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TWI772724B - 具有共同輕鏈的FIXaxFX雙專一性抗體 - Google Patents

具有共同輕鏈的FIXaxFX雙專一性抗體 Download PDF

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TWI772724B
TWI772724B TW108146911A TW108146911A TWI772724B TW I772724 B TWI772724 B TW I772724B TW 108146911 A TW108146911 A TW 108146911A TW 108146911 A TW108146911 A TW 108146911A TW I772724 B TWI772724 B TW I772724B
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Abstract

本發明係關於結合凝血因子（因子IXa（FIXa）及因子X（FX））且增強FIXa催化FX活化為FXa的雙專一性抗原結合分子（例如抗體）。該等雙專一性抗原結合分子藉由替代患有A型血友病之患者中缺乏的天然輔因子FVIIIa而控制出血之用途。

Description

具有共同輕鏈的FIXaxFX雙專一性抗體
本發明係關於結合血液凝結級聯中之因子IXa及因子X凝血因子之雙專一性抗原結合分子(例如，抗體)。此類雙專一性物藉由活化因子X在功能上取代因子VIII，恢復缺乏FVIII之患者(亦即，患有A型血友病之患者)的血液凝塊能力。
血友病係一種遺傳病況，其中因許多凝血因子中之一種功能喪失(部分或全部)之緣故，血液凝塊之能力減弱。A型血友病係凝血因子VIII(factor VIII；FVIII)缺乏症。該疾病具有輕度、中度及重度形式，視患者保留任何殘餘FVIII功能之程度及血液凝結級聯中其他組分之平衡而定。若未經治療，則A型血友病引起不可控出血，其可尤其經由來自關節積血事件之對關節的損害，導致重度失能。該疾病通常限制生活且可危及生命。咸信A型血友病之全球發病率為大約1：10,000。B型血友病(不同凝血因子因子IX之缺乏症)較不常見，發病率為大約1：50,000。兩種疾病均係X性聯的，因此通常在男性中發現，男性新生兒中A型血友病之發病率因此為大約1/5,000。
預防出血發作對於改善患者之生活品質及降低致死性失血之風險係必需的。對於A型血友病，缺失輔因子可由FVIII之投予替代。用於向患者投予之FVIII可以重組方式表現，或其可自血漿純化。典型地，接受此治療之患 者每48小時或每週3次用FVIII自行注射。
用FVIII進行之治療並非完美解決方案。嚴重缺陷係其可觸發體內同種異體抗體產生。此使得用FVIII進行之治療低效，因為同種異體抗體結合FVIII且阻礙其活性，若發生出血，則將患者置於危險境地。此類抑制性抗體在約30%的針對重度血友病經FVIII治療之患者中出現。
據報導，用血漿衍生之FVIII，而非重組形式進行之治療在患者中觸發抑制性抗體的風險較低。此可歸因於血漿衍生之形式保留溫韋伯氏因子(Von Willebrand factor；VWF)，發現其與FVIII天然締合(associate)且可掩蔽免疫原性抗原決定基。然而，尚未產生完全避免抑制性抗體之風險的FVIII形式。
儘管可能具有較高免疫原性，但重組FVIII提供一些優於血漿衍生之形式的優點，此係由於其較穩定，儲存及運輸較容易且較便宜。與20世紀80年代(當時諸如C型肝炎及HIV之病毒無意中擴散至受感染血液產品之接受者)相比，目前經由來自捐贈血漿之產品傳播感染之風險降低很多，但對嚴格安全控制之需求當然繼續存在。
已開發出FVIII之新重組形式，諸如B域截短多肽妥羅凝血素(turoctocog)α(NovoEight®)。然而，此類產品對於產生針對FVIII之中和抗體的患者低效。一些患者成功地經歷免疫耐受誘導以阻止抗FVIII抗體產生。然而，繼續存在對用於已產生抑制性抗體，或具有產生抑制性抗體之風險之患者的FVIII之替代物的實質性需求。
一種此類替代物係重組因子VIIa，其被稱為活化依他凝血素(eptacog)α(NovoSeven®)。然而，其半衰期短且必須每幾個小時注射。其用途很大程度上限於搶救療法或在具有抑制性抗體之血友病患者之手術中提供止血罩，而非用於長期保護性治療的可行選項。
另一可用產品為FEIBA(Factor Eight Inhibitor Bypassing Activity；因子八抑制劑旁路活性)，活化凝血酶原複合物濃縮物(activated prothrombin complex concentrate；aPCC)，其類似地可用於控制出血發作及在具有因子VIII之抑制劑的血友病患者之外科手術介入期間阻止出血。
當前實行多種其他替代療法，諸如基因療法、使用siRNA抑制抗凝血酶及針對TFPI(Tissue factor Pathway Inhibitor；組織因子路徑抑制劑)之抗體康昔祖單抗(concizumab)。
一種方法為靶向因子IXa(factor IXa；FIXa)及因子X(factor X；FX)兩者之人類化雙專一性IgG抗體。雙專一性抗體以一條臂結合FIXa且以另一臂結合FX，使此兩個輔因子在一起且從而以與FVIII相同之方式促進FIXa催化之FX活化。因此，該抗體在功能上替代血液凝結級聯(圖1)中之FVIII。由於其結構完全不同於FVIII，因此該抗體無法由抗FVIII抗體中和，且因此適於已產生針對所投予之FVIII的同種異體抗體，或具有產生針對所投予之FVIII的同種異體抗體之風險的患者。
在2012年，Kitazawa等人報導自用人類FIXa或FX免疫接種92隻實驗室動物，且將抗FIXa及抗FX抗體基因共轉染至宿主細胞中以便表現而產生之大致40,000種抗FIXa/X雙專一性抗體篩選中分離能夠活化FX之FIXa/X雙專一性抗體[1]。改良所選抗體以產生命名為hBS23之人類化抗體，其顯示在缺乏FVIII之血漿中之凝結活性及在靈長類中之活體內止血活性[1]。命名為hBS910之此抗體的較強效形式[2]以研究性藥物名稱ACE910，INN艾美賽珠單抗(emicizumab)進入臨床試驗[3]。ACE910之開發在全球主要抗體組之一中進行。儘管如此，花費超過7年來工程改造具有適當活體內功效且具有適於臨床規模製造之生物化學及生物物理學特性的分子。
在以至多1mg/kg之劑量皮下接受ACE910之48名健康男性個體的I期研究中，2名個體測試為抗ACE910抗體陽性[4]。據報導該抗體具有線性藥 物動力學概貌及約4至5週之半衰期[4]。艾美賽珠單抗隨後以至多3mg/kg之每週皮下劑量向患有重度A型血友病的18名日本患者投予，且據報導減少凝血因子之間歇性使用以控制此等患者中之出血[5]。在2016年12月，據報導艾美賽珠單抗在用於減少患有A型血友病之患者中之出血的III期臨床試驗(「HAVEN 1」研究)中到達其主要試驗指標(endpoint)。據報導與未接受預防性治療之患者相比，經艾美賽珠單抗預防治療之患者出血次數統計顯著減少。亦報導研究到達所有次要試驗指標，包括在已接受先前旁路劑預防治療之人中之患者內比較中，在艾美賽珠單抗預防治療情況下隨時間推移出血次數的統計顯著減少。關於艾美賽珠單抗之功效數據因此令人鼓舞，不過安全性考量因HAVEN 1研究中之患者死亡而提高。核准之藥物帶有關於接受aPCC與艾美賽珠單抗組合之患者中血栓性微血管病及血栓栓塞風險的加框警告。如上所指出，aPCC用於控制具有針對FVIII之抑制性抗體的患者中之出血，該等患者為用雙專一性抗體進行之治療的關鍵患者組。
值得注意的係，對血友病之處理需要持續患者之壽命的連續治療，其在診斷點(其通常在嬰兒期)開始，且需要被忍受而無不良影響且在數十年或甚至一個世紀內保持有效的療法。與意欲在較短持續時間(諸如數週、數月或甚至數年之時段)內投予之抗體相比，長期安全性，包括低免疫原性，對抗血友病抗體更重要。
WO2018/098363描述自人類抗體酵母菌庫分離之結合至FIX及FX之雙專一性抗體(阿迪單抗(Adimab))。WO2018/098363揭示提高雙專一性抗體之抗FIXa臂之親和力引起FVIIIa活性提高(由分析中之血液凝塊時間減少表示)。雙專一性抗體「BS-027125」由對最初所選「親本」抗體進行親和力成熟產生，親和力成熟提高其FIXa結合臂之親和力。據報導，BS-027125在一階段(one-stage)凝塊分析中達成大致90%類FVIIIa活性。當與艾美賽珠單抗相比時， 據報導BS-027125展現結合至因子FIX酶原、FIXa及FX酶原之高得多的親和力，及與FXa低得多的結合(無偵測到之結合)。據報導，FIX結合臂「BIIB-9-1336」顯示優先於FIX酶原(在蛋白分解活化之前的成熟FIX)，對FIXa(活化FIX)之選擇性結合，且被發現結合與FVIIIa所結合之FIXa抗原決定基重疊的抗原決定基。據報導，FX結合臂「BIIB-12-917」顯示與FX酶原之選擇性結合，不具有與(活化)FXa之可偵測結合，且結合處於活化胜肽內之FX(其以FX酶原而非FXa形式存在)的抗原決定基。隨後將其他突變引入至所選FIX結合抗體(包括BIIB-9-1336)中以產生庫，自庫中選擇對FIXa具有甚至進一步提高之專一性及/或親和力的抗體。
WO2018/141863及WO2018/145125亦描述抗FIXaxFX雙專一性抗體及其作為用於治療或減少出血之促凝血劑的用途。
本發明係關於結合凝血因子FIXa及FX之改良雙專一性抗原結合分子。本發明之雙專一性抗原結合分子增強FIXa催化FX活化成FXa，且可有效地替代患有A型血友病之患者中缺失的天然輔因子FVIIIa，以恢復患者血液凝塊之能力。參見圖2。
如此處所報導，諸位發明人成功地產生多種具有適用於作為治療性產品開發之品質，包括增強FX活化之極高效力的雙專一性抗原結合分子。描述具有用於抗FIXa及抗FX之新穎結合位點的雙專一性抗原結合分子，其可用於有效地取代血液凝塊級聯中之FVIIIa。特定而言，描述抗FIXa結合位點，其在與一批不同抗FX結合位點之組合中具有高活性，且可因此併入至多種不同FIXa-FX雙專一性物中，為選擇具有其他所要特徵(諸如易於製造)之雙專一性抗體提供靈活性。
諸位發明人已設計雙專一性抗體，其將強效FVIII模擬活性(如由試管內分析中之高效能指示)與適於臨床規模製造(包括表現、雙專一性分子組裝、純化及調配)之穩健生物化學及生物物理學特性組合，且具有完全人類來源，從而使人類活體內療法中之免疫原性的風險降至最低。
本發明之態樣在所附申請專利範圍中陳述，且本發明之另外具體實例及較佳特徵在下文描述。
在第一態樣中，本發明係關於雙專一性抗原結合分子，其包含(i)包含FIXa結合位點之FIXa結合多肽臂，及(ii)包含FX結合位點之FX結合多肽臂。FIXa及/或FX結合多肽臂可包含抗體Fv區，其分別包含FIXa或FX結合位點。抗體Fv區為抗體VH-VL域對。VH域在VH域架構中包含HCDR1、HCDR2及HCDR3，且VL域在VL域架構包含LCDR1、LCDR2及LCDR3。多肽臂可包含抗體重鏈(視需要包含IgG恆定區之抗體重鏈)及/或抗體輕鏈。
本發明之抗原結合分子可因此包含第一及第二抗體Fv區，該第一及第二抗體Fv區分別包含FIXa及FX之結合位點，及用於延長活體內分子半衰期之半衰期延長區。
半衰期延長區可為異二聚區，其包含與第一抗體Fv區共價鍵聯之第一多肽(例如，呈融合蛋白質形式)，及與第二抗體Fv區共價鍵聯之第二多肽(例如，呈融合蛋白質形式)，其中兩種多肽彼此共價及/或非共價成對。異二聚區之第一及第二多肽可具有相同或不同胺基酸序列。異二聚區可包含一或多種抗體恆定域，例如其可為抗體Fc區。
本發明之雙專一性抗原結合分子能夠經FIXa結合多肽臂之FIXa結合位點結合FIXa，且經FX結合多肽臂之FX結合位點結合FX，且從而增強FIXa催化FX活化成FXa。此可在如本文所描述之試管內FX活化分析中測定。
FIXa結合位點可由FIXa結合多肽臂中之一組互補決定區(complementarity determining region；CDR)提供，該CDR組包含HCDR1、HCDR2、HCDR3及LCDR1、LCDR2及LCDR3。視需要，HCDR1為SEQ ID NO：406，HCDR2為SEQ ID NO：407且HCDR3為SEQ ID NO：408。視需要，LCDR1為SEQ ID NO：6，LCDR2為SEQ ID NO：7且LCDR3為SEQ ID NO：8。
FIXa結合多肽臂中之HCDR組可為本文中所示之任何抗FIX VH域之HCDR的組，該VH域諸如表S-9A中所示之任一者，表N中所鑑別之任一者或圖20中所示之VH域N0128H、N0436H、N0511H、N1091H、N1172H、N1280H、N1314H、N1327H或N1333H中之任一者。HCDR1可為SEQ ID NO：441。HCDR2可為SEQ ID NO：634或SEQ ID NO：436。HCDR3可為SEQ ID NO：635或SEQ ID NO：433。CDR可為N1280 CDR，其中HCDR1為SEQ ID NO：441，HCDR2為SEQ ID NO：436且HCDR3為SEQ ID NO：433。可替代地，CDR可為N1333H CDR。
FIXa結合多肽臂中之LCDR組可為本文中顯示之任何抗FIXVL域之LCDR的組。LCDR可為如表S-50中所示之0128L的LCDR。LCDR1可為SEQ ID NO：6，LCDR2可為SEQ ID NO：7及/或LCDR3可為SEQ ID NO：8。
視需要，CDR組中之一或多個胺基酸可經突變以與此等序列不同。舉例而言，CDR組可包含1、2、3、4或5個胺基酸改變，一或多個改變殘基在重鏈或輕鏈CDR中之任何一或多者中。舉例而言，CDR組可包含一或兩個保守性取代。突變(例如，取代)之選擇可由本文實施例中所提供之資訊及分析告知。
FIXa結合多肽臂可包含抗體VH域，其包含一組HCDR HCDR1、HCDR2及HCDR3。HCDR1之序列可為SEQ ID NO：406，視需要具有一或兩個胺基酸改變(例如，取代)。HCDR2之序列可為SEQ ID NO：407，視需要具有一或兩個胺基酸改變(例如，取代)。HCDR3之序列可為SEQ ID NO：408，視需要具 有一或兩個胺基酸改變(例如，取代)。
FIXa結合多肽臂可包含抗體VL域，其包含一組LCDR LCDR1、LCDR2及LCDR3。LCDR1之序列可為SEQ ID NO：6，視需要具有一或兩個胺基酸改變(例如，取代)。LCDR2之序列可為SEQ ID NO：7，視需要具有一或兩個胺基酸改變(例如，取代)。LCDR3之序列可為SEQ ID NO：8，視需要具有一或兩個胺基酸改變(例如，取代)。
FIXa結合多肽臂之抗體Fv區可包含經由免疫球蛋白重鏈v、d及j基因區段重組產生之VH域，其中v基因區段為VH3-7(例如，VH3-7*01)，其中j基因區段為JH6(例如，JH6*02)，且視需要其中d基因區段為DH1-26(例如，DH1-26*01)，及/或其可包含經由免疫球蛋白輕鏈v及j基因區段重組產生之VL域，其中v基因區段為VL3-21(例如，VL3-21*d01)且j基因區段為JL2(例如，JL2*01)。在另一具體實例中，VL域可為經由免疫球蛋白輕鏈v及j基因區段重組產生之VL域，其中v基因區段為VL3-21(例如，VL3-21*d01)且j基因區段為JL3(例如，JL3*02)。
FIXa多肽結合臂之VH域的胺基酸序列可與圖20中所示之VH域，例如N1280H VH域共有至少90%序列一致性。序列一致性可為至少95%、至少97%、至少98%或至少99%。視需要VH域為本文中所示之抗FIX VH域中之一者，諸如表S-9A中所示之任一者，表N中所鑑別之任一者或圖20中所示之VH域N0128H、N0436H、N0511H、N1091H、N1172H、N1280H、N1314H、N1327H或N1333H中之任一者。視需要VH域為N1280H、N1333H、N1441、N1442或N1454。視需要抗FIXa VH域包含該等VH域(例如，N1280H)中之任一者之胺基酸序列，具有至多5個胺基酸取代，亦即，1、2、3、4或5個取代。取代可視需要在一或多個架構區中，例如，FR3中可存在1或2種取代，視需要在IMGT位置84及/或IMGT位置86處。
VL域之胺基酸序列可與SEQ ID NO：10(0128L)共有至少90%序列一致性。序列一致性可為至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%。視需要VL域胺基酸序列為SEQ ID NO：10。VL域胺基酸序列可替代地為SEQ ID NO：416。
FX結合位點可由FX結合多肽臂中之一組CDR提供。FX結合多肽臂可包含抗體VH-VL域對(亦即，抗體Fv區)，VH域在架構中包含HCDR1、HCDR2及HCDR3，且VL域在架構中包含LCDR1、LCDR2及LCDR3。
FX結合位點可由本文中所鑑別之任何抗FX VH域之HCDR(例如，表S10-C及/或圖11中所示之VH域的任何HCDR1、HCDR2及HCDR3組)及0128L LCDR提供。
FX結合多肽臂可包含與本文所揭示之VH域，包括表S-10C及/或圖11中之任一者(例如T0687H、T0736H或T0999H VH域)具有至少90%胺基酸序列一致性的VH域。序列一致性可為至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%。視需要VH域包含該VH域之胺基酸序列，具有至多5個胺基酸取代，亦即，1、2、3、4或5個取代。取代可視需要在一或多個架構區中。
FX結合多肽臂可包含與T0201 VH域(圖11中所示)具有至少90%胺基酸序列一致性之VH域。序列一致性可為至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%。視需要VH域包含該VH域之胺基酸序列，具有至多5個胺基酸取代，亦即，1、2、3、4或5個取代。取代可視需要在一或多個架構區中。
FX結合多肽臂可包含本文中所鑑別之任何VH域胺基酸序列，諸如表S-10C中所示之任一者、表T中所鑑別之任一者或來自圖11之任一者。視需要VH域為T0201H、T0687H、T0736H或T0999H。
FX結合多肽臂可包含與0128L VL域SEQ ID NO：10具有至少90%胺基酸序列一致性之VL域。序列一致性可為至少95%、至少96%、至少97%、 至少98%或至少99%。視需要VL域包含0128L VL域之胺基酸序列，具有至多5個胺基酸取代，亦即，1、2、3、4或5個取代。視需要VL域胺基酸序列為SEQ ID NO：10。可替代地，VL域序列為SEQ ID NO：416。
FX結合多肽臂可包含抗體Fv區，其包含經由免疫球蛋白重鏈v、d及j基因區段重組產生之VH域，其中v及j基因區段為IGHV1-46(例如，VH1-46*03)及IGHJ1(例如，JH1*01)，且視需要其中d基因區段為IGHD6-6(例如，DH6-6*01)，及經由免疫球蛋白輕鏈v及j基因區段重組產生之VL域，其中v及j基因區段為IGLV3-21(例如，VL3-21*d01)及IGLJ2(例如，JL2*01)或IGLJ3(例如，JL3*02)。
因此，本發明之一個態樣為結合FIXa及FX且催化FIXa介導之FX活化之雙專一性抗體，其中該抗體包含兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對，其中第一重鏈-輕鏈對包含結合FIXa的Fv區，其包含與第一VL域成對之第一VH域，且第二重鏈-輕鏈對包含結合FX的Fv區，其包含與第二VL域成對之第二VH域，其中該第一VH域包含一組HCDR，其包含具有所定義之胺基酸序列的HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中HCDR1係SEQ ID NO：406，HCDR2係SEQ ID NO：407且HCDR3係SEQ ID NO：408，且/或其中該第一VH域與N1280H VH域在胺基酸序列層級上至少95%一致；該第二VH域與T0201H VH域在胺基酸序列層級上至少95%一致，且該第一VL域及該第二VL域各自包含一組LCDR，其包含具有所定義之胺基酸序列的LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中LCDR1係SEQ ID NO：6，LCDR2係SEQ ID NO：7且LCDR3係SEQ ID NO：8，且/或其中該第一VL域及該第二VL域與0128L VL域SEQ ID NO：10在胺基酸序列層級上至少95%一致。
本發明之另一態樣為結合FIXa及FX且催化FIXa介導之FX活化之雙專一性抗體，其中該抗體包含兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對，其中第一重鏈-輕鏈對包含結合FIXa的Fv區，其包含與第一VL域成對之第一VH域，且第二重鏈-輕鏈對包含結合FX的Fv區，其包含與第二VL域成對之第二VH域，其中該第一VH域係人類免疫球蛋白重鏈v、d及j基因區段重組之產物，其中該v基因區段係IGHV3-7(例如，VH3-7*01)且該j基因區段係IGHJ6(例如，JH6*02)，該第二VH域係人類免疫球蛋白重鏈v、d及j基因區段重組之產物，其中該v基因區段係IGHV1-46(例如，VH1-46*03)且該j基因區段係IGHJ1(例如，JH1*01)，且視需要其中該d基因區段係IGHD6-6(例如，DH6-6*01)，且該第一VL域及該第二VL域均係人類免疫球蛋白輕鏈v及j基因區段重組之產物，其中該v基因區段係IGLV3-21(例如，VL3-21*d01)且該j基因區段係IGLJ2(例如，JL2*01)或IGLJ3(例如，JL3*02)。
本發明之另一態樣為結合FIXa及FX且催化FIXa介導之FX活化之雙專一性抗體，其中該抗體包含兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對，其中第一重鏈-輕鏈對包含結合FIXa的Fv區，其包含與第一VL域成對之第一VH域，且第二重鏈-輕鏈對包含結合FX的Fv區，其包含與第二VL域成對之第二VH域，其中該第一VH域與N1280H VH域具有至少95%胺基酸序列一致性，該第二VH域與該T0201H VH域具有至少95%胺基酸序列一致性，且該第一VL域及該第二VL域各自與0128L VL域具有至少95%胺基酸序列一致性。
第一VH域可包含一組HCDR，其包含具有所定義之胺基酸序列的HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中HCDR1係SEQ ID NO：406，HCDR2係SEQ ID NO：407且HCDR3係SEQ ID NO：408。
第一VH域可與N1280H具有至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性。第一VH域可包含一組N1280H HCDR，其包含N1280H HCDR1、N1280H HCDR2及N1280H HCDR3。舉例而言，其可為N1280H VH域。可替代地，VH域可為N1441H、N1442H或N1454H VH域。
示例VH域及VH CDR組之胺基酸序列顯示於圖20及/或表S-9A中。雙專一性抗體之第一VH域可為此等VH域中之任一者，或可與此等VH域中之任一具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性。視需要其可包含與該VH域相比，具有至多5個胺基酸取代，亦即1、2、3、4或5個取代之VH域胺基酸序列。取代視需要在架構區中。
第一VH域中可保留或引入之殘基及取代之實例包括以下者(參考N1280H界定，IMGT編號如圖14中所示)：FR3中Lys84處另一殘基(例如，Asp、Glu、His、Asn、Gln、Met、Thr、Gly、Ser、Ala、Ile、Leu、Val或Tyr)之取代，例如Lys84Asp或Lys84Glu；及FR3中Ser86處另一殘基，例如帶負電殘基(諸如Glu)之取代(Ser86Glu)。
其他實例包括：在Gln3、Val5、Gly9、Gly11、Gly16、Gly17及Leu21 FR1中之一或多者處帶負電殘基(例如，Asp或Glu)之取代，諸如Gln3Asp、Gln3Glu、Gln3His、Val5Glu、Gly9Glu、Gly11Asp、Gly11Glu、Gly11His、Gly16Glu、Gly17Asp、Gly17Glu或Leu21Asp中之任一者；FR3中Val68及/或Val71處帶負電殘基之取代，例如Val68Asp、Val68Glu或Val71Glu； FR3中Arg75處His、Gln或Leu之取代；FR3中Arg80處Ser、Thr、Gly、Leu或Lys之取代；及FR3中Asn82處Asp或His之取代。
可包括以上所列序列特徵中之任何一或多者。
