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BR112020022512A2 - métodos e composições para tratamento de doença de armazenamento de éster de colesteril - Google Patents

métodos e composições para tratamento de doença de armazenamento de éster de colesteril Download PDF

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BR112020022512A2
BR112020022512A2 BR112020022512-6A BR112020022512A BR112020022512A2 BR 112020022512 A2 BR112020022512 A2 BR 112020022512A2 BR 112020022512 A BR112020022512 A BR 112020022512A BR 112020022512 A2 BR112020022512 A2 BR 112020022512A2
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sec
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BR112020022512-6A
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Isabel Aznarez
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Stoke Therapeutics, Inc.
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Abstract

MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA TRATAMENTO DE DOENÇA DE ARMAZENAMENTO DE ÉSTER DE COLESTERIL. São fornecidos aqui métodos e composições para o tratamento de um sujeito em necessidade, tal como um sujeito com expressão deficiente da proteína LAL ou um sujeito com doença de armazenamento de éster de colesterol.

Description

MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA TRATAMENTO DE DOENÇA DE ARMAZENAMENTO DE ÉSTER DE COLESTERIL REFERÊNCIA CRUZADA
[001] Esse pedido reivindica o benefício do Pedido U.S. Provisório Nº 62/667.205, depositado em 4 de maio de 2018, que é incorporado nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade.
FUNDAMENTOS
[002] A doença do armazenamento de éster de colesteril (CESD) (também denominada algumas vezes deficiência de lipase ácida lisossomal (LAL)) é uma doença hepática crônica autossômica recessiva causada por deficiência da enzima LAL funcional. CESD é uma doença rara, mas séria, e acontece quando o corpo não produz LAL suficiente. A enzima LAL (também denominada éster de colesteril hidrolase) é uma enzima que degrada material gorduroso e é essencial para a metabolização de ésteres de colesteril e triglicerídeos. Uma mutação pontual do gene de LIPA resulta na produção de proteínas truncadas com atividade enzimática deficiente que levam ao acúmulo de éster de colesteril em órgãos e tecidos. A atividade da enzima LAL reduzida tipicamente resulta em um acúmulo maciço de material gorduroso em vários tecidos incluindo fígado, baço, intestino, paredes dos vasos sangüíneos e outros órgãos importantes. Como resultado, a CESD está tipicamente associada com morbidade e mortalidade significantes e pode afetar indivíduos desde a infância até a vida adulta.
SUMÁRIO
[003] De acordo com um aspecto da presente revelação, é fornecido nesse relatório descritivo um método de tratamento de Doença do Armazenamento de Éster de Colesteril (CESD) em um indivíduo necessitado por modulação da expressão de uma proteína-alvo ou RNA funcional por células do indivíduo, em que as células possuem um pré-mRNA que contém um éxon que pode ser saltado (pré-mRNA SEC), o pré-mRNA SEC compreendendo o éxon que pode ser saltado, um íntron que flanqueia o sítio de ligação (sítio de splice) 5’ do éxon que pode ser saltado, e um íntron que flanqueia o sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado, e em que o pré-mRNA SEC codifica a proteína-alvo ou RNA funcional, o método compreendendo o contato das células do indivíduo com um oligômero anti-senso (ASO) complementar a uma porção visada do pré-mRNA SEC que codifica a proteína-alvo ou RNA funcional, pelo qual o éxon que pode ser saltado é retido em um mRNA processado pelo pré-mRNA SEC que codifica a proteína-alvo ou RNA funcional modulando, dessa forma, um nível de mRNA que codifica a proteína-alvo ou RNA funcional e modulando a expressão da proteína-alvo ou RNA funcional nas células do indivíduo.
[004] De acordo com outro aspecto da presente revelação, é fornecido nesse relatório descritivo um método de modulação da expressão de uma proteína-alvo, em que a proteína-alvo é lipase ácida lisossomal (LAL), por células que possuem um pré-mRNA que contém um éxon que pode ser saltado (pré-mRNA SEC), o pré-mRNA SEC compreendendo o éxon que pode ser saltado, um íntron que flanqueia o sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado, um íntron que flanqueia o sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado, e em que o pré- mRNA SEC codifica proteína LAL, o método compreendendo o contato das células com um oligômero anti-senso (ASO) complementar a uma porção visada do pré-mRNA SEC que codifica proteína LAL, pelo qual o éxon que pode ser saltado é retido em um mRNA processado pelo pré-mRNA SEC que codifica proteína LAL modulando, dessa forma, o nível de mRNA que codifica proteína LAL e modulando a expressão de proteína LAL nas células.
[005] Em algumas modalidades, a modulação da expressão ou do nível da proteína-alvo ou mRNA que codifica a proteína- alvo aumenta a expressão ou o nível da proteína-alvo ou mRNA que codifica a proteína-alvo. Em algumas modalidades, a modulação da expressão ou do nível de proteína LAL ou mRNA que codifica proteína LAL aumenta a expressão ou o nível de proteína LAL ou mRNA que codifica proteína LAL. Em algumas modalidades, a proteína-alvo é LAL. Em algumas modalidades, as células estão em ou são de um indivíduo que possui uma condição causada por uma quantidade ou atividade deficiente de proteína LAL. Em algumas modalidades, pelo menos um nucleotídeo dos 9 nucleotídeos em +1 até +6 do íntron que flanqueia o sítio de ligação 5’ e -3e até -1e do éxon que pode ser saltado compreende pelo menos uma mutação. Em algumas modalidades, a mutação é uma substituição. Em algumas modalidades, a mutação é em -1e. Em algumas modalidades, a mutação é c.894G>A. Em algumas modalidades, a quantidade deficiente da proteína-alvo é causada por herança autossômica recessiva. Em algumas modalidades, o indivíduo possui um primeiro alelo que codifica uma proteína-alvo funcional e (a) um segundo alelo que codifica uma proteína- alvo funcional, em que o oligômero anti-senso se liga a uma porção visada de um pré-mRNA SEC transcrito pelo primeiro ou segundo alelo; ou (b) um segundo alelo, em que o oligômero anti-senso se liga a uma porção visada de um pré-mRNA SEC transcrito pelo primeiro alelo.
Em algumas modalidades, o indivíduo possui uma condição causada por um distúrbio que resulta de uma deficiência na quantidade ou função da proteína-alvo, em que o indivíduo possui um primeiro alelo que compreende uma primeira mutação pela qual a proteína- alvo é produzida em um nível reduzido, comparada com a produção por um alelo do tipo selvagem, a proteína-alvo é produzida em uma forma que possui função reduzida, comparada com uma proteína do tipo selvagem equivalente, ou a proteína- alvo não é produzida, e um segundo alelo que compreende uma segunda mutação pela qual a proteína-alvo é produzida em um nível reduzido, comparada com a produção por um alelo do tipo selvagem, a proteína-alvo é produzida em uma forma que possui função reduzida, comparada com uma proteína do tipo selvagem equivalente, ou a proteína-alvo não é produzida, e em que a primeira e segunda mutações são iguais ou diferentes.
Em algumas modalidades, a proteína-alvo é produzida em uma forma que possui função reduzida, comparada com a proteína do tipo selvagem equivalente.
Em algumas modalidades, a proteína-alvo é produzida em uma forma que é totalmente funcional, comparada com a proteína do tipo selvagem equivalente.
Em algumas modalidades, a porção visada do pré-mRNA SEC está no éxon que pode ser saltado dentro da região -4e em relação ao sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado até +2e em relação ao sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado.
Em algumas modalidades, a porção visada do pré-mRNA SEC está dentro: da região +6 até +500 no íntron que flanqueia o sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado; ou da região -16 até -500 no íntron que flanqueia o sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado.
Em algumas modalidades, a porção visada do pré-mRNA SEC está dentro: da região -4e até -500e em relação ao sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado; da região +6 até +500 em relação ao sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado; da região -16 até -500 em relação ao sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado; ou da região +2e até +500e em relação ao sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado.
Em algumas modalidades, o pré- mRNA SEC compreende uma seqüência com pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 100% de identidade de seqüência para o ID.
DE SEQ.
Nº: 1 ou um complemento deste.
Em algumas modalidades, o pré-mRNA SEC é codificado por uma seqüência genética com pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 100% de identidade de seqüência para o ID.
DE SEQ.
Nº: 1 ou um complemento deste.
Em algumas modalidades, a porção visada do pré-mRNA SEC compreende uma seqüência com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 100% de identidade de seqüência para uma região que compreende pelo menos 8 ácidos nucleicos contíguos dos IDS.
DE SEQ.
Nos: 2-4 ou complementos destes.
Em algumas modalidades, o ASO compreende uma seqüência que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 100% idêntica a qualquer um dos IDS.
DE SEQ.
Nos: 5-63 ou complementos destes.
Em algumas modalidades, a porção visada do pré-mRNA SEC está dentro da região -4e em relação ao sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado até +2e em relação ao sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado, em que o éxon que pode ser saltado é o éxon 8. Em algumas modalidades, o ASO compreende uma seqüência que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 100% idêntica a qualquer um dos IDS.
DE SEQ.
Nos: 54-63 ou complementos destes.
Em algumas modalidades, a porção visada do pré-mRNA SEC está dentro da região +6 até +500 em relação ao sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado, em que o éxon que pode ser saltado é o éxon 8. Em algumas modalidades, o ASO compreende uma seqüência que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 100% idêntica a qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 5-38 ou complementos destes. Em algumas modalidades, a porção visada do pré-mRNA SEC está dentro da região -16 até -500 em relação ao sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado, em que o éxon que pode ser saltado é o éxon 8. Em algumas modalidades, o ASO compreende uma seqüência que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 100% idêntica a qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 39-53 ou complementos destes. Em algumas modalidades, o pré-mRNA SEC é um pré-mRNA parcialmente ligado de um pré-mRNA de comprimento total ou é um pré-mRNA parcialmente ligado de um pré-mRNA do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o mRNA que codifica a proteína-alvo ou RNA funcional é um mRNA maduro de comprimento total, ou um mRNA maduro do tipo selvagem. Em algumas modalidades, a proteína-alvo produzida é proteína de comprimento total, ou proteína do tipo selvagem, ou uma combinação destas.
[006] Em algumas modalidades, a quantidade total do mRNA que codifica a proteína-alvo ou o RNA funcional produzido na célula colocada em contato com o oligômero anti-senso é aumentada cerca de 1,1 até cerca de 10 vezes, cerca de 1,5 até cerca de 10 vezes, cerca de 2 até cerca de 10 vezes, cerca de 3 até cerca de 10 vezes, cerca de 4 até cerca de 10 vezes, cerca de 1,1 até cerca de 5 vezes, cerca de 1,1 até cerca de 6 vezes, cerca de 1,1 até cerca de 7 vezes, cerca de 1,1 até cerca de 8 vezes, cerca de 1,1 até cerca de 9 vezes, cerca de 2 até cerca de 5 vezes, cerca de 2 até cerca de 6 vezes, cerca de 2 até cerca de 7 vezes, cerca de 2 até cerca de 8 vezes, cerca de 2 até cerca de 9 vezes, cerca de 3 até cerca de 6 vezes, cerca de 3 até cerca de 7 vezes, cerca de 3 até cerca de 8 vezes, cerca de 3 até cerca de 9 vezes, cerca de 4 até cerca de 7 vezes, cerca de 4 até cerca de 8 vezes, cerca de 4 até cerca de 9 vezes, pelo menos cerca de 1,1 vez, pelo menos cerca de 1,5 vez, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 3,5 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, ou pelo menos cerca de 10 vezes, comparada com a quantidade total do mRNA que codifica a proteína-alvo ou o RNA funcional produzido em uma célula de controle.
[007] Em algumas modalidades, a quantidade total do mRNA que codifica a proteína-alvo ou o RNA funcional produzido na célula colocada em contato com o oligômero anti-senso é aumentada cerca de 20% até cerca de 300%, cerca de 50% até cerca de 300%, cerca de 100% até cerca de 300%, cerca de 150% até cerca de 300%, cerca de 20% até cerca de 50%, cerca de 20% até cerca de 100%, cerca de 20% até cerca de 150%, cerca de 20% até cerca de 200%, cerca de 20% até cerca de 250%, cerca de 50% até cerca de 100%, cerca de 50% até cerca de 150%, cerca de 50% até cerca de 200%, cerca de 50% até cerca de 250%, cerca de 100% até cerca de 150%, cerca de 100% até cerca de 200%, cerca de 100% até cerca de 250%, cerca de 150% até cerca de 200%, cerca de 150% até cerca de 250%, cerca de 200% até cerca de 250%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 100%, pelo menos cerca de 150%, pelo menos cerca de 200%, pelo menos cerca de 250%, ou pelo menos cerca de 300%, comparada com a quantidade total do mRNA que codifica a proteína-alvo ou o RNA funcional produzido em uma célula de controle.
[008] Em algumas modalidades, a quantidade total de proteína-alvo produzida pela célula colocada em contato com o oligômero anti-senso é aumentada cerca de 1,1 até cerca de 10 vezes, cerca de 1,5 até cerca de 10 vezes, cerca de 2 até cerca de 10 vezes, cerca de 3 até cerca de 10 vezes, cerca de 4 até cerca de 10 vezes, cerca de 1,1 até cerca de 5 vezes, cerca de 1,1 até cerca de 6 vezes, cerca de 1,1 até cerca de 7 vezes, cerca de 1,1 até cerca de 8 vezes, cerca de 1,1 até cerca de 9 vezes, cerca de 2 até cerca de 5 vezes, cerca de 2 até cerca de 6 vezes, cerca de 2 até cerca de 7 vezes, cerca de 2 até cerca de 8 vezes, cerca de 2 até cerca de 9 vezes, cerca de 3 até cerca de 6 vezes, cerca de 3 até cerca de 7 vezes, cerca de 3 até cerca de 8 vezes, cerca de 3 até cerca de 9 vezes, cerca de 4 até cerca de 7 vezes, cerca de 4 até cerca de 8 vezes, cerca de 4 até cerca de 9 vezes, pelo menos cerca de 1,1 vez, pelo menos cerca de 1,5 vez, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 3,5 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, ou pelo menos cerca de 10 vezes, comparada com a quantidade total de proteína-alvo produzida por uma célula de controle.
[009] Em algumas modalidades, a quantidade total de proteína-alvo produzida pela célula colocada em contato com o oligômero anti-senso é aumentada cerca de 20% até cerca de
300%, cerca de 50% até cerca de 300%, cerca de 100% até cerca de 300%, cerca de 150% até cerca de 300%, cerca de 20% até cerca de 50%, cerca de 20% até cerca de 100%, cerca de 20% até cerca de 150%, cerca de 20% até cerca de 200%, cerca de 20% até cerca de 250%, cerca de 50% até cerca de 100%, cerca de 50% até cerca de 150%, cerca de 50% até cerca de 200%, cerca de 50% até cerca de 250%, cerca de 100% até cerca de 150%, cerca de 100% até cerca de 200%, cerca de 100% até cerca de 250%, cerca de 150% até cerca de 200%, cerca de 150% até cerca de 250%, cerca de 200% até cerca de 250%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 100%, pelo menos cerca de 150%, pelo menos cerca de 200%, pelo menos cerca de 250%, ou pelo menos cerca de 300%, comparada com a quantidade total de proteína-alvo produzida por uma célula de controle.
[010] Em algumas modalidades, o oligômero anti-senso compreende uma modificação do arcabouço que compreende uma ligação fosforotioato ou uma ligação fosforodiamidato. Em algumas modalidades, o oligômero anti-senso compreende uma porção fosforodiamidato morfolino, uma porção ácido nucleico bloqueado, uma porção ácido nucleico peptídico, uma porção 2’-O-metil, uma porção 2’-Flúor ou uma porção 2’-O- metoxietil. Em algumas modalidades, o oligômero anti-senso compreende pelo menos uma porção de açúcar modificada. Em algumas modalidades, cada porção de açúcar é uma porção de açúcar modificada.
[011] Em algumas modalidades, o oligômero anti-senso consiste em de 8 a 50 nucleobases, 8 a 40 nucleobases, 8 a 35 nucleobases, 8 a 30 nucleobases, 8 a 25 nucleobases, 8 a 20 nucleobases, 8 a 15 nucleobases, 9 a 50 nucleobases, 9 a
40 nucleobases, 9 a 35 nucleobases, 9 a 30 nucleobases, 9 a 25 nucleobases, 9 a 20 nucleobases, 9 a 15 nucleobases, 10 a 50 nucleobases, 10 a 40 nucleobases, 10 a 35 nucleobases, 10 a 30 nucleobases, 10 a 25 nucleobases, 10 a 20 nucleobases, 10 a 15 nucleobases, 11 a 50 nucleobases, 11 a 40 nucleobases, 11 a 35 nucleobases, 11 a 30 nucleobases, 11 a 25 nucleobases, 11 a 20 nucleobases, 11 a 15 nucleobases, 12 a 50 nucleobases, 12 a 40 nucleobases, 12 a 35 nucleobases, 12 a 30 nucleobases, 12 a 25 nucleobases, 12 a 20 nucleobases ou 12 a 15 nucleobases.
[012] Em algumas modalidades, o oligômero anti-senso é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% complementar à porção visada do pré-mRNA SEC que codifica a proteína. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a avaliação da expressão da proteína LIPA. Em algumas modalidades, CESD tratada e em que o oligômero anti-senso se liga a uma porção visada de um pré-mRNA SEC de LIPA, em que a porção visada compreende pelo menos 8 ácidos nucleicos contíguos dos IDS. DE SEQ. Nos: 2-4 ou complementos destes. Em algumas modalidades, o indivíduo é um humano. Em algumas modalidades, o indivíduo é um animal não humano. Em algumas modalidades, o indivíduo é um feto, um embrião ou uma criança. Em algumas modalidades, as células são colocadas em contato ex vivo. Em algumas modalidades, o oligômero anti-senso é administrado por injeção intratecal, injeção intracerebroventricular, injeção intraperitoneal, injeção intramuscular, injeção subcutânea ou injeção intravenosa no indivíduo.
[013] Em algumas modalidades, os 16 nucleotídeos em -15 até -1 do íntron e +1e do éxon que pode ser saltado que flanqueiam o sítio de ligação 3’ são idênticos à seqüência do tipo selvagem correspondente, em que o íntron é o íntron 7 e em que o éxon que pode ser saltado é o éxon 8.
[014] De acordo com outro aspecto da presente revelação, é fornecido nesse relatório descritivo um oligômero anti- senso como usado em qualquer um dos métodos fornecidos nesse relatório descritivo.
[015] De acordo com outro aspecto da presente revelação, é fornecido nesse relatório descritivo um oligômero anti- senso que compreende uma seqüência com pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 100% de identidade de seqüência para qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 5-63 ou complementos destes.
[016] De acordo com outro aspecto da presente revelação, é fornecida nesse relatório descritivo uma composição farmacêutica que compreende o oligômero anti-senso e um excipiente, diluente ou carreador farmaceuticamente aceitável.
[017] Um método de tratamento de um indivíduo necessitado, por administração da composição farmacêutica da reivindicação 52 por injeção intratecal, injeção intracerebroventricular, injeção intraperitoneal, injeção intramuscular, injeção subcutânea ou injeção intravenosa.
[018] De acordo com outro aspecto da presente revelação, é fornecida nesse relatório descritivo uma composição que compreende um oligômero anti-senso para uso em um método de modulação da expressão de uma proteína-alvo ou um RNA funcional por células para tratar Doença do Armazenamento de Éster de Colesteril (CESD) em um indivíduo necessitado, associada a uma proteína deficiente ou RNA funcional deficiente, em que a proteína deficiente ou RNA funcional deficiente é deficiente em termos de quantidade ou atividade no indivíduo, em que o oligômero anti-senso reduz a exclusão de um éxon de um pré-mRNA que contém um éxon que pode ser saltado (pré-mRNA SEC) que codifica a proteína-alvo ou o RNA funcional, em que a proteína-alvo é a proteína deficiente, em que o RNA funcional é o RNA deficiente e em que o pré- mRNA SEC compreende o éxon que pode ser saltado, um íntron que flanqueia o sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado e um íntron que flanqueia o sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado, e em que o éxon que pode ser saltado é retido em um mRNA processado pelo pré-mRNA SEC que codifica a proteína-alvo ou o RNA funcional modulando, dessa forma, a produção ou atividade da proteína-alvo ou do RNA funcional no indivíduo.
Também é fornecida nesse relatório descritivo uma composição que compreende um oligômero anti- senso para uso em um método de tratamento de uma condição associada com proteína de lipase ácida lisossomal (LAL) em um indivíduo necessitado, o método compreendendo a etapa de modulação da expressão de proteína LAL por células do indivíduo, em que as células possuem um pré-mRNA que contém um éxon que pode ser saltado (pré-mRNA SEC) que compreende o éxon que pode ser saltado, um íntron que flanqueia o sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado, um íntron que flanqueia o sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado, e em que o pré-mRNA SEC codifica a proteína LAL, o método compreendendo o contato das células com o oligômero anti- senso, pelo qual o éxon que pode ser saltado é retido em um mRNA processado pelos transcritos do pré-mRNA SEC que codificam proteína LAL modulando, dessa forma, o nível de mRNA que codifica proteína LAL, e modulando a expressão de proteína LAL, nas células do indivíduo.
[019] Em algumas modalidades, a modulação da atividade, expressão e/ou produção da proteína-alvo ou mRNA que codifica a proteína-alvo aumenta a atividade, expressão e/ou produção da proteína-alvo ou mRNA que codifica a proteína-alvo. Em algumas modalidades, a modulação da atividade, expressão e/ou produção de proteína LAL ou mRNA que codifica proteína LAL aumenta a atividade, expressão e/ou produção de proteína LAL ou mRNA que codifica proteína LAL. Em algumas modalidades, a proteína-alvo é LAL. Em algumas modalidades, a condição é uma doença ou distúrbio. Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio é CESD. Em algumas modalidades, a proteína-alvo e o pré-mRNA SEC são codificados pelo gene de LIPA. Em algumas modalidades, o ASO visa uma porção do pré- mRNA SEC que está no éxon que pode ser saltado dentro da região -4e em relação ao sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado até +2e em relação ao sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado. Em algumas modalidades, o oligômero anti-senso visa uma porção do pré-mRNA SEC que está no éxon que pode ser saltado dentro: da região +6 até +500 em relação ao sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado; ou da região -16 até -500 em relação ao sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado. Em algumas modalidades, o oligômero anti-senso visa uma porção do pré- mRNA SEC que está dentro da região cerca de 100 nucleotídeos a jusante do sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado, até cerca de 100 nucleotídeos a montante do sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado. Em algumas modalidades, a porção visada do pré-mRNA SEC está dentro: da região +6 até
+500 no íntron que flanqueia o sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado; ou da região -16 até -500 no éxon que flanqueia o sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado.
Em algumas modalidades, a porção visada do pré-mRNA SEC está dentro: da região -4e até -500e em relação ao sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado; da região +6 até +500 em relação ao sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado; da região -16 até -500 em relação ao sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado; ou da região +2e até +500e em relação ao sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado.
Em algumas modalidades, a proteína-alvo é LAL.
Em algumas modalidades, o pré-mRNA SEC compreende uma seqüência com pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 100% de identidade de seqüência para o ID.
DE SEQ.
Nº: 1 ou um complemento deste.
Em algumas modalidades, o pré-mRNA SEC é codificado por uma seqüência genética com pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 100% de identidade de seqüência para o ID.
DE SEQ.
Nº: 1 ou um complemento deste.
Em algumas modalidades, a porção visada do pré-mRNA SEC compreende uma seqüência com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 100% de identidade de seqüência para uma região que compreende pelo menos 8 ácidos nucleicos contíguos dos IDS.
DE SEQ.
Nos: 2-4 ou complementos destes.
Em algumas modalidades, o ASO compreende uma seqüência que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 100% idêntica a qualquer um dos IDS.
DE SEQ.
Nos: 5-63 ou complementos destes.
Em algumas modalidades, a porção visada do pré-mRNA SEC está dentro da região -4e em relação ao sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado até +2e em relação ao sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado, em que o éxon que pode ser saltado é o éxon 8. Em algumas modalidades, o ASO compreende uma seqüência que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 100% idêntica a qualquer um dos IDS.
DE SEQ.
Nos: 54- 63 ou complementos destes.
Em algumas modalidades, a porção visada do pré-mRNA SEC está dentro da região -16 até -500 em relação ao sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado, em que o éxon que pode ser saltado é o éxon 8. Em algumas modalidades, o ASO compreende uma seqüência que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 100% idêntica a qualquer um dos IDS.
DE SEQ.
Nos: 5-38 ou complementos destes.
Em algumas modalidades, a porção visada do pré-mRNA SEC está dentro da região +6 até +500 em relação ao sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado, em que o éxon que pode ser saltado é o éxon 8. Em algumas modalidades, o ASO compreende uma seqüência que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 100% idêntica a qualquer um dos IDS.
DE SEQ.
Nos: 39- 53 ou complementos destes.
