ES2613489T3 - Anticuerpos humanos de alta afinidad contra PCSK9 - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo humano o fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo humano que se une específicamente a la proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9 humana (hPCSK9) que comprende una HCVR de SEQ ID NO:90 y una LCVR de SEQ ID NO: 92.

Description

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eliminación de un resto de fucosa para aumentar la función de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) (véase Shield et al. (2002) JBC 277:26733). En otras aplicaciones, puede hacerse modificación de la galactosilación con el fin de modificar la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC).

5 En un aspecto adicional, la invención caracteriza una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo humano recombinante o fragmento del mismo como se define en las reivindicaciones que se une específicamente a hPCSK9 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización, la invención caracteriza una composición que es una combinación de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo de la invención, y un segundo agente terapéutico. El segundo agente terapéutico puede ser cualquier agente que se combine ventajosamente con el anticuerpo o fragmento del mismo de la invención, por ejemplo, un agente capaz de inducir un agotamiento celular de la síntesis de colesterol inhibiendo la 3-hidroxi-3-metilglutaril (HMG)-coenzima A (CoA) reductasa, tal como, por ejemplo, cerovastatina, atorvastatina, simvastatina, pitavastina, rosuvastatina, fluvastatina, lovastatina, pravastatina, etc.; capaz de inhibir la captación de colesterol y o la re-absorción de ácidos biliares; capaz de aumentar el catabolismo de lipoproteínas (tales como niacina); y/o activadores del factor de transcripción de LXR

15 que desempeña una función en la eliminación de colesterol tal como 22-hidroxicolesterol.

En el presente documento también se describen métodos de inhibición de la actividad de hPCSK9 usando el anticuerpo anti-PCSK9 o porción de unión al antígeno del anticuerpo de la invención, en el que los métodos terapéuticos comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo de la invención. El trastorno tratado es cualquier enfermedad o afección que se corrija, mejore, inhiba o prevenga por eliminación, inhibición o reducción de la actividad de PCSK9. Poblaciones específicas tratables por los métodos terapéuticos de la invención incluyen sujetos indicados para aféresis de LDL, sujetos con mutaciones activantes de PCSK9 (mutaciones de ganancia de función, "GOF"), sujetos con hipercolesterolemia familiar heterocigótica (heFH); sujetos con hipercolesterolemia

25 primaria que son intolerantes a las estatinas o incontrolada por estatinas; y sujetos en riesgo de desarrollar hipercolesterolemia que puede ser tratada preventivamente. Otras indicaciones incluyen dislipidemia asociada a causas secundarias tales como diabetes 2 mellitus de tipo, enfermedades hepáticas colestásicas (cirrosis biliar primaria), síndrome nefrótico, hipotiroidismo, obesidad; y la prevención y el tratamiento de aterosclerosis y enfermedades cardiovasculares.

El anticuerpo anti-hPCSK9 o fragmento de anticuerpo de la invención puede ser útil para reducir colesterol total elevado, colesterol no HDL, colesterol LDL y/o apolipoproteína B (apolipoproteína B100).

El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de la invención puede usarse solo o en combinación con un segundo 35 agente, por ejemplo, un inhibidor de HMG-CoA reductasa y/u otros fármacos hipolipemiantes.

Realizaciones adicionales incluyen un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo como se ha definido anteriormente para su uso para atenuar o inhibir la enfermedad o afección mediada por PCSK9.

La invención engloba el uso de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo como se ha definido anteriormente en la fabricación de un medicamento para su uso para atenuar o inhibir una enfermedad o afección mediada por PCSK9. En realizaciones específicas, en las que la enfermedad o afección mediada por PCSK9 es hipercolesterolemia, hiperlipidemia, aféresis de LDL, hipercolesterolemia familiar heterocigótica, intolerante a las estatinas, incontrolada por estatinas, el riesgo de desarrollar hipercolesterolemia, dislipidemia,

45 enfermedad hepática colestásica, síndrome nefrótico, hipotiroidismo, obesidad, aterosclerosis y enfermedades cardiovasculares.

Otras realizaciones serán evidentes a partir de una revisión de la descripción detallada resultante.

