cultivo se mantiene a menos de 4,0x106 células por ml. En una realización específica, la densidad celular del cultivo se mantiene a menos de 3,0x106 células por ml. En una realización específica, la densidad celular del cultivo se mantiene a menos de 2,0x106 células por ml. En una realización más específica, la densidad celular del cultivo se mantiene a menos de 1,5x106 células por ml.

VI. Formulaciones

En un aspecto, las formulaciones que comprenden la proteína rA13 terapéutica recombinante producida en la presente invención se liofilizan antes de su administración. La liofilización se lleva a cabo usando técnicas comunes en la técnica y debe optimizarse para la composición que está desarrollándose [Tang et al., Pharm Res. 21:191-200 (2004) y Chang et al., Pharm Res. 13:243-9 (1996)].

Los métodos de preparación de formulaciones farmacéuticas pueden incluir una o más de las siguientes etapas: añadir un agente estabilizante tal como se describe en el presente documento a dicha mezcla antes de la liofilización, añadir al menos un agente seleccionado de un agente de carga, un agente regulador de la osmolaridad y un tensioactivo, cada uno de los cuales tal como se describe en el presente documento, a dicha mezcla antes de la liofilización. Una formulación liofilizada está compuesta, en un aspecto, al menos por uno o más de un tampón, un agente de carga y un estabilizante. En este aspecto se evalúa y se selecciona la utilidad de un tensioactivo en casos en los que la agregación durante la etapa de liofilización o durante la reconstitución llega a ser un problema. Se incluye un agente tamponante apropiado para mantener la formulación dentro de zonas de pH estables durante la liofilización.

La práctica de reconstitución convencional para material liofilizado es añadir de nuevo un volumen de agua pura o agua estéril para inyección (WFI) (normalmente equivalente al volumen retirado durante la liofilización), aunque algunas veces se usan disoluciones diluidas de agentes antibacterianos en la producción de productos farmacéuticos para administración parenteral [Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy, 18:1311-1354 (1992)]. Por consiguiente, se proporcionan métodos para la preparación de composiciones de vWF recombinante reconstituido que comprenden la etapa de añadir un diluyente a una composición de vWF recombinante liofilizado de la divulgación.

El material liofilizado puede reconstituirse como disolución acuosa. Una variedad de portadores acuosos, por ejemplo, agua estéril para inyección, agua con conservantes para un uso de múltiples dosis o agua con cantidades apropiadas de tensioactivos (por ejemplo, una suspensión acuosa que contiene el compuesto activo en mezcla con excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones acuosas). En diversos aspectos, tales excipientes son agentes de suspensión, por ejemplo, y sin limitación, carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma tragacanto y goma arábiga; agentes dispersantes o humectantes son un fosfátido que se produce de manera natural, por ejemplo, y sin limitación, lecitina, o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos, por ejemplo, y sin limitación, poli(estearato de oxietileno), o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo, y sin limitación, heptadecaetil-enoxicetanol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol tal como monooleato de polioxietilensorbitol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo, y sin limitación, monooleato de polietilensorbitano. En diversos aspectos, las suspensiones acuosas también contienen uno o más conservantes, por ejemplo, y sin limitación, p-hidroxibenzoato de etilo o n-propilo.

Para administrar composiciones a humanos o animales de prueba, en un aspecto, las composiciones comprenden uno o más portadores farmacéuticamente aceptables. Las frases “farmacéuticamente” o “farmacológicamente” aceptable se refieren a entidades moleculares y composiciones que son estables, inhiben la degradación de proteínas tales como productos de agregación y escisión, y además no producen reacciones alérgicas u otras reacciones adversas cuando se administran usando vías bien conocidas en la técnica, tal como se describe a continuación. Los “portadores farmacéuticamente aceptables” incluyen todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción y similares clínicamente útiles, incluyendo los agentes divulgados anteriormente.

