MX2013000166A

MX2013000166A - Metodo para producir el factor von willebrand (vwf) de alto peso molecular recombinante en cultivo celular.

Info

Publication number: MX2013000166A
Application number: MX2013000166A
Authority: MX
Inventors: Manfred Reiter; Wolfgang Mundt; Leopold Grillberger
Original assignee: Baxter Healthcare Sa
Priority date: 2010-07-08
Filing date: 2011-07-08
Publication date: 2013-06-05
Also published as: US9458222B2; KR102007773B1; IL273304B; EA202090220A2; EA202090067A3; SI3064508T1; HRP20181657T1; TWI670073B; SG186936A1; US20180044405A1; EP3392271B1; CA2805557A1; EA201792340A3; NZ605403A; EP2590998A1; WO2012006594A1; US20190085052A1; WO2012006591A1; IL255327B; PT2591094T

Abstract

La presente invención se refiere entre otros aspectos, a condiciones de cultivo celular para producir vWF de alto peso molecular, en particular WF altamente multimérico con una alta actividad específica y ADAMTS13 con una alta actividad específica. Las condiciones de cultivo celular de la presente invención pueden incluir, por ejemplo, un medio de cultivo celular con una concentración incrementada de cobre y/o sobrenadante de cultivo celular con una baja concentración de amonio (NH4*). La presente invención también proporciona métodos para cultivar células en las condiciones de cultivo celular para expresar vWF de alto peso molecular y rA13 que tiene altas actividades específicas.

Description

METODO PARA PRODUCIR EL FACTOR VON WILLEBRAND (vWF) DE ALTO PESO MOLECULAR RECOMBINA TE EN CULTIVO CELULAR ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La expresión recombinante de proteínas terapéuticas en cultivo celular (particularmente cultivos de células a gran escala), que incluyen cultivo de células eucarióticas , y más específicamente cultivo de células de mamífero, requiere el uso de medios de cultivo especial que proporcionan sustancias nutrientes para el crecimiento eficiente de células. Las formulaciones de medio de cultivo celular son a menudo suplementadas con un intervalo de aditivos, que incluyen suero de bovino fetal (FCS, por sus siglas en inglés) , proteínas derivadas de animales y/o hidrolizados de proteína de origen bovino, así como también hidrolizados de proteínas derivadas de plantas o levadura. Un reto con tales cultivos es que la cantidad de proteína y la actividad específica y total de la proteína producida son a menudo variables a través de diferentes cultivos de células, aún cuando la formulación para el medio de cultivo celular no se cambia. Esta variabilidad es especialmente aparente en el caso de procesos de manufacturación a gran escala utilizando volúmenes de cultivo celular de 10 litros o más de 20,000 litros. Los medios de cultivo celular que contienen hidrolizados son particularmente propensos a variabilidad de Ref. 238225 un cultivo al siguiente, conduciendo a producción disminuida de proteína total así como también actividad específica y total disminuida.

Una razón potencial para la variabilidad vista a través de diferentes cultivos celulares es que contaminantes en aditivos tales como hidrolizados varían de un lote al siguiente. En general, el suero o sustancias derivadas del suero, tales como, por ejemplo, albúmina, transferrina o insulina, pueden comprender agentes indeseados que contaminan los cultivos celulares y los productos biológicos obtenidos de los mismos. Además, aditivos derivados de suero humano han sido probados para todos los virus conocidos, que incluyen virus de la hepatitis y HIV los cuales pueden ser transmitidos vía suero. Sin embargo, suero bovino y productos derivados de los mismos llevan el riesgo de contaminación por BSE. Además, todos los productos derivados del suero pueden ser contaminados por sustancias desconocidas. Cuando se usa suero o aditivos de proteína derivados de fuentes humanas y animales en cultivo celular, existen numerosos problemas (por ejemplo, la calidad variante en composición de diferentes lotes y el riesgo de contaminación con micoplasma, virus o BSE) , particularmente si las células son usadas en la manufactura de fármacos o vacunas para administración humana. Por lo tanto, se han hecho muchos intentos para proporcionar sistemas hospederos y condiciones de cultivo eficientes, las cuales no requieren suero u otros compuestos de proteína animal .

Tal medio libre de suero ha sido desarrollado con base en extractos de proteína derivados de plantas o levadura. Por ejemplo, se conoce hidrolizados de soja por ser útiles para procesos de fermentación y pueden mejorar el crecimiento de muchos organismos, levaduras y hongos fastidiosos. El documento WO 96/26266 describe que digestiones papaicas de harina de soja son una fuente de carbohidratos y nitrógeno y muchos de los componentes pueden ser usados en cultivo de tejidos. Franek et al. (Biotechnology Progress (2000) 16, 688-692) describe efectos de promover la productividad y crecimiento de fracciones peptídicas de hidrolizado de trigo y soja.

El documento WO 96/15231 describe un medio libre de suero compuesto de un medio esencial mínimo sintético y un extracto de levadura para la propagación de células de vertebrados y un proceso de producción de virus. Una formulación de medio compuesta de un medio de cultivo de células básales que comprende un péptido de arroz y/o un extracto de levadura y una digestión enzimática del mismo, y/o un lípido de planta para crecimiento de células animales se describe en el documento WO 98/15614. Un medio que comprende hidrolizado de soja purificado para el cultivo de células recombinantes se describe en el documento WO 01/23527. El documento WO 00/03000 describe un medio que comprende un hidrolizado de soja y un extracto de levadura, pero también requiere la presencia de formas recombinantes de proteínas animales, tales como factores de crecimiento.

El documento EP-A-0 481 791 describe un medio de cultivo bioquímicamente definido para cultivar células CHO diseñadas por ingeniería, las cuales están libres de proteína, lípidos y carbohidratos aislados de una fuente además, que comprenden además una insulina recombinante o análogo de insulina, 1% a 0.025% en p/v de putrescina y peptona de soja digerida por papaína. El documento WO 98/08934 describe un cultivo de células eucarióticas libre de suero que comprende péptidos de soja hidrolizados (1-1000 mg/L), 0.01 a 1 mg/L de putrescina y una variedad de componentes derivados de animal, que incluyen albúmina, fetuina, varias hormonas y otras proteínas. En este contexto, se debe notar que la putrescina también es conocida por estar comprendida en medio estándar como DMEM/F12 de Ham en una concentración de 0.08 mg/L.

Los hidrolizados de plantas y/o levadura, sin embargo, son mezclas indefinidas de oligopéptidos y otros componentes y contaminantes desconocidos. Sin embargo, la calidad de lotes de hidrolizados comercialmente disponibles varía extremadamente. Como un resultado, existen grandes variaciones en la producción de proteínas recombinantes o productos virales (una variación de hasta un factor de tres) como una función de los lotes de hidrolizados usados ("variación lote a lote")- Esta desventaja afecta la proliferación de las células así como también la expresión de proteína de cada célula. El documento US 2007/0212770 describe varios medios de cultivo químicamente definido, libre de proteína animal, y libres de oligopéptidos , que son útiles para la producción a gran escala de biofarmacéuticos de proteínas recombinantes .

La hemostasis involucra la interacción de varias rutas de reacción hemostáticas que conducen finalmente a formación de trombo. Los trombos son depósitos de componentes de la sangre en la superficie de la pared vascular que consisten principalmente de plaquetas sanguíneas agregadas y fibrina reticulada insoluble. La formación de fibrina es el resultado de proteólisis restringida de fibrinógeno por trombina, una enzima de coagulación. La trombina es el producto final de la cascada de coagulación, un éxito de las activaciones del zimógeno que se originan sobre las superficies de las plaquetas sanguíneas y leucocitos activados, y una variedad de células vasculares (para una inspección, cf . K. G. Mann et al., Blood, 1990, Vol . 76, pp. 1-16) .

Una función importante en la cascada de coagulación reside en la activación del Factor X por el complejo del Factor IX activado (Factor IXa) y Factor VIII activado (Factor Villa) . Una deficiencia o una disfunción de los componentes de este complejo está asociada con la enfermedad en la sangre conocida como hemofilia (J. E. Sadler & E . W. Davie: Hemophilia A, Hemophilia B, and von illebrand's Disease, in G. Stamatoyannopoulos et al., (Eds.): The molecular basis of blood diseases. W.B. Saunders Co . , Philadelphia, 1987, pp . 576-602) . La hemofilia A está relacionada con una deficiencia de la actividad del Factor VIII, mientras la Hemofilia B está relacionada con una deficiencia del Factor XI. El tratamiento actual consiste de una terapia de reemplazo usando preparaciones farmacéuticas comprendidas del factor de coagulación normal . De estas trombopatías, la Hemofilia A, ocurre más frecuentemente, afectando aproximadamente uno de 10,000 hombres. La terapia de reemplazo en pacientes con Hemofilia A involucra la administración repetida de preparaciones que contienen el Factor VIII normal por infusión intravenosa. El intervalo entre las infusiones es una función de la degradación de la actividad del Factor VIII en la circulación de la sangre. La vida media de la actividad del Factor VIII después de una infusión difiere de un individuo a otro, variando de 10 a 30 horas. De este modo, una terapia profiláctica requiere una infusión cada dos a tres días. Esto constituye una carga pesada en la vida de pacientes hemofílicos , en particular, si el acceso venoso ha llegado a ser difícil debido a la cicatrización local después de punciones de aguja frecuentes por infusiones intravenosas.

Podría ser particularmente ventajoso si la frecuencia de las infusiones pudiera ser reducida usando el Factor VIII que tiene vidas medias extendidas. Es bien sabido en la técnica que la vida media del heterodímero del Factor VIII no activado depende fuertemente de la presencia del Factor de von illebrand, el cual exhibe una fuerte afinidad al Factor VIII (aún no al Factor Villa) y sirve como una proteína portadora (J. E. Sadler and E. W. Davie: Hemophilia A, Hemophilia B and von Willebrand' s disease, in G. Stamatoynnopoulos et al. (Eds.): The molecular basis of blood diseases. W.B. Saunders Co.; Philadelphia, 1987, pp. 576-602) . Se sabe que pacientes que sufren de la enfermedad de von Willebrand tipo 3, quienes no tienen un Factor de von Willebrand detectable en su circulación de la sangre, también sufren de una deficiencia secundaria del Factor VIII. Además, la vida media del Factor VIII intravenosamente administrado en estos pacientes es 2 a 4 horas, el cual es considerablemente más corto que las 10 a 30 horas observadas en pacientes con Hemofilia A. De estos hallazgos resulta que el Factor VIII tiende a una rápida separación de la circulación de la sangre y que este proceso es algo extendido inhibido por la complej ación con su portador natural, von Willebrand Factor.

El factor Von Willebrand (vWF, por sus siglas en inglés) es una glicoproteína de circulación en plasma ya que una serie de multímeros típicamente varían en tamaño desde aproximadamente 500 hasta 20,000 kD (ó 2 a 40 dímeros de vWF) . Las formas diméricas y multiméricas de vWF están compuestas de subunidades de polipéptidos de 250 kD ligados en conjunto por enlaces disulfuro. El vWF media la adhesión inicial de plaquetas al sub-endotelio de la pared del recipiente dañado; solamente los multímeros más grandes también presentan actividad hemostática. El VWF multimerizado se une a la glicoproteína de la superficie de plaquetas Gplba, a través de una interacción en el dominio Al del VWF, para facilitar la adhesión de plaquetas. Se asume que las células endoteliales secretan grandes formas poliméricas de vWF y que aquellas formas de vWF las cuales tienen un bajo peso molecular (vWF de bajo peso molecular) se han originado de desdoblamiento proteolítico . Los multímeros que tienen grandes masas moleculares son almacenados en los cuerpos de Weibel-Palade de las células endoteliales y liberados después de la estimulación.

La reducción de la actividad de enlace del FVIII, debido a ya sea niveles reducidos de proteína del vWF o afinidad de enlace disminuida del FVIII, resulta en uno de los tres tipos de enfermedad de von Willebrand. Además de, o alteAR tivamente , ciertos tipos de enfermedad de von Willebrand están caracterizados por un incremento o decremento en el nivel de asociación de plaquetas mediadas por Gplba, es decir en los Tipos 2A, 2B, y 2M (resumido en Castaman efe al., Disorders of Hemostasis 88(1):94-108 (2003)). Como tal, la modulación de interacciones del vWF con tanto FVIII como Gplba es una estrategia variable para el tratamiento de Hemofilia como enfermedad de von Willebrand.

Dada la importancia biológica del vWF, existe una necesidad constante en la técnica para mejorar formas para producir el vWF para aplicaciones terapéuticas. Es bien sabido que el vWF puede ser aislado de fuentes endógenas, tales como plasma sanguíneo humano. El vWF aislado es ventajoso en que tiene una alta actividad específica para llevar a cabo su función biológica y puede, por lo tanto, ser usado efectivamente como una proteína terapéutica para tratar enfermedades relacionadas, tales como la enfermedad de von Willebrand. Típicamente, el vWF de plasma tiene una actividad de Ristocetina específica de aproximadamente 100 mU/^g, pero el aislamiento de plasma de sangre humana tiene desventajas debido a que, por ejemplo, el plasma puede contener una variedad de virus, tales como virus del HIV y/o hepatitis, los cuales pueden ser transferidos al paciente. Además, el plasma es un recurso limitado y, de este modo, la escasez del plasma puede ser problemática para proporcionar suficiente vWF para tratamiento. Como tal, los métodos recom inantes para producir vWF son ventajosos para atender algunos de los problemas asociados con la dependencia del plasma como una fuente para el vWF. Para producción recombinante , se clonó la longitud completa del ADNc del vWF; el propolipéptido corresponde a los residuos de aminoácido 23 a 764 del prepro-v F de longitud completa (Eikenboom et al (1995) Haemophilia 1, 77 90) .

Desafortunadamente, vWF es una molécula con modificaciones post-traduccionales complejas. También, la multimerización de los dímeros de vWF a multímeros grandes y ultragrandes en el aparato de Golgi es un desafío para la expresión en células de mamífero. Por ejemplo, el vWF de alto peso molecular expresado en cultivo celular de, por ejemplo, células endoteliales humanas (primarias) depende del almacenamiento específico de moléculas del vWF ultragrandes en cuerpos Weibel-Palade . Tales cultivos celulares no son adecuados para la producción de proteínas terapéuticas. Se han reportado otros métodos de cultivo celular, y se sabe que las condiciones de cultivo celular pueden afectar la producción del vWF en una variedad de formas. Por ejemplo, altas concentraciones de amonio (NH4+) se han mostrado por alterar las modificaciones post-traduccionales . Mayadas et al. (J. Biol. Chem., 264 (23) : 13497-13503 , 1989) demostró que niveles de 25 mM de amonio resultan en multimerización del wWF reducida en células endoteliales , las cuales también afectan negativamente la actividad específica de Ristocetina del vWF recombinante . La reducción de multimerización está en general asociada con la reducción de la actividad, particularmente actividad específica de Ristocetina, del vWF recombinante .

Permanece aún difícil predecir cuales parámetros pueden positivamente o negativamente afectar la producción de una proteína particular, especialmente complejos de glicoproteínas como el Factor VIII y vWF. Por ejemplo, ciertos compuestos de un medio de cultivo celular han sido mostrados por afectar la producción del Factor VIII. Como se describe en la Patente Estadounidense No. 5,804,420, la adición de poliol, cobre y otros materiales indicadores puede afectar positivamente el rendimiento de producción del Factor VIII. Como también se describe en el documento WO 2009/086309, los procesos de cultivo celular que usan cobre han. sido mostrados por mejorar la producción del Factor VIII. La expresión del vWF en células CHO recombinantes también se ha reportado por Mignot et al. (1989) . Sin embargo, ninguno de estos ejemplos proporciona información con respecto a la actividad específica del vWF o su distribución multimérica.

Las proteínas ADAMTS (una desintegrina y metaloproteinasa con motivos de tromboespondina tipo I) , son una familia de metaloproteinasas que contienen un número de dominios conservados, que incluyen un dominio catalítico dependiente de zinc, un dominio rico en cisteína, un dominio similar a desintegrina, y al menos uno, y en muchos casos múltiples repeticiones de tromboespondina tipo I (para revisión, véase Nicholson et al., BMC Evol Biol. 2005 Feb 4;5(1):11). Estas proteínas, las cuales están evolucionariamente relacionadas con las familias ADAM y MMP de metaloproteinasas (Jones GC, Curr Pharm Biotechnol . 2006 Feb; (1) : 25-31) , son enzimas secretadas que se han ligado a un número de enfermedades y condiciones que incluyen trombocitopénica púrpura trombótica (TTP) (Moake JL, Semin Hematol. 2004 Jan,-41 (1) :4-14) , trastornos del tejido conectivo, cánceres, inflamación (Nicholson et al.), y malaria severa por malaria por plasmodium falciparum (Larkin et al., PLoS Pathog. 2009 Mar; 5 (3 ) : el000349 ) . Debido a estas asociaciones, las enzimas ADAMTS han sido reconocidas como objetivos terapéuticos potenciales para un número de patologías (Jones GC, Curr Pharm Biotechnol. 2006 Feb; 7 (1) : 25-31) . Por consiguiente, son necesarios métodos para producir grandes rendimientos de proteínas ADAMTS que tienen altas actividades específicas, las cuales están libres de contaminantes tales como virus, BSE, y patógenos como bacterias de Mycoplasma.

Un miembro de la familia ADAMTS, ADAMTS13 , desdobla el factor von Willebrand (vWF) entre los residuos Tyr 1605 y Met 1606, una función responsable para la degradación de grandes multímeros del vWF in vivo. La pérdida de la actividad de ADAMTS13 se ha ligado a un número de condiciones, tales como TTP (Moake JL, Semin Hematol . 2004 Jan;41(l) :4-14), inflamación crónica y aguda (Chauhan et al., J Exp Med. 2008 Sep 1 ; 205 (9) : 2065-74 ) , y más recientemente, malaria severa por plasmodium falciparum (Larkin et al., PLoS Pathog. 2009 Mar; 5 (3) :el000349) .

La proteasa de ADAMTS13 es una proteína glicosilada de 190 kDa producida predominantemente por el hígado (Levy et al., Nature. 2001; 413:488-494; Fujikawa et al., Blood. 2001; 98:1662-1666; Zheng et al., J Biol Chem. 2001; 276:41059-41063; Soejima et al., J Biochem (Tokyo) . 2001; 130:475-480; and Gerritsen et al., Blood. 2001; 98:1654-1661). Al igual que los multímeros rVWF de orden superior, la expresión recombinante de grandes ADAMTS13 en cultivo de células de mamífero presenta muchos desafíos. Por lo tanto, existe una necesidad para proporcionar condiciones de cultivo celular, particularmente condiciones de cultivo de manufacturación a gran escala, que proporcionan rendimiento de proteína total consistente y/o actividad total y específica consistente de las proteínas producidas entre diferentes cultivos celulares. La consistencia entre cultivos en procesos de manufacturación a gran escala es de importancia en la manufactura de proteínas terapéuticas. Existe también una necesidad para condiciones de cultivo celular para producción a gran escala del rVWF con una actividad de Ristocetina específica y distribución multimérica comparable o superior que el VWF como se presenta en plasma humano normal. De manera similar, como las proteínas ADAMTS han sido implicadas en un número de enfermedades y condiciones, existe una necesidad en la técnica para métodos de producción a gran escala de proteínas ADAMTS recombinantes que tienen altas actividades específicas, las cuales son adecuadas para formulación y administración farmacéutica. La presente invención satisface estas y otras necesidades en la técnica para la producción del Factor von Willebrand recombinante y ADAMTS13 recombinante .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En ciertos aspectos, la presente invención se basa en el sorprendente hallazgo que la implementación de medio de cultivo celular usado para expresar el Factor Von Willebrand (rVWF) y ADAMTS13 recombinante (rA13) resulta en expresión de la proteína y actividad enzimática significantemente mejoradas.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un método para producir una composición del Factor Von Willebrand recombinante (rVWF, por sus siglas en inglés), el método comprende las etapas de: (a) proporcionar un medio de cultivo de células básales; (b) suplementar el medio de cultivo de células básales con cobre para proporcionar una concentración de cobre final de al menos 2.4 ug/L; (c) proporcionar una o más células que comprenden un ácido nucleico que codifica una proteína del rvWF; (d) cultivar una o más células en el medio de cultivo de células suplementadas con cobre de manera que el rVWF se expresa y excreta de las células en un cultivo de sobrenadante; y (e) recuperar al menos una porción del cultivo sobrenadante, en donde el sobrenadante recuperado tiene una actividad del cofactor de ristocetina específico del rVWF de al menos 30 mU/pg del rVWF.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, el método además comprende una etapa de suplementar el medio de cultivo de células básales con un hidrolizado previo a cultivar una o más células.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, el hidrolizado es un hidrolizado de planta. En una modalidad específica, el hidrolizado es un hidrolizado de so a .

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, el medio de cultivo de células básales es un medio de cultivo libre de proteína animal.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, el medio de cultivo de células básales es un medio de cultivo libre de proteína.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, el medio de cultivo de células básales es un medio de cultivo libre químicamente definido.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, la concentración final de cobre del medio de cultivo de células básales suplementado con cobre es al menos 4 ug/L de cobre.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, la concentración final de cobre del medio de cultivo de células básales suplementado con cobre es entre 2.4 pg/L y 20 pg/L de cobre.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, el medio de cultivo de células básales suplementado con cobre se proporciona como una sal de cobre, un quelato de cobre, o una combinación de los mismos.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, la sal de cobre se selecciona del grupo que consiste de sulfato de cobre, acetato de cobre, carbonato de cobre, cloruro de cobre, hidróxido de cobre, nitrato de cobre y óxido de cobre.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, una o más células son células de mamífero. En una modalidad específica, las células de mamífero son células CHO.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, cultivar una o más células comprende cultivación por lotes de las células.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, cultivar una o más células comprende cultivación continua de las células. En una modalidad específica, la cultivación continua de células se realiza en modo quimiostático . En otra modalidad específica, la cultivación continua de células se realiza en modo de perfusión .

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, una o más células se cultivan en al menos 100 L del medio de cultivo suplementado a base de células básales .

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, la densidad celular se mantiene a menos de 2.5xl06 células por mL durante la etapa de cultivar una o más células .

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, la densidad celular se mantiene a menos de 2.0xl06 células por mL durante la etapa de cultivar una o más células .

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, la densidad celular se mantiene a menos de 1.5xl06 células por mL durante la etapa de cultivar una o más células.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, la etapa de recuperar al menos una porción del cultivo sobrenadante comprende filtración o centrifugación para remover las células de la porción del sobrenadante del cultivo.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 40 mU^g del rVWF. En una modalidad específica, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 50 mU^g del rVWF. En una modalidad más específica, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 60 mU/ug del rVWF. En una modalidad más específica, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 70 mU/ug del rVWF. En una modalidad todavía más específica, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 80 mU/ g del rVWF .

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, al menos 10% del rVWF en el sobrenadante está presente en un multímero del VWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En una modalidad específica, al menos 15% del rVWF está presente en un multímero del VWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra modalidad específica, al menos 20% del rVWF está presente en un multímero del VWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra modalidad específica, al menos 25% del rVWF está presente en un multímero del V F de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra modalidad específica, al menos 30% del rVWF está presente en un multímero del VWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, el sobrenadante contiene multímero del VWF de alto peso molecular de 14 a 22 dímeros.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, el contenido de NH4+ del sobrenadante de cultivo celular se mantiene a una concentración por debajo de 10 mM.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, el contenido de NH4+ del sobrenadante de cultivo celular se mantiene a una concentración por debajo de 4 mM.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, el rVWF es co-expresado con el Factor VIII recombinante (rFVIII) . En una modalidad específica, el método además comprende una etapa de purificación del rVWF lejos de al menos 50% del rFVIII presente en el sobrenadante recuperado. En una modalidad, la relación del rVWF a rFVIII después de la etapa de purificación es al menos 10:1.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, el método además comprende una etapa de enriquecimiento del rVWF.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una composición del Factor Von Willebrand recombinante (rVWF) preparada por un método proporcionado en la presente.

En una modalidad de las composiciones proporcionadas anteriormente, la composición además comprende el Factor VIII recombinante (rFVIII) . En una modalidad específica, la relación del rVWF a rFVIII es al menos 10:1.

En una modalidad de las composiciones proporcionadas anteriormente, la composición es formulada para administración farmacéutica. En una modalidad específica, la composición es formulada para administración intravenosa .

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un sobrenadante de cultivo celular que comprende el Factor de Von Willebrand recombinante (rVWF) , en donde el sobrenadante es preparado por un método proporcionado en la presente .

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un sobrenadante de cultivo celular que comprende el Factor de Von Willebrand recombinante (rVWF) , en donde al menos 10% del rV F en el sobrenadante está presente en un multímero del VWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros . En una modalidad específica, al menos 15% del rVWF en el sobrenadante está presente en un multímero del VWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra modalidad específica, al menos 20% del rVWF en el sobrenadante está presente en un multímero del VWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra modalidad específica, al menos 25% del rVWF en el sobrenadante está presente en un multímero del VWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra modalidad específica, al menos 30% del rVWF en el sobrenadante está presente en un multímero del VWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En todavía otra modalidad específica de los sobrenadantes proporcionados anteriormente, el sobrenadante se prepara de conformidad con un método proporcionado en la presente.

En un quinto aspecto, la presente invención proporciona un sobrenadante de cultivo celular que comprende el Factor de Von Willebrand recombinante (rVWF) , en donde el sobrenadante contiene al menos 0.4 IU de actividad del cofactor de ristocetina por mL. En una modalidad específica, el sobrenadante contiene al menos 0.5 IU de actividad del cofactor de ristocetina por mL. En otra modalidad específica, el sobrenadante contiene al menos 0.6 IU de actividad del cofactor de ristocetina por mL. En otra modalidad específica, el sobrenadante contiene al menos 0.7 IU de actividad del cofactor de ristocetina por mL. En todavía otra modalidad específica de los sobrenadantes proporcionados anteriormente, el sobrenadante se prepara de conformidad con un método proporcionado en la presente.

En un sexto aspecto, la presente invención proporciona un método para producir una composición de ADA TS13 recombinante (rA13) , el método comprende las etapas de: (a) proporcionar un medio de cultivo de células básales; (b) suplementar el medio de cultivo de células básales con cobre para proporcionar una concentración de cobre final de al menos 1.0 ug/L; (c) proporcionar una o más células que comprenden un ácido nucleico que codifica una proteína rA13; (d) cultivar una o más células en el medio de cultivo celular suplementado con cobre de manera que la rA13 se expresa y excreta de las células en un cultivo de sobrenadante; y (e) recuperar al menos una porción del cultivo sobrenadante, en donde al menos 1500 Unidades de actividad del FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células básales suplementado por día están presentes en el sobrenadante de cultivo recuperado.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, la concentración final de cobre del medio de cultivo suplementado a base de células básales es al menos 1 ug/L de cobre.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, la concentración final de cobre del medio de cultivo suplementado a base de células básales es al menos 2 µg/L de cobre.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, la concentración final de cobre del medio de cultivo suplementado a base de células básales es al menos 4 ]xg/ de cobre.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, la concentración final de cobre del medio de cultivo suplementado a base de células básales es entre 1 ug/L y 6 ug/L de cobre.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, la concentración final de cobre del medio de cultivo suplementado a base de células básales es entre 2 ug/L y 4 ug/L de cobre.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, suplementar con cobre el medio de cultivo de células básales se proporciona como una sal de cobre, un quelato de cobre, o una combinación de los mismos. En una modalidad específica, la sal de cobre se selecciona del grupo que consiste de sulfato de cobre, acetato de cobre, carbonato de cobre, cloruro de cobre, hidróxido de cobre, nitrato de cobre y óxido de cobre .

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, cultivar una o más células comprende cultivación continua de las células. En una modalidad específica, la cultivación continua de células se realiza en modo quimiostático . En otra modalidad específica, la cultivación continua de células se realiza en modo de perfusión.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, una o más células se cultivan en al menos 100 L del medio de cultivo suplementado a base de células básales.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, la densidad celular se mantiene a menos de 4. OxlO6 células por mL durante la etapa de cultivar una o más células .

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, la densidad celular se mantiene a menos de 3.5xl06 células por mL durante la etapa de cultivar una o más células .

