CN102134276A

CN102134276A - 一种抗ctla-4嵌合抗体

Info

Publication number: CN102134276A
Application number: CN2010100231582A
Authority: CN
Inventors: 谈珉; 何进秋; 张大鹏; 钱卫珠; 李彩辉
Original assignee: ANTIBODIES NATIONAL ENGINEERING RESEARCH CENTER; Shanghai CP Guojian Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: ANTIBODIES NATIONAL ENGINEERING RESEARCH CENTER; Shanghai CP Guojian Pharmaceutical Co Ltd; Shanghai National Engineering Research Center of Antibody Medicine Co
Priority date: 2010-01-22
Filing date: 2010-01-22
Publication date: 2011-07-27

Abstract

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了一种抗CTLA-4嵌合抗体，其重链可变区CDR氨基酸序列分别选自GYTFTKY、DIYPGGDYTNYNE、FRQLGLRG，轻链可变区CDR氨基酸序列分别选自RASESVGSYGNSFML、RASNLES或NNEDPWT。本发明公开的抗CTLA-4嵌合抗体与商品化抗人CTLA-4抗体BNI3相比具有活性高的优点。

Description

一种抗CTLA-4嵌合抗体

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地，本发明公开了一种嵌合抗体、其制备方法及用途。

背景技术

CTLA-4由237个氨基酸组成，是I型跨膜糖蛋白，其单体的相对分子量约为43KD，在T细胞表面主要以二聚体形式存在，激活的T细胞高表达CTLA-4，与CD28竞争性结合B7分子，继而抑制T细胞活化。而CTLA-4抗体可以阻止CTLA-4与其天然配体的结合，从而封闭CTLA-4对T细胞负性调节信号的传导，增强T细胞对各种抗原的反应性，发展CTLA-4抗体用于肿瘤的免疫治疗是目前肿瘤基因治疗的热点。由于鼠源抗体进入人体后可能诱发人抗鼠抗体免疫应答(HAMA)，因而人们开发了人鼠嵌合抗体来降低人抗鼠抗体免疫应答反应。利用生物技术得到高亲和性的鼠源CTLA-4单克隆抗后对其进行改造制备出抗CTLA-4人鼠嵌合抗体一直是本领域技术人员着力解决的问题。

发明内容

本发明公开了一种抗CTLA-4嵌合抗体，其重链可变区CDR氨基酸序列分别选自GYTFTKY、DIYPGGDYTNYNE、FRQLGLRG，轻链可变CDR氨基酸序列分别选自RASESVGSYGNSFML、RASNLES或NNEDPWT；具体地，其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，恒定区为人抗体恒定区；进一步地，其重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，轻链链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；更进一步地，其重链氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

本发明还公开了一种核苷酸分子，其编码上述的抗CTLA-4嵌合抗体，其中编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示；进一步地，编码重链的核苷酸序列如SEQID NO：5所示，编码轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。

本发明还公开了含有上述核苷酸分子的表达载体，为pcDNA3.1/ZEO(+)或pcDNA3.1(+)。

另外，本发明还公开了一种宿主细胞，其被上述表达载体转化，进一步地，为CHO-K1细胞。

更具体地，本发明的发明人用大肠杆菌BL21(DE3)(购自德国默克公司)表达出人CTLA-4胞外区蛋白为抗原，采用细胞融合技术制备分泌抗CTLA-4单克隆(IgG1/κ亚型)杂交瘤细胞系16C11。细胞增殖实验显示16C11具有促使经过PHA刺激的Jurkat T细胞增殖的功能。为克服鼠源抗体16C11在临床应用中的局限性，通过RT-PCR的方法从杂交瘤细胞中克隆其轻重链可变区基因，分别与人的恒定区基因相连，构建了抗CTLA-4嵌合抗体。体外实验表明，此嵌合抗体能很好地与Jurkat细胞结合；与对应的鼠源抗体竞争结合抗原，而且它们的IC₅₀)值相似，说明此嵌合抗体保留了与鼠源抗体相似的亲和力和特异性。