Las formulaciones farmacéuticas se administran por vía intravenosa, oral, tópica, transdérmica, parenteral, mediante pulverización de inhalación, vaginal, rectal o mediante inyección intracraneal. El término parenteral tal como se usa en el presente documento incluye inyecciones subcutáneas, inyección intravenosa, intramuscular, intracisternal, o técnicas de infusión. También se contempla la administración mediante inyección intravenosa, intradérmica, intramuscular, intramamaria, intraperitoneal, intratecal, retrobulbar, intrapulmonar y/o implantación quirúrgica en un sitio particular. Generalmente, las composiciones están esencialmente libres de pirógenos, así como de otras impurezas que pueden ser perjudiciales para el receptor.

Se llevan a cabo administraciones individuales o múltiples de las composiciones seleccionándose el patrón y los niveles de dosis por el médico encargado. Para la prevención o el tratamiento de una enfermedad, la dosificación apropiada depende del tipo de enfermedad que va a tratarse, la gravedad y el curso de la enfermedad, si el fármaco se administra con fines preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del paciente y respuesta al fármaco, y la discreción del médico encargado.

En un aspecto, las formulaciones derivadas de la invención se administran mediante un bolo inicial, seguido por una infusión continua para mantener niveles circulantes terapéuticos de producto farmacológico. Como otro ejemplo, el compuesto de la invención se administra como dosis de una vez. Los expertos habituales en la técnica optimizarán fácilmente las dosificaciones y regímenes de administración eficaces según se determina mediante buena práctica médica y el estado clínico del paciente individual. La frecuencia de dosificación depende de los parámetros farmacocinéticos de los agentes y la vía de administración. La formulación farmacéutica óptima se determina por un experto en la técnica dependiendo de la vía de administración y la dosificación deseada. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042) páginas 1435-1712. Tales formulaciones influyen en el estado físico, estabilidad, tasa de liberación in vivo y tasa de aclaramiento in vivo de los agentes administrados. Dependiendo de la vía de administración, se calcula una dosis adecuada según el peso corporal, área de superficie corporal y tamaño de órgano. Pueden determinarse dosificaciones apropiadas mediante el uso de ensayos establecidos para determinar dosificaciones en sangre junto con datos de dosisrespuesta apropiados. La pauta posológica final se determina por el médico encargado, teniendo en cuenta diversos factores que modifican la acción de fármacos, por ejemplo, la actividad específica del fármaco, la gravedad del daño y la sensibilidad del paciente, la edad, estado, peso corporal, sexo y dieta del paciente, la gravedad de cualquier infección, tiempo de administración y otros factores clínicos. A modo de ejemplo, una dosis típica de un vWF recombinante de la presente divulgación es de aproximadamente 50 U/kg, igual a 500 pg/kg. A medida que se realicen estudios surgirá más información referente a los niveles de dosificación apropiados y la duración de tratamiento para diversas enfermedades y afecciones.

VII. Métodos de tratamiento

La presente divulgación contempla además métodos de tratamiento de un paciente que necesita rVWF o rA13 producido según los métodos descritos en el presente documento. Tales métodos de tratamiento pueden incluir la administración de formulaciones farmacéuticas que comprenden la A13 recombinante o el vWF recombinante de alto peso molecular de la presente divulgación.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona métodos para tratamientos terapéuticos o profilácticos que comprenden la administración de una composición de rVWF o rA13 proporcionada en el presente documento. Generalmente, para aplicaciones terapéuticas, se administran formulaciones a un sujeto con una enfermedad o afecciónasociada con disfunción de ADAMTS13 o vWF o que necesita de otro modo el mismo, en una “dosis terapéuticamente eficaz”. Las formulaciones y cantidades eficaces para estos usos dependerán de la gravedad de la enfermedad o afeccióny del estado general de salud del paciente. Pueden administrarse administraciones individuales o múltiples de las formulaciones dependiendo de la dosificación y frecuencia según requiera y tolere el paciente.