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, la densidad celular se mantiene a menos de 3. OxlO6 células por mL durante la etapa de cultivar una o más células .

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, la densidad celular se mantiene a menos de 2. OxlO6 células por mL durante la etapa de cultivar una o más células .

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, la densidad celular se mantiene a menos de 1.5xl06 células por mL durante la etapa de cultivar una o más células .

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, al menos 2000 Unidades de actividad del FRETS-V F73 por litro de medio de cultivo de células básales suplementado por día están presentes en el sobrenadante de cultivo recuperado.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, al menos 2500 Unidades de actividad del FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células básales suplementado por día están presentes en el sobrenadante de cultivo recuperado.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del FRETS-V F73 específica de la rA13 de al menos 800 mU/ug.

En una modalidad preferida de los métodos proporcionados anteriormente, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del FRETS-VWF73 específica de la rA13 de al menos 1200 mU/ g.

En una modalidad más preferida de los métodos proporcionados anteriormente, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del FRETS-VWF73 específica de la rA13 de al menos 1600 mU/Vg.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, el contenido de NH+ del sobrenadante de cultivo celular se mantiene a una concentración por debajo de 10 mM.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, el contenido de NH4+ del sobrenadante de cultivo celular se mantiene a una concentración por debajo de 5 mM.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, el método además comprende una etapa de enriquecimiento de la rA13.

En un séptimo aspecto, la presente invención proporciona un sobrenadante de cultivo celular que comprende ADAMTS13 recombinantes (rA13), en donde el sobrenadante es preparado por un método proporcionado en la presente.

En un octavo aspecto, la presente invención proporciona un sobrenadante de cultivo celular que comprende el Factor de Von Willebrand recombinante (rVWF) , en donde el sobrenadante contiene al menos 5 U de actividad del FRETS-V F73 por mL. En una modalidad específica, el sobrenadante contiene al menos 6 U de actividad del FRETS-VWF73 por mL. En otra modalidad específica, el sobrenadante contiene al menos 7 U de actividad del FRETS-VWF73 por mL. En otra modalidad específica, el sobrenadante contiene al menos 8 U de actividad del FRETS-VWF73 por mL. En otra modalidad específica, el sobrenadante contiene al menos 9 U de actividad del FRETS-VWF73 por mL . En otra modalidad específica, el sobrenadante contiene al menos 10 U de actividad del FRETS-VWF73 por mL. En todavía otra modalidad específica de los sobrenadantes proporcionados anteriormente, el sobrenadante se prepara de conformidad con un método proporcionado en la presente.

En un noveno aspecto, la presente invención proporciona un sobrenadante de cultivo celular que comprende el Factor de Von Willebrand recombinante (rV F) , en donde el sobrenadante contiene al menos 2 µ9 de rA13 por mL. En una modalidad específica, el sobrenadante contiene al menos 3 ug de rA13 por mL . En otra modalidad específica, el sobrenadante contiene al menos 4 ug de rA13 por mL. En otra modalidad específica, el sobrenadante contiene al menos 5 )ig de rA13 por mL. En otra modalidad específica, el sobrenadante contiene al menos 6 ig de rA13 por mL. En todavía otra modalidad específica de los sobrenadantes proporcionados anteriormente, el sobrenadante se prepara de conformidad con un método proporcionado en la presente.

En un décimo aspecto, la presente invención proporciona una composición de ADAMTS13 recombinante (rA13) preparada por un método de conformidad con cualquiera de los métodos descritos anteriormente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figuras 1A-1B. (Fig. 1A) Electroforesis en gel de agarosa de baja resolución (1 %) de rVWF expresado en cultivo de células de mamífero en la presencia de concentración de cobre baja (1.0 µ<3/1>) y alta (4.3 ig/h) , como se describe en el Ejemplo 2. Se observa que el cultivo de Día 3 es equivalente al lote del día 1 de la Tabla 7 y Tabla 8. (Fig. IB) Las cantidades relativas de multímeros del VWF que tienen 1 a 10 dímeros (banda número 1) y más de 10 dímeros (banda número 2) , como se indica por las bandas definidas en la Figura 1A, se cuantificó por análisis densitométrico .

Figuras 2A-2B. (Fig. 2A) Trazo de intervalo de la actividad específica del rVWF promedio presente en sobrenadantes de cultivo celular del rVWF que crecen a densidades celulares alta y baja en la presencia de niveles altos o bajos de cobre. (Fig. 2B) Trazo de intervalo de la concentración promedio de NH4+ encontrada en sobrenadantes de cultivo de células del rVWF que crecen a altas y bajas densidades en la presencia de niveles altos o bajos de cobre.

Figuras 3A-3B. Sobrenadantes de cultivos celulares que expresan ADA TS13 recombinantes en la presencia de niveles incrementados de cobre fueron investigados por análisis de SDS-PAGE. La rA13 se visualizó después de SDS-PAGE por (Fig.3A) teñido de plata y (Fig.3B) Western Blot anti-A13.

Figura 4. Trazo de datos de productividad volumétrica (P Frets) contra la concentración de cobre que muestra una extrapolación (linea sólida) del efecto de concentración de cobre óptima en productividad de rA13.

Figura 5A-5K. Gráfica de barras de cultivos celulares en suspensión continua (quimiostato) que expresan rA13 sobre un tiempo de cultivo de 8 semanas comparando los efectos de niveles básales de cobre (0.66 ug/L) con aquellos de cultivos suplementados a una concentración final de 2 g/L de cobre. Cada barra representa los datos medios de una semana de cultivo quimiostático . Las leyendas se refieren a la semana particular representada en los datos.

Figuras 6A-6B. (Fig. 6A) Electroforesis de gel de agarosa de baja resolución (1 %) de rVWF expresado en cultivo de células de mamífero en la presencia de baja (1.0 ug/L) y alta (4.3 concentración de cobre bajo alta y baja densidades celulares como se describe en el Ejemplo 3. Se observa que el cultivo del Día 8 y 17 ( "CST8" y "CST17" ) es equivalente al Día 8 y Día 17 de la Tabla 10 a la Tabla 13. (Fig. 6B) Las cantidades relativas de multímeros del VWF que tienen 1 a 10 dímeros y más de 10 dímeros, como se indica por las bandas definidas en la Figura 6A, fue cuantificada por análisis densitométricos .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN I . Introducción vWF recombinante (rVWF) y ADAMTS13 recombinante (rA13) pueden ser producidos por expresión en cultivos de células de mamífero a gran escala. Sin embargo, la actividad de estas proteínas cuando se producen usando condiciones estándares de cultivo celular a menudo varían a través de los cultivos celulares, aún cuando las formulaciones generales de los medios no se cambian, y las actividades específicas de las proteínas recombinantes son a menudo no iguales a aquellas del vWF y rA13 derivadas de plasma de sangre. Además, el rVWF expresado en cultivos de células de mamífero tiende a producir composiciones de proteína con bajos porcentajes (debajo de 10%) de multímeros de orden superior (multímeros de orden superior incluyen moléculas que contienen más de 10 dímeros del VWF) . Estas desventajas en métodos de producción estándar del rVWF y rA13 son particularmente problemáticas cuando se desarrollan cultivos para producción a gran escala (es decir, desde 10 hasta más de 20,000 litros de cultivos) .

Una fuente potencial de la variabilidad a menudo se observa en diferentes lotes de cultivo en la presencia de contaminantes en componentes del medio de cultivo celular. Estos contaminantes pueden estar presentes en diferentes cantidades en diferentes lotes, conduciendo a resultados variables en la producción de rVWF y rA13. Después de investigar los diferentes contaminantes encontrados en varios aditivos del medio de cultivo celular, los presentes inventores encontraron que la presencia de hidrolizados conduce a variación en concentraciones de cobre en el medio celular. Investigación adicional proporciona el resultado sorprendente de que concentraciones de cobre de suplementación en medio celular para producir una concentración total de cobre de al menos aproximadamente 1 µ9/:[ hasta aproximadamente 20 g/L incrementa consistentemente la actividad total y específica de rVWF y rA13 y/o podría también conducir al rendimiento de proteína total incrementada. De este modo, la presente invención proporciona métodos y composiciones para producción de alto rendimiento de proteínas rVWF y rA13 con alta actividad específica .

En un aspecto, la presente invención proporciona métodos y composiciones de cultivo celular para producir grandes cantidades de rVWF y rA13 con alta actividad que es comparable a o superior que aquella vista con el vWF derivado de plasma (pdVWF) o ADAMTS13 derivado de plasma (pdA13) . En aspectos adicionales, las proteínas del rVWF y rA13 producidas de conformidad con la presente invención muestran actividad consistentemente superior que las proteínas producidas usando métodos de cultivo celular estándar en medio que no ha sido suplementado con cobre u otros suplementos descritos en detalle adicional en la presente. Ventajosamente, en ciertas modalidades de los métodos y composiciones proporcionados en la presente, las proteínas del rVWF y rA13 producidas de conformidad con la presente invención muestran actividad específica consistentemente superior (es decir, U/mg de proteína) que las proteínas producidas usando métodos de cultivo celular estándar en medio que no ha sido suplementado con cobre u otros suplementos descritos en detalle adicional en la presente. Del mismo modo, los métodos proporcionados en la presente para la producción de rVWF y rA13 proporcionan rendimientos superiores de actividad por volumen de cultivo (es decir, U/L/D) , comparado con métodos de cultivo celular estándar utilizando medio que no ha sido suplementado con cobre u otros suplementos descritos en detalle adicional en la presente .

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona métodos de cultivo celular en los cuales un medio de cultivo de células básales es suplementado con cobre para resultar en una concentración total de al menos aproximadamente 1 ug/L. En otras modalidades, el medio de cultivo de células básales es suplementado con cobre para resultar en una concentración total de al menos aproximadamente 2 ug/L. En todavía otras modalidades, el medio de cultivo de células básales es suplementado con cobre para resultar en una concentración total de al menos aproximadamente 1 ug/L hasta aproximadamente 20 ug/L. En algunas modalidades, la concentración total de cobre es desde aproximadamente 1.5 - 4.5 ug/L. En ciertas modalidades, el medio de cultivo celular es suplementado para resultar en aproximadamente 1, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2.0, 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4, 4.2, 4.4, 4.6, 4.8, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ug/L de cobre, o más. El medio de cultivo de células básales en general tiene una concentración indicadora de cobre por debajo de 1 ug/L.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos de cultivo celular en los cuales un medio de cultivo de células básales es suplementado con desde aproximadamente 1.0 hasta aproximadamente 20 ug/L de cobre para producción del rVWF. En modalidades adicionales, el medio de cultivo de células básales es suplementado con desde aproximadamente 1.5-15, 2.0-10, 2.5-8, 3.0-6, 4.0 -5.0 u /L de cobre para producción del rVWF. En aún modalidades adicionales, el medio de cultivo de células básales puede, además del cobre suplementado, también incluir uno o más hidrolizados .

En otras modalidades, la presente invención proporciona métodos de cultivo celular en los cuales un medio de cultivo de células básales es suplementado con desde aproximadamente 1.5 hasta aproximadamente 4 ug/L de cobre para producción de rA13. En modalidades adicionales, el medio de cultivo de células básales es suplementado con desde aproximadamente 1.6 - 3.8, 1.7 - 3.6, 1.8 - 3.4, 1.9 - 3.2, 2.0 - 3.0, 2.1 - 2.8, 2.2 - 2.6, 2.3 - 2.4 ug/L de cobre para producción de rA13. En aún modalidades adicionales, el medio de cultivo de células básales puede, además del cobre suplementado, también incluir uno o más hidrolizados. En todavía modalidades adicionales, el medio de cultivo de células básales incluye, además del cobre y/o uno o más hidrolizados, aproximadamente 1.0 hasta aproximadamente 30 µ? zinc. En aún modalidades adicionales, el medio de cultivo de células básales además incluye, además del cobre y/o uno o más hidrolizados y/o zinc, entre aproximadamente 0.5 hasta aproximadamente 5.0 mM de calcio.

En un aspecto aún adicional y de conformidad con cualquiera de los anteriores, la presente invención proporciona métodos de cultivo celular en los cuales los niveles de amonio de la solución de cultivo celular son bajos (por debajo de 10 mM) . En ciertas modalidades, los métodos de cultivo celular de la presente invención utilizan medio de cultivo celular que tiene más de 1, 2, 3, 4, ó 5 ug/L de cobre en combinación con bajos niveles de amonio.

Una de las ventajas de los métodos y composiciones de la presente invención es que son susceptibles para producción de cultivo celular a gran escala. Estos cultivos de células a gran escala son al menos de 10 L, 50 L, 100 L, 150 L, 200 L, 250 L, 500 L, 750 L, 1,000 L, 1,500 L, 2,000 L, 5,000 L, 10,000 L, o 20,000 litros de cultivos.

En ciertos aspectos, los métodos de la invención no necesariamente resultan en una cantidad superior de proteína total recombinante , sino a la proteína recombinante (ya sea rV F o rA13) que se produce mostrando actividad total y específica superior que la que se observa en proteínas producidas usando cultivos de células estándares, particularmente comparado con proteínas producidas en cultivos celulares en los cuales el medio de cultivo celular aún no ha sido suplementado con cobre adicional. En aspectos adicionales, las proteínas del rVWF y rA13 producidas en cultivo de células en medio suplementado con cobre muestran actividad consistentemente incrementada por litro de cultivo celular comparada con células cultivadas en medio de cultivo de células básales que no se ha suplementado con cobre. En todavía aspectos adicionales, el medio suplementado de cobre de la presente invención resulta en rendimiento incrementado de la proteína, número incrementado de células en el cultivo, y/o actividad total incrementada por litro de cultivo comparada con el medio que no ha sido suplementado con cobre.

Todavía ventajas adicionales de métodos y composiciones de la invención es que resultan en una población de proteínas que contienen un alto porcentaje (más de 10%) del rVWF altamente multimerizado .

Aunque mucha de la discusión aquí con respecto a proteínas ADAMTS está en términos de ADAMTS13 (A13) , se apreciará que debido a que todas las proteínas ADAMTS portan una arquitectura de dominio de núcleo común y relaciones de estructura- función común, los métodos y composiciones descritos en la presente son aplicables para producción de cualquiera de las proteínas ADAMTS, no solamente rA13.

Definiciones Como se usa en la presente, "vWF recombinante" incluye el vWF obtenido vía tecnología de ADN recombinante. En ciertas modalidades, las proteínas del vWF de la invención pueden comprender un constructo, por ejemplo, preparado como en el documento WO 1986/06096 publicado en Oct . 23 1986 y Solicitud de Patente Estadounidense Ser. No. 07/559,509, presentada en Jul . 23 1990, a nombre de Ginsburg et al., el cual se incorpora en la presente por referencia con respecto a los métodos para producir vWF recombinante . El v F en la presente invención puede incluir todas las formas potenciales, que incluyen las formas monoméricas y multiméricas . Se debe entender también que la presente invención abarca diferentes formas del vWF para ser usado en combinación. Por ejemplo, el vWF de la presente invención puede incluir diferentes multímeros, diferentes derivados y tanto derivados biológicamente activos como derivados no biológicamente activos.

El término "recombinante" cuando se usa con referencia, por ejemplo, a una célula, o ácido nucleico, proteína, o vector, indica que la célula, ácido nucleico, proteína o vector, ha sido modificada por la introducción de una proteína o ácido nucleico heterologo o la alteración de una proteína o ácido nucleico nativo, o que la célula se deriva de una célula así modificada. De este modo, por ejemplo, genes que expresan células recombinantes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresan genes nativos que son de otro modo anormalmente expresados, sobre expresados o no expresados en todos .

En el contexto de la presente invención, el vWF recombinante abarca cualquier miembro de la familia del vWF de, por ejemplo, un mamífero tal como un primate, humano, mono, conejo, cerdo, roedor, ratón, rata, hámster, jerbo, canino, felino y derivados de los mismos biológicamente activos. En una modalidad preferida, el VWF recombinante es V F humano. Proteínas del vWF variantes y mutantes que tienen actividad también están abarcadas, como son fragmentos funcionales y proteínas de fusión de las proteínas del vWF. Además, el vWF de la invención puede comprender además etiquetas que facilitan la purificación, detección o ambos. El vWF descrito en la presente puede además ser modificado con una porción terapéutica o una porción adecuada de imagen in vitro o in vivo.

Los términos "vWF altamente multimérico, " "vWF de alto peso molecular," y "VWF HMW" pueden ser usados intercambiablemente y se refieren a multímeros del vWF covalentemente unidos que contienen más de 10 dímeros del VWF. En ciertas modalidades, VWF HMW contiene al menos 11 dímeros del VWF, o al menos 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, o más dímeros del VWF.

Como se usa en la presente, una "proteína ADAMTS" se refiere a un polipéptido de la disintegrina y metaloproteinasa con porciones de tromboespondina tipo de la familia de metaloproteinasas . Los miembros de esta familia incluyen las proteínas humanas ADAMTS1 (NM_006988) , ADAMTS2 (NM_014244; NM_021599) , ADAMTS3 (NM_014243), ADAMTS4 (NM_005099) , ADAMTS5 (NM_007038), ADAMTS6 (NM_014273), ADAMTS7 (NM 0142727), ADAMTS8 (NM_007037), ADAMTS9 (NM_182920; NM_182921; NM_020249), ADAMTS10 ( M_030957 ) , ADAMTS12 (NM_030955), ADAMTS13 (NM_139025; NM_139026; NM_139027; NM_139028), ADAMTS14 (NM_139155; NM_080722), ADAMTS15 (NM_139055), ADAMTS16 (NM_139056), ADAMTS17 (NM_139057) , ADAMTS18 (NM_199355; NM_139054), ADAMTS19 (NM_133638) , y ADAMTS20 (NM_025003, NM_175851) . Las proteínas ADAMTS incluyen tanto proteínas de longitud completa como polipéptidos parciales que exhiben al menos actividad biológica parcial, por ejemplo, al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o más de la actividad demostrada por la proteína de longitud completa, en particular la actividad de proteasa demostrada por la proteína de longitud completa. En ciertos casos, una proteína ADAMTS será post-traduccionalmente modificada ya sea in vivo o in vitro, por ejemplo, por medios enzimáticos o químicos. Se entiende que las proteínas ADAMTS de la presente invención incluyen isoformas alteAR tivamente empalmadas, proteínas conservativamente modificadas, proteínas sustancialmente idénticas, homólogos, y similares.

En el contexto de la presente invención, una proteína ADAMTS abarca cualquier miembro de la familia ADAMTS de, por ejemplo, un mamífero tal como un primate, humano, mono, conejo, cerdo, roedor, ratón, rata, hámster, jerbo, canino, felino, y derivados de los mismos biológicamente activos. Proteínas ADAMTS variantes y mutantés que tienen actividad también están abarcadas, como son fragmentos funcionales y proteínas de fusión de las proteínas ADAMTS. Además, las proteínas ADAMTS de la invención además pueden comprender etiquetas que facilitan la purificación, detección, o ambas. Las proteínas ADAMTS descritas en la presente pueden ser además modificadas con una porción terapéutica o una porción adecuada de imagen in vitro o in vivo .

Como se usa en la presente, una "proteína ADAMTS13" se refiere a cualquier proteína o polipéptido con actividad de ADAMTS13 , particularmente la capacidad para desdoblar el enlace peptídico entre residuos Tyr-842 y Met-843 del VWF. En una modalidad ejemplar, una proteína ADAMTS13 se refiere a un polipéptidos que comprende una secuencia de aminoácido que es altamente similar a aquella de NP_620594 (ADAMTS13 isoforma 1, preproproteína) o aminoácidos 75 a 1427 de NP_620594 (ADAMTS13 isoforma 1, polipéptido maduro) . En otra modalidad, una proteína ADAMTS13 se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido que es altamente similar a aquella de NP_620596 (ADAMTS13 isoforma 2, preproproteína) o aminoácidos 75 a 1371 de NP_620594 (ADAMTS13 isoforma 2, polipéptido maduro). En todavía otra modalidad, las proteínas ADAMTS13 incluyen polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácido altamente similar a aquella de NP_620595 (ADAMTS13 isoforma 3, preproproteína) o aminoácidos 75 a 1340 de NP_620595 (ADAMTS13 isoforma 1, polipéptido maduro) . Como se usa en la presente, una proteína ADA TS13 incluye variantes naturales con actividad de desdoblamiento del vWF y constructos artificiales con actividad de desdoblamiento del vWF. Como se usa en la presente invención, ADAMTS13 abarca cualquiera de las variantes naturales, secuencias alteAR tivas , isoformas o proteínas mutantes que retienen alguna actividad basal . Ejemplos de mutaciones de ADAMTS13 encontradas en la población humana incluyen, sin limitación, R7W, V88M, H96D, R102C, R193 , T196I, H234Q, A250V, R268P, W390C, R398H, Q448E, Q456H, P457L, C508Y, R528G, P618A, R625H, I673F, R692C, A732V, S903L, C908Y, C951G, G982R, C1024G, A1033T, R1095W, R1123C, C1213Y, T1226I, G1239V, R1336 , muchas de las cuales se han encontrado asociadas con púrpura trombocitopénica trombótica (TTP) . Las proteínas ADAMTS13 también incluyen polipéptidos que contienen modificaciones post-traduccionales . Por ejemplo, ADAMTS13 se ha mostrado por ser modificada por N-acetilglucosamina (GlcNAc) en los residuos 614, 667, y 1354, y se ha predicho que los residuos 142, 146, 552, 579, 707, 828, y 1235 pueden también ser modificados en esta forma.

ADAMTS13 recombinantes proteolíticamente activos pueden ser preparados por expresión en cultivos de células de mamífero, como se describe en Plaimauer et al., (2002, Blood. 15; 100 (10) :3626-32) y el documento US 2005/0266528, las descripciones de los cuales están en la presente incorporadas por referencia en sus totalidades para todos los propósitos, Los métodos para la expresión de ADAMTS13 recombinantes en cultivos celulares se describen en Plaimauer B, Scheiflinger F. (Semin Hematol . 2004 Jan; 41 (1) : 24-33 y documento US 2011/0086413, las descripciones de los cuales están incorporados en la presente por referencia en sus totalidades para todos los propósitos.

Como se usa en la presente, el término "derivado biológicamente activo", cuando se usa en el contexto de una proteína ADAMTS, también abarca polipéptidos obtenidos vía tecnología de ADN recombinante . Este puede incluir cualquier método conocido en la técnica para (i) la producción de ADN recombinante por ingeniería genética, por ejemplo, vía transcripción inversa de ARN y/o amplificación de ADN, (ii) introducir ADN recombinante en células procarióticas o eucarióticas por transíección, es decir, vía electroporación o microinyección, (iii) cultivar tales células transformadas, por ejemplo, en una manera continua o por lotes, (iv) expresar una proteína ADAMTS, por ejemplo, constitutivamente o después de la inducción, y (v) aislar tal proteína ADAMTS, por ejemplo, del medio de cultivo o cosechando las células transformadas, con el fin de (vi) obtener proteína ADAMTS recombinante sustancialmente purificada, por ejemplo, vía cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía de afinidad, cromatografía de interacción hidrofóbica, y similares. El término "derivado biológicamente activo" incluye también moléculas quiméricas tales como por ejemplo una proteína ADAMTS, o fragmento funcional de la misma, en combinación con un segundo polipéptido, por ejemplo, un dominio Fe de inmunoglobulina o un dominio de albúmina, con el fin de mejorar las propiedades biológicas/farmacológicas tales como por ejemplo, vida media de la proteína ADAMTS en el sistema de circulación de un mamífero, particularmente un humano.

Los términos "aislado", "purificado", o "biológicamente puro", se refieren a un material que es sustancialmente o esencialmente libre de componentes que normalmente lo acompañan como se encuentra en su estado nativo. Pureza y homogeneidad son típicamente determinados usando técnicas de química analítica tales como electroforesis de gel de poliacrilamida o cromatografía líquida de alta resolución. En una modalidad, el rVWF es la especie predominante presente en una preparación, es sustancialmente purificada. En otra modalidad, rA13 es la especie predominante presente en una preparación, es sustancialmente purificada. El término "purificado" en algunas modalidades denota que un ácido nucleico o proteína da origen a esencialmente una banda en un gel electroforático. En otras modalidades, significa que el ácido nucleico o proteína es al menos 50% puro, más preferiblemente al menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más puro. "Purifica" o "purificación" en otras modalidades significa remover al menos un contaminante de la composición a ser purificada. En este sentido, la purificación no requiere que los compuestos purificados sean homogéneos, por ejemplo, 100% puros.

La actividad biológica del vWF puede ser medida por ensayos in vitro conocidos. Por ejemplo, el ensayo del Cofactor de Ristocetina se basa en la aglutinación de plaquetas fijadas con formalinas o frescas inducidas por el antibiótico de ristocetina en la presencia de vWF. El grado de aglutinación de plaquetas depende de la concentración del vWF y puede ser medido por el método turbidimétrico, por ejemplo por el uso de un agregómetro ( eiss et al., J. Clin. Invest. 52: 2708-2716, 1973; Macfarlane et al., Thromb. Diath. Haemorrh. 34: 306-308, 1975). Como se proporciona en la presente, la actividad del Cofactor de Ristocetina específica del vWF de la presente invención se describe en términos de mU/ug de vWF, como se mide usando ensayos in vitro.

Como se usa en la presente, "una unidad de actividad ADAMTS" se define como la cantidad de actividad en 1 mL de plasma humano normal combinado, con respecto al ensayo a ser usado. Por ejemplo, cuando la proteína ADAMTS es ADAMTS13 , una unidad de actividad de ADAMTS13 FRETS-VWF73 es la cantidad de actividad necesaria para desdoblar la misma cantidad de sustrato de FRETS-VWF73 ( okame et al., Br J Haematol . 2005 Apr; 129(1) : 93-100) como se desdobla por un mL de plasma humano normal combinado. Convenientemente, la actividad de ADAMTS13 puede ser determinada por ensayos funcionales, tales como ensayos funcionales que emplean péptidos del factor von illebrand modificados como sustrato para ADAMTS13 (Tripodi et al. J Thromb Haemost. 2008 Sep;6(9) : 1534-41) . Un método preferido para determinar la actividad de ADAMTS13 humana recombinante se describe en Gerritsen et al. (Assay of von Willebrand factor (vWF) -cleaving protease based on decreased collagen binding affinity of degraded vWF: a tool for the diagnosis of thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP) . Thromb Haemost 1999; 82: 1386- 1389). En una modalidad, para ser considerado como una proteína ADAMTS13 como se define anteriormente, un polipéptido o proteína debe tener al menos 1% de la actividad de desdoblamiento del vWF de ADAMTS13 nativa. En otras modalidades, una proteína ADAMTS13 contendrá al menos 10% de la actividad de ADAMTS13 nativa. En todavía otras modalidades, una proteína ADAMTS13 contendrá al menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 100% de la actividad de ADAMTS13 nativa. La cantidad de una proteína ADAMTS13 también puede ser determinada por medición de un antígeno de ADAMTS13, por ejemplo usando el método ELISA descrito en Rieger et al., (2006, Thromb Haemost . 2006 95(2) :212- 20). Una convención bien establecida en la técnica es que 1 mL de plasma humano normal combinado contiene 1 µ9 de ADAMTS13. De este modo, la convención en la técnica es que 1 ig de ADAMTS13 derivado de plasma tiene una unidad de actividad ADAMTS13.

Los términos "solución de cultivo celular," "medios o medio de cultivo celular," y "sobrenadante de cultivo celular" se refieren a aspectos de procesos de cultivo celular en general bien conocidos en la técnica. En el contexto de la presente invención, una solución de cultivo celular puede incluir medios de cultivo celular y sobrenadante de cultivo celular. Los medios de cultivo celular son exteARNmente agregados a la solución de cultivo celular, opcionalmente junto con suplementos, para proporcionar nutrientes y otros componentes para cultivar células que expresan el rVWF o rA13. El sobrenadante de cultivo celular se refiere a una solución de cultivo celular que comprende los nutrientes y otros componentes del medio de cultivo celular así como también productos liberados, metabolizados y/o excretados de las células durante el cultivo, pero no las células mismas. De este modo en un contexto, un sobrenadante de cultivo celular puede referirse a la fase líquida de una solución de cultivo celular (es decir, la solución de cultivo celular excluyendo las células) . Por ejemplo, la concentración de amonio de un sobrenadante de cultivo en general se refiere a la concentración de amonio presente en la solución de cultivo celular. En otros contextos, un sobrenadante de cultivo celular se refiere a una solución de cultivo celular de la cual las células se han removido (es decir, un sobrenadante de cultivo celular recuperado) .