第二VH域可為T0201H或圖11及/或表S-10C中所示之任何其他VH域，或可與該VH域具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性。視需要其可包含與該VH域相比，具有至多5個胺基酸取代，亦即1、2、3、4或5個取代之VH域胺基酸序列。取代視需要在架構區中。第二VH域可包含HCDR1，其為T0201H HCDR1；HCDR2，其為T0201H HCDR1；及/或HCDR3，其為T0201H HCDR3。此等CDR之胺基酸序列顯示於圖11及12及表S-10C中。其他示例CDR在圖12及表T中指定。舉例而言，第二VH域可包含：HCDR1，其為T0201 HCDR1或T0736 HCDR1，HCDR2，其為T0201 HCDR2，及/或HCDR3，其為T0201 HCDR3、T0687 HCDR3或T0736 HCDR3。
視需要，HCDR1為SEQ ID NO：636或SEQ ID NO：598。視需要，HCDR2為SEQ ID NO：467。視需要，HCDR3為SEQ ID NO：637、SEQ ID NO：638、SEQ ID NO：639或SEQ ID NO：565。
第二VH域中可保留或引入之殘基及取代之實例包括以下者(參考T0201H界定，IMGT編號如圖13中所示)：Cys114處另一胺基酸殘基之取代，例如其中經取代殘基為Ile、Gln、Arg、Val或Trp(較佳Ile、Val或Leu)；對FR1中Gln3進行之另一帶正電殘基取代，例如Gln3Arg或Gln3Lys；對架構區中之殘基進行生殖系化，例如Ile5Val(對FR1中殘基5處之異白胺酸進行纈胺酸之取代)，或由不同非生殖系殘基置換架構區中之非生殖系殘基， 例如Ile5Arg(對FR1中殘基5處之異白胺酸進行精胺酸之取代)；FR1中Glu11處另一胺基酸殘基(例如，Lys、Ala或Gly)之取代，例如Glu11Lys；對FR1中Gly16進行之帶正電胺基酸殘基之取代，例如Gly16Arg；FR2中位置39處之Met，或可替代地此位置處Leu之存在；CDR2中位置62及/或位置64處Ser之存在；FR3中Phe71處Tyr之取代；FR3中Thr82處帶正電殘基之取代，例如Thr82Arg或Thr82Lys；FR3中位置85處之Ser，或可替代地此位置處Thr之存在；FR3中Thr86處帶正電殘基之取代，例如Thr86Arg或Thr86Lys。
可包括以上所列序列特徵中之任何一或多者。
FIXa結合多肽臂及FX結合多肽臂可各自包含抗體Fv，其中各Fv之VL域具有一致胺基酸序列，亦即雙專一性抗原結合分子具有共同VL域。分子可具有共同輕鏈，其包含可變區及恆定區，視需要人類λ恆定區。
雙專一性抗原結合分子可為四聚免疫球蛋白，其包含第一抗體重鏈及輕鏈對(重鏈-輕鏈對)，其包含結合FIXa的Fv區，第二重鏈-輕鏈對，其包含結合FX的Fv區，其中各重鏈包含VH域及恆定區，且各輕鏈包含VL域及恆定區，且其中第一及第二重鏈-輕鏈對經由其重鏈恆定區之異二聚化締合，以形成免疫球蛋白四聚體。
如所提及，輕鏈可為共同輕鏈，亦即，第一及第二重鏈-輕鏈對之輕鏈具有一致胺基酸序列。各重鏈-輕鏈對可包含與CH1域成對之0128L CL恆定域輕鏈之序列可為SEQ ID NO：405。可替代地，輕鏈之序列可為SEQ ID NO：414。例示性免疫球蛋白同型包括人類IgG，例如IgG4，視需要具有經工程改造 恆定域，諸如IgG4 PE。
雙專一性抗體之Fc域可經工程改造以相比於同二聚化促進異二聚化。舉例而言，第一重鏈-輕鏈對之重鏈恆定區可包含與第二重鏈-輕鏈對之重鏈恆定區不同的胺基酸序列，其中不同胺基酸序列經工程改造以促進重鏈恆定區之異二聚化。實例包括臼包杵(knobs-into-holes)突變或電荷對突變。可替代地，第一重鏈-輕鏈對之重鏈恆定區可與第二重鏈-輕鏈對之重鏈恆定區一致，在此情況下預期同二聚體及異二聚體兩者將組裝，且此等隨後將使用抗體製造方法中之一或多個純化步驟分開，以分離包含一條抗FIXa臂及一條抗FX臂之所要異二聚體。
此處例示之雙專一性抗體的有利特徵為其已使用Kymouse平台，由人類免疫球蛋白基因區段產生。不同於由對普通實驗室動物免疫接種產生之抗體，其可需要「人類化」步驟，諸如將小鼠CDR移植至人類抗體可變域中及迭代改良經工程改造可變域以減少由此等變化引起之功能喪失，本發明抗體自開始即利用完全人類抗體可變域產生及選擇。在血友病治療情形下，其中如上文所指出，低免疫原性至關重要，使用完全人類抗體具有特別相關性。本發明之雙專一性抗體的低免疫原性使得其適於治療A型血友病患者，包括具有或不具有針對其他治療(諸如FVIII)之抑制性抗體的患者。接受本發明之抗原結合分子的患者產生對療法之免疫原性反應的風險應極小。
雙專一性分子之作用模式亦與良好安全概貌相關，諸如深靜脈血栓及肺栓塞之併發症風險低。雙專一性分子之活性與天然FVIII之活性及整合於現有血液凝結路徑內之作用機制相當，僅在上游觸發天然凝塊級聯的情形下活化。
根據本發明之雙專一性抗體已在多種FVIII模擬活性之功能相關分析，包括因子X酶分析、活化部分凝血激酶時間(activated partial thromboplastin time；aPTT)分析及凝血酶產生分析(thrombin generation assay；TGA)中顯示強活性，如本文所例示。
其他所要特徵包括長半衰期(降低所需投予頻率)及分子對以高濃度調配之順應能力(便於居家環境中之皮下注射)。
患者順應性公認為長期自投予療法之顯著問題，尤其在青少年及青年患者中。為了使治療在實際中成功，其投予排程應簡單，以便患者理解且最方便地遵循。投予劑量之間的長間隔係所要的，但降低劑量頻率而不犧牲治療活性需要具有長活體內半衰期且同時在給藥時段即將結束之際在「谷(trough)」濃度下具有足夠功效之產品。根據本發明之抗原結合分子宜具有長活體內半衰期。此可藉由包含經由FcRn經歷活體內再循環之Fc區而促進。根據本發明之抗原結合分子亦較佳在低濃度下維持高功能活性。吾人發現根據本發明之雙專一性抗體具有類似於艾美賽珠單抗之血栓形成活性，但具有在較低濃度下最明顯之血栓形成活性提高。本文所揭示之數據表明，根據本發明之雙專一性抗體在至少1至300nM範圍內之濃度下具有相同於或超越艾美賽珠單抗之血栓形成活性，例如在該抗體及艾美賽珠單抗在以下濃度下測試時：1至30nM，例如在1nM下、在3nM下、在10nM下及/或在30nM下；100至300nM，例如在100nM下及/或在300nM下。
可在本文所描述之凝血酶產生分析中量測活性。在低濃度下之有效活性可幫助確保在給藥時段即將結束之際(在下一劑量到期之前最末天數中抗體之活體內濃度最低)維持防止出血。其亦可幫助保護由循環相對不良灌注之身體區域，包括關節，其為血友病患者中存在問題的出血之常見位點。
本發明之其他態樣係關於包含該等雙專一性抗原結合分子之醫藥組成物及其在包括A型血友病治療之醫藥中之用途，如所附申請專利範圍中所陳述及本發明中所描述。
亦提供單專一性抗體作為本發明之態樣。因此，抗FIXa抗體可包含如本文所定義之第一重鏈-輕鏈對的兩個複本(copies)。抗FX抗體可包含如本文所定義之第二重鏈-輕鏈對的兩個複本。
其他態樣包括編碼本文所描述之抗體之序列的核酸分子、含有此類核酸之宿主細胞及藉由培養宿主細胞及表現及視需要分離或純化抗體來產生抗體之方法。從而獲得所表現之抗體。本文所描述之抗體的VH及VL域可類似地產生且為本發明之態樣。適合之抗體產生方法包括藉由連續或批式培養(例如，饋料批式培養)在生物反應器中由宿主細胞(例如，哺乳動物細胞)大規模表現。
9a:因子IXa
10:因子X
本發明之態樣及具體實例現將參考圖式更詳細地描述，其中：[圖1]示出血液凝結級聯[6]。
[圖2]顯示(A)與FIXa及FX相互作用之FVIIIa的輔因子作用；(B)與FIXa及FX相互作用之雙專一性抗體的輔因子作用；及(C)與血小板表面上之FIXa(9a)及FX(10)相互作用之雙專一性抗體。此具體實例中之雙專一性抗體為四鏈分子，其具有各自包含(N至C)域VH1-CH1-CH2-CH3之兩個雙硫鍵鍵聯重鏈，及包含(N至C)域VL-CL之兩個一致輕鏈(共同輕鏈)。在此圖示中，包含VH1-VL之結合位點結合至FX，且包含VH2-VL之結合位點結合至FXa。
[圖3]顯示因子IX之胺基酸序列(SEQ ID NO：334)，其中成熟蛋白之殘基編號。信號肽(加直底線)在分泌之後裂解。原肽(加波浪底線)在成熟時裂解。成熟因子IX含有輕鏈(殘基1-145)及重鏈(殘基146-415)。活化胜肽(加框)在活化時裂解，產生活化因子IXa，其含有由Cys132與Cys289之間的雙硫橋鍵接合之輕鏈(殘基1-145)及重鏈(殘基181-415，粗體)。
[圖4]顯示因子X之胺基酸序列(SEQ ID NO：335)，其中殘基編號。殘基1-31為信號肽(加直底線)。殘基32-40為原肽(加波浪底線)。FX輕鏈為殘基41-179。FX重鏈為殘基183-488。FXa重鏈為殘基235-488(粗體)。
[圖5]顯示本發明之一具體實例：具有共同輕鏈之雙專一性IgG。
[圖6]概述使抗FIXa VH域序列N0436H及抗FX VH域序列T0200針對彼此功能組合及與N0128L共同VL域成對達到最佳的方法。
[圖7]示出(A)雙專一性分子之FVIII模擬活性之試管內分析(FX酶或X酶分析)的原理；及(B)來自該分析之實施例數據，顯示與陰性對照組相比，FIXa-FX雙專一性分子之陽性結果。
[圖8]顯示在FX酶分析中初級篩選具有各種抗FX臂之雙專一性抗體的結果(標準反應條件)。雙專一性抗體組包含一系列抗FX VH測試域，其各自與N0128H抗FIX VH域及0128L共同VL域組合。
[圖9]示出針對抗FX T0200H域之譜系鑑別的B細胞簇(cluster)。
[圖10]顯示在FX酶分析中篩選最佳化雙專一性抗體之結果。(A)包含所命名之抗FX VH域與N0128H、N1172H或N1280H抗FIX VH域及0128L共同輕鏈之組合之IgG4雙專一性抗體的FX酶活性。在10分鐘(600s)時在405nm下之OD。 (B)包含所命名之抗FX VH域與N1280H抗FIX VH域及N0128L共同輕鏈之組合之IgG4雙專一性抗體的FX酶活性。
[圖11]為來自T0200HB細胞簇之一系列抗FX VH域的胺基酸序列比對。顯示生殖系序列(SEQ ID NO：518)以便比較。CDR加框。
[圖12]鑑別T0201H VH域之突變體，其中CDR3之末端四個殘基分別地突變為其他胺基酸。舉例而言，T0590H VH域為T0201H VH域之Cys114Ala突變體，亦即，其中IMGT位置114處之半胱胺酸經丙胺酸置換。
[圖13]顯示VH域T0201H之胺基酸序列，在(A)中標註以顯示FR1、CDR1、 FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4，且在(B)中標註以顯示IMGT編號。
[圖14]顯示VH域N0128H之胺基酸序列，其相對於N192H及N1280H比對且在(A)中標註以顯示FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4，且在(B)中標註以顯示IMGT編號。
[圖15]顯示FX酶分析中(A)IXAX-1280.0201.0128及(B)比較抗體AbE之活性(劑量反應)的動力學。抗體由蛋白A純化且由同二聚體/異二聚體混合物構成。
[圖16]顯示X酶分析中雙專一性抗體之結果。「E」為抗體E陽性對照組。FX酶活性以相對於12.5μg/mL(10.4nM)最終濃度標準化之樣本在10分鐘時之OD405nm作圖。雙專一性抗體依活性順序排序。
[圖17]顯示雙專一性抗體最佳化對FVIII模擬活性(FX酶)之影響。顯示雙專一性抗體之結果，該等抗體各自在抗FIXa臂中具有所命名之VH域且在抗FX臂中具有T0638H VH域，該等VH域均與0128L共同輕鏈VL域成對。使用隨以秒為單位之時間(X軸)變化之405nm下之試管內顯色因子X活化分析(Y軸)，量測FVIII模擬活性(FX酶)。分別地標記最佳化雙專一性抗體。人類IgG4同型對照組未展現FVIII模擬活性。檢索表依最大FX酶活性順序在其對應圖右側顯示抗體中VH域之名稱，亦即，N1333H>N1280H>N1172H>N1091H>N0511H>N0436H>N0128H>對照組。
[圖18]顯示包含所命名之抗FX VH域與N0128H、N1172H或N1280H抗FIX VH域及0128L共同輕鏈之組合之IgG4雙專一性抗體的aPTT分析結果。
[圖19]顯示使用FVIII耗乏人類血漿之一階段活化aPTT凝塊分析中，IXAX-1280.0201.0128雙專一性抗體(在蛋白A上純化)之劑量反應。
[圖20]顯示N0128H、N0436H、N0511H、N1091H、N1172H、N1280H、N1314H、N1327H及N1333H之VH域胺基酸序列，其經標註以鑑別其架構區及 CDR。
[圖21]為結合至抗原之雙專一性抗體的SPR感測圖，其中相比於(A)同型對照組抗體或(B)單專一性抗體之感測圖，展現與FIX及FX之同時結合。
[圖22]呈現T0681H之所選CDR1及CDR2序列變異體之FX酶分析的概述結果。除指定為AbE對照組之位置外，樣本藉由蛋白A層析純化，且其最終濃度相對於12.5μg/mL(10.4nM)標準化。包括AbE陽性對照組抗體之3種樣本：(i)蛋白A純化；12.5μg/mL；(ii)蛋白A純化；37.5μg/mL；(iii)蛋白A純化後接藉由離子交換層析進一步純化；37.5μg/mL。所顯示之所有數據在10分鐘時間點處取樣。
[圖23]概述T0201H CDR1、CDR2及CDR3突變誘發對試管內雙專一性抗體FX酶活性之影響。雙專一性抗體抗FX T0201H變異體VH域與抗FIX N01280H臂及N128_IgL共同輕鏈一起在HEK細胞中表現，藉由蛋白A層析純化且藉由濃縮至0.15mg/ml(125nM最終濃度)標準化。試管內FX酶分析使用5μl純化材料進行。所顯示之數據係在10分鐘時間點處。點線代表T0201H之FX酶活性。
[圖24]呈現研究抗FX T0201H VH域中序列變化對雙專一性抗體活性之影響的aPTT凝塊分析之概述結果。在將FVIII缺乏型血漿外加包含所命名之抗FX VH臂、抗FIX N01280H臂及N128_IgL共同輕鏈的雙專一性抗體之後，記錄凝塊時間(秒)。將雙專一性抗體在HEK細胞中表現，藉由蛋白A層析純化且在三種不同濃度0.1mg/ml、0.3mg/ml及0.5mg/ml下分析。點線指示外加人類IgG4同型對照組之FVIII缺乏型血漿或外加PBS之正常混合人類血漿的凝塊時間。
[圖25]鑑別VH域之CDR，其在突變誘發過程期間針對FVIII模擬活性逐漸地改良。黑色陰影鑑別比同一子表中之彼等好的VH域。
[圖26]顯示在凝血酶產生分析(TGA)中使用因子IXa作為觸發劑，正常混合血漿之凝血酶產生曲線。凝血酶曲線(thrombogram)描繪樣本血漿中隨時間 推移之凝血酶產生，其依隨時間(分鐘)推移在凝塊期間產生之凝血酶的濃度(nM)作圖。
[圖27]描述與AbE、同型對照組、正常血漿及艾美賽珠單抗校準劑相比，以133nM最終濃度外加包含T0201H之CDR1、CDR2及CDR3單一及組合性變異體之雙專一性抗體的FVIII缺乏型血漿的凝血產生。FIXa在0.3nM下觸發。(A)80分鐘凝血酶曲線。(B)25分鐘凝血酶曲線。
[圖28]顯示來自與AbE、同型對照組、正常血漿及艾美賽珠單抗校準劑相比，對外加包含T0201H之CDR1、CDR2及CDR3單一及組合性突變體之雙專一性抗體的FVIII缺乏型血漿進行之TGA的凝血酶Cmax(nM)及Tmax(分鐘)。測試抗體僅藉由蛋白A層析純化且因此代表異二聚體與同二聚體之混合物。(A)抗體濃度133nM。(B)抗體濃度80nM。
[圖29]示出來自對外加(A)雙專一性抗體IXAX-1280.0999.0128及(B)艾美賽珠單抗校準劑之FVIII缺乏型血漿進行之TGA的Cmax(nM)及Tmax(分鐘)劑量反應。所使用之同型對照組(加號)為人類IgG4且外加至FVIII缺乏型血漿中。正常混合血漿(叉號)外加PBS。
[圖30]顯示TGA中IXAX-1280.0999.0325及AbE之Cmax的劑量反應曲線。豎直點線指示對應於4.5μg/ml(30nM)、10μg/ml(66.6nM)及45μg/ml(300nM)之最終抗體濃度。水平線代表自健康志願者收集之正常混合血漿的Cmax。
[圖31]顯示在人類FVIII耗乏血漿中，在0.1nM、1nM、10nM、100nM及300nM抗體濃度下之(A)IXAX-1280.0999.0325「BiAb_1」及(B)AbE的凝血酶曲線。正常人類血漿樣本之凝血酶曲線以陰影顯示。
[圖32]顯示TGA中IXAX-1280.0999.0325及AbE之Tmax的劑量反應曲線。豎直點線指示對應於4.5μg/ml(30nM)、10μg/ml(66.6nM)及45μg/ml(300nM)之抗體濃度。水平線代表自健康志願者收集之正常混合血漿之Tmax。
[圖33]顯示在市售人類FVIII耗乏型血漿中之TGA分析中，與市售艾美賽珠單抗校準劑相比，BiAb_1(IXAX-1280.0999.0325)、BiAb_2(IXAX-1454.0999.0325)、BiAb_3(IXAX-1441.0999.0325)及BiAb_4(IXAX-1442.0736.0325)就(A)Cmax及(B)Tmax而言之凝血酶產生能力。
[圖34]顯示在人類FVIII耗乏型血漿中之TGA分析中，與市售艾美賽珠單抗校準劑相比，BiAb_1(IXAX-1280.0999.0325)就(A)Cmax及(B)Tmax而言之凝血酶產生能力。
[圖35]顯示由穩定轉染CHO細胞之8個獨立小池(minipool)表現之雙專一性抗體IXAX-1172.0201.0128的純化量及異二聚體%。
[圖36]對由8個獨立小池表現之相對於0.3mg/ml標準化之雙專一性抗體IXAX-1172.0201.0128的由FX酶分析測定之雙專一性抗體活性(10分鐘時之活性)與異二聚體%之間的相關度作圖。皮爾森相關係數(Pearson's correlation coefficient)計算為0.9939。
[圖37](A)顯示藉由在1ml CaptoSP ImpRes管柱上之離子交換層析及於20nM磷酸鈉，pH 6.0中之至多500nM的線性NaCl梯度對IXAX-1280.0999.0128進行之分離。吸光度，mAU(毫吸光度單位)；導電率，mS/cm(每公分毫西門子)。峰1為NINA-1280.0128單專一性抗FIX抗體。峰2為IXAX-1280.0999.0128雙專一性抗體。峰3為TINA-0999.0128單專一性抗FX抗體。(B)顯示藉由離子交換層析伴隨逐步溶析對IXAX-0436.0202.0128進行之分離。峰1為NINA-0436.0128單專一性抗FIX抗體。峰2為IXAX-0436.0202.0128雙專一性抗體。峰3為TINA-0202.0128單專一性抗FX抗體。(C)顯示藉由離子交換層析對IXAX-1172.0201.0128進行之分離。峰1為NINA-1172.0128抗FIX單專一性抗體。峰2為IXAX-1172.0201.0128雙專一性抗體。
[圖38]顯示對於雙專一性抗體(A)IXAX-1280.0999.0325(B) XAX-1454.0999.0325(C)IXAX-1441.0999.0325及(D)IXAX-1442.0736.0325中之每一者，純化FIX/FX異二聚體之陽離子交換純化。
[圖39]顯示在IXAX-1280.0999.0325及AbE之情況下之FX酶分析中的劑量反應。點線指示對應於4.5μg/ml、10μg/ml及45μg/ml之抗體濃度。
[圖40]顯示在IXAX-1280.0999.0325及AbE之情況下之顯色FVIII模擬活性Hyphen分析中的劑量反應。
[圖41]顯示在IXAX-1280.0999.0325及AbE之情況下之aPTT分析中的劑量反應。豎直點線代表66.6nM(10μg/ml)及300nM(45μg/ml)最終抗體濃度；水平線代表自健康志願者收集之正常混合血漿的aPTT值。
[圖42]呈現研究雙專一性抗體IXAX-1280.0999.0325(圓形)、IXAX-1441.0999.0325(菱形)及AbE(叉)在抑制子血漿中之效果之aPTT凝塊時間分析的結果。顯示針對使用獲自患有A型血友病之患者之血漿的一階段aPTT凝塊分析中此等抗體之劑量反應，表明70BU之對FVIII的專一性抑制子水平。加點水平線指示外加人類IgG4同型對照組之抑制子血漿的凝塊時間。
[圖43]顯示在獲自患有A型血友病之患者之血漿的情況下，凝血酶產生分析中IgG4雙專一性抗體IXAX-1280.0999.0325、IXAX-1441.0999.0325及AbE(均在蛋白A上純化，接著進行陽離子交換層析)之凝血酶峰高度(Cmax)劑量反應，表明70BU之對FVIII的專一性抑制子水平。指示各稀釋液以nM為單位之雙專一性抗體濃度。
[圖44]顯示在獲自患有A型血友病之患者之血漿的情況下，凝血酶產生分析中IgG4雙專一性抗體(A)IXAX-1280.0999.0325、(B)IXAX-1441.0999.0325及(C)AbE(均在蛋白A上純化，接著進行陽離子交換層析)之劑量反應，表明70BU之對FVIII的專一性抑制子水平。所分析之雙專一性抗體濃度為100、33.3、11.1、3.7及1.23nM。加灰色陰影區域指示正常混合血漿之凝血酶產生。TGA觸 發劑為FIXa。
血液凝結
圖1中圖解血液凝結級聯。凝結或凝塊係最重要之生物過程之一，其阻止自受損血管失血以允許該血管得到修復。凝結機制涉及血小板之活化、黏著及凝集以及纖維蛋白之沈積及成熟。凝結之異常調節可導致過度出血(血友病)或阻塞性凝塊(血栓形成)。凝結作用在所有哺乳動物中高度保守。其由凝血因子之複雜網路控制。在血管內層之內皮受損時起始凝結。內皮下組織因子(TF)暴露於血漿因子VII(FVII)引起初級止血(外在路徑)：鬆軟的塞形成於損傷位點處。另外的凝血因子，尤其因子IX(FIX)及因子VIII(FVIII)之活化引起次級止血(內在路徑)：形成纖維蛋白股以強化該塞。外在路徑及內在路徑最終彙聚至共同點：因子Xa/Va複合物之形成，其與鈣一起且結合在磷脂表面，由凝血酶原(因子II)產生凝血酶(因子IIa)。
FVIII由凝血酶或因子Xa(factor Xa；FXa)裂解，且所得因子VIIIa(factor VIIIa；FVIIIa)提供由A1次單元、A2次單元及輕鏈組成之異三聚結構。在活化後且在鈣離子及磷脂表面(在血小板上)存在下，FVIIIa經其輕鏈及A2次單元結合至FIXa，且同時經其A1次單元結合至FX，形成活性內在「X酶(tenase/Xase)」複合物，其中FVIIIa輔因子使FIXa與FX接近且亦變構地提高FIXa之催化速率常數。參見圖2a。因子X由FIXa之絲胺酸蛋白酶活性活化，且凝塊級聯繼續，以纖維蛋白沈積結束，其為血凝塊之結構聚合物。
血友病經由因缺少FVIII輔因子活性(A型血友病)或缺少FIX酶活性(B型血友病)所致的X酶複合物缺乏產生。
因子IX(FIX)
因子IX為絲胺酸蛋白酶，其需要因子VIII作為輔因子。其以無活性前驅物形式在血液中循環，該前驅物在止血挑戰時經由內在或外在路徑活化，如上文所論述。
除非上下文另有要求，否則本文所提及之因子IX為人類因子IX，且因子IXa為人類因子IXa。
人類因子IX之胺基酸序列在圖3中顯示。因子IX基因為大致34kb長且含有8個外顯子。轉錄物包含短5'非轉譯區、開讀框外加終止密碼子及3'非轉譯區。ORF編碼461個胺基酸之前原蛋白(pre-pro-protein)，其中前序列(信號肽)引導因子IX分泌，原肽序列提供維生素K依賴性羧化酶之結合域，該羧化酶羧化相鄰GLA域中之某些麩胺酸殘基，且其餘部分代表因子IX酶原，其在前序列及原序列移除之後進入循環。成熟的415個殘基之FIX蛋白自N至C端含有：GLA域，其中12個麩胺酸殘基在轉譯後經γ羧化；兩個類表皮生長因子(epidermal growth factor；EGF)域；活化胜肽序列；及催化性絲胺酸蛋白酶域。FIX由經由內在路徑產生之活化因子XI，或由外在路徑之TF/FVIIa複合物活化。不管怎樣，活化均涉及R145之後的肽鍵裂解(α裂解)及R180之後的肽鍵裂解(β裂解)，釋放對應於中間序列之活化胜肽，且從而產生活化FIXa分子，其具有由輕鏈之C132與重鏈之C289之間的雙硫橋鍵接合之N端輕鏈(GLA-EGF-EGF)及C端重鏈(催化域)。殘基編號指代成熟FIX多肽序列中之胺基酸。在X酶複合物形成處之磷脂表面上，FIXa之GLA域與磷脂締合，而催化域立於高於(>70Å)磷脂表面，且受FVIIIa之A2域調節。[7,8]。
B型血友病(FIXa活性缺乏症)之分子基礎多樣，包括多種點突變、無義突變、mRNA剪接位點突變、缺失、插入或活化裂解位點處之誤義突變[9]。
與FVIIIa之結合中涉及活化FIX(FIXa)之催化(蛋白酶)域。此域中之殘基E245結合鈣離子，且此位置處之突變可減少與FVIII之結合且導致B型血友病，例如取代E245V。由殘基330-338形成之FIX螺旋內的突變亦與減少的與FVIII結合及因此與B型血友病有關。
亦已報導因子IX中之非病原性突變，包括單核苷酸多型性(single nucleotide polymorphism；SNP)及長度多型性，其評述於[9]中。此等包括外顯子6中之MnII SNP，引起殘基148處之T/A取代(馬爾默多型性(Malmö polymorphism))，其在美國白人及黑人群體中係相對共同的[9]。.
