ES2530175T3 - Ensayos para la detección de autoanticuerpos contra fármacos anti-TNF - Google Patents

Abstract

Mëtodo para detectar la presencia o el nivel de un autoanticuerpo contra un fármaco anti-TNF-α en una muestra sin interferencia del fármaco anti-TNF-α en la muestra, comprendiendo el método: (a) poner en contacto la muestra con un ácido para disociar los complejos preformados del autoanticuerpo y el fármaco anti-TNF-α, en el que la muestra presenta o se sospecha que presenta un autoanticuerpo contra el fármaco anti-TNF-α, (b) poner en contacto la muestra con un fármaco anti-TNF-α marcado tras la disociación de los complejos preformados, en el que opcionalmente la etapa (b) comprende además poner en contacto un control interno marcado con la muestra, (c) neutralizar el ácido en la muestra para formar complejos marcados del fármaco anti-TNF-α marcado y el autoanticuerpo, (d) someter los complejos marcados a cromatografía de exclusión por tamaño para separar los complejos marcados, y (e) detectar los complejos marcados, detectando de esta manera la presencia o el nivel del autoanticuerpo sin interferencia del fármaco anti-TNF-α en la muestra.

Description

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determinada longitud de onda. Para la detección de anticuerpos unidos a enzima, puede llevarse a cabo un análisis cuantitativo de los niveles de AAF utilizando un espectrofotómetro, tal como un lector de microplacas EMAX (Molecular Devices, Menlo Park, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Si se desea, los ensayos pueden automatizarse o ejecutarse robóticamente, y puede detectarse simultáneamente la señal de múltiples muestras.

Puede utilizarse la cromatografía de exclusión por tamaño. El principio subyacente de la CET es que las partículas de diferentes tamaños eluyen (se filtran) a través de una fase estacionaria a diferentes velocidades. Ello resulta en la separación de una solución de partículas basándose en el tamaño. Con la condición de que todas las partículas se carguen simultáneamente o prácticamente de manera simultánea, las partículas del mismo tamaño eluyen juntas. Cada columna de exclusión por tamaño presenta un abanico de pesos moleculares que pueden separarse. El límite de exclusión define el peso molecular en el extremo superior de dicho abanico y es donde las moléculas son excesivamente grandes para resultar atrapadas en la fase estacionaria. El límite de permeación define el peso molecular en el extremo inferior del abanico de separación y es donde las moléculas de un tamaño suficientemente pequeño pueden penetrar en los poros de la fase estacionaria por completo y todas las moléculas bajo dicha masa molecular son tan pequeñas que eluyen como una única banda.

En determinados aspectos, se recoge el eluyente en volúmenes constantes, o fracciones. Cuanto más similares de tamaño sean las partículas, más probablemente se encontrarán en la misma fracción y no se detectarán separadas. Preferentemente, las fracciones recogidas se examinan mediante técnicas espectroscópicas para determinar la concentración de las partículas eluidas. Típicamente, entre las técnicas de detección espectroscópica útiles en el presente método se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, la fluorimetría, el índice refractivo (IR) y la luz ultravioleta (UV). En determinados casos, el volumen de elución disminuye de manera aproximadamente lineal con el logaritmo del volumen hidrodinámico molecular (es decir, las fracciones más pesadas eluyen las primeras).

Se da a conocer un kit para detectar la presencia o el nivel de autoanticuerpos contra un fármaco anti-TNF-α en una muestra. El kit puede comprender uno o más de los componentes siguientes: un ácido (o mezcla de ácidos), un fármaco anti-TNF-α marcado (por ejemplo un anticuerpo anti-TNF-α marcado), un control interno marcado, un agente neutralizador (o mezclas del mismo), medios para la detección (por ejemplo un detector de fluorescencia), una cromatografía líquida de alto rendimiento-de exclusión por tamaño (HPLC-ET) y/o instrucciones para la utilización del kit.

Se da a conocer además un método para seleccionar un curso de terapia (por ejemplo para seleccionar un fármaco anti-TNF-α apropiado) para el tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por TNF-α en un sujeto, comprendiendo el método:

(a)

analizar una muestra obtenida del sujeto para determinar la presencia, el nivel o el genotipo de uno o más marcadores en la muestra,

(b)

aplicar un algoritmo estadístico a la presencia, nivel o genotipo de uno o más marcadores determinados en la etapa (a) para generar un índice de actividad/gravedad de la enfermedad, y

(c)

seleccionar un curso de terapia apropiado (por ejemplo una terapia anti-TNF-α) para el sujeto basándose en el índice de actividad/gravedad de la enfermedad.