Como se usa en la presente, los términos "vitamina B3 , " "nicotinamida, " "niacinamida , " "niacina," y "ácido nicotínico" pueden ser usados intercambiablemente para referirse a cualquier miembro de la familia B3 de vitaminas. De conformidad, cualquier miembro de esta familia puede ser usado para suplementar el medio usado en los métodos de la presente invención.

Como se usa en la presente, el término "medio químicamente definido" o "medios químicamente definidos" se refiere a un medio de crecimiento sintético en el cual se conoce la identidad y concentración de todos los componentes. Medios químicamente definidos no contienen extractos bacterianos, levadura, animal o vegetal, aunque pueden o no pueden incluir componentes derivados de plantas o animales (por ejemplo, proteínas, polipéptidos, etc.). Ejemplos no limitantes de medios químicamente definidos comercialmente disponibles incluyen varios medios Eagle Modificados de Dulbecco (DME) (Sigma-Aldrich Co; SAFC Biosciences, Inc) , Mezcla de Nutriente de Ham (Sigma-Aldrich Co; SAFC Biosciences, Inc) , combinaciones de los mismos, y similares. Los métodos de preparación de medios de cultivo químicamente definidos se conocen en la técnica, por ejemplo en las Patentes Estadounidenses Números 6,171,825 y 6,936,441, WO 2007/077217, y Publicaciones de Solicitud de Patente Estadounidense Números 2008/0009040 y 2007/0212770, las descripciones de las cuales se incorporan en la presente por referencia en sus totalidades para todos los propósitos.

Como se usa en la presente, el término "medio de cultivo libre de oligopéptido" o "medios de cultivo libres de oligopéptido" se refiere a un medio libre de proteína que no comprende oligopéptidos , tales como, por ejemplo, oligopéptidos derivados de un hidrolizado de proteína. En una modalidad, el medio no comprende oligopéptidos que tienen veinte o más aminoácidos. En una modalidad de la presente invención, el medio no comprende oligopéptidos que tienen quince o más aminoácidos. En otra modalidad de la invención, el medio no comprende oligopéptidos que tienen diez o más aminoácidos. En una modalidad el medio no comprende oligopéptidos que tienen siete o más aminoácidos. En otra modalidad el medio no comprende oligopéptidos que tienen cinco o más aminoácidos. En aún otra modalidad el medio no comprende oligopéptidos que tienen tres o más aminoácidos. De conformidad con una modalidad adicional de la presente invención, el medio no comprende oligopéptidos que tienen dos o más aminoácidos. Los métodos para preparar medio de cultivo libre de oligopéptido se conocen en la técnica, por ejemplo en las Patentes Estadounidenses Números 6,171,825 y 6,936,441, WO 2007/077217, y Publicación de Solicitud de Patentes Estadounidenses Números 2008/0009040 y 2007/0212770, las descripciones de las cuales se incorporan en la presente por referencia en sus totalidades para todos los propósitos.

Como se usa en la presente, el término "medio de cultivo libre de suero" o "medios de cultivo libres de suero" se refiere a un medio de cultivo que no es suplementado con un suero animal. Aunque algunas veces los medios libres de suero son medios químicamente definidos, los medios libres de suero pueden ser suplementados con proteínas animales o vegetales discretas o fracciones de proteína. Los métodos para preparar medios de cultivo libre de suero se conocen en la técnica, por ejemplo en las Patentes Estadounidenses Números 6,171,825 y 6,936,441, WO 2007/077217, y Publicación de Solicitud de Patentes Estadounidenses Números 2008/0009040 y 2007/0212770, las descripciones de las cuales se incorporan en la presente por referencia en sus totalidades para todos los propósitos.

Como se usa en la presente, el término "medio de cultivo libre de proteína animal" o "medios de cultivo libres de proteína animal" se refiere a un medio de cultivo que no es suplementado con un suero animal, proteína o fracción de proteína. Aunque a menudo medios de cultivo libre de proteína animal son medios químicamente definidos, medios de cultivo libre de proteína animal pueden contener hidrolizados de planta o levadura. Métodos para preparar medio de cultivo libre de proteína animal se conocen en la técnica, por ejemplo en las Patentes Estadounidenses Números 6,171,825 y 6,936,441, WO 2007/077217, y Publicación de Solicitud de Patentes Estadounidenses Números 2008/0009040 y 2007/0212770, las descripciones de las cuales se incorporan en la presente por referencia en sus totalidades para todos los propósitos.

Como se usa en la presente, el término "medio de cultivo de células básales" o "medios de cultivo de células básales" se refiere a un medio de cultivo químicamente definido, un medio de cultivo libre de oligopéptido, u medio de cultivo libre de suero, o un medio de cultivo libre de proteína animal que no ha sido suplementado con un hidrolizado, por ejemplo, un hidrolizado de planta o levadura. Medios básales son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, DMEM, F12 de Ham, DMEM/F12 de Ham, Medio 199, McCoy, o RPMI . El medio basal puede incluir un número de ingredientes, que incluyen aminoácidos, vitaminas, sales orgánicas e inorgánicas, y fuentes de carbohidratos. Cada ingrediente puede estar presente en una cantidad que soporta el cultivo de una célula, tales cantidades son en general conocidas por una persona experta en la técnica. El medio puede incluir sustancias auxiliares, tales como sustancias amortiguadoras, por ejemplo, bicarbonato de sodio, antioxidantes, estabilizadores para contrarrestar el estrés mecánico, o inhibidores de proteasa. Si es necesario, un tensioactivo no iónico tal como copolímeros y/o mezclas de polietilenglicoles y polipropilenglicoles pueden ser agregadas.

III. Medios de cultivo celular y Sobrenadante de cultivo celular Un aspecto de la presente invención se refiere a medios de cultivo celular para producción del rVWF y/o rA13 que tienen actividad incrementada comparada con rVWF y rA13 producidos con medios de cultivo de células básales. En un aspecto, la presente invención se refiere a medios de cultivo celular para producción del rVWF y/o rA13 en el cual los medios de cultivo de células básales son suplementados con una o más sustancias adicionales. En modalidades específicas y como se discute en detalle adicional abajo, las condiciones de cultivo celular de la presente invención incluyen medios de cultivo de células básales suplementados para tener al menos 1.0 ]ig/L de cobre. En modalidades adicionales, medios de cultivo celular de uso y sobrenadantes derivados de los procesos en la presente invención también comprenden bajos niveles (debajo de 10 mM) de amonio. En una modalidad particular, las condiciones de cultivo celular usadas para expresar el rVWF y/o rA13 son controladas de manera que el sobrenadante de cultivo celular mantiene un bajo nivel de amonio, es decir, menos de 10 mM y preferiblemente menos de 5 mM.

Los medios de cultivo de la presente invención se pueden basar en un medio basal adecuado bien conocido en la técnica, por ejemplo, DMEM, F12 de Ham, DMEM/F12 de Ham, Medio 199, McCoy, o RPMI . El medio basal puede incluir un número de ingredientes, que incluyen aminoácidos, vitaminas, sales orgánicas e inorgánicas, y fuentes de carbohidratos. Cada ingrediente puede estar presente en una cantidad que soporta la cultivación de una célula, tales cantidades son en general conocidas para una persona experta en la técnica. El medio puede incluir sustancias auxiliares, tales como sustancias amortiguadoras, por ejemplo, bicarbonato de sodio, antioxidantes, estabilizadores para contrarrestar el estrés mecánicos o inhibidores de proteasa. Si es necesario un tensioactivo no iónico tal como copolímeros y/o mezclas de polietilenglicoles y polipropilenglicoles pueden ser agregados .

En general, el medio basal contiene menos de 1 ug/L de cobre -- por ejemplo, DMEM/F12 de Ham tiene una concentración de cobre de aproximadamente 0.3 g/L. Tales concentraciones de cobre no proporcionan suficientes iones de cobre para soportar la producción de proteínas del rVWF y rA13 de la presente invención, las cuales muestran alta actividad específica.

El cobre puede ser proporcionado á medios de cultivo celular de la presente invención a través de una variedad de formas, tales como a través de adición de un suplemento de medio. En algunas modalidades, el suplemento de medio puede contener hidrolizado, el cual puede ser proporcionado para incrementar la concentración de cobre en el medio. Los hidrolizados pueden incluir cualquier hidrolizado bien conocido en la técnica, tales como hidrolizados de plantas, hidrolizados de soja e hidrolizados de gluten de trigo. En ciertas modalidades, la adición del hidrolizado puede contribuir a una concentración incrementada de cobre de aproximadamente 0.2 hasta aproximadamente 10 ]ig/ de Cu2+ . En algunas modalidades, la cantidad de cobre proporcionada por el hidrolizado puede depender de la cantidad de cobre en el hidrolizado así como también de la cantidad de hidrolizado agregado. El contenido de cobre de un hidrolizado puede ser determinado por análisis elemental, por ejemplo, espectroscopia de adsorción de átomo (GFAA: adsorción atómica de horno de grafito) , o métodos de espectroscopia de masas (por ejemplo, ICP-MS) .

En ciertas modalidades, se puede proporcionar cobre a los medios de cultivo solo o en adición al hidrolizado proporcionando un suplemento de medio que incluye una sal de cobre o quelato de cobre adecuado. Las sales de cobre adecuadas pueden incluir pero no se limitan a sulfato de cobre, acetato de cobre, carbonato de cobre, cloruro de cobre, hidróxido de cobre, nitrato de cobre y óxido de cobre. Queladores de cobre adecuados pueden incluir pero no se limitan a albúmina, ácido etilendiaminatetraacético (EDTA) , agentes quelantes de poliamina, etilendiamina, dietilentriamina, trietilentetramina, trietilendiamina, tetraetilenpentamina, aminoetiletanolamina, aminoetilpiperazina, pentaetilenhexamina, trietilentetramina-clorhidrato, tetraetilenpentamina-clorhidrato, pentaetilenhexamina-clorhidrato, tetraetilpentamina, captopril, penicilamina, ?,?' -bis (3 -aminopropil) -1, 3-propandiamina , N,N, Bis- (2 -aminoetil) -1 , 3 -propandiamina, 1,7-dioxa-4 , 10-diazaciclododecano, 1,4,8, 11-tetraaza ciclotetradecan-5 , 7-diona, - triclorhidrato de 1,4,7-triazaciclononana, l-oxa- , 7 , 10-triazaciclododecane, 1 , 4 , 8 , 12 -tetraaza ciclopentadecano, y 1 , 4 , 7 , 10 -tetraaza ciclododecano .

En ciertas modalidades, medios de cultivo de células básales son suplementados con cobre para resultar en una concentración total de cobre de aproximadamente 1.0 hasta aproximadamente 20 ug/L. En una modalidad específica, los medios de células básales son suplementado con cobre a una concentración final de entre aproximadamente 1.0 hasta aproximadamente 10 ug/L. En modalidades adicionales, el medio de cultivo de células básales es suplementado para resultar en una concentración final de cobre de aproximadamente 1.0 - 5.0, 1.2 - 4.0, 1.3 - 3.0, 1.4 - 2.9, 1.5 - 2.8, 1.6 - 2.7, 1.7 - 2.6, 1.8 - 2.5, 1.9 - 2.4, 2.0 -2.3, 2.1 - 2.2 ug/L de cobre. En modalidades adicionales, los medios de cultivo de células básales usados en los métodos de la presente invención son suplementados para resultar en aproximadamente 1.2 - 9.5, 1.4 - 9, 1.6 - 8.5, 1.8 - 8, 2.0 - 7.5, 2.2 - 7, 2.4 - 6.5, 2.6 - 6.0, 2.8 -5.5, 3.0 - 5.0, 3.2 - 4.5, 3.4 - 4, y 2 - 4 ug/L de cobre. En todavía otras modalidades, los medios de cultivo de células básales usados en los métodos de la presente invención son suplementados para resultar en aproximadamente 1-6, 2-5, 3-4 ug/L de cobre. En una modalidad, el medio de cultivo de células básales es suplementado con cobre para resultar en una concentración total de cobre de al menos 1 Ug/L. En otra modalidad, el medio de cultivo de células básales es suplementado con cobre para resultar en una concentración total de cobre de al menos 2 ug/L. En todavía otra modalidad, el medio de cultivo de células básales es suplementado con cobre para resultar en una concentración total de cobre de al menos 4 ug/L. En ciertas modalidades, el medio de cultivo de células básales es suplementado con cobre para resultar en una concentración total de cobre de al menos 1 g/L, o al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 µg/L de cobre, o más. En ciertas modalidades y como se discute en detalle adicional en la presente, cultivos para producir rA13 pueden contener desde aproximadamente 2 - 4 ug/L de cobre, mientras los cultivos para producción del rVWF pueden contener al menos 2 g/L de cobre.

Las concentraciones indicadas anteriormente son las concentraciones respectivas de cobre puro, en forma cúprica (Cu2+) . Si un derivado de cobre, por ejemplo, una sal hidratada, o un compuesto que comprende cobre, por ejemplo, un quelador de cobre, se usan, la cantidad de derivado o quelador se agrega de manera que la concentración final del cobre está en los intervalos descritos anteriormente. Por ejemplo, 2 ug/L de CuS04 · 5H20 son equivalentes a una concentración de cobre de aproximadamente 0.51 g/L (sin sulfate y 5H20) .

Ventajosamente, se ha encontrado que el uso del medio de cultivo celular en procesos de cultivo celular que resultan en bajas concentraciones de amonio (NH4+) en la solución de cultivo celular (es decir, en el sobrenadante del cultivo) resultan en la expresión de VWF recombinante y/o rA13 con actividades específicas superiores. Por consiguiente, en ciertas modalidades, la concentración de NH4+ del sobrenadante no es superior de 10 mM. En una modalidad preferida, la concentración de NH4+ del sobrenadante no es superior de 5 mM. En una modalidad preferida, la concentración de NH4+ del sobrenadante no es superior de 4 mM. En todavía otras modalidades, la concentración de NH4+ del sobrenadante no es superior de 10 mM, 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM, o menos.

Por consiguiente, en ciertas modalidades, los métodos y composiciones proporcionados en la presente dependen del uso de medios de cultivo de células básales suplementadas con cobre (por ejemplo, a una concentración final de al menos 2 pg/L) usadas en un proceso que resulta en una concentración de NH4+ de no superior de 10 mM en el sobrenadante. En todavía otras modalidades, el medio de cultivo de células básales es suplementado para proporcionar una concentración final de cobre y amonio de conformidad con cualquiera de las variaciones 1 a 440, como se proporciona en la Tabla 1.

Tabla 1. Modalidades Ejemplares de concentraciones de cobre y amonio presentes en el medio de cultivo y sobrenadante útiles para la expresión de proteínas recombinantes como se proporciona en la presente.

*ND = no definido *NMT = no más de *AL = al menos En algunas modalidades, los medios suplementados de cobre de la presente invención son producidos suplementando medio basal que es libre de proteína animal y/o químicamente modificado. Métodos para preparar medios de cultivo libres de proteína animal y químicamente definidos se conocen en la técnica, por ejemplo en las Patentes Estadounidenses Números 6,171,825 y 6,936,441, WO 2007/077217, y Publicación de Solicitud de Patentes Estadounidenses Números 2008/0009040 y 2007/0212770, las descripciones de las cuales se incorporan en la presente por referencia en sus totalidades para todos los propósitos. En una modalidad, el medio de cultivo basal usado en los métodos descritos en la presente es medio libre de oligopéptido o libre de proteína animal. En ciertas modalidades, el medio de cultivo puede ser químicamente modificado. En ciertas modalidades, los medios de cultivo pueden contener al menos una poliamina a una concentración de aproximadamente 0.5 mg/L hasta aproximadamente 10 mg/L.

En modalidades adicionales y en adición a cualquiera de la modalidad proporcionada anteriormente, se proporcionan medios de cultivo de la invención en los cuales un medio basal es suplementado con cobre y al menos uno de calcio, zinc, y/o vitamina B3. En ciertas modalidades, el medio puede ser un medio libre de proteína animal, libre de oligopéptido o químicamente definido. En ciertas modalidades, el medio libre de proteína animal o libre de oligopéptido se prepara como se muestra en las Patentes Estadounidenses Números 6,171,825 y 6,936,441, WO 2007/077217, y Publicación de Solicitud de Patentes Estadounidenses Números 2008/0009040 y 2007/0212770, las descripciones de las cuales se incorporan en la presente por referencia en sus totalidades para todos los propósitos, ambas de las cuales se incorporan en la presente por referencia en sus totalidades para todos los propósitos, y suplementado con cobre adicional y opcionalmente uno o más de calcio, zinc, y vitamina B3. En una modalidad específica, el medio de cultivo químicamente definido puede ser similar a una mezcla 1:1 de Medio de Eagel Modificado de Dulbecco/F12 de Ham (DMEM/F12 de Ham) , la cual ha sido suplementada con cobre adicional y opcionalmente calcio, zinc, y/o vitamina B3 , con el fin de incrementar la actividad específica de rV F o rA13 expresado en un cultivo celular en el medio. En todavía otras modalidades, el medio de cultivo está libre de componentes animales. En otra modalidad, el medio de cultivo contiene proteína, por ejemplo, proteína animal de suero tal como suero de bovino fetal. En otra modalidad, el cultivo tiene proteínas recombinantes exógenamente agregadas. En otra modalidad, las proteínas son de un animal libre de patógeno certificado.

En ciertas modalidades, los medios de cultivo contienen al menos una poliamina a una concentración de en o aproximadamente entre 0.5 mg/L y 30 mg/L. En otra modalidad, el medio de cultivo contiene al menos una poliamina en o aproximadamente entre 0.5 mg/L y 10 mg/L. En una modalidad, el medio de cultivo contiene al menos una poliamina en o aproximadamente entre 2 mg/L y 8 mg/L. En ciertas modalidades la poliamina es del grupo de ornitina, putrescina, espermina o espermidina, o similares. En una modalidad preferida, la poliamina es putrescina. En una modalidad específica, el medio de cultivo contiene en o aproximadamente entre 2 mg/L y 8 mg/L de putrescina.

En una modalidad, los medios de cultivo contienen al menos una poliamina a una concentración de en o aproximadamente entre 0.5 mg/L y 30 mg/L y una combinación de cobre y amonio de conformidad con cualquiera de las variaciones 1 a 440, como se expone en la Tabla 1. En otra modalidad, el medio de cultivo contiene al menos una poliamina en o aproximadamente entre 0.5 mg/L y 10 mg/L y una combinación de cobre y amonio de conformidad con cualquiera de las variaciones 1 a 440, como se expone en la Tabla 1. En una modalidad, el medio de cultivo contiene al menos una poliamina en o aproximadamente entre 2 mg/L y 8 mg/L y una combinación de cobre y amonio de conformidad con cualquiera de las variaciones 1 a 440, como se expone en la Tabla 1. En ciertas modalidades la poliamina es del grupo de ornitina, putrescina, espermina o espermidina, o similares. En una modalidad preferida, la poliamina es putrescina. En una modalidad específica, el medio de cultivo contiene en o aproximadamente entre 2 mg/L y 8 mg/L de putrescina y una combinación de cobre y amonio de conformidad con cualquiera de las variaciones 1 a 440, como se expone en la Tabla 1.

En aspectos adicionales, además del cobre, los medios de cultivo celular de uso en la presente invención pueden incluir además uno o más de: calcio adicional, zinc, una o más vitaminas, y cualquier combinación de los mismos.

En general, cualquier sal de calcio se puede usar para suplementar el medio de la invención, ejemplos no limitantes de sales aceptables incluyen CaCl2, CaCl2, CaFP03-2H20, Cal2, CaBr2 , (C2H302) 2Ca, (CH02)2Ca, (CsH706) 2Ca, (C6H50 ) 2Ca3 · 2H20, y similares. En ciertas modalidades, una sal farmacéuticamente aceptable de calcio se usa para suplementar los medios de cultivo de la invención.

En general, cualquier sal de zinc se puede usar para suplementar el medio de la invención, ejemplos no limitantes de sales aceptables incluyen, ZnS04-7H20, ZnS03-2H20, (C6H507) 2Zn3 · 2H20, ZnBr2, ZnBr2-2H20, ZnCl2, Zn (N03) 2 · 6H20, Zn (H2P04) 2 ·?20, (C2H302) 2??· 2H20, y similares. En ciertas modalidades, una sal farmacéuticamente aceptable de zinc se usa para suplementar los medios de cultivo de la invención. En otras modalidades, una preparación de péptido o proteína que contiene zinc, por ejemplo insulina, se puede usar con el suplemento del cultivo proporcionado en la presente .

En todavía aspectos adicionales, el medio de células básales suplementado con cobre y uno o más de los materiales adicionales discutidos anteriormente puede ser además usado en cultivos con bajos niveles de amonio en el sobrenadante. En ciertas modalidades, medios de cultivo celular suplementados de uso en la presente invención resultan en niveles de amonio en la solución de cultivo celular por debajo de 10 mM . En modalidades adicionales, los medios de cultivo celular suplementados de la presente invención se usan con niveles de amonio del cultivo celular desde aproximadamente 0.5 - 9.5, 1.0 - 9.0, 1.5 - 8.5, 2.0 -8.0, 2.5 - 7.5, 3.0 - 7.0, 3.5 - 6.5, 4.0 - 6.0, 4.5 - 5.5 mM.

En una modalidad, las concentraciones de cobre y amonio de un medio de cultivo celular y un sobrenadante de cultivo celular se mantienen por un periodo de tiempo prolongado durante el proceso de manufacturación. En una modalidad específica, las concentraciones de cobre y amonio de un cultivo celular se mantienen por la duración de un proceso de manufacturación, es decir, durante el tiempo en el cual rVWF o rA13 están siendo expresados y recuperados de un cultivo de células a gran escala. En ciertas modalidades, las concentraciones de cobre y amonio se mantienen en la solución del cultivo a un nivel de conformidad con cualquiera de las variaciones 1 a 440, como se expone en la Tabla 1. En una modalidad preferida las concentraciones de cobre y amonio se mantiene por el tiempo total de tal proceso de producción.

En algunas modalidades, el medio de cultivo proporcionado por la invención puede ser proporcionado en una forma líquida o una seca o polvo. El medio puede ser pre-alicuotado en una cantidad adecuada para uso único o proporcionado en una cantidad más grande que puede ser usada para más de un cultivo celular. En general, el medio de la invención se proporcionará en una forma estéril.

Detalles específicos de medios de cultivo celular de uso para producción del rVWF o rA13 se discuten abajo. Aunque los siguientes son discutidos con respecto a sus rVWF o rA13, se apreciará que cualquiera de la discusión proporcionada abajo con respecto a rVWF es aplicable para rA13, y vice versa.

A. Medios de Cultivo Celular del VWF Recombinante Un aspecto de la presente invención se refiere a una solución de cultivo celular para producir vWF recombinante, más específicamente, vWF de alto peso molecular que tiene una alta actividad específica, los cuales son además descritos en la presente. En una modalidad, la presente invención proporciona una solución de cultivo celular para producir vWF recombinante, de alto peso molecular, que comprende un medio de cultivo celular que comprende una concentración de cobre de al menos aproximadamente 2.4 ]ig/l¡ y una pluralidad de células que expresan vWF altamente multimérico que comprende aproximadamente 14 hasta aproximadamente 22 dímeros y una actividad del factor de Ristocetina específica de al menos aproximadamente 30 mU/ug.

En una modalidad, la solución de cultivo celular comprende además una concentración de amonio de menos de 10 mM. En una modalidad preferida, el cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 5 mM. En todavía otras modalidades, el cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 10 mM, o no más de 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM, o menos. En todavía otras modalidades, el cultivo celular tiene una concentración de cobre y amonio de conformidad con cualquiera de las variaciones 1 a 440, como se expone en la Tabla 1. En ciertas modalidades, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene por un periodo extendido a una concentración como se proporciona anteriormente. Por ejemplo, en una modalidad, la concentración de amonio se mantiene a una concentración baja por al menos 3 días, o al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, o más días. En una modalidad específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 5 mM por al menos 7 días. En otra modalidad específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 4 mM por al menos 7 días. En una modalidad específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 5 mM por al menos 14 días. En otra modalidad específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 4 mM por al menos 14 días. En todavía otra modalidad, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a un nivel bajo por la duración del proceso (es decir, para el tiempo total que el cultivo está siendo usado para producir rVWF) .

En una modalidad de la invención, los medios de cultivo . celular pueden comprender una concentración de cobre de al menos aproximadamente 2.4 g/L, en otra modalidad al menos aproximadamente 3 ]ig/L, en todavía otra modalidad al menos aproximadamente 4 ug/L, en todavía otra modalidad al menos aproximadamente 8 ug/L, en todavía otra modalidad al menos aproximadamente 10 µ9/ ?? , en todavía otra modalidad al menos aproximadamente 15 ug/L, y en una modalidad adicional al menos aproximadamente 20 ug/L.

En otras modalidades, la concentración de cobre en los medios de cultivo celular de la presente invención puede variar desde aproximadamente 2.4 ug/L hasta aproximadamente 20 ug/L, en otra modalidad desde aproximadamente 2.4 ug/L hasta aproximadamente 15 ug/L, en todavía otra modalidad desde aproximadamente 2.4 ug/L hasta aproximadamente 10 g/L, en todavía otra modalidad desde aproximadamente 2.4 ug/L hasta aproximadamente 8 g/L, en todavía otra modalidad desde aproximadamente 2.4 g/L hasta aproximadamente 6 ug/L, en todavía otra modalidad desde aproximadamente 2.4 g/L hasta aproximadamente 4 ug/L, en todavía otra modalidad desde aproximadamente 4 ug/L hasta aproximadamente 20 ug/L, en todavía otra modalidad desde aproximadamente 4 ug/L hasta aproximadamente 15 ig/L, en todavía otra modalidad desde aproximadamente 4 ug/L hasta aproximadamente 10 ug/L, en todavía otra modalidad desde aproximadamente 4 ug/L hasta aproximadamente 8 ug/L, y en una modalidad adicional desde aproximadamente 4 µg/L hasta aproximadamente 6 g/L.

La presente invención también proporciona kits para la expresión o producción de rVWF, los kits comprenden un medio de cultivo adecuado para la expresión de rVWF que tiene alta actividad específica.

B. Medios de Cultivo Celular ADAMTS13 (A13) En un aspecto, la presente invención proporciona medios de cultivo que son útiles para la expresión de proteínas ADAMTS que tienen altas actividades específicas. Ventajosamente, se ha encontrado que suplementando un medio de cultivo con cobre, que las actividades de enzimas ADAMTS recombinantes (por ejemplo, rADAMTS13) expresadas en células cultivadas en el medio suplementado son mayormente mejoradas, mientras las enzimas son expresadas a niveles tan altos, sino superiores, que las células cultivadas en medios no suplementados .

En un aspecto, la presente invención proporciona medios de cultivo celular suplementados con cobre para la expresión de proteínas ADAMTS13 recombinantes con alta actividad específica. En una modalidad, los medios son suplementados para resultar en una concentración total de cobre de desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 4 ug/L. En modalidades adicionales, los medios son suplementados para resultar en una concentración total de cobre de desde aproximadamente 1 - 3, 2 - 3, 3 - 4 g/L. En una modalidad, el medio contiene una concentración de cobre de al menos 1 ug/L. En otra modalidad, el medio contiene al menos 2 ug/L de cobre. En otra modalidad, el medio contiene al menos 4 ug/L de cobre. En otras modalidades, el medio contiene entre 2 ug/L y 20 ug/L de cobre. En otra modalidad, el medio contiene entre 1 u /L y 6 ug/L de cobre. En otra modalidad, el medio contiene entre 2 ug/L y 5 ug/L de cobre. En otra modalidad, el medio contiene entre 3 ug/L y 4 ug/L de cobre. En todavía otras modalidades, el medio contiene al menos 1 ug/L de cobre, o al menos 2 ug/L, 3 ug/L, 4 ug/L, 5 ug/L, 6 ug/L, 7 ug/L, 8 ug/L, ug/L, 10 ug/L, íi ug/L, 12 ug/L/ 13 ug/L, 14 ug/L, 15 ug/L, 16 ug/L, 17 ug/L, 18 ug/L, 19 ug/L, 20 ug/L, o superior concentraciones de cobre.