因子X(FX)
除非上下文，否則本文所提及之因子X為人類因子X，且因子Xa為人類因子Xa。人類FX之胺基酸序列在圖4中顯示。
FX亦被稱作斯圖亞特-普勞厄因子(Stuart-Prower factor)。其為絲胺酸內肽酶。FX可由因子IX(與其輔因子因子FVIII一起，如上文所描述)或因子VII(以及其輔因子組織因子)藉由水解成因子Xa而活化。FX藉由在兩個位置，Arg-Thr鍵處及隨後Arg-Ile鍵處裂解凝血酶原起作用，得到活性凝血酶。
抗原結合
雙專一性抗原結合分子之所要特徵為其以允許所結合之FIXa活化所結合之FX的方式結合FIXa及FX。
為了使FIXa與FX在一起且從而促進由FIXa進行之FX活化，雙專一性抗原結合分子可同時結合此兩種輔因子。結合可依序進行，例如可在第一結合臂與其同源抗原之間形成初始二元複合物，接著第二結合臂與其同源抗原結合。原則上此兩個結合事件可以任一順序發生，亦即FIXa後接FX，或FX後接 FIXa。分子編排(choreography)受兩個結合位點對其各別抗原之相對親和力影響。在雙專一性抗原結合分子之群中，預期FIXa及FX、多種不同複合物並行存在。因此，池將包含游離抗原結合分子、游離FIXa、游離FX、與抗原結合分子複合之FIXa、與抗原結合分子複合之FX及FIX、FX及抗原結合分子之三元複合物，其中此等物種中之每一者按照個別相互作用之相對締合速率及解離速率以不同比例存在。
雙專一性抗原結合分子對FIXa之親和力比對FX之親和力高可能較佳。將設想此類雙專一性分子與FIXa形成初始複合物，其繼而將結合且活化FX。對FX之相對低親和力降低不完全抗體-抗原複合物(亦即，不含FIXa)中所結合之FX的比例。此之潛在優點為其允許較大比例之FX保持游離以與可存在於患者血液中之任何FVIII接合。A型血友病涵蓋一系列FVIII缺乏，在功能性FVIII之輕度缺乏至完全不存在的範圍內。對於保留一些功能性FVIII之彼等患者，可能需要儘可能保留此天然活性。因此，可能需要提供雙專一性抗原結合分子，其中FX結合臂不與FVIII競爭與FX之結合。
較佳FX結合臂對FX之親和力比對FXa之親和力高。對FXa之低親和力促進活化產物之釋放，完成FVIII模擬分子在凝結級聯中之作用且釋放FX結合位點以便再次使用。在各種具體實例中，本文所描述之雙專一性物(例如，抗體IXAX-1280.0999.0325或抗體IXAX-1441.0999.0325)、此類雙專一性物之FX結合臂(例如，包含T0999H VH域之結合臂)或包含兩個此類臂之同二聚體的抗FX單專一性抗體對FX之親和力比對FXa之親和力高至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少100倍，例如對FX之親和力比對FXa之親和力高至少1000倍，且視需要不顯示與FXa之顯著結合，例如如藉由ELISA所量測。舉例而言，在各種具體實例中，雙專一性物、FX結合臂或抗FX單專一性抗體(例如，TINA-0999.0325)不結合人類FXa，如藉由ELISA所測定且參照陰性對照組 IgG。作為ELISA之替代方案，可藉由SPR量測親和力，且將對FX之親和力與對FXa之親和力進行比較。
FIXa結合
雙專一性抗原結合分子之FIXa結合臂可結合FIXa之輕鏈及/或重鏈。初始研究表明實施例中所描述之N128譜系之FIXa結合臂不結合呈分離狀態(在不存在重鏈之情況下)的FIXa輕鏈。
本發明之雙專一性抗原結合分子(或其FIXa結合多肽臂)因此可為結合包含重鏈及輕鏈之FIXa分子，且在不存在重鏈之情況下不結合FIX輕鏈的分子。視需要，FIXa結合臂識別由FIXa重鏈及輕鏈之組合形成或由其穩定化的抗原決定基。其可例如僅與FIXa分子中之輕鏈接觸，結合僅在輕鏈與重鏈組合存在於FIXa分子中時暴露或穩定化之抗原決定基。可替代地，其可接觸包含來自輕鏈及重鏈兩者之一或多個殘基，或包含單獨的重鏈之殘基的抗原決定基。
根據本發明之抗原結合分子，或其FIXa結合多肽臂，可以10mM或更低、較佳5mM或更低、1mM更佳或更低之親和力(以KD量測)結合人類FIXa之EC域。舉例而言，KD可在1nM與3μM之間。
結合人類FIXa之KD可在0.1μM與1μM之間，例如在0.15μM與0.3μM之間。KD可為0.6μM或更低、0.5μM或更低、0.4μM或更低、0.3μM或更低、0.25μM或更低或2μM或更低。KD可為至少0.1μM，例如至少0.2μM。其可為0.1μM至0.5μM。
KD可在10nM與100nM之間，例如在25nM與75nM之間。
KD可為50nM或更低、10nM或更低、5nM或更低、2nM或更低或1nM或更低。KD可為0.9nM或更低、0.8nM或更低、0.7nM或更低、0.6nM或更低、0.5nM或更低、0.4nM或更低、0.3nM或更低、0.2nM或更低或0.1nM 或更低。KD可為至少0.001nM，例如至少0.01nM或至少0.1nM。KD可在0.1nM至10nM之間。
根據本發明之抗原結合分子，或其FIXa結合多肽臂，可以在0.1μM與1μM之間，例如在0.15μM與0.3μM之間的親和力(以KD量測)結合人類FIX。KD可為0.6μM或更低、0.5μM或更低、0.4μM或更低、0.3μM或更低、0.25μM或更低或2μM或更低。KD可為至少0.1μM，例如至少0.2μM。
與FIX相互作用之KD可與FIXa相互作用之KD相當，例如與對FIXa之親和力相比，FIXa結合臂對FIX之親和力中可存在小於25%，視需要小於10%之差異。與FIXa相比，與FIX相互作用之KD中可能不存在統計顯著差異。
如本文別處所描述，可使用表面電漿子共振(surface plasmon resonance；SPR)測定親和力，例如其中結合臂與固體表面偶合，視需要呈二聚體形式(例如，呈單專一性IgG形式)，其中在25℃下，溶液中之抗原作為分析物。
FX結合
根據本發明之抗原結合分子，或其FX結合多肽臂，可以10mM或更低、較佳5mM或更低、更佳1mM或更低之KD結合人類FX之EC域。舉例而言，KD可在5μM與1nM之間，例如在5μM與10nM之間。
KD可在0.1μM與2μM之間，例如在0.1μM與1μM之間，例如在0.15μM與0.3μM之間。KD可為0.6μM或更低、0.5μM或更低、0.4μM或更低、0.3μM或更低、或0.25μM或更低。KD可為至少0.1μM。
KD可為50nM或更低、10nM或更低、5nM或更低、2nM或更低或1nM或更低。KD可為0.9nM或更低、0.8nM或更低、0.7nM或更低、0.6nM或更低、0.5nM或更低、0.4nM或更低、0.3nM或更低、0.2nM或更低或0.1nM 或更低。KD可為至少0.001nM，例如至少0.01nM或至少0.1nM。舉例而言，KD可在1nM至100nM之間。KD可在1nM至10nM之間。
如本文別處所描述，可使用表面電漿子共振(SPR)測定親和力，例如其中結合臂與固體表面偶合，視需要呈二聚體形式(例如，呈單專一性IgG形式)，其中在25℃下，溶液中之抗原作為分析物。
抗原結合親和力之量測
抗原結合分子對結合FIX、FIXa、FX及FXa之親和力可就結合相互作用之平衡解離常數KD、締合(association/on)速率(Ka)及解離(dissociation/off)速率(kd)之比率Ka/Kd而言定量。抗原結合之KD、Ka及Kd可使用表面電漿子共振(SPR)量測。示例SPR程序及條件陳述於實施例10中。
可使用SPR用呈單價形式之抗原結合多肽臂，例如包含抗原結合位點之抗體Fab或Fv或具有針對所討論之抗原之單一抗原結合臂的異二聚免疫球蛋白(例如，IgG)進行親和力定量。可替代地，可方便地測定呈二價形式之抗原結合多肽臂，例如包含同二聚抗原結合臂之IgG的親和力。SPR可包含將抗原結合多肽臂之二聚體塗佈至生物感測器晶片上(直接地或間接地)，將抗原結合多肽臂暴露於一系列濃度下之緩衝溶液中的抗原，偵測結合及計算結合相互作用之平衡解離常數KD。SPR可在25℃下進行。適合之緩衝溶液為150mM NaCl，0.05%清潔劑(例如，P20)及3mM EDTA，pH 7.6。含2.5mM CaCl2之HBS-P 1×(10mM HEPES pH 7.4，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05%聚山梨醇酯20 pH 7.6)為示例緩衝液。可使用可為所使用之儀器固有的標準演算法將結合數據擬合至1：1模型。已知多種SPR儀器，諸如BiacoreTM、ProteOn XPR36TM(Bio-Rad®)及KinExA®(Sapidyne Instruments公司)。
交叉反應性
調節體可需要候選治療性分子在其推進至人類臨床試驗之前在實驗室動物中展現治療功效。所獲取之A型血友病動物模型的一實例為食蟹獼猴，其經由FVIII中和抗體或針對FVIII之小分子抑制劑的投予而缺乏血液凝塊，從而複製人類A型血友病患者之表型。為了使得能夠在動物模型中測試雙專一性抗原結合分子，需要各臂之結合位點具有與來自一或多種非人類哺乳動物之對應抗原的交叉反應性。因此，抗原結合分子之FIXa結合位點可結合鼠類(例如，小鼠或大鼠)、兔或非人類靈長類(例如，食蟹獼猴)FIXa以及人類FIXa，且FX結合位點可結合鼠類(例如，小鼠或大鼠)、兔或非人類靈長類(例如，食蟹獼猴)FXa以及人類FXa。
定量抗原結合分子(或更精確而言，其抗原結合位點)之物種交叉反應性程度的一種方式係作為其與一種物種之抗原與另一物種之抗原相比的親和力倍數差，例如相對於食蟹獼猴抗原，對人類抗原之親和力的倍數差。親和力可以KD定量，其指代抗原與抗原結合分子之結合的平衡解離常數。KD可藉由如本文別處所描述之SPR測定。
物種交叉反應性結合分子對結合人類及非人類抗原之親和力的倍數差可為30倍或更低、25倍或更低、20倍或更低、15倍或更低、10倍或更低或5倍或更低。換言之，結合人類抗原之細胞外域之KD可在結合非人類抗原之細胞外域之KD的30倍、25倍、20倍、15倍、10倍或5倍內。
較佳地，人類及非人類抗原之結合親和力在10倍或更低範圍內，更佳5倍內或2倍內。結合非人類FIXa之KD，例如如藉由表面電漿子共振所測定，可比結合人類FIXa之KD高至多10倍(較佳至多5倍或至多2倍)或低至多10倍(較佳低至多5倍或至多2倍)。類似地，結合非人類FX之KD，例如如藉由SPR所測定，可比結合人類FX之KD高至多10倍(較佳至多5倍或至多2倍)或低至多 10倍(較佳至多5倍或至多2倍)。測定親和力之方法在本文別處描述。
若結合兩種物種之抗原的KD符合閾值，例如若結合人類抗原之KD及結合非人類抗原之KD均為10mM或更低、較佳5mM或更低、更佳1mM或更低，則結合分子亦可視為具有物種交叉反應性。KD可為10mM或更低、5mM或更低、2mM或更低或1mM或更低.KD可為0.9nM或更低、0.8nM或更低、0.7nM或更低、0.6nM或更低、0.5nM或更低、0.4nM或更低、0.3nM或更低、0.2nM或更低或0.1nM或更低。
儘管對結合不同物種之抗原的物種交叉反應性可為有利的，但儘管如此亦需要FIXa結合臂及FX結合臂對其各別抗原之選擇性以避免非所需副作用。因此，在體內，FIX/FIXa及FX/FXa較佳為抗原結合分子所結合之唯一抗原。
FIXa介導之FX活化的增強
可在試管內或活體內分析中測定雙專一性抗原結合分子增強FIXa介導之FX向FXa活化的能力。
適合試管內分析為實施例3及實施例7中所例示及圖7中所示出之FX活化分析。該分析包含(i)在適於形成FXa之條件下(例如，在磷脂存在下，在37℃下之緩衝溶液中)，使雙專一性抗原結合分子與FIXa及FX接觸(ii)添加可由FXa裂解以產生可偵測產物之受質，及(iii)偵測，及視需要量化可偵測產物之存在。
詳細方案陳述於實施例7中。
可將產物之水平與對照組分析相比，在對照組分析中，反應混合物中不存在FIXa-FX雙專一性抗原結合分子。與對照組相比，在雙專一性物之情況下的分析中產物水平的顯著差異指示雙專一性物能夠增強FIXa介導之FX活 化。可包括FVIII作為陽性對照組。
可將產物之水平與FIXa-FX雙專一性抗原結合分子為艾美賽珠單抗之分析相比。根據本發明之雙專一性物可將FIXa介導FX活化成FXa增強與艾美賽珠單抗相同或類似的程度(例如，在10%差異內或在5%差異內)，或增強更大程度(例如，如藉由可偵測產物之水平所量測，FX向FXa之活化比在艾美賽珠單抗之情況下所達成的活化多大於10%)。較佳雙專一性抗體將FIXa介導FX活化成FXa增強與艾美賽珠單抗至少相同的程度。該分析典型地在37℃之生理溫度下進行。用於分析之雙專一性物的適合濃度在本文實施例中指定，例如12.5μg/ml(10.4nM)或125nM。
另一適合分析為量測FVIII缺乏型血漿中之活化部分凝血激酶時間(aPTT)，其可在存在或不存在抑制劑之情況下進行，且可用於將雙專一性分子之活性與重組人類FVIII進行比較。此分析在實施例8中例示。aPTT為提供血凝塊形成之整體綜觀及提供作為分析讀出之凝結時間的試驗指標分析。在aPTT分析中，FVIII缺乏型血漿將典型地具有大約80至90秒之凝結時間。本發明之雙專一性抗原結合分子可有效減少aPTT分析中之凝結時間(與陰性對照組相比)。在根據本發明之雙專一性抗原結合分子之情況下，aPTT分析中人類FVIII缺乏型之凝結時間可例如與在重組人類FVIIIa之情況下的凝結時間相同或更少。正常(FVIII+)人類血漿之生理凝塊時間典型地<40秒，例如在37s至34s範圍內。在提供活化FVIIIa後，利用FVIII缺乏型血漿可達成類似值，其經由將設備/量測相對於參考值校準提供標準化分析之合宜方式。可替代地，正常(FVIII+)人類血漿之凝結時間可用於參考，aPTT分析藉由經由添加鈣誘導凝結開始。該分析典型地在37℃之生理溫度下進行。用於該分析之雙專一性物的適合濃度在本文實施例中指定，且包括0.1mg/ml(44nM)、0.3mg/ml(133nM)及0.5mg/ml(222nM)。
本發明之雙專一性抗原結合分子可在aPTT分析中產生在FVIIIa之凝結時間的10秒內之凝結時間(亦即，比在FVIIIa之情況下的aPTT分析之凝結時間多至多10秒或少至多10秒)。較佳地，在本發明之雙專一性抗原結合分子之情況下的aPTT分析中之凝結時間少於在FVIIIa之情況下的凝結時間。雙專一性抗原結合分子可減少凝結時間至少於40秒、少於35秒或少於30秒。凝結時間可在20秒與40秒之間，例如在20秒與30秒之間。較佳凝結時間為22秒至28秒，例如24秒至26秒。
功能之另一量度為在雙專一性抗原結合分子存在下，FVIII缺乏型血漿中凝血酶之產生速率。雙專一性抗體之活性可在凝血酶產生分析(TGA)中量測。[10]。已描述多種凝血酶產生分析，如最近所評述[11]。基本上，TGA包含在添加測試分子(此處，候選雙專一性抗體)之後，隨時間推移量測凝血酶原向凝血酶之轉化(活化)，其中經由凝血酶裂解受質形成可偵測產物來偵測凝血酶。
參考圖1，應記住存在外在組織因子(TF)路徑以起始凝結級聯。表現TF之細胞通常駐存在血管外，且在組織損傷後，此類帶有TF之細胞與循環血小板形成接觸。TF充當促進少量因子IX及X由因子VIIa活化的輔因子。活化因子Xa及因子V在帶有TF之細胞上形成凝血酶原酶複合物，產生有限量之凝血酶。新產生之凝血酶活化在損傷位點處累積之血小板及存在於血小板上之因子XI。需要血小板結合FXIa以確保FIXa之進一步活化。鑒於TGA為活體外分析，不存在帶有TF之細胞且必須供應凝結觸發劑以起始級聯。商業分析典型地使用重組TF/磷脂混合物來起始凝結[11]。本文所例示之TGA方法(參見實施例13)使用因子IXa/磷脂混合物作為觸發劑，不過可使用其他上游活化劑，諸如FXIa。
為了進行TGA，使FVIII缺乏型血漿與以下者接觸以產生條件：(i)觸發試劑，(ii)可由凝血酶轉化為可偵測產物之受質，例如在由凝血酶裂 解時產生可視覺偵測之產物的螢光或顯色受質，及(iii)測試分子(例如，雙專一性抗體)，在該等條件下，FVIII模擬活性之存在將引起凝血酶產生及因此來自可偵測產物之信號。典型地，血漿將不具有游離金屬離子(諸如鈣)，其為血液凝塊級聯(圖1)中所必需的。可供應Ca2+離子(例如，呈溶液中之CaCl2形式)以起始分析，例如其可含於受質溶液內。在起始之後，例如藉由偵測螢光或色彩，隨時間推移監測(較佳連續，或以頻繁間隔，例如約每20秒)可偵測產物之產生(代表凝血酶之產生)。可使用讀盤機，例如以監測螢光受質向螢光團之轉化。TGA在37℃之生理溫度下進行。
可藉由相對於添加至對照組血漿中之凝血酶的已知濃度進行校準，將螢光轉換為凝血酶濃度。隨後可產生凝血酶曲線(圖26、圖27)。
較佳地，將雙專一性抗體(或其他測試分子)針對TGA中之使用適合地純化(例如，藉由蛋白A層析及離子交換層析或疏水相互作用層析)，例如以至少95%雙專一性異二聚體之組成物提供雙專一性物(亦即，應存在不超過5%同二聚或其他抗體污染物)。較佳儘可能提供接近100%純度之測試分子。其可為約98%、99%或100%純雙專一性物。
在螢光TGA中，來自健康個體之血漿的大致參考範圍為Cmax 200至450nM及Tmax 5至8分鐘[11]。亦可將TGA中之活性相對於來自健康個體、患有重度FVIII缺乏症之患者及FVIII輸注後之患有重度FVIII缺乏症之患者之血漿的公開代表性凝血酶產生曲線進行比較。[12]。為了標準化，亦可將TGA中之效能相對於代表已知濃度下之陽性對照組的校準劑進行比較。可將測試雙專一性物之稀釋系列相對於一系列已知固定濃度下之校準劑進行比較。適合校準劑為艾美賽珠單抗校準劑。艾美賽珠單抗校準劑可商購，由外加100μg/mL艾美賽珠單抗(Hemlibra®)之FVIII免疫耗竭檸檬酸化人類血漿製備且進一步包含緩衝劑及穩定劑。其以凍乾形式供應且在TGA中使用之前在水中復水。校準劑小瓶 (phial)中之艾美賽珠單抗的精確濃度已知，因此可在對濃度標準化之後，將分析中之測試雙專一性分子的活性相對於校準劑之活性進行比較。作為相對於艾美賽珠單抗比較雙專一性抗體之替代對照組，可將TGA中測試雙專一性抗體之效能相對於具有艾美賽珠單抗之胺基酸序列之對照組雙專一性抗體的效能進行比較，其中測試雙專一性抗體及具有艾美賽珠單抗之胺基酸序列的雙專一性抗體在TGA中在相同條件下測試。
TGA可用於界定凝血酶產生之六個態樣的特徵：滯後時間(滯後)、達至峰之時間(Tmax)、最大峰高度(Cmax)、內源性凝血酶潛能(endogenous thrombin potential；ETP)、速度指數(velocity index；VI)及「尾起始(tail start)」或向基線之返回。滯後時間代表凝血酶峰開始產生之前的起始階段，其中觸發之添加引起凝結級聯之活化。一旦起始，則在傳播階段期間快速產生大量凝血酶。達至峰之時間代表達到最大凝血酶峰高度(Cmax)所花費的時間，ETP代表所產生之凝血酶的總量，且速度指數界定滯後時間與達至峰之時間之間斜率的特徵。向基線之返回(尾起始)反映對凝血酶形成之抑制(藉由活化蛋白C)及對已形成之凝血酶的去活化(藉由抗凝血酶)。Cmax及/或Tmax典型地為用於代表TGA中之活性的關鍵量度。可針對固定濃度，例如1nM、3nM、10nM、30nM、100nM或300nM下之雙專一性物測定TGA中之參考值(例如，Cmax、Tmax、滯後時間等)。可在一系列濃度，例如1nM、3nM、10nM、30nM、100nM及300nM及/或其他濃度下量測參數以獲得完整劑量反應曲線，允許隨後測定EC50值。劑量反應曲線可使用非線性log(抗體)對反應變斜率模型(例如，變斜率4參數邏輯回歸模型，其可使用GraphPad Prism v8.0.0進行)擬合。EC50為測試分子(例如，抗體)之濃度，在該濃度下達到半最大效果(在基線與量測參數之最大值中間)。可根據劑量反應曲線測定EC50。在EC50數據之情況下的工作實施例呈現在本文實施例14中。
在一個具體實例中，TGA包含：(a)使不具有游離鈣離子之FVIII缺乏型血漿與以下者接觸：(i)觸發試劑，其包含因子IXa/磷脂混合物，(ii)溶液，其包含在由凝血酶裂解時產生可視覺偵測之螢光團的螢光受質(例如，2nM ZGGR-AMC螢光受質)，及鈣離子(例如，100mM CaCl2)，(例如，來自Stago之FluCa試劑)，及(iii)雙專一性抗體(例如，在95%至100%，例如99%至100%純度下)，(b)在37℃下在FVIII模擬活性之存在將引起凝血酶產生及因此來自螢光團之信號的條件下培養血漿，(c)隨時間推移偵測螢光以監測螢光受質向螢光團之轉化，(d)相對於來自預定濃度下之凝血酶溶液的螢光校準所偵測到之螢光，及(e)測定凝血酶曲線之一或多個參數，其中該等參數為：達到的最大凝血酶峰高度(Cmax)，達到最大凝血酶峰高度所花費的時間(Tmax)，及/或凝血酶峰開始產生之前起始階段的長度(滯後時間)。
在雙專一性抗體之一系列濃度下測定該一或多個參數，以獲得包括基線及反應之頂部平線區(最大值)的完整劑量反應曲線。可使用非線性log[抗體]對反應參數變斜率模型(4參數邏輯回歸模型)將劑量反應曲線擬合至數據點。根據該劑量反應曲線測定EC50。可在測試雙專一性抗體與艾美賽珠單抗(例如，艾美賽珠單抗校準劑，如可獲自Enzyme Research Laboratories)之間比較該一或多個參數，或該一或多個參數之EC50。
根據本發明之雙專一性抗體較佳在螢光TGA中展現類似於或大於艾美賽珠單抗的效力。較高效力可由該分析中一或多個參數，例如Cmax、Tmax或滯後時間的較低EC50表示。如本文實施例中所展現，本發明之具體實例在較 低濃度下始終展現比艾美賽珠單抗更大的效力。參見例如圖29、圖30、圖31、圖33及圖34中所呈現之結果。
螢光TGA中之最大反應(例如，最高Cmax、最低Tmax、最短滯後時間等)亦值得注意。最大反應為隨著抗體濃度提高，量測參數(例如，Cmax)平穩之水平，且代表可達成的最大水平(例如，最大Cmax)。過度最大反應可能與雙專一性分子過量給藥之風險提高相關，包括特徵由促凝血路徑異常增加的活化界定之消耗性凝血病或播散性血管內凝血(disseminated intravascular coagulation；DIC)的風險。高凝結性(hypercoagulability)可經由諸如動脈/靜脈血栓形成、栓塞及血栓性微血管病的凝血病事件危害患者安全，且將因此縮窄治療窗，亦即，達成有益效果而無不可接受的副作用或不良事件之風險的劑量或血漿濃度範圍。
由於艾美賽珠單抗基於在人類臨床試驗中被認為可接受之安全概貌已得到法規批准，因此TGA中艾美賽珠單抗之最大反應代表已建立之安全極限。視需要，本發明之雙專一性物在TGA中之最大Cmax及/或最大Tmax反應與艾美賽珠單抗的差異不超過20%(例如，不超過15%或不超過10%)。可使用艾美賽珠單抗校準劑或艾美賽珠單抗之序列一致類似物測定此等參考值。
本發明之雙專一性物可在TGA中展現如下最大反應：- TGA中之Cmax不超過500nM。視需要Cmax之最大反應不超過450nM，例如不超過400nM。Cmax之最大反應可在200nM與450nM之間，例如在250nM與350nM之間；及/或- TGA中之Tmax不低於1分鐘之最大反應。視需要Tmax之最大反應不少於5分鐘、不少於4分鐘、不少於3分鐘或不少於2分鐘。Tmax之最大反應可在2分鐘與10分鐘之間，例如在2分鐘與8分鐘之間或在5分鐘與8分鐘之間.
如藉由螢光TGA所測定，根據本發明之雙專一性抗原結合分子可 具有在100nM至450nM(例如，200nM至450nM)範圍內之Cmax，例如其中在該分析中，雙專一性抗體在100nM或300nM之濃度下。Cmax較佳至少200nM，更佳至少250nM或至少300nM。雙專一性物之Cmax可與艾美賽珠單抗之Cmax相同或類似(例如，與其差異在10%內)，或其可大於艾美賽珠單抗之Cmax。在該分析中，雙專一性物之Cmax EC50可在艾美賽珠單抗之Cmax EC50的10%內或更低。在EC50低於艾美賽珠單抗時，在本發明之雙專一性物與艾美賽珠單抗之間TGA中之Cmax EC50的差異可為至少2倍、至少3倍、至少4倍或至少5倍。視需要TGA中之Cmax EC50可具有至多10倍、至多15倍或至多20倍的差異。螢光TGA中雙專一性抗原結合分子之Cmax的EC50可低於50nM，例如在1nM與50nM之間、在5nM與20nM之間或在5nM與10nM之間。
根據本發明之雙專一性抗原結合分子可具有8分鐘或以下的Tmax，例如在4至8分鐘範圍內，如藉由螢光TGA所測定，例如其中在該分析中，雙專一性抗體在100nM或300nM之濃度下。雙專一性物之Tmax可與艾美賽珠單抗之Tmax相同或類似(例如，與其差異在10%內)，或其可少於艾美賽珠單抗之Tmax。在該分析中，雙專一性物之Tmax EC50可在艾美賽珠單抗之Tmax EC50的10%內或更低。
在螢光TGA中，雙專一性抗原結合分子之Tmax的EC50可低於5nM，例如低於3nM或低於2nM。其可在1nM與5nM之間，例如在1nM與2nM之間。
如藉由螢光TGA所測定，根據本發明之雙專一性抗原結合分子可具有2至6分鐘之滯後時間，例如其中在該分析中，雙專一性抗體在100nM或300nM之濃度下。雙專一性物之滯後時間可與艾美賽珠單抗之滯後時間相同或類似(例如，與其差異在10%內)，或其可低於艾美賽珠單抗之滯後時間。在該分析中，雙專一性物之滯後時間EC50可在艾美賽珠單抗之滯後時間EC50的10%內或 更低。
雙專一性抗原結合分子
雙專一性抗原結合分子包含FIXa結合多肽臂及FX結合多肽臂。其可為多鏈或單鏈多肽分子。儘管FIXa結合多肽臂及FX結合多肽臂代表雙專一性分子之不同部分，但一種多肽可視需要形成FIXa結合臂及FX結合臂兩者之全部或部分。
多肽結合臂為雙專一性分子之區，其包含抗原(FIXa或FX)中之一種的結合位點。雙專一性分子之一個或兩個抗原結合位點可由多肽臂中之一組互補決定區(或胜肽環)提供，其中多肽臂為任何適合之支架多肽，無論抗體(例如，抗體Fv區)或非抗體分子之支架多肽。結合臂可包含一種或多於一種(例如，兩種)多肽或其部分(例如，域)。
本發明於本文中針對雙專一性抗體詳細描述，其中抗原結合多肽臂中之至少一者由抗體VH及/或VL域，視需要Fv區中之一組CDR提供。
抗體為免疫球蛋白或包含免疫球蛋白域之分子。抗體可為IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子，或包括其抗原專一性抗體片段之分子。術語「抗體」涵蓋包含抗體抗原結合位點之任何多肽或蛋白質。抗體抗原結合位點(互補位)為結合至其目標抗原之抗原決定基且與該抗原決定基互補之抗體的部分。術語「抗原決定基」係指抗體所結合之抗原的區。抗原決定基可定義為結構性或功能性的。功能性抗原決定基一般為結構性抗原決定基之子集，且具有直接促成相互作用之親和力的彼等殘基。抗原決定基亦可為構形的，亦即，由非線性胺基酸構成。在某些具體實例中，抗原決定基可包括為諸如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基之分子之化學活性表面群組的決定子，且在某些具體實例中，可具有特定三維結構特徵及/或特定電荷特徵。
抗體抗原結合位點由抗體VH及/或VL域中之一組互補決定區(CDR)提供，且能夠結合抗原。在一實例中，抗體結合位點由單一可變域，例如重鏈可變域(VH域)或輕鏈可變域(VL域)提供。在另一實例中，結合位點由VH/VL對(Fv)或兩個或更多個此類對提供。
抗體可變域為抗體之輕鏈及重鏈的部分，其包括互補決定區(CDR；亦即，CDR1、CDR2及CDR3)及架構區(framework region；FR)之胺基酸序列。因此，CDR及FR在VH及VL域中之各者內。VH域包含一組HCDR，且VL域包含一組LCDR。VH係指重鏈之可變域。VL係指輕鏈之可變域。各VH及VL典型地由三個CDR及四個FR構成，自胺基端至羧基端依以下次序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。分配給CDR及FR之胺基酸位置可根據IMGT命名法定義。抗體可包含抗體VH域，其包含VH CDR1、CDR2及CDR3及架構。其可替代地或另外包含抗體VL域，其包含VL CDR1、CDR2及CDR3及架構。抗體VH及VL域及CDR之示例序列形成本發明之部分。CDR根據IMGT系統定義[13]。本文所揭示之所有VH及VL序列、CDR序列、CDR組及HCDR組及LCDR組代表本發明之態樣及具體實例。如本文所描述，「CDR組」包含CDR1、CDR2及CDR3。因此，一組HCDR係指HCDR1、HCDR2及HCDR3，且一組LCDR係指LCDR1、LCDR2及LCDR3。除非另外說明，否則「CDR組」包括HCDR及LCDR。
抗體可在抗體架構內包含一或多個CDR，例如一組CDR。架構區可具有人類生殖系基因區段序列。因此，抗體可為人類抗體，其具有在人類生殖系架構中包含一組HCDR的VH域。通常抗體亦具有VL域，其例如在人類生殖系架構中包含一組LCDR。抗體「基因區段」，例如VH基因區段、D基因區段或JH基因區段係指寡核苷酸，該寡核苷酸具有抗體部分自其中衍生之核酸序列，例如VH基因區段為寡核苷酸，其包含對應於FR1至CDR3之部分的多肽VH 域之核酸序列。人類v、d及j基因區段重組合以產生VH域，且人類v及j區段重組合以產生VL域。D域或區係指抗體鏈之多樣性域或區。J域或區係指抗體鏈之接合域或區。體細胞超突變可產生具有不與對應基因區段精確匹配或對準之架構區的抗體VH或VL域，但可使用序列比對來鑑別最接近基因區段且因此鑑別特定VH或VL域衍生自基因區段之哪一特定組合。當將抗體序列與基因區段比對時，可將抗體胺基酸序列與由基因區段編碼之胺基酸序列比對，或可將抗體核苷酸序列直接與基因區段之核苷酸序列比對。對應於本文所描述之示例抗體之架構區的生殖系基因區段在表S-12中指定。
抗體可為包括恆定區之整個免疫球蛋白，或可為抗體片段。抗體片段為完整抗體之一部分，例如包含完整抗體之抗原結合區及/或可變區。抗體片段可包括一或多個恆定區域。
本發明之抗體可為人類抗體或包含人類可變區及非人類(例如，小鼠)恆定區之嵌合抗體。本發明之抗體例如具有人類可變區，且視需要亦具有人類恆定區。
因此，抗體視需要包括恆定區或其部分，例如人類抗體恆定區或其部分，諸如人類IgG4恆定區。舉例而言，VL域可在其C端部末端連接至抗體輕鏈κ或λ恆定域。類似地，抗體VH域可在其C端部末端連接至衍生自抗體同型，例如IgG、IgA、IgE及IgM及同型子類，諸如IgG1或IgG4中之任一者之免疫球蛋白重鏈恆定區的全部或部分(例如，CH1域或Fc區)。
