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ES2862125T3 - Terapia combinada para acromegalia - Google Patents

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ES2862125T3
ES2862125T3 ES14810926T ES14810926T ES2862125T3 ES 2862125 T3 ES2862125 T3 ES 2862125T3 ES 14810926 T ES14810926 T ES 14810926T ES 14810926 T ES14810926 T ES 14810926T ES 2862125 T3 ES2862125 T3 ES 2862125T3
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George Tachas
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Percheron Therapeutics Ltd
Original Assignee
Antisense Therapeutics Ltd
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Publication date
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Abstract

Octreotida, lanreotida, pasireotida u octreolina en combinación con un oligonucleótido antisentido de 15 a 30 nucleobases de longitud dirigido a un ácido nucleico que codifica el receptor de la hormona de crecimiento (GHR) humano para su uso en el tratamiento de la acromegalia en un sujeto que tiene niveles séricos de factor de crecimiento análogo a la insulina I (IGF-I) por encima de lo normal a pesar de recibir terapia con agonistas de somatostatina, donde dicho oligonucleótido: (i) comprende al menos una porción de 8 nucleobases consecutivas de SEQ ID NO: 6; (ii) consiste en una región de desoxinucleótidos flanqueada en los extremos 5' y 3' por uno o más restos de azúcar modificados en 2'-O; (iii) comprende al menos un resto de azúcar 2'-O-metoxietilo, al menos un enlace entre nucleósidos fosforotioato y al menos una 5-metilcitosina.

Description

DESCRIPCIÓN
Terapia combinada para acromegalia
CAMPO
La presente descripción se refiere a un procedimiento para el tratamiento o la prevención de enfermedades causadas por, y/o asociadas con, un nivel aumentado de factor de crecimiento análogo a la insulina I (IGF-I) que se basa en la administración de un análogo de la somatostatina que tiene actividad agonista del receptor de la somatostatina en combinación con un oligonucleótido antisentido dirigido al receptor de la hormona de crecimiento (GHR).
ANTECEDENTES
La hormona de crecimiento (GH), liberada por la pituitaria, forma parte de una cascada de hormonas que regulan el crecimiento del cuerpo y sus órganos. La secreción de GH en el torrente sanguíneo va seguida de la unión al receptor de la hormona de crecimiento (GHR) en muchos tipos de células y órganos. La señalización de la hormona de crecimiento está mediada por esta interacción. La señalización de la hormona de crecimiento provoca la producción de otra hormona, el factor de crecimiento análogo a la insulina I (IGF-I), que se produce en el hígado, el tejido adiposo, el riñón y otros órganos y se secreta en el torrente sanguíneo. Aproximadamente el 75 % del IGF-I sérico se produce en el hígado en respuesta a la estimulación de la GH. Muchos trastornos están causados por, y/o asociados con, niveles aumentados de GH y/o niveles aumentados de IGF-I en plasma y/o tejidos como, por ejemplo, acromegalia, gigantismo, retinopatía, degeneración macular, nefropatía, diabetes y cánceres. El papel de la GH y el IGF-I en estos y otros trastornos está bien documentado. El papel del IGF-I en la mediación de muchos efectos de la GH está bien documentado y esta interrelación se denomina eje GH/IGF-I. En un ciclo de retroalimentación normal, el IGF-I también hace que se reduzca la producción de GH por parte de la pituitaria. Existe la necesidad de desarrollar tratamientos que reduzcan los niveles de IGF-I en un sujeto, por ejemplo, de manera más eficaz, segura, conveniente y/o económica. Los análogos de la somatostatina que tienen actividad agonista del receptor de la somatostatina están aprobados para el tratamiento de la acromegalia con el fin de reducir los niveles de g H e IGF-I sérico en un paciente. Para obtener una reseña de las prácticas actuales para el tratamiento de la acromegalia, véase Guistina et al., 2011. En síntesis, en la acromegalia, como primer paso en el tratamiento, se recurre a la cirugía para reducir el volumen del tumor y disminuir la secreción de GH del tumor pituitario y reducir la producción de IGF-I en el suero. Los tratamientos medicinales también se utilizan para reducir el IGF-I sérico y, en algunos casos, también reducen la liberación de GH. Todos los tratamientos utilizan una monoterapia medicinal o una terapia combinada dirigida a diferentes dianas proteicas biológicas. El tratamiento medicinal de primera línea es con un agonista de somatostatina, y este tratamiento se inicia con dosis bajas y se escala a dosis que reducen la GH y normalizan el IGF-I sérico del paciente. Cuando falla un tratamiento con agonistas de somatostatina, se puede usar un agonista de dopamina en combinación con un agonista de somatostatina, o se usa Somavert en combinación con un agonista de somatostatina o se usa Somavert como monoterapia. Para los pacientes en los que ha fallado la terapia de primera línea con SST o para los pacientes en los que ha fallado la monoterapia con Somavert o la combinación con somatostatina, los médicos están buscando nuevos tratamientos más efectivos.
El documento WO 2004/078922 describe oligonucleótidos dirigidos al GHR que inhiben la expresión del GHR y el IGF-I y su uso para tratar enfermedades relacionadas con el IGF-I. En las referencias se describen numerosos oligonucleótidos y otros fármacos (incluido el agonista de somatostatina, octreotida) que se pueden usar en combinación con los oligonucleótidos de la invención para tratar varios trastornos. Los datos incluidos en dichas referencias y relacionados con la octreotida no se refieren a una combinación de un oligonucleótido dirigido al GHR y octreotida.
RESUMEN
Los autores de la presente invención han descubierto recientemente que un análogo de la somatostatina que tiene actividad agonista del receptor de la somatostatina y un oligonucleótido antisentido dirigido al GHR actúan para producir actividad adicional para reducir el factor de crecimiento análogo a la insulina I (IGF-I) en comparación con la actividad agonista del receptor de la somatostatina y/o actúan sinérgicamente para reducir los niveles de factor de crecimiento análogo a la insulina I (IGF-I) en un sujeto. Dicho de otro modo, la administración combinada del agonista de somatostatina y el oligonucleótido dirigido al GHR muestra una actividad terapéutica mejorada en comparación con el agonista de somatostatina. Esto es sorprendente, sobre todo teniendo en cuenta que no es de esperar que se produzcan sinergias con el uso de fármacos antisentido dirigidos al GHR y un agonista de somatostatina.
En consecuencia, la presente descripción proporciona un procedimiento para el tratamiento o la prevención de una enfermedad causada por, y/o asociada con, el IGF-I, comprendiendo el procedimiento administrar a un sujeto que lo necesite un agonista de somatostatina en combinación con un oligonucleótido de 8 a 80 nucleobases de longitud dirigido a un ácido nucleico que codifica GHR para inhibir la expresión del GHR, reduciendo así el nivel de IGF-I en el sujeto. En una realización de la presente descripción, se reduce el nivel de IGF-I sérico/plasmático. En una realización de la presente descripción, la enfermedad es causada por, y/o asociada con, un nivel aumentado de IGF-I.
En una realización de la presente descripción, el procedimiento comprende además la identificación de un sujeto que necesita una reducción en sus niveles de GHR y/o IGF-I, por ejemplo, en los niveles séricos/plasmáticos de IGF-I. En una realización de la presente descripción, la enfermedad es acromegalia, gigantismo, retinopatía diabética, nefropatía diabética o un cáncer con IGF-I positivo y/o sensible a IGF-I y/o GH tal como cáncer de próstata, mieloma, cáncer de pulmón, cáncer de mama o cáncer de colon.
En una realización de la presente descripción, el agonista de somatostatina tiene una mayor afinidad de unión por el subtipo 1 de receptor de la somatostatina humana que los otros subtipos de receptor de la somatostatina humana, por el subtipo 2 de receptor de la somatostatina humana que los otros subtipos de receptor de la somatostatina humana, por el subtipo 3 de receptor de la somatostatina humana que los otros subtipos de receptor de la somatostatina humana, por el subtipo 4 de receptor de la somatostatina humana que los otros subtipos de receptor de la somatostatina humana, o por el subtipo 5 de receptor de la somatostatina humana que los otros subtipos de receptor de la somatostatina humana; o donde el agonista de somatostatina tiene una mayor afinidad de unión por dos o más subtipos de receptor de la somatostatina humana, por ejemplo, 1,2, 3, 4 y/o 5.
En una realización de la presente descripción, el agonista de somatostatina es, por ejemplo, octreotida, lanreotida o pasireotida en formas de acción corta, media o prolongada, u Octreolin. En una realización adicional de la presente descripción, el agonista de somatostatina es de liberación de prolongada (LAR por su sigla en inglés), por ejemplo, octreotida-LAR (Sandostatin™-LAR), lanreotida-LAR (Lanreotide Autogel), o pasireotida-LAR, o micropartículas de lanreotida.
En una realización de la presente descripción, el agonista de somatostatina es:
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o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, donde
A1 es un isómero D o L de Ala, Leu, Ile, Val, Nle, Thr, Ser, p-Nal, p-Pal, Trp, Phe, 2,4-dicloro-Phe, pentafluoro-Phe, p-X-Phe u o-X-Phe;
A2 es Ala, Leu, Ile, Val, Nle, Phe, p-Nal, piridil-Ala, Trp, 2,4-dicloro-Phe, pentafluoro-Phe, o-X-Phe o p-X-Phe; A3 es piridil-Ala, Trp, Phe, p-Nal, 2,4-dicloro-Phe, pentafluoro-Phe, o-X-Phe o p-X-Phe;
A6 es Val, Ala, Leu, Ile, Nle, Thr, Abu o Ser;
A7 es Ala, Leu, Ile, Val, Nle, Phe, p-Nal, piridil-Ala, Trp, 2,4-dicloro-Phe, pentafluoro-Phe, o-X-Phe o p-X-Phe; A8 es un isómero D o L de Ala, Leu, Ile, Val, Nle, Thr, Ser, Phe, p-Nal, piridil-Ala, Trp, 2,4-dicloro-Phe, pentafluoro-Phe, p-X-Phe u o-X-Phe;
donde X para cada aparición se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en CH3, Cl, Br, F, OH, OCH3 y NO2;
cada R1 y R2, independientemente, es H, acilo inferior o alquilo inferior; y R3es OH o NH2; siempre que al menos uno de A1y A8y uno de A2y A7 sea un aminoácido aromático; y, además, siempre que A1, A2, A7 y A8 no sean todos aminoácidos aromáticos.
En otra realización de la presente descripción, el agonista de somatostatina es:
H-D-Phe-p-cloro-Phe-Tyr-D-T rp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2;
H-D-Phe-p-NO2-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2;
H-D-Nal-p-cloro-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2;
H-D-Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2;
H-D-Phe-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2;
H-D-Phe-p-cloro-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2; o
H-D-Phe-Ala-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Ala-p-D-Nal-NH2; o
una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otra realización de la presente descripción, el agonista de somatostatina es:
D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-P-Nal-NH2;
D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-P-Nal-NH2;
D-P-Nal-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2;
D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Pen-Thr-NH2;
D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Pen-Thr-NH2;
D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Pen-Thr-OH;
D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Pen-Thr-OH;
Gly-Pen-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-OH;
Phe-Pen-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-OH;
Phe-Pen-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Pen-Thr-OH;
H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol;
H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2;
H-D-Trp-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2;
H-D-Trp-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2;
H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2;
H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH2;
H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2;
Ac-D-Phe-Lys*-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Asp-Thr-NH2, donde hay un puente de amida entre Lys* y Asp; Ac-hArg(Et)2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2;
Ac-D-hArg(Et)2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2;
Ac-D-hArg(Bu)-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2;
Ac-D-hArg(Et)2-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-H2;
Ac-L-hArg(Et)2-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2;
Ac-D-hArg(CH2CF3)2-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2;
Ac-D-hArg(cH2CF3)2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2;
Ac-D-hArg(cH2CF3)2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Phe-NH2;
Ac-D-hArg(CH2CF3)2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NHEt;
Ac-L-hArg(CH2CF3)2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2 ;
Ac-D-hArg(CH2CF3)2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys(Me)-Thr-Cys-Thr-NH2;
Ac-D-hArg(CH2CF3)2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys(Me)-Thr-Cys-Thr-NHEt;
Ac-hArg(CH3, hexil)-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2;
H-hArg(hexil)2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2;
Ac-D-hArg(Et)2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NHEt;
Ac-D-hArg(Et)2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Phe-NH2;
Propionil-D-hArg(Et)2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys(iPr)-Thr-Cys-Thr-NH2;
c-D-P-Nal-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Gly-hArg(Et)2-NH2;
Ac-D-Lys(iPr)-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2;
Ac-D-hArg(CH2CF3)2-D-hArg(CH2CF3)2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys
Thr-NFh;
Ac-D-hArg(CH2CF3)2-D-hArg(CH2CF3)2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys Phe-NH2;
Ac-D-hArg(Et)2-D-hArg(Et)2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2;
Ac-Cys-Lys-Asn-4-Cl-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-D-Cys-NH2;
Bmp-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2;
Bmp-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Phe-NH2;
Bmp-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-p-Cl-Phe-NH2;
Bmp-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-P-Nal-NH2;
H-D-p-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2;
H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2;
H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-P-Nal-NH2;
H-pentafluoro-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2;
Ac-D-p-Nal-Cys-pentafluoro-Phe-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2;
H-D-p-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-p-Nal-NH2;
H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-p-Nal-NH2;
H-D-p-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2;
H-D-p-Cl-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2;
Ac-D-p-Cl-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2;
H-D-Phe-Cys-p-Nal-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2;
H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys-Thr-NH2;
ciclo (Pro-Phe-D-Trp-N-Me-Lys-Thr-Phe);
ciclo (Pro-Phe-D-Trp=Lys-Thr-N-Me-Phe);
ciclo (N-Me-Ala-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe);
ciclo (Pro-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe);
ciclo (Pro-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe);
ciclo (Pro-Phe-L-T rp-Lys-Thr-Phe);
ciclo (Pro-Phe-D-Trp(F)-Lys-Thr-Phe);
ciclo (Pro-Phe-Trp(F)-Lys-Thr-Phe);
ciclo (Pro-Phe-D-T rp-Lys-Ser-Phe);
ciclo (Pro-Phe-D-Trp-Lys-Thr-p-Cl-Phe);
ciclo (D-Ala-N-Me-D-Phe-D-Thr-D-Lys-T rp-D-Phe);
ciclo (D-Ala-N-Me-D-Phe-D-Val-Lys-D-T rp-D-Phe);
ciclo (D-Ala-N-Me-D-Phe-D-Thr-Lys-D-T rp-D-Phe);
ciclo (D-Abu-N-Me-D-Phe-D-Val-Lys-D-Trp-D-Tyr);
ciclo (Pro-Tyr-D-Trp-t-4-AchxAla-Thr-Phe);
ciclo (Pro-Phe-D-T rp-t-4-AchxAla-Thr-Phe);
ciclo (N-Me-Ala-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe);
ciclo (N-Me-Ala-Tyr-D-Trp-t-4-AchxAla-Thr-Phe);
ciclo (Pro-Tyr-D-Trp-4-Amphe-Thr-Phe);
ciclo (Pro-Phe-D-T rp-4-Amphe-Thr-Phe);
ciclo (N-Me-Ala-Tyr-D-Trp-4-Amphe-Thr-Phe);
ciclo (Asn-Phe-Phe-D-T rp-Lys-Thr-Phe-Gaba);
ciclo (Asn-Phe-Phe-D-T rp-Lys-Thr-Phe-Gaba-Gaba);
ciclo (Asn-Phe-D-T rp-Lys-Thr-Phe);
ciclo (Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-NH(CH2)4CO);
ciclo (Asn-Phe-Phe-D-T rp-Lys-Thr-Phe-p-Ala);
ciclo (Asn-Phe-Phe-D-T rp-Lys-Thr-Phe-D-Glu)-OH;
ciclo (Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe);
ciclo (Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Gly);
ciclo (Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Gaba);
ciclo (Asn-Phe-Phe-D-T rp-Lys-Thr-Phe-Gly);
ciclo (Asn-Phe-Phe-D-Trp(F)-Lys-Thr-Phe-Gaba);
ciclo (Asn-Phe-Phe-D-T rp(NO2)-Lys-Thr-Phe-Gaba);
ciclo (Asn-Phe-Phe-Trp(Br)-Lys-Thr-Phe-Gaba);
ciclo (Asn-Phe-Phe-D-T rp-Lys-Thr-Phe(I)-Gaba);
ciclo (Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Tyr(But)-Gaba);
ciclo (Bmp-Lys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Pro-Cys)-OH;
ciclo (Bmp-Lys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-T po-Cys)-OH;
ciclo (Bmp-Lys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-MeLeu-Cys)-OH; ciclo (Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Phe-Gaba);
ciclo (Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-D-Phe-Gaba;
ciclo (Phe-Phe-D-Trp(5F)-Lys-Thr-Phe-Phe-Gaba);
ciclo (Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys(Ac)-Thr-Phe-NH-(CH2)3-CO);
ciclo (Lys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Gaba); o
ciclo (Orn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Gaba); o
una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En una realización de la presente descripción, el agonista de somatostatina es:
D-p-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2;
H-Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys-NH2;
Figure imgf000006_0001
D-Phe-ciclo(Cys-Phe-D-T rp-Lys-Thr-Cys)-Thr-ol; o
una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otra realización de la presente descripción, el agonista de somatostatina es:
D-Phe-ciclo (Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys)-Thr-ol o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En una realización de la presente descripción, el ácido nucleico codifica GHR humano. El ácido nucleico puede tener una secuencia de nucleótidos como se muestra en la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5.
En una realización de la presente descripción, el oligonucleótido tiene una longitud de 12 a 50 nucleobases. En otra realización de la presente descripción, el oligonucleótido tiene una longitud de 15 a 30 nucleobases.
En una realización de la presente descripción, el oligonucleótido es un oligonucleótido de ADN. En otra realización de la presente descripción, el oligonucleótido es un oligonucleótido de ARN, por ejemplo, un ARN de interferencia pequeño (ARNip). En otra realización de la presente descripción, el oligonucleótido es un oligonucleótido quimérico.
