ES2857509T3 - Anticuerpo monoclonal anti-CTLA4 o fragmento de unión al antígeno del mismo, composición medicinal y uso - Google Patents
Anticuerpo monoclonal anti-CTLA4 o fragmento de unión al antígeno del mismo, composición medicinal y uso Download PDFInfo
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Abstract
Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une al CTLA4 humano, seleccionado del grupo que consiste en: (a) un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 14 y una región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 16; y (b) un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 14 y una región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 16, en el que en la SEQ ID NO: 14 en la posición 18, la metionina se puede sustituir por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: leucina, valina, isoleucina y alanina.
Description
DESCRIPCIÓN
Anticuerpo monoclonal anti-CTLA4 o fragmento de unión al antígeno del mismo, composición medicinal y uso Campo técnico
La presente invención pertenece a los campos de la terapia tumoral y la inmunología molecular. La presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal anti-CTLA4 o un fragmento de unión al antígeno del mismo, una composición farmacéutica del mismo, secuencias codificantes del mismo y uso en procedimientos de diagnóstico, prevención, terapia y/o terapia adyuvante usando el mismo.
Antecedentes técnicos
El antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos (abreviado como CTLA4) tiene una relación muy estrecha con la molécula CD28 en la estructura génica, ubicación cromosómica, homología de secuencia y expresión génica. Ambos son receptores de la molécula coestimuladora B7, expresada principalmente en la superficie de las células T activadas. Sin embargo, como señal coestimulante de la activación de linfocitos, CTLA4 tiene una función opuesta a CD28. Después de unirse a B7, CTLA4 puede inhibir la activación de las células T humanas y de ratón, desempeñando un papel regulador negativo en la activación de las células T.
Los AcM de CTLA4 o los ligandos de CTLA4 pueden evitar que CTLA4 se una a sus ligandos nativos, bloqueando así la transducción de la señal reguladora negativa de las células T por CTLA4 y mejorando la capacidad de respuesta de las células T a varios antígenos. En este aspecto, los resultados de los estudios in vivo e in vitro coinciden sustancialmente. En la actualidad, se están probando algunos AcM CTLA4 (10D1, 11.2.2) en ensayos clínicos para el tratamiento del cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer colorrectal, cáncer del tracto gastrointestinal, cáncer de hígado, melanoma maligno, etc. (bloqueo de CTLA-4 en tumores modelos: una descripción general de la investigación preclínica y traslacional. Grosso JF., Jure-Kunkel MN., Cancer Immun. 2013; 13: 5. Epub 201322 de enero; US 6984720 B1; y US 6682736 B1). Entre ellos, 10D1 y 11.2.2 se consideran entre los anticuerpos monoclonales anti-CTLA4 que tienen mejores efectos.
La interleucina 2 (IL-2) es producida por las células T. Es un factor de crecimiento que regula un subgrupo de células T. También es un factor importante que modula la respuesta inmune. Puede promover y activar la expansión de las células B e implica la reacción de anticuerpos, la hematopoyesis y la vigilancia de tumores. La IL-2 humana recombinante ha sido aprobada por la FDA de EE. UU. Para el tratamiento de tumores malignos (incluido el melanoma, el tumor de riñón, etc.). También se encuentra en estudios clínicos para el tratamiento de la infección viral crónica (administración farmacológica de interleucina-2. Chávez, AR y otros, Ann NY Acad Sci, 2009. 1182: 14 27).
Como factores importantes que afectan la función de las células T, los AcM CTLA4 y CTLA4 pueden producir un efecto terapéutico específico en enfermedades al interferir con el microambiente inmunológico del cuerpo. Tienen alta eficacia y remedian la deficiencia de la medicación tradicional, abriendo una nueva vía de terapia génica. Los AcM CTLA4 y CTLA4 se están probando en experimentos y en varias etapas de ensayos clínicos. Por ejemplo, en enfermedades autoinmunes, inhibieron eficazmente la hiperreactividad de las vías respiratorias en un modelo animal de asma, previnieron el desarrollo de enfermedades reumáticas, mediaron la tolerancia inmunitaria a un aloinjerto en el cuerpo y similares. Por otro lado, aunque la terapia génica biológica no ha mostrado ningún efecto adverso en ensayos clínicos a corto plazo, se debe prestar atención al efecto potencial después de la aplicación a largo plazo. Por ejemplo, el bloqueo excesivo de la señalización de CTLA4-B7 por AcM CTLA4 puede resultar en el desarrollo de enfermedades autoinmunes. Como los anticuerpos pueden unirse específicamente a sus ligandos e inducir la lisis de las células diana o bloquear el progreso de la patología, el desarrollo y la utilización de fármacos en base a anticuerpos, especialmente los anticuerpos humanizados tienen una importancia importante en el tratamiento clínico de tumores malignos y otras enfermedades inmunitarias en humanos.
En la actualidad, todavía existe la necesidad de desarrollar nuevos anticuerpos que bloqueen la unión de CTLA4 a B7 y sus anticuerpos humanizados.
Sumario de la invención
Después de intensos estudios y trabajos creativos de los inventores, se expresó CTLA4 recombinante utilizando un sistema de expresión de células de mamífero y se utilizó como antígeno para ratones inmunes. Las células de hibridoma se obtuvieron fusionando las células esplénicas de ratón con células de mieloma. Después del cribado de un gran número de muestras por parte de los inventores, se obtuvo una línea de células de hibridoma capaz de secretar y producir un anticuerpo monoclonal específico que se une específicamente a CTLA4 y puede bloquear la unión de CTLA4 a B7 de manera muy eficaz. Además, se generaron anticuerpos humanizados. Por tanto, se proporcionan las siguientes invenciones.
La presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une a CTLA4 humano, seleccionado del grupo que consiste en:
(a) un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 14 y una región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 16; y
(b) un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 14 y una región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 16, en el que en la SEQ ID NO: 14 en la posición 18, la metionina se puede sustituir por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: leucina, valina, isoleucina y alanina.
La presente invención proporciona además una o más moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican para un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de la invención, específicamente en el que una o más moléculas de ácido nucleico aisladas tienen la secuencia de nucleótidos que se establece en SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 15. La presente invención proporciona además el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de la invención para su uso en un procedimiento de tratamiento del cáncer, tal como melanoma, tumor de riñón/tumor renal, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer colorrectal, cáncer del tracto gastrointestinal y/o cáncer de hígado/cáncer de hígado en un sujeto humano.
La presente invención proporciona además el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de la invención para su uso en un procedimiento de tratamiento de linfoma.
La presente invención proporciona además un procedimiento in vitro que comprende la etapa de administrar a las células una cantidad eficaz del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de la invención, en el que el método es seleccionado de entre los siguientes:
(a) un procedimiento para detectar el nivel de CTLA4 en una muestra,
(b) un procedimiento para bloquear la unión de CTLA4 humano a B7 humano,
(c) un procedimiento para regular la actividad de CTLA4 humano o el nivel de CTLA4 humano,
(d) un procedimiento para aliviar la inmunosupresión en el cuerpo por CTLA4 humano,
(e) un procedimiento para activar los linfocitos T o
(f) un procedimiento para aumentar la expresión de IL-2 en linfocitos T.
Un aspecto se refiere a un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión al antígeno del mismo, en el que el anticuerpo monoclonal comprende las regiones determinantes complementarias (CDR) seleccionadas de entre las siguientes:
HCDR1 que comprende la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 27,
HCDR2 que comprende la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 28 y
HCDR3 que comprende la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 29;
y/o
LCDR1 que comprende la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 30,
LCDR2 que comprende la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 31 y
LCDR3 que comprende la secuencia aminoacídica seleccionada de SEQ ID NO: 32, la SEQ ID NO: 33 y la SEQ ID NO: 34.
El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de los aspectos de la presente divulgación, en el que la secuencia aminoacídica de la región variable de cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal es seleccionada SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 14 y la SEQ ID NO: 18; y/o
la secuencia aminoacídica de la región variable de cadena ligera (VL) del anticuerpo monoclonal se selecciona de SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 16, la SEQ ID NO: 20, la SEQ ID NO: 22 y la SEQ ID NO: 24. El anticuerpo monoclonal o su fragmento de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de los aspectos de la presente divulgación, en el que el anticuerpo monoclonal comprende
(1) VH como se establece en SEQ ID NO: 6 y VL como se establece en SEQ ID NO: 8;
(2 ) VH como se establece en SEQ ID NO: 10 y VL como se establece en SEQ ID NO: 12;
(3 ) VH como se establece en SEQ ID NO: 14 y VL como se establece en SEQ ID NO: 16;
(4 ) VH como se establece en SEQ ID NO: 18 y VL como se establece en SEQ ID NO: 20;
(5 ) VH como se establece en SEQ ID NO: 14 y VL como se establece en SEQ ID NO: 22; o
(6) VH como se establece en SEQ ID NO: 14 y VL como se establece en SEQ ID NO: 24.
En la presente divulgación, los grupos anteriores (1) a (6) muestran las secuencias aminoacídicas de la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera de 8D2/8D2 (Re), 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 y 8D2H2L17. respectivamente.
Específicamente, la metionina (Met) en la posición 18 en SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 10 y la SEQ ID NO: 14 está independientemente sustituido con un aminoácido seleccionado de entre los siguientes: Leucina (Leu), Valina (Val), Isoleucina (Ile) o Alanina (Ala).
Los fármacos terapéuticos en base a los anticuerpos, especialmente los anticuerpos monoclonales (AcM), han logrado una excelente eficacia en el tratamiento de diversas enfermedades. El procedimiento tradicional para obtener dicho anticuerpo terapéutico es inmunizar a un animal con un antígeno, obtener anticuerpos contra el antígeno del animal inmunizado o mejorando un anticuerpo que tenga baja afinidad por el antígeno mediante maduración por afinidad. Sin embargo, tal procedimiento requiere mucho tiempo y trabajo, y con frecuencia no logra apuntar a un epítopo específico en el antígeno.
La unión del antígeno depende de las regiones variables de la cadena ligera y la cadena pesada; la región variable de cada cadena comprende tres regiones hipervariables, también llamadas región determinante de complementariedad (CDR) (la cadena pesada (H) comprende HCDR1, HCDR2 y HCDR3, y la cadena ligera (L) comprende LCDR1, LCDR2 y LCDR3; por definición, ver Kabat y otros., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición (1991), vol. 1-3, Publicación de los NIH 91-3242, Bethesda Md).
Las secuencias aminoacídicas de las CDR en las secuencias del anticuerpo monoclonal de los aspectos (1) a (6) anteriores se analizaron mediante medios técnicos bien conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, mediante análisis de la base de datos VBASE2. Los resultados se proporcionan a continuación.
(1)Las secuencias aminoacídicas de las 3 CDR de la región variable de la cadena pesada se muestran a continuación:
HCDR1: GFTFSDNW (SEQ ID NO: 27),
HCDR2: IRNKPYNYET (SEQ ID NO: 28),
HCDR3: TAQFAY (SEQ ID NO: 29).
Las secuencias aminoacídicas de las 3 CDR de la región variable de la cadena ligera se muestran a continuación:
LCDR1: ENIYGG (SEQ ID NO: 30),
LCDR2: GAT (SEQ ID NO: 31),
LCDR3: QNVLRSPFT (SEQ ID NO: 32).
(2) Las secuencias aminoacídicas de las 3 CDR de la región variable de la cadena pesada se muestran a continuación:
HCDR1: GFTFSDNW (SEQ ID NO: 27),
HCDR2: IRNKPYNYET (SEQ ID NO: 28),
HCDR3: TAQFAY (SEQ ID NO: 29).
Las secuencias aminoacídicas de las 3 CDR de la región variable de la cadena ligera se muestran a continuación:
LCDR1: ENIYGG (SEQ ID NO: 30),
LCDR2: GAT (SEQ ID NO: 31),
LCDR3: QNVLRSPFT (SEQ ID NO: 32).
(3) Las secuencias aminoacídicas de las 3 CDR de la región variable de la cadena pesada se muestran a continuación:
HCDR1: GFTFSDNW (SEQ ID NO: 27),
HCDR2: IRNKPYNYET (SEQ ID NO: 28),
HCDR3: TAQFAY (SEQ ID NO: 29).
Las secuencias aminoacídicas de las 3 CDR de la región variable de la cadena ligera se muestran a continuación:
LCDR1: ENIYGG (SEQ ID NO: 30),
LCDR2: GAT (SEQ ID NO: 31),
LCDR3: QNVLRSPFT (SEQ ID NO: 32).
(4) Las secuencias aminoacídicas de las 3 CDR de la región variable de la cadena pesada se muestran a continuación:
HCDR1: GFTFSDNW (SEQ ID NO: 27),
HCDR2: IRNKPYNYET (SEQ ID NO: 28),
HCDR3: TAQFAY (SEQ ID NO: 29).
Las secuencias aminoacídicas de las 3 CDR de la región variable de la cadena ligera se muestran a continuación:
LCDR1: ENIYGG (SEQ ID NO: 30),
LCDR2: GAT (SEQ ID NO: 31),
LCDR3: QNVLRSPFT (SEQ ID NO: 32).
(5) Las secuencias aminoacídicas de las 3 CDR de la región variable de la cadena pesada se muestran a continuación:
HCDR1: GFTFSDNW (SEQ ID NO: 27),
HCDR2: IRNKPYNYET (SEQ ID NO: 28),
HCDR3: TAQFAY (SEQ ID NO: 29).
Las secuencias aminoacídicas de las 3 CDR de la región variable de la cadena ligera se muestran a continuación:
LCDR1: ENIYGG (SEQ ID NO: 30),
LCDR2: GAT (SEQ ID NO: 31),
LCDR3: QNVLSRHPG (SEQ ID NO: 33).
