ES2863526T3 - Tratamiento de enfermedades relacionadas con la subunidad alfa del canal de sodio (SCNA), controlado por voltaje, mediante inhibición de la transcripción antisentido natural a SCNA - Google Patents

Abstract

Un oligonucleótido para uso como compuesto terapéutico, donde dicho oligonucleótido aumenta la expresión del canal de sodio, controlado por voltaje, tipo I, subunidad alfa (SCN1A), y donde dicho oligonucleótido: a. se dirige a una transcripción antisentido natural del canal de sodio, tipo I, de subunidad alfa (SCN1A), donde la transcripción antisentido natural tiene la secuencia de ácido nucleico como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO: 12 a 15 o 17 a 28, o una variante del mismo que conserva la función de la transcripción antisentido natural de cualquiera de las SEQ ID NO: 12 a 15 o 17 a 28; o b. tiene una longitud de 10-30 nucleótidos y se une a un complemento inverso de SEQ ID NO: 16.

Description

DESCRIPCIÓN

Tratamiento de enfermedades relacionadas con la subunidad alfa del canal de sodio (SCNA), controlado por voltaje, mediante inhibición de la transcripción antisentido natural a SCNA

CAMPO DE LA DESCRIPCIÓN

La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de patente provisional de EE.UU. con n°. 61/357.774 depositada 23 de junio de 2010.

Aspectos de la divulgación comprenden oligonucleótidos que modulan la expresión y/o la función de SCNA y moléculas asociadas.

ANTECEDENTES

La hibridación ADN-ARN y ARN-ARN son importantes para muchos aspectos de la función del ácido nucleico, incluida la replicación, la transcripción y la traducción del ADN. La hibridación también es fundamental para una variedad de tecnologías que tanto detectan un ácido nucleico particular como alteran su expresión. Los nucleótidos antisentido, por ejemplo, alteran la expresión génica hibridándose con ARN diana, interfiriendo así con el splicing, la transcripción, la traducción y la replicación de ARN. El ADN antisentido tiene la característica añadida de que los híbridos de ADN-ARN sirven de sustrato para la digestión por ribonucleasa H, una actividad que está presente en la mayoría de los tipos de células. Las moléculas antisentido pueden suministrarse a las células, como es el caso de los oligodesoxinucleótidos (ODN), o pueden expresarse a partir de genes endógenos como moléculas de ARN. La FDA recientemente aprobó un fármaco antisentido, VITRAVENE™ (para el tratamiento de retinitis por citomegalovirus), que refleja que el antisentido tiene utilidad terapéutica.

RESUMEN

La invención se define por las reivindicaciones. Aquellos aspectos/casos de la presente descripción que constituyen la invención se definen por las reivindicaciones.

Este resumen se proporciona para presentar un resumen de la descripción para indicar brevemente la naturaleza y el contenido de la descripción. Se presenta con el entendimiento de que no se utilizará para interpretar ni limitar el alcance o significado de las reivindicaciones.

En un aspecto, la descripción proporciona procedimientos de inhibición de la acción de una transcripción antisentido natural mediante el uso de uno o más oligonucleótidos antisentido dirigidos a cualquier región de la transcripción antisentido natural que resulta en una regulación positiva del gen sentido correspondiente, donde dicho gen sentido se selecciona de entre al menos un miembro de la familia de genes SCNA y variantes del mismo. También se contempla en esta invención que la inhibición de la transcripción antisentido natural puede lograrse mediante siRNA, ribozimas y moléculas pequeñas, que se consideran dentro del alcance de la presente descripción.

Un aspecto proporciona un procedimiento para modular la función y/o expresión de un polinucleótido SCNA en células 0 tejidos de pacientes in vivo o in vitro que comprende poner en contacto dichas células o tejidos con un oligonucleótido antisentido de 5 a 30 nucleótidos de longitud donde dicho oligonucleótido tiene al menos 50 % de identidad de secuencia a un complemento inverso de un polinucleótido que comprende de 5 a 30 nucleótidos consecutivos dentro de los nucleótidos 1 a 1123 de SEQ ID NO: 12 y 1 a 2352 de SEQ ID NO: 13, 1 a 267 de SEQ ID NO: 14, 1 a 1080 de SEQ ID NO: 15, 1 a 173 de SEQ ID NO: 16, 1 a 618 de SEQ ID NO: 17, 1 a 871 de SEQ ID NO: 18,1 a 304 de SEQ ID NO: 19, 1 a 293 de SEQ ID NO: 20, 1 a 892 de SEQ ID NO: 21,1 a 260 de SEQ ID NO: 22, 1 a 982 de SEQ ID NO: 23, 1 a 906 de SEQ ID NO: 24, 1 a 476 de SEQ ID NO: 25, 1 a 285 de SEQ ID NO: 26, 1 a 162 de SEQ ID NO: 27 y 1 a 94 de SEQ ID NO: 28 modulando así la función y/o expresión del polinucleótido SCNA en células de pacientes o tejidos in vivo o in vitro.

En otro aspecto, un oligonucleótido se dirige a una secuencia antisentido natural de polinucleótidos SCNA, por ejemplo, nucleótidos expuestos en la SEQ ID NOS: 12 a 28, y cualquier variante, alelo, homólogo, mutante, derivado, fragmento y secuencia complementaria a los mismos. Ejemplos de oligonucleótidos antisentido se exponen como las SEQ ID NOS: 29 a 94.

Otro aspecto proporciona un procedimiento de modulación de la función y/o expresión de un polinucleótido SCNA en células o tejidos de pacientes in vivo o in vitro que comprende poner en contacto dichas células o tejidos con un oligonucleótido antisentido de 5 a 30 nucleótidos de longitud donde dicho oligonucleótido tiene al menos 50 % de identidad de secuencia a un complemento inverso del antisentido del polinucleótido SCNA; modulando así la función y/o expresión del polinucleótido SCNA en células o tejidos de pacientes in vivo o in vitro

Otro aspecto proporciona un procedimiento para modular la función y/o expresión de un polinucleótido SCNA en células o tejidos de pacientes in vivo o in vitro que comprende poner en contacto dichas células o tejidos con un oligonucleótido antisentido de 5 a 30 nucleótidos de longitud donde dicho oligonucleótido tiene al menos 50 % de secuencia complementaria a una transcripción antisentido natural de SCNA; modulando así la función y/o expresión del polinucleótido SCNA en células o tejidos de pacientes in vivo o in vitro.

En un aspecto, una composición comprende uno o más oligonucleótidos antisentido que se unen a polinucleótidos SCNA sentido y/o antisentido donde dichos polinucleótidos se seleccionan de entre el grupo que consiste en SCNA a SCN12A y variantes de los mismos. En un aspecto preferido, el polinucleótido diana se selecciona de entre SCNA.

En un aspecto, los oligonucleótidos comprenden uno o más nucleótidos modificados o sustituidos.

En un aspecto, los oligonucleótidos comprenden uno o más enlaces modificados.

En otro aspecto más, los nucleótidos modificados comprenden bases modificadas que comprenden fosforotioato, metilfosfonato, ácidos nucleicos peptídicos, 2'-O-metilo, fluoro- o carbono, metileno u otras moléculas de ácido nucleico bloqueado (ANB). Preferentemente, los nucleótidos modificados son moléculas de ácido nucleico bloqueado, que incluyen a-L-ANB.

En un aspecto, los oligonucleótidos se administran a un paciente por vía subcutánea, por vía intramuscular, por vía intravenosa o por vía intraperitoneal.

En un aspecto, los oligonucleótidos se administran en una composición farmacéutica. Un régimen de tratamiento comprende administrar los compuestos antisentido al menos una vez al paciente; sin embargo, este tratamiento puede modificarse para comprender múltiples dosis durante un periodo de tiempo. El tratamiento puede combinarse con uno o más tipos distintos de terapias.

En un aspecto, los oligonucleótidos están encapsulados en un liposoma o unidos a una molécula vehículo (por ejemplo, colesterol, péptido TAT).

Otros aspectos se describen más adelante.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1 es un gráfico de resultados de PCR en tiempo real que muestra la tasa de cambio la desviación estándar en ARNm de SCN1A después del tratamiento de células HepG2 con oligonucleótidos de fosforotioato introducidos usando Lipofectamine 2000, en comparación con el control. Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de SCNIA en células HepG2 se incrementan significativamente 48 h después del tratamiento con uno de los oligonucleótidos antisentido diseñados para BG724147 antisentido de SCN1A. Las barras indicadas como CUR-1624 a CUR-1627 se corresponden con muestras tratadas con SEQ ID NOS: 30 a 33 respectivamente.

La figura 2 es un gráfico de resultados de PCR en tiempo real que muestra la tasa de cambio la desviación estándar en ARNm de SCN1A después del tratamiento de células HepG2 con oligonucleótidos de fosforotioato introducidos usando Lipofectamine 2000, en comparación con el control. Las barras indicadas como CUR-1628 a CUR-1631 se corresponden con muestras tratadas con SEQ ID NOS: 34 a 37 respectivamente.

La figura 3 es un gráfico de resultados de PCR en tiempo real que muestra la tasa de cambio la desviación estándar en ARNm de SCN1A después del tratamiento de células HepG2 con oligonucleótidos de fosforotioato introducidos usando Lipofectamine 2000, en comparación con el control. Las barras indicadas como CUR-1632 a CUR-1636 se corresponden con muestras tratadas con SEQ ID NOS: 38 a 42 respectivamente.

La Figura 4 muestra la regulación positiva dependiente de la dosis de ARNm de SCNIA en fibroblastos primarios de piel humana que llevan una mutación asociada al síndrome de Dravet. CUR-1916, CUR-1740, CUR-1764 y Cu R-1770 corresponden a muestras tratadas con SEQ ID NOS: 70, 45, 52 y 57 respectivamente. La figura 5 muestra la regulación positiva dependiente de la dosis de ARNm de SCN1A en células SK-N-AS. CUR-1916, CUR-1740, CUR-1764 y CUR-1770 corresponden a muestras tratadas con SEQ ID NOS: 70, 45, 52 y 57 respectivamente.

La figura 6 muestra la regulación positiva dependiente de la dosis de ARNm de SCN1A en células Vero76.

CUR-1916, CUR-1740, CUR-1764 y CUR-1770 corresponde a muestras tratadas con SEQ ID NOS: 70,45,52 y 57 respectivamente.

La figura 7 muestra que la regulación positiva del ARNm de SCN1A no está provocada por la toxicidad no específica de los oligonucleótidos antisentido. A - regulación positiva por CUR-1916; B - regulación positiva por CUR-1770. CUR-1462 es un oligonucleótido de control inactivo de química similar.

La figura 8 muestra que la expresión de los canales SCNSA y SCN9A en fibroblastos humanos que portan una mutación asociada a Dravet no se ve significativamente afectada por el tratamiento con oligonucleótidos antisentido dirigidos contra la transcripción antisentido natural de SCN1A. A - tratamiento con CUR-1770; B - tratamiento con CUR-1916.

La figura 9 muestra la estabilidad de oligonucleótidos antisentido que se dirigen a la transcripción antisentido natural específico de SCN1A. Se trataron células Vero 76 como se describe en el Ejemplo 2 con dos lotes diferentes de CUR-1916 sintetizados en agosto de 2010 y marzo de 2011. El oligonucleótido sintetizado en agosto de 2010 se almacenó como una solución acuosa 1 mM a 4°C. El oligonucleótido sintetizado en marzo de 2011 se envió en forma liofilizada y se probó inmediatamente después de su llegada.

La figura 10 muestra la regulación positiva de la proteína SCN1A en fibroblastos que llevan una mutación del síndrome de Dravet tratados con oligonucleótidos antisentido complementarios al antisentido natural de SCN1A. Los fibroblastos se cultivaron en placas de 24 pocillos y se trataron con oligonucleótidos antisentido complementarios al antisentido natural de SCN1A a 20 nM. (panel c: CUR-1740; d: CUR-1770; c: CUR-1916) y a 0 nM (b). Las células se tiñeron para SCN1A (b-e) mediante inmunohistoquímica indirecta utilizando un anticuerpo anti-SCN1A (Abeam cat # ab24820) y una tinción/amplificación de anticuerpo secundario con el procedimiento avidina/biotina (Vector Laboratories cat # SP-2001; Vector Laboratories cat # PK-6101; Vector Laboratories cat # SK-4105); panel a - control negativo, se usó un anticuerpo anti-ratón de conejo como anticuerpo primario seguido del mismo procedimiento de tinción que en los paneles b-e.

La figura 11 muestra la regulación positiva de la proteína SCN1A en células SK-N-AS tratadas con oligonucleótidos antisentido complementarios al antisentido natural de SCN1A. Las células SK-N-AS se cultivaron en placas de 24 pocillos y se trataron con oligonucleótidos a 20 nM (c: CUR-1740; d: CUR-1764; e: CUR-1770; f: CUR-1916) y a (b: 0 nM). Las células SK-N-AS se tiñeron para SCN1A (b-f) mediante inmunohistoquímica indirecta usando un anticuerpo anti-SCN1A (Abcam cat # ab24820) y tinción/amplificación de anticuerpos secundarios usando el procedimiento de avidina/biotina (Vector Laboratories cat # SP-2001; Vector Laboratories cat # PK-6101; Vector Laboratories cat # SK-4105); como control negativo, se usó un anticuerpo anti-ratón de conejo como anticuerpo primario seguido del mismo procedimiento de tinción que en los paneles b-f (panel a).

La figura 12 muestra la regulación positiva de la proteína SCN1A en células Vero 76 tratadas con oligonucleótidos antisentido complementarios al antisentido natural de SCN1A. Se cultivaron células Vero 76 en placas de 24 pocillos y se trataron con oligonucleótidos antisentido complementarios al antisentido natural SCN1A a 2,0 nM (c: CUR-1740; d: CUR-1945; e: CUR-1770; f: CUR-1916; g: CUR-1924) y a 0 nM. (b). Las células Vero 76 se tiñeron para SCN1A (b-f) mediante inmunohistoquímica indirecta usando un anticuerpo anti-SCN1A (Abcam cat # ab24820) y tinción/amplificación de anticuerpos secundarios con el procedimiento de avidina/biotina (Vector Laboratories cat # SP-2001; Vector Laboratories cat # # PK-6101; Vector Laboratories cat # SK-4105); panel a - como control negativo, se utilizó un anticuerpo de conejo anti-ratón como anticuerpo primario seguido del mismo procedimiento de tinción que en los paneles b-g.

La figura 13 muestra que los oligonucleótidos que se dirigen a la transcripción antisentido natural específico de SCN1A que regulan positivamente el ARNm de SCN1A no regulan positivamente la actina en las células Vero76. Los mismos oligonucleótidos antisentido (CUR-1740, CUR-1838, CUR-1924) dirigidos a la transcripción antisentido natural específico de SCN1A que se mostró en los Ejemplos 5 y 12 para regular positivamente el ARNm y la proteína de SCN1A se probaron para determinar su efecto sobre la expresión del ARNm de beta-actina en células Vero 76. Los datos confirman que los oligonucleótidos que se dirigen a la transcripción antisentido natural específico de SCN1A no regulan positivamente un gen no relacionado como la actina. Las barras indicadas como CUR-1740, CUR-1838 y CUR-1924 se corresponden con muestras tratadas con SEQ ID NOS: 45, 62 y 78 respectivamente.

La figura 14 muestra que el oligonucleótido que se dirige a la transcripción antisentido natural específico de SCN1A que se muestra que regula positivamente el ARNm de SCN1A y la proteína no regula positivamente la actina en los fibroblastos que llevan una mutación asociada a Dravet. Los oligonucleótidos (CUR-1916, CUR-1945) dirigidos a la transcripción antisentido natural específico de SCN1A que se mostró en los Ejemplos 2 y 7 para regular positivamente el ARNm y la proteína de SCN1A se probaron para determinar su efecto sobre la expresión del ARNm de actina en fibroblastos que portaban una mutación asociada a Dravet. Los datos siguientes confirman que los oligonucleótidos que se dirigen a la transcripción antisentido natural específico de SCN1A no regulan positivamente un gen no relacionado como la actina. Las barras indicadas como CUR-1916 y CUR-1945 se corresponden con muestras tratadas con SEQ ID NOS: 70 y 93 respectivamente.

La Figura 15 muestra que los oligonucleótidos que se dirigen a la transcripción antisentido natural específico de SCN1A que se ha demostrado que regulan positivamente el ARNm y la proteína de SCN1A no regulan positivamente la actina en las células SK-N-AS. Los mismos oligonucleótidos antisentido (CUR-1740, CUR-1770, CUR-1916, CUR-1764, CUR-1838) que se mostraron en los Ejemplos para regular positivamente el ARNm y la proteína de SCN1A se probaron para determinar su efecto sobre la expresión del ARNm de actina en células SK-N- AS. Los datos confirman que los oligonucleótidos que se dirigen a la transcripción antisentido natural específico de SCN1A no regulan positivamente un gen no relacionado como la actina. Las barras indicadas como CUR-1740, CUR-1770, CUR-1916, CUR-1764 y CUR-1838 corresponden a muestras tratadas con SEQ ID NOS: 45, 57, 70, 52 y 62 respectivamente.

La figura 16 muestra la tinción de la proteína actina en células SK-N-AS tratadas con oligonucleótidos antisentido complementarios al antisentido natural de SCN1A. Se cultivaron células SK-N-AS en placas de 24 pocillos y se trataron con oligonucleótidos a 20 nM (b: CUR-1740; c: CUR-1764; d: CUR-1770; e: CUR-1916) y a 0 nM (a). Las células SK-N-AS se tiñeron para actina (a-e) mediante inmunohistoquímica indirecta usando un anticuerpo anti-actina (Abcam cat # ab1801) y tinción/amplificación de anticuerpos secundarios usando el procedimiento avidina/biotina (Vector Laboratories cat # SP-2001; Vector Laboratories cat # PK-6101; Vector Laboratories cat # SK-4105).

La figura 17 muestra la tinción de la proteína actina en células Vero 76 tratadas con oligonucleótidos antisentido complementarios al antisentido natural de SCN1A. Se cultivaron células Vero 76 en placas de 24 pocillos y se trataron con oligonucleótidos antisentido complementarios al antisentido natural de SCN1A a 20 nM (b: CUR-1740; c: CUR-1770; d: CUR-1916; e: CUR-1924; f: CUR-1945) y a 0 nM. (a). Las células Vero 76 se tiñeron para la actina (b-f) mediante inmunohistoquímica indirecta utilizando un anticuerpo anti-actina (Abcam cat # ab1801) y tinción/amplificación de anticuerpos secundarios con el procedimiento avidina/biotina (Vector Laboratories cat # SP-2001; Vector Laboratories cat # # PK-6101; Vector Laboratories cat # SK-4105); panel a - control negativo, se utilizó un anticuerpo anti-ratón de conejo como anticuerpo primario seguido del mismo procedimiento de tinción que en los paneles b-g.

La figura 18 muestra la regulación positiva de la proteína actina en fibroblastos que portan una mutación del síndrome de Dravet tratados con oligonucleótidos antisentido complementarios al antisentido natural de SCN1A. Los fibroblastos se cultivaron en placas de 24 pocillos y se trataron con oligonucleótidos antisentido complementarios al antisentido natural s Cn 1A a 20 nM (panel b: CUR-1740; c: CUR-1764; d: CUR-1770; e: CUR-1838 y f: CUR- 1916) y a 0 nM (a). Las células se tiñeron para actina (a-f) mediante inmunohistoquímica indirecta utilizando un anticuerpo anti-actina (Abcam cat # ab1801) y una tinción/amplificación de anticuerpo secundario con el procedimiento de avidina/biotina (Vector Laboratories cat # SP-2001; Vector Laboratories cat # PK-6101; Vector Laboratories cat # SK-4105).

La Figura 19 muestra la regulación positiva de la proteína SCN1A en fibroblastos que portan una mutación del síndrome de Dravet tratados con oligonucleótidos antisentido complementarios al antisentido natural SCN1A cuantificado usando ELISA. Los fibroblastos se trataron con oligonucleótidos complementarios al antisentido natural de SCN1A a 0 u 80 nM. Después de 48 h, las células se transfirieron a una placa de 96 pocillos durante 24 h, antes de fijarlas y utilizarlas para ELISA de SCN1A y actina. Las lecturas de DO para la señal de SCN1A se normalizaron a la señal de actina para la misma condición experimental. La señal de SCN1A normalizada en células dosificadas con 0 nM de oligonucleótido se usó como línea de base (100 %). Las barras indicadas como CUR-1740, CUR-1770 y CUR-1916 se corresponden con muestras tratadas con SEQ ID NOS: 45, 57 y 70 respectivamente.

La Figura 20 muestra la regulación positiva de la proteína SCN1A en células Vero76 tratadas con oligonucleótidos antisentido complementarios al antisentido natural SCN1A cuantificado usando ELISA. Las células Vero76 se trataron con oligonucleótidos antisentido complementarios al antisentido natural de SCNIA a 0 u 80 nM. Después de 48 h, las células se transfirieron a una placa de 96 pocillos durante 24 h antes de fijarlas y usarlas para ELISA de SCN1A y actina. Las lecturas de DO para la señal de SCN1A se normalizaron a la señal de actina para la misma condición experimental. La señal de SCN1A normalizada en células dosificadas con 0 nM de oligonucleótido se usó como línea de base (100 %). Las barras indicadas como CUR-1740, CUR-1770, CUR-1916, CUR-1924, CUR-1945 corresponden a muestras tratadas con SEQ ID NOS: 45, 57, 70, 78 y 93 respectivamente.

La Figura 21 muestra la regulación positiva de la proteína SCN1A en células SK-N-AS tratadas con oligonucleótidos complementarios al antisentido natural de SCN1A cuantificado usando ELISA. Se trataron células SK-N-AS con oligonucleótidos antisentido complementarios al antisentido natural SCN1A a 0 o 20 nM. Después de 48 h, las células se transfirieron a una placa de 96 pocillos durante 24 h, antes de fijarlas y utilizarlas para ELISA de SCN1A y actina. Las lecturas de DO para la señal de SCN1A se normalizaron a la señal de actina para la misma condición experimental. La señal de SCN1A normalizada en células dosificadas con 0 nM de oligonucleótido se usó como línea de base (100 %). Las barras indicadas como CUR-1740, CUR-1770, CUR-1924, CUR-1945 corresponden a muestras tratadas con SEQ ID NOS: 45, 57, 78 y 93 respectivamente.

La Figura 22 muestra los productos de una segunda ronda de PCR de una RACE 3' de la transcripción antisentido natural de SCN1A B0724147. Se realizó una RACE 3' sobre: a) ARN total de células HcpG2 con adenosina añadida; b - ARN poli A aislado de células HcpG2; c - en el ARN total de fibroblastos humanos primarios que llevan una mutación asociada al síndrome de Dravet con adenosina añadida; d en ARN poli A aislado de fibroblastos humanos primarios portadores de una mutación asociada al síndrome de Dravet. La figura representa un negativo de un gel de agarosa al 1 %/1xTAE teñido con GelRed (GenScript, cat # M00120). La flecha muestra una banda común para las células HcpG2 y los fibroblastos humanos primarios que llevan una mutación asociada al síndrome de Dravet, lo que demuestra la presencia de la transcripción antisentido natural BG724147 en estas células.

Descripción del listado de secuencias- SEQ ID NO: 1: canal de sodio de Homo sapiens, dependiente de voltaje, tipo 1, subunidad alfa (SCN1A), variante de transcripción 1, ARNm (Número de acceso NCBI: Nm_001165963); SEQ ID NO: 2: canal de sodio de Homo sapiens, dependiente de voltaje, tipo II, subunidad alfa (SCN2A), variante de transcripción 1, ARNm (N° de acceso NCBI: NM_021007); Se Q ID NO: 3: canal de sodio de Homo sapiens, dependiente de voltaje, tipo III, subunidad alfa (SCN3A), variante de transcripción 1, ARNm (N° de acceso NCBI: n M_006922); SEQ ID NO: 4: canal de sodio de Homo sapiens, dependiente de voltaje, tipo IV, subunidad alfa (SCN4A), ARNm (No de acceso NCBI: NM_000334); SEQ ID NO: 5: canal de sodio de Homo sapiens, dependiente de voltaje, tipo V, subunidad alfa (SCN5A), variante de transcripción 1, ARNm (No de acceso Nc Bi.: NM_198056); SEQ ID NO: 6: canal de sodio de Homo sapiens, dependiente de voltaje, tipo VII, alfa (SCN7A), ARNm (No de acceso NCBI.: NM_002976); SEQ ID NO: 7: canal de sodio de Homo sapiens, dependiente de voltaje, tipo VII, subunidad alfa (SCN8A), variante de transcripción 1, ARNm (N° de acceso NCBI: n M_014191); SEQ iD NO: 8: canal de sodio de Homo sapiens, dependiente de voltaje, tipo IX, subunidad alfa (SCN9A), ARNm (No de acceso NCBI: NM_002977); SEQ ID NO: 9: canal de sodio de Homo sapiens, dependiente de voltaje, tipo X, subunidad alfa (SCN10A), ARNm (No de acceso NCBI.: NM_006514); SEQ ID NO: 10: canal de sodio de Homo sapiens, dependiente de voltaje, tipo XI, subunidad alfa (SCN11A), ARNm (No de acceso NCBI: NM_014139); SEQ ID NO: 11: ARNm de la subunidad alfa de canal de sodio regulado por voltaje de Homo sapiens SCN12A (SCN12A), cds completos (No de acceso NCBI: AF109737); SEQ ID NO: 12: secuencia antisentido de SCN1A natural (BG724147 extendida); SEQ ID NO: 13: secuencia antisentido de SCN1A natural (Hs, 662210); SEQ ID NO: 14: secuencia antisentido de SCN1A natural (AA383040); SEQ ID NO: 15: secuencia antisentido de SCN1A natural (BC029452); SEQ ID NO; 16: Secuencia antisentido de SCN1A natural (AA630035); SEQ ID NO: 17: secuencia antisentido de SCN1A natural (BE566126); SEQ ID NO: 18: secuencia antisentido de SCN1A natural (BF673100); SEQ ID NO: 19: secuencia antisentido de SCN1A natural (BG181807); SEQ ID NO: 20: secuencia antisentido de SCNIA natural (BG183871); SEQ ID NO; 21: Secuencia antisentido de SCN1A natural (BG215777); SEQ ID NO: 22: secuencia antisentido de SCN1A natural (BG227970); SEQ ID NO: 23: secuencia antisentido de SCN1A natural (BM905527); SEQ ID NO: 24: secuencia antisentido de SCN1A natural (BU180772); SEQ ID NO: 25; Secuencia antisentido de SCN1A Natural de Ratón (BG724147 ExtRatón); SEQ ID NO: 26: secuencia antisentido de SCN1A Natural de Ratón (Hs.662210mouseAS1); SEQ ID NO: 27: secuencia antisentido de SCN1A Natural de Ratón (Hs.662210mouseAS2); SEQ ID NO: 28: secuencia antisentido de SCN1A Natural de Ratón (Hs.662210mouseAS3); SEQ ID NOS: 29 a 94: oligonucleótidos antisentido. SEQ ID NO: 95 y 96 son los complementos inversos de los oligonucleótidos antisentido SEQ ID NO: 58 y 59 respectivamente, * indica un enlace fosfotioato, indica ANB, 'r' indica RNA y 'm' indica un grupo metilo en el átomo de oxígeno 2' en el resto de azúcar designado del oligonucleótido.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

A continuación se describen varios aspectos de la descripción con referencia a aplicaciones de ejemplo para ilustración. Debe entenderse que los numerosos detalles, relaciones y procedimientos específicos se exponen para proporcionar un entendimiento completo de la divulgación. Un experto en la técnica pertinente, sin embargo, reconocerá fácilmente que la divulgación puede ponerse en práctica sin uno o más de los detalles específicos o con otros procedimientos. La presente divulgación no está limitada por el orden de actos o acontecimientos, ya que algunos actos pueden producirse en diferentes órdenes y/o simultáneamente con otros actos o acontecimientos. Además, no se requieren todos los actos o acontecimientos ilustrados para implementar una metodología según la presente descripción.

Todos los genes, nombres de genes, y productos génicos divulgados en esta invención pretenden corresponderse a homólogos de cualquier especie para los cuales las composiciones y procedimientos divulgados en esta invención son aplicables. Así, los términos incluyen, pero no se limitan a, genes y productos génicos de seres humanos y ratones. Se entiende que cuando se describe un gen o producto génico de una especie particular, esta descripción pretende ser solo ejemplar, y no debe interpretarse como una limitación a menos que el contexto donde aparece lo indique claramente. Así, por ejemplo, para los genes descritos en esta invención, que en algunos aspectos se relacionan con el ácido nucleico de mamíferos y secuencias de aminoácidos se pretende que abarquen genes homólogos y/u ortólogos y productos génicos de otros animales que incluyen, pero no se limitan a, otros mamíferos, peces, anfibios, reptiles y aves. En un aspecto, los genes o secuencias de ácidos nucleicos son humanos.

Definiciones

La terminología utilizada en esta invención tiene el objetivo de describir solo aspectos particulares y no pretende limitar la descripción. Tal como se utilizan en esta invención, se pretende que las formas en singular “un”, “uno”, “una”, “el” y “la” incluyan también las formas plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Además, en la medida en que las expresiones "que incluye", "incluye", "que tiene", "tiene", "con", o variantes de las mismas se usan en la descripción detallada y/o en las reivindicaciones, dichas expresiones pretenden ser inclusivas de una manera similar a la expresión "que comprende".

El término “aproximadamente” significa dentro de un intervalo de error aceptable para el valor particular como se ha determinado por un experto habitual en la materia, que dependerá en parte de cómo se mide o determina el valor, es decir, las limitaciones del sistema de medición. Por ejemplo, "aproximadamente" puede significar dentro de 1 o más de 1 desviación estándar, segúnn la práctica en la técnica. Como alternativa, "aproximadamente" puede significar un intervalo de hasta el 20 %, preferiblemente hasta el 10 %, más preferiblemente hasta el 5 %, y aún más preferiblemente hasta el 1 % de un valor dado. Como alternativa, en particular con respecto a los sistemas o procedimientos biológicos, el término puede significar dentro de un orden de magnitud de un valor, preferiblemente comprendido en 5 veces y más preferiblemente, comprendido en 2 veces. En los casos en que se describen valores particulares en la solicitud y las reivindicaciones, a menos que se indique lo contrario, el término "aproximadamente" significa que debe asumirse un intervalo de error aceptable para el valor particular.

Como se usa en esta invención, el término "ARNm" significa la o las transcripciones de ARNm actualmente conocidas de un gen dirigido, y cualquier transcripción adicional que pueda ser dilucidado.

Por "oligonucleótidos antisentido" o "compuesto antisentido" se entiende una molécula de ARN o de ADN que se une a otro ARN o ADN (ARN, ADN diana). Por ejemplo, si éste es un oligonucleótido de ARN, se une a otra diana de ARN por medio de interacciones ARN-ARN y altera la actividad del ARN diana. Un oligonucleótido antisentido puede regular positivamente o regular negativamente la expresión y/o función de un polinucleótido particular. La definición pretende comprender cualquier molécula de ARN o a Dn extraña que es útil desde un punto de vista terapéutico, de diagnóstico u otro. Dichas moléculas incluyen, por ejemplo, moléculas de ARN o ADN antisentido, ARN de interferencia (ARNi), micro ARN, moléculas de ARN señuelo, siRNA, ARN enzimático, ARN de edición terapéutica y ARN agonista y antagonista, compuestos oligoméricos antisentido, oligonucleótidos antisentido, oligonucleótidos de secuencia guía externa (EGS), splicings alternativos, cebadores, sondas y otros compuestos oligoméricos que se hibridan a al menos una parte del ácido nucleico diana. Como tales, estos compuestos pueden introducirse en forma de compuestos oligoméricos monocatenarios, bicatenarios, parcialmente monocatenarios, o circulares.

En el contexto de esta divulgación, el término "oligonucleótido" se refiere a un oligómero o polímero de ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN) o miméticos de los mismos. El término “oligonucleótido” también incluye oligómeros lineales o circulares de monómeros o enlaces naturales y/o modificados, que incluyen desoxirribonucleósidos, ribonucleósidos, formas sustituidas y alfa-anómeras de los mismos, ácidos nucleicos peptídicos (ANP), ácidos nucleicos bloqueados (ANB), fosforotioato, metilfosfonato y similares. Los oligonucleótidos son capaces de unirse específicamente a un polinucleótido diana por medio de un patrón regular de interacciones monómero a monómero, tales como tipo de apareamiento de bases de Watson-Crick, tipos de apareamiento de bases de Hoogsteen o Hoogsteen inversa, o similares.

El oligonucleótido puede ser "quimérico", es decir, estar compuesto por diferentes regiones. En el contexto de esta divulgación los compuestos "quiméricos" son oligonucleótidos, que contienen dos o más regiones químicas, por ejemplo, una o más regiones de ADN, una o más regiones de a Rn , una o más regiones de ANP, etc. Cada región química está compuesta por al menos un conjunto monomérico, es decir, un nucleótido en el caso de un compuesto de oligonucleótidos. Estos oligonucleótidos normalmente comprenden al menos una región donde el oligonucleótido se modifica con el fin de presentar una o más propiedades deseadas. Las propiedades deseadas del oligonucleótido incluyen, entre otras, por ejemplo, resistencia incrementada a la degradación por nucleasas, captación celular incrementada, y/o afinidad de unión incrementada para el ácido nucleico diana. Las diferentes regiones del oligonucleótido pueden, por lo tanto, tener diferentes propiedades. Los oligonucleótidos quiméricos de la presente descripción pueden formarse como estructuras mixtas de dos o más oligonucleótidos, oligonucleótidos modificados, oligonucleósidos y/o análogos de oligonucleótidos, como se ha descrito anteriormente.

El oligonucleótido puede estar compuesto de regiones que pueden enlazarse en “registro”, es decir, cuando los monómeros se enlazan consecutivamente, como en ADN nativo, o se enlazan mediante espaciadores. Se pretende que los espaciadores constituyan un «puente» covalente entre las regiones y tengan, en casos preferidos, una longitud que no supere aproximadamente los 100 átomos de carbono. Los espaciadores pueden portar diferentes funcionalidades, por ejemplo, tener carga positiva o negativa, portar propiedades de unión a ácido nucleico especiales (intercaladores, aglutinantes de surcos, toxinas, fluoróforos, etc.), ser lipófilos, inducir estructuras secundarias especiales como, por ejemplo, péptidos que contienen alanina que inducen hélices alfa.