En una realización de la presente descripción, el oligonucleótido tiene al menos un 70 % de complementariedad con el ácido nucleico que codifica GHR. En otra realización de la presente descripción, el oligonucleótido tiene al menos un 80 % de complementariedad con el ácido nucleico que codifica GHR. En otra realización de la presente descripción, el oligonucleótido tiene al menos un 90 % de complementariedad con el ácido nucleico que codifica GHR. En otra realización de la presente descripción, el oligonucleótido tiene al menos un 95 % de complementariedad, por ejemplo,
96 %, 97 %, 98 % o 99 % de complementariedad con el ácido nucleico que codifica GHR.
En una realización de la presente descripción, el oligonucleótido comprende al menos una porción de 8 nucleobases consecutivas de SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 29, 30, 31,32,
33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 60, 65, 66, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 78, 79, 80, u 81.
En otra realización de la presente descripción, el oligonucleótido está constituido por la secuencia de nucleobases de
SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36,
37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 60, 61,62, 63, 64, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 78, 79, 80, u 81.
En una realización de la presente descripción, el oligonucleótido está constituido por la secuencia de nucleobases de
SEQ ID NO: 6.
En una realización de la presente descripción, el oligonucleótido se hibrida específicamente con una región que codifica GHR, donde la región comprende un codón de inicio de la traducción, un codón de terminación, una región de codificación, una región no traducida en 5', una región no traducida en 3', una unión intrón:exón o una unión exón:intrón. En una realización de la presente descripción, la región comprende al menos una porción de 8 nucleobases consecutivas de una secuencia seleccionada de entre las SEQ ID NO: 84-154.
En una realización de la presente descripción, el oligonucleótido comprende al menos una porción de 8 nucleobases consecutivas complementaria a una región de la SEQ ID NO: 4 seleccionada de entre el grupo compuesto por los nucleótidos 260-339, 332-351 y 344-423 de la SEQ ID NO: 4.
En una realización de la presente descripción, el oligonucleótido inhibe la expresión del GHR y/o de la proteína de unión a la hormona de crecimiento (GHBP) en al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30,
31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 o 45 %.
En una realización de la presente descripción, el oligonucleótido comprende al menos un enlace entre nucleósidos, un resto de azúcar o una nucleobase modificados. El oligonucleótido puede comprender, por ejemplo, al menos un resto de azúcar 2'-O-metoxietilo y/o al menos un enlace entre nucleósidos fosforotioato y/o al menos una 5-metilcitosina.
En una realización de la presente descripción, el oligonucleótido está constituido por 20 nucleósidos enlazados, donde el oligonucleótido está constituido por una nucleobase de la SEQ ID NO: 6; y donde el oligonucleótido está constituido por una región de diez desoxinucleótidos flanqueada tanto en el extremo 5' como en el extremo 3' de dicha región de diez desoxinucleótidos por cinco 2'-O-(2-metoxietil) nucleótidos, y donde cada enlace entre nucleósidos en el oligonucleótido es un enlace fosforotioato, y donde cada citosina en dicho oligonucleótido es una 5-metilcitosina. La presente descripción también proporciona un procedimiento para reducir el nivel de IGF-I en un sujeto, comprendiendo el procedimiento administrar un agonista de somatostatina en combinación con un oligonucleótido de 8 a 80 nucleobases de longitud dirigido a un ácido nucleico que codifica GHR para inhibir la expresión del GHR, reduciendo así el nivel de IGF-I en el sujeto. En una realización de la presente descripción, se reduce el nivel de IGF-I sérico/plasmático.
En una realización de la presente descripción, el procedimiento comprende además la identificación de un sujeto que necesita una reducción en sus niveles de GHR y/o IGF-I, por ejemplo en los niveles de IGF-I sérico/plasmático. El agonista de somatostatina, el GHR y el oligonucleótido también pueden estar caracterizados por cualquiera de las características mencionadas.
La presente descripción también contempla el uso de un agonista de somatostatina y un oligonucleótido de 8 a 80 nucleobases de longitud dirigido a un ácido nucleico que codifica GHR para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad causada por, y/o asociada con, un nivel aumentado de IGF-I. En una realización de la presente descripción, se reduce el nivel de IGF-I sérico/plasmático.
En una realización de la presente descripción, la enfermedad es acromegalia, gigantismo, retinopatía diabética, nefropatía diabética, o un cáncer con IGF-I positivo tal como cáncer de próstata, mieloma, cáncer de pulmón, cáncer de mama o cáncer de colon.
El agonista de somatostatina, el GHR y el oligonucleótido también pueden estar caracterizados por cualquiera de las características mencionadas.
La presente descripción también contempla el uso de un agonista de somatostatina y un oligonucleótido de 8 a 80 nucleobases de longitud dirigido a un ácido nucleico que codifica GHR para la fabricación de un medicamento para reducir el nivel de IGF-I en un sujeto.
El agonista de somatostatina, el GHR y el oligonucleótido también pueden estar caracterizados por cualquiera de las características mencionadas.
La presente descripción también contempla una composición que comprende un agonista de somatostatina y un oligonucleótido de 8 a 80 nucleobases de longitud dirigido a un ácido nucleico que codifica GHR para el tratamiento o prevención de una enfermedad causada por, y/o asociada con, un nivel aumentado de IGF-I.
El agonista de somatostatina, el GHR y el oligonucleótido también pueden estar caracterizados por cualquiera de las características mencionadas.
La presente descripción también contempla una composición que comprende un agonista de somatostatina y un oligonucleótido de 8 a 80 nucleobases de longitud dirigido a un ácido nucleico que codifica GHR para reducir el nivel de IGF-I en un sujeto.
El agonista de somatostatina, el GHR y el oligonucleótido también pueden estar caracterizados por cualquiera de las características mencionadas.
En la presente invención, se considerará que cualquier realización de la presente descripción se aplica mutatis mutandis a cualquier otra realización de la presente descripción a menos que se indique específicamente lo contrario.
En lo sucesivo, la invención se describirá mediante los siguientes ejemplos no limitantes y con referencia a las figuras adjuntas.
CÓDIGOS PARA EL LISTADO DE SECUENCIAS SEQ ID NO: 1 - Secuencia de nucleótidos de somatostatina
SEQ ID NO: 2 - Secuencia polipeptídica de somatostatina
SEQ ID NO: 3 - Secuencia peptídica de octreotida
SEQ ID NO: 4 - Secuencia de ADNc del receptor de la hormona de crecimiento humano (hGHR)
SEQ ID NO: 5 - Secuencia genética del hGHR
SEQ ID NO: 6-83 - Oligonucleótidos dirigidos al hGHR
SEQ ID NO: 84-154 - Secuencias diana de hGHR
La Figura 1 es una representación gráfica de datos que muestran la reducción en los niveles de IGF-1 como porcentaje del valor inicial en sujetos con acromegalia tratados con 200 mg (400 mg/semana) del oligonucleótido antisentido dirigido al receptor de la hormona de crecimiento (GHR) ATL1103 (SEQ ID NO: 6) dos veces por semana.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas. Cualquier realización que no se encuentre dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la invención.
Técnicas generales y definiciones seleccionadas
A menos que se indique específicamente lo contrario, debe entenderse que todos los términos técnicos y científicos usados en esta invención tienen el mismo significado que comúnmente entendería cualquier experto en la materia (por ejemplo, en tecnología antisentido, tecnología recombinante, cultivo celular, genética molecular, inmunología, inmunohistoquímica, química de proteínas y bioquímica).
A menos que se indique lo contrario, la proteína recombinante, el cultivo celular y las técnicas inmunológicas utilizadas en la presente descripción son procedimientos estándar, bien conocidos por los expertos en la materia. Dichas técnicas se describen y explican en la bibliografía, en fuentes tales como J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), TA Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, volúmenes 1 y 2, IRL Press (1991), DM Glover y BD Hames (editores), DNA Cloning: A Practical Approach, volúmenes 1-4, IRL Press (1995 y 1996), FM Ausubel et al. (editores), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates y Wiley-Interscience (1988, incluidas todas las actualizaciones hasta la fecha), Ed Harlow y David Lane (editores) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988) y JE Coligan et Alabama. (editores), Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (incluidas todas las actualizaciones hasta la fecha).
El término «y/o», por ejemplo, «X y/o Y» se entiende que significa ya sea «X e Y» o «X o Y» y se interpretará como apoyo explícito para ambos significados o para cualquiera de ellos.
Tal como se usa en la presente invención, las expresiones «alrededor de» o «aproximadamente» se referirán, en general, a 20 %, preferentemente a 10 % y más preferentemente a 5 % de un valor o un intervalo dados.
A lo largo de la presente memoria descriptiva, se entenderá que el término «comprender», o variaciones del mismo tales como «comprende» o «comprendiendo», implican la inclusión de un elemento, entero o etapa, o un grupo de elementos, enteros o etapas, indicados pero no la exclusión de cualquier otro elemento, entero o etapa, o grupo de elementos, enteros o etapas.
A lo largo de la presente memoria descriptiva, a menos que se especifique o que el contexto exija lo contrario, al hacer referencia a una única etapa, composición de materia, grupo de etapas o grupo de composiciones de materia, se entenderá que estos abarcan uno y una pluralidad (es decir, uno o más) de tales etapas, composiciones de materia, grupo de etapas o grupo de composiciones de materia.
Abreviaturas
p-Nal = p-naftilalanina
p-Pal = p-piridilalanina
hArg (Bu) = N-guanidino-(butil)-homoarginina
hArg (Et)2 = N,N'-guanidino-(dietil)-homoarginina
hArg (CH2CF3)2 = N,N'-guanidino-bis-(2,2,2, -trifluoroetil)-homoarginina
hArg (CH3, hexil) = N,N'-guanidino-(metil, hexil)-homoarginina
Lys (Me) = NE-metilisina
Lys (iPr) = N-isopropilisina
AmPhe = aminometilfenilalanina
AchxAla = aminociclohexilalanina
Abu = ácido a-aminobutírico
Tpo = 4-tiaprolina
MeLeu = N-metileucina
Orn = ornitina
Nle = norleucina
Nva = norvalina
Trp(Br) = 5-bromo-triptófano
Trp(F) = 5-fluoro-triptófano
Trp(NO2) = 5-nitro-triptófano
Gaba = ácido Y-aminobutírico
Bmp = p-mercaptopropionilo
Ac = acetilo
Pen = pencilamina.
Tratamiento y prevención de enfermedades con IGF-I positivo
La presente descripción proporciona procedimientos útiles para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección causado/a por el factor de crecimiento análogo a la insulina I (IGF-I) y/o asociado/a con un nivel aumentado de factor de crecimiento análogo a la insulina I (IGF-I). Como se usa en la presente invención, el término «tratamiento» se refiere a la administración de una composición farmacéutica con el fin de provocar una alteración o mejora de una enfermedad, trastorno o afección. Como se usa en la presente invención, el término «prevención» se refiere a la administración de una composición farmacéutica con el fin de detener o dificultar el desarrollo de al menos un síntoma de una enfermedad, trastorno o afección. El sujeto objeto de tratamiento es un mamífero, preferentemente un ser humano. Como se usa en la presente invención, «un nivel aumentado de factor de crecimiento análogo a la insulina I (IGF-I)» incluye un nivel por encima del intervalo normal o, dentro del intervalo normal, por ejemplo, incluye los valores más elevados del intervalo normal, ajustados en función de la edad y el sexo.
Los procedimientos implican la administración a un sujeto de un análogo de la somatostatina que tiene actividad agonista del receptor de la somatostatina y un oligonucleótido dirigido al receptor de la hormona de crecimiento (GHR). El «sujeto» puede ser cualquier mamífero, preferentemente un humano. Sin desear ceñirse a la teoría, el oligonucleótido actúa para inhibir la expresión del GHR en dicho sujeto, mientras que el agonista de somatostatina actúa para impedir la producción de GH, reduciendo la unión de la GH al GHR, reduciendo de este modo el nivel de IGF-I (que se produce en respuesta a la señalización de la GH) en el sujeto. El factor de crecimiento análogo a la insulina I es un polipéptido omnipresente importante para la proliferación, con potentes efectos mitogénicos en una amplia gama de células, e importante para la supervivencia celular, ya que regula la apoptosis en una amplia gama de células.
Sin desear ceñirse a la teoría, el oligonucleótido antisentido inhibe la expresión del GHR a nivel de ARN mientras que el agonista de somatostatina puede aumentar el GHR o la proteína de unión a la hormona de crecimiento (GHBP) o ambos. En una realización de la presente descripción, el oligonucleótido también actúa para reducir la expresión de la GHBP. La GHBP es la porción extracelular soluble del receptor de la GH, derivada por splicing alternativo de ARNm de la transcripción de ARNm (en, por ejemplo, ratones y ratas) o escisión proteolítica del GHR (en, por ejemplo, seres humanos, vacas y cerdos). La GHBP puede unirse a la GH, aumentando la semivida de la GH, y aumentando la acción de la GH.
En una realización de la presente descripción, el tratamiento reduce o previene la aparición de uno o más síntomas de acromegalia, por ejemplo, reduciendo los niveles aumentados de IGF-I sérico en la acromegalia a niveles normales, o reduciendo la inflamación de tejidos blandos, el agrandamiento de órganos internos, o extremos tales como el crecimiento excesivo de la mandíbula, el agrandamiento de manos y pies, la voz más grave, el engrosamiento de la piel, el olor corporal desagradable, los problemas de cartílago articular, la hiperfosfatemia, las neuropatías periféricas, la presión arterial más elevada, la diabetes, las cardiopatías y el cáncer.
En otra realización de la presente descripción, el tratamiento reduce o previene la aparición de uno o más síntomas de retinopatía, por ejemplo, reduciendo la formación de nuevos vasos sanguíneos y/o edema, visión borrosa, doble o distorsionada, o dificultad para la lectura, moscas volantes o manchas en la visión, pérdida de la visión o sombra o velo en el campo de visión, dolor, presión o enrojecimiento constante del ojo.
En otra realización de la presente descripción, el tratamiento reduce o previene la aparición de uno o más síntomas de nefropatía diabética, por ejemplo, filtración glomerular, microalbuminuria, proteinuria, daño renal, hinchazón de las piernas, náuseas y vómitos, malestar, fatiga, dolor de cabeza, picazón, hipo frecuente, pérdida de peso involuntaria, hinchazón del rostro, aumento de peso involuntario debido a la acumulación de líquido y presión arterial elevada. En otra realización de la presente descripción, el tratamiento reduce el tamaño y/o crecimiento de un tumor o cáncer (tal como cáncer de próstata, mieloma, cáncer de pulmón, de mama o de colon) y/o retrasa la progresión del tumor o cáncer (como el cáncer de próstata) de andrógeno-sensible/dependiente a andrógeno-insensible/independiente. El tamaño y/o el crecimiento del tumor o cáncer se puede reducir, por ejemplo, reduciendo la tasa de proliferación de las células tumorales/cancerosas, aumentando la tasa de apoptosis de las células tumorales/cancerosas, modulando la señalización de las células tumorales/cancerosas, por quimiosensibilización y/o inhibiendo la adhesión, anclaje, metástasis de las células tumorales/cancerosas y/o la transformación de células, por ejemplo, células de próstata. El tratamiento puede, por ejemplo, reducir los niveles de IGF-I desde los valores elevados del intervalo normal a niveles más bajos, y/o desde el cuartil superior al 2° cuartil, 3° o 4°cuartil, y/o desde el 2° cuartil al 3° o 4° cuartil ajustado en función de la edad y el sexo. El tratamiento puede reducir los niveles endocrinos, autocrinos o paracrinos de IGF-I ya que los oligonucleótidos antisentido y el agonista de somatostatina pueden actuar en los tejidos.
Somatostatina y sus agonistas
La somatostatina (factor inhibidor de la liberación de somatotropina o SRIF) tiene una isoforma de 14 aminoácidos (somatostatina-14) y una isoforma de 28 aminoácidos (somatostatina-28) (véase Wilson, J. & Foster, D., Williams, Textbook of Endocrinology, página 510 (7a ed., 1985)). El compuesto es un inhibidor de la secreción de la hormona de crecimiento y se aisló originalmente del hipotálamo (Brazeau et al., 1973). El efecto de la somatostatina nativa tiene una duración muy breve in vivo ya que es desactivada rápidamente por endopeptidasas y exopeptidasas. Se han preparado muchos análogos novedosos para mejorar la duración del efecto, la actividad biológica y la selectividad (por ejemplo, para el receptor de la somatostatina en particular) de esta hormona. En la presente invención, dichos análogos se denominarán «agonistas de somatostatina». Además, los compuestos que son péptidos cortos modificados por restos orgánicos y no péptidos, tales como moléculas orgánicas que no tienen un aminoácido reconocido en la técnica como parte de su estructura, que se unen al receptor o receptores de la somatostatina también están comprendidos dentro del significado de «agonistas de somatostatina».
Se han aislado varios receptores de la somatostatina (SSTR), por ejemplo, SSTR-1, SSTR-2, SSTR-3, SSTR-4 y SSTR-5. Por tanto, el agonista de somatostatina puede ser un agonista de SSTR-1, un agonista de SSTR-2, un agonista de SSTR-3, un agonista de SSTR-4, o un agonista de SSTR-5. Preferentemente, el agonista de SSTR tiene una alta afinidad (por ejemplo, Ki de menos de 1 nM o, preferentemente, de menos de 10 nM) por el SSTR. El agonista de somatostatina también puede ser selectivo para un receptor de la somatostatina en particular, por ejemplo, puede tener una mayor afinidad de unión por un subtipo particular de receptor de la somatostatina. Preferentemente, el agonista de somatostatina cuando se usa en el tratamiento de acromegalia o gigantismo es más selectivo para con SSTR-2, como la octreotida o la lanreotida, o se une a SSTR-1, 2, 3 y 5 como la pasireotida.