Se da a conocer un método para optimizar la terapia y/o reducir la toxicidad en sujeto que recibe un curso de terapia para el tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por TNF-α, comprendiendo el método:

(a)

analizar una muestra obtenida del sujeto para determinar la presencia, el nivel o el genotipo de uno o más marcadores en la muestra,

(b)

aplicar un algoritmo estadístico a la presencia, nivel o genotipo de uno o más marcadores determinados en la etapa (a) para generar una actividad de enfermedad/índice de gravedad, y

(c)

determinar una dosis posterior del curso de terapia para el sujeto o si debería administrarse un curso de terapia diferente en el sujeto basándose en el índice de actividad/gravedad de la enfermedad.

El curso de la terapia puede comprender un anticuerpo anti-TNF-α. En determinados casos, el anticuerpo anti-TNFα es un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de REMICADETM (infliximab), ENBRELTM (etanercept), HUMIRATM (adalimumab), CIMZIA® (certolizumab pegol), SIMPONI® (golimumab, CNTO 148) y combinaciones de los mismos. El curso de la terapia puede comprender un anticuerpo anti-TNF-α conjuntamente con un agente inmunosupresor.

El nivel de uno o más marcadores puede comprender un nivel total, un nivel de activación o combinaciones de los mismos. En casos particulares, el marcador o marcadores son elementos seleccionados de entre el grupo que consiste de un marcador inflamatorio, un factor de crecimiento, un marcador serológico, una citoquina y/o quimoquina, un marcador de estrés oxidativo, un receptor de superficie celular, un marcador de ruta de señalización, un marcador genético, un anticuerpo anti-TNF-α, un anticuerpo antifármaco (AAF) y combinaciones de los mismos.

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Biophys. 243:338-348, 1985 Trinel et al., Infect. Immun., 60:3845-3851, 1992); o la posición del enlace (Kikuchi et al., Planta 190:525-535, 1993).

Entre los oligomanósidos adecuados para la utilización en los métodos se incluyen, aunque sin limitación, un oligomanósido que presenta la manotetraosa Man(1-3) Man(1-2) Man(1-2) Man. Dicho oligomanósido puede purificarse a partir de PPM tal como se describe en, por ejemplo, Faille et al., supra. Un neoglucolípido ejemplar específico para AASC puede construirse liberando el oligomanósido de su PPM respectivo y posteriormente acoplando el oligomanósido liberado con 4-hexadecil-anilina o similar.

3. Anticuerpos antimicrobianos

La determinación de los niveles de anticuerpo anti-OmpC en una muestra también resulta útil en el presente método. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "anticuerpo anti-proteína C de membrana externa" o "anticuerpo anti-OmpC" incluye anticuerpos dirigidos contra una porina de membrana externa bacteriana tal como se describe en, por ejemplo, la publicación de patente PCT nº WO 01/89361. La expresión "proteína C de membrana externa" o "OmpC" se refiere a una porina bacteriana que es inmunorreactiva con un anticuerpo anti-OmpC.

El nivel de anticuerpo anti-OmpC presente en una muestra de un individuo puede determinarse utilizando una proteína OmpC o un fragmento de la misma, tal como un fragmento inmunorreactivo de la misma. Entre los antígenos OmpC adecuados que resultan útiles para determinar los niveles de anticuerpo anti-OmpC en una muestra se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, una proteína OmpC, un polipéptido OmpC que presenta sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la proteína OmpC, o un fragmento de la misma, tal como un fragmento inmunorreactivo de la misma. Tal como se utiliza en la presente memoria, un polipéptido OmpC generalmente describe los polipéptidos que presentan una secuencia de aminoácidos con una identidad superior a aproximadamente 50%, preferentemente superior a aproximadamente 60%, más preferentemente superior a aproximadamente 70%, todavía más preferentemente superior a aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% respecto a una proteína OmpC, determinando la identidad de aminoácidos con un programa de alineación de secuencias tal como CLUSTALW. Dichos antígenos pueden prepararse mediante, por ejemplo, purificación a partir de bacterias entéricas, tales como E. coli, mediante expresión recombinante de un ácido nucleico, tal como GenBank nº de acceso K00541, por medios sintéticos, tal como la síntesis peptídica en solución o en fase sólida, o mediante la utilización de expresión fágica.