Como se usa en esta invención, "SCN1A" incluye todos los miembros de la familia, mutantes, alelos, fragmentos, especies, secuencias codificantes y no codificantes, cadenas de polinucleótidos con sentido y antisentido, etc. De manera similar, SCN2A-SCN12A incluye todos los mutantes, alelos, fragmentos, etc.

Como se usa en esta invención, las palabras 'Canal de sodio, controlado por voltaje, tipo I, subunidad alfa', SCN1A, FEB3, FEB3A, GEFSP2, HBSCI, NACI, Nav1.1, SCN1, SME1, Proteína del canal de sodio subunidad alfa del cerebro I, proteína del canal de sodio tipo I subunidad alfa, proteína del canal de sodio tipo I subunidad alfa y la subunidad alfa del canal de sodio dependiente de voltaje alfa Nav1.1, se consideran iguales en la bibliografía y se usan indistintamente en la presente solicitud..

Tal como se usa en esta invención, la expresión “oligonucleótido específico para” u “oligonucleótido que se dirige a” se refiere a un oligonucleótido que tiene una secuencia (i) capaz de formar un complejo estable con una parte del gen elegido como diana, o (ii) capaz de formar un dúplex estable con una parte de una transcripción de ARNm del gen elegido como diana. La estabilidad de los complejos y los dúplex puede determinarse mediante cálculos teóricos y/o ensayos in vitro. Los ensayos ejemplares para determinar la estabilidad de los complejos y dúplex de hibridación se describen en los ejemplos más adelante.

Tal como se usa en esta invención, la expresión “ácido nucleico diana” engloba ADN, ARN (que comprende pre-ARNm y ARNm) transcrito a partir de dicho ADN, y también ADNc derivado de dicho ARN, secuencias codificantes, no codificantes, polinucleótidos sentido o antisentido. La hibridación específica de un compuesto oligomérico con su ácido nucleico diana interfiere en la función normal del ácido nucleico. Esta modulación de la función de un ácido nucleico diana por compuestos, que se hibridan específicamente con él, se denomina generalmente “antisentido”. Las funciones de ADN con las que interferirán incluyen, por ejemplo, la replicación y transcripción. Las funciones del ARN a interferir incluyen todas las funciones vitales tales como, por ejemplo, la translocación del ARN al sitio de traducción de proteína, la traducción de proteína del ARN, el splicing del ARN para producir una o más especies de ARNm, y la actividad catalítica que pueda ser acoplada o facilitada por el ARN. El efecto global de dicha interferencia con las funciones del ácido nucleico diana es la modulación de la expresión de un producto codificado u oligonucleótidos.

La interferencia de ARN "ARNi" está mediada por moléculas de ARN bicatenario (dsARN) que tienen homología específica de secuencia con sus secuencias de ácido nucleico "diana". En ciertos aspectos de la presente divulgación, los mediadores son dúplex de ARN "de interferencia pequeña" (siRNA) de 5-25 nucleótidos. Los ARNip se derivan a partir del procesamiento del ARNdc mediante una enzima conocida como Dicer. Los productos dúplex son reclutados en un ARNip multiproteína denominado RISC (complejo de silenciamiento inducido por ARN). Sin desear ceñirse a ninguna teoría particular, se cree entonces que un RISC es guiado a un ácido nucleico diana (adecuadamente ARNm), en el que el dúplex de ARNip interactúa de una forma específica de secuencia para mediar en la escisión en un modo catalítico. Los ARN de interferencia pequeños que pueden usarse según la presente divulgación pueden sintetizarse y usarse según procedimientos que son bien conocidos en la técnica y que serán familiares para el experto en la materia. Los ARN de interferencia pequeña para su uso en los procedimientos de la presente divulgación comprenden adecuadamente entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 nucleótidos (nt). En los ejemplos de aspectos no limitantes, los siRNA pueden comprender de aproximadamente 5 a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 nt, o aproximadamente 20-25 nucleótidos.

La selección de oligonucleótidos adecuados se facilita usando programas informáticos que alinean automáticamente secuencias de ácido nucleico e indican regiones de identidad u homología. Dichos programas se usan para comparar secuencias de ácidos nucleicos obtenidas, por ejemplo, buscando en bases de datos tales como GenBank o secuenciando productos de PCR. La comparación de secuencias de ácidos nucleicos de un intervalo de especies permite la selección de secuencias de ácidos nucleicos que muestran un grado de identidad apropiado entre especies. En el caso de genes que no han sido secuenciados, se realizan Southern blots para permitir una determinación del grado de identidad entre genes en especies diana y otras especies. Realizando Southern blots a grados de astringencia variables, tal como es muy conocido en la técnica, es posible obtener una medida aproximada de la identidad. Estos procedimientos permiten la selección de oligonucleótidos que muestran un alto grado de complementariedad con secuencias de ácido nucleico diana en un sujeto a controlar y un menor grado de complementariedad con secuencias de ácido nucleico correspondientes en otras especies. Un experto en la materia se dará cuenta de que hay una libertad considerable en la selección de regiones adecuadas de genes para su uso en la presente descripción.

Por "ARN enzimático" se entiende una molécula de ARN con actividad enzimática (Cech, (1988) J. American. Med. Assoc. 260, 3030-3035), Los ácidos nucleicos enzimáticos (ribozimas) actúan uniéndose primero a un ARN diana.

Dicha unión se produce a través de la parte de unión diana de un ácido nucleico enzimático que se mantiene en estrecha proximidad a una parte enzimática de la molécula que actúa para escindir el ARN diana. De este modo, el ácido nucleico enzimático reconoce primero y a continuación se une a ARN diana mediante apareamiento de bases, y una vez unido al sitio correcto, actúa enzimáticamente para cortar el ARN diana.

Por "ARN señuelo" se entiende una molécula de ARN que imita el dominio de unión natural para un ligando. El ARN señuelo compite, por lo tanto, con la diana de unión natural para la unión de un ligando específico. Por ejemplo, se ha mostrado que la sobreexpresión de ARN de respuesta de activación en trans (TAR) de HIV puede actuar como un "señuelo" y se une de forma eficiente a la proteína tat de HIV, impidiendo de este modo que se una a secuencias TAR codificadas por el ARN de HIV Este pretende ser un ejemplo específico. Los expertos en la materia reconocerán que esto es solo un ejemplo, y fácilmente pueden generarse otros aspectos usando técnicas generalmente conocidas en la técnica.

Tal como se usa en esta invención, el término "monómeros" normalmente indica monómeros enlazados por enlaces fosfodiéster o análogos de los mismos para formar oligonucleótidos que varían en tamaño entre unas pocas unidades monoméricas, por ejemplo, entre aproximadamente 3-4, y aproximadamente varios cientos de unidades monoméricas. Los análogos de enlaces fosfodiéster incluyen: fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonatos, fosforoselenoato, fosforamidato y similares, tal como se describe con mayor detalle más adelante.

El término “nudeótido” incluye nucleótidos que existen de forma natural, además de nucleótidos que no existen de forma natural. Debe ser evidente para el experto en la materia que diversos nucleótidos que se consideraron anteriormente “no de origen natural” se han descubierto posteriormente en la naturaleza. De este modo, "nucleótidos" incluye no solamente las moléculas que contienen heterociclos de purina y pirimidina conocidas, sino también análogos heterocídiclicos y tautómeros de las mismas. Ejemplos ilustrativos de otros tipos de nucleótidos son moléculas que contienen adenina, guanina, timina, citosina, uracilo, purina, xantina, diaminopurina, 8-oxo- N6-metiladenina, 7-deazaxantina, 7-deazaguanina, N4,N4-etanocitosina, N6,N6-etano-2,6- diaminopurina, 5-metilcitosina, 5-(C3-C6)-alquinilcitosina, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, seudoisocitosina, 2-hidroxi-5-metil-4-triazolopiridina, isocitosina, isoguanina, inosina y los nucleótidos "de origen no natural" descritos en Benner y col., Pat. EE. UU. N.° 5.432.272. El término "nucleótido" pretende cubrir todos y cada uno de estos ejemplos, además de análogos y tautómeros de los mismos. Nucleótidos especialmente interesantes son aquellos que contienen adenina, guanina, timina, citosina y uracilo, que se consideran como los nucleótidos de origen natural en relación con la aplicación terapéutica y diagnóstica en seres humanos. Los nucleótidos incluyen los azúcares naturales 2'-desoxi y 2'-hidroxilo, por ejemplo, como se describe en Kornberg y Baker, DNA Replication, 2a ed. (Freeman, San Francisco, 1992) así como sus análogos.

"Análogos" en referencia a los nucleótidos incluyen nucleótidos sintéticos que tienen restos de base modificados y/o restos de azúcar modificados (ver, por ejemplo, descrito generalmente por Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, Nueva York, 1980; Freier & Altmann, (1997) Nucl. Acid. Res., 25(22), 4429-4443, Toulmé, JJ. (2001) Nature Biotechnology 19:17-18; Manoharan M., (1999) Biochemica et Biophisica Acta 1489:117- 139; Freier S, M., (1997) Nucleic Acid Research, 25:4429-4443, Uhlman, E., (2000) Drug Discovery & Development, 3: 203-213, Herdewin P., (2000) Antisense & Nucleic Acid Drug Dev., 10:297-310); 2'-O, 3'-C-linked [3.2.0] bicycloarabinonucleosides. Dichos análogos incluyen nucleótidos sintéticos diseñados para mejorar propiedades de unión, por ejemplo, la estabilidad, especificidad del dúplex o el tríplex, o similares.

Como se usa en esta invención, "hibridación" significa el apareamiento de cadenas sustancialmente complementarias de compuestos oligoméricos. Un mecanismo de apareamiento implica la formación de puentes de hidrógeno, que pueden ser puentes de hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteen o de Hoogsteen inverso, entre bases de nucleósidos o de nucleótidos (nucleótidos) complementarias de las cadenas de compuestos oligoméricos. Por ejemplo, la adenina y la timina son nucleótidos complementarios que se aparean mediante la formación de puentes de hidrógeno. La hibridación puede producirse en circunstancias variables.

Un compuesto antisentido es "específicamente hibridable" cuando la unión del compuesto al ácido nucleico diana interfiere con la función normal del ácido nucleico diana para causar una modulación de la función y/o actividad, y existe un grado suficiente de complementariedad para evitar la unión no específica del compuesto antisentido a las secuencias de ácido nucleico no diana en condiciones en las que se desea la unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapéutico, y en condiciones en las que se realizan ensayos en el caso de ensayos in vitro.

Como se usa en esta invención, la frase "condiciones de hibridación astringentes" o "condiciones astringentes" se refiere a condiciones en las que un compuesto de la descripción se hibridará con su secuencia diana, pero con un número mínimo de otras secuencias. Las condiciones rigurosas son dependientes de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias y en el contexto de esta descripción, las "condiciones astringentes" en las que los compuestos oligoméricos se hibridan con una secuencia diana se determinan mediante la naturaleza y la composición de los compuestos oligoméricos y los ensayos en los que están siendo investigados. En general, las condiciones de hibridación astringentes comprenden bajas concentraciones (<0,15 M) de sales con cationes inorgánicos tales como Na++ o K++ (es decir, baja fuerza iónica), temperatura superior a 20 °C ~ 25 °C por debajo de la Tm del complejo de compuesto oligomérico: secuencia diana, y la presencia de desnaturalizantes tales como formamida, dimetilformamida, dimetilsulfóxido, o el detergente dodecilsulfato de sodio (SDS). Por ejemplo, la tasa de hibridación disminuye 1,1 % por cada 1 % de formamida. Un ejemplo de una condición de hibridación de alta astringencia es 0,1X tampón cloruro sódico-citrato sódico (SSC)/0,1 % (peso/volumen) de SDS a 60 °C durante 30 minutos.

"Complementario", como se usa en esta invención, se refiere a la capacidad para el apareamiento preciso entre dos nucleobases en una o dos cadenas oligoméricas. Por ejemplo, si una nucleobase en cierta posición de un compuesto antisentido es capaz de formar puentes de hidrógeno con una nucleobase en cierta posición de un ácido nucleico diana, siendo dicho ácido nucleico diana un ADN, ARN, o molécula de oligonucleótido, entonces la posición de la formación de puentes de hidrógeno entre el oligonucleótido y se considera que el ácido nucleico diana es una posición complementaria. El compuesto oligomérico y el ADN, ARN, o molécula de oligonucleótido, adicional son complementarios entre sí cuando un número suficiente de posiciones complementarias en cada molécula están ocupadas por nucleótidos que pueden formar puentes de hidrógeno entre sí. De este modo, "específicamente hibridable" y "complementariedad" son expresiones que se usan para indicar un grado suficiente de apareamiento preciso o complementariedad sobre un número suficiente de nucleótidos de modo que se produzca unión estable y específica entre el compuesto oligomérico y un ácido nucleico diana.

Se entiende en la técnica que no es necesario que la secuencia de un compuesto oligomérico sea un 100 % complementaria a la de su ácido nucleico diana para ser específicamente hibridable. Además, un oligonucleótido puede hibridarse sobre uno o más segmentos, de modo que los segmentos intermedios o adyacentes no estén implicados en el acontecimiento de hibridación (por ejemplo, una estructura en bucle, un desapareamiento o una estructura de horquilla). Los compuestos oligoméricos de la presente divulgación comprenden al menos aproximadamente el 70 %, o al menos aproximadamente el 75 %, o al menos aproximadamente el 80 %, o al menos aproximadamente el 85 %, o al menos aproximadamente el 90 %, o al menos aproximadamente el 95 %, o al menos aproximadamente el 99 %, de complementariedad de secuencia con una región diana dentro de la secuencia de ácidos nucleicos diana a la que se dirigen. Por ejemplo, un compuesto antisentido en el que 18 de los 20 nucleótidos del compuesto antisentido son complementarios a una región diana y, por lo tanto, hibridarían específicamente, representaría el 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, los nucleótidos no complementarios restantes pueden agruparse o intercalarse con nucleótidos complementarios y no necesitan ser contiguos entre sí o a nucleótidos complementarios. Por lo tanto, un compuesto antisentido que tiene 18 nucleótidos de longitud que tiene 4 (cuatro) nucleótidos no complementarios que están flanqueados por dos regiones de complementariedad completa con el ácido nucleico diana tendría el 77,8 % de complementariedad global con el ácido nucleico diana y de este modo estaría dentro del alcance de la presente divulgación. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una región de un ácido nucleico diana puede determinarse de forma rutinaria usando programas BLAST (herramientas básicas de búsqueda de alineación local) y programas PowerBLAST conocidos en la técnica. El porcentaje de homología, identidad de secuencia o complementariedad se puede determinar, por ejemplo, mediante el programa Gap (Paquete de Análisis de Secuencias de Wisconsin. Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), utilizando la configuración predeterminada, que utiliza el algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., (1981) 2, 482-489).

Tal como se usa en esta invención, la expresión "punto de fusión térmico (Tm)" se refiere a la temperatura, bajo fuerza iónica, pH y concentración de ácido nucleico definidas, a la que el 50 % de los oligonucleótidos complementarios a la secuencia diana hibridan con la secuencia diana en equilibrio. Típicamente, condiciones astringentes serán aquellas en las que la concentración de sales es la concentración de ion Na (u otras sales) de al menos aproximadamente 0,01 a 1,0 M a pH de 7,0 a 8,3 y la temperatura es al menos aproximadamente 30°C para oligonucleótidos cortos (por ejemplo, de 10 a 50 nucleótidos). También pueden lograrse condiciones astringentes con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida.

Como se usa en esta invención, "modulación" significa un incremento (estimulación) o una disminución (inhibición) de la expresión de un gen.

El término "variante", cuando se usa en el contexto de una secuencia de polinucleótidos, puede abarcar una secuencia de polinucleótidos relacionada con un gen de tipo silvestre. Esta definición también puede comprender, por ejemplo, variantes «alélicas», de «splicing», de «especie» o «polimórficas». Una variante de splicing puede tener identidad significativa con una molécula de referencia, pero generalmente tendrá un mayor o menor número de polinucleótidos debido al splicing alterno de exones durante el procesamiento de ARNm. El polipéptido correspondiente puede poseer dominios funcionales adicionales o una ausencia de dominios. Las variantes de especie son secuencias polinucleotídicas que varían de una especie a otra. Son de particular utilidad en la descripción las variantes de productos génicos de tipo silvestre. Las variantes pueden resultar de al menos una mutación en la secuencia de ácidos nucleicos y pueden dar lugar a ARNm alterados o polipéptidos cuya estructura o función puede o no estar alterada. Cualquier gen natural o recombinante dado puede tener ninguna, una o muchas formas alélicas. Cambios mutacionales comunes que dan lugar a variantes se atribuyen generalmente a deleciones, adiciones o sustituciones naturales de nucleótidos. Cada uno de estos tipos de cambios puede producirse solo, o en combinación con los otros, una o más veces en una secuencia dada.

Los polipéptidos resultantes generalmente tendrán una identidad significativa de aminoácidos los unos en relación con los otros. Una variante polimórfica es una variación en la secuencia de polinucleótidos de un gen particular entre individuos de una especie dada. Las variantes polimórficas también pueden englobar "polimorfismos de un solo nucleótido" (SNP), o mutaciones de una sola base en las que la secuencia de polinucleótidos varía en una base. La presencia de SNP puede ser indicativa de, por ejemplo, una determinada población con una propensión por una patología, es decir, la susceptibilidad frente a la resistencia.

Los polinucleótidos derivados incluyen ácidos nucleicos sometidos a modificación química, por ejemplo, sustitución de hidrógeno por un grupo alquilo, acilo o amino. Los derivados, por ejemplo, oligonucleótidos derivados, pueden comprender partes de origen no natural, tales como restos de azúcar alterados o enlaces entre azúcares. Ejemplos de estos son el fosforotioato y otras especies que contienen azufre que son conocidas en la técnica. Los ácidos nucleicos derivados también pueden contener marcadores, que incluyen radionucleótidos, enzimas, agentes fluorescentes, agentes quimioluminiscentes, agentes cromogénicos, sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas y similares.

Un polipéptido o péptido "derivado" es uno que se modifica, por ejemplo, por glucosilación, pegilación, fosforilación, sulfatación, reducción/alquilación, acilación, acoplamiento químico o tratamiento suave con formalina. Un derivado también puede modificarse para contener un marcador detectable, tanto directa como indirectamente, que incluye, pero no se limita a, un radioisótopo, un marcador fluorescente y enzimático.

Como se usa en esta invención, el término "animal" o "paciente" pretende incluir, por ejemplo, seres humanos, ovejas, alces, venados, ciervos, mulos, visones, mamíferos, monos, caballos, ganado vacuno, cerdos, cabras, perros, gatos, ratas, ratones, aves, pollo, reptiles, peces, insectos y arácnidos.

"Mamífero" incluye mamíferos de sangre caliente que típicamente están bajo atención médica (por ejemplo, seres humanos y animales domesticados). Ejemplos incluyen felinos, caninos, equinos, bovinos y seres humanos, además de solo seres humanos.

"Tratar" o "tratamiento" cubre el tratamiento de una patología en un mamífero, e incluye: a) prevenir que se produzca la patología en un mamífero, en particular, cuando dicho mamífero tiene predisposición a la patología, pero todavía no se ha diagnosticado que la tenga; (b) inhibir la patología, por ejemplo, detener el desarrollo; y/o (c) aliviar la patología, por ejemplo, causando la regresión de la patología hasta que se alcance un criterio de valoración deseado. Tratar también incluye la mejora de un síntoma de una enfermedad (por ejemplo, reducir el dolor o molestia), donde dicha mejora puede o no afectar directamente a la enfermedad (por ejemplo, causa, transmisión, expresión, etc.).

Tal como se usa en esta invención "enfermedad o trastorno neurológico" se refiere a cualquier enfermedad o trastorno del sistema nervioso y/o del sistema visual. "Enfermedad o trastorno neurológico" incluye enfermedades o trastornos que implican al sistema nervioso central (cerebro, tronco del encéfalo y cerebelo), el sistema nervioso periférico (incluyendo los nervios craneales), y el sistema nervioso autónomo (partes del cual están ubicadas en el sistema nervioso tanto central como periférico). Una enfermedad o trastorno neurológico incluye, pero sin limitarse a, afasia epileptiforme adquirida; encefalomielitis aguda diseminada; adrenoleucodistrofia; degeneración macular relacionada con la edad; agenesia del cuerpo calloso; agnosia; síndrome de Aicardi; enfermedad de Alexander; enfermedad de Alpers; hemiplejia alternante; enfermedad de Alzheimer; demencia vascular; esclerosis lateral amiotrófica; anencefalia; síndrome de Angelman; angiomatosis; anoxia; afasia; apraxia; quistes aracnoides; aracnoiditis; malformación de Anronl-Chiari; malformación arteriovenosa; síndrome de Asperger; ataxia-telangiectasia; trastorno por déficit de atención con hiperactividad; autismo; disfunción autónoma; dolor de espalda; enfermedad de Batten; enfermedad de Behcet; parálisis de Bell; blefaroespasmo esencial benigno; focal benigna; amiotrofia; hipertensión intracraneal benigna; enfermedad de Binswanger; blefaroespasmo; síndrome de Bloch Sulzberger; lesión del plexo braquial; absceso cerebral; daño cerebral; tumores cerebrales (incluyendo glioblastoma multiforme); tumor espinal; síndrome de Brown-Sequard; enfermedad de Canavan; síndrome del túnel carpiano; causalgia; síndrome de dolor central; mielinólisis pontina central; trastorno cefálico; aneurisma cerebral; arteriosclerosis cerebral; atrofia cerebral; gigantismo cerebral; parálisis cerebral; enfermedad de Charcot-Marie-Tooth; neuropatía inducida por quimioterapia y dolor neuropático; malformación de Chiari; corea; polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica; dolor crónico; síndrome de dolor regional crónico; síndrome de Coffin Lowry; coma, incluyendo estado vegetativo persistente; diplejía facial congénita; degeneración corticobasal; arteritis craneal; craneosinostosis; enfermedad de Creutzfeldt-Jakob; trastornos traumáticos acumulativos; síndrome de Cushing; enfermedad del cuerpo de inclusión citomegálica; infección por citomegalovirus; síndrome de los ojos y pies danzantes; síndrome de Dandy Walker; enfermedad de Dawson; síndrome de De Morsier; parálisis de Dejerine-Klumke; demencia; dermatomiositis; neuropatía diabética; esclerosis difusa; disautonomia de Dravet; disgrafia dislexia; distonias; encefalopatía epiléptica infantil temprana; síndrome de la silla vacía; encefalitis; encefaloceles; angiomatosis encefalotrigeminal; epilepsia; parálisis de Erb; temblor esencial; enfermedad de Fabry; síndrome de Fahr; desmayo; parálisis espástica familiar; convulsiones febriles; síndrome de Fisher; ataxia de Friedreich; demencia fronto-temporal y otras "tanopatías"; enfermedad de Gaucher; síndrome de Gerstmann; arteritis de células gigantes; enfermedad de inclusión celular gigante; leucodistrofia de células globoides; síndrome de Guillain-Barré; mielopatía asociada al HTlV-1; enfermedad de Hallervorden-Spatz; lesión craneal; dolor de cabeza; espasmo hemifacial; paraplejía espástica hereditaria; heredopatía atáctica polineuritiforme; herpes Zoster ótico; herpes Zoster; síndrome de Hirayama; demencia y neuropatía asociada al VIH (también manifestaciones neurológicas del SIDA); holoprosencefalia; enfermedad de Huntington y otras enfermedades de repetición de poliglutamina; hidranencefalia; hidrocefalia; hipercortisolismo; hipoxia; encefalomielitis mediada por inmunidad; miositis del cuerpo de inclusión; incontinentia pigmenti; enfermedad de almacenamiento de ácido fitánico infantil; enfermedad de Refsum infantil; espasmos infantiles; miopatía inflamatoria; quiste intracraneal; hipertensión intracraneal; síndrome de Joubert; síndrome de Keams-Sayre; enfermedad de Kennedy síndrome de Kinsboume; síndrome de Klippel Feil; enfermedad de Krabbe; enfermedad de Kugelberg-Welander; kuru; enfermedad de Lafora; síndrome miasténico de Lambert-Eaton; síndrome de Landau-Kleffner; síndrome medular lateral (Wallenberg); dificultades de aprendizaje; enfermedad de Leigh; síndrome de Lennox-Gustaut; síndrome de Lesch-Nyhan; leucodistrofia; demencia del cuerpo de Lewy; lisencefalia; síndrome de enclaustramiento; enfermedad de Lou Gehrig (es decir, enfermedad de las neuronas motoras o esclerosis lateral amiotrófica); enfermedad del disco lumbar; enfermedad de Lyme - secuelas neurológicas; enfermedad de Machado-Joseph; macrocefalia; megalencefalia; síndrome de Melkersson-Rosenthal; l enfermedad de Meniere; meningitis; enfermedad de Menkes; leucodistrofia metacromática; microcefalia; migraña; síndrome de Miller Fisher; mini-derrames; miopatías mitocondriales; síndrome de Moebius; amiotrofia monomélica; enfermedad de la neuronas motoras; enfermedad de Moyamoya; mucopolisacaridosis; demencia por multi-infarto; neuropatía motora multifocal; esclerosis múltiple y otros trastornos desmielinizantes; atrofia de múltiples sistemas con hipotensión postural; distrofia muscular; miastenia gravis; esclerosis difusa mielinoclástica; encefalopatía mioclónica de lactantes; mioclono; miopatía; miotonía congénita; narcolepsia; neurofibromatosis; síndrome neuroléptico maligno; manifestaciones neurológicas del sida; secuelas neurológicas del lupus; neuromiotonía; lipofuscinosis ceroide neuronal; trastornos de migración neuronal; enfermedad de Niemann-Pick; síndrome de O'sullivan-Mcleod; neuralgia occipital; secuencia de disrafismo espinal oculto; síndrome de Ohtahara; atrofia olivopontocerebelosa; opsoclono mioclono; neuritis óptica; hipotensión ortostática; síndrome de sobreuso; parestesias; enfermedad o trastorno neurodegenerativo (enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), demencia, esclerosis múltiple y otras enfermedades y trastornos asociados con la muerte celular neuronal); paramiotonía congénita; enfermedades paraneoplásicas; ataques paroxísticos; síndrome de Parry Romberg; enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher; parálisis periódicas; neuropatía periférica; neuropatía dolorosa y dolor neuropático; estado vegetativo persistente; trastornos profundos del desarrollo; reflejo estornudo fótico; enfermedad de almacenamiento de ácido fitánico; enfermedad de Pick; nervio pinzado; tumores pituitarios; polimiositis; porencefalia; síndrome post-polio; neuralgia postherpética; encefalomielitis postinfecciosa; hipotensión postural; síndrome de Prader-Willi; esclerosis lateral primaria; enfermedades priónicas; atrofia hemifacial progresiva; leucoencefalopatía multifocal progresiva; poliodistrofía esclerosante progresiva; parálisis supranuclear progresiva; pseudotumor cerebral; síndrome de Ramsay-Hunt (tipos I y II); encefalitis de Rasmussen; síndrome de distrofia simpática refleja; enfermedad de Refsum; trastornos del movimiento repetitivo; lesiones por estrés repetitivo; síndrome de piernas inquietas; mielopatía asociada a retrovirus; síndrome de Rett; síndrome de Reye; baile de San Vito; enfermedad de Sandhoff; enfermedad de Schilder; esquizencefalia; displasia septo-óptica; síndrome del bebé sacudido; herpes; síndrome de Shy-Drager; síndrome de Sjogren; apnea del sueño; síndrome de Soto; espasticidad; espina bífida; lesión de la médula espinal; tumores de la médula espinal; atrofia muscular en la columna; síndrome de Stiff-Person; derrame; síndrome de Sturge-Weber; panencefalitis esclerosante subaguda; encefalopatía arteriosclerótica subcortical; corea de Sydenham; síncope; siringomielia; discinesia tardía; enfermedad de Tay-Sachs; arteritis temporal; síndrome de la médula espinal anclada; enfermedad de Thomsen; síndrome de la salida torácica; tic doloroso; parálisis de Todd; síndrome de Tourette; ataque isquémico transitorio; encefalopatías espongiformes transmisibles; mielitis transversa; lesión cerebral traumática; temblor; neuralgia trigeminal; paraparesia espástica tropical; esclerosis tuberosa; demencia vascular (demencia por múltiples infartos); vasculitis incluyendo arteritis temporal; enfermedad de Von Hippel-Lindau; síndrome de Wallenberg; enfermedad de Werdnig-Hoffman; síndrome de West; latigazo; síndrome de Williams; enfermedad de Wildon; y síndrome de Zellweger y otros trastornos neurológicos enumerados en esta invención.

Una enfermedad o trastorno cardiovascular incluye aquellos trastornos que pueden causar isquemia o son causados por reperfusión del corazón. Los ejemplos incluyen, pero sin limitarse a, aterosclerosis, enfermedad de la arteria coronaria, miocarditis granulomatosa, miocarditis crónica (no granulomatosa), cardiomiopatía hipertrófica primaria, enfermedad arterial periférica (EAP), enfermedad vascular periférica, tromboembolismo venoso, embolismo pulmonar, accidente cerebrovascular, angina de pecho, infarto de miocardio, daño tisular cardiovascular provocado por paro cardiaco, daño tisular cardiovascular provocado por bypass cardíaco, choque cardiógeno, y afecciones relacionadas que serían conocidas por los expertos en la materia o que implican disfunción de o daño tisular al corazón o la vasculatura, especialmente, pero sin limitarse a, daño tisular relacionado con la activación de SCNA. Las enfermedades CVS incluyen, aunque sin limitarse a, aterosclerosis, miocarditis granulomatosa, infarto de miocardio, fibrosis miocárdica secundaria a enfermedad valvular cardiaca, fibrosis miocárdica sin infarto, cardiomiopatía hipertrófica primaria, y miocarditis crónica (no granulomatosa).

Los ejemplos de enfermedades o trastornos asociados con la disfunción del canal de sodio incluyen, pero no se limitan a, hipertermia maligna, miastenia, ataxia episódica, dolor neuropático e inflamatorio, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esquizofrenia, hipereplexia, miotonias tales como parálisis periódica hipo e hipercalémica, paramiotonía congénita y miotonía agravada por potasio, así como arritmias cardíacas tales como síndrome de QT largo.

Composiciones y moléculas de polinucleótidos y oligonucleótidos

Dianas: En un aspecto, las dianas comprenden secuencias de ácido nucleico de frataxina (SCNA), incluyendo sin limitación secuencias no codificantes y/o codificantes, sentido y/o antisentido asociadas al gen SCNA.

Los canales iónicos sensibles al voltaje son una clase de proteínas transmembrana que proporcionan una base para la excitabilidad celular y la capacidad de transmitir información a través de potenciales de membrana generados por iones. En respuesta a los cambios en los potenciales de membrana, estas moléculas median el flujo iónico rápido a través de canales selectivos en una membrana celular. Si la densidad del canal es lo suficientemente alta, se produce una despolarización regenerativa, lo que se denomina potencial de acción.

El canal de sodio dependiente de voltaje es responsable de la generación y propagación de potenciales de acción en la mayoría de las células eléctricamente excitables, incluidas las neuronas, las células cardíacas y los músculos. La actividad eléctrica se desencadena por la despolarización de la membrana, que abre canales a través de la membrana que son altamente selectivos para los iones de sodio. A continuación, los iones son impulsados intracelularmente a través de canales abiertos por un gradiente electroquímico. Aunque los potenciales de acción basados en sodio en diferentes tejidos son similares, estudios electrofisiológicos han demostrado que existen múltiples canales de sodio estructural y funcionalmente distintos, y se han clonado numerosos genes que codifican los canales de sodio. El gen SCNA pertenece a una familia de genes de canales de sodio controlados por voltaje.

Los canales de sodio controlados por voltaje se pueden nombrar según una forma estandarizada de nomenclatura descrita en Goldin, y col, (2000) Neuron 28: 365-368. De acuerdo con ese sistema, los canales de sodio dependientes de voltaje se agrupan en una familia de la cual se han identificado y expresado nueve isoformas de mamíferos. Estas nueve isoformas reciben el nombre Navl. 1. hasta Navl.9. Además, las variantes de splicing de las diversas isoformas se distinguen por el uso de letras minúsculas después de los números (por ejemplo, "Navl. Ia")

Los canales de sodio controlados por voltaje juegan un papel importante en la generación de potencial de acción en las células nerviosas y los músculos. La subunidad alfa (SCNA) es el componente principal del canal y sería suficiente para generar un canal eficiente cuando se expresa en células in vitro. A su vez, las subunidades beta-1 y 2 necesitan una subunidad alfa para proporcionar un canal efectivo. El papel de estas subunidades sería modificar las propiedades cinéticas del canal principalmente por inactivación rápida de las corrientes de sodio. Se muestra que la mutación encontrada en el síndrome GEFS en el gen SCN1B reduce la inactivación rápida de los canales de sodio en comparación con un SCNB1 normal, cuando se coexpresa con una subunidad alfa.

En un aspecto, se utilizan oligonucleótidos antisentido para prevenir o tratar enfermedades o trastornos asociados con los miembros de la familia SCNA. Enfermedades y trastornos mediados por canal de sodio, dependientes de voltaje, subunidad alfa (SCNA) que pueden tratarse con células/tejidos regenerados a partir de células madre obtenidas usando los compuestos antisentido comprenden: una enfermedad o trastorno asociado con función anormal y/o expresión de SCNA, una enfermedad o trastorno neurológico, convulsión, dolor (incluido el dolor crónico), alteración de la excitabilidad eléctrica que implica una disfunción del canal de sodio, una enfermedad o trastorno asociado con la disfunción del canal de sodio, una enfermedad o trastorno asociado con una mala regulación de la actividad de la subunidad alfa del canal de sodio dependiente de voltaje (p. ej., parálisis, parálisis periódica hiperpotasémica, paramiotonía congénita, miotonía agravada por potasio, síndrome de Q-T largo 3, enfermedad de la placa motora terminal, ataxia, etc.), una enfermedad del tracto gastrointestinal debido a una disfunción del sistema nervioso entérico (p. ej., colitis, ileítis, síndrome inflamatorio del intestino, etc.), una enfermedad o trastorno cardiovascular (por ejemplo, hipertensión, insuficiencia cardíaca congestiva e tc.); una enfermedad o trastorno del tracto genitourinario que implica inervación simpática y parasimpática (por ejemplo, hiperplasia benigna de próstata, impotencia); una enfermedad o trastorno asociado con el sistema neuromuscular (p. ej., distrofia muscular, esclerosis múltiple, epilepsia, autismo, migraña (p. ej., migrañas hemipléjicas familiares y esporádicas, etc.), epilepsia mioclónica grave de la infancia (SMEI o síndrome de Dravet), epilepsia generalizada con convulsiones febriles más (GEFS+), etc.) y trastornos convulsivos relacionados con SCNA.