Los agonistas de somatostatina que se pueden usar en los procedimientos de la presente descripción, sin carácter restrictivo, aquellos cubiertos por fórmulas o aquellos específicamente mencionados en las publicaciones que se detallan a continuación:
Solicitud EP N.° 25164 EU;
Van Binst, G. et al., Peptide Research, 1992, 5:8;
Horvath, A. et al., Resumen, «Conformations of Somatostatin Analogs Having Antitumor Activity», 22° Simposio Europeo de Péptidos, 13-19 de septiembre, 1992, Interlaken, Suiza; y
Solicitud PCT WO 91/09056 (1991);
Solicitud EP 0363589 A2 (1990);
Patente de EE. UU. N.° 4.904.642 (1990);
Patente de EE. UU. N.° 4.871.717 (1989);
Patente de EE. UU. N.° 4.853.371 (1989);
Patente de EE. UU. N.° 4.725.577 (1988);
Patente de EE. UU. N ° 4.684.620 (1987)
Patente de EE. UU. N ° 4.650.787 (1987)
Patente de EE. UU. N ° 4.603.120 (1986)
Patente de EE. UU. N ° 4.585.755 (1986)
Solicitud EP 0203031 A2 (1986);
Patente de EE. UU. N ° 4.522.813
Patente de EE. UU. N ° 486.415 (1984);
Patente de EE. UU. N ° 4.485.101 (1984)
Patente de EE. UU. N ° 4.435.385 (1984)
Patente de EE. UU. N ° 4.395.403 (1983)
Patente de EE. UU. N ° 4.369.179 (1983)
Patente de EE. UU. N ° 4.360.516 (1982)
Patente de EE. UU. N ° 4.358.439 (1982)
Patente de EE. UU. N ° 4.328.214 (1982)
Patente de EE. UU. N ° 4.316.890 (1982)
Patente de EE. UU. N ° 4.310.518 (1982)
Patente de EE. UU. N ° 4.291.022 (1981)
Patente de EE. UU. N ° 4.238.481 (1980)
Patente de EE. UU. N ° 4.235.886 (1980)
Patente de EE. UU. N ° 4.224.190 (1980)
Patente de EE. UU. N ° 4.211.693 (1980)
Patente de EE. UU. N ° 4.190.648 (1980)
Patente de EE. UU. N ° 4.146.612 (1979) y
Patente de EE. UU. N ° 4.133.782 (1979)
Entre los ejemplos de agonistas de somatostatina se incluyen, sin carácter restrictivo, los siguientes análogos de la somatostatina y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos que se describen en las referencias citadas anteriormente:
D-p-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2;
D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-p-Nal-NH2;
D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-p-Nal-NH2;
D-p-Nal-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2;
D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Pen-Thr-NH2;
D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Pen-Thr-NH2;
D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Pen-Thr-OH;
D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Pen-Thr-OH;
Gly-Pen-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-OH;
Phe-Pen-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-OH;
Phe-Pen-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Pen-Thr-OH;
H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol;
H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2;
H-D-Trp-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2;
H-D-Trp-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2;
H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2;
H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH2;
H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2;
Ac-D-Phe-Lys*-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Asp-Thr-NH2 (con un puente de amida formado entre Lys* y Asp);
Ac-hArg(Et)2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2;
Ac-D-hArg(Et)2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2;
Ac-D-hArg(BU)-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2;
Ac-D-hArg(Et)2-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2;
Ac-L-hArg(Et)2-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2;
Ac-D-hArg(CH2CFa)2-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2;
Ac-D-hArg(CH2CFa)2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2;
Ac-D-hArg(CH2CF3)2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Phe-NH2;
Ac-D-hArg(CH2CF3)2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NHEt;
Ac-L-hArg(CH2CF3)2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2;
Ac-D-hArg(CH2CF3)2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys(Me)-Thr-Cys-Thr-NH2;
Ac-D-hArg(CH2CF3)2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys(Me)-Thr-Cys-Thr-NHEt;
Ac-hArg(CH3, hexil)-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2;
H-hArg(hexil)2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2;
Ac-D-hArg(Et)2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NHEt;
Ac-D-hArg(Et)2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Phe-NH2;
Propionil-D-hArg(Et)2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys(iPr)-Thr-Cys-Thr-NH2;
Ac-D-p-Nal-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Gly-hArg(Et)2-NH2;
Ac-D-Lys(iPr)-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2;
Ac-D-hArg(CH2CFa)2-D-hArg(CH2CFa)2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; Ac-D-hArg(CH2CF3)2-D-hArg(CH2CF3)2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Phe-NH2; Ac-D-hArg(Et)2-D-hArg(Et)2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2;
Ac-Cys-Lys-Asn-4-Cl-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-D-Cys-NH2;
Bmp-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2;
Bmp-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Phe-NH2;
Bmp-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-p-Cl-Phe-NH2;
Bmp-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-p-Nal-NH2;
H-D-p-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2;
H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2;
H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-p-Nal-NH2;
H-pentafluoro-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2;
Ac-D-p-Nal-Cys-pentafluoro-Phe-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2;
H-D-p-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-p-Nal-NH2;
H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-p-Nal-NH2;
H-D-p-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2;
H-D-p-Cl-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2;
Ac-D-p-Cl-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2;
H-D-Phe-Cys-p-Nal-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2;
H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys-Thr-NH2;
ciclo (Pro-Phe-D-Trp-N-Me-Lys-Thr-Phe);
ciclo (Pro-Phe-D-Trp-Lys-Thr-N-Me-Phe);
ciclo (N-Me-Ala-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe);
ciclo (Pro-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe);
ciclo (Pro-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe);
ciclo (Pro-Phe-L-T rp-Lys-Thr-Phe);
ciclo (Pro-Phe-D-Trp(F)-Lys-Thr-Phe);
ciclo (Pro-Phe-D-T rp-Lys-Ser-Phe);
ciclo (Pro-Phe-D-Trp-Lys-Thr-p-Cl-Phe);
ciclo (D-Ala-N-Me-D-Phe-D-Thr-D-Lys-T rp-D-Phe);
ciclo (D-Ala-N-Me-D-Phe-D-Val-Lys-D-T rp-D-Phe);
ciclo (D-Ala-N-Me-D-Phe-D-Thr-Lys-D-T rp-D-Phe);
ciclo (D-Abu-N-Me-D-Phe-D-Val-Lys-D-Trp-D-Tyr);
ciclo (Pro-Tyr-D-Trp-t-4-AchxAla-Thr-Phe);
ciclo (Pro-Phe-D-T rp-t-4-AchxAla-Thr-Phe);
ciclo (N-Me-Ala-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe);
ciclo (N-Me-Ala-Tyr-D-Trp-t-4-AchxAla-Thr-Phe);
ciclo (Pro-Tyr-D-Trp-4-Amphe-Thr-Phe);
ciclo (Pro-Phe-D-T rp-4-Amphe-Thr-Phe);
ciclo (N-Me-Ala-Tyr-D-Trp-4-Amphe-Thr-Phe);
ciclo (Asn-Phe-Phe-D-T rp-Lys-Thr-Phe-Gaba);
ciclo (Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Gaba-Gaba);
ciclo (Asn-Phe-D-T rp-Lys-Thr-Phe);
ciclo (Asn-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Lys-Thr-Phe-NH(CH2)4CO);
ciclo (Asn-Phe-Phe-D-T rp-Lys-Thr-Phe-p-Ala);
ciclo (Asn-Phe-Phe-D-T rp-Lys-Thr-Phe-D-Glu)-OH;
ciclo (Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe);
ciclo (Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Gly);
ciclo (Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Gaba);
ciclo (Asn-Phe-Phe-D-T rp-Lys-Thr-Phe-Gly);
ciclo (Asn-Phe-Phe-D-Trp(F)-Lys-Thr-Phe-Gaba);
ciclo (Asn-Phe-Phe-D-T rp(NO2)-Lys-Thr-Phe-Gaba);
ciclo (Asn-Phe-Phe-Trp(Br)-Lys-Thr-Phe-Gaba);
ciclo (Asn-Phe-Phe-D-T rp-Lys-Thr-Phe(I)-Gaba);
ciclo (Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Tyr(But)-Gaba);
ciclo (Bmp-Lys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Pro-Cys)-OH;
ciclo (Bmp-Lys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Tpo-Cys)-OH;
ciclo (Bmp-Lys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-MeLeu-Cys)-OH;
ciclo (Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Phe-Gaba);
ciclo (Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-D-Phe-Gaba);
ciclo (Phe-Phe-D-T rp(5F)-Lys-Thr-Phe-Phe-Gaba);
ciclo (Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys(Ac)-Thr-Phe-NH-(CH2)3-CO);
ciclo (Lys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Gaba);
ciclo (Orn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Gaba); y
H-Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys-NH2.
Nótese que para todos los agonistas de somatostatina descritos en la presente invención, cada residuo de aminoácido representa la estructura de -NH-C(R)H-CO-, en la que R es la cadena lateral (por ejemplo, CH3 para Ala) excepto para Thr-ol que significa -NH-CH(CH(CH3)OH)-CH2-OH y Pro que significa prolinilo. Las líneas entre los residuos de aminoácidos representan enlaces peptídicos que unen aminoácidos. Asimismo, donde el residuo de aminoácido está ópticamente activo, lo que se pretende es el icono de configuración en forma de L, a menos que se designe expresamente la forma D. Se forma un puente disulfuro entre dos residuos Cys; sin embargo, este no se muestra.
El uso de agonistas de somatostatina lineales de la siguiente fórmula también está comprendido dentro de la descripción:
Figure imgf000013_0001
-Trp - Ly s - A — A7— A8— R3
o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, donde
A1 es un isómero D o L de Ala, Leu, Ile, Val, Nle, Thr, Ser, p-Nal, p-Pal, Trp, Phe, 2,4-dicloro-Phe, pentafluoro-Phe, p-X-Phe u o-X-Phe;
A2 es Ala, Leu, Ile, Val, Nle, Phe, p-Nal, piridil-Ala, Trp, 2,4-dicloro-Phe, pentafluoro-Phe, o-X-Phe o p-X-Phe; A3es piridil-Ala, Trp, Phe, p-Nal, 2,4-dicloro-Phe, pentafluoro-Phe, o-X-Phe o p-X-Phe;
A6 es Val, Ala, Leu, Ile, Nle, Thr, Abu o Ser;
A7 es Ala, Leu, Ile, Val, Nle, Phe, p-Nal, piridil-Ala, Trp, 2,4-dicloro-Phe, pentafluoro-Phe, o-X-Phe o p-X-Phe; A8 es un isómero D o L de Ala, Leu, Ile, Val, Nle, Thr, Ser, Phe, p-Nal, piridil-Ala, Trp, 2,4-dicloro-Phe, pentafluoro-Phe, p-X-Phe u o-X-Phe;
donde X para cada aparición se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en CH3, Cl, Br, F, OH, OCH3 y NO2;
cada Ri y R2, independientemente, es H, acilo inferior o alquilo inferior; y R3 es OH o NH2; siempre que al menos uno de A1 y A8 y uno de A2 y A7 sea un aminoácido aromático; y, además, siempre que A1, A2, A7 y A8 no sean todos aminoácidos aromáticos.
Los ejemplos de agonistas lineales que se utilizarán en el procedimiento de la presente descripción incluyen:
H-D-Phe-p-cloro-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2;
H-D-Phe-p-NO2-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2;
H-D-Nal-p-cloro-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2;
H-D-Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2;
H-D-Phe-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2;
H-D-Phe-p-cloro-Phe-Tyr-D-T rp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2; y
H-D-Phe-Ala-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Val-Ala-p-D-Nal-NH2; o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
Si se desea, se pueden unir uno o más restos químicos, por ejemplo, un derivado de azúcar, grupos mono- o polihidroxi alquilo C2-12, mono o poli-hidroxi acilo C2-12, o un derivado de piperazina, al agonista de somatostatina, por ejemplo, al aminoácido en el extremo N. Véanse la solicitud PCT WO 88/02756, la solicitud europea 0329295 y la solicitud PCT N.° WO 94/04752. Entre los ejemplos de agonistas de somatostatina que contienen sustituciones químicas en el extremo N-terminal se encuentran:
Figure imgf000014_0001
(BIM-23190); y
Figure imgf000014_0002
o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
En una realización de la presente descripción, el agonista de somatostatina es, por ejemplo, octreotida, lanreotida o pasireotida. En una realización adicional de la presente descripción, el agonista de somatostatina es de liberación de prolongada (LAR), por ejemplo, octreotida-LAR (Sandostatin™-LAR), lanreotida-LAR (Lanreotide Autogel), o pasireotida-LAR, o micropartículas de lanreotida.
Síntesis de agonistas de somatostatina
Los procedimientos para sintetizar agonistas de somatostatina están bien documentados y son practicables por un experto en la materia, por ejemplo, como se ilustra en las patentes de EE. UU. y otras referencias citadas anteriormente. La síntesis de secuencias cortas de aminoácidos está consolidada en la técnica de los péptidos. Por ejemplo, la síntesis de D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2, descrita anteriormente, se puede llevar a cabo siguiendo el protocolo presentado en la patente de EE. UU. N.° 4.853.371 y la síntesis de H-D-Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2, descrita anteriormente, se puede llevar a cabo siguiendo el protocolo presentado en el ejemplo I de la solicitud de patente europea 0395417 A1. La síntesis de agonistas de somatostatina con un extremo N sustituido se puede lograr, por ejemplo, siguiendo el protocolo presentado en la publicación internacional WO 88/02756, en la solicitud de patente europea N.° 0329295 y en la publicación PCT N.° Wo 94/04752.
Conjugados
Los agonistas de somatostatina útiles para los procedimientos de la presente descripción pueden unirse de manera covalente (en adelante «conjugarse») a uno o más grupos químicos. Tal conjugación produce un conjugado de agonista de somatostatina que tiene un peso molecular real mayor que el agonista de somatostatina sin modificar. Se han descrito varios procedimientos para pegilar proteínas (véase, por ejemplo, el documento US 4.179.337), que abordan la conjugación de varias hormonas y enzimas con p Eg y polipropilenglicol para producir composiciones no inmunogénicas fisiológicamente activas. Generalmente, un PEG que tiene al menos un grupo hidroxi terminal se hace reaccionar con un agente de acoplamiento para formar un PEG activado que tiene un grupo reactivo terminal. A continuación, este grupo reactivo puede reaccionar con las aminas a y £ de proteínas para formar un enlace covalente. De forma conveniente, el otro extremo de la molécula de PEG se puede «bloquear» con un grupo químico no reactivo, tal como un grupo metoxi, para reducir la formación de complejos de moléculas de proteína reticulados con PEG. Una composición que contiene un agonista de somatostatina pegilado para uso en una formulación terapéutica puede ser heterogénea u homogénea, es decir, puede contener uno o múltiples agonistas de somatostatina pegilados. Normalmente, la composición contiene al menos 70 % de una o dos formas de agonistas de somatostatina pegilados, preferentemente, al menos 80 % de una o dos formas y, más preferentemente, al menos 90 % de una o dos formas.
Compuestos antisentido dirigidos al receptor de la hormona de crecimiento
Los procedimientos de la presente descripción se basan en el uso de un compuesto antisentido dirigido al receptor de la hormona de crecimiento (GHR) para modular la señalización de la hormona de crecimiento (GH) o el eje GH/factor de crecimiento análogo a la insulina I (IGF- I), particularmente la expresión de GHR y/o IGF-I. Preferentemente, el compuesto antisentido es un oligonucleótido. Sin embargo, se contemplan otros compuestos oligoméricos antisentido, incluidos, entre otros, miméticos de oligonucleótidos.
La hibridación de un compuesto antisentido con su ácido nucleico diana se denomina generalmente «antisentido». La hibridación del compuesto antisentido con su ácido nucleico diana inhibe la función del ácido nucleico diana. Dicha «inhibición antisentido» se basa normalmente en la hibridación basada en formación de enlaces de hidrógeno del compuesto antisentido con el ácido nucleico diana, de modo que el ácido nucleico diana sea escindido, degradado o se vuelva inoperativo de otro modo. Las funciones de ADN diana con las que se va a interferir incluyen, por ejemplo, replicación y transcripción. La replicación y la transcripción, por ejemplo, pueden ser a partir de una plantilla celular endógena, un vector, una construcción de plásmido o de otro modo. Las funciones de ARN con las que se va a interferir pueden incluir funciones tales como translocalización del ARN a un sitio de traducción de proteínas, translocalización del ARN a sitios dentro de la célula que están lejos del sitio de síntesis de ARN, traducción de proteína desde el ARN, splicing del ARN para producir una o más especies de ARN, y actividad catalítica o formación de complejos que comprenden el ARN que pueden acoplarse en, o facilitarse por, el ARN.
«Hibridación», como se usa en la presente invención, significa apareamiento de bases complementarias del oligonucleótido y el ácido nucleico diana. El apareamiento de bases normalmente implica formación de enlaces de hidrógeno, que puede ser formación de enlaces de hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen inverso, entre bases de nucleósidos o nucleótidos complementarias (nucleobases). Por ejemplo, la guanina (G) y la citosina (C) son nucleobases complementarias que se aparean mediante la formación de 3 enlaces de hidrógeno. Por ejemplo, la adenina (A) y la timina (T) son nucleobases complementarias que se aparean mediante la formación de 2 enlaces de hidrógeno. La hibridación puede producirse en circunstancias variables.
Un «nucleósido» es una combinación de azúcar y una base. La porción de base del nucleósido es comúnmente una base heterocíclica. Las dos clases más comunes de dichas bases heterocíclicas son las purinas y las pirimidinas. Los «nucleótidos» son nucleósidos que además incluyen un grupo fosfato unido de forma covalente a la porción de azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar pentofuranosilo, el grupo fosfato puede estar unido al resto hidroxilo 2', 3' o 5' del azúcar.
Los términos «específicamente hibridable» y «complementario/a» se usan para indicar un grado suficiente de complementariedad de modo que se produzca una unión estable y específica entre el compuesto antisentido y el ácido nucleico diana. Se entiende que no es necesario que el compuesto antisentido sea 100 % complementario a su secuencia de ácido nucleico diana para ser específicamente hibridable. Un compuesto antisentido es específicamente hibridable cuando la unión del compuesto antisentido al ácido nucleico diana interfiere en la expresión del ácido nucleico diana y hay un grado de complementariedad suficiente para evitar la unión no específica del compuesto antisentido a secuencias no diana en condiciones en las que se desea la unión específica, por ejemplo, en condiciones fisiológicas en el caso de un tratamiento fisiológico.