(6) Las secuencias aminoacídicas de las 3 CDR de la región variable de la cadena pesada se muestran a continuación:
HCDR1: GFTFSDNW (SEQ ID NO: 27),
HCDR2: IRNKPYNYET (SEQ ID NO: 28),
HCDR3: TAQFAY (SEQ ID NO: 29).
Las secuencias aminoacídicas de las 3 CDR de la región variable de la cadena ligera se muestran a continuación:
LCDR1: ENIYGG (SEQ ID NO: 30),
LCDR2: GAT (SEQ ID NO: 31),
LCDR3: QNVLSSRPG (SEQ ID NO: 34).
El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las realizaciones de la presente invención, en el que el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión al antígeno del mismo se selecciona de un Fab, un Fab', un F (ab')2, un Fd, un Fv, un dAc, un fragmento de región determinante de complementariedad, un anticuerpo de cadena sencilla (por ejemplo, un scFv), un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico o un diacuerpo.
El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las realizaciones de la presente invención, en el que el anticuerpo monoclonal une la proteína CTLA4 con una Kd menos de 10-5 M, por ejemplo, menos de aproximadamente 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, o 10-10 M o menos.
El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las realizaciones de la presente invención, en el que el anticuerpo monoclonal comprende regiones que no son CDR, y dichas regiones que no son CDR son de un anticuerpo de una especie distinta de murina, por ejemplo, un humano. El anticuerpo monoclonal o su fragmento de unión al antígeno de la presente invención es un anticuerpo monoclonal anti-CTLA4 o su fragmento de unión al antígeno que puede unirse específicamente a CTLA4.
El anticuerpo monoclonal o su fragmento de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de los aspectos de la presente divulgación para su uso en la prevención y/o terapia y/o terapia adyuvante y/o diagnóstico de un tumor; específicamente, el tumor es seleccionado de melanoma, tumor de riñón/tumor renal, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer colorrectal, cáncer del tracto gastrointestinal y cáncer de hígado/cáncer hepático.
El anticuerpo monoclonal de acuerdo con cualquiera de las realizaciones de la presente invención para su uso en: bloqueo de la unión de CTLA4 a B7,
regulación (por ejemplo, regulación negativa) la actividad de CTLA4 o el nivel de CTLA4,
aliviar la inmunosupresión en el cuerpo por CTLA4, o
un agente que activa los linfocitos T o aumenta la expresión de IL-2 en los linfocitos T.
Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada, que comprende una secuencia de ácido nucleico capaz de codificar la región variable de la cadena pesada de un anticuerpo, en el que la región variable de la cadena pesada del anticuerpo comprende CDR con las secuencias aminoacídicas de las SEQ ID NO: 27-29;
específicamente, la región variable de la cadena pesada del anticuerpo tiene la secuencia aminoacídica que se establece en SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 14 o la SEQ ID NO: 18;
más específicamente, la molécula de ácido nucleico tiene la secuencia de nucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 9, la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 17.
La presente invención proporciona además moléculas de ácido nucleico aisladas, que codifican el anticuerpo monoclonal o su fragmento de unión al antígeno de la presente invención. Dichas moléculas de ácido nucleico pueden aislarse de las células de hibridoma o pueden obtenerse mediante tecnologías recombinantes de ingeniería genética o procedimientos de síntesis química.
Un aspecto adicional de la presente divulgación se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada, que comprende una secuencia de ácido nucleico capaz de codificar la región variable de la cadena ligera de un anticuerpo, en la que la región variable de cadena ligera del anticuerpo comprende
1) CDR con las secuencias aminoacídicas de SEQ ID NO: 30-32;
2 ) CDR con la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 33; o
3 ) CDR con la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 34; específicamente, la región variable de la cadena ligera del anticuerpo tiene la secuencia aminoacídica que se establece en SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 16, la SEQ ID NO: 20, la SEQ ID NO: 22 o la SEQ ID NO: 24;
más específicamente, la molécula de ácido nucleico tiene la secuencia de nucleótidos como se establece en SEQ ID NO: SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 11, la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 19, la SEQ ID NO: 21 o la SEQ ID NO: 23.
Una realización adicional de la presente invención se refiere a un vector, que comprende la molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con cualquiera de las realizaciones de la presente invención. El vector de la presente invención puede ser un vector de clonación o un vector de expresión. En una realización preferente, el vector de la presente invención es, por ejemplo, un plásmido, un cósmido, un bacteriófago, un coemido o similares.
Una realización adicional de la presente invención se refiere a una célula huésped, que comprende la molécula de ácido nucleico aislada de cualquiera de las realizaciones de la presente invención, o el vector de acuerdo con la presente invención. Dichas células huésped incluyen, pero no se limitan a, células procariotas como células de E. coli y células eucariotas como células de levadura, células de insectos, células vegetales y células animales (como células de mamíferos, incluidas células de ratón, células humanas, o similar). Las células de la presente invención también pueden ser una línea celular, como las células 293T.
Una realización de aspecto adicional de la presente invención se refiere a un procedimiento para preparar el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las realizaciones de la presente invención, comprendiendo el procedimiento las etapas de cultivar la célula huésped de la presente invención en condiciones adecuadas y recuperación del anticuerpo monoclonal o fragmento de unión al antígeno del mismo del cultivo celular.
Un aspecto adicional se refiere a un conjugado, que comprende un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión al antígeno del mismo y un resto conjugado, en el que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las realizaciones de la presente invención, y el resto conjugado es un marcador detectable. Específicamente, el resto conjugado es un radioisótopo, una sustancia fluorescente, una sustancia luminiscente, una sustancia cromogénica o una enzima (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante).
Un aspecto adicional de la presente divulgación se refiere a un kit, que comprende el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las realizaciones de la presente invención, o el conjugado según la presente invención;
específicamente, el kit comprende además un segundo anticuerpo, que reconoce específicamente dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión al antígeno del mismo; opcionalmente, dicho segundo anticuerpo comprende además un marcador detectable, por ejemplo, un radioisótopo, una sustancia fluorescente, una sustancia luminiscente, una sustancia cromogénica o una enzima (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante).
Un aspecto adicional de la presente divulgación se refiere al uso del anticuerpo monoclonal o fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las realizaciones de la presente invención en la preparación de un kit para su uso en la detección de la presencia o el nivel de CTLA4 en una muestra.
Un aspecto adicional se refiere a una composición farmacéutica, que comprende el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones de la presente invención o el conjugado de acuerdo con la presente invención; opcionalmente, comprende además un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Un aspecto adicional se refiere al uso del anticuerpo monoclonal o fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las realizaciones de la presente invención o el conjugado según la presente invención en la preparación de un medicamento para su uso en la prevención y/o terapia y/o terapia adyuvante y/o diagnóstico de un tumor; específicamente, el tumor es seleccionado de melanoma, tumor de riñón/tumor renal, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer colorrectal, cáncer del tracto gastrointestinal y cáncer de hígado/cáncer hepático.
Un aspecto adicional se refiere al uso del anticuerpo monoclonal o fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las realizaciones de la presente invención o el conjugado de acuerdo con la presente invención en la preparación de un agente siguiente:
un agente que detecta la presencia o el nivel de CTLA4 en una muestra,
un agente que bloquea la unión de CTLA4 a B7,
un agente que regula (por ejemplo, regula negativamente) la actividad de CTLA4 o el nivel de CTLA4, un agente que alivia la inmunosupresión en el cuerpo por CTLA4,
un agente que activa los linfocitos T, o
un agente que aumenta la expresión de IL-2 en los linfocitos T.
Un aspecto adicional se refiere a un procedimiento in vivo o in vitro que comprende la etapa de administrar a las células una cantidad eficaz del anticuerpo monoclonal o fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las realizaciones de la presente invención o el conjugado de acuerdo con la presente invención, en el que el procedimiento es seleccionado de entre los siguientes:
un procedimiento para detectar la presencia o el nivel de CTLA4 en una muestra,
un procedimiento para bloquear la unión de CTLA4 a B7,
un procedimiento para regular (por ejemplo, regular negativamente) la actividad de CTLA4 o el nivel de CTLA4, un procedimiento para aliviar la inmunosupresión en el cuerpo por CTLA4,
un procedimiento para activar los linfocitos T, o
un procedimiento para aumentar la expresión de IL-2 en linfocitos T.
Dichos procedimientos pueden usarse con fines de diagnóstico o terapéuticos, o con fines no diagnósticos o no terapéuticos (por ejemplo, cuando la muestra es una muestra de células, en lugar de una muestra de un paciente). Un aspecto adicional se refiere a un procedimiento de prevención y/o terapia y/o terapia adyuvante y/o diagnóstico de un tumor, que comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz del anticuerpo monoclonal o fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de los aspectos de la presente divulgación o el conjugado según la presente invención; específicamente, el tumor es seleccionado de melanoma, tumor de riñón/tumor renal, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer colorrectal, cáncer del tracto gastrointestinal y cáncer de hígado/cáncer hepático.
En la presente invención, a menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que el conocido comúnmente por el experto en la técnica. Además, los procedimientos de cultivo de células, genética molecular, química de ácidos nucleicos, inmunología usados en la presente memoria son las metodologías ampliamente utilizadas en la técnica relevante. Mientras tanto, con el fin de comprender mejor la presente invención, a continuación se proporcionan las definiciones y explicaciones de los términos relevantes.
Como se usa en la presente memoria, cuando se hace referencia a la secuencia aminoacídica de la proteína CTLA4 (antígeno 4 de linfocitos T citotóxicos), incluye la longitud completa de la proteína CTLA4, o el fragmento extracelular de CTLA4, CTLA4ECD (SEQ ID NO: 2), o un fragmento que comprende CTLA4ECD; también incluye una proteína de fusión de CTLA4ECD, por ejemplo, un fragmento fusionado al fragmento de proteína Fc de una IgG de ratón (mFc) (SEQ ID NO: 3). Sin embargo, como entienden los expertos en la técnica, una mutación o variación (que incluye, pero no se limita a, sustitución, deleción y/o adición) puede producirse de forma natural o introducirse artificialmente en la secuencia aminoacídica de la proteína CTLA4, sin afectar sus funciones biológicas. Por lo tanto, en la presente invención, el término "proteína CTLA4" debe incluir todas estas secuencias, incluida la secuencia que se establece en la SEC ID NO: 2, así como sus variantes nativas o artificiales. Además, cuando se hace referencia a un fragmento de secuencia de la proteína CTLA4, no solo incluye un fragmento de secuencia de SEQ ID NO: 2, pero también incluye los fragmentos de secuencia correspondientes de sus variantes nativas o artificiales.
Como se usa en la presente memoria, a menos que se indique específicamente, B7 se refiere a B7-1 y/o B7-2; y sus secuencias de proteínas específicas se refieren a las secuencias conocidas en la técnica. Puede hacerse referencia a las secuencias divulgadas en la bibliografía de la técnica anterior o GenBank, por ejemplo, B7-1 (CD80, NCBI Gene ID: 941), B7-2 (CD86, NCBI Gene ID: 942).
Como se usa en la presente memoria, el término EC50 se refiere a la concentración para el 50 % del efecto máximo, es decir, la concentración que causa el 50 % del efecto máximo.
Como se usa en la presente memoria, el término "anticuerpo" se refiere a una molécula de inmunoglobulina que generalmente consiste en dos pares de cadenas polipeptídicas (cada par tiene una cadena "ligera" (L) y una cadena "pesada" (H)). Las cadenas ligeras de anticuerpos se pueden clasificar como cadenas ligeras k y A. Las cadenas pesadas se pueden clasificar como p, 5, y, a o £, y los isotipos de anticuerpo se definen como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Dentro de una cadena ligera y una cadena pesada, una región variable y una región constante se unen mediante una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, y la cadena pesada comprende además una región "D" de aproximadamente 3 o más aminoácidos. Cada cadena pesada consiste en un región variable de la cadena pesada (Vh) y una región constante de la cadena pesada (Ch). La región constante de la cadena pesada consiste en 3 dominios, (Ch1, Ch2 y Ch3). Cada cadena ligera consiste en un región variable de la cadena ligera (Vl) y una región constante de la cadena ligera (Cl). La región constante de la cadena ligera consiste en un dominio Cl. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del huésped, que incluyen varias células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y al primer componente del sistema clásico del complemento (C1q). Las regiones Vh y Vl pueden subdividirse además en regiones que tienen alta variabilidad (denominadas región determinante de complementariedad (CDR)), intercaladas con regiones denominadas regiones marco (FR) que están relativamente conservadas. Cada Vh o Vl consta de 3 CDR y 4 FR, organizados en el siguiente orden desde el terminal amino al terminal carboxi: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables (Vh y Vl) de cada par de cadena pesada/cadena ligera forman un sitio de unión del anticuerpo, respectivamente. La asignación de aminoácidos a cada región o dominio sigue la definición proporcionada en Kabat, Secuencias de proteínas de interés inmunológico (Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Md. (1987 y 1991))), o Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia y otros. (1989) Nature 342: 878-883. El término "anticuerpo" no está limitado por ningún procedimiento específico para producir el anticuerpo. Por ejemplo, incluye, en particular, anticuerpos recombinantes, anticuerpos monoclonales y anticuerpos policlonales. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos de diferentes isotipos, por ejemplo, anticuerpos IgG (por ejemplo, subtipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE o IgM.