En una modalidad, la solución de cultivo celular comprende además una concentración de amonio de menos de 10 mM. En una modalidad preferida, la solución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 5 mM. En todavía otras modalidades, la solución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 10 mM, o no más de 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM, o menos. En todavía otras modalidades, la solución de cultivo celular tiene una concentración de cobre y amonio de conformidad con cualquiera de las variaciones 1 a 440, como se expone en la Tabla 1. En ciertas modalidades, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene por un periodo extendido a una concentración como se proporciona anteriormente. Por ejemplo, en una modalidad, la concentración de amonio se mantiene a una concentración baja por al menos 3 días, o al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, o más días. En una modalidad específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 5 mM por al menos 7 días. En otra modalidad específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 4 mM por al menos 7 días. En una modalidad específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 5 mM por al menos 14 días. En otra modalidad específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 4 mM por al menos 14 días. En todavía otra modalidad, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a un nivel bajo por la duración del proceso (es decir, para el tiempo total que el cultivo está siendo usado para producir rA13) .

En una modalidad, se proporciona un medio de cultivo para la expresión de una proteína ADAMTS recombinante (por ejemplo, rADAMTS13) que contiene al menos 1 g/L de cobre y al menos 2 µ? de zinc. En otras modalidades, el medio contiene al menos 2 ug/L de cobre o al menos 4 ug/L de cobre. En otra modalidad en donde el medio es suplementado con cobre, el medio de cultivo también contiene al menos en o aproximadamente 5 µ? de zinc. En una modalidad, el medio de cultivo también contiene en o aproximadamente entre 2 µ? y 12 µ? de zinc. En otra modalidad, el medio de cultivo también contiene en o aproximadamente entre 5 µ? y 12 µ? de zinc. En todavía otras modalidades, el medio de cultivo también pueden contener al menos en o aproximadamente 2 µ?, o al menos en o aproximadamente 3 µ?, 4 µ?, 5 µ?, 6 µ?, 7 µ?, 8 µ?, 9 µ?, 10 µ?, 11 µ?, 12 µ?, 13 µ?, 14 µ?, 15 µ?, 20 µ?, 25 µ?, 30 µ , o más zinc. En una modalidad, el medio de cultivo contiene una concentración de cobre y zinc de conformidad con cualquiera de las variaciones 441 a 880, como se expone en la Tabla 2.

Tabla 2. Modalidades Ejemplares de concentraciones de cobre y zinc presentes en medio .de cultivo útil para la expresión de una proteína ADAMTS13 recombinante.

*AL = al menos En una modalidad, la solución de cultivo celular comprende además una baja concentración de amonio. En una modalidad, la solución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de menos de 10 mM y una concentración de cobre y zinc de conformidad con cualquiera de las variaciones 441 a 880, como se expone en la Tabla 2. En una modalidad específica, el amonio se mantiene a una concentración de no más de 10 mM por al menos 7 dias . En una modalidad preferida, la solución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 6 mM y una concentración de cobre y zinc de conformidad con cualquiera de las variaciones 441 a 880, como se expone en la Tabla 2. En una modalidad específica, el amonio se mantiene a una concentración de no más de 6 mM por al menos 7 días. En otra modalidad preferida, la solución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 5 mM y una concentración de cobre y zinc de conformidad con cualquiera de las variaciones 441 a 880, como se expone en la Tabla 2. En una modalidad específica, el amonio se mantiene a una concentración de no más de 5 mM por al menos 7 días. En otra modalidad preferida, la solución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 4 mM y una concentración de cobre y zinc de conformidad con cualquiera de las variaciones 441 a 880, como se expone en la Tabla 2. En una modalidad específica, el amonio se mantiene a una concentración de no más de 4 mM por al menos 7 días. En todavía otras modalidades, la solución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 10 mM, o no más de 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM, o menos y una concentración de cobre y zinc de conformidad con cualquiera de las variaciones 441 a 880, como se expone en la Tabla 2. En todavía otra modalidad específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a un nivel bajo por la duración del proceso (es decir, para el tiempo total que el cultivo está siendo usado para producir rA13) .

En una modalidad, se proporciona un medio de cultivo para la expresión de una proteína ADAMTS recombinante (por ejemplo, rADAMTS13) que contiene al menos 1 ug/L de cobre y al menos en o aproximadamente 0.5 mM de calcio. En otras modalidades, el medio contiene al menos 2 g/L de cobre o al menos 4 ug/L de cobre. En otra modalidad en donde el medio es suplementado con cobre, el medio de cultivo también contiene al menos 1.5 mM de calcio. En una modalidad, el medio de cultivo contiene en o aproximadamente entre 0.5 mM y 1.5 mM de calcio. En todavía otras modalidades, el medio de cultivo pueden contener al menos en o aproximadamente 0.5 mM, o al menos en o aproximadamente 0.6 mM, 0.7 mM, 0.8 mM, 0.9 mM, 1.0 mM, 1.1 mM, 1.2 mM, 1.3 mM, 1.4 mM, 1.5 mM, 1.6 mM, 1.7 mM, 1.8 mM, 1.9 mM, 2.0 mM, 2.25 mM, 2.5 mM, 2.75 mM, 3.0 mM, 3.5 mM, 4.0 mM, 4.5 mM, 5.0 mM, o más calcio. En una modalidad, el medio de cultivo contiene una concentración de cobre y calcio de conformidad con cualquiera de las variaciones 881 a 1320, como se expone en la Tabla 3.

Tabla 3. Modalidades Ejemplares de concentraciones de cobre y calcio presentes en medio de cultivo útil para la expresión de una proteína ADAMTS13 recombinante.

*AL = al menos En una modalidad, la solución de cultivo celular comprende además una baja concentración de amonio. En una modalidad, la solución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de menos de 10 mM y una concentración de cobre y calcio de conformidad con cualquiera de las variaciones 881 a 1320, como se expone en la Tabla 3. En una modalidad específica, el amonio se mantiene a una concentración de no más de 10 mM por al menos 7 días. En una modalidad preferida, el medio de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 6 mM y una concentración de cobre y calcio de conformidad con cualquiera de las variaciones 881 a 1320, como se expone en la Tabla 3. En una modalidad específica, el amonio se mantiene a una concentración de no más de 6 mM por al menos 7 días. En otra modalidad preferida, el medio de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 5 mM y una concentración de cobre y calcio de conformidad con cualquiera de las variaciones 881 a 1320, como se expone en la Tabla 3. En una modalidad específica, el amonio se mantiene a una concentración de no más de 5 mM por al menos 7 días . En otra modalidad preferida, el medio de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 4 mM y una concentración de cobre y calcio de conformidad con cualquiera de las variaciones 881 a 1320, como se expone en la Tabla 3. En una modalidad específica, el amonio se mantiene a una concentración de no más de 4 mM por al menos 7 días. En todavía otras modalidades, el medio de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 10 mM, o no más de 9 mM, 8 mM, 7 ni, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM, o menos y una concentración de cobre y calcio de conformidad con cualquiera de las variaciones 881 a 1320, como se expone en la Tabla 3. En todavía otra modalidad específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a un nivel bajo por la duración del proceso (es decir, para el tiempo total que el cultivo está siendo usado para producir rA13) .

En una modalidad, el medio de cultivo celular es suplementado con cobre, zinc y calcio. En una modalidad específica, el medio de cultivo tiene una concentración de calcio de al menos 0.5 mM y una concentración de cobre y zinc de conformidad con cualquiera de las variaciones 441 a 880, como se expone en la Tabla 2. En otra modalidad específica, el medio de cultivo tiene una concentración de calcio de al menos 1.5 mM y una concentración de cobre y zinc de conformidad con cualquiera de las variaciones 441 a 880, como se expone en la Tabla 2. En otra modalidad específica, el medio de cultivo tiene una concentración de calcio entre 0.5 mM y 1.5 mM y una concentración de cobre y zinc de conformidad con cualquiera de las variaciones 441 a 880, como se expone en la Tabla 2. En todavía otras modalidades, el medio de cultivo tiene una concentración de calcio de al menos 0.6 mM, 0.7 mM, 0.8 mM, 0.9 mM, 1.0 mM, 1.1 mM, 1.2 mM, 1.3 mM, 1.4 mM, 1.5 mM, 1.6 mM, 1.7 mM, 1.8 mM, 1.9 mM, 2.0 mM, 2.25 mM, 2.5 mM, 2.75 mM, 3.0 mM, 3.5 mM, 4.0 mM, 4.5 mM, 5.0 mM( o más, y una concentración de cobre y zinc de conformidad con cualquiera de las variaciones 441 a 880, como se expone en la Tabla 2.

En una modalidad, se proporciona un medio de cultivo para la expresión de una proteína ADAMTS recombinante (por ejemplo, rADAMTS13) que contiene al menos 1 ug/L de cobre y al menos 2 mg/L de nicotinamida (vitamina B3) . En otras modalidades, el medio contiene al menos 2 ug/L de cobre o al menos 4 ug/L de cobre. En otra modalidad en donde el medio es suplementado con cobre, el medio de cultivo también contiene al menos 7 mg/L de nicotinamida (vitamina B3) . En una modalidad, el medio de cultivo contiene en o aproximadamente entre 2 mg/L y 10 mg/L de nicotinamida (vitamina B3) . En todavía otras modalidades, el medio de cultivo pueden contener al menos en o aproximadamente 2 mg/L, 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, 6 mg/L, 7 mg/L, 8 mg/L, 9 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L, o superior concentraciones de nicotinamida (vitamina B3) . En una modalidad, el medio de cultivo contiene una concentración de cobre y nicotinamida de conformidad con cualquiera de las variaciones 1321 a 1760, como se expone en la Tabla 4.

Tabla 4. Modalidades Ejemplares de concentraciones de cobre y nicotinamida presentes en medio de cultivo útil para la expresión de una proteína ADAMTS13 recombinante .

*AL = a menos En una modalidad, la solución de cultivo celular comprende además una baja concentración de amonio. En una modalidad, el medio de cultivo comprende una concentración de amonio de menos de 10 mM y una concentración de cobre y nicotinamida de conformidad con cualquiera de las variaciones 1321 a 1760, como se expone en la Tabla 4. En una modalidad específica, el amonio se mantiene a una concentración de no más de 10 mM por al menos 7 días. En una modalidad preferida, la solución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 6 mM y una concentración de cobre y nicotinamida de conformidad con cualquiera de las variaciones 1321 a 1760, como se expone en la Tabla 4. En una modalidad específica, el amonio se mantiene a una concentración de no más de 6 mM por al menos 7 días. En otra modalidad preferida, la solución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 5 mM y una concentración de cobre y nicotinamida de conformidad con cualquiera de las variaciones 1321 a 1760, como se expone en la Tabla 4. En una modalidad específica, el amonio se mantiene a una concentración de no más de 5 mM por al menos 7 días. En otra modalidad preferida, la solución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 4 mM y una concentración de cobre y nicotinamida de conformidad con cualquiera de las variaciones 1321 a 1760, como se expone en la Tabla 4. En una modalidad específica, el amonio se mantiene a una concentración de no más de 4 mM por al menos 7 días. En todavía otras modalidades, la solución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 10 mM, o no más de 9 mM, 8 itiM, 7 mM, 6 mM, 5 itiM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, l mM, o menos y una concentración de cobre y nicotinamida de conformidad con cualquiera de las variaciones 1321 a 1760, como se expone en la Tabla 4. En todavía otra modalidad específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a un nivel bajo por la duración del proceso (es decir, para el tiempo total que el cultivo está siendo usado para producir rA13) .

En una modalidad, el medio de cultivo celular es suplementado con cobre, zinc y nicotinamida. En una modalidad específica, el medio de cultivo tiene una concentración de nicotinamida de al menos 2 mg/mL y una concentración de cobre y zinc de conformidad con cualquiera de las variaciones 441 a 880, como se expone en la Tabla 2. En otra modalidad específica, el medio de cultivo tiene una concentración de nicotinamida de al menos 7 mg/mL mM y una concentración de cobre y zinc de conformidad con cualquiera de las variaciones 441 a 880, como se expone en la Tabla 2. En otra modalidad específica, el medio de cultivo tiene una concentración de nicotinamida entre 2 mg/mL y 10 mg/mL y una concentración de cobre y zinc de conformidad con cualquiera de las variaciones 441 a 880, como se expone en la Tabla 2. En todavía otras modalidades, el medio de cultivo tiene una concentración de nicotinamida de al menos 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, 5 mg/mL, 6 mg/mL, 7 mg/mL, 8 mg/mL, 9 mg/mL, 10 mg/mL, 11 mg/mL, 12 mg/mL, 13 mg/mL, 14 mg/mL, 15 mg/mL, o más, y una concentración de cobre y zinc de conformidad con cualquiera de las variaciones 441 a 880, como se expone en la Tabla 2.

En una modalidad, el medio de cultivo celular es suplementado con cobre, calcio y nicotinamida . En una modalidad específica, el medio de cultivo tiene una concentración de nicotinamida de al menos 2 mg/mL y una concentración de cobre y calcio de conformidad con cualquiera de las variaciones 881 a 1320, como se expone en la Tabla 3. En otra modalidad específica, el medio de cultivo tiene una concentración de nicotinamida de al menos 7 mg/mL mM y una concentración de cobre y calcio de conformidad con cualquiera de las variaciones 881 a 1320, como se expone en la Tabla 3. En otra modalidad específica, el medio de cultivo tiene una concentración de nicotinamida entre 2 mg/mL y 10 mg/mL y una concentración de cobre y calcio de conformidad con cualquiera de las variaciones 881 a 1320, como se expone en la Tabla 3. En todavía otras modalidades, el medio de cultivo tiene una concentración de nicotinamida de al menos 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, 5 mg/mL, 6 mg/mL, 7 mg/mL, 8 mg/mL, 9 mg/mL, 10 mg/mL, 11 mg/mL, 12 mg/mL, 13 mg/mL, 14 mg/mL, 15 mg/mL, o más, y una concentración de cobre y calcio de conformidad con cualquiera de las variaciones 881 a 1320, como se expone en la Tabla 3.

IV. Métodos para la Producción de Factores Sanguíneos que Tienen Alta Actividad Específica A. Métodos de Cultivo Celular La presente invención proporciona métodos para producción a gran escala de proteínas recombi antes (tales como rVWF y rA13) . En ciertas modalidades, tales métodos de producción a gran escala utilizan reactores de tanque agitado/removido para la manufactura de estas proteínas recombinantes terapéuticas.

En ciertas modalidades, los métodos de la presente invención pueden comprender el uso de un sistema de cultivo celular operado bajo un modo de operación por lotes o continuo. Por ejemplo, cuando se utilizan cultivos celulares por lotes, pueden ser operados bajo modo de lote único, lote alimentado o lote repetido. Del mismo modo, los cultivos celulares continuos pueden ser operados bajo, por ejemplo, modo perfusión, turbidostático o quimiostático . El cultivo celular por lotes y continuo puede ser realizado bajo ya sea condiciones de suspensión o adherencia. Cuando se opera bajo condiciones de suspensión, las células serán libremente suspendidas y mezcladas dentro del medio de cultivo. AlteARNtivamente , bajo condiciones de adherencia, las células se unirán a una fase sólida, por ejemplo, un microportador, un microportador poroso, portador de disco, cartucho de cerámica, fibra hueca, lámina plana, matriz de gel, y similares .

Un cultivo de lotes es típicamente un cultivo celular a gran escala en el cual un inoculo celular se cultiva a una densidad máxima en un tanque o termentador, y se cosecha y procesa como un lote único. Un cultivo de lote alimentado es típicamente un cultivo de lotes el cual es suministrado con ya sea nutrientes frescos (por ejemplo, sustratos que limitan el crecimiento) o aditivos (por ejemplo, precursores a productos) . La solución alimentada es usualmente altamente concentrada para evitar dilución del biorreactor. En un cultivo de lote repetido, las células son conocidas en un medio de cultivo y crecen a una densidad celular deseada. Para evitar el comienzo de un decline de fase y muerte celular, el cultivo es entonces diluido con medio de crecimiento completo antes que las células alcances su máxima concentración. La cantidad y frecuencia de dilución varían ampliamente y dependen de las características de crecimiento de la línea celular y conveniencia del proceso de cultivo. El proceso puede ser repetido tantas veces como se requiera y, a menos que las células y medios se desechen en el sub-cultivo, el volumen del cultivo incrementará por etapas conforme se hace cada dilución. El incremento del volumen puede ser manejado teniendo un reactor de suficiente tamaño para . permitir diluciones dentro del recipiente o dividir el cultivo diluido en varios recipientes. La razón de este tipo de cultivo es mantener las células en un estado exponencialmente de crecimiento. El subcultivo serial se caracteriza en que el volumen del cultivo es siempre en forma de etapas incrementadas, pueden existir múltiples recolectores, las células pueden continuar creciendo y el proceso puede continuar tan largo como se desee. En ciertas modalidades, una proteína ADAMTS recombinante (por ejemplo, rADAMTS13) puede ser recuperada después de recolectar el sobrenadante de un cultivo de lotes. En otras modalidades, un VWF recombinante puede ser recuperado después de recolectar el sobrenadante de un cultivo de lotes.

Un cultivo continuo puede ser una suspensión de cultivo que es continuamente aplicado con nutrientes por el flujo de entrada de medio fresco, en donde el volumen del cultivo se mantiene usualmente constante por la remoción concomitante de medio consumido. En métodos quimiostáticos y turbidostáticos , el medio extraído contiene células. De este modo, las células que permanecen en el recipiente de cultivo celular deben crecer para mantener un estado listo. En el método quimiostático, la velocidad de crecimiento es típicamente controlada por el control de la velocidad de dilución, es decir, la velocidad en la cual se agrega el medio fresco. La velocidad de crecimiento de las células en el cultivo puede ser controlada, por ejemplo, a una velocidad de crecimiento sub-máxima, por alteración de la velocidad de dilución. Por el contrario, en el método turbidostático, la velocidad de dilución se ajusta para permitir la máxima velocidad de crecimiento que las células pueden lograr en las condiciones de operación dadas, tales como pH y temperatura. En ciertas modalidades, el rVWF o rA13 se recupera después de recolectar el sobrenadante de un cultivo continuo. Un método ejemplar para cultivo celular continuo se describe en el documento WO/2011/012725 (Grillberger et al.), el contenido del cual está de este modo incorporado por referencia en su totalidad para todos los propósitos.

En un cultivo de perfusión, el medio extraído es agotado de las células, las cuales se retienen en el recipiente de cultivo, por ejemplo, por filtración o por métodos centrífugos que conducen a la reintroducción de células en el cultivo. Sin embargo, típicamente membranas usadas para filtración no retienen 100% de las células y así una proporción es removida cuando el medio es extraído. No puede ser crucial operar cultivos de perfusión a velocidades de crecimiento muy altas, ya que la mayoría de las células son retenidas en el recipiente de cultivo. En ciertas modalidades, el rVWF o rA13 se recupera después de recolectar el sobrenadante de un cultivo de perfusión.

El sistema de reactor de tanque agitado puede ser usado para cultivos celulares de lotes y continuos operados bajo modos de suspensión o adherentes . En general, el sistema de reactor de tanque agitado puede ser operado como cualquier reactor de tanque agitado convencional con cualquier tipo de agitador tal como un Rushton, hidrodeslizador, hoja aguda o marino .

En ciertas modalidades, los métodos de cultivo celular de la invención pueden comprender el uso de un microportador . En algunas modalidades, los cultivos celulares de las modalidades pueden ser realizados en biorreactores grandes bajo condiciones adecuadas para proporcionar áreas de superficie de cultivo de alto volumen específicos para lograr altas densidades celular y expresión de proteína. Un medio para proporcionar tales condiciones de crecimiento es usar microportadores para cultivo celular en biorreactores de tanque agitado. El concepto de crecimiento celular en microportadores fue primero descrito por van Wezel (van Wezel, A.L., Nature 216:64-5 (1967)) y permite la unión celular en la superficie de partículas sólidas pequeñas suspendidas en el medio de crecimiento. Estos métodos proporcionan altas relaciones de superficie a volumen y de este modo permiten la eficiente uso de nutrientes. Además, para expresión de proteínas secretadas en líneas de células eucarióticas , la relación de superficie a volumen incrementada permite niveles superiores de secreción superior y de este modo rendimientos de proteína superiores en el sobrenadante del cultivo. Finalmente, estos métodos permiten la fácil escala de cultivos de expresión eucariótica.

Las células que expresan vWF y/o rA13 se pueden unir a un microportador esférico o poroso durante el crecimiento del cultivo celular. El microportador puede ser un microportador seleccionado del grupo de microportadores con base en dextrano, colágeno, plástico, gelatina y celulosa y otros como se describe en Butler (1988. In: Spier & Griffiths, Animal Cell Biotechnology 3:283-303). También es posible hacer crecer las células en una biomasa en microportadores esféricos y subcultivar las células cuando han alcanzado biomasa de termentador final y previo a la producción de la proteína expresada en un microportador poroso o vice versa. Microportadores esféricos adecuados pueden incluir microportadores de superficie lisa, tales como Cytodex™ 1, Cytodex™ 2, y Cytodex™ 3 (GE Healthcare) y microportadores macroporosos tales como Cytopore™ 1, Cytopore™ 2, Cytoline™ 1, y Cytoline™ 2 (GE Healthcare) .

Como se describe anteriormente, la presente invención incluye medios de cultivo celular que tienen una concentración incrementada de cobre. Se entiende que todas las modalidades y concentraciones descritas en la sección "Medios de cultivo celular" anterior pueden ser aplicados a los métodos de la presente invención descritos en la presente .

En ciertas modalidades, el cultivo puede ser mantenido por al menos aproximadamente 7 días, o al menos aproximadamente 14 días, 21 días, 28 días, o al menos aproximadamente 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, o al menos aproximadamente 2 meses, o 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses o más. La densidad celular en la cual un cultivo celular se mantiene para producción de una proteína vWF recombinante o rA13 recombinante dependerá de las condiciones del cultivo y medio usado para la expresión de la proteína. Un experto en la técnica será fácilmente capaz de determinar la densidad celular óptima para producción de un cultivo celular del rV F o rA13. En una modalidad, el cultivo se mantiene a una densidad celular de entre aproximadamente 0.5xl06 y 4xl07 células/mL por un periodo extendido de tiempo. En otras modalidades, la densidad celular se mantiene a una concentración de entre aproximadamente l.OxlO6 y aproximadamente l.OxlO7 células/mL por un periodo extendido de tiempo. En otras modalidades, la densidad celular se mantiene a una concentración de entre aproximadamente l.OxlO6 y aproximadamente 4.0xl06 células/mL por un periodo extendido de tiempo. En otras modalidades, la densidad celular se mantiene a una concentración de entre aproximadamente l.OxlO6 y aproximadamente 4.0xl06 células/mL por un periodo extendido de tiempo. En todavía otras modalidades, la densidad celular puede ser mantenida a una concentración entre aproximadamente 2.0xl06 y aproximadamente 4. OxlO6 células/mL, o entre aproximadamente 1.0x10s y aproximadamente 2.5xl06 células/mL, o entre aproximadamente 1.5xl06 y aproximadamente 3.5xl06 células/mL, o cualquier otro intervalo similar, por un periodo extendido de tiempo.

En una modalidad, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 4. OxlO6 células/mL por al menos 7 días. En una modalidad específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 4. OxlO6 células/mL por al menos 14 días. En una modalidad más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 4. OxlO6 células/mL por al menos 21 días. En una modalidad todavía más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 4. OxlO6 células/mL por al menos 28 días. En una modalidad todavía más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 4. OxlO6 células/mL por al menos 5 semanas. En una modalidad todavía más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 4. OxlO6 células/mL por al menos 6 semanas. En una modalidad todavía más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 4.0xl06 células/mL por al menos 7 semanas. En una modalidad todavía más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 4.0xl06 células/mL por al menos 8 semanas. En una modalidad todavía más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 4.0xl06 células/mL por al menos 9 semanas .

En una modalidad, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 3.5xl06 células/mL por al menos 7 días. En una modalidad específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 3.5xl06 células/mL por al menos 14 días. En una modalidad más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 3.5xl06 células/mL por al menos 21 días. En una modalidad todavía más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 3.5xl06 células/mL por al menos 28 días. En una modalidad todavía más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 3.5xl06 células/mL por al menos 5 semanas. En una modalidad todavía más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 3.5xl06 células/mL por al menos 6 semanas. En una modalidad todavía más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 3.5xl06 células/mL por al menos 7 semanas. En una modalidad todavía más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 3.5xl06 células/mL por al menos 8 semanas. En una modalidad todavía más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 3.5xl06 células/mL por al menos 9 semanas .

En una modalidad, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 3.0xl06 células/mL por al menos 7 días. En una modalidad específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 3. OxlO6 células/mL por al menos 14 días. En una modalidad más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 3.0xl06 células/mL por al menos 21 días. En una modalidad todavía más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 3.0xl06 células/mL por al menos 28 días. En una modalidad todavía más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 3.0xl06 células/mL por al menos 5 semanas. En una modalidad todavía más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 3.0xl06 células/mL por al menos 6 semanas. En una modalidad todavía más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 3.0x10s células/mL por al menos 7 semanas. En una modalidad todavía más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 3. OxlO6 células/mL por al menos 8 semanas. En una modalidad todavía más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 3. OxlO6 células/mL por al menos 9 semanas .

En una modalidad, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 2.5xl06 células/mL por al menos 7 días. En una modalidad específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 2.5xl06 células/mL por al menos 14 días. En una modalidad más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 2.5xl06 células/mL por al menos 21 días. En una modalidad todavía más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 2.5xl06 células/mL por al menos 28 días. En una modalidad todavía más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 2.5xl06 células/mL por al menos 5 semanas. En una modalidad todavía más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 2.5xl06 células/mL por al menos 6 semanas. En una modalidad todavía más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 2.5xl06 células/mL por al menos 7 semanas. En una modalidad todavía más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 2.5xl06 células/mL por al menos 8 semanas. En una modalidad todavía más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 2.5xl06 células/mL por al menos 9 semanas .

En otra modalidad, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 2.0xl06 células/mL por al menos 7 días. En una modalidad específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 2.0xl06 células/mL por al menos 14 días. En una modalidad más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 2.0xl06 células/mL por al menos 21 días. En una modalidad todavía más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 2.0xl06 células/mL por al menos 28 días. En una modalidad todavía más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 2.0xl06 células/mL por al menos 5 semanas. En una modalidad todavía más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 2.0xl06 células/mL por al menos 6 semanas. En una modalidad todavía más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 2. OxlO6 células/mL por al menos 7 semanas. En una modalidad todavía más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 2. OxlO6 células/mL por al menos 8 semanas. En una modalidad todavía más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 2. OxlO6 células/mL por al menos 9 semanas.

En una modalidad, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 1.5xl06 células/mL por al menos 7 días. En una modalidad específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 1.5xlOe células/mL por al menos 14 días. En una modalidad más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 1.5xl06 células/mL por al menos 21 días. En una modalidad todavía más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 1.5xl06 células/mL por al menos 28 días. En una modalidad todavía más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 1.5xl06 células/mL por al menos 5 semanas. En una modalidad todavía más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 1.5xl06 células/mL por al menos 6 semanas. En una modalidad todavía más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 1.5xl06 células/mL por al menos 7 semanas. En una modalidad todavía más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 1.5xl06 células/mL por al menos 8 semanas. En una modalidad todavía más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en la presente se mantiene a una concentración de no más de 1.5xl06 células/mL por al menos 9 semanas .

Lo siguiente proporciona detalles específicos en métodos para la producción del rV F y rA13. Como se apreciará, aunque las condiciones son presentadas específicamente para rWF o rA13, las condiciones para rV F pueden ser usadas para producir rA13 y vice versa.