En la presente invención, los términos «condiciones de hibridación astringentes» o «condiciones astringentes» se refieren a condiciones en las que el compuesto antisentido se hibridará con su secuencia diana, pero con una cantidad mínima de otras secuencias. Las condiciones astringentes dependen de las secuencias y diferirán según las circunstancias. La condición astringente en la que el compuesto antisentido se hibrida con una secuencia diana está determinada por la naturaleza y composición del compuesto antisentido y los ensayos en los que se está investigando.
Como se usa en la presente invención, el término «complementario/a» se refiere a la capacidad de apareamiento preciso entre una nucleobase del compuesto antisentido y el ácido nucleico diana. Por ejemplo, si una nucleobase en cierta posición del compuesto antisentido es capaz de formar enlaces de hidrógeno con una nucleobase en cierta posición del ácido nucleico diana, entonces la posición de la formación de enlaces de hidrógeno entre el compuesto antisentido y el ácido nucleico diana se considera una posición complementaria. El compuesto antisentido puede hibridarse a lo largo de uno o más segmentos, de modo que los segmentos intervinientes o adyacentes no estén implicados en el acontecimiento de hibridación (por ejemplo, una estructura en bucle o una estructura de horquilla). En una realización de la presente descripción, el compuesto antisentido comprende al menos un 70 % de complementariedad de secuencia con una región diana dentro del ácido nucleico diana. Por ejemplo, un compuesto antisentido en el que 18 de 20 nucleobases son complementarias a una región diana dentro del ácido nucleico diana y que, por lo tanto, se hibridaría de manera específica, representaría un 90 % de complementariedad. En este ejemplo, las nucleobases no complementarias restantes pueden agruparse o intercalarse con nucleobases complementarias y no necesitan ser contiguas entre sí, o con nucleobases complementarias. De esta forma, un compuesto antisentido que tiene 18 nucleobases de longitud con 4 nucleobases no complementarias flanqueadas por 2 regiones de complementariedad completa con el ácido nucleico diana tendría un 77,8 % de complementariedad total con el ácido nucleico diana y, por tanto, estaría comprendido en el alcance de la presente invención. Es posible determinar el porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una región de un ácido nucleico diana de forma habitual con programas BLAST (herramientas de búsqueda de alineación local básicas) y programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul et al., 1990; Zhang y Madden, 1997).
Oligonucleótidos antisentido
La presente descripción contempla el uso de un oligonucleótido antisentido para inhibir la expresión de un receptor de la hormona de crecimiento (GHR).
El término «inhibe», como se usa en la presente invención, significa cualquier disminución medible (por ejemplo, 10 %, 20 %, 50 %, 90 % o 100 %) en la expresión del GHR.
Como se usa en la presente invención, el término «oligonucleótido» se refiere a un oligómero o polímero de ARN o ADN o miméticos, quimeras, análogos y homólogos de los mismos. Este término incluye oligonucleótidos compuestos por nucleobases, azúcares y enlaces entre nucleósidos covalentes (esqueleto) de origen natural, además de oligonucleótidos que tienen porciones no de origen natural que funcionan de manera similar. Con frecuencia, se prefieren dichos oligonucleótidos modificados o sustituidos a las formas nativas debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, mayor captación celular, afinidad mejorada por el ácido nucleico diana y mayor estabilidad en presencia de nucleasas.
Al formar los oligonucleótidos, los grupos fosfato unen los nucleósidos adyacentes de manera covalente entre sí para formar un compuesto polimérico lineal. A su vez, los extremos respectivos de este compuesto polimérico lineal pueden unirse adicionalmente para formar un compuesto circular; sin embargo, en general, se prefieren los compuestos lineales. Además, los compuestos lineales pueden tener complementariedad de nucleobases internas y, por lo tanto, pueden plegarse para producir un compuesto total o parcialmente bicatenario. En cuanto a los oligonucleótidos, comúnmente se hace referencia a los grupos fosfato como formadores del esqueleto entre nucleósidos del oligonucleótido. El enlace normal o esqueleto de ARN y ADN es un enlace fosfodiéster de 3' a 5'.
Los oligonucleótidos antisentido útiles para los procedimientos de la presente descripción incluyen, por ejemplo, ribozimas, ARNip, oligonucleótidos de secuencia de guía externa (EGS), agentes de splicing alternativos, cebadores, sondas y otros oligonucleótidos que se hibridan con al menos una porción del ácido nucleico diana.
Los oligonucleótidos antisentido se pueden administrar con forma monocatenaria, bicatenaria, circular o de horquilla y pueden contener elementos estructurales tales como protuberancias o bucles internos o en los extremos. Una vez administrados, los oligonucleótidos antisentido pueden provocar la acción de una o más enzimas o proteínas estructurales para llevar a cabo la modificación del ácido nucleico diana.
Un ejemplo no restrictivo de dicha enzima es la RNasa H, una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de un dúplex ARN:ADN. Se sabe en la técnica que los compuestos antisentido monocatenarios que son «análogos al ADN» provocan la acción de la RNasa H. Por lo tanto, la activación de la RNasa H da como resultado la escisión del ARN diana, mejorando así en gran medida la eficacia de la inhibición de expresión génica mediada por oligonucleótidos. Se han postulado funciones similares para otras ribonucleasas, como las de la familia de enzimas RNasa III y ribonucleasa L.
Se ha demostrado que la introducción de moléculas de ARN bicatenario (ARNbc) induce una reducción mediada por mecanismo antisentido potente y específica de la función de un gen o de sus productos génicos asociados. Este fenómeno ocurre tanto en plantas como en animales y se cree que tiene una conexión evolutiva con la defensa viral y el silenciamiento de transposones.
La primera evidencia de que el ARNbc podía dar pie a silenciamiento génico en los animales se produjo en 1995 a partir de investigaciones del nematodo Caenorhabditis elegans (Guo y Kempheus, 1995). Montgomery et al. (1998) han demostrado que los efectos de interferencia primarios del ARNbc son postranscripcionales. El mecanismo antisentido postranscripcional definido en Caenorhabditis elegans resultante de la exposición a ARN bicatenario (ARNbc) se ha denominado ARN de interferencia (ARNi). De manera generalizada, este término se usa para referirse al silenciamiento génico mediado por mecanismo antisentido que implica la introducción de ARNbc, lo cual da pie a la reducción específica de secuencia de los niveles de ARNm endógeno elegido como diana (Fire et al., 1998). Se ha demostrado que, de hecho, los oligómeros de ARN monocatenario de polaridad antisentido de los ARNbc son inductores potentes de ARNi (Tijsterman et al., 2002).
Una persona con experiencia normal en la materia podría, sin experimentación excesiva, identificar oligonucleótidos antisentido útiles en los procedimientos de la presente descripción.
Enlaces entre nucleósidos modificados (esqueletos)
Los compuestos antisentido útiles para los procedimientos de la presente descripción incluyen oligonucleótidos que tienen esqueletos modificados o enlaces entre nucleósidos no naturales. Los oligonucleótidos con esqueletos modificados incluyen aquellos que retienen un átomo de fósforo en el esqueleto y aquellos que no tienen un átomo de fósforo en el esqueleto.
Los esqueletos de oligonucleótidos modificados que contienen un átomo de fósforo incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, metilo y otros fosfonatos de alquilo que incluyen 3'-alquilenfosfonatos, 5'-alquilenfosfonatos y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos que incluyen 3'-aminofosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres, selenofosfatos y boranofosfatos con enlaces 3'-5' normales, análogos enlazados 2'-5' de estos y aquellos con polaridad invertida donde uno o más enlaces entre nucleótidos son un enlace de 3' a 3', de 5' a 5' o de 2' a 2'.
Los oligonucleótidos con polaridad invertida comprenden un único enlace de 3' a 3' en el enlace entre nucleótidos en la posición 3' del último nucleótido, es decir, un único residuo de nucleósido invertido que puede ser abásico (le falta la nucleobase o tiene un grupo hidroxilo en su lugar). También están incluidas diversas sales, sales mixtas y formas de ácido libre.
Entre las patentes de EE. UU. representativas que explican la preparación de los enlaces que contienen fósforo mencionados se incluyen, sin carácter restrictivo, US 3.687.808, uS 4.469.863, US 4.476.301, US 5.023.243, US 5.177.196, US 5.188.897, US 5.264.423, US 5.276.019, US 5.278.302, US 5.286.717, US 5.321.131, US 5.399.676, US 5.405.939, US 5.453.496, US 5.455.233, US 5.466.677, US 5.476.925, US 5.519.126, US 5.536.821, US 5.541.306, US 5.550.111, US 5.563.253, US 5.571.799, US 5.587.361, US 5.194.599, US 5.565.555, US 5.527.899, US 5.721.218, US 5.672.697 y US 5.625.050.
Los esqueletos de oligonucleótidos modificados que no incluyen un átomo de fósforo en los mismos incluyen, por ejemplo, esqueletos formados por enlaces entre nucleósidos de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, enlaces entre nucleósidos mixtos de heteroátomo y alquilo o cicloalquilo, o uno o más enlaces entre nucleósidos heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Estos comprenden aquellos que tienen enlaces morfolino (formados, en parte, a partir de la porción de azúcar de un nucleósido); esqueletos de siloxano; esqueletos de sulfuro, sulfóxido y sulfona; esqueletos de formacetilo y tioformacetilo; esqueletos de metilenformacetilo y tioformacetilo; esqueletos de riboacetilo; esqueletos que contienen alqueno; esqueletos de sulfamato; esqueletos de metilenimino y metilenhidrazino; esqueletos de sulfonato y sulfonamida; esqueletos de amida; y otros que tienen componentes mixtos de N, O, S y CH2. Entre las patentes de EE. UU. representativas que explican la preparación de los oligonucleótidos mencionados se incluyen, sin carácter restrictivo, US 5.034.506, US 5.166.315, US 5.185.444, US 5.214.134, US 5.216.141, US 5.235.033, US 5.264.562, US 5.264.564, US 5.405.938, US 5.434.257, US 5.466.677, US 5.470.967, US 5.489.677, US 5.541.307, US 5.561.225, US 5.596.086, US 5.602.240, US 5.610.289, US 5.602.240, US 5.608.046, US 5.610.289, US 5.618.704, US 5.623.070, US 5.663.312, US 5.633.360, US 5.677.437, US 5.792.608, US 5.646.269 y US 5.677.439.
Azúcar y enlaces entre nucleósidos modificados
Los compuestos antisentido útiles para los procedimientos de la presente descripción incluyen miméticos de oligonucleótidos donde tanto el azúcar como el enlace entre nucleósidos (es decir, el esqueleto) de las unidades de nucleótido se sustituyen por grupos novedosos. Las unidades de nucleobase se mantienen para la hibridación con el ácido nucleico diana.
Un mimético de oligonucleótido que ha demostrado tener excelentes propiedades de hibridación se denomina ácido nucleico peptídico (ANP). En compuestos de ANP, el esqueleto de azúcar de un oligonucleótido se sustituye por un esqueleto que contiene amida, en particular, un esqueleto de aminoetilglicina. Las nucleobases son retenidas y se unen directa o indirectamente a átomos de nitrógeno azo de la porción de amida del esqueleto. Entre las patentes de EE. UU. representativas que explican la preparación de compuestos de ANP se incluyen, sin carácter restrictivo, US 5.539.082, US 5.714.331, y US 5.719.262. Se puede encontrar más información sobre compuestos de ANP en Nielsen et al., 1991.
Los compuestos antisentido útiles para los precedimientos de la presente descripción también incluyen oligonucleótidos con esqueletos de fosforotioato y oligonucleótidos con esqueletos de heteroátomos, por ejemplo,-CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2-[conocido como esqueleto de metileno (metilimino) o MMI], -c H2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-c H2- y -O-N(CH3)-CH2-CH2-[donde el esqueleto de fosfodiéster nativo se representa como -O-P-O-CH2-] del documento US 5.489.677 y los esqueletos de amida del documento US 5.602.240
Los compuestos antisentido útiles para los procedimientos de la presente descripción también incluyen oligonucleótidos que tienen estructuras de esqueleto de morfolino del documento US 5.034.506.
Azúcares modificados
Los compuestos antisentido útiles para los procedimientos de la presente descripción incluyen oligonucleótidos que tienen uno o más restos de azúcar sustituidos.
Los ejemplos incluyen oligonucleótidos que comprenden uno de los siguientes en la posición 2': OH; F; O-, S- o N-alquilo; O-, S-, o N-alquenilo; O-, S- o N-alquinilo; o O-alquil-O-alquilo, donde el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo C1 a C10 o alquenilo y alquinilo C2 a C10 sustituidos o sin sustituir.
En una realización de la presente descripción, el oligonucleótido comprende uno de los siguientes en la posición 2' : O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2y O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2, donde n y m son entre 1 y alrededor de 10.
Otros ejemplos de oligonucleótidos modificados incluyen oligonucleótidos que comprenden uno de los siguientes en la posición 2': alquilo inferior C1 a 10, alquilo, alquenilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo inferior sustituido, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo indicador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido, y otros sustituyentes que tienen propiedades similares.
En una realización de la presente descripción, la modificación incluye 2'-metoxietoxi (2 -OCH2CH2OCH3 (también conocido como 2'-O-(2-metoxietil) o 2'-MOE) (Martin et al., 1995), es decir, un grupo alcoxialcoxi. En una modificación adicional de la presente descripción, la modificación incluye 2'-dimetilaminooxietoxi, es decir, un grupo O(CH2)2ON(CH3)2 (también conocido como 2'-DMAOE), o 2'-dimetilaminoetoxietoxi (también conocido en la técnica como 2'-O-dimetilaminoetoxietil o 2'-DMAEOE), es decir, 2'-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2.
Otras modificaciones incluyen 2'-metoxi (2 -O-CH3), 2'-aminopropoxi (2 -OCH2CH2CH2NH2), 2'-alilo (2'-CH2-CH=CH2), 2'-O-alilo (2'-O-CH2-CH=CH2) y 2'-fluoro (2'-F). La modificación en 2' puede encontrarse en la posición arabino (arriba) o en la posición ribo (abajo). En una realización de la presente descripción, una modificación 2'-arabino es 2'-F. También pueden hacerse modificaciones similares en otras posiciones en el oligonucleótido, en particular, en la posición 3' del azúcar en el nucleótido del extremo 3' o en oligonucleótidos enlazados 2'-5' y en la posición 5' del nucleótido del extremo 5'.
Los oligonucleótidos también pueden tener miméticos de azúcar tales como restos ciclobutilo en lugar del azúcar pentofuranosilo.
Entre las patentes de EE. UU. representativas que explican la preparación de dichas estructuras de azúcar modificadas se incluyen, sin carácter restrictivo, US 4.981.957, US 5.118.800, US 5.319.080, US 5.359.044, US 5.393.878, US 5.446.137, US 5.466.786, US 5.514.785, US 5.519.134, US 5.567.811, US 5.576.427, US 5.591.722, US 5.597.909, US 5.610.300, US 5.627.053, US 5.639.873, US 5.646.265, US 5.658.873, US 5.670.633, US 5.792.747, y US 5.700.920.
Una modificación adicional del azúcar incluye ácidos nucleicos bloqueados (ANB) en los cuales el grupo 2'-hidroxilo está unido al átomo de carbono en la posición 3' o 4' del anillo de azúcar, formando, de esta manera, un resto de azúcar bicíclico. En una realización de la presente descripción, el enlace es un grupo metileno (-CH2-)n que forma un puente entre el átomo de oxígeno en la posición 2' y el átomo de carbono en la posición 4', donde n es 1 o 2. Los ANB y su preparación se describen en las publicaciones internacionales WO 98/39352 y WO 99/14226.
Nucleobases naturales y modificadas
Los compuestos antisentido útiles para los procedimientos de la presente descripción incluyen oligonucleótidos que tienen modificaciones o sustituciones de nucleobases. Tal como se usa en la presente invención, nucleobases «no modificadas» o «naturales» incluyen las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U).
Las nucleobases modificadas incluyen otras nucleobases sintéticas y naturales tales como, por ejemplo, 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, derivados de 6-metilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, derivados de 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil(-CEC-CH3) uracilo y citosina y otros derivados de alquinilo de bases de pirimidina, 6-azouracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudo-uracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas sustituidas en 8, 5-halo, en particular, 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas sustituidos en 5, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-aminoadenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina. Otras nucleobases modificadas incluyen pirimidinas tricíclicas, tales como fenoxazina citidina(1H-pirimido[5,4-b][1,4]benzoxazin-2(3H)-ona), fenotiazina citidina (1H-pirimido[5,4-b][1,4]benzotiazin-2(3H)-ona), pinzas G tales como, por ejemplo, una fenoxazina citidina sustituida (por ejemplo, 9-(2-aminoetoxi)-H-pirimido[5,4-b][1,4]benzoxazin-2(3H)-ona), carbazol citidina (2H-pirimido[4,5-b]indol-2-ona), piridoindol citidina (H-pirido[3',2':4,5]pirrolo[2,3-d]pirimidin-2-ona).
Las nucleobases modificadas también pueden incluir aquellas en las cuales la base de purina o pirimidina es reemplazada por otros heterociclos, por ejemplo 7-deaza-adenina, 7-deazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Entre las bases adicionales se incluyen las descritas en el documento US 3.687.808, las descritas en J.I. Kroschwitz (editor), The Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, páginas 858-859, John Wiley and Sons (1990), las descritas por Englisch et al. (1991), y las descritas por Y.S. Sanghvi, Capítulo 15: Antisense Research and Applications, páginas 289-302, S.T. Crooke, B. Lebleu (editores), CRC Press, 1993.
Algunas de estas nucleobases son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión del oligonucleótido. Estas incluyen pirimidinas sustituidas en 5, 6-azapirimidinas y purinas sustituidas en N-2, N-6 y O-6, a saber, 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se ha demostrado que las sustituciones con 5-metilcitosina aumentan la estabilidad del dúplex de ácido nucleico en 0,6-1,2 °C. En una realización de la presente descripción, estas sustituciones de nucleobase se combinan con modificaciones de azúcar 2'-O-metoxietilo.