附图说明

图115％SDS-PAGE蛋白凝胶电泳分析纯化得到的CTLA-4胞外区蛋白图①为阴离子交换柱子洗脱峰 ②③为分子筛分离峰 M为蛋白Marker④为阴离子交换柱子洗脱峰(还原) ⑤⑥为分子筛分离峰(还原)

图26C11抗体重链和轻链可变区核苷酸序列与氨基酸序列，括弧里表示的是CDR区；

图3鼠源抗体16C11与嵌合抗体c16C11的抗原结合活性实验结果；

图4竞争抑制实验结果

具体实施方式

以下实施例、实验例仅仅对本发明进行进一步说明，不应理解为对本发明的限制。

Jurkat细胞美国ATCC TIB-152

pGEM-T载体美国Promega公司

pet22b(+) 美国Invitrogen公司

T4DNA连接酶美国Invitrogen公司

BL21(DE3) 德国默克公司

BNI3 美国GeneTex公司

实施例1：人抗体轻、重链恒定区基因的克隆

用淋巴细胞分离液(鼎国生物技术发展公司产品)分离健康人淋巴细胞，用Trizol试剂(Invitrogen公司产品)提取总RNA，根据文献(Cloned humanand mouse kappa immunoglobulin constant and J region genes conservehomology in functional segments.Hieter PA，Max EE，Seidman JG，MaizelJV Jr，Leder P.Cell.1980Nov；22(1 Pt 1)：197-207.)和文献(Thenucleotide sequence of a human immunoglobulin C gammal gene.EllisonJW，Berson BJ，Hood LE.Nucleic Acids Res.1982 Jul10；10(13)：4071-4079)报道的序列分别设计引物采用RT-PCR反应扩增抗体重链和轻链恒定区基因。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T载体中，测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2分别显示了重链恒定区(CH)的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO：3和SEQID NO：4分别显示了轻链恒定区(CL)的核苷酸序列和氨基酸序列。本例中的正确克隆记作pGEM-T/CH和pGEM-T/CL。

实施例2：人CTLA-4胞外区片段的表达

按“Trizol Reagent”试剂盒(美国Gibco BRL公司产品)说明书提取5×10⁶Jurkat细胞的总RNA。设计引物CTLA-4反义进行逆转录扩增，得到cDNA后再通过CTLA-4正义和CTLA-4反义对CTLA-4反义胞外区基因进行扩增。引物由上海生工生物工程公司合成，序列如下：

CTLA-4正义：

5’-CCCCATATGGCAATGCAGTGGCCCAGCCTGCT-3’

CTLA-4反义：

5’-CCCAAGCTTGGTACCTTATCAGTCAGAATCTGGGCACGGTTCTGG-3’

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后回收纯化目的片断并克隆到pGEM-T载体中，筛选阳性克隆测序，对测序结果进行分析。然后用NdeI HindIII双酶切测序正确的pGEM-T/CTLA-4质粒，1％琼脂糖凝胶电泳分离后回收纯化目的片断与同酶切的质粒pet22b(+)用T4DNA连接酶进行连接，构建成表达载体pet22b(+)(CTLA-4)。并转化大肠杆菌BL21(DE3)，鉴定正确的克隆，用1mM IPTG 37℃诱导4小时，可得到CTLA-4胞外区片段蛋白，主要以包涵体的形式存在。

实施例3：人CTLA-4胞外区片段的复性及纯化

大肠杆菌表达得到的包涵体用4M尿素20mMTris 100mM β-巯基乙醇PH8.5溶解变性包涵体，4℃搅拌2h，并经过脱盐除去β-巯基乙醇，脱盐柱Hiprep26/10 Desalting G25预装柱，Buffer：2M尿素20mMTris 8mM β-巯基乙醇PH 8.5。将脱盐液以1ml/min的速度滴入复性液，复性buffer：50mMTris 5mM Nacl 0.05g/l PEG8000 5％丙三醇PH8.5不断搅拌。滴完后置于16℃过夜。使用Millipore 3KD硝酸纤维素膜包对复性液进行超滤浓缩，浓缩液用阴离子交换柱DEAE进行纯化，平衡液：20mMTris PH 8.5，洗脱液体：20mMTris 1M Nacl PH 8.5，流速6ml/min 0-60B％20倍柱体积洗脱，收集目的蛋白。洗脱液用分子筛SuperdexG75Hiload26/60 320ml预装柱进一步纯化。平衡液20mM PB 150mM NaCl PH 6.8，流速3.6ml/min，分管收集蛋白并用15％SDS-PAGE分析，得到纯度大于90％的CTLA-4胞外区蛋白(如图1所示)。