Como se usa en la presente memoria, el término "fragmento de unión al antígeno" de anticuerpo se refiere a un polipéptido que comprende un fragmento de un anticuerpo de longitud completa, que conserva la capacidad de unirse específicamente al antígeno unido por el anticuerpo de longitud completa, y/o competir con el anticuerpo de longitud completa para unirse específicamente al antígeno. También se denomina "porción de unión a antígeno". Generalmente, vea Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., Segunda edición, Raven Press, NY (1989)). Los fragmentos de unión al antígeno de un anticuerpo se producen por técnicas de ADN recombinante, o por escisión química o enzimática de los anticuerpos intactos. En algunos casos, los fragmentos de unión al antígeno incluyen Fab, Fab', F(ab')2 , Fd, Fv, dAb y fragmento de región determinante de complementariedad (CDR), anticuerpo monocatenario (por ejemplo, ScFv), anticuerpo quimérico, diacuerpo y dichos polipéptidos que comprende al menos una porción del anticuerpo suficiente para conferir la capacidad de unión del antígeno específico el polipéptido.
Como se usa en la presente memoria, el término "fragmento Fd" se refiere a un fragmento de anticuerpo que consiste en los dominios Vh y Ch1; el término "fragmento Fv" se refiere a un fragmento de anticuerpo que consiste en los dominios Vl y Vh de un solo brazo de anticuerpo; el término "fragmento dAb" se refiere a un fragmento de anticuerpo que consiste en el dominio Vh (Ward y otros., Nature 341: 544-546 (1989)); el término "fragmento Fab" se refiere a un fragmento de anticuerpo que consta de los dominios Vl, Vh, Cl y Ch1; y el término "fragmento F (ab')2" se refiere a un fragmento de anticuerpo que comprende dos fragmentos Fab conectados por puentes disulfuro en la región bisagra.
En algunos casos, el fragmento de unión al antígeno del anticuerpo es un anticuerpo monocatenario (por ejemplo, ScFv), en el que los dominios Vl y Vh se emparejan entre sí a través de un enlace que permite la producción de una sola cadena polipeptídica para formar una molécula monovalente (ver, por ejemplo, Bird y otros., Science 242: 423 426 (1988) y Huston y otros., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988)). Tal molécula scFv puede tener la estructura general: NH2-VL-enlace-VH-COOH o NH2-VH-enlace-VL-COOH. Los enlaces adecuados de la técnica anterior consisten en la secuencia aminoacídica GGGGS repetida o sus variantes. Por ejemplo, un enlace que tiene la secuencia de aminoácidos (GGGGS)4 se puede utilizar, pero sus variantes también se pueden utilizar (Holliger y otros. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448). Otros enlaces útiles en la presente invención se describen en Alfthan y otros. (1995) Protein Eng. 8: 725-731; Choi y otros. (2001) Eur. J. Immunol. 31: 94-106; Hu y otros (1996) Cancer Res. 56: 3055-3061; Kipriyanov y otros. (1999) J. Mol. Biol. 293: 41-56 y Roovers y otros (2001) Cancer Immunol.
En algunos casos, el fragmento de unión al antígeno del anticuerpo es un diacuerpo (un anticuerpo bivalente), en el que los dominios Vh y Vl se expresan en una única cadena polipeptídica. Sin embargo, el enlace explotado es
demasiado corto para que los dos dominios de la misma cadena no puedan emparejarse entre sí y se vean obligados a emparejarse con el dominio complementario de otra cadena. De esta manera, se forman dos sitios de unión al antígeno (ver, por ejemplo, Holliger P. y otros., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993) y Poljak RJ y otros., Estructura 2: 1121-1123(1994)).
Los fragmentos de unión al antígeno de los anticuerpos (por ejemplo, Los fragmentos de anticuerpos anteriores) se pueden obtener a partir de anticuerpos dados (por ejemplo, Los anticuerpos monoclonales 4B3, 13A10, 12B9 o 4H4 proporcionados en la presente invención) utilizando tecnologías convencionales que son conocidas por los expertos en la técnica (por ejemplo, técnica de ADN recombinante o procedimiento de escisión enzimática o química), y se puede cribar para determinar su especificidad de la misma manera que la de los anticuerpos intactos.
En la presente memoria, a menos que se indique explícitamente en el contexto, cuando se hace referencia al término "anticuerpo", no solo incluye anticuerpos intactos, sino que también incluye fragmentos de unión al antígeno del anticuerpo.
Como se usa en la presente memoria, el término "AcM" o "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de una población de moléculas anticuerpos altamente homogénea, por ejemplo, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que ocurren naturalmente. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos para un solo epítopo en el antígeno. A diferencia de los anticuerpos monoclonales, las preparaciones de anticuerpos policlonales típicamente incluyen al menos dos o más anticuerpos diferentes que reconocen diferentes epítopos en el antígeno. Los anticuerpos monoclonales generalmente se pueden obtener usando la técnica del hibridoma descrita por primera vez por Kohler y otros. (Nature, 256: 495, 1975), o puede obtenerse mediante la técnica del ADN recombinante (ver patente de Estados Unidos 4,816,567, por ejemplo).
Como se usa en la presente memoria, un anticuerpo monoclonal mencionado con un número es idéntico al anticuerpo monoclonal obtenido de un hibridoma mencionado con el mismo número. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal 4B3 (o 13A10, 12B9 o 4H4) es idéntico al anticuerpo obtenido de la línea de células de hibridoma 4B3 (o 13A10, 12B9 o 4H4) o sus subclones o células descendientes.
Como se usa en la presente memoria, el término "anticuerpo quimérico" se refiere a dicho anticuerpo, en el que una parte de la cadena ligera y/o cadena pesada se deriva de un anticuerpo (que puede derivar de una especie particular o pertenecer a una clase de anticuerpo particular o subclase), mientras que otra porción de la cadena ligera y/o cadena pesada se deriva de otro anticuerpo (que puede derivarse de una especie idéntica o diferente o pertenecer a una clase o subclase de anticuerpos idéntica o diferente), siempre que conserve la actividad para unirse al antígeno diana (patente estadounidense 4,816,567 concedida a Cabilly otros.; Morrison y otros., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)).
Como se usa en la presente memoria, el término "anticuerpo humanizado" se refiere al anticuerpo o fragmento de anticuerpo obtenido después de reemplazar todas o algunas CDR de una inmunoglobulina humana (anticuerpo receptor) con CDR de un anticuerpo no humano (anticuerpo donante), en el que el anticuerpo donante puede ser un anticuerpo no humano (por ejemplo, de ratón, rata o conejo) que tenga la especificidad, afinidad o reactividad deseadas. Además, algunos residuos aminoacídicos de las regiones marco (FR) del anticuerpo receptor pueden reemplazarse con los correspondientes residuos aminoacídicos del anticuerpo no humano o residuos aminoacídicos de otros anticuerpos para mejorar u optimizar aún más el rendimiento del anticuerpo. Para obtener más detalles sobre los anticuerpos humanizados, consulte, por ejemplo, Jones y otros, Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann y otros, Nature, 332: 323-329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992); y Clark, Immunol. Today 21: 397-402 (2000).
Como se usa en la presente memoria, un "anticuerpo neutralizante" se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que puede eliminar o reducir significativamente la virulencia del virus diana (por ejemplo, la capacidad de infectar células).
Como se usa en la presente memoria, el término "epítopo" se refiere al prat en un antígeno unido específicamente por una inmunoglobulina o anticuerpo. En la técnica, el "epítopo" también se denomina "determinante antigénico". Un epítopo o determinante antigénico generalmente consiste en los grupos de superficie químicamente activos de la molécula, por ejemplo, compuestos de aminoácidos o carbohidratos o cadenas laterales de azúcar, y generalmente tiene características estructurales tridimensionales específicas y características de carga específicas. Por ejemplo, un epítopo generalmente comprende al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos consecutivos o no consecutivos en una conformación espacial distinta. Puede ser un epítopo "lineal" o "conformacional". Ver, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, GE Morris, Ed. (1996). En un epítopo lineal, todos los puntos de interacción entre la proteína y la molécula de interacción (por ejemplo anticuerpo) se encuentran a lo largo de la secuencia aminoacídica primaria la proteína en una línea. En un epítopo conformacional, los puntos de interacción están presentes extendiendo los residuos aminoacídicos de la proteína que están separados entre sí.
Como se usa en la presente memoria, el término "aislado" significa que se obtiene del estado nativo por medios artificiales. Si una sustancia o componente "aislado" se encuentra en la naturaleza, es probable que su entorno natural haya cambiado, o que la sustancia se haya aislado del entorno natural, o ambos. Por ejemplo, los polinucleótidos o polipéptidos no aislados se encuentran naturalmente en un animal vivo in vivo, y los polinucleótidos o polipéptidos idénticos de alta pureza aislados de tal estado natural se describen como "aislados". El término "aislado" no excluye la mezcla con sustancias artificiales o sintéticas, y no excluye la presencia de otras impurezas que no afecten las actividades de la sustancia.
Como se usa en la presente memoria, el término "sistema de expresión de E. coli" se refiere a un sistema de expresión que consiste en E. coli (colorante) y el vector, en el que E. coli (cepa) se deriva de cepas disponibles comercialmente, por ejemplo, Pero no limitado a GI698, ER2566, BL21 (DE3), b834 (DE3) y BLR (DE3).
Como se usa en la presente memoria, el término "vector" se refiere a una herramienta portadora de ácido nucleico en la que se puede insertar un polinucleótido. Cuando un vector permite la expresión de la proteína codificada por el polinucleótido insertado, el vector se denomina vector de expresión. Un vector puede introducirse en una en una célula huésped mediante transformación, transducción o transfección, de modo que el componente de sustancia genética transportado por el vector se exprese en la célula huésped. Los vectores son bien conocidos por los expertos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a: plásmido; fagémido; cósmido; cromosoma artificial, por ejemplo, cromosoma artificial de levadura (YAC), cromosoma artificial bacteriano (BAC) o cromosoma artificial derivado de P1 (PAC); bacteriófagos, por ejemplo, fagos A o fagos M13 así como virus animales y similares. Los virus animales que pueden usarse como vector incluyen, pero no se limitan a, retrovirus (incluyendo lentivirus), adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes (por ejemplo, virus del herpes simple), poxvirus, baculovirus, virus del papiloma, papovavirus (por ejemplo, SV40). Un vector puede comprender varios componentes para controlar la expresión, que incluyen, pero no se limitan a, secuencia promotora, secuencia de inicio de la transcripción, secuencia potenciadora, componente de selección y gen reportero. Además, un vector también puede comprender un sitio de inicio de replicación.
Como se usa en la presente memoria, el término "célula huésped" se refiere a células que se pueden usar para la introducción de un vector, que incluyen, pero no se limitan a, células procariotas como E. coli o Bacillus subtilis, células fúngicas como células de levadura o Aspergillus, células de insecto como la célula S2 de Drosophila o Sf9, o células animales como fibroblasto, célula CHO, célula COS, célula NSO, célula HeLa, célula BHK, célula HEK293 o célula humana.
Como se usa en la presente memoria, el término "identidad" se usa para describir el emparejamiento de secuencias entre dos polipéptidos o entre dos ácidos nucleicos. Cuando las posiciones correspondientes en dos secuencias comparadas están ocupadas por la misma subunidad de monómero de base o aminoácido (por ejemplo, las posiciones correspondientes en dos moléculas de ADN están ocupadas por adenina, o las posiciones correspondientes en dos polipéptidos están ocupadas por lisina), las moléculas son idénticas en esa posición. El "porcentaje de identidad" entre dos secuencias es una función del número de posiciones coincidentes compartidas por estas dos secuencias divididas por el número de posiciones comparadas x 100. Por ejemplo, si coinciden 6 de las 10 posiciones de dos secuencias, estas dos secuencias tienen una identidad del 60 %. Por ejemplo, las secuencias de ADN CTGACT y CAGGTT comparten el 50 % de identidad (3 de las 6 posiciones coinciden en total). Generalmente, se comparan dos secuencias después del alineamiento para generar la máxima identidad. Por ejemplo, tal alineación se puede lograr convenientemente usando un programa de computadora, por ejemplo, el programa Align (DNAstar, Inc.), mediante el procedimiento de Needleman y otros. (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453. Además, el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17 (1988)) incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0) se puede utilizar para determinar el porcentaje de identidad entre dos secuencias aminoacídicas, utilizando la tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud de intervalo de 12 y una penalización de intervalo de 4. Además, el algoritmo de Needleman y Wunsch (J Mol Biol. 48: 444-453 (1970)) incorporado en el programa GAP del envase GCG (disponible en www.gcg.com) se puede utilizar para determinar el porcentaje de identidad entre dos secuencias aminoacídicas, utilizando la matriz Blossum 62 o la matriz PAM250, un peso de intervalo de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
Como se usa en la presente memoria, el término "sustitución conservativa" se refiere a sustituciones de aminoácidos que no afectan o alteran de manera desventajosa las propiedades esenciales de la proteína/polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica. Por ejemplo, pueden introducirse sustituciones conservativas mediante técnicas estándar conocidas en la técnica, tales como mutagénesis sitio-dirigida y mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones de aminoácidos conservativas incluyen aquellas en las que un residuo aminoacídico se reemplaza con un residuo aminoacídico que tiene una cadena lateral similar, por ejemplo, un residuo similar al residuo de aminoácido correspondiente en términos de física o función (por ejemplo, que tiene un tamaño, forma, carga, propiedades químicas, incluida la capacidad de formar un enlace covalente o enlace de hidrógeno, o similares). Las familias de residuos aminoacídicos que tienen cadenas laterales similares se definen en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acídicas (por ejemplo, el ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína y triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina y metionina), cadenas laterales beta
ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano e histidina). Por tanto, se prefiere reemplazar el residuo de aminoácido correspondiente con otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadenas laterales. Los procedimientos para identificar sustituciones conservativas de aminoácidos son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Brummell y otros., Biochem., 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi y otros, Protein Eng. 12 (10): 879-884 (1999); y Burks y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 94: 412-417 (1997)).