Entre las patentes de EE. UU. representativas que explican la preparación de determinadas nucleobases modificadas mencionadas más arriba así como otras nucleobases modificadas se incluyen, sin carácter restrictivo, US 3.687.808, US 4.845.205, US 5.130.302, US 5.134.066, US 5.175.273, US 5.367.066, US 5.432.272, US 5.457.187, US 5.459.255, US 5.484.908, US 5.502.177, US 5.525.711, US 5.552.540, US 5.587.469, US 5.594.121, US 5.596.091, US 5.614.617, US 5.645.985, US 5.830.653, US 5.763.588, US 6.005.096, US 5.681.941 and US 5.750.692.
Conjugados
Los compuestos antisentido útiles para los procedimientos de la presente descripción se pueden conjugar con uno o más restos o grupos que mejoran la actividad, distribución celular o captación celular del compuesto antisentido. Estos restos o grupos pueden unirse de manera covalente con grupos funcionales tales como grupos hidroxilo primarios o secundarios.
Entre los restos o grupos ejemplares se incluyen intercaladores, moléculas de genes indicadores, poliaminas, poliamidas, polietilenglicoles, poliéteres, grupos que potencian las propiedades farmacodinámicas de los oligómeros, y grupos que potencian las propiedades farmacocinéticas de los oligómeros. Entre los grupos conjugados típicos se incluyen colesteroles, lípidos, fosfolípidos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas y colorantes.
Los restos o grupos que mejoran las propiedades farmacodinámicas incluyen aquellos que mejoran la captación, que mejoran la resistencia a la degradación y/o que fortalecen la hibridación específica de secuencia con el ácido nucleico diana.
Los restos o grupos que potencian las propiedades farmacocinéticas incluyen aquellos que mejoran la captación, distribución, metabolismo o excreción de los compuestos antisentido.
En los documentos PCT/US92/09196 y US 6.287.860 se describen restos o grupos representativos.
Los restos o grupos incluyen, sin carácter restrictivo, restos de lípido tales como un resto colesterol, ácido cólico, un tioéter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol, un tiocolesterol, una cadena alifática, por ejemplo, residuos de dodecanodiol o undecilo, un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio, una poliamina o una cadena de polietilenglicol, o ácido adamantano acético, un resto palmitilo, o un resto octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol.
Los compuestos antisentido útiles para los procedimientos de la presente descripción también se pueden conjugar con sustancias farmacológicas activas. Esto incluye el agonista de somatostatina, por ejemplo, octreotida, lanreotida o pasireotida. Los expertos en la materia conocen técnicas para conjugar con octreotida.
En el documento US 09/334.130 se describen conjugados oligonucleótido-fármaco y su preparación.
Entre las patentes de EE. UU. representativas que explican la preparación de tales conjugados se incluyen, sin carácter restrictivo, US 4.828.979, US 4.948.882, US 5.218.105, US 5.525.465, US 5.541.313, US 5.545.730, US 5.552.538, US 5.578.717, US 5.580.731, US 5.580.731, US 5.591.584, US 5.109.124, US 5.118.802, US 5.138.045, US 5.414.077, US 5.486.603, US 5.512.439, US 5.578.718, US 5.608.046, US 4.587.044, US 4.605.735, US 4.667.025, US 4.762.779, US 4.789.737, US 4.824.941, US 4.835.263, US 4.876.335, US 4.904.582, US 4.958.013, US 5.082.830, US 5.112.963, US 5.214.136, US 5.082.830, US 5.112.963, US 5.214.136, US 5.245.022, US 5.254.469, US 5.258.506, US 5.262.536, US 5.272.250, US 5.292.873, US 5.317.098, US 5.371.241, US 5.391.723, US 5.416.203, US 5.451.463, US 5.510.475, US 5.512.667, US 5.514.785, US 5.565.552, US 5.567.810, US 5.574.142, US 5.585.481, US 5.587.371, US 5.595.726, US 5.597.696, US 5.599.923, US 5.599.928 y US 5.688.941.
Compuestos quiméricos
Como apreciarán los expertos en la materia, no es necesario que todas las posiciones en un compuesto dado estén modificadas uniformemente y, de hecho, se puede incorporar más de una de las modificaciones mencionadas anteriormente en un único oligonucleótido o incluso en un único nucleósido dentro de un oligonucleótido.
Los compuestos antisentido útiles para los procedimientos de la presente descripción incluyen oligonucleótidos quiméricos. Los «oligonucleótidos quiméricos» contienen dos o más regiones químicamente diferenciadas, cada una compuesta por al menos una unidad de monómero, es decir, un nucleótido en el caso de un compuesto de oligonucleótido. Estos oligonucleótidos normalmente contienen al menos una región donde el oligonucleótido es modificado como para ofrecer al oligonucleótido mayor resistencia a la degradación por nucleasas, mayor captación celular, mayor estabilidad y/o mayor afinidad de unión por el ácido nucleico diana. Una región adicional del oligonucleótido puede servir como sustrato para enzimas capaces de escindir híbridos ARN:ADN o ARN:ARN. A modo de ejemplo, la RNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de un dúplex ARN:ADN. Por lo tanto, la activación de la RNasa H produce la escisión de la diana de ARN, potenciando así, en gran medida, la eficiencia de la inhibición de expresión génica mediada por oligonucleótidos. La escisión de los híbridos ARN:ARN se puede conseguir, de manera similar, a través de las acciones de endorribonucleasas, tales como RNasaL, que escinde tanto el ARN celular como el viral. La escisión de la diana de ARN puede detectarse de manera rutinaria por electroforesis en gel y, si fuera necesario, mediante técnicas de hibridación de ácidos nucleicos asociadas conocidas en la técnica.
Se pueden formar compuestos antisentido quiméricos útiles para los procedimientos de la presente descripción como estructuras compuestas de dos o más oligonucleótidos, oligonucleótidos modificados y/o miméticos de oligonucleótidos. Dichos compuestos también se han denominado en la técnica híbridos o gapmers.
Entre las patentes de EE. UU. representativas que explican la preparación de tales estructuras híbridas se incluyen, sin carácter restrictivo, US 5.013.830, US 5.149.797, US 5.220.007, US 5.256.775, US 5.366.878, US 5.403.711, US 5.491.133, US 5.565.350, US 5.623.065, US 5.652.355, US 5.652.356 y US 5.700.922.
Oligonucleótidos ejemplares
En una realización de la presente descripción, el compuesto antisentido es un gapmer de oligonucleótido quimérico modificado con 2'-MOE de esqueleto de fosforotioato de segunda generación diseñado para hibridar con ARNm de GHR.
Los oligonucleótidos ejemplares se muestran en la Tabla 1. El término «sitio diana» indica el primer número de nucleótidos (en la posición 5' del último nucleótido) en la secuencia diana particular a la que se une el oligonucleótido. El término «% de inhib.» indica el efecto inhibidor sobre los niveles de ARNm de hGHR mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Los datos son promedios de tres experimentos en los que se trataron células MCF7 con los oligonucleótidos antisentido.
Tabla 1: Inhibición de niveles de ARNm de receptor de la hormona de crecimiento humana por oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen alas 2'-MOE y un hueco desoxi
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Todos los oligonucleótidos de la Tabla 1 son oligonucleótidos quiméricos («gapmers»), con una longitud de 20 nucleótidos, compuestos por una región central de «hueco» de diez 2'-desoxinucleótidos, flanqueada en ambos lados (sentidos 5' y 3') por «alas» de cinco nucleótidos. Las alas están compuestas por nucleótidos 2'-metoxietilo (2'-MOE). Los enlaces entre nucleósidos (esqueleto) son fosforotioato (P=S) en todo el oligonucleótido. Todos los uracilos son 5-metiluracilos (MeU). Normalmente, el oligonucleótido se sintetiza usando timidinas modificadas con 2-metoxietilo, no 5-metiluracilos. Todas las pirimidinas están metiladas en C5 (es decir, U, T, C están metiladas en C5).
El oligonucleótido puede sintetizarse mediante un procedimiento de múltiples etapas que puede dividirse en dos operaciones distintas: síntesis en fase sólida y procesamiento cadena abajo. En la primera operación, la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido se ensambla a través de un sintetizador en fase sólida controlado por ordenador. El procesamiento cadena abajo posterior incluye etapas de desprotección, purificación cromatográfica en fase inversa preparatoria, aislamiento y secado para producir la sustancia farmacológica de oligonucleótido. La síntesis química del oligonucelótido utiliza química de acoplamiento de fosforamidita seguida de sulfuración oxidativa y conlleva acoplamiento secuencial de monómeros activados a un oligómero de alargamiento, cuyo extremo 3' está unido de manera covalente al soporte sólido.
Destritilación (reacción a).
Cada ciclo de la síntesis en fase sólida comienza con la eliminación del grupo protector lábil en medio ácido 5'-O-4, 4'-dimetoxitritilo (DMT) del nucleósido del extremo 5' del oligonucleótido unido al soporte. Esto se logra mediante tratamiento con una disolución ácida (por ejemplo, ácido dicloroacético (DCA) en tolueno). Después de la destritilación, el exceso de reactivo se elimina del soporte lavando con acetonitrilo como preparación para la siguiente reacción.
Acoplamiento (reacción b)
El alargamiento de la cadena se consigue mediante la reacción del grupo 5'-hidroxilo del oligonucleótido unido al soporte con una disolución de la fosforamidita correspondiente a esa posición de base particular (por ejemplo, para base2: MOE-MeC amidita) en presencia de un activador (por ejemplo, 1 H-tetrazol). Esto da como resultado la formación de un enlace fosfito-triéster entre el sintón de nucleótido entrante y la cadena de oligonucleótido unida al soporte. Después de la reacción de acoplamiento, el exceso de reactivo se elimina del soporte lavando con acetonitrilo como preparación para la siguiente reacción.
Sulfuración (reacción c)
El enlace fosfito-triéster recién formado se convierte en el correspondiente triéster de fosforotioato de (O, O, O)-trialquilo mediante tratamiento con una disolución de un reactivo de transferencia de azufre (por ejemplo, disulfuro de fenilacetilo). Después de la sulfuración, el exceso de reactivo se elimina del soporte lavando con acetonitrilo como preparación para la siguiente reacción.
Ocupación de extremos (reacción d)
Una pequeña proporción de los grupos 5'-hidroxi disponibles en cualquier ciclo dado no se extiende. El acoplamiento de estos grupos en cualquiera de los ciclos posteriores daría como resultado la formación de impurezas relacionadas con el procedimiento («(n-1)-meros con d Mt ») que son difíciles de separar del producto deseado. Para evitar la formación de estas impurezas y facilitar la purificación, se introduce un «reactivo de ocupación de extremos» (por ejemplo, anhídrido acético y N-metilimidazol/acetonitrilo/piridina) en el recipiente de reacción para proporcionar secuencias con extremos ocupados. Las secuencias erróneas resultantes («truncadas sin DMT») se separan del producto deseado mediante purificación por HPLC en fase inversa. Después de la reacción de ocupación de extremos, el exceso de reactivo se elimina del soporte lavando con acetonitrilo como preparación para la siguiente reacción. La reiteración de este ciclo básico de cuatro etapas usando la fosforamidita de nucleósido protegida apropiada permite el ensamblaje de toda la secuencia de oligonucleótidos protegida.
Desprotección del esqueleto (reacción e)
Una vez completada la parte de ensamblaje del procedimiento, los grupos cianoetilo que protegen los enlaces entre nucleótidos de triéster de fosforotioato de (O,O,O)-trialquilo se eliminan mediante tratamiento con una disolución de trietilamina (TEA) en acetonitrilo. El reactivo y el acrilonitrilo generados durante esta etapa se eliminan lavando la columna con acetonitrilo.
Escisión del soporte y desprotección de bases (reacción f)
La desprotección de los grupos amino exocíclicos y la escisión del producto en bruto del soporte se logra mediante incubación con hidróxido de amonio acuoso (reacción f). La purificación del producto en bruto protegido con 5'-O-DMT se realiza mediante HPLC en fase inversa. La etapa de HPLC en fase inversa elimina las secuencias erróneas sin DMT. El perfil de elución se controla mediante espectroscopia de absorción UV. Las fracciones que contienen producto de oligonucleótido con DMT se recogen y analizan.
Desprotección ácida (reacción g)
Las fracciones de HPLC en fase inversa que contienen oligonucleótido protegido con 5'-O-DMT se combinan y se transfieren a una cuba de precipitación. Los productos obtenidos de la purificación de varias síntesis se combinan en esta etapa del procedimiento. El oligonucleótido con DMT purificado se trata con ácido (por ejemplo, ácido acético) para eliminar el grupo DMT unido al extremo 5'. Después de la exposición al ácido durante el tiempo prescrito y la neutralización, la sustancia farmacológica de oligonucleótido se aísla y se seca.
Después de la etapa de desprotección ácida final, la disolución se neutraliza mediante la adición de hidróxido sódico acuoso y la sustancia farmacológica de oligonucleótido se precipita a partir de la disolución añadiendo etanol. Se deja que el material precipitado se asiente en el fondo del recipiente de reacción y que se decante el sobrenadante etanólico. El material precipitado vuelve a disolverse en agua purificada y se ajusta el pH de la disolución entre pH 7,2 y 7,3. La etapa de precipitación se repite. El material precipitado se disuelve en agua y la disolución se filtra a través de un filtro de 0,45 micrómetros y se transfiere a bandejas de polipropileno desechables que posteriormente se cargan en un liofilizador. La disolución se enfría a -50 °C. El secado primario se lleva a cabo a 25 °C durante 37 horas. La temperatura se aumenta hasta 300 °C y se lleva a cabo una etapa de secado secundario durante 5,5 horas. Una vez completado el procedimiento de liofilización, la sustancia farmacológica se transfiere a botellas de polietileno de alta densidad y se almacena a -200 °C.
Ácido nucleico diana
El «direcdonamiento» de un compuesto antisentido a un ácido nucleico particular es un procedimiento que puede incluir múltiples etapas. El procedimiento normalmente empieza con la identificación de un ácido nucleico diana cuya función va a modularse. En la presente descripción, el ácido nucleico diana codifica receptor de la hormona de crecimiento (GHR). El término «ácido nucleico diana» abarca ADN que codifica GHR, ARN (a saber, pre-ARNm y ARNm o porciones de los mismos) transcrito a partir de dicho ADN y, además, ADNc derivado de dicho ARN.
El ADNc que codifica el receptor de la hormona de crecimiento ha sido clonado a partir de muchas especies. El receptor consta de una región extracelular de unión a hormonas (exones 2-7), una única región que atraviesa la membrana (exón 8) y una región intracelular (exones 9-10). También existen múltiples regiones 5' no traducidas alternativas que son primeros exones alternativos del gen, tanto en las transcripciones humanas como en las de ratón. El receptor de la hormona de crecimiento no tiene un dominio quinasa intrínseco, pero la región intracelular juega un papel importante en el procedimiento de transducción de señales. Una forma truncada del receptor, conocida como proteína de unión a la hormona de crecimiento (GHBP), carece de las regiones transmembrana e intracelular de GHR y se secreta en el suero. La proteína truncada se produce mediante uno de dos procedimientos diferentes, según la especie animal. En ratones y ratas, el splicing alternativo del ARN mensajero precursor de GHR reemplaza las regiones transmembrana e intracelular por una cola hidrófila muy corta (codificada por el exón 8A). En humanos, vacas y cerdos (entre otros), no se observa ningún splicing de ARN alternativo, sino que la GHBP se produce por proteólisis del GHR. La GHBP parece modular el nivel de hormona de crecimiento (GH) circulante.
En una realización de la presente descripción, el GHR es un GHR humano (hGHR) que tiene una secuencia de nucleótidos como se muestra en NM_000163.4 (SEQ ID NO: 4) o NG_011688 (4852-302955) (SEQ ID NO: 5). El procedimiento de direccionamiento normalmente también incluye la determinación de al menos una región, segmento o sitio diana dentro del ácido nucleico diana para que se produzca la interacción antisentido y que así se consiga el efecto deseado, por ejemplo, la inhibición de la expresión. Tal como se usa en la presente invención, el término «región» se refiere a una porción del ácido nucleico diana que tiene al menos una estructura, función o característica identificable. Dentro de las regiones de los ácidos nucleicos diana hay segmentos. Los «segmentos» se definen como porciones más pequeñas o sub-porciones de regiones dentro de un ácido nucleico diana. El término «sitios», como se usa en la presente invención, significa posiciones dentro del ácido nucleico diana.
Puesto que el «codón de iniciación de la traducción» normalmente es 5'-AUG (en moléculas de ARNm transcrito; 5'-ATG en la molécula de ADN correspondiente), el codón de iniciación de la traducción también se denomina «codón AUG», «codón de iniciación» o «codón de iniciación AUG». Una minoría de genes tienen un codón de iniciación de la traducción que tiene la secuencia de ARN 5'-GUG, 5'-UUG o 5'-CUG; y se ha demostrado que 5'-AUA, 5'-ACG y 5'-CUG funcionan in vivo. Por tanto, las expresiones «codón de iniciación de la traducción» y «codón de inicio» pueden abarcar muchas secuencias de codones aunque el aminoácido iniciador en cada caso sea normalmente metionina (en eucariotas) o formilmetionina (en procariotas). También es sabido en la técnica que los genes eucariotas y procariotas pueden tener dos o más codones de inicio alternativos, y cualquiera de ellos puede utilizarse preferentemente para la iniciación de la traducción en un tipo particular de célula o tejido, o en un conjunto particular de condiciones. En el contexto de la presente invención, los términos «codón de inicio» y «codón de iniciación de la traducción» se refieren al codón o codones que se usanin vivopara iniciar la traducción de un ARNm transcrito de un gen que codifica, por ejemplo, GHR, independientemente de la una o más secuencias de dichos codones.