La presente divulgación se refiere además a una composición farmacéutica que comprende al menos uno de un oligonucleótido que se dirige a una transcripción antisentido natural a al menos una o más de una diana seleccionada de entre el grupo que consiste en genes SCN1A a SCN12A o ARNm o isoformas o variantes de los mismos. La presente divulgación se refiere además a un procedimiento para tratar una enfermedad o trastorno neurológico que comprende administrar un oligonucleótido que se dirige a una transcripción antisentido natural de al menos una o más de una diana seleccionada de entre el grupo que consiste en ARNm SCN1A, SCN2A, SCN3A, SCN4A, SCN5A, SCN6A, SCN7A, SCN8A, SCN9A, SCN10A, SCN11A y SCN12A o una variante de los mismos. En un aspecto preferido, los oligos se seleccionan para regular positivamente la expresión de un producto de expresión completamente funcional de dicha familia de SCNA. En un aspecto preferido, los oligos de la divulgación regulan positivamente la transcripción y/o traducción de cualquiera de los ARNm de una familia de genes SCNXA para proporcionar canales de sodio completamente funcionales en un paciente que necesita tratamiento de los mismos. En pacientes que tienen una enfermedad o trastorno asociado con una versión mutada de un canal de sodio controlado por voltaje, en un aspecto preferido, la administración o tratamiento con una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido que se dirige a una transcripción antisentido natural de un gen o ARNm del canal alfa de sodio controlado por voltaje. de tal gen regula positivamente un producto de expresión completamente funcional en una proporción que es mayor que la regulación positiva de un producto de expresión derivado de una forma mutada del gen. En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una combinación de oligonucleótidos que se dirigen al menos a una transcripción antisentido natural de al menos dos miembros de la familia SCNXA, donde X se selecciona de entre 1 a 12. Por ejemplo, en el tratamiento del síndrome de Dravett, puede usarse una combinación de oligonucleótidos para regular positivamente los productos de expresión de, por ejemplo, SCN1A y SCN9A. En otro aspecto, se puede seleccionar al menos un oligonucleótido para dirigirse a una transcripción antisentido natural de al menos dos genes seleccionados de cualquiera de entre SCN1A a SCN12A. Los oligonucleótidos preferidos de la divulgación tienen entre aproximadamente 5 y aproximadamente 30 nucleótidos de longitud y son al menos un 50 % complementarios a un segmento de 5 a aproximadamente 30 nucleótidos de un NAT. Los NAT preferidos de cualquiera de los genes SCNA o productos de transcripción de los mismos son aquellos que, cuando son dirigidos por un oligonucleótido de la divulgación, interfieren y modulan la expresión de ARNm y/o el producto de traducción de dicho ARNm. En un aspecto preferido, los oligonucleótidos regulan positivamente la expresión de la proteína funcional de la diana para tratar o mitigar una enfermedad asociada a SCNA. En un aspecto preferido, esta "regulación positiva" no está asociada con una causa o promoción de una enfermedad como el cáncer.

Las alteraciones en un gen SCNA pueden incluir o abarcar muchas o todas las formas de mutaciones génicas, incluidas inserciones, deleciones, reordenamientos y/o mutaciones puntuales en la codificación y/o no regiones codificantes de un gen. Las deleciones pueden ser de todo el gen o de una parte del gen. Las mutaciones puntuales pueden dar como resultado sustituciones de aminoácidos, cambios de marco o codones de parada. Mutaciones puntuales también pueden producirse en una región reguladora de un gen SCNA, como un promotor, dando como resultado una pérdida o disminución de la expresión de un ARNm o pueden resultar en un procesamiento inadecuado de dicho ARNm que conduce a una disminución en la estabilidad o eficiencia de traducción. Tales alteraciones en humanos pueden conducir a diversas formas de enfermedad y hay muchas publicaciones que describen la asociación de una alteración en un gen SCNA con, por ejemplo, epilepsia o SMEI. Estas alteraciones pueden ser "de novo" o pueden heredarse. La presente divulgación no se limita al tratamiento de enfermedades asociadas con alteraciones en un gen SCNA y también incluye el tratamiento de una enfermedad o afección asociada con SCNA donde un paciente no tiene o tiene necesariamente una alteración o mutación en el gen SCNA. Se cree que cualquier modulación o regulación positiva de los productos de expresión del canal de sodio dependiente de voltaje funcional dará como resultado la mitigación o el tratamiento de una enfermedad o afección asociada a SCNA en un paciente que necesite tratamiento de los mismos. Tal mitigación también puede incluir al menos una indicación medible de mejora clínica que incluye menos convulsiones, convulsiones menos frecuentes, convulsiones menos graves, desarrollo de menos tipos de convulsiones, mejora en el desarrollo neurológico o cualquier otro beneficio del tratamiento.

En un aspecto, la modulación de SCNA por uno o varios oligonucleótidos antisentido se administra a un paciente que los necesite para impedir o tratar cualquier enfermedad o trastorno relacionado con la expresión, función o actividad anómalas de la SCNA en comparación con un control normal.

En un aspecto, los oligonucleótidos son específicos para polinucleótidos del gen SCNA, lo que incluye, sin limitación, regiones no codificantes. Las dianas de SCNA comprenden variantes de SCNA; imitantes de SCNA, incluyendo SNP; secuencias no codificantes de SCNA; alelos, fragmentos y similares. Preferentemente, el oligonucleótido es una molécula de ARN antisentido.

De acuerdo con aspectos de la divulgación, la molécula de ácido nucleico diana no está limitada a polinucleótidos de SCNA en solitario, sino que se extiende a cualquiera de las isoformas, receptores, homólogos, regiones no codificantes y similares de SCNA.

En un aspecto, un oligonucleótido está dirigido a una secuencia antisentido natural (antisentido natural a las regiones codificantes y no codificantes) de dianas del gen SCNA, incluyendo, sin limitación, variantes, alelos, homólogos, mutantes, derivados, fragmentos y secuencias complementarias a estos. Preferentemente el oligonucleótido es una molécula de ARN o ADN antisentido.

En un aspecto, los compuestos oligoméricos de la presente divulgación también incluyen variantes en las que una base diferente está presente en una o más de las posiciones de nucleótido en el compuesto. Por ejemplo, si el primer nucleótido es una adenina, pueden producirse variantes que contienen timidina, guanosina, citidina u otros nucleótidos naturales o no naturales en esta posición. Esto puede hacerse en cualquiera de las posiciones del compuesto antisentido. Estos compuestos se ensayan a continuación usando los procedimientos descritos en esta invención para determinar su capacidad para inhibir la expresión de un ácido nucleico diana.

En algunos aspectos, la homología, identidad de secuencias o complementariedad, entre el compuesto antisentido y la diana, es de aproximadamente el 50 % a aproximadamente el 60 %. En algunos aspectos, la homología, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 60 % a aproximadamente el 70 %. En algunos aspectos, la homología, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 70 % a aproximadamente el 80 %. En algunos aspectos, la homología, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 80 % a aproximadamente el 90 %. En algunos aspectos, la homología, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 94 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 %.

Un compuesto antisentido es específicamente hibridable cuando la unión del compuesto al ácido nucleico diana interfiere en la función normal del ácido nucleico diana para producir una pérdida de actividad y hay un grado de complementariedad suficiente para evitar la unión inespecífica del compuesto antisentido a secuencias de ácidos nucleicos no diana en condiciones en las que se desea la unión específica. Dichas condiciones incluyen, es decir, condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapéutico, y condiciones en las que se realizan los ensayos en el caso de ensayos in vitro.

Un compuesto antisentido, ya sea ADN, ARN, quimérico, sustituido etc., se puede hibridar específicamente cuando la unión del compuesto a la molécula de ADN o ARN diana interfiere con la función normal del ADN o ARN diana para causar una pérdida de utilidad y hay un grado de complementariedad suficiente para evitar la unión no específica del compuesto antisentido a las secuencias no diana en condiciones en las que se desea la unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de los ensayos in vivo o tratamiento terapéutico, y en el caso de los ensayos in vitro, en las condiciones en las que se realizan los ensayos.

En un aspecto, el direccionamiento de SCNA que incluye, sin limitación, secuencias antisentido que se identifican y expanden, usando por ejemplo, PCR, hibridación, etc., una o más de las secuencias establecidas como SEQ ID NOS: 12 a 28, y similares, modulan la expresión o función de SCNA. En un aspecto, la expresión o función está regulada positivamente en comparación con un control. En un aspecto, la expresión o función está regulada negativamente en comparación con un control.

En un aspecto, los oligonucleótidos comprenden secuencias de ácido nucleico establecidas como SEQ ID NOS: 29 a 94 que incluyen secuencias antisentido que se identifican y expanden, usando, por ejemplo, PCR, hibridación, etc. Estos oligonucleótidos pueden comprender uno o más nucleótidos modificados, fragmentos más cortos o más largos, enlaces modificados y similares. Los ejemplos de enlaces modificados o enlaces internucleotídicos comprenden fosforotioato, fosforoditioato o similares. En un aspecto, los nucleótidos comprenden un derivado de fósforo. El derivado de fósforo (o grupo fosfato modificado) que puede unirse al resto de azúcar o de análogo de azúcar en los oligonucleótidos modificados de la presente descripción puede ser un monofosfato, difosfato, trifosfato, alquilfosfato, alcanofosfato, fosforotioato y similares. La preparación de los análogos de fosfato indicados anteriormente, y su incorporación en nucleótidos, nucleótidos modificados y oligonucleótidos, también es en sí conocida y no es necesario describirla aquí.

La especificidad y sensibilidad del antisentido también es aprovechada por los expertos en la materia para usos terapéuticos. Se han empleado oligonucleótidos antisentido como restos terapéuticos en el tratamiento de patologías en animales y el ser humano. Los oligonucleótidos antisentido se han administrado con seguridad y eficazmente a seres humanos y numerosos ensayos clínicos están actualmente en marcha. Así, se establece que los oligonucleótidos pueden ser modalidades terapéuticas útiles que pueden configurarse para ser útiles en regímenes de tratamiento para el tratamiento de células, tejidos y animales, especialmente seres humanos.

En aspectos de la presente divulgación, los compuestos antisentido oligoméricos, particularmente oligonucleótidos, se unen a moléculas de ácidos nucleicos diana y modulan la expresión y/o función de moléculas codificadas por un gen diana. Las funciones de ADN con las que interferirán comprenden, por ejemplo, replicación y transcripción. Las funciones de ARN a interferir comprenden todas las funciones vitales tales como, por ejemplo, la translocalización del ARN al sitio de traducción de proteína, la traducción de proteína desde ARN, el splicing del ARN para producir una o más especies de ARNm, y la actividad catalítica que puede estar acoplada o facilitada por el ARN. Las funciones pueden regularse positivamente o inhibirse dependiendo de las funciones deseadas.

Los compuestos antisentido incluyen compuestos antisentido oligoméricos, oligonucleótidos antisentido, oligonucleótidos de secuencia de guía externa (EGS), agentes de splicing alternativos, cebadores, sondas, y otros compuestos oligoméricos que hibridan con al menos una parte del ácido nucleico diana. Como tales, estos compuestos pueden introducirse en forma de compuestos oligoméricos monocatenarios, bicatenarios, parcialmente monocatenarios, o circulares.

El direccionamiento de un compuesto antisentido a una molécula de ácido nucleico particular, en el contexto de esta descripción, puede ser un procedimiento multietapa. El procedimiento normalmente empieza con la identificación de un ácido nucleico diana cuya función va a modularse. Este ácido nucleico diana puede ser, por ejemplo, un gen celular (o ARNm transcrito del gen) cuya expresión está asociada a un trastorno o patología particular, o una molécula de ácido nucleico de un agente infeccioso. En la presente divulgación, el ácido nucleico diana codifica la subunidad alfa activada por voltaje del canal de sodio (SCNA).

El procedimiento de direccionamiento normalmente también incluye la determinación de al menos una región diana, segmento, o sitio dentro del ácido nucleico diana para que la interacción antisentido se produzca de forma que resulte el efecto deseado, por ejemplo, la modulación de la expresión. Dentro del contexto de la presente divulgación, el término «región» se define como una parte del ácido nucleico diana que tiene al menos una estructura, función o característica identificable. Dentro de las regiones de los ácidos nucleicos diana hay segmentos. Los «segmentos» se definen como partes más pequeñas o sub-partes de regiones dentro de un ácido nucleico diana. "Sitios", como se usa en la presente descripción, se define como posiciones dentro de un ácido nucleico diana.

En un aspecto, los oligonucleótidos antisentido se unen a las secuencias antisentido naturales del canal de sodio, subunidad alfa activada por voltaje (SCNA) y modulan la expresión y/o función de SCNA (SEQ ID NO: 1 a 11). Ejemplos de secuencias antisentido naturales incluyen SEQ ID NOS: 12 a 28. Ejemplos de secuencias de oligonucleótidos antisentido incluyen SEQ ID NOS: 29 a 94.

En un aspecto, los oligonucleótidos antisentido se unen a uno o más segmentos de polinucleótidos de la subunidad alfa (SCNA) activados por voltaje del canal de sodio y modulan la expresión y/o función de SCNA. Los segmentos comprenden al menos cinco nucleótidos consecutivos del SCNA sentido. o polinucleótidos antisentido.

En un aspecto, los oligonucleótidos antisentido son específicos para secuencias antisentido naturales del gen SCNA donde la unión de los oligonucleótidos a las secuencias antisentido naturales del gen SCNA modulan la expresión y/o la función del gen SCNA.

En un aspecto, los compuestos de oligonucleótidos comprenden secuencias establecidas como SEQ ID NOS: 29 a 94 que incluyen secuencias antisentido que se identifican y expanden, usando, por ejemplo, PCR, hibridación, etc. Estos oligonucleótidos pueden comprender uno o más nucleótidos modificados, fragmentos más cortos o más largos, enlaces modificados y similares. Los ejemplos de enlaces modificados o enlaces internucleotídicos comprenden fosforotioato, fosforoditioato o similares. En un aspecto, los nucleótidos comprenden un derivado de fósforo. El derivado de fósforo (o grupo fosfato modificado) que puede unirse al resto de azúcar o de análogo de azúcar en los oligonucleótidos modificados de la presente descripción puede ser un monofosfato, difosfato, trifosfato, alquilfosfato, alcanofosfato, fosforotioato y similares. La preparación de los análogos de fosfato indicados anteriormente, y su incorporación en nucleótidos, nucleótidos modificados y oligonucleótidos, también es en sí conocida y no es necesario describirla aquí.

Ya que, tal como se conoce en la técnica, el codón de iniciación de la traducción normalmente es 5'-AUG (en moléculas de ARNm transcrito; 5'-ATG en la molécula de ADN correspondiente), el codón de iniciación de la traducción también se denomina el "codón AUG", el "codón de iniciación" o el "codón de iniciación AUG". Una minoría de genes tiene un codón de iniciación de la traducción que tiene la secuencia de ARN 5'-GUG, 5'-UUG o 5'-CUG; y se ha demostrado que 5'-AUA, 5'-ACG y 5'-CUG funcionan in vivo. Por tanto, los términos "codón de inicio de la traducción" y "codón de inicio" pueden abarcar muchas secuencias de codones, aunque el aminoácido iniciador en cada aspecto es típicamente metionina (en eucariotas) o formilmetionina (en procariotas), los genes eucariotas y procariotas pueden tener dos o más codones de inicio alternativos, cualquiera de los cuales puede utilizarse preferiblemente para el inicio de la traducción en un tipo celular o tejido particular, o bajo un conjunto particular de condiciones. En el contexto de la divulgación, "codón de inicio" y "codón de inicio de la traducción" se refieren al codón o codones que se utilizan in vivo para iniciar la traducción de un ARNm transcrito de un gen que codifica el canal de sodio, subunidad alfa activada por voltaje (SCNA), independientemente de la secuencia o secuencias de dichos codones. Un codón de terminación de la traducción (o "codón de terminación") de un gen puede tener una de tres secuencias, es decir, 5'-UAA, 5'-UAG y 5'-UGA (las secuencias de ADN correspondientes son 5'-TAA, 5'-TAG y 5'-TGA, respectivamente).

Las expresiones "región de codón de iniciación" y "región de codón de iniciación de la traducción" se refieren a una parte de dicho ARNm o gen que engloba de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleótidos contiguos en cualquier dirección (es decir, 5' o 3') desde un codón de iniciación de la traducción. Análogamente, las expresiones «región de codón de terminación» y «región de codón de terminación de la traducción» se refieren a una parte de dicho ARNm o gen que engloba de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleótidos contiguos en cualquier dirección (es decir, 5' o 3') desde un codón de terminación de la traducción. En consecuencia, la "región de codón de inicio" (o "región de codón de iniciación de la traducción") y la "región de codón de parada" (o "región de codón de terminación de la traducción") son todas las regiones que pueden ser dirigidas de manera efectiva con los compuestos antisentido de la presente descripción.

El marco de lectura abierto (ORP) o "región codificante", que se conoce en la técnica para referirse a la región entre el codón de iniciación de la traducción y el codón de terminación de la traducción, también es una región que puede ser eficazmente elegida como diana. Dentro del contexto de la presente descripción, una región dirigida es la región intragénica que abarca el codón de iniciación o de terminación de la traducción del marco de lectura abierto (ORF) de un gen.

Otra región diana incluye la región no traducida 5' (5'UTR), conocida en la técnica para referirse a la parte de un ARNm en la dirección 5' desde el codón de iniciación de la traducción, y que incluye, por lo tanto, nucleótidos entre el sitio caperuza 5' y el codón de iniciación de la traducción de un ARNm (o nucleótidos correspondientes en el gen). Otra región diana más incluye la región no traducida 3' (3'UTR), conocida en la técnica para referirse a la parte de un ARNm en la dirección 3' desde el codón de terminación de la traducción, y que incluye, por lo tanto, nucleótidos entre el codón de terminación de la traducción y el extremo 3' de un ARNm (o nucleótidos correspondientes en el gen). El sitio caperuza 5' de un ARNm comprende un residuo de guanosina N7-metilado unido al residuo más 5' del ARNm mediante un enlace trifosfato 5'-5'. La región caperuza 5' de un ARNm se considera que incluye la propia estructura caperuza 5', además de los primeros 50 nucleótidos adyacentes al sitio caperuza. Otra región diana para esta descripción es la región caperuza 5'.

Aunque algunas transcripciones de ARNm eucariotas se traducen directamente, muchos contienen una o más regiones, conocidas como "intrones", que se escinden de una transcripción antes de que se traduzca. Las regiones restantes (y, por tanto, traducidas) se conocen como «exones» y se someten a splicing juntas para formar una secuencia de ARNm continua. En un aspecto, la elección como diana de sitios de splicing, es decir, empalmes intrónexón o empalmes exón-intrón, es particularmente útil en situaciones en las que el splicing aberrante participa en la enfermedad, o en las que una producción en exceso de un producto de splicing particular participa en la enfermedad. Una unión de fusión aberrante debida a un reordenamiento o deleción es otra instancia de un sitio diana. Las transcripciones de ARNm producidas mediante el proceso de splicing de dos (o más) ARNm de diferentes fuentes de genes se conocen como "transcripciones de fusión". Los intrones pueden dirigirse eficazmente utilizando compuestos antisentido dirigidos a, por ejemplo, ADN o pre-ARNm.

En un aspecto, los oligonucleótidos antisentido se unen a regiones codificantes y/o no codificantes de un polinucleótido diana y modulan la expresión y/o función de la molécula diana.

En un aspecto, los oligonucleótidos antisentido se unen a polinucleótidos antisentido naturales y modulan la expresión y/o función de la molécula diana.

En un aspecto, los oligonucleótidos antisentido se unen a polinucleótidos sentido y modulan la expresión y/o función de la molécula diana.

Pueden producirse transcripciones de ARN alternativos a partir de la misma región genómica de ADN. Estas transcripciones alternativas son generalmente conocidas como «variantes». Más específicamente, las "variantes de pre-ARNm" son transcripciones producidas a partir del mismo ADN genómico que diferen de otras transcripciones producidas a partir del mismo ADN genómico en su posición de inicio o de parada y contienen tanto secuencia intrónica como exónica.

Tras la escisión de una o más regiones de exón o intrón, o partes de las mismas durante el splicing, las variantes de pre-ARNm producen "variantes de ARNm" más pequeñas. Por consiguiente, las variantes de ARNm son variantes de pre-ARNm procesadas y cada variante de pre-ARNm única siempre debe producir una variante de ARNm única como resultado del splicing. Estas variantes de ARNm son también conocidas como “variantes de splicing alternativo”. Si no se produce el splicing de la variante de pre-ARNm, entonces la variante de pre-ARNm es idéntica a la variante de ARNm.

Las variantes pueden producirse mediante el uso de señales alternativas para la transcripción de inicio o de parada. Los Pre-ARNm y ARNm pueden poseer más de un codón de iniciación o codón de terminación. Las variantes que se originan a partir de un pre-ARNm o ARNm que usan codones de iniciación alternativos se conocen como «variantes de inicio alternativas» de ese pre-ARNm o ARNm. Aquellas transcripciones que usan un codón de terminación alternativo se conocen como «variantes de parada alternativas» de ese pre-ARNm o ARNm. Un tipo específico de variante de parada alternativa es la «variante poliA», en la que las múltiples transcripciones producidas resultan de la selección alternativa de una de las «señales de parada de poliA» por la maquinaria de transcripción, produciendo de este modo transcripciones que terminan en sitios de poliA únicos. Dentro del contexto de la descripción, los tipos de variantes descritos en esta invención también son aspectos de ácidos nucleicos diana.

Las ubicaciones en el ácido nucleico diana con las que los compuestos antisentido hibridan se definen como al menos una parte de 5 nucleótidos de longitud de una región diana a la que se dirige un compuesto antisentido activo.

Aunque las secuencias específicas de ciertos segmentos diana a modo de ejemplo se exponen en esta invención, un experto en la materia reconocerá que éstas sirven para ilustrar y describir aspectos particulares dentro del alcance de la presente divulgación. Los segmentos diana adicionales son fácilmente identificables por un experto en la materia en vista de esta descripción.

Los segmentos diana de 5-100 nucleótidos de longitud que comprenden un tramo de entre al menos cinco (5) nucleótidos consecutivos seleccionados de entre los segmentos diana preferidos ilustrativos también se consideran adecuados para el direccionamiento.

Los segmentos diana pueden comprender secuencias de ADN o ARN que comprenden al menos los 5 nucleótidos consecutivos desde el extremo 5' de uno de los segmentos diana preferidos ilustrativos (siendo los restantes nucleótidos un tramo consecutivo del mismo ADN o ARN que empieza inmediatamente cadena arriba del extremo 5' del segmento diana y que continúa hasta que el ADN o ARN contenga de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 nucleótidos). Los segmentos diana similarmente preferidos se representan por secuencias de ADN o ARN que comprenden al menos los 5 nucleótidos consecutivos desde el extremo 3 de uno de los segmentos diana preferidos ilustrativos (siendo los restantes nucleótidos un tramo consecutivo del mismo ADN o ARN que empieza inmediatamente cadena abajo del extremo 3 del segmento diana y que continúa hasta que el ADN o ARN contenga de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 nucleótidos). Un experto en la materia armado con los segmentos diana ilustrados en esta invención será capaz, sin excesiva experimentación, de identificar segmentos diana preferidos adicionales.

Una vez se han identificado una o más regiones, segmentos o sitios diana, se eligen los compuestos antisentido que sean suficientemente complementarios a la diana, es decir, se hibridan suficientemente bien y con suficiente especificidad, para proporcionar el efecto deseado.

En aspectos de la descripción, los oligonucleótidos se unen a una cadena antisentido de una diana particular. Los oligonucleótidos tienen al menos nucleótidos de longitud y se pueden sintetizar de modo que cada oligonucleótido se dirija a secuencias superpuestas, de modo que los oligonucleótidos se sinteticen para cubrir la longitud completa del polinucleótido diana. Las dianas también incluyen regiones codificantes y no codificantes..

En un aspecto, se prefiere apuntar a ácidos nucleicos específicos mediante oligonucleótidos antisentido. Dirigir un compuesto antisentido a un ácido nucleico particular es un procedimiento de varias etapas. El procedimiento normalmente empieza con la identificación de una secuencia de ácido nucleico cuya función va a modularse. Esta puede ser, por ejemplo, un gen celular (o ARNm transcrito a partir del gen) cuya expresión está asociada a un trastorno o patología particular, o un polinucleótido no codificante tal como, por ejemplo, a Rn no codificante (ARNnc).

Los ARN pueden clasificarse en (1) ARN mensajeros (ARNm), que se traducen en proteínas, y (2) ARN no codificantes de proteína (ARNnc). Los ARNnc comprenden microARN, transcripciones antisentido y otras unidades transcripcionales (TU) que contienen una alta densidad de codones de parada y que carecen de cualquier "marco de lectura abierto" extenso. Muchos ARNnc parecen empezar a partir de sitios de iniciación en regiones no traducidas 3' (3'UTRs) de loci codificantes de proteínas. Los ARNnc son frecuentemente raros y al menos la mitad de los ARNnc que se han secuenciado por el consorcio FANTOM no parecen estar poliadenilados. La mayoría de los investigadores se han basado, por motivos obvios, en ARNm poliadenilados que se procesan y se exportan al citoplasma. Recientemente, se demostró que el conjunto de ARN nucleares no poliadenilados puede ser muy grande, y que muchas de dichas transcripciones surgen de las llamadas regiones intergénicas. El mecanismo por el que los ARNnc pueden regular la expresión génica es por apareamiento de bases con transcripciones diana. Los ARN que funcionan por apareamiento de bases pueden agruparse en (1) ARN codificados en cis que están codificados en la misma ubicación genética, pero en la cadena opuesta a los ARN en los que actúan y, por lo tanto, muestran complementariedad perfecta con su diana, y (2) ARN codificados en trans que están codificados en una ubicación cromosómica distinta de los ARN en los que actúan y generalmente no presentan potencial de apareamiento de bases perfecto con sus dianas.

Sin desear ceñirse a ninguna teoría, la perturbación de un polinucleótido antisentido por los oligonucleótidos antisentido descritos en esta invención puede alterar la expresión de los ARN mensajeros sentido correspondientes. Sin embargo, esta regulación puede ser discordante (la inactivación antisentido da como resultado la elevación del ARN mensajero) o concordante (la caída antisentido da como resultado una reducción concomitante del ARN mensajero). En estos casos, los oligonucleótidos antisentido pueden dirigirse a partes superpuestas o no superpuestas de la transcripción antisentido, resultando en su inactivación o secuestro. El antisentido codificante, así como no codificante, puede ser dirigido de una manera idéntica y esa categoría es capaz de regular las transcripciones sentido correspondientes - tanto de una manera concordante como discordante. Las estrategias que se emplean en identificar nuevos oligonucleótidos para su uso contra una diana pueden basarse en la inactivación de transcripciones de ARN antisentido por oligonucleótidos antisentido o cualquier otro medio de modulación de la diana deseada.

Estrategia 1: En el caso de regulación discordante, la inactivación de la transcripción antisentido eleva la expresión del gen convencional (sentido). Si el último gen debe codificar un fármaco diana conocido o supuesto, entonces la inactivación de su homólogo antisentido podría imitar posiblemente la acción de un agonista receptor o una enzima estimulante.

Estrategia 2: En el caso de regulación concordante, podrían inactivarse de forma concomitante tanto las transcripciones antisentido como sentido y así lograr una reducción sinérgica de la expresión génica (sentido) convencional. Si, por ejemplo, un oligonucleótido antisentido se usa para lograr la inactivación, a continuación esta estrategia puede usarse para aplicar un oligonucleótido antisentido dirigido a la transcripción con sentido y otro oligonucleótido antisentido a la transcripción antisentido correspondiente, o un único oligonucleótido antisentido energéticamente simétrico que se dirige simultáneamente a transcripciones sentido y antisentido solapantes.

De acuerdo con la presente divulgación, los compuestos antisentido incluyen oligonucleótidos antisentido, ribozimas, oligonucleótidos de secuencia de guía externa (EGS), compuestos de siRNA, compuestos de interferencia (ARNi) de ARN mono- o bicatenario tales como compuestos de siRNA, y otros compuestos oligoméricos que hibridan con al menos una parte del ácido nucleico diana y modulan su función. Por lo tanto, pueden ser ADN, ARN, similares a ADN, similares a ARN, o mezclas de los mismos, o pueden ser miméticos de uno o más de estos. Estos compuestos pueden ser compuestos oligoméricos monocatenarios, bicatenarios, circulares o de horquilla y pueden contener elementos estructurales tales como protuberancias internas o terminales, desapareamientos o bucles. Los compuestos antisentido se preparan de forma rutinaria linealmente, pero pueden unirse o prepararse de otro modo para ser circulares y/o ramificados. Los compuestos antisentido pueden comprender constructos tales como, por ejemplo, dos cadenas hibridadas para formar un compuesto completo o parcialmente bicatenario o una única cadena con autocomplementariedad suficiente para permitir la hibridación y formación de un compuesto completa o parcialmente bicatenario. Las dos cadenas pueden enlazarse internamente, dejando los extremos 3' o 5' libres o pueden enlazarse para formar una estructura de horquilla continua o bucle. La estructura de horquilla puede contener un nucleótido protuberante en cualquiera de los extremos 5' o 3' que produce una extensión del carácter monocatenario. Los compuestos bicatenarios opcionalmente pueden comprender nucleótidos protuberantes en los extremos. Modificaciones adicionales pueden incluir grupos conjugados unidos a uno de los extremos, posiciones de nucleótido seleccionadas, posiciones de azúcar o a uno de los enlaces internucleosídicos. Como alternativa, las dos cadenas pueden enlazarse mediante un resto de ácido no nucleico o grupo conector. Cuando se forma a partir de solo una cadena, el dsARN puede tomar la forma de una molécula tipo horquilla auto-complementaria que se dobla sobre sí misma para formar un dúplex. De este modo, el dsARN puede ser completa o parcialmente bicatenario. Puede lograrse modulación específica de la expresión génica por expresión estable de horquillas de dsARN en líneas celulares transgénicas, sin embargo, en algunos aspectos, la expresión o función génica está regulada positivamente. Cuando se forma a partir de dos cadenas, o una sola cadena que adopta la forma de una molécula de tipo horquilla autocomplementaria que se dobla sobre sí misma para formar un dúplex, las dos cadenas (o regiones formadoras de dúplex de una sola cadena) son cadenas de ARN complementarias que se aparean con bases en el modo de Watson-Crick.

Una vez introducidos a un sistema, los compuestos de la divulgación pueden provocar la acción de una o más enzimas o proteínas estructurales para efectuar la escisión u otra modificación del ácido nucleico diana o pueden trabajar mediante mecanismos basados en la ocupación. En general, los ácidos nucleicos (incluyendo oligonucleótidos) pueden describirse como "similares a ADN" (es decir, que generalmente tienen uno o más 2'-desoxiazúcares y, generalmente, bases T en vez de U) o "similares a ARN" (es decir, que generalmente tienen uno o más 2'-hidroxilazúcares o azucares modificados en 2' y, generalmente bases U en vez de T). Las hélices de ácido nucleico pueden adoptar más de un tipo de estructura, más comúnmente las formas A y B: Se cree que, en general, los oligonucleótidos que tienen estructura similar a la forma B son "de tipo ADN" y aquellos que tienen estructura de tipo forma A son "de tipo ARN". En algunos aspectos (quiméricos), un compuesto antisentido puede contener tanto regiones en forma A como B.

En un aspecto, los oligonucleótidos o compuestos antisentido deseados comprenden al menos un ARN antisentido, ADN antisentido, oligonucleótidos antisentido quiméricos, oligonucleótidos antisentido que comprenden enlaces modificados, ARN de interferencia (ARNi), ARN de interferencia pequeño (siRNA); un microARN de interferencia (miARN); un ARN temporal pequeño (ARNtp); o un ARN de horquilla corta (ARNhc); activación génica inducida por ARN pequeño (ARNa); ARN activantes pequeños (ARNap), o combinaciones de los mismos.

Los dsARN también pueden activar la expresión génica, un mecanismo que se ha llamado "activación génica inducida por ARN pequeño" o aARN. Los promotores génicos que se dirigen a dsARN inducen la potente activación transcripcional de genes asociados. El ARNa se demostró en células humanas usando dsARN sintéticos, denominados «ARN de activación pequeño» (saARN). Actualmente no se sabe de dónde se conserva el ARNa en otros organismos.

Se ha descubierto que el ARN bicatenario pequeño (dsARN), tal como ARN interferente pequeño (siRNA) y microARN (miARN), es el desencadenante de un mecanismo evolutivamente conservado conocido como interferencia de ARN (ARNi). El ARNi conduce invariablemente al silenciamiento génico mediante la remodelación de cromatina para suprimir de este modo la transcripción, degradación de ARNm complementario, o bloqueo de la traducción de proteínas. Sin embargo, en los aspectos descritos en detalle en la sección de ejemplos que sigue, se muestra que los oligonucleótidos aumentan la expresión y/o función de los polinucleótidos de la subunidad alfa (SCNA) dependientes de voltaje del canal de sodio y productos codificados de los mismos. Los dsARN también pueden actuar como RNA activadores pequeños (ARNap). Sin desear quedar ligado a teoría alguna, al dirigir las secuencias en los promotores génicos, los saARN inducirán la expresión de genes diana en un fenómeno denominado activación transcripcional inducida por dsARN (ARNa).

En un aspecto adicional, los "segmentos diana preferidos" identificados en esta invención pueden emplearse en un cribado de compuestos adicionales que modulan la expresión de polinucleótidos de subunidad alfa (SCNA) de canal de sodio, controlados por voltaje. Los "moduladores" son aquellos compuestos que disminuyen o aumentan la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica SCNA y que comprenden al menos una parte de 5 nucleótidos que es complementaria a un segmento diana preferido. El procedimiento de cribado comprende las etapas de poner en contacto un segmento diana preferido de una molécula de ácido nucleico que codifica polinucleótidos sentido o antisentido naturales de SCNA con uno o más moduladores candidatos, y seleccionar uno o más moduladores candidatos que disminuyen o aumentan la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica polinucleótidos de SCNA, por ejemplo, las SEQ ID NOS: 29 a 94 Una vez que se demuestra que el modulador o moduladores candidatos son capaces de modular (por ejemplo, tanto disminuir como aumentar) la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica polinucleótidos de SCNA, el modulador puede entonces emplearse en estudios de investigación adicionales de la función de polinucleótidos de SCNA, o para su uso como un agente de investigación, diagnóstico o terapéutico según la presente divulgación.