Em algumas modalidades, o pré- mRNA SEC foi produzido por ligação parcial (splicing) de um pré-mRNA de comprimento total ou um pré-mRNA do tipo selvagem.
Em algumas modalidades, o mRNA que codifica a proteína-alvo ou o RNA funcional é um mRNA maduro de comprimento total, ou um mRNA maduro do tipo selvagem.
Em algumas modalidades, a proteína-alvo produzida é proteína de comprimento total, ou proteína do tipo selvagem.
Em algumas modalidades, o oligômero anti-senso compreende uma modificação do arcabouço que compreende uma ligação fosforotioato ou uma ligação fosforodiamidato.
Em algumas modalidades, o referido oligômero anti-senso é um oligonucleotídeo anti-senso.
Em algumas modalidades, o oligômero anti-senso compreende uma porção fosforodiamidato morfolino, uma porção ácido nucleico bloqueado, uma porção ácido nucleico peptídico, uma porção 2’-O-metil, uma porção 2’-Flúor ou uma porção 2’-O-metoxietil. Em algumas modalidades, o oligômero anti-senso compreende pelo menos uma porção de açúcar modificada. Em algumas modalidades, cada porção de açúcar é uma porção de açúcar modificada. Em algumas modalidades, o oligômero anti-senso consiste em de 8 a 50 nucleobases, 8 a 40 nucleobases, 8 a 35 nucleobases, 8 a 30 nucleobases, 8 a 25 nucleobases, 8 a 20 nucleobases, 8 a 15 nucleobases, 9 a 50 nucleobases, 9 a 40 nucleobases, 9 a 35 nucleobases, 9 a 30 nucleobases, 9 a 25 nucleobases, 9 a 20 nucleobases, 9 a 15 nucleobases, 10 a 50 nucleobases, 10 a 40 nucleobases, 10 a 35 nucleobases, 10 a 30 nucleobases, 10 a 25 nucleobases, 10 a 20 nucleobases, 10 a 15 nucleobases, 11 a 50 nucleobases, 11 a 40 nucleobases, 11 a 35 nucleobases, 11 a 30 nucleobases, 11 a 25 nucleobases, 11 a 20 nucleobases, 11 a 15 nucleobases, 12 a 50 nucleobases, 12 a 40 nucleobases, 12 a 35 nucleobases, 12 a 30 nucleobases, 12 a 25 nucleobases, 12 a 20 nucleobases ou 12 a 15 nucleobases.
[020] Também é fornecida nesse relatório descritivo uma composição farmacêutica que compreende o oligômero anti- senso de qualquer uma das composições das reivindicações 54 a 86, e um excipiente, diluente ou carreador farmaceuticamente aceitável.
[021] De acordo com outro aspecto da presente revelação, é fornecido nesse relatório descritivo um método de tratamento de um indivíduo necessitado, por administração da composição farmacêutica da reivindicação 87 por injeção intratecal, injeção intracerebroventricular, injeção intraperitoneal, injeção intramuscular, injeção subcutânea ou injeção intravenosa.
[022] De acordo com outro aspecto da presente revelação, é fornecida nesse relatório descritivo uma composição farmacêutica que compreende: um oligômero anti-senso que hibridiza para uma seqüência-alvo de um transcrito de mRNA de LIPA, em que o transcrito de mRNA de LIPA compreende um éxon saltado, em que o oligômero anti-senso induz retenção do éxon saltado do transcrito de mRNA de LIPA; e um excipiente, diluente ou carreador farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, o transcrito de mRNA de LIPA é um transcrito de pré-mRNA SEC de LIPA. Em algumas modalidades, a porção visada do transcrito de pré-mRNA SEC de LIPA está no éxon que pode ser saltado dentro da região -4e em relação ao sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado até +2e em relação ao sítio ligado 3’ do éxon que pode ser saltado. Em algumas modalidades, o transcrito de pré-mRNA SEC de LIPA é codificado por uma seqüência genética com pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüência para o ID. DE SEQ. Nº: 1 ou um complemento deste. Em algumas modalidades, o transcrito de pré-mRNA SEC de LIPA compreende uma seqüência com pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüência para o ID. DE SEQ. Nº: 1 ou um complemento deste. Em algumas modalidades, o oligômero anti-senso compreende uma modificação do arcabouço que compreende uma ligação fosforotioato ou uma ligação fosforodiamidato. Em algumas modalidades, o oligômero anti- senso é um oligonucleotídeo anti-senso. Em algumas modalidades, o oligômero anti-senso compreende uma porção fosforodiamidato morfolino, uma porção ácido nucleico bloqueado, uma porção ácido nucleico peptídico, uma porção 2’-O-metil, uma porção 2’-Flúor ou uma porção 2’-O- metoxietil. Em algumas modalidades, o oligômero anti-senso compreende pelo menos uma porção de açúcar modificada. Em algumas modalidades, o oligômero anti-senso compreende de 8 a 50 nucleobases, 8 a 40 nucleobases, 8 a 35 nucleobases, 8 a 30 nucleobases, 8 a 25 nucleobases, 8 a 20 nucleobases, 8 a 15 nucleobases, 9 a 50 nucleobases, 9 a 40 nucleobases, 9 a 35 nucleobases, 9 a 30 nucleobases, 9 a 25 nucleobases, 9 a 20 nucleobases, 9 a 15 nucleobases, 10 a 50 nucleobases, 10 a 40 nucleobases, 10 a 35 nucleobases, 10 a 30 nucleobases, 10 a 25 nucleobases, 10 a 20 nucleobases, 10 a 15 nucleobases, 11 a 50 nucleobases, 11 a 40 nucleobases, 11 a 35 nucleobases, 11 a 30 nucleobases, 11 a 25 nucleobases, 11 a 20 nucleobases, 11 a 15 nucleobases, 12 a 50 nucleobases, 12 a 40 nucleobases, 12 a 35 nucleobases, 12 a 30 nucleobases, 12 a 25 nucleobases, 12 a 20 nucleobases ou 12 a 15 nucleobases. Em algumas modalidades, o oligômero anti-senso é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou é 100% complementar a uma porção visada do transcrito de pré-mRNA SEC de LIPA. Em algumas modalidades, a porção visada do transcrito de pré-mRNA SEC de LIPA está dentro de uma seqüência selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 2-4 ou complementos destes.
[023] Em algumas modalidades, o oligômero anti-senso compreende uma seqüência de nucleotídeos que tem pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência para qualquer um dos
IDS. DE SEQ. Nos: 5-63 ou complementos destes.
[024] Em algumas modalidades, o oligômero anti-senso compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 5-63 ou complementos destes.
[025] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é formulada para injeção intratecal, injeção intracerebroventricular, injeção intraperitoneal, injeção intramuscular, injeção subcutânea ou injeção intravenosa.
[026] De acordo com ainda outro aspecto da presente revelação, é fornecido nesse relatório descritivo um método de tratamento de um indivíduo que possui uma condição causada por uma quantidade ou atividade deficiente de proteína LAL, que compreende a administração ao indivíduo de um oligômero anti-senso que compreende uma seqüência de nucleotídeos com pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência para qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 5-63 ou complementos destes. Em algumas modalidades, o indivíduo é um humano.
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA
[027] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados nesse relatório descritivo são aqui incorporados por referência no mesmo grau como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[028] A FIG. 1 retrata uma representação esquemática do pré-mRNA de LIPA. A mutação de LIPA c.894G>A que leva ao salto do éxon 8 e, por fim, a doença do armazenamento de éster de colesteril (CESD) é retratada. Também são retratadas representações esquemáticas dos transcritos de mRNA ligados do tipo selvagem (WT) e mutantes (MT) que resultam da mutação de LIPA. Como mostrado, a mutação de CESD resulta em cerca de 95% dos transcritos de mRNA em uma forma truncada que leva a uma proteína LAL não funcional e somente 3-5% do mRNA funcional (de comprimento total) que leva a uma proteína LAL funcional.
[029] A FIG. 2 retrata uma eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) exemplar que mostra a confirmação do salto do éxon 8 em células de fibroblastos de paciente com CESD que carregam a mutação de LIPA c.894G>A. Análise por RT-PCR usando células de fibroblastos de controle e de paciente com CESD e iniciadores no éxon 7 e éxon 9 confirmou a presença de uma banda que corresponde ao salto do éxon 8 causado pela mutação c.894G>A. A identidade dos produtos foi confirmada por seqüenciamento.
[030] A FIG. 3 retrata um walk de oligonucleotídeo anti- senso (ASO) da região do sítio de ligação 5’ do íntron 8 de LIPA exemplar. É mostrada uma representação gráfica de um ASO walk realizado para a região do sítio de ligação 5’ do íntron 8 de LIPA que visa seqüências a jusante do sítio de ligação 5’ usando ASOs de 2’-O-metoxietil (2ʹ-MOE) com um arcabouço de fosforotioato (PS). Os ASOs foram projetados para cobrir essa região por deslocamento de 1 nucleotídeo de cada vez da posição +6 até +11 e 5 nucleotídeos de cada vez posteriormente.
[031] A FIG. 4A retrata ASO walk da região do sítio de ligação 5’ do íntron 8 de LIPA avaliado por Transcriptase Reversa-Reação em Cadeia de Polimerase (RT-PCR). Uma PAGE representativa mostra produtos de RT-PCR corados com SYBR-
Safe de LIPA, não tratadas (unt), células tratadas de forma simulada (Simulado1, Simulado2, eletroporadas), ou tratadas com um ASO de 2ʹ-MOE que visa a região do sítio de ligação 5’ do íntron 8 como descrito nesse relatório descritivo nos Exemplos e na descrição da FIG. 3, na concentração de 120 nM em fibroblasto de paciente com CESD que carrega a mutação c.894G>A por meio de eletroporação. Dois produtos que correspondem à inclusão do éxon 8 (comprimento total, banda superior) e salto do éxon 8 (banda inferior) foram quantificados.
[032] A FIG. 4B retrata um gráfico que plota o comprimento total percentual (inclusão do éxon 8) a partir dos dados na FIG. 4A. A linha preta indica ausência de alteração com relação às células não tratadas (Unt).
[033] A FIG. 5A retrata efeito dose-dependente exemplar de ASOs selecionados em células de fibroblastos de paciente com CESD. É mostrada uma PAGE representativa que mostra produtos de RT-PCR corados com SYBR-Safe de LIPA de células tratadas de forma simulada (Simulado, eletroporadas), ou tratadas com ASOs de 2ʹ-MOE A-3334 (+9) ou A-3347 (+66) que visam o íntron 8 nas concentrações de 30 nM, 60 nM, 120 nM, 240 nM e 480 nM em fibroblasto de paciente com CESD que carrega a mutação c.894G>A por meio de eletroporação. Dois produtos que correspondem à inclusão do éxon 8 (comprimento total, banda superior) e salto do éxon 8 (banda inferior) foram quantificados.
[034] A FIG. 5B retrata um gráfico que plota o comprimento total percentual (inclusão do éxon 8) a partir dos dados na FIG. 5A. A linha preta indica ausência de alteração com relação às células tratadas de forma simulada.
[035] A FIG. 5C retrata efeito dose-dependente exemplar de ASOs selecionados em células de fibroblastos de paciente com CESD. É mostrada uma PAGE representativa que mostra produtos de RT-PCR corados com SYBR-Safe de LIPA de células tratadas de forma simulada (Simulado), ou tratadas com ASOs de 2ʹ-MOE A-3334 (+9) ou A-3347 (+66) que visam o íntron 8 nas concentrações de 240 nM, 720 nM e 2.160 nM em fibroblasto de paciente com CESD que carrega a mutação c.894G>A por meio de eletroporação. Dois produtos que correspondem à inclusão do éxon 8 (comprimento total, banda superior) e salto do éxon 8 (banda inferior) foram quantificados.
[036] A FIG. 5D retrata um gráfico que plota o comprimento total percentual (inclusão do éxon 8) a partir dos dados na FIG. 5C. A linha preta indica ausência de alteração com relação às células tratadas de forma simulada.
[037] A FIG. 6A retrata efeito dose-dependente exemplar de ASO selecionado em células de fibroblastos de paciente com CESD. É mostrada uma PAGE representativa que mostra produtos de RT-PCR corados com SYBR-Safe de LIPA de células tratadas de forma simulada (Simulado), ou tratadas com ASO de 2ʹ-MOE A-3334 (+9) que visa o íntron 8 nas concentrações de 1 µM, 5 µM e 20 µM em fibroblasto de paciente com CESD que carrega a mutação c.894G>A por meio de captação livre. Dois produtos que correspondem à inclusão do éxon 8 (comprimento total, banda superior) e salto do éxon 8 (banda inferior) foram quantificados.
[038] A FIG. 6B retrata um gráfico que plota o comprimento total percentual (inclusão do éxon 8) a partir dos dados na FIG. 6A. A linha preta indica ausência de alteração com relação às células tratadas de forma simulada.
[039] A FIG. 7A retrata efeito dose-dependente exemplar de ASO selecionado em células de fibroblastos de paciente com CESD. É mostrada uma eletroforese em gel de dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) representativa que mostra proteína de lipase ácida lisossomal (LAL) de células tratadas de forma simulada (-), ou tratadas com ASO de 2ʹ-MOE A-3334 (+9) que visa o íntron 8 nas concentrações de 0,125 µM, 0,5 µM e 2 µM em fibroblasto de paciente com CESD que carrega a mutação c.894G>A por meio de eletroporação. Um produto que corresponde à proteína de comprimento total glicosilada foi quantificado e normalizado para blot corado com Ponceau S.
[040] A FIG. 7B retrata um gráfico que plota a razão de aumento em proteína de comprimento total glicosilada com relação às células tratadas de forma simulada a partir dos dados na FIG. 7A.
[041] A FIG. 8 retrata um gráfico que plota a cinética de atividade de LAL medida desde o tempo de 0 minuto até 60 minutos em intervalos de 5 minutos de extratos de proteína de fibroblasto de paciente com CESD que carrega a mutação c.894G>A de células tratadas de forma simulada (Controle de CESD) ou tratadas com ASO de 2ʹ-MOE A-3334 (+9) que visa o íntron 8 nas concentrações de 0,125 µM, 0,5 µM e 2 µM por meio de eletroporação. Extrato de proteína de um fibroblasto do tipo selvagem (Controle de WT) é incluído para comparação. É tabulada a Unidade de Fluorescência Relativa (RFU) por micrograma (µg) de proteína.
[042] A FIG. 9A retrata efeito dose-dependente exemplar de ASOs selecionados de diferentes comprimentos de direcionamento à região +9 do íntron 8 em células de fibroblastos de paciente com CESD. É mostrada uma PAGE representativa que mostra produtos de RT-PCR corados com SYBR-Safe de LIPA de células tratadas de forma simulada (Controle), ou tratadas com ASOs de 2ʹ-MOE A-3334 (+9), A- 3680 (+9(17)), A-3681 (+9(16)), A-3682 (+10(17)), A-3683 (+10(16)), A-3684 (+11(16)) que visam o íntron 8 nas concentrações de 0,125 µM, 0,5 µM e 2 µM em fibroblasto de paciente com CESD que carrega a mutação c.894G>A por meio de eletroporação. Dois produtos que correspondem à inclusão do éxon 8 (comprimento total, banda superior) e salto do éxon 8 (banda inferior) foram quantificados.
[043] A FIG. 9B retrata um gráfico que plota o comprimento total percentual (inclusão do éxon 8) a partir dos dados na FIG. 9A.
[044] A FIG. 10 retrata um gráfico que plota a alteração da atividade de LAL (inclinação da curva) medida de 30 minutos até 60 minutos de extratos de proteína de fibroblasto de paciente com CESD que carrega a mutação c.894G>A. Células tratadas de forma simulada (Controle), ou tratadas com ASOs de 2ʹ-MOE A-3334 (+9), A-3680 (+9(17)), A-3681 (+9(16)), A- 3682 (+10(17)), A-3683 (+10(16)), A-3684 (+11(16)) que visam o íntron 8 nas concentrações de 0,125 µM, 0,5 µM e 2 µM por meio de eletroporação. É plotada a alteração de RFU por minuto por micrograma (µg) de proteína.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[045] Certos detalhes específicos dessa descrição são apresentados a fim de fornecer uma compreensão detalhada de várias modalidades. No entanto, aqueles habilitados na técnica compreenderão que a presente revelação pode ser praticada sem esses detalhes. Em outros casos, estruturas bem detalhadas não foram mostradas ou descritas em detalhe para evitar descrições que desnecessariamente obscureçam as modalidades. A menos que o contexto exija de outra forma, ao longo do relatório descritivo e das reivindicações seguintes, a palavra “compreendem” e variações destas, por exemplo, “compreende” e “que compreende”, deve ser considerada em um sentido aberto, inclusivo, ou seja, como “incluindo, sem limitação”. Além disso, os cabeçalhos fornecidos nesse relatório descritivo são apenas por conveniência e não interpretam o escopo ou significado das revelação reivindicada.
[046] Como usadas nesse relatório descritivo e nas reivindicações em anexo, as formas no singular “um”, “a” e “o” incluem referentes no plural, a menos que o conteúdo determine claramente o contrário. Também deve ser observado que o termo “ou” é geralmente empregado em seu sentido que inclui “e/ou”, a menos que o conteúdo determine claramente o contrário.
[047] Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados nesse relatório descritivo possuem o mesmos significados que comumente subentendidos por aqueles habilitados na técnica à qual essa revelação pertence. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos nesse relatório descritivo possam ser usados na prática ou testagem da presente revelação, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Doença do Armazenamento de Éster de Colesteril e gene
LIPA
[048] A doença do armazenamento de éster de colesteril
(CESD) é uma doença hepática crônica autossômica recessiva causada por deficiência da enzima lipase ácida lisossomal (LAL) funcional. A enzima LAL é essencial para a metabolização de ésteres de colesteril e, em menor grau, triglicerídeos. A atividade de LAL deficiente predominantemente resulta em acúmulo de éster de colesteril nos órgãos e tecidos, particularmente no fígado, baço e macrófagos. A doença é caracterizada por hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, deficiência de HDL e deposição anormal de lipídeos em muitos órgãos. No fígado isso resulta em hepatomegalia causada por esteatose e fibrose hepáticas que podem levar à cirrose micronodular. A expectativa de vida de pacientes é freqüentemente de menos de 30 anos de idade. O surgimento da CESD tipicamente ocorre durante a infância ou adolescência; no entanto, os sintomas podem não ser detectados até a vida adulta e é aproximadamente igualmente prevalente em homens e mulheres.
[049] Mutações no gene LIPA que codifica a proteína LAL são a causa subjacente da CESD. Diferentemente da doença de Wolman, na qual mutações do gene LIPA resultam em uma enzima sem atividade residual ou em nenhuma enzima, as mutações que causam CESD codificam LAL que retém alguma atividade enzimática. Um estudo prévio da atividade de LAL em fibroblastos cutâneos cultivados de um paciente com CESD identificou uma mutação G→A na posição -1 do sítio de ligação 5’ do éxon 8 (E8SJM, Mutação da Junção de Ligação do Éxon 8, c.894G>A) que leva a uma deleção in frame de 72 pares de bases (bp) do mRNA resultante. Foi demonstrado subseqüentemente que essa deleção de 72 bp corresponde ao éxon 8 inteiro. A mutação G→A causa ligação aberrante do pré-mRNA de LIPA e salto do éxon 8. A deleção do éxon 8 do mRNA resulta na perda dos códons para os aminoácidos 254-277 de proteína LAL. A proteína mais curta não possui atividade de LAL residual; no entanto, E8SJM não causa doença de Wolman, pois 2% da 5% do LIPA normalmente ligado estão presentes em carreadores homozigotos. A grande maioria dos pacientes com CESD descrita até hoje é portadora de E8SJM.
[050] A presente revelação fornece composições e métodos para a modulação da ligação aberrante causada pela mutação de LIPA c.894G>A para aumentar a produção de mRNA maduro que codifica proteína funcional e, dessa forma, proteína LAL funcional traduzida. Essas composições e métodos incluem oligômeros anti-senso (ASOs) que podem promover inclusão de éxon e ligação constitutiva de pré-mRNA de LIPA. Em várias modalidades, proteína LAL funcional pode ser aumentada usando os métodos da revelação para tratar uma condição causada por deficiência de proteína LAL. Em algumas modalidades, a condição é CESD.
[051] Em algumas modalidades, os métodos da invenção são usados para aumentar a produção de proteína LAL funcional para tratar uma condição em um indivíduo necessitado. Em algumas modalidades, o indivíduo possui uma condição na qual LAL não está necessariamente deficiente em relação ao tipo selvagem, mas em que um aumento em LAL, todavia, atenua a condição. Em algumas modalidades, CESD é causada por herança autossômica recessiva. Ligação
[052] Seqüências ou íntrons intervenientes são removidos por um complexo RNA-proteína grande e altamente dinâmico denominado o espliceossomo, que orquestra interações complexas entre transcritos primários, RNAs nucleares pequenos (snRNAs) e um grande número de proteínas. Espliceossomos se montam ad hoc em cada íntron de forma ordenada, começando com reconhecimento do sítio de ligação 5’ (5’ss) por U1 snRNA ou do sítio de ligação 3’ (3’ss), que envolve a ligação do fator auxiliar U2 (U2AF) à região 3’ss para facilitar a ligação de U2 snRNA à seqüência do ponto de ramificação (BPS). U2AF é um heterodímero estável formado por uma subunidade de 65 kD codificada por U2AF2 (U2AF65), que se liga ao trato de polipirimidina (PPT), e uma subunidade de 35 kD codificada por U2AF1 (U2AF35), que interage com dinucleotídeos AG altamente conservados em 3’ss e estabiliza a ligação de U2AF65. Além da unidade BPS/PPT e 3’ss/5’ss, a ligação precisa exige seqüências ou estruturas auxiliares que ativam ou reprimem o reconhecimento do sítio de ligação, conhecidas como intensificadores ou silenciadores intrônicos ou exônicos de ligação. Esses elementos permitem que sítios de ligação genuínos sejam reconhecidos entre um grande excesso de sítios crípticos ou pseudo-sítios no genoma de eucariotas superiores, que possuem as mesmas seqüências, mas superam numericamente sítios autênticos por uma ordem de magnitude. Embora freqüentemente eles possuam função regulatória, os mecanismos exatos de sua ativação ou repressão são pouco compreendidos.
[053] A decisão sobre se a ligação ocorre pode ser tipicamente modelada como estocástica, e não um processo determinístico, de modo que até mesmo os sinais de ligação mais definidos podem, algumas vezes, se ligar incorretamente. No entanto, sob condições normais, a ligação de pré-mRNA procede com precisão surpreendentemente elevada.
Isso pode ser atribuído, em parte, à atividade de elementos regulatórios de ligação exônicos e intrônicos (ESRs ou ISRs) cis-atuantes auxiliares adjacentes.
Tipicamente, esses elementos funcionais são classificados como intensificadores (ESEs ou ISEs) ou silenciadores (ESSs ou ISSs) de ligação exônicos ou intrônicos com base em sua habilidade para estimular ou inibir a ligação, respectivamente.
Embora agora haja evidências para sugerir que alguns elementos auxiliares cis-atuantes possam atuar influenciando a cinética de montagem do espliceossomo, por exemplo, o arranjo do complexo entre U1 snRNP e os 5’ss, parece altamente provável que múltiplos elementos funcionem de uma forma coordenada com proteínas de ligação de RNA trans-atuantes (RBPs). Por exemplo, a família rica em serina e arginina de RBPs (proteínas SR) é uma família conservada de proteínas que participam na definição de éxons.
Proteínas SR promovem reconhecimento de éxon por recrutamento de componentes do pré-espliceossomo para sítios de ligação adjacentes ou por antagonismo aos efeitos de ESSs nas vizinhanças.
Os efeitos repressivos de ESSs e ISSs podem ser mediados por membros da família da ribonucleoproteína nuclear heterogênea (hnRNP) e podem alterar o recrutamento de fatores de ligação centrais para sítios de ligação adjacentes.
Além de sua participação na regulação da ligação, foi sugerido que elementos silenciadores participam na repressão de pseudo-éxons, que são conjuntos de sítios de ligação intrônicos de armadilha com o espaçamento típico de um éxon, mas sem um quadro de leitura aberta funcional.
ISEs, ISSs, ESEs e ESSs, em cooperação com seus RBPs trans-atuantes relacionados,
representam componentes importantes em um conjunto de controles de ligação que especificam como, onde e quando mRNAs são montados a partir de seus precursores.