Como se usa en la presente memoria, el término "inmunogenicidad" se refiere a la capacidad de estimular el cuerpo para generar anticuerpos específicos o sensibilizar linfocitos. No solo se refiere a las propiedades del antígeno que puede estimular células inmunes específicas para inducir la activación, proliferación y diferenciación de las células inmunitarias y, en última instancia, la producción de sustancias efectoras inmunes, como anticuerpos, y puede sensibilizar a los linfocitos, sino que también se refiere a las respuestas inmunitarias específicas del sistema inmunológico del cuerpo para producir anticuerpos o sensibilizar a los linfocitos T después de la estimulación del cuerpo por el antígeno. La inmunogenicidad es la propiedad más importante del antígeno. El que un antígeno pueda inducir con éxito una respuesta inmune en un huésped depende de tres factores: la naturaleza del antígeno, la reactividad del huésped y la forma de inmunización.
Como se usa en la presente memoria, el término "unión específica" se refiere a la reacción de unión no aleatoria entre dos moléculas, tal como la reacción entre un anticuerpo y su antígeno diana. En algunas realizaciones, un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno (o un anticuerpo específico para un antígeno) significa que el anticuerpo se une al antígeno con una afinidad (Kd) menos de aproximadamente 1°'5 M, por ejemplo, menos de aproximadamente 1°'6 M, 10'7 M, 10'8 M, 1°'9 M, o 10'1° M o menos.
Como se usa en la presente memoria, el término "Kd" se refiere a la constante de disociación de equilibrio de una interacción anticuerpo-antígeno particular, que se usa para describir la afinidad de unión entre el anticuerpo y el antígeno. Cuanto menor sea la constante de disociación de equilibrio, más estrecha será la unión anticuerpoantígeno y mayor será la afinidad entre el anticuerpo y el antígeno. En general, un anticuerpo (por ejemplo, los anticuerpos monoclonales 4B3, 13A10, 12B9 o 4H4 de la presente invención) se unen al antígeno (por ejemplo, la proteína L1) con una constante de equilibrio de disociación (Kd) menos de aproximadamente 1°'5 M, por ejemplo, menos de aproximadamente 1°'6 M, 1°'7 M, 1°'8 M, 1°'9 M, o 10'1° M o menos, por ejemplo, determinada con el uso de resonancia de plasmón de superficie (SPR) en un instrumento BIACORE.
Como se usa en la presente memoria, los términos "anticuerpo monoclonal" y "AcM, tienen el mismo significado y pueden usarse indistintamente. Además, los términos "anticuerpo policlonal" y "AcP" tienen el mismo significado y pueden usarse indistintamente. Nuevamente, los términos "polipéptido" y "proteína" tienen el mismo significado y pueden usarse indistintamente. Además, en la presente invención, los aminoácidos se representan generalmente por abreviaturas de una o tres letras bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, la alanina puede estar representada por A o Ala.
Como se usa en la presente memoria, los términos "hibridoma" y "línea de células de hibridoma" pueden usarse indistintamente. Además, cuando se hace referencia al término "hibridoma" o "línea de células de hibridoma", también comprende los subclones y las células descendientes del hibridoma. Por ejemplo, cuando se hace referencia a la línea de células de hibridoma 4B3, también comprende los subclones y las células descendientes de la línea de células de hibridoma 4B3.
Como se usa en la presente memoria, el término "vector y/o excipiente farmacéuticamente aceptable" se refiere a un vector y/o excipiente compatible con el sujeto y el componente activo en farmacología y/o fisiología, que son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Ciencias farmacéuticas de Remington. Editado por Gennaro AR, 19a ed. Pensilvania: Mack Publishing Company, 1995), e incluyen pero no se limitan a: agente de ajuste del pH, tensioactivo, adyuvante, potenciador de la intensidad iónica. Por ejemplo, el agente de ajuste del pH incluye pero no se limita a tampón fosfato; tensioactivo incluye, pero no se limita a, tensioactivo catiónico, aniónico o no iónico, por ejemplo, Tween-80; y el potenciador de la intensidad iónica incluye, pero no se limita a, cloruro de sodio.
Como se usa en la presente memoria, el término "adyuvante" se refiere a un potenciador inmune no específico, que puede mejorar la respuesta inmune del cuerpo al antígeno o cambiar el tipo de respuesta inmune cuando se administra junto con un antígeno o por adelantado en el cuerpo. Hay muchos adyuvantes, que incluyen, pero no se limitan a, adyuvante de aluminio (por ejemplo, hidróxido de aluminio), adyuvante de Freund (por ejemplo, adyuvante completo de Freund y adyuvante incompleto de Freund), Corynebacterium parvum, lipopolisacárido, citoquina y similares. El adyuvante de Freund es el más utilizado en ensayos con animales en la actualidad, y el hidróxido de aluminio es el más utilizado en experimentos clínicos.
Como se usa en la presente memoria, el término "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad suficiente para lograr o al menos lograr parcialmente los efectos deseados. Por ejemplo, cantidad profilácticamente eficaz para una enfermedad (por ejemplo, Una enfermedad asociada con la unión excesiva de CTLA4 a B7 o actividad CTLA4 como un tumor) se refiere a una cantidad suficiente para prevenir, detener o retrasar el desarrollo de una enfermedad (por ejemplo enfermedad asociada con la unión excesiva de CTLA4 a B7 o actividad CTLA4 como un tumor); y la
cantidad terapéuticamente eficaz para una enfermedad se refiere a una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente una enfermedad y sus complicaciones en un paciente que padece la enfermedad. Está bien dentro de las habilidades de los expertos en la técnica determinar dicha cantidad eficaz. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz dependerá de la gravedad de la enfermedad a tratar, el estado general del sistema inmunológico del paciente, el estado general del paciente, por ejemplo, la edad, el peso corporal y el sexo, el modo de administración del medicamento. agente, otras terapias administradas simultáneamente y similares.
Efectos beneficiosos de la invención
El anticuerpo monoclonal 8D2 y sus anticuerpos humanizados de la presente invención pueden unirse específicamente muy bien a CTLA4. Entre ellos, los anticuerpos 8D2 y 8D2 (Re) se unen al antígeno CTLA4 murino con una eficacia de unión mejor que los anticuerpos de control 10D1 (Alan J. Korman, Edward L. Halk, y otros., HUMAN CTLA-4 ANTICUERPOS, Estados Unidos Patente No. US 6984720 B1) y 11.2.1 (Douglas Charles Hanson, Mark Joseph Neveu, y otros., anticuerpos monoclonales humanos contra CTLA-4, patente de Estados Unidos núm.
US 682736 B1). El anticuerpo humanizado 8D2H1L1 se une al antígeno CTLA4 murino con una eficacia de unión mejor que el anticuerpo de control 10D1, y comparable a 11.2.1. El anticuerpo humanizado 8D2H2L2 se une al antígeno CTLA4 humano con una eficacia de unión comparable a la del 10D1. Los anticuerpos humanizados 8D2H2L2 y 8D2H3L3 se unen al antígeno CTLA4 de mono con una eficacia de unión comparable a la de 10D1. Los anticuerpos 8D2H2L15 y 8D2H2L17 se unen al antígeno CTLA4 humano con una eficacia de unión mejor que los anticuerpos de control 10D1 y 11.2.1.
Los anticuerpos 8D2, 8D2 (Re) y los anticuerpos humanizados 8D2 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 y 8D2H2L17 pueden competir con B7 por unirse al antígeno CTLA4. Entre ellos, 8D2, 8D2 (Re), 8D2H1L1 y 8D2H2L2 son más fuertes que 10D1 al competir con B7-2 por unirse a CTLA4; y 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 y 8D2H2L17 son todos más fuertes que los anticuerpos 10D1 y 11.2.1 al competir con B7-1 y B7-2 por unirse a CTLA4.
El anticuerpo monoclonal 8D2 y sus anticuerpos humanizados de la presente invención pueden bloquear la unión de CLTA4 a B7, aliviar específicamente la inmunosupresión en el cuerpo por CTLA4 y activar los linfocitos T de manera muy eficaz. Entre ellos, 8D2H2L2 y 8D2H2L15 son más fuertes que los anticuerpos de control 10D1 y 11.2.1 en la activación de linfocitos T.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Resultados de SDS-PAGE de la proteína de fusión CTLA4ECD-mFc. Las muestras y sus cantidades de carga en los 4 carriles, de izquierda a derecha, fueron: M, marcador, 10 jl; Proteína de fusión CTLA4ECD-mFc, 1
|jg; Proteína de fusión CTLA4ECD-mFc, 2 jg; Proteína de fusión CTLA4ECD-mFc, 3 jg.
Figura 2. Resultados de SDS-PAGE del anticuerpo 8D2. Las muestras y sus cantidades de carga en los 4 carriles, de izquierda a derecha, fueron: M, marcador, 10 jL; una muestra de anticuerpo en el tampón de carga reductor para electroforesis de proteínas, 0,3 jg; el tampón de carga no reductor para electroforesis de proteínas, 2 jL; una muestra de anticuerpo en el tampón de carga no reductor para electroforesis de proteínas, 0,3 pg.
Figura 3. Resultados de SDS-PAGE del anticuerpo recombinante 8D2 (8D2 (Re)). Las muestras y sus cantidades de carga en los 4 carriles, de izquierda a derecha, fueron: M, marcador, 10 jL; una muestra de anticuerpo en el tampón de carga reductor para electroforesis de proteínas, 1 jg; el tampón de carga no reductor para electroforesis de proteínas, 2 jL; una muestra de anticuerpo en el tampón de carga no reductor para electroforesis de proteínas, 1 jg.
Figura 4. Resultados de SDS-PAGE del anticuerpo humanizado de 8D2, 8D2H1L1. Las muestras y sus cantidades de carga en los 4 carriles, de izquierda a derecha, fueron: M, marcador, 10 jL; una muestra de anticuerpo en el tampón de carga reductor para electroforesis de proteínas, 1 jg; el tampón de carga no reductor para electroforesis de proteínas, 2 jL; una muestra de anticuerpo en el tampón de carga no reductor para electroforesis de proteínas, 1 jg.
Figura 5. Resultados de SDS-PAGE del anticuerpo humanizado de 8D2, 8D2H2L2. Las muestras y sus cantidades de carga en los 4 carriles, de izquierda a derecha, fueron: M, marcador, 10 jL; una muestra de anticuerpo en el tampón de carga reductor para electroforesis de proteínas, 1 jg; el tampón de carga no reductor para electroforesis de proteínas, 2 jL; una muestra de anticuerpo en el tampón de carga no reductor para electroforesis de proteínas, 1 jg.
Figura 6. Resultados de SDS-PAGE del anticuerpo humanizado de 8D2, 8D2H3L3. Las muestras y sus cantidades de carga en los 4 carriles, de izquierda a derecha, fueron: M, marcador, 10 jL; una muestra de anticuerpo en el tampón de carga reductor para electroforesis de proteínas, 1 jg; el tampón de carga no reductor
para electroforesis de proteínas, 2 pL; una muestra de anticuerpo en el tampón de carga no reductor para electroforesis de proteínas, 1 pg.
Figura 7. Resultados de SDS-PAGE del anticuerpo humanizado de 8D2, 8D2H2L15. Las muestras y sus cantidades de carga fueron: M, marcador, 10 pL; una muestra de anticuerpo en el tampón de carga no reductor para electroforesis de proteínas, 1 pg; una muestra de anticuerpo en el tampón de carga reductor para electroforesis de proteínas, 1 pg.
Figura 8. Resultados de SDS-PAGE del anticuerpo humanizado de 8D2, 8D2H2L17. Las muestras y sus cantidades de carga fueron: M, marcador, 10 pL; una muestra de anticuerpo en el tampón de carga no reductor para electroforesis de proteínas, 1 pg; una muestra de anticuerpo en el tampón de carga reductor para electroforesis de proteínas, 1 pg.
Figura 9. Resultados de la determinación de los parámetros característicos dinámicos del AcM 8D2.
Figura 10. Resultados de la determinación de los parámetros dinámicos característicos de 8D2H1L1. Figura 11. Resultados de la determinación de los parámetros dinámicos característicos de 8D2H2L2. Figura 12. Resultados de la determinación de los parámetros dinámicos característicos de 8D2H3L3. Figura 13. Resultados de la determinación de los parámetros dinámicos característicos de 8D2H2L15. Figura 14. Resultados de la determinación de los parámetros dinámicos característicos de 8D2H2L17. Figura 15. Un histograma que muestra la expresión de CTLA4 en células 293F no marcadas, control de isotipo y células 293F-CTLA4 detectadas mediante citometría de flujo (número de células-fluorescencia (FITC)).
Figura 16. Intensidad media de fluorescencia (MFI) de la expresión de CTLA4 en células 293F no marcadas, control de isotipo y células 293F-CTLA4 detectadas mediante citometría de flujo.
Figura 17. La EC50 resultados de la unión del AcM 8D2 a las células 293F-CTLA4 marcadas.
Figura 18. La EC50 resultados de la unión del anticuerpo 8D2(Re) a las células 293F-CTLA4 marcadas.
Figura 19. La EC50 resultados de la unión de 8D2H1L1 a las células 293F-CTLA4 marcadas.
Figura 20. La EC50 resultados de la unión de 8D2H2L2 a las células 293F-CTLA4 marcadas.
Figura 21. La EC50 resultados de la unión de 8D2H3L3 a las células 293F-CTLA4 marcadas.
Figura 22. Determinación de la unión de los anticuerpos 8D2, 8D2H1L1 y 8D2(Re) a CTLA4 mediante el procedimiento de ELISA.
Figura 23. Determinación de la unión de los anticuerpos recombinantes 8D2H2L2 y 8D2H3L3 a CTLA4 humano mediante el procedimiento de ELISA.
Figura 24. Determinación de la unión de los anticuerpos recombinantes 8D2H2L2 y 8D2H3L3 a CTLA4 de mono mediante el procedimiento de ELISA.