El direccionamiento de la secuencia antisentido natural modula preferiblemente la función del gen diana. Por ejemplo, el gen SCNA (por ejemplo, número de acceso NM_001165963, NM_021007, NM_006922, NM_000334, NM_198056, NM_002976, NM_014191, NM_002977, NM_006514, NM_014139, AF109737). En un aspecto, la diana es un polinucleótido antisentido del gen SCNA, en un aspecto, un oligonucleótido antisentido apunta a secuencias antisentido y/o antisentido naturales de polinucleótidos SCNA (por ejemplo, número de acceso NM_001165963, NM_021007, NM_006922, NM_000334, NM_198056, NM_002976, NM_014191, NM_002977. NM_006514, NM_014139, AF109737), variantes, alelos, isoformas, homólogos, mutantes, derivados, fragmentos y secuencias complementarias a los mismos. Preferentemente, el oligonucleótido es una molécula antisentido y las dianas incluyen regiones codificantes y no codificantes de polinucleótidos antisentido y/o sentido del gen SCNA.

Los segmentos diana preferidos de la presente descripción también pueden combinarse con sus compuestos antisentido complementarios respectivos de la presente descripción para formar oligonucleótidos (duplexados) bicatenarios estabilizados

Se ha demostrado en la técnica que dichos restos de oligonucleótido bicatenario modulan la expresión de la diana y regulan la traducción, además del procesamiento de ARN mediante un mecanismo antisentido. Además, los restos bicatenarios pueden someterse a modificación química. Por ejemplo, se ha demostrado que dichos restos bicatenarios inhiben la diana mediante la hibridación clásica de la cadena antisentido del dúplex a la diana, desencadenando de este modo la degradación enzimática de la diana.

En un aspecto, un oligonucleótido antisentido se dirige a polinucleótidos de subunidad alfa (SCNA) controlados por voltaje del canal de sodio (por ejemplo, número de acceso NM_001165963, NM_021007, n M_006922, NM_000334, NM_198056, NM_002976, NM_014191, NM_002977, NM_006514, NM_014139, AF109737), variantes, alelos, isoformas, homólogos, mutantes, derivados, fragmentos y secuencias complementarias de los mismos. Preferentemente, el oligonucleótido es una molécula antisentido.

De acuerdo con aspectos de la divulgación, la molécula de ácido nucleico diana no se limita a la SCNA por sí sola, sino que se extiende a cualquiera de las isoformas, receptores, homólogos y similares de las moléculas de SCNA.

En un aspecto, un oligonucleótido se dirige a una secuencia antisentido natural de polinucleótidos SCNA, por ejemplo, polinucleótidos establecidos como SEQ ID NOS: 12 a 28, y cualquier variante, alelo, homólogo, mutante, derivado, fragmento y secuencia complementaria de la misma. Ejemplos de oligonucleótidos antisentido se exponen como las SEQ ID NOS: 29 a 94.

En un aspecto, los oligonucleótidos son complementarios a, o se unen a, secuencias de ácido nucleico del gen SCNA antisentido, incluyendo sin limitación secuencias sentido y/o antisentido no codificantes asociadas con polinucleótidos del gen SCNA y modulan la expresión y/o función de moléculas de SCNA.

En un aspecto, los oligonucleótidos son complementarios o se unen a secuencias de ácido nucleico de SCNA antisentido natural, establecidas como SEQ ID NOS: 12 a 28, y modulan la expresión y/o función de las moléculas de SCNA.

En un aspecto, los oligonucleótidos comprenden secuencias de al menos 5 nucleótidos consecutivos de SEQ ID NOS: 29 a 94 y modulan la expresión y/o función de moléculas de SCNA.

Las dianas de polinucleótido comprenden SCNA, que incluyen miembros de la familia del mismo, variantes del SCNA; mutantes del SCNA, que incluyen SNP; secuencias no codificantes del SCNA; alelos del SCNA; variantes de especies, fragmentos y similares. Preferentemente, el oligonucleótido es una molécula antisentido.

En un aspecto, el oligonucleótido que se dirige a polinucleótidos del gen SCNA, comprende: ARN antisentido, ARN de interferencia (ARNi), ARN de interferencia pequeño (siRNA); microARN de interferencia (miARN); un ARN temporal pequeño (ARNtp); o un ARN de horquilla corta (ARNhc); activación génica inducida por ARN pequeño (ARNa); o, ARN activador pequeño (ARNap).

En un aspecto, el direccionamiento de polinucleótidos de subunidad alfa (SCNA) regulados por voltaje del canal de sodio, p. ej. SEQ ID NOS: 1 a 11, modula la expresión o función de estas dianas. En un aspecto, la expresión o función está regulada positivamente en comparación con un control. En un aspecto, la expresión o función está regulada negativamente en comparación con un control. En un aspecto adicional, el direccionamiento de las transcripciones antisentido naturales (por ejemplo, SEQ ID NOS. 12 a 28) así como cualquier otro NAT diana de tales polinucleótidos diana da como resultado la regulación positiva de dicho ARNm diana y la proteína correspondiente.

En un aspecto, los compuestos antisentido comprenden secuencias expuestas como SEQ ID NOS: 29 a 94. Estos oligonucleótidos pueden comprender uno o más nucleótidos modificados, fragmentos más cortos o más largos, enlaces modificados y similares.

En un aspecto, las SEQ ID NOS: 29 a 94 comprenden uno o más nucleótidos de ANB. La tabla 1 muestra ejemplos de oligonucleótidos antisentido útiles en los procedimientos de la divulgación.

Tabla 1.

* Indicado un enlace fosfotioato. indica ANB. "r" indica ARN y "m" indica un grupo metilo en el átomo de

oxígeno 2" en el resto de azúcar designado del oligouucleótido. Para evitar ambigüedades, este ANB tiene la fórmula

donde B es la base designada particular.

Tabla 2: Expresión relativa del ARNm de SCN1A en células tratadas con oligonucleótidos antisentido dirigidos a la transcripción antisentido natural específico de SCN1A. Avg - tasa de diferencia promedio en la expresión de SCN1A en comparación con el control simulado transfectado; Std - desviación estándar. P - probabilidad de que las muestras tratadas no sean diferentes del control simulado. N - número total de réplicas

La modulación de un ácido nucleico diana deseado puede llevarse a acabo de varias maneras conocidas en la técnica. Por ejemplo, oligonucleótidos antisentido, siRNA, etc. Las moléculas de ácidos nucleico enzimáticas (por ejemplo, las ribozimas) son moléculas de ácido nucleico capaces de catalizar una o más de diversas reacciones, que incluyen la capacidad para escindir repetidamente otras moléculas de ácidos nucleicos separadas en un modo específico de secuencia de bases de nucleótidos. Dichas moléculas de ácidos nucleicos enzimáticos pueden usarse, por ejemplo, para dirigirse prácticamente a cualquier transcripción de ARN.

Debido a su especificidad de secuencia, las moléculas de ácidos nucleicos enzimáticos que se escinden en trans son una promesa como agentes terapéuticos para enfermedades humanas. Las moléculas de ácidos nucleicos enzimáticas pueden diseñarse para escindir dianas de ARN específicas dentro del fondo del ARN celular. Un acontecimiento de escisión de este tipo convierte al ARNm en no funcional y anula la expresión de proteínas de ese ARN. De este modo, la síntesis de una proteína asociada a una patología puede inhibirse de forma selectiva.

En general, los ácidos nucleicos enzimáticos con actividad de escisión de ARN actúan uniéndose primero a un ARN diana. Dicha unión se produce a través de la parte de unión diana de un ácido nucleico enzimático que se mantiene en estrecha proximidad a una parte enzimática de la molécula que actúa para escindir el ARN diana. De este modo, el ácido nucleico enzimático se reconoce primero y a continuación se une a un ARN diana mediante apareamiento de bases complementario, y una vez se une al sitio correcto, actúa enzimáticamente para cortar el ARN diana. La escisión estratégica de dicho ARN diana destruirá su capacidad para dirigir la síntesis de una proteína codificada. Después de unirse un ácido nucleico enzimático y escindir su ARN diana, se libera de ese ARN para buscar otra diana y puede unirse repetidamente y escindir nuevas dianas.

Varias estrategias como la selección (evolución) in vitro (Orgel, (1979) Proc. R. Soc. London, B 205, 435) se han usado para desarrollar nuevos catalizadores de ácido nucleico capaces de catalizar diversas reacciones, tales como escisión y ligamiento de enlaces fosfodiéster y enlaces amida.

El desarrollo de ribozimas que son óptimas para la actividad catalítica contribuiría significativamente a cualquier estrategia que empleara ribozimas que escinden ARN con el fin de regular la expresión génica. La ribozima de cabeza de martillo, por ejemplo, funciona con una velocidad catalítica (kcat) de aproximadamente 1 min-1 en presencia de concentraciones saturantes (10 mM) de cofactor de Mg2+. Se ha demostrado que una ribozima de "ligasa de ARN" artificial cataliza la reacción de auto-modificación correspondiente con una velocidad de aproximadamente 100 min-1. Además, se sabe que ciertas ribozimas de cabeza de martillo modificadas que tienen brazos de unión al sustrato hechos de ADN catalizan la escisión de ARN con múltiples velocidades de recuperación que se aproximan a 100 min-1. Finalmente, la sustitución de un resto específico dentro del núcleo catalítico de la cabeza de martillo con ciertos análogos de nucleótido produce ribozimas modificadas que muestran una mejora de hasta 10 veces en la velocidad catalítica. Estos descubrimientos demuestran que las ribozimas pueden promover transformaciones químicas con velocidades catalíticas que son significativamente superiores a aquellas mostradas in vitro por la mayoría de las ribozimas que se auto-escinden naturales. Entonces es posible que las estructuras de ciertas ribozimas que se autoescinden puedan optimizarse para dar la máxima actividad catalítica, o que puedan prepararse motivos de ARN completamente nuevos que muestran velocidades significativamente más rápidas para la escisión de fosfodiéster de ARN.

La escisión intermolecular de un sustrato de ARN por un catalizador de ARN que se ajusta al modelo de "cabeza de martillo" se demostró por primera vez en 1987 (Uhlenbeck, O. C. (1987) Nature, 328: 596-600). Se recuperó el catalizador de ARN y se hizo reaccionar con múltiples moléculas de ARN, demostrando que era verdaderamente catalítico.

Se han usado ARN catalíticos diseñados basándose en el motivo de "cabeza de martillo" para escindir secuencias diana específicas haciendo cambios de base apropiados en el ARN catalítico para mantener apareamiento de bases necesarios con las secuencias diana. Esto ha permitido el uso del ARN catalítico para escindir secuencias diana específicas e indica que los ARN catalíticos diseñados según el modelo de "cabeza de martillo" pueden escindir posiblemente ARN de sustrato específico in vivo.

El ARN de interferencia (ARNi) se ha convertido en una poderosa herramienta para modular la expresión génica en mamíferos y células de mamífero. Este enfoque requiere la administración de ARN de interferencia pequeño (ARNip) bien como el propio ARN o bien como ADN, usando un plásmido de expresión o virus y la secuencia codificante para ARN de horquilla pequeño que se procesa a ARNip. Este sistema permite el transporte efectivo de los pre-siRNA al citoplasma donde son activos y permiten el uso de promotores regulados y específicos de tejido para la expresión génica.

En un aspecto, un oligonucleótido o compuesto antisentido comprende un oligómero o polímero de ácido ribonucleico (ARN) y/o ácido desoxirribonucleico (ADN), o un mimético, quimera, análogo u homólogo de los mismos. Este término incluye oligonucleótidos compuestos de nucleótidos de origen natural, azúcares y enlaces internucleosídicos covalentes (estructura), además de oligonucleótidos que tienen partes no de origen natural que funcionan similarmente. Dichos oligonucleótidos modificados o sustituidos son frecuentemente deseados con respecto a las formas nativas debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, mayor captación celular, afinidad mejorada por un ácido nucleico diana y mayor estabilidad en presencia de nucleasas.

De acuerdo con la presente divulgación, los oligonucleótidos o "compuestos antisentido" incluyen oligonucleótidos antisentido (por ejemplo, ARN, ADN, mimético, quimera, análogo u homólogo de los mismos), ribozimas, oligonucleótidos de secuencia de guía externa (EGS), compuestos de siRNA, compuestos de interferencia (ARNi) de ARN mono- o bicatenario tales como compuestos de sírNa , ARNap, aARN, y otros compuestos oligoméricos que hibridan con al menos una parte del ácido nucleico diana y modulan su función. Por lo tanto, pueden ser ADN, a Rn , similares a ADN, similares a ARN, o mezclas de los mismos, o pueden ser miméticos de uno o más de estos. Estos compuestos pueden ser compuestos oligoméricos monocatenarios, bicatenarios, circulares o de horquilla y pueden contener elementos estructurales tales como protuberancias internas o terminales, desapareamientos o bucles. Los compuestos antisentido se preparan de forma habitual linealmente, pero pueden unirse o prepararse de otra manera para que sean circulares y/o ramificados. Los compuestos antisentido pueden comprender construcciones tales como, por ejemplo, dos cadenas hibridadas para formar un compuesto completo o parcialmente bicatenario o una única cadena con auto-complementariedad suficiente para permitir la hibridación y formación de un compuesto completa o parcialmente bicatenario. Las dos cadenas pueden enlazarse internamente, dejando los extremos 3' o 5' libres o pueden enlazarse para formar una estructura de horquilla continua o bucle. La estructura de horquilla puede contener un nucleótido protuberante en cualquiera de los extremos 5' o 3' que produce una extensión del carácter monocatenario.

Los compuestos bicatenarios opcionalmente pueden comprender nucleótidos protuberantes en los extremos. Modificaciones adicionales pueden incluir grupos conjugados unidos a uno de los extremos, posiciones de nucleótido seleccionadas, posiciones de azúcar o a uno de los enlaces internucleosídicos. Como alternativa, las dos cadenas pueden enlazarse mediante un resto de ácido no nucleico o grupo conector. Cuando se forma a partir de solo una cadena, el dsARN puede tomar la forma de una molécula tipo horquilla auto-complementaria que se dobla sobre sí misma para formar un dúplex. De este modo, el dsARN puede ser completa o parcialmente bicatenario. Puede lograrse modulación específica de la expresión génica por expresión estable de horquillas de ARNdc en líneas celulares transgénicas. Cuando se forma a partir de dos cadenas, o una sola cadena que adopta la forma de una molécula de tipo horquilla autocomplementaria que se dobla sobre sí misma para formar un dúplex, las dos cadenas (o regiones formadoras de dúplex de una sola cadena) son cadenas de ARN complementarias que se aparean con bases en el modo de Watson-Crick.

Una vez introducidos a un sistema, los compuestos de la divulgación pueden provocar la acción de una o más enzimas o proteínas estructurales para efectuar la escisión u otra modificación del ácido nucleico diana o pueden trabajar mediante mecanismos basados en la ocupación. En general, los ácidos nucleicos (incluyendo oligonucleótidos) pueden describirse como "similares a ADN" (es decir, que generalmente tienen uno o más 2'-desoxiazúcares y, generalmente, bases T en vez de U) o "similares a ARN" (es decir, que generalmente tienen uno o más 2'-hidroxilazúcares o azucares modificados en 2' y, generalmente bases U en vez de T). Las hélices de ácido nucleico pueden adoptar más de un tipo de estructura, más comúnmente las formas A y B. Se cree que, en general, los oligonucleótidos que tienen estructura similar a la forma B son " de tipo ADN" y aquellos que tienen estructura similar a la forma A son "similares a ARN". En algunas realizaciones (quiméricas), un compuesto antisentido puede contener tanto regiones en forma A como B.

Los compuestos antisentido según esta divulgación pueden comprender una parte antisentido de aproximadamente 5 a aproximadamente 80 nucleótidos (es decir, de aproximadamente 5 a aproximadamente 80 nucleósidos enlazados) de longitud. Esto se refiere a la longitud de la cadena antisentido o parte del compuesto antisentido. En otras palabras, un compuesto antisentido monocatenario de la divulgación comprende de 5 a aproximadamente 80 nucleótidos, y un compuesto antisentido bicatenario de la divulgación (tal como un dsARN, por ejemplo) comprende una cadena sentido y antisentido o parte de 5 a aproximadamente 80 nucleótidos de longitud. Un experto habitual en la materia apreciará que este comprenda partes antisentido de 5, 6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44,45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, u 80 nucleótidos de longitud, o cualquier intervalo entremedio.

En un aspecto, los compuestos antisentido de la descripción tienen partes antisentido de 10 a 50 nucleótidos de longitud. Un experto habitual en la materia apreciará que éstos integran oligonucleótidos que tienen partes antisentido de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 nucleótidos de longitud, o cualquier intervalo intermedio. En algunos aspectos, los oligonucleótidos tienen 15 nucleótidos de longitud.

En un aspecto, los compuestos antisentido o de oligonucleótido de la descripción tienen partes antisentido de 12 o 13 a 30 nucleótidos de longitud. Un experto en la materia apreciará que estos integran compuestos antisentido que tienen partes antisentido de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos de longitud, o cualquier intervalo entremedias.

En un aspecto, los compuestos oligoméricos de la presente divulgación también incluyen variantes en las que una base diferente está presente en una o más de las posiciones de nucleótido en el compuesto. Por ejemplo, si el primer nucleótido es una adenosina, pueden producirse variantes que contienen timidina, guanosina o citidina en esta posición. Esto puede hacerse en cualquiera de las posiciones de los compuestos antisentido o de dsARN. Estos compuestos se ensayan a continuación usando los procedimientos descritos en esta invención para determinar su capacidad para inhibir la expresión de un ácido nucleico diana.

En algunos aspectos, la homología, identidad de secuencias o complementariedad, entre el compuesto antisentido y la diana, es de aproximadamente el 40 % a aproximadamente el 60 %. En algunos aspectos, la homología, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 60 % a aproximadamente el 70 %. En algunos aspectos, la homología, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 70 % a aproximadamente el 80 %. En algunos aspectos, la homología, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 80 % a aproximadamente el 90 %. En algunos aspectos, la homología, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 94 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 %.

En un aspecto, los oligonucleótidos antisentido, tales como, por ejemplo, las moléculas de ácidos nucleicos expuestas en SEQ ID NOS: 29 a 94 comprenden una o más sustituciones o modificaciones. En un aspecto, los nucleótidos están sustituidos con ácidos nucleicos bloqueados (ANB).

En un aspecto, los oligonucleótidos se dirigen a una o más regiones de las moléculas de ácidos nucleicos sentido y/o antisentido de secuencias codificantes y/o no codificantes asociadas al gen SCNA y las secuencias expuestas como SEQ ID NOS: 1 a 28. Los oligonucleótidos también se dirigen a regiones solapantes de SEQ ID NOS: 1 a 28.

Determinados oligonucleótidos preferidos de esta descripción son los oligonucleótidos quiméricos. "Oligonucleótidos quiméricos" o "quimeras", en el contexto de esta divulgación, son oligonucleótidos que contienen dos o más regiones químicamente distintas, cada una constituida por al menos un nucleótido. Estos oligonucleótidos típicamente contienen al menos una región de nucleótidos modificados que confiere una o más propiedades beneficiosas (tales como, por ejemplo, una mayor resistencia a nucleasas, una mayor captación en células, una mayor afinidad de unión por la diana) y una región que es un sustrato para enzimas capaces de escindir híbridos de ARN:ADN o ARN:ARN. A modo de ejemplo, la ARNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de un dúplex de ARN:ADN. La activación de RNasa H, por lo tanto, produce la escisión del ARN diana, potenciando así enormemente la eficiencia de la modulación antisentido de la expresión génica. Por consiguiente, frecuentemente pueden obtenerse resultados comparables con oligonucleótidos más cortos cuando se usan oligonucleótidos quiméricos, en comparación con desoxioligonucleótidos de fosforotioato que hibridan con la misma región diana. La escisión de la diana de ARN puede ser detectada de manera rutinaria mediante electroforesis y, si es necesario, técnicas de hibridación de ácido nucleico asociadas conocidas en la técnica. En un aspecto, un oligonucleótido quimérico comprende al menos una región modificada para aumentar la afinidad de unión de la diana, y, normalmente, una región que actúa como sustrato para RNasa H. La afinidad de un oligonucleótido por su diana (en este caso, un ácido nucleico que codifica ras) se determina rutinariamente midiendo la Tm de un par de oligonucleótido/diana, que es la temperatura a la que se disocian el oligonucleótido y la diana; la disociación se detecta por espectrofotometría. Cuanto mayor sea la Tm, mayor será la afinidad del oligonucleótido por la diana.

Se pueden formar compuestos antisentido quiméricos de la divulgación como estructuras compuestas de dos o más oligonucleótidos, oligonucleótidos modificados, oligonucleósidos y/o miméticos de oligonucleótidos, tal como se ha descrito anteriormente. Como tales, estos compuestos también se han referido en la técnica como híbridos o gapmeros. Patentes representativas de EE. UU. que enseñan la preparación de tales estructuras híbridas comprenden, pero no se limitan a, Patente EE. UU. nos. 5.013.830; 5.149.797; 5. 220.007; 5.256.775; 5.366.878; 5.403.711; 5.491.133; 5.565.350; 5.623.065; 5.652.355; 5.652.356; y 5.700.900.

En un aspecto, la región del oligonucleótido que se modifica comprende al menos un nucleótido modificado en la posición 2' del azúcar, de la forma más preferente un nucleótido modificado con 2'-O-alquilo, 2'-O-alquil-O-alquilo o 2'-fluoro. En otro aspecto, las modificaciones de ARN incluyen modificaciones de 2'-flúor, 2'-amino y 2'-O-metilo en la ribosa de pirimidinas, residuos abásicos o una base invertida en el extremo 3' del ARN. Dichas modificaciones se incorporan rutinariamente en oligonucleótidos y se ha demostrado que estos oligonucleótidos tienen una mayor Tm (es decir, mayor afinidad de unión a diana) que los 2'-desoxioligonucleótidos contra una diana dada. El efecto de tal afinidad incrementada es mejorar enormemente la inhibición por oligonucleótidos de ARNi de la expresión génica. La ARNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de los dúplex de ARN:ADN; por lo tanto, la activación de esta enzima produce la escisión del ARN diana, y así puede mejorar en gran medida la eficiencia de inhibición de ARNi. La escisión de la diana de ARN puede demostrarse rutinariamente por electroforesis en gel. En un aspecto, el oligonucleótido quimérico también se modifica para mejorar la resistencia a las nucleasas. Las células contienen una variedad de exo y endonucleasas que pueden degradar los ácidos nucleicos. Se ha demostrado que una serie de modificaciones de nucleótidos y nucleósidos hacen que el oligonucleótido en el que se incorporan sea más resistente a la digestión por nucleasa que el oligodesoxinudeótido nativo; La resistencia a las nucleasas se mide de forma rutinaria incubando oligonucleótidos con extractos celulares o soluciones de nucleasas aisladas y midiendo la extensión del oligonucleótido intacto que queda a lo largo del tiempo, normalmente mediante electroforesis en gel. Los oligonucleótidos que se han modificado para mejorar su resistencia a nucleasas sobreviven intactos durante más tiempo que los oligonucleótidos sin modificar. Se ha demostrado que diversas modificaciones de oligonucleótidos potencian o confieren resistencia a nucleasas. Los oligonucleótidos que contienen al menos una modificación de fosforotioato son actualmente más preferidos. En algunos casos, las modificaciones de oligonucleótidos que potencian la afinidad de unión a diana son, también, independientemente, capaces de mejorar la resistencia a nucleasas.

Ejemplos específicos de algunos oligonucleótidos preferidos concebidos por esta descripción incluyen aquellos que comprenden estructuras modificadas, por ejemplo, fosforotioatos, fosfotriésteres, metilfosfonatos, enlaces entre azúcares de alquilo o cicloalquilo de cadena corta o enlaces entre azúcares heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Los más preferidos son los oligonucleótidos con cadenas principales de fosforotioato y aquellos con estructuras de heteroátomos, particularmente CH2--NH--O-CH2, CH,--N(CH3)--O--CH2 [conocido como una estructura de metileno (metilimino) o MMI], estructuras de CH2--O--N(CH3)--CH2, CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2 y O--N*(CH3)--CH2--CH2, donde la estrucura del fosfodiéster nativo se representa como O--P-O--CH²). Las estructuras de amida descritas por De Mesmaeker y col. (1995) Acc. Chem. Res. 28:366-374 también se prefieren. También se prefieren oligonucleótidos que tienen estructuras principales de morfolino (Summerton y Weller, Pat. EE. UU. No. 5.034.506). En otros aspectos, tal como la estructura de ácido nucleico peptídico (a Np ), la estructura de fosfodiéster del oligonucleótido se sustituye por una estructura de poliamida, estando los nucleótidos unidos directamente o indirectamente a los átomos de nitrógeno azo de la estructura de poliamida. Los oligonucleótidos también pueden comprender uno o más restos de azúcar sustituidos. Oligonucleótidos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2': OH, SH, SCH3, F, OCN, OCH3 OCH3, OCH3 O(CH2)n CH3, O(CH2)n NH2 or O(CH2)n CH3 donde n es de 1 a aproximadamente 10; C1 a C10 alquilo inferior, alcoxialcoxi, alquilo inferior sustituido, alcarilo o aralquilo; Cl; Br; CN; CF3 ; OCF3; O--, S--, o N-alquilo; O-, S--, o N-alquenilo; SOCH3; SO2 CH3, ONO2; NO2; N3; NH2; heterocicloalquilo; heterocicloalcarilo; aminoalquilamino; polialquilamino; sililo sustituido; un grupo de escisión de ARN; un grupo de reporteros; un intercalador; un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido; o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Una modificación preferida incluye 2'-metoxietoxi [2'-O-CH2 CH2 OCH3, también conocido como 2'-O-(2-metoxietilo)]. Otras modificaciones preferidas incluyen 2'-metoxi (2'-O--CH3), 2'-propoxi(2'-OCH2 CH2CH3) y 2'-flúor (2'-F). También pueden hacerse modificaciones similares en otras posiciones sobre el oligonucleótido, particularmente la posición 3' del azúcar en el nucleótido terminal 3' y la posición 5' del nucleótido del terminal 5'. Los oligonucleótidos también pueden tener miméticos de azúcar tales como ciclobutilos en lugar del grupo pentofuranosilo.

Los oligonucleótidos también pueden incluir, además o como alternativa, modificaciones o sustituciones de nucleobases (con frecuencia denominadas en la técnica simplemente "base"). Tal como se usa en esta invención, nucleótidos "no modificados" o "naturales" incluyen adenina (A), guanina (G), timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Los nucleótidos modificados incluyen nucleótidos encontrados solo poco frecuentemente o transitoriamente en ácidos nucleicos naturales, por ejemplo, hipoxantina, 6-metiladenina, 5-Me-pirimidinas, particularmente 5-metilcitosina (también denominada 5-metil-2'-desoxicitosina y frecuentemente denominada en la técnica 3-Me-C), 5-hidroximetilcitosina (HMC), glicosil HMC y gentobiosil HMC, además de nucleótidos sintéticos, por ejemplo, 2­ aminoadenina, 2-(metilamino)adenina, 2-(imidazolilalquil)adenina, 2-(aminoalquilamino)adenina u otras alquiladeninas heterosustituidas, 2-tiouracilo, 2-tiotimina, 5-bromouracilo, 5-hidroximetiluracilo, 8-azaguanina, 7-deazaguanina, N6(6-aminohexil)adenina y 2,6-diaminopurina. Puede incluirse una base "universal" conocida en la técnica, por ejemplo, inosina. Se ha demostrado que las sustituciones 5-ME-C aumentan la estabilidad de los dúplex de ácidos nucleicos en 0,6-1,2 °C., y actualmente son las sustituciones de base preferidas.

Otra modificación de los oligonucleótidos de la descripción implica enlazar químicamente al oligonucleótido uno o más restos o conjugados que mejoran la actividad o captación celular del oligonucleótido. Esos restos incluyen, pero no se limitan a restos lipídicos como restos de colesterol, restos de colesterilo, una cadena alifática, p. ej. restos de dodecandiol o undecilo, una poliamina o una cadena de polietilenglicol, o ácido adamantano acético. Los oligonucleótidos que comprenden restos lipófilos, y procedimientos para preparar dichos oligonucleótidos, son conocidos en la técnica, por ejemplo, Pat. EE. UU. Nos. 5.138.045, 5.118.105 y 5.459.255.

No es necesario que todas las posiciones en un oligonucleótido dado estén uniformemente modificadas, y de hecho más de una de las modificaciones mencionadas anteriormente puede incorporarse en un único oligonucleótido o incluso dentro de un único nucleósido dentro de un oligonucleótido. La presente descripción también incluye oligonucleótidos que son oligonucleótidos quiméricos, como se ha definido anteriormente en esta invención.

En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico de la presente divulgación está conjugada con otro resto que incluye, aunque no se limita a, nucleótidos abásicos, poliéter, poliamina, poliamidas, péptidos, hidratos de carbono, lípido, o compuestos de polihidrocarburo. Los expertos en la materia reconocerán que estas moléculas pueden enlazarse a uno o más de cualquiera de los nucleótidos que comprenden la molécula de ácido nucleico en varias posiciones en el azúcar, base o grupo fosfato.

Los oligonucleótidos usados según esta descripción pueden prepararse de manera práctica y habitual mediante la técnica muy conocida de síntesis de fase. Los equipos para dicha síntesis son comercializados por varios proveedores que incluyen Applied Biosystems. También puede emplearse cualquier otro medio para dicha síntesis; la síntesis real de los oligonucleótidos está perfectamente dentro de las aptitudes de un experto en la materia. También es muy conocido usar técnicas similares para preparar otros oligonucleótidos tales como fosforotioatos y derivados alquilados. También es muy conocido usar técnicas similares y amiditos modificados disponibles en el mercado y productos de vidrio de poro controlado (CPG) tales como biotina, fluoresceína, acridina o amiditos modificados con psoraleno y/o CPG (disponible en Glen Research, Sterling VA) para sintetizar oligonucleótidos marcados de forma fluorescente, biotinilados u otros oligonucleótidos modificados tales como oligonucleótidos modificados con colesterol.

De acuerdo con la divulgación, el uso de modificaciones tales como el uso de monómeros de ANB para mejorar la potencia, especificidad y duración de la acción y ampliar las vías de administración de oligonucleótidos comprende químicas actuales tales como MOE, ANA, FANA, PS, etc. Esto puede lograrse al sustituir alguno de los monómeros en los oligonucleótidos actuales por monómeros de ANB. Los oligonucleótidos modificados con ANB pueden tener un tamaño similar al compuesto parental o puede ser más grandes o preferiblemente más pequeños. Se prefiere que dichos oligonucleótidos modificados con ANB contengan menos de aproximadamente el 70 %, más preferiblemente menos de aproximadamente el 60 %, lo más preferiblemente menos de aproximadamente el 50 % de monómeros de ANB y que sus tamaños estén entre aproximadamente 5 y 25 nucleótidos, más preferiblemente entre aproximadamente 12 y 20 nucleótidos.

Estructuras de oligonucleótidos modificados preferidos comprenden, aunque no se limitan a, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, metil y otros alquil fosfonatos que comprenden 3'-alquilenfosfonatos y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos que comprenden 3'-amino fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres y boranofosfatos que tienen enlaces 3'-5' normales, análogos enlazados en 2'-5' de estos, y aquellos que tienen polaridad invertida, donde los pares adyacentes de conjuntos de nucleósidos están enlazados 3'-5' a 5'-3' o 2'-5' a 5'-2'. También están incluidas diversas sales, sales mixtas y formas de ácido libre.

Patentes EE. UU. Representativas que enseñan la preparación de los enlaces que contienen fósforo anteriores comprenden, pero no se limitan a, Patentes EE. UU. Nos. 3.687.808; 4.469.863; 4.476.301; 5.023.243; 5. 177.196; 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019; 5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939; 5.453.496; 5.455. 233; 5.466.677; 5.476.925; 5.519.126; 5.536.821; 5.541.306; 5.550.111; 5.563. 253; 5.571.799; 5.587.361; y 5.625.050.

Estructuras de oligonucleótido modificadas preferidas que no incluyen un átomo de fósforo en ellos tienen estructuras que se forman por enlaces internucleosídicos de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, enlaces internucleosídicos de heteroátomo y alquilo o cicloalquilo mixtos, o uno o más enlaces internucleosídicos heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Estos comprenden aquellos que tienen enlaces morfolino (formados en parte a partir de la parte de azúcar de un nucleósido); estructuras de siloxano; estructuras de sulfuro, sulfóxido y sulfona; estructuras de formacetilo y tioformacetilo; estructuras de metilenformacetilo y tioformacetilo; estructuras que contienen alqueno; estructuras de sulfamato; estructuras de metilenimino y metilenhidrazino; estructuras de sulfonato y sulfonamida; estructuras de amida; y otros que tienen partes de componentes de N, O, S y CH2 mixtos.

Patentes EE. UU. representativas que enseñan la preparación de los oligonucleósidos anteriores comprenden, pero no se limitan a, Patentes EE. UU. Nos. 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134; 5.216.141; 5.235.033; 5.264. 562; 5. 264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225; 5.596. 086; 5.602.240; 5.610.289; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704. 5.623.070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; y 5.677.439.

En otros miméticos de oligonucleótidos preferidos, tanto el azúcar como el enlace internucleosídico, es decir, la estructura, de las unidades de nucleótido se sustituyen por grupos novedosos. Las unidades de base se mantienen para la hibridación con un compuesto de ácido nucleico diana adecuado. Dicho compuesto oligomérico, un mimético de oligonucleótido que se ha demostrado que tiene excelentes propiedades de hibridación, se denomina ácido nucleico peptídico (ANP). En compuestos de ANP, la estructura de azúcar de un oligonucleótido se sustituye por una estructura que contiene amida, en particular una estructura de aminoetilglicina. Las nucleobases son retenidas y se unen directamente o indirectamente a átomos de nitrógeno azo de la parte de amida de la estructura. Las patentes representativas EE. UU. que enseñan la preparación de compuestos de ANP comprenden, pero no se limitan a, patentes EE. UU n.° 5.539.082; 5.714.331; y 5.719.262.

Enseñanzas adicionales de compuestos de ANP pueden encontrarse en Nielsen, y col. (1991) Science 254, 1497­ 1500.