En una realización, la presente divulgación proporciona métodos de tratamiento o prevención de una enfermedad o afecciónasociada con una disfunción de ADAMTS13 o vWF. En una realización adicional, las formulaciones farmacéuticas que comprenden vWF recombinante pueden administrarse para tratar enfermedades relacionadas con vWF, tales como enfermedad de von Willebrand o hemofilia. En otra realización, la divulgación proporciona métodos de tratamiento o prevención de una enfermedad o afecciónasociada con la formación y/o presencia de uno o más trombos, que comprenden la administración de una composición de rA13 proporcionada en el presente documento. En otra realización, la divulgación proporciona métodos de desintegración de uno o más trombos en un sujeto que lo necesita. En aún otras realizaciones, la divulgación proporciona métodos de tratamiento o prevención de un infarto en un sujeto que lo necesita. Generalmente, los métodos proporcionados por la divulgación comprenden administrar una composición de rADAMTS13 según se proporciona en el presente documento a un sujeto que lo necesita.

Ejemplos no limitativos de trastornos asociados con la formación y/o la presencia de uno o más trombos son púrpura trombocitopénica trombótica (PTT)hereditaria, PTT adquirida, trombosis arterial, infarto de miocardio agudo (AMI), accidente cerebrovascular, septicemia y coagulación intravascular diseminada (DIC).

Los ejemplos no limitativos de trastornos asociados con un infarto incluyen, sin limitación, infarto de miocardio (ataque al corazón), embolia pulmonar, acontecimientos cerebrovasculares tales como accidente cerebrovascular, arteriopatía oclusiva periférica (tal como gangrena), síndrome de antifosfolípidos, septicemia, arteritis de células gigantes (GCA), hernia y vólvulo.

VIII. Ejemplos

Ahora se ilustrará adicionalmente la presente invención en los siguientes ejemplos, sin limitarse a los mismos.

Ejemplo 1

Se realizaron experimentos de cultivo celular continuo usando cultivos de una línea celular de CHO recombinante que expresaba vWF. El medio basal era DMEM/F12 que contenía aproximadamente 0,3 pg/l de Cu2+. Se complementó el medio con hidrolizado de soja y sulfato de cobre (CuSÜ4-5H2O) para llevar la concentración de cobre final en el medio hasta más de al menos 2,4 pg/l.

Se cultivaron células CHO recombinantes que expresaban vWF mediante cultivos celulares continuos de modo que se mantuvieron los niveles de amonio (NH4+) a una concentración de menos de aproximadamente 10 mM. Se encontró que sistemas de producción que proporcionaban un suministro continuo de medio (por ejemplo, cultivos quimiostáticos o de perfusión) eran preferibles porque las técnicas convencionales discontinuas o semicontinuas producían altas concentraciones de NH4+ al final del cultivo. Al final del cultivo se aisló el vWF altamente multimérico y se midió la actividad de cofactor de ristocetina específica del vWF.

Ejemplo 2

Se coexpresaron factor VIII recombinante (rFVIII) y factor de von Willebrand recombinante (rVWF) en cultivos discontinuos de células GD8/6 para determinar el efecto de la composición del medio de cultivo sobre la expresión y actividad de vWF. En resumen, se cultivaron células GD8/6 de manera discontinua en medio BAV-SP compuesto por un polvo basal de DMEM/F12 modificado (tabla 5) y complementos adicionales que también contenían 4 g/l de hidrolizado de soja, véase la tabla 6, con y sin complementación de cobre adicional. Para someter a prueba el efecto de bajas concentraciones de cobre sobre la expresión y actividad de rVWF se usó medio BAV-SP basal. El medio basal contenía 0,3 pg/l de cobre y se complementó con hidrolizado de soja, que aportó 0,7 pg/l adicionales de cobre, según se determinó experimentalmente, proporcionando una concentración de cobre final de 1,0 pg/l. Comocomparación, el medio BAV-SP usado para los cultivos discontinuos se complementó además con 3,3 pg/l adicionales de Cu2+, proporcionando una concentración de cobre final de 4,3 pg/l, para determinar el efecto de altas concentraciones de cobre sobre la expresión y actividad de vWF.