La determinación de los niveles de anticuerpo anti-I2 en una muestra también resulta útil en el presente método. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "anticuerpo anti-I2" incluye los anticuerpos dirigidos contra un antígeno microbiano que comparte homología con reguladores transcripcionales bacterianos, tal como se describe en, por ejemplo, la patente US nº 6.309.643. El término "I2" se refiere a un antígeno microbiano que es inmunorreactivo con un anticuerpo anti-I2. La proteína I2 microbiana es un polipéptido de 100 aminoácidos que comparte cierta débil homología con la proteína 4 predicha de C. pasteurianum, Rv3557c de Mycobacterium tuberculosis y un regulador transcripcional de Aquifex aeolicus. Las secuencias de ácidos nucleicos y proteica de la proteína I2 se describen en, por ejemplo, la patente US nº 6.309.643.

El nivel de anticuerpo anti-I2 presente en una muestra de un individuo puede determinarse utilizando una proteína I2

o un fragmento de la misma, tal como un fragmento inmunorreactivo de la misma. Entre los antígenos I2 adecuados que resultan útiles para determinar los niveles de anticuerpo anti-I2 en una muestra se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, una proteína I2, un polipéptido I2 que presenta sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la proteína I2, o un fragmento de la misma, tal como un fragmento inmunorreactivo de la misma. Dichos polipéptidos I2 muestran una similitud de secuencia superior respecto a la proteína I2 que respecto a la proteína 4 de C. pasteurianum e incluyen variantes de isotipo y homólogos de los mismos. Tal como se utiliza en la presente memoria, un polipéptido I2 generalmente describe los polipéptidos que presentan una secuencia de aminoácidos con una identidad superior a aproximadamente 50%, preferentemente superior a aproximadamente 60%, más preferentemente superior a aproximadamente 70%, todavía más preferentemente superior a aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% respecto a una proteína I2 natural, determinando la identidad de aminoácidos con un programa de alineación de secuencias tal como CLUSTALW. Dichos antígenos I2 pueden prepararse mediante, por ejemplo, purificación a partir de microbios, mediante expresión recombinante de un ácido nucleico codificante de un antígeno I2, por medios sintéticos, tal como la síntesis peptídica en solución o en fase sólida, o mediante la utilización de expresión fágica.

La determinación de los niveles de anticuerpo anti-flagelina en una muestra también resulta útil en el presente método. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "anticuerpo anti-flagelina" incluye anticuerpos dirigidos contra un componente proteico de los flagelos bacterianos, tal como se describe en, por ejemplo, la solicitud publicada de patente PCT nº WO 03/053220 y la publicación de patente US nº 2004/0043931. El término "flagelina" se refiere a una proteína de flagelo bacteriano que es inmunorreactiva con un anticuerpo anti-flagelina.

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Tabla 3

Gen

PSN

NOD2 (R702W) -SNP8

rs2066844

NOD2 (G908R) -SNP12

rs2066845

NOD2 (3020insC) -SNP13

rs5743293

ATG16L1 (T300A)

rs2241880

IL23R (R381Q)