En un aspecto de la divulgación, los oligonucleótidos con cadenas principales de fosforotioato y oligonucleósidos con cadenas principales de heteroátomos, y en particular- CH2-NH-O-CH2-,-CH2-N (CH3)-O-CH2-conocido como estructura de metileno (metilimino) o MMl,- CH2-O-N (CH3)-CH2-,-CH2N(CH3)-N(CH3) CH2-y-O-N(CH3)-CH2-CH2-donde la estructura del fosfodiéster nativo se representa como-O-P-O-CH2- de la Patente EE. UU. No, 5.489.677, citada anteriormente, y las estructuras de amida de la Patente EE. UU. No, 5.602.240, citada anteriormente. También se prefieren oligonucleótidos que tienen estructura principal de morfolino de la Patente EE. UU. 5.034.506citada anteriormente.

Los oligonucleótidos modificados también pueden contener uno o más restos de azúcar sustituidos. Los oligonucleótidos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2': OH; F; O-, S- o N-alquilo; O-, S-, o N-alquenilo; O-, S- o N-alquinilo; o O-alquil-O-alquilo, donde el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo C a CO sustituido o sin sustituir o alquenilo y alquinilo C2 a CO. Se prefieren particularmente O(CH2)n OmCH3, O(CH2)n, OCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 y O(CH2nON(CH2)nCH3)2 en las que n y m pueden ser de 1 a aproximadamente 10. Otros oligonucleótidos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2': C a CO, (alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH3, o Cn , Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, n H2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo indicador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Una modificación preferida comprende 2'-metoxietoxi (2'-O-CH2CH2OCH3, también conocido como 2'-O-(2-metoxietilo) o 2'-MOE) es decir, un grupo alcoxialcoxi. Otra modificación preferida comprende 2'-dimetilaminooxietoxi, es decir, un grupo O(CH2)2ON(CH3)2, también conocido como 2'-DMAOE, tal como se describe en los ejemplos en esta invención más adelante, y 2'-dimetilaminoetoxietoxi (también conocido en la técnica como 2'-O-dimetilaminoetoxietilo o 2'-DMAEOE), es decir, 2'-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2.

Otras modificaciones preferidas comprenden 2'-metoxi (2'-OCH3), 2'-aminopropoxi (2'-OCH2CH2CH2NH2) y 2'-fluoro (2'-F). También pueden hacerse modificaciones similares en otras posiciones en el oligonucleótido, particularmente la posición 3' del azúcar en el nucleótido del extremo 3' o en oligonucleótidos enlazados 2'-5' y la posición 5' del nucleótido del extremo 5'. Los oligonucleótidos también pueden tener miméticos de azúcar tales como restos ciclobutilo en lugar del azúcar pentofuranosilo. Patentes representativas de los EE. UU. que enseñan la preparación de tales estructuras de azúcar modificadas comprenden, pero no se limitan a, Patentes Ee . UU. Nos. 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514, 785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646, 265; 5,658,873; 5,670,633; y 5,700,920.

Los oligonucleótidos también pueden comprender modificaciones o sustituciones de nucleobases (con frecuencia denominadas en la técnica simplemente "base"). Tal como se usa en esta invención, nucleótidos "no modificados" o "naturales" comprenden las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Los nucleótidos modificados comprenden otros nucleótidos sintéticos y naturales tales como 5­ metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, derivados de 6-metilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, derivados de 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propiniluracilo y citosina, 6-azouracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudo-uracilo), 4-tiouracilo, 8-halógeno, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas sustituidas en 8, 5-halógeno, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas sustituidos en 5, 7-metilquanina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina.

Además, nucleótidos comprenden los descritos en la Patente EE. UU. No. 3.687.808, los descritos en The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering', pags. 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990, los descritos por Englisch y col., 'Angewandle Chemie, International Edition', 1991, 30, pag. 613, y los descritos por Sanghvi, Y.S., Chapter 15, 'Antisense Research and Applications', pags. 289-302, Crooke, S.T. and Lebleu, B. y col., CRC Press, 1993. Algunos de estos nucleótidos son particularmente útiles para incrementar la afinidad de unión de los compuestos oligoméricos de la divulgación. Estos comprenden pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas sustituidas en N-2, N-6 y 0-6, que comprenden 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se ha mostrado que las sustituciones de 5-metilcitosina incrementan la estabilidad del dúplex de ácido nucleico alrededor de 0,6-1,2 °C (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds, 'Antisense Research and Applications', CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) y actualmente son las sustituciones base preferidas, de manera aún más particular cuando se combinan con modificaciones de azúcar de 2'-Ometoxietilo.

Patentes representativas de los EE. UU. que enseñan la preparación de los nucleótidos modificados mencionados anteriormente, así como otros nucleótidos modificados comprenden, pero no se limitan a, Patentes EE. UU. Nos.

3.687.808. así como 4.845.205; 5.130.302; 5.134.066; 5.175. 273; 5. 367.066; 5.433.272. 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.596.091; 5.614.617; 5.750.692. y 5.681.941.

Otra modificación de los oligonucleótidos de la descripción implica enlazar químicamente al oligonucleótido uno o más restos o conjugados que mejoran la actividad, la distribución celular, o la captación celular del oligonucleótido.

Dichos restos comprenden, aunque no se limitan a, restos de lípido tales como un resto colesterol, ácido cólico, un tioéter, por ejemplo, hexil-5-tritiltiol, un tiocolesterol, una cadena alifática, por ejemplo, residuos de dodecanodiol o undecilo, un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio, una poliamina o una cadena de polietilenglicol, o ácido adamantano acético, un resto palmitilo, o un resto octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol.

Patentes representativas de los EE. UU. que enseñan la preparación de tales conjugados de oligonucleótidos comprenden, pero no se limitan a, Patentes EE. UU. Nos. 4.828.979; 4.948.882; 5.218.105; 5.525.465; 5.541.313; 5.545.730; 5.552. 538; 5.578.717. 5.580.731; 5.580.731; 5.591.584; 5.108.124; 5.118.802; 5.138.045; 5.414.077; 5.486. 603; 5.512.439; 5.578.718; 5.608.046; 4.587.044; 4.605.735; 4.667.025; 4.762. 779; 4.789.737; 4.824.941; 4.835.263; 4.876.335; 4.904.582; 4.958.013; 5.082. 830; 5.112.963; 5.214.136; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.

245.022; 5.254.469; 5.258.506; 5.262.536; 5.272.250; 5.292.873; 5.317.098; 5.371.241. 5.391. 723; 5.416.203.

5.451.463; 5.510.475; 5.512.667; 5.514.785; 5. 565.552; 5.567.810; 5.574.142; 5.585.481; 5.587.371; 5.595.726; 5.597.696; 5.599.923; 5.599.928 y 5.688.941.

Descubrimiento de fármacos: Los compuestos de la presente divulgación también pueden aplicarse en las áreas del descubrimiento de fármacos y validación de dianas. La presente divulgación comprende el uso de los compuestos y los segmentos diana preferidos identificados en esta invención en los esfuerzos de descubrimiento de fármacos para dilucidar las relaciones que existen entre los polinucleótidos del canal de sodio, los polinucleótidos de subunidad alfa controlados por voltaje (SCNA) y una enfermedad, fenotipo o afección. Estos procedimientos incluyen detectar o modular los polinucleótidos de g Lo BINA que comprenden poner en contacto una muestra, tejido, célula u organismo con los compuestos de la presente divulgación, medir el nivel de ácido nucleico o de proteína de los polinucleótidos de GLOBINA y/o un criterio de valoración fenotípico o químico relacionado en algún momento después del tratamiento, y opcionalmente comparar el valor medido con una muestra no tratada o muestra tratada con otro compuesto de la divulgación. Estos procedimientos también pueden realizarse en paralelo o en combinación con otros experimentos para determinar la función de genes desconocidos para el procedimiento de validación de dianas o para determinar la validez de un producto génico particular como diana para el tratamiento o prevención de una enfermedad, afección o fenotipo particular.

Evaluación de la regulación positiva o inhibición de la expresión génica:

La transferencia de un ácido nucleico exógeno a una célula u organismo huésped puede evaluarse detectando directamente la presencia del ácido nucleico en la célula u organismo. Dicha detección puede lograse mediante varios procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la presencia del ácido nucleico exógeno puede detectarse por Southern blot o por una técnica de reacción en cadena de la polimerasa (RCP) usando cebadores que amplifican específicamente secuencias de nucleótidos asociadas al ácido nucleico. La expresión de los ácidos nucleicos exógenos también puede medirse usando procedimientos convencionales que incluyen el análisis de expresión génica. Por ejemplo, el ARNm producido a partir de un ácido nucleico exógeno puede detectarse y cuantificarse usando una Northern blot y RCP con transcripción inversa (RCP-TI).

La expresión de un ARN del ácido nucleico exógeno también puede detectarse midiendo una actividad enzimática o una actividad de proteína reportera. Por ejemplo, puede medirse la actividad moduladora antisentido indirectamente como una disminución o aumento en la expresión de ácido nucleico diana como una indicación de que el ácido nucleico exógeno está produciendo el ARN efector. Basándose en conservación de secuencias, pueden diseñarse cebadores y usarse para amplificar regiones codificantes de los genes diana. Inicialmente, la región codificante más altamente expresada de cada gen puede usarse para construir un gen de control modelo, aunque puede usarse cualquier región codificante o no codificante. Cada gen de control se ensambla insertando cada región de codificación entre una región de codificación informadora y su señal poli (A). Estos plásmidos producirían un ARNm con un gen indicador en la parte aguas arriba del gen y una potencial diana de ARNi en la región no codificante 3'. La eficacia de oligonucleótidos antisentido individuales se ensayaría por modulación del gen indicador. Los genes reporteros útiles en los procedimientos de la presente divulgación incluyen acetohidroxiácido sintasa (AHAS), fosfatasa alcalina (AP), beta-galactosidasa (LacZ), beta-glucuronidasa (GUS), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), proteína verde fluorescente (GFP), proteína roja fluorescente (RFP), proteína amarilla fluorescente (YFP), proteína cian fluorescente (CFP), peroxidasa de rábano picante (MRP), luciferasa (Luc), nopalina sintasa (NOS), octopina sintasa (OCS), y derivados de los mismos. Están disponibles múltiples marcadores de selección que confieren resistencia a ampicilina, bleomicina, cloranfenicol, gentamicina, higromicina, kanamicina, lincomicina, metotrexato, fosfinotricina, puromicina y tetraciclina. Los procedimientos para la determinación de la modulación de un gen reportero son muy conocidos en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a, procedimientos fluorimétricos (por ejemplo, espectroscopía de fluorescencia, clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), microscopía de fluorescencia), determinación de la resistencia a antibióticos.

Segmentos de ácido nucleico diana también se pueden detectar en los ensayos basados en células. Se llevan a cabo experimentos para detectar el BG724147 antisentido natural de Senla en HepG2, en fibroblastos humanos primarios que llevan una mutación asociada al síndrome de Dravet y también en testículos humanos. Para HepG2, así como para fibroblastos humanos primarios que portan una mutación asociada al síndrome de Dravet, las células se cultivan y se extrae el ARN. Para el testículo humano, se compra y utiliza ARN aislado con poliA. Este experimento se denomina RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends - amplificación rápida de extremos de ADNc) y se utilizan cebadores específicos para la transcripción de ARN BG724147.

Se detectó un producto de PCR muy similar en ARN aislado con poliA de HepG2 de fibroblastos humanos primarios que portaban una mutación asociada al síndrome de Dravet, pero este producto no se detectó en poli A ARN aislado de testículo humano. Además, ese producto de PCR no se detectó (o en cantidades muy muy bajas) en el ARN total de las células HepG2 y el ARN total de los fibroblastos humanos primarios portadores de una mutación asociada al síndrome de Dravet. Los resultados sugieren que el antisentido natural para Scn1a llamado BG724147 está presente en células HepG2 y fibroblastos humanos primarios que llevan una mutación asociada al síndrome de Dravet pero no en Testículos humanos.

La expresión de la proteína y el ARNm de SCNA se pueden valorar usando procedimientos conocidos por los expertos en la materia y descritos en otra parte en esta invención. Por ejemplo, pueden usarse inmunoensayos tales como ELISA para medir los niveles de proteínas. Los kits de ensayo e L isA para SCNA están disponibles comercialmente, p. ej., en R&D Systems (Minneapolis, MN).

En aspectos, la expresión de SCNA (por ejemplo, ARNm o proteína) en una muestra (por ejemplo, células o tejidos in vivo o in vitro) tratada usando un oligonucleótido antisentido de la divulgación se evalúa comparando con la expresión de SCNA en una muestra de control. Por ejemplo, la expresión de la proteína o ácido nucleico puede compararse usando procedimientos conocidos para los expertos en la materia con aquella en una muestra tratada con vector simulado o sin tratar. De forma alternativa, puede hacerse una comparación con una muestra tratada con un oligonucleótido antisentido control (p. ej., uno que tenga una secuencia modificada o diferente) dependiendo de la información deseada. En otro aspecto, una diferencia en la expresión de la proteína SCNA o su ácido nucleico en una muestra tratada frente a una muestra sin tratar puede compararse con la diferencia en la expresión de un ácido nucleico diferente (incluyendo cualquier estándar que el investigador considere apropiado, p. ej. un gen de mantenimiento) en una muestra tratada frente a una muestra sin tratar.

Las diferencias observadas pueden expresarse según se desee, por ejemplo, en forma de una relación o fracción, para su uso en una comparación con control. En unos aspectos, el nivel de ARNm o proteína de SCNA, en una muestra tratada con un oligonucleótido antisentido de la presente divulgación, aumenta o disminuye entre aproximadamente 1,25 veces a unas 10 veces o más en relación con una muestra sin tratar o una muestra tratada con un ácido nucleico de control. En unos aspectos, el nivel de ARNm de SCNA o proteína aumenta o disminuye en al menos aproximadamente 1,25 veces, al menos aproximadamente 1,3 veces, al menos aproximadamente 1,4 veces, al menos aproximadamente 1,5 veces, al menos aproximadamente 1,6 veces, al menos aproximadamente 1,7 veces, al menos aproximadamente 1,8 veces, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 2,5 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 3,5 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 4,5 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 5,5 veces, al menos aproximadamente 6 veces, al menos aproximadamente 6,5 veces, al menos aproximadamente 7 veces, al menos aproximadamente 7,5 veces, al menos aproximadamente 8 veces, al menos aproximadamente 8,5 veces, al menos aproximadamente 9 veces, al menos aproximadamente 9,5 veces, o al menos aproximadamente 10 veces o más.

Kits, reactivos de investigación, diagnósticos y terapéuticos

Los compuestos de la presente descripción pueden utilizarse para diagnósticos, agentes terapéuticos y profilaxis, y como reactivos de investigación y componentes de kits. Además, los oligonucleótidos antisentido, que son capaces de inhibir la expresión génica con exquisita especificidad, son usados con frecuencia por los expertos en la materia para dilucidar la función de genes particulares o para distinguir entre funciones de diversos miembros de una vía biológica.

Para su uso en kits y diagnósticos y en diversos sistemas biológicos, los compuestos de la presente descripción, tanto solos como en combinación con otros compuestos o agentes terapéuticos, son útiles como herramientas en análisis diferenciales y/o combinatorios para dilucidar patrones de expresión de una parte o de todo el complemento de genes expresados dentro de células y tejidos.

Tal como se usa en esta invención, la expresión "sistema biológico" o "sistema" se define como cualquier organismo, célula, cultivo celular o tejido que expresa, o se ha hecho competente para expresar productos de genes de la frataxina (SCNA). Estos incluyen, pero no se limitan a, seres humanos, animales transgénicos, células, cultivos celulares, tejidos, xenoinjertos, trasplantes y combinaciones de los mismos.

Como ejemplo no limitante, patrones de expresión dentro de células o tejidos tratados con uno o más compuestos antisentido se comparan con células o tejidos de control no tratados con compuestos antisentido y los patrones producidos se analizan para niveles diferenciales de expresión génica, ya que están relacionados, por ejemplo, con asociación de enfermedad, vía de señalización, localización celular, nivel de expresión, tamaño, estructura o función de los genes examinados. Estos análisis pueden realizarse en células estimuladas o sin estimular y en presencia o ausencia de otros compuestos que afectan los patrones de expresión.

Ejemplos de procedimientos de análisis de la expresión génica conocidos en la técnica incluyen micromatrices o matrices de ADN, SAGE (análisis en serie de expresión génica), READS (amplificación por enzimas de restricción de los ADNc digeridos), TOGA (análisis de expresión génica total), matrices de proteínas y proteómicos, secuenciación de marca de secuencia expresada (EST), huella de ADN sustractiva (SuRF), clonación sustractiva, presentación diferencial (DD), hibridación genómica comparativa, técnicas de FISH (hibridación in situ fluorescente) y procedimientos de espectrometría de masas.

Los compuestos de la divulgación son útiles para la investigación y el diagnóstico, porque estos compuestos se hibridan con ácidos nucleicos que codifican el canal de sodio, subunidad alfa controlada por voltaje (SCNA). Por ejemplo, los oligonucleótidos que hibridan con dicha eficiencia y en dichas condiciones que se han descrito en esta invención como moduladores efectivos del SCNA son cebadores o sondas efectivos en condiciones que favorecen la amplificación génica o detección, respectivamente. Estos cebadores y sondas son útiles en procedimientos que requieren la detección específica de moléculas de ácidos nucleicos que codifican SCNA y en la amplificación de dichas moléculas de ácidos nucleicos para la detección o para su uso en estudios adicionales de SCNA. La hibridación de los oligonucleótidos antisentido, en particular los cebadores y las sondas, de la descripción con un ácido nucleico que codifica SCNA puede detectarse por medios conocidos en la técnica. Dichos medios pueden incluir la conjugación de una enzima con el oligonucleótido, el radiomarcaje del oligonucleótido o cualquier otro medio de detección adecuado. También pueden prepararse kits que usan dichos medios de detección para detectar el nivel de SCNA en una muestra.

La especificidad y sensibilidad del antisentido también es aprovechada por los expertos en la materia para usos terapéuticos. Se han empleado compuestos antisentido como restos terapéuticos en el tratamiento de patologías en animales, que incluyen seres humanos. Los fármacos de oligonucleótido antisentido se han administrado con seguridad y eficazmente a seres humanos y numerosos ensayos clínicos están actualmente en marcha. Así, se establece que los compuestos antisentido pueden ser modalidades terapéuticas útiles que pueden configurarse para ser útiles en regímenes de tratamiento para el tratamiento de células, tejidos y animales, especialmente seres humanos.

Para terapéutica, un animal, preferiblemente un ser humano, que se sospecha que tiene una enfermedad o trastorno que puede tratarse modulando la expresión de la polinucleótidos de SCNA se trata administrando compuestos antisentido según esta divulgación. Por ejemplo, en un aspecto no limitante, los procedimientos comprenden la etapa de administrar al animal que necesita tratamiento una cantidad terapéuticamente efectiva del modulador de SCNA. Los moduladores de SCNA de la presente divulgación modulan de manera efectiva la actividad de SCNA o modulan la expresión de la proteína SCNA. En un aspecto, la actividad o expresión del SCNA en un animal se inhibe aproximadamente el 10 % en comparación con un control. Preferiblemente, la actividad o expresión de SCNA en un animal se inhibe aproximadamente el 30 %. Más preferiblemente, la actividad o expresión de SCNA en un animal se inhibe en un 50 % o más. Por lo tanto, los compuestos oligoméricos modulan la expresión del ARNm de subunidad alfa (SCNA) dependiente de voltaje del canal de sodio en al menos un 10 %, al menos un 50 %, al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, en al menos 50 %, en al menos 60 %, en al menos 70 %, en al menos 75 %, en al menos 80 %, en al menos 85 %, en al menos 90 %, en al menos 95 %, en al menos al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % en comparación con un control.

En un aspecto, la actividad o expresión del canal de sodio, subunidad alfa controlada por voltaje (SCNA) y/o en un animal aumenta en aproximadamente un 10 % en comparación con un control. Preferiblemente, la actividad o expresión de SCNA en un animal se aumenta en aproximadamente el 30 %. Más preferiblemente, la actividad o expresión de SCNA en un animal se aumenta en el 50 % o más. Así, los compuestos oligoméricos modulan la expresión de SCNA mRN A en al menos 10 %, al menos 50 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o en un 100 % en comparación con un control.

Por ejemplo, la reducción de la expresión del canal de sodio, subunidad alfa controlada por voltaje (SCNA) puede medirse en suero, sangre, tejido adiposo, hígado o cualquier otro fluido corporal, tejido u órgano del animal. Preferiblemente, las células contenidas dentro de dichos fluidos, los tejidos u órganos que se analizan contienen una molécula de ácido nucleico que codifica péptidos SCNA y/o la propia proteína SCNA.

Los compuestos de la divulgación pueden emplearse en composiciones farmacéuticas añadiendo una cantidad efectiva de un compuesto a un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado. El uso de los compuestos y procedimientos de la invención también pueden ser útiles profilácticamente.

Conjugados

Otra modificación de los oligonucleótidos de la descripción implica enlazar químicamente al oligonucleótido uno o más restos o conjugados que mejoran la actividad, la distribución celular, o la captación celular del oligonucleótido. Estos restos o conjugados pueden incluir grupos conjugados unidos de manera covalente a grupos funcionales tales como grupos hidroxilo primarios o secundarios. Los grupos conjugados de la divulgación incluyen intercaladores, moléculas repórteres, poliaminas, poliamidas, polietilenglicoles, poliéteres, grupos que potencian las propiedades farmacodinámicas de oligómeros, y grupos que potencian las propiedades farmacocinéticas de oligómeros. Grupos conjugados típicos incluyen colesteroles, lípidos, fosfolípidos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas y colorantes. Grupos que potencian las propiedades farmacodinámicas, en el contexto de esta divulgación, incluyen grupos que mejoran la captación, mejoran la resistencia a la degradación y/o fortalecen la hibridación específica de secuencia con el ácido nucleico diana. Los grupos que mejoran las propiedades farmacocinéticas, en el contexto de esta descripción, incluyen grupos que mejoran la captación, la distribución, el metabolismo o la eliminación de los compuestos de la presente descripción. Grupos conjugados representativos se describen en la Solicitud de Patente Internacional N° PCT/US92/09196, presentada el 23 de octubre de 1992, y Pat. EE. UU. No. 6.287.860.

Restos conjugados incluyen, aunque no se limitan a, restos de lípido tales como un resto colesterol, ácido cólico, un tioéter, por ejemplo, hexil-5-tritiltiol, un tiocolesterol, una cadena alifática, por ejemplo, residuos de dodecanodiol o undecilo, un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio, una poliamina o una cadena de polietilenglicol, o ácido adamantano acético, un resto palmitilo, o un resto octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol. Los oligonucleótidos de la divulgación también pueden conjugarse con principios activos, por ejemplo, aspirina, warfarina, fenilbutazona, ibuprofeno, suprofeno, fenbufeno, ketoprofeno, (S)-(+)-pranoprofeno, carprofeno, dansilsarcosina, ácido 2,3,5-triyodobenzoico, ácido flufenámico, ácido folínico, una benzotiadiazida, clorotiazida, una diazepina, indometacina, un barbitúrico, una cefalosporina, un fármaco sulfa, un antidiabético, un antibacteriano o un antibiótico.

Patentes EE. UU. representativas que enseñan la preparación de tales conjugados de oligonucleótidos comprenden pero no se limitan a, Pat. EE. UU. Nos. 4.828.979; 4.948.882; 5.218.105; 5.525.465; 5.541.313; 5.545.730; 5.552.538 5.578.717 5.580.731; 5.580.731 5.591.584 5.109.124 5.118.802 5.138.045 5.414.077 5.486.603; 5.512.439 5.578.718 5.608.046; 4.587.044 4.605.735; 4.667.025; 4.762.779 4.789.737 4.824.941 4.835.263; 4.876.335 4.904.582 4.958.013; 5.082.830 5.112.963 5.214.136 5.082.830 5.112.963 5.214.136 5.245.022; 5.254.469; 5.258.506 5.262.536; 5.272.250 5.292.873; 5.317.098 5.371.241 5.391.723 5.416.203 5.451.463 5.510.475 5.512.667 5.514.785; 5.565.552 5.567.810 5.574.142 5.585.481 5.587.371 5.595.726 5.597.696; 5.599.923 5.599.928 - 5.688.941.

Formulaciones

Los compuestos de la divulgación también se pueden mezclar, encapsular, conjugar o asociar de otro modo con otras moléculas, estructuras moleculares o mezclas de compuestos, como por ejemplo, liposomas, moléculas dirigidas al receptor, formulaciones orales, rectales, tópicas u otras, para ayudar en captación, distribución y/o absorción, las Patentes EE. UU. representativas que enseñan la preparación de dichas formulaciones que ayudan a la captación, distribución y/o absorción incluyen, pero no se limitan a, Pat. EE. UU. Nos. 5.108.921; 5.354.844; 5.416.016; 5.459.127; 5.521.291; 5.543.165; 5.547.932; 5.583.020; 5.591.721; 4.426.330; 4.534.899; 5.013.556; 5.108.921: 5.213.804; 5.227.170; 5.264.221; 5.356.633; 5.395.619; 5.416.016; 5.417.978; 5.462.854; 5.468.854; 5.512.295; 5.527.528; 5.534.259; 5.543.152; 5.556.948; 5.580.575; and 5.595.756.

Aunque los oligonucleótidos antisentido no necesitan administrarse en el contexto de un vector con el fin de modular la expresión y/o función de una diana, los aspectos de la descripción se refieren a construcciones de vectores de expresión para la expresión de oligonucleótidos antisentido, que comprenden promotores, secuencias de genes promotores híbridos y poseen una fuerte actividad promotora constitutiva, o una actividad promotora que puede inducirse en el caso deseado.

En un aspecto, la práctica de la descripción implica administrar al menos uno de los oligonucleótidos antisentido anteriores con un sistema de suministro de ácidos nucleicos adecuado. En un aspecto, ese sistema incluye un vector no viral enlazado operativamente al polinucleótido. Ejemplos de dichos vectores no virales incluyen el oligonucleótido solo (por ejemplo, una cualquiera o más de SEQ ID NOS: 29 to 94) o en combinación con una formulación de proteína, polisacárido o lípido adecuada.

Los sistemas de suministro de ácidos nucleicos adecuados adicionales incluyen un vector viral, típicamente la secuencia de al menos uno de un adenovirus, un virus asociado a adenovirus (AAV), un adenovirus dependiente de auxiliar, un retrovirus, o un complejo de virus hemaglutinante de Japón-liposoma (HVJ). Preferentemente, el vector viral comprende un promotor eucariota fuerte enlazado operativamente al polinucleótido, por ejemplo, un promotor del citomegalovirus (CMV).

Los vectores preferidos adicionales incluyen vectores virales, proteínas de fusión y conjugados químicos. Los vectores retrovirales incluyen virus de la leucemia murina de Moloney y virus basados en el VIH. Un vector viral basado en el HIV preferido comprende al menos dos vectores donde los genes gag y pol son de un genoma de1HIV y el gen env es de otro virus. Se prefieren vectores virales de ADN. Estos vectores incluyen vectores de pox tales como vectores de ortopox o avipox, vectores del virus del herpes tales como un vector del virus del herpes simple I (HSV), vectores de adenovirus y vectores de virus asociados a adenovirus.

Los compuestos antisentido de la descripción abarcan cualquier sal, éster o sal de dichos ésteres farmacéuticamente aceptables, o cualquier otro compuesto que, tras la administración a un animal, que incluye un ser humano, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biológicamente activo o resto del mismo

La expresión "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la descripción: es decir, sales que conservan la actividad biológica deseada del compuesto parental y no confieren efectos toxicológicos no deseados al mismo. Para oligonucleótidos, ejemplos preferidos de sales farmacéuticamente aceptables y sus usos se describen adicionalmente en la Pat. EE. u U. No. 6.287.860.

La presente descripción también incluye composiciones y formulaciones farmacéuticas que incluyen los compuestos antisentido de la descripción. Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden administrarse en varias formas que dependen de si se desea tratamiento local o sistémico y del área que va a tratarse. La administración puede ser tópica (incluida la oftálmica y las membranas mucosas, incluida la administración vaginal y rectal), pulmonar, por ejemplo, por inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, incluso por nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmica y transdérmica), oral o parenteral. La administración parenteral incluye inyección o infusión intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular; o administración intracraneal, por ejemplo, intratecal o intraventricular.

Para tratar tejidos en el sistema nervioso central, la administración puede realizarse mediante, por ejemplo, inyección o infusión en el líquido cefalorraquídeo. La administración de ARN antisentido en el líquido cefalorraquídeo se describe, por ejemplo, en la lPub. ADD. ee Pat. EE. UU. No. 2007/0117772, "Methods for slowing familial ALS disease progression,".

Cuando se pretende que el oligonucleótido antisentido de la presente divulgación se administre a células en el sistema nervioso central, la administración puede ser con uno o más agentes capaces de promover la penetración del oligonucleótido antisentido objeto a través de la barrera hematoencefálica. La inyección puede realizarse, por ejemplo, en la corteza entorrinal o en el hipocampo. La aplicación de factores neurotróficos mediante la administración de un vector adenovirus en las neuronas motoras del tejido muscular se describe en, por ejemplo, la Pat. EE. UU. No.

6.632.427, "Adenoviral-vector-mediated gene transfer into medullary motor neurons,". El suministro de vectores directamente al cerebro, por ejemplo, el cuerpo estriado, el tálamo, el hipocampo o la sustancia negra, se conoce en la técnica y se describe, por ejemplo, en Pat. EE. UU. No. 6.756.523, "Adenovirus vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system particularly in brain,".

La administración puede ser rápida como por inyección o realizarse a lo largo de un período de tiempo ya sea por perfusión lenta o mediante la administración de formulaciones de liberación lenta.

Los oligonucleótidos antisentido objeto también puede enlazarse o conjugarse con agentes que proporcionan propiedades farmacéuticas o farmacodinámicas deseables. Por ejemplo, el oligonucleótido antisentido puede acoplarse a cualquier sustancia, conocida en la técnica por favorecer la penetración o el transporte a través de la barrera hematoencefálica, como un anticuerpo contra el receptor de la transferrina, y administrarse por inyección intravenosa. El compuesto antisentido puede unirse a un vector viral, por ejemplo, que hace que el compuesto antisentido resulte más efectivo y/o aumente el transporte del compuesto antisentido a través de la barrera hematoencefálica. La alteración de la barrera hematoencefálica osmótica también se puede lograr mediante, por ejemplo, la infusión de azúcares que incluyen, entre otros, mesoeritritol, xilitol, D (+) galactosa, D (+) lactosa, D (+) xilosa, dulcitol, mio- inositol, L (-) fructosa, D (-) manitol, D (+) glucosa, D (+) arabinosa, D (-) arabinosa, celobiosa, D (+) maltosa, D (-) rafinosa, L (+) ramnosa, D (+) melibiosa, D (-) ribosa, adonitol, D (+) arabitol, L (-) arabitol, D (+) fucosa, L (-) fucosa. D (-) lixosa, L (+) lixosa y L (-) lixosa, o aminoácidos que incluyen, entre otros, glutamina, lisina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutámico, glicina, histidina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, tirosina, valina y taurina. Procedimientos y materiales para mejorar la penetración de la barrera hematoencefálica se describen, por ejemplo, en Patentes EE. UU. No. 4.866.042, "Method for the delivery of genetic material across the blood brain barrier," 6.294.520, "Material for passage through the blood-brain barrier," y 6.936.589, "Parenteral delivery systems,".

Los compuestos antisentido objeto pueden mezclarse, encapsularse, conjugarse o asociarse de otro modo a otras moléculas, estructuras de molécula o mezclas de compuestos, por ejemplo, liposomas, moléculas dirigidas a receptor, formulaciones orales, rectales, tópica u otras, para ayudar en la captación, distribución y/o absorción. Por ejemplo, pueden incluirse lípidos catiónicos en la formulación para facilitar la captación de oligonucleótidos. Una de dichas composiciones que se ha demostrado que facilita la absorción es LIPOFECTIN (disponible en GIBCO BRL, Bethesda, MD).

Se cree que los oligonucleótidos con al menos una modificación de 2'-O-metoxietilo son particularmente útiles para administración por vía oral. Composiciones y formulaciones farmacéuticas para administración tópica pueden comprender parches transdérmicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, aerosoles, líquidos y polvos. Pueden ser necesarios o deseables vehículos farmacéuticos convencionales, bases acuosas, en polvo o aceitosas, espesantes y similares. También pueden ser útiles preservativos recubiertos, guantes y similares.

Las formulaciones farmacéuticas de la presente divulgación, que pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria, pueden prepararse según técnicas convencionales muy conocidas en la industria farmacéutica. Dichas técnicas incluyen la etapa de asociar los ingredientes activos con los vehículos o excipientes farmacéuticos. En general, las formulaciones se preparan asociando de manera uniforme e íntima los ingredientes activos con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos. o ambos, y a continuación, si es necesario, dar forma al producto.

Las composiciones de la presente divulgación pueden formularse en cualquiera de muchas formas de dosificación posibles tales como, aunque no se limitan a, comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, jarabes líquidos, geles blandos, supositorios y enemas. Las composiciones de la presente divulgación también pueden formularse como suspensiones en medios acuosos, no acuosos o mixtos. Las suspensiones acuosas pueden contener adicionalmente sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión que incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizantes.

Las composiciones farmacéuticas de la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, soluciones, emulsiones, espumas y formulaciones que contienen liposomas. Las composiciones y formulaciones farmacéuticas de la presente descripción pueden comprender uno o más mejoradores de la penetración, vehículos, excipientes u otros principios activos o inactivos.

Las emulsiones típicamente son sistemas heterogéneos de un líquido dispersado en otro en forma de gotitas que generalmente superan los 0,1 pm de diámetro. Las emulsiones pueden contener componentes adicionales, además de las fases dispersas, y el fármaco activo que puede estar presente bien como una solución en la fase acuosa, la fase oleosa o bien el mismo como una fase independiente. Las microemulsiones están incluidas como un aspecto de la presente descripción. Las emulsiones y sus usos son muy conocidos en la técnica y se describen adicionalmente en la Pat. EE. UU. No. 6.287.860.

Las formulaciones de la presente descripción incluyen formulaciones liposomales. Tal como se usa en la presente divulgación, el término «liposoma» significa una vesícula compuesta por lípidos anfifílicos dispuestos en una bicapa o bicapas esféricas. Los liposomas son vesículas unilaminares o multilaminares que tienen una membrana formada por un material lipófilo y un interior acuoso que contiene la composición que va a administrarse. Los liposomas catiónicos son liposomas positivamente cargados que se cree que interactúan con moléculas de ADN negativamente cargadas para formar un complejo estable. Se cree que los liposomas que son sensibles al pH o están cargados negativamente atrapan el ADN en vez de formar complejos con él. Se han usado tanto liposomas catiónicos como no catiónicos para suministrar ADN a las células.