Breve descripción de la figura

Fig. 1. Tablas de comparación de secuencias de regiones variables de cadena pesada (A) y cadena ligera (B) y CDR de anticuerpos H1H316P y H1M300N. Fig. 2. Concentraciones de anticuerpo en suero con el tiempo. 316P 5 mg/kg (□); 300N 5 mg/kg (□); 316P 15

55 mg/kg (v); 300N 15 mg/kg (●). Fig. 3. Nivel de colesterol total en suero como un porcentaje del cambio con respecto al control de tampón. Control (T); 316P 5 mg/kg (v); 300N 5 mg/kg (σ); 316P 15 mg/kg (□); 300N 15 mg/kg (Δ). Fig. 4. Nivel de colesterol LDL en suero como un porcentaje del cambio con respecto al control de tampón. Control (T); 316P 5 mg/kg (v); 300N 5 mg/kg (σ); 316P 15 mg/kg (□); 300N 15 mg/kg (Δ). Fig. 5. Nivel de colesterol LDL en suero normalizado al control de tapón. Control de tapón (T); 316P 5 mg/kg (v); 300N 5 mg/kg (σ); 316P 15 mg/kg (□); 300N 15 mg/kg (Δ). Fig. 6. Nivel de colesterol HDL en suero como un porcentaje del cambio con respecto al control de tampón. Control (T); 316P 5 mg/kg (v); 300N 5 mg/kg (σ); 316P 15 mg/kg (□); 300N 15 mg/kg (Δ). Fig. 7. Nivel de triglicéridos en suero como un porcentaje del cambio con respecto al control de tampón. Control

65 de tampón (T); 316P 5 mg/kg (v); 300N 5 mg/kg (σ); 316P 15 mg/kg (□); 300N 15 mg/kg (Δ). Fig. 8. Nivel de colesterol LDL en suero expresado como un porcentaje del cambio con respecto al nivel inicial

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de las bases de nucleótidos, como se mide por cualquier algoritmo muy conocido de identidad de secuencia, tal como FASTA, BLAST o GAP, como se trata más adelante.

Como se aplica a polipéptidos, el término “similitud sustancial” o “sustancialmente similar” significa que dos

5 secuencias peptídicas, cuando están alineadas de forma óptima, tal como por los programas GAP o BESTFIT usando pesos de huecos por defecto, comparten al menos el 90 % de identidad de secuencia, incluso más preferiblemente al menos el 95 %, 98 % o el 99 % de identidad de secuencia. Preferiblemente, las posiciones de restos que no son idénticas difieren por sustituciones conservativas de aminoácidos. Una “sustitución conservativa de aminoácido” es aquella en la que un resto de aminoácido se sustituye con otro resto de aminoácido que tiene una

10 cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución conservativa de aminoácido no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En los casos en que dos o más secuencias de aminoácidos difieren una de la otra por sustituciones conservativas, el porcentaje o grado de similitud puede ajustarse hacia arriba para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Los medios para realizar este ajuste son bien conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por

15 ejemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen 1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales de hidroxilo alifáticas: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; 5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato, y 7) cadenas laterales que

20 contienen azufre: cisteína y metionina. Grupos preferidos de sustitución conservativa de aminoácidos son: valinaleucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina. Alternativamente, un reemplazo conservativo es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz PAM250 de verosimilitud logarítmica desvelada en Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443 45. Un reemplazo “moderadamente conservativo” es cualquier cambio que tenga un valor no negativo en la matriz PAM250 de

25 verosimilitud logarítmica.

La similitud de secuencia para los polipéptidos se mide normalmente usando un software de análisis de secuencias. El software de análisis de proteínas compara secuencias similares usando medidas de similitud asignada a diferentes sustituciones, deleciones y otras modificaciones, incluyendo las sustituciones conservativas de 30 aminoácidos. Por ejemplo, el software GCG contiene programas tales como GAP y BESTFIT que pueden usarse con parámetros por defecto para determinar la homología de secuencia o la identidad de secuencia entre los polipéptidos estrechamente relacionados, tales como los polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína no mutante y una muteína de la misma. Véase, por ejemplo, GCG Versión 6.1. También pueden compararse secuencias polipeptídicas usando FASTA con parámetros por defecto o 35 recomendados: un programa en GCG Versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineaciones y porcentaje de identidad de secuencia de las regiones de mejor solapamiento entre las secuencias de búsqueda e investigación (Pearson (2000) arriba). Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la invención con una base de datos que contiene un gran número de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST, especialmente BLASTP o TBLASTN, usando parámetros por defecto. Véase, por

40 ejemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403 410 y (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 402.