B. Métodos para Producir vWF Recombinante de Alto Peso Molecular En otro aspecto, la presente invención se refiere además a métodos para producir vWF bajo condiciones de cultivo que comprenden un medio de cultivo celular que tiene una concentración incrementada de cobre. En ciertas modalidades, el cultivo también comprende una baja concentración de amonio. Como se usa en la presente, el término "cultivo celular" y "solución de cultivo celular" son usados intercambiablemente.

En una modalidad, la presente invención proporciona un método para producir un vWF recombinante, de alto peso molecular, que comprende: a) proporcionar un cultivo de células; b) introducir una secuencia de ácido nucleico codificante para vWF; c) seleccionar las células que llevan la secuencia de ácido nucleico; y, d) expresar el vWF en las células bajo condiciones de cultivo que comprenden un medio de cultivo celular que comprende una concentración de cobre de al menos aproximadamente 2.4 ug/L y un sobrenadante de cultivo celular que comprende una concentración de amonio menos de aproximadamente 10 mM, en donde el vWF es vWF altamente multimérico que comprende aproximadamente 14 hasta aproximadamente 22 dímeros y una actividad específica de Ristoce ina de al menos aproximadamente 30 mU/ug. En modalidades adicionales, el rVWF multimérico producido usando métodos de la presente invención comprende aproximadamente 10-30, 12-28, 14-26, 16-24, 18-22, 20-21 dímeros. En aún modalidades adicionales, el rVWF producido de conformidad con la presente invención tiene una actividad específica de al menos aproximadamente 20, 22.5, 25, 27.5, 30, 32.5, 35, 37.5, 40, 42.5, 45, 47.5, 50, 52.5, 55, 57.5, 60, 62.5, 65, 67.5, 70, 72.5, 75, 77.5, 80, o más mü/ig. En una modalidad específica, la densidad celular del cultivo celular continuo para producción del rVWF se mantiene a una concentración de no más de 2.5xl06 células/mL por un periodo extendido. En otras modalidades específicas, la densidad celular se mantiene a no más de 2.0xl06 células/mL, 1.5xl06 células/mL, 1.0x10s células/mL, 0.5xl06 células/mL, o menos. En una modalidad, la densidad celular se mantiene a entre 1.5xl06 células/mL y 2.5xl06 células/mL.

En una modalidad, la presente invención proporciona un método para producir una composición del Factor Von illebrand recombinante (rVWF) , el método comprende las etapas de: (a) proporcionar un medio de cultivo de células básales; (b) suplementar el medio de cultivo de células básales con cobre para proporcionar una concentración de cobre final de al menos 2.0 ug/L; (c) proporcionar una o más células que comprenden un ácido nucleico que codifica una proteína del rvWF; (d) cultivar una o más células en el medio de cultivo de células suplementadas con cobre de manera que el rVWF se expresa y excreta de las células en un cultivo de sobrenadante; y (e) recuperar al menos una porción del cultivo sobrenadante, en donde el sobrenadante recuperado tiene una actividad del cofactor de ristocetina específico del rVWF de al menos 30 mU/ug del rVWF. En una modalidad, la solución de cultivo celular comprende además una concentración de amonio de menos de 10 mM. En otra modalidad específica, la concentración de amonio de la solución de cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 10 mM por al menos 7 días. En una modalidad preferida, la solución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 5 mM. En otra modalidad específica, la concentración de amonio de la solución de cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 5 mM por al menos 7 días. En una modalidad preferida, la solución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 4 mM. En otra modalidad específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 4 mM por al menos 7 días. En todavía otras modalidades, la solución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 10 mM, o no más de 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 M, 5 mM, 4 mM, 3 "mM, 2 mM, 1 mM, o menos. En todavía otra modalidad, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a un nivel bajo por la duración del proceso (es decir, para el tiempo total que el cultivo está siendo usado para producir rVWF) . En una modalidad preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 50 mU/ g del rVWF. En una modalidad más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 70 mU/ug del rVWF.

En una modalidad del método descrito anteriormente, el medio de cultivo de células básales es suplementado con cobre para proporcionar una concentración de cobre final de al menos 2.4 ug/L. En una modalidad, la solución de cultivo celular comprende además una concentración de amonio de menos de 10 mM. En otra modalidad específica, la concentración de amonio de la solución de cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 10 mM por al menos 7 días. En una modalidad preferida, la solución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 5 mM. En otra modalidad específica, la concentración de amonio de la solución de cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 5 mM por al menos 7 días. En una modalidad preferida, la solución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 4 mM. En otra modalidad específica, la concentración de amonio de la solución de cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 4 mM por al menos 7 días. En todavía otras modalidades, la solución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 10 mM, o no más de 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM, o menos. En todavía otra modalidad, la concentración de amonio de la solución de cultivo celular se mantiene a un nivel bajo por la duración del proceso (es decir, para el tiempo total que el cultivo está siendo usado para producir rVWF) . En una modalidad preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 50 mU/ug del rVWF. En una modalidad más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 70 mU/ g del rVWF.

En una modalidad del método descrito anteriormente, el medio de cultivo de células básales es suplementado con cobre para proporcionar una concentración de cobre final de al menos 3 ug/L. En una modalidad, la solución de cultivo celular comprende además una concentración de amonio de menos de 10 mM. En otra modalidad específica, la concentración de amonio de la solución de cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 10 mM por al menos 7 días. En una modalidad preferida, la solución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 5 mM. En otra modalidad específica, la concentración de amonio de la solución de cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 5 mM por al menos 7 días. En una modalidad preferida, la solución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 4 mM. En otra modalidad específica, la concentración de amonio de la solución de cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 4 mM por al menos 7 días. En todavía otras modalidades, la solución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 10 mM, o no más de 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM, o menos. En todavía otra modalidad, la concentración de amonio de la solución de cultivo celular se mantiene a un nivel bajo por la duración del proceso (es decir, para el tiempo total que el cultivo está siendo usado para producir rVWF) . En una modalidad preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 50 mü/]ig del rVWF. En una modalidad más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 70 mU/^g del rVWF.

En una modalidad del método descrito anteriormente, el medio de cultivo de células básales es suplementado con cobre para proporcionar una concentración de cobre final de al menos 4 ug/L. En una modalidad, la solución de cultivo celular comprende además una concentración de amonio de menos de 10 mM. En otra modalidad específica, la concentración de amonio de la solución de cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 10 mM por al menos 7 días. En una modalidad preferida, la solución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 5 mM. En otra modalidad específica, la concentración de amonio de la solución de cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 5 mM por al menos 7 días. En una modalidad preferida, la solución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 4 mM. En otra modalidad específica, la concentración de amonio de la solución de cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 4 mM por al menos 7 días. En todavía otras modalidades, los medios de cultivo celular comprenden una concentración de amonio de no más de 10 mM, o no más de 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM, o menos. En todavía otra modalidad, la concentración de amonio de la solución de cultivo celular se mantiene a un nivel bajo por la duración del proceso (es decir, para el tiempo total que el cultivo está siendo usado para producir rVWF) . En una modalidad preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 50 mU/ug del rVWF. En una modalidad más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 70 mU^g del rVWF.

En una modalidad del método descrito anteriormente, el medio de cultivo de células básales es suplementado con cobre para proporcionar una concentración final de cobre de aproximadamente 4.3 ]ig/l>. En una modalidad, la solución de cultivo celular comprende además una concentración de amonio de menos de 10 mM. En otra modalidad específica, la concentración de amonio de la solución de cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 10 mM por al menos 7 días. En una modalidad preferida, la solución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 5 mM. En otra modalidad específica, la concentración de amonio de la solución de cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 5 mM por al menos 7 días. En una modalidad preferida, la solución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 4 mM. En otra modalidad específica, la concentración de amonio de la solución de cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 4 mM por al menos 7 días. En todavía otras modalidades, la solución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 10 mM, o no más de 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM, o menos. En todavía otra modalidad, la concentración de amonio de la solución de cultivo celular se mantiene a un nivel bajo por la duración del proceso (es decir, para el tiempo total que el cultivo está siendo usado para producir rVWF) . En una modalidad preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 50 xnü/]ig del rVWF. En una modalidad más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 70 mü/ig del rVWF.

En una modalidad del método descrito anteriormente, el medio de cultivo de células básales es suplementado con cobre para proporcionar una concentración final de cobre de entre 2 yg/L y 20 ug/L. En una modalidad, la solución de cultivo celular comprende además una concentración de amonio de menos de 10 mM. En otra modalidad específica, la concentración de amonio de la solución de cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 10 mM por al menos 7 días. En una modalidad preferida, la solución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 5 mM. En otra modalidad específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 5 mM por al menos 7 días . En una modalidad preferida, la solución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 4 mM. En otra modalidad específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 4 mM por al menos 7 días. En todavía otras modalidades, la solución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 10 mM, o no más de 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM, o menos. En todavía otra modalidad, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a un nivel bajo por la duración del proceso (es decir, para el tiempo total que el cultivo está siendo usado para producir rVWF) . En una modalidad preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 50 mU/ g del rVWF. En una modalidad más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 70 mU/pg del rVWF.

En una modalidad del método descrito anteriormente, el medio de cultivo de células básales es suplementado con cobre para proporcionar una concentración final de cobre de entre 3 ug/L y 10 ug/L. En una modalidad, la solución de cultivo celular comprende además una concentración de amonio de menos de 10 mM. En otra modalidad específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 10 mM por al menos 7 días. En una modalidad preferida, la solución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 5 mM. En otra modalidad específica, la concentración de amonio de la solución de cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 5 mM por al menos 7 días. En una modalidad preferida, la solución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 4 mM. En otra modalidad específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 4 mM por al menos 7 días. En todavía otras modalidades, la solución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 10 mM, o no más de 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM, o menos. En todavía otra modalidad, la concentración de amonio de la solución de cultivo celular se mantiene a un nivel bajo por la duración del proceso (es decir, para el tiempo total que el cultivo está siendo usado para producir rVWF) . En una modalidad preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 50 mU/pg del rVWF. En una modalidad más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 70 mU/ug del rVWF.

En una modalidad del método descrito anteriormente, el medio de cultivo de células básales es suplementado con cobre para proporcionar una concentración final de cobre de entre 4 g/L y 7.5 g/L. En una modalidad, la solución de cultivo celular comprende además una concentración de amonio de menos de 10 mM. En otra modalidad específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 10 mM por al menos 7 días. En una modalidad preferida, la solución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 5 mM. En otra modalidad específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 5 mM por al menos 7 días. En una modalidad preferida, la solución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 4 mM. En otra modalidad específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 4 mM por al menos 7 días. En todavía otras modalidades, la solución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 10 mM, o no más de 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM, o menos. En todavía otra modalidad, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a un nivel bajo por la duración del proceso (es decir, para el tiempo total que el cultivo está siendo usado para producir rVWF) . En una modalidad preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 50 mU^g del rVWF. En una modalidad más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 70 mU/ g del rVWF.

En una modalidad, la presente invención proporciona un método para producir una composición del Factor Von Willebrand recombinante (rVWF) , el método comprende las etapas de: (a) proporcionar un medio de cultivo de células básales; (b) suplementar el medio de cultivo de células básales con cobre; (c) proporcionar una o más células que comprenden un ácido nucleico que codifica una proteína del rvWF; (d) cultivar una o más células en el medio de cultivo de células suplementadas con cobre de manera que el rVWF se expresa y excreta de las células en un cultivo de sobrenadante; y (e) recuperar al menos una porción del cultivo sobrenadante, en donde la concentración de NH4+ del sobrenadante se mantiene a un bajo nivel por al menos 7 días, y además en donde el sobrenadante recuperado tiene una actividad del cofactor de ristocetina específico del rVWF de al menos 30 mü/ig del rVWF. En una modalidad específica, la concentración de cobre y concentración de NH4+ de la solución de cultivo celular se mantiene a una concentración de conformidad con cualquiera de las variaciones 1 a 440, como se expone en la Tabla 1. En una modalidad preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 50 xviU/ig del rVWF. En una modalidad más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 70 mU/ug del rVWF.

En una modalidad del método descrito anteriormente, la concentración de cobre y concentración de NH4+ del cultivo celular se mantiene a una concentración de conformidad con cualquiera de las variaciones 1 a 440, como se expone en la Tabla 1 por al menos 14 días. En una modalidad preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 50 mU/ug del rVWF. En una modalidad más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 70 mU^g del rVWF.

En una modalidad del método descrito anteriormente, la concentración de cobre y concentración de NH4+ del cultivo celular se mantiene a una concentración de conformidad con cualquiera de las variaciones 1 a 440, como se expone en la Tabla 1 por al menos 21 días. En una modalidad preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 50 mU/ug del rVWF. En una modalidad más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 70 mU/ g del rVWF.

En una modalidad del método descrito anteriormente, la concentración de cobre y concentración de NH4+ del cultivo celular se mantiene a una concentración de conformidad con cualquiera de las variaciones 1 a 440, como se expone en la Tabla 1 por al menos 28 días. En una modalidad preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 50 mU/Vg del rVWF. En una modalidad más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 70 mU^g del rVWF.

En una modalidad del método descrito anteriormente, la concentración de cobre y concentración de NH4+ del cultivo celular se mantiene a una concentración de conformidad con cualquiera de las variaciones 1 a 440, como se expone en la Tabla 1 por al menos 5 semanas. En una modalidad preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 50 mU/ug del rVWF. En una modalidad más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 70 mU/ug del rVWF.

En una modalidad del método descrito anteriormente, la concentración de cobre y concentración de NH4+ del cultivo celular se mantiene a una concentración de conformidad con cualquiera de las variaciones 1 a 440, como se expone en la Tabla 1 por al menos 6 semanas. En una modalidad preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 50 mU/ g del rVWF. En una modalidad más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 70 mU/ug del rVWF.

En una modalidad del método descrito anteriormente, la concentración de cobre y concentración de NH4+ del cultivo celular se mantiene a una concentración de conformidad con cualquiera de las variaciones 1 a 440, como se expone en la Tabla 1 por al menos 7 semanas. En una modalidad preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 50 mU/ g del rVWF. En una modalidad más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 70 mü/ig del rVWF.

En una modalidad del método descrito anteriormente, la concentración de cobre y concentración de NH4+ del cultivo celular se mantiene a una concentración de conformidad con cualquiera de las variaciones 1 a 440, como se expone en la Tabla 1 por al menos 8 semanas. En una modalidad preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 50 mU/ug del rVWF. En una modalidad más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 70 mU/ug del rVWF.

En una modalidad del método descrito anteriormente, la concentración de cobre y concentración de NH4+ del cultivo celular se mantiene a una concentración de conformidad con cualquiera de las variaciones 1 a 440, como se expone en la Tabla 1 por al menos 9 semanas. En una modalidad preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 50 m\J/]ig del rVWF. En una modalidad más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 70 mü/ig del rVWF.

En una modalidad, la presente invención proporciona un método para producir una composición del Factor Von illebrand recombinante (rVWF) , el método comprende las etapas de: (a) proporcionar un medio de cultivo de células básales (b) suplementar el medio de cultivo de células básales con cobre para proporcionar una concentración de cobre final de al menos 2.0 ug/L; (c) proporcionar una o más células que comprenden un ácido nucleico que codifica una proteína del rvWF; (d) cultivar una o más células en el medio de cultivo de células suplementadas con cobre de manera que el rVWF se expresa y excreta de las células en un cultivo de sobrenadante; (e) monitorear la concentración de amonio del sobrenadante del cultivo; y (f) recuperar al menos una porción del cultivo sobrenadante, en donde el sobrenadante del cultivo que comprende una concentración de amonio de más de 10 mM no se usa para producir la composición del rVWF, y además en donde el sobrenadante recuperado tiene una actividad del cofactor de ristocetina específico del rVWF de al menos 30 mU/ g del rVWF. En ciertas modalidades, la concentración final de cobre del medio de cultivo basal suplementado es al menos 2.4 ug/L, 3 ug/L, 4 ug/L, 5 g/L, 6 ug/L, 7 ug/L, 8 ug/L, 9 g/L, 10 g/L, 15 g/L, 20 g/L, o superior. En otras modalidades, la concentración final de cobre del medio de cultivo basal suplementado es entre 2-20 ug/L, 2-10 ug/L, 3-8 ug/L, o 4-6 ug/L. En una modalidad preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 50 mU/ug del rVWF. En una modalidad más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 70 mU/ug del rVWF.

En una modalidad del método descrito anteriormente, el sobrenadante del cultivo que comprende una concentración de amonio de más de 6 mM no se usa para producir la composición del rVWF. En ciertas modalidades, la concentración final de cobre del medio de cultivo basal suplementado es al menos 2.4 ug/L, 3 ug/L, 4 yg/L, 5 yg/L, 6 Ug/L, 7 ug/L, 8 ug/L, 9 ug/L, 10 ug/L, 15 ug/L, 20 ug/L, o superior. En otras modalidades, la concentración final de cobre del medio de cultivo basal suplementado es entre 2-20 yg/L, 2-10 ug/L, 3-8 yg/L, o 4-6 g/L. En una modalidad preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 50 mU/pg del rVWF. En una modalidad más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 70 mU/yg del rVWF.

En una modalidad del método descrito anteriormente, el sobrenadante del cultivo que comprende una concentración de amonio de más de 5 mM no se usa para producir la composición del rVWF. En ciertas modalidades, la concentración final de cobre del medio de cultivo basal suplementado es al menos 2.4 ug/L, 3 ug/L, 4 ug/L, 5 ug/L, 6 Ug/L, 7 ug/L, 8 ug/L, 9 ug/L, 10 ug/L, 15 ug/L, 20 g/L, o superior. En otras modalidades, la concentración final de cobre del medio de cultivo basal suplementado es entre 2-20 Ug/L, 2-10 g/L, 3-8 ug/L, o 4-6 ug/L. En una modalidad preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 50 mU/ug del rVWF . En una modalidad más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 70 mU/ug del rVWF.

En una modalidad del método descrito anteriormente, el sobrenadante del cultivo que comprende una concentración de amonio de más de 4 mM no se usa para producir la composición del rVWF. En ciertas modalidades, la concentración final de cobre del medio de cultivo basal suplementado es al menos 2.4 ug/L, 3 ug/L, 4 ug/L, 5 ug/L, 6 ug/L, 7 ug/L, 8 ug/L, 9 ug/L, 10 ug/L, 15 ug/L, 20 ug/L, o superior. En otras modalidades, la concentración final de cobre del medio de cultivo basal suplementado es entre 2-20 Ug/L, 2-10 ug/L, 3-8 ]ig/L, ?· 4-6 ug/L. En una modalidad preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rV F de al menos 50 mU/^g del rVWF . En una modalidad más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad del factor de ristocetina específica del rVWF de al menos 70 mU/ug del rVWF.

El vWF recombinante puede ser producido por expresión en un sistema hospedero eucariótico adecuado. Ejemplos de células eucarióticas incluyen, sin limitación, células de mamífero, tales como CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep, y HepG2 ; células de insecto, por ejemplo, células SF9, células SF21, células S2, y células High Five; y células de levadura, por ejemplo, células de Saccharomyces o Schizosaccharomyces . En una modalidad, el vWF puede ser expresado en células de levadura, células de insecto, células de ave, células de mamífero y similares. Por ejemplo, en una línea de células humanas, una línea de células de hámster, o una línea de células murinas . En una modalidad particular, la línea de células es una línea de células CHO, BHK, o HEK. Típicamente, células de mamífero, por ejemplo, células CHO de una línea de células continua, pueden ser usadas para expresar el vWF de la presente invención.

En ciertas modalidades, la secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia codificante para el v F puede ser un vector. El vector puede ser suministrado por un virus o puede ser un plásmido. La secuencia de ácido nucleico codificante para la proteína puede ser un gen específico o una parte biológicamente funcional del mismo. En una modalidad, la proteína es al menos una parte biológicamente activa del vWF.

Una amplia variedad de vectores puede ser usada para la expresión del vWF y se puede seleccionar de vectores de expresión eucarióticos . Ejemplos de vectores para expresión eucariótica incluyen: (i) para expresión en levadura, vectores tales como pAO, pPIC, pYES, pMET, usando promotores tales como AOX1, GAP, GAL1, AUG1, etc; (ii) para expresión en células de insecto, vectores tales como p T, pAc5, pIB, pMIB, pBAC, etc., usando promotores tales como PH, plO, MT, Ac5, 0pIE2, gp64, polh, etc., y (iii) para expresión en células de mamífero, vectores tales como pSVL, pCMV, p c/RSV, pcADN3, pBPV, etc., y vectores derivados de sistemas virales tales como virus vaccinia, virus adeno asociados, virus del herpes, retrovirus, etc., usando promotores tales como CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV, y ß-actina. Un vector ejemplar para expresión del rVWF se describe por Kaufman et al. (Mol Cell Biol . 1989 Mar; 9 (3 ) : 1233-42 ) , el contenido del cual está de este modo incorporado por referencia en su totalidad para todos los propósitos.

En algunas modalidades de la presente invención, la secuencia de ácido nucleico comprende además otras secuencias adecuadas para una expresión controlada de una proteina tales como secuencias promotoras, intensificadores, cuadros TATA, sitios de inicio de la transcripción, polienlazadores, sitios de restricción, poli-A-secuencias, secuencias de procesamiento de proteina, marcadores de selección, y similares los cuales son en general conocidos para una persona de habilidad ordinaria en la técnica.

Además de los medios de cultivo celular que comprenden una concentración incrementada de cobre, las condiciones de cultivo celular de la presente invención pueden incluir una concentración de amonio de menos de aproximadamente 25 mM a través de un proceso corriente arriba completo en sistemas de cultivo. En una modalidad, las condiciones de cultivo celular incluyen una concentración de amonio de menos de aproximadamente 25 mM, en otra modalidad menos de aproximadamente 20 mM, en todavía otra modalidad menos de aproximadamente 15 mM, en todavía otra modalidad menos de aproximadamente 10 mM, y en una modalidad adicional menos de aproximadamente 5 mM.

En algunas modalidades, las concentraciones de amonio de la presente invención se mantienen constantes a través del proceso corriente arriba completo del sistema de cultivo celular. Las células usadas de conformidad con la presente invención pueden ser cultivadas, por ejemplo, por métodos que son modificados comparados con cultivos de lote y cultivos de lote alimentado convencionales, cada uno de los cuales son en general conocidos en el campo. Sin embargo, tales técnicas convencionales pueden producir altas concentraciones de amonio al final del cultivo. Los métodos de la presente invención superan este problema empleando sistemas de producción que pueden proporcionar un suministro continuo del medio de cultivo a través de técnicas tales como, por ejemplo, cultivos de perfusión o quimiostáticos . Después del cultivo de las células hospederas, el v F puede ser recuperado del medio agotado usando metodologías estándares, tales como ultrafiltración o centrifugación. Si se desea, el vWF puede ser purificado mediante, por ejemplo, intercambio iónico y/o cromatografía de exclusión de tamaño y similares .

Un cultivo continuo (por ejemplo, un cultivo de perfusión o quimiostático) puede ser un cultivo de suspensión que es continuamente aplicado con nutrientes por el flujo de entrada del medio fresco, en donde el volumen del cultivo es usualmente constante. De manera similar, la fermentación continua puede referirse a un proceso en el cual las células o micro-organismos se mantienen en cultivo en la fase de crecimiento exponencial por la adición continua de medio fresco que es exactamente balanceado por la remoción de la suspensión celular del biorreactor. Además, un sistema de reactor de tanque agitado puede ser usado para cultivos de suspensión, perfusión, quimiostático y/o microportador . En general, el sistema de reactor de tanque agitado puede ser operado como cualquier reactor de tanque agitado convencional con cualquier tipo de agitador tal como un Rushton, hidrodeslizador, hoja aguda o marino.

C. Métodos para Producir ADAMTS13 recombinantes (A13) En otro aspecto, la presente invención se refiere además a métodos para producir rA13 bajo condiciones de cultivo que comprenden un medio de cultivo celular que tienen una concentración incrementada de cobre. En ciertas modalidades, el cultivo también comprende una baja concentración de amonio.

En una modalidad, la presente invención proporciona un método para producir una composición de ADAMTS13 recombinante (rA13), el método comprende las etapas de: (a) proporcionar un medio de cultivo de células básales; (b) suplementar el medio de cultivo de células básales con cobre para proporcionar una concentración de cobre final de al menos 1.0 ug/L; (c) proporcionar una o más células que comprenden un ácido nucleico que codifica una proteína rA13; (d) cultivar una o más células en el medio de cultivo celular suplementado con cobre de manera que la rA13 se expresa y excreta de las células en un cultivo de sobrenadante; y (e) recuperar al menos una porción del cultivo sobrenadante, en donde, al menos 1500 Unidades de actividad del FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células básales suplementado por día (es decir, 1500 Unidades de actividad del FRETS-VWF73 por día por litro de cultivo celular; P FRETS) está presente en el sobrenadante del cultivo recuperado. En ciertas modalidades, la concentración final de cobre del medio de cultivo basal suplementado es al menos 2 ug/L, 3 ug/L, 4 g/L, 5 g/L, 6 pg/L, o superior. En otras modalidades, la concentración final de cobre del medio de cultivo basal suplementado es entre 1-6 pg/L, 2-5 ug/L, 2-4 pg/L, o 3-4 pg/L. En una modalidad preferida, al menos 2000 Unidades de actividad del FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células básales suplementado por día están presentes en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una modalidad más preferida, al menos 2500 Unidades de actividad del FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células b sales suplementado por día están presentes en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una modalidad muy preferida, al menos 3000 Unidades de actividad de FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células básales suplementado por día están presentes en el sobrenadante de cultivo recuperado. En ciertas modalidades, los métodos proporcionan productividad de FRETS-VWF73 volumétrica sosteniblemente mejorada (P FRETS) . Por ejemplo, en ciertas modalidades, al menos 1500 Unidades de actividad del FRETS-V F73 por litro de medio de cultivo de células básales suplementado se recuperan diariamente por al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, o más días. En una modalidad preferida, al menos 2000 Unidades de actividad del FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células básales suplementado se recuperan diariamente por al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, o más días. En una modalidad más preferida, al menos 2500 Unidades de actividad del FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células básales suplementado se recuperan diariamente por al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, o más días. En una modalidad muy preferida, al menos 3000 Unidades de actividad de FRETS-VWF3 por litro de medio de cultivo de células básales suplementado se recuperan diariamente por al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, o más días. En una modalidad específica, la densidad celular del cultivo celular continuo para producción de rA13 se mantiene a una concentración de no más de 4.0xl06 células/mL por un periodo extendido. En otras modalidades específicas, la densidad celular se mantiene a no más de 3.5xl06 células/mL, 3.0xl06 células/mL, 2.5xl06 células/mL, 2.0xl06 células/mL, 1.5xl06 células/mL, 1. OxlO6 células/mL, o menos. En una modalidad, la densidad celular se mantiene a entre 3. OxlO6 células/mL y 4. OxlO6 células/mL.

En una modalidad de los métodos descritos anteriormente, el sobrenadante recuperado tiene al menos 4 Unidades de actividad de FRETS-V F3 por mL de sobrenadante (FRETS) . En una modalidad preferida, el sobrenadante recuperado tiene al menos 6 Unidades de actividad de FRETS-VWF3 por mL de sobrenadante. En una modalidad más preferida, el sobrenadante recuperado tiene al menos 8 Unidades de actividad de FRETS-VWF3 por mL de sobrenadante. En una modalidad muy preferida, el sobrenadante recuperado tiene al menos 10 Unidades de actividad de FRETS-VWF3 por mL de sobrenadante. En ciertas modalidades, los métodos proporcionan producción de FRETS sustancialmente mejorada. Por ejemplo, en ciertas modalidades, sobrenadantes que tienen al menos 4 Unidades de actividad de FRETS-VWF3 por mL son recuperados diariamente por al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, o más días. En una modalidad preferida, sobrenadantes que tienen al menos 6 Unidades de actividad de FRETS-VWF3 por mL son recuperados diariamente por al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, o más días. En una modalidad más preferida, sobrenadantes que tienen al menos 8 Unidades de actividad de FRETS-VWF3 por mL son recuperados diariamente por al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, o más días. En una modalidad muy preferida, sobrenadantes que tienen al menos 10 Unidades de actividad de FRETS-VWF3 por mL son recuperados diariamente por al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, o más días.