Los liposomas también incluyen liposomas "estabilizados estéricamente", una expresión que, como se usa en esta invención, se refiere a liposomas que comprenden uno o más lípidos especializados. Cuando se incorporan en liposomas, estos lípidos especializados producen liposomas con vidas en circulación mejoradas con respecto a los liposomas que carecen de dichos lípidos especializados. Ejemplos de liposomas estéricamente estabilizados son aquellos en los que parte de la parte de lípido formado de vesícula del liposoma comprende uno o más glucolípidos o se derivatiza con uno o más polímeros hidrófilos, tales como un resto de polietilenglicol (PEG). Los liposomas y sus usos se describen adicionalmente en la Pat. EE. UU. No. 6.287.860.

Las formulaciones y composiciones farmacéuticas de la presente descripción también pueden incluir tensioactivos. El uso de tensioactivos en productos farmacéuticos, formulaciones y emulsiones es bien conocido en la técnica. Los tensioactivos y sus usos se describen con más detalle en la Pat. EE. UU. No. 6.287.860.

En un aspecto, la presente descripción emplea diversos mejoradores de la penetración para efectuar el suministro eficiente de ácidos nucleicos, particularmente oligonucleótidos. Además de ayudar en la difusión de fármacos no lipófilos a través de membranas celulares, los mejoradores de la penetración también mejoran la permeabilidad de fármacos lipófilos. Los mejoradores de la penetración pueden clasificarse como pertenecientes a una de cinco amplias categorías, es decir, tensioactivos, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y no tensioactivos no quelantes. Los mejoradores de la penetración y sus usos se describen en la Pat. EE. Uu . No. 6.287.860.

Un experto en la materia reconocerá que las formulaciones se diseñan habitualmente según su uso previsto, es decir, su vía de administración.

Las formulaciones preferidas para administración tópica incluyen aquellas en las que los oligonucleótidos de la divulgación están en mezcla con un agente de administración tópica tal como lípidos, liposomas, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, esteroides, agentes quelantes y tensioactivos. Los lípidos y liposomas preferidos incluyen neutros (por ejemplo, dioleoil-fosfatidiletanolamina DOPE, dimiristoilfosfatidilcolina DMPc , diestearoilfosfatidilcolina) negativos (por ejemplo, dimiristoilfosfatidilglicerol DMPG) y catiónicos (por ejemplo, dioleoiltetrametilaminopropilo DOTAP y dioleoil-fosfatidiletanolamina DOTMA).

Para la administración tópica u otra, los oligonucleótidos de la descripción pueden encapsularse dentro de liposomas o pueden formar complejos con los mismos, en particular con liposomas catiónicos. Como alternativa, los oligonucleótidos pueden formar complejos con lípidos, en particular con lípidos catiónicos. Ácidos grasos y ésteres preferidos, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y sus usos se describen adicionalmente en la Pat. EE. UU. No. 6.287.860.

Las composiciones y formulaciones para la administración por vía oral incluyen polvos o gránulos, micropartículas, nanopartículas, suspensiones o soluciones en agua o medios no acuosos, cápsulas, cápsulas de gel, sobres, comprimidos o minicomprimidos. Pueden ser deseables espesantes, agentes saporíferos, diluyentes, emulsionantes, adyuvantes de dispensación o aglutinantes. Las formulaciones orales preferidas son aquellas en las que los oligonucleótidos de la divulgación se administran conjuntamente con uno o más mejoradores de la penetración, tensioactivos y quelantes. Entre los tensioactivos preferidos se incluyen ácidos grasos y/o ésteres o sales de los mismos, ácidos biliares y/o sales de los mismos. Ácidos biliares/sales y ácidos grasos preferidos y sus usos se describen adicionalmente en la Pat. EE. UU. No. 6.287.860. También se prefieren combinaciones de mejoradores de la penetración, por ejemplo, ácidos grasos/sales en combinación con ácidos biliares/sales. Una combinación particularmente preferida es la sal de sodio de ácido láurico, ácido cáprico y UDCA. Mejoradores de la penetración adicionales incluyen éter polioxietilen-9-laurílico, éter polioxietilen-20-cetílico. Los oligonucleótidos de la descripción pueden suministrarse por vía oral, en forma granulada que incluye partículas secadas por pulverización, o en complejos para formar micro o nanopartículas. Los agentes complejantes de oligonucleótidos y sus usos se describen adicionalmente en la Pat. EE. UU. No. 6.287.860.

Las composiciones y formulaciones para la administración parenteral, intratecal o intraventricular pueden incluir soluciones acuosas estériles que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados tales como, pero no se limitan a, mejoradores de la penetración, compuestos portadores y otros vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables

Ciertos aspectos de la divulgación proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen uno o más compuestos oligoméricos y uno o más de otros agentes quimioterapéuticos que funcionan por un mecanismo no antisentido. Entre los ejemplos de dichos agentes quimioterapéuticos se incluyen, aunque no se limitan a, fármacos quimioterapéuticos para el cáncer tales como daunorrubicina, daunomicina, dactinomicina, doxorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, esorrubicina, bleomicina, mafosfamida, ifosfamida, citosina arabinósido, biscloroetil-nitrosurea, busulfano, mitomicina C, actinomicina D, mitramicina, prednisona, hidroxiprogesterona, testosterona, tamoxifeno, dacarbazina, procarbazina, hexametilmelamina, pentametilmelamina, mitoxantrona, amsacrina, clorambucilo, metilciclohexilnitrosurea, mostazas de nitrógeno, melfalan, ciclofosfamida, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-azacitidina, hidroxiurea, deoxicoformicina, 4-hidroxiperoxiciclo-fosforamida, 5-fluorouracilo (5-FU), 5-fluorodeoxiuridina (5-FUdR), metotrexato (MTX), colchicina, taxol, vincristina, vinblastina, etopósido (VP-16), trimetrexato, irinotecán, topotecán, gemcitabina, tenipósido, cisplatino y dietilestilbestrol (DES). Cuando se usan con los compuestos de la divulgación, dichos agentes quimioterapéuticos pueden usarse individualmente (por ejemplo, 5-FU y oligonucleótido), secuencialmente (por ejemplo, 5-FU y oligonucleótido durante un periodo de tiempo seguido de MTX y oligonucleótido), o en combinación con uno o más de otros de dichos agentes quimioterapéuticos (por ejemplo, 5-FU, MTX y oligonucleótido, o 5-FU, radioterapia y oligonucleótido). Los fármacos antiinflamatorios, que incluyen, pero no se limitan a, fármacos antiinflamatorios no esteroideos y corticosteroides, y fármacos antivirales, que incluyen, pero no se limitan a, ribivirina, vidarabina, aciclovir y ganciclovir, también pueden combinarse en composiciones de la descripción. Las combinaciones de compuestos antisentido y otros fármacos no antisentido también están dentro del alcance de la presente divulgación. Pueden usarse dos o más compuestos combinados juntos o secuencialmente.

En otro aspecto relacionado, las composiciones de la divulgación pueden contener uno o más compuestos antisentido, particularmente oligonucleótidos, dirigidos a un primer ácido nucleico y uno o más compuestos antisentido adicionales dirigidos a un segundo ácido nucleico diana. Por ejemplo, la primera diana puede ser una secuencia antisentido particular del canal de sodio, subunidad alfa activada por voltaje (SCNA), y la segunda diana puede ser una región de otra secuencia de nucleótidos. Alternativamente, las composiciones de la divulgación pueden contener dos o más compuestos antisentido dirigidos a diferentes regiones del mismo canal de sodio, diana de ácido nucleico alfa controlado por voltaje (SCNA). Se ilustran numerosos ejemplos de compuestos antisentido en esta invención y otros pueden seleccionarse de entre compuestos adecuados conocidos en la técnica. Pueden usarse dos o más compuestos combinados juntos o secuencialmente.

Dosificación:

Se cree que la formulación de composiciones terapéuticas y su posterior administración (dosificación) está dentro de la experiencia de los expertos en la materia. La dosificación depende de la gravedad y la capacidad de respuesta de la patología a tratar, con el curso del tratamiento que dura desde varios días hasta varios meses, o hasta que se efectúe una cura o se logre una disminución de la patología. Pueden calcularse programas de dosificación óptimos a partir de mediciones de acumulación de fármaco en el cuerpo del paciente. Los expertos pueden determinar fácilmente dosificaciones óptimas, metodologías de dosificación y tasas de repetición. Las dosificaciones óptimas pueden variar dependiendo de la potencia relativa de oligonucleótidos individuales, y generalmente pueden estimarse basándose en las CE50 que se ha descubierto que son efectivas en modelos animales in vitro e in vivo. En general, la dosificación es de 0,01 pg a 100 mg por kg de peso corporal, y puede administrarse una vez o más diariamente, semanalmente, mensualmente o anualmente, o incluso una vez cada 2 a 20 años. Los expertos en la materia pueden estimar fácilmente las tasas de repetición para la dosificación basándose en tiempos de residencia medidos y concentraciones del fármaco en fluidos corporales o tejidos. Tras el tratamiento satisfactorio, puede desearse que el paciente se someta a terapia de mantenimiento para impedir la reaparición de la patología, donde el oligonucleótido se administra en dosis de mantenimiento, que varían de 0,01 pg a 100 mg por kg de peso corporal, una vez o más diariamente, a una vez cada 20 años.

En aspectos, un paciente se trata con una dosificación de fármaco que es al menos aproximadamente 1, al menos aproximadamente 2, al menos aproximadamente 3, al menos aproximadamente 4, al menos aproximadamente 5, al menos aproximadamente 6, al menos aproximadamente 7, al menos aproximadamente 8, al menos aproximadamente 9, al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 35, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 45, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 60, al menos aproximadamente 70, al menos aproximadamente 80, al menos aproximadamente 90, o al menos aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. Ciertas dosis inyectadas de oligonucleótidos antisentido se describen, por ejemplo, en la Pat. EE. UU. No. 7.563.884, "Antisense modulation of PTPIB expression,".

Aunque diversos aspectos de la presente divulgación se han descrito anteriormente, debe entenderse que se han presentado a modo de ejemplo solamente, y no de limitación. Pueden realizarse numerosos cambios a los aspectos descritos según la divulgación en esta invención sin alejarse del espíritu o alcance de la divulgación. Por lo tanto, la amplitud y el alcance de la presente descripción no deben estar limitados por ninguno de los aspectos descritos anteriormente.

Por su citación de diversos antecedentes en esta invención, los solicitantes no admiten que ningún antecedente particular sea "técnica anterior" a su invención. Las realizaciones de composiciones y procedimientos inventivos se ilustran en los siguientes ejemplos.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos no limitantes sirven para ilustrar realizaciones seleccionadas de la invención. Se apreciará que las variaciones en las proporciones y alternativas en los elementos de los componentes mostrados serán evidentes para los expertos en la materia y están dentro del alcance de los aspectos de la presente descripción.

Ejemplo 1: Diseño de oligonucleótidos antisentido específicos para una molécula de ácido nucleico antisentido a una frataxina (SCNA) y/o una cadena sentido de polinucleótido de SCNA.

Como se indicó anteriormente, la expresión "oligonucleótido específico para" u "oligonucleótido que se dirige a" se refiere a un oligonucleótido que tiene una secuencia (i) capaz de formar un complejo estable con una parte del gen dirigido, o (ii) capaz de formar un dúplex estable con una parte de una transcripción de ARNm del gen dirigido.

La selección de los oligonucleótidos se ve facilitada por la utilización de programas informáticos (por ejemplo, IDT AntiSense Design, IDT OligoAnalyzer) que identifican automáticamente en cada secuencia, subsecuencias de 19-25 nucleótidos que formarán híbridos con una secuencia de polinucleótidos diana con una temperatura de fusión deseada (normalmente 50-60 °C) y no formará autodímeros u otras estructuras secundarias complejas.

La selección de los oligonucleótidos apropiados se facilita usando programas informáticos que alinean automáticamente secuencias de ácido nucleico e indican regiones de identidad u homología. Dichos programas se usan para comparar secuencias de ácidos nucleicos obtenidas, por ejemplo, buscando en bases de datos tales como GenBank o secuenciando productos de PCR. La comparación de secuencias de ácido nucleico de una variedad de genes y regiones intergénicas de un genoma dado permite la selección de secuencias de ácido nucleico que muestran un grado apropiado de especificidad para el gen de interés. Estos procedimientos permiten la selección de oligonucleótidos que exhiben un alto grado de complementariedad. para apuntar a secuencias de ácidos nucleicos y un menor grado de complementariedad con otras secuencias de ácidos nucleicos en un genoma dado. Un experto en la materia se dará cuenta de que hay una libertad considerable en la selección de regiones adecuadas de genes para su uso en la presente descripción.

Un compuesto antisentido es "específicamente hibridable" cuando la unión del compuesto al ácido nucleico diana interfiere en la función normal del ácido nucleico diana para causar una modulación de la función y/o la actividad, y existe un grado de complementariedad suficiente para evitar unión inespecífica del compuesto antisentido a secuencias de ácido nucleico no diana en condiciones en las que se desea unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapéutico, y en condiciones en las que se realizan ensayos en el caso de ensayos in vitro.

Las propiedades de hibridación de los oliginucleótidos descritos en esta invención pueden determinarse mediante uno o más ensayos in vitro como se conoce en la técnica. Por ejemplo, las propiedades de los oligonucleótidos descritos en esta invención pueden obtenerse mediante la determinación de la fuerza de unión entre el antisentido natural diana y una posible molécula de fármaco utilizando el ensayo de curva de fusión.

La fuerza de unión entre el antisentido natural diana y una posible molécula de fármaco (Molécula) puede estimarse usando cualquiera de los procedimientos establecidos de medición de la fuerza de interacciones intermoleculares, por ejemplo, un ensayo de curva de fusión.

El ensayo de la curva de fusión determina la temperatura a la que se produce una rápida transición de conformación bicatenaria a monocatenaria para el complejo natural antisentido/molécula. Esta temperatura es ampliamente aceptada como una medida fiable de la fuerza de interacción entre las dos moléculas.

Puede realizarse un ensayo de la curva de fusión usando una copia de ADNc de la molécula de ARN antisentido natural real o un nucleótido de ADN o ARN sintético correspondiente al sitio de unión de la molécula. Están disponibles múltiples kits que contienen todos los reactivos necesarios para realizar este ensayo (por ejemplo, kit MeltDoctor de Applied Biosystems lnc.). Estos kits incluyen una disolución tampón adecuada que contiene uno de los colorantes de unión a ADN bicatenario (dsADN) (tales como los colorantes a B i HRM, SYBR Green, SYTO, etc.). Las propiedades de los colorantes de dsADN son tales que casi no emiten fluorescencia en forma libre, pero son altamente fluorescentes cuando se unen a dsADN.

Para realizar el ensayo, el ADNc o un oligonucleótido correspondiente se mezclan con la Molécula en concentraciones definidas por los protocolos particulares del fabricante. La mezcla se calienta a 95 °C para disociar todos los complejos de ADNdc previamente formados, a continuación, se enfría lentamente a temperatura ambiente u otra temperatura menor definida por el fabricante del kit para permitir que se hibriden las moléculas de ADN. Entonces, los complejos recientemente formados se calientan lentamente a 95 °C con recopilación de datos continua simultánea sobre la cantidad de fluorescencia que se produce por la reacción. La intensidad de fluorescencia es inversamente proporcional a las cantidades de ADNdc presentes en la reacción. Los datos pueden recopilarse usando un instrumento de RCP en tiempo real compatible con el kit (por ejemplo, sistema de RCP en tiempo real StepOne Plus de ABI o el instrumento LightTyper, Roche Diagnostics, Lewes, Reino Unido).

Los picos de fusión se construyen representando la derivada negativa de la fluorescencia con respecto a la temperatura (-d(Fluorescencia)/dT) sobre el eje y) contra la temperatura (eje x) usando software apropiado (por ejemplo, LightTyper (Roche) o SDS Dissociation Curve, ABI). Los datos se analizan para identificar la temperatura de la rápida transición del complejo de ADNdc a moléculas monocatenarias. Esta temperatura se llama Tm y es directamente proporcional a la intensidad de la interacción entre las dos moléculas. Típicamente, la Tm superará los 40 C.

Ejemplo 2: Modulación de polinucleótidos de SCNA

Tratamiento de células HepG2 con oligonucleótidos antisentido

Se cultivaron células HepG2 de ATCC (cat # HB-8065) en medio de crecimiento (MEM/EBSS (Hyclone cat # SH30024 o Mediatech cat # MT-10-010-CV) 10 % FBS (Mediatech cat # MT35-011- CV) penicilina/estreptomicina (Mediatech cat # MT30-002-CI)) a 37 °C y 5 % de CO². Un día antes del experimento, las células volvieron a sembrarse en placas a la densidad de 1,5 x 105/ml en placas de 6 pocillos y se incubaron a 37 °C y 5 % de CO². El día del experimento, el medio en las placas de 6 pocillos se cambió a medio recién cultivado. Todos los oligonucleótidos antisentido se diluyeron a la concentración de 20 pM. Se incubaron dos pI de esta solución con 400 pI de medio Opti-MEM (Gibco, n° de cat 311985-070) y 4 pI de Lipofectamine 2000 (Invitrogen, n° de cat 11668019) a temperatura ambiente durante 20 min y se aplicaron a cada pocillo de las placas de 6 pocillos con células HepG2. Se usó una mezcla similar que incluía 2 pl de agua en lugar de la solución de oligonucleótidos para los controles simulados de transfección. Después de 3-18 h de incubación a 37 °C y 5 % de CO² el medio se cambió a medio de crecimiento fresco. 48 h después de la adición de oligonucleótidos antisentido, se eliminó el medio y se extrajo el ARN de las células usando el sistema de aislamiento de ARN total SV de Promega (cat # Z3105) o el kit de aislamiento de ARN total RNeasy de Qiagen (cat # 74181) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se agregaron 600 ng de ARN a la reacción de transcripción inversa realizada con el kit de ADNc Verso de Thermo Scientific (n.o de cat. AB1453B) o el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (n.o de cat. 4168813) como se describe en el protocolo del fabricante. El ADNc de esta reacción de transcripción inversa se utilizado para controlar la expresión génica mediante PCR en tiempo real utilizando ABI Taqman Gene Expression Mix (cat # 4369510) y cebadores/sondas diseñados por ABI (Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay: Hs00374696_ml, Hs00897350_ml o Hs00897341_ml para SCNA humano) por Applied Biosystems Inc. Foster City CA). Se usó el siguiente ciclo de PCR; 50 °C durante 2 min, 95 °C durante 10 min, 40 ciclos de (95 °C durante 15 segundos, 60 °C durante 1 min) usando la máquina de PCR en tiempo real StepOne Plus (Applied Biosystems).

Se calculó la tasa de cambio en la expresión génica después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido basándose en la diferencia en los valores de dCt normalizados con 18S entre las muestras tratadas y transfectadas simuladamente. Resultados: Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de SCN1A en células HepG2 aumentan significativamente 48 h después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido para SCN1A antisentido B0724147 (Fig. 1, 4). Otros oligonucleótidos diseñados para SCN1A antisentido BG724147 y Hs.662210 no elevaron los niveles de SCN1A. (Fig 2, 3)

Ejemplo 3: Regulación positiva del ARNm de SCNA en diferentes líneas celulares mediante el tratamiento con oligonucleótidos antisentido que se dirigen a la transcripción antisentido natural específico de SCNA

En el Ejemplo 3, se seleccionaron oligonucleótidos antisentido de diferentes químicas que se dirigen a la transcripción antisentido natural específico de SCN1A en un panel de varias líneas celulares a una concentración final de 20 nM. Las líneas celulares utilizadas proceden de diferentes órganos y diferentes especies animales. Los datos siguientes confirman que la regulación positiva de ARNm/proteína de SCN1A mediante la modulación de la función de la transcripción antisentido natural específico de SCN1A no se limita a un único oligonucleótido, tejido o especie y, por tanto, representa un fenómeno general.

Materiales y Procedimientos

Fibroblastos humanos primarios que portan una mutación asociada al síndrome de Dravet. Los fibroblastos primarios de piel humana que portaban una mutación E1099X asociada al síndrome de Dravet introducida en cultivo por el Dr. N. Kenyon (Universidad de Miami) se cultivaron en medios de crecimiento que consistían en a-MEM (Gibco, cat: 12561-056) FBS al 10 % ( Mediatech, cat: 35-015 CV) 1 % Antimicótico-Antibiótico (Gibco, cat: 15240-062) a 37°C y 5 % CO². Las células se trataron con oligonucleótidos antisentido usando uno de los siguientes procedimientos. Para el procedimiento del día siguiente, un día antes del experimento, las células volvieron a sembrarse con una densidad de aproximadamente 2x105/platillo, en placas de 6 pocillos, en medio de crecimiento y se incubaron a 37 °C y con el 5 % de CO² durante la noche. Al día siguiente, el medio de las placas de 6 pocillos se cambió por medio de crecimiento fresco (1,5 ml/pocillo) y se dosificaron las células con oligonucleótidos antisentido. Todos los oligonucleótidos antisentido fueron fabricados por IDT Inc. (Coralville, 1A) o Exiqon (Vedback, Dinamarca). Las secuencias de todos los oligonucleótidos se enumeran en la Tabla 1. Las soluciones madre de oligonucleótidos se diluyeron a la concentración de 20 pM en agua estéril libre de ADNasa/ARNasa. Para dosificar un pocilio, se incubaron 2 pI de esta solución con 400 pI de medio Opti-MEM (Gibco, n° de cat. 31985-070) y 4 pI de Lipofectamine 2000 (invitrogen, n° de cat. 11668019) a temperatura ambiente durante 20 min y se aplicaron gota a gota a un pocillo de una placa de 6 pocilios con células. Se usó una mezcla similar que incluye 2 pI de agua en lugar de la disolución de oligonucleótido para los controles transfectados de forma simulada. Además, se utilizó como control un oligonucleótido inactivo CUR-1462 a la misma concentración. Después de 18 horas de incubación a 37 °C y 5 % de CO² el medio se cambió a medio de crecimiento fresco. Cuarenta y ocho horas después de la adición de los oligonucleótidos antisentido, el medio se eliminó y se extrajo el ARN de las células usando el sistema de aislamiento de ARN total SV de Promega (n.° de cat. Z3105) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se añadieron seiscientos nanogramos de ARN total purificado a la reacción de transcripción inversa realizada usando el kit de síntesis de ADNc SuperScript VILO de Invitrogen (n.° de cat. 11754-250), tal y como se describe en el protocolo del fabricante. El ADNc de esta reacción de transcripción inversa se usó para monitorear la expresión génica por PCR en tiempo real usando ABI Taqman Gene Expression Mix (cat # 4369510) y cebadores/sondas diseñados por ABI (ensayos Hs00374696_ml, Hs00897350_ml o Hs00897341_ml para SCN1A humano). Los resultados obtenidos usando los tres ensayos fueron muy similares. Se usó el siguiente ciclo de PCR; 50 °C durante 2 min, 95 °C durante 10 min, 40 ciclos de (95 °C durante 15 segundos, 60 °C durante 1 min) usando la máquina de PCR en tiempo real StepOne Plus (Applied Biosystems). El ensayo para 18S fue fabricado por ABI (n.° de cat. 4319413E). La tasa de cambio en la expresión génica después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido se calculó basándose en la diferencia de valores de dCt normalizados contra 18S entre las muestras tratadas y las transfectadas de forma simulada. Para el procedimiento del mismo día alternativo, se llevaron a cabo todos los procedimientos de forma similar, pero las células se dosificaron con oligonucleótidos antisentido el primer día, inmediatamente después de que se distribuyeran en placas de 6 pocillos.

Línea Celular SK-N-AS. Se cultivaron células de neuroblastoma humano SK-N-AS de ATCC (cat # CRL-2137) en medio de crecimiento (DMEM (Mediatech cat # 10-013-CV) 10 % FBS (Mediatech cat # MT35-011-CV) penicilina/estreptomicina (Mediatech cat # MT30-002-CI) Aminoácidos no esenciales (NEAA) (MyClone SH30238.01)) a 37°C y 5 % de CO². Las células se trataron con oligonucleótidos antisentido usando uno de los siguientes procedimientos. Para el procedimiento del día siguiente, un día antes del experimento, las células volvieron a sembrarse con una densidad de aproximadamente 3x105/platillo, en placas de 6 pocillos, en medio de crecimiento y se incubaron a 37 °C y con el 5 % de CO² durante la noche. Al día siguiente, el medio de las placas de 6 pocillos se cambió por medio de crecimiento fresco (1,5 ml/pocillo) y se dosificaron las células con oligonucleótidos antisentido. Todos los oligonucleótidos antisentido fueron fabricados por IDT Inc. (Coralville, IA) o Exiqon (Vedbaek, Dinamarca). Las secuencias de todos los oligonucleótidos se enumeran en la Tabla 1. Se diluyeron soluciones madre de oligonucleótidos a una concentración de 20 pM en agua estéril libre de ADNasa/ARNasa. Para dosificar un pocillo, se incubaron 2 pI de esta solución con 400 pI de medio Opti-MEM (Gibco, n° de cat. 31985-070) y 4 pI de Lipofectamine 2000 (lnvitrogen, n° de cat. 11668019) a temperatura ambiente durante 20 min y se aplicaron gota a gota a un pocillo de una placa de 6 pocillos con células. Se usó una mezcla similar que incluye 2 pI de agua en lugar de la disolución de oligonucleótido para los controles transfectados de forma simulada. Además, se utilizó como control un oligonucleótido inactivo CUR-1462 a la misma concentración. Después de 18 horas de incubación a 37 °C y 5 % de CO² el medio se cambió a medio de crecimiento fresco. Cuarenta y ocho horas después de la adición de los oligonucleótidos antisentido, el medio se eliminó y se extrajo el ARN de las células usando el sistema de aislamiento de ARN total SV de Promega (n.° de cat. Z3105) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se agregaron seiscientos nanogramos de ARN total purificado a la reacción de transcripción inversa realizada usando el kit de síntesis de ADNc SuperScript VILO de Invitrogen (n° de cat. 11754-250) como se describe en el protocolo del fabricante. El ADNc de esta reacción de transcripción inversa se usó para monitorear la expresión génica por PCR en tiempo real usando ABI Taqman Gene Expression Mix (cat # 4369510) y cebadores/sondas diseñados por ABI (ensayos Hs00374696_ml, Hs00897350_ml o Hs0089734I_m1 para SCN1A humano). Los resultados obtenidos usando los tres ensayos fueron muy similares. Se usó el siguiente ciclo de PCR; 50 °C durante 2 min, 95 °C durante 10 min, 40 ciclos de (95 °C durante 15 segundos, 60 °C durante 1 min) usando la máquina de PCR en tiempo real StepOne Plus (Applied Biosystems). El ensayo para 18S fue fabricado por ABI (n.° de cat. 4319413E). Se calculó la tasa de cambio en la expresión génica después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido basándose en la diferencia en los valores de dCt normalizados con 18S entre las muestras tratadas y transfectadas simuladamente. Para el procedimiento del mismo día alternativo, se llevaron a cabo todos los procedimientos de forma similar, pero las células se dosificaron con oligonucleótidos antisentido el primer día, inmediatamente después de que se distribuyeran en placas de 6 pocillos.

Línea Celular CHP-212. Se cultivaron células de neuroblastoma humano CHP-212 de ATCC (cat # CRL-2273) en medio de crecimiento (1: mezcla de MEM y F12 (ATCC cat 30-2003 y Mediatech cat # CV respectivamente) 10 % FBS (Mediatech cat # Mt 35 -011-CV) penicilina/estreptomicina (mediada) cat # MT30-002-CI)) a 37°C y 5 % de CO². Las células se trataron con oligonucleótidos antisentido usando uno de los siguientes procedimientos. Para el procedimiento del día siguiente, un día antes del experimento, las células volvieron a sembrarse con una densidad de aproximadamente 2x105/platillo, en placas de 6 pocilios, en medio de crecimiento y se incubaron a 37 °C y con el 5 % de CO² durante la noche. Al día siguiente, el medio de las placas de 6 pocillos se cambió por medio de crecimiento fresco (1,5 ml/pocillo) y se dosificaron las células con oligonucleótidos antisentido. Todos los oligonucleótidos antisentido fueron fabricados por IDT Inc. (Coralville, 1A) o Exiqon (Vedbaek, Dinamarca). Las secuencias de todos los oligonucleótidos se enumeran en la Tabla 1. Se diluyeron soluciones madre de oligonucleótidos a una concentración de 20 pM en agua estéril libre de ADNasa/ARNasa. Para dosificar un pocilio, se incubaron 2 pl de esta solución con 400 pl de medio Opti-MEM (Gibco cat # 31985-070) y 4 pl de Lipofectamine 2000 (Invitrogen cat # 11668019 a temperatura ambiente durante 20 min y se aplicaron gota a gota a un pocillo de una placa de 6 pocillos con células. Se usó una mezcla similar que incluía 2 pl de agua en lugar de la solución de oligonucleótidos para los controles de transfección simulada. Además, se utilizó como control un oligonucleótido inactivo CUR-1462 a la misma concentración. Después de 18 horas de incubación a 37 °C y 5 % de CO² el medio se cambió a medio de crecimiento fresco. Cuarenta y ocho horas después de la adición de los oligonucleótidos antisentido, el medio se eliminó y se extrajo el ARN de las células usando el sistema de aislamiento de ARN total SV de Promega (n.° de cat. Z3105) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se añadieron seiscientos nanogramos de ARN total purificado a la reacción de transcripción inversa realizada usando el kit de síntesis de ADNc SuperScript VILO de Invitrogen (n.° de cat. 11754­ 250), tal y como se describe en el protocolo del fabricante. El ADNc de esta reacción de transcripción inversa se usó para monitorear la expresión génica por PCR en tiempo real usando ABI Taqman Gene Expression Mix (cat # 4369510) y cebadores/sondas diseñados por AB1 (ensayos Hs00374696_m1, Hs00897350_ml o Hs00897341_ml para SCNiA humano). Los resultados obtenidos usando los tres ensayos fueron muy similares. Se usó el siguiente ciclo de PCR; 50 °C durante 2 min, 95 °C durante 10 min, 40 ciclos de (95 °C durante 15 segundos, 60 °C durante 1 min) usando la máquina de PCR en tiempo real StepOne Plus (Applied Biosystems). El ensayo para 18S fue fabricado por ABI (n.° de cat. 4319413E). La tasa de cambio en la expresión génica después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido se calculó basándose en la diferencia de valores de dCt normalizados contra 18S entre las muestras tratadas y las transfectadas de forma simulada. Para el procedimiento del mismo día alternativo, se llevaron a cabo todos los procedimientos de forma similar, pero las células se dosificaron con oligonucleótidos antisentido el primer día, inmediatamente después de que se distribuyeran en placas de 6 pocillos.

Línea celular Vero76. Se cultivaron células renales embrionarias de mono verde africano Vero76 de ATCC (cat # CRL-1587) en medio de crecimiento (medio de Eagle modificado de Dulbecco (Cellgrow 10-013-CV) 5 %, FBS (Mediatech cat # MT35-011-CV) penicilina/estreptomicina (Mediatech cat # MT30-002-CI)) a 37°C y 5 % de CO². Las células se trataron con oligonucleótidos antisentido usando uno de los siguientes procedimientos. Para el procedimiento del día siguiente, un día antes del experimento, las células se volvieron a sembrar a una densidad de aproximadamente 105/pocillo en placas de 6 pocillos en medio de crecimiento y se incubaron a 37 ° C y 5 % de CO² durante la noche. Al día siguiente, el medio de las placas de 6 pocillos se cambió por medio de crecimiento fresco (1,5 ml/pocillo) y se dosificaron las células con oligonucleótidos antisentido. Todos los oligonucleótidos antisentido fueron fabricados por IDT Inc. (Coralville, 1A) o Exiqon (Vedbaek, Dinamarca). Las secuencias de todos los oligonucleótidos se enumeran en la Tabla 1. Se diluyeron soluciones madre de oligonudeótidos a una concentración de 20 pM en agua estéril libre de ADNasa/ARNasa. Para dosificar un pocillo, se incubaron 2 pl de esta solución con 400 pl de medio Opti-MEM (Gibco, n° de cat. 31985-070) y 4 pl de Lipofectamine 2000 (lnvitrogen, n° de cat. 11668019) a temperatura ambiente durante 20 min y se aplicaron gota a gota a un pocillo de una placa de 6 pocillos con células. Se usó una mezcla similar que incluye 2 pl de agua en lugar de la disolución de oligonucleótido para los controles transfectados de forma simulada. Además, se utilizó como control un oligonucleótido inactivo CUR-1462 a la misma concentración. Después de 18 horas de incubación a 37 °C y 5 % de CO² el medio se cambió a medio de crecimiento fresco. Cuarenta y ocho horas después de la adición de los oligonucleótidos antisentido, el medio se eliminó y se extrajo el ARN de las células usando el sistema de aislamiento de ARN total SV de Promega (n.° de cat. Z3105) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se añadieron seiscientos nanogramos de ARN total purificado a la reacción de transcripción inversa realizada usando el kit de síntesis de ADNc SuperScript VILO de Invitrogen (n° de cat. 11754-250) como se describe en el protocolo del fabricante. El ADNc de esta reacción de transcripción inversa se usó para monitorear la expresión génica por PCR en tiempo real usando ABI Taqman Gene Expression Mix (cat # 4369510) y cebadores/sondas diseñados por ABI (ensayos Hs00374696_m1, Hs00897350_m1 o Hs00897341_m1 para SCNIA humano). Se usó el siguiente ciclo de PCR; 50 °C durante 2 min, 95 °C durante 10 min, 40 ciclos de (95 °C durante 15 segundos, 60 °C durante 1 min) usando la máquina de PCR en tiempo real StepOne Plus (Applied Biosystems). El ensayo para 18S fue fabricado por ABI (n.° de cat. 4319413E). La tasa de cambio en la expresión génica después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido se calculó basándose en la diferencia de valores de dCt normalizados contra 18S entre las muestras tratadas y las transfectadas de forma simulada. Para el procedimiento del mismo día alternativo, se llevaron a cabo todos los procedimientos de forma similar, pero las células se dosificaron con oligonucleótidos antisentido el primer día, inmediatamente después de que se distribuyeran en placas de 6 pocillos.