用酶木瓜蛋白酶消化整個(二價)免疫球蛋白產生兩個被稱為「Fab」片段的一致(單價)抗原結合片段，及「Fc」片段。Fc不具有抗原結合活性但能夠結晶。當在本文中使用時，「Fab」係指抗體之片段，其包括重鏈及輕鏈中之各者的一個恆定域及一個可變域。本文中之術語「Fc區」用於定義免疫球蛋白重鏈之C端區，包括天然序列Fc區及變異Fc區。「Fc片段」係指由雙硫 鍵結合在一起之兩個H鏈的羧基端部分。
用酶胃蛋白酶消化抗體產生二價F(ab')2片段，其中抗體分子之兩條臂保持鍵聯。F(ab')2片段為二價片段，其包括在鉸鏈區由雙硫橋鍵鍵聯之兩個Fab片段。單鏈抗體(例如，scFv)為另一片段。可將兩種不同單價單專一性抗體片段(諸如scFv)鍵聯在一起以形成二價雙專一性抗體。
當在本文中使用時，「Fv」係指保留抗原識別及抗原結合位點兩者之抗體的最小片段。此區由緊密、非共價或共價締合之一個重鏈可變域及一個輕鏈可變域的二聚體組成。在此組態中，各可變域之三個CDR相互作用以界定VH-VL二聚體表面上之抗原結合位點。集合地，六個CDR賦予抗體抗原結合專一性。然而，即使單一可變域(或僅包含三個對抗原具有專一性之CDR之Fv的一半)亦能夠識別且結合抗原，不過親和力通常比完整結合位點低。
較佳地，雙專一性抗體為雙重結合抗體，亦即，其中兩個抗原結合域均由VH/VL對形成之雙專一性抗體。雙重結合抗體包括FIT-Ig(參見WO2015/103072，以引用之方式併入本文中)、mAb-dAb、塢與鎖(dock and lock)、Fab-臂交換、SEED體(SEEDbody)、三功能單抗(Triomab)、LUZ-Y、Fcab、κλ體(κλ-body)、正交Fab、sc雙功能抗體-Fc、雙功能抗體-Fc、串聯scFv-Fc、Fab-scFv-Fc、Fab-scFv、胞內抗體、BiTE、雙功能抗體、DART、串聯雙鏈體(TandAb)、sc雙功能抗體、sc雙功能抗體-CH3、雙功能抗體-CH3、三重體(Triple body)、微型抗體(Miniantibody)、微型體(minibody)、scFv-CH3 KIH、scFv-CH-CL-scFv、F(ab')2-scFv、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四價HCab、ImmTAC、臼包杵、具有共同輕鏈的臼包杵、具有共同輕鏈及電荷對之臼包杵、電荷對、具有共同輕鏈之電荷對、DT-IgG、DutaMab、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)IgG、IgG(L,H)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv及scFv4-Ig。
在一個具體實例中，雙專一性抗體為雙專一性IgG，其包含FIXa結合多肽臂及FX結合多肽臂，各多肽臂包含重鏈及輕鏈。IgG為四聚免疫球蛋白，其包含第一抗體重鏈及輕鏈對(重鏈-輕鏈對)，其包含結合FIXa的Fv區，第二重鏈-輕鏈對，其包含結合FX的Fv區，其中各重鏈包含VH域及恆定區，且各輕鏈包含VL域及恆定區，且其中第一及第二重鏈-輕鏈對經由其重鏈恆定區之異二聚化締合，以形成免疫球蛋白四聚體。
視需要，兩個多肽臂包含共同輕鏈，因此第一及第二重鏈-輕鏈對之輕鏈具有一致胺基酸序列(圖5)。可替代地，兩個多肽臂可包含不同輕鏈。
雙專一性抗體可為對於結合FIXa而言及對於結合FX而言單價的。
抗體恆定區
如上文所論述，抗體可以各種同型提供且提供有不同恆定區。抗體之Fc區由Fc受體識別且決定抗體介導細胞效應功能之能力，包括抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity；ADCC)活性、補體依賴性細胞毒性(complement dependent cytotoxicity；CDC)活性及抗體依賴性細胞吞噬作用(antibody-dependent cell phagocytosis；ADCP)活性。此等細胞效應功能涉及將帶有Fc受體之細胞募集至目標細胞位點，引起抗體結合之細胞的殺死。
在本發明之情形下，需要避免細胞效應功能，諸如ADCC、ADCP及/或CDC。因此，根據本發明之雙專一性抗原結合分子可不具有Fc效應功能，例如其可含有不介導ADCC、ADCP及/或CDC之Fc區，或其可不具有Fc區或不具 有整個抗體恆定區。抗體可具有無效應(effector null)的恆定區。
抗體可具有重鏈恆定區，其結合一或多種類型之Fc受體但不誘導細胞效應功能，亦即，不介導ADCC、CDC或ADCP活性。此類恆定區可能無法結合負責觸發ADCC、CDC或ADCP活性之特定Fc受體。
抗體可具有不結合Fcγ受體之重鏈恆定區，例如恆定區可包含Leu235Glu突變(亦即，其中野生型白胺酸殘基突變為麩胺酸殘基)，其可稱作「E」突變，例如IgG4-E。重鏈恆定區另一視需要選用之突變為Ser228Pro(「P」突變)，其藉由減少Fab臂交換提高穩定性。重鏈恆定區可為IgG4，其包含Leu235Glu突變及Ser228Pro突變兩者(EU編號)。此「IgG4-PE」重鏈恆定區無效應。替代無效應人類恆定區為失能IgG1。
抗體恆定區可經工程改造以具有延長的活體內半衰期。實例包括「YTE」突變及其他延長半衰期之突變(Dall'Acqua,Kiener及Wu,JBC 281(33)：23514-23524 2006及WO02/060919，其以引用之方式併入本文中)。三重突變YTE為IgG CH2域中3個胺基酸之取代，此等突變提供殘基252處之酪胺酸、殘基254處之蘇胺酸及殘基256處之麩胺酸，根據Kabat之EU索引編號。如所提及之出版物中所描述，與具有人類CH2野生型域之對應抗體的半衰期相比，YTE修飾延長抗體之半衰期。為了提供增加的活體內功效持續時間，本發明之抗體可包括抗體恆定區(例如，IgG恆定區，例如IgG CH2域)，與對應野生型人類恆定區(例如，IgG，例如IgG CH2域)相比，其具有一或多個延長抗體之半衰期的突變。可藉由諸如WO02/060919中所描述之標準方法測定半衰期。
在一些具體實例中，雙專一性抗體中包括富γ羧基麩胺酸(Gla)域或其他膜結合域(例如，在Fc之C端處)，以促進抗體定位至血小板表面處之磷脂膜(經由Gla域與膜之間的相互作用)，從而在活體內FIX及FX天然存在之位置提高雙專一性抗體之局部濃度。WO2018/145125描述FVIII模擬蛋白，其包含 FIX/FX雙專一性抗體及膜結合域，例如血小板結合域，諸如血小板膜醣蛋白之C1、C2域、PH域、GLA域或膜結合域。如其中所描述，膜結合域可鍵聯至雙專一性抗體之重鏈恆定域中之一或兩者的C端。本發明之雙專一性抗原結合分子可視需要包括WO2018/145125中所描述之特徵及分子形式。
如下文所論述，在雙專一性IgG形式或不同抗原結合臂經由恆定區異二聚化之其他抗體形式中，恆定區可經工程改造以相比於同二聚體形成促進異二聚體形成，及/或以便於自不同物種之混合物純化異二聚體。
抗FIXaxFX雙專一性抗體艾美賽珠單抗含有重鏈恆定區，且包括經設計以促進其組裝、純化及/或治療效能之特徵。根據本發明之雙專一性抗體可包含此等特徵中之任何一或多者。因此，其可包含人類IgG4(例如，IgHG4*03)重鏈恆定區胺基酸序列，該胺基酸序列包含以下變化中之一或多者(EU編號)：CH1中之Lys196Gln；鉸鏈區中之Ser228Pro(P突變)；CH2之DE轉向結構(turn)中之Phe296Tyr；CH3中之Glu356Lys；CH3中之Lys439Glu；CH3中之Leu445Pro；Gly446之缺失；Lys447之缺失。
異二聚雙專一性物之Fc內的兩個相對成對重鏈恆定區中包括突變Glu356Lys及Lys439Glu中之每一者，亦即，一個重鏈恆定區包含Glu356及Lys439Glu，且另一重鏈恆定區包含Glu356Lys及Lys439(參見以下對電荷成對之論述)。
根據本發明之雙專一性抗體可包含Fc區，其具有艾美賽珠單抗之 Fc區中存在的特徵中之任何一或多者。其可包含艾美賽珠單抗之Fc區。在一個具體實例中，重鏈恆定區之胺基酸序列為艾美賽珠單抗重鏈恆定區之胺基酸序列。
重鏈恆定區之示例胺基酸序列在表S-100中顯示。
促進異二聚體形成及/或純化之雙專一性抗體工程改造
歷史上，在臨床中使用雙專一性抗體的困難之一係以大量及醫藥級純度產生該等抗體的困難。「傳統」雙專一性IgG形式包含兩對不同重鏈及輕鏈，因此4條不同多肽鏈，若共同表現，則其可組裝成10種不同潛在抗體分子。物種之混合物將包括同二聚體(同二聚抗FIXa結合臂及同二聚抗FX結合臂)、一條或兩條輕鏈在H-L對之間交換的分子以及「正確」雙專一性異二聚結構。
已開發出替代分子形式，其避免此潛在錯誤成對，且本文提供數個實例。此等包括例如藉由化學偶合或白胺酸拉鏈(fos：jun)組裝製備的F(ab')2雙功能抗體及scFv異二聚體。儘管如此，仍需要能夠使用雙專一性IgG，以反映血流中抗體之天然結構並且使所投予之治療性分子的免疫原性最小化。另外，全長雙專一性抗體可具有較長血清半衰期。
用於製造雙專一性抗體之「臼包杵」技術描述於[14]及US5,731,168中，其均以引用之方式併入本文中。原理為工程改造異二聚重鏈之成對CH3域，使得一個CH3域含有「杵」並且另一CH3域在空間相對位置處含有「臼」。杵藉由在CH3域之間的界面處置換小胺基酸側鏈產生，而臼藉由用較小側鏈置換大側鏈產生。杵經設計以插入至臼中，以有利於不同CH3域之異二聚化，同時使同二聚體形成不穩定。在組裝以形成雙專一性抗體之抗體重鏈及輕鏈的混合物中，具有成對異二聚重鏈之IgG分子的比例因此提高，提高活性分子之產量及回收率。
可包括突變Y349C及/或T366W以在IgG CH3域中形成「杵」。可包括突變E356C、T366S、L368A及/或Y407V以在IgG CH3域中形成「臼」。杵及臼可引入至任何人類IgG CH3域，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH3域中。較佳實例為IgG4。如所提及，IgG4可包括進一步修飾，諸如「P」及/或「E」突變。示例IgG4-PE序列及包括臼包杵突變之其他示例恆定區在表S-100中顯示。IgG4 a型(「ra」)序列含有取代Y349C及T366W(「杵」)，且IgG4 b型(「γb」)序列含有取代E356C、T366S、L368A及Y407V(「臼」)。ra及γb兩者亦在鉸鏈中之位置228處含有「P」取代(S228P)，以使重鏈之鉸鏈區穩定。ra及γb兩者亦在CH2區中在位置235處含有「E」取代(L235S)，以消除與FcγR之結合。因此，IgG4-PE重鏈之相關序列為ppcp P cpapef E ggps(SEQ ID NO：401)。本發明之雙專一性抗原結合分子可含有IgG4 PE人類重鏈恆定區(例如，SEQ ID NO：143)，視需要兩個此類成對恆定區，視需要其中一個具有「杵」突變且一個具有「臼」突變，例如其中一個重鏈恆定區具有序列SEQ ID NO：144(杵)且一個重鏈恆定區具有序列SEQ ID NO：145(臼)。
雙專一性IgG工程改造中之另一進展為使用共同輕鏈之想法，如WO98/50431中所描述。描述包含兩個重鏈-輕鏈對之雙專一性抗體，其中兩個重鏈-輕鏈對之可變輕鏈具有共同序列。WO98/50431描述將共同輕鏈方法與重鏈異二聚化界面(諸如臼包杵)中之專一性互補相互作用組合，以促進異二聚體形成且阻礙同二聚體形成。組合地，此等方法增強相對於非所要異二聚體及同二聚體，所要異二聚體之形成。
臼包杵技術涉及工程改造胺基酸側鏈以在雙專一性異二聚體中之成對CH3域的界面處產生互補分子形狀，而促進異二聚體形成且阻礙同二聚體形成之另一方式為工程改造胺基酸側鏈以具有相反電荷。帶相反電荷之殘基的成對有利於重鏈異二聚體中CH3域之締合，而成對正電荷或成對負電荷將使同二 聚體形成在能量上較不利。WO2006/106905描述一種用於產生異多聚體之方法，該異多聚體由多於一種類型之多肽構成(諸如兩種不同抗體重鏈之異二聚體)，多肽包含在該等多肽之間形成界面之胺基酸殘基中的取代，使得異多聚體締合將受調節，該方法包含：(a)將編碼形成多肽之間界面的胺基酸殘基之核酸自初始核酸修飾，使得形成一或多種多聚體之多肽之間的締合在可形成兩種或更多種類型之多聚體的異多聚體中受抑制；(b)培養宿主細胞，使得藉由步驟(a)修飾之核酸序列被表現；及(c)自宿主細胞培養物回收該異多聚體，其中步驟(a)之修飾為修飾初始核酸，使得一或多個胺基酸殘基在界面處經取代，以使得形成界面之兩個或更多個胺基酸殘基(包括突變殘基)將帶有相同類型之正電荷或負電荷。
此之實例為藉由在重鏈同二聚體之界面處引入靜電斥力，例如藉由修飾在CH3域之界面處彼此接觸的胺基酸殘基抑制重鏈之間的締合，包括：位置356及439
位置357及370
位置399及409，殘基編號係根據EU編號系統。
藉由修飾此等殘基對中之一或多者以在第一重鏈之CH3域中具有相同電荷(均為正或均為負)，重鏈同二聚體之成對藉由靜電斥力抑制。藉由工程改造第二(不同)重鏈之CH3域中之相同對或殘基對以與第一重鏈中之對應殘基相比具有相反電荷，第一及第二重鏈之異二聚成對藉由靜電引力促進。
重鏈恆定區CH3界面處之胺基酸經修飾以引入電荷對，突變在WO2006/106905之表1中列舉。據報導，修飾重鏈位置356、357、370、399、409 及439處之胺基酸以在CH3界面處引入電荷感應之分子斥力具有提高預期雙專一性抗體形成效率的效果。舉例而言，一個重鏈恆定區可為含有突變K439E(帶正電Lys經帶負電Glu置換)之IgG4恆定區，且另一重鏈恆定區可為含有突變E356K(帶負電Glu經帶正電Lys置換)之IgG4恆定區，使用EU編號。「電荷成對」由自此兩個恆定區之異二聚化組裝的Fc區中之殘基439及356之空間鄰近引起。
在使用兩種不同重鏈恆定區時，此等可以任一方向連接至抗體之兩種不同VH域。舉例而言，第一重鏈可包含抗FIX VH域及包含K439E之恆定區，且第二重鏈可包含抗FX VH域及包含E356K之恆定區，或第一重鏈可包含抗FIX VH域及包含E356K之恆定區，且第二重鏈可包含抗FX VH域及包含K439E之恆定區。
WO2006/106905亦例示結合FX及FIXa之雙專一性IgG抗體，其中IgG4之CH3域經工程改造以具有臼包杵突變。a型a型(IgG4γa)為在Y349C及T366W處經取代之IgG4，且b型(IgG4γb)為在E356C、T366S、L368A及Y407V處經取代之IgG4。
在另一實例中，在抗體VH及VL域中引入電荷對用於抑制「不正確」VH-VL對形成(來自一個抗體之VH與另一抗體之VL成對)。在一個實例中，VH及VL中之Q殘基改變為K或R(正)，或改變為E或D(負)，以抑制Q側鏈之間的氫鍵鍵合且引入靜電斥力。
電荷對之其他實例揭示於WO2013/157954中，其描述一種用於由單一細胞產生包含異二聚CH3域之分子之方法，該分子包含能夠形成界面的兩個CH3域。該方法包含在細胞中提供(a)編碼包含第一CH3域之多肽鏈的第一核酸分子，根據EU編號系統，此鏈在位置366處包含K殘基，及 (b)編碼包含第二CH3域之多肽鏈的第二核酸分子，根據EU編號系統，此鏈在位置351處包含D殘基，該方法進一步包含培養宿主細胞之步驟，允許表現兩個核酸分子且自培養物收穫包含異二聚CH3域之分子。
工程改造多肽鏈中之靜電相互作用，以相比於同二聚體形成促進異二聚體形成的其他方法描述於WO2011/143545中。
在CH3-CH3介面處之工程改造的另一實例為股交換工程改造域(strand-exchange engineered domain；SEED)CH3異二聚體。CH3域由人類IgA及IgG CH3序列之交替區段構成，其形成被稱作「SEED體」之互補SEED異二聚體對。[15；WO2007/110205]。
亦已用異二聚化重鏈產生雙專一性物，該等重鏈在CH3域中經差異修飾以改變其對與純化試劑(諸如蛋白A)結合的親和力。WO2010/151792描述異二聚雙專一性抗原結合蛋白，其包含第一多肽，其自N端至C端包含選擇性結合第一抗原決定基之第一抗原決定基結合區，包含選自IgG1、IgG2及IgG4之人類IgG之第一CH3區的免疫球蛋白恆定區；及第二多肽，其自N端至C端包含選擇性結合第二抗原決定基之第二抗原決定基結合區，包含選自IgG1、IgG2及IgG4之人類IgG之第二CH3區的免疫球蛋白恆定區，其中第二CH3區包含減少或消除第二CH3域與蛋白A之結合的修飾。
Fc區可因此包含一或多個突變以促進活性異二聚體自同二聚體物種之差異性純化。一個重鏈恆定區之CH3可包含突變His435Arg及/或Tyr436Phe(EU編號)[16]而另一重鏈恆定區之CH3不具有該等突變。舉例而言，艾美賽珠單抗包含Fc區，其中一個CH3包含His435且另一CH3包含His435Arg。
本發明之雙專一性物可視需要使用此等技術及分子形式中之任 一者。
產生及修飾抗體
用於鑑別及製備抗體之方法為人所熟知。可將本文所描述之編碼抗體(或其重鏈-輕鏈對或多肽結合臂)的經分離(視需要突變)核酸引入至宿主細胞，例如如所論述之CHO細胞中。隨後在用於表現抗體(或抗體重鏈及/或輕鏈可變域、重鏈-輕鏈對或多肽結合臂)之條件下培養宿主細胞，以產生所要抗體形式。一些可能的抗體形式在本文中描述，例如整個免疫球蛋白、抗原結合片段及其他設計。
如所論述，VH及VL域中之任一者或CDR的可變域胺基酸序列變異體之序列在本文中具體揭示且可根據本發明使用。
如本文所描述，可進行對編碼抗體重鏈及/或輕鏈可變域之核酸的改變，諸如殘基之突變及變異體之產生。可能需要產生變異體之原因很多，其包括針對大規模製造使抗體序列達到最佳、便於純化、增強穩定性或提高對於包括於所要醫藥調配物中之適合性。可在抗體序列中之一或多個目標殘基處進行蛋白質工程改造工作，例如以用替代胺基酸取代一個胺基酸(視需要，產生在此位置處含有所有天然存在之胺基酸的變異體，其中可能的例外為Cys及Met)，及監測對功能及表現之影響以確定最佳取代。在一些情況下，用Cys或Met取代殘基或將此等殘基引入至序列中係非所要的，因為如此進行可產生製造困難，例如經由新分子內或分子間半胱胺酸-半胱胺酸鍵之形成。在先導候選物已經選擇且針對製造及臨床開發最佳化時，一般需要儘可能少地改變其抗原結合特性，或至少保留母分子之親和力及效力。然而，亦可產生變異體以便調節關鍵抗體特徵，諸如親和力、交叉反應性或中和效力。
可視需要在本文所揭示之抗體VH或VL域的架構區中進行一或 多種胺基酸突變。舉例而言，可將不同於對應人類生殖系區段序列之一或多個殘基恢復至生殖系。對應於本文示例抗體之VH及VL域的人類生殖系基因區段序列在表S-12中指定。
在雙專一性抗原結合分子中，抗原結合位點可包含所揭示之抗FIX或抗FX抗體中之任一者的一組H及/或L CDR，其中所揭示之H及/或L CDR組內具有一或多種胺基酸突變。突變可為胺基酸取代、缺失或插入。因此，舉例而言，在所揭示之H及/或L CDR組內可存在一或多種胺基酸取代。舉例而言，在H及/或L CDR組內可存在至多12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2種突變，例如取代。舉例而言，在HCDR3中可存在至多6、5、4、3或2種突變，例如取代，且/或在LCDR3中可存在至多6、5、4、3或2種突變，例如取代。
抗體可包含與如表中所顯示之VH域具有至少60、70、80、85、90、95、98或99%胺基酸序列一致性的VH域，及/或包含與彼等抗體中之任一者的VL域具有至少60、70、80、85、90、95、98或99%胺基酸序列一致性的VL域。可用於計算兩個胺基酸序列之一致性%的演算法包括例如BLAST、FASTA或史密斯-沃特曼演算法(Smith-Waterman algorithm)，例如使用預設參數。特定變異體可包括一或多種胺基酸序列改變(添加、缺失、取代及/或插入胺基酸殘基)。
可在一或多個架構區及/或一或多個CDR中進行改變。變異體視需要藉由CDR突變誘發提供。改變通常不引起功能喪失，因此包含如此改變之胺基酸序列的抗體可保留結合其抗原之能力。其可保留與其中未進行改變之抗體數量相同的結合能力，例如如本文所描述之分析中所量測。包含如此改變之胺基酸序列的抗體可具有改良之結合其抗原的能力。
改變可包含用非天然存在或非標準胺基酸置換一或多個胺基酸殘基，將一或多個胺基酸殘基修飾成非天然存在或非標準形式，或將非天然存在或非標準胺基酸插入至序列中。本發明之序列中之改變的數目及位置之實例 在本文別處描述。天然存在之胺基酸包括20種「標準」L-胺基酸，該等胺基酸由其標準單字母代碼鑑別為G、A、V、L、I、M、P、F、W、S、T、N、Q、Y、C、K、R、H、D、E。非標準胺基酸包括可併入至多肽主鏈中或由現有胺基酸殘基之修飾產生的任何其他殘基。非標準胺基酸可為天然存在或非天然存在的。
如本文所用，術語「變異體」係指胜肽或核酸，其因一或多種胺基酸或核酸缺失、取代或添加而與親本多肽或核酸不同，但保留母分子之一或多種特定功能或生物活性。胺基酸取代包括胺基酸經不同的天然存在之胺基酸殘基置換的改變。此類取代可分類為「保守性的」，在此情況下多肽中所含有之胺基酸殘基經另一天然存在之胺基酸置換，另一胺基酸相對於極性、側鏈官能基或大小具有類似特徵。此類保守性取代為所屬技術領域中所熟知。本發明所涵蓋之取代亦可為「非保守性的」，其中存在於胜肽中之胺基酸殘基經具有不同特性之胺基酸，諸如來自不同組之天然存在之胺基酸取代(例如，用丙胺酸取代帶電或疏水性胺基酸)，或可替代地，其中天然存在之胺基酸經非習知胺基酸取代。在一些具體實例中，胺基酸取代為保守性的。當對於聚核苷酸或多肽使用時術語變異體內亦涵蓋，係指相比於參考聚核苷酸或多肽(例如，相比於野生型聚核苷酸或多肽)，可分別在一級、二級或三級結構中改變之聚核苷酸或多肽。
在一些態樣中，吾人可使用所屬技術領域中熟知之方法分離或產生的「合成變異體」、「重組變異體」或「經化學修飾」聚核苷酸變異體或多肽變異體。「經修飾變異體」可包括保守性或非保守性胺基酸變化，如下文所描述。聚核苷酸變化可引起由參考序列編碼之多肽中的胺基酸取代、添加、缺失、融合及截短。一些態樣包括插入變異體、缺失變異體或具有胺基酸取代之經取代變異體，包括胺基酸及其他分子之插入及取代，其通常不在作為變異體之基體的肽序列中出現，例如(但不限於)通常不在人類蛋白質中出現之鳥胺酸插入。 當描述多肽時，術語「保守性取代」係指不實質上改變多肽活性之多肽之胺基酸組成中的變化。舉例而言，保守性取代係指將胺基酸殘基取代為具有類似化學特性(例如，酸性、鹼性、帶正電或帶負電、極性或非極性等)之不同胺基酸殘基。保守性胺基酸取代包括用異白胺酸或纈胺酸置換白胺酸、用麩胺酸置換天冬胺酸或用絲胺酸置換蘇胺酸。提供功能類似之胺基酸的保守性取代表為所屬技術領域中所熟知。舉例而言，以下六個組各自含有作為彼此之保守性取代的胺基酸：1)丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；2)天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)；3)天冬醯胺(N)、麩醯胺酸(Q)；4)精胺酸(R)、離胺酸(K)；5)異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)；及6)苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)。(亦參見Creighton,Proteins,W.H.Freeman and Company(1984)，其以全文引用之方式併入)。在一些具體實例中，若變化不降低胜肽之活性，則改變、添加或缺失單一胺基酸或小百分比之胺基酸的個別取代、缺失或添加亦可視為「保守性取代」。插入或缺失典型地在約1至5個胺基酸範圍內。保守性胺基酸之選擇可基於胜肽中待取代之胺基酸的位置選擇，例如胺基酸係在胜肽之外部且暴露於溶劑，或在內部且不暴露於溶劑。
吾人可選擇將基於現有胺基酸之位置，包括其向溶劑之暴露(亦即，相比於不暴露於溶劑之內部定位的胺基酸，胺基酸暴露於溶劑或存在於胜肽或多肽之外表面上)，取代現有胺基酸之胺基酸。此類保守性胺基酸取代之選擇為所屬技術領域中所熟知，例如如Dordo等人J.MoI Biol,1999,217,721-739及Taylor等人，J.Theor.Biol.119(1986)；205-218及S.French及B.Robson,J.Mol.Evol.19(1983)171中所揭示。因此，吾人可選擇適於在蛋白質或胜肽外部之胺基酸(亦即暴露於溶劑之胺基酸)的保守性胺基酸取代，例如(但不限於)以下取代可使用：用F取代Y、用S或K取代T、用A取代P、用D或Q取代E、用D或G取代N、用K取代R、用N或A取代G、用S或K取代T、用N或E取代D、用L或V取 代I、用Y取代F、用T或A取代S、用K取代R、用N或A取代G、用R取代K、用S、K或P取代A。
在替代性具體實例中，吾人亦可選擇適於在蛋白質或胜肽內部之胺基酸的所涵蓋之保守性胺基酸取代，例如吾人可使用適用於蛋白質或胜肽內部之胺基酸(亦即不暴露於溶劑之胺基酸)的保守性取代，例如(但不限於)吾人可使用以下保守性取代：其中Y經F取代、T經A或S取代、I經L或V取代、W經Y取代、M經L取代、N經D取代、G經A取代、T經A或S取代、D經N取代、I經L或V取代、F經Y或L取代、S經A或T取代，且A經S、G、T或V取代。在一些具體實例中，術語變異體內亦涵蓋非保守性胺基酸取代。
本發明包括產生含有本文表中所顯示之抗體VH及/或VL域之VH及/或VL域變異體之多肽結合臂的方法。包含變異VH域之FIXa結合多肽臂可藉由包含以下者之方法產生(i)藉助於在親本抗體VH域之胺基酸序列中添加、缺失、取代或插入一或多個胺基酸，提供抗體VH域，其為親本抗體VH域之胺基酸序列變異體，其中親本抗體VH域為圖20中所顯示之VH域，例如N1280H，或為包含彼等VH域中之任一者之重鏈互補決定區的VH域，(ii)視需要將由此提供之VH域與VL域組合，以提供VH/VL組合，及(iii)測試由此提供之VH域或VH/VL域組合，以鑑別具有一或多種所要特徵之抗體。
VH域可為序列在表S-9A或圖20中顯示之任何VH域，或包含表S-9A或圖20中所顯示之VH域之一組HCDR(HCDR1、HCDR2及HCDR3)的任何VH域。
FIXa結合多肽臂及包含其之雙專一性抗FIXa/FX結合分子的所要特徵在本文別處詳述。舉例而言，該方法可包含證實VH域或VH/VL域組合結 合如本文所描述之FIXa。
當該方法中包括VL域時，VL域可為N0128LVL域或可為藉助於在N0128L VL域之胺基酸序列中添加、缺失、取代或插入一或多個胺基酸提供的變異體，或可為包含N0128L VL域之輕鏈互補決定區的VL域。VL域可為0325L VL域。
產生變異抗體之方法可視需要包含產生抗體或VH/VL域組合之複本。方法可進一步包含例如藉由表現編碼核酸，產生包含FIXa結合多肽臂之雙專一性抗體。表現，包括在宿主細胞中重組表現之適合方法在本文中詳細陳述。
編碼核酸及表現之方法
可提供經分離核酸，編碼根據本發明之雙專一性抗原結合分子，例如雙專一性抗體。核酸可為DNA及/或RNA。合成來源之基因組DNA、cDNA、mRNA或其他RNA或其任何組合可編碼抗體。
本發明提供呈質體、載體、轉錄或表現卡匣形式之構築體，其包含至少一種如上聚核苷酸。表中包括例示性核苷酸序列。對如本文中所陳述之核苷酸序列的提及涵蓋具有指定序列之DNA分子，且涵蓋具有指定序列之RNA分子，除非上下文另外要求，否則其中U經T取代。
本發明亦提供包含一或多種編碼抗原結合分子之核酸的重組宿主細胞。產生編碼分子之方法可包含例如培養含有核酸之重組宿主細胞，自核酸表現。雙專一性分子可因此獲得，且可使用任何適合之技術分離及/或純化，隨後視需要使用。產生方法可包含將產物調配成組成物，其包括至少一種額外組分，諸如醫藥學上可接受之賦形劑。
用於在多種不同宿主細胞中選殖及表現多肽之系統為人所熟 知。適合之宿主細胞包括細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、絲狀真菌、酵母菌及桿狀病毒系統及基因轉殖植物及動物。
在原核細胞中表現抗體及抗體片段在所屬技術領域中沿用已久。常用細菌宿主為大腸桿菌(E.coli)。在培養的真核細胞中表現亦可供所屬技術領域中具有通常知識者作為用於產生之選項使用。所屬技術領域中可用於表現異源多肽之哺乳動物細胞系包括中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary；CHO)細胞、海拉細胞(HeLa cell)、幼倉鼠腎細胞、NSO小鼠黑素瘤細胞、YB2/0大鼠骨髓瘤細胞、人類胚胎腎細胞、人類胚胎視網膜細胞及許多其他細胞。
載體可視需要含有適當調節序列，包括啟動子序列、終止子序列、多腺苷酸化序列、增強子序列、標記基因及其他序列。可將編碼抗體之核酸引入至宿主細胞中。可藉由各種方法，包括磷酸鈣轉染、DEAE-聚葡萄糖、電穿孔、脂質體介導之轉染及使用反轉錄病毒或其他病毒(例如牛痘或對於昆蟲細胞，桿狀病毒)轉導，將核酸引入至真核細胞中。在宿主細胞，尤其真核細胞中引入核酸可使用基於病毒或質體之系統。質體系統可游離地維持或可併入至宿主細胞中或人工染色體中。併入可藉由單一或多個基因座處一或多個複本之隨機或靶向整合進行。對於細菌細胞，適合之技術包括氯化鈣轉型、電穿孔及使用噬菌體轉染。引入可後接表現核酸，例如藉由在用於表現基因之條件下培養宿主細胞，隨後視需要分離或純化抗體。
本發明之核酸可整合於宿主細胞之基因組(例如染色體)中。可藉由根據標準技術，包括促進與基因組重組之序列促進整合。編碼雙專一性物之核酸可整合於宿主(例如，CHO)細胞之基因組DNA中，例如染色體DNA中，且所得重組細胞可經培養以表現雙專一性物。細胞系開發過程可包含將編碼雙專一性物之核酸引入至多個宿主細胞中，及選擇以所要產量(例如，至少0.5g/L或至少1g/L)表現所要水平之雙專一性抗體(例如，至少95%異二聚體，伴隨 不超過5%同二聚污染物)的細胞系。較佳細胞系將在細胞培養物中在多代內保留穩定表現，且因此其可在例如至少60代內維持此等產生水平。
本發明亦提供包含在表現系統中使用本文所描述之核酸以便表現雙專一性抗原結合分子的方法。理想地，在初始醱酵之後，在細胞上清液中抗原結合分子以至少0.5g/L之產量，較佳>2g/L之產量表現。溶解度應為>10mg/ml，較佳>50mg/ml，無顯著分子凝集或降解。
為了提供適於全球治療之醫藥，抗體可大規模產生，例如在至少100公升或至少200公升，例如在100至250公升之間的細胞培養物體積中。批式培養，尤其饋料批式培養，目前常用於產生用於臨床及商業用途之生物治療劑，且此類方法可適合地用於本發明以產生抗體，後接如本文所提及之純化及調配步驟。生物反應器可為金屬(例如，不鏽鋼)容器或可為單次用生物反應器。
調配及投予