En una modalidad de los métodos descritos anteriormente, el cultivo celular resulta en la producción de al menos 800 mU de actividad de FRETS-V F73 por 10s células presentes en el cultivo por día (es decir, q FRETS) . En una modalidad preferida, el cultivo celular resulta en la producción de al menos 1 U de actividad de FRETS-VWF73 por 106 células presentes en el cultivo por día. En una modalidad más preferida, el cultivo celular resulta en la producción de al menos 1.2 U de actividad de FRETS-VWF73 por 106 células presentes en el cultivo por día. En una modalidad muy preferida, el cultivo celular resulta en la producción de al menos 1.4 U de actividad de FRETS-VWF73 por 106 células presentes en el cultivo por día. En ciertas modalidades, los métodos proporcionan productividad de FRETS-VWF73 específica de la célula sosteniblemente mejorada (q FRETS) . Por ejemplo, en ciertas modalidades, el cultivo celular resulta en la producción de al menos 800 mU de actividad de FRETS-V F73 por 106 células presentes en el cultivo diariamente por al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, o más días. En una modalidad preferida, el cultivo celular resulta en la producción de al menos 1 U de actividad de FRETS-VWF73 por 106 células presentes en el cultivo diariamente por al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, o más días. En una modalidad más preferida, el cultivo celular resulta en la producción de al menos 1.2 U de actividad de FRETS-VWF73 por 106 células presentes en el cultivo diariamente por al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, o más días. En una modalidad muy preferida, el cultivo celular resulta en la producción de al menos 1.4 U de actividad de FRETS- F73 por 106 células presentes en el cultivo diariamente por al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, o más días.

En una modalidad de los métodos descritos anteriormente, el cultivo celular resulta en la producción de al menos 1 mg rA13, como se mide por ELISA, por litro de cultivo por día (P ELISA) . En una modalidad preferida, el cultivo celular resulta en la producción de al menos 1.5 mg rA13, como se mide por ELISA, por litro de cultivo por día. En una modalidad más preferida, el cultivo celular resulta en la producción de al menos 2 mg rA13, como se mide por ELISA, por litro de cultivo por día. En ciertas modalidades, los métodos proporcionan producción de rA13 sosteniblemente mejorada. Por ejemplo, en ciertas modalidades, el cultivo celular resulta en la producción de al menos 1 mg rA13, como se mide por ELISA, por litro de cultivo diariamente por al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, o más días. En una modalidad preferida, el cultivo celular resulta en la producción de al menos 1.5 mg rA13, como se mide por ELISA, por litro de cultivo diariamente por al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, o más días. En una modalidad más preferida, el cultivo celular resulta en la producción de al menos 2 mg rA13, como se mide por ELISA, por litro de cultivo diariamente por al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, o más días .

En una modalidad de los métodos descritos anteriormente, el cultivo celular resulta en la producción de al menos 0.5 xg de rA13, como se mide por ELISA, por 106 células presentes en el cultivo por día (es decir, q ELISA) . En una modalidad preferida, el cultivo celular resulta en la producción de al menos 0.7 µ9 de rA13, como se mide por ELISA, por 1.06 células presentes en el cultivo por día. En una modalidad más preferida, el cultivo celular resulta en la producción de al menos 0.9 ig de rA13, como se mide por ELISA, por 106 células presentes en el cultivo por día. En ciertas modalidades, los métodos proporcionan producción de q ELISA sosteniblemente mejorada. Por ejemplo, en ciertas modalidades, el cultivo celular resulta en la producción de al menos 0.5 µ9 de rA13, como se mide por ELISA, por 106 células presentes en el cultivo diariamente por al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, o más días. En una modalidad preferida, el cultivo celular resulta en la producción de al menos 0.7 ]ig de rA13, como se mide por ELISA, por 106 células presentes en el cultivo diariamente por al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, o más días. En una modalidad más preferida, el cultivo celular resulta en la producción de al menos 0.9 ig de rA13, como se mide por ELISA, por 106 células presentes en el cultivo diariamente por al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, o más días.

En una modalidad de los métodos descritos anteriormente, el sobrenadante recuperado tiene al menos 3 µg de rA13, como se mide por ELISA, por mL de sobrenadante. En una modalidad preferida, el sobrenadante recuperado tiene al menos 4 ug de rA13, como se mide por ELISA, por mL de sobrenadante. En una modalidad más preferida, el sobrenadante recuperado tiene al menos 5 ug de rA13, como se mide por ELISA, por mL de sobrenadante. En una modalidad muy preferida, el sobrenadante recuperado tiene al menos 6 ig de rA13, como se mide por ELISA, por mL de sobrenadante. En ciertas modalidades, los métodos proporcionan producción de rA13 sosteniblemente mejorada. Por ejemplo, en ciertas modalidades, sobrenadantes que tienen al menos 3 ug de rA13 por mL son recuperados diariamente por al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, o más días. En una modalidad preferida, sobrenadantes que tienen al menos 4 µg de rA13 por mL son recuperados diariamente por al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, o más días. En una modalidad más preferida, sobrenadantes que tienen al menos 5 ]ig de rA13 por mL son recuperados diariamente por al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, o más días. En una modalidad muy preferida, sobrenadantes que tienen al menos 6 µ9 de rA13 por mL son recuperados diariamente por al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, o más días.

En una modalidad de los métodos descritos anteriormente, la solución de cultivo celular comprende además una concentración de amonio de menos de 10 mM. En otra modalidad específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 10 mM por al menos 7 días. En una modalidad preferida, la solución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 5 mM. En otra modalidad específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 5 mM por al menos 7 días. En una modalidad preferida, la solución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 4 mM. En otra modalidad específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 4 mM por al menos 7 días. En todavía otras modalidades, la solución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 10 mM, o no más de 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 M, 2 mM, 1 mM, o menos. En todavía otra modalidad, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a un nivel bajo por la duración del proceso (es decir, para el tiempo total que el cultivo está siendo usado para producir rA13) . En una modalidad particular, la solución del cultivo tiene una concentración de cobre y amonio de conformidad con cualquiera de las variaciones 1 a 440, como se proporciona en la Tabla 1.

En una modalidad, la presente invención proporciona un método para producir una composición de ADAMTS13 recombinante (rA13), el método comprende las etapas de: (a) proporcionar un medio de cultivo de células básales; (b) suplementar el medio de cultivo de células básales con cobre y zinc; (c) proporcionar una o más células que comprenden un ácido nucleico que codifica una proteína rA13; (d) cultivar una o más células en el medio de cultivo celular suplementado con cobre de manera que la rA13 se expresa y excreta de las células en un cultivo de sobrenadante; y (e) recuperar al menos una porción del cultivo sobrenadante, en donde al menos 1500 Unidades de actividad del FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células básales suplementado por día están presentes en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una modalidad, el medio de cultivo contiene al menos 1 g/L de cobre y al menos 2 µ? de zinc. En otras modalidades, el medio contiene al menos 2 ug/L de cobre o al menos 4 ug/L de cobre. En una modalidad en donde el medio es suplementado con cobre, el medio de cultivo también contiene al menos en o aproximadamente 5 µ? de zinc. En una modalidad, el medio de cultivo también contiene en o aproximadamente entre 2 µ? y 12 µ? de zinc. En otra modalidad, el medio de cultivo también contiene en o aproximadamente entre 5 µ? y 12 µ? de zinc. En todavía otras modalidades, el medio de cultivo también pueden contener al menos en o aproximadamente 2 µ?, o al menos en o aproximadamente 3 µ?, 4 µ?, 5 µ?, 6 µ?, 7 µ?, 8 µ?, 9 µ?, 10 µ?, 11 µ?, 12 µ?, 13 µ , 14 µ?, 15 µ?, 20 µ?, 25 µ?, 30 µ?, o más zinc. En una modalidad, el medio de cultivo contiene una concentración de cobre y zinc de conformidad con cualquiera de las variaciones 441 a 880, como se expone en la Tabla 2. En una modalidad preferida, al menos 2000 Unidades de actividad del FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células básales suplementado por día están presentes en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una modalidad más preferida, al menos 2500 Unidades de actividad del FRETS- F73 por litro de medio de cultivo de células básales suplementado por día están presentes en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una modalidad muy preferida, al menos 3000 Unidades de actividad de FRETS-VWF3 por litro de medio de cultivo de células básales suplementado por día están presentes en el sobrenadante de cultivo recuperado.

En una modalidad, la presente invención proporciona un método para producir una composición de ADAMTS13 recombinante (rA13), el método comprende las etapas de: (a) proporcionar un medio de cultivo de células básales; (b) suplementar el medio de cultivo de células básales con cobre y calcio; (c) proporcionar una o más células que comprenden un ácido nucleico que codifica una proteina rA13; (d) cultivar una o más células en el medio de cultivo celular suplementado con cobre de manera que la rA13 se expresa y excreta de las células en un cultivo de sobrenadante; y (e) recuperar al menos una porción del cultivo sobrenadante, en donde al menos 1500 Unidades de actividad del FRETS-V F73 por litro de medio de cultivo de células básales suplementado por día están presentes en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una modalidad, el medio de cultivo contiene al menos 1 Ug/L de cobre y al menos 0.5 mM de calcio. En otras modalidades, el medio contiene al menos 2 pg/L de cobre o al menos 4 ug/L de cobre. En otra modalidad en donde el medio es suplementado con cobre, el medio de cultivo también contiene al menos 1.5 mM de calcio. En una modalidad, el medio de cultivo contiene en o aproximadamente entre 0.5 mM y 1.5 mM de calcio. En todavía otras modalidades, el medio de cultivo pueden contener al menos en o aproximadamente 0.5 mM, o al menos en o aproximadamente 0.6 mM, 0.7 mM, 0.8 mM, 0.9 mM, 1.0 mM, 1.1 mM, 1.2 mM, 1.3 mM, 1.4 mM, 1.5 mM, 1.6 mM, 1.7 mM, 1.8 mM, 1.9 mM, 2.0 mM, 2.25 mM, 2.5 mM, 2.75 mM, 3.0 mM, 3.5 mM, 4.0 mM, 4.5 mM, 5.0 mM, o más calcio. En una modalidad, el medio de cultivo contiene una concentración de cobre y calcio de conformidad con cualquiera de las variaciones 881 a 1320, como se expone en la Tabla 3. En una modalidad preferida, al menos 2000 Unidades de actividad del FRETS-V F73 por litro de medio de cultivo de células básales suplementado por día están presentes en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una modalidad más preferida, al menos 2500 Unidades de actividad del FRETS-V F73 por litro de medio de cultivo de células básales suplementado por día están presentes en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una modalidad muy preferida, al menos 3000 Unidades de actividad de FRETS-V F3 por litro de medio de cultivo de células básales suplementado por día están presentes en el sobrenadante de cultivo recuperado.

En una modalidad, la presente invención proporciona un método para producir una composición de ADAMTS13 recombinante (rA13), el método comprende las etapas de: (a) proporcionar un medio de cultivo de células básales; (b) suplementar el medio de cultivo de células básales con cobre, zinc, y calcio (c) proporcionar una o más células que comprenden un ácido nucleico que codifica una proteína rA13; (d) cultivar una o más células en el medio de cultivo celular suplementado con cobre de manera que la rA13 se expresa y excreta de las células en un cultivo de sobrenadante; y (e) recuperar al menos una porción del cultivo sobrenadante, en donde al menos 1500 Unidades de actividad del FRETS-V F73 por litro de medio de cultivo de células básales suplementado por día están presentes en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una modalidad, el medio de cultivo tiene una concentración de calcio de al menos 0.5 mM y una concentración de cobre y zinc de conformidad con cualquiera de las variaciones 441 a 880, como se expone en la Tabla 2. En otra modalidad específica, el medio de cultivo tiene una concentración de calcio de al menos 1.5 mM y una concentración de cobre y zinc de conformidad con cualquiera de las variaciones 441 a 880, como se expone en la Tabla 2. En otra modalidad específica, el medio de cultivo tiene una concentración de calcio entre 0.5 mM y 1.5 mM y una concentración de cobre y zinc de conformidad con cualquiera de las variaciones 441 a 880, como se expone en la Tabla 2. En todavía otras modalidades, el medio de cultivo tiene una concentración de calcio de al menos 0.6 mM, 0.7 mM, 0.8 mM, 0.9 mM, 1.0 mM, 1.1 mM, 1.2 mM, 1.3 mM, 1.4 mM, 1.5 mM, 1.6 mM, 1.7 mM, 1.8 mM, 1.9 mM, 2.0 mM, 2.25 mM, 2.5 mM, 2.75 mM, 3.0 mM, 3.5 mM, 4.0 mM, 4.5 mM, 5.0 mM, o más, y una concentración de cobre y zinc de conformidad con cualquiera de las variaciones 441 a 880, como se expone en la Tabla 2. En una modalidad preferida, al menos 2000 Unidades de actividad del FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células básales suplementado por día están presentes en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una modalidad más preferida, al menos 2500 Unidades de actividad del FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células básales suplementado por día están presentes en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una modalidad muy preferida, al menos 3000 Unidades de actividad de F ETS-VWF3 por litro de medio de cultivo de células básales suplementado por día están presentes en el sobrenadante de cultivo recuperado .

En una modalidad, la presente invención proporciona un método para producir una composición de ADAMTS13 recombinante (rA13) , el método comprende las etapas de: (a) proporcionar un medio de cultivo de células básales; (b) suplementar el medio de cultivo de células básales con cobre y nicotinamida; (c) proporcionar una o más células que comprenden un ácido nucleico que codifica una proteína rA13; (d) cultivar una o más células en el medio de cultivo celular suplementado con cobre de manera que la rA13 se expresa y excreta de las células en un cultivo de sobrenadante; y (e) recuperar al menos una porción del cultivo sobrenadante, en donde al menos 1500 Unidades de actividad del FRETS-V F73 por litro de medio de cultivo de células básales suplementado por día están presentes en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una modalidad, el medio de cultivo contiene al menos 1 g/L de cobre y al menos 2 mg/L de nicotinamida (vitamina B3) . En otras modalidades, el medio contiene al menos 2 ug/L de cobre o al menos 4 g/L de cobre. En otra modalidad en donde el medio es suplementado con cobre, el medio de cultivo también contiene al menos 7 mg/L de nicotinamida (vitamina B3) . En una modalidad, el medio de cultivo contiene en o aproximadamente entre 2 mg/L y 10 mg/L de nicotinamida (vitamina B3) . En todavía otras modalidades, el medio de cultivo pueden contener al menos en o aproximadamente 2 mg/L, 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, 6 mg/L, 7 mg/L, 8 mg/L, 9 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L, o superior concentraciones of nicotinamida (vitamina B3) . En una modalidad, el medio de cultivo contiene una concentración de cobre y nicotinamida de conformidad con cualquiera de las variaciones 1321 a 1760, como se expone en la Tabla 4. En una modalidad preferida, al menos 2000 Unidades de actividad del FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células básales suplementado por día están presentes en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una modalidad más preferida, al menos 2500 Unidades de actividad del FRETS- F73 por litro de medio de cultivo de células básales - suplementado por día están presentes en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una modalidad muy preferida, al menos 3000 Unidades de actividad de FRETS-VWF3 por litro de medio de cultivo de células básales suplementado por día están presentes en el sobrenadante de cultivo recuperado .

En una modalidad, la presente invención proporciona un método para producir una composición de ADAMTS13 recombinante (rA13) , el método comprende las etapas de: (a) proporcionar un medio de cultivo de células básales; (b) suplementar el medio de cultivo de células básales con cobre, zinc, y nicotinamida; (c) proporcionar una o más células que comprenden un ácido nucleico que codifica una proteína rA13; (d) cultivar una o más células en el medio de cultivo celular suplementado con cobre de manera que la rA13 se expresa y excreta de las células en un cultivo de sobrenadante; y (e) recuperar al menos una porción del cultivo sobrenadante, en donde al menos 1500 Unidades de actividad del FRETS-V F73 por litro de medio de cultivo de células básales suplementado por día están presentes en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una modalidad, el medio de cultivo celular tiene una concentración de nicotinamida de al menos 2 mg/mL y una concentración de cobre y zinc de conformidad con cualquiera de las variaciones 441 a 880, como se expone en la Tabla 2. En otra modalidad específica, el medio de cultivo tiene una concentración de nicotinamida de al menos 7 mg/mL mM y una concentración de cobre y zinc de conformidad con cualquiera de las variaciones 441 a 880, como se expone en la Tabla 2. En otra modalidad específica, el medio de cultivo tiene una concentración de nicotinamida entre 2 mg/mL y 10 mg/mL y una concentración de cobre y zinc de conformidad con cualquiera de las variaciones 441 a 880, como se expone en la Tabla 2.

En todavía otras modalidades, el medio de cultivo tiene una concentración de nicotinamida de al menos 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, 5 mg/mL, 6 mg/mL, 7 mg/mL, 8 mg/mL, 9 mg/mL, 10 mg/mL, 11 mg/mL, 12 mg/mL, 13 mg/mL, 14 mg/mL, 15 mg/mL, o más, y una concentración de cobre y zinc de conformidad con cualquiera de las variaciones 441 a 880, como se expone en la Tabla 2. En una modalidad preferida, al menos 2000 Unidades de actividad del FRETS-V F73 por litro de medio de cultivo de células básales suplementado por día están presentes en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una modalidad más preferida, al menos 2500 Unidades de actividad del FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células básales suplementado por día están presentes en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una modalidad muy preferida, al menos 3000 Unidades de actividad de FRETS-WJF3 por litro de medio de cultivo de células básales suplementado por día están presentes en el sobrenadante de cultivo recuperado.

En una modalidad, la presente invención proporciona un método para producir una composición de ADAMTS13 recombinante (rA13), el método comprende las etapas de: (a) proporcionar un medio de cultivo de células básales; (b) suplementar el medio de cultivo de células básales con cobre, calcio, y nicotinamida; (c) proporcionar una o más células que comprenden un ácido nucleico que codifica una proteína rA13; (d) cultivar una o más células en el medio de cultivo celular suplementado con cobre de manera que la rA13 se expresa y excreta de las células en un cultivo de sobrenadante; y (e) recuperar al menos una porción del cultivo sobrenadante, en donde al menos 1500 Unidades de actividad del FRETS-V F73 por litro de medio de cultivo de células básales suplementado por día están presentes en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una modalidad, el medio de cultivo celular tiene una concentración de nicotinamida de al menos 2 mg/mL y una concentración de cobre y calcio de conformidad con cualquiera de las variaciones 881 a 1320, como se expone en la Tabla 3. En otra modalidad específica, el medio de cultivo tiene una concentración de nicotinamida de al menos 7 mg/mL mM y una concentración de cobre y calcio de conformidad con cualquiera de las variaciones 881 a 1320, como se expone en la Tabla 3. En otra modalidad específica, el medio de cultivo tiene una concentración de nicotinamida entre 2 mg/mL y 10 mg/mL y una concentración de cobre y calcio de conformidad con cualquiera de las variaciones 881 a 1320, como se expone en la Tabla 3. En todavía otras modalidades, el medio de cultivo tiene una concentración de nicotinamida de al menos 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, 5 mg/mL, 6 mg/mL, 7 mg/mL, 8 mg/mL, 9 mg/mL, 10 mg/mL, 11 mg/mL, 12 mg/mL, 13 mg/mL, 14 mg/mL, 15 mg/mL, o más, y una concentración de cobre y calcio de conformidad con cualquiera de las variaciones 881 a 1320, como se expone en la Tabla 3. En una modalidad preferida, al menos 2000 Unidades de actividad del FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células básales suplementado por día están presentes en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una modalidad más preferida, al menos 2500 Unidades de actividad del FRETS-VWF73 por litro de medio de cultivo de células básales suplementado por día están presentes en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una modalidad muy preferida, al menos 3000 Unidades de actividad de FRETS-VWF3 por litro de medio de cultivo de células básales suplementado por día están presentes en el sobrenadante de cultivo recuperado .

Proteínas ADAMTS recombinantes pueden ser producidas por expresión en cualquier sistema hospedero procariótico o eucariótico adecuado. Ejemplos de células eucarióticas incluyen, sin limitación, células de mamífero, tales como CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep, y HepG2 ; células de insecto, por ejemplo células SF9, células SF21, células S2, y células High Five; y células de levadura, por ejemplo células de Saccharomyces o Schizosaccharomyces . En una modalidad, las proteínas ADAMTS pueden ser expresadas en células bacterianas, células de levadura, células de insecto, células de ave, células de mamífero, y similares. Por ejemplo, en una línea de células humanas, una línea de células de hámster, o una línea de células murinas . En una modalidad particular, la línea de células es una línea de células CHO, BHK, o HEK. En una modalidad preferida, la línea de células es una línea de células CHO. En una modalidad específica, clones CHO capaces de expresar establemente rA13 son preparados co-transfectando una célula CHO con secuencias codificantes para rA13 y una hidrofolato reductasa (por ejemplo, a gen dhfr murino) y seleccionar para el crecimiento en la presencia de niveles incrementados de metotrexato.

En una modalidad, las células pueden ser cualquier célula de mamífero que puede ser cultivada, preferiblemente en un proceso de manufacturación (es decir, al menos 10 litros, preferiblemente al menos 100 litros) , para producir una proteína ADAMTS deseada tal como ADAMTS13. Ejemplos incluyen la línea CVl de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651) ; línea de riñon embriónico humano (células 293 o 293 subclonadas para crecimiento en cultivo de suspensión, Graham et al., J. Gen Virol . , 36:59 (1977)); células de riñon de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10) ; células de ovario de hámster Chino/-DHFR, tal como el subclon DUKX-Bll (CHO, Uriaub and Chasin, Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 77:4216 (1980)); células Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol . Reprod, 23:243-251 (1980)),· células de riñon de mono (CVl ATCC CCL 70) ; células de riñon de mono verde Africano (VERO-76, ATCC CRL-1587) ; células de carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC CCL 2) ; células de riñon canino (MDCK, ATCC CCL 34) ; células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2 , HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51 ); células TRI (Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y la línea de hepatoma humano (Hep G2) . Preferiblemente, la línea de células es una línea de células de roedor, especialmente una línea de células de hámster tal como CHO o BH .

Se puede usar una amplia variedad de vectores para la expresión de una proteína ADA TS (por ejemplo, ADAMTS13) y puede ser seleccionada de vectores de expresión eucarióticos y procarióticos . En ciertas modalidades, se contempla un vector de plásmido para uso en la expresión de una proteína ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13 ) . En general, vectores plásmidos que contienen secuencias de control y replicón los cuales se derivan de especies compatibles con la célula hospedera se usan en conjunto con estos hospederos. El vector puede llevar un sitio de replicación, así como también secuencias marcadoras las cuales son capaces de proporcionar selección fenotípica en células transformadas. El plásmido comprenderá una secuencia de nucleótido que codifica una proteína ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) operablemente ligada a una o más secuencias de control, por ejemplo, un promotor. un método preferido para preparar clones de células CHO estales que expresan una proteína ADAMTS recombinante es como sigue. Una línea de células CHO deficientes en DHFR DUKX-B11 es transfectada con un vector de expresión DHFR para permitir la expresión de la proteína recombinante relevante. Un método ejemplar se describe por Plaimauer efc al. (Blood. 2002 Nov 15; 100 (10) :3626-32. Epub 2002 Jul 12), el contenido del cual está de este modo incorporado por referencia en su totalidad para todos los propósitos. Se lleva a cabo selección por crecimiento en medio libre de Hipoxantina/Timidina (HT) y se logra amplificación de la región relevante codificante para la expresión de la proteína ADAMTS recombinante y gen DHRR por propagación de las células en concentraciones incrementadas de metotrexato. Donde sea apropiado, las líneas de células CHO puede ser adaptada para crecimiento en medio libre de proteína y/o suero, esencialmente como se describe en el documento US 6,100,061 (Reiter et al., lmmuno Aktiengesellschaft) .

En otra modalidad preferida, se preparan células HEK293 estables transfectando con un constructo que contienen un marcador seleccionable de higromicina y seleccionando transformantes por resistencia al antibiótico.

La capacidad de ciertos virus para infectar células o ingresar células vía endocitosis mediada por el receptor, y para integrarla en el genoma de célula hospedera y expresar genes virales establemente y eficientemente las han hecho candidatos atractivos para la transferencia de ácidos nucleicos extraños en células (por ejemplo, células de mamífero). Por consiguiente, en ciertas modalidades, se usa un vector viral para introducir una secuencia de nucleótido que codifica una proteína ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13 ) en una célula hospedera para expresión. El vector viral comprenderá una secuencia de nucleótido que codifica una proteína ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13 ) operablemente ligada a una o más secuencias de control, por ejemplo, un promotor. AlteARNtivamente , el vector viral puede no contener una secuencia de control y preferentemente dependerá de una secuencia de control dentro de la célula hospedera para accionar la expresión de la proteína ADAMTS. Ejemplos no limitantes de vectores de virus que pueden ser usados para suministrar un ácido nucleico incluyen vectores Adenovirales , vectores AAV, y vectores Retrovirales .

En una modalidad, un vector de expresión de Adenovirus incluye aquellos constructos que contienen secuencias de adenovirus suficientes para soportar empaquetamiento del constructo y finalmente expresar un constructo ADAMTS que ha sido clonado en este. Vectores adenovirales permiten la introducción de secuencias extrañas de hasta 7 kb (Grunhaus et al., Seminar in Virology, 200 (2) : 535-546, 1992) ) .

En otra modalidad, un virus adeno-asociado (AAV) puede ser usado para introducir una secuencia de nucleótido que codifica una proteína ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en una célula hospedera para expresión. Sistemas AAV han sido descritos previamente y son en general bien conocidos en la técnica (Kelleher y Vos, Biotechniques, 17 (6 ) : 1110 - 7 , 1994; Cotten et al . , Proc Nati Acad Sci USA, 89 (13) : 6094-6098, 1992; Curiel, Nat Immun, 13 (2-3 ): 141-64 , 1994; Muzyczka, Curr Top Microbiol Immunol, 158:97-129, 1992). Detalles que se refieren a la generación y uso de vectores rAAV se describen, por ejemplo, en las Patentes Estadounidenses Nos. 5,139,941 y 4,797,368, cada una incorporada en la presente por referencia en sus totalidades para todos los propósitos.

En una modalidad, un vector de expresión retroviral puede ser usado para introducir una secuencia de nucleótido que codifica una proteína ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13 ) en una célula hospedera para expresión. Estos sistemas han sido descritos previamente y son en general bien conocidos en la técnica (Mann et al., Cell, 33:153-159, 1983; Nicolás and Rubinstein, In: Vectors : A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodríguez y Denhardt, eds . , Stoneham: Butterworth, p . 494-513, 1988; Temin, In: Gene Transfer, Kucherlapati (ed.), New York: Plenum Press, pp. 149-188, 1986) . En una modalidad específica, el vector retroviral es un vector lentiviralor (véase, por ejemplo, Naldini et al., Science, 272 (5259) :263-267 , 1996; Zufferey et al., Nat Biotechnol, 15 (9) : 871-875 , 1997; Blomer et al., J Virol . , 71 (9) : 6641-6649 , 1997; Patentes Estadounidenses Nos. 6, 013, 516 y 5, 994, 136) .

Ejemplos no limitantes de vectores para expresión procariótica incluyen plásmidos tales como pRSET, pET, pBAD, etc., en donde los promotores usados en vectores de expresión procariótica incluyen lac, trc, trp, recA, araBAD,. etc. Ejemplos de vectores para expresión eucariótica incluyen: (i) para expresión en levadura, vectores tales como pAO, pPIC, pYES, pMET, usando promotores tales como AOX1, GAP, GAL1, AUG1 , etc; (ii) para expresión en células de insecto, vectores tales como pMT, pAc5, pIB, pMIB, pBAC, etc., usando promotores tales como PH, lO, MT, Ac5, OpIE2, gp64, polh, etc., y (iii) para expresión en células de mamífero, vectores tales como pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcAD 3 , pBPV, etc., y vectores derivados de sistemas virales tales como virus vaccinia, virus adeno asociados, virus del herpes, retrovirus, etc., usando promotores tales como CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV, y ß-áctina. Un vector ejemplar para expresar rA13 se describe por Plaimauer et al. (Blood. 2002 Nov 15 ; 100 (10) : 3626-32. Epub 2002 Jul 12), el contenido del cual está de este modo incorporado por referencia en su totalidad para todos los propósitos.