En realizaciones específicas, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo para su uso en el método de la invención puede ser monoespecífico, biespecífico o multiespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopes de un polipéptido diana o pueden contener dominios de unión al antígeno específicos para 45 epítopes de más de un polipéptido diana. Un formato de anticuerpo biespecífico a modo de ejemplo que puede usarse en el contexto de la presente invención implica el uso de un primer dominio CH3 de inmunoglobulina (Ig) y un segundo dominio CH3 de Ig, en el que el primero y segundo dominios CH3 de Ig se diferencian el uno del otro por al menos un aminoácido, y en el que al menos una diferencia de aminoácidos reduce la unión del anticuerpo biespecífico a la proteína A en comparación con un anticuerpo biespecífico que carece de la diferencia de 50 aminoácidos. En una realización, el primer dominio CH3 de Ig se une a la proteína A y el segundo dominio CH3 de Ig contiene una mutación que reduce o suprime la unión a la proteína A tal como una modificación H95R (por la numeración de exones de IMGT; H435R por la numeración de EU). El segundo CH3 puede comprender además una modificación Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Modificaciones adicionales que pueden encontrarse dentro del segundo CH3 incluyen: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M y V82I (por IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M,

55 y V422I por EU) en el caso de mAb IgG1; N44S, K52N y V82I (IMGT; N384S, K392N y V422I por EU) en el caso de mAb IgG2; y Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q y V82I (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q y V422I por EU) en el caso de mAb IgG4. Las variaciones en el formato de anticuerpo biespecífico descrito anteriormente se contemplan dentro del alcance de la presente invención.

60 Por la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se indica una cantidad que produce el efecto deseado para el que se administra. La cantidad exacta dependerá del fin del tratamiento, y podrá ser determinada por un experto en la materia usando técnicas conocidas (véase, por ejemplo, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding).

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documento se describen anticuerpos anti-PCSK9 que compiten para unirse a PCSK9 o un fragmento de PCSK9 con cualquiera de los anticuerpos a modo de ejemplo específicos descritos en el presente documento.

Puede determinarse fácilmente si un anticuerpo se une al mismo epítope o no, o compite por la unión con un

5 anticuerpo anti-PCSK9 de referencia usando métodos rutinarios conocidos en la técnica. Por ejemplo, para determinar si un anticuerpo de prueba se une al mismo epítope que un anticuerpo anti-PCSK9 de referencia de la invención, se deja que el anticuerpo de referencia se una a una proteína o péptido PCSK9 en condiciones de saturación. A continuación, se evalúa la capacidad de un anticuerpo de prueba para unirse a la molécula de PCSK9. Si el anticuerpo de prueba es capaz de unirse a PCSK9 tras la unión de saturación con el anticuerpo anti-PCSK9 de referencia, se puede sacar la conclusión de que el anticuerpo de prueba se une con un epítope diferente que el anticuerpo anti-PCSK9 de referencia. Por otro lado, si el anticuerpo de prueba no es capaz de unirse a la molécula de PCSK9 tras la unión de saturación con el anticuerpo anti-PCSK9 de referencia, entonces el anticuerpo de prueba puede unirse al mismo epítope que el epítope unido por el anticuerpo anti-PCSK9 de referencia de la invención.

15 Para determinar si un anticuerpo compite por la unión con un anticuerpo anti-PCSK9 de referencia, la metodología de unión anteriormente descrita se realiza en dos orientaciones: En una primera orientación, se deja que el anticuerpo de referencia se una a una molécula de PCSK9 en condiciones de saturación, seguido por la evaluación de la unión del anticuerpo de prueba a la molécula de PCSK9. En una segunda orientación, se deja que el anticuerpo de prueba se una a una molécula de PCSK9 en condiciones de saturación, seguido por la evaluación de la unión del anticuerpo de referencia a la molécula de PCSK9. Si, en ambas orientaciones, solamente el primer anticuerpo (de saturación) es capaz de unión a la molécula de PCSK9, entonces se llega a la conclusión de que el anticuerpo de prueba y el anticuerpo de referencia compiten por la unión a la PCSK9. Como se apreciará por un experto habitual en la materia, un anticuerpo que compite por la unión con un anticuerpo de referencia puede no unirse necesariamente al epítope idéntico que el anticuerpo de referencia, pero puede bloquear estéricamente la

25 unión del anticuerpo de referencia mediante la unión con un epítope solapante o adyacente.

Dos anticuerpos se unen al mismo epítope o epítope de solapamiento si cada uno inhibe (bloquea) competitivamente la unión del otro al antígeno. Es decir, un exceso de 1, 5, 10, 20 o 100 veces de un anticuerpo inhibe la unión del otro al menos el 50 %, pero preferentemente el 75 %, 90 % o incluso el 99 % como se mide en un ensayo de unión competitiva (véase, por ejemplo, Junghans et al., Cancer Res. 1990 50: 1495-1502). Alternativamente, dos anticuerpos tienen el mismo epítope si esencialmente todas las mutaciones de aminoácidos en el antígeno que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro. Dos anticuerpos tienen epítopes de solapamiento si algunas mutaciones de aminoácidos que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro.