实施例4：抗人CTLA-4单克隆抗体16C11的制备—细胞融合杂交瘤制备单克隆抗体

用经过PHA刺激后高表达CTLA-4的Jurkat细胞免疫BALB/c小鼠(购自购自上海实验动物中心)，使其脾脏中的B淋巴细胞能产生抗人CTLA-4的抗体，取免疫后小鼠的脾细胞与NS-1(BALB/c小鼠骨髓瘤细胞)融合，经HAT选择性培养，经过培养，以实施例3得到的复性纯化后的人CTLA-4蛋白胞外区蛋白筛选出抗人CTLA-4阳性克隆，再经克隆化后筛选出亚克隆，以确保抗体是由单个克隆细胞产生，然后收集单个克隆细胞培养上清，经Protein A柱纯化后，就得到抗人CTLA-4的单克隆抗体16C11。

实施例5：抗人CTLA-4单克隆抗体16C11可变区基因的克隆

按“Trizol Reagent”试剂盒(美国Gibco BRL公司产品)说明书提取2×106分泌抗人CTLA-4单克隆抗体的杂交瘤细胞16C11的总RNA。选择抗体(IgG2a，κ)重链和轻链恒定区的适当位置分别设计3条基因特异性引物GSP1、GSP2、GSP3，其中GSP1距离可变区基因最远，用于逆转录反应，GSP2用于首轮PCR扩增，GSP3用于巢式扩增。引物由上海生工生物工程公司合成，序列如下：GSP1-H，5’-GTA GAG GTC AGA CTG CAG GAC-3’；GSP2-H，5’-CTC AGGGAA ATA GCC CTT GAC-3’；GSP3-H，5’-AGA TCC AGG GGC CAG TGG ATA GAC-3’.GSP1-L，5’-TTG CTG TCC TGA TCA GTC CAA CT-3’；GSP2-L，5’-TGT CGTTCA CTG CCA TCA ATC TT-3’；GSP3-L，5’-TTG TTC AAG AAG CAC ACG ACTGA-3’。

按照5’RACE试剂盒(美国Gibco BRL公司产品)说明书以GSP1为引物将总RNA逆转录成cDNA，然后给第一链cDNA的3’末端加上poly(C)尾，加尾后用GSP2和AAP为引物进行PCR扩增，将扩增产物稀释100倍再以AUAP和GSP3为引物进行巢式PCR扩增。两次PCR反应均采用热启动，反应条件：94℃ 5分钟；94℃ 45秒，60℃ 45秒，72℃ 1分10秒，30个循环；72℃ 7分钟。巢式PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后回收纯化目的片断并克隆到pGEM-T easy载体中，筛选阳性克隆测序，对测序结果进行分析。然后以测序正确的pGEM-T/VH为模板，设计引物H正义AAG CTT GCC GCCACC ATG GAA TGTAAC TGG ATA C和H反义GCT AGC TGA GGA GAC GGT GAC TG，采用Onestep RT-PCR反应扩增VH链可变区基因并使其5’端含有限制酶位点HindIII，3’端含有限制酶位点Nhe I，反应条件为：50℃ 30分；95℃ 15分钟；94℃ 50秒，58℃50秒，72℃ 50秒，30个循环；72℃ 10分钟。经琼脂糖凝胶电泳纯化回收PCR产物并克隆到pGEM-T载体中，筛选阳性克隆测序验证，结果证明该序列与5’RACE的序列完全一致。SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10分别显示了16C11重链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。本例中的正确克隆记作pGEM-T/VH。