Línea Celular 3T3. Se cultivaron células de fibroblastos embrionarios de ratón 3T3 de ATCC (cat # CRL-1658) en medio de crecimiento (medio de Eagle modificado de Dulbecco (Cellgrow 10-013-CV) suero de ternero fetal al 10 % (Cellgrow 35-22-CV) penicilina/estreptomicina (Mediatech catt # MT30-002-CI)) a 37 ° C y 5 % de CO². Las células se trataron con oligonucleótidos antisentido usando uno de los siguientes procedimientos. Para el procedimiento del día siguiente, un día antes del experimento, las células se volvieron a sembrar a una densidad de aproximadamente 105/pocillo en placas de 6 pocillos en medio de crecimiento y se incubaron a 37 ° C y 5 % de CO² durante la noche. Al día siguiente, el medio en las placas de 6 pocillos se cambió a recién preparado. Se dosificaron los medios de crecimiento (1,5 ml/pocillo) y las células con oligonucleótidos antisentido. Todos los oligonucleótidos antisentido fueron fabricados por IDT Inc. (Coralville, 1A) o Exiqon (Vedbaek, Dinamarca). Las secuencias de todos los oligonucleótidos se enumeran en la Tabla 1. Se diluyeron soluciones madre de oligonucleótidos a una concentración de 20 pM en agua estéril libre de ADNasa/ARNasa. Para dosificar un pocilio, se incubaron 2 pI de esta solución con 400 pI de medio Opti-MEM (Gibco, n° de cat. 31985-070) y 4 pI de Lipofectamine 2000 (lnvitrogen, n° de cat. 11668019) a temperatura ambiente durante 20 min y se aplicaron gota a gota a un pocillo de una placa de 6 pocillos con células. Se usó una mezcla similar que incluye 2 pI de agua en lugar de la disolución de oligonucleótido para los controles transfectados de forma simulada. Además, se utilizó como control un oligonucleótido inactivo CUR-1462 a la misma concentración. Después de 18 horas de incubación a 37 °C y 5 % de CO² el medio se cambió a medio de crecimiento fresco. Cuarenta y ocho horas después de la adición de los oligonucleótidos antisentido, el medio se eliminó y se extrajo el ARN de las células usando el sistema de aislamiento de ARN total SV de Promega (n.° de cat. Z3105) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se añadieron seiscientos nanogramos de ARN total purificado a la reacción de transcripción inversa realizada usando el kit de síntesis de ADNc SuperScript VILO de lnvitrogen (n.° de cat. 11754-250), tal y como se describe en el protocolo del fabricante. El ADNc de esta reacción de transcripción inversa se usó para monitorear la expresión génica por PCR en tiempo real usando ABI Taqman Gene Expression Mix (cat # 4369510) y cebadores/sondas diseñados por ABI (ensayos Hs00374696_m1, Hs00897350_m1 o Hs00897341_ml para ScNlA humano). Los resultados obtenidos usando los tres ensayos fueron muy similares. Se usó el siguiente ciclo de PCR; 50 °C durante 2 min, 95 °C durante 10 min, 40 ciclos de (95 °C durante 15 segundos, 60 °C durante 1 min) usando la máquina de PCR en tiempo real StepOne Plus (Applied Biosystems). El ensayo para 18S fue fabricado por ABI (n.° de cat. 4319413E). La tasa de cambio en la expresión génica después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido se calculó basándose en la diferencia de valores de dCt normalizados contra 18S entre las muestras tratadas y las transfectadas de forma simulada. Para el procedimiento del mismo día alternativo, se llevaron a cabo todos los procedimientos de forma similar, pero las células se dosificaron con oligonucleótidos antisentido el primer día, inmediatamente después de que se distribuyeran en placas de 6 pocillos.

Línea celular HepG2. Se cultivaron células de carcinoma hepatocelular humano HepG2 de ATCC (cat # HB-8065) en medio de crecimiento (MEM/EBSS (Hyclone cat # SH30024, o Mediatech cat # MT-10-010-CV) 10 % FBS (Mediatech cat # MT35 - 011-CV) penicilina/estreptomicina (Mediatech cat # MT30-002-CI)) a 31 ° C y 5 % de CO². Las células se trataron con oligonucleótidos antisentido usando uno de los siguientes procedimientos. Para el procedimiento del día siguiente, un día antes del experimento, las células se volvieron a sembrar a una densidad de aproximadamente 3x105/pocillo en placas de 6 pocillos en Medio de Crecimiento y se incubaron a 37 ° C y 5 % CO² durante la noche. Al día siguiente, el medio de las placas de 6 pocillos se cambió por medio de crecimiento fresco (1,5 ml/pocillo) y se dosificaron las células con oligonucleótidos antisentido. Todos los oligonucleótidos antisentido fueron fabricados por IDT Inc. (Coralville, IA) o Exiqon (Vedbaek, Dinamarca). Las secuencias de todos los oligonucleótidos se enumeran en la Tabla 1. Se diluyeron soluciones madre de oligonucleótidos a una concentración de 20 pM en agua estéril libre de ADNasa/ARNasa. Para dosificar un pocillo, se incubaron 2 pI de esta solución con 400 pI de medio Opti-MEM (Gibco, n° de cat. 31985-070) y 4 pI de Lipofectamine 2000 (lnvitrogen, n° de cat. 11668019) a temperatura ambiente durante 20 min y se aplicaron gota a gota a un pocillo de una placa de 6 pocillos con células. Se usó una mezcla similar que incluye 2 pI de agua en lugar de la disolución de oligonucleótido para los controles transfectados de forma simulada. Además, se utilizó como control un oligonucleótido inactivo CUR-1462 a la misma concentración. Después de 18 horas de incubación a 37 °C y 5 % de CO² el medio se cambió a medio de crecimiento fresco. Cuarenta y ocho horas después de la adición de los oligonucleótidos antisentido, el medio se eliminó y se extrajo el ARN de las células usando el sistema de aislamiento de ARN total SV de Promega (n.° de cat. Z3105) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se añadieron seiscientos nanogramos de ARN total purificado a la reacción de transcripción inversa realizada usando el kit de síntesis de ADNc SuperScript VILO de Invitrogen (n.° de cat. 11754-250), tal y como se describe en el protocolo del fabricante. El ADNc de esta reacción de transcripción inversa se usó para monitorear la expresión génica por PCR en tiempo real usando ABI Taqman Gene Expression Mix (cat # 4369510) y cebadores/sondas diseñados por ABI (ensayos Hs00374696_ml, Hs00897350_ml o Hs00897341_ml para SCN¹ A humano). Los resultados obtenidos usando los tres ensayos fueron muy similares. Se usó el siguiente ciclo de PCR; 50 °C durante 2 min, 95 °C durante 10 min, 40 ciclos de (95 °C durante 15 segundos, 60 °C durante 1 min) usando la máquina de PCR en tiempo real StepOne Plus (Applied Biosystems). El ensayo para 18S fue fabricado por ABI (n.° de cat. 4319413E). La tasa de cambio en la expresión génica después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido se calculó basándose en la diferencia de valores de dCt normalizados contra 18S entre las muestras tratadas y las transfectadas de forma simulada. Para el procedimiento del mismo día alternativo, se llevaron a cabo todos los procedimientos de forma similar, pero las células se dosificaron con oligonucleótidos antisentido el primer día, inmediatamente después de que se distribuyeran en placas de 6 pocillos.

Resultados. Los niveles de ARNm de SCN1A en diferentes líneas celulares después del tratamiento con 20 nM de oligonucleótidos antisentido en comparación con el control simulado transfectado se muestran en la Tabla 2. Como se ve en los datos, algunos de los oligonucleótidos cuando se aplicaron a 20 nM fueron altamente activos en la regulación positiva de los niveles de SCN1A ARNm y mostró regulación ascendente de manera consistente en varias especies (humano, mono verde africano y ratón), en líneas celulares derivadas de diferentes órganos/tipos de células (hígado, riñón, cerebro, fibroblastos embrionarios) y fibroblastos primarios de piel que llevan la mutación SCN1A. La regulación positiva de la proteína SCN1A en células portadoras de la mutación de Draver respalda la idoneidad del procedimiento para el tratamiento de enfermedades asociadas con mutaciones en el gen SCN1A. Algunos de los oligonucleótidos diseñados contra la secuencia antisentido natural no afectaron o solo afectaron marginalmente los niveles de ARNm de SCN1A en todas o algunas de las líneas celulares probadas. Estas diferencias están en consonancia con los datos bibliográficos que indican que la unión de oligonucleótidos puede depender de las estructuras secundaria y terciaria de la secuencia diana de los oligonucleótidos. En particular, los niveles de SCN1A en células tratadas con un oligonucleótido sin homología con la secuencia antisentido natural de SCN1A pero de química similar (CUR-1462) no son significativamente diferentes del control de transacción simulada, lo que confirma que los efectos de los oligonucleótidos diana no dependen de toxicidad inespecífica de estas moléculas.

Ejemplo 4: Dependencia de la dosis de regulación positiva de ARNm de SCY4 en diferentes líneas celulares mediante tratamiento con oligonucleótidos antisentido dirigidos a la transcripción antisentido natural específico de SCNA

En el Ejemplo 4, se seleccionaron oligonucleótidos antisentido de diferentes químicas que se dirigen a la transcripción antisentido natural específico de SCNA en un panel de varias líneas celulares a concentraciones finales que varían de 5 a 80 nM. Las líneas celulares utilizadas procedían de diferentes órganos y diferentes especies animales. Los datos siguientes confirman que el grado de regulación positiva del ARNm de SCNA a través de la modulación de la función de la transcripción antisentido natural específico de SCNA se puede variar aplicando cantidades variables de oligonucleótidos activos.

Materiales y Procedimientos. SK-N-AS, Vero 76 y fobroblastos humanos primarios que pueden tener una mutación Dravet se trataron con oligonucleótidos antisentido como se describe en el Ejemplo 2 con la excepción de las concentraciones de oligonucleótido y Lipofectamine 2000 utilizadas para tratar cada pocillo Las concentraciones de oligonucleótido y Lipofectamine 2000 se ajustaron para para asegurar las concentraciones finales de oligonucleótidos de 5, 10, 20, 40 y 80 nM y la relación de Lipofectamine 2000 a 20 pM de solución madre de oligonucleótidos de 2: 1 (v: v).

Resultados. Los resultados de los experimentos de respuesta a la dosis han confirmado que los oligonucleótidos antisentido dirigidos contra el ARN antisentido natural específico de SCNIA pueden inducir una regulación positiva dependiente de la dosis del ARNm de SCNIA (Fig. 1-3). En algunos casos, esta regulación positiva fue muy potente (hasta 60 veces) a dosis más altas (Fig. 1-3). El grado de regulación positiva inducida por el mismo nucleótido en diferentes líneas celulares parecía ser diferente, por ejemplo, la regulación positiva lograda, en fibroblastos primarios a 40 nM estaba al nivel de 10-40 veces, mientras que la regulación positiva en células Vero 76 por los mismos oligonucleótidos en la misma concentración fue de 2 a 6 veces (figura 1 vs figura 3). Estas diferencias podrían deberse a diferentes eficiencias de transfección de diferentes líneas celulares y/o varias vías de retroalimentación expresadas por ellas. El efecto de la mayoría de los oligonucleótidos alcanzó la meseta en aproximadamente 40 nM, con la excepción de CUR-1764 y c UR-1770 en fibroblastos SCN1A y todos los oligonucleótidos probados en células Vero 76 donde la meseta no se alcanzó en la concentración más alta probada (Fig. 1-3).

Ejemplo 5: Especificidad de secuencia de la regulación positiva del ARNm de SCNA mediante oligonucleótidos antisentido que se dirigen a la transcripción antisentido natural específico de SCNA

En el Ejemplo 5, los oligonucleótidos antisentido que se dirigen a la transcripción antisentido natural específico de SCN1A se probaron en experimentos diseñados para confirmar la independencia de la regulación positiva de SCN1A causada por los oligonucleótidos de la toxicidad no específica asociada con la química de oligonucleótidos utilizada. Los datos a continuación confirman que el grado de regulación positiva del ARNm de SCN1A a través de la modulación de la función de la transcripción antisentido natural específico de SCN1A solo depende de las cantidades de oligonucleótidos activos y no de la cantidad total de moléculas de química similar.

Materiales y Procedimientos: Veto 76 y fibroblastos humanos primarios que portaban una mutación de Dravet se trataron con oligonucleótidos antisentido como se describe en el Ejemplo 2 con la excepción de las concentraciones de oligonucleótidos usadas para tratar cada pocillo. El oligonucleótido activo fue coadministrado con un oligonucleótido inactivo de química similar pero sin una diana conocida en el genoma humano (CUR-1462) y sin efecto sobre la expresión de múltiples genes probados (datos no mostrados). La cantidad total de oligonucleótidos así como la cantidad de Lipofectamine 2000 se mantuvieron constantes mientras se variaba la proporción del oligonucleótido activo en la mezcla. Las concentraciones de oligonucleótidos se ajustaron para asegurar las concentraciones finales de oligonucleótidos activos de 5, 10, 20 y 40 nM y la concentración total de oligonucleótidos (activo inactivo) de 40 nM.

Como se ve a partir de los datos (Fig. 7), el efecto dosis-dependiente de los oligonucleótidos dirigidos contra SCN1A antisentido natural no resultó de la toxicidad no específica potencialmente asociada con tales moléculas. Los niveles de ARNm de SCN1A dependían de la dosis del oligonucleótido activo usado para tratarlos (Fig. 7).

Ejemplo 6: Especificidad diana de la regulación positiva del ARNm de SCNA mediante oligonucleótidos antisentido que se dirigen a la transcripción antisentido natural específico de SCNA

En el Ejemplo 6, los oligonucleótidos antisentido que se dirigen a la transcripción antisentido natural específico de SCN1A se probaron en experimentos diseñados para confirmar la especificidad de su diana, es decir, SCN1A. Los datos siguientes confirman que la regulación positiva del ARNm de SCN1A a través de la modulación de la función de la transcripción antisentido natural específico de SCN1A se limitó al ARNm de SCN1A y no afectó a los canales de sodio relacionados SCN9A, SCN8A, SCN7A, SCN3A y SCN2A.

Materiales y Procedimientos. Vero 76 y fibroblastos humanos primarios que portaban una mutación de Dravet se trataron con oligonucleótidos antisentido como se describe en el Ejemplo 3. Después del tratamiento, el ARN aislado se analizó como se describe en el Ejemplo 2 con la excepción de que los ensayos de expresión génica de Taqman utilizados para ejecutar la PCR en tiempo real del ARNm detectado para los canales SCN9A, SCN8A, SCN7A, SCN3A y SCN2A. Los ensayos para las subunidades alfa de los canales SCN9A, SCN8A, SCN7A, SCN3A y SCN2A humanos se obtuvieron de AB1 Inc. (cat # Hs00161567_mL, Hs00274075_ml, Hs00161546_ml, Hs00366902_ml y Hs00221379_ml respectivamente).

Resultados. Como se muestra en la Fig. 8, el tratamiento con oligonucleótidos CUR-1916 y CUR-1770 no afectó significativamente la expresión de los canales SCN8A y SCN9A en fibroblastos humanos portadores de la mutación de Dravet. La expresión de los canales SCN7A, SCN3A y SCN2A fue indetectable en estas células antes o después del tratamiento (datos no mostrados). Los datos confirman la especificidad de la modulación de la expresión génica utilizando oligonucleótidos dirigidos contra el ARN antisentido natural para un gen dado.

Ejemplo 7: Estabilidad de oligonucleótidos antisentido que se dirigen a la transcripción antisentido natural específico de SCNA

En el Ejemplo 7, se probaron dos lotes de un oligonucleótido antisentido dirigido a la transcripción antisentido natural específico de SCN1A en experimentos diseñados para verificar su estabilidad después del almacenamiento en una solución acuosa diluida (1 mM) a 4°C. Los datos siguientes muestran que los oligonucleótidos pueden ser estables en estas condiciones durante períodos de al menos 6 meses sin una pérdida significativa de actividad.

Materiales y Procedimientos. Células Vero 76 se trataron con dos lotes diferentes de un oligonucleótido antisentido como se describe en el Ejemplo 2. Los lotes se sintetizaron en agosto de 2010 y marzo de 2011. El oligonucleótido sintetizado en agosto de 2010 se almacenó como una solución acuosa 1 mM a 4°C. El oligonucleótido sintetizado en marzo de 2011 se envió en forma liofilizada dentro de los 3 días posteriores a la síntesis y se probó inmediatamente después de su llegada.

Resultados: Como se muestra en la Fig. 9, no hubo pérdida significativa de actividad biológica después de un almacenamiento de 6 meses de los oligonucleótidos en solución acuosa a 4 °C.

Ejemplo 8: Regulación positiva de la proteína SCNA en fibroblastos humanos primarios que llevan una mutación asociada al síndrome de Dravet tratados con oligonucleótidos antisentido dirigidos a la transcripción antisentido natural específico de SCNA

El propósito de este experimento fue clasificar los oligonucleótidos antisentido CUR-1740, CUR-1770 y CUR-1916 según su capacidad para regular positivamente la expresión de la proteína SCNA en células de fibroblastos que llevan una mutación asociada al síndrome de Dravet.

Materiales y Procedimientos. Los fibroblastos que portaban una mutación asociada al síndrome de Dravet introducidos en cultivo por el Dr. N. Kenyon (Universidad de Miami) se cultivaron en medios de crecimiento que consistían en a-MEM (Gibco, cat: 12561-056) FBS al 10 % (Mediatech, cat: 35-015 CV) 1 % Antimicótico-Antibiótico (Gibco, cat: 15240-062) a 37 ° C y 5 % de CO². Las células se trataron con oligonucleótidos antisentido usando uno de los siguientes procedimientos. Para el procedimiento del día siguiente, un día antes del experimento, las células se volvieron a sembrar a una densidad de aproximadamente 4 x 104/ pocilio en placas de 24 pocilios en medio de crecimiento y se incubaron a 37 °C y 5 % de CO² durante la noche. Al día siguiente, el medio en las placas de 24 pocillos se cambió a medio de crecimiento recién preparado (1 ml/pocillo) y las células se dosificaron con oligonucleótidos antisentido CUR-1740, CUR-1770 y CUR-1916. Todos los oligonucleótidos antisentido fueron fabricados por IDT Inc. (Coralville, 1A) o Exiqon (Vedbaek, Dinamarca). Las secuencias de los oligonucleótidos CUR-1740, CUR-1770 y CUR-1916 se enumeran en la Tabla 1. Las soluciones madre de oligonucleótidos se diluyeron hasta la concentración de 20 pM en agua estéril libre de ADNasa/ARNasa. Para dosificar un pocillo a una concentración final de 20 nM, se incubó 1 pl de la solución madre de oligonucleótidos 20 pM con 200 pl de medio Opti-MEM (Gibco cat # 31985-070) y 2 pl de Lipofectamine 2000 (Invitrogen ca # 11668019) a temperatura ambiente durante 20 min y se aplicó gota a gota a un pocillo de una placa de 24 pocillos con células. Para lograr concentraciones finales de 5, 10, 40 y 80 nM, los volúmenes de la reserva de oligonucleótidos 20 pM usados se ajustaron en consecuencia. La relación de la solución madre de oligonucleótidos 20 pM a Lipofectamine 2000 fue 1:2 (v:v). Se usó una mezcla similar que incluía 8 pl de agua en lugar de la solución de oligonucleótidos y el volumen correspondiente de Lipofectamine 2000 para los controles de transfección simulada. Después de 18 horas de incubación a 37 °C y 5 % de CO² el medio se cambió a medio de crecimiento fresco. Cuarenta y ocho horas después de la adición de oligonucleótidos antisentido, se eliminó el medio y se lavaron las células 3 veces con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco sin calcio y magnesio (PBS) (Mediatech cat # 21-031-CV). A continuación, se descartó el PBS y las células se fijaron en la placa de 24 pocillos usando 300 pl de metanol al 100 % durante 15 min a ~20 °C. Después de eliminar el metanol y lavar con PBS, las células se incubaron con peróxido de hidrógeno al 3 % (Fisher Chemical cat # H325-100) durante 5 min a 21°C. Las células se lavaron tres veces durante 5 min con PBS, a continuación se incubaron con 300 pl de albúmina de suero bovino (BSA) (Sigma cat # A-9647) al 0,1 % en PBS durante 30 min a 21 °C. Las células se lavaron tres veces durante 5 min con PBS y a continuación se incubaron con 300 pl de solución de avidina (Vector Laboratories cat # SP-2001) durante 30 min a 21°C. Las células se enjuagaron brevemente tres veces con PBS y a continuación se incubaron con solución de biotina (Vector Laboratories cat # SP-2001) durante 30 min a 21°C. Las células se lavaron tres veces con PBS y a continuación se incubaron durante la noche a 4 °C con 300 pl por pocillo de anticuerpo de conejo contra SCN1A humano (Abcam cat # ab24820) diluido a 1:250 en PBS/BSA al 0,1 %. Después de equilibrar la placa durante 5 min a 21 ° C, las células se lavaron tres veces 5 min cada una con PBS y a continuación se incubaron con anticuerpo anti-conejo de cabra diluido 1:200 en PBS/BSA al 0,1 % durante 30 min a 21 ° C. Las células se lavaron tres veces durante 5 min con PBS y a continuación se incubaron con 300 pl de solución de reactivo A B Vectastain Elite ABC (Vector Laboratories cat # PK-6101) durante 30 min; Se preparó la solución de reactivo A B de Vectastain Elite ABC a 21 ° C 30 min antes de la incubación con las células agregando y mezclando sucesivamente 2 gotas de reactivo A a 5 ml de PBS y a continuación 2 gotas de reactivo B. Las células se lavaron 3 veces 5 min cada una con PBS a 21 ° C y a continuación se incubaron con solución de sustrato de peroxidasa de diaminobencidina (DAB) (Vector Laboratories cat # SK-4105) hasta que las células se tiñeron; la solución de sustrato de peroxidasa DAB se reconstituyó antes de añadirse a las células mezclando 1 ml de diluyente ImmPACT ™ DAB con 30 pl de concentrado de cromógeno ImmPACT™ DAB. En este momento, las células se lavaron brevemente tres veces con PBS y se dejaron 300 pl de PBS en cada pocillo. La tinción de las células se analizó directamente dentro de los pocillos de la placa de 24 pocillos utilizando un microscopio Nikon Eclipse TS100 invertido equipado con una cámara Nikon DS-Ri1 junto con un equipo Nikon Digital-Sight en la pantalla de una computadora portátil Dell Latitude D630. Las fotografías de los pozos individuales se tomaron utilizando el software proporcionado con la cámara Nikon, NIS-Elements D 3.0.

Resultados. Todos los oligonucleótidos antisentido ensayados regularon positivamente y eficazmente la proteína SCN1A, siendo CUR-1770 y CUR-1916 los dos mejores (Fig. 10).

Ejemplo 9: Regulación positiva de la proteína SCM en células SK-N-AS tratadas con oligonucleótidos antisentido que se dirigen a la transcripción antisentido natural específico de SCNA

El propósito de este experimento fue clasificar los oligonucleótidos antisentido CUR-1740, CUR-1764, CUR-1770 y CUR-1916 según su capacidad para regular positivamente la expresión de la proteína SCN1A en células SK-N-AS. SK-N-AS es una línea celular de neuroblastoma humano.

Materiales y Procedimientos: Se cultivaron células de neuroblastoma humano SK-N-AS de ATCC (cat # CRL-2137) en medio de crecimiento (DMEM (Mediatech cat # 10-013-CV) 10 % FBS (Mediatech cat # MT35-011-CV) penicilina/estreptomicina (Mediatech cat # MT30-002-CI) Aminoácidos no esenciales (NEAA) (HyClone SH30238.01)) a 37°C y 5 % de CO². Las células se trataron con oligonucleótidos antisentido usando uno de los siguientes procedimientos. Para el procedimiento del día siguiente, un día antes del experimento, las células se volvieron a sembrar a una densidad de aproximadamente 5 x 104/ pocillo en placas de 24 pocillos en medio de crecimiento y se incubaron a 37 °C y 5 deCO² durante la noche. Al día siguiente, el medio en las placas de 24 pocillos se cambió por medio de crecimiento recién preparado (1 ml/pocillo) y las células se dosificaron con oligonucleótidos antisentido c UR-1740, CUR-1764, CUR-1770 y CUR-1916. Todos los oligonucleótidos antisentido fueron fabricados por IDT Inc.

(Coralville, IA) o Exiqon (Vedbaek, Dinamarca). Las secuencias de los oligonucleótidos CUR-1740, CUR-1764, CUR-1770 y CUR-1916 se enumeran en la Tabla 1. Se diluyeron soluciones madre de oligonucleótidos a la concentración de 20 |jM en agua estéril libre de ADNasa/ARNasa. Para dosificar un pocillo a una concentración final de 20 nM, se incubó 1 j l de la solución madre de oligonucleótidos 20 j M con j l de medio Opti-MEM (Gibco cat # 31985-070) y 2 j l de Lipofectamine 2000 (Invitrogen cat # 11668019) a temperatura ambiente durante 20 min y se aplica gota a gota a un pocillo de una placa de 24 pocillos con células. Para lograr concentraciones finales de 5, 10, 40 y 80 nM, los volúmenes de la reserva de oligonucleótidos 20 j M usados se ajustaron en consecuencia. La relación de la solución madre de oligonucleótidos 20 j M a Lipofectamine 2000 fue 1:2 (v:v). Se usó una mezcla similar que incluía 8 j l de agua en lugar de la solución de oligonucleótidos y el volumen correspondiente de Lipofectamine 2000 para los controles de transfección simulada. Después de 18 horas de incubación a 37 °C y 5 % de CO² el medio se cambió a medio de crecimiento fresco. Cuarenta y ocho horas después de la adición de oligonucleótidos antisentido, se eliminó el medio y se lavaron las células 3 veces con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco sin calcio y magnesio (PBS) (Mediatech cat # 21-031-CV). A continuación se descartó el PBS y las células se fijaron en la placa de 24 pocillos usando 300 j l de metanol al 100 % durante 15 min a -20 °C. Después de eliminar el metanol y lavar con PBS, las células se incubaron con peróxido de hidrógeno al 3 % (Fisher Chemical cat # H325-100) durante 5 min a 21°C. Las células se lavaron tres veces durante 5 min con PBS a continuación se incubaron con 300 j l de albúmina de suero bovino (BSA) (Sigma cat # A-9647) al 0,1 % en PBS durante 30 min a 21 °C. Las células se lavaron tres veces durante 5 min con PBS y a continuación se incubaron con 300 j l de solución de avidina (Vector Laboratories cat # SP-2001) durante 30 min a 21°C. Las células se enjuagaron brevemente tres veces con PBS y a continuación se incubaron con solución de biotina (Vector Laboratories cat # SP-2001) durante 30 min a 21°C. Las células se lavaron tres veces con PBS y a continuación se incubaron durante la noche a 4 °C con 300 j l por pocillo de anticuerpo de conejo contra SCN1A humano (Abcam cat # ab24820) diluido a 1:250 en PBS/BSA al 0,1 %. Después de equilibrar la placa durante 5 min a 21 ° C, las células se lavaron tres veces 5 min cada una con PBS y a continuación se incubaron con anticuerpo anti-conejo de cabra diluido 1:200 en PBS/BSA al 0,1 % durante 30 min a 21 ° C. Las células se lavaron tres veces durante 5 min con PBS y a continuación se incubaron con 300 j l de solución de reactivo A B Vectastain Elite ABC (Vector Laboratories cat # PK-6101) durante 30 min; Se preparó la solución de reactivo A B de Vectastain Elite ABC a 21 ° C 30 min antes de la incubación con las células agregando y mezclando sucesivamente 2 gotas de reactivo A a 5 ml de PBS y a continuación 2 gotas de reactivo B. Las células se lavaron 3 veces durante 5 min cada una con PBS a 21 °C y a continuación se incubaron con solución de sustrato de peroxidasa de diaminobencidina (DAB) (Vector Laboratories cat # SK-4105) hasta que las células se tiñeron; la solución de sustrato de peroxidasa DAB se reconstituyó antes de añadirse a las células mezclando 1 ml de diluyente ImmPACT ™ DAB con 30 pl de concentrado de cromógeno ImmPACT™ DAB. En este momento, las células se lavaron brevemente tres veces con PBS y se dejaron 300 j l de PBS en cada pocillo. La tinción de las células se analizó directamente dentro de los pocillos de la placa de 24 pocillos utilizando un microscopio Nikon Eclipse TS100 invertido equipado con una cámara Nikon DS-Ril junto con un equipo Nikon Digital-Sight en la pantalla de una computadora portátil Dell Latitude D630. Las fotografías de los pocillos individuales se tomaron utilizando el software proporcionado con la cámara Nikon, NIS-Ekments D 3.0.

Resultados: Todos los oligonucleótidos antisentido probaron la proteína SCNIA regulada positivamente, siendo CUR-1764 y CUR-1770 las dos mejores (Fig. 11).

Ejemplo 10: Regulación positiva de la proteína SCNA en células Vero 76 tratadas con oligonucleótidos antisentido que se dirigen a la transcripción antisentido natural específico de SCNA

El propósito de este experimento fue clasificar los oligonucleótidos antisentido CUR-1740, CUR-1770, CUR-1916, CUR-1924 y CUR-1945 según su capacidad para regular positivamente la expresión de la proteína SCNIA en células Vero 76. La Vero76 es una línea celular de riñón de Cercopithecus aethiops (vervet o mono verde africano).

Materiales y Procedimientos: Se cultivaron células renales embrionarias de mono verde africano Vero76 de ATCC (cat # CRL-1587) en medio de crecimiento (medio de Eagle modificado de Dulbecco (Cellgrow 10-013-CV) 5 % FBS (Mediatech cat # MI35-011-CV) penicilina/estreptomicina (Mediatech cat # MT30-002-CI)) a 37°C y 5 % de CO². Las células se trataron con oligonucleótidos antisentido usando uno de los siguientes procedimientos. Para el procedimiento del día siguiente, un día antes del experimento, las células se volvieron a sembrar a una densidad de aproximadamente 4 x 104/ pocillo en placas de 24 pocillos en medio de crecimiento y se incubaron a 37 °C y 5 % de CO² durante la noche. Al día siguiente, el medio en las placas de pocillos se cambió por medio de crecimiento reciente (1 ml/pocillo) y las células se dosificaron con oligonucleótidos antisentido CUR-1740, CUR-1770 y CUR-1916. Todos los oligonucleótidos antisentido fueron fabricados por IDT Inc. (Coralville, IA) o Exiqon (Vedback, Dinamarca). Las secuencias de los oligonucleótidos CUR-1740, CUR-1770, Cu R-1916, CUR-1924 y CUR-1945 se enumeran en la Tabla 1. Las soluciones madre de oligonucleótidos se diluyeron hasta una concentración de 20 j M en agua estéril libre de ADNasa/ARNasa. Para dosificar un pocillo a una concentración final de 20 NM, se incubó 1 j l de la solución de oligonucleótidos 20 j M con 200 j l de medio Opti-MEM (Gibco cat # 31985-070) y 2 j l de Lipofectamine 2000 (Invitrogen cat # 11668019) a temperatura ambiente durante 20 min y se aplicó gota a gota a un pocillo de una placa de 24 pocilios con células. Para lograr concentraciones finales de 5, 10, 40 y 80 nM, los volúmenes de la reserva de oligonucleótidos 20 pM usados se ajustaron en consecuencia. La relación de la solución madre de oligonucleótidos 20 pM a Lipofectamine 2000 fue 1:2 (v:v). Se usó una mezcla similar que incluía 8 pl de agua en lugar de la solución de oligonucleótidos y el volumen correspondiente de Lipofectamine 2000 para los controles de transfección simulada. Después de 18 horas de incubación a 37 °C y 5 % de CO² el medio se cambió a medio de crecimiento fresco. Cuarenta y ocho horas después de la adición de oligonucleótidos antisentido, se eliminó el medio y se lavaron las células 3 veces con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco sin calcio y magnesio (PBS) (Mediatech cat # 21 -031-CV). Se descartó el PBS y se fijaron las células Vero 76 en la placa de 24 pocillos usando 300 pl de metanol al 100 % durante 15 min a -20 °C. Después de eliminar el metanol y lavar las células con PBS, las células se incubaron con peróxido de hidrógeno al 3 % (Fisher Chemical cat # H325-100) durante 5 min a 21 °C. Las células se lavaron tres veces durante 5 min con PBS a continuación se incubaron con 300 pl de albúmina de suero bovino (BSA) (Sigma cat # A-9647) al 0,1 % en PBS durante 30 min a 21 °C. Las células se lavaron tres veces durante 5 min con PBS y a continuación se incubaron con 300 pl de solución de avidina (Vector Laboratories cat # SP-2001) durante 30 min a 21°C. Las células se enjuagaron brevemente tres veces con PBS y a continuación se incubaron con solución de biotina (Vector Laboratories cat # SP-2001) durante 30 min a 21°C. Las células se lavaron tres veces con PBS y a continuación se incubaron durante la noche a 4 °C con 300 pl por pocillo de anticuerpo de conejo contra SCNIA humano (Abcam cat # ab24820) diluido a 1:250 en PBS/BSA al 0,1 %. Después de equilibrar la placa durante 5 min a 21 ° C, las células se lavaron tres veces 5 min cada una con PBS y a continuación se incubaron con anticuerpo anti-conejo de cabra diluido 1:200 en PBS/BSA al 0,1 % durante 30 min a 21 ° C. Las células se lavaron tres veces durante 5 min con PBS y a continuación se incubaron con 300 pl de solución de reactivo A B Vectastain Elite ABC (Vector Laboratories cat # PK-6101) durante 30 min; Se preparó la solución de reactivo A B de Vectastain Elite ABC a 21 ° C 30 min antes de la incubación con las células agregando y mezclando sucesivamente 2 gotas de reactivo A a 5 ml de PBS y a continuación 2 gotas de reactivo B. Las células se lavaron 3 veces 5 min cada una con PBS a 21 ° C y a continuación se incubaron con solución de sustrato de peroxidasa de diaminobencidina (DAB) (Vector Laboratories cat # SK-4105) hasta que las células se tiñeron; la solución de sustrato de peroxidasa DAB se reconstituyó antes de añadirse a las células mezclando 1 ml de diluyente ImmPACT ™ DAB con 30 pl de concentrado de cromógeno ImmPACT™ DAB. En este momento, las células se lavaron brevemente tres veces con PBS y se dejaron 300 pl de PBS en cada pocillo. La tinción de las células se analizó directamente dentro de los pocillos de la placa de 24 pocillos utilizando un microscopio Nikon Eclipse TS100 invertido equipado con una cámara Nikon DS-Ri1 junto con un equipo Nikon Digital-Sight en la pantalla de una computadora portátil Dell Latitude D630. Las fotografías de los pozos individuales se tomaron utilizando el software proporcionado con la cámara Nikon, NIS-Elements D 3.0.