35 Puede entonces llevarse a cabo experimentación rutinaria adicional (por ejemplo, mutación de péptidos y análisis de unión) para confirmar si la ausencia observada de unión del anticuerpo de prueba es de hecho debida a la unión al mismo epítope que el anticuerpo de referencia o si el bloqueo estérico (u otro fenómeno) es el responsable de la ausencia de unión observada. Pueden realizarse experimentos de este tipo usando ELISA, RIA, resonancia de plasmones superficiales, citometría de flujo o cualquier otro ensayo de unión de anticuerpo cuantitativo o cualitativo disponible en la materia.

En una realización específica, la invención comprende un anticuerpo anti-PCSK9 o fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo que se une a una proteína PCSK9 de SEQ ID NO:755, en el que la unión entre el anticuerpo o

45 fragmento del mismo a PCSK9 y una proteína PCSK9 de variante es inferior al 50 % de la unión entre el anticuerpo

o fragmento y la proteína PCSK9 de SEQ ID NO:755. En una realización específica, la proteína PCSK9 de variante comprende al menos una mutación de un resto en una posición seleccionada del grupo que consiste en 153, 159, 238 y 343. En una realización más específica, la al menos una mutación es S153R, E159R, D238R y D343R. La proteína PCSK9 de variante puede comprender al menos una mutación de un resto en una posición seleccionada del grupo que consiste en 366. La proteína PCSK9 de variante puede comprender al menos una mutación de un resto en una posición seleccionada del grupo que consiste en 147, 366 y 380. La mutación puede ser S147F, E366K y/o V380M.

Inmunoconjugados

55 La invención engloba un anticuerpo monoclonal anti-PCSK9 humano conjugado con un resto terapéutico (“inmunoconjugado”) tal como una citotoxina, un fármaco quimioterapéutico, un inmunosupresor o un radioisótopo. Agentes de citotoxina incluyen cualquier agente que sea perjudicial para las células. Ejemplos de agentes de citotoxina y agentes quimioterapéuticos adecuados para formar inmunoconjugados son conocidos en la técnica, véase, por ejemplo el documento WO 05/103081.

Biespecíficos

Los anticuerpos de la presente invención pueden ser monoespecíficos, biespecíficos o multiespecíficos. Los mAb

65 multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopes de un polipéptido diana o pueden contener dominios de unión al antígeno específicos para más de un polipéptido diana. Véase, por ejemplo, Tutt et al. (1991) J.

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Immunol. 147:60-69. Los mAb anti-PCSK9 humanos pueden unirse o co-expresarse con otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo puede unirse funcionalmente (por ejemplo, por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otra forma) a una o más de otras entidades moleculares; tales como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo, para producir un anticuerpo

5 biespecífico o multiespecífico con una segunda especificidad de unión.

Un formato de anticuerpo biespecífico a modo de ejemplo que puede usarse en el contexto de la presente invención implica el uso de un primer dominio CH3 de inmunoglobulina (Ig) y un segundo dominio CH3 de Ig, en el que el primer y segundo dominios CH3 de Ig difieren entre sí en al menos un aminoácido, y en el que la diferencia de al menos un aminoácido reduce la unión del anticuerpo biespecífico a la proteína A en comparación con un anticuerpo biespecífico que carece de la diferencia de aminoácido. En una realización, el primer dominio CH3 de Ig se une a la proteína A y el segundo dominio CH3 de Ig contiene una mutación que reduce o suprime la unión a la proteína A tal como una modificación de H95R (por numeración de exones de IMGT; H435R por numeración EU). El segundo CH3 puede comprender además una modificación Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Modificaciones adicionales que se

15 pueden encontrar dentro del segundo CH3 incluyen; D16E, L18M, N44S, K52N, V57M y V82I (por IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M y V422I por EU) en el caso de anticuerpos lgG1; N44S, K52N y V82I (IMGT; N384S, K392N y V422I por EU) en el caso de anticuerpos lgG2; y Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q y V82I (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q y V422I por EU) en el caso de anticuerpos lgG4. Variaciones del formato de anticuerpo bi-específico descrito anteriormente se contemplan dentro del alcance de la presente invención.