Un «codón de terminación de la traducción», también denominado «codón de parada», puede tener una de tres secuencias de ARN: 5'-UAA, 5'-UAG y 5'-UGA (5'-TAA, 5'-TAG y 5'-TGA, respectivamente en la molécula de ADN correspondiente). En el contexto de la presente invención, los términos «codón de terminación de la traducción» y «codón de parada» se refieren al codón o codones que se usan in vivo para terminar la traducción de un ARNm transcrito de un gen que codifica el GHR, independientemente de la una o más secuencias de dichos codones. Los términos «región de codón de inicio» y «región de codón de iniciación de la traducción» se refieren a una porción del ARNm o gen que abarca entre alrededor de 25 y alrededor de 50 nucleótidos contiguos en cualquier dirección (es decir, 5' o 3') desde el codón de iniciación de la traducción. De manera similar, los términos «región de codón de parada» y «región de codón de terminación de la traducción» se refieren a una porción del ARNm o gen que abarca entre alrededor de 25 y alrededor de 50 nucleótidos contiguos en cualquier dirección (es decir, 5' o 3') desde el codón de terminación de la traducción. En consecuencia, la «región de codón de inicio» o «región de codón de iniciación de la traducción» y la «región de codón de parada» o «región de codón de terminación de la traducción» son todas las regiones que pueden ser dirigidas de manera eficaz con los compuestos antisentido.
El «marco de lectura abierto» (ORF) o «región de codificación», que en la técnica se refiere a la región entre el codón de iniciación de la traducción y el codón de terminación de la traducción, es una región que también puede ser elegida como diana de forma eficaz. En una realización de la presente descripción, se elige como diana la región intragénica que abarca el codón de iniciación o de terminación de la traducción del ORF de un gen.
Otras regiones diana incluyen la región no traducida 5' (5'UTR), que en la técnica se refiere a la porción del ARNm en la dirección 5' desde el codón de iniciación de la traducción y que incluye, por tanto, nucleótidos entre el sitio caperuza 5' (5' cap) y el codón de iniciación de la traducción del ARNm (o nucleótidos correspondientes en el gen), y la región no traducida 3' (3'UTR), que en la técnica se refiere a la porción del ARNm en la dirección 3' desde el codón de terminación de la traducción y que incluye, por tanto, nucleótidos entre el codón de terminación de la traducción y el extremo 3' del ARNm (o nucleótidos correspondientes en el gen). El sitio caperuza 5' de un ARNm comprende un residuo de guanosina N7-metilado unido al residuo en la posición 5' del último nucleótido del ARNm mediante un enlace trifosfato 5'-5'. Se considera que la región caperuza 5' de un ARNm incluye la propia estructura de caperuza 5', además de los primeros 50 nucleótidos adyacentes al sitio caperuza. En una realización de la presente descripción, se elige como diana la región caperuza 5'.
Aunque algunas transcripciones de ARNm eucariotas se traducen directamente, muchas contienen una o más regiones, conocidas como «intrones», que se suprimen de una transcripción antes de que se traduzca. Las regiones restantes (y, por lo tanto, traducidas) se conocen como «exones» y se ensamblan mediante splicing para formar una secuencia de ARNm continua. Las transcripciones de ARNm producidas mediante el procedimiento de splicing de dos (o más) ARNm de diferentes fuentes génicas se conocen como «transcripciones de fusión». En una realización de la presente descripción, se eligen como diana intrones o sitios de splicing, es decir, uniones intrón-exón o uniones exónintrón, o uniones de fusión aberrantes debido a reordenamientos o eliminaciones.
Pueden producirse transcripciones de ARN alternativas a partir de la misma región genómica de ADN. Estas transcripciones alternativas son generalmente conocidas como «variantes».
Las «variantes de pre-ARNm» son transcripciones producidas a partir del mismo ADN genómico que difieren de otras transcripciones producidas a partir del mismo ADN genómico ya sea en su posición de inicio o de parada y contienen secuencia tanto intrónica como exónica. Tras la supresión de una o más regiones de exón o intrón, o porciones de las mismas durante el splicing, las variantes de pre-ARNm producen «variantes de ARNm» más pequeñas. En consecuencia, las variantes de ARNm son variantes de pre-ARNm procesadas y cada variante de pre-ARNm única siempre debe producir una variante de ARNm única como resultado del splicing. Estas variantes de ARNm también se conocen como «variantes de splicing alternativas». Si no se produce el splicing de la variante de pre-ARNm, entonces la variante de pre-ARNm es idéntica a la variante de ARNm.
En ratones, ratas y monos, la GHBP, que es la forma abreviada soluble del GHR, se produce mediante splicing alternativo de la transcripción primaria del GHR. En algunas realizaciones de la presente descripción, puede ser preferible elegir como diana regiones de la transcripción que están presentes tanto en la transcripción del GHR como en la transcripción abreviada de la GHBP. En otras realizaciones de la presente descripción, puede ser preferible elegir como diana regiones del ARNm que únicamente están presentes en la transcripción más larga del GHR. En seres humanos, vacas y cerdos (entre otros), no se observa splicing de ARN alternativo, pero, en su lugar, se produce GHBP abreviada por proteólisis del GHR. Se entenderá que en el contexto de la presente descripción, «ácido nucleico que codifica GHR» incluye ácido nucleico que codifica GHBP.
Las variantes pueden producirse mediante el uso de señales alternativas para iniciar o detener la transcripción, es decir, mediante el uso de un codón de inicio o codón de parada alternativo. Las variantes que se originan a partir de un pre-ARNm o ARNm que usan codones de iniciación alternativos se conocen como «variantes de inicio alternativas» de ese pre-ARNm o ARNm. Aquellas transcripciones que usan un codón de parada alternativo se conocen como «variantes de parada alternativas» de ese pre-ARNm o ARNm. Un tipo específico de variante de parada alternativa es la «variante de poliA», en la que las múltiples transcripciones producidas resultan de la selección alternativa de una de las «señales de parada de poliA» por la maquinaria de transcripción, produciendo de este modo transcripciones que terminan en sitios de poliA únicos. En una realización de la presente descripción, se eligen como diana las variantes de pre-ARNm o ARNm. El GHR humano tiene varias variantes de transcripción que se pueden identificar en el Centro Nacional de Información Biotecnológica de EE. UU. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/ y otros sitios web http://www.uniprot.org/uniprot/ P10912 # PRO_0000010958. Además, existen secuencias alternativas y secuencias de variantes naturales de estas transcripciones.
La ubicación en el ácido nucleico diana con el que se híbrida el compuesto antisentido se denomina «segmento diana». Como se usa en la presente invención, el término «segmento diana» se define como al menos una porción de 8 nucleobases de una región diana a la que se dirige un compuesto antisentido. Sin desear ceñirse a la teoría, actualmente se cree que estos segmentos diana representan porciones del ácido nucleico diana a las cuales se puede acceder para hibridación.
Una vez que se han identificado una o más regiones, segmentos o sitios diana, se eligen compuestos antisentido que sean suficientemente complementarios a un segmento diana, es decir, compuestos antisentido que se hibriden suficientemente bien y con suficiente especificidad, para proporcionar el efecto deseado.
En una realización adicional de la presente descripción, el segmento diana identificado en la presente invención puede emplearse en un cribado para compuestos adicionales que modulen la expresión del gen del GHR (y, por tanto, la expresión del GHR). Los «moduladores» son aquellos compuestos que disminuyen o aumentan la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica GHR y que comprenden al menos una porción de 8 nucleobases que es complementaria a un segmento diana preferido.
El procedimiento de cribado comprende las etapas de poner en contacto un segmento diana del ácido nucleico que codifica GHR con uno o más moduladores candidatos, y seleccionar uno o más moduladores candidatos que disminuyen o aumentan la expresión de un ácido nucleico que codifica GHR. Una vez que se demuestra que el modulador o moduladores candidatos son capaces de modular (por ejemplo, tanto disminuir como aumentar) la expresión de un ácido nucleico que codifica GHR, el modulador puede entonces emplearse en estudios de investigación adicionales de la función del GHR, o como agente de investigación, diagnóstico o terapéutico.
El segmento diana también puede combinarse con su respectivo compuesto antisentido complementario para formar oligonucleótidos bicatenarios (duplexados) estabilizados.
Se ha demostrado en la técnica que dichos restos de oligonucleótido bicatenario modulan la expresión de la diana y regulan la traducción además del procesamiento de ARN mediante un mecanismo antisentido. Asimismo, los restos bicatenarios pueden estar sujetos a modificaciones químicas (Fire et al., 1998; Timmons y Fire, 1998; Timmons et al., 2001; Tabara et al., 1998; Montgomery et al., 1998; Tuschl et al., 1999; Elbashir et al., 2001a; Elbashir et al., 2001b). Por ejemplo, se ha demostrado que dichos restos bicatenarios inhiben la diana mediante la hibridación clásica de cadena antisentido del dúplex con la diana, desencadenando de este modo la degradación enzimática de la diana (Tijsterman et al., 2002).
Ácidos nucleicos diana ejemplares
En la Tabla 2 se muestran ejemplos de secuencias diana.
Tabla 2: Secuencia y posición de los segmentos diana preferidos identificados en el receptor de la hormona de crecimiento
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Composiciones/Formulaciones
Los compuestos antisentido útiles para los procedimientos de la presente descripción pueden mezclarse, encapsularse, conjugarse o asociarse de otra manera con otras moléculas, estructuras de moléculas o mezclas de compuestos, produciendo como resultado, por ejemplo, liposomas, moléculas dirigidas a receptores, formulaciones orales, rectales, tópicas u otras, para contribuir con la captación, distribución y/o absorción.
Entre las patentes de EE. UU. representativas que explican la preparación de dichas formulaciones que contribuyen con la captación, distribución y/o absorción se incluyen, sin carácter restrictivo, US 5.108.921, US 5.354.844, US 5.416.016, US 5.459.127, US 5.521.291, US 5.543.158, US 5.547.932, US 5.583.020, US 5.591.721, US 4.426.330, US 4.534.899, US 5.013.556, US 5.108.921, US 5.213.804, US 5.227.170, US 5.264.221, US 5.356.633, US 5.395.619, US 5.416.016, US 5.417.978, US 5.462.854, US 5.469.854, US 5.512.295, US 5.527.528, US 5.534.259, US 5.543.152, US 5.556.948, US 5.580.575, y US 5.595.756.
Los compuestos antisentido se pueden administrar en un vehículo farmacéuticamente aceptable. El término «vehículo farmacéuticamente aceptable» se refiere a entidades moleculares que no producen una reacción alérgica, tóxica o adversa de otro modo cuando se administran a un sujeto, particularmente a un mamífero, y más particularmente a un ser humano. El vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser sólido o líquido. Los ejemplos útiles de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, sin carácter restrictivo, diluyentes, disolventes, tensioactivos, excipientes, agentes de suspensión, agentes tamponantes, agentes lubricantes, adyuvantes, vehículos, emulsionantes, absorbentes, medios de dispersión, revestimientos, estabilizadores, coloides protectores, adhesivos, espesantes, agentes tixotrópicos, agentes de penetración, agentes secuestrantes, agentes isotónicos y retardadores de la absorción que no afectan la actividad de los agentes activos de la descripción.
Los compuestos antisentido pueden ser sales farmacéuticamente aceptables, ésteres o sales de los ésteres, o cualquier otro compuesto que, tras la administración, sea capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biológicamente activo.
En la presente invención, la expresión «sales farmacéuticamente aceptables» se refiere a sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de los compuestos antisentido que conservan las actividades biológicas deseadas de los compuestos parentales y que no confieren efectos toxicológicos no deseados tras la administración. Los ejemplos preferidos de sales farmacéuticamente aceptables y sus usos se describen adicionalmente en el documento US 6.287.860.
Los compuestos antisentido pueden ser profármacos o sales farmacéuticamente aceptables de los profármacos, u otros bioequivalentes.
En la presente invención, el término «profármaco» se refiere a agentes terapéuticos que se preparan en una forma inactiva que se convierte en una forma activa (es decir, un fármaco) tras la administración mediante la acción de enzimas endógenas u otros químicos y/o condiciones. En particular, las formas de profármaco de los compuestos antisentido se preparan como derivados de SATE [(S-acetil-2-tioetil)fosfato] de acuerdo con los procedimientos descritos en las publicaciones internacionales WO 93/24510, WO 94/26764 y Us 5.770.713.
Los agonistas de somatostatina se pueden administrar en un vehículo farmacéuticamente aceptable. El vehículo debe ser «aceptable» en el sentido de ser compatible con el/los ingrediente/s activo/s de la formulación (por ejemplo, capaz de estabilizar péptidos) y no perjudicial para el sujeto que se va a tratar. Idealmente, la formulación no debería incluir agentes oxidantes u otras sustancias con las que se sepa que los péptidos son incompatibles. Por ejemplo, los agonistas de somatostatina en forma ciclada (por ejemplo, enlace disulfuro de cisteína interno) se oxidan; por tanto, la presencia de agentes reductores como excipientes podría dar pie a una apertura del puente disulfuro de cisteína. Por otro lado, las condiciones altamente oxidativas pueden dar pie a la formación de sulfóxido de cisteína y a la oxidación de triptófano. En consecuencia, es importante seleccionar cuidadosamente el excipiente. El pH es otro factor clave y puede ser necesario tamponar el producto en condiciones ligeramente ácidas (pH 5 a 6).
Las formulaciones se pueden presentar convenientemente en forma de dosificación unitaria y se pueden preparar mediante cualquier procedimiento bien conocido en la técnica de farmacia. Todos los procedimientos incluyen la etapa de asociar el ingrediente o ingredientes activos con el vehículo que constituye uno o más ingredientes auxiliares. En general, las formulaciones para comprimidos o polvos se preparan mezclando uniforme e íntimamente el ingrediente activo con vehículos sólidos finamente divididos y, a continuación, si fuera necesario, como en el caso de los comprimidos, moldeando el producto con la forma y tamaño deseados.
Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral (por ejemplo, intravenosa), por otro lado, comprenden convenientemente disoluciones acuosas estériles del ingrediente o ingredientes activos. Preferentemente, las disoluciones son isotónicas con la sangre del sujeto que se va a tratar. Tales formulaciones se pueden preparar convenientemente disolviendo el ingrediente o ingredientes activos en un disolvente que comprende agua para producir una disolución acuosa, y esterilizando dicha solución. La formulación puede presentarse en envases unitarios o multidosis, por ejemplo, ampollas o viales sellados.
Las formulaciones adecuadas para administraciones parenterales de liberación sostenida (por ejemplo, formulaciones poliméricas biodegradables) también son bien conocidas en la técnica (véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU N.° 3.773.919 y 4.767.628 y la publicación PCT N.° WO 94/15587).
Las composiciones para administración rectal o vaginal son preferentemente supositorios que pueden contener, además del principio activo, excipientes tales como manteca de cacao o cera de supositorio.
Las composiciones para administración nasal o sublingual también se preparan con excipientes estándar bien conocidos en la técnica.
Para la administración tópica, las mejores formas de utilización son las disoluciones, cremas, pomadas, lociones, ungüentos y similares.
Administración
Los procedimientos de la presente descripción se basan en la actividad adicional y/o sinergia insospechada de combinar un análogo de la somatostatina que tiene actividad agonista del receptor de la somatostatina con un oligonucleótido dirigido al receptor de la hormona de crecimiento (GHR) para reducir el factor de crecimiento análogo a la insulina I (IGF-I) en un sujeto.
En una realización particular de la presente descripción, el agonista de somatostatina y el oligonucleótido se administran de forma concomitante. El agonista de somatostatina y el oligonucleótido se pueden administrar en forma de una composición que comprende una mezcla de ambos componentes. Como alternativa, el agonista de somatostatina y el oligonucleótido se pueden administrar en composiciones separadas.
En una realización de la presente descripción, el oligonucleótido antisentido se administra de forma sistémica. Como se usa en la presente invención, «administración sistémica» es una vía de administración que es o bien enteral o parenteral.
Como se usa en la presente invención, «enteral» se refiere a cualquier forma de administración que implica cualquier parte del tracto gastrointestinal e incluye la administración oral de, por ejemplo, el oligonucleótido antisentido en forma de comprimido, cápsula o gota; sonda de alimentación gástrica, sonda de alimentación duodenal o gastrostomía; y administración rectal de, por ejemplo, el compuesto antisentido en forma de supositorio o enema.
Tal como se usa en la presente invención, «parenteral» incluye la administración por inyección o infusión. Entre los ejemplos de vías de administración se incluyen las siguientes: intravenosa (en una vena), intraarterial (en una arteria), intramuscular (en un músculo), intracardíaca (en el corazón), subcutánea (debajo de la piel), infusión intraósea (en la médula ósea), intradérmica, (en la propia piel), intratecal (en el canal espinal), intraperitoneal (infusión o inyección en el peritoneo), intravesical (infusión en la vejiga urinaria), transdérmica (difusión a través de la piel intacta), transmucosa (difusión a través de una membrana mucosa), inhalada.
El oligonucleótido antisentido se puede administrar como dosis única o como dosis repetidas de forma periódica, por ejemplo, diariamente, una vez cada dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece o catorce días, una vez por semana, dos veces por semana, tres veces por semana, o cada dos semanas, cada tres semanas o cada cuatro semanas.
El oligonucleótido antisentido que se usará en la terapia se formula y administra de manera compatible con las buenas prácticas médicas, teniendo en cuenta la afección específica que se está tratando, el estado clínico del paciente en cuestión, el lugar de administración del oligonucleótido, el procedimiento de administración, la programación de la administración y otros factores conocidos por los profesionales. Por tanto, la «cantidad efectiva» de oligonucleótido a los efectos de la presente invención se determina en función de dichas consideraciones. En este contexto, el término «cantidad eficaz» se refiere a cualquier dosis del oligonucleótido antisentido suficiente para inhibir la expresión del GHR, en las condiciones de administración.
A modo de ejemplo, se puede administrar a un sujeto una dosis de oligonucleótido de 25-3.400 mg, más preferentemente de 50-1.600 mg, durante una semana. Para seres humanos se contempla, en particular, una dosis única de 150-400 mg, por ejemplo, una dosis de 250 mg. En una realización de la presente descripción, se administra una dosis de 250 mg por día seis veces durante 3 semanas, los días 1, 3, 5, 7, 14 y 21 o dos veces por semana. En otra realización de la presente descripción, se administra una dosis de 250 mg una vez a la semana o una vez cada quince días.