rs11209026

DLG5

rs2165047

NOD2/CARD15

rs2066847

IL23R

rs11465804

ATG16L1

rs3828309

MST1

rs3197999

PTGER4

rs4613763

IRGM

rs11747270

TNFSF15

rs4263839

ZNF365

rs10995271

NKX2-3

rs11190140

PTPN2

rs2542151

PTPN22

rs2476601

ITLN1

rs2274910

IL12B

rs10045431

CDKAL1

rs6908425

CCR6

rs2301436

JAK2

rs10758669

C11orf30

rs7927894

LRRK2, MUC19

rs11175593

ORMDL3

rs2872507

STAT3

rs744166

ICOSLG

rs762421

GCKR

rs780094

BTNL2, SLC26A3, HLA-DRB1, HLA-DQA1

rs3763313

PUS10

rs13003464

CCL2, CCL7

rs991804

LYRM4

rs12529198

SLC22A23

rs17309827

IL18RAP

rs917997

IL12RB2

rs7546245

IL12RB1

rs374326

CD3D

rs3212262

CD3G

rs3212262

CD247

rs704853

JUN

rs6661505

CD3E

rs7937334

IL18R1

rs1035127

CCR5

MAPK14

rs2237093

IL18

rs11214108

IFNG

rs10878698

MAP2K6

rs2905443

STAT4

rs1584945

IL12A

rs6800657

TYK2

rs12720356

ETV5

rs9867846

MAPK8

rs17697885

IRGM

rs13361189

IRGM

rs4958847

IRGM

rs1000113

IRGM

rs11747270

TL1A/TNFSF15

rs6478109

28

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TL1A/TNFSF15

rs6478108

TL1A/TNFSF15

rs4263839

PTN22

rs2476601

CCR6

rs1456893

CCR6

rs2301436

5p13/PTGER4

rs1373692

5p13/PTGER4

rs4495224

5p13/PTGER4

rs7720838

5p13/PTGER4

rs4613763

ITLN1

rs2274910

ITLN1

rs9286879

ITLN1

rs11584383

IBD5/5q31

rs2188962

IBD5/5q31

rs252057

IBD5/5q31

rs10067603

GCKR

rs780094

TNFRSF6B

rs1736135

ZNF365

rs224136

ZNF365

rs10995271

C11orf30

rs7927894

LRRK2;MUC19

rs1175593

IL-27

rs8049439

TLR2

rs4696480

TLR2

rs3804099

TLR2

rs3804100

TLR2

rs5743704

TLR2

rs2405432

TLR4 (D299G)

rs4986790

TLR4 (T399I)

rs4986791

TLR4 (S360N)

rs4987233

TLR9

rs187084

TLR9

rs352140

NFC4

rs4821544

KIF21B

rs11584383

IKZF1

rs1456893

C11orf30

rs7927894

CCL2,CCL7

rs991804

ICOSLG

rs762421

TNFAIP3

rs7753394

FLJ45139

rs2836754

PTGER4

rs4613763

ECM1

rs7511649

ECM1 (T130M)

rs3737240

ECM1 (G290S)

rs13294

GLI1 (G933D)

rs2228224

GLI1 (Q1100E)

rs2228226

MDR1 (3435C>T)

rs1045642

MDR1 (A893S/T)

rs2032582

MAGI2

rs6962966

MAGI2

rs2160322

IL26

rs12815372

IFNG,IL26

rs1558744

IFNG,IL26

rs971545

IL26

rs2870946

ARPC2

rs12612347

IL10,IL19

rs3024493

IL10,IL19

rs3024505

IL23R

rs1004819

IL23R

rs2201841

29

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IL23R

rs11465804

IL23R

rs10889677

BTLN2

rs9268480

HLA-DRB1

rs660895

MEP1

rs6920863

MEP1

rs2274658

MEP1

rs4714952

MEP1

rs1059276

PUS10

rs13003464

PUS10

rs6706689

RNF 186

rs3806308

RNF186

rs1317209

RNF186

rs6426833

FCGR2A,C

rs10800309

CEP72

rs4957048

DLD,LAMB1

rs4598195

CAPN10,KIF1A

rs4676410

IL23R

rs11805303

IL23R

rs7517847

IL12B/p40

rs1368438

IL12B/p40

rs10045431

IL12B/p40

rs6556416

IL12B/p40

rs6887695

IL12B/p40

rs3212227

STAT3

rs744166

JAK2

rs10974914

JAK2

rs10758669

NKX2-3

rs6584283

NKX2-3

rs10883365

NKX2-3

rs11190140

IL18RAP

rs917997

LYRM4

rs12529198

CDKAL1

rs6908425

MAGI2

rs2160322

TNFRSF6B

rs2160322

TNFRSF6B

rs2315008

TNFRSF6B

rs4809330

PSMG1

rs2094871

PSMG1

rs2836878

PTPN2

rs2542151

MST1/3p21

rs9858542

MST1/3p21

rs3197999

SLC22A23

rs17309827

MHC

rs660895

XBP1

rs35873774

ICOSLG1

rs762421

BTLN2

rs3763313

BTLN2

rs2395185

BTLN2

rs9268480

ATG5

rs7746082

CUL2,CREM

rs17582416

CARD9

rs4077515

ORMDL3

rs2872507

ORMDL3

rs2305480

Entre los PSN adicionales útiles en el presente método se incluyen, por ejemplo, rs2188962, rs9286879, rs11584383, rs7746082, rs1456893, rs1551398, rs17582416, rs3764147, rs1736135, rs4807569, rs7758080 y rs8098673. Ver, por ejemplo, Barrett et al., Nat. Genet. 40:955-62, 2008.