[054] As seqüências que marcam os limites éxon-íntron são sinais degenerados de potências variáveis que podem ocorrer em freqüência elevada dentro de genes humanos. Em genes multiéxons, pares de sítios de ligação diferentes podem ser ligados juntos em muitas combinações diferentes, criando um arranjo diverso de transcritos a partir de um único gene. Isso é comumente denominado ligação de pré-mRNA alternativa. Embora a maioria das isoformas de mRNA produzidas por ligação alternativa possa ser exportada pelo núcleo e traduzida em polipeptídeos funcionais, diferentes isoformas de mRNA de um único gene podem variar acentuadamente em sua eficiência de tradução. Aquelas isoformas de mRNA com códons de terminação prematura (PTCs) pelo menos 50 bp a montante de um complexo de junção de éxon têm grande probabilidade de serem visadas para degradação pela via de decaimento de mRNA (NMD) de mediação nonsense. Mutações em motivos de junção tradicionais (BPS/PPT/3’ss/5’ss) e auxiliares podem causar ligação aberrante, por exemplo, salto de éxon ou inclusão de éxon críptico (ou pseudoéxon) ou ativação de sítio de ligação, e contribuem significantemente para morbidade e mortalidade humanas. Ambos os padrões, de ligação aberrante e alternativa, podem ser influenciados por variantes de DNA naturais em éxons e íntrons.
[055] ESEs podem ser muito prevalentes, estando presentes na maioria dos éxons, talvez em todos, incluindo éxons constitutivos. Embora alguns éxons possam ter ESEs redundantes e sejam, portanto, resistentes às mutações pontuais, em certos casos (por exemplo, éxon 8 de LIPA), mutações pontuais únicas podem romper um ESE crítico, resultando em salto de éxon parcial ou completo inapropriado. Transcritos-alvo
[056] Em algumas modalidades, os métodos da presente revelação exploram a presença de pré-mRNA que contém um éxon que pode ser saltado (pré-mRNA SEC) transcrito pelo gene LIPA. A ligação dos transcritos de pré-mRNA SEC de LIPA identificados para produzir mRNA de LIPA maduro, funcional, pode ser induzida usando um agente terapêutico, por exemplo, um ASO, que promove inclusão de éxon e ligação constitutiva de pré-mRNA SEC de LIPA. Em algumas modalidades, o mRNA de LIPA maduro, funcional, resultante pode ser traduzido normalmente aumentando, dessa forma, a quantidade de proteína LAL funcional nas células do paciente e aliviando os sintomas de CESD.
[057] Em várias modalidades, a presente revelação fornece um agente terapêutico que pode visar pré-mRNA SEC de LIPA para modular a ligação ou o nível de expressão de proteína. O agente terapêutico pode ser uma pequena molécula, polinucleotídeo ou polipeptídeo. Em algumas modalidades, o agente terapêutico é um ASO. Várias regiões ou seqüências no pré-mRNA SEC de LIPA podem ser visadas por um agente terapêutico, por exemplo, um ASO. Em algumas modalidades, o ASO visa um transcrito de pré-mRNA SEC de LIPA pelo gene LIPA. Em algumas modalidades, o ASO visa um transcrito de pré-mRNA SEC de LIPA pelo gene LIPA, que compreende um éxon que pode ser saltado. Em algumas modalidades, o éxon que pode ser saltado é o éxon 8 de um transcrito de pré-mRNA SEC de LIPA. Em algumas modalidades, o éxon que pode ser saltado é emendado de um transcrito de pré-mRNA SEC de LIPA em função de ligação aberrante.
Em algumas modalidades, a ligação aberrante é causada por uma mutação no gene LIPA.
Em algumas modalidades, a mutação é uma mutação G→A na posição -1 do doador de splice do éxon 8 (E8SJM, Mutação da Junção de Ligação do Éxon 8, c.894G>A). Em algumas modalidades, o ASO visa uma seqüência dento de um éxon que pode ser saltado de um transcrito de pré-mRNA SEC de LIPA.
Em algumas modalidades, o éxon que pode ser saltado é o éxon 8 de um transcrito de pré-mRNA SEC de LIPA.
Em algumas modalidades, o ASO visa uma seqüência dentro do éxon 8 de um transcrito de pré-mRNA SEC de LIPA.
Em algumas modalidades, o ASO visa uma seqüência de éxon a montante (ou 5’) do sítio de ligação 5’ do éxon 8 de um transcrito de pré-mRNA SEC de LIPA.
Em algumas modalidades, o ASO visa uma seqüência de éxon a jusante (ou 3’) do sítio de ligação 3’ do éxon 8 de um transcrito de pré-mRNA de LIPA.
Em algumas modalidades, o ASO visa uma seqüência dentro de um íntron que flanqueia o sítio de ligação 3’ de um éxon que pode ser saltado de um transcrito de pré-mRNA SEC de LIPA.
Em algumas modalidades, o ASO visa uma seqüência dentro do íntron 7 de um transcrito de pré-mRNA SEC de LIPA.
Em algumas modalidades, o ASO visa um íntron seqüência a montante (ou 5’) do sítio de ligação 3’ do íntron 7 de um transcrito de pré-mRNA SEC de LIPA.
Em algumas modalidades, o ASO visa uma seqüência de íntron a jusante (ou 3’) do sítio de ligação 5’ do íntron 7 de um transcrito de pré-mRNA de LIPA.
Em algumas modalidades, o ASO visa uma seqüência dentro de um íntron que flanqueia o sítio de ligação 5’ de um éxon que pode ser saltado de um transcrito de pré-mRNA SEC de LIPA.
Em algumas modalidades,
o ASO visa uma seqüência dentro do íntron 8 de um transcrito de pré-mRNA SEC de LIPA. Em algumas modalidades, o ASO visa uma seqüência de íntron a montante (ou 5’) do sítio de ligação 3’ do íntron 8 de um transcrito de pré-mRNA SEC de LIPA. Em algumas modalidades, o ASO visa uma seqüência de íntron a jusante (ou 3’) do sítio de ligação 5’ do íntron 8 de um transcrito de pré-mRNA de LIPA. Em algumas modalidades, o ASO visa uma seqüência que compreende um limite éxon-íntron de um transcrito de pré-mRNA SEC de LIPA. Em algumas modalidades, o éxon é um éxon que pode ser saltado. Um limite éxon-íntron pode se referir à junção de uma seqüência de éxon e uma seqüência de íntron. Em algumas modalidades, a seqüência de íntron pode flanquear a extremidade 5’ do éxon que pode ser saltado, ou a extremidade 3’ do éxon. Em algumas modalidades, o ASO visa uma seqüência que compreende um limite éxon 8-íntron 8 de um transcrito de pré-mRNA SEC de LIPA. Em algumas modalidades, o ASO visa uma seqüência que compreende um limite íntron 7-éxon 8 de um transcrito de pré-mRNA SEC de LIPA. Em algumas modalidades, o ASO visa uma seqüência que compreende tanto uma porção de um íntron quanto uma porção de um éxon.
[058] Em algumas modalidades, o ASO visa uma seqüência cerca de 4 até cerca de 300 nucleotídeos a montante (ou 5’) do sítio de ligação 3’ de um éxon que pode ser saltado de um transcrito de pré-mRNA SEC de LIPA. Em algumas modalidades, o ASO visa uma seqüência cerca de 1 até cerca de 20 nucleotídeos, cerca de 20 até cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 50 até cerca de 100 nucleotídeos, cerca de 100 até cerca de 150 nucleotídeos, cerca de 150 até cerca de 200 nucleotídeos, cerca de 200 até cerca de 250 nucleotídeos, ou cerca de 250 até cerca de 300 nucleotídeos a montante (ou 5’) do sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado de um transcrito de pré-mRNA SEC de LIPA.
Em algumas modalidades, o ASO pode visar uma seqüência mais do que 300 nucleotídeos a montante do sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado de um transcrito de pré-mRNA SEC de LIPA.
Em algumas modalidades, o ASO visa uma seqüência cerca de 4 até cerca de 300 nucleotídeos a jusante (ou 3’) do sítio de ligação 3’ de um éxon que pode ser saltado de um transcrito de pré-mRNA SEC de LIPA.
Em algumas modalidades, o ASO visa uma seqüência cerca de 1 até cerca de 20 nucleotídeos, cerca de 20 até cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 50 até cerca de 100 nucleotídeos, cerca de 100 até cerca de 150 nucleotídeos, cerca de 150 até cerca de 200 nucleotídeos, cerca de 200 até cerca de 250 nucleotídeos, ou cerca de 250 até cerca de 300 nucleotídeos a jusante (ou 3’) do sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado de um transcrito de pré-mRNA SEC de LIPA.
Em algumas modalidades, o ASO pode visar uma seqüência mais do que 300 nucleotídeos a jusante do sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado de um transcrito de pré-mRNA SEC de LIPA.
Em algumas modalidades, o ASO visa uma seqüência cerca de 4 até cerca de 300 nucleotídeos a jusante (ou 3’) do sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado de um transcrito de pré-mRNA SEC de LIPA.
Em algumas modalidades, o ASO visa uma seqüência cerca de 1 até cerca de 20 nucleotídeos, cerca de 20 até cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 50 até cerca de 100 nucleotídeos, cerca de 100 até cerca de 150 nucleotídeos, cerca de 150 até cerca de 200 nucleotídeos, cerca de 200 até cerca de 250 nucleotídeos, ou cerca de 250 até cerca de 300 nucleotídeos a jusante do sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado de um transcrito de pré-mRNA SEC de LIPA. Em algumas modalidades, o ASO visa uma seqüência mais do que 300 nucleotídeos a jusante do sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado de um transcrito de pré-mRNA SEC de LIPA. Em algumas modalidades, o ASO visa uma seqüência cerca de 4 até cerca de 300 nucleotídeos a montante (ou 5’) do sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado de um transcrito de pré-mRNA SEC de LIPA. Em algumas modalidades, o ASO visa uma seqüência cerca de 1 até cerca de 20 nucleotídeos, cerca de 20 até cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 50 até cerca de 100 nucleotídeos, cerca de 100 até cerca de 150 nucleotídeos, cerca de 150 até cerca de 200 nucleotídeos, cerca de 200 até cerca de 250 nucleotídeos, ou cerca de 250 até cerca de 300 nucleotídeos a montante do sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado de um transcrito de pré-mRNA SEC de LIPA. Em algumas modalidades, o ASO visa uma seqüência mais do que 300 nucleotídeos a montante do sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado de um transcrito de pré-mRNA SEC de LIPA.
[059] Como descrito nesse relatório descritivo nos Exemplos, o gene LIPA (ID. DE SEQ. Nº: 1) foi analisado quanto a eventos de salto de éxon e exclusão de éxon 8 de um mRNA processado pelo pré-mRNA SEC. Em algumas modalidades, os ASOs revelados nesse relatório descritivo visam um transcrito do pré-mRNA SEC de uma seqüência genômica de LIPA. Em algumas modalidades, o ASO visa um transcrito do pré-mRNA SEC de uma seqüência genômica de LIPA, que compreende um éxon que pode ser saltado. Em algumas modalidades o éxon que pode ser saltado é o éxon 8. Em algumas modalidades, o ASO visa um transcrito do pré-mRNA SEC de uma seqüência genômica de LIPA que compreende éxon 8. Em algumas modalidades, o ASO visa um transcrito do pré-mRNA SEC de uma seqüência genômica de LIPA que compreende um íntron que flanqueia o sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado e um íntron que flanqueia o sítio de ligação 5’ de um éxon que pode ser saltado.
Em algumas modalidades, o íntron que flanqueia o sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado é o íntron 7 e o íntron que flanqueia o sítio de ligação 5’ de um éxon que pode ser saltado é o íntron 8. Em algumas modalidades, o ASO visa um transcrito do pré-mRNA SEC de uma seqüência genômica de LIPA que compreende o íntron 7, o éxon 8 e o íntron 8. Em algumas modalidades, o ASO visa um transcrito do pré-mRNA SEC do ID.
DE SEQ.
Nº: 1. Em algumas modalidades, o ASO visa um transcrito do pré-mRNA SEC do ID.
DE SEQ.
Nº: 1 que compreende o éxon 8. Em algumas modalidades, o ASO visa um transcrito do pré-mRNA SEC do ID.
DE SEQ.
Nº: 1 que compreende o íntron 7. Em algumas modalidades, o ASO visa um transcrito do pré-mRNA SEC do ID.
DE SEQ.
Nº: 1 que compreende o íntron 8. Em algumas modalidades, o ASO visa um transcrito do pré-mRNA SEC do ID.
DE SEQ.
Nº: 1 que compreende o íntron 7, o éxon 8 e o íntron 8. Em algumas modalidades, os ASOs revelados nesse relatório descritivo visam uma seqüência de pré-mRNA SEC de LIPA (ID.
DE SEQ.
Nº: 1). Em algumas modalidades, o ASO visa uma seqüência de pré- mRNA SEC de LIPA, que compreende um éxon que pode ser saltado.
Em algumas modalidades, o ASO visa uma seqüência de pré-mRNA SEC de LIPA que compreende o éxon 8. (ID.
DE SEQ.
Nº: 4). Em algumas modalidades, o ASO visa uma seqüência de pré-mRNA SEC de LIPA que compreende um íntron que flanqueia o sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado.
Em algumas modalidades, o ASO visa uma seqüência de pré-mRNA SEC de LIPA que compreende o íntron 7 (ID. DE SEQ. Nº: 3). Em algumas modalidades, o ASO visa uma seqüência de pré-mRNA SEC de LIPA que compreende um íntron que flanqueia o sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado. Em algumas modalidades, o ASO visa uma seqüência de pré-mRNA SEC de LIPA que compreende o íntron 8 (ID. DE SEQ. Nº: 2). Em algumas modalidades, o ASO visa uma seqüência de pré-mRNA SEC de LIPA de acordo com qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 2-4. Em algumas modalidades, o ASO possui uma seqüência de acordo com qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 5-63.
[060] Em algumas modalidades, o transcrito de pré-mRNA SEC de LIPA é codificado por uma seqüência genética com pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüência para o ID. DE SEQ. Nº: 1 ou um complemento deste. Em algumas modalidades, o transcrito de pré-mRNA SEC de LIPA compreende uma seqüência com pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüência para o ID. DE SEQ. Nº: 1 ou um complemento deste.
[061] Em algumas modalidades, a porção visada do pré- mRNA SEC de LIPA compreende uma seqüência com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 100% de identidade de seqüência para uma região que compreende pelo menos 8 ácidos nucleicos contíguos dos IDS. DE SEQ. Nos: 2-4 ou complementos destes. Em algumas modalidades, o ASO compreende uma seqüência que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 100% idêntica a qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 5-64 ou complementos destes.
[062] Em algumas modalidades, o ASO visa o éxon 8 de um pré-mRNA SEC de LIPA, que compreende um éxon que pode ser saltado. Em algumas modalidades, o ASO visa uma seqüência cerca de 2 nucleotídeos a jusante (ou 3’) do sítio de ligação 3’ do éxon 8 até cerca de 4 nucleotídeos a montante (ou 5’) do sítio de ligação 5’ do éxon 8. Em algumas modalidades, o ASO possui uma seqüência de acordo com qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 54-63 ou complementos destes.
[063] Em algumas modalidades, o ASO visa o íntron 7 de um pré-mRNA SEC de LIPA, que compreende um éxon que pode ser saltado. Em algumas modalidades, o ASO visa uma seqüência cerca de 4 até cerca de 300 nucleotídeos a montante (ou 5’) do sítio de ligação 3’ do íntron 7. Em algumas modalidades, o ASO visa uma seqüência cerca de 16 até cerca de 100 nucleotídeos a montante (ou 5’) do sítio de ligação 3’ do íntron 7. Em algumas modalidades, o ASO visa uma seqüência cerca de 4 até cerca de 300 nucleotídeos a jusante (ou 3’) do sítio de ligação 5’ do íntron 7. Em algumas modalidades, o ASO possui uma seqüência de acordo com qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 39-53 ou complementos destes.
[064] Em algumas modalidades, o ASO visa o íntron 8 de um pré-mRNA SEC de LIPA, que compreende um éxon que pode ser saltado. Em algumas modalidades, o ASO visa uma seqüência cerca de 4 até cerca de 300 nucleotídeos a montante (ou 5’) do sítio de ligação 3’ do íntron 8. Em algumas modalidades, o ASO visa uma seqüência cerca de 4 até cerca de 300 nucleotídeos a jusante (ou 3’) do sítio de ligação 5’ do íntron 8. Em algumas modalidades, o ASO visa uma seqüência cerca de 6 até cerca de 100 nucleotídeos a jusante (ou 5’) do sítio de ligação 5’ do íntron 8. Em algumas modalidades, o ASO possui uma seqüência de acordo com qualquer um dos
IDS. DE SEQ. Nos: 5-38 ou complementos destes.
[065] Em algumas modalidades, a porção visada do pré- mRNA SEC de LIPA está no íntron 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9. Em algumas modalidades, a porção visada do pré-mRNA SEC de LIPA está no éxon 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em algumas modalidades, a hibridização de um ASO para a porção visada do pré-mRNA SEC resulta em inclusão do éxon 8, e subseqüentemente aumenta a produção de proteína LAL. Em algumas modalidades, a porção visada do pré-mRNA SEC de LIPA está no éxon 8. Em algumas modalidades, a porção visada do pré-mRNA SEC de LIPA está no íntron 7. Em algumas modalidades, a porção visada do pré-mRNA SEC de LIPA está no íntron 8. Proteína LAL
[066] Também descrita acima, a mutação de LIPA mais comum na CESD ocorre no éxon 8 (por exemplo, E8SJM, Mutação da Junção de Ligação do Éxon 8, c.894G>A). Em algumas modalidades, a mutação c.894G>A ocorre em ambos os alelos. Em algumas modalidades, a mutação c.894G>A ocorre em um dos dois alelos. Em algumas modalidades, uma mutação adicional ocorre em um dos dois alelos. Em algumas modalidades, a mutação adicional ocorre no mesmo alelo que a mutação c.894G>A. Em outras modalidades, a mutação adicional ocorre é uma mutação trans.
[067] Em algumas modalidades, os métodos descritos nesse relatório descritivo são usados para aumentar a produção de uma proteína LAL funcional. Como usado nesse relatório descritivo, o termo “funcional” se refere à quantidade de atividade ou função de uma proteína LAL que é necessária para eliminar qualquer um ou mais sintomas de uma doença ou condição tratada, por exemplo, CESD. Em algumas modalidades, os métodos são usados para aumentar a produção de uma proteína LAL parcialmente funcional. Como usado nesse relatório descritivo, o termo “parcialmente funcional” se refere a qualquer quantidade de atividade ou função da proteína LAL que é menor do que a quantidade de atividade ou função que é necessária para eliminar ou evitar qualquer um ou mais sintomas de uma doença ou condição, por exemplo, CESD. Em algumas modalidades, uma proteína ou um RNA parcialmente funcional terá pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% menos atividade em relação à proteína ou RNA totalmente funcional.
[068] Em algumas modalidades, o método é um método de aumento da expressão da proteína LAL por células de um indivíduo que possui um pré-mRNA SEC que codifica a proteína LAL, em que o indivíduo possui CESD causada por uma quantidade deficiente de atividade de proteína LAL, e em que a quantidade deficiente da proteína LAL é causada por herança autossômica recessiva. Em uma modalidade desse tipo, o indivíduo possui um primeiro alelo que carrega a mutação c.984G>A e um segundo alelo pelo qual a proteína LAL não é produzida. Em outra modalidade desse tipo, o indivíduo possui um primeiro alelo que carrega a mutação c.984G>A e um segundo alelo que codifica uma proteína LAL não funcional. Em outra modalidade desse tipo, o indivíduo possui um primeiro alelo que carrega a mutação c.984G>A e um segundo alelo que codifica uma proteína LAL parcialmente funcional. Em outra modalidade desse tipo, o indivíduo possui um primeiro alelo que carrega a mutação c.984G>A e um segundo alelo que carrega a mutação c.984G>A. Em qualquer uma dessas modalidades, o oligômero anti-senso se liga a uma porção visada do pré-mRNA SEC transcrito pelo alelo que carrega a mutação c.984G>A evitando, dessa forma, salto de éxon do éxon que pode ser saltado pelo pré-mRNA, e causando um aumento no nível de mRNA maduro que codifica proteína LAL funcional, e um aumento na expressão da proteína LAL nas células do indivíduo.
[069] Em modalidades relacionadas, o método é um método de utilização de um ASO para aumentar a expressão de uma proteína funcional ou RNA funcional. Em algumas modalidades, um ASO é usado para aumentar a expressão de proteína LIPA em células de um indivíduo que possui um pré-mRNA SEC que codifica proteína LAL, em que o indivíduo possui uma deficiência, por exemplo, CESD, na quantidade ou função de proteína LAL.
[070] Em algumas modalidades, o transcrito do pré-mRNA SEC que codifica a proteína que é a causa da doença ou condição é visada pelos ASOs descritos nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, um transcrito do pré- mRNA SEC que codifica uma proteína que não é a causa da doença é visada pelos ASOs. Por exemplo, uma doença que é o resultado de uma mutação ou deficiência de uma primeira proteína em uma via particular pode ser melhorada por direcionamento a um pré-mRNA que contém NIE que codifica uma segunda proteína aumentando, dessa forma, a produção da segunda proteína. Em algumas modalidades, a função da segunda proteína é capaz de compensar a mutação ou deficiência da primeira proteína (que é a causa da doença ou condição).
[071] Em algumas modalidades, o indivíduo possui:
(a) um primeiro alelo mutante que carrega a mutação c.984G>A pelo qual a proteína LAL é produzida em um nível reduzido, comparada com a produção por um alelo do tipo selvagem, e (b) um segundo alelo mutante pelo qual: (i) a proteína LAL é produzida em um nível reduzido, comparada com a produção por um alelo do tipo selvagem em função da mutação c.984G>A (ii) a proteína LAL é produzida em um nível reduzido, comparada com a produção por um alelo do tipo selvagem, (iii) a proteína LAL é produzida em uma forma que possui função reduzida, comparada com uma proteína do tipo selvagem equivalente, ou (iv) a proteína LAL não é produzida, e em que o pré-mRNA SEC é transcrito pelo primeiro alelo e/ou pelo segundo alelo que carrega a mutação c.984G>A. Nessas modalidades, o ASO se liga a uma porção visada do pré-mRNA SEC transcrito pelo primeiro alelo ou pelo segundo alelo promovendo, dessa forma, a inclusão de éxon pelo pré- mRNA SEC, e causando um aumento no nível de mRNA de comprimento total que codifica proteína LAL e um aumento na expressão da proteína-alvo ou RNA funcional nas células do indivíduo. Nessas modalidades, a proteína-alvo ou o RNA funcional que possui um aumento no nível de expressão resultante da inclusão de éxon pelo pré-mRNA SEC possui função completa, comparada com a proteína do tipo selvagem equivalente (totalmente funcional).
[072] Em algumas modalidades, o contato das células com um ASO que é complementar a uma porção visada de um transcrito de pré-mRNA SEC de LIPA resulta em um aumento na quantidade de proteína LAL produzida por pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 ou 1.000%, comparada com a quantidade da proteína produzida por uma célula na ausência do ASO/ausência de tratamento.
Em algumas modalidades, a quantidade total de proteína LAL produzida pela célula com a qual o oligômero anti-senso é colocado em contato é aumentada cerca de 20% até cerca de 300%, cerca de 50% até cerca de 300%, cerca de 100% até cerca de 300%, cerca de 150% até cerca de 300%, cerca de 20% até cerca de 50%, cerca de 20% até cerca de 100%, cerca de 20% até cerca de 150%, cerca de 20% até cerca de 200%, cerca de 20% até cerca de 250%, cerca de 50% até cerca de 100%, cerca de 50% até cerca de 150%, cerca de 50% até cerca de 200%, cerca de 50% até cerca de 250%, cerca de 100% até cerca de 150%, cerca de 100% até cerca de 200%, cerca de 100% até cerca de 250%, cerca de 150% até cerca de 200%, cerca de 150% até cerca de 250%, cerca de 200% até cerca de 250%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 100%, pelo menos cerca de 150%, pelo menos cerca de 200%, pelo menos cerca de 250%, ou pelo menos cerca de 300%, comparada com a quantidade de proteína-alvo produzida por um composto de controle.
Em algumas modalidades, a quantidade total de proteína LAL produzida pela célula com a qual o oligômero anti-senso é colocado em contato é aumentada cerca de 1,1 até cerca de 10 vezes, cerca de 1,5 até cerca de 10 vezes, cerca de 2 até cerca de 10 vezes, cerca de 3 até cerca de 10 vezes, cerca de 4 até cerca de 10 vezes, cerca de 1,1 até cerca de 5 vezes, cerca de 1,1 até cerca de 6 vezes, cerca de 1,1 até cerca de 7 vezes, cerca de 1,1 até cerca de 8 vezes, cerca de 1,1 até cerca de 9 vezes, cerca de 2 até cerca de 5 vezes, cerca de 2 até cerca de 6 vezes, cerca de 2 até cerca de 7 vezes, cerca de 2 até cerca de 8 vezes, cerca de 2 até cerca de 9 vezes, cerca de 3 até cerca de 6 vezes, cerca de 3 até cerca de 7 vezes, cerca de 3 até cerca de 8 vezes, cerca de 3 até cerca de 9 vezes, cerca de 4 até cerca de 7 vezes, cerca de 4 até cerca de 8 vezes, cerca de 4 até cerca de 9 vezes, pelo menos cerca de 1,1 vez, pelo menos cerca de 1,5 vez, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 3,5 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, ou pelo menos cerca de 10 vezes, comparada com a quantidade de proteína-alvo produzida por um composto de controle. Um composto de controle pode ser, por exemplo, um oligonucleotídeo que não é complementar a uma porção visada do pré-mRNA.