Bioequivalentes

Los anticuerpos anti-PCSK9 y fragmentos de anticuerpos de la presente invención engloban proteínas que tienen

25 secuencias de aminoácidos que varían de aquellas de los mAb descritos, pero que retienen la capacidad de unirse a PCSK9 humana. Tales mAb de variante y fragmentos de anticuerpos comprenden una o más adiciones, deleciones

o sustituciones de aminoácidos cuando se comparan con la secuencia de origen, pero presentan actividad biológica que es esencialmente equivalente a la de los mAb descritos. Asimismo, las secuencias de ADN que codifican el anticuerpo anti-PCSK9 de la presente invención engloban secuencias que comprenden una o más adiciones, deleciones o sustituciones de nucleótidos cuando se comparan con la secuencia desvelada, pero que codifican un anticuerpo anti-PCSK9 o fragmento de anticuerpo que es esencialmente bioequivalente a un anticuerpo anti-PCSK9

o fragmento de anticuerpo de la invención. Ejemplos de tales secuencias de aminoácidos y de ADN de variante se tratan anteriormente.

35 Dos proteínas de unión al antígeno, o anticuerpos, se consideran bioequivalentes si, por ejemplo, son equivalentes farmacéuticos o alternativas farmacéuticas cuya tasa y grado de absorción no muestran una diferencia significativa cuando se administran a la misma dosis molar bajo condiciones experimentales similares, tanto dosis únicas como dosis múltiples. Algunos anticuerpos se considerarán equivalentes o alternativas farmacéuticas si son equivalentes en el grado de su absorción, pero no en su tasa de absorción, y aún pueden considerarse bioequivalentes debido a que tales diferencias en la tasa de absorción son intencionadas y se reflejan en el marcado, no son esenciales para la obtención de concentraciones de fármaco en el cuerpo eficaces en, por ejemplo, uso crónico, y se consideran médicamente insignificativas para el medicamento particular estudiado. En una realización, dos proteínas de unión al antígeno son bioequivalentes si no hay diferencias clínicamente significativas en su seguridad, pureza y potencia.

45 En una realización, dos proteínas de unión al antígeno son bioequivalentes si un paciente puede cambiarse una o más veces entre el producto de referencia y el producto biológico sin un aumento esperado en el riesgo de efectos adversos, que incluyen un cambio clínicamente significativo en la inmunogenicidad, o eficacia reducida, en comparación con la terapia continuada sin tal cambio.

En una realización, dos proteínas de unión al antígeno son bioequivalentes si ambas actúan por un mecanismo o mecanismos de acción comunes para la condición o condiciones de uso, hasta el punto que tales mecanismos sean conocidos.

La bioequivalencia puede demostrarse por métodos in vivo e in vitro. Las medidas de bioequivalencia incluyen, por

55 ejemplo, (a) una prueba in vivo en seres humanos u otros mamíferos, en la que la concentración de anticuerpo o sus metabolitos se mide en sangre, plasma, suero, u otro fluido biológico en función del tiempo; (b) una prueba in vitro que se ha correlacionado con y es razonablemente predictiva de datos de biodisponibilidad humana in vivo; (c) una prueba in vivo en seres humanos u otros mamíferos en la que se mide el efecto farmacológico agudo apropiado del anticuerpo (o su diana) en función del tiempo; y (d) en un ensayo clínico bien controlado que establece la seguridad, eficacia, o biodisponibilidad o bioequivalencia de un anticuerpo.

Pueden construirse variantes bioequivalentes de anticuerpos anti-PCSK9 de la invención, por ejemplo, haciendo diversas sustituciones de restos o secuencias o delecionando restos terminales o internos o secuencias no necesarias para la actividad biológica. Por ejemplo, pueden delecionarse o sustituirse restos de cisteína no

65 esenciales para la actividad biológica con otros aminoácidos para prevenir la formación de puentes disulfuro intramoleculares innecesarios o incorrectos tras la renaturalización.

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Población de tratamiento

La invención se refiere a métodos terapéuticos para tratar un paciente humano en necesidad de una composición de la invención. Aunque modificaciones en el estilo de vida y el tratamiento con fármacos convencionales son 5 frecuentemente satisfactorios en reducir los niveles de colesterol, no todos los pacientes son capaces de lograr los niveles de colesterol objetivo recomendados con tales enfoques. Diversas afecciones, tales como la hipercolesterolemia familiar (FH), parecen ser resistentes a reducir los niveles de LDL-C, a pesar del uso agresivo de terapia convencional. La hipercolesterolemia familiar homocigótica y heterocigótica (hoFH, heFH) es una afección asociada a enfermedad vascular aterosclerótica prematura. Sin embargo, los pacientes diagnosticados con hoFH son muy insensibles a la terapia con fármacos convencional y tienen opciones de tratamiento limitadas. Específicamente, el tratamiento con estatinas, que reducen LDL-C inhibiendo la síntesis del colesterol y regulando por incremento el receptor de LDL hepático, puede tener poco efecto en pacientes cuyos receptores de LDL son no existentes o defectuosos. Se ha informado recientemente de una reducción de LDL-C media de solo menos de aproximadamente el 20 % en pacientes con hoFH confirmada por genotipo tratados con la dosis máxima de