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de cada cuatro muestras positivas para AAF presentaba niveles indetectables de ADL. Para la detección de AAF, los 114 pacientes de EII tratados con ADL fueron divididos en dos categorías: 0 a 4 µg/ml de ADL y >4 µg/ml de ADL. Los pacientes con más de 4 µg/ml de ADL se sometieron a ensayo con una cantidad mayor de ADL-FI para contrarrestar la competición de ADL circulante con ADL-FI.

Las muestras de suero de control sano no causaron un cambio de movilidad del ADL marcado con FI. En un estudio preliminar, se encontró que el 9,52% de los pacientes con 0,4 µg/ml de ADL presentaba AAF en el presente ensayo.

5 Ejemplo 7: determinación de los niveles de concentración de REMICADETM y anticuerpos antifármaco humanos

El presente ejemplo describe un método para determinar los niveles de fármacos anti-TNF-α, por ejemplo de REMICADEMTM (Infliximab) en una muestra de suero, así como para determinar los niveles de un anticuerpo antifármaco humano, por ejemplo un anticuerpo antiquimérico humano (HACA) contra REMICADETM (Infliximab).

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Etapa 1: determinación del nivel de concentración de REMICADETM (infliximab) en una muestra.

TNF-α puede marcarse con un fluoróforo (por ejemplo Alexa647), en donde el fluoróforo puede detectarse en los espectros tanto visible como de IR, o en ambos. El TNF-α marcado se incuba con suero humano en una reacción en 15 fase líquida para permitir que se una el fármaco anti-TNF-α presente en el suero. El TNF-α marcado también puede incubarse con cantidades conocidas del fármaco anti-TNF-α en una reacción en fase líquida para generar una curva estándar. Tras la incubación, las muestras se cargan directamente en una columna de exclusión por tamaño. La unión del fármaco anti-TNF-α a TNF-α marcado resulta en un desplazamiento hacia la izquierda del pico en comparación con TNF-α marcado solo. La concentración del fármaco anti-TNF-α presente en la muestra de suero

20 seguidamente puede compararse con la curva estándar y los controles.

Análisis de HPLC-ET de los niveles de REMICADETM (infliximab) en el suero del paciente. Se marcó TNF-α recombinante humano con un fluoróforo (Alexa Fluor® 488) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se incubó TNF-α marcado con diferentes cantidades de REMICADETM o suero de paciente durante una hora a temperatura

25 ambiente. Se analizaron muestras de 100 µl mediante cromatografía de exclusión por tamaño en un sistema de HPLC. Se utilizó la detección de marcaje fluorescente para realizar el seguimiento del TNF-α marcado libre y el complejo inmunológico de TNF-α unido basándose en sus tiempos de retención. Se calcularon los niveles de REMICADETM a partir de la curva estándar.

30 Las ecuaciones siguientes son relevantes al presente ensayo:

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En la Etapa 1, se pone en contacto una cantidad conocida de TNF-α marcado con una muestra de suero que

35 contiene REMICADETM . El TNF-α marcado y REMICADETM forman un complejo (TNF-α marcado•REMICADE™)complejo, ver la Ecuación I. Debido a que la totalidad del REMICADETM formará un complejo con TNF-α marcado, la concentración de REMICADETM presente antes de la introducción de TNF-α marcado es igual a la concentración medida de TNF-α marcado•REMI-CADE™complejo, ver la Ecuación II. El nivel de concentración de REMICADETM se calculó multiplicando la proporción entre [(TNF

40 marcado•REMICADE™)complejo]/[TNF-α marcado] y [TNF-α marcado], ver la Ecuación III. La proporción [(TNF-α marcado•REMI-CADE™)complejo]/[TNF-α marcado] se obtuvo integrando el área bajo la curva para el pico de (TNF-α marcado•REMI-CADE™)complejo, a partir de un gráfico de intensidad de la señal como función del tiempo de elución del HPLC de exclusión por tamaño, y dividiendo este número por la integración resultante del área bajo la curva para el pico de TNF-α marcado del gráfico. La [TNF-α marcado] es conocida a priori.

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Etapa 2: determinación del nivel de anticuerpo antiquimérico humano, HACA.

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Claims (1)

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