Resultados. Todos los oligonucleótidos antisentido probaron la proteína SCNIA regulada positivamente, CUR-1764 y CUR-1770 produciendo la regulación positiva más alta (Fig 12).

Ejemplo 11: Los oligonucleótidos que se dirigen a la transcripción antisentido específico de SCNA son potentes para regular positivamente el ARNm de SCNA no aumentan el ARNm de actina en células Vero76

El propósito de este experimento fue comprobar si los oligonucleótidos antisentido (CUR-1924, CUR-1740, CUR-1838) dirigidos a la transcripción antisentido natural específico de SCNIA que se demostró que regulan positivamente el ARNm y la proteína de SCNIA son capaz de regular el ARNm de otros genes no relacionados como la actina en células renales embrionarias de mono verde africano Vero76.

Materiales y Procedimientos. La línea celular de riñón embrionario de mono verde africano Vero76 de ATCC (cat # CRL-1587) se dosificó en las mismas condiciones que se describen en el Ejemplo 2. El ARNm de actina se cuantificó mediante PCR en tiempo real como se describe en el Ejemplo 2 excepto que esta vez los cebadores/sondas diseñados por ABI eran específicos para actina (cat # Hs99999903_m1). Los datos se representan en la figura 13.

Resultados. Como se muestra en la figura 13, el oligonucleótido dirigido a la transcripción antisentido natural específica de SCNIA (CUR-1924, CUR-1740, CUR-1838) que se mostró en los Ejemplos 3 y 10 para regular positivamente el ARNm y la proteína de SCNIA en células Vero76 se probaron para determinar su efecto sobre la expresión de ARNm de actina en células Vero 76. Los datos de la figura 13 confirman que los oligonucleótidos que se dirigen a la transcripción antisentido natural específico de SCNIA no regulan positivamente un gen no relacionado como la actina. Por tanto, estos oligonucleótidos son específicos en la regulación positiva de SCN1A.

Ejemplo 12: Oligonucleótidos que se dirigen a la transcripción antisentido natural específico de SCNA que se muestra que regulan positivamente el ARNm de SCNA y la proteína no regulan positivamente el ARNm de actina en fibroblastos primarios que llevan una mutación asociada a Dravet

El propósito de este experimento fue comprobar si los oligonucleótidos antisentido (CUR-1916, CUR-1945) dirigidos a la transcripción antisentido natural específico de SCN1A que se demostró que regulan positivamente el ARNm de SCNIA y la proteína son capaces de regular el ARNm de otros genes no relacionados, como la actina, en fibroblastos primarios de piel humana que llevan una mutación E1099X asociada al síndrome de Dravet.

Materiales y Procedimientos. Se dosificaron fibroblastos primarios de piel humana que portaban una mutación E1099X asociada al síndrome de Dravet introducida en cultivo por el Dr. N. Kenyon (Universidad de Miami) en las mismas condiciones que se describen en el Ejemplo 3. El ARNm de actina se cuantificó mediante PCR en tiempo real como se describe en el Ejemplo 3 excepto que esta vez los cebadores/sondas diseñados por ABI eran específicos para actina (cat # Hs99999903_m1). Los datos se representan en la figura 14.

Resultados: Como se muestra en la figura 14, los oligonucleótidos que se dirigen a la transcripción antisentido natural específico de SCN1A no regulan positivamente un gen no relacionado como la actina. Por tanto, estos oligonucleótidos son específicos en la regulación positiva de SCN1A.

Ejemplo 13: Oligonucleótidos que se dirigen a la transcripción antisentido natural específico de SCNA que muestra que regulan positivamente el ARNm de SCNA y la proteína no regulan positivamente el ARNm de actina en células SK-N-AS

El propósito de este experimento era comprobar si los oligonucleótidos antisentido (CUR-1740, CUR-1764, CUR-1770, CUR-1838, CUR-1916) se dirigían a la transcripción antisentido natural específica de SCNIA que eran que se ha demostrado que regulan positivamente el ARNm de SCN1A y la proteína son capaces de regular el ARNm de otros genes no relacionados, como la actina en células de neuroblastoma humano SK-N-AS.

Materiales y Procedimientos. Se dosificaron células de neuroblastoma humano SK-N-AS de ATCC (cat # CRL-2137) en las mismas condiciones que se describen en el Ejemplo 2. El ARNm de actina se cuantificó mediante PCR en tiempo real como se describe en el Ejemplo 2 excepto que esta vez los cebadores/sondas diseñados por ABI eran específicos para actina (cat # Hs99999903_ml). Los datos se representan en la figura 15.

Resultados. Como se muestra en la figura 15, los oligonucleótidos que se dirigen a la transcripción antisentido natural específico de SCN1A no regulan positivamente un gen no relacionado como la actina. Por tanto, estos oligonucleótidos son específicos en la regulación positiva de SCN1A.

Ejemplo 14: La proteína actina no está regulada positivamente en células SK-N-AS tratadas con oligonucleótidos antisentido dirigidos a la transcripción antisentido natural específico de SCNA

El propósito de este experimento fue determinar si los oligonucleótidos que se dirigen a la transcripción antisentido natural específico de s Cn 1A (CUR-1740, CUR-1764, CUR-1770 y CUR-1916) y capaces de regular positivamente la proteína SCN1A también pueden regular la expresión de proteínas no relevantes como la actina en las células SK-N-AS. SK-N-AS es una línea celular de neuroblastoma humano.

Materiales y Procedimientos: Se cultivaron células de neuroblastoma humano SK-N-AS de ATCC (n° de cat. CRL-2137) en las mismas condiciones que se describen en el Ejemplo 9. Las células se fijaron y tiñeron exactamente en las mismas condiciones que las descritas en el Ejemplo 8, excepto que el primer anticuerpo fue una anti-actina de conejo (Abcam cat # ab1801) usada a una dilución de 1:500. La tinción de las células se analizó directamente dentro de los pocillos de la placa de 24 pocillos utilizando el mismo procedimiento que se describe en el Ejemplo 9.

Resultados: Como se muestra en la figura 16, ninguno de los oligonucleótidos antisentido probó la proteína actina regulada positivamente. Por tanto, estos oligonucleótidos son específicos para regular positivamente la proteína SCN1A.

Ejemplo 15: La proteína actina no se regula positivamente en células Vero 76 tratadas con oligonucleótidos antisentido que se dirigen a la transcripción antisentido natural específico de SCNA

El propósito de este experimento fue determinar si oligonucleótidos antisentido específicos dirigidos a la transcripción antisentido natural específico de SCN1A (CUR-1740, CUR-1770, CUR-1916, CUR-1924 y CUR-1945) y capaces de regular positivamente la proteína SCN1A también pueden regular la expresión de proteínas de genes no relevantes como la actina en las células Vero76. La Vero76 es una línea celular de riñón de Cercopithecus aethiops (vervet o mono verde africano).

Materiales y Procedimientos. Se cultivó la línea celular de riñón embrionario de mono verde africano Vero76 de ATCC (n° de cat. CRL-1587) en las mismas condiciones que se describen en el Ejemplo 10. Las células se fijaron y se tiñeron exactamente en las mismas condiciones que se describen en el Ejemplo 10, excepto que el primer anticuerpo fue una anti-actina de conejo (Abcam cat # ab1801) usada a una dilución de 1:500. La tinción de las células se analizó directamente dentro de los pocillos de la placa de 24 pocillos utilizando el mismo procedimiento que se describe en el Ejemplo 10.

Resultados. Como se muestra en la figura 17, ninguno de los oligonucleótidos antisentido probó la proteína actina regulada positivamente. Por tanto, estos oligonucleótidos son específicos para regular positivamente la proteína SCN1A.

Ejemplo 16: La proteína actina no se regula positivamente en fibroblastos humanos primarios que portan una mutación asociada al síndrome de Dravet tratados con oligonucleótidos antisentido que se dirigen a la transcripción antisentido natural específico de SCNA

El propósito de este experimento fue determinar si los oligonucleótidos que se dirigen a la transcripción antisentido natural específico de SCN1A (CUR-1740, CUR-1764, CUR-1770, CUR-1838 y CUR-1916) y capaces de regular positivamente la proteína SCNA también son capaces de regular la expresión proteica de genes no relevantes como la actina en fibroblastos humanos primarios que portan una mutación asociada al síndrome de Dravet.

Materiales y Procedimientos. Los fibroblastos que portaban una mutación asociada al síndrome de Dravet introducidos en cultivo por el Dr. N. Kenyon (Universidad de Miami) se cultivaron en las mismas condiciones que se describen en el Ejemplo 8. Las células se fijaron y tiñeron exactamente en las mismas condiciones como se describe en el Ejemplo 8, excepto que el primer anticuerpo era una anti-actina de conejo (Abcam cat # ab1801) usada a una dilución de 1:500. La tinción de las células se analizó directamente dentro de los pocillos de la placa de 24 pocillos utilizando el mismo procedimiento que se describe en el Ejemplo 8.

Resultados: Como se muestra en la figura 18, ninguno de los oligonucleótidos antisentido probó la proteína actina regulada positivamente. Por tanto, estos oligonucleótidos son específicos para regular positivamente la proteína SCN1A.

Ejemplo 17: Cuantificación de la proteína SCNA usando ELISA en fibrolastos humanos primarios que llevan una mutación asociada al síndrome de Dravet tratados con oligonucleótidos dirigidos a la transcripción antisentido natural específico de SCNA

El propósito de este experimento fue cuantificar mediante ELISA el nivel de regulación positiva de la proteína SCN1A debido al tratamiento con oligonucleótidos dirigidos a la transcripción antisentido natural específico de SCN1A (CUR-1740, CUR-1770 y CUR-1916) en fibroblastos humanos primarios que llevan una imitación asociada al síndrome de Dravet.

Materiales y Procedimientos: Los fibroblastos que llevan una mutación asociada al síndrome de Dravet introducidos en cultivo por el Dr. N. Kenyon (Universidad de Miami) se cultivaron en las mismas condiciones que se describen en Ejemplo 8, pero solo se usaron concentraciones de oligonucleótidos 0 y 80 nM para la dosificación. Después, las células a continuación se contaron y se volvieron a sembrar en placas de 96 pocillos. Después de 24 horas, las células se fijaron exactamente en las mismas condiciones que las descritas en los Ejemplos 8 y 16, excepto que todos los volúmenes de 300 pl se redujeron a 100 pl. Los pocillos replicados se tiñeron con actina y anticuerpos SCN1A como se describe en el Ejemplo 8, excepto que todas las reacciones se realizaron en volúmenes de 100 pl. La dilución del anticuerpo anti-actina fue 1:500, la dilución anti-SCN1A fue 1:250 y la dilución anti-ratón fue 1:250. Además, en lugar de la solución de sustrato de peroxidasa de diaminobencidina (dAb ) se usó una solución de sustrato de peroxidasa de tetrarnetilbencidina (TMB) (Thermo Scientific cat # N301). Después de que el sobrenadante se volvió azul, se transfirió a una nueva placa de 96 pocillos (Greiner bio one cat # 65121) y se añadió ácido sulfúrico 1 M. La absorbancia se leyó a 450 nm usando un espectrofotómetro Muitiskan Spectrum (Thermo Scientific). La señal de fondo (leída en los pocillos teñidos con un anti-ratón como anticuerpo primario) se restó de todas las lecturas de SCN1A y actina. A continuación, la señal de SCN1A se normalizó a la señal de actina para cada condición.

Resultados: La Figura 19 muestra que todos los oligonucleótidos antisentido probados (CUR-1740, CUR-1770 y CUR-1916) fueron efectivos en la regulación positiva de la proteína SCN1A hasta un 40 %.

Ejemplo 18: Cuantificación de la proteína SCNA usando ELISA en células Vero 76 tratadas con oligonucleótidos dirigidos a la transcripción antisentido natural específico de SCNA

El propósito de este experimento fue cuantificar mediante ELISA el nivel de regulación positiva de la proteína SCN1A debido al tratamiento con oligonucleótidos dirigidos a la transcripción antisentido natural específico de SCN1A (CUR-1740, CUR-1770, CUR-1916, CUR-1924, CUR-1945) en fibroblastos humanos primarios portadores de una mutación asociada al síndrome de Dravet.

Materiales y procedimientos: Se cultivaron células de riñón embrionario de mono verde africano Vero76 en las mismas condiciones que las descritas en el Ejemplo 10 pero solo se usaron concentraciones de oligonucleótidos 0 y 80 nM para la dosificación. Después, las células a continuación se contaron y se volvieron a sembrar en placas de 96 pocillos. Después de 24 horas, las células se fijaron exactamente en las mismas condiciones que se describen en el Ejemplo 8, excepto que todos los volúmenes de 300 pl se redujeron a 100 pl. Los pocillos replicados se tiñeron con actina y anticuerpos SCN1A como se describe en los Ejemplos 10 y 15, excepto que todas las reacciones se realizaron a 100 pl, la dilución del anticuerpo anti-actina fue 1:500, la dilución anti-SCN1A fue 1:250 y la dilución anti-ratón fue 1:250. Además, en lugar de usar una solución de sustrato de peroxidasa de diaminobencidina (DAB), se usó una solución de sustrato de peroxidasa de tetrametilbencidina (TMB) (Thermo Scientific cat # N301). Una vez que el sobrenadante se volvió azul, se transfirió a una nueva placa de 96 pocillos (Greiner bio one cat # 651201) y se añadió ácido sulfúrico 1 M. La absorbancia se leyó a 450 nm usando un espectrofotómetro Multiskan Spectrum (Thermo Scientific). La señal de fondo (leída en los pocillos teñidos con un anti-ratón como anticuerpo primario) se restó de todas las lecturas de SCN1A y actina. A continuación, la señal de SCN1A se normalizó a la señal de actina para cada condición.

Resultados: La Figura 20 muestra que todos los oligonucleótidos antisentido probados (CUR-1740, CUR-1770, CUR-1916, CUR-1924, CUR-1945) fueron eficaces en la regulación positiva de la proteína s Cn 1A hasta un 300 %.

Ejemplo 19: Cuantificación de la proteína SCNA usando ELISA en células SK-N-AS tratadas con oligonucleótidos dirigidos a la transcripción antisentido natural específico de SCNA

El propósito de este experimento fue cuantificar el nivel de aumento de la proteína SCN1A debido al tratamiento con oligonucleótidos dirigidos a la transcripción antisentido natural específico de SCN1A (CUR-1740, CUR-1770, CUR-1924 y CUR-1945) en células SK-N-AS.

Materiales y procedimientos: Se cultivaron células de neuroblastoma humano SK-N-AS de ATCC (cat # CRL-2137) en las mismas condiciones que se describen en el Ejemplo 10, pero solo se utilizaron concentraciones de oligonucleótidos de 0 y 20 nM para la dosificación. Después, las células a continuación se contaron y se volvieron a sembrar en placas de 96 pocillos. Después de 24 horas, las células se fijaron exactamente en las mismas condiciones que se describen en el Ejemplo 9, excepto que todos los volúmenes de 300 pl se redujeron a 100 pl. Los pocillos replicados se tiñeron con actina y anticuerpos SCN1A como se describe en los Ejemplos 9 y 13, excepto que todas las reacciones se realizaron a 100 pl, la dilución del anticuerpo anti-actina fue 1:500, la dilución anti-SCNIA fue 1:250 y la dilución anti­ ratón fue 1:250. Además, en lugar de la solución de sustrato de peroxidasa de diaminobencidina (DAB), se utilizó una solución de sustrato de peroxidasa de tetrametilbencidina (TMB) en el espectrofotómetro (Thermo Scientific cat # N301). Una vez que el sobrenadante se volvió azul, se transfirió a una nueva placa de 96 pocillos (Greiner bio one cat # 651201) y se añadió ácido sulfúrico 1 M. La absorbancia se leyó a 450 nm usando un Multiskan Spectrum (Thermo Scientific). La señal de fondo (leída en los pocillos teñidos con un anti-ratón como anticuerpo primario) se restó de todas las lecturas de SCN1A y actina. A continuación, la señal de SCN1A se normalizó a la señal de actina para cada condición.

Resultados: La Figura 21 muestra que todos los oligonucleótidos antisentido probados (CUR-1740, CUR-1770, CUR-1924 y

Resultados: La Figura 21 muestra que todos los oligonucleótidos antisentido probados (CUR-1740, CUR-1770, CUR-1945) fueron eficaces para regular positivamente la proteína SCN1A en células SK-N-AS hasta un 500 %.

Ejemplo 20: Detección del BG724147 antisentido natural en células HepG2 y fibroblastos humanos primarios que portan una mutación asociada al síndrome de Dravet.

El propósito de este experimento fue determinar si el antisentido natural BG724147 está presente en la línea celular de carcinoma hepatocelular humano HepG2 y fibroblastos humanos primarios que llevan una mutación asociada al síndrome de Dravet. Para lograr esto, se utilizaron dos tipos diferentes de ARN (poli A ARN y ARN total) aislados de cada tipo celular. Los productos de PCR obtenidos después de dos rondas sucesivas de PCR utilizando ambos tipos celulares se analizaron en un gel. La amplificación de bandas de tamaño similar usando un cebador específico de BG724147 confirmó la presencia de BG724147 en ambos tipos celulares.

Materiales y Procedimientos

Aislamiento de ARN Total. Se lavaron dos veces células HepG2 o fibroblastos humanos primarios que portaban una mutación asociada al síndrome de Dravet con una confluencia del 80 % en matraces de cultivo de 75 cm2 con PBS AccuGENE 1X (Lonza Rockeland Inc., Rockeland, ME). Después de descartar el PBS, se añadieron a estas células 5 ml de tampón RLT con b-mercaptoetanol (QIAGEN Inc.-EE. UU., Valencia, CA) y se almacenó el lisado celular en alícuotas de 1 ml en tubos de microcentrífuga a -80°C hasta el aislamiento de ARN total. El aislamiento de ARN total de estas células se realizó utilizando el kit midi RNeasy (QIAGEN Inc.-EE. UU., Valencia, CA) siguiendo el protocolo del fabricante. Brevemente, el lisado celular se centrifugó a 3000xg durante 5 min para aclarar el lisado y descartar cualquier sedimento.El lisado celular aclarado se centrifugó a través de columnas QIAshredder (dentro de tubos de microcentrífuga de 2 ml) a 14800xgy el lisado homogeneizado resultante se mezcló con un volumen igual de etanol al 70 %. El lisado celular mezclado con etanol se aplicó a columnas midi RNeasy (dentro de un tubo cónico de 15 ml) y se centrifugó durante 5 min a 3000xg. La columna se lavó una vez con 4 ml de tampón RW1 y a continuación se sometió a una digestión con ADNasa en columna durante 15 min con 140 pl de DNasa sin ARNasa en tampón RDD. La digestión con DNasa se detuvo añadiendo 4 ml de tampón RW1 y centrifugando la columna a 3000xg. La columna se lavó dos veces con tampón RPE y el ARN total que se unió al filtro se eluyó con 150 pl de agua libre de ADNasa y ARNasa. El ARN total se almacenó a -80°C hasta la siguiente etapa.

Aislamiento de ARN poli-A a partir de ARN total de células HepG2. El aislamiento de ARN poli A a partir del ARN total de células HepG2 y fibroblastos humanos primarios que llevan una mutación asociada al síndrome de Dravet se realizó utilizando un kit de aislamiento poli-A con perlas magnéticas de Ambion (Applied Biosystems/Ambion, Austin, TX) siguiendo el protocolo del fabricante. Básicamente, se resuspendieron 100 pg de ARN total hasta una concentración final de 600 pg/ml en agua libre de ADNasa/ARNasa y se añadió un volumen igual de solución de unión 2X. Durante ese tiempo, se colocaron 10 pl de perlas magnéticas Oligo (dT) en un tubo de microcentrífuga, se capturaron colocando este tubo en el soporte magnético y se desechó el tampón de almacenamiento. Se añadieron 50 pl de solución de lavado 1 a las perlas, se sacó el tubo del soporte magnético y se desechó la solución de lavado. En este momento, el ARN total de las células HepG2 en tampón de unión 1X se mezcló con las perlas magnéticas y se calentó a 70°C durante 5 min, a continuación se incubó durante 60 min a temperatura ambiente con agitación suave. El poli A ARN unido a las perlas magnéticas se capturó utilizando el soporte magnético durante 5 min. Se descartó el sobrenadante. Las perlas magnéticas de Oligo (dT) se lavaron dos veces con la solución de lavado 1 y una vez con la solución de lavado 2 para eliminar el ARN unido no específicamente. Las perlas magnéticas se capturaron con el soporte magnético y se añadieron a las perlas 200 pl de solución de almacenamiento de ARN caliente (precalentada a 70 °C durante 5 min). Las perlas magnéticas fueron capturadas por el soporte magnético, el sobrenadante fue almacenado (primera elución de poli A ARN). A continuación, se añadió a las perlas una segunda cantidad de 200 pl de solución de almacenamiento de ARN caliente (precalentada a 70 °C durante 5 min). La segunda elución de poliA ARN se añadió a la primera elución. En este momento, el ARN eluido se precipitó usando acetato de amonio 5 M, glucógeno y etanol al 100 % a -20 °C durante la noche. El poli ARN se centrifugó a 14800 xg durante 30 min a 4°C. El sobrenadante se descartó y el sedimento de ARN se lavó tres veces con 1 ml de etanol al 70 %, el sedimento de ARN se recuperó cada vez mediante centrifugación durante 10 min a 4 °C. Finalmente, el sedimento de poli A. ARN se resuspendió en una solución de almacenamiento de ARN calentada a 70°C para disolver mejor el a Rn . El poli A ARN se almacenó a -80°C.

Adición de adenosinas al extremo 3' de una transcripción de ARN. Se mezcló ARN total (40 pg) de células HepG2 o fibroblastos humanos primarios portadores de una mutación asociada al síndrome de Dravet con 2 unidades de ARN Polimerasa (A) utilizando un volumen de reacción final de 100 pl (Ambion, Applied Biosystems, St. Austin TX). El ATP usado en la reacción de poliadenilación fue de Invitrogen. Después de la poliadenilación, el ARN se purificó usando la técnica de fenol/cloroformo seguida de precipitación con glucógeno/acetato de sodio. Este ARN se resuspendió en 40 pl de agua libre de ADNasa/ARNasa y se usó en una reacción 3'RACE (kit FirstChoice RLM-RACE de Ambion, Applied Biosystems, St. Austin TX).

Extensión 3' de la transcripción antisentido natural BG724147 de SCN1A. Se realizaron dos conjuntos diferentes de reacciones de amplificación rápida 3' de extremos de ADNc (RACE) usando el kit FirstChoice RLM-RACE de Ambion, Applied Biosystems (St. Austin, TX). Un conjunto usó poli A ARN y el otro usó ARN total con una adenosina agregada, de células HepG2 o fibroblastos humanos primarios que portaban una mutación asociada al síndrome de Dravet. Se realizaron dos rondas consecutivas de PCR. La primera PCR se realizó utilizando el cebador externo 3' suministrado en el kit y un cebador 5' específico para BG724l47 diseñado por OPKO CURNA (5' GATTCTCCTACAGCAATTGGTA 3'). La segunda ronda de PCR se llevó a cabo utilizando el cebador externo 3' suministrado en el kit y un cebador 5' diferente específico para BG724147 diseñado por OPKO CURNA (5 'GACATGTAATCACTTTCATCAA 3'). Los productos de la segunda reacción de PCR se procesaron en un gel de agarosa -1xTAE al 1 %.

Resultados: La Figura 22 muestra los productos de la segunda ronda de reacciones de PCR de un 3' RACE experimentos usando poli A ARN y ARN total con adenosina agregada de células HepG2 y poli A ARN y ARN total con adenosina añadida de fibroblastos humanos primarios que llevan una mutación asociada al síndrome de Dravet. Se observa una banda idéntica en el pol,i A ARN de las células HepG2 y los fibroblastos humanos primarios que llevan una mutación asociada al síndrome de Dravet.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un oligonucleótido para uso como compuesto terapéutico, donde dicho oligonucleótido aumenta la expresión del canal de sodio, controlado por voltaje, tipo I, subunidad alfa (SCN1A), y donde dicho oligonucleótido:

a. se dirige a una transcripción antisentido natural del canal de sodio, tipo I, de subunidad alfa (SCN1A), donde la transcripción antisentido natural tiene la secuencia de ácido nucleico como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO: 12 a 15 o 17 a 28, o una variante del mismo que conserva la función de la transcripción antisentido natural de cualquiera de las SEQ ID NO: 12 a 15 o 17 a 28; o

b. tiene una longitud de 10-30 nucleótidos y se une a un complemento inverso de SEQ ID NO: 16.

2. Un oligonucleótido para su uso en la prevención o tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado a la subunidad alfa (SCN1A) controlada por voltaje, tipo I, del canal de sodio, donde dicho oligonucleótido aumenta la expresión del canal de sodio, tipo I, controlado por voltaje, subunidad alfa (SCN1A), y donde dicho oligonucleótido:

a. se dirige a una transcripción antisentido natural del canal de sodio, tipo I, de subunidad alfa (SCN1A), donde la transcripción antisentido natural tiene la secuencia de ácido nucleico como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO: 12 a 15 o 17 a 28, o una variante del mismo que conserva la función de la transcripción antisentido natural de cualquiera de las SEQ ID NO: 12 a 15 o 17 a 28; o

b. tiene una longitud de 10-30 nucleótidos y se une a un complemento inverso de SEQ ID NO: 16.

3. Uso de un oligonucleótido para la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado a la subunidad alfa (SCN1A) controlada por voltaje, tipo I, del canal de sodio, donde dicho oligonucleótido aumenta la expresión del del canal de sodio, controlado por voltaje, tipo I, subunidad alfa (SCN1A), y donde dicho oligonucleótido:

a. se dirige a una transcripción antisentido natural del canal de sodio, tipo I, de subunidad alfa (SCN1A), donde la transcripción antisentido natural tiene la secuencia de ácido nucleico como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO: 12 a 15 o 17 a 28, o una variante del mismo que conserva la función de la transcripción antisentido natural de cualquiera de las SEQ ID NO: 12 a 15 o 17 a 28; o

b. tiene una longitud de 10-30 nucleótidos y se une a un complemento inverso de SEQ ID NO: 16.

4. Uso según la reivindicación 3, o un oligonucleótido para su uso según la reivindicación 1 o 2, donde la enfermedad o trastorno se selecciona de entre el grupo que consiste en una enfermedad o trastorno asociado con una función y/o expresión anormal de SCNA, epilepsia mioclónica grave de la infancia (SMEI o síndrome de Dravet), una enfermedad o trastorno neurológico, convulsión, dolor (incluido el dolor crónico), alteración de la excitabilidad eléctrica que implica una disfunción del canal de sodio, una enfermedad o trastorno asociado con la disfunción del canal de sodio, una enfermedad o trastorno asociado con una mala regulación de actividad de la subunidad alfa del canal de sodio controlado por voltaje (p. ej., parálisis, parálisis periódica hiperpotasémica, paramiotonía congénita, miotonía agravada por potasio, síndrome de QT largo 3, enfermedad de la placa motora terminal, ataxia, etc.), una enfermedad del tracto gastrointestinal debido a disfunción del sistema nervioso entérico (por ejemplo, colitis, ileítis, síndrome inflamatorio del intestino, etc.), una enfermedad o trastorno cardiovascular (por ejemplo, hipertensión, congestión insuficiencia cardíaca, etc.); una enfermedad o trastorno del tracto genitourinario que implica inervación simpática y parasimpática (por ejemplo, hiperplasia benigna de próstata, impotencia); una enfermedad o trastorno asociado con el sistema neuromuscular (p. ej., distrofia muscular, esclerosis múltiple, epilepsia, autismo, migraña (p. ej., migrañas hemipléjicas familiares y esporádicas, etc.), epilepsia generalizada con convulsión febril más (GEFS ), etc.) y trastornos convulsivos relacionados con SCNA.

5. Un procedimiento in vitro para aumentar la expresión del canal de sodio, controlado por voltaje, tipo I, subunidad alfa (SCN1A) en células o tejidos de pacientes que comprende:

poner en contacto dichas células o tejidos con un oligonucleótido que:

a. se dirige a una transcripción antisentido natural de canal de sodio, tipo I, subunidad alfa (SCN1A), controlado por voltaje; y donde la transcripción antisentido natural tiene la secuencia de ácido nucleico como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO: 12 a 15 o 17 a 28, o una variante de la misma que retiene la función de la transcripción antisentido natural de cualquiera de las SEQ ID NOS: de 12 a 15 o de 17 a 28; o

b. tiene una longitud de 10-30 nucleótidos y se une a un complemento inverso de SEQ ID NO: 16;

aumentando así la expresión del canal de sodio, controlado por voltaje, tipo I, subunidad alfa (SCN1A),

6. Uso según la reivindicación 3 o 4, o un oligonucleótido para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 4, o un procedimiento según la reivindicación 5, donde el oligonucleótido es monocatenario.

7. Uso según la reivindicación 3 o 4, o un oligonucleótido para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 4, o un procedimiento según la reivindicación 5, donde el oligonucleótido es un compuesto de siRNA.

8. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4, 6 o 7, o un oligonucleótido para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4, 6 o 7, o un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, donde el oligonucleótido comprende al menos una de las SEQ ID NOS: 70, 93, 45, 57, 52, 40, 51,47, 49, 48, 90 a 92, 94, 87, 69, 78, 82, 79, 61 a 63, 84, 30, 33, 35, 37, 46, 50, 55, 56, 59, 67, 76, 77 u 83.

9. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 o 6 a 8, o un oligonucleótido para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4, o 6 a 8, o un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, donde la expresión de la subunidad alfa de tipo I, canal de sodio, controlado por voltaje (SCN1A) se incrementa en al menos un 10 %.

10. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 o 6 a 9, o un oligonucleótido para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 o 6 a 9, o un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9, donde el oligonucleótido comprende además una o más modificaciones que comprenden:

a. al menos un enlace internucleosídico modificado seleccionado de entre: un fosforotioato, alquilfosfonato, fosforoditioato, alquilfosfonotioato, fosforamidato, carbamato, carbonato, triéster de fosfato, acetamidato, éster carboximetílico y combinaciones de los mismos;

b. al menos un nucleótido modificado seleccionado de entre: un ácido nucleico peptídico (ANP), un ácido nucleico bloqueado (ANB), un ácido arabino-nucleico, un análogo, un derivado, y combinaciones de los mismos; o c. al menos un resto de azúcar modificado seleccionado de entre: un resto de azúcar modificado con 2'-O-metoxietilo, un resto de azúcar modificado con 2'-metoxi, un resto de azúcar modificado con 2'-O-alquilo, un resto de azúcar bicíclico, un resto de 2'-fluoro, y combinaciones de los mismos.

11. Un oligonucleótido que:

a. se puede hibridar con una transcripción antisentido natural que tiene la secuencia de ácido nucleico como se establece en cualquiera de las SEQ ID NOS: 12 o 23, o una variante de la misma que conserva la función de la transcripción antisentido natural de cualquiera de las SEQ ID NOS: 12 o 23 donde opcionalmente el oligonucleótido tiene entre 10 y 30 nucleótidos de longitud; o

b. tiene al menos un 80 % de complementariedad con una región diana dentro de una transcripción antisentido natural que tiene la secuencia de ácido nucleico como se establece en cualquiera de las SEQ ID NOS: 14 o 24, o una variante de la misma que conserva la función de la transcripción antisentido natural cualquiera de las SEQ ID NOS: 14 o 24, donde opcionalmente el oligonucleótido tiene una longitud de entre 10 y 30 nucleótidos; o c. se puede hibridar con una transcripción antisentido natural que tiene la secuencia de ácido nucleico como se establece en cualquiera de las SEQ ID NOS: 13 y 18, o una variante de la misma que conserva la función de la transcripción antisentido natural de cualquiera de las SEQ ID NOS: 13 o 18, donde el oligonucleótido tiene entre 10 y 30 nucleótidos de longitud; o

d. tiene una longitud de 10 a 30 nucleótidos y se puede hibridar con un complemento inverso de SEQ ID NO: 16; o

e. comprende al menos una de las SEQ ID NOS: 93, 45, 57, 52, 40, 51,47, 49, 48, 90 a 92, 94, 87, 69, 78, 82, 79, 61 a 63, 84, 30, 33, 35, 37, 46, 50, 55, 56, 59, 67, 70, 76, 77, 83, donde opcionalmente el oligonucleótido tiene entre 10 y 30 nucleótidos de longitud;

donde dicho oligonucleótido aumenta la expresión del canal de sodio, controlado por voltaje, tipo I, subunidad alfa (SCN1A).

12. Un oligonucleótido según la reivindicación 11, donde el oligonucleótido es monocatenario o un compuesto de siRNA.

13. Un oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 11 o 12, donde el oligonucleótido tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 16

14. Un oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, que además comprende una o más modificaciones que comprenden:

a. al menos un enlace internucleosídico modificado seleccionado de entre: un fosforotioato, alquilfosfonato, fosforoditioato, alquilfosfonotioato, fosforamidato, carbamato, carbonato, triéster de fosfato, acetamidato, éster carboximetílico y combinaciones de los mismos;

b. al menos un nucleótido modificado seleccionado de entre: un ácido nucleico peptídico (ANP), un ácido nucleico bloqueado (ANB), un ácido arabino-nucleico, un análogo, un derivado, y combinaciones de los mismos; o c. al menos un resto de azúcar modificado seleccionado de entre: un resto de azúcar modificado con 2'-O-metoxietilo, un resto de azúcar modificado con 2'-metoxi, un resto de azúcar modificado con 2'-O-alquilo, un resto de azúcar bicíclico, un resto de 2'-fluoro, y combinaciones de los mismos;

15. Una composición farmacéutica que comprende al menos un oligonucleótido que:

a. se puede hibridar con una transcripción antisentido natural que tiene la secuencia de ácido nucleico como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO: 12 a 15, 18 a 24 o una variante de la misma que retiene la función de la transcripción antisentido natural de cualquiera de las SEQ ID NOS: 12 a 15, 18 a 24, donde dicho oligonucleótido aumenta la expresión de SCN1A; o

b. tiene de 10 a 30 nucleótidos de longitud y se puede hibridar con un complemento inverso de SEQ ID NO: 16, donde dicho oligonucleótido aumenta la expresión de SCN1A;

y un excipiente farmacéuticamente aceptable; donde opcionalmente el al menos un oligonucleótido es un oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14.