根據本發明之雙專一性抗原結合分子(「雙專一性物」)及其編碼核酸分子將通常以經分離形式提供。雙專一性VH及/或VL域及核酸可提供為自其天然環境或其生產環境純化。經分離抗原結合分子及經分離核酸將不含或實質上不含與其天然締合之材料，諸如與其一起在活體內發現之其他多肽或核酸，或當此類製備藉由重組DNA技術在試管內進行時，製備其之環境(例如，細胞培養物)。視需要經分離抗原結合分子或核酸(1)不含將通常與其一起發現之至少一些其他蛋白質，(2)基本上不含來自相同源，例如來自相同物種之其他蛋白質，(3)由來自不同物種之細胞表現，(4)已與至少約50%的與其天然締合之聚核苷酸、脂質、碳水化合物或其他材料分離，(5)與其不天然締合之多肽可操作地締合(藉由共價或非共價相互作用)，或(6)不天然出現。
雙專一性抗體可藉由蛋白A層析及/或離子交換層析純化(例如， 自細胞培養上清液純化)。雙專一性抗體可藉由包含以下者之方法產生自包含編碼核酸之經培養宿主細胞表現兩個抗體重鏈及共同輕鏈，獲得細胞培養物，其包含由抗體重鏈及共同輕鏈組裝之雙專一性抗體及單專一性抗體，自細胞培養物分離雙專一性抗體及單專一性抗體(例如，使用蛋白A層析)，及自單專一性抗體純化雙專一性抗體(例如，使用陽離子交換層析)。
雙專一性物或其編碼核酸可與稀釋劑或佐劑一起調配，且又出於實際目的分離，例如若用於塗佈用於免疫分析之微量滴定盤，則其可與載劑混合，且當用於療法中時，可與醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑混合。如本文別處所描述，治療性製劑中亦可包括其他活性成分。抗原結合分子可活體內天然醣基化，或藉由諸如CHO細胞之異源真核細胞的系統醣基化，或其可為(例如若藉由在原核細胞中表現產生)未醣基化的。本發明涵蓋具有經修飾醣基化模式之抗體。
典型地，經分離產物構成給定樣本的至少約5%、至少約10%、至少約25%或至少約50%。雙專一性物可實質上不含在其天然或生產環境中所發現之將干擾其治療、診斷、預防、研究或其他用途的蛋白質或多肽或其他污染物。
如本文別處所論述，表現雙專一性抗體之抗體重鏈及輕鏈可產生除活性異二聚雙專一性抗體外的非所需同二聚物種(抗FIX及抗FX抗體)。較佳雙專一性物提供於組成物中，其中異二聚雙專一性抗體代表至少95%之總抗體，同二聚抗體污染物以5%或更低存在。組成物可包含至少98%或至少99%異二聚雙專一性物，同二聚污染物分別表示0至2%或0至1%。
本發明提供包含本文所描述之雙專一性物的治療性組成物。亦提 供包含編碼此類雙專一性物之核酸的治療性組成物。編碼核酸更詳細地描述於本文別處，且包括DNA及RNA，例如mRNA。在本文所描述之治療方法中，編碼雙專一性物之核酸及/或含有此類核酸之細胞的用途可用作包含雙專一性分子自身之組成物的替代方案(或另外使用)。含有編碼雙專一性物之核酸的細胞，視需要其中核酸穩定地整合於基因組中，因此代表用於患者中之治療用途的醫藥品。可將編碼雙專一性物之核酸引入至衍生自預期患者且經活體外修飾的人類細胞中。向患者投予含有編碼核酸之細胞提供能夠表現雙專一性物之細胞的儲池(reservoir)，與投予經分離核酸或經分離雙專一性分子相比，其可在較長時期內提供治療益處。可提供編碼雙專一性物之核酸以用於基因療法，包含將編碼核酸活體內引入至患者之細胞中，使得核酸在患者之細胞中表現且提供療效，諸如補償遺傳性因子VIII缺乏症。
組成物可含有適合之載劑、賦形劑及併入至調配物中以提供改良轉移、遞送、耐受及其類似者的其他試劑。多種適當調配物可見於所有醫藥化學家已知的處方集：Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,Pa。此等調配物包括例如散劑、糊劑、軟膏、凍膠、蠟、油、脂質、含脂質(陽離子或陰離子)之囊泡(諸如LIPOFECTINTTM)、DNA共軛物、無水吸收糊劑、水包油及水油包水乳液、乳液卡波蠟(各種分子量之聚乙二醇)、半固體凝膠、及含有卡波蠟之半固體混合物。亦參見Powell等人「Compendium of excipients for parenteral formulations」PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52：238-311。組成物可包含抗體或核酸與醫學注射緩衝液之組合。
雙專一性物，或其編碼核酸，可針對向患者投予的所要途徑調配，例如呈注射用液體(視需要水溶液)形式。其中調配用於注射之雙專一性物的示例緩衝液為20mM乙酸鈉、150mM精胺酸鹽酸鹽、0.05% w/v聚山梨醇酯80 pH 5.2之水溶液。
各種遞送系統已知且可用於投予本發明之醫藥組成物。引入方法包括(但不限於)皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜外及經口途徑。組成物可藉由任何合宜途徑投予，例如藉由輸注或推注注射，藉由經上皮或黏膜皮膚內層(例如，口腔黏膜、直腸及腸黏膜等)吸收且可與其他生物活性劑一起投予。投予可為全身或局部的。抗原結合分子較佳藉由皮下注射投予。
醫藥組成物亦可在囊泡，尤其脂質體中遞送(參見Langer(1990)Science 249：1527-1533；Treat等人(1989)在Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer,Lopez Berestein及Fidler(編),Liss,New York，第353-365頁中；Lopez-Berestein，同上，第317-327頁；參見大體上同上)。
在某些情境中，醫藥組成物可在控制釋放系統中遞送。在一個具體實例中，可使用泵(參見Langer，前述；Sefton(1987)CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201)。在另一具體實例中，可使用聚合材料；參見Medical Applications of Controlled Release,Langer及Wise(編),CRC Pres.,Boca Raton,Fla.(1974)。在又一具體實例中，控制釋放系統可接近組成物之目標置放，因此僅需要全身劑量之一部分(參見例如Goodson，在Medical Applications of Controlled Release，前述，第2卷，第115-138頁，1984中)。
可注射製劑可包括用於靜脈內、皮下、皮內及肌肉內注射、滴液輸液等之劑型。此等可注射製劑可藉由公開已知方法製備。舉例而言，可注射製劑可例如藉由將上文所描述之抗體或其鹽在習知用於注射之無菌水性介質或油性介質中溶解、懸浮或乳化製備。作為用於注射之水性介質，存在例如生理食鹽水、含有葡萄糖及其他輔助劑之等滲溶液等，其可與適當助溶劑組合使用，該助溶劑諸如醇(例如，乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非離子界面活性劑[例如，聚山梨醇酯80、HCO-50(氫化蓖麻油之聚氧乙烯(50莫耳) 加合物)]等。作為油性介質，使用例如芝麻油、大豆油等，其可與助溶劑組合使用，該助溶劑諸如苯甲酸苯甲酯、苯甲醇等。由此製備之注射劑可填充於適當安瓿中。本發明之醫藥組成物可用標準針及注射器皮下或靜脈內遞送。據設想，治療將不限於臨床用途。因此，使用無針裝置之皮下注射亦為有利的。就皮下遞送而言，筆式遞送裝置容易地應用於遞送本發明之醫藥組成物。此類筆式遞送裝置可為可再用或拋棄式的。可再用筆式遞送裝置一般利用含有醫藥組成物之可更換卡匣。一旦卡匣內之所有醫藥組成物已投予且卡匣為空，則空卡匣可容易地丟棄且用含有醫藥組成物之新卡匣置換。筆式遞送裝置隨後可再使用。在拋棄式筆式遞送裝置中，不存在可更換卡匣。實際上，拋棄式筆式遞送裝置預填充有容納於裝置內之儲槽中的醫藥組成物。一旦儲槽清空醫藥組成物，則丟棄整個裝置。大量可再用筆式及自動注射器遞送裝置應用於本發明之醫藥組成物的皮下遞送。實例包括但當然不限於AUTOPENTM(Owen Mumford公司，Woodstock,UK)；DISETRONICTM筆(Disetronic Medical Systems,Burghdorf,Switzerland)；HUMALOG MIX 75/25TM筆；HUMALOGTM筆；HUMALIN 70/30TM筆(Eli Lilly公司，Indianapolis,Ind.)；NOVOPENTMI、II及III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)；NOVOPEN JUNIORTM(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)；BDTM筆(Becton Dickinson,Franklin Lakes,N.J.)；OPTIPENTTM；OPTIPEN PROTM；OPTIPEN STARLETTM；及OPTICLIKTTM(Sanofi-Aventis,Frankfurt,Germany)，僅舉數例。應用於本發明之醫藥組成物之皮下遞送的拋棄式筆式遞送裝置之實例包括但當然不限於SOLOSTARTM筆(Sanofi-Aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)及KWIKPENTM(Eli Lilly)。
有利地，用於上文所描述之經口或非經腸用途之醫藥組成物以適於適合活性成分之劑量的單位劑量製備成劑型。呈單位劑量之此類劑型包括例如錠劑、丸劑、膠囊、注射劑(安瓿)、栓劑等。在單位劑量中，前述抗體之含 有量一般為每劑型約5至約500mg；尤其在注射劑形式中，前述抗體可以約5至約100mg含有，且對於其他劑型，以約10至約250mg含有。
雙專一性物、核酸或包含其之組成物可含於醫學容器，諸如小瓶、注射器、IV容器或注射裝置中。在一實例中，雙專一性、核酸或組成物在試管內，且可在無菌容器中。在一實例中，提供套組，其包含雙專一性物、包裝及用於在如本文所描述之治療方法中使用的說明書。
本發明之一態樣為一種組成物，其包含本發明之雙專一性物或核酸及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑，其實例在上文列出。「醫藥學上可接受」係指美國聯邦或州政府之管理機構核准或可核准，或列於美國藥典(U.S.Pharmacopeia)或用於動物(包括人類)之其他一般公認藥典中。醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或佐劑可與本文所描述之雙專一性劑，例如任何抗體或多肽分子一起向患者投予，且不破壞其藥理學活性，且當以足以遞送治療量之醫藥品的劑量投予時無毒性。
在一些具體實例中，雙專一性物將為根據本發明之組成物中的唯一活性成分。因此，組成物可由抗體組成或其可由雙專一性物以及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑組成。然而，根據本發明之組成物視需要包括一或多種額外活性成分。
在需要時(例如，用於處理急性出血)，雙專一性物可與血友病之一或多種其他治療，包括重組因子VIII(例如，妥羅凝血素α)或重組因子VIIa(例如，依他凝血素)組合。咸信本文所描述之雙專一性物之功能特性及安全概貌適於其與此類其他治療劑安全組合。雙專一性物可與重組因子Va(factor Va；FVa)，例如如US10407488中所描述之活化變異體FVa組合。
可能需要與根據本發明之雙專一性物或核酸一起投予之其他治療劑包括鎮痛劑。任何此類醫藥品或醫藥品之組合可與根據本發明之抗體或核 酸組合投予，或以與根據本發明之抗體或核酸的組成物形式提供，無論呈組合製劑或呈獨立製劑形式。根據本發明之雙專一性物或核酸可分別且依序投予，或並行且視需要以與另一治療劑或諸如所提及之彼等的醫藥品之組合製劑形式投予。
多種組成物可分別或同時投予。分別投予係指兩種組成物在不同時間投予，例如相隔至少10、20、30或10至60分鐘，或相隔1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12小時。吾人亦可相隔24小時，或相隔甚至更長投予組成物。可替代地，兩種或更多種組成物可同時投予，例如相隔少於10分鐘或少於5分鐘。同時投予之組成物可在一些態樣中以混合物形式投予，存在或不存在對於組分中之各者的類似或不同定時釋放機制。
雙專一性物，及其編碼核酸，可用作治療劑。本文中之患者一般為哺乳動物，典型地人類。雙專一性物或核酸可向哺乳動物投予，例如藉由本文所提及之任何投予途徑。
投予通常呈「治療有效量」，此為對其所投予者產生所要效果，足以顯示對患者之益處的量。精確量將取決於治療目的，且將可由所屬技術領域中具有通常知識者使用已知技術確定(參見例如Lloyd(1999)The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding)。治療處方，例如對劑量之決定等，在一般醫師及其他醫生之職責內且可取決於症狀之嚴重程度及/或所治療之疾病的進展。雙專一性物或核酸之治療有效量或適合劑量可藉由比較其試管內活性及動物模型中之活體內活性而確定。已知用於將小鼠及其他測試動物中之有效劑量外推至人類的方法。
雙專一性物可以每劑量以下範圍中之一者的量投予：約10微克/公斤體重至約100毫克/公斤體重，約50微克/公斤體重至約5毫克/公斤體重， 約100微克/公斤體重至約10毫克/公斤體重，約100微克/公斤體重至約20毫克/公斤體重，約0.5毫克/公斤體重至約20毫克/公斤體重，或約5毫克/公斤體重或更低，例如低於4、低於3、低於2或低於1毫克/公斤體重之抗體。
所投予之抗原結合分子的劑量可為至多1mg/kg。對於兒科群體，其可以較低強度調配，例如30至150mg/mL。對於兒科群體，雙專一性分子可以較小量包裝，例如其可以25至75mg，例如30或60mg之小瓶提供。
在本文所描述之治療方法中，可投予一或多次劑量。在一些情況下，單次劑量可有效達成長期益處。因此，該方法可包含投予單次劑量之雙專一性物、其編碼核酸或組成物。可替代地，可投予多次劑量，通常依序且由數天、數週或數個月之時段分隔開。視需要，可一月一次，或較不頻繁地，例如每兩個月或每三個月向患者投予雙專一性物。
如本文所用，術語「治療(treat/treatment/treating)」或「改善(amelioration)」係指治療性治療，其中目標為反轉、緩解、改善、抑制、減緩或停止與疾病或病症相關之病況的進展或嚴重程度。術語「治療」包括減少或緩解病況、疾病或病症之至少一種不良影響或症狀。若一或多種症狀或臨床標記減少，則治療一般為「有效的」。可替代地，若疾病之進展減少或停止，則治療為「有效的」。亦即，「治療」包括不僅症狀或標記之改善，而且與在不存在治療之情況下將預期的相比，症狀之進展或惡化的停止或至少減緩。有益或所要臨床結果包括(但不限於)一或多種症狀緩解、疾病程度減輕、穩定(亦即，不惡化的)疾病狀態、疾病進展延遲或減緩、疾病狀態改善或緩和、消退(無論部分或總體)及/或死亡率降低，無論可偵測或不可偵測。術語對疾病之「治療」亦包括提供自疾病之症狀或副作用的緩解(包括緩解性治療)。對於欲為有 效的治療，未設想完全治癒。該方法可在某些態樣中亦包括治癒。在本發明之情形下，治療可為防治性治療。
長半衰期為本發明之雙專一性物中之所要特徵。延長之半衰期轉化為較不頻繁的投予，需要較少注射來維持分子在血流中之治療有效濃度。本發明之抗原結合分子在人體內之活體內半衰期可為7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天或更長。抗原結合分子在諸如食蟹獼猴之非人類靈長類體內之活體內半衰期可為7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天或更長。
維持正常FVIII活性之1%視為血友病中之預防性用途的最小值[1]。在報導利用ACE910(艾美賽珠單抗)之人類臨床試驗的論文中，電子雜交群體藥物動力學建模及模擬表明1mg/kg之週劑量引起至少約300nM(45μg/ml)的血漿濃度，產生正常FVIII活性之至少10%的持續止血作用[4]。亦報導此劑量在患者中具有良好耐受性。
基於彼數據，假定抗體濃度與FVIII活性及相當抗體活性之間存在線性關係，大致30nM(約4.5μg/ml)至300nM(約45μg/ml)之血漿濃度範圍將對應於1%至10%之有效FVIII活性。
根據本發明之雙專一性物在30nM(約4.5μg/ml)至300nM(約45μg/ml)範圍內之濃度下展現格外高的活性，即使在相對低劑量下亦維持強凝血酶產生活性。如由其高效力(參見例如實施例14)所證明，根據本發明之雙專一性抗體可在比艾美賽珠單抗低的血漿濃度下展現治療功效。因此，與艾美賽珠單抗相比，其可在等效劑量下提供較大治療益處，且其可在較低劑量下提供等效治療益處。患者可因此受益於較小及/或較不頻繁的注射，且醫療保健供應商可受益於較低相關成本。
美國FDA當前(在2018年10月發佈之指南中)建議艾美賽珠單抗 以3mg/kg之起始劑量藉由皮下注射投予，每週一次持續前4週，後接以下維持劑量：1.5mg/kg每週一次，或3mg/kg每2週一次，或6mg/kg每4週一次。
可提供根據本發明之抗原結合分子以用於以一週、兩週、三週、四週或一個月之規則間隔投予。
在一較佳具體實例中，雙專一性物藉由皮下注射投予。
治療用途
本發明之雙專一性抗原結合分子可用於藉由療法治療人體或動物體之方法中。該等分子之治療適應症包括：治療A型血友病之用途，治療遺傳性因子VIII缺乏症之用途，顯著減少A型血友病患者中之出血事件之數目的用途，取代因子VIII功能之用途，及/或促進血液凝結之用途。
患者典型地為人類患者。患者可為診斷患有A型血友病或遺傳性因子VIII缺乏症之人類，或與野生型相比，具有較低(或不存在)因子VIII表現或活性之人類。患者可為兒科患者(例如，2至低於18歲)或可為成人。患者可為人類男性。患者可具有或可不具有因子VIII之抑制劑。
本發明之雙專一性分子，或包含此類雙專一性分子或其編碼核酸之組成物可用於或經提供以用於任何此類方法。亦設想雙專一性分子，或包含 其或其編碼核酸之組成物的用途，其用於製造用於任何此類方法之醫藥品。該方法典型地包含向哺乳動物，例如人類患者投予抗體或組成物。適合調配物及投予方法在本文別處描述。
存在當前未滿足的對治療產生FVIII之抑制性同種異體抗體之A型血友病患者的需求。本發明之抗原結合分子適用於此類患者。因此，在一些態樣中，經根據本發明之雙專一性抗原結合分子治療的患者可因在血流中存在抑制性抗體之緣故，對用FVIII進行之治療具有抗性。對治療之抗性可體現於療法功效之降低。此類抗性可利用來自患者之血漿樣本在試管內分析(例如aPTT分析)中偵測到，其中治療性分子不將凝結時間減少至與在對照組FVIII缺乏型血漿之情況下的分析中之相同水平(後者不具有針對治療性分子之抑制性抗體)。
接受血友病之其他治療，諸如針對FIXa及FX之雙專一性抗體的患者亦可產生針對彼等治療性抗體之抑制性抗體。如所提及，人類抗體(諸如本發明之彼等)之使用應使此之風險最小化，但儘管如此，抑制性抗體可在接受本發明之抗原結合分子或針對FIXa及FX之其他雙專一性抗原結合分子的一些患者中產生。經根據本發明之雙專一性抗原結合分子治療的患者可因在血流中存在抑制性抗體之緣故，對FIXa及FX之不同雙專一性抗原結合分子之治療具有抗性。患者可對用艾美賽珠單抗進行之治療具有抗性。
由於抑制性抗體可經由藥品之長期治療性投予產生，因此患者在多種不同治療之間交替或循環，以降低其產生抑制性抗體之風險可為有益的。因此，即使在患者(尚)未產生抑制性抗體時，亦可向先前已接受替代FVIIIa活性之不同多肽藥物，例如FIXa及FX之雙專一性抗原結合分子，視需要艾美賽珠單抗進行之治療的患者投予本發明之雙專一性抗原結合分子。類似地，可向先前經本發明之雙專一性抗原結合分子治療的患者投予艾美賽珠單抗或FIXa及 FX之其他雙專一性抗原結合分子，及一般而言替代FVIIIa活性之其他多肽藥物。治療方案可包含投予替代FVIII活性之第一多肽藥物持續第一時段(例如，在一個月與六個月之間，或在六個月與一年之間)，接著切換至替代FVIII活性之不同多肽藥物持續第二時段(例如，在一個月與六個月之間，或在六個月與一年之間)，接著切換回至第一藥物或切換至替代FVIII活性之又一多肽藥物。不同藥物治療之不同胺基酸序列應確保具有產生針對一種藥物之抑制性抗體之風險的患者在切換至不同藥物(例如，本發明之分子)之後，不再具有產生針對第一藥物(例如，艾美賽珠單抗)之抑制性抗體的風險。根據患者及醫生之便利性及偏好，循環時段可改變或縮短。
將認為投予編碼核酸代表替代療法，且可代替直接投予多肽藥物進行。
如所提及，咸信本發明之雙專一性抗原結合分子具有強安全概貌，不(或極少)與超敏反應事件、產生同種異體抗體、器官毒性或導致療法中斷之其他不良事件相關。
條項
以下編號條項代表本發明之具體實例且為本說明書之一部分。
1.一種雙專一性抗體，其結合FIXa及FX且催化FIXa介導之FX活化，其中該抗體包含兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對，其中第一重鏈-輕鏈對包含結合FIXa的Fv區，其包含與第一VL域成對之第一VH域，且第二重鏈-輕鏈對包含結合FX的Fv區，其包含與第二VL域成對之第二VH域，其中該第一VH域包含一組HCDR，其包含具有所定義之胺基酸序列的 HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中HCDR1係SEQ ID NO：406，HCDR2係SEQ ID NO：407且HCDR3係SEQ ID NO：408，且/或其中該第一VH域與N1280H VH域在胺基酸序列層級上至少95%一致；該第二VH域與T0201H VH域SEQ ID NO：470在胺基酸序列層級上至少95%一致，且該第一VL域及該第二VL域各自包含一組LCDR，其包含具有所定義之胺基酸序列的LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中LCDR1係SEQ ID NO：6，LCDR2係SEQ ID NO：7且LCDR3係SEQ ID NO：8，且/或其中該第一VL域及該第二VL域與0128L VL域SEQ ID NO：10在胺基酸序列層級上至少95%一致。
2.一種雙專一性抗體，其結合FIXa及FX且催化FIXa介導之FX活化，其中該抗體包含兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對，其中第一重鏈-輕鏈對包含結合FIXa的Fv區，其包含與第一VL域成對之第一VH域，且第二重鏈-輕鏈對包含結合FX的Fv區，其包含與第二VL域成對之第二VH域，其中該第一VH域係人類免疫球蛋白重鏈v、d及j基因區段重組之產物，其中該v基因區段係IGHV3-7(例如，VH3-7*01)且該j基因區段係IGHJ6(例如，JH6*02)，該第二VH域係人類免疫球蛋白重鏈v、d及j基因區段重組之產物，其中該v基因區段係IGHV1-46(例如，VH1-46*03)且該j基因區段係IGHJ1(例如，JH1*01)，且視需要其中該d基因區段係IGHD6-6(例如，DH6-6*01)，且該第一VL域及該第二VL域均係人類免疫球蛋白輕鏈v及j基因區段重組之產物，其中該v基因區段係IGLV3-21(例如，VL3-21*d01)且該j基因區段係IGLJ2(例如，JL2*01)或IGLJ3(例如，JL3*02)。
3.一種雙專一性抗體，其結合FIXa及FX且催化FIXa介導之FX活化，其中該抗體包含兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對，其中第一重鏈-輕鏈對包含結合FIXa的Fv區，其包含與第一VL域成對之第一VH域，且第二重鏈-輕鏈對包含結合FX的Fv區，其包含與第二VL域成對之第二VH域，其中該第一VH域與N1280H VH域SEQ ID NO：443具有至少95%胺基酸序列一致性，該第二VH域與T0201H VH域SEQ ID NO：470具有至少95%胺基酸序列一致性，且該第一VL域及該第二VL域各自與0128L VL域SEQ ID NO：10具有至少95%胺基酸序列一致性。
4.如任一前述條項之雙專一性抗體，其中該第一VH域包含一組HCDR，其包含具有所定義之胺基酸序列的HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中HCDR1係SEQ ID NO：406，HCDR2係SEQ ID NO：407且HCDR3係SEQ ID NO：408。
5.如條項4之雙專一性抗體，其中該第一VH域包含HCDR1 SEQ ID NO：441。
6.如條項4或條項5之雙專一性抗體，其中該第一VH域包含HCDR2 SEQ ID NO：634。
7.如條項4至6中任一項之雙專一性抗體，其中該第一VH域包含HCDR2 SEQ ID NO：436。
8.如條項4至7中任一項之雙專一性抗體，其中該第一VH域包含HCDR3 SEQ ID NO：635。
9.如條項4至8中任一項之雙專一性抗體，其中該第一VH域包含HCDR3 SEQ ID NO：433。
10.如任一前述條項之雙專一性抗體，其中該第一VH域與N1280H具有至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性。
11.如任一前述條項之雙專一性抗體，其中該第一VH域包含一組N1280H HCDR，其包含N1280H HCDR1 SEQ ID NO：441、N1280H HCDR2 SEQ ID NO：436及N1280H HCDR3 SEQ ID NO：433。
12.如條項10或條項11之雙專一性抗體，其中該第一VH域係N1280H VH域SEQ ID NO：443。
13.如條項1至11中任一項之雙專一性抗體，其中該第一VH域係N1454H VH域SEQ ID NO：454。
14.如條項1至11中任一項之雙專一性抗體，其中該第一VH域係N1441H VH域SEQ ID NO：456。
15.如條項1至11中任一項之雙專一性抗體，其中該第一VH域係N1442H VH域SEQ ID NO：458。
16.如條項1至3中任一項之雙專一性抗體，其中該第一VH域與N1333H具有至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性。
17.如條項16之雙專一性抗體，其中該第一VH域包含一組N1333H CDR，其包含N1333H CDR1、N1333H CDR2及N1333H CDR3。
18.如條項16或條項17之雙專一性抗體，其中該第一VH域係N1333H VH域。
19.如條項1至3中任一項之雙專一性抗體，其中該第一VH域與N1327H具有至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性。
20.如條項19之雙專一性抗體，其中該第一VH域包含一組N1327H HCDR，其包含N1327H HCDR1、N1327H HCDR2及N1327H HCDR3。
21.如條項19或條項20之雙專一性抗體，其中該第一VH域係N1327H VH域。
22.如條項1至3中任一項之雙專一性抗體，其中該第一VH域與N1314H具有至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性。
23.如條項22之雙專一性抗體，其中該第一VH域包含一組N1314H HCDR，其包含N1314H HCDR1、N1314H HCDR2及N1314H HCDR3。
24.如條項22或條項23之雙專一性抗體，其中該第一VH域係N1314H VH域。
25.如條項1至3中任一項之雙專一性抗體，其中該第一VH域與N1172H具有至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性。
26.如條項25之雙專一性抗體，其中該第一VH域包含一組N1172H HCDR，其包含N1172H HCDR1、N1172H HCDR2及N1172H HCDR3。
27.如條項25或條項26之雙專一性抗體，其中該第一VH域係N1172H VH域。
28.如條項1至3中任一項之雙專一性抗體，其中該第一VH域與N1091H具有至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性。
29.如條項28之雙專一性抗體，其中該第一VH域包含一組N1091H HCDR，其包含N1091H HCDR1、N1091H HCDR2及N1091H HCDR3。
30.如條項28或條項29之雙專一性抗體，其中該第一VH域係N1091H VH域。
31.如條項1至3中任一項之雙專一性抗體，其中該第一VH域與N0511H具有至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性。
32.如條項31之雙專一性抗體，其中該第一VH域包含一組N0511H HCDR，其包含N0511H HCDR1、N0511H HCDR2及N0511H HCDR3。
33.如條項31或條項32之雙專一性抗體，其中該第一VH域係N0511H VH域。
34.如條項1至3中任一項之雙專一性抗體，其中該第一VH域與N0436H具有至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性。
35.如條項34之雙專一性抗體，其中該第一VH域包含一組N0436H HCDR，其包含N0436H HCDR1、N0436H HCDR2及N0436H HCDR3。
36.如條項34或條項35之雙專一性抗體，其中該第一VH域係N0436H VH域。
37.如任一前述條項之雙專一性抗體，其中該第二VH域與T0201H VH域SEQ ID NO：470具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性。
38.如條項37之雙專一性抗體，其中該第二VH域包含HCDR1，其為T0201H HCDR1 SEQ ID NO：462；HCDR2，其為T0201H HCDR2 SEQ ID NO：467；及/或HCDR3，其為T0201H HCDR3 SEQ ID NO：468。
39.如任一前述條項之雙專一性抗體，其中該第二VH域包含HCDR1 SEQ ID NO：636。
40.如條項39之雙專一性抗體，其中該第二VH域包含HCDR1 SEQ ID NO：598。
41.如任一前述條項之雙專一性抗體，其中該第二VH域包含HCDR2 SEQ ID NO：467。