15 estatinas. La adición de ezetimiba 10 mg/día a esta pauta produjo una reducción total de los niveles de LDL-C del 27 %, que está todavía muy lejos de la óptima. Asimismo, muchos pacientes son no sensibles a las estatinas, están poco controlados con la terapia con estatinas, o no pueden tolerar la terapia con estatinas; en general, estos pacientes son incapaces de lograr el control del colesterol con tratamientos alternativos. Hay una gran necesidad médica sin cumplir de nuevos tratamientos que puedan tratar los inconvenientes de las actuales opciones de tratamiento.

Poblaciones específicas tratables por los métodos terapéuticos incluyen pacientes indicados para aféresis de LDL, sujetos con mutaciones (GOF) activantes de PCSK9, hipercolesterolemia familiar heterocigótica (heFH); sujetos con hipercolesterolemia primaria que son intolerantes a las estatinas o incontrolada por estatinas; y sujetos en riesgo de

25 desarrollar hipercolesterolemia que puede ser tratada preventivamente.

Administración terapéutica y formulaciones

La invención proporciona composiciones terapéuticas que comprenden los anticuerpos anti-PCSK9 o fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la presente invención. La administración de composiciones terapéuticas según la invención se administrarán con vehículos adecuados, excipientes, y otros agentes que se incorporan en las formulaciones para proporcionar transferencia mejorada, administración, tolerancia, y similares. Puede encontrarse una multitud de formulaciones apropiadas en el formulario conocido para todos los químicos farmacéuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Estas formulaciones incluyen, por

35 ejemplo, polvos, pastas, pomadas, gelatinas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónico) (tales como LIPOFECTIN™), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite en agua y de agua en aceite, emulsiones Carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semi-sólidas que contienen Carbowax. Véase también Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.

La dosis puede variar dependiendo de la edad y el tamaño de un sujeto que va a administrarse, enfermedad objetivo, afecciones, vía de administración, y similares. Cuando el anticuerpo de la presente invención se usa para tratar diversas afecciones y enfermedades asociadas a PCSK9, que incluyen hipercolesterolemia, trastornos asociados a LDL y apolipoproteína B, y trastornos del metabolismo de los lípidos, y similares, en un paciente adulto,

45 es ventajoso administrar por vía intravenosa el anticuerpo de la presente invención normalmente a una dosis única de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, más preferentemente aproximadamente 0,02 a aproximadamente 7, aproximadamente 0,03 a aproximadamente 5, o aproximadamente 0,05 a aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal. Dependiendo de la gravedad de la afección, pueden ajustarse la frecuencia y la duración del tratamiento.

Se conocen diversos sistemas de administración y pueden usarse para administrar la composición farmacéutica de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar los virus mutantes, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Los métodos de introducción incluyen, pero no se limitan a, vías intradérmica,

55 intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. La composición puede administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo por infusión o inyección en bolo, por absorción a través de los revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y puede administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.

La composición farmacéutica también puede administrarse en una vesícula, en particular un liposoma (véase Langer (1990) Science 249:1527-1533; Treat et al. (1989) en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365; Lopez-Berestein, arriba, pp. 317-327; véase generalmente arriba).

65 En ciertas situaciones, la composición farmacéutica puede administrarse en un sistema de liberación controlada. En una realización, puede usarse una bomba (véase Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). En otra

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realización, pueden usarse materiales poliméricos; véase, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974). En otra realización más, un sistema de liberación controlada puede colocarse en proximidad de la diana de la composición, requiriendo así solo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, arriba, vol. 2, pp. 115-138, 1984).

5 Las preparaciones inyectables pueden incluir formas de dosificación para inyecciones intravenosa, subcutánea, intracutánea e intramuscular, infusiones por goteo, etc. Estas preparaciones inyectables pueden prepararse por métodos públicamente conocidos. Por ejemplo, las preparaciones inyectables pueden prepararse, por ejemplo, disolviendo, suspendiendo o emulsionando el anticuerpo o su sal descrito anteriormente en un medio acuoso estéril

o un medio aceitoso convencionalmente usado para inyecciones. Como medio acuoso para inyecciones, están, por ejemplo, solución salina fisiológica, una solución isotónica que contiene glucosa y otros agentes auxiliares, etc., que pueden usarse en combinación con un agente solubilizante apropiado tal como un alcohol (por ejemplo, etanol), un polialcohol (por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol), un tensioactivo no iónico [por ejemplo, polisorbato 80, HCO50 (aducto de polioxietileno (50 moles) de aceite de ricino hidrogenado)], etc. Como medio aceitoso se emplean, por