以测序正确的pGEM-T/VL为模板，设计引物L正义AAG CTT GCC GCC ACCATG GAG ACA GAC ACA CTC CT和L反义TGG TGC AGC CAC AGT CCG TTT TAT TTCCAG采用Onestep RT-PCR反应扩增VL基因并使其5’端含有限制酶位点HindIII，3’端含有人抗体轻链恒定区5’端的互补序列，反应条件为：94℃ 5分钟；94℃ 50秒，58℃ 50秒，72℃ 1分钟，30个循环；72℃ 10分钟。经琼脂糖凝胶电泳纯化回收PCR产物并克隆到pGEM-T载体中，筛选阳性克隆测序验证，结果证明该序列与5’RACE的序列完全一致。SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12分别显示了16C11轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。本例中的正确克隆记作pGEM-T/VL。

实施例6：构建嵌合抗体c16C11

将上述Onestep RT-PCR测序正确的质粒pGEM-T/VH用HindIII和Nhe I双酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收获得约440bp的酶切片断，与同酶切的质粒pGEM-T/CH连接，挑选正确克隆后以HindIII和EcoR I酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收目的片段，与同酶切的质粒pcDNA3.1(+)(美国Invitrogen公司产品)用T4DNA连接酶(Invitrogen公司产品)进行连接，构建成真核表达载体pcDNA3.1(+)(VHCH)。

采用Overlapping PCR将上述Onestep RT-PCR测序正确的克隆pGEM-T/VL直接与轻链恒定区的正确克隆pGEM-T/CL融合，反应条件为：50℃30分；95℃15分钟；94℃50秒，58℃50秒，72℃50秒，30个循环；72℃10分钟，得到PCR产物VLCL，其5’端含有限制酶位点HindIII，3’端含有限制酶位点EcoR I。经琼脂糖凝胶电泳纯化回收PCR产物并克隆到pGEM-T载体(Promega公司产品)中，筛选阳性克隆测序。将测序正确的VLCL基因用HindIII和EcoR I双酶消化从pGEM-T载体中切下，克隆到pcDNA3.1/ZEO(+)载体(美国Invitrogen公司产品)中，构建成真核表达载体pcDNA3.1/ZEO(+)(VLCL)。

于3.5cm组织培养皿中接种3×105 CHO-K1细胞，细胞培养至90％-95％融合时进行转染：取质粒10μg(质粒pcDNA3.1(+)(VHCH)4μg，质粒pcDNA3.1/ZEO(+)(VLCL)6μg)和20μl Lipofectamine2000 Reagent(Invitrogen公司产品)分别溶于500μl无血清DMEM培养基，室温静置5分钟，将以上2种液体混合，室温孵育20分钟以使DNA-脂质体复合物形成，其间用3ml无血清的DMEM培养基替换培养皿中的含血清培养基，然后将形成的DNA-脂质体复合物加入到板中，CO2孵箱培养4小时后补加2ml含10％血清的DMEM完全培养基，置于CO2孵箱中继续培养。转染进行24h后细胞换含600μg/ml G418和250μg/ml Zeocin的选择培养基筛选抗性克隆。取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆：羊抗人IgG(Fc)包被于ELISA板，4℃过夜，用2％BSA-PBS于37℃封闭2h，加入待测的抗性克隆培养上清或标准品(Human myeloma IgG1，κ)，37℃温育2h，加入HRP-羊抗人IgG(κ)进行结合反应，37℃温育1h，加入TMB于37℃作用5min，最后用H₂SO₄终止反应，测A450值。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用ProteinA亲和柱(GE公司产品)分离纯化嵌合抗体c16C11。将纯化抗体用PBS进行透析，最后以紫外吸收法定量，纯化抗体经测序，其重链核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6所示，轻链核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8所示。

实验例1：抗原结合实验

将Jurkat细胞用1％FCS-PBS重悬成1×106cells/ml，分别加入不同稀释度的嵌合抗人CTLA-4单克隆抗体c16C11和鼠源抗人CTLA-4单克隆抗体16C11 BNI3(购自GeneTex公司)，置于4℃孵育60min，用1％FCS-PBS洗细胞2遍，再加入FITC-羊抗小鼠IgG(H+L)(购自ZYMED公司)于4℃孵育60min，洗细胞后流式细胞仪检测并用Cellquest软件分析。