[073] Em algumas modalidades, o nível de mRNA que codifica proteína LAL é aumentado 1,1 a 10 vezes, quando comparado com a quantidade de mRNA que codifica proteína LAL que é produzida em uma célula de controle, por exemplo, uma que não é tratada com o oligômero anti-senso ou uma que é tratada com um oligômero anti-senso que não se liga à porção visada do pré-mRNA que contém SEC de LIPA.
[074] Em algumas modalidades, o nível de mRNA que codifica proteína LAL é aumentado 1,1 a 10 vezes, quando comparado com a quantidade de mRNA que codifica proteína LAL que é produzida em uma célula de controle, por exemplo, uma que não é tratada com o oligômero anti-senso ou uma que é tratada com um oligômero anti-senso que não se liga à porção visada do pré-mRNA SEC de LIPA.
[075] Em algumas modalidades da presente invenção, um indivíduo pode ter uma mutação em LIPA. Foram relatadas diversas variantes patogênicas que supostamente causam deficiência de LAL, incluindo variantes missense, variantes nonsense, inserções e deleções de nucleotídeo único ou duplo, inserção/deleções complexas e variantes do sítio de ligação. A variante patogênica mais comum que resulta em CESD, c.894G>A, envolve a transição de G-para-A em -1e do éxon 8 em relação ao sítio de ligação 5’, rompendo a seqüência de consenso de splice doadora normal. Tipicamente, isso resulta em ligação alternativa e subseqüente salto do éxon 8. Na presença dessa variante patogênica, aproximadamente 2%-5% dos transcritos são emendados corretamente, permitindo atividade enzimática residual. O sítio ativo catalítico de LAL é composto pelos resíduos de aminoácidos Ser153, Asp324 e His353. A serina do sítio ativo é parte de uma seqüência de consenso de lipase que conecta uma fita-β a uma hélice- α, conhecida como o cotovelo nucleofílico, que facilita a interação entre o nucleófilo e a histidina e carbono do éster no complexo orientado adequadamente. A doença resulta da perda de função de LAL causada por variantes patogênicas de LIPA que geram proteínas truncadas ou proteínas com conformações alteradas ou atividade reduzida.
[076] Em algumas modalidades, um indivíduo que possui qualquer mutação de LIPA conhecida na técnica e descrita como acima pode ser tratado usando os métodos e composições descritos nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, a mutação está dentro de qualquer íntron ou éxon de LIPA. Em algumas modalidades, a mutação está dentro do éxon 8 de LIPA.
Salto de éxon
[077] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “que contém éxon que pode ser saltado” ou “pré-mRNA SEC” é um transcrito de pré-mRNA que contém pelo menos um éxon que pode ser saltado. Ligação alternativa ou aberrante do pré- mRNA SEC pode resultar no salto do (pelo menos um) éxon que pode ser saltado nos transcritos de mRNA maduro. Os termos “mRNA maduro” e “mRNA totalmente ligado” são usados de forma intercambiável nesse relatório descritivo para descrever um mRNA totalmente processado. O salto do (pelo menos um) éxon que pode ser saltado pode resultar em mRNA não produtivo. mRNA maduro pode algumas vezes levar à expressão de proteína aberrante.
[078] O grau de salto de éxon pode ser expresso como percentual de salto de éxon, por exemplo, a percentagem de transcritos nos quais certo éxon é saltado. Resumidamente, o percentual de salto de éxon pode ser calculado como a percentagem da quantidade de transcritos de RNA com o éxon saltado, em relação à soma da média da quantidade de transcritos de RNA com salto de éxon mais a média da quantidade de transcritos de RNA com inclusão de éxon.
[079] Em algumas modalidades, um éxon saltado é um éxon que é identificado como um éxon saltado com base em uma determinação de pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, ou pelo menos cerca de 50% de exclusão do transcrito de RNA. Em algumas modalidades, um éxon saltado é um éxon que é identificado como um éxon saltado com base em uma determinação de cerca de 5% até cerca de 100%, cerca de 5% até cerca de 95%, cerca de 5% até cerca de 90%, cerca de 5% até cerca de 85%, cerca de 5% até cerca de 80%, cerca de 5% até cerca de 75%, cerca de 5% até cerca de 70%, cerca de 5% até cerca de 65%, cerca de 5% até cerca de 60%, cerca de 5% até cerca de 55%, cerca de 5% até cerca de 50%, cerca de 5% até cerca de 45%, cerca de 5% até cerca de 40%, cerca de 5% até cerca de 35%, cerca de 5% até cerca de 30%, cerca de 5% até cerca de 25%, cerca de 5% até cerca de 20%, cerca de 5% até cerca de 15%, cerca de 10% até cerca de 100%, cerca de 10% até cerca de 95%, cerca de 10% até cerca de 90%, cerca de 10% até cerca de 85%, cerca de 10% até cerca de 80%, cerca de 10% até cerca de 75%, cerca de 10% até cerca de 70%, cerca de 10% até cerca de 65%, cerca de 10% até cerca de 60%, cerca de 10% até cerca de 55%, cerca de 10% até cerca de 50%, cerca de 10% até cerca de 45%, cerca de 10% até cerca de 40%, cerca de 10% até cerca de 35%, cerca de 10% até cerca de 30%, cerca de 10% até cerca de 25%, cerca de 10% até cerca de 20%, cerca de 15% até cerca de 100%, cerca de 15% até cerca de 95%, cerca de 15% até cerca de 90%, cerca de 15% até cerca de 85%, cerca de 15% até cerca de 80%, cerca de 15% até cerca de 75%, cerca de 15% até cerca de 70%, cerca de 15% até cerca de 65%, cerca de 15% até cerca de 60%, cerca de 15% até cerca de 55%, cerca de 15% até cerca de 50%, cerca de 15% até cerca de 45%, cerca de 15% até cerca de 40%, cerca de 15% até cerca de 35%, cerca de 15% até cerca de 30%, cerca de 15% até cerca de 25%, cerca de 20% até cerca de 100%, cerca de 20% até cerca de 95%, cerca de 20% até cerca de 90%, cerca de 20% até cerca de 85%, cerca de 20% até cerca de 80%, cerca de 20% até cerca de 75%, cerca de 20% até cerca de 70%, cerca de 20% até cerca de 65%, cerca de 20% até cerca de 60%, cerca de 20% até cerca de 55%, cerca de 20% até cerca de 50%, cerca de 20% até cerca de 45%, cerca de 20% até cerca de 40%, cerca de 20% até cerca de 35%, cerca de 20% até cerca de 30%, cerca de 25% até cerca de 100%, cerca de 25% até cerca de 95%, cerca de 25% até cerca de 90%, cerca de 25% até cerca de 85%, cerca de 25% até cerca de 80%, cerca de 25% até cerca de 75%, cerca de 25% até cerca de 70%, cerca de 25% até cerca de 65%, cerca de 25% até cerca de 60%, cerca de 25% até cerca de 55%, cerca de 25% até cerca de 50%, cerca de 25% até cerca de 45%, cerca de 25% até cerca de 40%, ou cerca de 25% até cerca de 35% de exclusão do transcrito de RNA. Dados de ENCODE (descritos, por exemplo, por Tilgner, e cols., 2012, “Deep Sequencing of Subcellular RNA Fractions Shows Splicing to be Predominantly Co-Transcripcional in the Human Genome but Inefficient for lncRNAs”, Genome Research 22(9): 1.616- 25) podem ser usados para ajudar na identificação do salto de éxon.
[080] Em algumas modalidades, o contato das células com um ASO que é complementar a uma porção visada de um transcrito de pré-mRNA de LIPA resulta em um aumento na quantidade de proteína LAL produzida por pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 ou 1.000%, comparada com a quantidade da proteína produzida por uma célula na ausência do ASO/ausência de tratamento. Em algumas modalidades, a quantidade total de proteína LAL produzida pela célula com a qual o oligômero anti-senso é colocado em contato é aumentada cerca de 20% até cerca de 300%, cerca de 50% até cerca de 300%, cerca de 100% até cerca de 300%, cerca de 150% até cerca de 300%,
cerca de 20% até cerca de 50%, cerca de 20% até cerca de 100%, cerca de 20% até cerca de 150%, cerca de 20% até cerca de 200%, cerca de 20% até cerca de 250%, cerca de 50% até cerca de 100%, cerca de 50% até cerca de 150%, cerca de 50% até cerca de 200%, cerca de 50% até cerca de 250%, cerca de 100% até cerca de 150%, cerca de 100% até cerca de 200%, cerca de 100% até cerca de 250%, cerca de 150% até cerca de 200%, cerca de 150% até cerca de 250%, cerca de 200% até cerca de 250%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 100%, pelo menos cerca de 150%, pelo menos cerca de 200%, pelo menos cerca de 250%, ou pelo menos cerca de 300%, comparada com a quantidade de proteína-alvo produzida por um composto de controle.
Em algumas modalidades, a quantidade total de proteína LAL produzida pela célula com a qual o oligômero anti-senso é colocado em contato é aumentada cerca de 1,1 até cerca de 10 vezes, cerca de 1,5 até cerca de 10 vezes, cerca de 2 até cerca de 10 vezes, cerca de 3 até cerca de 10 vezes, cerca de 4 até cerca de 10 vezes, cerca de 1,1 até cerca de 5 vezes, cerca de 1,1 até cerca de 6 vezes, cerca de 1,1 até cerca de 7 vezes, cerca de 1,1 até cerca de 8 vezes, cerca de 1,1 até cerca de 9 vezes, cerca de 2 até cerca de 5 vezes, cerca de 2 até cerca de 6 vezes, cerca de 2 até cerca de 7 vezes, cerca de 2 até cerca de 8 vezes, cerca de 2 até cerca de 9 vezes, cerca de 3 até cerca de 6 vezes, cerca de 3 até cerca de 7 vezes, cerca de 3 até cerca de 8 vezes, cerca de 3 até cerca de 9 vezes, cerca de 4 até cerca de 7 vezes, cerca de 4 até cerca de 8 vezes, cerca de 4 até cerca de 9 vezes, pelo menos cerca de 1,1 vez, pelo menos cerca de 1,5 vez, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 3,5 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, ou pelo menos cerca de 10 vezes, comparada com a quantidade de proteína-alvo produzida por um composto de controle. Um composto de controle pode ser, por exemplo, um oligonucleotídeo que não é complementar a uma porção visada do pré-mRNA.
[081] Em algumas modalidades, o contato das células com um ASO que é complementar a uma porção visada de um transcrito de pré-mRNA de LIPA resulta em um aumento na quantidade de mRNA que codifica LAL, incluindo o mRNA maduro que codifica a proteína-alvo. Em algumas modalidades, a quantidade de mRNA que codifica proteína LAL, ou o mRNA maduro que codifica a proteína LAL, é aumentada por pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 ou 1.000%, comparada com a quantidade da proteína produzida por uma célula na ausência do ASO/ausência de tratamento. Em algumas modalidades, a quantidade total do mRNA que codifica proteína LAL, ou do mRNA maduro que codifica proteína LAL produzida na célula com a qual o oligômero anti-senso é colocado em contato é aumentada cerca de 20% até cerca de 300%, cerca de 50% até cerca de 300%, cerca de 100% até cerca de 300%, cerca de 150% até cerca de 300%, cerca de 20% até cerca de 50%, cerca de 20% até cerca de 100%, cerca de 20% até cerca de 150%, cerca de 20% até cerca de 200%, cerca de 20% até cerca de 250%, cerca de 50% até cerca de 100%, cerca de 50% até cerca de 150%, cerca de 50% até cerca de 200%, cerca de 50% até cerca de 250%, cerca de 100% até cerca de 150%, cerca de 100% até cerca de 200%, cerca de 100% até cerca de 250%, cerca de 150% até cerca de
200%, cerca de 150% até cerca de 250%, cerca de 200% até cerca de 250%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 100%, pelo menos cerca de 150%, pelo menos cerca de 200%, pelo menos cerca de 250%, ou pelo menos cerca de 300%, comparada com a quantidade de mature RNA produzida em uma célula não tratada, por exemplo, uma célula não tratada ou uma célula tratada com um composto de controle.
Em algumas modalidades, a quantidade total do mRNA que codifica proteína LAL, ou do mRNA maduro que codifica proteína LAL produzida na célula com a qual o oligômero anti-senso é colocado em contato é aumentada cerca de 1,1 até cerca de 10 vezes, cerca de 1,5 até cerca de 10 vezes, cerca de 2 até cerca de 10 vezes, cerca de 3 até cerca de 10 vezes, cerca de 4 até cerca de 10 vezes, cerca de 1,1 até cerca de 5 vezes, cerca de 1,1 até cerca de 6 vezes, cerca de 1,1 até cerca de 7 vezes, cerca de 1,1 até cerca de 8 vezes, cerca de 1,1 até cerca de 9 vezes, cerca de 2 até cerca de 5 vezes, cerca de 2 até cerca de 6 vezes, cerca de 2 até cerca de 7 vezes, cerca de 2 até cerca de 8 vezes, cerca de 2 até cerca de 9 vezes, cerca de 3 até cerca de 6 vezes, cerca de 3 até cerca de 7 vezes, cerca de 3 até cerca de 8 vezes, cerca de 3 até cerca de 9 vezes, cerca de 4 até cerca de 7 vezes, cerca de 4 até cerca de 8 vezes, cerca de 4 até cerca de 9 vezes, pelo menos cerca de 1,1 vez, pelo menos cerca de 1,5 vez, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 3,5 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, ou pelo menos cerca de 10 vezes comparada com a quantidade de mature RNA produzida em uma célula não tratada, por exemplo, uma célula não tratada ou uma célula tratada com um composto de controle. Um composto de controle pode ser, por exemplo, um oligonucleotídeo que não é complementar a uma porção visada do pré-mRNA SEC de LIPA. Agentes terapêuticos
[082] Em várias modalidades da presente revelação, são fornecidas composições e métodos que compreendem um agente terapêutico para modular o nível de expressão de proteína de LAL. Em algumas modalidades, são fornecidas nesse relatório descritivo composições e métodos para modular a ligação alternativa de pré-mRNA de LIPA. Em algumas modalidades, são fornecidas nesse relatório descritivo composições e métodos para evitar o salto de éxon na ligação de pré-mRNA de LIPA, por exemplo, para evitar o salto de um éxon durante ligação de pré-mRNA de LIPA.
[083] Um agente terapêutico revelado nesse relatório descritivo pode ser um agente repressor do salto de éxon. Em algumas modalidades, um agente terapêutico pode compreender um polímero de ácido polinucléico.
[084] De acordo com um aspecto da presente revelação, é fornecido nesse relatório descritivo um método de tratamento ou prevenção de uma condição associada a uma deficiência de proteína LAL funcional, que compreende a administração de um agente repressor do salto de éxon a um indivíduo para aumentar os níveis de proteína LAL funcional, em que o agente se liga a uma região do transcrito de pré-mRNA para diminuir o salto do éxon no transcrito maduro. Por exemplo, é fornecido nesse relatório descritivo um método de tratamento ou prevenção de uma condição associada a uma deficiência de proteína LAL funcional, que compreende a administração de um agente repressor do salto de éxon a um indivíduo para aumentar os níveis de proteína LAL funcional, em que o agente se liga a uma região de um éxon ou um íntron (por exemplo, éxon 8, íntron 7 ou íntron 8 em um gene LIPA humano) do transcrito de pré-mRNA.
[085] Quando é feita referência à redução do ng salto de éxon no mRNA maduro, a redução pode ser completa, por exemplo, 100%, ou pode ser parcial. A redução pode ser clinicamente significante. A redução/correção pode ser em relação ao nível de salto de éxon no indivíduo sem tratamento, ou em relação à quantidade de salto de éxon em uma população de indivíduos similares. A redução/correção pode ser pelo menos 10% menos salto de éxon em relação ao indivíduo médio, ou ao indivíduo antes do tratamento. A redução pode ser pelo menos 20% menos salto de éxon em relação a um indivíduo médio, ou ao indivíduo antes do tratamento. A redução pode ser pelo menos 40% menos salto de éxon em relação a um indivíduo médio, ou ao indivíduo antes do tratamento. A redução pode ser pelo menos 50% menos salto de éxon em relação a um indivíduo médio, ou ao indivíduo antes do tratamento. A redução pode ser pelo menos 60% menos salto de éxon em relação a um indivíduo médio, ou ao indivíduo antes do tratamento. A redução pode ser pelo menos 80% menos salto de éxon em relação a um indivíduo médio, ou ao indivíduo antes do tratamento. A redução pode ser pelo menos 90% menos salto de éxon em relação a um indivíduo médio, ou ao indivíduo antes do tratamento.
[086] Quando é feita referência ao aumento dos níveis de proteína LAL funcional, o aumento pode ser clinicamente significante. O aumento pode ser em relação ao nível de proteína LAL funcional no indivíduo sem tratamento, ou em relação à quantidade de proteína LAL funcional em uma população de indivíduos similares. O aumento pode ser pelo menos 10% more proteína LAL funcional em relação ao indivíduo médio, ou ao indivíduo antes do tratamento. O aumento pode ser pelo menos 20% more proteína LAL funcional em relação ao indivíduo médio, ou ao indivíduo antes do tratamento. O aumento pode ser pelo menos 40% more proteína LAL funcional em relação ao indivíduo médio, ou ao indivíduo antes do tratamento. O aumento pode ser pelo menos 50% more proteína LAL funcional em relação ao indivíduo médio, ou ao indivíduo antes do tratamento. O aumento pode ser pelo menos 80% more proteína LAL funcional em relação ao indivíduo médio, ou ao indivíduo antes do tratamento. O aumento pode ser pelo menos 100% more proteína LAL funcional em relação ao indivíduo médio, ou ao indivíduo antes do tratamento. O aumento pode ser pelo menos 200% more proteína LAL funcional em relação ao indivíduo médio, ou ao indivíduo antes do tratamento. O aumento pode ser pelo menos 500% more proteína LAL funcional em relação ao indivíduo médio, ou ao indivíduo antes do tratamento.
[087] Em modalidades nas quais o agente repressor do salto de éxon compreende um polímero de ácido polinucléico, o polímero de ácido polinucléico pode ter cerca de 50 nucleotídeos de comprimento. O polímero de ácido polinucléico pode ter cerca de 45 nucleotídeos de comprimento. O polímero de ácido polinucléico pode ter cerca de 40 nucleotídeos de comprimento. O polímero de ácido polinucléico pode ter cerca de 35 nucleotídeos de comprimento. O polímero de ácido polinucléico pode ter cerca de 30 nucleotídeos de comprimento.
O polímero de ácido polinucléico pode ter cerca de 24 nucleotídeos de comprimento.
O polímero de ácido polinucléico pode ter cerca de 25 nucleotídeos de comprimento.
O polímero de ácido polinucléico pode ter cerca de 20 nucleotídeos de comprimento.
O polímero de ácido polinucléico pode ter cerca de 19 nucleotídeos de comprimento.
O polímero de ácido polinucléico pode ter cerca de 18 nucleotídeos de comprimento.
O polímero de ácido polinucléico pode ter cerca de 17 nucleotídeos de comprimento.
O polímero de ácido polinucléico pode ter cerca de 16 nucleotídeos de comprimento.
O polímero de ácido polinucléico pode ter cerca de 15 nucleotídeos de comprimento.
O polímero de ácido polinucléico pode ter cerca de 14 nucleotídeos de comprimento.
O polímero de ácido polinucléico pode ter cerca de 13 nucleotídeos de comprimento.
O polímero de ácido polinucléico pode ter cerca de 12 nucleotídeos de comprimento.
O polímero de ácido polinucléico pode ter cerca de 11 nucleotídeos de comprimento.
O polímero de ácido polinucléico pode ter cerca de 10 nucleotídeos de comprimento.
O polímero de ácido polinucléico pode ter entre cerca de 10 e cerca de 50 nucleotídeos de comprimento.
O polímero de ácido polinucléico pode ter entre cerca de 10 e cerca de 45 nucleotídeos de comprimento.
O polímero de ácido polinucléico pode ter entre cerca de 10 e cerca de 40 nucleotídeos de comprimento.
O polímero de ácido polinucléico pode ter entre cerca de 10 e cerca de 35 nucleotídeos de comprimento.
O polímero de ácido polinucléico pode ter entre cerca de 10 e cerca de 30 nucleotídeos de comprimento.
O polímero de ácido polinucléico pode ter entre cerca de 10 e cerca de 25 nucleotídeos de comprimento. O polímero de ácido polinucléico pode ter entre cerca de 10 e cerca de 20 nucleotídeos de comprimento. O polímero de ácido polinucléico pode ter entre cerca de 15 e cerca de 25 nucleotídeos de comprimento. O polímero de ácido polinucléico pode ter entre cerca de 15 e cerca de 30 nucleotídeos de comprimento. O polímero de ácido polinucléico pode ter entre cerca de 12 e cerca de 30 nucleotídeos de comprimento.
[088] A seqüência do polímero de ácido polinucléico pode ser pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% complementar a uma seqüência-alvo de um transcrito de mRNA, por exemplo, um transcrito de mRNA parcialmente processado. A seqüência do polímero de ácido polinucléico pode ser 100% complementar a uma seqüência-alvo de um transcrito de pré- mRNA.
[089] A seqüência do polímero de ácido polinucléico pode ter 4 ou menos erros de pareamento para uma seqüência-alvo do transcrito de pré-mRNA. A seqüência do polímero de ácido polinucléico pode ter 3 ou menos erros de pareamento para uma seqüência-alvo do transcrito de pré-mRNA. A seqüência do polímero de ácido polinucléico pode ter 2 ou menos erros de pareamento para uma seqüência-alvo do transcrito de pré- mRNA. A seqüência do polímero de ácido polinucléico pode ter 1 ou menos erros de pareamento para uma seqüência-alvo do transcrito de pré-mRNA. A seqüência do polímero de ácido polinucléico pode não ter nenhum erro de pareamento para uma seqüência-alvo do transcrito de pré-mRNA.
[090] Em algumas modalidades, o polímero de ácido polinucléico pode hibridizar especificamente para uma seqüência-alvo do transcrito de pré-mRNA. Por exemplo, o polímero de ácido polinucléico pode ter 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100% de complementaridade de seqüência para uma seqüência-alvo do transcrito de pré- mRNA. A hibridização pode ser sob condições de hibridização de alto rigor.
[091] O polímero de ácido polinucléico pode ter uma seqüência com pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% de identidade de seqüência para uma seqüência selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 5-
63. O polímero de ácido polinucléico pode ter uma seqüência com 100% de identidade de seqüência para uma seqüência selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 5-
63.
[092] Quando é feita referência a uma seqüência de polímero de ácido polinucléico, aqueles habilitados na técnica compreenderão que uma ou mais substituições podem ser toleradas, opcionalmente duas substituições podem ser toleradas na seqüência, de modo que ela mantenha a habilidade para hibridizar para a seqüência-alvo; ou, quando a substituição é em uma seqüência-alvo, a habilidade para ser reconhecida como a seqüência-alvo. Referências à identidade de seqüência pode ser determinada por alinhamento de seqüências por BLAST usando parâmetros-padrão/propostos. Por exemplo, a seqüência pode ter 99% de identidade e ainda funcionar de acordo com a presente revelação. Em outras modalidades, a seqüência pode ter 98% de identidade e ainda funcionar de acordo com a presente revelação. Em outra modalidade, a seqüência pode ter 95% de identidade e ainda funcionar de acordo com a presente revelação. Em outra modalidade, a seqüência pode ter 90% de identidade e ainda funcionar de acordo com a presente revelação. Oligômeros anti-senso
[093] É fornecida nesse relatório descritivo uma composição que compreende um oligômero anti-senso que evita o salto de éxon por ligação a uma porção visada de um pré- mRNA SEC de LIPA. Como usados nesse relatório descritivo, os termos “ASO” e “oligômero anti-senso” são usados de forma intercambiável e se referem a um oligômero como, por exemplo, um polinucleotídeo, que compreende nucleobases que hibridizam para uma seqüência de ácidos nucleicos-alvos (por exemplo, um pré-mRNA SEC de LIPA) por pareamento de bases de Watson-Crick ou pareamento de bases por oscilação (G-U). O ASO pode ter seqüência exatamente complementar à seqüência- alvo ou quase complementaridade (por exemplo, complementaridade suficiente para se ligar à seqüência-alvo e aumentar a ligação em um sítio de ligação). ASOs são projetados de modo que se liguem a (hibridizem para) um ácido nucleico-alvo (por exemplo, uma porção visada de um transcrito de pré-mRNA) e permaneçam hibridizados sob condições fisiológicas. Tipicamente, caso hibridizem para uma sítio diferente da seqüência de ácidos nucleicos desejada (visada), eles hibridizam para um número limitado de seqüências que não são um ácido nucleico-alvo (para poucos sítios diferentes de um ácido nucleico-alvo). O design de um ASO pode levar em consideração a ocorrência da seqüência de ácidos nucleicos da porção visada do transcrito de pré-mRNA ou uma seqüência de ácidos nucleicos suficientemente similar em outras localizações no genoma ou pré-mRNA ou transcriptoma celular, de modo que a probabilidade de que o ASO se ligará a outros sítios e cause efeitos “fora-do-alvo” seja limitada. Quaisquer oligômeros anti-senso conhecidos na técnica, por exemplo, no Pedido PCT Nº PCT/US2014/054151, publicado como WO 2015/035091, intitulado “Reducing Nonsense-Mediated mRNA Decay”, incorporado por referência nesse relatório descritivo, podem ser usados para a prática dos métodos descritos nesse relatório descritivo.