15 ejemplo, aceite de sésamo, aceite de soja, etc., que pueden usarse en combinación con un agente solubilizante tal como benzoato de bencilo, alcohol bencílico, etc. La inyección así preparada se llena preferentemente en una ampolla apropiada. Una composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse por vía subcutánea

o por vía intravenosa con una aguja y jeringa convencionales. Además, con respecto a la administración subcutánea, un dispositivo de administración de pluma tiene fácilmente aplicaciones en la administración de una composición farmacéutica de la presente invención. Un dispositivo de administración de pluma tal puede ser reutilizable o desechable. Un dispositivo de administración de pluma reutilizable generalmente utiliza un cartucho reemplazable que contiene una composición farmacéutica. Una vez se ha administrado toda la composición farmacéutica dentro del cartucho y el cartucho está vacío, el cartucho vacío puede desecharse fácilmente y sustituirse con un cartucho nuevo que contiene la composición farmacéutica. El dispositivo de administración de

25 pluma puede entonces reutilizarse. En un dispositivo de administración de pluma desechable, no hay cartucho sustituible. Más bien, el dispositivo de administración de pluma desechable viene precargado con la composición farmacéutica contenida en un recipiente dentro del dispositivo. Una vez se vacía el recipiente de la composición, se desecha el dispositivo entero.

Numerosos dispositivos de administración de pluma y auto-inyección reutilizables tienen aplicaciones en la administración subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención. Ejemplos incluyen, pero ciertamente no se limitan a, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, RU), pluma DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Suiza), pluma HUMALOG MIX 75/25™, pluma HUMALOG™, pluma HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly and Co., Indianápolis, IN), NOVOPEN™ I, II y III (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), NOVOPEN

35 JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), pluma BD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ y OPTICLIK™ (sanofi-aventis, Frankfurt, Alemania), por nombrar algunos. Ejemplos de dispositivos de administración de pluma desechables que tienen aplicaciones en la administración subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención incluyen, pero ciertamente no se limitan a, pluma SOLOSTAR™ (sanofi-aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk) y KWIKPEN™ (Eli Lilly).

Ventajosamente, las composiciones farmacéuticas para uso oral o parenteral descritas anteriormente se preparan en formas de dosificación en una dosis unitaria adecuada para adecuarse a una dosis de los principios activos. Tales formas de dosificación en una dosis unitaria incluyen, por ejemplo, comprimidos, píldoras, cápsulas, inyecciones (ampollas), supositorios, etc. La cantidad del anticuerpo anteriormente dicho contenida es generalmente

45 aproximadamente 5 a aproximadamente 500 mg por forma de dosificación en una dosis unitaria; especialmente en forma de inyección, se prefiere que el anticuerpo anteriormente dicho esté contenido en aproximadamente 5 a aproximadamente 100 mg y en aproximadamente 10 a aproximadamente 250 mg para las otras formas de dosificación.

La invención se refiere a métodos terapéuticos en los que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención es útil para tratar hipercolesterolemia asociada a una variedad de afecciones que implican a hPCSK9. Los anticuerpos anti-PCSK9 o fragmentos de anticuerpos de la invención son particularmente útiles para el tratamiento de hipercolesterolemia y similares. Las terapias de combinación pueden incluir el anticuerpo anti-PCSK9 de la invención con, por ejemplo, uno o más de cualquier agente que (1) induce un agotamiento celular de la síntesis de colesterol

55 inhibiendo la 3-hidroxi-3-metilglutaril (HMG)-coenzima A (CoA) reductasa, tal como cerivastatina, atorvastatina, simvastatina, pitavastatina, rosuvastatina, fluvastatina, lovastatina, pravastatina; (2) inhibe la captación de colesterol y o re-absorción de ácidos biliares; (3) aumenta el catabolismo de lipoproteínas (tales como niacina); y activadores del factor de transcripción de LXR que desempeña una función en la eliminación de colesterol tales como 22hidroxicolesterol o combinaciones fijas tales como ezetimiba más simvastatina; una estatina con una resina biliar (por ejemplo, colestiramina, colestipol, colesevelam), una combinación fija de niacina más una estatina (por ejemplo, niacina con lovastatina); o con otros agentes hipolipemiantes tales como ésteres etílicos de ácidos grasos omega-3 (por ejemplo, omacor).