Tabla 5. Composición de medio de cultivo BAV-SP

Tabla 6. Composición de complemento de BAV-SP

Se hicieron crecer células GD8/6 que expresaban rVWF o bien en medio con bajo contenido en cobre (tabla 7) o bien en medio con alto contenido en cobre (tabla 8) durante 7 días. Después de 2 días, se subcultivaron los cultivos para realizar un cultivo discontinuo durante un periodo de 5 días. Se sometieron a prueba diariamente muestras del sobrenadante de cultivo para determinar el contenido en rVWF (ELISA de vWF), total (ristocetina) y específico (actividad específica) mediante un ensayo de cofactor de ristocetina. También se monitorizaron diariamente diversos parámetros de cultivo, incluyendo recuento celular, viabilidad celular y concentración de amonio (excepto para los días 3 y 4 en modo discontinuo).

De manera inesperada, los cultivos celulares que se hicieron crecer con altas concentraciones de cobre produjeron sobrenadantes que contenían una actividad de rVWF total y específica significativamente superiores (compárense los resultados de la tabla 7 y la tabla 8). Por ejemplo, en el día 4 en modo discontinuo, el cultivo celular que se hizo crecer con una alta concentración de cobre contenía actividad de rVWF de 1,52 UI/ml, en comparación con una actividad de rVWF de 0,2 UI/ml para el cultivo con bajo contenido en cobre. Esto es a pesar del hecho de que el cultivo celular con bajo contenido en cobre produjo casi el doble de la cantidad de rVWF que el cultivo celular con alto contenido en cobre. Además, la actividad específica del sobrenadante obtenido a partir del cultivo con alto contenido en cobre era más de 13 veces mayor que la del sobrenadante de cultivo con bajo contenido en cobre (831 mU/10 pg de rVWF frente a 62 mU/10 pg de rVWF).

Tal como se observa en la tabla 7 y la tabla 8, la actividad de cofactor de ristocetina total y específica del cultivo con alto contenido en cobre era el doble de la del cultivo con bajo contenido en cobre en el día 1 en modo discontinuo. Además, a diferencia de los aumentos posteriores de actividad observados en el cultivo con alto contenido en cobre, no se observó ningún aumento de la cantidad de actividad de cofactor de ristocetina después del día 1 en modo discontinuo para el cultivo celular con bajo contenido en cobre. De manera que concuerda con este resultado, un análisis porelectroforesis en gel de agarosa del estado de multímero de rVWF reveló que una baja concentración de rVWF de alto peso molecular, con respecto a la concentración de la especie de rVWF de bajo peso molecular, estaba presente en el sobrenadante del cultivo celular con bajo contenido en cobre en el día 1 en modo discontinuo, y que la concentración relativa disminuyó adicionalmente a lo largo del tiempo (figuras 1A y 1B). En cambio, la complementación del medio de cultivo con Cu2+ dio como resultado una formación sistemática de antígeno activo de cofactor de ristocetina (RiCoF) hasta el cuarto día. De manera que concuerda, no se produjo ninguna pérdida de la cantidad de multímeros de rVWF de alto peso molecular estables hasta el día 4 del cultivo discontinuo (figuras 1A y 1B). Los resultados densitométricos del gel de electroforesis de agarosa mostrados en la figura 1B revelaron que, en condiciones de bajo contenido en cobre, el cultivo sólo era capaz de producir una población de rVWF en la que más del 10% (es decir, el 16,3%) del rVWF estaba presente en moléculas que tenían más de 10 dímeros durante un día del cultivo discontinuo (es decir, muestra de “día 3” en el carril 2 del gel de agarosa de la figura 1A) ,y de manera notable, esta población disminuyó hasta sólo el 4% en el día 5 del cultivo discontinuo (muestra de “día 7” en el carril 6). En cambio, en condiciones de alto contenido en cobre, la cantidad relativa de multímeros de vWF con más de 10dímeros es sistemáticamente de aproximadamente el 30% hasta el día 4 del cultivo discontinuo (del “día 3” al “día 6” en los carriles 7-10; del 28% al 31,4%).