42.如任一前述條項之雙專一性抗體，其中該第二VH域包含HCDR3 SEQ ID NO：637。
43.如條項42之雙專一性抗體，其中該第二VH域包含HCDR3 SEQ ID NO：638。
44.如條項43之雙專一性抗體，其中該第二VH域包含HCDR3 SEQ ID NO：639。
45.如條項44之雙專一性抗體，其中該第二VH域包含HCDR3 SEQ ID NO：565。
46.如條項44之雙專一性抗體，其中該第二VH域包含HCDR3 SEQ ID NO：583。
47.如條項37至45中任一項之雙專一性抗體，其中該第二VH域包含SEQ ID NO：632。
48.如條項37至45中任一項之雙專一性抗體，其中該第二VH域包含SEQ ID NO：600。
49.如條項37至46中任一項之雙專一性抗體，其中該第二VH域包含SEQ ID NO：585。
50.如條項38之雙專一性抗體，其中該第二VH域包含一組T0201H HCDR，其包含T0201H HCDR1、T0201H HCDR2及T0201H HCDR3。
51.如條項37、條項38或條項50之雙專一性抗體，其中該第二VH域係T0201H VH域，視需要具有在Cys114處之取代。
52.如條項51之雙專一性抗體，其中該在Cys114處之取代係Ile、Gln、Arg、Val或Trp。
53.如條項1至38中任一項之雙專一性抗體，其中該第二VH域包含一組T0638H HCDR，其包含T0638H HCDR1、T0638H HCDR2及T0638H HCDR3。
54.如條項53之雙專一性抗體，其中該第二VH域係T0638 VH域，視需要具有在Cys114處之取代。
55.如條項54之雙專一性抗體，其中該在Cys114處之取代係Ile、Gln、 Arg、Val或Trp。
56.如任一前述條項之雙專一性抗體，其中該第一VL域及該第二VL域各自與0128L SEQ ID NO：10具有至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性。
57.如任一前述條項之雙專一性抗體，其中該第一VL域及該第二VL域各自包含一組0128L CDR，其包含0128L LCDR1 SEQ ID NO：6、0128L LCDR2 SEQ ID NO：7及0128L LCDR3 SEQ ID NO：8。
58.如任一前述條項之雙專一性抗體，其中該第一VL域及該第二VL域在胺基酸序列中一致。
59.如條項58之雙專一性抗體，其中該第一VL域及該第二VL域包含0325L胺基酸序列SEQ ID NO：416。
60.如條項58或條項59之雙專一性抗體，其中該第一VL域及該第二VL域包含0128L胺基酸序列SEQ ID NO：10。
61.如任一前述條項之雙專一性抗體，其中各重鏈-輕鏈對進一步包含與CH1域成對之CL恆定域。
62.如任一前述條項之雙專一性抗體，其中該等重鏈-輕鏈對包含共同輕鏈。
63.如條項62之雙專一性抗體，其中該共同輕鏈包含0128L輕鏈之CL胺基酸序列SEQ ID NO：146。
64.如條項63之雙專一性抗體，其中該共同輕鏈係0325L輕鏈SEQ ID NO：414。
65.如條項63之雙專一性抗體，其中該共同輕鏈係0128L輕鏈SEQ ID NO：405。
66.如任一前述條項之雙專一性抗體，其中各重鏈-輕鏈之重鏈包含重鏈 恆定區，且其中該第一及第二重鏈-輕鏈對經由該等重鏈恆定區之二聚化締合以形成四聚免疫球蛋白。
67.如條項66之雙專一性抗體，其中該第一重鏈-輕鏈對之重鏈恆定區包含與該第二重鏈-輕鏈對之重鏈恆定區不同的胺基酸序列，其中該等不同的胺基酸序列經工程改造以促進該等重鏈恆定區之異二聚化。
68.如條項67之雙專一性抗體，其中該等重鏈恆定區包含臼包杵突變或電荷對突變。
69.如條項67之雙專一性抗體，其中一個(例如，該第一)重鏈-輕鏈對之重鏈恆定區係包含取代K439E之人類IgG4恆定區，且其中另一(例如，該第二)重鏈-輕鏈對之重鏈恆定區係包含取代E356K之IgG4區，其中恆定區編號係根據EU編號系統。
70.如條項66至69中任一項之雙專一性抗體，其中一個或兩個重鏈-輕鏈對之重鏈恆定區係包含取代S228P之人類IgG4恆定區，其中恆定區編號係根據EU編號系統。
71.如條項66至70中任一項之雙專一性抗體，其中一個(例如，該第一)重鏈-輕鏈對之重鏈恆定區包含SEQ ID NO：409，且另一(例如，該第二)重鏈-輕鏈對之重鏈恆定區包含SEQ ID NO：410。
72.如條項66至71中任一項之雙專一性抗體，其包含第一重鏈，其包含第一VH域胺基酸序列SEQ ID NO：443或SEQ ID NO：456，第二重鏈，其包含第二VH域胺基酸序列SEQ ID NO：632，及共同輕鏈，其包含VL域胺基酸序列SEQ ID NO：416。
73.如條項66至72中任一項之雙專一性抗體，其包含第一重鏈，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：419， 第二重鏈，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：421，及共同輕鏈，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：414。
74.如條項66至71中任一項之雙專一性抗體，其包含第一重鏈，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：424，第二重鏈，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：421，及共同輕鏈，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：414。
75.如條項66至72中任一項之雙專一性抗體，其包含第一重鏈，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：426，第二重鏈，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：421，及共同輕鏈，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：414。
76.如條項66至71中任一項之雙專一性抗體，其包含第一重鏈，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：428，第二重鏈，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：430，及共同輕鏈，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：414。
77.如條項66至71中任一項之雙專一性抗體，其包含第一重鏈，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：428，第二重鏈，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：432，及共同輕鏈，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：414。
78.如條項66之雙專一性抗體，其中該第一重鏈-輕鏈對之重鏈恆定區與該第二重鏈-輕鏈對之重鏈恆定區一致。
79.如條項1至68中任一項之雙專一性抗體，其中該抗體係人類IgG。
80.如條項79之雙專一性抗體，其中該抗體係人類IgG4。
81.如條項79或條項80之雙專一性抗體，其中該IgG包含IgG4-PE重鏈恆定區SEQ ID NO：143，視需要經工程改造有一或多種胺基酸取代以促進異二聚 化。
82.如條項79或條項80之雙專一性抗體，其中該抗體包含艾美賽珠單抗之Fc區。
83.一種雙專一性抗體，其結合FIXa及FX且催化FIXa介導之FX活化，其中該抗體包含兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對，其中第一重鏈-輕鏈對包含結合FIXa的Fv區，其包含與第一VL域成對之第一VH域，其中該第一VH域與N1280H VH域SEQ ID NO：443在胺基酸序列中至少98%一致，且第二重鏈-輕鏈對包含結合FX的Fv區，其包含與第二VL域成對之第二VH域，其中該第二VH域與T0999H VH域SEQ ID NO：632在胺基酸序列中至少98%一致，且其中該第一及第二重鏈-輕鏈對各自包含共同輕鏈，其包含0325L輕鏈胺基酸序列SEQ ID NO：414。
84.一種雙專一性抗體，其結合FIXa及FX且催化FIXa介導之FX活化，其中該抗體包含兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對，其中第一重鏈-輕鏈對包含結合FIXa的Fv區，其包含與第一VL域成對之第一VH域，其中該第一VH域與N1454H VH域SEQ ID NO：454在胺基酸序列中至少98%一致，且第二重鏈-輕鏈對包含結合FX的Fv區，其包含與第二VL域成對之第二VH域，其中該第二VH域與T0999H VH域SEQ ID NO：632在胺基酸序列中至少98%一致，且其中該第一及第二重鏈-輕鏈對各自包含共同輕鏈，其包含0325L輕鏈胺基酸序列SEQ ID NO：414。
85.一種雙專一性抗體，其結合FIXa及FX且催化FIXa介導之FX活化，其 中該抗體包含兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對，其中第一重鏈-輕鏈對包含結合FIXa的Fv區，其包含與第一VL域成對之第一VH域，其中該第一VH域與N1441H VH域SEQ ID NO：456在胺基酸序列中至少98%一致，且第二重鏈-輕鏈對包含結合FX的Fv區，其包含與第二VL域成對之第二VH域，其中該第二VH域與T0999H VH域SEQ ID NO：632在胺基酸序列中至少98%一致，且其中該第一及第二重鏈-輕鏈對各自包含共同輕鏈，其包含0325L輕鏈胺基酸序列SEQ ID NO：414。
86.一種雙專一性抗體，其結合FIXa及FX且催化FIXa介導之FX活化，其中該抗體包含兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對，其中第一重鏈-輕鏈對包含結合FIXa的Fv區，其包含與第一VL域成對之第一VH域，其中該第一VH域與N1442H VH域SEQ ID NO：458在胺基酸序列中至少98%一致，且第二重鏈-輕鏈對包含結合FX的Fv區，其包含與第二VL域成對之第二VH域，其中該第二VH域與T0736H VH域SEQ ID NO：600在胺基酸序列中至少98%一致，且其中該第一及第二重鏈-輕鏈對各自包含共同輕鏈，其包含0325L輕鏈胺基酸序列SEQ ID NO：414。
87.一種雙專一性抗體，其結合FIXa及FX且催化FIXa介導之FX活化，其中該抗體包含兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對，其中第一重鏈-輕鏈對包含結合FIXa的Fv區，其包含與第一VL域成對之第一VH域，其中該第一VH域與N1442H VH域SEQ ID NO：458在胺基酸序列中至少98%一致，且 第二重鏈-輕鏈對包含結合FX的Fv區，其包含與第二VL域成對之第二VH域，其中該第二VH域與T0687H VH域SEQ ID NO：585在胺基酸序列中至少98%一致，且其中該第一及第二重鏈-輕鏈對各自包含共同輕鏈，其包含0325L輕鏈胺基酸序列SEQ ID NO：414。
88.一種雙專一性抗體，其結合FIXa及FX且催化FIXa介導之FX活化，其中該抗體包含兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對，其中第一重鏈-輕鏈對包含結合FIXa的Fv區，其包含與第一VL域成對之第一VH域，其中該第一VH域與N1333H VH域在胺基酸序列中至少98%一致，且第二重鏈-輕鏈對包含結合FX的Fv區，其包含與第二VL域成對之第二VH域，其中該第二VH域與T0638H VH域在胺基酸序列中至少98%一致，且其中該第一及第二重鏈-輕鏈對各自包含共同輕鏈，其包含0128L輕鏈胺基酸序列SEQ ID NO：405。
89.如任一前述條項之雙專一性抗體，其將aPTT分析中FVIII缺乏型人類血漿之凝結時間減少至少於40秒。
90.如條項89之雙專一性抗體，其將aPTT分析中FVIII缺乏型人類血漿之凝結時間減少至少於30秒。
91.如條項90之雙專一性抗體，其將aPTT分析中FVIII缺乏型人類血漿之凝結時間減少至22秒至28秒。
92.如條項91之雙專一性抗體，其將aPTT分析中FVIII缺乏型人類血漿之凝結時間減少至24秒至26秒。
93.如任一前述條項之雙專一性抗體，其在FX酶分析中將FIXa介導之FX活化成FXa增強至與艾美賽珠單抗相同或類似的程度。
94.如任一前述條項之雙專一性抗體，其將該FIXa介導之FX活化成FXa增強至至少與艾美賽珠單抗相同的程度。
95.如條項89至94中任一項之雙專一性抗體，其中該凝結時間或FIXa介導之活化係如在37℃下在0.1mg/ml、0.3mg/ml或0.5mg/ml之抗體濃度下測定。
96.如任一前述條項之雙專一性抗體，其中該抗體在螢光凝血酶產生分析(TGA)中針對Cmax之EC50在該分析中艾美賽珠單抗之Cmax EC50的10%內，或低於艾美賽珠單抗之Cmax EC50，且/或其中該抗體在螢光TGA中產生在200nM與450nM凝血酶之間之Cmax的最大反應。
98.如條項96之雙專一性抗體，其中該抗體在螢光TGA中針對Cmax之EC50低於50nM。
99.如條項98之雙專一性抗體，其在螢光TGA中針對Cmax之EC50低於10nM。
100.如任一前述條項之雙專一性抗體，其中該Cmax之最大反應在250nM與400nM之間。
101.如任一前述條項之雙專一性抗體，其中該抗體在螢光TGA中針對Tmax之EC50在該分析中艾美賽珠單抗之Tmax EC50的10%內，或低於艾美賽珠單抗之Tmax EC50，且/或其中該抗體產生在1分鐘與10分鐘之間之Tmax的最大反應。
102.如任一前述條項之雙專一性抗體，其中該抗體在螢光TGA中針對Tmax之EC50低於5nM。
103.如條項102之雙專一性抗體，其中該針對Tmax之EC50低於2nM。
104.如任一前述條項之雙專一性抗體，其中該抗體在螢光TGA中產生在2分鐘與8分鐘之間之Tmax的最大反應。
105.一種抗FIXa抗體，其包含如任一前述條項中所界定之第一重鏈-輕鏈 對的兩個複本。
106.一種抗FX抗體，其包含如條項1至104中任一項中所界定之第二重鏈-輕鏈對的兩個複本。
107.一種經分離核酸，其編碼如任一前述條項之抗體。
108.一種試管內宿主細胞，其包含編碼以下者之重組DNA：抗體重鏈，其包含如條項1至104中任一項中所界定之第一VH域，抗體重鏈，其包含如條項1至104中任一項中所界定之第二VH域，及/或抗體輕鏈，其包含如條項1至104中任一項中所界定之第一或第二VL域。
109.如條項108之宿主細胞，其包含編碼以下者之重組DNA：第一重鏈，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：419或SEQ ID NO：426，第二重鏈，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：421，及共同輕鏈，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：414。
110.一種試管內宿主細胞群，其中各宿主細胞包含編碼如條項1至104中任一項之雙專一性抗體的重組DNA。
111.一種套組，其用於產生如條項1至104中任一項之雙專一性抗體，該套組包含抗體重鏈，其包含如條項1至104中任一項中所界定之第一VH域，或編碼該重鏈之核酸，抗體重鏈，其包含如條項1至104中任一項中所界定之第二VH域，或編碼該重鏈之核酸，抗體輕鏈，其包含如條項1至104中任一項中所界定之第一VL域，或編碼該輕鏈之核酸，及 抗體輕鏈，其包含如條項1至104中任一項中所界定之第二VL域，或編碼該輕鏈之核酸。
112.如條項111之套組，其包含第一重鏈，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：419或SEQ ID NO：426，或編碼該第一重鏈之核酸，第二重鏈，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：421，或編碼該第二重鏈之核酸，及共同輕鏈，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：414，或編碼該共同輕鏈之核酸。
113.如條項111或條項112之套組，其中該等胺基酸序列或該等核酸提供於細胞中。
114.如條項111或條項112之套組，其中該等胺基酸序列或該等核酸提供於無細胞緩衝水性介質中。
115.如條項111至114中任一項之套組，其中該等胺基酸序列中之每一者或該等核酸中之每一者提供於獨立小瓶中。
116.一種產生如條項1至104中任一項之雙專一性抗體之方法，其包含在用於表現該雙專一性抗體之條件下培養如條項108或條項109之宿主細胞，及自宿主細胞培養物回收該雙專一性抗體。
117.如條項116之方法，其包含在包含至少100公升之容積的容器中培養該等宿主細胞。
118.如條項117之方法，其中該容器係不鏽鋼的或係單次用生物反應器。
119.一種組成物，其包含與醫藥學上可接受之賦形劑一起在溶液中的如條項1至104中任一項之雙專一性抗體，或如條項107之經分離核酸。
120.如條項119之組成物，其中該雙專一性抗體或核酸在無菌水溶液中。
121.如條項119或條項120之組成物，其包含如條項1至104中任一項之雙專一性抗體，其中該雙專一性抗體至少95%純，使得該組成物包含不超過5%同二聚抗體污染物。
122.如條項121之組成物，其中該雙專一性抗體至少99%純，使得該組成物包含不超過1%同二聚抗體污染物。
123.一種控制患者之出血之方法，其包含向該患者投予如條項119至122中任一項之組成物。
124.如條項119至122中任一項之組成物，其用於藉由療法治療人體之方法。
125.如條項119至122中任一項之組成物，其用於控制患者之出血的方法。
125.一種如條項1至104中任一項之雙專一性抗體的用途，其用於製造用於控制A型血友病患者之出血的醫藥品。
126.如條項123之方法，或如條項125所使用之組成物或用途，其中該患者係A型血友病患者。
127.如條項126之方法或所使用之組成物，其中該患者因在血流中存在抑制性抗體之緣故，對用FVIII進行之治療具有抗性。
128.如條項126或條項127之方法或所使用之組成物，其中該患者因在血流中存在抑制性抗體之緣故，對用另一針對FIXa及FX之雙專一性抗體進行之治療具有抗性。
129.如條項128之方法或所使用之組成物，其中該患者對用艾美賽珠單抗進行之治療具有抗性。
130.一種在A型血友病患者中減少抑制性抗藥物抗體之產生之方法，該患者經歷替代FVIIIa活性之多肽治療，該方法包含向該患者投予替代FVIIIa活性之第一多肽藥物，持續1個月至12個月 的時段，將該患者切換至替代FVIIIa活性之第二、不同的多肽藥物，持續1個月至12個月的時段，及將該患者切換至第一抗原結合分子或替代FVIIIa活性之第三、不同的多肽藥物，持續1個月至12個月的時段，其中該替代FVIIIa活性之第一、第二或第三多肽藥物係如條項1至104中任一項之雙專一性抗體，且其中在各種情況下，該替代FVIIIa活性之多肽藥物或其編碼核酸以治療有效量投予，以在該患者中在功能上替代FVIIIa，且其中與繼續接受用該替代FVIIIa活性之多肽藥物進行之治療的患者相比，該患者產生針對該替代FVIIIa活性之多肽藥物中之任一者之抑制性抗藥物抗體的風險降低。
131.一種組成物，其包含替代FVIIIa活性之多肽藥物或其編碼核酸，該組成物用於治療A型血友病患者同時減少抑制性抗藥物抗體之產生的方法，或一種替代FVIIIa活性之多肽藥物或其編碼核酸之用途，其用於製造用於治療A型血友病患者同時減少抑制性抗藥物抗體之產生之方法的醫藥品，該方法包含向該患者投予替代FVIIIa活性之第一多肽藥物，持續1個月至12個月的時段，將該患者切換至替代FVIIIa活性之第二、不同的多肽藥物，持續1個月至12個月的時段，及將該患者切換至第一抗原結合分子或替代FVIIIa活性之第三、不同的多肽藥物，持續1個月至12個月的時段，其中該替代FVIIIa活性之第一、第二或第三多肽藥物係如條項1至104中任一項之雙專一性抗體，且其中在各種情況下，該替代FVIIIa活性之多肽藥物或其編碼核酸以 治療有效量投予，以在該患者中在功能上替代FVIIIa，且其中與繼續接受用該替代FVIIIa活性之多肽藥物進行之治療的患者相比，該患者產生針對該替代FVIIIa活性之多肽藥物中之任一者之抑制性抗藥物抗體的風險降低。
132.如條項130之方法，或如條項131所使用之組成物或用途，其中該第一、第二及第三替代FVIIIa活性之多肽藥物依任何次序為重組或血漿衍生之FVIII、艾美賽珠單抗及如條項1至104中任一項之雙專一性抗體。
133.如條項123至132中任一項之方法、所使用之組成物或用途，其中該治療包含向該患者皮下投予該組成物。
等效物：所屬技術領域中具有通常知識者將認識到，或能夠使用不超過常規實驗確定本文所描述之本發明之特定具體實例的許多等效物。此類等效物意欲在所附申請專利範圍之保護範圍內。
實施例
如2018年6月22日申請之發明名稱為「針對因子IX及因子X之雙專一性抗體(Bispecific antibodies for factor IX and factor X)」的PCT/EP2018/066836(WO2018/234575)中所描述，產生包含人類FIXa及人類FX之Fv結合位點的雙專一性IgG抗體。如其中所描述，大規模免疫接種及篩選操作引起抗FIXa抗體NINA-0128之鑑別，當與一系列不同抗FX結合Fv中之任一者以IgG形式成對時，該抗體在包括X酶分析及aPTT分析之功能篩選中顯示突出的活性。NINA-0128包含VH域N0128H及VL域0128L。產生且測試N0128H VH域之多種變異體，引起雙專一性形式之功能的進一步改良，變異體包括例如N0436H VH域。
基於該工作，將雙專一性IgG設計成具有NINA-0128之VL域作為共同輕鏈。在包含人類免疫球蛋白基因之基因轉殖小鼠中活體內產生一組抗FX 抗體。使用包括人類恆定區之共同輕鏈中的0128L VL域，將此等與作為抗FIX結合臂之NINA-0128共表現。一個VH域T0200在雙專一性形式中顯示突出的活性，且經選擇用於進一步開發。自與T0200H殖株相同的經免疫接種動物獲得結構上相關的抗體，包括在具有抗FIX VH域及0128L共同輕鏈之雙專一性IgG4中比T0200H VH域發揮甚至更好的功效的其他抗FX VH域。
同時，產生其他抗FIXa抗體變異體，在VH域中引入突變同時保留共同0128L VL域。抗FIXa N0436H VH域序列藉由以下最佳化：在CDR1、CDR2及CDR3中之各位置處取代所有可能的胺基酸，在包含共同輕鏈之雙專一性抗體情形下表現所得VH域變異體，在一系列功能分析中評估變異雙專一性抗體，鑑別與功能活性提高相關之突變，及產生包括與功能活性提高相關之突變之組合的其他變異體。
將改良T0200H VH域變異體與改良N0436H VH域變異體組合，其各自與N0128L共同輕鏈成對，且進行最佳化、篩選及選擇的重複輪。
圖6顯示篩選程序之簡化概覽。
在包括最佳化序列之共同輕鏈雙專一性抗體之情況下達成極強FVIII模擬活性。以下雙專一性抗體為發揮強力功效者之實例，如由一系列疾病相關分析中之功能特徵界定指示。具有共同輕鏈之雙專一性抗體的命名法為IXAX-nnnn.tttt.llll，其中nnnn為抗FIX VH域之4數位數值識別符號，tttt為抗FX VH域之4數位識別符號，且llll為共同VL域之4數位數值識別符號：IXAX-0128.0201.0128(抗FIXa VH域N0128H；抗FX VH域T0201H；0128L共同輕鏈)
IXAX-0436.0201.0128
IXAX-0511.0201.0128
IXAX-1091.0201.0128
IXAX-1172.0201.0128
IXAX-1280.0201.0128
IXAX-1341.0201.0128
IXAX-1327.0201.0128
IXAX-1333.0201.0128
在雙專一性抗體中與以上及其他抗FIX VH域良好組合的其他高效抗FX VH域為T0201H譜系之彼等及其變異體，諸如圖11中所列之彼等及其他相關序列。在包括選自以下者之抗FIX VH域、抗FX VH域及共同輕鏈之雙專一性抗體之情況下，獲得尤其良好結果：
Figure 108146911-A0305-02-0091-1
舉例而言，IXAX-1280.0999.0325
IXAX-1454.0999.0325
IXAX-1441.0999.0325
IXAX-1441.0736.0325
IXAX-1442.0687.0325
本文所描述之雙專一性抗體代表用於如本文所描述之治療用途的候選醫藥藥物分子。其可藉由提供諸如艾美賽珠單抗之現有治療的替代物，尤其在因為存在抗藥物抗體使得此類現有治療不再有效之患者中為患者提供生 命健康照護選項。
在此等實施例中，參考抗體AbE或抗體E為具有艾美賽珠單抗之重鏈及輕鏈胺基酸序列的雙專一性抗體[3]。
實施例1.具有共同輕鏈之抗FX抗體組的產生
用人類因子X免疫接種表現包含0128L VL域之共同輕鏈的基因轉殖小鼠。藉由流式細胞量測術單細胞分選抗原專一性B細胞，且藉由次世代定序(next generation sequencing；NGS)擷取VH及VL序列。藉由對單細胞分選淋巴球之NGS分析鑑別200條抗FX重鏈。對自相同基因轉殖動物收集之骨髓及淋巴結組織進行進一步整體NGS分析。
實施例2.具有共同輕鏈之抗FIXaxFIX雙專一性抗體的產生
將各抗FX重鏈在HEK293細胞中以雙專一性抗體形式表現，該雙專一性抗體包含抗FIX N0128H重鏈及0128L共同輕鏈。如2018年6月22日申請之發明名稱為「針對因子IX及因子X之雙專一性抗體(Bispecific antibodies for factor IX and factor X)」的PCT/EP2018/066836中所描述，實質上由蛋白A純化雙專一性抗體，該申請案以引用之方式併入本文中。
實施例3.使用類活化凝血因子VIII(FVIIIa)活性分析(FX酶或X酶分析)進行之抗FX臂的初始篩選
使用因子Xa產生分析篩選200種雙專一性抗體，其包含一系列不同抗FX重鏈，抗FX重鏈各自與N0128H抗FIX重鏈及0128L共同VL域組合。此功能篩選藉由酶素性「FX酶」分析在試管內偵測FVIIIa模擬活性，亦即，增強(催化)FIXa介導之FX向FXa活化的能力。在此分析中，在適於形成FXa之條件下， 在磷脂存在下使測試雙專一性分子與FIXa及FX接觸。添加FXa之受質，當由FXa裂解時，其產生可偵測產物。將在測試雙專一性抗體存在下此產物之偵測與陰性對照組進行比較，陰性對照組中不存在測試抗體(可包括對照組抗體)。藉由記錄反應溶液在405nm下之吸光度定量所偵測到之信號。在分析中遍及一系列抗體濃度量測吸光度，且將EC50值計算為此分析中雙專一性抗體效力之量度。測試抗體與對照組之間EC50的顯著差異指示測試抗體能夠增強FIXa介導之FX活化。圖7。
結果
在所分析的所有雙專一性抗體中，有一種顯示突出的FX酶活性：與0128L共同VL域成對之N0128H抗FIX重鏈及T0200H抗FX重鏈，具有比組中所有其他者明顯更高的FX酶活性。圖8。
材料及方法-標準FX酶反應條件
將7.5μL FIX(3.75μg/mL)及來自產生重組抗體(實施例8)之Expi293細胞的5μL上清液添加至分析盤之各孔中且在室溫下培養1小時。將2.5μL FXIa(10ng/mL)、5μL FX(50ng/mL)、0.05μL磷脂(10mg/mL)及5μL TBSB-S緩衝液之混合物添加至各孔中以起始酶反應(FIXa裂解FX以產生FXa)，且在37℃下培養1小時。在60分鐘之後，藉由添加5μL之0.5M EDTA終止反應。在將10μL S2765受質溶液添加至各孔中之後，量測在405nm(參照波長655nm)下之吸光度持續30分鐘(每10分鐘讀取一次)。除非另外說明，否則所有反應在37℃下進行。
TBSB：
含有0.1%牛血清白蛋白之Tris緩衝生理食鹽水
為了製備7.5mL TBSB：
0.1mL 7.5% BSA溶液(Sigma)
7.4mL 1×TBS溶液(由20×TBS溶液稀釋，ThermoFisher)
TBSB-S：
含有5mM CaCl2及1mM MgCl2之TBSB
為了製備100mL TBSB-S：
99.4mL TBSB
0.5mL 1M CaCl2(Sigma)
0.1mL 1M MgCl2(Sigma)
FXIa儲備溶液(10μg/mL)：
將10mL TBSB-S添加至0.1mg FXIa(Enzyme Research Laboratories)中以製備10μg/mL儲備溶液。
在使用之前稀釋為10ng/mL(1：1,000)工作溶液。
F.IXa儲備溶液(5μg/mL)
將100mL TBSB-S添加至0.5mg FIXa(HFIXa 1080)(Enzyme Research Laboratories)中以製備5μg/mL儲備溶液。
在使用之前稀釋為1.0μg/mL(1：5)工作溶液。
FIX儲備溶液(37.5μg/mL)：
將13.3mL TBSB-S添加至0.5mg FIX(Enzyme Research Laboratories)中以製備37.5μg/mL儲備溶液。
在使用之前稀釋為3.75μg/mL(1：10)工作溶液。
FX工作溶液(50μg/mL)：
將16mL TBSB-S添加至0.8mg FX(Enzyme Research Laboratories)中以製備50μg/mL工作溶液。
在使用之前不需要進一步稀釋。
S2765儲備溶液：
25mg S2765(Chromogenix)顯色受質(0.035mmol)
為了製備2mM儲備溶液：
將17.493mL水添加至小瓶中且伴隨振搖溶解。
凝聚胺(Polybrene)溶液：
為了製備0.6g/L溴化己二甲銨(hexadimethrine bromide)儲備溶液：