Los agonistas de somatostatina se pueden inyectar por vía parenteral, por ejemplo, por vía intravenosa, en el torrente sanguíneo del sujeto que se está tratando. Sin embargo, los expertos en la materia apreciarán fácilmente que la vía de administración, tal como subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, enteral, transdérmica, transmucosa, composiciones poliméricas de liberación sostenida (por ejemplo, un polímero de ácido láctico o una micropartícula o implante de copolímero de ácido láctico-glicólico), profusión, nasal, oral, tópica, vaginal, rectal, nasal, sublingual, etc., variará con la afección que se esté tratando y con la actividad y biodisponibilidad del agonista de somatostatina que se esté usando.
Aunque es posible administrar el agonista de somatostatina como el compuesto puro o sustancialmente puro, también puede presentarse como una formulación o preparación farmacéutica. Las formulaciones que se utilizarán en la presente descripción, tanto para seres humanos como para animales, comprenden cualquiera de los agonistas de somatostatina descritos en la presente, junto con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables de los mismos, y opcionalmente otros ingredientes terapéuticos.
El agonista de somatostatina puede administrarse, por ejemplo, mediante infusión continua (por ejemplo, por medio de minibombas tales como bombas osmóticas), o mediante inyección, por ejemplo, por vía intravenosa o subcutánea. En una realización de la presente descripción, el agonista de somatostatina se administra por vía subcutánea. La administración también puede ser mediante un bolo único o mediante una formulación de depósito de liberación lenta. La administración también puede ser por vía oral, usando, por ejemplo, Octreolin™ (acetato de octreotida oral). El agonista de somatostatina que se usará en la terapia se formula y administra de manera compatible con las buenas prácticas médicas, teniendo en cuenta la afección específica que se está tratando, el estado clínico del paciente en cuestión, el lugar de administración de la composición de agonista de somatostatina, el procedimiento de administración, la programación de la administración y otros factores conocidos por los profesionales. Por tanto, la «cantidad efectiva» de agonista de somatostatina a los efectos de la presente invención se determina en función de dichas consideraciones. En este contexto, el término «cantidad eficaz» se refiere a cualquier dosis del análogo de la somatostatina suficiente para mediar en la actividad agonista del receptor de la somatostatina, en las condiciones de administración.
Es posible variar la dosificación de ingrediente activo administrada en un procedimiento de esta descripción; sin embargo, es necesario que la cantidad de ingrediente activo sea la apropiada para obtener una forma de dosificación adecuada. La dosificación seleccionada depende del efecto terapéutico deseado, de la vía de administración, y de la duración del tratamiento. En general, a los seres humanos y a otros animales, por ejemplo, mamíferos, se les administran niveles de dosificación que oscilan entre 0,000001 y 100 mg/kg de peso corporal por día.
Un intervalo de dosificación preferido es entre 0,01 y 5,0 mg/kg de peso corporal por día, pudiéndose administrar dicha cantidad como dosis única o repartida en varias dosis.
El agonista de somatostatina se puede administrar como dosis única o como dosis repetidas de forma periódica, por ejemplo, varias veces al día, diariamente, una vez cada dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece o catorce días, una vez por semana, dos veces por semana, tres veces por semana, o cada dos semanas, cada tres semanas o cada cuatro semanas.
En una realización de la presente descripción, el agonista de somatostatina se selecciona de entre cualquiera de las formas LAR, por ejemplo, Sandostatin-LAR, Lanreotide Autogel, pasireotida-LAR o micropartículas de lanreotida y el oligonucleótido es ATL1103 (SEQ ID NO: 6) y los compuestos se administran secuencialmente. En una realización de la presente descripción, el oligonucleótido ATL1103 se administra primero con una dosis de 250 mg/día los días 1, 3, 5, 7, 14 y 21 y, a partir de entonces, una vez por semana (durante 5 a 12 semanas) y el agonista de somatostatina se administra posteriormente los mismos días con la dosis de 20 mg/28 días para Sandostatin-LAR, 90 mg/28 días para Lanreotide Autogel, 40 mg/28 días para pasireotida-LAR y 20 mg/semana para micropartículas de lanreotida o con dosis superiores de 30 mg/28 días para Sandostatin-LAR, o 120 mg/28 días para Lanreotide Autogel, o 60 mg/día para pasireotida-LAR o 60 mg/3 semanas para micropartículas de lanreotida.
Después de las 5 a 12 semanas, se puede continuar el tratamiento (ciclo 2) con dosis iguales, mayores o menores del agonista de somatostatina mencionado, y con dosis iguales, mayores o menores de ATL1103, y con una frecuencia de dosificación igual, mayor o menor para lograr los niveles objetivo deseados de IGF-I. Después de las 5 a 12 semanas, se puede pasar de la dosis baja a la dosis alta de agonista de somatostatina y controlar en aproximadamente 1 a 4 semanas para evaluar los niveles de IGF-I. Después de las 5 a 12 semanas, la modificación de la dosis de ATL1103 puede consistir en incrementos de alrededor de 25, 50 mg o 100 mg y se puede controlar en alrededor de 1 a 8 semanas para evaluar los niveles de IGF-I. Se puede continuar con el ciclo 2 si se logra la normalización del IGF-I diana o iniciar un nuevo ciclo para optimizar aún más la dosificación con el fin de conseguir la normalización del IGF-I paciente por paciente.
Como alternativa, el oligonucleótido ATL1103 se puede administrar una o dos veces por semana (durante 8 a 12 semanas) con dosis de 150, 200, 250, 300 o 350 mg junto con las dosis mencionadas de los agonistas de somatostatina. Después de las 8 a 12 semanas, se puede continuar el tratamiento (ciclo 2) con dosis iguales, mayores o menores del agonista de somatostatina mencionado, y con dosis iguales, mayores o menores de ATL1103, y con una frecuencia de dosificación igual, mayor o menor para lograr los niveles objetivo deseados de IGF-I. Se puede continuar con el ciclo 2 si se logra la normalización del IGF-I diana o iniciar un nuevo ciclo para optimizar aún más la dosificación con el fin de conseguir la normalización del IGF-I paciente por paciente.
En otra realización de la presente descripción, se puede usar un ciclo de tratamiento de repetición de 21 días, para el tratamiento de cáncer o retinopatía. El oligonucleótido ATL1103 se administra primero con una dosis de 250 mg/día los días 1, 3, 5, 7, 14 y 21, y el agonista de somatostatina mencionado se administra posteriormente los mismos días con una de las dosis mencionadas. Como alternativa, en un ciclo de repetición, la dosificación del oligonucleótido ATL1103 puede ser 250, 300 o 350 mg una o dos veces por semana junto con una de las dosis de agonista de somatostatina mencionadas comenzando el mismo día. Como alternativa, los tratamientos pueden proporcionarse en días diferentes.
Después de las 5 a 12 semanas, se puede continuar el tratamiento (ciclo 2) con dosis iguales, mayores o menores del agonista de somatostatina, y con dosis iguales, mayores o menores de ATL1103, y con una frecuencia de dosificación igual, mayor o menor para lograr los niveles objetivo deseados de IGF-I y los resultados de tratamiento para cáncer o retinopatía. Después de las 5 a 12 semanas, se puede modificar la dosis de agonista de somatostatina pasando de la dosis baja a la dosis alta y controlar en alrededor de 1 a 4 semanas para evaluar los niveles de IGF-I. Después de las 5 a 12 semanas, la modificación de la dosis de ATL1103 puede consistir en incrementos de alrededor de 25, 50 o 100 mg y se puede controlar en alrededor de 1 a 8 semanas para evaluar los niveles de IGF-I. Se puede continuar con el ciclo 2 si se logra la normalización del IGF-I diana o iniciar un nuevo ciclo para optimizar aún más la dosificación con el fin de conseguir la normalización del IGF-I paciente por paciente.
En otra realización de la presente descripción, el fármaco ATL1103 se puede administrar una, dos, tres veces por semana, día por medio o diariamente con dosis de 100, 200, 250, 300, 350 o 400 mg/día y el acetato de octreotida de somatostatina se puede administrar diariamente, dos veces al día o tres veces al día con los mg/día recomendados, o el Octreolin™ de somatostatina se puede administrar con la dosis recomendada de 40, 60 u 80 mg/día, o se pueden administrar las micropartículas de lanreotida, octreotida-LAR, lanreotida-LAR, pasireotida-LAR según lo recomendado. En otra realización de la presente descripción, el oligonucleótido ATL1103 se administra primero con una de las dosis mencionadas una vez cada dos semanas y las micropartículas de lanreotida de somatostatina se administran posteriormente a semanas alternas, de modo que el paciente tenga un régimen de dosificación alterno de una vez a la semana, primero de ATL1103 y luego de micropartículas de lanreotida. En una realización similar de la presente descripción, las micropartículas de lanreotida y el ATL1103 también pueden combinarse en una mezcla y administrarse el mismo día. Por ejemplo, el ATL1103 en una disolución en una jeringa precargada se puede agregar a las micropartículas de lanreotida y la mezcla se puede administrar al sujeto.
Los agonistas de somatostatina tales como Octreolin, lanreotida, pasireotida y octreotida se administran en formas de acción corta, media o prolongada para lograr dosificaciones eficaces como se indicó anteriormente a modo de ejemplo. En una realización de la presente descripción, el ATL1103 (SEQ ID NO: 6) se administra en una dosis que varía de 4 mg/kg semana a 12 mg/kg/semana. En una realización de la presente descripción, de 4 mg/kg/semana a 8 mg/kg/semana, o de 5 mg/kg/semana a 10 mg/kg/semana. En algunas realizaciones de la presente descripción, se contemplan dosis de 3,5 mg/kg/semana, 4 mg/kg/semana, 4,5 mg/kg/semana, 5 mg/kg/semana, 5,5 mg/kg/semana, 6 mg/kg/semana, 6,5 mg/kg/semana, 7 mg/kg/semana, 7,5 mg/kg/semana, 8 mg/kg/semana, 8,5 mg/kg/semana, 9 mg/kg/semana, 9,5 mg/kg/semana, 10 mg/kg/semana, 10,5 mg/kg/semana, 11 mg/kg/semana, 11,5 mg/kg/semana, 12 mg/kg/semana.
Como se describe en el Ejemplo 11, el ATL1103 es eficaz para reducir el sIGF-I con una dosificación de 200 mg dos veces por semana y se tolera bien. Hubo una reducción media del 30 % en el sIGF-I en comparación con el valor inicial en los 4 pacientes con acromegalia tratados con 200 mg dos veces por semana, y una reducción media del 38 % en los 3 pacientes tratados que tenían un peso corporal inferior a 85 kg. Como el fármaco es bien tolerado, se propone una dosificación de más de 200 mg dos veces por semana a 250 mg dos veces por semana, 300 mg dos veces por semana, o 200 mg, 250 mg y 300 mg tres veces por semana. En algunas realizaciones de la presente descripción, se emplea la dosificación de 200, 250, 300, 350 una vez por semana y 200 mg día por medio, o incluso 100 mg o 150 mg todos los días.
Para tratar pacientes con acromegalia que no han logrado normalizar su sIGF-I mediante terapia de primera línea con somatostatina, en la presente invención se propone emplear combinaciones con dosis de 200 mg, 250 mg, 300 mg y 350 mg de ATL1103 una vez por semana, así como todas las dosis e intervalos de dosificación descritos anteriormente junto con tratamientos con agonistas de somatostatina. Los pacientes con acromegalia tratados mediante terapia con agonistas de somatostatina para normalizar su sIGF-I al límite superior de la normalidad también pueden ser tratados combinando dicha terapia con ATL1103 para obtener beneficios adicionales.
Se contemplan formas de dosificación unitaria de oligonucleótido que comprenden 50 mg, 100 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg y 400 mg de oligonucleótido. En particular, se contemplan formas de dosificación unitaria de ATL1103 que comprenden 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg.
EJEMPLOS
Los ejemplos que no se encuentren dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forman parte de la invención. Ejemplo 1: Ensayo de fase I del fármaco dirigido al GHR ATL1103.
El objetivo principal del ensayo de fase I fue evaluar la seguridad, tolerabilidad y farmacocinética (pK) de ATL1103. El ensayo de fase I fue un estudio aleatorizado, controlado con placebo, doble ciego de dosis únicas ascendentes y dosis múltiples de ATL1103 en sujetos varones adultos sanos de entre 18 y 45 años. En la etapa de dosis únicas ascendentes del ensayo, a 24 sujetos se les administraron cuatro niveles de dosis de ATL1103 como una inyección única comenzando con 25 mg y aumentando a 75, 250 y 400 mg o placebo. La etapa de dosis múltiple se llevó a cabo en 12 sujetos, 8 que iban a recibir seis dosis subcutáneas de 250 mg de ATL1103 y 4 sujetos que recibieron placebo administrado los días 1, 3, 5, 7, 14 y 21. Los sujetos fueron controlados hasta el día 35.
Es importante destacar que no se informó sobre reacciones adversas graves en este ensayo. Dos sujetos del grupo de dosis múltiples abandonaron el estudio por razones no relacionadas con la seguridad. Se informó que todas las reacciones adversas fueron de «leves a moderadas». Las reacciones en el lugar de la inyección representaron la mayoría de todas las reacciones adversas sobre las que se informó en el ensayo. Se informó sobre una elevación en la enzima hepática ALT como reacción adversa en la etapa de dosis múltiples. Es importante destacar que los niveles de ALT en este sujeto volvieron a la normalidad durante la fase de dosificación, lo que sugiere que no existe un efecto residual o acumulativo del fármaco en este parámetro de seguridad.
Un objetivo secundario de este estudio fue obtener datos sobre los efectos farmacodinámicos del ATL1103 sobre los niveles de IGF-I en la sangre de los sujetos del ensayo. La reducción de los niveles aumentados de IGF-I sérico a la normalidad constituye el criterio de valoración terapéutico en el tratamiento del trastorno de crecimiento acromegalia, y la reducción de los efectos del IGF-I tiene un papel potencial en el tratamiento de la retinopatía diabética, la nefropatía y ciertas formas de cáncer.
Como se definió en el plan de análisis estadístico, el efecto del ATL1103 sobre el IGF-I sérico se evaluó como un cambio en los niveles de IGF-I respecto de las lecturas iniciales (punto de partida) para aquellos sujetos que recibieron tratamiento (ATL1103). Los niveles de referencia de IGF-I previos a la dosis se registraron antes del comienzo de la dosificación y, posteriormente, se midieron a intervalos semanales hasta el final del período de seguimiento. Este grupo tratado mostró una tendencia a la reducción de los niveles de IGF-I desde el día 14 hasta el día 28, y se observó un efecto significativo (p = 0,034 prueba t unilateral) el día 21 con una reducción del 7 % en los niveles medios de IGF-I respecto de los valores iniciales.
Otros objetivos exploratorios del estudio investigaron el mecanismo de acción y el perfil farmacológico más amplio del fármaco, a saber, los efectos farmacodinámicos sobre los niveles de proteína de unión a la hormona de crecimiento (GHBP), proteína de unión al factor de crecimiento análogo a la insulina 3 (IGFBP-3), subunidad ácido-lábil (ALS) del complejo de proteínas de unión al factor de crecimiento análogo a la insulina, y hormona de crecimiento (GH), así como parámetros mitogénicos y apoptóticos in vitro.
En particular, el ATL1103 tuvo un efecto significativo en la reducción de la GHBP en un 16 % (p = 0,007) el día 21 y en un 19 % (p <0,05) el día 28, una semana después de la última dosis. Como la GHBP circulante se produce por escisión del GHR, la reducción de los niveles de GHBP circulante sugiere que la expresión del GHR se está reduciendo. El ATL1103 también redujo significativamente la IGFBP-3 y la ALS, ambas acordes con su efecto sobre el IGF-I y con el hecho de que están reguladas por la GH. No hubo ningún efecto sobre los niveles de GH. Los detalles y resultados específicos de los ensayos se resumen en las Tablas 3-6.
T l : R m n l n líni f I l ATL11
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T l 4: R m n r m r f rm in i m i ± DE
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T l : Niv l I F-I ri n r n ATL11 n l E B
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T l : Ev l i n PD x l r ri n ATL11 n l E B
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Ejemplo 2: Estudio en ratones con terapia combinada y monoterapia con ATL1103.
Antecedentes y diseño del estudio
• A ratones hembra normales (N = 8 por grupo) se les inyectó, durante 3 semanas, solución salina, ATL1103 (2 dosis), Somavert (2 dosis) y acetato de octreotida (1 dosis), y se analizó cuando se usaron solos (monoterapia) y combinados con ATL1103.
• Los valores de IGF-I sérico se controlaron cada semana durante 3 semanas y los niveles relativos de ARN de GHR y ARN de IGF-I hepáticos se determinaron a las 3 semanas de la dosificación.
• El Somavert y la octreotida son tratamientos medicinales actuales para combatir la acromegalia y las dosis utilizadas en este estudio con ratones han demostrado previamente que son activas en estudios con roedores publicados anteriores.
• Se ha demostrado previamente que el ATL1103, con la dosis más alta utilizada en este estudio, está activo en ratones a las 3 semanas, reduciendo el ARN de GHR y el IGF-I sérico a las 3 semanas.
• En ratones normales, el hígado es la principal fuente de IGF-I en la sangre y contribuye con alrededor del 70 % del IGF-I sérico.
• Los datos de ARN de GHR e IGF-I se analizaron estadísticamente usando la prueba ANOVA unidireccional seguida de la prueba de Dunnett cuando se comparó el control tratado con el de solución salina. Los datos de sIGF-I se analizaron estadísticamente utilizando la prueba ANOVA unidireccional y haciendo comparaciones por pares.
• El objetivo del estudio fue evaluar los efectos de la monoterapia frente a un enfoque combinado (ATL1103 combinado con los otros tratamientos existentes) en ratones como guía del beneficio clínico potencial de los tratamientos combinados.