实验结果见图3，嵌合抗体c16C11和鼠源抗体16C11具有相似的结合曲线，均呈浓度梯度依赖性，说明二者都能很好地与Jurkat细胞特异性结合。但是c16C11的EC₅₀值(1.493±0.183)明显小于16C11(5.465±0.873)，说明c16C11较16C11有更强的结合活性(p＜0.01)。

实验例2：竞争抑制实验

将固定的亚饱和浓度的荧光标记抗体FITC-16C11(制备方法A液：20mg16C11抗体溶于1ml纯水中，B液：10mg FITC(AMRESCO公司)溶于100ml 25mMNaHCO3，25mM Na2CO3，PH 9.6的溶液中，A液和B液混合，24小时避光透析后，每8小时换透析液(PBS)一次，共6次，后以G25脱盐柱去除未结合的FITC)和系列稀释的未标记纯化抗体分别混合后加入到靶细胞Jurkat(1×106/ml)中，4℃孵育60min，1％FCS-PBS洗细胞2遍，流式细胞仪检测并用Cellquest软件分析。抗人CD3嵌合抗体c 12F6(制备方法参见Bohua Li，HaoWang，Jianxin Dai等Construction and characterization of a humanizedanti-human CD3monoclonal antibody 12F6 with effective immunoregulationfunctions.Immunology.116：4，487-498)作为阴性对照。竞争抗体的每个浓度设3个复管，计算半数抑制浓度IC₅₀值，最大荧光强度表示在没有竞争抗体时获得的平均荧光强度。

实验结果见图4，抗体16C11和c 16C11能完全阻断荧光标记抗体FITC-16C11与Jurkat细胞的结合，它们的IC₅₀值接近，表明嵌合抗体具有与原鼠源抗体相似的特异性和亲和力，而对照抗体不能阻断荧光标记抗体FITC-16C11与Jurkat细胞结合，竞争抑制分析实验结果见表1。

表1.竞争抑制分析

^aStudent’s unpaired t检验显示：嵌合抗体的IC₅₀值与对应的鼠源抗体之间无显著性差异。

SEQUENCE LISTING

<110>上海抗体药物国家工程研究中心有限公司

上海中信国健药业有限公司

<120>一种抗CTLA-4嵌合抗体

<130>77

<160>12

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>990

<212>DNA

<213>人抗体重链恒定区(CH)的核苷酸序列

<400>1

gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggaaga gcagtacaac 540

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960

cagaagagcc tctccctgtc tcccggtaaa 990

<210>2

<211>330

<212>PRT

<213>人抗体重链恒定区(CH)的氨基酸序列

<400>2

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210>3

<211>318

<212>DNA

<213>人抗体轻链恒定区(CL)的核苷酸序列

<400>3

actgtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60

actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120

aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180

aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240

cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300

ttcaacaggg gagagtgt 318

<210>4

<211>106

<212>PRT

<213>人抗体轻链恒定区(CL)的氨基酸序列

<400>4

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

1 5 10 15

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

20 25 30

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

35 40 45

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

65 70 75 80

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

85 90 95

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210>5

<211>1353

<212>DNA

<213>嵌和抗体c16C11重链核苷酸序列

<400>5

caggtccagc tgcagcagtc tggagctgag atggtaaggc ctgggacttc agtgaagatg 60

tcctgcaagg ctgctggata caccttcact aaatactgga taggttgggt aaagcagagg 120

cctggacatg gccttgagtg gattggagat atttaccctg gaggtgatta tactaactac 180

aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca catcctccag cacagcctac 240

atgcagctca gcagcctgac ctctgaagac tctgccctct actactgtgc aagattcaga 300

caactcgggc tacgtgggtg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct 360

gcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420

gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720

ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780

cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840

tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga agagcagtac 900

aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960

aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020

tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1080

gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140

atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200

gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260

tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320

acgcagaaga gcctctccct gtctcccggt aaa 1353

<210>6

<211>451

<212>PRT

<213>嵌和抗体c16C11重链氨基酸序列

<400>6

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Met Val Arg Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ala Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Als Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Phe Arg Gln Leu Gly Leu Arg Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210>7