將0.15g溴化己二甲銨(Sigma)添加至250mL水中。
在使用之前稀釋為0.6mg/L(1：1,000)工作溶液。
S2765受質工作溶液
2mM S-2765儲備溶液及0.6mg/L凝聚胺溶液之1：1混合物。
實施例4.抗FX T0200H VH域之鑑別
與其他雙專一性抗體相比，包含N0128H抗FIX VH域、T0200H抗FX VH域及0128L共同輕鏈，命名為IXAX.0128.0200.0128之雙專一性抗體展現高FX酶活性。選擇T0200H VH域以用於進一步開發，以嘗試產生進一步改良之雙專一性抗體。
實施例5.抗FX T0200H VH域之最佳化 譜系學分析
根據整體NGS(實施例1)及譜系學分析，113條抗FX重鏈經鑑別為屬於與抗FX重鏈T0200H相同的淋巴球簇。簇代表似乎共有共同進化譜系之B細胞。簇內之抗FX重鏈與T0200H在胺基酸層級上共有大致95%序列一致性。圖9。
將113條抗FX重鏈與一組不同抗FIX重鏈及0128L共同輕鏈一起在雙專一性抗體中表現，且藉由FX酶分析篩選。
吾人鑑別數種抗FX重鏈，當以雙專一性抗體形式分析時，與T0200H VH域相比，其顯示提高的FX酶活性。圖10顯示來自X酶分析之示例數據。
一系列活性最強之FX臂序列在圖11中顯示。此等VH域分別命名為T0201H至T0217H。雙專一性形式中具有最強活性之彼等為T0204、T0207、T0205及T0201(圖10)。
使用胺基酸序列比較，且由功能數據支持，吾人鑑別出抗FX重鏈之架構及CDR區中之數個胺基酸殘基，其在活性最強之VH域中不同，且可促成與T0200H相比增強之生物活性。舉例而言，VH域之以下胺基酸特徵中之一或多者可提高含有該VH域之雙專一性抗體的FVIII模擬活性(IMGT殘基編號)：在FR1中之位置5處由異白胺酸(I)置換纈胺酸(V)；在FR1中之位置13處由麩醯胺酸(Q)置換離胺酸(K)；在FR2中之位置39處由甲硫胺酸(M)置換白胺酸(L)；在CDR2中之位置62處由絲胺酸(S)置換蘇胺酸(T)；在CDR2中之位置64處由絲胺酸(S)置換天冬胺酸(D)；在FR3中之位置85處由絲胺酸(S)置換蘇胺酸(T)；在CDR3中之位置112處由絲胺酸(S)置換丙胺酸(A)。
儘管如此，顯而易見即使不具有此等胺基酸取代，活性亦高，此係由於在雙專一性抗體中T0200H自身顯示強活性，且此等取代中無一者持續存在於所有前面的VH域中(圖11)。
用於功能最佳化之靶向突變誘發
將VH域T0201H之CDR3系統地突變以提供VH域之庫，其中各位置處之殘基分別地經另一胺基酸置換。所得VH域被命名為T0XXXH，其中圖12中顯示IMGT位置114(Cys)、115(Leu)、116(Gln)及117(Leu)之突變體的XXX編號。關於IMGT編號參考圖13。
潛在開發不利條件之移除
CDR3中存在之未成對半胱胺酸(C)殘基被鑑別為高風險序列模體。在T0200H之CDR3中位置114處存在的此未成對半胱胺酸，及根據整體NGS分析鑑別之所有113個其他抗FX VH域，代表開發雙專一性抗體之不利條件。吾人篩選含有對T0201H中此位置處之半胱胺酸之所有其他胺基酸取代的VH域。將此等新變異體與N1280H(參見實施例6)及0128L共同輕鏈一起以IgG4雙專一性抗體形式表現，由蛋白A純化且針對FVIII模擬活性藉由FX酶分析進行篩選。用異白胺酸(I)、麩醯胺酸(Q)、精胺酸(R)、纈胺酸(V)或色胺酸(W)置換位置114處之半胱胺酸產生FVIII模擬活性類似於具有T0201H或T0202H VH域之雙專一性抗體的雙專一性抗體。吾人推斷C114可經多種其他胺基酸置換且仍維持FVIII模擬活性。
實施例6.抗FIX VH之系統性序列最佳化
將CDR1、CDR2及CDR3中之各胺基酸殘基分別地突變以產生抗FIX N0128H重鏈之單位置突變體。將由此產生之抗FIX重鏈變異體與抗FX重鏈T0201H及N0128L共同VL域成對，以雙專一性形式在HEK293中表現。
將經蛋白A純化之雙專一性抗體針對生物活性藉由FX酶(實施例7)及aPTT分析，以尋找提高雙專一性抗體之FVIII模擬活性的胺基酸變化。隨後組合改良變異體以在CDR1、CDR2及CDR3區中產生雙重或三重突變體。
表N鑑別N0128H VH域之突變體，其中CDR之一或多個殘基突變為其他胺基酸。舉例而言，N0436H VH域為N0128H VH域之Ser->Ile突變體，亦即，其中CDR3中IMGT位置111A處之絲胺酸經異白胺酸置換。除初始單一突變外，引入其他殘基突變。舉例而言，N0511H VH域為N0436H VH域之Ser112ALys突變體，亦即，其中CDR3中IMGT位置112A處之絲胺酸經離胺酸置換。N1172H為N0511H VH域之Glu64Arg突變體，亦即，其中CDR2中IMGT位置64處的麩胺酸經精胺酸置換。N1280H為N1172H VH域之Thr29Arg突變體，亦即，其中CDR1中IMGT位置29處之Thr經精胺酸置換。其他命名VH域可以相同方式自表N鑑別。
關於IMGT編號參考圖14。
實施例7.FX酶分析中改良雙專一性抗體之篩選
將包含如實施例5中所描述產生之VH域變異體的抗FX臂與包含如實施例6中所描述產生之VH域變異體的抗FIX臂組合，其各自與0128L共同VL域成對，以產生FIXAxFX雙專一性抗體，且在X酶分析中針對功能活性進行篩選。
結果
顯示實施例數據：
圖10。
圖15。
圖16。
針對各自與0128L共同VL域成對之抗FIX VH及抗FX VH域的數種組合鑑別高活性雙專一性抗體。抗FIX VH及抗FX VH域組合之實例在圖16中顯示。
對於此等雙專一性臂組合，抗FX VH域之屬性似乎具有比抗FIX VH域之屬性更強的影響，其中T0638H、T0616H、T0596H及T0663H在發揮最佳功效之抗FX VH域中。此等抗FX域與多種抗FIX臂組合發揮良好功效，抗FIX臂包括N1280H之變異體，諸如圖16中所指定之彼等。參考隨附表N鑑別抗FIX VH域序列。參考圖12鑑別抗FX VH域序列。
藉由修飾三個CDR中之任一者中的胺基酸殘基，依序最佳化N128雙專一性抗體之FVIII模擬活性。遍及CDR鑑別出數種提高FVIII模擬活性的胺基酸殘基，且將此等突變組合以使活性最大化。具有N0128H VH域之抗體的FVIII模擬活性隨著依以下次序的其他VH域逐漸提高：N0128H->N0436H->N0511H->N1091H->N01172H->N1280H->N1333H。圖17。
材料及方法-經修改FX酶反應條件。
使用以上實施例3中所陳述之標準FX酶反應條件，評定雙專一性抗體FVIII模擬活性之初始篩選。隨著雙專一性抗體之FVIII模擬活性提高，標準FX酶反應條件不再足以偵測FX酶活性之提高。因此，建立更敏感的經修改FX酶反應條件。
此經修改分析與標準FX酶反應條件在以下方面不同：不使用FXIa、使用因子IX之活化形式(FIXa)及不存在培養步驟。將所有FX酶試劑與雙專一性抗體混合，且藉由使用設定為37℃之Envision讀盤機在405nm下每30秒記錄反應溶液之吸光度40至50次來偵測FXa之產生。
將18.45μl TBSB-S緩衝液與0.05μl磷脂(10mg/ml)混合，且藉由抽吸劇烈混合以分散磷脂。將1.5μl FIXa(1μg/ml)及5μl之FX(50μg/ml)與5μl之凝聚胺(0.6mg/L)及5μl S2765(4mM)向此混合物中組合，其均預溫熱至37℃。最後，添加5ul之針對FX酶活性經研究之雙專一性抗體。每30秒記錄在405nm(參照波長655nm)下之吸光度40至50次。
實施例8.血漿凝結分析中改良雙專一性抗體之篩選
將包含如實施例5中所描述產生之VH域變異體的抗FX臂與包含如實施例6中所描述產生之VH域變異體的抗FIX臂組合，其各自與0128L共同VL域成對，以產生FIXaxFX雙專一性抗體。為了測定本發明之雙專一性抗體校正A型血友病患者之血液凝結能力的能力，使用FVIII缺乏型血漿檢查此等抗體對活化部分凝血激酶時間(aPTT)的影響。
將5μL之具有多種濃度之雙專一性抗體溶液、20μL之FVIII缺乏型血漿(Helena Biosciences)及25μL之aPTT試劑(APTT Si L Minus，Helena Biosciences)的混合物在37℃下溫熱3分鐘。藉由將25μL之25mM CaCl2(Helena Biosciences)添加至混合物中起始凝結反應。量測直至凝結之時段。用於此之裝置為C-4 4通道凝結分析器(Helena Biosciences)。
結果樣本在圖18中顯示。
隨後對展現最高凝結時間減少效果之雙專一性抗體測定濃度依賴性。
舉例而言，IXAX-1280.0201.0128 IgG4抗體展現aPTT之劑量依賴性減少，與參考抗體AbE(陽性對照組)相當。圖19。針對同型對照組抗體未觀測到aPTT之減少。注意用於此分析之抗體製劑為蛋白A上單步純化之結果，且因此除所要雙專一性部分以外含有殘餘抗FIX單專一性抗體及殘餘抗FX單專一性抗體。
實施例9.對雙專一性抗體之抗FIX VH域之分析
考慮來自多種功能分析之數據，包括實施例7及實施例8中所描述之彼等，注意到抗FX VH域T0201及其序列變異體與多種抗FIX VH域組合在具有 共同輕鏈之雙專一性抗體中發揮良好功效。舉例而言，抗FIX VH域N0128H、N0436H、N0511H、N1091H、N1172H、N1280H、N1314H、N1327H及N1333H均在雙專一性抗體中提供良好功能活性。此等抗FIX VH域共有緊密結構關係。圖20。可藉由經由取代(表N)微調殘基及組合與提高之活性相關的取代進一步增強其效能。
實施例10.對抗原結合之親和力
使用SPR測定結合親和力及抗體-抗原相互作用之動力學。將純化測試抗體(均為IgG4PE)之親和力及動力學與作為陽性對照組之比較抗FIX抗體AbN或抗FX抗體AbT進行比較，且與作為陰性對照組之同型對照組(isotype control；ISTC)進行比較。
對FIX之結合親和力
所分析之抗FIX抗體顯示在大致0.18μM至0.3μM之親和力範圍內的與FIX之結合，及針對FIX之快速締合(kon)及解離(koff)速率。與比較抗體AbN相比，所分析之抗FIX抗體顯示稍微較高的與FIX之結合親和力及較高締合速率。在ISTC之情況下未觀測到與FIX之結合。表E-10-1。
Figure 108146911-A0305-02-0101-2
表E-10-1.抗FIX抗體之結合親和力及動力學常數締合速率(kon)及解離速 率(koff)。抗FIXa單專一性抗體命名法：NINA-hhhh.llll，其中hhhh為VH域(例如，N0436H)之數值識別符號，且llll為VL域(例如，0128L)之數值識別符號。
對FX之結合親和力
所分析之抗FX抗體顯示在大致0.1μM至1.4μM之親和力範圍內的與FX之結合，及針對FX之快速締合(kon)及解離(koff)速率。在ISTC之情況下未觀測到與FX之結合。
與基準抗體AbT相比，抗FX抗體分析與FX之類似結合親和力。
Figure 108146911-A0305-02-0102-3
表E-10-2.抗FX抗體之結合親和力及動力學常數締合速率(kon)及解離速率(koff)。抗FX單專一性抗體命名法：TINA-hhhh.llll，其中hhhh為VH域(例如，N0201H)之數值識別符號，且llll為VL域(例如，0128L)之數值識別符號。
材料及方法
使用SPR以測定分別與FIX或FX之結合親和力(KD)、動力學常 數締合速率(kon)及解離速率(koff)。使用Biacore 8K(GE Healthcare)系統進行分析。
根據製造商說明書，將抗人類IgG Fc抗體固定在CM4晶片(GE Healthcare)上。晶片表面藉由胺偶合活化且隨後經1M乙醇胺阻斷。使用HBS-EP作為固定操作緩衝液(immobilisation running buffer)在25℃下進行固定操作。
已在蛋白A上純化之單專一性抗體(被稱作配位體)以大致2μg/ml捕獲至抗人類IgG Fc CM4表面上。在所有8條流動通道之所有有效通道(active channel)中以10μl/min注射配位體60秒。使用中性pH BS-P 1×+CaCl2 2.5mM作為操作緩衝液在25℃下進行操作。
將人類FIX(MW約55KDa)或人類FX(MW約58KDa)以1mg/ml在操作緩衝液中復水且用作分析物。在有效通道及參考通道兩者中在30μl/sec之流動速率下，在3種濃度(1.5μM、500nM及166.7nM)下伴隨120秒締合期及200秒(對於FIX)或300秒(對於FX)解離期，以多重循環動力學(multiple cycle kinetics；MCK)模式注射分析物。10mM甘胺酸pH 1.5在10μl/min下持續60秒之三次注射用於再生期。
對於抗FIX分析，在參考通道中在10μl/min下以1μg/ml捕獲ISTC抗體hIgG4PE 60秒。亦在有效通道中捕獲hIgG4PE ISTC及hIgG1 ISTC作為陰性對照組。單專一性抗體AbN用作陽性對照組。
對於抗FX分析，亦在有效通道中捕獲hIgG4PE ISTC作為陰性對照組。單專一性抗體AbT用作陽性對照組。
由BIAevaluation軟體根據結合數據計算締合速率常數(kon)、解離速率常數(koff)及解離常數(KD)之值。將數據進行參照及緩衝液減除且擬合至一步生物分子反應(朗格繆爾(Langmuir)1：1)模型中。在該模型中評估解離的前30秒。
實施例11.雙專一性抗體與FX及FIX之同時結合
使用SPR證明FIXxFX雙專一性抗體IXAX-0436.0202.0128同時結合至FIX及FX之能力。將純化雙專一性抗體之結合動力學與同型對照組(ISTC)進行比較。結合感測圖指示雙專一性抗體同時結合至FIX及FX，而在ISTC之情況下未觀測到與FIX及FX之結合。圖21A。
使FIX在捕獲有雙專一性抗體之表面上方飄流以允許與第一分析物結合。雙專一性抗體之間的相互作用產生如感測圖圖21所指示之基線反應。後續注射第二分析物FX產生信號之進一步增加，表明FX結合已與FIX複合之雙專一性抗體。
相反地，當使FIX及FX在捕獲同型對照組之表面上方飄流時未觀測到與FIX或FX之結合，表明FI與FX之間相互作用對雙專一性抗體的專一性。圖21A。
亦可將雙專一性抗體之感測圖與單專一性抗體之感測圖進行比較。當所捕獲之抗體為抗FX單專一性物時，在使FIX在上方飄流時相同注射系列不產生任何顯著反應，實際上，在進行第二注射(1：1混合物)時，觀測到約50反應單位(response unit；RU)，而在雙專一性物之情況下反應高25RU。圖21B。
FVII模擬雙專一性抗體之關鍵特徵係同時結合FIX及FX，以促進由FIXa進行之FX向FXa之轉化的能力。所觀測到之結合代表生物物理學確認，亦即本文所描述之雙專一性抗體可同時與因子IX及因子IX相互作用，其與隨附實施例中所描述之功能數據一致。
材料及方法
使用Biacore 8K(GE Healthcare)系統進行SPR分析。
根據製造商說明書將抗人類IgG Fc抗體固定在CM4晶片(GE Healthcare)上。晶片表面藉由胺偶合活化且隨後經1M乙醇胺阻斷。使用HBS-EP作為固定操作緩衝液在25℃下進行固定操作。
將已藉由蛋白A捕獲後接離子交換層析純化之雙專一性抗體(配位體)以大致2μg/ml捕獲至抗人類IgG Fc CM4表面上。在一條有效通道中在10μl/min下以10μg/ml注射配位體60秒。使用中性pH BS-P 1×+CaCl2 2.5mM作為操作緩衝液在25℃下進行操作。
將人類FIX及人類FX(分析物)以1.15mg/ml在操作緩衝液中復水且用作分析物。在10μl/min下以10μM單獨或混合1：1(10μM 10μM)注射分析物180秒。
在參考通道中在10μl/min下以10μg/ml捕獲同型對照組hIgG4PE抗體60秒作為陰性對照組。對於雙重參考過程中待使用之所有樣本，進行緩衝液之空白注射。10mM甘胺酸pH 1.5在30μl/min下持續30秒之三次注射用於再生期。將數據進行參照及緩衝液減除且擬合至朗格繆爾1：1模型中。
實施例12.抗FX VH之進一步最佳化
將雙專一性抗體之抗FIX結合臂「固定」為包含N1280H之CDR的VH域及包含0128L之CDR的VL域，同時對抗FX VH域進行進一步改良以提高效能。0128L用作共同輕鏈。
表T鑑別T0201H VH域之突變體，其中CDR之一或多個殘基突變為其他胺基酸。該表顯示給予具有經鑑別突變之各變異VH域的名稱。在各種情況下，除指定殘基外之殘基保持未改變。舉例而言，T0616H VH域為T0201H VH域之Leu115Ile突變體，亦即，其中CDR3中IMGT位置115處之白胺酸(L)經異白胺酸(I)置換。將其他殘基變化引入至在T0201H VH域中含有單一突變之變 異體中，產生代表T0201H VH域中不同突變之組合的其他變異體。舉例而言，T0687H VH域為T0201H VH域之Ser111APhe、Cys114Val、Leu115Ile突變體，亦即，其中CDR3中IMGT位置111A處之絲胺酸經苯丙胺酸置換(T0537H突變)，CDR3中IMGT位置114處之半胱胺酸經纈胺酸置換(T0606H突變)且IMGT位置115處之白胺酸經異白胺酸置換(T0616H突變)。其他所命名之抗FX VH域之序列可以相同方式自表T鑑別。關於IMGT編號參考圖13。
測試藉由蛋白A層析純化之雙專一性抗體的功能活性，以尋找優於包含T0201H VH域之親本雙專一性物的改良。
在FX酶分析(使用如實施例7中所詳述之經修改FX酶反應條件)及aPTT分析(如實施例8中所詳述之方法)中鑑別改良抗體。
HCDR3之突變誘發產生FVIII模擬活性之提高。展現提高之活性的VH域之HCDR在圖25中指定。舉例而言，發現T0201H VH域CDR3中以下取代及取代組合中之各者提高FVIII模擬活性(所得VH域之名稱在括號中指定)(非詳盡清單)：CDR3中之Gln116Met(T0638H VH)；CDR3中之Leu115Ile(T0616H VH)；CDR3中之Ser111APhe(T0537H VH)；Cys114Ile Leu115Ile(T0666H VH)；Serl11APhe Cys114Ile Leu115Ile(T0678H VH)；Ser111APhe Cys114Leu Leu115Ile(T0681H VH)；Ser111APhe Cys114Val Leu115Ile(T0687H)。
結束T0201H之HCDR3突變誘發，VH域T0687H、T0678H及T0681H在雙專一性抗體中展現最強活性。
雙專一性抗體之功能活性經由抗FX臂中HCDR1及HCDR2之突 變誘發又進一步提高。以T0681H開始，CDR1及CDR2之各胺基酸殘基經所有其他可能的胺基酸系統地置換，產生表T中所鑑別之編號為T0690H至T0993H的VH域。
亦進行aPTT及TGA分析以支持HCDR1變異體之功能評定。與T0681H相比，VH域T0736(S29K突變)、T0713、T0734、T0742、T0774及T0785顯示提高之活性。基於對T0681H之HCDR1變異體的功能分析，將VH域T0736H選為發揮頂尖功效者。與T0201H相比，T0736H將CDR1中之Ser29Lys取代與CDR3中之Ser111APhe Cys114Val及Leu115Ile取代組合。
亦進行FX酶、aPTT及TGA分析以支持HCDR2變異體之功能評定。基於對T0681H之HCDR2變異體的功能分析，將以下VH域鑑別為與T0681H相比具有提高之活性：T0926H(S62K)、T850H(I56L)、T0925H(S62L)、T0951H(G63S)、T0958H(S64D)、T0989(T65R)及T0990H(T65S)。
隨後將所選CDR1及CDR2變異體與所選CDR3組合，產生其他VH域變異體以研究可能的活性進一步提高。
高效抗體之FX酶分析數據概述於圖22及圖23中。aPTT分析數據概述於圖24中。
與包含T0201H之雙專一性抗體相比，包含圖22及圖23中所顯示之VH域的雙專一性抗體展現改良或類似凝塊時間，其中T0999H在aPTT分析中展現最短凝塊時間。
FX酶活性及凝塊時間與比較雙專一性抗體AbE相當。
圖25鑑別VH域之CDR，其在突變誘發過程期間針對FVIII模擬活性逐漸地改良。
實施例13.凝血酶產生分析中雙專一性抗體之強活性
凝血酶產生分析(TGA)偵測血漿中凝血酶原向凝血酶之活化。隨著凝血酶產生，其將螢光受質轉化成螢光團，該螢光團由讀盤機連續監測。TGA提供對雙專一性抗體在FVIII缺乏型血漿中取代凝結級聯中之FVIII之能力的穩健量測，且咸信TGA中凝血酶產生之動力學作為FVIII模擬藥物之活體內治療效能的指示物高度可靠。
結果
為了確定因子IXa作為TGA觸發劑之適合濃度，吾人最初用固定濃度之雙專一性抗體同時變化觸發試劑中存在之FIXa的濃度進行TGA。吾人確定含有222nM FIXa之1ml MP試劑的儲備溶液足以觸發正常混合人類血漿之凝血酶產生(最終濃度，0.33nM FIXa)，其中Cmax為418.11nM凝血酶，Tmax為7.67分鐘且滯後時間為5.83分鐘。圖26。此等值與健康成人中之參考範圍(參見例如參考文獻[11]之表3)相當，且證實FIXa作為TGA觸發劑之用途。
將雙專一性抗體VH域T0201H及T0201H之CDR1、CDR2及CDR3組合性變異體與FIX N1280H臂及N0128共同輕鏈一起在HEK細胞中表現，藉由蛋白A層析純化且在133nM及80nM之最終濃度下分析。與T0201H相比，VH域變異體展現縮短滯後時間、增加Cmax及達至峰之較短時間，其中在所分析之兩種濃度下，T0999展現最大凝血酶峰高度及達至峰之最短時間。至少IXAX-1280.0999.0128之效能與AbE及艾美賽珠單抗校準劑之效能相當。AbE展現分別2.5分鐘、291.8nM及6.0分鐘之滯後時間、峰高度及達至峰之時間，且IXAX-1280.0999.0128展現2.0分鐘、317.2nM及5分鐘之滯後時間、峰高度及達至峰之時間。圖27。圖28。如圖27中且依增加Tmax之順序所示出，吾人觀測到包含T0999、T0687、T0736、T0678、T0681、T0666、T0201及T0596之雙專一性抗體分別5、6.83、6.83、7、7.67、13.17、15及15.67分鐘之Tmax。
Figure 108146911-A0305-02-0109-4
表E13-1.來自對外加在133nM最終濃度下之雙專一性抗體IXAX-1280.0201.0128中T0201H之CDR1、CDR2及CDR3單一及組合性突變體的FVIII缺乏型血漿進行之TGA的記錄參數。ETP=內源性凝血酶潛能。
Figure 108146911-A0305-02-0109-5
表E13-2.來自對外加在80nM最終濃度下之雙專一性抗體IXAX-1280.0201.0128中T0201H之CDR1、CDR2及CDR3單一及組合性突變體的FVIII缺乏型血漿進行之TGA的記錄參數。ETP=內源性凝血酶潛能。參考圖27。
Figure 108146911-A0305-02-0110-6
表E13-2.來自用(i)艾美賽珠單抗校準劑及(ii)外加PBS之正常混合血漿進行之TGA的記錄參數。艾美賽珠單抗校準劑最初為100ug/ml=0.1mg/ml=666.666nM。稀釋125/80=1.5625(80血漿，20校準劑/MP，20 FluCa，5 PBS外加)為校準劑提供426.6nM之最終艾美賽珠單抗濃度。參考圖27。
對於劑量反應TGA，將雙專一性抗體IXAX-1280.0999.0128在HEK細胞中表現，藉由蛋白A層析純化且雙專一性異二聚體藉由離子交換層析純化。使用0.3nM FIXa觸發劑，對外加雙專一性抗體IXAX-1280.0999.0128之FVIII缺乏型血漿進行TGA中之Cmax(nM)及Tmax(分鐘)的劑量反應且對照艾美賽珠單抗校準劑比較。兩種雙專一性抗體均隨抗體濃度提高展現Cmax之線性降低。IXAX-1280.0999.0128達成比校準劑抗體更大的Cmax，此增加在較低雙專一性抗體濃度下較明顯。參見圖29。
Figure 108146911-A0305-02-0110-7
表E13-3.來自對外加雙專一性抗體IXAX-1280.0201.0128中T0201H之 CDR1、CDR2及CDR3單一及組合性突變體的FVIII缺乏型血漿進行之TGA的記錄參數。參考圖29。
Figure 108146911-A0305-02-0111-8
表E13-4.來自用艾美賽珠單抗校準劑進行之TGA的記錄參數。參考圖29。
材料及方法
為了初始實驗工作確定因子IXa作為TGA觸發劑之適合濃度，將獲自健康個體之80μl正常混合血漿(Helena Biosciences)與20μl之觸發試劑(微粒(Microparticle；MP)試劑，其由僅含有變化量之FIXa的磷脂構成)在Immulon 2HB透明U形底96孔盤(ThermoFisher編號3665)中混合。所有試劑根據製造商說明書使用，在水浴中預溫熱至37℃。
一旦確定0.33nM FIXa之最終濃度足以觸發正常血漿之凝血酶產生，則在經校準自動化凝血酶曲線分析中在FVIII耗乏型血漿之情況下應用包括0.3nM FIXa之相同分析條件。
將FVIII免疫耗乏血漿(Helena Biosciences)與20μl之觸發試劑(微粒(MP)試劑，其由僅含有222nM FIXa之磷脂構成，最終濃度0.33nM)在Immulon 2HB透明U形底96孔盤中混合。所有試劑根據製造商說明書使用，在水浴中預溫熱至37℃。進行TGA劑量反應，以300nM之測試雙專一性抗體或艾美賽珠單抗校準劑(外加至FVIII缺乏型血漿(Enzyme Research Laboratories)中 之艾美賽珠單抗)起始並經五點系列的1/3稀釋。人類IgG4同型對照組抗體用作陰性對照組，且外加PBS之正常(FVIII+ve)混合血漿用作陽性對照組。
將樣本重複量測兩次，伴有在相同血漿中含有凝血酶校準劑(含有預定數量之凝血酶)的重複校準劑孔。將96孔盤在Fluoroskan Ascent讀盤機(Thermo)溫熱至37℃持續10分鐘。凝血酶產生在添加20μl FluCa試劑(螢光受質，ZGGR-AMC(2.5mM)，在含有100mM CaCl2之緩衝液中)後開始。TGA試劑獲自Stago。由讀盤機監測隨時間推移螢光之增加。
在所研究之各樣本旁操作凝血酶校準劑曲線。使用校準劑，伴隨已知濃度之凝血酶，可由使用軟體ThrombinoscopeBV獲得之螢光信號計算所研究的樣本中產生的凝血酶之量。將來自測試孔之螢光對照來自凝血酶校準劑孔之螢光校準，以確定測試孔中所產生之等效凝血酶。
使用Stago分析軟體分析操作數據。使用具有已知活性之凝血酶校準劑曲線確定所產生之凝血酶的量。確定凝血酶曲線之以下態樣：滯後時間(分鐘)、內源性凝血酶潛能(ETP；凝血酶曲線下面積，奈莫耳濃度凝血酶/分鐘)、峰高度(Cmax；奈莫耳濃度凝血酶)、達至峰之時間(Tmax/分鐘)、速度指數(VI；奈莫耳濃度/分鐘，滯後時間與達至峰之時間之間的斜率)及尾起始(分鐘；凝血酶產生結束之時間)。
實施例14.凝血酶產生分析中之劑量反應及效力
為了評估雙專一性抗體IXAX-1280.0999.0325之最大凝血酶峰高度(Cmax，奈莫耳濃度凝血酶)及達至峰之時間(Tmax，分鐘)，吾人根據實施例13中所陳述之方法使用全抗體濃度劑量反應，在人類FVIII耗乏血漿中進行凝血酶產生分析(TGA)。使用非線性log[抗體]對反應參數變斜率模型(4參數邏輯回歸模型)擬合由劑量反應曲線產生之數據。包括AbE用於比較。此分析中 所使用之IXAX-1280.0999.0325及AbE藉由質譜測定為接近100%異二聚體，未偵測到同二聚污染物。
在橫跨300至30nM，等效於45至4.5μg/ml之有希望的治療窗內，吾人觀測到與所分析之所有濃度下之AbE相比，IXAX-1280.0999.0325的等效(10%內)或更大Cmax(奈莫耳濃度凝血酶)值(圖30)。當雙專一性抗體之濃度在100與300nM之間時，IXAX-1280.0999.0325之Cmax接近正常血漿對照組之Cmax(圖30及圖31)。相比之下，AbE之Cmax僅當IgG濃度為300nM時達到正常水平。在此研究中，IXAX-1280.0999.0325之EC50(8.0nM)為AbE之EC50(54.4nM)的大致15%。
使用Cmax曲線，可預測當其濃度等於或大於8μg/mL時，IXAX-1280.0999.0325可達成與45μg/mL之艾美賽珠單抗相同的活性，其表明與艾美賽珠單抗相比，在IXAX-1280.0999.0325之情況下的潛在功效優點。
對相同劑量反應但相對於Tmax進行分析，吾人觀測到與所分析之所有濃度下之AbE相比，IXAX-1280.0999.0325的等效(10%內)或更低(或降低)的Tmax值(圖32)。與AbE(方形)之2.8nM相比，IXAX-1280.0999.0325(圓形)所獲得之基於Tmax值的EC50計算值為1.65nM。
就圖30及圖32中所指定之治療範圍而言，吾人觀測在IXAX-1280.0999.0325之情況下，與AbE相比分別較大及較低之Cmax及Tmax劑量反應曲線。
Figure 108146911-A0305-02-0113-9
表E14-1.Cmax之非線性擬合。抗體濃度對數對Cmax之最佳擬合值。變斜率 (4參數)。
Figure 108146911-A0305-02-0114-10
表E14-2.Tmax之非線性擬合。抗體濃度對數對Cmax之最佳擬合值。變斜率(4參數)。
亦在TGA中評定三種其他雙專一性抗體(BiAb 2、3及4)之活性，且對照IXAX-1280.0999.0325(BiAb 1)及市售艾美賽珠單抗校準劑(Enzyme Research Laboratories)在市售人類FVIII耗乏型血漿(Helena Biosciences)中之效能比較。BiAb如下，各自包括分別在兩條重鏈中之重鏈恆定區SEQ ID NO：409及SEQ ID NO：410，及共同輕鏈中之λ輕鏈恆定區SEQ ID NO：146：
1.IXAX-1280.0999.0325。抗FIX重鏈SEQ ID NO：419，抗FX重鏈SEQ ID NO：421，共同輕鏈SEQ ID NO：414。
2.IXAX-1454.0999.0325。抗FIX重鏈SEQ ID NO：424，抗FX重鏈SEQ ID NO：421，共同輕鏈SEQ ID NO：414。
3.IXAX-1441.0999.0325。抗FIX重鏈SEQ ID NO：426，抗FX重鏈SEQ ID NO：421，共同輕鏈SEQ ID NO：414。