Figura 25. Determinación de la unión de los anticuerpos recombinantes 8D2H2L15 y 8D2H2L17 a CTLA4 de mono mediante el procedimiento de ELISA.
Figura 26. Resultados de ELISA para la competencia de los anticuerpos 8D2, 8D2H1L1 y 8D2(Re) con B7-1. Figura 27. Resultados de ELISA para la competencia de los anticuerpos 8D2, 8D2H1L1 y 8D2(Re) con B7-2. Figura 28. Resultados de ELISA para la competencia de los anticuerpos 8D2H2L2 y 8D2H3L3 con B7-1. Figura 29. Resultados de ELISA para la competencia de los anticuerpos 8D2H2L2 y 8D2H3L3 con B7-2. Figura 30. Resultados de ELISA para la competencia de los anticuerpos 8D2H2L15 y 8D2H2L17 con B7-1. Figura 31. Resultados de ELISA para la competencia de los anticuerpos 8D2H2L15 y 8D2H2L17 con B7-2.
Figura 32. Efectos sobre el nivel de secreción de IL-2 por los linfocitos T detectados por el procedimiento de ELISA después de un cocultivo de 72 horas con células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células Raji y los anticuerpos humanizados 8D2H1L1, 8D2H2L2 o 8D2H3L3, respectivamente. Los resultados muestran que los anticuerpos humanizados del AcM 8D2 aumentaron la secreción de IL-2 por los linfocitos T al prevenir el receptor de CTLA4.
Figura 33. Efectos sobre el nivel de secreción de IL-2 por los linfocitos T detectados por el procedimiento de ELISA después de un cocultivo de 72 horas con células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células Raji y los anticuerpos humanizados 8D2H2L15 o 8D2H2L17, respectivamente. Los resultados muestran que los anticuerpos humanizados del AcM 8D2 aumentaron la secreción de IL-2 por los linfocitos T al prevenir el receptor de CTLA4.
Figura 34. La curva de crecimiento del tumor trasplantado subcutáneamente en el modelo hu-SCID-raji tratado con 8D2H2L2.
Realizaciones específicas
Las realizaciones de la invención se describirán a continuación en detalle con referencia a los Ejemplos. Los expertos en la técnica comprenderán que se proporcionan los siguientes ejemplos para ilustrar la invención. Los ejemplos, para los cuales no se describen técnicas o condiciones específicas, se realizaron utilizando las técnicas o condiciones divulgadas en la literatura de la técnica (por ejemplo, escrito por J. Sambrook y otros, Traducido por Peitang HUANG y otros, Clonación molecular: manual de laboratorio, tercera edición, Science Press) o siguiendo las instrucciones proporcionadas con los productos. Los reactivos e instrumentos, para los que el proveedor no está indicado, son productos convencionales que están disponibles comercialmente.
En los siguientes ejemplos de la invención, los ratones BALB/C se adquirieron en el Guangdong Medical Laboratory Animal Center.
En los siguientes ejemplos de la invención, las células T utilizadas se obtuvieron de Akeso Biopharma Inc., Zhongshan.
El anticuerpo de control, 10D1, se preparó de acuerdo con Patente de Estados Unidos No. 6984720 B1; y 11.2.1 según US 6682736 B1.
Ejemplo l. Generación de la línea de células de hibridoma CTLA4-8D2 LT001 y preparación del anticuerpo monoclonal 8D2
Se expresó CTLA4 recombinante en un sistema de expresión de células de mamífero para inmunizar ratones como antígeno, y se obtuvieron células de hibridoma fusionando células de bazo de ratón con células de mieloma. Se obtuvo una línea de células de hibridoma (la línea de células LT001 de hibridoma CTLA4-8D2) después del cribado un gran número de muestras. Dicha línea de células podría secretar el anticuerpo monoclonal 8D2, que se une específicamente a CTLA4. Los procedimientos específicos se describen a continuación.
1. Síntesis del gen CTLA4ECD-mFc
De acuerdo con el diseño (SEQ ID NO: 3), la secuencia aminoacídica (SEQ ID NO: 2) correspondiente al fragmento extracelular del gen CTLA4 (antígeno de linfocito T citotóxico 4, Citotoxic T-Lymphocyte Antigen 4, NCBI ID del Gen: 1493, SEQ ID NO: 1) (CTLA4ECD) se fusionó con el fragmento de proteína Fc de IgG de ratón (mFc), en el que mFc se refiere al fragmento de proteína Fc de IgG de ratón con la secuencias aminoacídicas como se muestra en la parte subrayada de SEQ ID NO: 3.
Para aumentar la eficiencia de expresión del gen de interés en el sistema de expresión de células 293f, la secuencia de ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO: La secuencia de la proteína 3 se optimizó en Genscript Co., principalmente teniendo en cuenta factores como la preferencia de codón, el contenido de GC, las estructuras secundarias del ARNm y las secuencias repetidas. El gen optimizado final que codifica la proteína de fusión CTLA4ECD-mFc tiene la siguiente secuencia (SEQ ID NO: 4) y se sintetizó en Genscript Co..
La secuencia del gen CTLA4ECD (375 pb):
GCAATGCACGTGGCCCAGCCTGCTGTGGTACTGGCCAGCAG
C CGAGGC ATCGC C AGC TTTGTGTGTGAGT ATGC ATC TC C AGGC A
AAGCCACTGAGGTCCGGGTGACAGTGCTTCGGCAGGCTGACAG
CCAGGTGACTGAAGTCTGTGCGGCAACCTACATGATGGGGAAT
GAGTTGACCTTCCTAGATGATTCCATCTGCACGGGCACCTCCAG
TGGAAATCAAGTGAACCTCACTATCCAAGGACTGAGGGCCATGG
ACACGGGACTCTACATCTGCAAGGTGGAGCTCATGTACCCACCG
C C AT ACT ACC TGGGC AT AGGC AACGGAAC CC AGATTT ATGT AAT
TGATCCAGAACCGTGCCCAGATTCTGAC ( SEQ ID NO: 1 )
La secuencia de la proteína codificada por CTLA4ECD (125 aa):
AMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADS
QVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDT
GLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSD ( SEQ ID NO:
2 )
La secuencia de la proteína de fusión CTLA4ECD-mFc (364 aa):
en la que la parte CTLA4ECD está subrayada con una línea ondulada y la parte mFc está subrayada con una línea continua.
AMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADS QVTEyCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQYNLTIQGLRAMDT GLYICKyELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDENLYFQGPRG PTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKPyLMISLSPIVTCyyyDVS EDDPDVOISWFVNNyEVHTAOTOTHREDYNSTLRVVSALPIQHQD WMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQyYyLPPPEEEM TKKQVTLTCMyTDFMPEDIYyEWTNNGKTELNYKNTEPyLDSDGS YFMYSKLRVEKKNWyERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK (SE Q ID NO: 3 )
La secuencia codificante del gen correspondiente a la proteína de fusión CTLA4ECD-mFc (1092 pb):
en la que la parte CTLA4ECD está subrayada con una línea ondulada y la parte mFc está subrayada con una línea continua.
GCAATGCATGTCGCACAGCCTGCAGTGGTCCTGGCAAGCTC
CAGGGGAATCGCTAGCTTCGTGTGCGAATACGCTTCCCCAGGCA
AGGCAACCGAGGTCCGGGTGACAGTCCTGAGACAGGCCGACAG
OCAGGTGACAGAAGTOIGCGOCGOAOXáXAIGATGGGCAACG
AGCTGACCTTTCTGGACGATAGCATTTGTACCGGGACATCTAGT
GGAAACCAAGTGAATCTGACCATCCAGGGCCTGCGCGCTATGG
ACACAGGGCTGTACATTTGTAAAGTGGAGCTGATGTATCCCCCT
C C AT AC T ATC TGGGAATCGGC A AC GGGACC C AG ATCT AC GTG AT
TGATCCTGAACCATGCCCCGACTCCGATGAGAATCTGTATTTCC
AGGGACCACGAGGCCCCACAATTAAGCCATGTCCCCCTTGCAAA
TGTCCTGCACCAAACCTGCTGGGAGGACCAAGCGTGTTCATCTT
TCCACCCAAGATCAAGGACGTGCTGATGATCTCACTGAGCCCCA
TTGTGACCTGCGTGGTCGTGGACGTGAGCGAGGACGATCCTGA
TGTGCAGATCAGTTGGTTCGTCAACAATGTGGAAGTCCACACAG
C TC AGAC TC AG ACC C AT AGGGAGGAT T AC AAT AGT AC TC TGCGC
GTCGTGTCAGCACTGCCCATTCAGCACCAGGACTGGATGAGCG
GCAAGGAGTTCAAGTGCAAAGTGAACAACAAGGATCTGCCCGC
ACCTATCGAGAGAACTATTTCCAAGCCTAAAGGGTCTGTGAGGG
CCCCACAGGTGTATGTCCTGCCTCCACCCGAGGAAGAGATGACT
AAGAAACAGGTGACACTGACTTGTATGGTCACCGACTTCATGCC
CGAAGATATCTACGTGGAGTGGACTAACAATGGGAAGACCGAA
CTGAACTATAAAAATACAGAGCCTGTGCTGGACTCAGATGGAAG
CTACTTTATGTATAGCAAGCTGCGAGTGGAAAAGAAAAACTGGG
TCGAGCGGAACAGCTACTCTTGTAGTGTGGTCCACGAAGGGCTG
CATAATCACCACACCACTAAATCATTCTCCCGAACTCCAGGCAA
A ( SEQ ID NO: 4 )
2. Generación del plásmido pUC57simple-CTLA4ECD-mFc
El gen de fusión CTLA4ECD-mFc sintetizado (SEC ID NO: 4) se clonó en el vector de expresión pUC57simple (proporcionado por Genscript Co.) en Genscript Co., dando como resultado el plásmido pUC57simple-CTLA4ECD-mFc.
3. Construcción del plásmido recombinante pcDNA3.1-CTLA4ECD-mFc
El plásmido pUC57simple-CTLA4ECD-mFc se digirió con las endonucleasas Xba I y BamH I. El fragmento del gen de fusión CTLA4ECD-mFc se recuperó mediante electroforesis y se ligó en el vector de expresión pcDNA3.1 (adquirido de Invitrogen Co.). El plásmido pcDNA3.1-CTLA4ECD-mFc resultante se utilizó para transfectar las células competentes de la cepa DH5a de E. coli (comprado a TIANGEN Co.). La transfección y el cultivo se realizaron siguiendo las instrucciones. Las colonias de E. coli positivas para pcDNA3.1-CTLA4ECD-mFc se
seleccionaron y se propagaron siguiendo procedimientos convencionales. Luego, se extrajo el plásmido recombinante pcDNA3.1-CTLA4ECD-mFc usando un kit (adquirido de Tiangen Biotech (Beijing) Co. LTD, DP103-03) siguiendo las instrucciones proporcionadas con el kit.
4. Se transfectaron células de 293F (adquiridas de Invitrogen Co.) con el plásmido recombinante pcDNA3.1-CTLA4ECD-mFc usando el kit de transfección de lipofectamina (adquirido de Invitrogen Co.).
5. Siete días después de la transfección de células 293F con el plásmido recombinante pcDNA3.1-CTLA4ECD-mFc, la proteína de fusión CTLA4ECD-mFc se purificó del líquido de cultivo mediante centrifugación a alta velocidad, filtración al vacío a través de una membrana de filtro microporosa y cromatografía en columna HP de proteína A HiTrap. Después de la purificación, se tomaron muestras, se añadieron al tampón de carga reductor para electroforesis de proteínas y se examinaron mediante electroforesis SDS-PAGE. Como se muestra en la Figura 1, la proteína de interés se muestra como una banda a aproximadamente 45 kD.
6. Generación de la línea de células de hibridoma CTLA4-8D2 LT001
Usando la proteína de fusión CTLA4ECD-mFc como antígeno, se obtuvieron células de hibridoma fusionando las células esplénicas de los ratones BALB/C inmunizados (adquiridos en el Guangdong Medical Laboratory Animal Center) con células de mieloma de ratón siguiendo un procedimiento establecido (por ejemplo, Stewart, SJ, "Producción de anticuerpos monoclonales", en Procedimientos básicos en la producción y caracterización de anticuerpos, Eds. GC Howard y DR Bethell, Boca Raton: CRC Press, 2000).
Se usó CTLA4 como antígeno para recubrir una placa ELISA, y se obtuvieron células de hibridoma que secretaban nuevos anticuerpos que se unían específicamente a CTLA4 mediante un cribado en un ELISA indirecto. Las líneas de células de hibridoma que secretan anticuerpos monoclonales que compitieron con el ligando B7-1 (CD80, NCBI Gene ID: 941) o B7-2 (CD86, NCBI Gene ID: 942) para unirse a CTLA4 se obtuvieron mediante un cribado en un ELISA competitivo del hibridoma células obtenidas en el cribado del ELISA indirecto. Se obtuvo una línea de células de hibridoma estable mediante dilución limitada. La línea de células de hibridoma se designó como línea de células de hibridoma CTLA4-8D2, y la línea de células estable CTLA4-8D2 se obtuvo mediante dilución limitada (también denominada LT001 en la presente invención; el anticuerpo monoclonal secretado por ella se designó como 8D2). 7. Preparación del anticuerpo 8G2
La línea de células CTLA4-8D2 (LT001) de la presente invención se cultivó en un medio suplementado con suero fetal bovino al 10 % con baja IgG. Siete días después, se recogió el sobrenadante del cultivo de células para purificar el anticuerpo 8D2.