[094] Em algumas modalidades, ASOs “hibridizam especificamente” para ou são “especifico” para um ácido nucleico-alvo ou uma porção visada de um pré-mRNA RIC. Tipicamente essa hibridização ocorre com uma Tm substancialmente maior do que 37°C, preferivelmente pelo menos 50°C e, tipicamente, entre 60°C até aproximadamente 90°C. Essa hibridização preferivelmente corresponde às condições rigorosas de hibridização. Em certa força iônica e pH, a Tm é a temperatura na qual 50% de uma seqüência-alvo hibridizam para um oligonucleotídeo complementar.
[095] Oligômeros, por exemplo, oligonucleotídeos, são “complementares” entre eles quando a hibridização ocorre em uma configuração antiparalela entre dois polinucleotídeos de fita simples. Um polinucleotídeo de fita dupla pode ser “complementar” a outro polinucleotídeo, se a hibridização puder ocorrer entre uma das fitas do primeiro polinucleotídeo e o segundo. A complementaridade (o grau até o qual um polinucleotídeo é complementar com outro) é quantificável em termos da proporção (por exemplo, a percentagem) de bases em fitas opostas que supostamente formam ligações hidrogênio entre elas, de acordo com regras geralmente aceitas de pareamento de bases. A seqüência de um oligômero anti-senso (ASO) não precisa ser 100% complementar àquela de seu ácido nucleico-alvo para hibridizar. Em certas modalidades, ASOs podem compreender pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de complementaridade de seqüência para uma região-alvo dentro da seqüência de ácidos nucleicos-alvo para a qual são direcionados. Por exemplo, um ASO no qual 18 de 20 nucleobases do composto oligomérico são complementares a uma região-alvo e, portanto, hibridizariam especificamente, representaria 90 por cento de complementaridade. Nesse exemplo, as nucleobases não complementares restantes podem ser agrupadas juntas ou espalhadas com nucleobases complementares e não precisam ser contíguas entre elas ou para nucleobases complementares. O percentual de complementaridade de um ASO com uma região de um ácido nucleico-alvo pode ser determinado rotineiramente usando os programas BLAST (ferramentas de pesquisa de alinhamento básico local) e programas PowerBLAST conhecidos na técnica (Altschul, e cols., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; Zhang e Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656).
[096] Um ASO não precisa hibridizar para todas as nucleobases em uma seqüência-alvo e as nucleobases às quais ele hibridiza podem ser contíguas ou não contíguas. ASOs podem hibridizar sobre um ou mais segmentos de um transcrito de pré-mRNA, de modo que segmentos intervenientes ou adjacentes não estejam envolvidos no evento de hibridização (por exemplo, uma estrutura de alça ou uma estrutura hairpin pode ser formada). Em certas modalidades, um ASO hibridiza para nucleobases não contíguas em um transcrito de pré-mRNA- alvo. Por exemplo, um ASO pode hibridizar para nucleobases em um transcrito de pré-mRNA que são separadas por uma ou mais nucleobases para as quais o ASO não hibridiza.
[097] Os ASOs descritos nesse relatório descritivo compreendem nucleobases que são complementares às nucleobases presentes em uma porção-alvo de um pré-mRNA SEC. O termo “ASO” engloba oligonucleotídeos e qualquer outra molécula oligomérica que compreende nucleobases capazes de hibridização para uma nucleobase complementar em um mRNA- alvo, mas não compreende uma porção de açúcar, por exemplo, um ácido nucleico peptídico (PNA). Os ASOs podem compreender nucleotídeos de ocorrência natural, análogos de nucleotídeos, nucleotídeos modificados, ou qualquer combinação de dois ou três dos precedentes. O termo “nucleotídeos de ocorrência natural” inclui desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos. O termo “nucleotídeos modificados” inclui nucleotídeos com grupos de açúcar modificados ou substituídos e/ou que possuem um arcabouço modificado. Em algumas modalidades, todos os nucleotídeos do ASO são nucleotídeos modificados. Modificações químicas de ASOs ou componentes de ASOs que são compatíveis com os métodos e composições descritos nesse relatório descritivo serão evidentes para aqueles habilitados na técnica e podem ser encontradas, por exemplo, na Patente U.S. Nº 8.258.109 B2, Patente U.S. Nº 5.656.612, Publicação de Patente U.S. Nº 2012/0190728, e Dias e Stein, Mol. Cancer Ther. 2002, 347-355, incorporadas nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade.
[098] Uma ou mais nucleobases de um ASO podem ser qualquer nucleobase não modificada, de ocorrência natural, por exemplo, adenina, guanina, citosina, timina e uracil, ou qualquer nucleobase sintética ou modifica que seja suficientemente similar a uma nucleobase não modificada de modo que seja capaz de formar ligação hidrogênio com uma nucleobase presente em um pré-mRNA-alvo. Exemplos de nucleobases modificadas incluem, sem limitação, hipoxantina, xantina, 7-metilguanina, 5, 6-diidrouracil, 5-metilcitosina e 5-hidroximetilcitosina.
[099] Os ASOs descritos nesse relatório descritivo também compreendem uma estrutura de arcabouço que conecta os componentes de um oligômero. Os termos “estrutura de arcabouço” e “ligações de oligômero” podem ser usados de forma intercambiável e se referem à conexão entre monômeros do ASO. Em oligonucleotídeos de ocorrência natural, o arcabouço compreende uma ligação 3’-5’ fosfodiéster que conecta porções de açúcar do oligômero. A estrutura de arcabouço ou ligações de oligômero dos ASOs descritos nesse relatório descritivo podem incluir (sem limitação) fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodisselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforamidato e semelhantes. Veja, por exemplo, LaPlanche, e cols., Nucleic Acids Res. 14: 9.081 (1986); Stec, e cols., J. Am. Chem. Soc. 106: 6.077 (1984), Stein, e cols., Nucleic Acids Res. 16: 3.209 (1988), Zon, e cols., Anti-Cancer Drug Design 6: 539 (1991); Zon, e cols., “Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach”, páginas 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec, e cols., Patente U.S. Nº 5.151.510; Uhlmann e Peyman, Chemical Reviews 90: 543 (1990). Em algumas modalidades, a estrutura de arcabouço do ASO não contém fósforo, mas sim contém ligações peptídicas, por exemplo, em um ácido nucleico peptídico (PNA), ou grupos de ligação, incluindo carbamato, amidas, e grupos hidrocarboneto lineares e cíclicos. Em algumas modalidades, a modificação do arcabouço é uma ligação fosfotioato. Em algumas modalidades, a modificação do arcabouço é uma ligação fosforamidato.
[100] Em algumas modalidades, a estereoquímica em cada uma das ligações internucleotídeos de fósforo do arcabouço do ASO é aleatória. Em algumas modalidades, a estereoquímica em cada uma das ligações internucleotídeos de fósforo do arcabouço do ASO é controlada e não é aleatória. Por exemplo, Publicação de Pedido de Patente U.S. Nº 2014/0194610, “Methods for the Synthesis of Functionalized Nucleic Acids”, incorporada nesse relatório descritivo por referência, descreve métodos para selecionar independentemente a lateralidade de quiralidade em cada átomo de fósforo em um oligômero de ácido nucleico. Em algumas modalidades, um ASO usado nos métodos da invenção incluindo, sem limitação, qualquer um dos ASOs apresentados nesse relatório descritivo na Tabela 3, compreende um ASO que possui ligações internucleotídeos de fósforo que não são aleatórias. Em algumas modalidades, uma composição usada nos métodos da invenção compreende um ASO diastereomérico puro. Em algumas modalidades, uma composição usada nos métodos da invenção compreende um ASO que possui pureza diastereomérica de pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%,
pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, cerca de 100%, cerca de 90% até cerca de 100%, cerca de 91% até cerca de 100%, cerca de 92% até cerca de 100%, cerca de 93% até cerca de 100%, cerca de 94% até cerca de 100%, cerca de 95% até cerca de 100%, cerca de 96% até cerca de 100%, cerca de 97% até cerca de 100%, cerca de 98% até cerca de 100%, ou cerca de 99% até cerca de 100%.
[101] Em algumas modalidades, o ASO possui uma mistura não aleatória de configurações Rp e Sp em suas ligações internucleotídeos de fósforo. Por exemplo, foi sugerido que uma mistura de Rp e Sp é necessária em oligonucleotídeos anti-senso par obter um equilíbrio entre boa atividade e estabilidade da nuclease (Wan, e cols., 2014, “Synthesis, Biophysical Properties and Biological Activity of Second Generation Antisense Oligonucleotides Containing Phosphorothioate Linkages”, Nucleic Acids Research 42 (22):
13.456-13.468, incorporado nesse relatório descritivo por referência). Em algumas modalidades, um ASO usado nos métodos da invenção incluindo, sem limitação, qualquer um dos ASOs apresentados nesse relatório descritivo na Tabela 3, compreende cerca de 5-100% de Rp, pelo menos cerca de 5% de Rp, pelo menos cerca de 10% de Rp, pelo menos cerca de 15% de Rp, pelo menos cerca de 20% de Rp, pelo menos cerca de 25% de Rp, pelo menos cerca de 30% de Rp, pelo menos cerca de 35% de Rp, pelo menos cerca de 40% de Rp, pelo menos cerca de 45% de Rp, pelo menos cerca de 50% de Rp, pelo menos cerca de 55% de Rp, pelo menos cerca de 60% de Rp, pelo menos cerca de 65% de Rp, pelo menos cerca de 70% de Rp, pelo menos cerca de 75% de Rp, pelo menos cerca de 80% de Rp, pelo menos cerca de 85% de Rp, pelo menos cerca de 90% de Rp, ou pelo menos cerca de 95% de Rp, com o restante Sp, ou cerca de 100% de Rp. Em algumas modalidades, um ASO usado nos métodos da invenção incluindo, sem limitação, qualquer um dos ASOs apresentados nesse relatório descritivo na Tabela 3, compreende cerca de 10% até cerca de 100% de Rp, cerca de 15% até cerca de 100% de Rp, cerca de 20% até cerca de 100% de Rp, cerca de 25% até cerca de 100% de Rp, cerca de 30% até cerca de 100% de Rp, cerca de 35% até cerca de 100% de Rp, cerca de 40% até cerca de 100% de Rp, cerca de 45% até cerca de 100% de Rp, cerca de 50% até cerca de 100% de Rp, cerca de 55% até cerca de 100% de Rp, cerca de 60% até cerca de 100% de Rp, cerca de 65% até cerca de 100% de Rp, cerca de 70% até cerca de 100% de Rp, cerca de 75% até cerca de 100% de Rp, cerca de 80% até cerca de 100% de Rp, cerca de 85% até cerca de 100% de Rp, cerca de 90% até cerca de 100% de Rp, ou cerca de 95% até cerca de 100% de Rp, cerca de 20% até cerca de 80% de Rp, cerca de 25% até cerca de 75% de Rp, cerca de 30% até cerca de 70% de Rp, cerca de 40% até cerca de 60% de Rp, ou cerca de 45% até cerca de 55% de Rp, com o restante Sp.
[102] Em modalidades, um ASO usado nos métodos da invenção incluindo, sem limitação, qualquer um dos ASOs apresentados nesse relatório descritivo na Tabela 3, compreende cerca de 5-100% de Sp, pelo menos cerca de 5% de Sp, pelo menos cerca de 10% de Sp, pelo menos cerca de 15% de Sp, pelo menos cerca de 20% de Sp, pelo menos cerca de 25% de Sp, pelo menos cerca de 30% de Sp, pelo menos cerca de 35% de Sp, pelo menos cerca de 40% de Sp, pelo menos cerca de 45% de Sp, pelo menos cerca de 50% de Sp, pelo menos cerca de 55% de Sp, pelo menos cerca de 60% de Sp, pelo menos cerca de 65% de Sp, pelo menos cerca de 70% de Sp, pelo menos cerca de 75% de Sp, pelo menos cerca de 80% de Sp, pelo menos cerca de 85% de Sp, pelo menos cerca de 90% de Sp, ou pelo menos cerca de 95% de Sp, com o restante Rp, ou cerca de 100% de Sp. Em algumas modalidades, um ASO usado nos métodos da invenção incluindo, sem limitação, qualquer um dos ASOs apresentados nesse relatório descritivo na Tabela 3, compreende cerca de 10% até cerca de 100% de Sp, cerca de 15% até cerca de 100% de Sp, cerca de 20% até cerca de 100% de Sp, cerca de 25% até cerca de 100% de Sp, cerca de 30% até cerca de 100% de Sp, cerca de 35% até cerca de 100% de Sp, cerca de 40% até cerca de 100% de Sp, cerca de 45% até cerca de 100% de Sp, cerca de 50% até cerca de 100% de Sp, cerca de 55% até cerca de 100% de Sp, cerca de 60% até cerca de 100% de Sp, cerca de 65% até cerca de 100% de Sp, cerca de 70% até cerca de 100% de Sp, cerca de 75% até cerca de 100% de Sp, cerca de 80% até cerca de 100% de Sp, cerca de 85% até cerca de 100% de Sp, cerca de 90% até cerca de 100% de Sp, ou cerca de 95% até cerca de 100% de Sp, cerca de 20% até cerca de 80% de Sp, cerca de 25% até cerca de 75% de Sp, cerca de 30% até cerca de 70% de Sp, cerca de 40% até cerca de 60% de Sp, ou cerca de 45% até cerca de 55% de Sp, com o restante Rp.
[103] Qualquer um dos ASOs descritos nesse relatório descritivo pode conter uma porção de açúcar que compreende ribose ou desoxirribose, como presente em nucleotídeos de ocorrência natural, ou uma porção de açúcar modificada ou análogo de açúcar, incluindo um anel morfolino. Exemplos não limitantes de porções de açúcar modificadas incluem substituições 2’ como, por exemplo, 2’-O-metil (2’-O-Me), 2’-O-metoxietil (2’MOE), 2’-O-aminoetil, 2’F; N3’->P5’ fosforamidato, 2’dimetilaminooxietoxi, 2’dimetilaminoetoxietoxi, 2’-guanidínio, etil 2’-O- guanidínio, açúcares modificados com carbamato e açúcares bicíclicos modificados. Em algumas modalidades, a modificação da porção de açúcar é selecionada de 2’-O-Me, 2’F, e 2’MOE. Em algumas modalidades, a modificação da porção de açúcar é uma ligação em ponte extra, por exemplo, em um ácido nucleico bloqueado (LNA). Em algumas modalidades o análogo de açúcar contém um anel morfolino, por exemplo, fosforodiamidato morfolino (PMO). Em algumas modalidades, a porção de açúcar compreende modificação de uma ribofuranosil ou 2’desoxirribofuranosil. Em algumas modalidades, a porção de açúcar compreende modificações 2’O-metiloxietil restritas a 2’4’ (cMOE). Em algumas modalidades, a porção de açúcar compreende modificações 2’-O etil BNA restritas a cEt 2’,4’. Em algumas modalidades, a porção de açúcar compreende modificações triciclo-DNA (tcDNA). Em algumas modalidades, a porção de açúcar compreende modificações ácido nucleico- etileno (ENA). Em algumas modalidades, a porção de açúcar compreende modificações MCE. Modificações são conhecidas na técnica e descritas na literatura, por exemplo, por Jarver, e cols., 2014, “A Chemical View of Oligonucleotides for Exon Skipping and Related Drug Applications”, Nucleic Acid Therapeutics 24 (1): 37-47, incorporado por referência para essa finalidade nesse relatório descritivo.
[104] Em algumas modalidades, cada monômero do ASO é modificado na mesma forma, por exemplo, cada ligação do arcabouço do ASO compreende uma ligação fosforotioato ou cada porção de açúcar ribose compreende uma modificação 2’O- metil. Essas modificações que estão presentes em cada um dos componentes de monômero de um ASO são denominadas “modificações uniformes”. Em algumas modalidades, uma combinação de modificações diferentes pode ser desejada, por exemplo, um ASO pode compreender uma combinação de ligações fosforodiamidato e porções de açúcar que compreendem anéis morfolino (morfolinos). Combinações de modificações diferentes a um ASO são denominadas “modificações mistas” ou “químicas mistas”.
[105] Em algumas modalidades, o ASO compreende uma ou mais modificações do arcabouço. Em algumas modalidades, o ASO compreende uma ou mais modificações da porção de açúcar. Em algumas modalidades, o ASO compreende uma ou mais modificações do arcabouço e uma ou mais modificações da porção de açúcar. Em algumas modalidades, o ASO compreende modificações 2’MOE e um arcabouço de fosforotioato. Em algumas modalidades, o ASO compreende um fosforodiamidato morfolino (PMO). Em algumas modalidades, o ASO compreende um ácido nucleico peptídico (PNA). Qualquer um dos ASOs ou qualquer componente de um ASO (por exemplo, uma nucleobase, porção de açúcar, arcabouço) descrito nesse relatório descritivo pode ser modificado a fim de obter propriedades ou atividades desejadas do ASO ou reduzir propriedades ou atividades indesejadas do ASO. Em algumas modalidades, um ASO ou um ou mais componentes de qualquer ASO podem ser modificados para aumentar a afinidade de ligação para uma seqüência-alvo em um transcrito de pré-mRNA; reduzir a ligação a qualquer seqüência-não-alvo; reduzir a degradação por nucleases celulares (ou seja, RNase H); aumentar a captação do ASO em uma célula e/ou no núcleo de uma célula; alterar a farmacocinética ou farmacodinâmica do ASO; e modular a meia-vida do ASO.
[106] Em algumas modalidades, os ASOs são compostos por nucleotídeos modificados por 2'-O-(2-metoxietil) (MOE) fosforotioato. ASOs compostos por esses nucleotídeos são especialmente bem adequados aos métodos revelados nesse relatório descritivo; oligômeros que possuem essas modificações demonstraram ter resistência significantemente aumentada à degradação por nuclease e biodisponibilidade aumentada, tornando-os adequados, por exemplo, para liberação oral em algumas modalidades descritas nesse relatório descritivo. Veja, por exemplo, Geary, e cols., J. Pharmacol. Exp. Ther. 2001; 296 (3): 890-7; Geary, e cols., J. Pharmacol. Exp. Ther. 2001; 296 (3): 898-904.
[107] Métodos de síntese de ASOs serão conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Alternativamente ou em adição, ASOs podem ser obtidos de uma fonte comercial.
[108] Salvo especificação em contrário, a extremidade à esquerda das seqüências de ácido nucleico de fita simples (por exemplo, transcrito de pré-mRNA, oligonucleotídeo, ASO etc.) é a extremidade 5’ e a direção para esquerda de seqüências de ácidos nucleicos de fita simples ou dupla é denominada a direção 5’. Similarmente, a extremidade ou direção à direita de uma seqüência de ácidos nucleicos (de fita simples ou dupla) é a extremidade ou direção 3’. Geralmente, uma região ou seqüência que está a 5’ para um ponto de referência em um ácido nucleico é denominada “a montante”, e uma região ou seqüência que está a 3’ para um ponto de referência em um ácido nucleico é denominada “a jusante”. Geralmente, a direção ou extremidade 5’ de um mRNA é onde o códon iniciação ou de início está localizado, enquanto a extremidade ou direção 3’ é onde o códon de terminação está localizado. Em algumas modalidades, nucleotídeos que estão a montante de um ponto de referência em um ácido nucleico podem ser designados por um número negativo, enquanto nucleotídeos que estão a jusante de um ponto de referência podem ser designados por um número positivo. Por exemplo, um ponto de referência (por exemplo, uma junção éxon-éxon em mRNA) pode ser designado como o sítio “zero”, e um nucleotídeo que está diretamente adjacente e a montante do ponto de referência é designado “menos um”, por exemplo, “-1”, enquanto um nucleotídeo que está diretamente adjacente e a jusante do ponto de referência é designado “mais um”, por exemplo, “+1”.
[109] Em algumas modalidades, a ASOs são complementares a (e se ligam a) uma porção visada de um pré-mRNA SEC de LIPA que está a jusante (na direção 3’) do sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado em um pré-mRNA SEC de LIPA (por exemplo, a direção designada por números positivos em relação ao sítio de ligação 5’). Em algumas modalidades, os ASOs são complementares a uma porção visada do pré-mRNA SEC de LIPA que está dentro da região cerca de +6 até cerca de +500 em relação ao sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado. Em algumas modalidades, o ASO não é complementar aos nucleotídeos +1 até +5 em relação ao sítio de ligação 5’ (os primeiros cinco nucleotídeos localizados a jusante do sítio de ligação 5’). Em algumas modalidades, os ASOs podem ser complementares a uma porção visada de um pré-mRNA SEC de LIPA que está dentro da região entre os nucleotídeos +6 e
+100 em relação ao sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado. Em alguns aspectos, os ASOs são complementares a uma porção visada que está dentro da região cerca de +6 até cerca de +500, cerca de +6 até cerca de +490, cerca de +6 até cerca de +480, cerca de +6 até cerca de +470, cerca de +6 até cerca de +460, cerca de +6 até cerca de +450, cerca de +6 até cerca de +440, cerca de +6 até cerca de +430, cerca de +6 até cerca de +420, cerca de +6 até cerca de +410, cerca de +6 até cerca de +400, cerca de +6 até cerca de +390, cerca de +6 até cerca de +380, cerca de +6 até cerca de +370, cerca de +6 até cerca de +360, cerca de +6 até cerca de +350, cerca de +6 até cerca de +340, cerca de +6 até cerca de +330, cerca de +6 até cerca de +320, cerca de +6 até cerca de +310, cerca de +6 até cerca de +300, cerca de +6 até cerca de +290, cerca de +6 até cerca de +280, cerca de +6 até cerca de +270, cerca de +6 até cerca de +260, cerca de +6 até cerca de +250, cerca de +6 até cerca de +240, cerca de +6 até cerca de +230, cerca de +6 até cerca de +220, cerca de +6 até cerca de +210, cerca de +6 até cerca de +200, cerca de +6 até cerca de +190, cerca de +6 até cerca de +180, cerca de +6 até cerca de +170, cerca de +6 até cerca de +160, cerca de +6 até cerca de +150, cerca de +6 até cerca de +140, cerca de +6 até cerca de +130, cerca de +6 até cerca de +120, cerca de +6 até cerca de +110, cerca de +6 até cerca de +100, cerca de +6 até cerca de +90, cerca de +6 até cerca de +80, cerca de +6 até cerca de +70, cerca de +6 até cerca de +60, cerca de +6 até cerca de +50, cerca de +6 até cerca de +40, cerca de +6 até cerca de +30, ou cerca de +6 até cerca de +20 em relação ao sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado.
[110] Em algumas modalidades, os ASOs são complementares a (e se ligam a) uma porção visada de um pré-mRNA SEC de LIPA que está a montante (na direção 5’) do sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado em um pré-mRNA SEC de LIPA (por exemplo, a direção designada por números negativos em relação ao sítio de ligação 3’). Em algumas modalidades, os ASOs são complementares a uma porção visada do pré-mRNA SEC de LIPA que está dentro da região cerca de -16 até cerca de -500 em relação ao sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado.
Em algumas modalidades, o ASO não é complementar aos nucleotídeos -1 até -15 em relação ao sítio de ligação 5’ (os primeiros cinco nucleotídeos localizados a jusante do sítio de ligação 5’). Em algumas modalidades, os ASOs podem ser complementares a uma porção visada de um pré-mRNA SEC de LIPA que está dentro da região entre os nucleotídeos -16 e -100 em relação ao sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado.
Em alguns aspectos, os ASOs são complementares a uma porção visada que está dentro da região cerca de +6 até cerca de +500, cerca de +6 até cerca de +490, cerca de +6 até cerca de +480, cerca de +6 até cerca de +470, cerca de +6 até cerca de +460, cerca de +6 até cerca de +450, cerca de +6 até cerca de +440, cerca de +6 até cerca de +430, cerca de +6 até cerca de +420, cerca de +6 até cerca de +410, cerca de +6 até cerca de +400, cerca de +6 até cerca de +390, cerca de +6 até cerca de +380, cerca de +6 até cerca de +370, cerca de +6 até cerca de +360, cerca de +6 até cerca de +350, cerca de +6 até cerca de +340, cerca de +6 até cerca de +330, cerca de +6 até cerca de +320, cerca de +6 até cerca de +310, cerca de +6 até cerca de +300, cerca de +6 até cerca de +290, cerca de +6 até cerca de +280, cerca de +6 até cerca de +270, cerca de +6 até cerca de +260, cerca de +6 até cerca de +250, cerca de +6 até cerca de +240, cerca de +6 até cerca de +230, cerca de +6 até cerca de +220, cerca de +6 até cerca de +210, cerca de +6 até cerca de +200, cerca de +6 até cerca de +190, cerca de +6 até cerca de +180, cerca de +6 até cerca de +170, cerca de +6 até cerca de +160, cerca de +6 até cerca de +150, cerca de +6 até cerca de +140, cerca de +6 até cerca de +130, cerca de +6 até cerca de +120, cerca de +6 até cerca de +110, cerca de +6 até cerca de +100, cerca de +6 até cerca de +90, cerca de +6 até cerca de +80, cerca de +6 até cerca de +70, cerca de +6 até cerca de +60, cerca de +6 até cerca de +50, cerca de +6 até cerca de +40, cerca de +6 até cerca de +30, ou cerca de +6 até cerca de +20 em relação ao sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado.