4.IXAX-1442.0736.0325。抗FIX重鏈SEQ ID NO：428，抗FX重鏈SEQ ID NO：430，共同輕鏈SEQ ID NO：414。
BiAb_1、2、3及4以與艾美賽珠單抗相同之方式以劑量依賴性方式增加凝血酶峰高度(Cmax)，且以劑量依賴性方式減少達至峰之時間(Tmax)。BiAb_1之Cmax曲線頂部經量測在約368nM下，高於艾美賽珠單抗之Cmax曲線頂部(334.8nM)。BiAb_1、2、3及4之EC50(Cmax)類似於彼此，且分別具有 6.45nM、5.87nM、5.2nM及4.81nM之EC50計算值，代表在艾美賽珠單抗之EC50(18.33nM)的26%與35%之間的EC50。圖33 A。與艾美賽珠單抗之2.53nM相比，BiAb_1至BiAb_4之EC50(Tmax)計算值分別為0.56nM、0.65nM、1.08nM及0.93nM。圖33 B。
在第三研究中，藉由在人類FVIII耗乏血漿中使用TGA分析，再次將BiAb_1(IXAX-1280.0999.0325)與市售艾美賽珠單抗校準劑進行比較。BiAb_1以劑量依賴性方式增加凝血酶峰高度(Cmax)，且以劑量依賴性方式減少達至峰之時間(Tmax)。圖34。BiAb_1之Cmax曲線頂部為約396.5nM，高於艾美賽珠單抗之Cmax曲線頂部(286.3nM)。BiAb_1之EC50為7.7nM，艾美賽珠單抗之EC50(25.9nM)的大致30%。
在如圖34、圖33及圖30中所顯示之TGA之間觀測到分析之間的變化，其中BiAb_1分別展現大致400nM、375nM及375nM之Cmax，且其中艾美賽珠單抗展現275nM、300nM及350nM之Cmax。不管絕對讀數中之變化如何，所觀測到之傾向在TGA之各情況下相同。
總體而言，在市售艾美賽珠單抗校準劑或所產生之參考抗體AbE之情況下的TGA數據始終指示與艾美賽珠單抗相比，BiAb_1(IXAX-1280.0999.0325)之功效優點。在所測試之其他抗體(BiAb_2、BiAb_3及BiAb_4)之情況下亦觀測到優點。
根據艾美賽珠單抗之FDA多學科審閱，在
Figure 108146911-A0305-02-0115-140
45μg/mL之艾美賽珠單抗穩定狀態谷血漿濃度下將達成按年計算之出血比率(annualized bleeding rate；ABR)中值為0。[17]。使用來自上文所描述之TGA的Cmax曲線，預測當其濃度等於或大於約2至4μg/mL時，BiAb_1可達成與45μg/mL之艾美賽珠單抗相同的活性。此觀測結果表明相對於艾美賽珠單抗之潛在功效及/或給藥優點。活性中之差異可能意謂當以與艾美賽珠單抗相比更低劑量及/或更低頻率投予 時，雙專一性抗體可達成相同療效，代表臨床優點。儘管較高Cmax指示較有效的促凝血性能，此增加之量值不大可能與安全性考量相關。
實施例15.最佳化抗體臂之親和力
如以上實施例10中所描述，藉由SPR測定純化抗FIX及抗FX抗體對與其各別抗原之結合的親和力及動力學。
抗FIX抗體顯示以大致0.05μM至0.3μM(50至300nM)之親和力範圍結合至FIX，具有逐漸提高之親和力(較低Kd)及較快解離速率與雙專一性抗體中之較大活性相關的大體趨勢。表E15-1。
Figure 108146911-A0305-02-0116-11
表E15-1。
抗FX抗體顯示以大致0.3至3μM之親和力範圍結合至FX。表E15-2。包括抗FX抗體MONA作為對照組低親和力抗體，其中VH及VL域來自獲自單細胞分選(實施例1)之IgM殖株。
Figure 108146911-A0305-02-0116-12
表E15-2。
實施例16.初始生物物理學評定
為了評估雙專一性抗體之表現，將IXAX-1172.0201.0128選擇為小池分析之代表性抗體。小池分析允許篩選表現大量(至少1g/l)異二聚雙專一性抗體之CHO經穩定轉染的細胞，且代表評估穩定雙專一性抗體表現之手段。
對經穩定轉染之CHO-K1細胞使用標準龍沙(Lonza)饋料批式過度生長方案，表現雙專一性抗體。在轉染之後，將5000個活細胞每孔等分以產生多個小池。基於如藉由Octet所量測之抗體力價取出8個。
將細胞收集，過濾且藉由蛋白A層析純化以自上清液分離抗體。藉由OD280定量抗體濃度(mg)，相應地基於樣本體積及根據細胞培養體積指定之純化量(mg/L)計算抗體之總量(mg)。使用成像毛細管等電聚焦(imaged capillary isoelectic focusing；icIEF)(Protein Simple，Maurice)測定8個小池樣本中之各者中異二聚體及同二聚體的相對百分比。使用FIX及FX之短暫表現參考同二聚體臂指定同二聚體及異二聚體峰。
吾人能夠分離表現大致1g/L具有高達大致95%異二聚體之雙專一性抗體之經穩定轉染的細胞(例如，如針對MP_1及MP_7所顯示，圖35)。
FX酶分析中之雙專一性抗體活性與異二聚體%以0.99之皮爾森相關係數相關(圖36)。
實施例17.雙專一性抗體之純化
雙專一性抗體之兩條重鏈及一條共同輕鏈的共表現產生組成物，其包含雙專一性抗體外加單專一性抗體副產物。此等可藉由離子交換層析，採用與單專一性同二聚體相比雙專一性異二聚體之等電點的差異進行分離。
雙專一性抗體IXAX-1280.0999.0128包含抗FIX重鏈SEQ ID NO：419、抗FX重鏈SEQ ID NO：421及共同輕鏈SEQ ID NO：405。在將此等多肽在 HEK細胞中共表現之後，使用蛋白A層析以將抗體自細胞上清液分離，接著進行離子交換層析以分離異二聚體來純化雙專一性抗體。
雙專一性抗體IXAX-0436.0201.0128包含抗FIX重鏈，其包含VH域SEQ ID NO：324及具有P(鉸鏈)突變及K439E之IgG4人類重鏈恆定區；抗FX重鏈，其包含VH域SEQ ID NO：470及具有P(鉸鏈)突變及E356K之IgG4人類重鏈恆定區；及共同輕鏈SEQ ID NO：405。
雙專一性抗體IXAX-0436.0202.0128包含抗FIX重鏈，其包含VH域SEQ ID NO：324及具有P(鉸鏈)突變及K439E之IgG4人類重鏈恆定區；抗FX重鏈，其包含VH域SEQ ID NO：472及具有P(鉸鏈)突變及E356K之IgG4人類重鏈恆定區；及共同輕鏈SEQ ID NO：405。
雙專一性抗體IXAX-1172.0201.0128包含抗FIX重鏈，其包含VH域SEQ ID NO：440及具有P(鉸鏈)突變及K439E之IgG4人類重鏈恆定區；抗FX重鏈，其包含VH域SEQ ID NO：470及具有P(鉸鏈)突變及E356K之IgG4人類重鏈恆定區；及共同輕鏈SEQ ID NO：405。
離子交換層析將各抗體組成物純淨地分離成其組成部分。觀測到基線分離。抗FIXxFX異二聚雙專一性抗體與同二聚雜質抗FIX及/或抗FX單專一性抗體分離。
圖37a顯示自包含與抗FIX同二聚體NINA-1280.0128及抗FX同二聚體TINA-0999.0128混合之雙專一性抗體的組成物成功純化IXAX-1280.0999.0128。
圖37b顯示自包含與抗FIX同二聚體NINA-0436.0128及抗FX同二聚體TINA-0202.0128混合之雙專一性抗體的組成物成功純化IXAX-0436.0202.0128。層析圖代表使用一系列逐步溶析，使用於乙酸鈉pH 5中至多500nM之提高濃度的NaCl，自同二聚體污染物陽離子離子交換純化N436雙 專一性抗體。峰1代表抗FIX同二聚體抗體；峰2，抗FIX/FX雙專一性抗體且峰3代表抗FX同二聚體抗體。峰1、2及3分別佔18%、79%及3%總峰面積。
圖37c顯示自包含雙專一性抗體及抗FIX同二聚體NINA-1172.0128之組成物成功純化IXAX-1172.0201.0128。此處管柱純化產生31.5%抗FIX同二聚體及68.5%雙專一性異二聚體。層析圖代表使用初始逐步溶析以移除弱結合峰1(抗FIX同二聚體)，接著使用提高濃度之NaCl進行梯度溶析以溶析抗FIX/FX雙專一性物，自抗FIX同二聚體污染物陽離子離子交換純化N1172雙專一性抗體。未偵測到抗FX同二聚體之存在。
材料及方法
對於IXAX-1280.0999.0128純化，將雙專一性抗體在Expi293F HEK細胞中短暫表現。將細胞培養物上清液收集，過濾且負載至用1×磷酸鹽緩衝生理食鹽水(phosphate buffered saline；PBS)平衡之5ml HiTrap MabSelect Sure(MSS)管柱(GE Healthcare)上。將管柱用5管柱體積之PBS洗滌且使用IgG溶析(ThermoFisher)溶析結合的抗體。將溶析雙專一性抗體在4℃下透析至1×PBS隔夜，且使用具有10kDa分子量截止值之離心過濾器單元濃縮。
在室溫下進行層析。將1ml HiTrap Capto SP管柱(GE Healthcare)用20mM磷酸鈉，pH 6.0平衡，且將1：20稀釋於平衡緩衝液(20mM磷酸鈉，pH 6.0)中之0.5mg蛋白A純化材料負載至管柱上。將管柱隨後用10管柱體積之平衡緩衝液洗滌，後接線性梯度(100% B在90管柱體積內至500mM NaCl)以溶析雙專一性抗體及單專一性污染物。在此過程中，緩衝液在對於1ml管柱1毫升/分鐘之流動速率下在90cv內自A(20mM磷酸鈉，pH 6.0，無鹽)逐漸改變為B(具有500mM NaCl添加之緩衝液A)。
對於IXAX-0436.0202.0128純化，使用緩衝液A(50mM乙酸鈉， pH 5)及緩衝液B(50nM乙酸鈉及500mM氯化鈉)之變化比例施加逐步梯度，其包括在三種不同離子強度下之洗滌。
對於IXAX-1172.0201.0128純化，使用初始逐步溶析以移除弱結合峰1(抗FIX同二聚體)，接著使用提高濃度之NaCl進行梯度溶析以溶析抗FIX/FX雙專一性物。
隨後，將以下雙專一性抗體在CHO細胞中表現：
5.IXAX-1280.0999.0325。抗FIX重鏈SEQ ID NO：419，抗FX重鏈SEQ ID NO：421，共同輕鏈SEQ ID NO：414。
6.IXAX-1454.0999.0325。抗FIX重鏈SEQ ID NO：424，抗FX重鏈SEQ ID NO：421，共同輕鏈SEQ ID NO：414。
7.IXAX-1441.0999.0325。抗FIX重鏈SEQ ID NO：426，抗FX重鏈SEQ ID NO：421，共同輕鏈SEQ ID NO：414。
8.IXAX-1442.0736.0325。抗FIX重鏈SEQ ID NO：428，抗FX重鏈SEQ ID NO：430，共同輕鏈SEQ ID NO：414。
9.IXAX-1442.0687.0325。抗FIX重鏈SEQ ID NO：428，抗FX重鏈SEQ ID NO：421，共同輕鏈SEQ ID NO：414。
此等雙專一性抗體中之各者分別包括SEQ ID NO：409及SEQ ID NO：410用於兩條重鏈，及共同輕鏈中之λ輕鏈恆定區SEQ ID NO：146。
由在CHO細胞中短暫表現抗體1至5中之各者觀測到的力價與單專一性同型對照組抗體的力價相當。亦產生穩定池及小池(在轉染之後接種至多4,000個細胞)。儘管穩定池產生低百分比(11%至19%)異二聚抗體，但由有限數目個經篩選小池建立具有高達4.9g/l之力價及高達82%之異二聚體百分比的小池。
在蛋白A純化之後，使用陽離子交換層析以移除同二聚副產物以 產生適用於功能分析及可發展性篩選的高純度材料。
使用梯度陽離子交換方法，將抗體1至4與同二聚副產物分離，在溶析材料中提供91%至96%異二聚體。因此，即使在此基本純化方法之情況下，吾人亦能夠獲得91%至96%純異二聚體。圖38。使用此技術，針對抗體5未觀測到相當的同二聚體/異二聚體分離。
實施例18.藉由質譜進行之品質評定
治療性單株抗體之結構完整性可被多種類型之轉譯後修飾損害，其導致產物異質性。質譜(Mass spectrometry；MS)用於在陽離子交換純化之後界定雙專一性抗體之特徵且評估其品質。
在如實施例17中所描述之陽離子交換分離之後，藉由MS分析BiAb_1 IXAX-1280.0999.0325之溶析組成物中的三種不同物種(分別抗FIX/抗FX異二聚體、抗FIX同二聚體及抗FX同二聚體)。藉由MS測定之三種分子的分子量(Molecular weight；MW)匹配由BiAb_1之胺基酸序列預測的理論MW。MS結果因此證實陽離子交換純化之後FIX/FX異二聚體之身分及純度。
實施例19.穩定性評定
在如實施例17中所描述之純化之後，將BiAb_1、2、3及4分別緩衝液交換至緩衝液1(乙酸鈉，pH 5.5)或緩衝液2(檸檬酸鹽/磷酸鹽，pH 6.0)，在4℃下儲存2週，在25℃下儲存4週或經歷1次凍結/解凍循環。在處理之前及之後量測IgG之濃度以計算歸因於處理的抗體損失。亦在處理之前及之後進行SEC-HPLC以監測雙專一性抗體降解及凝集。未觀測到BiAb_1、2、3或4之明顯損失或降解。此等四種雙專一性抗體因此均在緩衝液1及緩衝液2兩者中穩定。
實施例20.FX酶分析中之劑量反應及效力
按照實施例7進行FX酶動力學分析以量測IXAX-1280.0999.0325及AbE在劑量反應中之因子VIII模擬活性，以測定其EC50值。使用非線性log[抗體]對反應參數變斜率模型(4參數邏輯回歸模型)擬合由劑量反應曲線產生之數據。圖39。y軸在600秒分析時間點處標繪OD405nm值。由數據之非線性回歸曲線計算IXAX-1280.0999.0325及AbE兩者之EC50值，得到IXAX-1280.0999.0325之3.99nM的EC50及AbE之261.2nM的EC50。由於劑量反應曲線不完全，因此此等為近似值。儘管如此，顯而易見IXAX-1280.0999.0325具有比AbE顯著更低之EC50。IXAX-1280.0999.0325及AbE之活性係劑量依賴性的。與AbE相比，IXAX-1280.0999.0325展現較高FVIII模擬活性，尤其在較低濃度下。
Figure 108146911-A0305-02-0122-13
表E20-1.抗體濃度對數對反應之動力學FX酶最佳擬合值。變斜率(4參數)。
實施例21.Hyphen分析劑量反應
使用分析人類血漿中因子Xa產生之顯色分析(HYPHEN BioMed)來量測IXAX-1280.0999.0325及AbE之因子VIII模擬活性。在此分析中，FXa產生與顯色受質添加之後所量測的OD405成比例。產生抗體濃度劑量反應曲線且使用非線性log[抗體]對反應參數變斜率模型(4參數邏輯回歸模型)擬合。計算基於劑量反應之EC50值。與AbE之15.43nM相比，針對IXAX-1280.0999.0325計算出5.92nM之EC50值。
在幾乎所有濃度中，IXAX-1280.0999.0325始終達成比AbE更大 的FVIII模擬能力。在60nM下，對於兩種分子A405nm在4.988下飽和。IXAX-1280.0999.0325在20nM下保留此飽和而AbE呈現有3.457之減少A405nm。在0.028nM之最低濃度下，IXAX-1280.0999.0325顯示比AbE大超過4倍的吸光度。EC50計算值證實當遍及劑量反應分析與AbE進行比較時，IXAX-1280.0999.0325顯示更優效力。圖40。
Figure 108146911-A0305-02-0123-14
表E21-1.Hyphen FX酶EC50。抗體濃度對數對反應之最佳擬合值。變斜率(4參數)。
材料及方法
遵循製造商分析方案使用BIOPHEN FVIII：C(編號221402)套組。簡言之，將FVIII缺乏型血漿(Helena Biosciences Europe)使用Tris-BSA緩衝液(R4)1：40稀釋，且將45μl添加至透明底部96孔盤中。將5μl之雙專一性抗體添加至稀釋血漿中。將預培養至37℃之50μl試劑R1(FX)及R2(FIXa)中之各者添加至各孔中，且在37℃下培養五分鐘。隨後，添加50μl之試劑R3(SXa-11，顯色試劑)，混合且培養恰好額外五分鐘。添加50μl 20%乙酸終止反應。經由因子Xa裂解特定因子Xa受質(SXa-11)之能力監測因子Xa的產生。此受質之裂解釋放有色產物pNA，其可使用分光光度計在405nM下監測且與空白樣本進行比較。
藉由質譜測定此分析中所使用之IXAX-1280.0999.0325及AbE接近100%異二聚體，未偵測到(或偵測到低水平)同二聚污染物。
使用1：3稀釋系列用PBS作為稀釋劑稀釋IXAX-1280.0999.0325及 AbE樣本。將5μL體積添加至45μL因子VIII缺乏型血漿中。稀釋系列中各樣本之最終濃度(nM)(當分析時)為：60.0、20.0、6.67、2.22、0.741、0.247、0.082及0.028。將濃度轉換為log(M)且作圖。在圖上繪製非線性回歸以實現EC50計算。
實施例22.血漿凝結分析中之劑量反應及效力
吾人使用全抗體濃度劑量反應評估雙專一性抗體AbE對照IXAX-1280.0999.0325之活化部分凝血激酶時間(aPTT)(根據實施例8之方法)。將由劑量反應曲線產生之數據使用非線性log[抗體]對反應參數變斜率模型(4參數邏輯回歸模型)擬合。
在所分析之濃度值中，吾人觀測到在所分析之所有濃度下，與AbE相比IXAX-1280.0999.0325的等效aPTT值(10%內)(圖41)。將劑量反應曲線與人類IgG4單株抗體同型對照組進行比較，該同型對照組未展現止血功效。與AbE(方形)之2.0nM相比，針對IXAX-1280.0999.0325(圓形)所獲得之基於aPTT值的EC50計算值為2.1nM。
就30至300nM之有希望的治療範圍而言，吾人觀測到在IXAX-1280.0999.0325之情況下等效於AbE的aPTT劑量反應曲線。
藉由質譜測定此分析中所使用之IXAX-1280.0999.0325及AbE為100%異二聚體，未偵測到同二聚污染物。
實施例23.在抗FVIII抑制性抗體存在下之活性
若患者產生針對外源投予之FVIII的同種異體抗體，則因子VIII替代療法可變為對治療患有A型血友病之患者低效。抑制性抗FVIII同種異體抗體可阻斷FIX、磷脂及溫韋伯氏因子向FVIII之結合，使其無活性。
有利地，治療性雙專一性抗體對患者血液中FVIII同種異體抗體 之存在不敏感，此係由於同種異體抗體具有對FVIII之專一性。此由雙專一性抗體在功能上恢復獲自抑制子患者之血漿之止血的能力證實。在此實施例中，吾人使用兩個止血分析證明此：使用來自具有抑制性同種異體抗體之患有A型血友病之患者的血漿(被稱作「抑制子血漿」)的活化部分凝血激酶時間(aPTT)及凝血酶產生分析(TGA)。凝塊時間之恢復指示所分析之雙專一性抗體在FVIII抑制性同種異體抗體存在下具有功能。因此，此處呈現之數據表明IXAX-1280.0999.0325及IXAX-1441.0999.0325將能夠在功能上急救具有針對FVIII之抑制性同種異體抗體之患者的凝塊時間。
使用貝塞斯達分析(Bethesda assay)或奈梅亨修改之貝塞斯達分析(Nijmegen-Modified Bethesda assay)量測針對FVIII之同種異體抗體的力價。在此等分析中，將患者血漿之不同稀釋液與等體積的『正常』血漿混合，且靜置培養一段時間且量測FVIII之水平。當觀測到殘餘FVIII之降低時指示抑制劑之存在。此等分析中之量測單位被稱為貝塞斯達單位(Bethesda Unit；BU)，較高BU指示較大抑制及較低殘餘FVIII活性。本文所描述之實驗使用具有70BU之特定抑制子水平的患者血漿。
aPTT
將IgG4雙專一性抗體IXAX-1280.0999.0325、IXAX-1441.0999.0325及AbE在CHO細胞中表現，隨後藉由蛋白A層析後接陽離子交換層析純化，以將活性異二聚體與污染同二聚體分離，且藉由aPTT在六個不同濃度300、100、33.3、11.1、3.7及1.23nM下分析。按照實施例8進行aPTT。將由劑量反應曲線產生之數據使用非線性log[抗體]對反應參數變斜率模型(4參數邏輯回歸模型)擬合。IXAX-1280.0999.0325及IXAX-1441.0999.0325 IgG4抗體兩者能夠以與AbE類似之方式急救抑制子患者樣本中的凝塊缺陷。圖42。
凝血酶產生分析
在蛋白A上純化後接陽離子交換層析之後，測定抑制子血漿(70BU)中之凝血酶產生，用於IXAX-1280.0999.0325、IXAX-1441.0999.0325及AbE IgG4雙專一性抗體。按照實施例13使用凝血酶產生分析。針對所有雙專一性抗體觀測到凝血酶峰，表明IXAX-1280.0999.0325及IXAX-1441.0999.0325兩者可以與AbE類似之方式在功能上恢復含有針對FVIII之抑制性同種異體抗體之血漿中的止血。
進行針對各雙專一性抗體之劑量反應且測定峰值凝血酶高度(Cmax)。圖43。在所分析之濃度範圍內，IXAX-1280.0999.0325及IXAX-1441.0999.0325之Cmax劑量反應大於AbE之Cmax，表明更大凝血酶突發，且IXAX-1280.0999.0325及IXAX-1441.0999.0325之Tmax劑量反應低於AbE之Tmax，表明較快凝血酶突發。圖44。
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FIXa結合臂VH域多肽序列
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FX結合臂VH域多肽序列
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人類生殖系基因區段
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共同輕鏈序列
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使用具有其天然人類Igλ前導序列(v3-21前導肽MAWTALLLGLLSHCTGSVT SEQ ID NO：519)之共同輕鏈N0128L重組表現雙專一性抗體引起N端Ser之截割，以產生VL域與在本文中針對N0325 VL域顯示之序列一致的抗體。對於與成熟輕鏈多肽由在Ser之後裂解產生之替代前導序列一起使用，產生輕鏈0325以便獲得相同成熟產物。0325略去0128L之N端Ser殘基。
恆定區
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Claims (27)

  1. 一種雙專一性抗體，其結合FIXa及FX且催化FIXa介導之FX活化，其中該抗體包含兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對，其中第一重鏈-輕鏈對包含結合FIXa的Fv區，該Fv區包含與第一VL域成對之第一VH域，且第二重鏈-輕鏈對包含結合FX的Fv區，該Fv區包含與第二VL域成對之第二VH域，其中該第一VH域包含一組HCDR，該組HCDR包含具有所定義之胺基酸序列的HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中HCDR1係SEQ ID NO：441，HCDR2係SEQ ID NO：436且HCDR3係SEQ ID NO：433；該第二VH域包含一組HCDR，該組HCDR包含具有所定義之胺基酸序列的HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中HCDR1係SEQ ID NO：598，HCDR2係SEQ ID NO：467且HCDR3係SEQ ID NO：565，且該第一VL域及該第二VL域各自包含一組LCDR，該組LCDR包含具有所定義之胺基酸序列的LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中LCDR1係SEQ ID NO：6，LCDR2係SEQ ID NO：7且LCDR3係SEQ ID NO：8。
  2. 如請求項1之雙專一性抗體，其中該第一VH域與N1280H VH域SEQ ID NO：443具有至少95%的胺基酸序列一致性，該第二VH域與T0999H VH域SEQ ID NO：632具有至少95%的胺基酸序列一致性，且該第一VL域及該第二VL域各自與0128L VL域SEQ ID NO：10具有至少95%的胺基酸序列一致性。
  3. 如請求項1至2中任一項之雙專一性抗體，其中該第一VH域與 N1280H VH域SEQ ID NO：443具有至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的胺基酸序列一致性。
  4. 如請求項3之雙專一性抗體，其中該第一VH域係N1280H VH域SEQ ID NO：443。
  5. 如請求項3之雙專一性抗體，其中該第一VH域係N1441H VH域SEQ ID NO：456。
  6. 如請求項1至2中任一項之雙專一性抗體，其中該第二VH域包含SEQ ID NO：632。
  7. 如請求項1至2中任一項之雙專一性抗體，其中該第一VL域及該第二VL域各自與0128L SEQ ID NO：10具有至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的胺基酸序列一致性。
  8. 如請求項1至2中任一項之雙專一性抗體，其中該第一VL域與該第二VL域的胺基酸序列一致。
  9. 如請求項8之雙專一性抗體，其中該第一VL域及該第二VL域包含0325L的胺基酸序列SEQ ID NO：416。
  10. 如請求項1至2中任一項之雙專一性抗體，其中各重鏈-輕鏈對進一步包含與CH1域成對之CL恆定域。
  11. 如請求項1至2中任一項之雙專一性抗體，其中該等重鏈-輕鏈對包含共同輕鏈。
  12. 如請求項11之雙專一性抗體，其中該共同輕鏈包含0128L輕鏈之CL胺基酸序列SEQ ID NO：146。
  13. 如請求項12之雙專一性抗體，其中該共同輕鏈係0325L輕鏈SEQ ID NO：414。
  14. 如請求項1至2中任一項之雙專一性抗體，其中各重鏈-輕鏈之 重鏈包含重鏈恆定區，且其中該第一及第二重鏈-輕鏈對經由該等重鏈恆定區之二聚化而締合形成四聚免疫球蛋白。
  15. 如請求項14之雙專一性抗體，其中該第一重鏈-輕鏈對之重鏈恆定區包含與該第二重鏈-輕鏈對之重鏈恆定區不同的胺基酸序列，其中該等不同的胺基酸序列經工程改造以促進該等重鏈恆定區之異二聚化。
  16. 如請求項14之雙專一性抗體，其中一個或兩個重鏈-輕鏈對之重鏈恆定區係包含取代S228P之人類IgG4恆定區，其中恆定區編號係根據EU編號系統。
  17. 如請求項14之雙專一性抗體，其中一個重鏈-輕鏈對之重鏈恆定區包含SEQ ID NO：409，且另一重鏈-輕鏈對之重鏈恆定區包含SEQ ID NO：410。
  18. 如請求項14之雙專一性抗體，其包含第一重鏈，其包含第一VH域胺基酸序列SEQ ID NO：443或SEQ ID NO：456，第二重鏈，其包含第二VH域胺基酸序列SEQ ID NO：632，及共同輕鏈，其包含VL域胺基酸序列SEQ ID NO：416。
  19. 如請求項14之雙專一性抗體，其包含第一重鏈，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：419，第二重鏈，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：421，及共同輕鏈，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：414。
  20. 如請求項14之雙專一性抗體，其包含第一重鏈，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：426，第二重鏈，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：421，及共同輕鏈，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：414。
  21. 如請求項1至2中任一項之雙專一性抗體，其中該抗體係人類 IgG4。
  22. 如請求項1之雙專一性抗體，其中第一重鏈-輕鏈對包含結合FIXa的Fv區，該Fv區包含與第一VL域成對之第一VH域，其中該第一VH域的胺基酸序列與N1280H VH域SEQ ID NO：443至少98%一致，且第二重鏈-輕鏈對包含結合FX的Fv區，該Fv區包含與第二VL域成對之第二VH域，其中該第二VH域的胺基酸序列與T0999H VH域SEQ ID NO：632至少98%一致，且其中該第一及第二重鏈-輕鏈對各自包含共同輕鏈，該共同輕鏈包含0325L輕鏈胺基酸序列SEQ ID NO：414。
  23. 如請求項1之雙專一性抗體，其中第一重鏈-輕鏈對包含結合FIXa的Fv區，該Fv區包含與第一VL域成對之第一VH域，其中該第一VH域的胺基酸序列與N1441H VH域SEQ ID NO：456至少98%一致，且第二重鏈-輕鏈對包含結合FX的Fv區，該Fv區包含與第二VL域成對之第二VH域，其中該第二VH域的胺基酸序列與T0999H VH域SEQ ID NO：632至少98%一致，且其中該第一及第二重鏈-輕鏈對各自包含共同輕鏈，該共同輕鏈包含0325L輕鏈胺基酸序列SEQ ID NO：414。
  24. 一種經分離核酸，其編碼如請求項1至23中任一項之雙專一性抗體。
  25. 一種試管內宿主細胞，其包含編碼以下者之重組DNA：抗體重鏈，其包含如請求項1至23中任一項中所界定之第一VH域，抗體重鏈，其包含如請求項1至23中任一項中所界定之第二VH域，及/或 抗體輕鏈，其包含如請求項1至23中任一項中所界定之第一或第二VL域。
  26. 如請求項25之試管內宿主細胞，其包含編碼以下者之重組DNA：第一重鏈，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：419或SEQ ID NO：426，第二重鏈，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：421，及共同輕鏈，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：414。
  27. 一種如請求項1至23中任一項之雙專一性抗體的用途，其用於製造供控制A型血友病患者出血的醫藥品。
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