8. Detección del anticuerpo 8D2 por SDS-PAGE
Las muestras purificadas se añadieron al tampón de carga reductor para electroforesis de proteínas y al tampón de carga no reductor para electroforesis de proteínas. Después de hervir, se realizó la detección. Los resultados muestran que la proteína de interés se muestra como dos bandas a aproximadamente 50 kD y 25 kD para la muestra de proteína reducida, o como una banda a aproximadamente 150 kD para la muestra de proteína no reducida (Figura 2).
Ejemplo 2. Determinación de las secuencias de cadena ligera y cadena pesada del anticuerpo monoclonal 8D2 Siguiendo las instrucciones del kit de extracción de ARN total de células/bacterias en cultivo (Tiangen, Cat. No. DP430), se extrajo ARNm de la línea de células de hibridoma CTLA4-8D2 (células LT001) generada en el Ejemplo 1. Siguiendo las instrucciones del kit Invitrogen SuperScript® III First-Strand Synthesis System para RT-PCR, se sintetizó y amplificó el ADNc mediante PCR. El producto de amplificación por PCR se sometió inmediatamente a clonación TA, siguiendo las instrucciones del kit de clonación pEASY-T1 (TransGen, n° de cat. CT101). El producto de la clonación de TA se sometió inmediatamente a secuenciación y los resultados de secuenciación se proporcionan a continuación.
Los resultados de la secuenciación del ADN de la región variable de la cadena pesada (345 pb):
GAGGTGAAACTGGACGAAACTGGCGGGGGGCTGGTGCAGC
CCGGACGACCTATGAAGCTGTCATGCGTCGCCAGCGGCTTCACC
TTTAGCGACAACTGGATGAATTGGGTGAGGCAGAGCCCAGAGA
AGGGGCTGGAATGGCTGGCTCAGATCCGCAACAAACCCTACAAT
T AT G AG AC C T AC T ATT C T G AC AGT GT G AAGGGC C GGT T C AC AAT
TTCCAGAGACGATTCTAAAAGCTCCGTCTACCTGCAGATGAACA
ATCTGAGAGGCGAAGATATGGGGATCTACTATTGCACAGCACAG
TTCGCTTATTGGGGACAGGGCACTCTGGTCACAGTCTCCGCC
( S E Q I D N O : 5 )
La secuencia de proteínas codificada por ella (115 aa):
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDNWMNWVRQSP
EKGLE WL AQIRNKP YN YE T YY SD S VKGRFTIS RDD SKS S V YLQMNN
LRGEDMGIYYCTAQFAYWGQGTLVTYSA ( SEQ ID NO: 6 )
Los resultados de la secuenciación del ADN de la región variable de la cadena ligera (318 pb):
GACATTCAGATGACACAGAGTCCTGCTTCCCTGAGTGCCTC
AGTGGGGGAGACCGTCACAATCACTTGCGGCACCTCTGAAAACA
TCTACGGCGGGCTGAATTGGTATCAGCGGAAGCAGGGCAAAAG
TCCCCAGCTGCTGATCTTCGGAGCAACAAACCTGGCCGACGGCA
TGAGCTCCCGGTTTAGCGGGTCCGGATCTGGCAGACAGTACAG
CCTGAAGATTTCTAGTCTGCACCCAGACGATGTGGCTACTTACT
ATTGCCAGAATGTCCTGAGGAGTCCCTTCACCTTTGGGTCAGGA
ACAAAGCTGGAGATC ( SEQ ID NO: 7 )
La secuencia de proteínas codificada por ella (106 aa):
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCGTSENIYGGLNWYQRKQGKS
PQLLIFGATNLADGMSSRFSGSGSGRQYSLKISSLHPDDVATYYCQN
VLRSPFTFGSGTKLEI ( SEQ ID NO: 8 )
Ejemplo 3. Diseño de las secuencias de cadena ligera y cadena pesada de los anticuerpos humanizados 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 y 8D2H2L17
En base a la estructura cristalina tridimensional de la proteína CTLA4 (Nat. Struct. Biol. (1997) 4, pág. 527) y las secuencias del anticuerpo 8D2 obtenidas en el Ejemplo 2, la estructura del anticuerpo se modeló en ordenador. Las secuencias de región variable de los anticuerpos 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 y 8D2H2L17 se diseñaron en base a las secuencias de anticuerpos y el modelo estructural (las secuencias de región constante de los anticuerpos fueron de la base de datos NCBI). Las secuencias de la región variable se proporcionan a continuación.
1. Las secuencias de cadena ligera y cadena pesada del anticuerpo monoclonal 8D2H1L1
La secuencia de ADN de la región variable de la cadena pesada (345 pb):
GAAGTGCAGCTGGTCGAGTCCGGGGGGGGCCTGGTGCAGC
CAGGAGGATCAATGCGACTGAGCTGCGCCGCTTCCGGCTTCACC
TTCAGCGACAACTGGATGAATTGGGTCAGGCAGGCACCAGGAA
AGGGACTGGAGTGGCTGGCACAGATCCGCAACAAACCTTACAA
C TAC GAAACTT AC T AC AGCGAC TC CGTGAAGGGGC GGTTC AC C A
TTTCTAGAGACGATTCTAAAAACAGTGTGTACCTGCAGATGAAT
AGCCTGAAGACCGAGGATACAGGAGTCTACTATTGTACCGCACA
GTTTGCTTATTGGGGGCAGGGCACTCTGGTGACAGTCTCTTCA
( S E Q I D N O : 9 )
La secuencia de proteínas codificada por ella (115 aa):
EVQLVESGGGLVQPGGSMRLSCAASGFTFSDNWMNWYRQAP
GKGLEWLAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKNSVYLQMNS
LKTEDTGVYYCTAQFAYWGQGTLVTVSS ( SEQ ID NO: 10 )
La secuencia de ADN de la región variable de la cadena ligera (321 pb):
GACATTCAGATGACTCAGAGCCCTTCAAGCCTGTCCGCATC
TGTGGGCGACCGAGTCACCATCACATGCAGAACCTCCGAGAACA
TCTACGGCGGGCTGAATTGGTATCAGCGAAAGCAGGGGAAAAG
TCCCAAGCTGCTGATCTACGGGGCAACAAACCTGGCCAGCGGA
ATGAGCTCCAGATTCAGTGGATCAGGCAGCGGGACAGATTATAC
TCTGAAAATTTCTAGTCTGCACCCAGACGATGTGGCAACCTACT
ATTGCCAGAATGTCCTGAGGTCACCCTTCACCTTTGGAAGCGGC
ACAAAACTGGAGATCAAG ( SEQ ID NO: 11 )
La secuencia de proteínas codificada por ella (107 aa):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSENIYGGLNWYQRKQGKS
PKLLIY GATNL ASGMSSRFSGSGSGTD YTLKIS SLHPDD VATYY C QN
VLRSPFTFGSGTKLEIK ( SEQ ID NO: 12 )
2. Las secuencias de cadena ligera y cadena pesada del anticuerpo monoclonal humanizado de 8D2, 8D2H2L2 La secuencia de ADN de la región variable de la cadena pesada (345 pb):
GAAGTGCAGCTGGTCGAGTCCGGGGGGGGCCTGGTGCAGC
CAGGAGGATCAATGCGACTGAGCTGCGCCGCTTCCGGCTTCACC
TTCAGCGACAACTGGATGAATTGGGTCAGGCAGGCACCAGGAA
AGGGACTGGAGTGGCTGGCACAGATCCGCAACAAACCTTACAA
CTACGAAACTTACTACAGCGCCTCCGTGAAGGGGCGGTTCACCA
TTTCTAGAGACGATTCTAAAAACAGTGTGTACCTGCAGATGAAT
AGCCTGAAGACCGAGGATACAGGAGTCTACTATTGTACCGCACA
GTTTGCTTATTGGGGGCAGGGCACTCTGGTGACAGTCTCTTCA
( S E Q I D N O : 13 )
La secuencia de proteínas codificada por ella (115 aa):
EVQLVESGGGLVQPGGSMRLSCAASGFTFSDNWMNWVRQAP
GKGLEWLAQIRNKPYNYETYYSASVKGRFTISRDDSKNSVYLQMNS
LKTEDTGVYYCTAQFAYWGQGTLVTVSS ( S E Q I D N O : 14)
La secuencia de ADN de la región variable de la cadena ligera (321 pb):
GACATTCAGATGACTCAGAGCCCTTCAAGCCTGAGTGCCTC
AGTGGGAGACCGGGTCACCATCACATGCAGAACCAGCGAGAAC
ATCTACGGCGGCCTGAACTGGTATCAGCGAAAGCCAGGCAAGA
GCCCCAAGCTGCTGATCTACGGGGCAACCAACCTGGCCTCTGGA
GTGAGCTCCAGATTCAGCGGCAGCGGCTCTGGGACCGACTATA
CTCTGACCATTTCTAGTCTGCAGCCTGAAGATGTGGCAACATAC
TATTGCCAGAATGTCCTGAGGTCCCCATTCACCTTTGGATCTGG
CACCAAGCTGGAGATCAAG ( SEQ ID NO: 15 )
La secuencia de proteínas codificada por ella (107 aa):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSENIYGGLNWYQRKPGKSP
KLLIYGATNLASGVSSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCQNV
LRSPFTFGSGTKLEIK ( SEQ ID NO: 16 )
3. Las secuencias de cadena ligera y cadena pesada del anticuerpo monoclonal humanizado de 8D2, 8D2H3L3 La secuencia de ADN de la región variable de la cadena pesada (345 pb):
GAGGTGC AGC TGGTC GAGTC TGGAGGCGGCCTGGTGC AGC
CCGGCGGGTCACTGCGACTGAGCTGCGCCGCTTCCGGCTTCAC
C TTC AGC G AC AAC TGGATGAATTGGGTGAGGC AGGC AC CC GGG
AAGGGGCTGGAGTGGGTCGCTCAGATCCGCAACAAACCTTACA
ATTATGAGACAGAATACGCAGCCTCTGTGAAGGGGCGGTTCACT
ATT AGT AGAGACGAT AGC AAGA AC AGC GC C T ATC T GC AG ATGA A
T AGCC TGA AGAC C GAAGAT AC AGCCGTC TAC T ATTGT AC AGC TC
AGTTTGCATACTGGGGCCAGGGAACTCTGGTGACCGTCAGCTCC
( S E Q I D N O : 17)
La secuencia de proteínas codificada por ella (115 aa):
E V QL VE SGGGL V QPGGSLRL SC AAS GFTF SDN WMN WVRQ APG
KGLE W VAQIRNKP YN YETE YAAS VKGRFTISRDD SKN S A YLQMN SL
KTEDTAVYYCTAQFAYWGQGTLVTVSS ( SEQ ID NO: 18 )
La secuencia de ADN de la región variable de la cadena ligera (321 pb):
GACATTCAGATGACTCAGAGCCCTTCTTCTCTGTCCGCATCT
GTGGGAGACCGGGTCACCATCACATGCAGAGCCAGCGAGAACA
TCTACGGCGGCCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCAAAGC
TCCCAAGCTGCTGATCTACGGAGCAACCTCCCTGGCATCTGGAG
TGCCATCCCGGTTCAGTGGATCAGGCAGCGGGACCGACTATACT
CTGACCATTAGCTCCCTGCAGCCTGAAGACTTCGCCACATACTA
TTGCCAGAACGTGCTGAGGTCCCCATTCACCTTTGGATCTGGCA
CCAAGCTGGAGATCAAG ( SEQ ID NO: 19 )
La secuencia de proteínas codificada por ella (107 aa):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYGGLNWYQQKPGKA
PKLLIYGATSLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQNV
LRSPFTFGSGTKLEIK ( SEQ ID NO: 20 )
4. Las secuencias de cadena ligera y cadena pesada del anticuerpo monoclonal humanizado de 8D2, 8D2H2L15 La secuencia de ADN de la región variable de la cadena pesada (345 pb):
GAAGTGCAGCTGGTCGAGTCCGGGGGGGGCCTGGTGC
AGCCAGGAGGATCAATGCGACTGAGCTGCGCCGCTTCCGG
CTTCACCTTCAGCGACAACTGGATGAATTGGGTCAGGCAGG
CACCAGGAAAGGGACTGGAGTGGCTGGCACAGATCCGCAA
C AAACCTT AC AACT ACGAAACTT ACT AC AGCGCCTCCGT GA
AGGGGCGGTTCACCATTTCTAGAGACGATTCTAAAAACAGT
GTGTACCTGCAGATGAATAGCCTGAAGACCGAGGATACAGG
AGTCTACTATTGTACCGCACAGTTTGCTTATTGGGGGCAGG
GCACTCTGGTGACAGTCTCTTCA ( SEQ ID NO: 13 )
La secuencia de proteínas codificada por ella (115 aa):
EVQLVESGGGLVQPGGSMRLSCAASGFTFSDNW MNW VR
QAPGKGLEW LAQIRNKPYNYETYYSASVKGRFTISRDDSKNSV
YLQMNSLKTEDTGVYYCTAQFAYW GQGTLVTVSS ( SEQ ID
NO: 14)
La secuencia de ADN de la región variable de la cadena ligera (321 pb):
GACATCCAGATGACTCAGTCTCCCAGCTCCCTGTCCGC
TTCTGTGGGCGATCGGGTCACTATCACCTGTAGAACCAGCG
AGAACATTTACGGCGGACTGAATTGGTATCAGAGGAAGCCC
GGGAAAAGTCCTAAGCTGCTGATCTACGGAGCAACAAACCT
GGCCTCCGGCGTGTCTAGTCGCTTCAGTGGATCAGGCAGCG
GGACCGACTATACACTGACTATTTCAAGCCTGCAGCCAGAG
GATGTGGCCACATACTATTGCCAGAATGTCCTGAGCCGGCA
CCCCGGATTTGGCTCAGGGACCAAACTGGAAATTAAG ( SEQ
ID NO: 21 )
La secuencia de proteínas codificada por ella (107 aa):
DIQMTQSPSSLSASYGDRYTITCRTSENIYGGLNW YQRKP
GKSPKLLIYGATNLASGVSSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVAT
YYCQNVLSRHPGFGSGTKLEIK ( SEQ ID NO: 22 )
5. Las secuencias de cadena ligera y cadena pesada del anticuerpo monoclonal humanizado de 8D2, 8D2H2L17 La secuencia de ADN de la región variable de la cadena pesada (345 pb):
GAAGTGCAGCTGGTCGAGTCCGGGGGGGGCCTGGTGC
AGCCAGGAGGATCAATGCGACTGAGCTGCGCCGCTTCCGG
CTTCACCTTCAGCGACAACTGGATGAATTGGGTCAGGCAGG
CACCAGGAAAGGGACTGGAGTGGCTGGCACAGATCCGCAA
CAAACCTTACAACTACGAAACTTACTACAGCGCCTCCGTGA
AGGGGCGGTTCACCATTTCTAGAGACGATTCTAAAAACAGT
GTGTACCTGCAGATGAATAGCCTGAAGACCGAGGATACAGG
AGTCTACTATTGTACCGCACAGTTTGCTTATTGGGGGCAGG
GCACTCTGGTGACAGTCTCTTCA ( SEQ ID NO: 13 )
La secuencia de proteínas codificada por ella (115 aa):
EVQLVESGGGLVQPGGSM RLSCAASGFTFSDNW M NW VR
QAPGKGLEW LAQIRNKPYNYETYYSASVKGRFTISRDDSKNSV
YLQM NSLKTEDTGVYYCTAQFAYW GQGTLVTVSS ( SEQ ID
NO: 14)
La secuencia de ADN de la región variable de la cadena ligera (321 pb):
G ACATCCAG ATG ACTCAG TCACCCAG CTCCCTG AG TG
CTTCAG TG G G CG ATCG G G TCACTATCACCTG TAG AACCAG C
G AG AACATTTACG G CG G ACTG AATTG G TATCAG AG G AAG CC
CG G G AAAAG CCCTAAG CTG CTG ATCTACG G AG CAACAAACC
TG GCCTCCG G CG TG TCTAG TCG CTTCAG CG G CAG CG G CTCT
G G A ACC G A CTATA CAC TG A CTA TTTCAA G C CTG CAG CC AG A
G G ATG TG G CCACATACTATTG CCAG AATG TCCTG TCCTCTC
G ACC CG G A TTTG G C AG TG G G ACC AAA CTG G A AATTA AG
( S E Q ID NO: 2 3 )
La secuencia de proteínas codificada por ella (107 aa):
DIQM TQSPSSLSASYGDRVTITCRTSENIYGGLNW YQRKP
GKSPKLLIYGATNLASGVSSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVAT
YYCQNVLSSRPGFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 24)
Ejemplo 4. Preparación del anticuerpo recombinante 8D2, 8D2(Re) y los anticuerpos humanizados 8D2, 8D2H1L1, 8D2H2L3, 8D2H3L3, 8D2H2L15 y 8D2H2L17, y detección por SDS-PAGE
1. Preparación del anticuerpo recombinante 8D2, 8D2 (Re) y detección por SDS-PAGE
La secuencia de cADN de la cadena pesada (su secuencia de región variable se muestra en SEQ ID NO: 5) y la secuencia de cADN de la cadena ligera (su secuencia de región variable se muestra en SEQ ID NO: 7) de 8D2 se clonaron en el pUC57simple vector (proporcionado por Genscript Co.), respectivamente, dando como resultado los plásmidos pUC57simple-8D2H y pUC57simple-8D2L.