<211>657

<212>DNA

<213>嵌和抗体c16C11轻链核苷酸序列

<400>7

ggtaaaattg tgctgaccca atctccagct tctttggctg tgtctctaag gcagagggcc 60

gccatatcct gcagagccag tgaaagtgtt ggtagttatg gcaatagttt tatgctctgg 120

taccagcaga aaccaggaca gccacccaaa ctcctcatct atcgtgcatc caacctagaa 180

tctggggtcc ctgccaggtt cagtggcagt gggtctagga cagacttcac cctcaccatt 240

gatcctgtgg aggctgatga tgctgcaacc tattactgtc agcaaaataa tgaggatccg 300

tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaacgga ctgtggctgc accatctgtc 360

ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420

ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480

tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540

agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600

gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt 657

<210>8

<211>219

<212>PRT

<213>嵌和抗体c16C11轻链氨基酸序列

<400>8

Gly Lys Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu

1 5 10 15

Arg Gln Arg Ala Ala Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Gly Ser

20 25 30

Tyr Gly Asn Ser Phe Met Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro

50 55 60

Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Asp Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn

85 90 95

Asn Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210>9

<211>363

<212>DNA

<213>嵌和抗体c16C11重链可变区核苷酸序列

<400>9

caggtccagc tgcagcagtc tggagctgag atggtaaggc ctgggacttc agtgaagatg 60

tcctgcaagg ctgctggata caccttcact aaatactgga taggttgggt aaagcagagg 120

cctggacatg gccttgagtg gattggagat atttaccctg gaggtgatta tactaactac 180

aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca catcctccag cacagcctac 240

atgcagctca gcagcctgac ctctgaagac tctgccctct actactgtgc aagattcaga 300

caactcgggc tacgtgggtg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct 360

gca 363

<210>10

<211>121

<212>PRT

<213>嵌和抗体c16C11重链可变区氨基酸序列

<400>10

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Met Val Arg Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ala Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Phe Arg Gln Leu Gly Leu Arg Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210>11

<211>324

<212>DNA

<213>嵌和抗体c16C11轻链可变区核苷酸序列

<400>11

gacatcgtac ttacccaaag tcccagtagc ctcagcgcga gtgtaggtga ccgcgtgacc 60

atcacctgcc gcgcgagtca aagcatcaga aacaatctcc attggttcca acagaagcca 120

ggtaaggctc caaaactcct cataaaatat gccagccaga gcatatctgg cgtgccgtct 180

agattctctg gctccggctc cggcacagac ttcacactaa cgatatcctc cctacagcct 240

gaggactttg ctacgtatta ttgccaacaa tcaaatacgt ggcctctgac ttttggccag 300

ggcactaagg tggagattaa gagg 324

<210>12

<211>113

<212>PRT

<213>嵌和抗体c16C11轻链可变区氨基酸序列

<400>12

Gly Lys Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu

1 5 10 15

Arg Gln Arg Ala Ala Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Gly Ser

20 25 30

Tyr Gly Asn Ser Phe Met Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro

50 55 60

Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Asp Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn

85 90 95

Asn Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

Claims

1.一种抗CTLA-4嵌合抗体，其重链可变区CDR氨基酸序列分别选自GYTFTKY、DIYPGGDYTNYNE、FRQLGLRG，轻链可变区CDR氨基酸序列分别选自RASESVGSYGNSFML、RASNLES或NNEDPWT。

2.权利要求1所述的抗CTLA-4嵌合抗体，其重链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO：10所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，恒定区为人抗体恒定区。

3.权利要求2所述的的抗CTLA-4嵌合抗体，重链恒定区的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示，轻链链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

4.权利要求2所述的抗CTLA-4嵌合抗体，其重链氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

5.一种核苷酸分子，其编码权利要求2~4任一所述的抗CTLA-4嵌合抗体，其中编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。

6.权利要求5所述的核苷酸分子，其中编码重链的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，编码轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。

7.一种表达载体，含有权利要求5或6所述的核苷酸分子，为pcDNA3.1/ZEO(+)或pcDNA3.1(+)。

8.一种宿主细胞，被权利要求7的表达载体转化。

9.权利要求8所述的宿主细胞，为CHO-K1细胞。