De manera notable, comenzando el día 5 en modo discontinuo del cultivo discontinuo con alto contenido en cobre, cuando los niveles de NH4+ superaron 100 mg/l (más de aproximadamente 5,0 mM), la expresión de antígeno adicional (de 18,3 a 35,4 pg/l; compárense los días 4 y 5 en modo discontinuo de la tabla 8) no dio como resultado un aumento concomitante de la actividad de RiCoF presente en el sobrenadante. De manera que concuerda con este resultado, el nivel de multímeros de rVWF de alto peso molecular en el día 5 en modo discontinuo (día 7 del cultivo) disminuyó con respecto a la concentración de multímeros de rVWF de bajo peso molecular. Además, sólo en el día 5 en modo discontinuo (muestra de “día 7” del cultivo en el carril 11), la cantidad relativa del vWF con más de 10 dímeros se redujo hasta el 21,4%.

Tomados en conjunto, los datos proporcionados anteriormente demuestran que la complementación de concentraciones de cobre en cultivos celulares que expresan rVWF aumenta drásticamente la actividad de cofactor de ristocetina de rVWF total y específica, así como la producción estable de multímeros de rVWF de alto peso molecular. Además, los datos muestran una correlación entre la presencia de altas concentraciones de NH4+ en el cultivo celular y la pérdida de actividad de cofactor de ristocetina de rVWF y producción de multímeros de rVWF de alto peso molecular.

Tabla 7. Expresión de rVWF en cultivo de células de mamífero realizado en modo discontinuo usando medio BAV-SP con una baja concentración de cobre (1,0 pg/l).

Tabla 8. Expresión de rVWF en cultivo de células de mamífero realizado en modo discontinuo usando medio BAV-SP con una alta concentración de cobre (4,3 pg/l).

Ejemplo 3

Se coexpresaron factor VIII recombinante (rFVIII) y factor de von Willebrand recombinante (rVWF) en cultivos continuos de células GD8/6 que se hicieron funcionar en condiciones quimiostáticas para determinar el efecto de la composición del medio de cultivo sobre la expresión y actividad de vWF. En resumen, se cultivaron células GD8/6 en medio BAV-SP que contenía 4 g/l de hidrolizado de soja con y sin complementación de cobre tal como se describió en el ejemplo 2. Para someter a prueba el efecto de bajas concentraciones de cobre sobre la expresión y actividad de rVWF, se usó medio BAV-SP basal. El medio basal contenía 0,3 pg/l de cobre y se complementó con hidrolizado de soja, que aportó 0,7 pg/l adicionales de cobre, proporcionando una concentración de cobre final de 1,0 pg/l. En comparación, el medio BAV-SP usado para los cultivos discontinuos se complementó además con 3,3 pg/l adicionales de Cu2+, proporcionando una concentración de cobre final de 4,3 pg/l, para determinar el efecto de altas concentraciones de cobre sobre la expresión y actividad de rVWF. Se cultivaron cultivos que se hicieron crecer en presencia de altas y bajas concentraciones de cobre tanto a altas (2,8x106 células/ml) como a bajas (aproximadamente 1,4x106células/ml) densidades celulares.

Como anteriormente, se sometieron a prueba muestras del sobrenadante de cultivo para determinar el contenido de rVWF (ELISA de vWF), actividad total (ristocetina) y específica (actividad específica) mediante un ensayo de cofactor de ristocetina. También se monitorizaron diversos parámetros de cultivo, incluyendo recuento celular, viabilidad celular y concentración de amonio. Se generaron datos a partir de la fase en estado estacionario de las semanas 2 y 3 de los cultivos quimiostáticos (tabla 9 a tabla 13).