Los plásmidos pUC57simple-8D2H y pUC57simple-8D2L se digirieron con las endonucleasas (Hind III y EcoR I), respectivamente. Los fragmentos que codifican la cadena pesada y la cadena ligera recuperados mediante electroforesis se subclonaron por separado en el vector pcDNA3.1. Los plásmidos recombinantes se extrajeron y cotransfectaron en células de 293F. Después de 7 días de cultivo de células, el líquido de cultivo se sometió a centrifugación a alta velocidad, filtración al vacío a través de una membrana de filtro microporosa y purificación en una columna HP HiTrap de proteína A. Las muestras purificadas se añadieron al tampón de carga reductor para electroforesis de proteínas y al tampón de carga no reductor para electroforesis de proteínas. Después de hervir, la detección se realizó mediante SDS-PAGE. Como se muestra en la Figura 3, la proteína de interés se muestra como dos bandas a aproximadamente 50 kD y 25 kD para la muestra de proteína reducida, o como una banda a aproximadamente 150 kD para la muestra de proteína no reducida.
2. Preparación de los anticuerpos humanizados 8D2, 8D2H1L1, 8D2H2L2 y 8D2H3L3, y detección por SDS-PAGE Las secuencias de cADN de la cadena pesada (sus secuencias de región variable se muestran en SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 13, respectivamente) y las secuencias de cADN de la cadena ligera (sus secuencias de región variable se muestran en SeQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, respectivamente) de 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 y 8D2H2L17 se clonaron en el vector pUC57simple (proporcionado por Genscript Co.), respectivamente, lo que dio como resultado los plásmidos pUC57simple-8D2H1L1, pUC57simple-8D2H2L2, pUC57simple-8D2H3L3, pUC57simple-8D2H2L15 y pUC57simple-8D2H2L17. Se subclonaron por separado en el vector pcDNA3.1 siguiendo el procedimiento descrito anteriormente para 8D2(Re).
Los plásmidos recombinantes se transfectaron en células de 293F. El líquido de cultivo de las células 293F se sometió a detección después de la purificación siguiendo el procedimiento descrito anteriormente para 8D2(Re). Los resultados se muestran en la Figura 4, Figura 5, Figura 6, Figura 7 y Figura 8. Las muestras de proteína reducida mostraron las proteínas de interés como dos bandas a aproximadamente 50 kD y 25 kD, y las muestras de proteína no reducida mostraron las proteínas de interés como una banda a aproximadamente 150 kD.
El anticuerpo recombinante 8D2, 8D2 (Re) y los anticuerpos humanizados 8D2, 8D2H1L1, 8D2H2L3, 8D2H3L3, 8D2H2L15 y 8D2H2L17 usados en los siguientes ejemplos se prepararon siguiendo el procedimiento descrito en este ejemplo.
Ejemplo 5. Determinación de los parámetros dinámicos de los anticuerpos
Los parámetros dinámicos de la unión de los anticuerpos 8D2 y 8D2H1L1, 8D2H2L2 y 8D2H3L3 humanizados al antígeno CTLA4 (NCBI Gene ID: 1493, con la secuencia de ácido nucleico codificante como se muestra en SEQ ID NO: 25 y la secuencia aminoacídica codificada como se muestra en SEQ ID NO: 26) se determinaron usando el analizador de interacción molecular Fortebio.
1. La proteína CTLA4-mFc (CTLA4-mFc se generó siguiendo el mismo procedimiento que el descrito en el Ejemplo 1 para la síntesis de CTLA4ECD-mFc) se escindió con la proteasa TEV y el antígeno CTLA4 se obtuvo mediante purificación en una columna.
La secuencia del gen CTLA4 (636 pb):
ATGGGCGTCCTGCTGACTCAGAGAACCCTGCTGTCCCTGGT
GCTGGCACTGCTGTTTCCTTCAATGGCTTCAATGGCTATGCATG
TGGCTCAGCCAGCAGTGGTCCTGGCAAGCTCCAGGGGGATCGC
CAGTTTCGTGTGCGAGTACGCCTCACCTGGAAAGGCTACAGAAG
TCCGGGTGACTGTCCTGAGACAGGCTGACTCTCAGGTGACCGA
GGTCTGCGCCGCTACATATATGATGGGCAACGAACTGACCTTTC
TGGACGATTCCATTTGTACTGGCACCTCTAGTGGGAACCAAGTG
AATCTGACTATCCAGGGACTGCGAGCAATGGACACCGGACTGTA
CATTTGCAAAGTGGAGCTGATGTATCCCCCTCCATACTATCTGG
GCATCGGGAATGGAACACAGATCTACGTGATTGATCCCGAACCT
TGTCCAGACAGCGATTTCCTGCTGTGGATTCTGGCAGCCGTGTC
AAGCGGCCTGTTCTTTTATAGCTTTCTGCTGACTGCCGTCTCCCT
GTC T AAGATGC TGAAGAAAC GATCC CC C CTGAC C AC AGGGGTG
GTCGTGAAAATGCCACCTACCGAGCCCGAGTGCGAAAAACAGTT
CCAGCCATACTTTATCCCTATCAAT ( SEQ ID NO: 25 )
La secuencia aminoacídica codificada correspondiente (212 aa):
MGVLLTQRTLLSLVLALLFPSMASMAMHVAQPAVVLASSRGI
ASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFL
DDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIG
NGTQIYVIDPEPCPDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKMLK
KRSPLTTGVVVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN ( SEQ ID NO: 26 )
2. El anticuerpo 8D2 y sus anticuerpos humanizados 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 y 8D2H2L17 se inmovilizaron en la superficie del sensor AR2G mediante acoplamiento amino y se bloquearon con etanolamina. Después de equilibrar en PBST, se añadió el antígeno CTLA4 para la unión. CTLA4 se diluyó en serie 2x en PBST y se obtuvieron las siguientes concentraciones: 300; 150; 75; 37,5; 18,75; 9,38; 4,69; 0 nM. La disociación ocurrió en PBST. Los anticuerpos humanizados 8D2H1L1, H2L2, H3L3, H2L15 y H2L17 se detectaron mediante un procedimiento similar al 8D2, y las concentraciones de antígeno fueron 180, 90, 45; 22,5; 11,25; 5,625; 2,813; 0 nM.
Los parámetros dinámicos del anticuerpo 8D2 y sus anticuerpos humanizados 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 y 8D2H2L17 se proporcionan en la Tabla 1, y los resultados de la determinación de los parámetros característicos dinámicos se muestran en las Figuras 9 a 14, respectivamente.
Tabla 1. Parámetros dinámicos de los anticuer os 8D2 8D2H1L1 8D2H2L2 8D2H3L3 8D2H2L15 8D2H2L17
continuación
Los resultados demuestran que los seis anticuerpos tienen una buena afinidad por el antígeno, que es comparable o incluso superiora los anticuerpos de control 10D1 y 11.2.1.
Ejemplo 6. Determinación de la actividad de los anticuerpos para unirse al antígeno CTLA4 en la superficie de la línea de células de hibridoma mediante citometría de fluio.
En primer lugar, se generaron células huésped 293F que expresaban el antígeno CTLA4 y se prepararon en la presente invención el etiquetado con el anticuerpo monoclonal 8D2 (Ejemplo 1) y 8D2(Re) y los anticuerpos humanizados 8D28D2H1L1, 8D2H2L2 y 8D2H3L3 (Ejemplo 4) respectivamente. Luego, se verificó la capacidad de los anticuerpos para unirse específicamente al antígeno que tiene conformación nativa en la superficie de las células mediante citometría de flujo.
Las etapas específicas se proporcionan a continuación.
1. Generación de células huésped 293F que expresan el antígeno CTLA4
Se transfectaron células de 293F con el plásmido pLenti6.3-CTLA4 para CTLA4 (el vector pLenti6.3 se adquirió en Invitrogen Co.) utilizando el kit de transfección Lipofectamin (adquirido en Invitrogen Co.). Después del cribado, se obtuvo una población clonal de células que expresan de forma estable CTLA4 (293F-CTLA4).
2. Marcado con los anticuerpos y detección mediante citómetro de fluio
Las células huésped 293F que expresan el antígeno CTLA4 obtenidas mediante los pasos anteriores se digirieron con tripsina siguiendo un procedimiento convencional, y se añadieron 2 ^ 105 células a cada tubo de recogida. Las soluciones diluidas del anticuerpo 8D2 en PBS que contenían BSA al 1 % se prepararon para lograr concentraciones de 20 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, 0,1 nM, 0,01 nM y 0 nM, respectivamente. Después de la incubación con células 293F que expresan CTLA4 en hielo durante 2 horas, se añadieron 100 pl de IgG-FITC-Cabra-Anti-Ratón (1:500) a cada tubo, y los tubos se incubaron en hielo durante 1 hora. Después de la adición de 300 pl de PBS, se detectó la señal fluorescente usando el canal FITC en el citómetro de flujo. Otros anticuerpos se detectaron de forma similar al anticuerpo 8D2.
3. Resultados
Los resultados de verificar la expresión de CTLA4 en células 293F-CTLA4 se muestran en la Figura 15 y la Figura 16, respectivamente. Los resultados de la unión de los anticuerpos 8D2, 8D2(Re) y los tres anticuerpos humanizados a las células 293F se muestran en las Figuras 17 a 21, respectivamente. Como se muestra en las figuras, el anticuerpo 8D2 y sus anticuerpos humanizados pueden unirse eficazmente a la proteína diana CTLA4 en la superficie de la célula huésped 293F, y su eficacia de unión depende de la dosis. Las intensidades fluorescentes en cada dosis se proporcionan en la Tabla 2.
La eficiencia de unión, EC50, de 8D2 y sus anticuerpos humanizados se obtuvo mediante simulación de curva en el análisis cuantitativo fluorescente de los anticuerpos unidos 8D2 y sus anticuerpos humanizados, que se muestra en la Tabla 3.