[111] Em algumas modalidades, a porção visada do pré- mRNA SEC de LIPA está dentro da região -4e em relação ao sítio de ligação 3’ (extremidade 5’) do éxon que pode ser saltado até +2e em relação ao sítio de ligação 5’ (extremidade 3’) do éxon que pode ser saltado.
[112] Os ASOs podem ser de qualquer comprimento adequado para ligação específica e aumento de ligação eficaz. Em algumas modalidades, os ASOs consistem em 8 a 50 nucleobases. Por exemplo, o ASO pode ter 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45 ou 50 nucleobases de comprimento. Em algumas modalidades, os ASOs consistem em mais do que 50 nucleobases. Em algumas modalidades, o ASO tem de 8 a 50 nucleobases, 8 a 40 nucleobases, 8 a 35 nucleobases, 8 a 30 nucleobases, 8 a 25 nucleobases, 8 a 20 nucleobases, 8 a 15 nucleobases, 9 a 50 nucleobases, 9 a 40 nucleobases, 9 a 35 nucleobases, 9 a 30 nucleobases, 9 a 25 nucleobases, 9 a 20 nucleobases, 9 a 15 nucleobases, 10 a 50 nucleobases, 10 a 40 nucleobases, 10 a 35 nucleobases, 10 a 30 nucleobases, 10 a 25 nucleobases, 10 a 20 nucleobases, 10 a 15 nucleobases, 11 a 50 nucleobases, 11 a 40 nucleobases, 11 a 35 nucleobases, 11 a 30 nucleobases, 11 a 25 nucleobases, 11 a 20 nucleobases, 11 a 15 nucleobases, 12 a 50 nucleobases, 12 a 40 nucleobases, 12 a 35 nucleobases, 12 a 30 nucleobases, 12 a 25 nucleobases, 12 a 20 nucleobases, 12 a 15 nucleobases, 13 a 50 nucleobases, 13 a 40 nucleobases, 13 a 35 nucleobases, 13 a 30 nucleobases, 13 a 25 nucleobases, 13 a 20 nucleobases, 14 a 50 nucleobases, 14 a 40 nucleobases, 14 a 35 nucleobases, 14 a 30 nucleobases, 14 a 25 nucleobases, 14 a 20 nucleobases, 15 a 50 nucleobases, 15 a 40 nucleobases, 15 a 35 nucleobases, 15 a 30 nucleobases, 15 a 25 nucleobases, 15 a 20 nucleobases, 20 a 50 nucleobases, 20 a 40 nucleobases, 20 a 35 nucleobases, 20 a 30 nucleobases, 20 a 25 nucleobases, 25 a 50 nucleobases, 25 a 40 nucleobases, 25 a 35 nucleobases ou 25 a 30 nucleobases de comprimento. Em algumas modalidades, os ASOs têm 15 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, os ASOs têm 16 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, os ASOs têm 17 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, os ASOs têm 18 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, os ASOs têm 25 nucleotídeos de comprimento.
[113] Em algumas modalidades, dois ou mais ASOs com químicas diferentes, mas complementares à mesma porção visada do pré-mRNA SEC são usados. Em algumas modalidades, dois ou mais ASOs que são complementares a porções visadas diferentes do pré-mRNA SEC são usados.
[114] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos anti- senso da invenção estão ligados quimicamente a uma ou mais porções ou conjugados, por exemplo, uma porção de direcionamento ou outro conjugado que aumenta a atividade ou captação celular do oligonucleotídeo.
Essas porções incluem, sem limitação, uma porção de lipídeo, por exemplo, como uma porção de colesterol, uma porção de colesteril, uma cadeia alifática, por exemplo, resíduos de dodecanodiol ou undecil, uma poliamina ou uma cadeia de polietileno glicol ou ácido adamantano acético.
Oligonucleotídeos que compreendem porções lipofílicas e métodos de preparação foram descritos na literatura publicada.
Em modalidades, o oligonucleotídeo anti-senso é conjugado a uma porção que inclui, sem limitação, um nucleotídeo abásico, um poliéter, uma poliamina, uma poliamida, peptídeos, um carboidrato, por exemplo, N-acetilgalactosamina (GalNAc), N-Ac-Glucosamina (GluNAc) ou manose (por exemplo, manose-6-fosfato), um lipídeo ou um composto de polihidrocarboneto.
Conjugados podem estar ligados a um ou mais de quaisquer nucleotídeos que compreendem o oligonucleotídeo anti-senso em qualquer uma de diversas posições no açúcar, base ou grupo fosfato, como subentendido na técnica e descrito na literatura, por exemplo, com o uso de um ligante.
Ligantes podem incluir um ligante ramificado bivalente ou trivalente.
Em modalidades, o conjugado está anexado à extremidade 3’ do oligonucleotídeo anti-senso.
Métodos de preparação de oligonucleotídeo conjugados são descritos, por exemplo, na Patente U.S.
Nº 8,450,467, “Carbohydrate Conjugates as Delivery Agents for Oligonucleotides”, incorporada por referência nesse relatório descritivo.
[115] Em algumas modalidades, o ácido nucleico a ser direcionado por um ASO é um pré-mRNA SEC de LIPA expresso em uma célula, por exemplo, uma célula eucariótica. Em algumas modalidades, o termo “célula” pode se referir a uma população de células. Em algumas modalidades, a célula está em um indivíduo. Em algumas modalidades, a célula é isolada de um indivíduo. Em algumas modalidades, a célula está ex vivo. Em algumas modalidades, a célula é uma célula ou uma linhagem de células relevante para a condição ou doença. Em algumas modalidades, a célula está in vitro (por exemplo, em cultura de células). Composições farmacêuticas
[116] Composições ou formulações farmacêuticas que compreendem o agente, por exemplo, oligonucleotídeo anti- senso, das composições descritas e para uso em qualquer um dos métodos descritos, podem ser preparadas de acordo com técnicas convencionais bem conhecidas na indústria farmacêutica e descritas na literatura publicada. Em modalidades, uma composição ou formulação farmacêutica para o tratamento de um indivíduo compreende uma quantidade eficaz de qualquer oligômero anti-senso como descrito nesse relatório descritivo, ou um sal, solvato, hidrato ou éster farmaceuticamente aceitável deste. A formulação farmacêutica que compreende um oligômero anti-senso pode ainda compreender um excipiente, diluente ou carreador farmaceuticamente aceitável.
[117] Sais farmaceuticamente aceitáveis são adequados para uso em contato com os tecidos de humanos e animais inferiores sem toxicidade desnecessária, irritação, resposta alérgica etc., e são compatíveis com uma proporção risco/benefício razoável (veja, por exemplo, S.M.
Berge, e cols., J.
Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19 (1977), incorporado nesse relatório descritivo por referência para essa finalidade.
Os sais podem ser preparados in situ durante o isolamento final e purificação dos compostos, ou separadamente por reação entre a base livre e um ácido orgânico adequado.
Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis, de adição ácida, atóxicos, são sais de um grupo amino formados com ácidos inorgânicos como, por exemplo, ácido clorídrico, ácido hidrobrômico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico e ácido perclórico ou com ácidos orgânicos como, por exemplo, ácido acético, ácido oxálico, ácido maléico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico ou ácido malônico, ou por utilização de outras metodologias documentadas como, por exemplo, troca iônica.
Outros sais farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de adipato, alginato, ascorbato, aspartato, benzenossulfonato, benzoato, bissulfato, borato, butirato, canforato, canforsulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanossulfonato, formato, fumarato, glucoheptonato, glicerofosfato, gluconato, hemissulfato, heptanoato, hexanoato, hidroiodeto, 2-hidróxi- etanossulfonato, lactobionato, lactato, laurato, lauril sulfato, malato, maleato, malonato, metanossulfonato, 2- naftalenossulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3- fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, p- toluenossulfonato, undecanoato, valerato, e semelhantes.
Sais de metal alcalino ou alcalino terroso representativos incluem sódio, lítio, potássio, cálcio, magnésio e semelhantes. Sais farmaceuticamente aceitáveis adicionais incluem, quando apropriado, sais atóxicos de amônio, amônio quaternário, e cátions de amina formados usando contra-íons como, por exemplo, haleto, hidróxido, carboxilato, sulfato, fosfato, nitrato, alquil inferior sulfonato e aril sulfonato.
[118] Em algumas modalidades, as composições são formuladas em qualquer uma de muitas formas de dosagem possíveis como, por exemplo, sem limitação, comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, xaropes líquidos, géis macios, supositórios e enemas. Em algumas modalidades, as composições são formuladas como suspensões em meios aquosos, não aquosos ou mistos. Suspensões aquosas podem ainda conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão incluindo, por exemplo, carboximetilcelulose sódica, sorbitol e/ou dextrana. A suspensão também pode conter estabilizantes. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica da presente invenção inclui, sem limitação, uma solução, emulsão, microemulsão, espuma ou formulação contendo lipossomo (por exemplo, lipossomos catiônicos ou não catiônicos).
[119] A composição ou formulação farmacêutica da presente invenção pode compreender um ou mais intensificadores de penetração, carreadores, excipientes ou outros ingredientes ativos ou inativos, como apropriado e bem conhecido por aqueles habilitados na técnica ou descrito na literatura publicada. Em algumas modalidades, lipossomos também incluem lipossomos estericamente estabilizados, por exemplo, lipossomos que compreendem um ou mais lipídeos especializados. Esses lipídeos especializados resultam em lipossomos com meias-vidas na circulação aumentadas. Em algumas modalidades, um lipossomo estericamente estabilizado compreende um ou mais glicolipídeos ou é derivatizado com um ou mais polímeros hidrofílicos, por exemplo, uma porção de polietileno glicol (PEG). Em algumas modalidades, um tensoativo é incluído na formulação ou composições farmacêuticas. O uso de tensoativos em produtos, formulações e emulsões farmacológicas é bem conhecido na técnica. Em algumas modalidades, a presente invenção emprega um intensificador de penetração para efetuar a liberação do eficiente do oligonucleotídeo anti-senso, por exemplo, para ajudar na difusão através das membranas celulares e/ou aumentar a permeabilidade de um fármaco lipofílico. Em algumas modalidades, os intensificadores de penetração são um tensoativo, ácido graxo, sal biliar, agente quelante ou não-tensoativo não-quelante.
[120] Em algumas modalidades, a formulação farmacêutica compreende múltiplos oligonucleotídeos anti-senso. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo anti-senso é administrado em combinação com outro fármaco ou agente terapêutico. Tratamento de indivíduos
[121] Qualquer uma das composições fornecidas nesse relatório descritivo pode ser administrada a um indivíduo. O termo “indivíduo” pode ser usado de forma intercambiável com “pessoa” ou “paciente”. Um indivíduo pode ser um mamífero, por exemplo, um humano ou animal como, por exemplo, um primata não humano, um roedor, um coelho, um rato, um camundongo, um cavalo, um macaco, uma cabra, um gato, um cão, uma vaca, um porco ou um carneiro. Em algumas modalidades, o indivíduo é um humano. Em algumas modalidades, o indivíduo é um feto, um embrião ou uma criança. Em outras modalidades, o indivíduo pode ser outro organismo eucariótico, por exemplo, uma planta. Em algumas modalidades, as composições fornecidas nesse relatório descritivo são administradas a uma célula ex vivo.
[122] Em algumas modalidades, as composições fornecidas nesse relatório descritivo são administradas a um indivíduo como um método de tratamento de uma doença ou distúrbio. Em algumas modalidades, o indivíduo possui uma doença genética, por exemplo, qualquer uma das doenças descritas nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, o indivíduo está em risco de ter uma doença, por exemplo, qualquer uma das doenças descritas nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, o indivíduo está em risco aumentado de ter uma doença ou distúrbio causado por quantidade insuficiente de uma proteína ou atividade insuficiente de uma proteína. Em algumas modalidades, se um indivíduo está “em um risco aumentado” de ter uma doença ou distúrbio causado por quantidade insuficiente de uma proteína ou atividade insuficiente de uma proteína, o método envolve tratamento preventivo ou profilático. Por exemplo, um indivíduo pode estar em um risco aumentado de ter essa doença ou distúrbio por causa da história familiar da doença. Tipicamente, indivíduos em um risco aumentado de terem essa doença ou distúrbio se beneficiam do tratamento profilático (por exemplo, por prevenção ou retardo do surgimento ou progressão da doença ou distúrbio). Em algumas modalidades, um feto é tratado no útero, por exemplo, por administração da composição de ASO ao feto diretamente ou indiretamente (por exemplo, através da mãe).
[123] Vias adequadas para administração de ASOs da presente invenção podem variar dependendo do tipo de célula para a qual a liberação dos ASOs é desejada. Vários tecidos e órgãos podem ser afetados pela CESD. Em algumas modalidades, o fígado pode ser o tecido mais significantemente afetado. Os ASOs da presente invenção podem ser administrados aos pacientes parenteralmente, por exemplo, por injeção intratecal, injeção intracerebroventricular, injeção intraperitoneal, injeção intramuscular, injeção subcutânea ou injeção intravenosa. Métodos de identificação de ASOs adicionais que evitam o saldo de éxon
[124] Também estão dentro do escopo da presente revelação métodos para a identificação ou determinação de ASOs que evitam o salto de éxon de um pré-mRNA SEC de LIPA. Por exemplo, um método pode compreender a identificação ou determinação de ASOs que evitam salto de éxon de um pré-mRNA SEC de LIPA. ASOs que hibridizam especificamente para nucleotídeos diferentes dentro da região-alvo do pré-mRNA podem ser avaliados para identificar ou determinar ASOs que aumentam a extensão da retenção do éxon que pode ser saltado. Em algumas modalidades, o ASO pode bloquear ou interferir com o sítio (ou sítios) de ligação de um silenciador de ligação. Qualquer método conhecido na técnica pode ser usado para identificar (determinar) um ASO que, quando hibridizado para a região-alvo do éxon que pode ser saltado, resulta no efeito desejado (por exemplo, inclusão de éxon, produção de proteína ou RNA funcional). Esses métodos também podem ser usados para a identificação de ASOs que evitam salto de éxon do éxon que pode ser saltado por ligação a uma região visada em um íntron que flanqueia o éxon que pode ser saltado. Um exemplo de um método que pode ser usado é fornecido abaixo.
[125] Uma rodada de avaliação, denominada um ASO “walk”, pode ser realizada usando ASOs que foram projetados para hibridizar para uma região-alvo de um pré-mRNA. Por exemplo, os ASOs usados no ASO walk podem ser pavimentados a cada 5 nucleotídeos a partir de aproximadamente 100 nucleotídeos a montante do sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado (por exemplo, uma porção da seqüência do íntron localizada a montante do alvo/éxon que pode ser saltado) até aproximadamente 100 nucleotídeos a jusante do sítio de ligação 3’ do alvo/éxon que pode ser saltado e/ou a partir de aproximadamente 100 nucleotídeos a montante do sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado até aproximadamente 100 nucleotídeos a jusante do sítio de ligação 5’ do alvo/éxon que pode ser saltado (por exemplo, uma porção da seqüência do íntron localizada a jusante do alvo/éxon que pode ser saltado). Por exemplo, um primeiro ASO de 18 nucleotídeos de comprimento pode ser projetado para hibridizar especificamente para os nucleotídeos +6 até +23 em relação ao sítio de ligação 5’ do alvo/éxon que pode ser saltado. Um segundo ASO é projetado para hibridizar especificamente para os nucleotídeos +11 até +28 em relação ao sítio de ligação 5’ do alvo/éxon que pode ser saltado. ASOs são projetados de modo a transpor a região-alvo do pré- mRNA. Em algumas modalidades, os ASOs podem ser pavimentados mais intimamente, por exemplo, a cada 1, 2, 3 ou 4 nucleotídeos. Além disso, os ASOs podem ser pavimentados a partir de 100 nucleotídeos a jusante do sítio de ligação 5’, até 100 nucleotídeos a montante do sítio de ligação 3’. Em algumas modalidades, os ASOs podem ser pavimentados a partir de cerca de 572 nucleotídeos a montante do sítio de ligação 3’, até cerca de 500 nucleotídeos a jusante do sítio de ligação 5’. Em algumas modalidades, os ASOs podem ser pavimentados a partir de cerca de 500 nucleotídeos a montante do sítio de ligação 3’, até cerca de 572 nucleotídeos a jusante do sítio de ligação 3’.
[126] Um ou mais ASOs, ou um ASO de controle (um ASO com uma seqüência embaralhada, uma seqüência que supostamente não hibridiza para a região-alvo) são liberados, por exemplo, por transfecção, em uma linhagem de célula relevante para doença que expressa o pré-mRNA-alvo (por exemplo, um pré- mRNA SEC descrito nesse relatório descritivo). Os efeitos de retenção de éxon de cada um dos ASOs podem ser avaliados por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, por transcriptase reversa (RT)-PCR com o uso de iniciadores que transpõem a junção de emenda, como descrito no Exemplo XX. Um aumento ou presença de um produto de RT-PCR mais longo produzido com o uso dos iniciadores que transpõem a região que contém o éxon que pode ser saltado em células tratadas com ASO, comparadas com células tratadas com ASO de controle, indica que a retenção do éxon que pode ser saltado foi aumentada. Em algumas modalidades, a eficiência da retenção de éxon ou a proporção de mRNA que contém éxon que pode ser saltado retido para mRNA de éxon saltado pode ser aumentada usando os ASOs descritos nesse relatório descritivo. A quantidade de proteína ou RNA funcional que é codificada pelo pré-mRNA-alvo também pode ser avaliada para determinar se cada ASO obteve o efeito desejado (por exemplo, produção de proteína funcional aumentada). Qualquer método conhecido na técnica para avaliação e/ou quantificação da produção de proteína, por exemplo, Western blotting, citometria de fluxo, microscopia de imunofluorescência e ELISA, pode ser usado.
[127] Uma segunda rodada de avaliação, denominada um ASO “micro-walk”, pode ser realizada usando ASOs que foram projetados para hibridizar para uma região-alvo de um pré- mRNA. Os ASOs usados no ASO micro-walk são pavimentados a cada 1 nucleotídeo para refinar ainda mais a seqüência de nucleotídeos do pré-mRNA que, quando hibridizada com um ASO, resulta em retenção de éxon.
[128] Regiões definidas por ASOs que promovem inclusão de éxon que pode ser saltado-alvo são exploradas em mais detalhe por meio de um ASO “micro-walk”, que envolvem ASOs espaçados em etapas de 1-nt, bem como ASOs mais longos, tipicamente de 15-25 nt.
[129] Como descrito para o ASO walk acima, o ASO micro- walk é realizado por liberação de um ou mais ASOs, ou um ASO de controle (um ASO com uma seqüência embaralhada, uma seqüência que supostamente não hibridiza para a região- alvo), por exemplo, por transfecção, em uma linhagem de célula relevante para doença que expressa o pré-mRNA-alvo. Os efeitos de indução de ligação de cada um dos ASOs podem ser avaliados por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, por transcriptase reversa (RT)-PCR com o uso de iniciadores que transpõem o éxon que pode ser saltado, como descrito nesse relatório descritivo (veja, por exemplo, o Exemplo XX). Um aumento ou presença de um produto de RT-PCR mais longo produzido com o uso dos iniciadores que transpõem a região que contém o éxon que pode ser saltado em células tratadas com ASO, comparadas com células tratadas com ASO de controle, indica que a retenção do éxon que pode ser saltado foi aumentada. Em algumas modalidades, a eficiência da retenção de éxon ou a proporção de mRNA que contém éxon que pode ser saltado retido para mRNA de éxon saltado pode ser aumentada usando os ASOs descritos nesse relatório descritivo. A quantidade de proteína ou RNA funcional que é codificada pelo pré-mRNA-alvo também pode ser avaliada para determinar se cada ASO obteve o efeito desejado (por exemplo, produção de proteína funcional aumentada). Qualquer método conhecido na técnica para avaliação e/ou quantificação da produção de proteína, por exemplo, Western blotting, citometria de fluxo, microscopia de imunofluorescência e ELISA, pode ser usado.
[130] ASOs que, quando hibridizados para uma região de um pré-mRNA, resultam em inclusão de éxon e produção de proteína aumentada, podem ser testados in vivo com o uso de modelos animais, por exemplo, modelos em camundongo transgênico nos quais o gene humano de comprimento total foi knocked-in ou em modelos de doença em camundongo humanizado. Vias adequadas para administração de ASOs podem variar dependendo da doença e/ou dos tipos de células para as quais a liberação dos ASOs é desejada. ASOs podem ser administrados, por exemplo, por injeção intratecal, injeção intracerebroventricular, injeção intraperitoneal, injeção intramuscular, injeção subcutânea ou injeção intravenosa. Após administração, as células, tecidos e/ou órgãos dos animais do modelo podem ser avaliados para determinar o efeito do tratamento com ASO, por exemplo, por avaliação da ligação (eficiência, taxa, extensão) e produção de proteína por métodos conhecidos na técnica e descritos nesse relatório descritivo. Os modelos animais também podem ser qualquer indicação fenotípica ou comportamental da doença ou da severidade da doença.