Tabla 9. Datos medios para la expresión de rVWF en cultivo celular quimiostático durante las semanas 2 y 3.

Tabla 10. Expresión de rVWF en cultivo celular quimiostático en condiciones de alto recuento celular, bajo contenido en cobre durante las semanas 2 y 3.

Tabla 11. Expresión de rVWF en cultivo celular quimiostático en condiciones de alto recuento celular, alto contenido en cobre durante las semanas 2 y 3.

Tabla 12. Expresión de rVWF en cultivo celular quimiostático en condiciones de bajo recuento celular, bajo contenido en cobre durante las semanas 2 y 3.

Tabla 13. Expresión de rVWF en cultivo celular quimiostático en condiciones de bajo recuento celular, alto contenido en cobre durante las semanas 2 y 3.

Tal como se muestra en la figura 2A, el sobrenadante recogido del cultivo celular continuo de rVWF que se hizo crecer a bajas densidades celulares y a altas concentraciones de cobre contenía una alta actividad específica (promedio de 600 mU/10 pg), mientras que los sobrenadantes recogidos de cultivos celulares de rVWF que se hicieron crecer a altas densidades celulares en presencia de altas o bajas concentraciones de cobre y cultivos celulares de rVWF que se hicieron crecer a baja densidad celular en presencia de baja concentración de cobre contenían bajas actividades específicas (menos de 100 mU/10 pg). De manera que concuerda con los resultados observados para cultivos discontinuos, la figura 2B muestra que los cultivos continuos de células de mamífero que expresan rVWF con altas actividades específicas tienen concentraciones de NH4+ menores que cultivos que producen rVWF con bajas actividades específicas. Estos datos refuerzan adicionalmente la correlación entre la concentración de NH4+ en el cultivo celular y la actividad específica de rVWF producido por el cultivo. De manera notable, la combinación de alta concentración de cobre y baja concentración de amonio en el cultivo celular permitió la producción de actividad de rVWF significativamente mejorada.

De manera que concuerda con este resultado, el análisis porelectroforesis en gel de agarosa del estado de multímero de rVWF de cultivos quimiostáticos (figura 6) reveló que sólo los sobrenadantes de cultivos que se hicieron funcionar con un alto contenido en cobre y baja densidad celular y, por tanto, bajo contenido en amonio dieron como resultado un alto contenido en vWF multimérico con expresión sistemática (aproximadamente del 23% al 27% el día CST 8, 17 y 24 en los carriles 4, 8 y 12, respectivamente). Ninguna de las demás condiciones alcanzó cantidades sistemáticamente altas de más del 10% de vWF con más de 10 dímeros a lo largo de un periodo de cultivo prolongado.

Ejemplo 4

Para determinar el efecto de la concentración de cobre en el medio de cultivo sobre la expresión y actividad específica de rA13, se hicieron crecer cultivos de células de mamífero que expresaban rA13 durante 4 semanas en condiciones de cultivo continuo quimiostático en medio ADAMTS13 que comprendía un medio basal DMEM/F12 modificado, BESP845, y complementos adicionales (tabla 14) que contenían concentraciones de cobre que oscilaban entre 0,66 pg/l (sin complementación de cobre adicional) y con complementación de cobre adicional hasta 4 pg/l. Tal como se muestra en la tabla 15, aumentar la concentración de cobre en los medios de cultivo celular dio como resultado un aumento significativo de la productividad volumétrica (P) y específica (q) expresada como actividad de rA13 total producida por litro de cultivo y día y la actividad de rA13 total producida por célula y día, respectivamente.

Tabla 14. Composición de medio ADAMTS13.