Ejemplos

65 Los siguientes ejemplos se exponen de manera que se proporcione a aquellos expertos habituales en la materia de

16

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imagen11

Anticuerpo

kd (1/s) T1/2 (min)

H1H320P

3,17 x 10-4 36

H1M300

1,52 x 10-4 76

H1M504

5,04 x 10-4 23

H1M497

6,60 x 10-5 175

H1M503

8,73 x 10-5 132

H1M496

4,45 x 10-5 260

Ejemplo 4. Efecto del pH sobre la afinidad de unión al antígeno

Se evaluaron los efectos del pH sobre la afinidad de unión al antígeno por mAb anti-hPCSK9 completamente

5 humanos producidos por células CHO como se ha descrito anteriormente. Los mAb probados son versiones completamente humanas de H1H316P ("316P") (HCVR/LCVR SEQ ID NO: 90/92; secuencias de CDR SEQ ID NO: 76/78/80 y 84/86/88) y H1M300N ("300N") (HCVR/LCVR SEQ ID NO: 218/226; secuencias de CDR SEQ ID NO:220/222/224 y 228/230/232). Se capturó hPCSK9-mmh sobre una superficie de mAb anti-myc tanto a una densidad alta (aproximadamente 35 a 45 unidades de resonancia) (UR) como a una densidad baja

10 (aproximadamente 5 a 14 UR). Cada anticuerpo, a 50 nM en HBST (pH 7,4 o pH 5,5), se inyectó sobre la superficie de hPCSK9 capturada a un caudal de 100 µl/min durante 1,5 min a 25 ºC y se monitorizó la disociación antígenoanticuerpo durante 10 min. Control I: mAb anti-hPCSK9 SEQ ID NO:79/101 (documento WO 2008/063382) (KD = pM; T1/2 = min).

15 Tabla 5

Anticuerpo

Superficie de hPCSK9 Alta densidad Superficie de hPCSK9 Baja densidad

pH 7,4

pH 5,5 pH 7,4 pH 5,5

KD

T1/2 KD T1/2 KD T1/2 KD T1/2

316P

191 74 144 83 339 45 188 58

300N

65 507 1180 26 310 119 1380 13

Control I

20000 29 ND ND ND ND ND ND

Las propiedades de unión al antígeno de 316P y 300N a pH 7,4 o pH 5,5 se determinaron por un ensayo BIACORE™ modificado como se ha descrito anteriormente. Brevemente, los mAb se inmovilizaron sobre chips sensores CM5 de BIACORE™ mediante acoplamiento de amina. Se inyectaron concentraciones variables de 20 hPCSK9 marcada con myc-myc-his, PCSK9 de ratón (mPCSK9, SEQ ID NO:757), hPCSK9 con una mutación puntual de ganancia de función (GOF) de D374Y (hPCSK9(D374Y)), PCSK9 de mono cinomolgo (Macaca fascicularis) (mfPCSK9, SEQ ID NO:761) (mfPCSK9), PCSK9 de rata (Rattus norvegicus) (rPCSK9, SEQ ID NO:763) y PCSK9 de hámster dorado sirio marcada con his (Mesocricetus auratus) (maPCSK9, SEQ ID NO:762) (maPCSK9), que oscilaban de 11 a 100 nM, sobre la superficie del anticuerpo a caudal de 100 µl/min durante 1,5

25 min y se monitorizó la disociación antígeno-anticuerpo en tiempo real durante 5 min a tanto 25 ºC (Tabla 6) como 37 ºC (Tabla 7). Control II: mAbs anti-hPCSK9 SEQ ID NO:67/12 (documento WO 2009/026558). NB: No se observó unión en la condición experimental (KD = pM; T1/2 = min).

Tabla 6. Efecto del pH a 25 ºC

Antígeno

316P

pH 7,4

pH 5,5

KD

T1/2 KD T1/2

hPCSK9-mmh

1260 36 22 39

mPCSK9-mmh

4460 10 63 11

hPCSK9(D347Y)-mmh

2490 15 166 13

mfPCSK9-mmh

1420 42 8 23

maPCSK9-h

8350 8 87 8

rPCSK9-mmh

24100 2 349 5

300N

hPCSK9-mmh

1100 76 3100 5

mPCSK9-mmh

NB NB NB NB

hPCSK9(D347Y)-mmh

1310 46 9030 3

mfPCSK9-mmh

2170 31 38500 ,4

maPCSK9-h

NB NB NB NB

rPCSK9-mmh

NB NB NB NB

Control I

hPCSK9-mmh

33100 14 1740 31

mPCSK9-mmh

NB NB NB NB

hPCSK9(D347Y)-mmh

71000 11 7320 30

mfPCSK9-mmh

362000 0,2 67200 3

19

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Claims (1)

1. imagen1