Tabla 2. Análisis de intensidad fluorescente que determina la unión de los anticuerpos humanizados 8D2, 8D2(Re) y 8D28D2H1L1, 8D2H2L2 y 8D2H3L3 al antígeno CTLA4 en la superficie de la célula huésped 293F-CTLA4 mediante i m rí fl
continuación
Tabla 3. La eficiencia vinculante, EC50, de 8D2, 8D2 (Re) y los anticuerpos humanizados 8D28D2H1L1, 8D2H2L2 y 8D2H3L3 al antígeno CTLA4 en la superficie de la célula huésped 293F-CTLA4 obtenido por simulación de curva en
Los resultados demuestran que los anticuerpos 8D2, 8D2(Re) y los anticuerpos humanizados de 8D2, 8D2H1L1, 8D2H2L2 y 8D2H3L3 tienen todos una capacidad muy fuerte para unirse al antígeno CTLA4 en la superficie de las células huésped 293F-CTLA4.
Ejemplo 7. Determinación de la actividad de los anticuerpos para unirse al antígeno CTLA4 mediante ELISA La placa ELISA se revistió con CTLA4 a 4 °C durante la noche. Después de bloquear con BSA al 1 % a 37 °C durante 2 h, los anticuerpos CTLA4 8D2, 8D2(Re) y los anticuerpos humanizados 8D2 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 y 8D2H2L17, y los anticuerpos de control 1 0 D1 (Alan J. Korman, Edward L. Halk, y otros, ANTICUERPOS HUMANOS CTLA-4, Patente de los Estados Unidos No. US 6984720 B1) y 11.2.1 (Douglas Charles Hanson, Mark Joseph Neveu, y otros, anticuerpos monoclonales humanos contra CTLA-4, patente de Estados Unidos núm. US 682736 B1) se añadieron para la reacción durante 30 min. Se añadió el anticuerpo secundario conjugado con enzima para incubación durante 30 min. Luego, se determinó la absorbancia a 450 nm en un lector de placas ELISA.
Los resultados de la detección de la unión del anticuerpo 8D2 y sus anticuerpos humanizados al antígeno CTLA4 se muestran en las Figuras 22 a 25, respectivamente. Como se muestra en las figuras, los anticuerpos 8D2, 8D2(Re) y los anticuerpos humanizados 8D2 pueden unirse eficazmente a la proteína CTLA4 y su eficacia de unión depende de la dosis. Las intensidades fluorescentes en cada dosis se proporcionan en las Tablas 4 a 8. La eficiencia de unión, EC50, de 8D2, 8D2(Re) y los anticuerpos humanizados se obtuvieron mediante simulación de curva en el análisis cuantitativo fluorescente de los anticuerpos 8D2, 8D2(Re) unidos y humanizados (Tabla 9).
Tabla 4. Unión de 8D2 8D2 Re a CTLA4 murino ELISA
Tabla 5. Unión de 8D2 8D2H1L1 8D2 Re a CTLA4 humano ELISA
continuación
Tabla 6. Unión de 8D2H2L2 8D2H3L3 a CTLA4 humano ELISA
Tabla 7. Unión de 8D2H2L2 8D2H3L3 a CTLA4 de mono ELISA
Tabla 9: La eficiencia de unión, EC50, de 8D2, 8D2(Re) y los anticuerpos humanizados de 8D2, 8D2H1L1, 8D2H2L2,
Los resultados anteriores demuestran que los anticuerpos 8D2 y 8D2(Re) se unen al antígeno CTLA4 murino con una eficacia mejor que la de los anticuerpos de control 10D1 y 11.2.1. El anticuerpo humanizado 8D2H1L1 se une al antígeno CTLA4 murino con una eficacia más fuerte que la del anticuerpo de control 10D1 y comparable a la de 11.2.1.
El anticuerpo humanizado 8D2H2L2 se une al antígeno CTLA4 humano con una eficacia comparable a la del 10D1. Los anticuerpos humanizados 8D2H2L2 y 8D2H3L3 se unen al antígeno CTLA4 de mono con una eficacia comparable a la del 10D1. Los anticuerpos humanizados 8D2H2L15 y 8D2H2L17 se unen al antígeno CTLA4 humano con una eficacia significativamente mayor que la de los anticuerpos de control 10D1 y 11.2.1.
Ejemplo 8. Detección de la actividad de los anticuerpos para competir con B7-1/2 por la unión al antígeno CTLA4 mediante ELISA competitivo
1. Detección de la actividad de los anticuerpos para competir con B7-1 por la unión al antígeno CTLA4 mediante ELISA
Las placas de ELISA se recubrieron con B7-1 a 4 °C durante la noche. Después de bloquear con BSA al 1 % a 37 °C durante 2 h, se añadieron los anticuerpos anti-CTLA4, es decir, los anticuerpos monoclonales 8D2 y 8D2(Re) y los anticuerpos humanizados 8D28 D2 H1 L1 , 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 y 8D2H2L17, así como los anticuerpos de control 10D1 y 11.2.1. Después de la incubación durante 10 minutos, se añadió CTLA4-mFc. Después de la incubación a 37 °C durante 40 minutos, se añadió el anticuerpo secundario conjugado con enzima. Después de la incubación a 37 °C durante 30 minutos, se detectó la absorbancia a 450 nm en un lector de placas ELISA.
2. Detección de la actividad de los anticuerpos para competir con B7-2 por la unión al antígeno CTLA4 mediante ELISA
Las placas de ELISA se recubrieron con CTLA4-mFc a 4 °C durante la noche. Después de bloquear con BSA al 1 % a 37 °C durante 2 h, se añadieron los anticuerpos anti-CTLA4, es decir, los anticuerpos monoclonales 8D2 y 8D2(Re) y los anticuerpos humanizados 8D28D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 y 8D2H2L17, así como los anticuerpos de control 10D1 y 11.2.1. Después de la incubación durante 10 minutos, se añadió B7-2-his. Después de la incubación a 37 °C durante 40 minutos, se añadió el anticuerpo secundario conjugado con enzima. Después de la incubación a 37 °C durante 30 minutos, se detectó la absorbancia a 450 nm en un lector de placas ELISA. Los resultados de la detección de la unión de los anticuerpos 8D2, 8D2(Re) y humanizados al antígeno CTLA4 se muestran en las Figuras 26 a 31, respectivamente. Como se muestra en las figuras, los anticuerpos 8D2, 8D2(Re) y los anticuerpos humanizados 8D2 podrían unirse eficazmente a la proteína CTLA, y su eficacia de unión depende de la dosis. Las intensidades fluorescentes en cada dosis se proporcionan en las Tablas 10 a 16. La eficiencia de unión, EC50, de 8D2, 8D2(Re) y los anticuerpos humanizados se obtuvieron mediante simulación de curva en el análisis cuantitativo fluorescente de los anticuerpos unidos 8D2, 8D2(Re) y los anticuerpos humanizados (Tabla 17).
Tabla 10.8D2 8D2Re comiten con B7-1 en ELISA
Tabla 11.8D28D2H1L1 8D2Re comiten con B7-1 en ELISA
Tabla 12.8D28D2H1L1 8D2Re comiten con B7-2 en ELISA
Tabla 13. Los anticuer os 8D2H2L2 8D2H3L3 comiten con B7-1 en ELISA
continuación
-
Tabla 17. La eficiencia de unión, EC50, de 8D2, 8D2(Re) y los anticuerpos humanizados de 8D2, 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 y 8D2H2L17 al antígeno CTLA4 en competencia con B7 obtenido mediante la
Los resultados anteriores demostraron que los anticuerpos 8D2, 8D2(Re) y los anticuerpos humanizados de 8D2, 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 y 8D2H2L17 pueden competir con B7 por la unión al antígeno CTLA4. En particular, 8D2, 8D2(Re), 8D2H1L1 y 8D2H2L2 son más fuertes que 10D1 al competir con B7-2 por unirse a CTLA4, mientras que 8D2H2L17 es más fuerte que los anticuerpos 10D1 y 11.2.1 al competir con B7-1 y B7-2 para unirse a CTLA4.
Ejemplo 9. Análisis de las actividades biológicas del anticuerpo monoclonal 8D2 y los anticuerpos humanizados 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 y 8D2H2L17 en células
Para detectar el efecto del anticuerpo monoclonal 8D2 y los anticuerpos humanizados 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 y 8D2H2L17, y los anticuerpos de control 10D1 y 11.2.1 sobre la expresión de IL-2 de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), se recogió sangre periférica de donantes sanos en tubos de recogida que contenían heparina sódica. Las PBMC se obtuvieron como una suspensión de células después de diluir en PBS y centrifugar en medio de separación (a 2550 rpm durante 20 min). La suspensión de células se añadió con SEB (1 |jg/mL) / PHA (30 jL/mL) y se colocó en una incubadora a 37 °C con humedad saturada que contenía 5 % de CO2 para una mayor cultura. Se añadieron linfocitos Raji y el anticuerpo. Después de la coincubación durante 48 horas, las PBMC se lavaron con PBS dos veces y se agregaron a placas de 96 pozos a 10000 células/pozo. Luego, se añadió el correspondiente gradiente de concentración de los anticuerpos. Después de la inoculación durante 20 minutos, se añadieron células Raji tratadas con MMC durante 1 hora a 10000 células/pocillo para un cocultivo de 72 horas. Después del cocultivo durante 72 horas, se recogió el cultivo de células para el sobrenadante y se detectó el perfil de expresión de IL-2 en el sobrenadante del cocultivo de células usando un kit ELISA siguiendo las instrucciones proporcionadas con el kit (Dakewe Co., DKW12-1020-096).
Después del análisis estadístico, los resultados de los experimentos se muestran en las Figuras 32 y 33. En comparación con el grupo de células T y el grupo de células Raji, para el anticuerpo monoclonal 8D2, todos sus anticuerpos humanizados 8D2H1L1, 8D2H2L2, 8D2H3L3, 8D2H2L15 y 8D2H2L17 pueden bloquear eficazmente la unión de CTLA4 a B7 y mejorar la expresión de IL-2 en linfocitos T (Figuras 32 y 33). Particularmente, el inventor descubrió sorprendentemente que 8D2H2L2, 8D2H2L15 y 8D2H2L17 son significativamente superiores que los anticuerpos de control 10D1 y 11.2.1. A la concentración de 10 nM, lograron un nivel de IL-2 comparable o incluso mejor que el alcanzado por 10D1 o 11.2.1 a la concentración de 100 nM. Por tanto, los anticuerpos de la presente invención pueden aumentar el nivel de IL-2 a una concentración más baja, por ejemplo, aproximadamente 10 nM. Ejemplo 10. La actividad antitumoral in vivo del anticuerpo monoclonal 8D2H2L2
La actividad antitumoral in vivo de 8D2H2L2 se evaluó usando el modelo animal hu-SCID-raji. Se aislaron células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) usando el reactivo Ficoll y se activaron usando SEB a 1 jg/mL durante 3 días. Entonces, las PBMC activadas 1.25 * 106 se mezclaron con 5*10® células de linfoma raji Burkitt y 8D2H2L2 (20 mg/kg), y se inyectaron por vía subcutánea en el lomo de ratones SCID-beige. Al mismo tiempo, se creó un grupo de control de isotipos, 5 animales por grupo. Posteriormente, se administró una dosis de 20 mg/kg mediante inyección intravenosa una vez a la semana durante tres semanas consecutivas. El volumen del tumor se midió dos veces por semana hasta el final de los experimentos o cuando el volumen del tumor alcanzó los 1000 mm3.
Como se muestra en la Figura 34, 8D2H2L2 podría inhibir notablemente el crecimiento tumoral en el modelo hu-SCID-raji. Este resultado indicó que este anticuerpo puede usarse clínicamente para tratar el linfoma.
Claims (14)
1. Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une al CTLA4 humano, seleccionado del grupo que consiste en:
(a) un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 14 y una región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 16; y
(b) un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 14 y una región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 16, en el que en la SEQ ID NO: 14 en la posición 18, la metionina se puede sustituir por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: leucina, valina, isoleucina y alanina.
2. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de la reivindicación 1, en el que la metionina en la posición 18 de SEQ ID NO: 14 está sustituido con leucina y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 16.
3. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de las reivindicaciones 1 o 2, el cual es un anticuerpo humanizado o un fragmento de unión al antígeno del mismo.
4. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo se une a CTLA4 humano con una Kd menor de aproximadamente 10-5 M, determinada por resonancia de plasmón de superficie.
5. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en las que el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo:
(a) bloquea la unión de CTLA4 humano a B7 humano;
(b) regula la actividad de CTLA4 humano;
(c) alivia la inmunosupresión en el cuerpo por CTLA4 humano;
(d) activa los linfocitos T y/o
(e) aumenta la expresión de IL-2 en linfocitos T.
6. Una o más moléculas de ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de la reivindicación 1.
7. La una o más moléculas de ácido nucleico aisladas de la reivindicación 6, en la que la una o más moléculas de ácidos nucleicos aisladas tienen la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 15.
8. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 6.
9. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 8.
10. Un procedimiento para preparar el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende las etapas de cultivar la célula huésped de la reivindicación 8 en condiciones adecuadas y recuperar el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo del cultivo celular.
11. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.
12. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para su uso en un procedimiento de tratamiento de cáncer, tal como melanoma, tumor de riñón/tumor renal, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer colorrectal, cáncer del tracto gastrointestinal y/o cáncer de hígado/cáncer hepático en un sujeto humano.
13. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para su uso en un procedimiento de tratamiento de linfoma.
14. Un procedimiento in vitro que comprende la etapa de administrar a las células una cantidad eficaz del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el método se selecciona de los siguientes:
(a) un procedimiento para detectar el nivel de CTLA4 en una muestra,
(b) un procedimiento para bloquear la unión de CTLA4 humano a B7 humano,
(c) un procedimiento para regular la actividad de CTLA4 humano o el nivel de CTLA4 humano,
(d) un procedimiento para aliviar la inmunosupresión en el cuerpo por CTLA4 humano,
(e) un procedimiento para activar los linfocitos T o
(f) un procedimiento para aumentar la expresión de IL-2 en linfocitos T.
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