En ciertas modalidades, los métodos de cultivo celular de la invención pueden comprender el uso de un microportador . La presente invención proporciona, entre otros aspectos, métodos de expresión de proteína ADAMTS a gran escala. En algunas modalidades, los cultivos celulares de las modalidades pueden ser realizados en biorreactores grandes bajo condiciones adecuadas para proporcionar áreas de superficie de cultivo de alto volumen específicas para lograr altas densidades y expresión de proteínas. Un medio para proporcionar tales condiciones de crecimiento es usar microportadores para cultivo celular en biorreactores de tanque agitado. En otra modalidad, estos requerimientos de crecimiento son cubiertos vía el uso de una suspensión de cultivo celular.

IV. Modalidades específicas A. Factor Von Willebrand Recombinante (rVWF) El vWF recombinante puede ser expresado en células de mamífero, pero la actividad específica del vWF puede variar ampliamente dependiendo de las condiciones de cultivo celular y no se ha mostrado por ser comparable o igual a aquella del vWF aislado de plasma de sangre. La presente invención se basa en parte en el resultado sorprendente de que los medios de cultivo celular que tienen al menos 2.4 ug/L de cobre proporcionan un efecto ventajoso de promover la expresión del vWF de alto peso molecular que tiene una alta actividad específica. En particular, el vWF recombinante, de alto peso molecular de la presente invención puede incluir una forma altamente multimérica que comprende aproximadamente 14 hasta aproximadamente 22 dimeros y una actividad especifica de Ristocetina de al menos aproximadamente 30 O/\iq. Los procesos de cultivo celular de conformidad con la presente invención también permiten mantener bajos niveles de NH4+ (por ejemplo, menos de 10 mM) durante el proceso corriente arriba en sistemas de cultivo celular, de este modo produciendo efectos deletéreos para modificaciones post-traduccionales . Se cree que la presente invención proporciona por primera vez condiciones de cultivo celular que comprenden un medio que tiene una concentración adecuada de cobre en combinación con niveles apropiados de amonio en el sobrenadante para expresar un v F altamente multimérico con una alta actividad especifica.

En un aspecto, la presente invención se refiere a condiciones de cultivo celular para producir vWF recombinante , de alto peso molecular con una alta actividad especifica. Las condiciones de cultivo celular de la presente invención pueden incluir, por ejemplo, un medio de cultivo celular con una concentración incrementada de cobre y/o sobrenadante de cultivo celular con una baja concentración de amonio (NH,j+) . La presente invención también proporciona métodos para cultivar células en condiciones de cultivo celular para expresar un vWF de alto peso molecular con una alta actividad especifica.

En un aspecto, la presente invención proporciona una solución de cultivo celular para producir proteína del vWF recombinante, de alto peso molecular, la solución de cultivo celular que comprende: un medio de cultivo celular que comprende una concentración de cobre de al menos aproximadamente 2.4 ug/L; un sobrenadante de cultivo celular que comprende una concentración de amonio de menos de 10 mM; y una pluralidad de células que expresan proteína del vWF altamente multimérico, en donde la proteína del vWF comprende una actividad específica de Ristocetina de al menos aproximadamente 30 mU/ug.

En una modalidad específica de los cultivos celulares descritos anteriormente, la solución de cultivo celular comprende un suplemento de medio que comprende cobre.

En una modalidad específica de los cultivos celulares descritos anteriormente, el suplemento de medio comprende un hidrolizado, opcionalmente un hidrolizado de soj a .

En una modalidad específica de los cultivos celulares descritos anteriormente, el suplemento de medio comprende una sal de cobre, un quelato de cobre, o una combinación de los mismos.

En una modalidad específica de los cultivos celulares descritos anteriormente, la sal de cobre se selecciona del grupo que consiste de sulfato de cobre, acetato de cobre, carbonato de cobre, cloruro de cobre, hidróxido de cobre, nitrato de cobre y óxido de cobre.

En una modalidad específica de los cultivos celulares descritos anteriormente, la concentración de cobre es al menos aproximadamente 4 g/L.

En una modalidad específica de los cultivos celulares descritos anteriormente, la concentración de cobre es desde aproximadamente 2.4 ug/L hasta aproximadamente 20 ug/L.

En una modalidad específica de los cultivos celulares descritos anteriormente, la proteína del v F comprende aproximadamente 14 hasta aproximadamente 22 dímeros .

En un aspecto, la presente invención proporciona un método para producir una proteína del vWF recombinante , de alto peso molecular, el método comprende las etapas de: a) proporcionar un cultivo de células que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína del vWF recombinante; b) expresar la proteína del vWF en las células bajo condiciones de cultivo que comprenden un medio de cultivo celular que comprende una concentración de cobre de al menos aproximadamente 2.4 ug/L y un sobrenadante de cultivo celular que comprende una concentración de amonio menos de aproximadamente 10 mM, en donde la proteína del vWF es proteína del vWF altamente multimérico y comprende una actividad específica de Ristocetina de al menos aproximadamente 30 mO/]ig.

En una modalidad específica de los métodos descritos anteriormente, las células son células de mamífero.

En una modalidad específica de los métodos descritos anteriormente, las células son de una línea de células continuas.

En una modalidad específica de los métodos descritos anteriormente, las células son células CHO.

En una modalidad específica de los métodos descritos anteriormente, la concentración de cobre es al menos aproximadamente 4 ug/L.

En una modalidad específica de los métodos descritos anteriormente, la concentración de cobre es desde aproximadamente 2.4 ug/L hasta aproximadamente 20 ug/L.

En una modalidad específica de los métodos descritos anteriormente, la proteína del VWF recombinante tiene una actividad del cofactor de Ristocetina específica de al menos aproximadamente 50 mU^g.

En una modalidad específica de los métodos descritos anteriormente, la proteína del VWF recombinante tiene una actividad del cofactor de Ristocetina específica desde aproximadamente 30 mU/ig hasta aproximadamente 100 mU/\ig .

En una modalidad específica de los métodos descritos anteriormente, la proteína del VWF recombinante comprende aproximadamente 14 hasta aproximadamente 22 dímeros .

En un aspecto, la presente invención proporciona una proteína vWF recombinante, de alto peso molecular producida por un proceso, el proceso comprende las etapas de: a) proporcionar un cultivo de células que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína del vWF recombinante; y b) expresar la proteína del vWF en las células bajo condiciones de cultivo que comprenden un medio de cultivo celular que comprende una concentración de cobre de al menos 2.4 g/L y un sobrenadante de cultivo celular que comprende una concentración de amonio menos de 10 mM, en donde la proteína del vWF es proteína del vWF altamente multimérico y comprende una actividad específica de Ristocetina de al menos aproximadamente 30 mU/ g.

En una modalidad específica de la composición de los rVRF descritos anteriormente, la proteína del VWF recombinante tiene una actividad del cofactor de Ristocetina específica de al menos aproximadamente 50 mU/yag.

En una modalidad específica de la composición de los rVRF descritos anteriormente, la proteína del VWF recombinante tiene una actividad del cofactor de Ristocetina específica desde aproximadamente 30 mU/ug hasta aproximadamente 100 mU/ug.

En una modalidad específica de la composición de los rVRF descritos anteriormente, la proteína del VWF recombinante comprende aproximadamente 14 hasta aproximadamente 22 dimeros.

En un aspecto, la presente invención proporciona una solución de cultivo celular para producir proteína del vWF recombinante, de alto peso molecular, la solución de cultivo celular que comprende: un medio de cultivo celular que comprende una concentración de cobre de al menos aproximadamente 2.4 xq/l¡; un sobrenadante de cultivo celular que comprende una concentración de amonio de menos de 10 m ; y una pluralidad de células que expresan proteína del vWF altamente multimérico, en donde la proteína del vWF comprende aproximadamente 14 hasta aproximadamente 22 dimeros y una actividad específica de Ristocetina de al menos aproximadamente 30 mU/ug.

En un aspecto, la presente invención se refiere a condiciones de cultivo celular para producir vWF recombinante de alto peso molecular que está en una forma altamente multimérica con una alta actividad específica. Las condiciones de cultivo celular de la presente invención pueden incluir, por ejemplo, un medio de cultivo celular con una concentración incrementada de cobre y sobrenadante de cultivo celular con una baja concentración de amonio (NH4+) . La presente invención también proporciona métodos para cultivar células en condiciones de cultivo celular para expresar un vWF de alto peso molecular con una alta actividad específica .

En un aspecto, la presente invención incluye una solución de cultivo celular para producir vWF recombinante , de alto peso molecular, que comprende un medio de cultivo celular que comprende una concentración de cobre de al menos aproximadamente 2.4 ug/L; un sobrenadante de cultivo celular que comprende una concentración de amonio de menos de 10 mM; y una pluralidad de células que expresan vWF altamente multimérico que comprende aproximadamente 14 hasta aproximadamente 22 dímeros y una actividad específica de Ristocetina de al menos aproximadamente 30 mU/ug. En una modalidad de las soluciones de cultivo celular descritas anteriormente, al menos 10% del rV F está presente en un multímero del VWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En una modalidad específica, al menos 15% del rVWF está presente en un multímero del VWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra modalidad específica, al menos 20% del rVWF está presente en un multímero del VWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra modalidad específica, al menos 25% del rVWF está presente en un multímero del VWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra modalidad específica, al menos 30% del rVWF está presente en un multímero del VWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En ciertas modalidades, la concentración de cobre puede ser al menos aproximadamente 4 yg/L o la concentración de cobre puede variar desde aproximadamente 2.4 ug/L hasta aproximadamente 20 g/L. En algunas modalidades, los medios de cultivo celular comprenden un suplemento de medio que comprende cobre. En ciertas modalidades, el suplemento de medio puede comprender un hidrolizado o una sal de cobre, quelato de cobre, o una combinación de los mismos. En algunas modalidades, la sal de cobre puede incluir sulfato de cobre, acetato de cobre, carbonato de cobre, cloruro de cobre, hidróxido de cobre, nitrato de cobre, u óxido de cobre. En ciertas modalidades, las células pueden ser de una línea de células continuas y pueden incluir células de mamífero, tales como células CHO. En algunas modalidades, el VWF recombinante tiene una actividad del cofactor de Ristocetina específica de al menos aproximadamente 50 mU/yg, o la actividad del cofactor de Ristocetina específica puede variar desde aproximadamente 30 mU/yg hasta aproximadamente 100 mU/yg.

En otro aspecto, la presente invención incluye un método para producir un v F recombinante, de alto peso molecular, que comprende a) proporcionar un cultivo de células; b) introducir una secuencia de ácido nucleico codificante para vWF; c) seleccionar las células que llevan la secuencia de ácido nucleico; y, d) expresar el vWF en las células bajo condiciones de cultivo que comprenden un medio de cultivo celular que comprende una concentración de cobre de al menos aproximadamente 2.4 ug/L y un sobrenadante de cultivo celular que comprende una concentración de amonio menos de aproximadamente 10 mM, en donde el v F es vWF altamente multimérico que comprende aproximadamente 14 hasta aproximadamente 22 dímeros y una actividad específica de Ristocetina de al menos aproximadamente 30 mU/ug. En una modalidad del sobrenadante de cultivo celular descrito anteriormente, al menos 10% del rV F est presente en un multímero del VWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En una modalidad específica, al menos 15% del rVWF está presente en un multímero del VWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra modalidad específica, al menos 20% del rVWF está presente en un multímero del VWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra modalidad específica, al menos 25% del rVWF está presente en un multímero del VWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra modalidad específica, al menos 30% del rVWF está presente en un multímero del VWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En algunas modalidades, las células pueden ser de una línea de células continuas y pueden incluir células de mamífero, tales como células CHO. En ciertas modalidades, la concentración de cobre puede ser al menos aproximadamente 4 ug/L o la concentración de cobre puede variar desde aproximadamente 2.4 ug/L hasta aproximadamente 20 ug/L. En algunas modalidades, los medios de cultivo celular comprenden un suplemento de medio que comprende cobre. En ciertas modalidades, el suplemento de medio puede comprender un hidrolizado o una sal de cobre, quelato de cobre, o una combinación de los mismos. En algunas modalidades, la sal de cobre puede incluir sulfato de cobre, acetato de cobre, carbonato de cobre, cloruro de cobre, hidróxido de cobre, nitrato de cobre, u óxido de cobre. En algunas modalidades, el V F recombinante tiene una actividad del cofactor de Ristocetiha específica de al menos aproximadamente 50 mU/ug, o la actividad del cofactor de Ristocetina específica puede variar desde aproximadamente 30 mU/ug hasta aproximadamente 100 mU/ug.

En todavía otro aspecto, la presente invención incluye un vWF recombinante, de alto peso molecular producido por un proceso, que comprende las etapas de: a) proporcionar un cultivo de células; b) introducir una secuencia de ácido nucleico codificante para vWF; c) seleccionar las células que llevan la secuencia de ácido nucleico; y, d) expresar el vWF en las células bajo condiciones de cultivo que comprenden un medio de cultivo celular que comprende una concentración de cobre de al menos 2.4 g/L y un sobrenadante de cultivo celular que comprende una concentración de amonio menos de 10 mM, en donde el vWF es vWF altamente multimérico que comprende aproximadamente 14 hasta aproximadamente 22 dimeros y una actividad específica de Ristocetina de al menos aproximadamente 30 mU/ug. En una modalidad del sobrenadante de cultivo celular descrito anteriormente, al menos 10% del rV F está presente en un multímero del VWF de alto peso molecular de más de 10 dimeros. En una modalidad específica, al menos 15% del rVWF está presente en un multímero del VWF de alto peso molecular de más de 10 dimeros. En otra modalidad específica, al menos 20% del rVWF está presente en un multímero del VWF de alto peso molecular de más de 10 dimeros. En otra modalidad específica, al menos 25% del rVWF está presente en un multímero del VWF de alto peso molecular de más de 10 dimeros. En otra modalidad específica, al menos 30% del rVWF está presente en un multímero del VWF de alto peso molecular de más de 10 dimeros. En algunas modalidades, las células pueden ser de una línea de células continuas y pueden incluir células de mamífero, tales como células CHO. En ciertas modalidades, la concentración de cobre puede ser al menos aproximadamente 4 ig/L o la concentración de cobre puede variar desde aproximadamente 2.4 ug/L hasta aproximadamente 20 µg/L. En algunas modalidades, los medios de cultivo celular comprenden un suplemento de medio que comprende cobre. En ciertas modalidades, el suplemento de medio puede comprender un hidrol izado o una sal de cobre, quelato de cobre, o una combinación de los mismos. En algunas modalidades, la sal de cobre puede incluir sulfato de cobre, acetato de cobre, carbonato de cobre, cloruro de cobre, hidróxido de cobre, nitrato de cobre, u óxido de cobre. En algunas modalidades, el VWF recombinante tiene una actividad del cofactor de Ristocetina específica de al menos aproximadamente 50 mU/ g, o la actividad del cofactor de Ristocetina específica puede variar desde aproximadamente 30 ü/¡.g hasta aproximadamente 100 mU/^g.

En un aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende el Factor Von illebrand recombinante (rV F) que tiene una actividad del cofactor de ristocetina específica de al menos 30 ü/]ig. En una modalidad preferida, la composición tiene una actividad del cofactor de Ristocetina específica de al menos 40 mU/ug. En una modalidad más preferida, la composición tiene una actividad del cofactor de Ristocetina específica de al menos 50 mU/ug. En una modalidad más preferida, la composición tiene una actividad del cofactor de Ristocetina específica de al menos 60 mU/ug. En una modalidad más preferida, la composición tiene una actividad del cofactor de Ristocetina específica de al menos 70 mU/ug. En todavía una modalidad más preferida, la composición tiene una actividad del cofactor de Ristocetina específica de al menos 80 m\J/ig.

En una modalidad de las composiciones descritas anteriormente, al menos 10% del rVWF de la composición está presente en un multímero del VWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En una modalidad específica, al menos 15% del rVWF está presente en un multímero del VWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra modalidad específica, al menos 20% del rVWF está presente en un multímero del VWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra modalidad específica, al menos 25% del rVWF está presente en un multímero del VWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra modalidad específica, al menos 30% del rVWF está presente en un multímero del VWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros.

En una modalidad de las composiciones descritas anteriormente, la composición comprende el sobrenadante del cultivo. En una modalidad específica el sobrenadante del cultivo es un sobrenadante de cultivo celular de mamífero. En una modalidad más específica, el sobrenadante de cultivo celular de mamífero es un sobrenadante de células CHO.

En una modalidad de las composiciones descritas anteriormente, el rVWF se expresa en un cultivo celular que comprende al menos 2.4 ug/L de cobre. En una modalidad específica, el cultivo celular comprende al menos 4 ug/L de cobre. En una modalidad más específica, el cultivo comprende entre 2.4 ug/L y 20 ug/L de cobre. En una modalidad, el cobre se proporciona como una sal de cobre, un quelato de cobre, o una combinación de los mismos. En una modalidad específica, la sal de cobre se selecciona del grupo que consiste de sulfato de cobre, acetato de cobre, carbonato de cobre, cloruro de cobre, hidróxido de cobre, nitrato de cobre y óxido de cobre .

En una modalidad de las composiciones descritas anteriormente, el cultivo celular es un cultivo de lotes.

En una modalidad de las composiciones descritas anteriormente, el cultivo celular es un cultivo continuo. En una modalidad específica, el cultivo continuo se realiza en modo quimiostático . En otra modalidad específica, el cultivo continuo se realiza en modo de perfusión.

En una modalidad de las composiciones descritas anteriormente, el nivel de NH4+ en el cultivo se mantiene a una concentración por debajo de 4 mM.

En una modalidad de las composiciones descritas anteriormente, la densidad celular del cultivo se mantiene a menos de 2.5xl06 células por mL.

En una modalidad de las composiciones descritas anteriormente, la densidad celular del cultivo se mantiene a menos de 2.0x106 células por mL .

En una modalidad de las composiciones descritas anteriormente, el cultivo se mantiene a menos de 1.5xl06 células por mL.

En una modalidad de las composiciones descritas anteriormente, el rV F es co-expresado con el Factor VIII recombinante (rFVIII). En una modalidad específica, la mayoría del rFVIII co-expresado se ha removido. En una modalidad más específica, la relación del rV F a rFVIII en la composición es al menos 10:1.

En una modalidad de las composiciones descritas anteriormente, la composición es formulada para administración farmacéutica. En una modalidad específica, la composición es formulada para administración intravenosa, subcutánea o intramuscular.

En una modalidad de las composiciones descritas anteriormente, la composición es liofilizada.

En todavía otro aspecto, la presente invención incluye un vWF recombinante, de alto peso molecular producido por un proceso, que comprende las etapas de: a) proporcionar un cultivo de células; b) introducir una secuencia de ácido nucleico codificante para vWF; c) seleccionar las células que llevan la secuencia de ácido nucleico; y, d) expresar el vWF en las células bajo condiciones de cultivo que comprenden un medio de cultivo celular que comprende una concentración de cobre de al menos 2.4 g/L y un sobrenadante de cultivo celular que comprende una concentración de amonio menos de 10 mM, en donde el vWF es vWF altamente multimérico que comprende aproximadamente 14 hasta aproximadamente 22 dímeros y una actividad específica de Ristocetina de al menos aproximadamente 30 mU/ug. Se entiende que todas las modalidades y concentraciones descritas en las secciones anteriores "Medios de Cultivo Celular" y "Métodos para Producir vWF Recombinante" pueden aplicar aquí.

El VWF recombinante de la presente invención puede incluir una proteína del vWF recombinante de alto peso molecular que tiene una alta actividad específica. En una modalidad, el vWF de la presente invención es una forma altamente multimérica del vWF. En algunas modalidades, la forma altamente multimérica del vWF incluye al menos hasta aproximadamente 14 dímeros y en otras modalidades al menos hasta aproximadamente 22 dímeros. En todavía otras modalidades, la forma altamente multimérica del vWF puede variar desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 20 dímeros, o desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 25 dímeros, o desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 40 dímeros. En ciertas modalidades, el VWF recombinante es comparable con el vWF plasmático.

Como se describe en la presente, la presente invención proporciona el resultado sorprendente que la concentración incrementada de cobre en medios de cultivo celular puede producir vWF de alto peso molecular con alta actividad específica. Medios de cultivo celular que comprenden una concentración de cobre, por ejemplo, mayor de aproximadamente 2.4 ug/L pueden incrementar el rendimiento del vWF multimérico recombinante, comparado con media sin cobre. En ciertas modalidades, el porcentaje de vWF multimérico (es decir, rVWF que comprende al menos 2 dimeros) puede ser mayor de aproximadamente 50%, o mayor de aproximadamente 75%, o mayor de aproximadamente 90%. La distribución multimérica del vWF puede ser analizada usando técnicas estándares tales como, por ejemplo, en electroforesis de Agarosa bajo condiciones no reductoras .

Como se proporciona en la presente, el VWF recombinante producido por los métodos de la presente invención puede tener una alta actividad específica, por ejemplo, una alta actividad del cofactor de Ristocetina específica. En una modalidad, el VWF recombinante producido por los métodos de la presente invención puede incluir una actividad del cofactor de Ristocetina específica de al menos 30 mU/ug y en otra modalidad al menos 50 mU/ug. En otras modalidades, la actividad del cofactor de Ristocetina específica puede variar desde aproximadamente 30 mU/ug hasta aproximadamente 100 mU/ug o desde aproximadamente 50 mU/ug hasta aproximadamente 100 mU/ug.

B. ADAMTS13 recombinantes (rA13) Las proteínas ADAMTS (es decir, ADAMTS-1 a ADAMTS-20) son una familia de metaloproteinasas de zinc secretadas que portan una organización de dominio modular común (para revisión, véase, Flannery C.R., Front Biosci. 2006 Jan l;ll:544-69) . Todas las proteínas ADAMTS portan una arquitectura de dominio de núcleo común, que consiste de un péptido señal, seguido por una prodominio, un dominio catalítico de metaloproteinasa dependiente del zinc, un dominio similar a desintegrina, una repetición de tromboespondina tipo I, un dominio rico en cisteína y un dominio espaciador (Apte S.S., J Biol Chem. 2009 Nov 13 ; 284 (46) : 31493-7) . Adicionalmente , todos pero el ADAMTS-4 contienen al menos un dominio de repetición de tromboespondina tipo I y muchas de las proteínas ADAMTS contienen uno o más dominios ancilares adicionalmente. Notablemente, se ha reportado que todas las proteínas ADAMTS parecen contener al menos un sitio de unión a calcio y un sitio de unión a zinc localizados dentro del dominio catalítico de metaloproteinasas (Andreini et al., J. Proteome Res., 2005, 4 (3), pp 881-888).

Los papeles biológicos para proteínas ADAMTS se han reportado para varias enfermedades y condiciones, que incluyen, antiangiogénesis , fibrosis intersticial renal, remodelación ósea, foliculogénesis de ovario, aterosclerosis, desarrollo urogenital, y crecimiento/remodelación del tumor (ADAMTS-1) ; síndrome Ehler-Danlos tipo 7C y dermotopraxis bovina (ADAMTS-2); artritis, aterosclerosis y tendinopatía (ADAMTS-4 ) ; artritis y glibolastoma (ADAMTS- 5) ; artritis (ADAMTS-7) ; antiangiogénesis, males cerebrales, artritis y aterosclerosis (ADAMTS-8) artritis (ADAMTS-9 , -12) ; púrpura trombocitopénica trombótica (ADAMTS-13); y antitrombosis/apoplejía (para revisión, véase, Lin and Liu, Open Access Rheu atology Research and Reviews 2009:1 121-131) .

Las ADAMTS13 recorabinantes (A13) han sido expresadas antes en células de mamífero, sin embargo la actividad específica varía ampliamente dependiendo de las condiciones de cultivo celular. Se ha encontrado que muchos medios de cultivo comercialmente disponibles no son suficientes para expresión de rA13 con altas actividades específicas, expresadas como la relación de actividad, medida por el ensayo FRETS-VWF73. Para contenido de antígeno, como se determina por ELISA. En un aspecto, los métodos proporcionados en la presente se basan en varios hallazgos ventajosos que permiten la expresión del cultivo celular de rA13 que tiene niveles incrementados de actividad total y específica .

Por consiguiente, debido a la relación de estructura-función portada entre la familia ADAMTS de metaloproteinasas secretadas, los métodos proporcionados por la presente invención permiten la expresión de todas las proteínas ADAMTS en cultivo celular y recuperación del medio celular .

En un aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende ADAMTS13 recombinante (rA13) que tiene actividad de FRETS-VWF específica de al menos 1600 mU/pg.

En una modalidad de las composiciones descritas anteriormente, la rA13 tiene una actividad de FRETS-VWF específica de al menos 800 mU/pg.

En una modalidad de las composiciones descritas anteriormente, la composición comprende el sobrenadante del cultivo. En una modalidad específica, el sobrenadante del cultivo es un sobrenadante de cultivo celular de mamífero. En una modalidad más específica, el sobrenadante de cultivo celular de mamífero es un sobrenadante de células CHO.

En una modalidad de las composiciones descritas anteriormente, la rA13 es expresada en un cultivo celular que comprende al menos 1 ug/L de cobre. En una modalidad específica, el cultivo celular comprende al menos 2 pg/L de cobre. En una modalidad más específica, el cultivo comprende entre 2 ug/L y 20 ug/L de cobre.

En una modalidad de las composiciones descritas anteriormente, el cobre se proporciona como una sal de cobre, un quelato de cobre, o una combinación de los mismos. En una modalidad específica, la sal de cobre se selecciona del grupo que consiste de sulfato de cobre, acetato de cobre, carbonato de cobre, cloruro de cobre, hidróxido de cobre, nitrato de cobre y óxido de cobre .

En una modalidad de las composiciones descritas anteriormente, el nivel de NH4+ en el cultivo se mantiene a una concentración por debajo de 5 mM.

En una modalidad de las composiciones descritas anteriormente, la densidad celular del cultivo se mantiene a menos de 4. OxlO6 células por mL. En una modalidad específica, la densidad celular del cultivo se mantiene a menos de 3. OxlO6 células por mL. En una modalidad específica, la densidad celular del cultivo se mantiene a menos de 2. OxlO6 células por mL. En una modalidad más específica, la densidad celular del cultivo se mantiene a menos de 1.5xl06 células por mL.

VI. Formulaciones En un aspecto, las formulaciones que comprenden las proteínas terapéuticas recombinantes rVWF o rA13 de la presente invención son liofilizadas previo a la administración. La liofilización se lleva a cabo usando técnicas comunes en el arte y debe ser optimizada para la composición a ser desarrollada [Tang et al., Pharm Res. 21:191-200, (2004) y Chang et al., Pharm Res. 13:243-9 (1996) ] .

Los Métodos para preparar formulaciones farmacéuticas pueden incluir una o más de las siguientes etapas: agregar un agente estabilizante como se describe en la presente a tal mezcla previo a la liofilización, agregar al menos un agente seleccionado de un agente de volumen, un agente que regula la osmolaridad y un tensioactivo, cada uno de los cuales es como se describe en la presente, a tal mezcla previo a la liofilización. Una formulación liofilizada está, en un aspecto, al menos comprendida de uno o más de un amortiguador, un agente de volumen y un estabilizador. En este aspecto, la utilidad de un tensioactivo se evalúa y selecciona en casos donde la agregación durante la etapa de liofilización o durante la reconstitución llega a ser un problema. Un agente amortiguador apropiado se incluye para mantener la formulación dentro de zonas estables de pH durante la liofilización .

La práctica de reconstitución estándar para el material liofilizado se agrega nuevamente a un volumen de agua pura o agua estéril para inyección (WFI, por sus siglas en inglés) (típicamente equivalente al volumen removido durante la liofilización) , aunque las soluciones dilutas de agentes antibacterianos son algunas veces usadas en la producción de farmacéuticos para administración parenteral [Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy, 18:1311-1354 (1992)]. Por consiguiente, se proporcionan métodos para la preparación de composiciones del V F recombinante reconstituidas que comprenden la etapa de agregar un diluyente a una composición del VWF recombinante liofilizada de la invención.