EXEMPLOS
[131] A presente invenção será mais especificamente ilustrada pelos Exemplos seguintes. No entanto, deve ser subentendido que a presente invenção não é limitada de modo algum por esses exemplos. Exemplo 1: Identificação de eventos de salto de éxon em transcritos de LIPA por RT-PCR
[132] RT-PCR foi realizada para revelar a diferença nos comprimentos dos transcritos produzidos pelo gene LIPA em fibroblastos obtidos de doadores saudáveis e de doadores com doença do armazenamento de éster de colesteril (CESD). Células normais produzem transcritos de mRNA do gene LIPA que retêm o éxon 8, resultando na forma ativa de comprimento total da proteína LAL. A CESD resulta quando o éxon 8 é saltado, em conseqüência de mutação (c.894G>A) no gene LIPA, e uma forma não funcional da proteína LAL é expressa predominantemente. Transcritos de mRNA de fibroblastos normais e de CESD foram amplificados com o uso de iniciadores que flanqueiam os éxons 7 e 9 a fim de detectar a presença ou ausência do éxon 8 nos transcritos de LIPA produzidos. Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) foi então usada para exibir os tamanhos dos produtos de RT-PCR resultantes. Fibroblastos de controle (normais) geraram o produto de PCR mais longo contendo os éxon 7, 8 e 9, enquanto os produtos de PCR amplificados de fibroblastos de paciente com CESD tinham comprimentos mais curtos, consistente com a presença apenas dos éxons 7 e 9 sendo retidos nos transcritos e fornecendo confirmação do salto do éxon 8 em células de fibroblastos de paciente com CESD. A partir dessa análise foi demonstrado que cerca de 95% dos transcritos de mRNA dos pacientes com CESD resultavam em uma forma truncada (éxon 8 saltado), o que leva a uma proteína LAL não funcional, e na produção de cerca de 5% do mRNA de comprimento total nos quais o éxon 8 é retido. A identidade dos produtos foi confirmada por seqüenciamento. Exemplo 2: Design de ASO-walk direcionado ao éxon 8 de
LIPA
[133] Foi projetado um ASO walk para visar o éxon 8 (Tabela 2, ID. DE SEQ. Nº: 4) de LIPA (Tabela 1, ID. DE SEQ. Nº: 1) usando o método descrito nesse relatório descritivo (Tabela 3, IDS. DE SEQ. Nos: 54-63). Uma região imediatamente a jusante do sítio de ligação 3’ do éxon 8 e a montante do sítio de ligação 5’ do éxon 8 que transpõe os nucleotídeos +2e até -4e foi utilizada para o design de ASOs que visam os pré-mRNAs de SEC de LIPA do éxon que pode ser saltado. A Tabela 3 lista ASOs exemplares que foram projetados e suas seqüências-alvo. Por esse design, foram produzidos ASOs de 2’-MOE de 18-mer, com arcabouço de PS, deslocados por intervalos de 5 nucleotídeos e serão utilizados para visar pré-mRNAs de SEC de LIPA para aumentar a produção de proteína LAL. Tabela 1. Seqüência do gene LIPA/pré-mRNA SEC. Seqüência de Gene LIPA/Pré-mRNA (ID. DE SEQ. Nº: 1)
GCGTAGGCGACGCGCTGGTAGAGCTGTGGACCTGCCAGCCTGCGAGGCGGAGGACGG GCTCCATCTCTTAGAAACGCCTACGGCGCATGCTCTATGGGGTCAACTGGGGGGCTG GCAAGCGGCAGCGCTGGTCTGGGGCGGAGTCTCCGAGGCACTTCCCGGTGGCTGGCT GCTCTGATTGGCTGAACAAATAGTCCGAGGGTGGTGGGCATCCGCCCTCCCGACAAG
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GAGCGGGGGTCACGACTGGCTTGCAGATGTCTACGACGTCAATATCTTACTGACTCA GATCACCAACTTGGTGTTCCATGAGAGCATTCCGGAATGGGAGCATCTTGACTTCAT TTGGGGCCTGGATGCCCCTTGGAGGCTTTATAATAAAATTATTAATCTAATGAGGAA ATATCAGTGAAAGCTGGACTTGAGCTGTGTACCACCAAGTCAATGATTATGTCATGT GAAAATGTGTTTGCTTCATTTCTGTAAAACACTTGTTTTTCTTTCCCAGGTCTTTTG TTTTTTTATATCCAAGAAAATGATAACTTTGAAGATGCCCAGTTCACTCTAGTTTCA ATTAGAAACATACTAGCTATTTTTTCTTTAATTAGGGCTGGAATAGGAAGCCAGTGT CTCAACCATAGTATTGTCTCTTTAAGTCTTTTAAATATCACTGATGTGTAAAAAGGT CATTATATCCATTCTGTTTTTAAAATTTAAAATATATTGACTTTTTGCCCTTCATAG GACAAAGTAATATATGTGTTGGAATTTTAAAATTGTGTTGTCATTGGTAAATCTGTC ACTGACTTAAGCGAGGTATAAAAGTACGCAGTTTTCATGTCCTTGCCTTAAAGAGCT CTCTAGTCTAACGGTCTTGTAGTTAGAGATCTAAATGACATTTTATCATGTTTTCCT GCAGCAGGTGCATAGTCAAATCCAGAAATATCACAGCTGTGCCAGTAATAAGGATGC TAACAATTAATTTTATCAAACCTAACTGTGACAGCTGTGATTTGACACGTTTTAATT GCTCAGGTTAAATGAAATAGTTTTCCGGCGTCTTCAAAAACAAATTGCACTGATAAA ACAAAAACAAAAGTATGTTTTAAATGCTTTGAAGACTGATACACTCAACCATCTATA TTCATGAGCTCTCAATTTCATGGCAGGCCATAGTTCTACTTATCTGAGAAGCAAATC CCTGTGGAGACTATACCACTATTTTTTCTGAGATTAATGTACTCTTGGAGCCCGCTA CTGTCGTTATTGATCACATCTGTGTGAAGCCAAAGCCCCGTGGTTGCCCATGAGAAG TGTCCTTGTTCATTTTCACCCAAATGAAGTGTGAACGTGATGTTTTCGGATGCAAAC TCAGCTCAGGGATTCATTTTGTGTCTTAGTTTTATATGCATCCTTATTTTTAATACA CCTGCTTCACGTCCCTATGTTGGGAAGTCCATATTTGTCTGCTTTTCTTGCAGCATC ATTTCCTTACAATACTGTCCGGTGGACAAAATGACAATTGATATGTTTTTCTGATAT AATTACTTTAGCTGCACTAACAGTACAATGCTTGTTAATGGTTAATATAGGCAGGGC GAATACTACTTTGTAACTTTTAAAGTCTTAAACTTTTCAATAAAATTGAGTGAGACT
TATAGGCCCAAAGAA Tabela 2. Seqüências de pré-mRNA SEC de LIPA que visam éxon/íntron. ID. DE Éxon / SEQ. Íntron- Seqüência Nº: alvo 2 Íntron gtaggcattccaggagtgcatttggggttcatgtaaaat 8 caacatcagaaaggtctgggcatgcaaaccctttccaaa tagaaagacaacctgcttacaaatctgatctggttttct tccccagagtcctgggtttttgtcatcgtgcttgtgttg cttttgatacctgtggtggggcacactgtgttatacgtg ggttcacaaacagctactggggttgacatttttcttttc cctcctctcccttcctcaagtctcaggttaatatattct ctccctttccttctcccccagctttcttttcctcctcct gtttcctcccctccatctgcttctcattgagtcctagat tttttttatttctgtgttgcttcataaagagtgatttta agtccgttttggagatagaaaccgctgtttcaacactaa cccctgatcacaatatgcttggaatagcagtgaataaac tggagctaaaccaatgatagatgtgaatgggggcccctg acttttgaaatacagttttgattattttatcatgtaaat aagtcatgttcattctagaaaatttagaaactacatcta gaaaaaaattatcttaaaatgaaaataaaatcattctat aaccctagacagagaggaaatgcatatccatagatattg aatgtctctgcattctattctatacctcttttcaaaaag atgctgttaaagacatggatagaaatagtagatgtagaa atagattgatttttctcctgcttactgttttacagcttg cttttcttttttcacctgacaatatgtcagggacttctt tctacctcaggacataattttgtgccatttatttttcag ctaacttcatttttaatatgaaacaactcaccatttaag ccctaaaccaagacactgtaggtgtcttgaatagtaatt 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agagggctcttatggtatgagtttggggttgaccttaaa ggccattttgtttacagtccattcagaagtttacttttt gtttaaataattaggattaacttgttaataaattccata ccttgttctttagcgggattttaaatatagcatactcat ctttccattctccttataaacctgatgaatttcggagct ccccagagccaagacttgatattacttctcactttctca ctggccctgcccagagcccaggtactctcacctgtttga agaaggccatcccagtgtagttttccagtgttgttctga cctacctaaggtgctattaaaaatactggttcttgggcc tgtctgagacctgtggagactctgaattcctagggctgt gaccctgggatctatgtttgagttaagtgccttagatga ttacgatgtgctcttttttttttctttaaaggaaaaaac atacttttggtaggcttttaaagaacactgtaaaaagga tattcagtataatttttgttaaacatgtaatatgtttta tgaaattttagaaaatacatgagtgaaagaaaaatgact tgtatgtctagcacccagcaatagccactattaatattt tggtataatcttacagttttgtaatataatcatttccat tacaaaagtcagatcatactacatctgcttttatgtaaa ttttcatttaaagaaatgccattatatttgttagataca agttaagctgttgtattagagaccccaaaatacagctgc taaataaagagtttatttctttctcataataaagttcag agagaggtggcccagactgatgatagagggggttttggc tgtgttccatgaggccatgcagggacccagttccctcca tactatagctctgccatcctcggggtgttgtcctcttct gcctggttgcagcccggtcacctccatgtctcttccaac 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tatagcctatgcatatcctttcatatgctttaaatcatc tctagattacttatgatgcttaatacaatgtaaacgcta tgtaagtaggtgttacactgttttaaaatttgtattttt tattgttttattatcttttattgtttttttccaaatatt ttccatctgcaaaatatcacttggctgaatccacagata caaaactggatatggagggccaattgtatattataatta ttttatctatatatatccatctctctctctctctctcta ttatatatatatatatgtatatatatatgtagctaccta tctgtctacctttatttcccaagtaaaatgactaactct ttgaaaaagcttaggatgcaaatttcagcagaaaatgtc agcataaagttccgctagcaggagcaactgttgatctag tataattgacagcatatgtgcatagctgctttcttgtgt caggtggtagctgcttaacaatcatacaatgagaaattg agtcattcagtaaagcaggacaaaaccatgccatctcat ttaaaataatgccttggaaatgaagagtaaatctggata ttggtataaagttgatttccgaggttgtggctagctcca gcaacctatgatgttatctctaactttggtgtcagataa ctcttttccaaattatcttctttttag 3 Íntron gtatgcatgtttatagtaagatttgatttttttttttat 7 ctgtgaatgtgcttatttgtgttgaatgatatgggagag gtgggaatgacctcatcagaactctaaagagtctttcat ttgagaggcacaagcatgaactttggccaatgcctagaa tacggtaccacctgctgccatcctcaggctgactgtggt caccttcttatgttgtacctagatggagattattgaatg aggagatctgtcacaaattaagctgtaatatttataatt 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ACTTCTGTGCAAAACATGTTACACTGGAGCCAG Tabela 3. ASO macrowalk de éxon 8, íntron 7 e íntron 8 de LIPA. Comprimento ID. DE Nº DO do ASO ID Éxon ou SEQ. ID. DO Seqüência 5’-3’ (número de interna/posição íntron-alvo Nº: ASO nucleotídeos) 5 A-03331 AAATGCACTCCTGGAATG 18 LIPA-IVS8+6 Íntron 8 6 A-03332 CAAATGCACTCCTGGAAT 18 LIPA-IVS8+7 Íntron 8 7 A-03333 CCAAATGCACTCCTGGAA 18 LIPA-IVS8+8 Íntron 8 8 A-03334 CCCAAATGCACTCCTGGA 18 LIPA-IVS8+9 Íntron 8 9 A-03335 CCCCAAATGCACTCCTGG 18 LIPA-IVS8+10 Íntron 8 10 A-03336 ACCCCAAATGCACTCCTG 18 LIPA-IVS8+11 Íntron 8 11 A-03337 CATGAACCCCAAATGCAC 18 LIPA-IVS8+16 Íntron 8 12 A-03338 TTTTACATGAACCCCAAA 18 LIPA-IVS8+21 Íntron 8 13 A-03339 GTTGATTTTACATGAACC 18 LIPA-IVS8+26 Íntron 8 14 A-03340 CTGATGTTGATTTTACAT 18 LIPA-IVS8+31 Íntron 8 15 A-03341 CCTTTCTGATGTTGATTT 18 LIPA-IVS8+36 Íntron 8 16 A-03342 CCAGACCTTTCTGATGTT 18 LIPA-IVS8+41 Íntron 8 17 A-03343 CATGCCCAGACCTTTCTG 18 LIPA-IVS8+46 Íntron 8 18 A-03344 GTTTGCATGCCCAGACCT 18 LIPA-IVS8+51 Íntron 8 19 A-03345 AAAGGGTTTGCATGCCCA 18 LIPA-IVS8+56 Íntron 8
20 A-03346 TTTGGAAAGGGTTTGCAT 18 LIPA-IVS8+61 Íntron 8
21 A-03628 ATTTGGAAAGGGTTTGCA 18 LIPA-IVS8+62 Íntron 8
22 A-03629 TATTTGGAAAGGGTTTGC 18 LIPA-IVS8+63 Íntron 8
23 A-03630 CTATTTGGAAAGGGTTTG 18 LIPA-IVS8+64 Íntron 8
24 A-03631 TCTATTTGGAAAGGGTTT 18 LIPA-IVS8+65 Íntron 8
25 A-03347 TTCTATTTGGAAAGGGTT 18 LIPA-IVS8+66 Íntron 8
26 A-03633 TTTCTATTTGGAAAGGGT 18 LIPA-IVS8+67 Íntron 8
27 A-03634 CTTTCTATTTGGAAAGGG 18 LIPA-IVS8+68 Íntron 8
28 A-03635 TCTTTCTATTTGGAAAGG 18 LIPA-IVS8+69 Íntron 8
29 A-03636 GTCTTTCTATTTGGAAAG 18 LIPA-IVS8+70 Íntron 8
30 A-03348 TGTCTTTCTATTTGGAAA 18 LIPA-IVS8+71 Íntron 8
31 A-03349 CAGGTTGTCTTTCTATTT 18 LIPA-IVS8+76 Íntron 8
32 A-03350 GTAAGCAGGTTGTCTTTC 18 LIPA-IVS8+81 Íntron 8
33 A-03351 GATTTGTAAGCAGGTTGT 18 LIPA-IVS8+86 Íntron 8
34 A-03680 CCAAATGCACTCCTGGA 17 LIPA-IVS8+9(17) Íntron 8
35 A-03681 CAAATGCACTCCTGGA 16 LIPA-IVS8+9(16) Íntron 8
36 A-03682 CCCAAATGCACTCCTGG 17 LIPA- Íntron 8
IVS8+10(17)
37 A-03683 CCAAATGCACTCCTGG 16 LIPA- Íntron 8
IVS8+10(16)
38 A-03684 CCCAAATGCACTCCTG 16 LIPA- Íntron 8
IVS8+11(16)
39 A-03603 ACTAAAAACTAGAGCCAT 18 LIPA-IVS7-86 Íntron 7
40 A-03604 AAAGCACTAAAAACTAGA 18 LIPA-IVS7-81 Íntron 7
41 A-03605 CCTTCAAAGCACTAAAAA 18 LIPA-IVS7-76 Íntron 7
42 A-03606 TTTGCCCTTCAAAGCACT 18 LIPA-IVS7-71 Íntron 7
43 A-03607 TGTATTTTGCCCTTCAAA 18 LIPA-IVS7-66 Íntron 7
44 A-03608 AACATTGTATTTTGCCCT 18 LIPA-IVS7-61 Íntron 7
45 A-03609 TAATAAACATTGTATTTT 18 LIPA-IVS7-56 Íntron 7
46 A-03610 ATTGATAATAAACATTGT 18 LIPA-IVS7-51 Íntron 7 47 A-03611 GTGGCATTGATAATAAAC 18 LIPA-IVS7-46 Íntron 7 48 A-03612 TTAAGGTGGCATTGATAA 18 LIPA-IVS7-41 Íntron 7 49 A-03613 CAGCATTAAGGTGGCATT 18 LIPA-IVS7-36 Íntron 7 50 A-03614 GAAAACAGCATTAAGGTG 18 LIPA-IVS7-31 Íntron 7 51 A-03615 AGAATGAAAACAGCATTA 18 LIPA-IVS7-26 Íntron 7 52 A-03616 AATGAAGAATGAAAACAG 18 LIPA-IVS7-21 Íntron 7 53 A-03617 ATTGAAATGAAGAATGAA 18 LIPA-IVS7-16 Íntron 7 54 A-03618 TATATACATCCACTCTAG 18 LIPA-EX8+2 Éxon 8 55 A-03619 TGTTGTATATACATCCAC 18 LIPA-EX8+7 Éxon 8 56 A-03620 GAATGTGTTGTATATACA 18 LIPA-EX8+12 Éxon 8 57 A-03621 CAGGAGAATGTGTTGTAT 18 LIPA-EX8+17 Éxon 8 58 A-03622 TCCAGCAGGAGAATGTGT 18 LIPA-EX8+22 Éxon 8 59 A-03623 GCACAGAAGTTCCAGCAG 18 LIPA-EX8-24 Éxon 8 60 A-03624 GTTTTGCACAGAAGTTCC 18 LIPA-EX8-19 Éxon 8 61 A-03625 AACATGTTTTGCACAGAA 18 LIPA-EX8-14 Éxon 8 62 A-03626 AGTGTAACATGTTTTGCA 18 LIPA-EX8-9 Éxon 8 63 A-03627 GCTCCAGTGTAACATGTT 18 LIPA-EX8-4 Éxon 8 Exemplo 3: Design de ASO-walk que visa o íntron 7 de
LIPA
[134] Um ASO walk foi projetado para visar o íntron 7 (Tabela 2, ID. DE SEQ. Nº: 3) de LIPA (Tabela 1, ID. DE SEQ. Nº: 1) usando o método descrito nesse relatório descritivo (Tabela 3, IDS. DE SEQ. Nos: 39-53). Uma região imediatamente a montante do íntron 7 sítio de ligação 3’ que transpõe os nucleotídeos -16 até -100 foi utilizada para projetar ASOs que visam o íntron 7 de pré-mRNAs de SEC de LIPA. A Tabela 3 lista ASOs exemplares que foram projetados e suas seqüências-alvo. Por esse design, ASOs de 2’-MOE de 18-mer, com arcabouço de PS, deslocados por intervalos de 5 nucleotídeos foram produzidos e serão utilizados para visar pré-mRNAs de SEC de LIPA para aumentar a produção de proteína LAL. Exemplo 4: Design de ASO-walk que visa o íntron 8 de
LIPA
[135] Um ASO walk foi projetado para visar o íntron 8 (FIG. 3; Tabela 2, ID. DE SEQ. Nº: 2) de LIPA (Tabela 1, ID. DE SEQ. Nº: 1) usando o método descrito nesse relatório descritivo (Tabela 3, IDS. DE SEQ. Nos: 1-38). Uma região imediatamente a jusante do íntron 8 sítio de ligação 5’ que transpõe os nucleotídeos +6 até +100 foi utilizada para projetar ASOs que visam o íntron 8 de pré-mRNAs de SEC de LIPA. A Tabela 3 lista ASOs exemplares que foram projetados e suas seqüências-alvo. Por esse design, ASOs de 2’-MOE de 18-mer, com arcabouço de PS, deslocados por intervalos de 1 nucleotídeo de +6 até +11 e intervalos de 5 nucleotídeo posteriormente foram produzidos e utilizados para visar pré- mRNAs de SEC de LIPA para aumentar a produção de proteína LAL (veja a FIG. 4A e FIG. 4B). Exemplo 5:
[136] Foi projetado um conjunto de experimentos para demonstrar a habilidade dose-dependente de ASOs que visam pré-mRNA SEC de LIPA para alterar a ligação do transcrito para aumentar a retenção do íntron 8 no produto do mRNA maduro e, dessa forma, aumentar a produção da proteína LAL funcional de comprimento total em células de doador com CESD que carregam a mutação c.894G>A. As células foram tratadas com um conjunto de ASOs de 2ʹ-MOE diferentes que visam o íntron 8 por eletroporação (por exemplo, A-3334 (+9) nas FIG. 5, 7 e 9) ou captação livre (por exemplo, A-3334 (+9)
na FIG. 6) em uma série de concentrações para mostrar que o tratamento com quantidades crescentes de ASO leva à retenção crescente do éxon 8 em transcritos de LIPA produzidos e fibroblastos de CESD, comparados com células não tratadas (por exemplo, FIG. 5A, 5C). PAGE representativa mostra produtos de RT-PCR para dois produtos que correspondem à inclusão do éxon 8 (comprimento total, banda superior) e salto do éxon 8 (banda inferior) e cada um deles foi quantificado e avaliado como uma percentagem do transcrito de comprimento total (FIG. 5, 6 e 9). Foi feita análise adicional para confirmar que o tratamento com ASO não apenas altera a geração do transcrito de mRNA, mas também resulta em aumentos dose-dependentes na produção de proteína LAL funcional de comprimento total em células de CESD. Eletroforese em gel de dodecilsulfato de sódio- poliacrilamida (SDS-PAGE) mostra que proteína de lipase ácida lisossomal (LAL) foi produzida em níveis crescentes em células tratadas com quantidades crescentes de ASO de 2ʹ-MOE que visa o íntron 8, comparadas com células tratadas de forma simulada (-) de fibroblastos de paciente com CESD que carregam a mutação c.894G>A (FIG. 7). Um produto que corresponde à proteína de comprimento total glicosilada foi quantificado e normalizado para blot corado com Ponceau S. A atividade de proteína LAL produzida em células de CESD tratadas com ASO foi confirmada usando um ensaio enzimático. Os resultados demonstram que a proteína expressa é funcional e a quantidade de atividade é proporcional à quantidade de proteína LAL (FIGS. 8 e 10).
[137] Embora modalidades preferidas da presente invenção tenham sido mostradas e descritas nesse relatório descritivo, será óbvio para aqueles habilitados na técnica que essas modalidades são fornecidas apenas como exemplo.
Diversas variações, alterações e substituições ocorrerão agora àqueles habilitados na técnica sem se afastar da invenção.
Deve ser subentendido que várias alternativas às modalidades da invenção descritas nesse relatório descritivo podem ser empregadas na prática da invenção.
Deseja-se que as reivindicações seguintes definam o escopo da invenção e que métodos e estruturas dentro do escopo dessas reivindicações e seus equivalentes sejam por elas cobertos.

Claims (105)

REIVINDICAÇÕES
1. Método de tratamento de Doença do Armazenamento de Éster de Colesteril (CESD) em um indivíduo necessitado por modulação da expressão de uma proteína-alvo ou RNA funcional por células do indivíduo, caracterizado pelo fato de que as células possuem um pré-mRNA que contém um éxon que pode ser saltado (pré-mRNA SEC), o pré-mRNA SEC compreendendo o éxon que pode ser saltado, um íntron que flanqueia o sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado, e um íntron que flanqueia o sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado, e em que o pré-mRNA SEC codifica a proteína-alvo ou RNA funcional, o método compreendendo o contato das células do indivíduo com um oligômero anti-senso (ASO) complementar a uma porção visada do pré-mRNA SEC que codifica a proteína- alvo ou RNA funcional, pelo qual o éxon que pode ser saltado é retido em um mRNA processado pelo pré-mRNA SEC que codifica a proteína-alvo ou o RNA funcional modulando, dessa forma, um nível de mRNA que codifica a proteína-alvo ou o RNA funcional e modulando a expressão da proteína-alvo ou RNA funcional nas células do indivíduo.
2. Método de modulação da expressão de uma proteína- alvo, caracterizado pelo fato de que a proteína-alvo é lipase ácida lisossomal (LAL), por células que possuem um pré-mRNA que contém um éxon que pode ser saltado (pré-mRNA SEC), o pré-mRNA SEC compreendendo o éxon que pode ser saltado, um íntron que flanqueia o sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado, um íntron que flanqueia o sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado, e em que o pré-mRNA SEC codifica proteína LAL, o método compreendendo o contato das células com um oligômero anti-senso (ASO) complementar a uma porção visada do pré-mRNA SEC que codifica proteína LAL, pelo qual o éxon que pode ser saltado é retido em um mRNA processado pelo pré-mRNA SEC que codifica proteína LAL modulando, dessa forma, o nível de mRNA que codifica proteína LAL e modulando a expressão de proteína LAL nas células.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a modulação da expressão ou do nível da proteína-alvo ou mRNA que codifica a proteína- alvo aumenta a expressão ou o nível da proteína-alvo ou mRNA que codifica a proteína-alvo.
4. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a modulação da expressão ou do nível de proteína LAL ou mRNA que codifica proteína LAL aumenta a expressão ou o nível de proteína LAL ou mRNA que codifica proteína LAL.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 3, caracterizado pelo fato de que a proteína-alvo é LAL.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que as células estão em ou são de um indivíduo que possui uma condição causada por uma quantidade ou atividade deficiente de proteína LAL.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que pelo menos um nucleotídeo dos 9 nucleotídeos em +1 até +6 do íntron que flanqueia o sítio de ligação 5’ e -3e até -1e do éxon que pode ser saltado compreende pelo menos uma mutação.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a mutação é uma substituição.
9. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a mutação é em -1e.
10. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a mutação é c.894G>A.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a quantidade deficiente da proteína-alvo é causada por herança autossômica recessiva.
12. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que o indivíduo possui um primeiro alelo que codifica uma proteína-alvo funcional e (a) um segundo alelo que codifica uma proteína-alvo funcional, em que o oligômero anti-senso se liga a uma porção visada de um pré-mRNA SEC transcrito pelo primeiro ou segundo alelo; ou (b) um segundo alelo, em que o oligômero anti-senso se liga a uma porção visada de um pré-mRNA SEC transcrito pelo primeiro alelo.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o indivíduo possui uma condição causada por um distúrbio que resulta de uma deficiência na quantidade ou função da proteína-alvo, em que o indivíduo possui: (a) um primeiro alelo que compreende uma primeira mutação pela qual: (i) a proteína-alvo é produzida em um nível reduzido, comparada com a produção por um alelo do tipo selvagem, (ii) a proteína-alvo é produzida em uma forma que possui função reduzida, comparada com uma proteína do tipo selvagem equivalente, ou (iii) a proteína-alvo não é produzida, e (b) um segundo alelo que compreende uma segunda mutação pela qual:
(i) a proteína-alvo é produzida em um nível reduzido, comparada com a produção por um alelo do tipo selvagem, (ii) a proteína-alvo é produzida em uma forma que possui função reduzida, comparada com uma proteína do tipo selvagem equivalente, ou (iii) a proteína-alvo não é produzida, e em que a primeira e segunda mutações são iguais ou diferentes.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a proteína-alvo é produzida em uma forma que possui função reduzida, comparada com a proteína do tipo selvagem equivalente.
15. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a proteína-alvo é produzida em uma forma que é totalmente funcional, comparada com a proteína do tipo selvagem equivalente.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que a porção visada do pré-mRNA SEC está no éxon que pode ser saltado dentro da região -4e em relação ao sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado até +2e em relação ao sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado.
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que a porção visada do pré-mRNA SEC está dentro: (a) da região +6 até +500 no íntron que flanqueia o sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado; ou (b) da região -16 até -500 no íntron que flanqueia o sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado.
18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que a porção visada do pré-mRNA SEC está dentro: (a) da região -4e até -500e em relação ao sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado; (b) da região +6 até +500 em relação ao sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado; (c) da região -16 até -500 em relação ao sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado; ou (d) da região +2e até +500e em relação ao sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado.