Para determinar si concentraciones aumentadas de cobre afectaban a la integridad del rA13 expresado, se examinó mediante análisis de SDS-PAGE el sobrenadante recogido de cultivos celulares de rA13 que se hicieron crecer en medios que contenían 0,66 pg/l, 1 pg/l y 4 pg/l de cobre. Tal como se observa en la figura 3A (tinción con plata) y la figura 3B (inmunotransferencia de tipo Western anti-A13), no se observó ningún cambio evidente en la calidad de producto mediante electroforesis en gel. Específicamente, ningún aumento en el nivel de variante truncada de 170 kD u otras variantes de rA13 de bajo p M y ninguna otra banda de HCP adicional o aumentada resultó de la expresión de rA13 en presencia de concentraciones de cobre aumentadas.

Para estimar una concentración óptima de cobre sobre la actividad de rA13, una extrapolación de datos de la tabla 15 de P FRETSfrente a la concentración de cobre (figura 4) muestra que el efecto óptimo se alcanza probablemente a aproximadamente 2 pg/l, con una estimación conservativa de un efecto negativo por encima de aproximadamente 4 pg/l.

Tabla 15. Expresión de rA13 en cultivo de células de mamífero realizado en modo de cultivo continuo quimiostático usando medios que contienen concentraciones de cobre variables.

Basándose en los resultados obtenidos anteriormente, se realizó un experimento adicional que comparó la expresión de rA13 en medios de cultivo celular que contenían 0,66 pg/l de cobre con 2,0 pg/l de cobre. Tal como se muestra en la tabla 16, la complementación de los medios celulares basales con cobre hasta una concentración final de 2,0 pg/l de cobre dio como resultado un aumento significativo de la productividad volumétrica (P) y específica (q) expresada como la actividad de rA13 total producida por litro de cultivo y día y la actividad de rA13 total producida por célula y día, respectivamente, a lo largo de un periodo de 8 semanas. Los datos específicos para cada semana de producción de rA13 en los dos cultivos se muestran en la figura 5. A partir de estos datos, queda claro que la complementación con cobre tiene un efecto beneficioso medible sobre el metabolismo celular, la tasa de crecimiento específica y la productividad de rA13.

Tabla 16. Expresión de rA13 en cultivo de células de mamífero realizado en modo de cultivo continuo quimiostático usando medios que contienen concentraciones de cobre variables.

Se entiende que la invención se define por las reivindicaciones, y los ejemplos y las realizaciones descritos en el presente documento son sólo con fines ilustrativos y que a los expertos en la técnica se les ocurrirán diversas modificaciones o cambios a la luz de los mismos.

Claims

REIVINDICACIONES

(a) proporcionar un medio de cultivo de células basales;

(e) recuperar al menos una porción del sobrenadante de cultivo,

2. Método según la reivindicación 1, en el que el medio de cultivo de células basales es un medio de cultivo libre de proteínas animales.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que el medio de cultivo de células basales esun medio de cultivo libre de proteínas.

4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el medio de cultivo de células basales es un medio de cultivo definido químicamente.

5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la concentración de cobre final del medio de cultivo de células basales complementado es de al menos 2 pg/l de cobre.

6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la concentración de cobre final del medio de cultivo de células basales complementado es de entre 2 pg/l y 4 pg/l de cobre.

7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que las células de mamífero son células CHO.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el cultivo continuo de célulasse realiza en modo quimiostático.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el cultivo continuo de célulasse realiza en modo de perfusión.

10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la una o más células se cultivan en al menos 100 l del medio de cultivo de células basales complementado.

11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el queestán presentes al menos 2500 unidades de actividad FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células basales complementado al día en el sobrenadante de cultivo recuperado.

12. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el sobrenadante recuperado tiene una actividad FRETS-VWF73 específica de rA13 deal menos 1600 mU/pg.

13. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el método comprende además una etapa de enriquecimiento en rA13.

14. Sobrenadante de cultivo celular que comprende ADAMTS13 recombinante (rA13), en el que se prepara el sobrenadante mediante un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores,

en el que el sobrenadante contieneal menos 6 U de actividad FRETS-VWF73 por ml.

15. Sobrenadante de cultivo celular que comprende ADAMTS13 recombinante (rA13) según la reivindicación 14, en el que el sobrenadante contieneal menos 3 pg de rA13 por ml.