Los principales resultados del estudio para los grupos de tratamientos con monoterapia y combinado son los siguientes: Resultados del tratamiento con monoterapia:
• El ATL1103 (25 mg/kg, 2 veces por semana) redujo el ARN de GHR hepático (99,7 %, p=0,001), el ARN de IGF-I (76,2 % , p=0,001) hepático, y el iGF-I sérico (44,5 %, p=0,003) en la semana 3 en comparación con el control de solución salina, y se produjeron reducciones de sIGF-I similares en las semanas 1 (36,5 %, p=0,0070) y 2 (41,5 %, p=0,004) en comparación con el control de solución salina.
• Las dosis inferiores de ATL1103 (12 mg/kg, 3 veces la primera semana y, a continuación, 2 veces por semana durante dos semanas) reducen el ARN de GHR hepático (99 %, p=0,001), y el Ar N de IGF-I hepático (64,3 %, p=0,001) en la semana 3.
• La octreotida (1,25 mg/kg, 2 veces al día) redujo el ARN de GHR hepático (82,9 %, p=0,001), el ARN de IGF-I hepático (47,7 %, p=0,05), y el IGF-I sérico (25,2 %, p=0,03) en la semana 3 en comparación con el control de solución salina, y se produjeron reducciones de sIGF-I similares desde la semana 1 (25,1 %, p=0,012).
• El ATL1103 reduce el ARN de GHR y el ARN de IGF-I hepáticos a niveles inferiores a los alcanzados con octreotida con las dosis empleadas en este estudio.
• Somavert (20 mg/kg, día por medio) redujo el ARN de GHR hepático (79,9 %, p=0,01) y el ARN de IGF-I hepático (43,2 %, p=0,05) en la semana 3 en comparación con el control de solución salina. (NB: Según el ensayo de sIGF-I, los niveles de sIGF-I en muestras tratadas con Somavert mostraron un aumento del doble en la semana 1 con la dosis más alta de Somavert. Se esperaba que Somavert redujera el sIGF-I en este estudio, lo cual sugiere que hubo un problema con el ensayo y, por lo tanto, no se proporcionan en la presente invención otros datos de sIGF-I con Somavert). Somavert con la dosis más baja (5 mg/kg, día por medio) aumentó el ARN de GHR hepático (23 %, p = 0,05), y no se registró ningún efecto sobre el ARN de IGF-I hepático en comparación con el control de solución salina.
• El ATL1103 reduce los niveles de ARN de GHR y de ARN de IGF-I hepáticos a niveles inferiores a los alcanzados con la dosis elevada de Somavert empleada en este estudio.
Resultados del tratamiento combinado
• Las combinaciones de ATL1103 (25 mg/kg, 2 veces por semana) con octreotida (1,25 mg/kg dos veces al día) redujeron de manera significativa el Ar N de GHR (99,5 %, p=0,001), el ARN de IGF-I (76 %, p=0,001), y el sIGF-I (42,3 %, p=0,005), en comparación con el control de solución salina en la semana 3.
• La combinación de ATL1103 con octreotida demostró una mayor actividad en comparación con la monoterapia con octreotida en cada uno de estos parámetros. La combinación no demostró actividad adicional en comparación con la monoterapia con ATL1103 en la semana 3 en este estudio con ratones.
• Las combinaciones de ATL1103 (25 mg/kg, 2 veces por semana) con octreotida (1,25 mg/kg dos veces al día) en la semana 1 mostraron una reducción significativa del sIGF-I (44 %, p<0,002), en comparación con los niveles de control iniciales. La monoterapia con ATL1103 (25 mg/kg, 2 veces por semana) en la semana 1 mostró una reducción del sIGF-I del 25 %, p<0,013, en comparación con los niveles de control iniciales y la octreotida (1,25 mg/kg dos veces al día) redujo el sIGF-I (15 %, p<0,04), en comparación con los niveles de control iniciales.
• En la primera semana, la combinación de ATL1103 con octreotida mostró que el ATL1103 era significativamente capaz de disminuir aún más la reducción de sIGF-I por parte de la octreotida y la octreotida era capaz de disminuir aún más la reducción de sIGF-I por parte del ATL1103 con las dosis únicas probadas. Esto mostró que la combinación producía un efecto adicional en comparación con la monoterapia.
• La combinación de una dosis baja de ATL1103 con una dosis activa elevada de Somavert redujo el ARN de GHR hepático (99,5 %, p=0,001), el ARN de IGF-I hepático (86,6 %, p=0,001), en comparación con la solución salina en la semana 3. La combinación de una dosis elevada de ATL1103 con Somavert redujo el ARN de GHR hepático (99.8 %, p=0,001), el ARN de IGF-I (87,6 %, p=0,001), en comparación con la solución salina de control en la semana 3. • Las combinaciones de ATL1103 (dosis más baja y más alta) con la dosis activa más alta de Somavert (20 mg/kg, día por medio) a las 3 semanas mostraron reducciones adicionales del ARN de IGF-I hepático que fueron estadísticamente significativas en comparación con la monoterapia con ya sea ATL1103 o Somavert. Esto se observó mediante un análisis estadístico de estructura factorial y una prueba t. También se observó una reducción adicional estadísticamente significativa en el nivel de ARN de GHR hepático utilizando la prueba t.
Los estudios de combinación de ATL1103 con Somavert en ratones mostraron actividad adicional a nivel de ARN hepático y sirven como apoyo de las exploraciones adicionales de los beneficios potenciales del ATL1103.
Ejemplo 3: Coadministración de un oligonucleótido antisentido y Sandostatin-LAR, incluso en sujetos que necesitan reducción de IGF-I sérico.
El ATL1103 se ha de administrar por vía subcutánea con una dosis de 250 mg por día, seis veces durante 3 semanas, los días 1, 3, 5, 7, 14 y 21 o de 250 mg dos veces por semana durante 21 días, y una o dos veces por semana con una dosis de 250 mg durante 5 semanas más. Sandostatin-LAR se administrará con una dosis de 20 mg cada 28 días durante el mismo período de 8 semanas.
Grupo de control: Sandostatin-LAR se ha de administrar solo durante un período similar de 8 semanas cada 28 días a voluntarios normales o sujetos que necesiten reducción de IGF-I sérico.
Los efectos farmacodinámicos y farmacológicos se evaluarán como se describe en el Ejemplo 1 con ensayos similares y ensayos adicionales cuando resulten útiles, por ejemplo, para IGF-I y GH séricos.
El tratamiento se ha de continuar con dosis iguales, mayores o menores de Sandostatin-LAR, y con dosis iguales, mayores o menores de ATL1103, y con una frecuencia de dosificación igual, mayor o menor para lograr los niveles objetivo deseados de IGF-I sérico y, opcionalmente, los niveles de GH.
Ejemplo 4: Coadministración de un oligonucleótido antisentido y Sandostatin-LAR para el tratamiento de la acromegalia.
Se han de mantener grupos de hasta 15 pacientes con acromegalia con su dosis de Sandostatin-LAR y, además, se les debe administrar ATL1103 como se describe en el Ejemplo 1.
El tratamiento se ha de continuar con dosis iguales, mayores o menores de Sandostatin-LAR, y con dosis iguales, mayores o menores de ATL1103, y con una frecuencia de dosificación igual, mayor o menor para lograr los niveles objetivo deseados de IGF-I y, opcionalmente, los niveles de GH.
Ejemplo 5: Coadministración de un oligonucleótido antisentido y lanreotida-LAR (Autogel) para el tratamiento de la acromegalia.
Grupos de 15 pacientes con acromegalia han de recibir una dosis de 200 mg de ATL1103 una o dos veces por semana durante 13 semanas, pacientes que ya reciben (i) dosis de 90 mg de lanreotida-LAR una vez cada 28 días o (ii) 120 mg de lanreotida-LAR una vez cada 28 días los mismos días que reciben ATL1103.
El tratamiento se ha de continuar con dosis iguales, mayores o menores de lanreotida-LAR, y con dosis iguales, mayores o menores de ATL1103, y con una frecuencia de dosificación igual, mayor o menor para lograr los niveles objetivo deseados de IGF-I sérico y, opcionalmente, los niveles de GH.
Ejemplo 6: Coadministración de un oligonucleótido antisentido y octreotida-LAR para el tratamiento de la retinopatía diabética.
Grupos de 15 pacientes con retinopatía diabética han de recibir una dosis de 200 mg de ATL1103 una o dos veces por semana durante 13 semanas y ya sea (i) 20 mg de octreotida-LAR una vez cada 28 días o (ii) 30 mg de octreotida-LAR una vez cada 28 días durante 13 semanas los mismos días que reciben ATL1103.
Grupos de control: ATL1103 u octreotida-LAR se han de administrar solos durante un período similar de 13 semanas a pacientes con retinopatía diabética.
El tratamiento se ha de continuar con dosis iguales, mayores o menores de octreotida-LAR, y con dosis iguales, mayores o menores de ATL1103, y con una frecuencia de dosificación igual, mayor o menor para lograr los niveles objetivo deseados de IGF-I y, opcionalmente, los niveles de GH y los resultados para enfermedad de la retina.
Ejemplo 7: Coadministración de un oligonucleótido antisentido y lanreotida-LAR para el tratamiento del cáncer. Grupos de 15 pacientes con cáncer asociado a niveles aumentados de IGF-I han de recibir una dosis de 200 mg de ATL1103 una o dos veces por semana durante 13 semanas y ya sea (i) 90 mg de lanreotida-LAR una vez cada 28 días o (ii) 120 mg de lanreotida-LAR una vez cada 28 días durante 13 semanas.
Grupos de control: ATL1103 o lanreotida-LAR se han de administrar solos, junto con la medicación de base, a pacientes con cáncer durante un período similar de 13 semanas.
El tratamiento se ha de continuar con dosis iguales, mayores o menores de lanreotida-LAR, y con dosis iguales, mayores o menores de ATL1103, y con una frecuencia de dosificación igual, mayor o menor para lograr los niveles objetivo deseados de IGF-I y, opcionalmente, los niveles de GH y los resultados para cáncer.
Ejemplo 8: Coadministración de un oligonucleótido antisentido y un análogo de la somatostatina para el tratamiento de la acromegalia.
El análogo de la somatostatina se administrará con las dosis que los pacientes con acromegalia están usando actualmente para su tratamiento, por ejemplo, 20 mg, 30 mg de octreotida-LAR una vez cada 28 días o más, o 90 mg, 120 mg de lanreotida-LAR una vez cada 28 días o de 40 mg a 60 mg de pasireotida-LAR.
El ATL1103 se ha de administrar por vía subcutánea con una dosis de 250 mg por día, seis veces durante 3 semanas, los días 1, 3, 5, 7, 14 y 21 o de 250 mg dos veces por semana durante 21 días, y una o dos veces por semana con una dosis de 250 mg durante 5 semanas más.
Los efectos farmacodinámicos y farmacológicos se evaluarán como se describe en el Ejemplo 1 con ensayos similares y ensayos adicionales cuando resulten útiles, por ejemplo, para IGF-I y GH séricos.
El tratamiento se ha de continuar con dosis iguales, mayores o menores de análogo de la somatostatina, y con dosis iguales, mayores o menores de ATL1103, y con una frecuencia de dosificación igual, mayor o menor para lograr los niveles objetivo deseados de IGF-I sérico y, opcionalmente, de GH.
Ejemplo 9: Coadministración de un oligonucleótido antisentido y un análogo de la somatostatina para el tratamiento de la acromegalia
El análogo de somatostatina se administrará por vía subcutánea o intramuscular con las dosis que los pacientes con acromegalia están usando actualmente para su tratamiento, por ejemplo, como se indica en el ejemplo anterior.
El ATL1103 se debe administrar por vía subcutánea con dosis de 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 mg una o dos veces por semana durante 3 semanas o hasta alcanzar una dosis acumulada de ~ 1200-1800 mg.
Los efectos farmacodinámicos y farmacológicos se evaluarán como se describe en el Ejemplo 1 con ensayos similares y ensayos adicionales cuando resulten útiles, por ejemplo, para IGF-I y GH séricos.
El tratamiento se ha de continuar con dosis iguales, mayores o menores de análogo de la somatostatina, y con dosis iguales, mayores o menores de ATL1103, y con una frecuencia de dosificación igual, mayor o menor para lograr los niveles objetivo deseados de IGF-I sérico y, opcionalmente, de GH.
Ejemplo 10: Coadministración de un oligonucleótido antisentido y un análogo de la somatostatina para el tratamiento de la acromegalia
El análogo de la somatostatina se administrará por vía subcutánea o intramuscular con las dosis que los pacientes con acromegalia están usando actualmente para su tratamiento, por ejemplo, como se indica en los ejemplos anteriores.
El ATL1103 se ha de administrar por vía subcutánea con dosis de 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 mg una o dos veces por semana durante 4 semanas, o una o dos veces por semana durante 6 semanas, o una o dos veces por semana durante 8 semanas o una o dos veces por semana durante 12 semanas.
Los efectos farmacodinámicos y farmacológicos se evaluarán como se describe en el Ejemplo 1 con ensayos similares y ensayos adicionales cuando resulten útiles, por ejemplo, para IGF-I y GH séricos.
El tratamiento se ha de continuar con dosis iguales, mayores o menores de análogo de la somatostatina, y con dosis iguales, mayores o menores de ATL1103, y con una frecuencia de dosificación igual, mayor o menor para lograr los niveles objetivo deseados de IGF-I sérico y, opcionalmente, de GH.
Ejemplo 11: El ATL1103 es eficaz para reducir los niveles de IGF-1 en sujetos con acromegalia.
El ensayo de fase II de ATL1103 fue un estudio aleatorizado, abierto, de grupos paralelos de la seguridad, tolerabilidad, farmacocinética y eficacia de dos regímenes de dosificación subcutánea de ATL1103 en 24 pacientes adultos con acromegalia que recibieron ATL1103 durante 13 semanas (3 meses) con dos meses de seguimiento. Se probaron dos regímenes de dosificación de ATL1103: (a) 200 mg 3 veces la primera semana y, a partir de entonces, una vez por semana (200 mg/semana) o (b) 200 mg 3 veces la primera semana y, a partir de entonces, dos veces por semana (400 mg/semana). Los criterios de valoración primarios u objetivos principales del ensayo fueron (i) evaluar la seguridad y tolerabilidad de ATL1103 en pacientes con acromegalia, y (ii) evaluar los perfiles farmacocinéticos de dosis únicas y múltiples de ATL1103 por vía subcutánea en pacientes con acromegalia . Un criterio de valoración secundario, pero importante, que también figura en el protocolo del ensayo fue la evaluación del efecto de ATL1103 sobre los niveles de factor de crecimiento análogo a la insulina I (IGF-I) sérico en los pacientes. El criterio de valoración secundario fue la reducción porcentual promedio de los niveles de IGF-I sérico al final del tratamiento en comparación con los niveles iniciales para cada uno de los dos regímenes de dosificación utilizados en el estudio de fase II. En los 4 pacientes que recibieron la dosis de 400 mg por semana, el ATL1103 redujo los niveles de sIGF-I de manera constante y en un promedio (media) de 30 % (intervalo de 4 % a 48 %) la semana 14 (una semana después de la última dosis), considerado el punto de tiempo primario de eficacia del ensayo. Los niveles de sIGF-I disminuyeron en una media de 38 % (28-48 %) en los 3 pacientes que tenían pesos corporales más bajos (58-83 kg en la selección) y, de ese modo, recibieron una dosis relativamente más elevada por kg de peso corporal de entre alrededor de 4,8 y 6,9 mg/kg. El único paciente que mostró la reducción más baja de sIGF-I en la semana 14 tenía el peso corporal más alto (132 kg en la selección).
Con la dosis de 200 mg por semana, no se observó ninguna reducción constante en los niveles medios de sIGF-I en la semana 14, aunque se observó cierta reducción de sIGF-I en pacientes individuales.
Los datos de evolución temporal (véase la Figura 1) con la dosis de 200 mg dos veces por semana (400 mg por semana) muestran, en general, una velocidad progresiva de reducción de sIGF-I durante el período de dosificación. Esto sirve de apoyo adicional de la acción terapéutica del ATL1103 observada en este ensayo y sugiere que la dosificación continua de ATL1103 con la dosis de 400 mg por semana durante más de 3 meses podría producir reducciones adicionales del sIGF-I.

Claims (3)

REIVINDICACIONES
1. Octreotida, lanreotida, pasireotida u octreolina en combinación con un oligonucleótido antisentido de 15 a 30 nucleobases de longitud dirigido a un ácido nucleico que codifica el receptor de la hormona de crecimiento (GHR) humano para su uso en el tratamiento de la acromegalia en un sujeto que tiene niveles séricos de factor de crecimiento análogo a la insulina I (IGF-I) por encima de lo normal a pesar de recibir terapia con agonistas de somatostatina, donde dicho oligonucleótido:
(i) comprende al menos una porción de 8 nucleobases consecutivas de SEQ ID NO: 6;
(ii) consiste en una región de desoxinucleótidos flanqueada en los extremos 5' y 3' por uno o más restos de azúcar modificados en 2'-O;
(iii) comprende al menos un resto de azúcar 2'-O-metoxietilo, al menos un enlace entre nucleósidos fosforotioato y al menos una 5-metilcitosina.
2. Octreotida, lanreotida, pasireotida u Octreolin y el oligonucleótido para su uso según la reivindicación 1, donde el oligonucleótido consiste en la secuencia de nucleobases de SEQ ID NO: 6.
3. Octreotida, lanreotida, pasireotida u Octreolin y el oligonucleótido para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, donde el oligonucleótido está constituido por 20 nucleósidos enlazados, donde el oligonucleótido está constituido por una nucleobase de SEQ ID NO: 6; y donde el oligonucleótido está constituido por una región de diez desoxinucleótidos flanqueada tanto en el extremo 5' como en el extremo 3' de dicha región de diez desoxinucleótidos por cinco 2'-O-(2-metoxietil) nucleótidos, y donde cada enlace entre nucleósidos en el oligonucleótido es un enlace fosforotioato, y donde cada citosina en dicho oligonucleótido es una 5-metilcitosina.
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