19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que o pré- mRNA SEC compreende uma seqüência com pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 100% de identidade de seqüência para o ID. DE SEQ. Nº: 1 ou um complemento deste.
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que o pré- mRNA SEC é codificado por uma seqüência genética com pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 100% de identidade de seqüência para o ID. DE SEQ. Nº: 1 ou um complemento deste.
21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que a porção visada do pré-mRNA SEC compreende uma seqüência com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 100% de identidade de seqüência para uma região que compreende pelo menos 8 ácidos nucleicos contíguos dos IDS. DE SEQ. Nos: 2-4 ou complementos destes.
22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que o ASO compreende uma seqüência que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 100% idêntica a qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 5-63 ou complementos destes.
23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que a porção visada do pré-mRNA SEC está dentro da região -4e em relação ao sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado até +2e em relação ao sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado, em que o éxon que pode ser saltado é o éxon 8.
24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o ASO compreende uma seqüência que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 100% idêntica a qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 54-63 ou complementos destes.
25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que a porção visada do pré-mRNA SEC está dentro da região +6 até +500 em relação ao sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado, em que o éxon que pode ser saltado é o éxon 8.
26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o ASO compreende uma seqüência que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 100% idêntica a qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 5-38 ou complementos destes.
27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que a porção visada do pré-mRNA SEC está dentro da região -16 até -500 em relação ao sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado, em que o éxon que pode ser saltado é o éxon 8.
28. Método, de acordo com a reivindicação 27,
caracterizado pelo fato de que o ASO compreende uma seqüência que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 100% idêntica a qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 39-53 ou complementos destes.
29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizado pelo fato de que o pré- mRNA SEC é um pré-mRNA parcialmente ligado de um pré-mRNA de comprimento total ou é um pré-mRNA parcialmente ligado de um pré-mRNA do tipo selvagem.
30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizado pelo fato de que o mRNA que codifica a proteína-alvo ou o RNA funcional é um mRNA maduro de comprimento total, ou um mRNA maduro do tipo selvagem.
31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, caracterizado pelo fato de que a proteína-alvo produzida é proteína de comprimento total, ou proteína do tipo selvagem, ou uma combinação destas.
32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que a quantidade total do mRNA que codifica a proteína-alvo ou o RNA funcional produzido na célula colocada em contato com o oligômero anti-senso é aumentada cerca de 1,1 até cerca de 10 vezes, cerca de 1,5 até cerca de 10 vezes, cerca de 2 até cerca de 10 vezes, cerca de 3 até cerca de 10 vezes, cerca de 4 até cerca de 10 vezes, cerca de 1,1 até cerca de 5 vezes, cerca de 1,1 até cerca de 6 vezes, cerca de 1,1 até cerca de 7 vezes, cerca de 1,1 até cerca de 8 vezes, cerca de 1,1 até cerca de 9 vezes, cerca de 2 até cerca de 5 vezes, cerca de 2 até cerca de 6 vezes, cerca de 2 até cerca de 7 vezes, cerca de 2 até cerca de 8 vezes, cerca de 2 até cerca de 9 vezes, cerca de 3 até cerca de 6 vezes, cerca de 3 até cerca de 7 vezes, cerca de 3 até cerca de 8 vezes, cerca de 3 até cerca de 9 vezes, cerca de 4 até cerca de 7 vezes, cerca de 4 até cerca de 8 vezes, cerca de 4 até cerca de 9 vezes, pelo menos cerca de 1,1 vez, pelo menos cerca de 1,5 vez, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 3,5 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, ou pelo menos cerca de 10 vezes, comparada com a quantidade total do mRNA que codifica a proteína-alvo ou o RNA funcional produzido em uma célula de controle.
33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que a quantidade total do mRNA que codifica a proteína-alvo ou o RNA funcional produzido na célula colocada em contato com o oligômero anti-senso é aumentada cerca de 20% até cerca de 300%, cerca de 50% até cerca de 300%, cerca de 100% até cerca de 300%, cerca de 150% até cerca de 300%, cerca de 20% até cerca de 50%, cerca de 20% até cerca de 100%, cerca de 20% até cerca de 150%, cerca de 20% até cerca de 200%, cerca de 20% até cerca de 250%, cerca de 50% até cerca de 100%, cerca de 50% até cerca de 150%, cerca de 50% até cerca de 200%, cerca de 50% até cerca de 250%, cerca de 100% até cerca de 150%, cerca de 100% até cerca de 200%, cerca de 100% até cerca de 250%, cerca de 150% até cerca de 200%, cerca de 150% até cerca de 250%, cerca de 200% até cerca de 250%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 100%, pelo menos cerca de 150%, pelo menos cerca de 200%, pelo menos cerca de 250%, ou pelo menos cerca de 300%, comparada com a quantidade total do mRNA que codifica a proteína-alvo ou o RNA funcional produzido em uma célula de controle.
34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, caracterizado pelo fato de que a quantidade total de proteína-alvo produzida pela célula colocada em contato com o oligômero anti-senso é aumentada cerca de 1,1 até cerca de 10 vezes, cerca de 1,5 até cerca de 10 vezes, cerca de 2 até cerca de 10 vezes, cerca de 3 até cerca de 10 vezes, cerca de 4 até cerca de 10 vezes, cerca de 1,1 até cerca de 5 vezes, cerca de 1,1 até cerca de 6 vezes, cerca de 1,1 até cerca de 7 vezes, cerca de 1,1 até cerca de 8 vezes, cerca de 1,1 até cerca de 9 vezes, cerca de 2 até cerca de 5 vezes, cerca de 2 até cerca de 6 vezes, cerca de 2 até cerca de 7 vezes, cerca de 2 até cerca de 8 vezes, cerca de 2 até cerca de 9 vezes, cerca de 3 até cerca de 6 vezes, cerca de 3 até cerca de 7 vezes, cerca de 3 até cerca de 8 vezes, cerca de 3 até cerca de 9 vezes, cerca de 4 até cerca de 7 vezes, cerca de 4 até cerca de 8 vezes, cerca de 4 até cerca de 9 vezes, pelo menos cerca de 1,1 vez, pelo menos cerca de 1,5 vez, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 3,5 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, ou pelo menos cerca de 10 vezes, comparada com a quantidade total de proteína-alvo produzida por uma célula de controle.
35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, caracterizado pelo fato de que a quantidade total de proteína-alvo produzida pela célula colocada em contato com o oligômero anti-senso é aumentada cerca de 20% até cerca de 300%, cerca de 50% até cerca de 300%, cerca de 100% até cerca de 300%, cerca de 150% até cerca de 300%, cerca de 20% até cerca de 50%, cerca de 20% até cerca de 100%, cerca de 20% até cerca de 150%, cerca de 20% até cerca de 200%, cerca de 20% até cerca de 250%, cerca de 50% até cerca de 100%, cerca de 50% até cerca de 150%, cerca de 50% até cerca de 200%, cerca de 50% até cerca de 250%, cerca de 100% até cerca de 150%, cerca de 100% até cerca de 200%, cerca de 100% até cerca de 250%, cerca de 150% até cerca de 200%, cerca de 150% até cerca de 250%, cerca de 200% até cerca de 250%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 100%, pelo menos cerca de 150%, pelo menos cerca de 200%, pelo menos cerca de 250%, ou pelo menos cerca de 300%, comparada com a quantidade total de proteína-alvo produzida por uma célula de controle.
36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 35, caracterizado pelo fato de que o oligômero anti-senso compreende uma modificação do arcabouço que compreende uma ligação fosforotioato ou uma ligação fosforodiamidato.
37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, caracterizado pelo fato de que o oligômero anti-senso compreende uma porção fosforodiamidato morfolino, uma porção ácido nucleico bloqueado, uma porção ácido nucleico peptídico, uma porção 2’-O-metil, uma porção 2’-Flúor ou uma porção 2’-O-metoxietil.
38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 37, caracterizado pelo fato de que o oligômero anti-senso compreende pelo menos uma porção de açúcar modificada.
39. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que cada porção de açúcar é uma porção de açúcar modificada.
40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 39, caracterizado pelo fato de que o oligômero anti-senso consiste em de 8 a 50 nucleobases, 8 a 40 nucleobases, 8 a 35 nucleobases, 8 a 30 nucleobases, 8 a 25 nucleobases, 8 a 20 nucleobases, 8 a 15 nucleobases, 9 a 50 nucleobases, 9 a 40 nucleobases, 9 a 35 nucleobases, 9 a 30 nucleobases, 9 a 25 nucleobases, 9 a 20 nucleobases, 9 a 15 nucleobases, 10 a 50 nucleobases, 10 a 40 nucleobases, 10 a 35 nucleobases, 10 a 30 nucleobases, 10 a 25 nucleobases, 10 a 20 nucleobases, 10 a 15 nucleobases, 11 a 50 nucleobases, 11 a 40 nucleobases, 11 a 35 nucleobases, 11 a 30 nucleobases, 11 a 25 nucleobases, 11 a 20 nucleobases, 11 a 15 nucleobases, 12 a 50 nucleobases, 12 a 40 nucleobases, 12 a 35 nucleobases, 12 a 30 nucleobases, 12 a 25 nucleobases, 12 a 20 nucleobases ou 12 a 15 nucleobases.
41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 40, caracterizado pelo fato de que o oligômero anti-senso é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% complementar à porção visada do pré-mRNA SEC que codifica a proteína.
42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 41, caracterizado pelo fato de que o método ainda compreende a avaliação da expressão da proteína LIPA.
43. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 42, caracterizado pelo fato de que CESD tratada e em que o oligômero anti-senso se liga a uma porção visada de um pré-mRNA SEC de LIPA, em que a porção visada compreende pelo menos 8 ácidos nucleicos contíguos dos IDS. DE SEQ. Nos: 2-4 ou complementos destes.
44. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 43, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um humano.
45. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 44, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um animal não humano.
46. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 45, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um feto, um embrião ou uma criança.
47. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 46, caracterizado pelo fato de que as células são colocadas em contato ex vivo.
48. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 47, caracterizado pelo fato de que o oligômero anti-senso é administrado por injeção intratecal, injeção intracerebroventricular, injeção intraperitoneal, injeção intramuscular, injeção subcutânea ou injeção intravenosa no indivíduo.
49. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 48, caracterizado pelo fato de que os 16 nucleotídeos em -15 até -1 do íntron e +1e do éxon que pode ser saltado que flanqueiam o sítio de ligação 3’ são idênticos à seqüência do tipo selvagem correspondente, em que o íntron é o íntron 7 e em que o éxon que pode ser saltado é o éxon 8.
50. Oligômero anti-senso caracterizado por ser usado em um método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 49.
51. Oligômero anti-senso caracterizado por compreender uma seqüência com pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 100% de identidade de seqüência para qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 5-63 ou complementos destes.
52. Composição farmacêutica caracterizada por compreender o oligômero anti-senso conforme definido na reivindicação 50 ou 51 e um excipiente, diluente ou carreador farmaceuticamente aceitável.
53. Método de tratamento de um indivíduo necessitado, caracterizado pela administração da composição farmacêutica conforme definido na reivindicação 52 por injeção intratecal, injeção intracerebroventricular, injeção intraperitoneal, injeção intramuscular, injeção subcutânea ou injeção intravenosa.
54. Composição farmacêutica caracterizada por compreender um oligômero anti-senso para uso em um método de modulação da expressão de uma proteína-alvo ou um RNA funcional por células para tratar Doença do Armazenamento de Éster de Colesteril (CESD) em um indivíduo necessitado, associada a uma proteína deficiente ou RNA funcional deficiente, em que a proteína deficiente ou RNA funcional deficiente é deficiente em termos de quantidade ou atividade no indivíduo, em que o oligômero anti-senso reduz a exclusão de um éxon de um pré-mRNA que contém um éxon que pode ser saltado (pré-mRNA SEC) que codifica a proteína-alvo ou o RNA funcional, em que a proteína-alvo é a proteína deficiente, em que o RNA funcional é o RNA deficiente e em que o pré-
mRNA SEC compreende o éxon que pode ser saltado, um íntron que flanqueia o sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado e um íntron que flanqueia o sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado, e em que o éxon que pode ser saltado é retido em um mRNA processado pelo pré-mRNA SEC que codifica a proteína-alvo ou o RNA funcional modulando, dessa forma, a produção ou atividade da proteína-alvo ou do RNA funcional no indivíduo.
55. Composição farmacêutica caracterizada por compreender um oligômero anti-senso para uso em um método de tratamento de uma condição associada com proteína de lipase ácida lisossomal (LAL) em um indivíduo necessitado, o método compreendendo a etapa de modulação da expressão de proteína LAL por células do indivíduo, em que as células possuem um pré-mRNA que contém um éxon que pode ser saltado (pré-mRNA SEC) que compreende o éxon que pode ser saltado, um íntron que flanqueia o sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado, um íntron que flanqueia o sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado, e em que o pré-mRNA SEC codifica a proteína LAL, o método compreendendo o contato das células com o oligômero anti-senso, pelo qual o éxon que pode ser saltado é retido em um mRNA processado pelos transcritos do pré-mRNA SEC que codificam proteína LAL modulando, dessa forma, o nível de mRNA que codifica proteína LAL, e modulando a expressão de proteína LAL, nas células do indivíduo.
56. Composição, de acordo com a reivindicação 54, caracterizada pelo fato de que a modulação da atividade, expressão e/ou produção da proteína-alvo ou mRNA que codifica a proteína-alvo aumenta a atividade, expressão e/ou produção da proteína-alvo ou mRNA que codifica a proteína-alvo.
57. Composição, de acordo com a reivindicação 54, caracterizada pelo fato de que a modulação da atividade, expressão e/ou produção de proteína LAL ou mRNA que codifica proteína LAL aumenta a atividade, expressão e/ou produção de proteína LAL ou mRNA que codifica proteína LAL.
58. Composição, de acordo com a reivindicação 54 ou 56, caracterizada pelo fato de que a proteína-alvo é LAL.
59. Composição, de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pelo fato de que a condição é uma doença ou distúrbio.
60. Composição, de acordo com a reivindicação 59, caracterizada pelo fato de que a doença ou distúrbio é CESD.
61. Composição, de acordo com a reivindicação 0, caracterizada pelo fato de que a proteína-alvo e o pré-mRNA SEC são codificados pelo gene LIPA.
62. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 54 a 61, caracterizada pelo fato de que o ASO visa uma porção do pré-mRNA SEC que está no éxon que pode ser saltado dentro da região -4e em relação ao sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado até +2e em relação ao sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado.
63. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 54 a 61, caracterizada pelo fato de que o oligômero anti-senso visa uma porção do pré-mRNA SEC que está no éxon que pode ser saltado dentro: (a) da região +6 até +500 em relação ao sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado; ou (b) a região -16 até -500 em relação ao sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado.
64. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 54 a 61, caracterizada pelo fato de que o oligômero anti-senso visa uma porção do pré-mRNA SEC que está dentro da região cerca de 100 nucleotídeos a jusante do sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado, até cerca de 100 nucleotídeos a montante do sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado.
65. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 54 a 61, caracterizada pelo fato de que a porção visada do pré-mRNA SEC está dentro: (a) da região +6 até +500 no íntron que flanqueia o sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado; ou (b) da região -16 até -500 no éxon que flanqueia o sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado.
66. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 54 a 61, caracterizada pelo fato de que a porção visada do pré-mRNA SEC está dentro: (a) da região -4e até -500e em relação ao sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado; (b) da região +6 até +500 em relação ao sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado; (c) da região -16 até -500 em relação ao sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado; ou (d) da região +2e até +500e em relação ao sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado.
67. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 54 a 61, caracterizada pelo fato de que a proteína-alvo é LAL.
68. Composição, de acordo com a reivindicação 67, caracterizada pelo fato de que o pré-mRNA SEC compreende uma seqüência com pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou
100% de identidade de seqüência para o ID. DE SEQ. Nº: 1 ou um complemento deste.
69. Composição, de acordo com a reivindicação 67, caracterizada pelo fato de que o pré-mRNA SEC é codificado por uma seqüência genética com pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 100% de identidade de seqüência para o ID. DE SEQ. Nº: 1 ou um complemento deste.
70. Composição, de acordo com a reivindicação 67, caracterizada pelo fato de que a porção visada do pré-mRNA SEC compreende uma seqüência com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 100% de identidade de seqüência para uma região que compreende pelo menos 8 ácidos nucleicos contíguos dos IDS. DE SEQ. Nos: 2-4 ou complementos destes.
71. Composição, de acordo com a reivindicação 67, caracterizada pelo fato de que o ASO compreende uma seqüência que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 100% idêntica a qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 5-63 ou complementos destes.
72. Composição, de acordo com a reivindicação 67, caracterizada pelo fato de que a porção visada do pré-mRNA SEC está dentro da região -4e em relação ao sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado até +2e em relação ao sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado, em que o éxon que pode ser saltado é o éxon 8.
73. Composição, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que o ASO compreende uma seqüência que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 100% idêntica a qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 54-63 ou complementos destes.
74. Composição, de acordo com a reivindicação 67,
caracterizada pelo fato de que a porção visada do pré-mRNA SEC está dentro da região -16 até -500 em relação ao sítio de ligação 3’ do éxon que pode ser saltado, em que o éxon que pode ser saltado é o éxon 8.
75. Composição, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que o ASO compreende uma seqüência que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 100% idêntica a qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 5-38 ou complementos destes.
76. Composição, de acordo com a reivindicação 67, caracterizada pelo fato de que a porção visada do pré-mRNA SEC está dentro da região +6 até +500 em relação ao sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado, em que o éxon que pode ser saltado é o éxon 8.
77. Composição, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que o ASO compreende uma seqüência que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 100% idêntica a qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 39-53 ou complementos destes.
78. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 54 a 77, caracterizada pelo fato de que o pré-mRNA SEC foi produzido por ligação parcial de um pré- mRNA de comprimento total ou um pré-mRNA do tipo selvagem.
79. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 54 a 78, caracterizada pelo fato de que o mRNA que codifica a proteína-alvo ou o RNA funcional é um mRNA maduro de comprimento total, ou um mRNA maduro do tipo selvagem.
80. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 54 a 79, caracterizada pelo fato de que a proteína-alvo produzida é proteína de comprimento total, ou proteína do tipo selvagem.
81. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 54 a 80, caracterizada pelo fato de que o oligômero anti-senso compreende uma modificação do arcabouço que compreende uma ligação fosforotioato ou uma ligação fosforodiamidato.
82. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 54 a 81, caracterizada pelo fato de que o referido oligômero anti-senso é um oligonucleotídeo anti- senso.
83. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 54 a 82, caracterizada pelo fato de que o oligômero anti-senso compreende uma porção fosforodiamidato morfolino, uma porção ácido nucleico bloqueado, uma porção ácido nucleico peptídico, uma porção 2’-O-metil, uma porção 2’-Flúor ou uma porção 2’-O-metoxietil.
84. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 54 a 83, caracterizada pelo fato de que o oligômero anti-senso compreende pelo menos uma porção de açúcar modificada.
85. Composição, de acordo com a reivindicação 84, caracterizada pelo fato de que cada porção de açúcar é uma porção de açúcar modificada.
86. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 54 a 85, caracterizada pelo fato de que o oligômero anti-senso consiste em de 8 a 50 nucleobases, 8 a 40 nucleobases, 8 a 35 nucleobases, 8 a 30 nucleobases, 8 a 25 nucleobases, 8 a 20 nucleobases, 8 a 15 nucleobases, 9 a 50 nucleobases, 9 a 40 nucleobases, 9 a 35 nucleobases, 9 a
30 nucleobases, 9 a 25 nucleobases, 9 a 20 nucleobases, 9 a 15 nucleobases, 10 a 50 nucleobases, 10 a 40 nucleobases, 10 a 35 nucleobases, 10 a 30 nucleobases, 10 a 25 nucleobases, 10 a 20 nucleobases, 10 a 15 nucleobases, 11 a 50 nucleobases, 11 a 40 nucleobases, 11 a 35 nucleobases, 11 a 30 nucleobases, 11 a 25 nucleobases, 11 a 20 nucleobases, 11 a 15 nucleobases, 12 a 50 nucleobases, 12 a 40 nucleobases, 12 a 35 nucleobases, 12 a 30 nucleobases, 12 a 25 nucleobases, 12 a 20 nucleobases ou 12 a 15 nucleobases.
87. Composição farmacêutica caracterizada por compreender o oligômero anti-senso de qualquer uma das composições conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 54 a 86, e um excipiente, diluente ou carreador farmaceuticamente aceitável.
88. Método de tratamento de um indivíduo necessitado, caracterizado pela administração da composição farmacêutica conforme definida na reivindicação 87 por injeção intratecal, injeção intracerebroventricular, injeção intraperitoneal, injeção intramuscular, injeção subcutânea ou injeção intravenosa.
89. Composição farmacêutica caracterizada por compreender: um oligômero anti-senso que hibridiza para uma seqüência-alvo de um transcrito de mRNA de LIPA, em que o transcrito de mRNA de LIPA compreende um éxon saltado, em que o oligômero anti-senso induz retenção do éxon saltado do transcrito de mRNA de LIPA; e um excipiente, diluente ou carreador farmaceuticamente aceitável.
90. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 89, caracterizada pelo fato de que o transcrito de mRNA de LIPA é um transcrito de pré-mRNA SEC de LIPA.
91. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 89 ou 90, caracterizada pelo fato de que a porção visada do transcrito de pré-mRNA SEC de LIPA está no éxon que pode ser saltado dentro da região -4e em relação ao sítio de ligação 5’ do éxon que pode ser saltado até +2e em relação ao sítio ligado 3’ do éxon que pode ser saltado.
92. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 89 ou 90, caracterizada pelo fato de que o transcrito de pré-mRNA SEC de LIPA é codificado por uma seqüência genética com pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüência para o ID. DE SEQ. Nº: 1 ou um complemento deste.
93. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 89 ou 90, caracterizada pelo fato de que o transcrito de pré-mRNA SEC de LIPA compreende uma seqüência com pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüência para o ID. DE SEQ. Nº: 1 ou um complemento deste.
94. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 89, caracterizada pelo fato de que o oligômero anti-senso compreende uma modificação do arcabouço que compreende uma ligação fosforotioato ou uma ligação fosforodiamidato.
95. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 89, caracterizada pelo fato de que o oligômero anti-senso é um oligonucleotídeo anti-senso.
96. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 89, caracterizada pelo fato de que o oligômero anti-senso compreende uma porção fosforodiamidato morfolino, uma porção ácido nucleico bloqueado, uma porção ácido nucleico peptídico, uma porção 2’-O-metil, uma porção 2’- Flúor ou uma porção 2’-O-metoxietil.
97. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 89, caracterizada pelo fato de que o oligômero anti-senso compreende pelo menos uma porção de açúcar modificada.
98. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 89, caracterizada pelo fato de que o oligômero anti-senso compreende de 8 a 50 nucleobases, 8 a 40 nucleobases, 8 a 35 nucleobases, 8 a 30 nucleobases, 8 a 25 nucleobases, 8 a 20 nucleobases, 8 a 15 nucleobases, 9 a 50 nucleobases, 9 a 40 nucleobases, 9 a 35 nucleobases, 9 a 30 nucleobases, 9 a 25 nucleobases, 9 a 20 nucleobases, 9 a 15 nucleobases, 10 a 50 nucleobases, 10 a 40 nucleobases, 10 a 35 nucleobases, 10 a 30 nucleobases, 10 a 25 nucleobases, 10 a 20 nucleobases, 10 a 15 nucleobases, 11 a 50 nucleobases, 11 a 40 nucleobases, 11 a 35 nucleobases, 11 a 30 nucleobases, 11 a 25 nucleobases, 11 a 20 nucleobases, 11 a 15 nucleobases, 12 a 50 nucleobases, 12 a 40 nucleobases, 12 a 35 nucleobases, 12 a 30 nucleobases, 12 a 25 nucleobases, 12 a 20 nucleobases ou 12 a 15 nucleobases.
99. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 89 ou 90, caracterizada pelo fato de que o oligômero anti-senso é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou é 100% complementar a uma porção visada do transcrito de pré-mRNA SEC de LIPA.
100. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 89 ou 90, caracterizada pelo fato de que a porção visada do transcrito de pré-mRNA SEC de LIPA está dentro de uma seqüência selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 2- 4 ou complementos destes.
101. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 89, caracterizada pelo fato de que o oligômero anti-senso compreende uma seqüência de nucleotídeos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência para qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 5-63 ou complementos destes.
102. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 89, caracterizada pelo fato de que o oligômero anti-senso compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 5-63 ou complementos destes.
103. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 89 a 102, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica é formulada para injeção intratecal, injeção intracerebroventricular, injeção intraperitoneal, injeção intramuscular, injeção subcutânea ou injeção intravenosa.
104. Método de tratamento de um indivíduo que possui uma condição causada por uma quantidade ou atividade deficiente de proteína LAL, caracterizado por compreender a administração ao indivíduo de um oligômero anti-senso que compreende uma seqüência de nucleotídeos com pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência para qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 5-63 ou complementos destes.
105. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um humano.
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