El material liofilizado puede ser reconstituido como una solución acuosa. Una variedad de portadores acuosos, por ejemplo, agua estéril para inyección, agua con preservativos para uso de dosis múltiples, o agua con cantidades apropiadas de tensioactivos (por ejemplo, una suspensión acuosa que contiene el compuesto activo en mezcla con excipientes adecuados para la manufactura de suspensiones acuosas) . En varios aspectos, tales excipientes son agentes de suspensión, por ejemplo y sin limitación, carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma de acacia; agentes de dispersión o humectantes son un fosfátido que se origina naturalmente, por ejemplo y sin limitación, lecitina, o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos, por ejemplo y sin limitación, estearato de polioxietileno, o productos de condensación óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo y sin limitación, heptadecaetil-eneoxicetanol , o productos de condensación de óxido de etileno con esteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol tal como monooleato de polioxietilen sorbitol, o productos de condensación de óxido de etileno con ásteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo y sin limitación, monooleato de polietilen sorbitán. En varios aspectos, las suspensiones acuosas también contienen uno o más preservativos, por ejemplo y sin limitación, etilo, o n-propilo, p-hidroxibenzoato .

Para administrar composiciones a humanos o animales de prueba, en un aspecto, las composiciones comprenden uno o más portadores farmacéuticamente aceptables. Las frases "farmacéuticamente" o "farmacológicamente" aceptables se refieren a entidades y composiciones moleculares que son estables, inhiben la degradación de la proteína tal como productos de desdoblamiento y agregación, y demás no producen reacciones alérgicas u otras adversas cuando se administran usando rutas bien conocidas en la técnica, como se describe abajo. "Portadores farmacéuticamente aceptables" incluyen cualquier y todos los solventes clínicamente útiles, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos , agentes que retardan la absorción e isotónicos y similares, que incluyen aquellos agentes descritos anteriormente .

Las formulaciones farmacéuticas son administradas intravenosamente, oralmente, tópicamente, transdermalmente, parenteralmente , por atomización de inhalación, vaginalmente, rectalmente o por inyección intracraneal . El término parenteral como se usa en la presente incluye inyecciones subcutáneas, intravenosas, intramusculares, inyección int acisteARNl , o técnicas de infusión. La administración por intravenosa, intradérmal, intramuscular, intramamaria, intraperitoneal , intratecal, retrobulbar, inyección pulmonar y/o implante quirúrgico en un sitio particular está contemplada también. En general, las composiciones están esencialmente libres de pirógenos, así como también de otras impurezas que podrían ser peligrosas al recipiente.

Las administraciones únicas o múltiples de las composiciones se llevan a cabo a los niveles y patrones de dosis siendo seleccionados por el especialista que trata.

Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosificación apropiada depende del tipo de enfermedad a ser tratada, la severidad y curso de la enfermedad, si el fármaco es administrado para propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, el historial clínico del paciente y respuesta al fármaco, y la discreción del especialista que atiende.

En un aspecto, las formulaciones de la invención son administradas por un bolo inicial seguido por una infusión continua para mantener los niveles de circulación terapéuticos del producto de fármaco. Como otro ejemplo, el compuesto inventivo se administra como una dosis de una vez. Aquellos de habilidad ordinaria en la técnica optimizarán fácilmente dosificaciones y regímenes de administración efectivos como se determina por la buena práctica médica y la condición clínica del paciente individual. La frecuencia de dosificación depende de los parámetros de farmacocinética de los agentes y la ruta de administración. La formulación farmacéutica óptima se determina por un experto en la técnica dependiendo de la ruta de administración y la dosificación deseada. Véase por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co . , Easton, Pa. 18042) páginas 1435-1712, la modalidad de la cual está de este modo incorporada por referencia. Tales formulaciones influencian el estado físico, estabilidad, velocidad de liberación in vivo y velocidad de separación in vivo de los agentes administrados. Dependiendo de la ruta de administración, una dosis adecuada se calcula de conformidad con el peso corporal, área de superficie corporal o tamaño de órgano. Las dosificaciones apropiadas pueden ser evaluadas a través del uso de ensayos establecidos para determinar las dosificaciones del nivel de sangre en conjunto con los datos de respuesta de dosis apropiados. El régimen de dosificación final se determina por el especialista que atiende, considerando varios factores los cuales modifican la acción de los fármacos, por ejemplo, la actividad específica del fármaco, la severidad del daño y la capacidad de respuesta del paciente, la edad, la condición, peso corporal, sexo y dieta del paciente, la severidad de cualquier infección, tiempo de administración y otros factores clínicos. Por medio del ejemplo, una dosis típica de un vWF recombinante de la presente invención es aproximadamente 50 U/kg, igual a 500 ug/kg. Como se conducen los estudios, la información adicional emergerá con respecto a los niveles de dosificación apropiados y duración del tratamiento para varias enfermedades y condiciones.

VII. Métodos de tratamiento La presente invención además contempla métodos para tratar un paciente en necesidad de rVWF o rA13 producidos de conformidad con los métodos descritos en la presente. Tales métodos de tratamiento pueden incluir administración de formulaciones farmacéuticas que comprenden la rA13 recombinante o el vWF recombinante , de alto peso molecular de la presente invención.

En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para tratamientos terapéuticos o profilácticos que comprenden la administración de una composición de rV F o rA13 proporcionada en la presente. En general, para aplicaciones terapéuticas, las formulaciones son administradas a un sujeto con una enfermedad o condición asociada con disfunción de ADAMTS13 o VWF o de otro modo en necesidad de las mismas, en una "dosis terapéuticamente efectiva" . Las formulaciones y cantidades efectivas para estos usos dependerán de la severidad de la enfermedad o condición y el estado general de la salud del paciente. Las administraciones únicas o múltiples de las formulaciones pueden ser administradas dependiendo de la dosificación y frecuencia como se requiera y tolere por el paciente.

En una modalidad, la presente invención proporciona métodos para tratar o prevenir una enfermedad o condición asociada con una disfunción de ADAMTS13 ó VWF. En una modalidad adicional, las formulaciones farmacéuticas que comprende vWF recombinante pueden ser administradas para tratar enfermedades relacionadas a vWF, tal como enfermedad de von Willebrand o hemofilia. En otra modalidad, la invención proporciona métodos de tratamiento o prevención de una enfermedad o condición asociada con la formación y/o presencia de uno o más trombos, que comprende la administración de una composición rA13 proporcionada en la presente. En una modalidad adicional, la invención proporciona métodos para desintegrar uno o más trombos en un sujeto en necesidad del mismo. En aún otras modalidades, la invención proporciona métodos de tratamiento o prevención de un infarto en un sujeto en necesidad de los mismos. Generalmente, los métodos proporcionados por la invención comprenden administrar una composición rADAMTS13 proporcionada en la presente a un sujeto en necesidad de la misma.

Ejemplos no limitantes de trastornos asociados con la formación y/o la presencia de uno o más trombos son púrpura trombocitopénica trombótica hereditaria (TTP) , TTP adquirida, trombosis arterial, infarto al miocardio agudo (AMI, por sus siglas en inglés), apoplejía, sepsias y coagulación intravascular diseminada (DIC, por sus siglas en inglés) .

Ejemplos no limitantes de trastornos asociados con un infarto, incluyen sin limitación, infarto al miocardio (ataque al corazón) , embolismo pulmonar, eventos cerebrovasculares tales como apoplejía, enfermedad oclusiva de la arteria periférica (tal como gangrena) , síndrome antifosfolípido, sepsias, arteritis de la célula gigante (GCA, por sus siglas en inglés) , hernia y vólvulo.

VIII. Ejemplos La presente invención ahora será ilustrada adicionalmente en los siguientes ejemplos, sin ser limitada a esto .

Ejemplo 1 Se realizaron experimentos de cultivo celulares continuos usando cultivos de una línea de célula CHO recombinante que expresa vWF. El medio basal como DMEM/F12, el cual contiene aproximadamente 0.3 ]ig/L de Cu2+ . El medio es suplementado con hidrolizado de soja y sulfato de cobre (CuS04*5H20) para llevar la concentración de cobre final en el medio a más de al menos 2.4 pg/L.

Las células CHO recombinantes que expresan vWF son cultivados por cultivos celulares continuos de forma que los niveles de amonio (NH4+) se mantienen a una concentración menos de aproximadamente 10 ttiM. Se encontró que los sistemas de producción que proporcionan un suplemento de medio continuo (por ejemplo, cultivos de perfusión o quimiostato) son preferibles porque el lote convencional o técnicas alimentados por lote produce altas concentraciones de NH4+ al final del cultivo. Al final del cultivo, el vWF altamente multimérico se aisló y la actividad del Cofactor Ristocetina específico del vWF se midió.

Ejemplo 2 El Factor Recombinante VIII (rFVIII) y Factor de Von illebrand (rVWF) son co-expresados en cultivos por lotes de células GD8/6 para determinar el efecto de la composición del medio de cultivo en expresión y actividad de VWF. Brevemente, las células GD8/6 son cultivadas por lotes en medio BAV-SP compuesto de un polvo basal D EM/F12 (Tabla 5) y suplementos adicionales también que contienen 4 g/L de hidrolizado de soja, véase Tabla 6, con y sin suplementación de cobre adicional. Para probar el efecto de bajas concentraciones de cobre en expresión y actividad de rVWF, se usó medio BAV-SP basal. El medio basal que contiene 0.3 ]ig/L de cobre y fue suplementado con hidrolizado de soja, lo cual contribuye con un 0.7 ug/L de cobre adicional, como se determinó experimentalmente , proporcionando una concentración de cobre final de 1.0 ug/L. Como una comparación, el medio BAV-SP usado para los cultivos por lotes fue suplementado adicionalmente con un 3.3 ug/L adicional de Cu2+, proporcionando una concentración de cobre final de 4.3 g/L, para determinar el efecto de altas concentraciones de cobre en expresión y actividad de VWF.

Tabla 5. Comparación del Medio de Cultivo BAV-SP Tabla 6. Composición de BAV-SP Suplementado Las células GD8/6 que expresan rVWF se hacen crecer en ya sea medio bajo en cobre (Tabla 7) o medio alto en cobre (Tabla 8) por 7 días. Después de 2 días, los cultivos se subcultivaron para realizar un cultivo por lote por un periodo de 5 días. Las muestras del sobrenadante del cultivo se probaron diariamente para contenido de rVWF (ELISA v F) , total (Ristocetina) y específico (Actividad Específica) vía un ensayo del cofactor de ristocetina. Varios parámetros de cultivo, que incluyen conteo celular, viabilidad celular y concentración de amonio también son monitoreadas diariamente (excepto por lotes los días 3 y 4) .

Inesperadamente, los cultivos se hacen crecer bajo altas concentraciones de cobre que producen sobrenadantes que contienen actividad rVWF específica y total significantemente alta (resultados comparados en la Tabla 7 y Tabla 8) . Por ejemplo, en el lote del día 4, el cultivo celular se hace crecer bajo concentraciones altas en cobre que contienen actividad rVWF de 1.52 IU/mL, comparado a la actividad rVWF 0.2 IU/mL para el cultivo bajo en cobre. Esto es a pesar del hecho que el cultivo celular bajo en cobre que produce casi dos veces la cantidad de rVWF como el cultivo celular alto en cobre. Además, la actividad específica del sobrenadante obtenido del cultivo alto en cobre fue más de 13 veces mayor que del sobrenadante del cultivo bajo en cobre (831 mU/10 g de rVWF contra 62 mU/10 µg de rVWF) .

Como se observa en la Tabla 7 y Tabla 8, la actividad del cofactor de ristocetina total y específica del cultivo alto en cobre fue dos veces que la del cultivo bajo en cobre en el lote del día 1. Además, en contraste a los subsecuentes incrementos en actividad observados en el cultivo alto en cobre, no se observa incremento en la cantidad de actividad del cofactor ristocetina después del lote del día 1 para el cultivo celular bajo en cobre. Consistente con este resultado, el análisis de electroforesis en gel de agarosa del estado de multímero rVWF reveló que una baja concentración de rVWF de peso molecular bajo, en relación a la concentración de especies de rVWF de bajo peso molecular, está presente en el sobrenadante del cultivo celular bajo en cobre en el lote del día 1, y que la concentración relativa además disminuye con el tiempo (Figura 1A y IB) . En contraste, la suplementación del medio de cultivo con Cu+ resulta en la formación consistente del antígeno activo del cofactor ristocetina (RiCoF) a través del cuarto día. Consistentemente, no hay pérdida en la cantidad de multímeros rVWF de alto peso molecular estables ocurrido a través del día 4 del cultivo por lote (Figura 1A y IB) . Los resultados densitométricos del electroforesis en gel de agarosa mostrados en la Figura IB reveló que las condiciones bajas en cobre del cultivo fue solamente capaz de producir una población de rVWF en el cual más del 10% (es decir, 16.3%) del rVWF está presente en moléculas que tienen más de 10 dímeros para un día del cultivo por lotes (es decir, muestra del "día 3" en Línea 2 del gel de agarosa de la Figura 1A) , y notablemente, esta población cayó solamente al 4% en el día 5 del cultivo por lotes (muestra del "día 7" en la Línea 6) . En contraste bajo en condiciones altas en cobre, la cantidad relativa de multímeros vWF con más de 10 dímeros es consistentemente alrededor de 30% a través del día 4 del cultivo por lotes ("día 3" a "día 6" en Líneas 7-10; 28% a 31.4%) .

Notablemente, iniciando en el lote del día 5 del cultivo por lotes alto en cobre, cuando los niveles de NH4+ exceden 100 mg/L (mayor que aproximadamente 5.0 mM) , la expresión del antígeno adicional (18.3 a 35.4 ]ig/l¡; comparado al lote de los días 4 y 5 de la Tabla 8) no resulta en un incremento concomitante en la actividad de RiCoF presente en el sobrenadante. Consistente con este resultado, el nivel de multímeros rVWF de alto peso molecular en el lote del día 5 (día 7 del cultivo) disminuye en la relación a la concentración de multímeros rVWF de bajo peso molecular. También solamente en el lote del día 5 (muestra del "día 7" del cultivo en la Línea 11) , la cantidad relativa del vWF con más de 10 dímeros es reducido a 21.4%.

Tomados juntos, los datos proporcionados anteriormente demuestran que la suplementación de concentraciones de cobre en cultivos celulares que expresan rVWF dramáticamente incrementa la actividad del cofactor de ristocetina rVWF total y específica, así como también la producción estable de multímeros rVWF de alto pero molecular. Además, los datos muestran una correlación entre la presencia de concentraciones de NH4+ altas en los cultivos celulares y la pérdida de la actividad del cofactor ristocetina rVWF y producción del multímero rVWF de alto pero molecular.

Tabla 7. Expresión de rVWF en cultivo de células de mamífero realizados en forma de lote usando media BAV-SP con una concentración de cobre baja (1.0 ]xg/L) .

Tabla 8. Expresión de rVWF en cultivo celular mamífero realizados en forma de lote usando media BAV-SP una concentración de cobre baja (4.3 ig/L¡) .

Ej emplo 3 Se co-expresaron el Factor Recombinante VIII (rFVIII) y el Factor de Von illebrand (rVWF) en cultivos continuos de células GD8/6 operadas bajo condiciones quimiostáticas para determinar el efecto de la composición del medio de cultivo en expresión y actividad VWF. Brevemente, las células GD8/6 se cultivaron en medio BAV-SP que contiene 4 g/L de hidrolizado de soja con y sin suplementación de cobre como se describe en el Ejemplo 2. Para probar el efecto de concentraciones de cobra bajas en expresión y actividad rVWF, se usó medio BAV-SP basal . El medio basal contiene 0.3 ug/L de cobre y se suplemento con hidrolizado de soja, lo cual contribuye a 0.7 ug/L de cobre adicional, proporcionando una concentración de cobre final de 1.0 µg/h. Como una comparación, el medio BAV-SP usado para los cultivos por lote fue suplementado adicionalmente con 3.3 Ug/L de Cu2+ adicional, proporcionando una concentración de cobre final de 4.3 ug/L, para determinar el efecto de concentraciones de cobre altas en expresión y actividad VWF. Los cultivos se hicieron crecer en la presencia de concentraciones de cobre altas y bajas se cultivaron bajo densidades celulares tanto altas (2.8xl06 células/mL) como bajas (aproximadamente 1.4xlOE06 células/mL) .

Como anteriormente, las muestras del sobrenadante del cultivo se probaron para contenido de rVWF (ELISA vWF) , actividad total (Ristocetina) y específica (Actividad Específica) vía ensayo del cofactor ristocetina. También se monitorearon varios parámetros del cultivo, que incluyen conteo celular, viabilidad celular y concentración de amonio. Los datos se generaron de la fase de estado estable de las semanas 2 y 3 de los cultivos quimiostático (Tabla 9 a Tabla 13) .

Tabla 9. Datos de la media para expresión rVWF en cultivo celular quimioestático durante las semanas 2 y 3.

Tabla 10. Expresión rV F en cultivo celular quimioestático durante el conteo celular alto, condiciones de cobre bajas durante las semanas 2 y 3.

Tabla 11. Expresión rVWF en cultivo celular quimioestático durante el conteo celular alto, condiciones de cobre altas durante las semanas 2 y 3.

Tabla 12. Expresión rV F en cultivo celular quimioestático durante el conteo celular bajo, condiciones de cobre bajas durante las semanas 2 y 3.

Tabla 13. Expresión rV F en cultivo celular quimioestático durante el conteo celular bajo, condiciones de cobre altas durante las semanas 2 y 3.

Como se muestra en la Figura 2A, el sobrenadante recolectado del cultivo celular rVWF continuo que crece a densidades celulares bajas y concentraciones de cobre altas que contienen actividad específica alta (promedio de 600 mU/10 pg) , mientras los sobrenadantes recolectados de los cultivos celulares rVWF que crecen a densidades celulares bajas en la presencia de concentraciones de cobre bajas que contienen actividades específicas bajas (menos de 100 mU/10 ig) . Consistente con los resultados observados para cultivos por lotes, la Figura 2B muestra cultivos celulares de mamífero continuos que expresan rVWF con actividades específicas altas que tienen concentraciones de NH4+ más bajas que los cultivos que produce rVWF con actividades específicas bajas. Estos datos además refuerzan la correlación entre la concentración de NH4+ en el cultivo celular y la actividad específica de rVWF producido por el cultivo. Notablemente, la combinación de concentraciones de cobre altas y concentraciones de amino bajas en el cultivo celular permitidas para la producción de actividad rVWF significativamente mejorada.

Consistente con este resultado, el análisis de electroforesis en gel de agarosa del estado de multímero rVWF de cultivos quimiostato (Figura 6A-6B) reveló que solamente los sobrenadantes de los cultivos operados a densidades de cobre altas y celulares bajas y así el amonio bajo resultó en un vWF multimérico de expresión alta consistente (aproximadamente 23% a 27% en CST a los días 8, 17 y 24 en Líneas 4, 8 y 12, respectivamente). Todas las otras condiciones no alcanzan cantidades consistentemente altas de más del 10% de vWF con más de 10 dímeros durante un periodo de cultivo prolongado.

Ejemplo 4 Para determinar el efecto de la concentración de cobre en el medio de cultivo en la expresión y actividad específica de rA13, se hicieron crecer cultivos celulares de mamífero que expresan rA13 por 4 semanas bajo condiciones de cultivo continuo quimiostático en medio ADAMTS13 que comprende BESP845del medio basal DMEM/F12 y suplementos adicionales (Tabla 14) que contiene concentraciones de cobre que varía de 0.66 ug/L (sin suplementacion de cobre adicional) y con suplementacion de cobre adicional a 4 ug/L. Como se muestra en la Tabla 5, incrementando la concentración de cobre en el medio de cultivo celular resulta en un incremento significante en productividad volumétrica (P) y específica (q) expresada como la actividad de rA13 total producida por litro de cultivo y día, y la actividad de rA13 total producida por célula y día, respectivamente.

Tabla 14. Composición del medio ADAMTS13.

Para determinar si las concentraciones de cobre incrementadas afectan la integridad del rA13 expresado, se examinó el sobrenadante recolectado de cultivos celulares rA13 que crecen en medio que contiene 0.66 ug/L, 1 ug/L y 4 ug/L de cobre por análisis SDS-PAGE. Como se observa en la Figura 3A (tinte de plata) y Figura 3B (Western Blot anti-A13), no se observaron cambios obvios en la calidad del producto por electroforesis en gel . Específicamente, no hay incremento en el nivel de 170 kD truncado u otras variantes rA13 MW bajos y no hay otras bandas HCP adicionales o incrementadas resultado de la expresión rA13 en la presencia de concentraciones de cobre incrementadas.

Para estimar una concentración óptima de cobre en la actividad de rA13, una extrapolación de datos de la Tabla 15 de P Frest contra concentración de cobre (Figura 4) muestra que el efecto óptimo es igualmente alcanzado a aproximadamente 2 ug/L, con una estimación conservadora de un efecto negativo por arriba de aproximadamente 4 ug/L.

Tabla 15. Expresión de rA13 en cultivo celular de mamífero realizado en modo de cultivo continúo quimostático usando medio que contiene concentraciones de cobre variables .

En base a los resultados obtenidos anteriormente, se realiza un experimento adicional, el cual compara la expresión de rA13 en medio de cultivo celular que contiene 0.66 pg/L de cobre con 2.0 pg/L de cobre. Como se muestra en la Tabla 16, la suplementación del medio celular basal con cobre, para una concentración final de 2.0 pg/L de cobre, resultando en un incremento significante en productividad volumétrica (P) y especifica (q) expresada como la actividad de rA13 total producida por litro de cultivo y día, y la actividad de rA13 total producida por célula y día, respectivamente, durante un periodo de 8 semanas. Los datos específicos para cada semana de producción de rA13 en los dos cultivos se muestran en las Figuras 5A-5K. A partir de estos datos, es claro que la suplementación con cobre tiene un efecto benéfico medible en metabolismo celular, velocidad de crecimiento específico y productividad de rA13.

Tabla 16. Expresión de rAl3 en cultivo celular de mamífero realizado en modo de cultivo continúo quimostático usando medio que contiene concentraciones de cobre variables.

Se entenderá que los ejemplos y modalidades descritas en la presente son para propósitos ilustrativos solamente y que se pueden sugerir varios cambios o modificaciones en vista de la misma a personas expertas en la técnica y deben ser incluidos dentro del espíritu y competencia de esta solicitud y alcance de las reivindicaciones adjuntas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes citadas en la presente son por este medio incorporadas para referencia en su totalidad para todos los propósitos.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reividicaciones :

1. Un método para producir una composición del Factor Von illebrand recombinante (rVWF) , caracterizado porque comprende las etapas de : (a) proporcionar un medio de cultivo de células básales; (b) suplementar el medio de cultivo de células básales con cobre para proporcionar una concentración de cobre final de al menos 2.4 ug/L; (c) proporcionar una o más células que comprenden un ácido nucleico que codifica una proteína del rvWF; (d) cultivar una o más células en el medio de cultivo de células suplementadas con cobre de manera que el rVWF se expresa y excreta de las células en un cultivo de sobrenadante ; y (e) recuperar al menos una porción del cultivo sobrenadante , en donde el sobrenadante recuperado tiene una actividad del cofactor de ristocetina específico del rVWF de al menos 30 mU/ug del rVWF.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende la etapa de suplementar el medio de cultivo de células básales con un hidrolizado previo a cultivar una o más células.

3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el hidrolizado es un hidrolizado de planta .

4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el hidrolizado es un hidrolizado de soja .

5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el medio de cultivo de células básales es un medio de cultivo libre de proteína animal .

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el medio de cultivo de células básales es un medio de cultivo libre de proteína .

7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el medio de cultivo de células básales es un medio de cultivo libre químicamente definido.

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la concentración final de cobre del medio de cultivo de células básales suplementado con cobre es al menos 4 ig/l¡ de cobre.

9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la concentración final de cobre del medio de cultivo de células básales suplementado con cobre es entre 2.4 ug/L y 20 pg/L de cobre.

10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el medio de cultivo de células básales suplementado con cobre se proporciona como una sal de cobre, un quelato de cobre, o una combinación de los mismos.

11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la sal de cobre se selecciona del grupo que consiste de sulfato de cobre, acetato de cobre, carbonato de cobre, cloruro de cobre, hidróxido de cobre, nitrato de cobre y óxido de cobre.

12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque una o más células son células de mamífero.

13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque las células de mamífero son células CHO .

14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 , caracterizado porque cultivar una o más células comprende cultivación por lotes de las células.

15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 , caracterizado porque cultivar una o más células comprende cultivación continua de las células.

16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la cultivación continua de células se realiza en modo quimiostático .

17. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la cultivación continua de células se realiza en modo de perfusión.

18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque una o más células se cultivan en al menos 100 L del medio de cultivo suplementado a base de células básales.

19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque la densidad celular se mantiene a menos de 2.5xl06 células por mL durante la etapa de cultivar una o más células.

20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la densidad celular se mantiene a menos de 2.0xl06 células por mL durante la etapa de cultivar una o más células.

21. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la densidad celular se mantiene a menos de 1.5xl06 células por mL durante la etapa de cultivar una o más células.

22. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque la etapa de recuperar al menos una porción del cultivo sobrenadante comprende filtración o centrifugación para remover las células de la porción del sobrenadante del cultivo.

23. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, caracterizado porque el sobrenadante recuperado tiene una actividad del cofactor de ristocetina específico del rV F de al menos 40 mU/ug del rVWF.

24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el sobrenadante recuperado tiene una actividad del cofactor de ristocetina específico del rVWF de al menos 50 mU/ug del rVWF.

25. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el sobrenadante recuperado tiene una actividad del cofactor de ristocetina específico del rVWF de al menos 60 mU/Vg del rVWF.

26. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el sobrenadante recuperado tiene una actividad del cofactor de ristocetina específico del rVWF de al menos 70 mU/yg del rVWF.

27. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el sobrenadante recuperado tiene una actividad del cofactor de ristocetina específico del rVWF de al menos 80 mU/yg del rVWF.

28. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, caracterizado porque al menos 10% del rVWF en el sobrenadante está presente en un multímero del V F de alto peso molecular de más de 10 dímeros.

29. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, caracterizado porque al menos 20% del rVWF en el sobrenadante está presente en un multímero del VWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros.

30. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, caracterizado porque al menos 30% del rVWF en el sobrenadante está presente en un multímero del VWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros.

31. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, caracterizado porque el sobrenadante contiene multímero del VWF de alto peso molecular de 14 a 22 dímeros .

32. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31, caracterizado porque el contenido de NH4+ of el sobrenadante de cultivo celular se mantiene a una concentración por debajo de 10 mM.

33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el contenido de NH4+ of el sobrenadante de cultivo celular se mantiene a una concentración por debajo de 4 mM.

34. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33, caracterizado porque el rVWF es co-expresado con el Factor VIII recombinante (rFVIII) .

35. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque además comprende una etapa de purificación del rVWF lejos de al menos 50% del rFVIII presente en el sobrenadante recuperado.

36. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la relación del rVWF a rFVIII después de la etapa de purificación es al menos 10:1.

37. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 36, caracterizado porque el método además comprende una etapa de enriquecimiento del rVWF.

38. Un sobrenadante de cultivo celular que comprende el Factor Von illebrand recombinante (rVWF) , caracterizado porque el sobrenadante se prepara por un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

39. Un sobrenadante de cultivo celular caracterizado porque comprende el Factor Von Willebrand recombinante (rVWF) , caracterizado porque al menos 20% del rVWF en el sobrenadante está presente en un multímero del VWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros .

40. Un sobrenadante de cultivo celular caracterizado porque comprende el Factor Von Willebrand recombinante (rVWF) , donde el sobrenadante contiene al menos 0.5 IU de actividad del cofactor de ristocetina por mL.

41. Una composición del Factor Von Willebrand recombinante (rV F) caracterizada porque se prepara por un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 37.

42. La composición de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque la composición además comprende el Factor VIII recombinante (rFVIII) .

43. La composición de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada porque la relación del rVWF a rFVIII es al menos 10:1.

44. La composición de conformidad con la reivindicación 42 o 43, caracterizada porque la composición es formulada para administración farmacéutica.

45. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 42 a 44, caracterizada porque la composición es formulada para administración intravenosa.